MX2015003616A

MX2015003616A - Anticuerpos sin fc que comprenden dos fragmentos fab y metodos de uso.

Info

Publication number: MX2015003616A
Application number: MX2015003616A
Authority: MX
Inventors: Christian Klein; Pablo Umana; Peter Bruenker; Christiane Jaeger; Tanja Fauti
Original assignee: Roche Glycart Ag
Priority date: 2012-10-08
Filing date: 2013-10-03
Publication date: 2015-06-05
Also published as: JP2015536908A; CA2879768A1; KR20150064068A; WO2014056783A1; BR112015007120A2; RU2015117393A; EP2904016A1; CN104704004A; US20160130347A1; JP6444874B2; CN104704004B; HK1211303A1; US10087250B2; EP2904016B1

Abstract

La presente invención se relaciona con anticuerpos biespecíficos que comprende por lo menos dos fragmentos Fab, en donde el primer fragmento Fab comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para un primer antígeno; y el segundo fragmento Fab comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para un segundo antígeno en donde ya sea las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del segundo Fab se intercambian y los dos fragmentos Fab se conectan entre si por dos enlazantes peptídicos; y en donde el anticuerpo biespecífico carece de un dominio Fc; se describen métodos para su producción, se presentan composiciones farmacéuticas que contienen a los anticuerpos y usos de las mismas.

Description

ANTICUERPOS SIN Fe QUE COMPRENDEN DOS FRAGMENTOS Fab Y MÉTODOS DE USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con anticuerpos biespecíficos que comprenden por lo menos dos fragmentos en donde el primer fragmento Fab comprende por lo menos un sitio específico de unión a antígeno para un primer y el segundo fragmento Fab comprende por lo menos un sitio específico de unión a antígeno para un segundo en donde ya sea las regiones variables o las regiones constantes de la segunda cadena pesada y ligera de Fab se intercambian y los dos fragmentos Fab se conectan entre sí por dos enlaces y en donde el anticuerpo biespecífico carece de un dominio métodos para su composiciones farmacéuticas que contienen a los anticuerpos y usos de los La presente invención se relaciona adicionalmente con anticuerpos biespecíficos que unen específicamente un antígeno activante de linfocitos T y un antígeno tumoral por sus siglas en que comprende un primer fragmento Fab y un segundo fragmento en donde ya sea las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del segundo Fab se intercambian y los dos fragmentos Fab se conectan entre sí por dos enlazantes de y en donde el anticuerpo específico no comprende un dominio métodos para su composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos y usos de los ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los anticuerpos monoclonales por sus siglas en son una clase cada vez más importantes de agentes Además de los productos de Mab constituidos de la forma de tamaño completo de la se han desarrollado una amplia variedad de formatos de anticuerpos recombinantes por anticuerpos biespecífíeos tetravalentes por por de un formato de anticuerpo IgG y dominios de cadena sencilla por et Nature Biotech 15 y Nature Biotech 25 Varios otros formatos nuevos en donde la estructura de núcleo de anticuerpo IgG o no es retenida tal como los o varios formatos de cadena sencilla los cuales son capaces de unir dos o más se han desarrollado et Nature Biotech 23 Pathobiology 74 et Journal of Immunological Methods 318 et Nature La totalidad de estos formatos utilizan enlazantes ya sea para fusionar el núcleo de anticuerpo IgG o a una proteína de unión adicional o para por dos fragmentos Fab o scFvs Pathobiology 74 Los scFVs en son dos fragmentos scFv unidos por un enlazante peptídico adicional y también se les denomina como Al reducir la longitud del enlazante peptídico entre los dominios variables se generan los La adición de un enlazante peptídico adicional entre los dos polipéptidos proporciona lo que se denominan diacuerpos de cadena El documento US se relaciona con anticuerpos que comprende fragmento Fab de cadena sencilla por sus siglas en Los fragmentos de anticuerpo tienen ventajas y desventajas como sustancias terapéuticas en comparación con los anticuerpos monoclonales de tamaño una ventaja es que son más pequeños y penetran tejidos y tumores más el tamaño pequeño de los fragmentos se ha sugerido que permite la unión a epítopos no accesibles a los anticuerpos monoclonales de tamaño Como un los fragmentos muestran vidas medias circulantes breves en debido probablemente a la depuración Una vida media más corta puede evitar acumulación suficiente de terapia en el sitio La producción de fragmentos de anticuerpo no es trivial dado que los fragmentos es probable que formen agregados y pueden ser menos estables que los anticuerpos monoclonales de tamaño el pareamiento no deseado de cadenas pesada y ligera no afines resulta en la formación de sitios inactivos de unión a antígeno otros productos secundarios no deseados no funcionales lo que constituye un problema principal en la producción a escala clínica y la aplicación terapéutica de fragmentos de En en construcciones en en donde dos o más Fab se fusionan entre sí por medio de un conector no son factibles debido a la asociación aleatoria de las dos cadenas ligeras que resulta en productos secundarios no deseados e Estos inconvenientes ahora se han superado con un formato nuevo de anticuerpos de la En la presente se proporciona un formato de anticuerpo biespecífico nuevo que puede producirse con facilidad con un rendimiento aumentado debido a una cantidad disminuida de productos secundarios mal los cuales muestran menos agregación que los fragmentos de anticuerpo biespecífíeos conocidos en el Utilizando un enfoque de entrecruzamiento que corrige la asociación LC puede ser generada sin necesidad de producción de una cadena ligera El enfoque de cadena ligera común no es posible para los anticuerpos el nuevo formato de anticuerpo biespecífico es estable y no se agrega a temperaturas superiores que los formatos biespecífíeos lo que permite una mejor capacidad de producción y de el nuevo formato de anticuerpo biespecífico tiene un peso molecular mayor en comparación con muchos fragmentos de anticuerpo biespecíficos convencionales y de esta manera se evita la depuración excesiva del riñón lo que genera una vida media mejorada en El nuevo formato de anticuerpo biespecífico es completamente funcional y tiene una unión y actividad comparables o mejoradas con respecto a los anticuerpos biespecíf icos convencionales La destrucción selectiva de una célula individual o un tipo de célula específica con frecuencia es deseable en una diversidad de ámbitos Por el objetivo principal del tratamiento contra el cáncer es destruir de manera específica células tumorales mientras se dejan sin daño a las células y tejidos Un enfoque es inducir selectivamente una respuesta inmunitaria contra el tumor que active el ataque y subsecuente destrucción de las células tumorales por células efectoras inmunes tales como las células citolíticas naturales por sus siglas en o los linfocitos T citotóxicos por sus siglas en Los CTL constituyen las células efectoras más potentes del sistema no no pueden ser activadas por el mecanismo efector mediado por el dominio Fe de los anticuerpos terapéuticos A este los anticuerpos biespecíficos los cuales son capaces de unirse a un antígeno de superficie sobre células cancerosas y activar componentes invariables del complejo de receptor de linfocitos T por sus siglas en se ha vuelto de interés en años La unión simultánea del anticuerpo biespecífico a ambos de sus objetivos obliga a una interacción temporal entre la célula cancerosa y el linfocito lo que provoca activación de los linfocitos T citotóxicos y subsecuente lisis de la célula Se han desarrollado diversos formatos de anticuerpo biespecífico y su adecuación para inmunoterapia contra el cáncer mediado por linfocitos T se ha De las denominadas moléculas BiTE de linfocitos T han sido muy bien caracterizadas y ya han mostrado algunos resultados promisorios en el ámbito clínico en Nagorsen y Exp Cell Res Los BiTE son moléculas scFv en tándem en donde dos moléculas scFv se fusionan por un enlazante Formatos biespecíficos adicionales son evaluados para acoplamiento de linfocitos T que incluyen diacuerpos et Prot Eng y derivados de los mismos tales como diacuerpos en tándem et J Mol Biol Un desarrollo más reciente son las denominadas moléculas DART redireccionamiento de afinidad las cuales se basan en el formato de diacuerpo pero presentan un puente disulfuro para estabilización adicional et Blood Los denominados los cuales son moléculas híbridas completas de IgG de y también actualmente están siendo evaluadas en ensayos representan un formato de tamaño más grande en Seimetz et Treat Rev No los anticuerpos biespecíficos desarrollados para inmunoterapia contra el cáncer mediada por linfocitos T conocidos hasta ahora tienen inconvenientes principales en relación a su toxicidad y Las construcciones pequeñas tales por moléculas BiTE aunque son capaces de efectores reticulados eficientemente y células objetivo tienen una vida media sérica muy corta que requiere que se administren a pacientes por infusión Por otra los formatos similares a IgG aunque tienen el gran beneficio de una vida media prolongada adolescen de toxicidad asociada con las funciones efectoras nativas inherentes a moléculas de Este potencial inmunogénico constituye otro rasgo desfavorable de anticuerpos biespecíficos similares a para desarrollo terapéutico un reto mayor en el desarrollo general de anticuerpos biespecífíeos permanece en la producción construcciones de anticuerpo biespecíficos a una cantidad y pureza clínicamente El mal pareamiento de cadenas pesada y ligera de anticuerpo de diferentes especificidades ante la coexpresión disminuye el rendimiento de la construcción ensamblada correctamente y resulta en un número de productos secundarios no Dadas las dificultades y desventajas asociadas con anticuerpos biespecífíeos disponibles actualmente para inmunoterapia contra el cáncer mediada por linfocitos aún permanece la necesidad de formatos mejorados novedosos de estas Estos inconvenientes ahora se han superado con los nuevos anticuerpos biespecíficos de la Los nuevos anticuerpos biespecíficos se pueden producir con un rendimiento aumentado debido a una cantidad disminuida de productos secundarios mal los cuales muestran menos agregación que los fragmentos de anticuerpo biespecíficos conocidos en el los nuevos anticuerpos biespecíficos son estables a temperaturas aumentadas en comparación con formatos de anticuerpo biespecíficos conocidos en el Utilizando el enfoque de cruce se puede forzar asociación de cadena correctos sin necesidad de generación de una cadena ligera los nuevos anticuerpos biespecíficos novedosos tienen un peso molecular mayor en comparación con muchos fragmentos de anticuerpo biespecífico convencionales y de esta manera se evita la depuración excesiva por parte del riñón y se genera una vida media mejorada in se necesitan únicamente dos plásmidos para producir los anticuerpos biespecíficos Los nuevos anticuerpos biespecífíeos son completamente funcionales y tienen una unión y actividad comparables o mejoradas en que los anticuerpos biespecíficos convencionales La presente invención proporciona moléculas de unión de antígeno biespecíficas diseñadas para activación y redirección de linfocitos T que combinan buena eficacia y capacidad de producción con baja toxicidad y propiedades farmacocinéticas SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relación con anticuerpos biespecíficos que comprenden por lo menos dos fragmentos en donde el primer fragmento Fab comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para un primer y el segundo fragmento Fab comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para un segundo en donde ya sea las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del segundo Fab se intercambian y los dos fragmentos de Fab se conectan entre sí por dos enlaces y en donde el anticuerpo biespecífico carece de un dominio el enlazante peptídico es un enlazante En una el anticuerpo adicionalmente comprende un tercer fragmento En otra el tercer fragmento Fab comprende por lo menos un sitio que une antígeno específico para el primero o segundo preferiblemente para el primer En una el tercer fragmento Fab está conectado a la cadena ligera o la cadena pesada del primer fragmento En otra el tercer fragmento Fab está conectado a la parte o de la cadena ligera o la cadena pesada del segundo fragmento En una el tercer fragmento Fab está conectado al primero o segundo fragmento Fab por medio de uno o más enlazantes el enlazante peptídico es un enlazante Los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención son por lo menos bivalentes y pueden ser trivalentes o por En una los anticuerpos biespecíficos son bivalentes 1 con un sitio de unión cada uno dirigido a un primer antígeno y un segundo En otra los anticuerpos biespecíficos son trivalentes con dos sitios de cada uno dirigido a un primer antígeno y un sitio de unión dirigido a un segundo antígeno como se detalla en la siguiente La presente invención se relaciona con anticuerpos biespecíficos que unen específicamente un antígeno activante de linfocitos T y un antígeno tumoral que comprende un primer fragmento Fab y un segundo fragmento en donde ya sea las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del segundo Fab se intercambian y los dos fragmentos Fab están conectados entre sí por dos enlaces peptídicos y en donde el anticuerpo biespecífico no comprende un dominio Los anticuerpos de la invención se unen específicamente a un antígeno tumoral sobre la superficie de una célula tumoral y al mismo tiempo se unen a antígeno activador de linfocitos Por medio del anticuerpo biespecífico es capaz de inducir una respuesta inmunitaria específicamente en el sitio del que subsecuentemente resulta en apoptósis de la célula En un se proporciona un anticuerpo biespecífico que une específicamente un antígeno activador de linfocitos T y un antígeno tumoral que comprende por lo menos dos fragmentos Fab los cuales están conectados entre sí por dos enlaces en donde el primer fragmento Fab comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para un antígeno tumoral y el segundo fragmento Fab comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para un antígeno activador de linfocitos en donde ya sea las regiones variables o las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera del segundo Fab se y en donde el anticuerpo biespecífico carece de un dominio En la presente invención se relaciona con anticuerpos específicos en donde el antígeno activador de linfocitos T es un antígeno dirigido a correceptor de linfocitos T CD3 En una el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste de proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma por sus siglas en receptor de factor de crecimiento epidérmico por sus siglas en el antígeno carcinoembriónico la proteína de activación de fibroblastos por sus siglas en y En una modalidad el antígeno tumoral es En un se proporciona un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a antígeno de correceptor de linfocitos T CD3 y un antígeno tumoral que comprende por lo menos dos fragmentos Fab los cuales están conectados entre sí por dos enlazantes en donde el primer fragmento Fab comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para un antígeno tumoral y un segundo fragmento Fab comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para un correceptor de linfocito T CD3 en donde ya sea las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del segundo Fab se y en donde el anticuerpo biespecífico carece de un dominio el enlace peptídico es un enlazante En una el anticuerpo adicionalmente comprende un tercer fragmento el cual está conectado al primero o segundo fragmento por uno o dos enlazantes En otra el tercer fragmento Fab comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para un antígeno En una el tercer fragmento Fab está conectado a la parte N o de la cadena ligera o la cadena pesada del primer fragmento En otra el tercer fragmento Fab está conectado a la parte N o de la cadena ligera o la cadena pesada del segundo fragmento En una el tercer fragmento Fab está conectado al primero o segundo fragmentos Fab por uno o dos enlazantes el enlazante peptídico es un enlazante Los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención son por lo menos bivalentes y pueden ser trivalentes o por tetravalentes o En una los anticuerpos biespecíficos son bivalentes 1 con un sitio de unión cada uno dirigido a un antígeno tumoral y un antígeno activante de linfocitos En otra los anticuerpos biespecífíeos son trivalentes 2 con dos sitios de unión cada uno dirigido a un antígeno tumoral y un sitio de unión dirigido a antígeno activador de linfocitos como se detalla en la siguiente En una modalidad el antígeno activante de linfocitos T es En un segundo la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico de la presente En un tercer la presente invención se relaciona con un anticuerpo biespecífico de la presente invención para el tratamiento de En otra se proporciona el uso de un anticuerpo biespecífico como un Preferiblemente el uso es para el tratamiento del En objetivos adicionales la presente invención se relaciona con una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica para una cadena pesada de un anticuerpo biespecífico de la presente una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica para una cadena ligera de un anticuerpo biespecífico de la presente un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de la presente invención y con una célula hospedadora procariótica o eucariótica que comprende un vector de la presente se proporciona un método para producir un anticuerpo que comprende cultivar la célula hospedadora de manera que el anticuerpo se En una modalidad adicional se proporciona un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo biespecífico de la invención y un agente BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras son ilustraciones esquemáticas de formatos de anticuerpo biespecífíeos ejemplares en donde dos fragmentos Fab se conectan entre sí por un Molécula de molécula de molécula de molécula de molécula Las figuras 2a y 2b es análisis de la producción y purificación de hu teñido con 1 Mark 12 2 hu Fab no 1 Mark 12 2 hu Fab La figura 3 es un análisis de la producción y purificación de Cromatografía analítica de exclusión de cromatograma A280 200 GL MOPS 2 pH NaCl 150 de se inyectaron 50 de Las figuras 4a y 4b son análisis de producción y purificación de hu Fab teñido con 1 Mark 12 2 hu no 1 Mark 12 hu Fab La figura 5 es un análisis de producción y purificación de hu Fab Cromatografía analítica por exclusión de cromatograma A280 GL MOPS 2 pH NaCl 150 se inyectaron 50 pg de Las figuras 6a y 6b son análisis de producción y purificación de hu Fab de teñido con 1 Mark 12 2 hu Fab no 1 Mark 12 hu La figura 7 es un análisis de producción y purificación de hu Fab Cromatografía analítica por exclusión de cromatograma A280 200 GL 2 pH NaCl 150 de se inyectaron 50 de Las figuras 8a y 8b son un análisis de producción y purificación de la forma murina de de teñido con 1 Mark 12 2 forma murina de no 1 Mark 12 murina de Crossfab Fab La figura 9 es un análisis de producción y purificación de la forma murina de Cromatografía analítica por exclusión de cromatograma A280 GL MOPS 2 pH NaCl 150 de se inyectaron 50 pg de La figura 10 es una destrucción por liberación de de células tumorales al realizar cocultivo con pan linfocitos T humanos y activación durante 20 horas por diferentes concentraciones de hu Crossfab hu Fab hu así como moléculas biespecíficas Las construcciones con direccionamiento MCSP bivalente muestran actividad citotóxica comparable en comparación con la construcción mientras que la construcción con la unión MCSP monovalente claramente es menos La figura 11 es la comparación de la construcción hu Fab y el Se muestra la liberación de LDH a partir de células ante cocultivo con pan linfocitos T humano y activación durante 21 horas por concentraciones diferentes de las construcciones biespecíficas y las IgG La construcción induce apoptósis en células objetivo de una manera por lo menos comparablemente tan buena como la molécula La figura 12 es la comparación de hu Fab y la construcción Se muestra la liberación de LDH a partir de células tumorales de melanoma humanas ante cocultivo con PBMC humanos y activación durante 26 horas por concentraciones diferentes de las construcciones biespecíficas y las IgG La construcción induce apoptósis en células objetivo por lo menos comparablemente tan buena como la molécula La figura 13 muestra la liberación de LDH a partir de células tumorales del clon 48 de inducido por activación de linfocitos T murinos primarios con la construcción murina Crossfab MCSP humano dirigido así como CD3 La relación de célula efectora respecto a objetivo es de El ensayo se analiza después de incubación durante horas a de La construcción induce apoptosis mediada por linfocitos dependiente de la de células objetivo que expresan La figura 14 muestra la liberación de LDH de células tumorales clon 48 Fluc2 inducido por activación de linfocitos T murinos primario con 50 nM de la construcción murina Crossfab MCSP humano dirigido así como CD3 La relación de células efectoras respecto a objetivo es de El ensayo se analiza después de incubación durante horas a de La construcción induce apoptósis mediada por linfocitos T de células objetivo que expresan MCSP Existe únicamente hiperactivación débil de linfocitos T a esta concentración de la Las figuras muestran diferentes niveles de citocina medidos en el sobrenadante de sangre completa después de tratamiento con 1 nM de diferentes construcciones biespecíficas de Fab y en presencia y o ausencia de células de tumor durante 24 de sangre completa se sembraron en placa por pozo de una placa de 96 pozos y 30 000 células se según se ha La citocina principal que se secretó por activación de linfocitos T en presencia de células tumorales es seguido por también los niveles de la granzima B aumentaron de manera notoria ante la activación de linfocitos T en la presencia de células En la construcción eleva los niveles de TNF e así como granzima B en presencia de células objetivo y un poco más en comparación con la otra construcción No hay secreción significativa de citocinas Th2 e ante la activación de linfocitos T por construcciones biespecíficas en presencia de células En este análisis también hay una secreción débil de IFNgamma inducida por la construcción en ausencia de células La figura 16 muestra el nivel de expresión en superficie del marcador de activación tardío CD25 sobre linfocitos pan T aislados de Los linfocitos pan T murinos se incuban con 50 de la construcción murina Crossfa de la construcción biespecífica murino así como MCSP en presencia o ausencia de células objetivo tumorales clon 48 como se indica es Se muestra el nivel de expresión del marcador de activación tardío CD25 sobre linfocitos T después de 70 La regulación por aumento de CD25 en linfocitos T con la construcción se produce únicamente en presencia de células Las IgG de utilizadas ajustadas a la misma no son capaces de regular por aumento Las figuras 17a y 17b muestran el análisis de la producción y purificación de de teñida con 1 HiMark 2 no de 1 Mark 12 La figura 18 muestra el análisis de la producción y purificación de Fab Cromatografía analítica por exclusión de Cromatograma A280 200 GL MOPS 2 pH NaCl 150 de de 50 de muestras se La figura 19 muestra la destrucción por liberación de de células tumorales ante con humanas y activación durante 24 horas por diferentes concentraciones de construcciones biespecíficas designado como sin y la molécula de referencia La construcción induce apoptósis en células objetivo con una CE5o calculada de mientras que la CEso calculada de la molécula de referencia es 57 que muestra una potencia ligeramente mejor de la molécula en términos de Las figuras 20A y 20b muestran la activación de linfocitos T o medido por regulación por aumento de CD69 incremento respectivo de células positivas en presencia de células tumorales huMCSP positivas ante cocultivo con PBMC humanos tratados con las construcciones biespecíficas designadas como y la molécula de referencia durante En la mediana de valores de CD69 son mayores en linfocitos T en comparación con linfocitos T Existe un claro incremento dependiente de la concentración en mediana de valores CD69 así como el porcentaje de células CD69 positivas para ambas La figura 21 es una ilustración de la molécula de referencia La figura 22 es análisis de la producción y purificación de teñido con 1 Mark 12 2 3 no La figura 23 muestra el análisis de producción y purificación de Cromatografía analítica por exclusión de cromatograma A280 75 GL MOPS 2 pH NaCl 150 de 50 yg de muestra se Las figuras son una ilustración esquemática de los formatos de anticuerpo biespecífíeos ejemplares en donde dos fragmentos Fab se conectan entre sí por dos enlazantes molécula molécula molécula y molécula molécula y molécula molécula y La figura 25 muestra el análisis de la producción y purificación de hu teñido con hu Mark 12 hu no La figura 26 muestra la destrucción por liberación de de células de melanoma humana ante el cocultivo con PBMC humanos tratados con diferentes construcciones biespecíficas de denominado LC Crossfab designado como y la molécula de referencia durante Se aislaron PBMC humanos de sangre fresca de voluntarios Se determinaron los valores CE5o utilizando el programa Graph Pad Las figuras muestran el nivel de expresión de superficie del marcador de activación temprano CD69 en linfocitos T CD4 y CD8 después de 24 horas de incubación con 10 80 ó 16 pM de construcciones biespecíficas de linfocitos T que tienen como objetivo CD3 humana y MCSP humana Fab denominado como LC hu Fab denominado como y la molécula de referencia en presencia de células objetivo de melanoma que expresan MCSP humana Muestra la mediana de valores de expresión de muestra el porcentaje de linfocitos T CD69 La figura 28 muestra la estabilidad térmica de la molécula con dos enlazantes en comparación con la molécula de referencia Dispersión dinámica de medida en un cambio paulatino de temperatura de a La molécula con dos enlazantes se muestra en negro y la molécula de referencia se muestra en DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DEFINICIONES o se refiere a residuos de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable por sus siglas en La FR de un dominio variable generalmente consiste de cuatro dominios FR3 y En las secuencias HVR y FR generalmente aparecen en la siguiente secuencia en VH Una humana para los propósitos en la presente es una infraestructura que comprende la secuencia de aminoácidos de la infraestructura de dominio variable de cadena ligera o una infraestructura de dominio variable de cadena pesada derivada de una infraestructura de inmunoglobulina humana o una infraestructura de consenso como se define más Una infraestructura humana aceptora una infraestructura de inmunoglobulina humana o una infraestructura de consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma o puede contener cambios en la secuencia de En algunas el número de cambio de aminoácidos son 10 o 9 o 8 o 7 o 6 o 5 o 4 o 3 o o 2 o En algunas la infraestructura humana aceptora VL es idéntica en secuencia a la secuencia de infraestructura de inmunoglobulina humana VL o a la secuencia de infraestructura de consenso Una de consenso es una infraestructura la cual representa los residuos aminoácidos que se presentan más comúnmente en una selección de secuencias de infraestructura VL o VH de inmunoglobulina la selección de las secuencias VL o VH de inmunoglobulina humana es a partir de un subgrupo de secuencias de dominio el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et Sequences of Proteins of Immunological Quinta Publication Bethesda MD volúmenes En una para la el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et En una para la VH el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et supra El término hipervariable o sus siglas en como se utiliza en la se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo las cuales son hipervariables en secuencia forman bucles definidos estructuralmente los anticuerpos nativos de cuatro cadenas comprenden seis tres en la VH H2 y y tres en la VL y Las HVR generalmente comprenden residuos de aminoácidos de los bucles hipervariables de las determinadoras de por sus siglas en estas últimas son de la más alta variabilidad de secuencia involucradas en el reconocimiento de Los bucles hipervariables ejemplares se presentan en los residuos aminoácidos 26 a 32 50 a 52 91 a 96 26 a 32 53 a 55 y 96 a 101 and Mol Biol Las CDR ejemplares y se presentan en los residuos aminoácidos 24 a 34 de 50 a 56 de 89 a 97 de 31 a 35B de 50 a 65 de H2 y 95 a 102 de H3 et Sequences of Protelns of Immunological Interest 5th Public Health National Institutes of MD Los términos regiones hipervariables por sus siglas en y regiones determinadoras de complementariedad por sus siglas en se utilizan en la presente de manera intercambiable con referencia a las porciones de la región variable que forman las regiones que unen Esta región particular ha sido descrita por Kabat et of Health and Human of Proteins of Immunological y por Chothia et Mol Biol en donde las definiciones incluyen la superposición o subconjuntos de residuos aminoácidos cuando se comparan unos con No la aplicación de cualquiera de las definiciones para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes de las mismas se pretende que esté dentro del ámbito del término como se define y como se utiliza en la Los residuos aminoácidos apropiados los cuales abarcan las CDR como se definen por cada una de las referencias mencionadas en lo anterior se establecen a continuación en la Tabla 1 como una Los números exactos de residuos los cuales abarcan una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia en tamaño de la Los expertos en el ámbito pueden determinar de modo sistemático cuáles residuos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de región variable del TABLA DEFINICIONES DE LAS CDR1 Numeración de todas las definiciones de CDR en la Tabla 1 es de acuerdo con las convenciones de numeración que se han establecido por Kabat et más con una en como se utiliza en la Tabla 1 se refiere a las CDR como se definen por el programa de elaboración de modelos de anticuerpos de Oxford Kabat et también definen un sistema de numeración para secuencias de región variable que son aplicables a cualquier Una persona habitualmente experta en el ámbito puede asignar inequívocamente este sistema de de a cualquier secuencia de región variable sin basarse en dato experimental alguno más allá de la secuencia Como se utiliza en la la de se refiere al sistema de numeración establecido por Kabat et of Health and Human of Proteins of Immunological A menos que se especifique en otro las referencias a la numeración de las posiciones de residuos aminoácidos específicos en una región variable de anticuerpo son de acuerdo con el sistema de numeración de Con la excepción de CDR1 en las CDR generalmente comprenden los residuos aminoácidos que forman los bucles Las CDR también comprenden determinadores de o sus siglas en los cuales son residuos que hacen contacto con el Los SDR están contenidos dentro de regiones de las CDR denominadas CDR abreviadas o Las ejemplares y se presentan en los residuos aminoácidos 31 a 34 de 50 a 55 de 89 a 96 de 31 a 35B de 50 a 58 de H2 y 95 a 102 de Almagro y Front Biosci A menos que se indique en otro los residuos HVR y otros residuos en el dominio variable residuos se numeran en la presente de acuerdo con Kabat et supra El término en la presente se utiliza en su sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpo que incluyen pero que no se limitan a anticuerpos anticuerpos anticuerpos multiespecíficos anticuerpos y fragmentos de anticuerpo en la medida en que presenten la actividad deseada de unión a En el término también incluye los anticuerpos biespecífíeos de la invención que comprenden por lo menos dos fragmentos Fab conectados entre sí por dos enlazantes y los cuales carecen de un dominio Un es uno que presenta una secuencia de aminoácidos la cual corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano o una célula o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican para anticuerpos Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprenda residuos no humanos que se unan a El término humano como se utiliza en la se pretende que incluya todos los anticuerpos humanos que se crean o aíslan por medios recombinantes tales como anticuerpos aislados a partir de una célula hospedadora tal como una célula NSO o CHO o a partir de un animal un que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana o anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula Estos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes en una forma Los anticuerpos humanos recombinantes de acuerdo con la invención se han sometido a hipermutación somática in las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias aunque derivadas y relacionadas con una línea germinal humana de secuencias VH y pueden no existir de modo natural dentro del repertorio de línea general de anticuerpos humanos in Un anticuerpo se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoácidos de HVR no humanas y residuos aminoácidos de FR En ciertas un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de por lo menos y típicamente dos dominios variables en los cuales la totalidad o sustancialmente la totalidad de las HVR las corresponden a aquellas de un anticuerpo no y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las FR corresponden a aquellas de un anticuerpo Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender por lo menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo Una de un por ejemplo un anticuerpo no humano se refiere a un anticuerpo que ha experimentado Otras formas de humanizados abarcadas por la presente invención son aquellas en las cuales la región constante ha sido modificada o cambiada adicionalmente a partir de la del anticuerpo original para generar las propiedades de acuerdo con la especialmente respecto a la unión a Clq la unión al receptor Fe El término anticuerpo se refiere a un anticuerpo en el cual una porción de la cadena pesada ligera se deriva de una fuente o especie particular mientras que el resto de la cadena pesada ligera se deriva de una fuente o especie habitualmente preparada por téenicas de ADN Los anticuerpos quiméricos que comprenden región variable murina y una región constante humana son los que se Otras formas preferidas de abarcados por la presente invención son aquellos en los cuales la región constante ha sido modificada o cambiada con respecto al anticuerpo original para generar las propiedades de acuerdo con la especialmente respecto a la unión de Cql la unión al receptor Fe Estos anticuerpos quiméricos también se les denomina como de clase Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN que codifican para regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN que codifican para regiones constantes de Los métodos para producir anticuerpos quiméricos involucran ADN recombinante convencional y técnicas de transfección de genes las cuales son bien conocidas en el por ejemplo et USA 81 patentes y El término como se utiliza en la se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente es los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos unen el mismo excepto por posibles anticuerpos por que contienen mutaciones que se producen de manera natural o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpo estas variantes generalmente estarán presentes en cantidades En contraste con preparaciones de anticuerpo las cuales típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un determinante único sobre un De esta el adjetivo indica el carácter del anticuerpo que se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y que no se construye como lo requiere la producción de anticuerpo por cualquier método Por los anticuerpos monoclonales que van a ser utilizados de acuerdo con la presente invención se pueden elaborar en una diversidad de téenicas que pero que no se limitan al método de métodos de ADN métodos de presentación de fago y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen la totalidad o parte de los loci de inmunoglobulina estos métodos y otros métodos ejemplares para elaboración de anticuerpos monoclonales se describen en la Un de se refiere a una molécula diferente al anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que une antígeno al cual se une el anticuerpo Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a anticuerpos moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de Los anticuerpos scFv se por en Methods in los fragmentos de anticuerpo comprenden polipéptidos de cadena sencilla que tienen las características de un dominio específicamente son capaces de unirse ensamblados con un dominio VL o de un dominio específicamente son capaces de unirse ensamblándose con un dominio VH a un sitio de unión a antígeno funcional y de esta manera proporcionan la propiedad de unión a antígeno de los anticuerpos de longitud Como se utiliza en la un se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende un fragmento de cadena ligera que comprende un dominio VL y un dominio constante de una cadena ligera por sus siglas en y un dominio VH y un primer dominio constante de una cadena Los anticuerpos biespecífíeos de la invención comprenden por lo menos dos fragmentos en donde ya sea las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del segundo fragmento Fab se han Debido al intercambio de ya sea las regiones variables o las regiones el segundo fragmento Fab también se denomina como un Fab o o Fab Dos composiciones de cadena diferente de una molécula Fab entrecruzada son posibles y están comprendidas en los anticuerpos biespecífíeos de la por una las regiones variables de la cadena pesada y ligera de Fab se han es la molécula Fab de entrecruzamiento comprende una cadena peptídica constituida de la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena pesada y una cadena peptídica constituida de la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena ligera Esta molécula de Fab entrecruzada también se denomina como Fab entrecruzado Por otra cuando las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab se la molécula de Fab entrecruzada comprende una cadena peptídica constituida de la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena ligera y una cadena peptídica constituida de la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena pesada Esta molécula de Fab entrecruzada también se denomina como Fab entrecruzado Los fragmentos Fab están conectados entre sí por al menos dos enlazantes como se indica más Si no se define en otro sentido significa que los fragmentos Fab están unidos por enlaces ya sea directamente o por medio de uno o más enlazantes El término como se utiliza dentro de la invención indica un péptido con secuencias de aminoácidos el cual preferiblemente es de origen Estos enlazantes peptídicos de acuerdo con la invención se utilizan para conectar uno de los fragmentos Fab a la parte o de otro fragmento Fab para formar un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la los enlazantes peptídicos son péptidos con una secuencia de aminoácidos con una longitud de por lo menos 5 preferiblemente con una longitud de 5 a de manera más preferible de 10 a 50 En una el enlazante peptídico es o con G S serina y n 5 ó 6 y m 2 ó o n 4 ó 5 y 2 ó preferiblemente x 4 y n 2 ó de manera más preferible con x n los enlazantes pueden comprender porción una región de bisagra de En una modalidad el enlazante peptídico es ID Otros enlazantes peptídicos adecuados para conectar los fragmentos Fab por ejemplo ID o ID o ID 145 y El término de unión a se refiere a la parte de una molécula que une antígeno que comprende el área la cual se une específicamente y es complementaria a parte o la totalidad de un Cuando un antígeno es una molécula que une antígeno únicamente se puede unir a una parte particular del parte la cual se denomina un Un dominio de unión a antígeno se puede por por uno o más dominios variables de anticuerpo denominadas regiones variables de un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera de anticuerpo y una región variable de cadena pesada de El término o se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está involucrada en la unión del anticuerpo a Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera y de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras en donde cada dominio comprende cuatro regiones de infraestructura conservadas y tres regiones hipervariables por Kindt et Kuby 6th Freeman and page 91 Un dominio único VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a los anticuerpos que unen un antígeno en particular se pueden aislar utilizando un dominio VH o VL a partir de un anticuerpo que une el antígeno para cribar una biblioteca de dominios VL o VH por Portolano et Immunol Clarkson et Nature 628 El término de un anticuerpo que une cuando se utiliza en la presente para referirse a los residuos aminoácidos de un anticuerpo los cuales son responsables de unión a La porción de un anticuerpo que une antígeno comprende residuos aminoácidos de las determinadoras de o las Las regiones de o son aquellas regiones de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable como se definen en la Por lo los dominios variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo desde la parte a la los dominios FR2 CDR3 y CDR3 de la cadena pesada es la región la cual contribuye en mayor medida a la unión a antígeno y define las propiedades del Las regiones CDR y FR se determinan de acuerdo con la definición estándar de Kabat et Sequences of Proteins of Immunological 5th Public Health National Institutes of MD aquellos residuos a partir de un El término incluye cualquier determinante polipeptídico capaz de unión específica a un En ciertas el determinante epitópico incluye agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas tales como cadenas laterales de fosforilo o sulfonilo en ciertas puede tener características estructurales tridimensionales específicas características de carga Un epítopo es una región de un antígeno que está unida por un El término en la presente se utiliza para definir una región de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene por lo menos una porción de la región Por en anticuerpos el dominio Fe está constituido de dos fragmentos proteínicos derivados del segundo y tercer dominios constantes de dos cadenas pesadas de anticuerpo en los isotipos IgA e los dominios Fe de IgM e IgE contienen tres dominios constantes de cadena pesada de en cada cadena Los anticuerpos biespecíficos de la invención carecen del dominio del dominio como se utiliza en la presente significa que los anticuerpos biespecíficos de la invención no comprenden un dominio CH3 o es la cadena pesada constante consiste únicamente de uno o más dominios La se refiere a la resistencia de la sumatoria total de interacciones no covalentes entre un sitio de unión único de una molécula un y su asociado de unión un A menos que se indique en otro como se utiliza en la de se refiere a afinidad de unión intrínseca la cual refleja una interacción entre miembros de un par de unión anticuerpo y La afinidad de una molécula X por su asociado Y generalmente se puede representar por la constante de disociación La afinidad se puede medir por métodos comunes conocidos en el que incluye los que aquí se Las modalidades ilustrativas y ejemplares específicas para medir la afinidad de unión se describen en lo Como se utiliza en la el término o significa que la unión es selectiva para el antígeno y se puede discriminar de interacciones no deseadas o no La capacidad de una porción de unión a antígeno para unirse a un determinante antigénico específico se puede medir ya sea a través de un análisis inmunoabsorbente unido a enzima por sus siglas en u otras téenicas familiares para los expertos en el por la resonancia de plasmón de superficie por sus siglas en en un instrumento et Glyco J y análisis de unión tradicionales Endocr Res 229 En una la extensión de unión de una porción que une antígeno a una proteína no relacionada es menor de aproximadamente de la unión de la porción que une antígeno al antígeno como se por por En ciertas una porción que une antígeno la cual se une a antígeno o una molécula que une antígeno que comprende a esta porción que une tiene una constante de disociación de 1 menor 100 10 1 o nM ejemplo 108 M o por ejemplo desde a 1013 por de M a IO13 Un anticuerpo por se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables en comparación con un anticuerpo original el cual no presenta estas las alteraciones resultan en una mejoría en la afinidad del anticuerpo por el En una la extensión de unión de un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a un primer antígeno y segundo antígeno a una proteína no relacionada es menor de aproximadamente de la unión del anticuerpo al primero o segundo como se por por un radioinmunoanálisis por sus siglas en o citometría de flujo En ciertas un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a un primer antígeno y un segundo antígeno tiene una constante de disociación de 1 100 10 1 o nM 108 M o por de 108 a por de M a 1013 En ciertas un anticuerpo biespecífico que une específicamente un primer antígeno y un segundo antígeno se une a un epítopo del primer antígeno o del segundo antígeno que está conservado entre el primero o segundo antígeno de especies En una la extensión de unión de un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a un antígeno activador de linfocitos T y un antígeno tumoral por sus siglas en a una proteína no relacionada es menor de aproximadamente de la unión del anticuerpo a un antígeno activador de linfocitos T o un antígeno tumoral como se por por radioinmunoanálisis o citometría de flujo En ciertas un anticuerpo biespecífico que une específicamente antígeno activante de linfocitos T y un antígeno tumoral tiene una constante de disociación de 1 100 10 1 o nM ejemplo M o por ejemplo de 108 a por de M a 1013 En ciertas un anticuerpo biespecífico que une específicamente un antígeno activante de linfocitos T y un antígeno tumoral se une a un epítopo de un antígeno activador de linfocitos T o antígeno tumoral que está conservado entre un antígeno activador de linfocitos T o un antígeno tumoral de especies Los términos anticuerpo biespecífico que une específicamente un antígeno activador de linfocitos T y un antígeno tumoral se refiere a un anticuerpo biespecífico que es capaz de unir un antígeno activador de linfocitos T y un antígeno tumoral con afinidad suficiente de manera que el anticuerpo es útil en mediar una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T o cerca de células que expresan un antígteno En una modalidad el antígeno activador de linfocitos T es el antígeno de correceptor de linfocitos T CD3 particularmente CD3 de humano o de de manera más particular CD3 En algunas el antígeno activador de linfocitos T es la subunidad epsilón de En otras el antígeno activador de linfocitos T es la subunidad alfa o beta de En una el anticuerpo biespecífico que une específicamente un antígeno activador de linfocitos y un antígeno tumoral puede competir con el anticuerpo monoclonal H2C en la publicación PCT para unión de un epítopo a En otra el anticuerpo biespecífico que se une específicamente a un antígeno activador de linfocitos T y un antígeno tumoral puede competir con el anticuerpo monoclonal V9 en Rodrigues et Int J Cáncer Suppl y la patente para unión a un epítopo de En otra modalidad el anticuerpo biespecífico que une específicamente un antígeno activador de linfocitos T y un antígeno tumoral puede competir con el anticuerpo monoclonal FN18 en Nooij et Eur J Immunol para unión de un epítopo de En una el anticuerpo biespecífico comprende una porción que une antígeno que puede competir con el anticuerpo monoclonal CH2527 ID 157 y o una variante madurada por afinidad del mismo para unión a un epítopo de Un de linfocito T como se utiliza en la se refiere a un determinante antigénico expresado sobre la superficie de un linfocito particularmente un linfocito T citotóxico el cual es capaz de inducir activación de linfocitos T por interacción con una molécula de unión a la interacción de una molécula que une antígeno con un antígeno de linfocito T activante puede inducir activación de linfocitos T al disparar la cascada de señalización del complejo de receptor de linfocitos En una modalidad el antígeno de linfocito T activante es La de linfocitos como se utiliza en la se refiere a una o más respuestas celulares de un linfocito particularmente un linfocito T citotóxico que se selecciona secreción de liberación de molécula efectora actividad citotóxica y expresión de marcadores de Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas que activan linfocitos T de la invención son capaces de inducir activación de linfocitos Los análisis adecuados para medir activación de linfocitos T se conocen en el ámbito y se describen en la El término de linfocito T CD3 como se utiliza en la se refiere a un complejo proteínico y está constituido de cuatro cadenas En el complejo contiene una cadena una cadena CD35 y dos cadenas Estas cadenas se asocian con una molécula conocida como el receptor del linfocito T por sus siglas en y la cadena z para generar una señal de activación en linfocitos El término de linfocito T CD3 incluye cualquier CD3 nativo de fuente de cualquier vertebrado que incluyen mamíferos tales como primates y roedores ratones y a menos que se indique en otro preferiblemente de una fuente El término abarca CD3 no procesado de así como cualquier forma de CD3 que resulte del procesamiento en la El término también abarca variantes como se presentan de modo natural de por ejemplo variantes de empalme o variantes En una modalidad el término correceptor de linfocito T CD3 se refiere a CD3 humano o de particularmente CD3 En algunas el antígeno activador de linfocitos T es la subunidad e de En otras el antígeno activador de linfocitos T es la subunidad alfa o beta de Una secuencia ejemplar de CD3 humana se proporciona en la SEC ID El término tumoral como se utiliza en la se refiere a antígenos asociados a tumor así como antígenos específicos de es cualquier epítopo inmunogénico expresado por una célula La proteína se puede expresar por células no tumorales pero ser inmunogénica únicamente cuando es expresada por una célula De manera la proteína se puede expresar por células pero no por células el anticuerpo de la invención se une al dominio extracelular de En una modalidad el antígeno tumoral es antígeno tumoral Los antígenos tumorales ejemplares incluyen pero no se limitan a proteglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma por sus siglas en UniProt NCBI Acceso proteína de activación de fibroblastos por sus siglas en Uni Prot NCBI Acceso receptor de factor de crecimiento epidérmico por sus siglas en también conocido como ErbBl y UniProt NCBI Acceso antígeno carcinoembriónico también conocido como molécula de adhesión celular relacionado con antígeno carcinoembriónico 5 o UniProt NCBI Acceso y CD33 conocido como gp76 o lectina 3 similar a Ig de unión a ácido siálico UniProt NCBI Acceso En una el anticuerpo biespecífico de la invención comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno que es específico para proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma por sus siglas en La especificidad a anticuerpo se refiere al reconocimiento selectivo del anticuerpo para un epítopo particular de un Los anticuerpos por son Los biespecífíeos de acuerdo con la invención son anticuerpos los cuales tienen dos especificidades diferentes de unión a Los anticuerpos de la presente invención son específicos para dos antígenos es para un primer antígeno y un segundo En la presente se proporciona un anticuerpo con especificidades de unión por un antígeno tumoral y un antígeno activador de linfocitos En ciertas los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes de Los anticuerpos biespecíficos también se pueden utilizar para localizar agentes citotóxicos para células las cuales expresan El término anticuerpo como se utiliza en la indica un anticuerpo que tiene uno o más sitios de cada uno de los cuales se une al mismo epítopo del mismo El término anticuerpo como se utiliza en la indica un anticuerpo que tiene por lo menos dos sitios de cada uno de los cuales se une a epítopos diferentes del mismo antígeno o de un antígeno El anticuerpo que se proporciona en la presente es un anticuerpo por un anticuerpo Los anticuerpos multiespecífíeos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios En la presente se proporciona un anticuerpo con especificidades de unión por un primer antígeno y por un segundo En ciertas los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes de un primer antígeno o un segundo Los anticuerpos biespecíficos también se pueden utilizar para localizar agentes citotóxicos para las células que expresan un primer antígeno o un segundo En una la extensión de unión de un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a antígeno activador de linfocitos T y un antígeno tumoral a una proteína no relacionada es menor de aproximadamente de la unión del anticuerpo a un antígeno activador de linfocitos T o un antígeno tumoral por por un radioinmunoanálisis o de flujo En ciertas un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a antígeno activador de linfocitos T y un antígeno tumoral tienen una constante de disociación de 1 100 10 1 o nM 108 M o por de 108 a 1013 por de 109 M a 1013 En ciertas un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a un antígeno activador de linfocitos T y un antígeno tumoral que se une a un epítopo de un antígeno activador de linfocitos T o un antígeno tumoral que está conservado entre el antígeno activador de linfocitos T o un antígeno tumoral de especies El término como se utiliza dentro de la presente solicitud indica la presencia de un número especificado de sitios de unión en una molécula de De esta los términos y indica la presencia de dos sitios de de cuatro sitios de unión y de seis sitios de en una molécula de Los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención son por lo menos y pueden ser o o Los anticuerpos de la presente invención tienen dos o más sitios de unión y son Es los anticuerpos pueden ser biespecíficos incluso en casos en donde existen más de dos sitios de unión que el anticuerpo es trivalente o Un que se une al mismo como un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un análisis de competencia en o e el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un análisis de competencia en o Un análisis de competencia ejemplar se proporciona en la reactividad cruzada significa que una molécula un no reconoce o une específicamente un antígeno diferente del antígeno objetivo actual de la molécula un antígeno relacionado estrechamente con el antígeno particularmente cuando se compara con ése antígeno Por un anticuerpo puede unir miles de aproximadamente a menos de aproximadamente a un antígeno diferente del antígeno objetivo o puede unir el antígeno diferente del antígeno objetivo actual en una cantidad que se selecciona del grupo que consiste de menos de aproximadamente o menos de aproximadamente o y de manera mucho más preferible menos de aproximadamente ó de antígeno diferente del antígeno objetivo La frase ciento de identidad de secuencia de con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos en la secuencia polipeptídica de referencia después de alinear las secuencias e introducir si son para obtener el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar sustitución conservadora alguna como parte de la identidad de La alineación para propósitos de determinación del por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos se puede obtener de diversas maneras que están dentro de las habilidades en el por en la utilización de un programa de computadora disponible públicamente tal como los programas ALIGN o Megalign Los expertos en el ámbito pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias que incluyen cualquier algoritmo necesario para obtener alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se Para los propósitos de la no los valores de de identidad de secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa de computadora de comparación de secuencia El programa de computadora de comparación de secuencia es autoría de y el código fuente ha sido presentado con documentación de usuario en la Copyright Washington en donde está registrada bajo Copyright Registration El programa está disponible públicamente de South San California o se puede compilar del código El programa se puede compilar para uso en un sistema operativo UNIX que incluye la forma digital UNIX Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen por el programa y no En situaciones en donde se utiliza para comparaciones de secuencia de el de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con o contra una secuencia de aminoácidos dada B que alternativamente se puede mencionar como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o que comprende cierto de identidad de secuencia de aminoácidos con o contra una secuencia de aminoácidos dada se calcula como 100 multiplicado por la fracción en donde X es el número de residuos aminoácidos calificados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias en la alineación de ése programa de A y B y en donde Y es el número total de residuos aminoácidos en Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos el de identidad de secuencia de aminoácidos de A respecto a B no será igual a de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto a A menos que se establezca de modo específico en otro todos los de valores de identidad de secuencia de aminoácidos utilizados en la presente se obtiene como se describe en el párrafo inmediatamente precedente utilizando el programa de computadora Un anticuerpo es uno el cual ha sido separado de un componente de su ambiente En algunas un anticuerpo se purifica en más de ó de pureza por por métodos electroforéticos enfoque isoeléctrico electroforesis o cromatográficos intercambio de iones o CLAP en fase Para una revisión de los métodos para determinación de pureza de anticuerpo por Flatman et B Un ácido nucleico se refiere a una molécula de ácido nucleico que ha sido separada de un componente de su ambiente Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que habitualmente contiene la molécula de ácido pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica La frase nucleico aislado que codifica para un anticuerpo biespecífico de la se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para cadenas pesada y ligera de anticuerpo fragmentos de las que incluyen a una o varias de las moléculas de ácido nucleico en un vector único o en vectores separados y una o varias de estas moléculas de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones en una célula La frase nucleico aislado que codifica para un anticuerpo biespecífico que une específicamente un antígeno activador de linfocitos T y un antígeno tumoral se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para las cadenas pesada y ligera de anticuerpo fragmentos de las que incluyen a una o varias de estas moléculas de ácido nucleico en un vector único o en vectores y en una o varias de estas moléculas de ácido nucleico están presentes en una o más ubicaciones en una célula El término como se utiliza en esta solicitud indica el grupo de carboxi como se encuentran de modo natural que comprenden alanina código de tres código de una arginina asparagina ácido aspártico cisterna glutamina ácido glutámico glicina histidina isoleucina leucina lisina metionina fenilalanina prolina serina treonina triptofano tirosina y valina El término como se utiliza en la se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de preparar otro ácido nucleico al cual está El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula hospedadora en la cual se ha Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los cuales están unidos Estos vectores se denominan en la presente como de Como se utiliza en la los términos y se utilizan de manera intercambiable y la totalidad de estas designaciones incluyen a la De este las palabras y transfectadas incluyen células y cultivos objeto primarios derivados de los mismos sin considerar el número de También se entiende que toda descendencia no necesariamente es idéntica en contenido de debido a mutaciones deliberadas o La descendencia variante que tenga la misma función o actividad biológica como se analiza en las células transformadas originalmente se Los términos línea de y de células hospedadoras se utilizan de manera intercambiable y se refieren a células en las cuales el ácido nucleico exógeno ha sido que incluye la descendencia de estas Las células hospedadoras incluye a y las cuales incluyen la célula transformada primaria y la desdencencia derivada de la misma sin importar el número de La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a la célula original sino que puede contener La descendencia mutante que tenga la misma función o actividad biológica como se ha cribado o se ha seleccionado en la célula transformada originalmente se incluye en la Un se refiere a un anticuerpo que no está conjugado a una porción heteróloga una porción o El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación Un es un anticuerpo conjugado a una o más moléculas heterólogas que pero que no se limitan a un agente El término como se utiliza en la se refiere a una sustancia que inhibe o que evita la función celular que provoca la muerte o destrucción Los agentes citotóxicos pero no se limitan a isótopos radioactivos ejemplo g90 Pb212 e isótopos radioactivos de agentes o fármacos quimioterapéuticos alcaloides vinca mitomicina daunorrubicina u otros agentes agentes inhibidores del enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen vegetal o animal que incluyen fragmentos variantes de las y los diversos agentes antitumorales o anticancerígenos que se describen más El término indica el último aminoácido de la parte el término indica el último aminoácido de la parte El término se refiere a una preparación la cual está en una forma tal que permite que sea efectiva la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma y la cual no contiene componentes adicionales los cuales sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al cual se le administraría la Un farmacéuticamente se refiere a un ingrediente en una formulación además del ingrediente el cual es no tóxico para un Un portador farmacéuticamente aceptable pero no se limita a un estabilizante o Como se utiliza en la el variaciones gramáticas del mismo tales como o se refiere a intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo que está siendo tratado y que se puede realizar ya sea como profilaxis o durante el curso de una patología Los efectos deseables del tratamiento pero no se limitan a evitar la presencia o recurrencia de alivio de los disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la evitar disminuir la tasa de progreso de disminución o paleamiento del estado de enfermedad y remisión del pronóstico En algunas los anticuerpos de la invención se utilizan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para frenar el progreso de una Un o es un Los mamíferos pero no se limitan a animales domesticados ejemplo perros y primates ejemplo humanos y primates no humanos tales como conejos y roedores ratones y En ciertas el individuo es un Una de un por una formulación se refiere a una cantidad en dosificaciones y por períodos de tiempo necesarios para obtener el resultado terapéutico o profiláctico El término como se utiliza en la se refiere a enfermedades proliferativas tales como leucemias cáncer de cáncer de pulmón amicrocítico por sus siglas en cáncer de pulmón de células cáncer cáncer cáncer cáncer de vías respiratorias y digestivas melanoma cutáneo o cáncer cáncer de cáncer cáncer de la región cáncer de cáncer cáncer de cáncer de cáncer carcinoma de las trompas de carcinoma del carcinoma del cuello carcinoma de la carcinoma de la enfermedad de cáncer del cáncer del intestino cáncer del sistema cáncer de la glándula cáncer de la glándula cáncer de la glándula sarcoma de tejido cáncer de la cáncer del cáncer de cáncer de la cáncer del riñón o carcinoma de células carcinoma de la pelvis cáncer cáncer neoplasmas del sistema nervioso central tumores del eje glioma del tallo glioblastoma carcinomas de célula adenoma de la hipófisis y sarcoma de que incluye versiones refractarias de cualquiera de los cánceres anteriores o una combinación de uno o más de los cánceres El término de se utiliza para referirse a instrucciones incluidas habitualmente en empaques comerciales de productos terapéuticos que contienen información acerca de las tratamiento contraindicaciones advertencias en relación al uso de estos productos COMPOSICIONES Y MÉTODOS Anticuerpos biespecíficos ejemplares La presente invención se relaciona con anticuerpos biespecífíeos que comprende por lo menos dos fragmentos Fab en donde el primer fragmento Fab comprende por lo menos un sitio específico que une antígeno para un primer y un segundo fragmento Fab comprende por lo menos un sitio específico de unión a antígeno para un segundo en donde ya sea las regiones variables o regiones constantes de la cadena pesada y ligera del segundo fragmento Fab se y en donde los dos fragmentos Fab se conectan entre sí por dos enlazantes y en donde el anticuerpo biespecífico carece de un dominio el enlazante peptídico es un péptido con una secuencia de aminoácidos con una longitud de por lo menos 5 preferiblemente con una longitud de 5 a de manera más preferible 10 a 50 En una el enlazante peptídico es o en donde G S serina y n 5 Ó y m 2 ó o n 4 ó 5 y m 2 ó preferiblemente x 4 y n 2 ó de manera más preferible en donde x n En una el enlazante peptídico es Los enlazantes peptídicos se utilizan para conectar el primero y segundo fragmentos de En una el primer fragmento Fab se conecta a la parte del segundo fragmento Fab por dos enlazantes Dependiendo de si los dominios variables o constantes de las cadenas pesada y la ligera del segundo fragmento Fab están son posibles diferentes moléculas de anticuerpo biespecíficas cuando el primer fragmento Fab está conectado a la parte N terminal del segundo fragmento Fab por dos enlazantes En una los dominios variables del segundo fragmento Fab se intercambian el segundo fragmento Fab es un CrossFab y la parte de la cadena pesada del primer fragmento Fab se conecta a la parte de la cadena VLCH1 del segundo fragmento Fab por un enlazante peptídico y la parte de la cadena ligera del primer fragmento Fab se conecta a la parte de la cadena VHCL del segundo fragmento Fab por un enlazante De esta en una modalidad del anticuerpo biespecífico comprende dos una cadena ligera del primer fragmento Fab conectado a la cadena VHCL del segundo fragmento Fab por medio de un enlazante peptídico y la cadena pesada del primer fragmento Fab conectada a la cadena VLCH1 del segundo fragmento Fab por medio de un enlazante peptídico En otra los dominios constantes del segundo fragmento Fab están intercambiados el segundo fragmento Fab es un CrossFab Fab y la parte de la cadena pesada del primer fragmento Fab está conectada a la parte de la cadena VHCL del segundo fragmento Fab por un enlazante y la cadena ligera del primer fragmento Fab está conectada a la parte de la cadena VLCH1 por un enlazante en una el anticuerpo biespecífico comprende dos una cadena ligera del primer fragmento Fab conectada a la cadena VLCH1 del segundo fragmento Fab por medio de un enlazante peptídico y la cadena pesada del primer fragmento Fab conectada a la cadena VHCL del segundo fragmento Fab por medio de un enlazante peptídico En una el primer fragmento Fab está conectado a la parte del segundo fragmento Fab por dos enlazantes Dependiendo de si los dominios variable o constante de las cadenas pesada y ligera del segundo fragmento Fab están son posibles diferentes moléculas de anticuerpo biespecíficas cuando el primer fragmento Fab está conectado a la parte del segundo fragmento Fab por dos enlazantes En una los dominios variables del segundo fragmento Fab están intercambiados el segundo fragmento Fab es un CrossFab y la parte de la cadena pesada del primer fragmento Fab está conectada a la parte de la cadena VLCH1 del segundo fragmento Fab por un enlazante y la parte de la cadena ligera del primer fragmento Fab está conectada a la parte de la cadena VHCL del segundo fragmento Fab por un enlazante en una el anticuerpo biespecífico comprende dos la cadena VHCL del segundo fragmento Fab conectada a una cadena ligera del primer fragmento Fab por medio de un enlazante peptídico y la cadena VLCH1 del segundo fragmento Fab conectada a la cadena pesada del primer fragmento Fab por medio de un enlazante peptídico En otra los dominios constantes del segundo fragmento Fab se intercambian el segundo fragmento Fab es un CrossFab y la parte de la cadena pesada del primer fragmento Fab está conectada a la parte de la cadena VHCL del segundo fragmento Fab por un enlazante y la parte de la cadena ligera del primer fragmento Fab está conectada a la parte de la cadena VLCH1 por un enlazante De esta en una el anticuerpo biespecífico comprende dos la cadena VLCH1 del segundo fragmento Fab conectada a una cadena ligera del primer fragmento Fab por medio de un enlazante peptídico y la cadena VHCL del segundo fragmento Fab conectada a la cadena pesada del primer fragmento Fab por medio de un enlazante peptídico Los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención son por lo menos bivalentes y pueden ser trivalentes o por En una los anticuerpos biespecíficos son bivalentes 1 con un sitio de cada uno dirigido a un primer antígeno y un segundo En otra los anticuerpos biespecíficos son trivalentes 2 con dos sitios de cada uno dirigido a un primer antígeno y un sitio de unión dirigido a un segundo como se detalla en la siguiente En una el anticuerpo comprende adicionalmente un tercer fragmento En otra el tercer fragmento Fab comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para el primero o segundo preferiblemente para el primer En una el tercer fragmento Fab se conecta a la parte N o del primer fragmento En una el tercer fragmento Fab se conecta al primer fragmento Fab por medio de por lo menos un enlazante el enlazante peptídico es un enlazante En una el tercer fragmento Fab se conecta a la parte N o de la cadena ligera o la cadena pesada del primer fragmento Dependiendo de cuál parte terminal del primer fragmento Fab se conecta al segundo fragmento Fab se detalla en lo el tercer fragmento Fab se conecta en la parte terminal opuesta del primer El tercer fragmento Fab se puede conectar a ya sea uno o dos En una el anticuerpo biespecífico de la invención comprende tres fragmentos Fab en donde los fragmentos Fab y los enlazantes están conectados en el siguiente desde la dirección a la fragmento 3 de ó 2 1 de 2 de en donde ya sea las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del segundo fragmento Fab están En esta la parte del tercer fragmento Fab se conecta a la parte del primer fragmento Como se detalla en lo los fragmentos Fab se pueden conectar entre sí por medio de cadenas pesada o En una la parte de la cadena pesada del tercer fragmento Fab se conecta a la parte de la cadena pesada del primer fragmento Fab por medio de un enlazante y el primer fragmento Fab está conectado al segundo fragmento Fab por dos en donde ya sea las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del segundo fragmento Fab están Dependiendo de si los dominios variable o constante de las cadenas pesada y ligera del segundo fragmento Fab están son posibles diferentes moléculas de anticuerpo En una los dominios variables del segundo fragmento Fab están intercambiados el esgundo fragmento Fab es un CrossFab y las cadenas de los tres fragmentos Fab están conectadas en el siguiente desde la dirección a la En una el anticuerpo biespecífico comprende tres una cadena ligera del tercer fragmento una cadena ligera del primer fragmento Fab conectada a la cadena VHCL del segundo fragmento Fab por un enlazante peptídico y la cadena pesada del tercer fragmento está conectada a la cadena pesada del primer fragmento Fab el cual en sí mismo está conectada a la cadena VLCH1 del segundo fragmento Fab por medio del enlazante peptídico En otra el tercer fragmento Fab está conectado al primer fragmento Fab por dos enlazantes y el anticuerpo biespecífico comprende dos la cadena ligera del tercer fragmento Fab conectado por el enlazante a una cadena ligera del primer fragmento Fab el cual a su vez está conectado a la cadena VHCL del segundo fragmento Fab por un enlazante peptídico y la cadena pesada del tercer fragmento está conectada a la cadena pesada del primer fragmento Fab el cual en sí mismo está conectado a la cadena VLCH1 del segundo fragmento Fab por medio de un enlazante peptídico En una los dominios constantes del segundo fragmento Fab están intercambiados el segundo fragmento Fab es un CrossFab y las cadenas de los tres fragmentos Fab están conectadas en el siguiente desde la dirección a la En una el anticuerpo biespecífico comprende tres una cadena ligera del tercer fragmento una cadena ligera del primer fragmento Fab a la cadena VLCH1 del segundo fragmento Fab por un enlazante peptídico y la cadena pesada del tercer fragmento conectada a la cadena pesada del primer fragmento Fab el cual en sí mismo está conectado a la cadena VHCL del segundo fragmento Fab por medio de un enlazante peptídico En otra el tercer fragmento está conectado al primer fragmento Fab por dos enlazantes y el anticuerpo biespecífico comprende dos una cadena ligera del tercer fragmento Fab conectado a una cadena ligera del primer fragmento Fab el cual a su vez está conectado a la cadena VLCH1 del segundo fragmento Fab por un enlazante peptídico y la cadena pesada del tercer fragmento está conectada a la cadena pesada del primer fragmento Fab el cual en sí mismo está conectado a la cadena VHCL del segundo fragmento Fab por medio del enlazante peptídico En una el anticuerpo biespecífico de la invención comprende tres fragmentos Fab en donde los fragmento Fab y el enlazante están conectados en el siguiente desde la dirección a la fragmento 2 de 1 de ó 2 3 de en donde cualquiera de las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del segundo fragmento Fab están En esta la parte del tercer fragmento Fab está conectada a la parte del primer fragmento Como se detalla en lo los fragmentos Fab se pueden conectar entre sí por medio de las cadenas pesadas o En una la parte de la cadena pesada del tercer fragmento Fab está conectada a la parte de la cadena pesada del primer fragmento Fab por medio de un enlazante y el primer fragmento Fab está conectado al segundo fragmento Fab por los dos en donde cualquiera de las regiones variables o regiones constantes de la cadena pesada y ligera del segundo fragmento Fab están Dependiendo de si los dominios variables o constantes de las cadenas pesada y ligera del segundo fragmento Fab están son posibles diferentes moléculas de anticuerpo En una los dominios variables del segundo fragmento Fab están intercambiados el segundo fragmento Fab es un CrossFab y las cadenas de los tres fragmentos Fab están conectados en el siguiente desde la dirección a la En una el anticuerpo biespecífico comprende tres una cadena ligera del tercer fragmento una cadena VHCL del segundo fragmento Fab conectado a una cadena ligera del primer fragmento Fab por un enlazante peptídico y la cadena VLCH1 del segundo fragmento Fab conectada a la cadena pesada del primer fragmento el cual en sí mismo está conectado a la cadena pesada del primer fragmento Fab por medio de un enlazante peptídico En otra el tercer fragmento Fab está conectado al primer fragmento Fab por dos y el anticuerpo biespecífico comprende dos una cadena VHCL del segundo fragmento Fab conectada a una cadena ligera del primer fragmento Fab por un enlazante el cual a su vez está conectado a una cadena ligera del tercer fragmento Fab por un enlazante peptídico y la cadena VLCH1 del segundo fragmento Fab conectada a la cadena pesada del primer fragmento el cual en sí mismo está conectado a la cadena pesada del primer fragmento Fab por medio de un enlazante peptídico En una los dominios constantes del segundo fragmento Fab están intercambiados el segundo fragmento Fab es un CrossFab y las cadenas de los tres fragmentos Fab están conectados en el siguiente desde la dirección a la En una el anticuerpo biespecífico comprende tres una cadena ligera del tercer fragmento Fab y una cadena VLCH1 del segundo fragmento Fab conectada a una cadena ligera del primer fragmento Fab y la cadena VHCL del segundo fragmento Fab conectada a la cadena pesada del primer fragmento el cual en sí mismo está conectado a la cadena pesada del primer fragmento Fab por medio de un enlazante peptídico En otra el tercer fragmento Fab está conectado al primer fragmento Fab por dos y el anticuerpo biespecífico comprende dos una cadena VLCH1 del segundo fragmento Fab conectado a una cadena ligera del primer fragmento el cual a su vez está conectado a una cadena ligera del tercer fragmento y la cadena VHCL del segundo fragmento Fab está conectada a la cadena pesada del primer fragmento el cual en sí mismo está conectado a la cadena pesada del primer fragmento Fab por medio de un enlazante peptídico En otra el tercer fragmento Fab está conectado a la parte o de la cadena ligera o la cadena pesada del segundo fragmento En una el tercer fragmento Fab está conectado al segundo fragmento Fab por medio de un enlazante el enlazante peptídico es un enlazante Como se detalla en lo los fragmentos Fab se pueden conectar entre sí por medio de las cadenas pesada o En una el anticuerpo biespecífico de la invención comprende tres fragmentos Fab en donde los fragmentos Fab y el enlazante están conectados en el siguiente orden desde la dirección a la fragmento 1 de 2 de ó 2 3 de en donde ya sea las regiones variables o las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera del segundo fragmento Fab están En una la parte del tercer fragmento Fab está conectada a la parte del segundo fragmento En otra la parte de la cadena pesada del tercer fragmento Fab se conecta a la parte del segundo fragmento Fab por medio de un enlazante y el primer fragmento Fab está conectado al segundo fragmento Fab por los dos en donde ya sea las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del segundo fragmento Fab están Dependiendo de si los dominios variable o constante de las cadenas pesada y ligera del segundo fragmento Fab están son posibles diferentes moléculas de anticuerpo En una los dominios variables del segundo fragmento Fab están intercambiados el segundo fragmento Fab es un CrossFab y las cadenas de los tres fragmentos Fab están conectados en el siguiente desde la dirección a la En una el anticuerpo biespecífico comprende tres una cadena ligera del tercer fragmento una cadena ligera del primer fragmento Fab conectada a la cadena VHCL del segundo fragmento Fab por un enlazante y la cadena pesada del tercer fragmento está conectada a la parte de la cadena VLCH1 del segundo fragmento Fab y la parte de la cadena VLCH1 está conectada a la parte de la cadena pesada del primer fragmento Fab por medio de un enlazante peptídico En otra el tercer fragmento Fab está conectado al segundo fragmento Fab por dos enlazantes y el anticuerpo biespecífico comprende dos una cadena ligera del primer fragmento Fab conectado a una cadena VHCL del segundo fragmento Fab por un el cual a su vez está conectado a la cadena ligera del tercer fragmento Fab y la cadena pesada del tercer fragmento está conectada a la parte de la cadena VLCH1 del segundo fragmento Fab y la parte de la cadena VLCH1 está conectada a la parte de la cadena pesada del primer fragmento Fab por un enlazante peptídico En una los dominios constantes del segundo fragmento Fab están intercambiados el segundo fragmento Fab es un CrossFab y las cadenas de los tres fragmentos Fab están conectados en el siguiente desde la dirección a la En una el anticuerpo biespecífico comprende tres una cadena ligera del tercer fragmento una cadena ligera del primer fragmento Fab conectado a una cadena VLCH1 del segundo fragmento Fab por un enlazante peptídico y la cadena pesada del tercer fragmento está conectada a la parte de la cadena VHCL del segundo fragmento y la parte de la cadena VHCL está conectada a la parte de la cadena pesada del primer fragmento Fab por medio de un enlazante peptídico En otra el tercer fragmento Fab está conectado al segundo fragmento Fab por dos enlazantes y el anticuerpo biespecífico comprende dos una cadena ligera del primer fragmento Fab conectado a una cadena VLCH1 del segundo fragmento Fab por un enlazante el cual a su vez está conectado a la cadena ligera del tercer fragmento Fab y la cadena pesada del tercer fragmento está conectada a la parte de la cadena VHCL del segundo fragmento Fab y la parte de la cadena VHCL está conectada a la parte de la cadena pesada del primer fragmento Fab por medio de un enlazante peptídico Anticuerpos biespecíficos ejemplares que se unen a un antígeno activador de linfocitos T y un antigeno tumoral La presente invención se relaciona con anticuerpos biespecíficos que combinan un sitio de unión a antígeno activador de linfocitos T con un segundo sitio de unión a antígeno que está dirigido a un antígeno tumoral Los anticuerpos de la invención se unen específicamente a un antígeno tumoral en la superficie de una célula tumoral y al mismo tiempo se unen a un antígeno sobre la superficie de linfocitos T el antígeno es un antígeno correceptor de linfocito T El anticuerpo biespecífico es capaz de inducir una respuesta inmunitaria específicamente en el sitio del lo que subsecuentemente resulta en apoptósis de la célula Se entiende que las secuencias e emplificadas en esta sección se pueden distribuir en cualquier formato de anticuerpo ejemplificado en las modalidades en la sección A En una modalidad particular de acuerdo con la el anticuerpo biespecífico activador de linfocitos T es capaz de unión simultánea a un antígeno de célula tumoral y un antígeno de linfocito T En una el anticuerpo biespecífico activador de linfocitos T es capaz de entrecruzar un linfocito T y una célula tumoral mediante unión simultánea a un antígeno de célula tumoral y un antígeno de linfocito T En una modalidad incluso más la unión simultánea resulta en lisis de la célula En una la unión simultánea resulta en activación de linfocito En otras la unión simultánea resulta en una respuesta celular de un linfocito particularmente un linfocito T citotóxico que se selecciona del grupo secreción de liberación de molécula efectora actividad citotóxica y expresión de marcadores de En una la unión del anticuerpo biespecífico activador de linfocitos T al antígeno de linfocito T activante sin unión simultánea al antígeno de célula objetivo no resulta en activación de los linfocitos En una el anticuerpo biespecífico activador de linfocitos T es capaz de redirigir la actividad citotóxica de un linfocito T a una célula En una modalidad la redirección es independiente de la presentación de antígeno peptídica mediada por CPH principal de por la célula objetivo especificidad del linfocito un linfocito T de acuerdo con cualquiera de las modalidades de la invención es un linfocito T En algunas el linfocito T es un linfocito T o particularmente un linfocito T En una se proporcionan anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a un antígeno activador de linfocitos T y un antígeno tumoral que comprende un primer fragmento Fab y un segundo fragmento en donde ya sea las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del segundo Fab se cambian y los dos fragmentos Fab están conectados entre sí por dos enlazantes peptídicos y en donde el anticuerpo biespecífico no comprende un dominio como se detalla en la sección A En un un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a antígeno activador de linfocitos T y antígeno tumoral se que comprende por lo menos dos fragmentos Fab conectados por dos enlazantes en donde el primer fragmento Fab comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para un antígeno tumoral y el segundo fragmento Fab comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para un antígeno activador de linfocitos en donde cualquiera de las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del segundo Fab están y en donde el anticuerpo biespecífico carece de un dominio En una modalidad el antígeno activador de linfocitos T es el antígeno correceptor de linfocitos T CD3 particularmente CD3 humano o de de manera más particular CD3 En algunas el antígeno activador de linfocitos T es la subunidad epsilón de En otras el antígeno activador de linfocitos T es la subunidad alfa o beta de En un un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a antígeno de correceptor de linfocitos T CD3 y un antígeno tumoral se que comprende por lo menos dos fragmentos Fab los cuales están conectados por dos enlazantes en donde el primer fragmento Fab comprende por lo menos un sitio que une antígeno específico para un antígeno tumoral y el segundo fragmento Fab comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para un correceptor de linfocito T CD3 en donde cualquiera de las regiones variables o regiones constantes de la cadena pesada y ligera del segundo Fab están y en donde el anticuerpo biespecífico carece de un dominio Los anticuerpos biespecífíeos de acuerdo con la invención son por lo menos bivalentes y pueden ser trivalentes o por tetravalentes o En una los anticuerpos biespecíficos son bivalentes 1 con un sitio de cada uno dirigido a un antígeno tumoral y un antígeno activador de linfocitos En otra los anticuerpos biespecífíeos son trivalentes 2 con dos sitios de cada uno dirigido a un antígeno tumoral y un sitio de unión dirigido a un antígeno activador de linfocitos como se detalla en la siguiente En una el anticuerpo adicionalmente comprende un tercer fragmento como se detalla en la sección A En una el tercer fragmento Fab comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para un antígeno En una el sitio de unión a antígeno del tercer fragmento Fab es específico para el mismo antígeno tumoral que el sitio de unión a antígeno del primer fragmento En una el sitio de unión a antígeno del tercer fragmento Fab es específico para el mismo antígeno tumoral que el sitio de unión a antígeno del primer fragmento Fab y el anticuerpo biespecífico de la invención comprende tres fragmentos Fab conectados por enlazantes peptídicos en el siguiente orden sea desde la dirección a la o desde la dirección a la ó 2 de íinfocitos en donde indica un fragmento Fab con un sitio de unión a antígeno específico para un antígeno tumoral y activador de íinfocitos indica un fragmento Fab con un sitio de unión a antígeno específico para un antígeno activador de Íinfocitos en donde cualquiera de las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y ligera están En una el sitio de unión a antígeno del tercer fragmento Fab es específico para el mismo antígeno tumoral que el sitio de unión a antígeno del primer fragmento Fab y el anticuerpo biespecífico de la invención comprende tres fragmentos Fab conectados por enlazantes peptídicos en el siguiente orden sea desde la dirección a la o desde la dirección a la activador de Íinfocitos 2 en donde indica un fragmento Fab con un sitio de unión a antígeno específico para un antígeno tumoral y íinfocitos indica un fragmento Fab con un sitio de unión a antígeno específico para un antígeno activador de Íinfocitos en donde ya sea las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y ligera están En una el anticuerpo biespecífico comprende una porción que une antígeno que puede competir con el anticuerpo monoclonal V9 por unión a un epítopo de por Rodrigues et Int Cáncer Suppl 7 documento US incorporado en la presente como referencia en su En una el anticuerpo biespecífico comprende una porción que une antígeno que puede competir con el anticuerpo monoclonal FN18 por unión a un epítopo de Véase Nooij et Eur J Immunol 19 incorporado en la presente como referencia en su En una el anticuerpo biespecífico comprende una porción que une antígeno que puede competir con el anticuerpo monoclonal CH2527 ID 157 y 158 y variantes o una variante madurada por afinidad del mismo para unión a un epítopo de En una el anticuerpo biespecífico comprende un segundo fragmento Fab que se une específicamente a en donde la región variable de cadena pesada comprende una CDR de la SEC ID 10 o SEC ID una CDR2 de la SEC ID 11 o SEC ID 33 y una CDR3 de la SEC ID 11 o SEC ID y en donde la región variable de cadena ligera comprende una CDR1 de la SEC ID 7 o la SEC ID una CDR2 de la SEC ID 8 o SEC ID 30 y una CDR3 de la SEC ID 9o SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende un segundo fragmento Fab que se une específicamente a en donde la región variable de cadena pesada comprende una CDR1 de la SEC ID una CDR2 de la SEC ID 11 y una CDR3 de la SEC ID y en donde la región variable de cadena ligera comprende una CDR1 de la SEC ID una CDR2 de la SEC ID 8 y una CDR3 de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende un segundo fragmento Fab que se une específicamente a en donde la región variable de cadena pesada comprende una CDR1 de la SEC ID una CDR2 de la SEC ID 33 y una CDR3 de la SEC ID y en donde la región variable de cadena ligera comprende una CDR1 de la SEC ID una CDR2 de la SEC ID 30 y una CDR3 de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende un segundo fragmento Fab que se une específicamente a en donde la región variable de cadena pesada comprende una CDR1 de la SEC ID una CDR2 de la SEC ID 171 y una CDR3 de la SEC ID y en donde la región variable de cadena ligera comprende una CDR1 de la SEC ID una CDR2 de la SEC ID 175 y una CDR3 de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a en donde la secuencia de la región variable de cadena pesada es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID 20 o SEC ID en donde la secuencia de región variable de cadena ligera es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID 19 o SEC ID 35 o variantes de las mismas que retienen En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID 19 o variantes de las mismas que retienen En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID 35 o variantes de las mismas que retienen En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID 157 o variantes de la misma que retienen En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a en donde la secuencia de la región variable de cadena pesada es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID en donde la secuencia de región variable de cadena ligera es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID o variantes de la que retienen En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a en donde la secuencia de región variable de la cadena pesada es una variante madurada por afinidad de la SEC ID 158 y en donde la secuencia de región variable de cadena ligera es una variante madurada por afinidad de la SEC ID Las variantes maduradas por en esta significa que independientemente se intercambian 3 ó 4 aminoácidos de la SEC ID 158 de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada del segundo fragmento Fab que se une específicamente a en donde la cadena pesada comprende una región constante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 22 o la SEC ID 38 o variantes de las mismas que retienen En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a en donde la cadena pesada comprende una región constante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 22 o la SEC ID 38 y una cadena ligera y una cadena pesada del primer fragmento Fab específico para un antígeno tumoral que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las modalidades que aquí se En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada del segundo fragmento Fab que se une específicamente a en donde la cadena pesada comprende una región constante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a CD3 en donde la cadena pesada comprende una región constante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 22 y una cadena ligera y una cadena pesada del primer fragmento Fab específico para un antígeno tumoral que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las modalidades que aquí se En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a en donde la cadena ligera comprende una región constante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 21 o la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a en donde la cadena ligera comprende una región constante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 21 o la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para un antígeno tumoral que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las modalidades que aquí se En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a en donde la cadena ligera comprende una región constante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a en donde la cadena ligera comprende una región constante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para un antígeno tumoral que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las modalidades que aquí se En otra modalidad específica un anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a la cadena pesada comprende una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 22 o la SEC ID y la cadena ligera comprende una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 21 o la SEC ID En otra modalidad específica un anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a la cadena pesada comprende una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID y la cadena ligera comprende una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID En otra modalidad específica un anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a la cadena pesada comprende una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID y la cadena ligera comprende una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para un antígeno tumoral que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las modalidades que aquí se En una el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 19 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 22 y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 19 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 22 y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para un antígeno tumoral que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las modalidades que aquí se En una el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 35 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 38 y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 35 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 38 y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para un antígeno tumoral que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se determina en cualquiera de las modalidades que aquí se En una el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 173 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 38 y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 173 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 38 y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para un antígeno tumoral que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se determina en cualquiera de las modalidades que aquí se En una el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 157 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 22 y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 157 o una variante madurada por afinidad de la misma y una cadena pesada variable de la SEC ID o una variante madurada por afinidad de la misma y una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Las variantes maduradas por afinidad en esta modalidad significa que se intercambian independientemente 3 ó 4 aminoácidos de la SEC ID 158 la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 157 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para un antígeno tumoral que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se determina en cualquiera de las modalidades que aquí se En una el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 157 o una variante madurada por afinidad de la misma y una cadena pesada variable de la SEC ID 158 o una variante madurada por afinidad de la y una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 22 y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para un antígeno tumoral que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se determina en cualquiera de las modalidades que aquí se Las variantes maduradas por en esta significa que se intercambian independientemente 3 ó 4 aminoácidos de la SEC ID 158 SEC ID En una el antígeno tumoral se selecciona del grupo de proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma por sus siglas en receptor de factor de crecimiento epidérmico por sus siglas en el antígeno carcinoembriónico la proteína de activación de fibroblastos por sus siglas en y En una modalidad el antígeno tumoral es En una el anticuerpo biespecífico activador de linfocitos T comprende por lo menos un sitio que une antígeno que es específico para proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma En otra el anticuerpo biespecífico activador de linfocitos T comprende por lo menos y típicamente dos o más porciones que unen antígeno que pueden competir con anticuerpo monoclonal ML2 ID 161 y o una variante madurada por afinidad del mismo para unión a un epítopo de En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab que se une específicamente a en donde la cadena pesada variable comprende una CDR1 de la SEC ID una CDR2 de la SEC ID una CDR3 de la SEC ID y la cadena ligera variable comprende una CDR1 de la SEC ID una CDR2 de la SEC ID 2 y una CDR3 de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab que se une específicamente a en donde la cadena pesada variable comprende una CDR1 de la SEC ID una CDR2 de la SEC ID una CDR3 de la SEC ID 6 y la cadena ligera variable comprende una CDR1 de la SEC ID una CDR2 de la SEC ID 2 y una CDR3 de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab que se une específicamente a en donde la secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID y una región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab que se une específicamente a en donde la secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID y una región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab que se une específicamente a en donde la secuencia de región variable de cadena pesada es una variante madurada por afinidad de la SEC ID 161 y en donde la secuencia de región variable de cadena ligera es una variante madurada por afinidad de la SEC ID En esta las variantes maduradas por afinidad significan que se intercambian independientement 3 ó 4 aminoácidos de la SEC ID 161 SEC ID En una la variante madurada por afinidad comprende una cadena pesada variable que comprende una CDR1 de la SEC ID una CDR2 de la SEC ID una CDR3 de la SEC ID 6 una cadena ligera variable que comprende una CDR1 de la SEC ID una CDR2 de la SEC ID 2 y una CDR3 de la SEC ID En otra la variante madurada por afinidad comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de la SEC ID 179 y en donde la secuencia de región variable de cadena ligera es una variante madurada por afinidad de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab que se une específicamente a en donde la cadena pesada comprende una región constante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab que se une específicamente a en donde la cadena pesada comprende una región constante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 16 y una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab específico para CD3 que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las modalidades que aquí se En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab que se une específicamente a en donde la cadena ligera comprende una región constante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo anticuerpo que se une específicamente a en donde la cadena ligera comprende una región constante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 15 y una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab específico para CD3 que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las modalidades que aquí se En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab que se une específicamente a en donde la región constante de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab que se une específicamente a en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y en donde la región constante de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID En una modalidad el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 19 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 13 y una cadena pesada variable de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab que se une específicamente a en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y en donde la región constante de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID En una modalidad el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 19 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 161 y una cadena pesada variable de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab que se une específicamente a en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID 161 o una variante madurada por afinidad de la y una región variable cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID o una variante madurada por afinidad de la misma y en donde la región constante de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Las variantes maduradas por afinidad en esta modalidad significa que se intercambian independientemente 3 ó 4 aminoácidos de la SEC ID 161 la SEC ID En una modalidad el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 19 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 161 o una variante madurada por afinidad de la misma y una cadena pesada variable de la SEC ID 162 o una variante madurada por afinidad de la Las variantes maduradas por afinidad en esta modalidad significa que se han intercambiado independientemente 3 ó 4 aminoácidos de la SEC ID 161 la SEC ID En una modalidad el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 158 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 161 y una cadena pesada variable de la SEC ID En una modalidad el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 158 o una variante madurada por afinidad del mismo y una cadena pesada variable de la SEC ID 157 o una variante madurada por afinidad de la y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 161 o una variante madurada por afinidad de la misma y una cadena pesada variable de la SEC ID o una variante madurada por afinidad de la En esta las variantes maduradas por afinidad significan que se han intercambiado independientemente 3 ó 4 aminoácidos de una o más de las SEC ID SEC ID SEC ID 161 la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende un tercer fragmento Fab que comprende una cadena ligera y una cadena pesada que se une específicamente a en donde la cadena pesada variable comprende una CDR1 de SEC ID una CDR2 de SEC ID una CDR3 de SEC ID y la cadena ligera variable comprende una CDR1 de SEC ID una CDR2 de SEC ID 2 y una CDR3 de SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende un tercer fragmento Fab que comprende una cadena ligera y una cadena pesada que se une específicamente a en donde la secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID y una región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende un tercer fragmento Fab que comprende una cadena ligera y una cadena pesada que se une específicamente a en donde la secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID y una región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende un tercer fragmento que comprende una cadena ligera y una cadena pesada que se une específicamente a en donde la secuencia de región variable de cadena pesada es una variante madurada por afinidad de la SEC ID 161 y en donde la secuencia de región variable de la cadena ligera es una variante madurada por afinidad de la SEC ID En esta las variantes maduradas por afinidad significan que se han intercambiado independientemente 3 ó 4 aminoácidos de la SEC ID 161 SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende un tercer fragmento que comprende una cadena ligera y una cadena pesada que se une específicamente a en donde la cadena pesada comprende una región constante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende un tercer fragmento Fab que comprende una cadena ligera y una cadena pesada que se une específicamente a en donde la cadena pesada comprende una región constante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab específico para CD3 que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las modalidades que se describen en la presente y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las modalidades que aquí se En una el anticuerpo biespecífico comprende un tercer fragmento que comprende una cadena ligera y una cadena pesada que se une específicamente a en donde la cadena ligera comprende una región constante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo anticuerpo que se une específicamente a en donde la cadena pesada ligera comprende una región constante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab específico para y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para MCSP que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las modalidades que aquí se En una el anticuerpo biespecífico comprende un tercer fragmento que comprende una cadena ligera y una cadena pesada que se une específicamente a en donde la región constante de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una región constante de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende un tercer fragmento que comprende una cadena ligera y una cadena pesada que se une específicamente a en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y en donde la región constante de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende un tercer fragmento que comprende una cadena ligera y una cadena pesada que se une específicamente a en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y en donde la región constante de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende un tercer fragmento que comprende una cadena ligera y una cadena pesada que se unen específicamente a en donde la secuencia de región variable de cadena pesada es una variante madurada por afinidad de la SEC ID 161 y en donde la secuencia de región variable de cadena ligera es una variante madurada por afinidad de la SEC ID y en donde la región constante de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Las variantes maduradas por afinidad en esta modalidad significa que se intercambian independientemente 3 ó 4 aminoácidos de la SEC ID 161 la SEC ID En una modalidad el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 19 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 13 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un tercer fragmento Fab específico para que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 13 y una cadena pesada variable de la SEC ID En una modalidad el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 19 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 162 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un tercer fragmento Fab específico para que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 162 y una cadena pesada variable de la SEC ID En una modalidad el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 19 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 162 o una variante madurada por afinidad de la misma y una cadena pesada variable de la SEC ID 161 o una variante madurada por afinidad de la y una cadena ligera y una cadena pesada de un tercer fragmento Fab específico para que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 162 o una variante madurada por afinidad de la misma y una cadena pesada variable de la SEC ID 161 o una variante madurada por afinidad de la En esta las variantes maduradas por afinidad significan que se han intercambiado independientemente ó 4 aminoácidos de la SEC ID 161 SEC ID En una modalidad el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 157 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 162 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un tercer fragmento Fab específico para que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 162 y una cadena pesada variable de la SEC ID En una modalidad el anticuerpo biespecífico de la invención comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab que se une específicamente a que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 157 y una cadena pesada variable de la SEC ID y una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab específico para que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 162 o una variante madurada por afinidad de la misma y una cadena pesada variable de la SEC ID 161 o una variante madurada por afinidad de la y una cadena ligera y una cadena pesada de un tercer fragmento Fab específico para que comprende una cadena ligera variable de la SEC ID 162 o una variante madurada por afinidad de la misma y una cadena pesada variable de la SEC ID 161 o una variante madurada por afinidad de la En esta las variantes maduradas por afinidad significa que se intercambian independientemente 3 ó 4 aminoácidos de la SEC ID 161 SEC ID En otra modalidad el anticuerpo biespecífico comprende una o más secuencias de aminoácidos que se seleccionan del grupo de la SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID 41 y SEC ID En una el anticuerpo biespecífico comprende la SEC ID SEC ID SEC ID 26 y SEC ID En una modalidad el anticuerpo biespecífico comprende la SEC ID 163 y la SEC ID En una el anticuerpo biespecífico activador de linfocitos T comprende por lo menos un sitio que une antígeno que es específico para el receptor de factor de crecimiento epidérmico por sus siglas en En otra el anticuerpo biespecífico activador de linfocitos T comprende por lo menos típicamente dos o más porciones que unen antígeno que pueden competir con el anticuerpo monoclonal GA201 para unión a un epítopo de Véase la publicación WO incorporada en la presente como referencia en su En una el sitio que une antígeno que es específico para EGFR comprende una CDR1 de cadena pesada de la SEC ID la CDR2 de cadena pesada de la SEC ID la CDR3 de cadena pesada de la SEC ID la CDR1 de cadena ligera de la SEC ID la CDR2 de cadena ligera de la SEC ID 72 y la CDR3 de cadena ligera de la SEC ID En una modalidad el sitio que une antígeno que es específico para EGFR comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID 74 y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID o variantes de la misma que retienen En una modalidad el anticuerpo biespecífico comprende un primer fragmento Fab que comprende un sitio que une antígeno que es específico para EGFR que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID 74 y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID o variantes de las mismas que retienen y una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab específico para que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las modalidades que aquí se En una modalidad el anticuerpo biespecífico comprende un primero y un tercer fragmentos Fab que comprenden un sitio que une antígeno que es específico para EGFR que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID 74 y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID o variantes de las mismas que retienen y una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab específico para que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las modalidades que aquí se En una el anticuerpo biespecífico activador de linfocitos T comprende por lo menos un sitio que une antígeno que es específico para la proteína de activación de fibroblastos por sus siglas en En otra el anticuerpo biespecífico activador de linfocitos T comprende por lo menos típicamente dos o más porciones que unen antígeno que pueden competir con el anticuerpo monoclonal 3F2 por unión a un epítopo de Véase la solicitud de patente europea incorporada en la presente como referencia en su En una el sitio que une antígeno que es específico para FAP comprende la CDR1 de cadena pesada de la SEC ID la CDR2 de cadena pesada de la SEC ID la CDR3 de cadena pesada de la SEC ID la CDR1 de cadena ligera de la SEC ID la CDR2 de cadena ligera de la SEC ID 80 y la CDR3 de cadena ligera de la SEC ID En una modalidad el sitio que une antígeno que es específico para FAP comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID 82 y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID o variantes de las mismas que retienen En una modalidad el anticuerpo biespecífico comprende un primer fragmento Fab que comprende un sitio que une antígeno que es específico para FAP que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID 82 y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente ó idéntica a la SEC ID o variantes de las mismas que retienen y una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab específico para que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las modalidades que aquí se En una modalidad el anticuerpo biespecífico comprende un primero y un tercer fragmento Fab que comprende un sitio que une antígeno que es específico para FAP que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente o idéntica a la SEC ID 82 y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente o idéntica a la SEC ID o variantes de las mismas que retienen funcionalidad y una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab específico para CD3 que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las modalidades que aquí se En una el anticuerpo biespecífico que activa linfocitos T comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno que es específico para antígeno carcinoembriónico por sus siglas en En otra el anticuerpo biespecífico activante de linfocitos T comprende por lo menos típicamente dos o más porciones que unen antígeno que compiten con el anticuerpo monoclonal CH1A1A para unión a un epítopo de En una el anticuerpo biespecífico activante de linfocitos T comprende por lo menos típicamente dos o más porciones que unen antígeno que compiten con el anticuerpo monoclonal CH1A1A clon por unión a un epítopo de Véase el número de solicitud de patente incorporado en la presente como referencia en su En una el sitio que une antígeno que es específico para CEA comprende la CDR1 de cadena pesada de la SEC ID la CDR2 de cadena pesada de la SEC ID la CDR3 de cadena pesada de la SEC ID la CDR1 de cadena ligera de la SEC ID la CDR2 de cadena ligera de la SEC ID y la CDR3 de cadena ligera de la SEC ID En una modalidad el sitio que une antígeno que es específico para CEA comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente o idéntica a la SEC ID 90 o la SEC ID 159 y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente o idéntica a la SEC ID 91 o la SEC ID 160 o variantes de las mismas que retienen En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab que se une específicamente a en donde la región variable de cadena pesada comprende una variante madurada por afinidad de la SEC ID 159 o de la y una región variable de cadena ligera que comprende una variante madurada por afinidad de la SEC ID Las variantes maduradas por afinidad en esta modalidad significa que independientemente ó 4 aminoácidos de la SEC ID 159 de la SEC ID 160 se han En una modalidad el anticuerpo biespecífico comprende un primer fragmento Fab que comprende un sitio que une antígeno que es específico para CEA que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente o idéntica a la SEC ID 90 y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 99 o idéntica a la SEC ID 91 o variantes de las mismas que retienen y una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab específico para CD3 que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las modalidades descritas en la En una modalidad el anticuerpo biespecífico comprende un primer fragmento Fab que comprende un sitio que une antígeno que es específico para CEA que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente o idéntica a la SEC ID 159 y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente o idéntica a la SEC ID 160 o variantes de las mismas que retienen y una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab específico para CD3 que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las modalidades descritas en la En una el anticuerpo biespecífico comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un primer fragmento Fab que se une específicamente a en donde la región variable de cadena pesada comprende una variante madurada por afinidad de la SEC ID y una región variable de cadena ligera que comprende una variante madurada por afinidad de la SEC ID 160 y una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab especifico para CD3 que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se define en cualquiera de las modalidades descritas en la Las variantes maduradas por afinidad en esta modalidad significa que independientemente 3 4 aminoácidos de la SEC ID 159 la SEC ID 160 se han En una modalidad el anticuerpo biespecífico comprende un primero y un tercer fragmento Fab que comprende un sitio que une antígeno que es específico para CEA que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos o idéntica a la SEC ID 90 o SEC ID 159 y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente o idéntica a la SEC ID 91 o SEC ID 160 o variantes de la misma que retienen y una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab específico para CD3 que comprende una o más secuencias de como se define en cualquiera de las modalidades que aquí se Las variantes maduradas por afinidad en esta modalidad significan que independientemente 3 ó 4 aminoácidos de la SEC ID 159 la SEC ID 160 se han En una modalidad el anticuerpo biespecífico comprende un primero y un tercer fragmento Fab que comprende un sitio que une antígeno que es específico para en donde la región variable de cadena pesada comprende una variante madurada por afinidad de la SEC ID la región variable de cadena ligera comprende una variante madurada por afinidad de la SEC ID Las variantes maduradas por afinidad en esta modalidad significa que independientemente 3 ó 4 aminoácidos de la SEC ID 159 SEC ID 160 se han En una el anticuerpo biespecífico activante de linfocitos T comprende por lo menos un sitio que une antígeno que es específico para En una el sitio de unión a antígeno que es específico para CD33 comprende la CDR1 de cadena pesada de la SEC ID la CDR2 de cadena pesada de la SEC ID la CDR3 de cadena pesada de la SEC ID la CDR1 de cadena ligera de la SEC ID la CDR2 de cadena ligera de la SEC ID 96 y la CDR3 de cadena ligera de la SEC ID En una modalidad el sitio que une antígeno que es específico para CD33 comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente o idéntica a la SEC ID 98 y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente o idéntica a la SEC ID 99 o variantes de las mismas que retienen En una modalidad el anticuerpo biespecífico comprende un primer fragmento Fab que comprende un sitio que une antígeno que es específico para CD33 que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente o idéntica a la SEC ID 98 y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente o idéntica a la SEC ID 99 o variantes de la misma que retienen y una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo fragmento Fab específico para CD3 que comprende una o más secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las modalidades descritas en la En una modalidad el anticuerpo biespecífico activante de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es por lo menos aproximadamente o idéntica a una secuencia que se selecciona del grupo de la SEC ID SEC ID 101 y SEC ID En una el anticuerpo biespecífico activante de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es por lo menos aproximadamente oo idéntica a una secuencia que se selecciona del grupo de la SEC ID 151 SEC ID 152 y SEC ID En otra modalidad el anticuerpo biespecífico comprende una o más secuencias de aminoácidos que se seleccionan del grupo de la SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID 152 y SEC ID En una modalidad de la el anticuerpo biespecífico es una anticuerpo como se detalla más En otra modalidad de la el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo como se detalla más En un segundo objetivo la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico de la presente En un tercer la presente invención se relaciona con un anticuerpo biespecífico de la presente invención para el tratamiento de En otra se proporciona el uso del anticuerpo biespecífico como un el uso es para el tratamiento de En objetivos adicionales la presente invención se relaciona con una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica para una cadena pesada de un anticuerpo biespecífico de la presente una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica para una cadena ligera de un anticuerpo biespecífico de la presente un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de la presente invención y con una célula hospedadora procariótica o eucariótica que comprende un vector de la presente Además se proporciona un método para producir un anticuerpo que comprende el cultivo de células hospedadoras de manera que el anticuerpo se En una modalidad adicional se proporciona un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo biespecífico de la invención y un agente En objetivos adicionales de la presente invención se relaciona con una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica para una cadena pesada de un anticuerpo biespecífico de la presente una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica para una cadena ligera de un anticuerpo biespecífico de la presente un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de la presente invención y con una célula hospedadora procariótica o eucariótica que comprende un vector de la presente se proporciona un método para producir un anticuerpo que comprende cultivar la célula hospedadora de manera que se produzca el En una modalidad el anticuerpo biespecífico activante de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es por lo menos aproximadamente o idéntica a una secuencia que se selecciona del grupo de la SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID 66 y SEC ID En una modalidad el anticuerpo biespecífico activador de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es por lo menos aproximadamente o idéntica a una secuencia que se selecciona del grupo de la SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID 111 y SEC ID En una modalidad el anticuerpo biespecífico activador de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es por lo menos aproximadamente o idéntica a una secuencia que se selecciona del grupo de la SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID 119 y SEC ID En una modalidad el anticuerpo biespecífico activador de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es por lo menos aproximadamente o idéntica a una secuencia que se selecciona del grupo de la SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID 125 SEC ID SEC ID 127 y SEC ID En una modalidad el anticuerpo biespecífico que activa linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es por lo menos aproximadamente o idéntica a una secuencia que se selecciona del grupo de la SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID 135 y SEC ID En una modalidad el anticuerpo biespecífico activador de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es por lo menos aproximadamente o idéntica a una secuencia que se selecciona del grupo de la SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID SEC ID 155 y SEC ID En una modalidad el anticuerpo biespecífico activador de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es por lo menos aproximadamente o idéntica a una secuencia que se selecciona del grupo de la SEC ID 165 y SEC ID En un aspecto un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede incorporar cualquiera de los solos o en como se describe en las secciones 1 a 5 a AFINIDAD DE ANTICUERPO La afinidad del anticuerpo biespecífico que se proporciona en la presente para un antígeno objetivo se puede determinar de acuerdo con los métodos que se establecen en los ejemplos mediante resonancia de plasmón de superficie utilizando instrumentación estándar tal como instrumento BIAcore y receptores de proteínas objetivo tales como las que se pueden obtener por expresión De manera la unión de anticuerpos biespecíficos para diferentes receptores o antígenos objetivo se puede evaluar utilizando líneas de células que expresan el receptor o antígeno objetivo por ejemplo por citometría de flujo En ciertas un anticuerpo biespecífico proporcionado en la presente tiene una constante de disociación de 1 100 10 1 o nM 108M o por de 108 M a por de M a 1013 De acuerdo con una KD se mide utilizando análisis de resonancia de plasmón de superficie utilizando los equipos o un a con chips CM5 de antígeno inmovilizado a 10 unidades de respuesta por sus siglas en se activan chips de biosensor de dextrano carboximetilado con clorhidrato de y de acuerdo con las instrucciones del El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 pH a 5 antes de inyección a un caudal de 5 para obtener aproximadamente 10 unidades de respuesta de proteína Después de la inyección de se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han Para mediciones diluciones seriadas dobles de Fab nM a 500 se inyectan en PBS con polysorbate 20 de tensioactivo a a un caudal de aproximadamente 25 Las velocidades de asociación y y las velocidades de disociación o se calculan utilizando el modelo de unión de Langmuir uno a uno simple de evaluación versión mediante ajuste simultáneo de los sensogramas de asociación y de La constante de disociación al equilibrio se calcula como la relación por Chen et Mol Biol Si la velocidad de activación excede 106 por el análisis de resonancia de plasmón de superficie entonces la velocidad de activación se puede determinar utilizando una téenica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia 295 emisión 340 paso de banda 16 a de un anticuerpo 20 nM en pH en presencia de concentraciones en aumento de antígeno medido en un tal como un espectrofotómetro equipado con detección de flujo o un espectrofotómetro serie 8000 con una cubeta ANTICUERPOS QUIMÉRICOS Y HUMANIZADOS En ciertas un anticuerpo biespecífico proporcionado en la presente es un anticuerpo Ciertos anticuerpos quiméricos se por en la patente y Morrison et Nati Sci En un un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana una región variable derivada de rata conejo o un primate no humano tal como un y una región constante En un ejemplo un anticuerpo quimérico es un anticuerpo de en el cual la clase o subclase ha sido cambiada con respecto al del anticuerpo Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de los mismos que unen En ciertas un anticuerpo quimérico es un anticuerpo un anticuerpo no humano es humanizado para reducir inmunogenicidad a humanos mientras se retiene la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano De modo un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los cuales las por ejemplo las CDR porciones de las se derivan de un anticuerpo no humano y las FR porciones de las se derivan de secuencias de anticuerpo Un anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante En algunas algunos residuos FR en un anticuerpo humanizado están sustituidos con residuos correspondientes de un anticuerpo no humano el anticuerpo del cual se derivan los residuos por para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad de Los anticuerpos humanizados y métodos para su elaboración se por en Almagro y Front Biosci y se describen por en Riechmann et Nature Queen et Proc Nat USA patentes y Kashmiri et Methods describen injertado de SDR Mol Immunol describen de et Methods describe de y Osbourn et Methods y Klimka et describe el enfoque de para barajado Las regiones de infraestructura humana para humanización incluyen pero no se limitan regiones de infraestructura que se seleccionan utilizando el método de por Sims et Immunol 2296 regiones de infraestructura derivada de la secuencia de consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular o regiones variable de cadena ligera o pesada por Cárter et Nati Sci 4285 y Presta et Immunol 2623 regiones de infraestructura maduras humanas de regiones de infraestructura de línea germinal humana por Almagro y Front Biosci y regiones de infraestructura derivadas de cribado de bibliotecas de FR por Baca et Biol 10684 y Rosok et Biol 271 ANTICUERPOS HUMANOS En ciertas un anticuerpo biespecífico proporcionado en la presente es un anticuerpo Los anticuerpos humanos se pueden producir utilizando diversas téenicas conocidas en el Los anticuerpos humanos se describen de manera general en van Dijk y van de Opin Pharmacol y Immunol Los anticuerpos humanos se pueden preparar al administrar un inmunógeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a exposición Estos animales habitualmente contendrán la totalidad o una porción de los loci de inmunoglobulina humana los cuales sustituyen los loci de inmunoglobulina endógena o los cuales están presentes extracromosómicamente o integrados aleatoriamente en los cromosomas de los En estos ratones los loci de inmunoglobulina endógenos han sido inactivados de manera Para una revisión de los métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de animales transgénicos véase Na t Véanse por las patentes y que describen la teenología la patente que describe la tecnología la patente que describe la tecnología M0USEMR y la publicación de solicitud de patente US que describe la tecnología Las regiones variables humanas a partir de anticuerpos intactos generadas por estos animales se pueden modificar por al combinar con una región constante humana Los anticuerpos humanos también se pueden elaborar por métodos basados en El mieloma humano y las líneas de células de heteromieloma para la producción de anticuerpos monoclonales humanos ya han sido descritas por Kozbor Immunol 3001 Brodeur et Monoclonal Antibody Production Techniques and New y Boerner et Immunol 86 Los anticuerpos humanos generados por medio de teenología de hibridoma de linfocitos B humanos también se han descrito en Li et Proc Nati Sci Los métodos adicionales incluyen aquellos por en la patente describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales a partir de líneas de células de y Xiandai describe hibridomas La tecnología de hibridoma humano también se describe en Vollmers y Histology and y Vollmers y Methods and Findings in Experimental and Clinical Los anticuerpos humanos también se pueden generar por aislamiento de las secuencias de dominio variable del clon Fv que se seleccionan de bibliotecas de presentación de fago derivadas de Estas secuencias de dominio variable después se pueden combinar con un dominio constante humano Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de anticuerpo se describen más ANTICUERPOS DERIVADOS DE BIBLIOTECA Los anticuerpos biespecíficos de la invención se pueden aislar mediante cribado de bibliotecas combinatorias para anticuerpos con la actividad o las actividades Por se conocen en el ámbito una diversidad de métodos para generar bibliotecas de presentación de fago y cribado de estas bibliotecas para anticuerpos que presentan las características de unión Estos métodos se por en Hoogenboom et en Methods in Molecular Biology et Human y se describen por en McCafferty et Nature Clackson et Nature Marks et Mol Biol Marks y en Methods in Molecular Biology Human Sodhu et Mol Biol Lee et Mol Biol Proc Nati Sci USA 101 y Lee et Immunol Methods En ciertos métodos de presentación de los repertorios de los genes VH y VL se clonan por separado mediante reacción en cadena de polimerasa por sus siglas en y se recombinan aleatoriamente en bibliotecas de fagos las cuales después pueden ser cribadas para fago que una como se describe en Winter et Immunol 12 El fago habitualmente muestra fragmentos de ya sea como fragmentos Fv de cadena sencilla por sus siglas en o como fragmentos Las bibliotecas a partir de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad al inmunógeno sin el requerimiento de construir De manera el repertorio previamente no expuesto se pueden clonar a partir de para proporcionar una fuente única de anticuerpos a una amplia gama de antígenos no propios y también propios sin inmunización como se describe por Griffiths et EMBO bibliotecas previamente no expuestas también se pueden elaborar de manera sintética por clonación de segmentos de gen V no rearreglados a partir de y utilización de cebadores de que contengan secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para llevar a cabo el rearreglo in como se describe por Hoogenboom y Mol Biol Las publicaciones de patente que describen bibliotecas de fago de anticuerpo humano por la patente US y las publicaciones de patentes US y Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos aislados de bibliotecas de anticuerpos de humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos en la VARIANTES DE ANTICUERPOS En ciertas las variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos biespecífíeos que se proporcionan en la presente se Por puede ser deseable mejorar la afinidad otras propiedades biológicas del anticuerpo Las variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo biespecífico se pueden preparar al introducir modificaciones apropiadas dentro de la secuencia de nucleótidos que codifican para el anticuerpo biespecífico o por síntesis Estas modificaciones por supresiones inserciones dentro sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del Cualquier combinación de inserción y sustitución se puede llevar a cabo para llegar a la construcción final con la condición de que la construcción final presente las características por unión a Variantes por Inserción y Supresión En ciertas modalidades se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones de Los sitios de interés para mutagénesis en sustitutiva incluyen las HVR y Las sustituciones conservadoras se muestran en la tabla 2 bajo el encabezado de Los cambios más sustanciales se proporcionan en la tabla 2 bajo el encabezado de y como se describen adicionalmente en lo siguiente con referencia a las clases de cadena laterales de Las sustituciones de aminoácidos se pueden introducir en un anticuerpo de interés y los productos cribados para una actividad por ejemplo unión a antigeno o inmunogenicidad TABLA 2 Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con las propiedades comunes de la cadena residuos que influyen en la orientación de Las sustituciones no conservadoras implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otro de otra Un tipo de variante de sustitución involucra sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original un anticuerpo humanizado o una o varias de las variantes resultantes seleccionadas para estudio adicional tendrán modificaciones en ciertas propiedades biológicas afinidad inmunogenicidad en relación al anticuerpo original tendrán ciertas propiedades biológicas retenidas sustancialmente del anticuerpo Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado por afinidad el cual puede ser generado por utilizando téenicas de maduración por afinidad basadas en presentación de fago tal como los que aquí se uno o más de los residuos HVR son mutados y los anticuerpos variantes se presentan en fago y se criban para una actividad biológica particular afinidad de Las alteraciones se pueden realizar en las por para mejorar la afinidad de Estas alteraciones se pueden realizar en los de es residuos codificados por codones que experimentan mutaciones con alta frecuencia durante un proceso de maduración somático por Methods Mol Biol los SDR con la variante resultante VH o VL probada para afinidad de La maduración por afinidad al construir y reseleccionar a partir de bibliotecas secundarias se ha por en Hoogenboom et en Methods in Molecular Biology et Human En algunas modalidades de maduración por se introduce diversidad en los genes variables seleccionados para maduración por cualquiera de una diversidad de métodos PCR susceptible a barajado de cadena o mutagénesis dirigida a De esta manera se genera una biblioteca La biblioteca después se criba para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad Otro método para introducir diversidad involucra enfoques dirigidos a HVR en los cuales varios residuos de HVR 4 a 6 residuos a la son Los residuos HVR involucrados en la unión antígeno pueden ser identificados por utilizando mutagénesis de exploración con alanina o y en particular con frecuencia son el En ciertas pueden producirse inserciones o supresiones dentro de uno o más HVR en la medida en que estas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unir Por alteraciones conservadoras sustituciones conservadoras como se proporcionan en la no reducen sustancialmente la afinidad de unión y pueden realizarse en Estas alteraciones pueden estar fuera de los de HVR o En ciertas modalidades de las secuencias VH y VL variantes proporcionadas en lo cada HVR se ya sin alteración o contiene no más de dos o tres sustituciones de Un método útil para identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que pueden ser el objetivo para mutagénesis se denomina de exploración con como se describe por Cunningham y Wells En este un residuo o grupo de residuos objetivo ejemplo residuos cargados tales como lys y se identifican y sustituyen por aminoácidos neutros o cargados negativamente alanina o para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se Sustituciones adicionales se pueden introducir en las ubicaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones De manera alternativa o una estructura cristalina de un complejo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el Estos residuos de contacto y residuos aledaños pueden ser dirigidos o eliminados como candidatos para Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en la parte que varían en longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más así como inserciones intrasecuencia de residuos aminoácidos únicos o Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión de la parte o del anticuerpo a una enzima para o un polipéptido el cual incrementa la vida media sérica del Variantes de anticuerpo manipuladas con cisteína En ciertas puede ser deseable crear anticuerpos biespecífíeos manipulados con por ejemplo los en los cuales uno o más residuos de un anticuerpo biespecífico están sustituidos con residuos En modalidades los residuos sustituidos se presentan en sitios accesibles del anticuerpo Al sustituir estos residuos con los grupos tiol reactivos de esta manera se colocan en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden utilizar para conjugar el anticuerpo a otras tales como porciones de fármacos o porciones de fármaco enlazante para crear un como se describe de manera adicional en la En ciertas cualquiera de uno o más de los siguientes residuos pueden estar sustituidos con V205 de de la cadena ligera y A118 de la cadena Los anticuerpos manipulados con cisteína se pueden generar como se por en la patente de Derivados de anticuerpo En ciertas un anticuerpo biespecífico proporcionado en la presente se puede modificar adicionalmente para contener porciones no proteináceas adicionales que son conocidas en el ámbito y están disponibles Las porciones adecuadas para formación de derivados del anticuerpo biespecífico incluyen pero no se limitan a polímeros Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles pero no se limitan a polietilenglicol copolímeros de alcohol copolímero de poliaminoácidos sea homopolímeros o copolímeros y dextrano o homopolímeros de copolímeros de óxido de de polioles polioxietilados alcohol polivinílico y mezclas de los El polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas en la elaboración debido a su estabilidad en El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o sin El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y si se une más de un pueden ser moléculas iguales o En el número tipo de polímeros utilizados para la formación de derivados se puede determinar en base en consideraciones que incluyen pero que no se limitan a las propiedades particulares o funciones del anticuerpo que se va a si el derivado de anticuerpo se utilizara en un tratamiento bajo condiciones En otra los conjugados de un anticuerpo biespecífico y la porción no proteinácea que se pueden calentar selectivamente por exposición a radiación se En una la porción no proteinácea es un nanotubo de carbono et Nati Sci USA La radiación puede ser de cualquier longitud de onda e pero no se limita a longitudes de onda que no dañan células pero la cual calienta la porción no proteinácea a una temperatura a la cual las células próximas a la porción no proteinácea del anticuerpo son Métodos y composiciones Los anticuerpos biespecífíeos de la invención se pueden por por síntesis peptídica en estado sólido síntesis en fase sólida de o producción Para producción uno o más de los polinucleótidos que codifican para el anticuerpo biespecífico por como se describe en lo se aísla e inserta en uno o más vectores para clonación expresión adicional en una célula Este polinucleótido se puede aislar con facilidad y secuenciar utilizando procedimientos En una modalidad un preferiblemente un vector de expresión que comprende uno o más de los polinucleótidos de la invención se Los métodos los cuales son bien conocidos por aquellos expertos en el ámbito se pueden utilizar para construir vectores de expresión que contengan la secuencia codificante de un anticuerpo biespecífico junto con las señales de control Estos métodos incluyen téenicas de ADN recombinante in técnicas sintéticas y recombinación in por las técnicas descritas en Maniatis et MOLECULAR A LABORATORY MANUAL Coid Spring Harbor y Ausubel et CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR Greene Publishing Associates and El vector de expresión puede ser parte de un virus o puede ser un fragmento de ácido El vector de expresión incluye un casete de expresión en el cual el polinucleótido que codifica para el anticuerpo biespecífico la región es clonado en asociación operable con un promotor otros elementos de control de transcripción o de Como se utiliza en la una es una porción de ácido nucleico la cual consiste de codones traducidos en Aunque un de TGA o no se traduce en un se puede considerar que es parte de una región si está pero cualquier secuencia por sitios de unión de terminadores regiones no traducidas y y similares no son parte de una región Pueden estar presentes dos o más regiones codificantes en una construcción polinucleotídica por sobre un vector único o en construcciones polinucleotídicas por ejemplo sobre vectores separados el vector puede contener una región codificante única o puede comprender dos o más regiones por un vector de la presente invención puede codificar para uno o más los cuales están separados o en las proteínas finales por medio de escisión el polinucleótido o ácido nucleico de la invención puede codificar para regiones codificantes ya sea fusionadas o no fusionadas a un polinucleótido que codifica para un anticuerpo específico de la o variante o derivado del Los regiones codificantes heterólogas sin elementos o motivos especializados tales como un péptido de señal secretora o un dominio funcional Una asociación operable es cuando una región codificante de un producto de por ejemplo un se asocia con una o más secuencias reguladoras de manera tal que coloca expresión del producto de gen bajo la influencia o control de una o varias secuencias Dos fragmentos de ADN como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado con la están si la inducción de la función de promotor resulta en la transcripción de ARNm que codifica para el producto de gen deseado y si la naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de expresión para dirigir la expresión del producto de gen o interferir con la capacidad de una plantilla de ADN para ser una región promotora puede estar asociado operablemente con un ácido nucleico que codifica para un polipéptido si el promotor es capaz de llevar a cabo la transcripción del ácido El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirige transcripción sustancial del ADN únicamente en células Otros elementos de control de además de un por represores y señales de terminación de transcripción pueden estar asociados operablemente con el polinucleótido para dirigir transcripción específica de Los promotores adecuados y otras regiones de control de transcripción se describen en la Se conocen por los expertos en el ámbito una diversidad de regiones de control de Estas sin regiones de control de transcripción las cuales funcionan en células de vertebrados tales pero sin limitarse a segmentos promotores y mejoradores a partir de citomegalovirus el promotor temprano junto con el virus simio 40 el promotor y retrovirus por virus de sarcoma de Otras regiones de control de transcripción incluyen aquellas derivadas de genes vertebrados tales como proteína de choque hormona del crecimiento bovina y globina a de conejo así como otras secuencias capaces de controlar la expresión de genes en células Las regiones de control de transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores específicos de tejido y mejoradores así como promotores inducibles ejemplo tetracielinas inducibles por De modo una diversidad de elementos de control de traducción se conocen por aquellos habitualmente expertos en el Estas pero no se limitan a sitios de unión a codones de inicio y de terminación de traducción y elementos derivados de sistemas virales un sitio de entrada de ribosoma o sus siglas en también denominado como una secuencia El casete de expresión también puede incluir otros rasgos tales como un origen de replicación elementos de integración de cromosoma tales como secuencias repetidas terminales largas por sus siglas en retrovirales o secuencias repetidas terminales invertidas por sus siglas en virales por sus siglas en Las regiones codificantes polinucleotídicas y de ácido nucleico de la presente invención se pueden asociar con regiones codificantes adicionales las cuales codifican para péptidos secretores o péptidos los cuales dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente Por si la secreción de la molécula de unión antígeno biespecífica se se puede colocar ADN que codifique para una secuencia de señal hacia el extremo del ácido nucleico que codifica para un anticuerpo biespecífico de la invención o un fragmento del De acuerdo con la hipótesis de las proteínas secretadas por células de mamífero tienen un péptido señal o secuencia líder secretora la cual es escindida de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo endoplásmico Los expertos en el ámbito tendrán conocimiento de que los polipéptidos secretados por células de vertebrados generalmente tienen un péptido señal fusionado a la parte del el cual se escinde del polipéptido traducido para producir una forma secretada o del En ciertas el péptido señal por ejemplo un péptido señal de cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina se o un derivado funcional de esa secuencia que retiene la capacidad para dirigir la secreción del polipéptido que está asociado operablemente al De manera un péptido señal de mamífero heterólogo o un derivado funcional del mismo se pueden Por una secuencia líder de tipo silvestre puede ser sustituida con una secuencia líder de activador de plasminógeno de tejido humano por sus siglas en de de El ADN que codifica para una secuencia de proteína corta que puede ser utilizada para facilitar purificación posterior una etiqueta o para ayudar en el marcado del anticuerpo biespecífico se pueden incluir dentro o en los extremos de un polinucleótido que codifica para el anticuerpo En una modalidad adicional se proporciona una célula hospedadora que comprende uno o más polinucleótidos de la En ciertas se proporciona una célula hospedadora que comprende uno o más vectores de la Los polinucleótidos y vectores pueden incorporar cualquiera de los solos o en combinación descritos en la presente con relación con polinucleótidos y En una de estas modalidades una célula hospedadora comprende ha sido transformada o transfectada un vector que comprende un polinucleótido que codifica un anticuerpo biespecífico de la Como se utiliza en la el término se refiere a cualquier clase de sistema celular el cual puede ser manipulado para generar los anticuerpos biespecífíeos de la invención o fragmentos de los Las células hospedadoras adecuadas para replicación y para soportar la expresión de anticuerpos biespecífíeos son bien conocidas en el Estas células se pueden transfectar o someter a traducción según sea apropiado con el vector de expresión particular y grandes cantidades de células que contienen el vector se pueden hacer crecer para la siembra en termentadores a gran escala para obtener cantidades suficientes del anticuerpo biespecífico para aplicaciones Las células hospedadoras adecuadas incluyen microorganismos procarióticos tales como E coli o diversas células eucarióticas tales como células de ovario de hámster chino células de insecto o Por se pueden producir polipéptidos en bacterias en particular cuando no se necesita Después de la el polipéptido se puede aislar de una pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar Además de los microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levaduras son hospedadores de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican para polipéptidos que incluyen hongos y cepas de levadura cuyas vías de glucosilación han sido lo que resulta en la producción de un polipéptido con un patrón de glucosilación parcial o completamente Véase Nat Biotech 1414 y Li et Nat Biotech Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de polipéptidos también se derivan de organismos multicelulares y Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e Se han identificado numerosas cepas baculovirales las cuales se pueden utilizar junto con las células de particularmente para transfección de células de Spodoptera También se han utilizado como hospedadores cultivos de células por las patentes y describen la teenología para producir anticuerpos en plantas Las células de vertebrado también se pueden utilizar como Por pueden ser útiles líneas de células de mamífero que están adaptadas para crecer en Otros ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 línea de riñón embriónico humano 293 ó 293T como se por en Graham et J Gen Virol 59 células de riñón de hámster bebé por sus siglas en células de sertoli de ratón de TM4 como se por en Reprod células de riñón de mono células de riñón de mono verde Africano células de carcinoma cervical humano células de riñón de perro células de hígado de rata búfalo células de pulmón humano células de hígado humano células de tumor mamario humano células TRI se por ejemplo en Mather et Annals Acad Sci células 5 y células Otras líneas de células de hospedador de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino por sus siglas en que incluyen células CHO et Proc Nati Acad Sci USA 4216 y líneas de células de mieloma tales como P3X63 y Para una revisión de ciertas líneas de células de hospedador de mamífero adecuadas para producción de proteínas por Yazaki y Methods in Molecular Humana Las células hospedadoras incluyen células por ejemplo células cultivadas de células de células de células bacterianas y células vegetales solo por mencionar pero también células comprendidas dentro de un animal una planta transgénica o una planta cultivada o un tejido En una la célula hospedadora es una célula preferiblemente una célula de mamífero tal como célula de ovario de hámster chino células de riñón embriónico humana o una célula linfoide ejemplo células Las teenologías estándar se conocen en el ámbito para expresar genes extraños en estos Las células que expresan un polipéptido que comprende ya sea la cadena pesada o la ligera de un dominio que une antígeno tal como un anticuerpo se pueden manipular de manera que expresen la otra de las cadenas de anticuerpo de manera tal que el producto expresado sea un anticuerpo que tiene tanto una cadena pesada y una En una se proporciona un método para producir un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la en donde el método comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un polinucleótido que codifica para el anticuerpo como se proporciona en la bajo condiciones adecuadas para la expresión de la molécula que une antígeno y recuperar el antígeno biespecífico de la célula hospedadora medio de cultivo de células Los componentes del anticuerpo biespecífico se fusionan genéticamente entre Se puede diseñar un anticuerpo biespecífico de manera que sus componentes estén fusionados directamente entre o indirectamente a través de una secuencia La composición y longitud de un enlazante se pueden determinar de acuerdo con métodos bien conocidos en el ámbito y se pueden probar para determinar su Los ejemplos de secuencias enlazantes entre diferentes componentes de anticuerpos biespecíficos se encuentran en las secuencias que se proporcionan en este Las secuencias adicionales también se pueden incluir para incorporar un sitio de escisión para separar los componentes individuales de la fusión si así se por ejemplo una secuencia de reconocimiento de En ciertas una o más de las porciones de unión a antígeno de los anticuerpos biespecíficos comprende por lo menos una región variable de anticuerpo capaz de unirse a un determinante Las regiones variables pueden formar parte y se pueden derivar de anticuerpos que se produzcan de manera natural o de modo no natural y fragmentos de los Los métodos para producir anticuerpos policlonales y anticuerpo monoclonales son bien conocidos en el ámbito por Harlow y a laboratory Coid Spring Harbor Los anticuerpos que no se presentan de modo natural se pueden construir utilizando síntesis de péptido en fase se pueden producir de modo recombinante como se describe en la patente o se pueden por mediante cribado de bibliotecas combinatorias que comprendan cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables por la patente para Cualquier especie animal de fragmento de dominio que une antígeno o región variable se puede utilizar en los anticuerpos biespecíficos de la Los anticuerpos no fragmentos de dominios de unión a antígeno o regiones variables útiles en la presente invención pueden ser de origen de primate o Si el anticuerpo está destinado para uso se puede usar una forma quimérica de anticuerpo en donde las regiones constantes del anticuerpo son de un Una forma humanizada o completamente humana del anticuerpo también se puede preparar de acuerdo con métodos bien conocidos en el ámbito por la patente para La humanización se puede obtener por diversos métodos que pero que no se limitan injertado de CDR no humanas del anticuerpo sobre una infraestructura humana un anticuerpo y regiones constantes con o sin retención de residuos de infraestructura críticos aquellos que son importantes para retener buena afinidad de unión a antígeno o funciones de injertado únicamente de regiones determinadoras de especificidad no humanas o los residuos críticos para la interacción sobre una infraestructura humana y regiones o transplantar la totalidad de los dominios variables de pero con una sección similar a humana mediante sustitución de los residuos de Los anticuerpos humanizados y métodos para su elaboración se por en Almagro y Front Biosci y se describen por en Riechmann et Nature Queen et Proc Nati Acad Sci USA patentes de Estados Unidos y Jones et Nature Morrison et Proc Nati Acad Sci Morrison y Adv Immunol et Science Molec Kashmiri et Methods describe injertos de SDR Mol Immunol describe de et Methods describe de y Osbourn et Methods y Klimka et Br J Cáncer describen el enfoque de para barajado de Los anticuerpos humanos y las regiones variables humanas se pueden producir utilizando diversas téenicas conocidas en el Los anticuerpos humanos se describen de manera general en van Dijk y van de Curr Opin Pharmacol y Curr Opin Immunol Las regiones variables humanas pueden formar parte y pueden derivarse de anticuerpos monoclonales humanos elaborados por el método de hibridoma por Monoclonal Antibody Production Techniques and New Los anticuerpos humanos y las regiones variables humanas también se pueden preparar por administración de un inmunógeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a exposición antigénica por Nat Biotech Los anticuerpos humanos y las regiones variables humanas también se pueden generar por aislamiento de secuencias de región variable de clon Fv que se seleccionan de bibliotecas de presentación de fago derivadas de humano por Hoogenboom et en Methods in Molecular Biology et human y McCafferty et Nature Clackson et Nature Los fagos típicamente presentan fragmentos de ya sea como fragmentos Fv de cadena sencilla por sus siglas en o como fragmentos En ciertas los anticuerpos biespecífíeos de la presente invención son manipulados para presentar afinidad de unión mejorada de por con los métodos descritos en la publicación de solicitud de patente el contenido completo de la cual se incorpora en la presente como La capacidad del anticuerpo biespecífico de la invención para unirse a un determinante antigénico específico se puede medir ya sea mediante un análisis inmunosorbente unido a enzima pro sus siglas en u otras téenicas familiares para aquellos expertos en el por la técnica de resonancia de plasmón de superficie en un sistema BIACORE et Glyco J y los análisis de unión tradicionales Endocr Res Los análisis de competencia se pueden utilizar para identificar un fragmento de dominio que une antígeno o dominio variable que compite con un anticuerpo de referencia por la unión a un antígeno por ejemplo un anticuerpo que compite con el anticuerpo V9 por la unión a CD3 En ciertas tal anticuerpo de competencia se une al mismo epítopo un epítopo lineal o que es unido por el anticuerpo de Los métodos ejemplares detallados para elaboración de mapas de un epítopo al cual se une el anticuerpo se proporcionan en Morris Mapping en Methods in Molecular Biology 66 En un análisis de competencia el antígeno inmovilizado se incuba en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une al antígeno el anticuerpo y un segundo anticuerpo sin marcar que es probado para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo por la unión al El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de Como un se incuba un antígeno inmovilizado en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo sin Después de incubación bajo condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo con el se elimina el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de marca asociada con el antígeno Si la cantidad de marca asociada con el antígeno inmovilizado se reduce sustancialmente en la muestra de prueba en relación a la muestra entonces esto indica que el segundo anticuerpo compite con el primer anticuerpo por unión al Véase Harlow y Lañe A Laboratory Manual 14 Spring Harbor Coid Spring Los anticuerpos biespecíficos preparados como se describe en la presente se pueden purificar por téenicas conocidas en el ámbito tales como cromatografía líquida de alta cromatografía de intercambio electroforesis en cromatografía de cromatografía de exclusión de tamaño y Las condiciones actuales utilizadas para purificar una proteína particular en de factores tales como la carga y serán evidentes para aquellos con habilidad en la Para purificación por cromatografía de afinidad de un el receptor o el antígeno se pueden utilizar a los cuales se une el anticuerpo Por para purificación por cromatografía de afinidad del anticuerpo biespecífico de la invención se puede utilizar una matriz con proteína A o proteína La cromatografía secuencial por afinidad en proteína A o G y la cromatografía de exclusión de tamaño se pueden utilizar para aislar un anticuerpo biespecífico esencial como se describe en los La pureza de los anticuerpos biespecífíeos se puede determinar por cualquiera de una diversidad de métodos analíticos bien conocidos que incluyen electroforesis en cromatografía líquida de alta presión y ANÁLISIS Los anticuerpos biespecíficos que se proporcionan en la presente se pueden buscar por cribado o caracterizar a partir de sus propiedades actividades biológicas por diversos análisis conocidos en el Análisis de unión y otros análisis En un un anticuerpo biespecífico de la invención se prueba para determinar su actividad de unión a por por métodos conocidos tales como transferencia En otro se pueden utilizar análisis de competencia para identificar un anticuerpo que compite con un anticuerpo específico por unión al primero o segundo En ciertas tal anticuerpo que compite se une al mismo epítopo un epítopo lineal o uno que se une por medio de un anticuerpo Los métodos ejemplares detallados de mapeo de un epítopo al cual se une un anticuerpo se proporcionan en Morris Mapping en Methods in Molecular Biology Análisis de actividad En un se proporcionan análisis para identificar anticuerpos biespecíficos de los mismos que tienen actividad La actividad biológica puede por lisis de células o inducción de Los anticuerpos que tienen esta actividad biológica in vivo in vitro también se En ciertas un anticuerpo biespecífico de la invención se prueba para tal actividad Los análisis para detectar lisis celular por medición de liberación de o apoptosis ejemplo utilizando el análisis son bien conocidos en el INMUNOCONJUGADOS La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo biespecífico de la invención conjugado a uno o más agentes tales como agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores de toxinas toxinas toxinas enzimáticamente activas de origen vegetal o animal o fragmentos de las o isótopos En una un inmunoconjugado es un conjugado de por sus siglas en en el cual un anticuerpo se conjuga a uno o más que incluyen pero que no se limitan a un las patentes y la patente Europea EP 0 425 235 una auristatina tal como porciones de fármaco de monometilauristatina DE y DF y las patentes y y una una caliqueamicina o un derivado de la misma las patente y et Cáncer Res y Lode et Cáncer una antracielina tal como daunomicina o doxorrubicina Kratz et Current et Bioorganic Letters Torgov et Bioconj Nagy et Nati Sci USA Dubowchi et Letters King et y la patente un taxano tal como tesetaxel y un y En otra un inmunoconjugado comprende un anticuerpo biespecífico como se describe en la presente conjugado a una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma que incluye pero que no se limita a cadena A de fragmentos activos que no se unen de toxina de cadena A de exotoxina Pseudomonas cadena A de cadena A de cadena A de proteínas de Aleurites fordii proteína de proteínas de Phytolaca americana y inhibidor de Momordica inhibidor de Saponaria enomicina y los En otra un inmunoconjugado comprende un anticuerpo biespecífico como se describe en la presente conjugado a un átomo radiactivo para formar un Una diversidad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de Los ejemplos incluyen Pb212 e isótopos radioactivos de Cuando el radioconjugado se utiliza para puede comprender un átomo radioactivo para estudios por ejemplo tc99m o o una marca de spin para la generación de imágenes por resonancia magnética nuclear conocida como generación de imágenes por resonancia por sus siglas en tales como manganeso o Los conjugados de un anticuerpo biespecífico y agentes citotóxicos se pueden elaborar utilizando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como por sus siglas en por sus siglas en iminotiolano por sus siglas en derivados bifuncionales de imidoésteres como clorhidrato de adipimidato de ásteres activos como suberato de aldehidos como compuestos como derivados de como diisocianatos como de y compuestos de flúor como Por se puede preparar inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et Science 1098 El ácido triaminopentaacético marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para conjugación de radionucleótido al Véase El enlazante puede ser un que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la Por un enlazante lábil a un enlazante sensible a un enlazante un enlazante de dimetilo o un enlazante que contenga disulfuro et C ncer Res patente se puede Los inmunoconjugados para los ADC en la presente contemplan de manera pero no se limitan a los conjugados preparados con reactivos de reticulación que incluyen pero que no se limitan y y SVSB los cuales están disponibles comercialmente de Pierce Estados Métodos y Composiciones para Diagnóstico y Detección En ciertas cualquiera de los anticuerpos biespecíficos que se proporcionan en la presente son útiles para detectar la presencia de un primero un segundo antígeno en una muestra El término como se utiliza en la abarca detección cuantitativa o En ciertas una muestra biológica comprende una célula o En una modalidad se proporciona un anticuerpo biespecífico para uso en un método de diagnóstico o En un aspecto se proporciona un método para detectar la presencia de un primero un segundo antígeno en una muestra biológica en ciertas el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo biespecífico como se describe en la presente bajo condiciones permisivas para unión del anticuerpo biespecífico a un primero un segundo y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo biespecífico y un primero un segundo Este método puede ser un método in vitro o in En una se utiliza un anticuerpo biespecífico para seleccionar a los sujetos elegibles para tratamiento con el anticuerpo por ejemplo en donde el primero segundo antígeno es un biomarcador para selección de Los trastornos ejemplares que se pueden diagnosticar utilizando un anticuerpo de la invención incluyen En ciertas se proporcionan anticuerpos biespecíficos Las marcas pero no se limitan a marcas o porciones que son detectadas directamente como marcas quimioluminiscentes y así como tales como enzimas o ligandos que son detectados por ejemplo a través de una reacción enzimática o interacción Las marcas ejemplares pero no se limitan a los radioisótopos y fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus rodamina y sus luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana peroxidasa de rábano por sus siglas en fosfatasa sacárido por ejemplo glucosa galactosa oxidasa y oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina acoplado con una enzima que utiliza peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte tal como lactoperoxidasa o marcas de marcas de radicales libres estables y Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo biespecífico como se describe en la presente se preparan al mezclar el anticuerpo biespecífico que tiene el grado de pureza deseado con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables opcionales s Pharmaceuticals Science décima sexta en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones Los portadores farmacéuticamente aceptables generalmente son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones utilizadas e pero no se limitan amortiguadores tales citrato y otros ácidos antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y conservadores como cloruro de cloruro de cloruro de cloruro de alcohol butílico o alquilparabenos tales como metil o y polipéptidos de peso molecular bajo de aproximadamente 10 proteínas tales como albúmina gelatina o polímeros hidrofílicos tales como aminoácidos tales como arginina o disacáridos y otros carbohidratos que incluyen mañosa o agentes quelantes tales como azúcares tales como trehalosa o contraiones formadores de sal tales como complejos de metal complejos de tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol Los portadores farmacéuticamente aceptables ejemplares en la presente incluyen además agentes de dispersión de fármaco intersticial tal como glucoproteínas de hialuronidasa activos neutros solubles por ejemplo glucoproteínas de hialuronidasa solubles humanas tales como rHuPH20 Baxer Ciertos sHASEGP ejemplares y métodos de que incluyen rHUPH20 se describen en las publicaciones de patentes US y En un un sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglicanasa adicionales tales como Las formulaciones de anticuerpo liofilizadas ejemplares se describen en la patente Las formulaciones de anticuerpo acuosas incluyen las descritas en la patente y estas últimas formulaciones incluyen un amortiguador de La formulación en la presente también puede contener más de uno de los ingredientes activos según sea necesario para la indicación particular que es preferiblemente aquellas con actividades complementarias que no afectan de manera adversa entre Los ingredientes activos están presentes adecuadamente en en cantidades que son eficaces para el propósito Los ingredientes activos pueden ser atrapados en microcápsulas por por téenicas de coacervación o por polimerización por hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de de en sistemas de suministro de fármaco coloidal microesferas de nanopartículas y o en Estas técnicas se describen en Remington s Pharmaceuticals Sciences décima sexta Se pueden preparar preparaciones de liberación Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el matrices las cuales están en forma de artículos por ejemplo películas o Las formulaciones para ser utilizadas para administración in vivo generalmente son La esterilidad se puede llevar a cabo por ejemplo mediante filtración a través de membranas de filtración Métodos y Composiciones Terapéuticas Cualquiera de los anticuerpos biespecíficos que se proporcionan en la presente se pueden utilizar en métodos En un aspecto se proporciona un anticuerpo biespecífico para uso como un En aspectos adicionales se proporciona un anticuerpo biespecífico para uso en el tratamiento de En ciertas modalidades se proporciona un anticuerpo biespecífico para uso en un método de En ciertas la invención proporciona un anticuerpo biespecífico para uso en un método para tratar a un individuo que tiene que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo En una de estas el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de por lo menos un agente terapéutico por como se describe más Un de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores preferiblemente es un En un aspecto la invención proporciona el uso de un anticuerpo biespecífico en la elaboración o preparación de un En una el medicamento es para el tratamiento de En una modalidad el medicamento es para uso en un método para tratar cáncer que comprende administrar a un individuo que tiene cáncer una cantidad eficaz del En una de estas el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de por lo menos un agente terapéutico por como se describe más Un de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un En un aspecto la invención proporciona un método para tratar En una el método comprende administrar a un individuo que tiene cáncer en una cantidad eficaz de un anticuerpo En una de estas el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de por lo menos un agente terapéutico adicional como se describe en lo Un de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un En un aspecto la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos biespecíficos que se proporcionan en la por para uso en cualquiera de los métodos terapéuticos En una una formulación farmacéutica comprende cualquiera del anticuerpo biespecífico que se proporciona en la presente y un portador farmacéuticamente En otra una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos biespecíficos que se proporcionan en la presente y por lo menos un agente terapéutico por como se describe más Los anticuerpos biespecíficos de la invención se pueden utilizar ya sea solos o en combinación con otros agentes en un Por un anticuerpo biespecífico de la invención se puede coadministrar con por lo menos un agente terapéutico Estos tratamientos combinados indicados en lo anterior abarcan la administración combinada donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones y la administración en cuyo caso la administración del anticuerpo de la invención se puede llevar a cabo antes simultáneamente posterior a la administración del agente adyuvante terapéutico Los anticuerpos biespecíficos de la invención también se pueden utilizar en combinación con Un anticuerpo biespecífico de la invención cualquier agente terapéutico se puede administrar por cualquier medio adecuado que incluye por administración intrapulmonar e intranasal si se para tratamiento administración Las infusiones parenterales incluyen la administración intraperitoneal o La dosificación puede ser cualquier vía por por inyecciones tales como inyecciones intravenosas o en de si la administración es breve o Diversos protocolos de dosificación que incluyen pero que no se limitan a administraciones sencillas o múltiples sobre diversos puntos de la administración en bolo y la infusión por pulsos se contemplan en la Los anticuerpos biespecíficos de la invención se pueden dosificar y administrar de una manera consistente con la buena práctica Los factores para consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que es el mamífero particular que es la condición clínica del paciente la causa del el sitio de suministro del el método de el protocolo de administración y otros factores conocidos por los profesionales de la El anticuerpo biespecífico no necesita pero opcionalmente se formula con uno o más agentes utilizados habitualmente para evitar o tratar el trastorno en La cantidad eficaz de estos otros agentes dependen de la cantidad de anticuerpo presente en la el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores descritos en lo Estos generalmente se utilizan en las mismas dosificaciones y con vías de administración como se describe en la presente o desde aproximadamente 1 a de las dosificaciones que se describen en la o cualquier dosificación o por cualquier vía que se determine como Para la prevención o tratamiento de una la dosificación apropiada de un anticuerpo biespecífico de la invención se utiliza solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales dependerá del tipo de enfermedad que se va a el tipo de la gravedad y curso de la si el anticuerpo biespecífico se administra para propósitos de prevención o tratamientos los antecedentes clínicos del paciente y la respuesta al anticuerpo biespecífico así como el criterio del médico que El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente en una ocasión o en una serie de En base en el tipo y gravedad de la una cantidad de aproximadamente 1 a 15 10 del anticuerpo biespecífico pueden ser la dosificación candidata inicial para administración al por por una o más administraciones separadas o por infusión Una dosificación típicamente diaria puede variar desde aproximadamente a 100 o dependiendo de factores mencionados Para administraciones repetidas durante varios días o por períodos más dependiendo de la el tratamiento generalmente se sostendrá hasta que se produzca la supresión deseada de los síntomas de Una dosificación ejemplar del anticuerpo biespecífico puede estar en el intervalo desde aproximadamente a aproximadamente 10 De esta se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente o 10 cualquier combinación de las Estas dosis se pueden administrar de manera por ejemplo cada semana o cada tres semanas ejemplo de manera tal que el paciente reciba desde aproximadamente dos hasta aproximadamente veinte por aproximadamente seis dosis del anticuerpo Se puede administrar una dosis de carga inicial más seguida por una o más dosis No pueden ser útiles otros regímenes de El progreso de esta tratamiento se monitorea fácilmente por téenicas y análisis Se entiende que cualquiera de las formulaciones anteriores o métodos terapéuticos se pueden llevar a cabo utilizando un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además del anticuerpo biespecífico de la Artículos de Manufactura En otro aspecto de la se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el prevención diagnóstico de los trastornos descritos en lo el artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de empaque sobre o asociado al Los recipientes adecuados por bolsas de solución Los recipientes se pueden conformar a partir de una diversidad de materiales tales como vidrio o El recipiente retiene una composición la cual en sí misma o combinada con otra composición es eficaz para evitar diagnosticar la condición y puede tener un orificio de acceso estéril el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja para inyección Por lo menos un agente activo en la composición es un anticuerpo biespecífico de la La etiqueta o el inserto de empaque indica que la composición se utiliza para tratar la condición de el artículo de manufactura puede un primer recipiente con una composición contenida en el en donde la composición comprende un anticuerpo biespecífico de la y un segundo recipiente con una composición contenida en el en donde la composición comprende un agente terapéutico citotóxico adicional o de otro El artículo de manufactura en esta modalidad de la invención puede comprender además un inserto de empaque que indique que las composiciones se pueden utilizar para tratar una condición De manera alternativa o el artículo de manufactura puede comprender además un segundo recipiente que comprende un amortiguador farmacéuticamente tal como agua para inyección bacteriostática por sus siglas en solución salina amortiguada con solución Ringer y solución de Puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario que incluyen otros agujas y Se entiende que cualquiera de los artículos de manufactura anteriores pueden incluir un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo biespecífico de la EJEMPLOS Los siguientes son ejemplos de métodos y composiciones de la Se entiende que se pueden llevar a la práctica diversas otras dada la descripción general que se proporciona en lo Aunque la invención precedente se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de las descripciones y ejemplos no deben considerarse como limitantes del alcance de la Las descripciones de toda la literatura de patente y científica mencionada en la presente se incorpora de manera expresa en su totalidad como EJEMPLO PREPARACIÓN DE Fab La región variable resultante de las secuencias de ADN para las cadenas pesada y ligera se han subclonado en marco con ya sea la cadena pesada constante o la cadena ligera constante preinsertada en el vector de expresión de mamífero receptor La expresión de anticuerpo es activada por un promotor MPSV y presenta una secuencia de señal poliA sintética en el extremo del Además cada vector contiene la secuencia OriP de La molécula se produce por cotransfección de células con los vectores de expresión de mamífero utilizando transfección con fosfato de Las células que crecen exponencialmente se transfectan por el método de fosfato de De manera células que crecen en suspensión se transfectan por Las células se transfectan con los vectores de expresión correspondientes en una relación ligera de ligera de vector Para transfección utilizando fosfato de calcio se hacen crecer células como cultivos de monocapa adherente en matraces T utilizando medio de cultivo DMEM suplementado con FCS y se transfectan cuando se encuentran con una confluencia entre 50 y Para la transfección de un matraz se siembran 15 millones de células 24 horas antes de la transfección en 25 mi de medio de cultivo DMEM suplementado con FCS y las células se colocan a en un incubador con una atmósfera de durante la Para cada matraz T150 que va a ser una solución de CaCl2 y agua se prepara al mezclar 94 mg de ADN de vector plasmídico total dividido entre la relación agua hasta un volumen final de 469 y 469 de una solución de CaCl21 A esta 938 m? de HEPES 50 NaCl 280 mM en a pH se se mezcla inmediatamente durante 10 s y se deja reposar a temperatura ambiente durante 20 La suspensión se diluye con 10 mi de DMEM suplementado con FCS y se agrega a T150 en lugar del medio Después se agregan 13 mi adicionales de medio de Las células se incuban a durante aproximadamente 17 a 20 después el medio se sustituye con 25 mi de FCS El medio de cultivo acondicionado se recolecta aproximadamente 7 días posteriores a intercambio de medio por centrifugación durante 15 min a 210 x la solución se esteriliza por filtración de y se agrega azida de sodio en una concentración final de y se mantiene a Para transfección utilizando se cultivan células HEK293 EBNA en suspensión libre de suero en medio de cultivo CD Para la producción en matraces de agitación de 500 se siembran 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la Para la transfección las células se centrifugan durante 5 min por 210 x el sobrenadante se sustituye por 20 mi de medio CD CHO previamente Los vectores de expresión se mezclan en 20 mi de medio CD CHO hasta una cantidad final de 200 mg de Después de la adición de 540 de PEI la solución se somete a remolino durante 15 s y subsecuentemente se incuba durante 10 min a temperatura Posteriormente las células se mezclan con una solución de se transfieren a un matraz de agitación de 500 mi y se incuban durante 3 horas a en un incubador con una atmósfera de Después del tiempo de se agregan 160 mi de medio F17 y las células se cultivan durante 24 Un día después de la transfección se agrega ácido valpróico 1 y Feed 1 Después de 7 días de cultivo el sobrenadante se recolecta para purificación por centrifugación durante 15 min a 210 x la solución se esteriliza por filtración de y se agrega azida de sodio en una concentración final de y se mantiene a La proteína secretada se purifica a partir de los sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad utilizando cromatografía de afinidad de proteína A y proteína seguido por una etapa cromatográfica de exclusión de Para la cromatografía de afinidad el sobrenadante se carga en una columna HiTrap Protein A HP 5 GE acoplada a una columna HiTrap Protein G HP 5 GE cada columna equilibrada con 30 mi de fosfato de sodio 20 citrato de sodio 20 pH La proteína no unida se separa por lavado de ambas columnas con 6 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 citrato de sodio 20 pH Subsecuentemente es necesario una etapa de lavado adicional para lavar únicamente la columna HiTrap Protein G HP utilizando por lo menos 8 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 citrato de sodio 20 pH La proteína objetivo se eluye con una columna HiTrap Protein G HP utilizando un gradiente paulatino con 7 volúmenes de columna de ácido fórmico pH La solución de proteína se neutraliza al agregar de fosfato de sodio pH La proteína objetivo se concentra y se filtra antes del cargado sobre una columna HiLoad Superdex 200 equilibrada con fosfato de potasio 25 cloruro de sodio 125 solución de glicina 100 mM de pH La concentración de proteína de las muestras de proteína purificadas se determina al medir la densidad óptica por sus siglas en a 280 utilizando coeficiente de extinción molar calculado en base en la secuencia de La pureza y peso molecular de los anticuerpo se analizó por en presencia y ausencia de un agente reductor 5 y tinción con Coomassie SafeStain de Se utilizó el sistema de gel NuPAGEMR Estados de acuerdo con la instrucción del fabricante de o El contenido de agregado de las muestras de anticuerpo se analiza utilizando una columna de exclusión de tamaño analítica Superdex200 en MOPS 2 NaCl 150 NaN3 pH como amortiguador de corrimiento a El análisis de producción y purificación de una molécula ejemplar cosiste de tres SEC ID SEC ID 17 y SEC ID con una orientación como se muestra en la figura 1 se muestra en las figuras 2a Esta molécula se denomina adicionalmente como Fab o hu Fab EJEMPLO PREPARACIÓN DE Fab y Fab La región variable resultante de las secuencias de ADN de cadenas pesada y ligera se subclonan en marco con ya sea la cadena pesada constante o la cadena ligera constante preinsertadas en el vector de expresión de mamífero receptor La expresión de anticuerpo es activada por un promotor MPSV y transporta una secuencia de señal poliA sintética en el extremo del Además cada vector contiene una secuencia OriP de La molécula se produce por cotransfección de células con los vectores de expresión de mamífero utilizando transfección con fosfato de Las células que crecen exponencialmente se transfectan por el método de fosfato de De manera células que crecen en suspensión se transfectan por Las células se transfectan con los vectores de expresión correspondientes en una relación ligera de ligera de vector Para transfección utilizando fosfato de calcio se hacen crecer células como cultivos de monocapa adherente en matraces T utilizando medio de cultivo DMEM suplementado con FCS y se transfectan cuando se encuentran con una confluencia entre 50 y Para la transfección de un matraz se siembran 15 millones de células 24 horas antes de la transfección en 25 mi de medio de cultivo DMEM suplementado con FCS y las células se colocan a en un incubador con una atmósfera de durante la Para cada matraz T150 que va a una solución de CaCl2 y agua se prepara al mezclar 94 mg de ADN de vector plasmídico total dividido en la relación agua hasta un volumen final de 469 y 469 m? de una solución de A esta se le agregan 938 m? de una solución de HEPES 50 NaCl 280 mM en a pH se mezcla inmediatamente durante 10 s y se deja reposar a temperatura ambiente durante 20 La suspensión se diluye en 10 mi de DMEM suplementado con FCS y se agrega a T150 en lugar del medio Después se agregan 13 mi adicionales de medio de Las células se incuban a CO2 durante aproximadamente 17 a 20 y después el medio se sustituye con 25 mi de FCS El medio de cultivo acondicionado se recolecta aproximadamente 7 días posterior a la exposición al medio por centrifugación durante 15 min a 210 x la solución se esteriliza por filtración de y se agrega azida de sodio en una concentración final de y se mantiene a Para transfección utilizando se cultivan células HEK293 EBNA en suspensión libre de suero en medio de cultivo CD Para la producción en un matraz de agitación de 500 se siembran 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la Para la transfección las células se centrifugan durante 5 min a 210 x se sustituye el sobrenadante con 20 de medio CD CHO previamente Los vectores de expresión se mezclan en 20 mi de medio CD CHO a una cantidad final de ADN de 200 Después de la adición de 540 de PEI la solución se somete a remolino durante 15 s y subsecuentemente se incuba durante 10 min a temperatura Posteriormente las células se mezclan con una solución de se transfieren a un matraz de agitación de 500 mi y se incuban durante 3 horas a en un incubador con una atmósfera de CO2 Después del tiempo de se agregan 160 mi de medio F17 y las células se cultivan durante 24 Un día después de la transfección se agrega ácido valpróico 1 y Feed 1 Después de 7 días el sobrenadante de cultivo se recolecta para purificación por centrifugación durante 15 min a 210 x la solución se esteriliza por filtración de y se agrega azida de sodio en una concentración final de y se mantiene a La proteína secretada se purifica de los sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad utilizando cromatografía de afinidad de proteína A y proteína seguido por la etapa cromatográfica de exclusión de Para cromatografía de afinidad el sobrenadante se carga en una columna HiTrap Protein A HP 5 GE acoplada a una columna HiTrap Protein G HP 5 GE cada columna está equilibrada con 30 mi de fosfato de sodio 20 citrato de sodio 20 pH La proteína que no se une es eliminada por lavado de ambas columnas con 6 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 citrato de sodio 20 pH Subsecuentemente es necesaria una etapa de lavado adicional para lavar únicamente la columna HiTrap Protein G HP utilizando por lo menos 8 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 citrato de sodio 20 pH La proteína objetivo se eluye desde la columna HiTrap Protein G HP utilizando un gradiente paulatino con 7 volúmenes de columna de ácido fórmico pH La solución de proteínas se neutraliza al agregar de fosfato de sodio pH La proteína objetivo se concentra y filtra antes del cargado en una columna HiLoad Superdex 200 equilibrada con fosfato de potasio 25 cloruro de sodio 125 solución de glicina 100 mM de pH La concentración de proteína de las muestras de proteína purificadas se determina al medir la densidad óptica por sus siglas en a 280 utilizando un coeficiente de extinción molar calculado en base en la secuencia de La pureza y el peso molecular de los anticuerpos se analiza por en presencia y ausencia de un agente reductor 5 y tinción con Coomassie SafeStain de Se utiliza el sistema de gel NuPAGEMR de acuerdo con las instrucciones del fabricante de 4 o El contenido de agregado de las muestras de anticuerpo se analiza utilizando una columna de exclusión de tamaño analítica Superdex 200 gl en MOPS 2 NaCl 150 NaN3 pH como amortiguador de corrimiento a y se compara con un fragmento de anticuerpo de la téenica anterior resultados en la tabla Análisis de producción y purificación de una molécula ejemplar consiste de cuatro SEC ID 2 cadenas SEC ID 17 y una cadena SEC ID con una orientación como se muestra en la figura se muestra en las figuras 4a Esta molécula se denomina adicionalmente como Fab o hu Fab El análisis de producción y purificación de una molécula ejemplar consiste de cuatro SEC ID 2 cadenas SEC ID 17 y una cadena SEC ID con una orientación como se muestra en la figura se muestra en las figuras 6a Esta molécula se denomina adicionalmente como Fab o hu Fab Análisis de producción y purificación de una molécula ejemplar consiste de cuatro SEC ID 2 cadenas SEC ID 17 y una cadena SEC ID con una orientación como se muestra en la figura se muestra en las figuras 8a Esta molécula se denomina adicionalmente como la forma murina de EJEMPLO PREPARACIÓN DE La región variable resultante de las secuencias de ADN de cadena pesada y ligera se subclonan en marco con ya sea una cadena pesada constante o una cadena ligera constante insertada previamente en el vector de expresión de mamífero receptor La expresión de anticuerpo es activada por un promotor MPSV y transporta una secuencia de señal poliA sintética en el extremo de las cada vector contiene una secuencia OriP de La molécula se produce por cotransfección de células con vectores de expresión de mamífero utilizando transfección con fosfato de Las células que crecen de modo exponencial se transfectan por el método de fosfato de De manera células que crecen en suspensión se transfectan por Las células se transfectan con los vectores de expresión correspondientes en una relación ligera de ligera de vector Para transfección utilizando fosfato de calcio se hacen crecer células como cultivos de monocapa adherente en matraces T utilizando medio de cultivo DMEM suplementado con FCS y se transfectan cuando se encuentran entre 50 y de Para la transfección de un matraz se siembran 15 millones de células 24 horas antes de la transfección en 25 mi de medio de cultivo DMEM suplementado con FCS y las células se colocan a en una incubador con una atmósfera de durante la Para cada matraz T150 que se va a una solución de CaCl2 y agua se prepara al mezclar 94 del ADN del vector plasmídico total dividido en la relación agua hasta un volumen final de 469 y 469 de una solución de CaCl2 1 A esta solución se le agregan 938 m? de HEPES 50 NaCl 280 mM en solución a pH se mezcla inmediatamente durante 10 s y se deja reposar a temperatura ambiente durante 20 La suspensión se diluye con 10 mi de DMEM suplementado con FCS y se agrega a T150 en el lugar del medio Después se agregan 13 mi adicionales del medio de Las células se incuban a durante aproximadamente 17 a 20 y después el medio se sustituye con 25 mi de FCS El medio de cultivo acondicionado se recolecta aproximadamente 7 días después de la exposición al medio por centrifugación durante 15 min a 250 x la solución se esteriliza por filtración de y se agrega azida de sodio en una concentración final de y se mantiene a Para transfección utilizando se cultivan células HEK293 EBNA en suspensión libre de suero en medio de cultivo CD Para la producción en un matraz de agitación de 500 mi se siembran 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la Para la transfección las células se centrifugan durante 5 min a 210 x el sobrenadante se sustituye por 20 mi de medio CD CHO previamente Los vectores de expresión se mezclan en 20 mi de medio CD CHO hasta una cantidad final de 200 pg de Después de la adición de 540 de solución PEI se somete a remolino durante 15 s y subsecuentemente se incuba durante 10 min a temperatura Posteriormente las células se mezclan con la solución de se transfieren a un matraz de agitación de 500 mi y se incuban durante 3 horas a en un incubador con una atmósfera de Después del tiempo de se agregan 160 mi de medio F17 y las células se cultivan durante 24 Un día después de la transfección se agrega ácido valproico 1 y Feed Después de 7 días de cultivo se recolecta el sobrenadante por purificación mediante centrifugación durante 15 min a 210 x la solución se esteriliza por filtración de y se agrega azida de sodio en una concentración final de y se mantiene a La proteína secretada se purifica de los sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad utilizando cromatografía de afinidad de proteína A y proteína seguido por una etapa cromatográfica por exclusión de Para cromatografía de afinidad el sobrenadante se carga en una columna HiTrap Protein A HP 5 GE acoplada a una columna HiTrap Protein G HP 5 GE cada columna se equilibra con 30 mi de fosfato de sodio 20 citrato de sodio 20 pH La proteína que no se ha unido se separa por lavado de ambas columnas con 6 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 citrato de sodio 20 pH Subsecuentemente es necesaria una etapa de lavado adicional para lavar únicamente la columna HiTrap Protein G HP utilizando por lo menos 8 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 citrato de sodio 20 pH La proteína objetivo se eluye de la columna HiTrap Protein G HP utilizando un gradiente paulatino con 7 volúmenes de columna de ácido fórmico La solución de proteína se neutraliza al agregar de fosfato de sodio pH La proteína objetivo se concentra y filtra antes del cargado en una columna HiLoad Superdex 200 equilibrada con fosfato de potasio 25 cloruro de sodio 125 solución de glicina 100 mM de pH La concentración de proteína de las muestras de proteína purificadas se determina al medir la densidad óptica por sus siglas en a 280 utilizando el coeficiente de extinción molar calculado en base en la secuencia de La pureza y el peso molecular de los anticuerpos se analiza por en presencia y ausencia de un agente reductor 5 y tinción con Coomassie SafeStain de Se utiliza el sistema de gel NuPAGEMR de acuerdo con la instrucción del fabricante de 4 o El contenido de agregado de las muestras de anticuerpo se analiza utilizando una columna de exclusión de tamaño analítica Superdex 200 gl en MOPS 2 NaCl 150 NaN3 pH amortiguador de corrimiento a Análisis de producción y purificación de una molécula ejemplar consiste de tres SEC ID SEC ID 100 y SEC ID 23 o SEC ID con una orientación como se muestra en la figura que se muestra en las figuras 17a Esta molécula se denomina adicionalmente como Fab o hu Crossfab EJEMPLO PREPARACIÓN DE LA MOLÉCULA DE REFERENCIA Clonación y producción La región variable resultante de las secuencias de ADN de cadena pesada y ligera se subclonan en marco con el vector de expresión de mamífero receptor La expresión de anticuerpo es activada por un promotor MPSV y presenta una secuencia de señal poliA sintética en el extremo de las cada vector contiene una secuencia OriP de La molécula se produce al transfectar células con el vector de expresión de mamífero utilizando Las células se cultivan en suspensión libre de suero en medio de cultivo CD Para la producción en un matraz de agitación de 500 mi se siembran 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la Para la transfección las células se centrifugan durante 5 min por 210 x el sobrenadante se sustituye por 20 mi de medio CD CHO previamente Los vectores de expresión se mezclan en 20 mi de medio CD CHO hasta una cantidad final de 200 de Después de la adición de 540 de PEI la solución se somete a remolino durante 15 s y subsecuentemente se incuba durante 10 min a temperatura Posteriormente las células se mezclan con la solución de se transfieren a un matraz de agitación de 500 mi y se incuban durante 3 horas a en un incubador con una atmósfera de CO2 Después del tiempo de se agregan 160 mi de medio F17 y las células se cultivan durante 24 Un día después de la transfección se agrega ácido valproico 1 y Feed Después de 7 días de cultivo se recolecta el sobrenadante por purificación mediante centrifugación durante 15 min a 210 x la solución se esteriliza por filtración de y azida de sodio en una concentración final de se agrega y se mantiene a Purificación de La proteína secretada se purifica de los sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad utilizando cromatografía de afinidad de ion metálico inmovilizado por sus siglas en seguido por una etapa cromatográfica por exclusión de Antes de la primera etapa de los componentes alterantes del sobrenadante son separados por diafiltración utilizando un sistema de filtración de flujo tangencial Sarcojet equipado con una membrana de M CO Slice El sobrenadante se concentra a 210 mi y subsecuente se diluye en 11 de fosfato de sodio 20 cloruro de sodio 500 pH La solución de proteína se concentra nuevamente a 210 Este proceso se repite dos veces para asegurar intercambio completo de Para la cromatografía de el retenido del proceso de diafiltración se carga en un cartucho NiNTA Superflow Cartridge 5 equilibrado con 25 mi de fosfato de sodio 20 cloruro de sodio 500 imidazol 15 pH La proteína que no se ha unido es separada por lavado con por lo menos 2 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 cloruro de sodio 500 imidazol 15 pH seguido por una etapa de lavado adicional utilizando 3 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 cloruro de sodio 500 imidazol pH La proteína objetivo se eluye en 2 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 cloruro de sodio 500 imidazol 125 pH La columna se lava subsecuentemente con fosfato de sodio 20 cloruro de sodio 500 imidazol 250 pH La proteína objetivo se concentra antes del cargado en una columna HiLoad Superdex 75 equilibrada con KH2PO425 NaCl 125 arginina 200 pH Los el contenido de agregado después de la primera etapa de purificación y el contenido de final se muestran en la tabla La comparación del contenido de agregado después de la primera etapa de purificación indica la estabilidad superior de la construcción en contraste con Caracterización de La concentración de muestras de proteína purificadas se determina al medir la densidad óptica por sus siglas en a 280 utilizando el coeficiente de extinción molar calculado en base en la secuencia de La pureza y el peso molecular de los anticuerpos se analiza por en presencia y ausencia de un agente reductor 5 y tinción con Coomassie SafeStain de Se utiliza el sistema de gel NuPAGEMR de acuerdo con las instrucciones del fabricante de 4 o El contenido de agregado de las muestras de anticuerpo se analiza utilizando una columna de exclusión de tamaño analítica Superdex 75 gl en MOPS 2 NaCl 150 pH amortiguador de corrimiento a Un dibujo esquemático de la molécula se muestra en la figura El análisis de producción y purificación de una molécula ejemplar que consiste de dos Fv de cadena y SEC ID se muestra en la figura 22 y en la figura Esta molécula se denomina adicionalmente como EJEMPLO AISLAMIENTO DE LINFOCITOS PAN T HUMANOS PRIMARIOS A PARTIR DE PBMC Células mononucleares de sangre periférica por sus siglas en se preparan por centrifugación de densidad Histopaque a partir de preparaciones enriquecidas en linfocitos obtenidas de bancos de sangre locales o a partir de sangre fresca de donadores humanos El enriquecimiento de linfocitos T a partir de PBMC se realiza utilizando el Pan T Cell Isolation Kit II Biotec de acuerdo con las instrucciones del los sedimentos celulares se diluyen en 40 de amortiguador frío por 10 células Mió con BSA EDTA 2 por y se incuban con 10 de combinación de anticuerpo por 10 células Mió durante 10 min a Se agregan 30 m? de amortiguador frío y 20 m? de esferas magnéticas por 10 células Mió y la mezcla se incuba durante otros 15 minutos a Las células se lavan al agregar de volumen de marcado y una etapa de centrifugación subsecuente a 300 g durante 10 Hasta 100 células Mío se resuspenden en 500 de La separación magnética de linfocitos pan T humanos sin marcar se realiza utilizando columnas LS Biotec de acuerdo con las instrucciones del La población de linfocitos T resultante se cuenta automáticamente y se almacena en medio a CO2 en el incubador hasta que se inicia el análisis período no mayor de 24 EJEMPLO AISLAMIENTO DE LINFOCITOS PAN T MURINOS A PARTIR DE ESPLENOCITOS Se aíslan los bazos de los ratones se transfieren a un tubo C GentleMACS Biotech que contiene amortiguador MACS BSA EDTA 2 y se disocia con el equipo GentleMACS Dissociator para obtener suspensiones de células solas de acuerdo con las instrucciones del La suspensión celular se hace pasar a través de un filtro de para obtener partículas de tejido no disociado remanentes que hayan Después de centrifugación a 400 g durante 4 minutos a se agrega amortiguador de lisis ACK para lisar eritrocitos durante 5 minutos a temperatura Las células restantes se lavan con amortiguador MACS dos se cuentan y se utilizan para el aislamiento de linfocitos pan T La selección negativa se realiza utilizando el Pan T cells Isolation Kit de Miltenyi Biotec siguiendo las instrucciones del La población de linfocitos T resultante se cuenta automáticamente y se utiliza de inmediato para análisis EJEMPLO 7i CITOTOXICIDAD DE LINFOCITOS T REDIRIGIDA MEDIADA POR CONSTRUCCIONES BIESPECÍFICAS RETICULADAS DIRIGIDAS A CD3 SOBRE LINFOCITOS T Y MCSP SOBRE CÉLULAS TUMORALES DE LIBERACIÓN DE Construcciones específicas que tienen como objetivo CD3 sobre linfocitos T humanos o de ratón y células humanas o tumorales se analizaron por un análisis de liberación de LDH respecto a su potencial para inducir apoptosis mediada por linfocitos T de las células se cosechan células objetivo de melanoma humano o las células del clon 48 Fluc 2 todas expresando MCSP con amortiguador de disociación de células es sensible a la o con tripsina después se siembran en placa el día se lavan y resuspenden en el medio de cultivo celular apropiado descripción detallada de las diferentes Se siembran en placas 20000 30000 células por pozo en una placa de 96 pozos de fondo redondo y se agregan la dilución de anticuerpo respectiva según se indica Las celulas efectoras se agregan para obtener una relación final de 5 1 linfocitos Pan T 10 1 PBMC Además se utiliza 1 a 10 de a una mezcla de isolectinas aisladas de Phaseolus vulgaris como un estímulo mitogénico para inducir activación de linfocitos T humanos o de Para linfocitos T murinos se utilizó una solución de de rata con como un control positivo para activación de linfocitos Para se obtuvo la lisis máxima de las células objetivo por incubación de las células objetivo con una concentración final de Lisis mínima se refiere a células objetivo con células efectoras pero sin construcción o anticuerpo Después de incubación durante la noche durante por lo menos 18 h a de la liberación de LDH de células objetivo en el sobrenadante se midió con el kit de detección de LDH Applied 11 644 793 de acuerdo con las instrucciones del fabricante Análisis de liberación de LDH con construcciones biespecíf icas Fab y Fab Se analizaron fracciones purif icadas de Fab Crossfab Fab y el 2 molécula de para su potencial para inducir apoptosis mediada por linfocitos T en células objetivo tumorales ante el cruce de la construcción por medio de unión de ambas porciones objetivo a los antígenos respectivos en las células objetivo de melanoma humano que expresan huMCSP se cosecharon con amortiguador de disociación se lavaron y resuspendieron en medio Se sembraron en placas 30000 células por en una placa de 96 pozos de fondo redondo y la dilución de anticuerpo respectiva se agregó en las concentraciones Todas las construcciones y controles se ajustaron a la misma Se agregaron células efectoras pan T humanas para obtener una relación final de Como un control positivo para la activación de linfocitos pan T se utilizó 1 de Para normalización la lisis máxima de las células objetivo se determinó por incubación de las células objetivo con una concentración final de La lisis mínima se refiere a células objetivo coincubadas con células efectoras pero sin construcción o anticuerpo Después de una incubación durante la noche durante 20 h a de liberación de LDH de células objetivo en el sobrenadante se midió con el kit de detección de LDH Applied 11 644 793 de acuerdo con las instrucciones del Como se muestra en la figura las construcciones con direccionamiento MCSP bivalente mostraron actividad citotóxica comparable en comparación con la construcción mientras que la construcción Fab con unión MCSP monovalente claramente es menos Análisis de liberación de LDH con la construcción biespecífica Fab con células jetivo de melanoma humanas Las formas purificadas de Fab y en la molécula de referencia se analizaron para determinar su potencial para inducir apoptosis mediada por linfocitos T en células objetivo tumorales ante el cruce de la construcción por medio de unión tanto de las porciones objetivo como de los antígenos respectivos sobre las se cosecharon células objetivo de melanoma humanas que expresan huMCSP con amortiguador de disociación de se lavaron y se resuspendieron en medio Se sembraron en placas 30000 células por en una placa de 96 pozos de fondo redondo y la dilución de anticuerpo respectiva se agregó en las concentraciones Todas las construcciones y controles se ajustaron a la misma Las células efectoras pan T humanas se agregaron para obtener una relación final de Como un control positivo para la activación de linfocitos pan T se utilizaron 5 de Para la lisis máxima de las células objetivo se determinó por incubación de las células objetivo con una concentración final de La lisis mínima se refiere a células objetivo coincubadas con células efectoras pero sin construcción o anticuerpo Después de incubación durante la noche por 21 h a de se midió la liberación de LDH en las células objetivo hacia el con el kit de detección de LDH Applied 11644 793 de acuerdo con las instrucciones del Como se muestra en la figura Fab Fab induce apoptosis en células objetivo por lo menos comparablemente tan bien como la molécula Análisis de liberación de LDH con la construcción biespecífica Fab con células objetivo de melanoma humanas La forma purificada de Fab Crossfab y la molécula se analizó para determinar su potencial para inducir apoptosis mediada por linfocitos T en células objetivo tumorales ante el cruce de la construcción por medio de unión a ambas porciones objetivo a los antígenos respectivos en las células objetivo de melanoma humano que expresan huMCSP se recolectan con tripsina en el día anterior y se inició el análisis de liberación de Las células se lavaron y resuspendieron en un medio de cultivo celular Se sembraron en placa 30 000 células por pozo en una placa de 96 pozos de fondo Al día el sobrenadante se desechó y se agregaron 100 de medio así como la dilución de anticuerpo respectiva en las concentraciones Todas las construcciones y controles se ajustaron a la misma Se agregaron células efectoras PBMC humanas para obtener una relación final de Como un control positivo para la activación de linfocitos pan T se utilizaron 5 de Para la lisis máxima de las células objetivo se determinó por incubación de las células objetivo con una concentración final de La lisis mínima se refiere a células objetivo coincubadas con células efectoras pero sin construcción o anticuerpo Después de una incubación durante la noche por 26 h a de se midió la liberación de LDH de las células objetivo en el con el kit de detección de LDH Applied 11 644 793 de acuerdo con las instrucciones del Como se muestra en la figura Fab Fab induce apoptosis en células objetivo por lo menos comparablemente igual de bien que la molécula Análisis de liberación de LDH con la construcción biespecífica Fab con células objetivo de melanoma humano Se llevó a cabo un análisis de liberación de LDH como se ha indicado en lo La figura 19 muestra la destrucción de células tumorales positivas a huMCSP ante el cocultivo con PBMC humanos tratadas con Fab Crossfab respecto a la molécula de referencia durante Análisis de liberación de LDH con construcción biespecífica murina Crossfab Fab La forma purificada con la forma murina Crossfab que tiene como objetivo CD3 murina así como MCSP humano se analizó para determinar su potencial para inducir apoptosis mediada por linfocitos T en células objetivo tumorales ante el cruce de la construcción por medio de unión de ambas porciones objetivo a los antígenos respectivos en las células objetivo de tumor clon 48 Fluc2 que expresan huMCSP se cosecharon con amortiguador de disociación de se lavaron y resuspendieron en medio RPMI1640 que incluye NEAA Hepes 10 50 y piruvato de sodio 1 Se sembraron en placas 20 000 células por pozo en una placa de 96 pozos de fondo redondo y la dilución de anticuerpo respectiva se agregó en las concentraciones La construcción biespecífica y los controles IgG diferentes de ajustaron a la misma Como un control adicional para la activación de linfocitos T se utilizó Cell Stim con diluido con medio de Las células efectoras pan T aisladas de esplenocitos se agregaron para obtener una relación final de Para normalización se determinó la lisis máxima de las células objetivo por incubación de las células objetivo con una concentración final de La lisis mínima se refiere a células objetivo coincubadas con células efectoras pero sin construcción o anticuerpo Después de incubación durante 70 h a de se midió la liberación de LDH de células objetivo en el sobrenadante con el kit de detección de LDH Applied 11644 793 de acuerdo con las instrucciones del Como se muestra en la figura la construcción biespecífica induce liberación de LDH dependiente de la concentración desde las células comparable con el control positivo con Cell Stim con Análisis de liberación de LDH con la construcción biespecífica Crossfab Fab La forma purificada murina de Crossfab que tiene como objetivo CD3 murino así como MCSP humano se analizó para determinar su potencial para inducir apoptosis mediada por linfocitos T en células objetivo tumorales ante el cruce de la construcción por medio de unión a ambas porciones objetivo hacia los antígenos respectivos en las células objetivo de tumor clon 48 de Fluc2 que expresan huMCSP se cosecharon con amortiguador de disociación de se lavaron y resuspendieron en medio RPMI1640 que incluye NEAA Hepes 10 50 y piruvato de sodio 1 Se sembraron en placas 20 000 células por pozo en una placa de 96 pozos de fondo redondo y la dilución de anticuerpo respectiva se agregó en la concentración final de 50 La construcción biespecífica y los controles IgG diferentes de ajustaron a la misma Las células efectoras pan T aisladas de esplenocitos se agregaron para obtener una relación final de Para determinar el nivel de hiperactivación de linfocitos T murinos en ausencia de células los pozos control con construcción biespecífica 50 nM y linfocitos T se siembran en de manera Para la lisis máxima de las células objetivo se determinó por incubación de las células objetivo con una concentración final de La lisis mínima se refiere a células objetivo coincubadas con células efectoras pero sin construcción o anticuerpo Después de una incubación durante 70 h a de se midió la liberación de LDH de células objetivo en el sobrenadante con el kit de detección de LDH Applied 11644 de acuerdo con las instrucciones del Como se muestra en la figura la construcción biespecífica induce una fuerte liberación de LDH de células En ausencia de las células esto únicamente presenta un ligero incremento de LDH refleja hiperactivación de linfocitos en comparación con linfocitos T murinos no coincubados con células Ninguna de las IgG control induce liberación de LDH de las células EJEMPLO ANÁLISIS DE LIBERACIÓN DE CITOCINA DE Para determinar la secreción de novo de diferentes citocinas ante la activación de linfocitos T con construcciones biespecíficas CD3 en presencia o ausencia de células se aislaron PBMC humanos de las capas leucocíticas y células Mió por pozos se sembraron en placa en una placa de 96 pozos de fondo De manera 280 de sangre completa de un donador sano se sembró en placa por en una placa de 96 pozos de pozo Se agregaron células objetivo tumorales células para construcciones biespecíficas para obtener una relación final de Las construcciones biespecíficas y los controles se agregaron como se ha Después de una incubación hasta de 24 h a de la placa de análisis se centrifuga durante 5 min a 350 g y el sobrenadante se transfiere a una placa de 96 pozos de pozos profundos nueva para el análisis El análisis de CBA se realiza de acuerdo con las instrucciones del fabricante para FACS CantoII utilizando la combinación de los siguientes ajustes CBA granzima B humana humana Flex Set TNF human Flex Set humana Flex Set humana Flex Set humana Flex Set Análisis liberación de citocina con construcciones biespecíficas Se analizaron las siguientes construcciones biespecíficas purificadas que tienen como objetivo humano y CD3 humano para determinar su capacidad para indicar secreción de mediada por linfocitos de citocinas en presencia versus ausencia de células objetivo Fab Crossfab y la molécula de referencia 280 de sangre completa de un donador sano se siembran en placa por pozo de una placa de 96 pozos de pozo Se agregan 30000 células objetivo de tumor que expresan MCSP humano así como las diferentes construcciones biespecíficas y controles a 1 nM de concentración Las células se incuban durante 24 h a de y después se centrifugan durante 5 min a 350 x El sobrenadante se transfiere a una placa de 96 pozos de pozo profundo nueva para el análisis Se realiza el análisis CBA de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes para FACS utilizando la combinación de los siguientes CBA Flex granzima B humana humana Flex Set TNF human Flex Set humana Flex Set humana Flex Set humana Flex Set Las figuras muestran diferentes niveles de citocina que se midieron en el sobrenadante de sangre completa después del tratamiento con 1 de diferentes construcciones biespecíficas Fab y el en presencia 15a y o ausencia de células tumorales durante 24 Se sembraron en placa 280 de sangre completa por pozo de una placa de 96 pozos y se agregaron 30 000 células como se ha La citocina principal se secretó ante la activación de linfocitos T en presencia de células tumorales fue seguido por también los niveles de granzima B aumentaron de manera notable ante la activación de linfocitos T en presencia de células En la construcción elevó los niveles de TNF e así como granzima B en presencia de las células objetivo 15a y un poco más en comparación con la otra construcción No hay secreción significativa de citocinas Th2 e ante la activación de linfocitos T por construcciones biespecíficas en presencia de células En este también existe una secreción débil de INFgamma inducida por la construcción Fab en ausencia de células Análisis de liberación de citocina con construcciones biespecíficas murina La forma purificada de la molécula biespecífica que tiene como objetivo como la forma murina de Crossfab se prueba por citometría de flujo para determinar su potencial para regular por aumento el marcador de activación tardío CD25 sobre linfocitos T en presencia de células tumorales que expresan MCSP se cosechan células tumorales clon 48 Fluc2 positivas a MCSP con amortiguador de disociación de se cuentan y verifican para Las células se ajustan a x 106 células por mi en medio RPMI1640 incluye NEAA Hepes 10 50 piruvato de sodio 1 100 de esta suspensión celular se pipetea por pozo en una placa de 96 pozos de fondo redondo se ha Se agregan 50 de la construcción biespecífica a los pozos que contienen células para obtener una concentración final de 50 Las células efectoras T murinas humanas se aíslan de esplenocitos y se ajustan a 3 x 106 células por mi en medio 50 de esta suspensión celular se agrega por pozo de la placa de análisis para obtener una relación final de Para si la construcción biespecífica es capaz de activar linfocitos T únicamente en presencia de células que expresan los pozos se incluyen aquellos que contienen 50 de la molécula biespecífica así como el efector pero no las células Después de incubación durante 70 horas a de las células se centrifugan 350 x y se lavan dos veces con 150 de que incluye BSA El teñido de la superficie para CD8a de clon BioLegend y CD25 de clon BD se realiza de acuerdo con las sugerencias de los Las células se lavan dos veces con 150 de que incluye BSA y se fija durante 15 min a utilizando 100 de amortiguador de fijación Después de centrifugación las muestras se resuspenden en 200 de BSA y se analizan utilizando la máquina FACS CantoII FACS La figura 16 muestra que conforme la construcción murina Crossfab induce regulación por aumento de CD25 en presencia de células objetivo EJEMPLO EXPRESIÓN DE MARCADORES DE ACTIVACIÓN DE SUPERFICIE SOBRE LINFOCITOS T HUMANOS PRIMARIOS ANTE ACOPLAMIENTO DE CONSTRUCCIONES BIESPECÍFICAS Para verificar la activación específica de linfocitos T ante la unión de construcciones biespecíficas CD3 exclusivamente en presencia de células objetivo se incubaron PBMC humanos primarios como se describe en lo con las concentraciones indicadas de construcciones biespecíficas durante por lo menos 24 h en presencia o ausencia de células objetivo positivas a antígeno se sembraron en placa millones de PBMC humanos primarios por pozo en una placa de 96 pozos de fondo plano que contiene células objetivo positivas a huMCSP tumorales o La relación final de células efectoras respecto a objetivo es Las células se incuban con la concentración indicada de las construcciones biespecíficas denominado como y la molécula de referencia como por los tiempos de incubación a de Las células efectoras se tiñeron para CD8 y el marcador de activación temprano CD69 o el marcador de activación tardío CD25 y se analizaron por FACS Las figuras 20a y 20b muestran el resultado de este EJEMPLO PREPARACIÓN DE CADENA LIGERA UNIDA A CON DOS La molécula se produce por cotransfección de células que crecen en suspensión con los vectores de expresión de mamífero utilizados por Las células se transfectan con los vectores de expresión correspondientes en una relación pesada de ligera enlazada a Se cultivan células HEK293 EBNA en libre de en un medio de cultivo CD Para la producción en matraces de agitación de 500 mi se siembran 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la Para la las células se centrifugan 210 x g durante 5 el sobrenadante se sustituye por 20 mi de medio CD CHO calentado Los vectores de expresión se mezclan en 20 mi de medio CD CHO a una cantidad final de 200 de Después de la adición de 540 de solución se someten a remolino durante 15 s y subsecuentemente se incuban durante 10 min a temperatura Posteriormente las células se mezclan con la solución de se transfieren a un matraz de agitación de 500 y se incuban durante 3 horas a en un incubador con una atmósfera de Después del tiempo de incubación se agregan 160 mi de medio F17 y las células se cultivan durante 24 Un día después de la transfección se agrega ácido valproico 1 mM y de Feed Después de 7 días el sobrenadante de cultivo se recolecta para purificación por centrifugación durante 15 min a 210 x la solución se esteriliza por filtración de y se agrega azida de sodio en una concentración final de y se mantiene a La proteína secretada se purifica a partir de los sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad utilizando cromatografía de afinidad de proteína seguido por una etapa cromatográfica de exclusión de Para la cromatografía de afinidad el sobrenadante se carga en una columna HiTrap ProteinG HP 5 GE equilibrada con 30 mi de fosfato de sodio 20 citrato de sodio 20 pH La proteína que no se ha unido se separa por lavado de ambas columnas con 6 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 citrato de sodio 20 pH Subsecuentemente la columna se lava utilizando por lo menos 8 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 citrato de sodio 20 pH La proteína objetivo se eluye a partir de la columna HiTrap ProteinG HP utilizando un gradiente paulatino con 7 volúmenes de columna de ácido fórmico pH La solución de proteína se carga directamente en una columna HiLoad Superdex 200 equilibrada con fosfato de potasio 25 cloruro de sodio 125 solución de glicina 100 mM de pH La concentración de proteína de las muestras de proteína purificadas se determina al medir la densidad óptica por sus siglas en a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción molar calculado en base en la secuencia de La pureza y el peso molecular de la construcción se analiza por en presencia y ausencia de un agente reductor 5 y tinción con Coomassie SafeStain de Se utiliza el sistema de gel NuPAGEMR de acuerdo con las instrucciones del fabricante El contenido de agregado de las muestras de anticuerpo se analiza utilizando una columna de exclusión de tamaño analítica TSKgel G3000 SW XL en K2HPO425 NaCl 125 monoclorhidrato de 200 de pH de amortiguador de corrimiento El contenido final de monómero es de El análisis de producción y purificación de una molécula ejemplar con dos enlazantes consiste de dos SEC ID SEC ID con una orientación como se muestra en la figura se muestra en la figura Esta molécula se denomina adicionalmente como Fab o hu Fab Estabilidad térmica de la cadena ligera enlazada a La estabilidad térmica de la proteína se monitorea mediante dispersión de luz dinámica por sus siglas en 30 de muestra de proteína filtrada con una concentración de proteína de 1 se aplica por duplicado a un lector de placa Dynapro Technology La temperatura cambia paulatinamente de 25 a a con el radio y la intensidad de dispersión total Los resultados se muestran en la figura La estabilidad térmica se analiza para una molécula ejemplar de con dos enlazantes consiste de dos SEC ID SEC ID con una orientación como se muestra en la figura en comparación con la molécula La temperatura de agregación de la molécula de cadena ligera unida a se mide a La molécula es inferior a la molécula Crossfab con dos enlazantes puesto que comienza a agregarse ya desde los La molécula con dos enlazantes tiene una estabilidad superior y por lo tanto es más susceptible de desarrollo en comparación con la molécula EJEMPLO ANÁLISIS DE CON DOS ENLAZANTES Aislamiento de PBMC humanos primarios a partir de sangre fresca o capa leucocítica Se preparan células mononucleares de sangre periférica por sus siglas en mediante centrifugación por densidad Histopaque a partir de purificaciones linfocíticas enriquecidas obtenidas de bancos de sangre locales o a partir de sangre fresca de donadores humanos la sangre se diluye con PBS estéril y se estratifica cuidadosamente sobre un gradiente Histopaque Después de centrifugación durante 30 minutos a 450 x g a temperatura ambiente de parte del plasma por encima de la interfase que contiene PBMC se La transferencia de los PBMC a tubos Falcon nuevos de 50 mi y el llenado de los tubos con PBS hasta un volumen total de 50 El encendido del frenado y la centrífuga a temperatura durante 10 minutos a 400 x Se desecha el sobrenadante y se lava el sedimento de PBMC dos veces con PBS estéril de centrifugación a durante 10 minutos a 350 x La población de PBMC resultante se cuenta automáticamente y se almacena en medio RPMI1640 que contiene FCS y a de CO2 en el incubador hasta que se inicia el Análisis FACS de marcadores de activación de superficie sobre linfocitos T humanos primarios ante el acoplamiento de construcciones biespecíficas Para verificar en búsqueda de activación específica de linfocitos T ante la unión de construcciones biespecíficas de CD3 exclusivamente en presencia de células objetivo se incubaron PBMC humanos primarios con las concentraciones indicada de construcciones biespecíficas durante por lo menos 22 h en presencia ausencia de células objetivo positivas a millones de PBMC humanos primarios se sembraron en por en una placa de 96 pozos de fondo que contiene células objetivo positivas a MCSP La relación final célula efectora respecto a objetivo es Las células de incubaron con la concentración indicada de construcciones biespecíficas y controles para los tiempos de incubación a Las células efectoras se tiñeron para CD8 y el marcador de activación temprano CD69 o el marcador de activación tardío CD25 se analizaron por FACS Las figuras muestran los resultados de este Activación de linfocitos T y mediado por diferentes construcciones biespecíficas en presencia versus ausencia de células tumorales positivas a MCSP después de 24 horas medido como regulación por aumento de la mediana de fluorescencia de el porcentaje respectivo de células positivas CD69 Análisis de liberación de LDH Se analizaron construcciones biespecíficas dirigidas a CD3 sobre linfocitos T humanos y MCSP humano sobre células tumorales mediante análisis de liberación de LDH para determinar su potencial para inducir apoptosis mediada por linfocitos T de células se cosecharon células objetivo humano o células de melanoma con amortiguador de disociación de células en el día del análisis con tripsina un día antes de que se iniciara el se lavaron y resuspendieron en el medio de cultivo celular apropiado se Se sembraron en placas 20 000 30 000 células por pozo en una placa de 96 pozos de fondo plano y la dilución de anticuerpo respectiva se agregó según se ha indicado Las células efectoras se agregaron para obtener una relación final de Todas las construcciones y controles se ajustaron a la misma Para el lisis máximo de las células objetivo se obtiene por incubación de las células objetivo con una concentración final de La lisis mínima se refiere a células objetivo coincubadas con células pero sin construcción biespecífica Después de una incubación durante la noche durante por lo menos 22 h a se midió la liberación de LDH de células objetivo en el sobrenadante utilizando el kit de detección LDH Applied 644 793 de acuerdo con las instrucciones del La figura 26 muestra los resultados de este destrucción por liberación de de células de tumor positivas a MCSP bajo cocultivo con PBMC humanos tratados con diferentes construcciones biespecíficas de durante Los valores CE50 se determinaron utilizando el programa Graph Pad CEso Aunque se muestran y describen actualmente las modalidades preferidas de la deberá entenderse de modo distintivo que la invención no se limita a estas sino que se puede constituir de otra manera en diversas formas y se puede llevar a la práctica dentro del ámbito de las siguientes EJEMPLO MADURACIÓN POR AFINIDAD DE ANTICUERPO MCSP La maduración por afinidad se describe en la solicitud de patente Europea EP la cual se incorpora en la presente como referencia en su La maduración de afinidad se realiza por medio del procedimiento de mutagénesis dirigido a Para la variante de cadena pesada y la variante de cadena ligera ML2 se clonan en un vector similar a lo descrito por Hoogenboom et Nucleic Acids Los residuos que van a ser aleatorizados se identifican primero al generar un modelo 3D de ese anticuerpo por medio de elaboración de modelos por homología clásica y después al identificar los residuos accesibles a disolvente de las regiones determinadoras de complementariedad de la cadena pesada y Los oligonucleótidos con aleatorización basada en síntesis de trinucleótidos como se muestra en la tabla 3 se adquieren de Se generaron tres bibliotecas secundarias independientes por medio de PCR clásica y comprenden la aleatorización de junto con o junto con se aleatorizó en un enfoque Los fragmentos de ADN de estas bibliotecas se clonaron en el fagémido por medio de digestión de restricción y y subsecuentemente se sometieron a electroporación en bacterias Selección de bibliotecas Las variantes de anticuerpo generadas de esta manera se mostraron de manera monovalente a partir de partículas de fago filamentosas como fusiones al producto de gen III de M13 empacado dentro de cada Las variantes presentadas en fago después se cribaron para determinar sus actividades biológicas afinidad de y los candidatos que tienen una o más actividades mejoradas se utilizaron para desarrollo Los métodos para elaborar bibliotecas de presentación de fago se pueden encontrar en Lee et Las selecciones con todas las bibliotecas de maduración de afinidad se llevaron a cabo en solución de acuerdo con el siguiente unión de 1012 partículas de fagémido de cada una de las bibliotecas de maduración por afinidad a 100 nM de la forma biotinada de MCSP ID durante en un volumen total de 1 captura de la forma biotinada de y específicamente partículas de fago unidas por adición de x 107 esferas magnéticas recubiertas con estreptavidina durante 10 lavado de esferas utilizando de 1 mi de 20 y de 1 mi de elución de las partículas de fago por adición de 1 mi de TEA 100 mM durante 10 min y neutralización por adición de 500 de 1M de pH y reinfección de bacterias coli TG1 que crecen la infección con el fago cooperador VCSM13 y subsecuente precipitación con de las partículas de fagémido que se van a utilizar en rondas de selección Las selecciones se llevaron a cabo sobre rondas utilizando concentraciones ya sea constantes o en disminución a 12 x de En la ronda la captura de los complejos se realiza utilizando placas de neutravidina en vez de esferas de Los aglutinantes específicos se identifican por ELISA como 100 de 10 nM de la forma biotinada de por pozo se recubren sobre placas de Los sobrenadantes bacterianos que contienen Fab se agregan y los Fab de unión se detectan por medio de sus etiquetas Flag mediante la utilización de un anticuerpo secundario Los clones positivos por ELISA se expresan bacterialmente como fragmentos Fab solubles en el formato de 96 pozos y los sobrenadantes se someten a experimento de cribado cinético por análisis SPR utilizando ProteOn XRP36 Los clones que expresan Fab con las constantes de afinidad más altas se identifican y se secuencían los fagémidos TABLA 3 excluyen siempre Cys y Se excluye Lys en la parte superior en aquellos casos en donde el oligonucleótido es un cebador La aleatorización de cadena pesada se realiza únicamente en CDR1 y La aleatorización de cadena ligera se realiza en CDR1 y 2 e independientemente en Durante la selección algunas mutaciones en las infraestructuras se producen como F71Y en el clon G3 o Y87H en el clon Producción y purificación de IgGl humana La región variable de las secuencias de ADN de cadena pesada y ligera de las variantes maduras por afinidad se subclonan en marco con ya sea la cadena pesada constante o la cadena ligera constante insertadas previamente en el vector de expresión de mamífero receptor La expresión de anticuerpo se activa por un promotor MPSV y transporta una secuencia de señal poliA sintética en el extremo 3 del cada vector contiene una secuencia OriP de La molécula se produce por cotransfección de células con los vectores de expresión de mamífero utilizando Las células se transfectan con los vectores de expresión correspondientes en una relación Para se cultivan células HEK293 EBNA en suspensión libre de suero en medio de cultivo CD Para la producción en un matraz de agitación de 500 mi se siembran 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la Para la transfección las células se centrifugan 210 x g durante 5 el sobrenadante se sustituye por 20 mi de medio CD CHO calentado Los vectores de expresión se mezclan en 20 de medio CD CHO a una cantidad final de 200 de Después de la adición de 540 de solución se someten a remolino durante 15 s y subsecuentemente se incuban durante 10 min a temperatura Posteriormente las células se mezclan con una solución de se transfieren a un matraz de agitación de 500 mi y se incuban durante 3 horas a en un incubador con una atmósfera de Después del tiempo de incubación se agregan 160 mi de medio F17 y las células se cultivan durante 24 Un día después de la transfección se agrega ácido valproico 1 mM y Feed 1 Después de 7 días de cultivo el sobrenadante se recolecta para purificación por centrifugación durante 15 min a 210 x la solución se esteriliza por filtración de p y se agrega azida de sodio en una concentración final de y se mantiene a La proteína secretada se purifica a partir de los sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad utilizando proteína El sobrenadante se carga en una columna HiTrap ProteinA HP 5 GE equilibrada con 40 mi de fosfato de sodio 20 citrato de sodio 20 cloruro de sodio pH La proteína no unida es separada por lavado con por lo menos 10 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 citrato de sodio 20 cloruro de sodio pH La proteína objetivo se eluye durante un gradiente sobre 20 volúmenes de columna a partir de citrato de sodio 20 cloruro de sodio pH a citrato de sodio 20 cloruro de sodio pH La solución de proteína se neutraliza al agregar de fosfato de sodio pH La proteína objetivo se concentra y filtra antes de cargado en una columna HiLoad Superdex 200 equilibrada con histidina 20 solución de cloruro de sodio 140 mM de La concentración de proteína de las muestras de proteína purificada se determina al medir la densidad óptica por sus siglas en a 280 utilizando el coeficiente de extinción molar calculado en base en la secuencia de La pureza y el peso molecular de las moléculas se analiza por análisis en presencia y ausencia de un agente Se utiliza el sistema Caliper LabChip GXII de acuerdo con las instrucciones del Para los análisis se utilizan una muestra de 2 El contenido de agregado de las muestras de anticuerpo se analiza utilizando una columna de exclusión de tamaño analítica TSKgel G3000 XL en K2HPO4 25 NaCl 1215 monoclorhidrato de 200 aN3 pH de amortiguador de a DETERMINACIÓN DE AFINIDAD Análisis ProteOn Se mide KD mediante resonancia de plasmón de superficie utilizando una máquina ProteOn XPR36 a con anticuerpo de captura específico humano ImmunoResearch inmovilizado por acoplamiento amina en chips CM5 y captura subsecuente de Fab a partir de sobrenadante bacteriano o a partir de preparaciones de Fab se activan chips de biosensor de dextrano carboximetilados GE con clorhidrato de por sus siglas en y de acuerdo con las instrucciones del Se diluye anticuerpo de captura específico humano con acetato de sodio 10 pH a 50 antes de inyección a un caudal de 10 para obtener aproximadamente unidades de respuesta por sus siglas en de anticuerpo de captura Después de la inyección del anticuerpo de se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han Para mediciones los Fab del sobrenadante bacteriano o los Fab purificados se inyectan a un caudal de 10 durante 300 s y una disociación de 300 s para estabilización de los valores iniciales de Los niveles de captura están en el intervalo de 500 En una etapa se inyecta el analito MCSP humano ya sea como una concentración única o como una serie de concentraciones base en la afinidad de clon en un intervalo entre 100 y 250 diluido en HEPES 10 NaCl 150 EDTA 3 tensioactivo pH a a un caudal de 50 La superficie del chip sensor se regenera por inyección de glicina pH durante 30 s a 90 seguido por inyección de NaOH durante 20 s al mismo Las tasas de asociación y las tasas de disociación se calculan utilizando el modelo de unión de Langmuir uno a uno sencillo de evaluación ProteOn XPR36 o programa Scrubber al ajustar simultáneamente los sensogramas de asociación y de Se calcula la constante de disociación al equilibrio como la relación Estos datos se utilizan para determinar la afinidad de unión comparativa de las variantes maduradas de afinidad con el anticuerpo La tabla 4a muestra los datos generados a partir de estos Se seleccionan C5 para la cadena ligera y C1 para la cadena pesada para la conversión al formato IgGl Puesto que CDR1 y 2 de la cadena ligera se aleatorizan independientemente de los CDR obtenidos se combinan durante la conversión de En las afinidades de formato IgG se miden nuevamente para el antígeno MCSP humano además también para el homólogo de El método es exactamente como se describe en los fragmentos la IgG recién purificada de producción de mamífero es la que se TABLA CLONES MADURADOS POR AFINIDAD DE DATOS DE ProteOn Determinación de afinidad por resonancia de plas ón de superficie utilizando Biacore T200 Los experimentos de resonancia de plasmón de superficie para determinar la afinidad y la avidez de las IgG maduradas por afinidad se realiza en un equipo Biacore T200 a con como amortiguador de corrimiento pH NaCl EDTA 3 tensioactivo Para analizar la avidez de la interacción de diferentes IgG para MCSP D3 de humano y de macaco el acoplamiento directo de aproximadamente unidades de resonancia por sus siglas en del anticuerpo His se realiza en un chip CM5 a pH utilizando el kit de acoplamiento amina estándar Los antígenos se capturan durante 60 s a 30 nM con 10 Las IgG se hacen pasar a una concentración de 100 nM con un caudal de 30 a través de las células de flujo sobre 280 La disociación se monitorea durante 180 Las diferencias de índice de refracción a granel se corrigen al restar la respuesta obtenida en la célula de flujo de las IgG se hacen fluir sobre una superficie con anticuerpo His inmovilizado pero sobre las cuales se ha inyectado en vez de MCSP D3 humano o MCSP D3 de Para mediciones de afinidad las IgG se capturan sobre una superficie de chip sensor CM5 con humano La IgG de captura se acopla a la superficie de chip sensor mediante inmovilización directa de aproximadamente unidades de resonancia a pH utilizando el kit de acoplamiento amina estándar Las IgG son capturadas durante 25 s a 10 nM con 30 Se hacen pasar MCSP D3 de humano y de macaco a una concentración de nM con un caudal de 30 a través de las células de flujo durante 120 La disociación se monitorea durante 60 La asociación y la disociación para concentración 166 y 500 nM se monitorea durante 1200 y 600 Las diferencias de índice de refracción a granel se corrigen al restar la respuesta obtenida en la célula de flujo de los antígenos fluyen sobre una superficie con anticuerpo humano inmovilizado pero sobre el cual se ha inyectado en vez de IgG anti Las constantes cinéticas se derivan utilizando el programa de evaluación Biacore T200 Biacore para ajustar las ecuaciones de velocidad para unión Langmuir mediante integración Una afinidad mayor a MCSP D3 de humano y de macaco se confirmó mediante mediciones de resonancia de plasmón de superficie utilizando el equipo Biacore las mediciones de avidez mostraron un incremento de hasta 3 veces en la unión bivalente TABLA AFINIDAD Y AVIDEZ DE IgGs PARA HUMANO Y MCSP D3 DE MACACO BREVE DESCRIPCION DEL LISTADO DE SECUENCIAS GA201 Enlazante 3F2 Enlazante CH1A1A Enlazante CEA SECUENCIAS DE PROTEÍNAS Secuencias de enlazantes CD3 humanizados y enlazantes MCSP madurados por afinidad Secuencias de ADN Aunque se han mostrado y descrito las modalidades de la invención preferidas debe entenderse de modo distintivo que la invención no se limita a las mismas sino de otra puede estar constituida de modos diversos y se puede llevar a la práctica dentro del ámbito de las siguientes Se hace constar que con relación a esta el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada es el que resulta claro de la presente descripción de la insufficientOCRQuality

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un anticuerpo biespecífico caracterizado porque comprende por lo menos dos fragmentos Fab, en donde el primer fragmento Fab comprende por lo menos un sitio específico de unión a antígeno para un primer antígeno; y el segundo fragmento Fab comprende por lo menos un sitio específico de unión a antígeno para un segundo antígeno, en donde cualquiera de las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del segundo Fab están intercambiadas; y los dos fragmentos Fab están conectados entre si por dos enlazantes peptídicos y en donde el anticuerpo biespecífico carece de un dominio Fe.

2. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque adicionalmente comprende un tercer fragmento Fab.

3. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el tercer fragmento Fab comprende por lo menos un sitio que une antígeno específico para el primero o segundo antígeno.

4. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el tercer fragmento Fab comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para el primer antígeno.

5. El anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque el tercer fragmento Fab está conectado al primer fragmento Fab por uno o dos enlazantes peptídicos.

6. El anticuerpo biespecífico de conformidad con las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque el tercer fragmento Fab está conectado al segundo fragmento Fab por uno o dos enlazantes peptídicos.

7. El anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el primer fragmento Fab comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para un antígeno tumoral; y el segundo fragmento Fab comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para un antígeno activador de linfocitos T.

8 El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el antígeno activador de linfocitos T es un antígeno co-receptor de linfocitos T CD3 (CD3).

9. El anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste de proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), antígeno carcinoembriónico (CEA), proteína de activación de fibroblastos (FAP) y CD33.

10. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el antígeno tumoral es MCSP.

11. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un anticuerpo biespecífico de conformidad con las reivindicaciones 1 a 10.

12. El anticuerpo biespecífico de conformidad con las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque es para el tratamiento de cáncer.

13. El anticuerpo biespecífico de conformidad con las reivindicaciones 1 a 10, para usarse como un medicamento.

14. El uso del anticuerpo biespecífico de conformidad con las reivindicaciones 1 a 10, en la elaboración de un medicamento.

15. El uso de conformidad con la reivindicación 14, en donde el medicamento es para el tratamiento de cáncer.

16. Una célula hospedadora procariótica o eucariótica caracterizada porque comprende vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican para las cadenas ligeras y cadenas pesadas del anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

17. Un método para producir un anticuerpo caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 16 de manera que se produzca el anticuerpo.