CN117120471A - 结合cd3的多特异性抗原结合蛋白及其用途 - Google Patents

结合cd3的多特异性抗原结合蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种多特异性抗原结合蛋白，其包含针对CD3的结合部分。本申请还提供了多特异性抗原结合蛋白在制备用于激活T细胞和/或治疗肿瘤的药物中的用途。

Description

结合CD3的多特异性抗原结合蛋白及其用途
发明背景
双特异性抗体可以同时识别两个不同的靶标并且能够激活更多细胞的调节机制，其在治疗肿瘤和其他疾病方面可能具有巨大潜力。T细胞衔接器双特异性抗体是典型的双特异性抗体。它可以形成免疫突触，即通过同时结合T细胞表面抗原(诸如CD3)和肿瘤细胞表面抗原(诸如CD19)来形成免疫突触。双特异性抗体可以缩短肿瘤细胞与T细胞之间的距离，随后直接激活T细胞并使T细胞增殖，并且激活的T细胞直接杀死肿瘤细胞和/或释放细胞毒素来杀死肿瘤细胞。因此，双特异性抗体激活T细胞的过程并不涉及向T细胞呈递肿瘤抗原来生成特异性T淋巴细胞克隆。因此，该过程不受MHC或HLA的限制并且非常适合临床使用。
CD3(分化簇3)是在大多数T细胞表面上表达的蛋白质复合物。它可以传递MHC-TCR结合信号并激活T细胞，使其成为T细胞衔接器双特异性抗体的理想结合位点。第一代抗CD3药物已经取得了巨大成功。然而，为了提高安全性(例如，为了避免发生细胞因子释放综合征(CRS))，还需要对合理控制T细胞的激活和/或细胞因子的释放进行改进。降低CRS的发生率不仅会促进T细胞衔接器双特异性抗体在血液学癌症中的治疗应用，而且会在实体瘤应用中取得重大进展。因此，迫切需要提供更有效和更安全的针对CD3的多特异性抗体和相应的人源化抗CD3抗体。
发明内容
本申请提供了一种多特异性抗原结合蛋白，其包含针对CD3的结合部分，并且针对CD3的结合部分包含来自SEQ ID NO:8的重链可变区VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3区域，和/或来自SEQ ID NO:7的轻链可变区VH的LCDR1、LCDR2和LCDR3区域。多特异性抗原结合蛋白可以进一步包含针对肿瘤相关抗原(TAA)的结合部分。本申请的多特异性抗原结合蛋白可以用于制备用于预防、缓解和/或治疗肿瘤的药物。本申请的多特异性抗原结合蛋白可以更有效的杀死肿瘤细胞。本申请的多特异性抗原结合蛋白可以在施用受试者中表现出更好的安全性特征，例如，可以诱导减少的T细胞介导的细胞因子释放。本申请的多特异性抗原结合蛋白和/或针对CD3的结合部分表现出显著增强的与CD3的结合亲和力。
一方面，本申请提供了一种包含CD3结合部分的多特异性抗原结合蛋白，其中该CD3结合部分包含与重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且HCDR1具有SEQ ID NO:4、37、45和53中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2具有SEQ IDNO:5、38、46和54中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3具有SEQ ID NO:6、39、47和55中任一个所示的氨基酸序列，和/或该CD3结合部分包含与轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且LCDR1具有SEQ ID NO:1、40、48和56中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2具有SEQ ID NO:2、41、49和57中任一个所示的氨基酸序列；LCDR3具有SEQ IDNO:3、42、50和58中任一个所示的氨基酸序列，其中该CD3结合部分诱导T细胞激活。
在一些实施方式中，CD3结合部分包含重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且HCDR1具有SEQ ID NO:4、37、45和53中任一个所示的氨基酸序列，HCDR2具有SEQ ID NO:5、38、46和54中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3具有SEQ ID NO:6、39、47和55中任一个所示的氨基酸序列，和/或CD3结合部分包含轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且LCDR1具有SEQ ID NO:1、40、48和56中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2具有SEQ ID NO:2、41、49和57中任一个所示的氨基酸序列；LCDR3具有SEQ ID NO:3、42、50和58中任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有SEQ ID NO:4、5和6中所示的序列，和/或轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:1、2和3中所示的序列；重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有SEQ ID NO:37、38和39中所示的序列，和/或轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:40、41和42中所示的序列；重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有SEQ ID NO:45、46和47中所示的序列，和/或轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:48、49和50中所示的序列；或者重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有SEQ ID NO:53、54和55中所示的序列，和/或轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:56、57和58中所示的序列。
在一些实施方式中，CD3结合部分包含与重链可变区具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且重链可变区具有SEQ ID NO:8、35、43和51中任一个所示的氨基酸序列；和/或CD3结合部分包含与轻链可变区具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且轻链可变区具有SEQ ID NO:7、36、44和52中任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，重链可变区具有SEQ ID NO:8、35、43和51中任一个所示的氨基酸序列；和/或轻链可变区具有SEQ ID NO:7、36、44和52中任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，CD3结合部分包含与SEQ ID NO:8的重链可变区和/或SEQ IDNO:7的轻链可变区具有至少80％同一性的氨基酸序列；CD3结合部分包含与SEQ ID NO:35的重链可变区和/或SEQ ID NO:36的轻链可变区具有至少80％同一性的氨基酸序列；CD3结合部分包含与SEQ ID NO:43的重链可变区和/或SEQ ID NO:44的轻链可变区具有至少80％同一性的氨基酸序列；或者CD3结合部分包含与SEQ ID NO:51的重链可变区和/或SEQ IDNO:52的轻链可变区具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，CD3结合部分包含SEQ ID NO:8的重链可变区和/或SEQ IDNO:7的轻链可变区；CD3结合部分包含SEQ ID NO:35的重链可变区和/或SEQ ID NO:36的轻链可变区；CD3结合部分包含SEQ ID NO:43的重链可变区和/或SEQ ID NO:44的轻链可变区；或者CD3结合部分包含SEQ ID NO:51的重链可变区和/或SEQ ID NO:52的轻链可变区。
在一些实施方式中，VH包括框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4。
在一些实施方式中，针对CD3的结合部分包含抗体重链恒定区。
在一些实施方式中，针对CD3的结合部分包含源自IgA、IgG、IgD、IgE或IgM抗体的抗体重链恒定区。
在一些实施方式中，抗体重链恒定区包含IgG恒定区。
在一些实施方式中，抗体重链恒定区包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，VL包括框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。
在一些实施方式中，针对CD3的结合部分包含抗体轻链恒定区。
在一些实施方式中，针对CD3的结合部分包含源自IgA、IgG、IgD、IgE或IgM抗体的抗体轻链恒定区。
在一些实施方式中，抗体轻链恒定区包含Igк恒定区。
在一些实施方式中，抗体轻链恒定区包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，针对CD3的结合部分包含抗体或其抗原结合片段。
一方面，多特异性抗原结合蛋白的CD3结合部分为人源化来源。
在一些实施方式中，针对CD3的人源化结合部分包含与SEQ ID NO:27的重链可变区和/或SEQ ID NO:31的轻链可变区具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，针对CD3的人源化结合部分包含与SEQ ID NO:28的重链可变区和/或SEQ ID NO:31的轻链可变区具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，针对CD3的人源化结合部分包含SEQ ID NO:27的重链可变区和/或SEQ ID NO:31的轻链可变区。
在一些实施方式中，针对CD3的人源化结合部分包含SEQ ID NO:28的重链可变区和/或SEQ ID NO:31的轻链可变区。
在一些实施方式中，抗原结合片段包含Fab、Fab'、F(ab)2、Fv片段、F(ab')2、scFv、di-scFv和/或dAb。
在一些实施方式中，抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体。
在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白由宿主细胞的重组表达产生。
在一些实施方式中，表达多特异性抗原结合蛋白的宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞、植物细胞、哺乳动物细胞或病毒。
在一些实施方式中，细菌细胞是大肠埃希菌(E.coli.)。
在一些实施方式中，真菌细胞是酵母细胞。
在一些实施方式中，哺乳动物细胞选自CHO、NSO、BHK或HEK293细胞。
在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白由杂交瘤细胞产生。
在一些实施方式中，杂交瘤细胞选自小鼠、大鼠或兔。
在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白的形式选自双特异性抗体、双特异性双链抗体、双特异性scFv、TandAb、三价结合分子或四价结合分子。
在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白包含针对至少一种肿瘤相关抗原(TAA)的结合部分。
在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白的TAA选自包含以下的组：EPCAM、CCR5、CD19、HER2、HER3 neu、HER3、HER4、EGFR、PSMA、CEA、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUC7、βhCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神经节苷脂GD3、9-0-乙酰基-GD3、GM2、globo H、岩藻糖基GM1、Poly SA、GD2、RON、c-Met、CEACAM-6、PCTA-1、PSA、PAP、ALCAM(CD166)、PECAM-1、CD151、MAGE-1、TROP2、IGF1 R.TGFBR2、GHRHR、GHR、IL-6R、gpl30、TNFR2、OSMRp、Patched-1、Frizzled、Robol、LTpR、CD26、CD27、CD44、CD80、CD81、CD86、CD100、CXCR4、SAS、BCMA、TWEAKR/Fnl4、FGFR4、VEGFR1、VEGFR2、SSX1和SSX2、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、CD44v6、SonicHedgehog(Shh)、Wue-1、浆细胞抗原、(膜结合)IgE、黑色素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、CCR8、TNF-α前体、STEAP、间皮素、A33抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、Ly-6；桥粒芯蛋白4、E-钙粘蛋白新表位、胎儿乙酰胆碱受体、CD25、CA19-9标记物、CA-125标记物和穆勒氏抑制物质(MIS)受体II型、sTn(唾液酸Tn抗原，TAG72)、FAP(成纤维细胞激活抗原)、内皮唾酸蛋白、EGFRvIII、L6、SAS、CD63、TF-抗原、Cora抗原、CD7、CD79b、CD22、Igα、Igβ、gp100、MT-MMPs、F19-抗原、CO-29和EphA2。
在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白包含针对HER2的结合部分。
在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白的针对HER2的结合部分包含与分别具有SEQ ID NO:12、13和14中所示的序列的重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3，和/或分别具有SEQ ID NO:9、10和11中所示的序列的轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白的针对HER2的结合部分包含分别具有SEQ ID NO:12、13和14中所示的序列的重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3，和/或分别具有SEQ ID NO:9、10和11中所示的序列的轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中CD3结合部分诱导T细胞激活。
在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白的针对HER2的结合部分包含与SEQ IDNO:16的重链可变区和/或SEQ ID NO:15的轻链可变区具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白的针对HER2的结合部分包含SEQ IDNO:16的重链可变区和/或SEQ ID NO:15的轻链可变区。
在一些实施方式中，针对HER2的结合部分包含抗体重链恒定区。
在一些实施方式中，针对HER2的结合部分包含源自IgA、IgG、IgD、IgE或IgM抗体的抗体重链恒定区。
在一些实施方式中，抗体重链恒定区包含IgG恒定区。
在一些实施方式中，抗体重链恒定区包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，针对HER2的结合部分包含抗体轻链恒定区。
在一些实施方式中，针对HER2的结合部分包含源自IgA、IgG、IgD、IgE或IgM抗体的抗体轻链恒定区。
在一些实施方式中，HER2抗体轻链恒定区包含Igк恒定区。
在一些实施方式中，HER2抗体轻链恒定区包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，针对HER2的结合部分包含抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，针对HER2的抗原结合片段包含Fab、Fab'、F(ab)2、Fv片段、F(ab')2、scFv、di-scFv和/或dAb。
在一些实施方式中，针对HER2的抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体。
在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白包含针对CD20的结合部分。
在一些实施方式中，针对CD20的结合部分的重链可变区VH包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，针对CD20的结合部分的轻链可变区VL包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，针对CD3的结合部分包含第一多肽链和第二多肽链，其中第一多肽链包含抗体的与CD3结合的重链可变区VH，并且第二多肽链包括抗体的与CD3结合的轻链可变区VL。
在一些实施方式中，针对TAA的结合部分包含第三多肽链和第四多肽链，其中第三多肽链包含与TAA结合的抗体的重链可变区VH，并且第四多肽链包含与TAA结合的抗体的轻链可变区VL。
在一些实施方式中，第三多肽链包含抗体的与HER2结合的重链可变区VH，并且第四多肽链包含抗体的与HER2结合的轻链可变区VL。
在一些实施方式中，与HER2结合的抗体的重链可变区VH包含SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列，并且与HER2结合的抗体的轻链可变区VL包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列，或者与HER2结合的抗体的重链可变区VH包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列，并且与HER2结合的抗体的轻链可变区VL包含SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，第三多肽链包含抗体的与CD20结合的重链可变区VH，并且第四多肽链包含抗体的与CD20结合的轻链可变区VL。
在一些实施方式中，与CD20结合的抗体的重链可变区VH包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列，并且与CD20结合的抗体的轻链可变区VL包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了一种或多种分离的核酸分子，其编码本申请的多特异性抗原结合蛋白。
另一方面，本申请提供了一种载体，其包含本申请的分离的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含本申请的分离的核酸分子和/或本申请的载体。
另一方面，本申请提供了一种制备本申请的多特异性抗原结合蛋白的方法，其中该方法包括在使得能够表达本申请的多特异性抗原结合蛋白的条件下培养本申请的细胞。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含本申请的多特异性抗原结合蛋白、本申请的分离的核酸分子、本申请的载体和/或本申请的细胞以及任选的药学上可接受的佐剂。
另一方面，本申请提供了本申请的多特异性抗原结合蛋白、本申请的分离的核酸分子、本申请的载体、本申请的细胞和/或本申请的药物组合物在制备用于预防、缓解和/或治疗肿瘤的药物中的用途。
另一方面，本申请提供了用于预防、缓解和/或治疗肿瘤的本申请的多特异性抗原结合蛋白、本申请的分离的核酸分子、本申请的载体、本申请的细胞和/或本申请的药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种预防、缓解和/或治疗肿瘤的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本申请的多特异性抗原结合蛋白、本申请的分离的核酸分子、本申请的载体、本申请的细胞和/或本申请的药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种预防、缓解和/或治疗受试者肿瘤的方法，其中肿瘤包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、鳞状细胞肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠道癌、食管癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、泌尿系统癌、肝细胞癌(HCC)、肛门癌、阴茎癌、头颈癌或其他类型的癌症。
另一方面，本申请提供了一种激活T细胞、靶向在T细胞上表达的CD3和/或促进T细胞与肿瘤细胞之间的相互作用的方法，该方法包括施用本申请的多特异性抗原结合蛋白、本申请的分离的核酸分子、本申请的载体、本申请的细胞和/或本申请的药物组合物。
通过下面的详细说明，本申请的其他方面和优点对于本领域的技术人员来说将是显而易见的，其中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请能够具有其他和不同的实施方式，并且其若干细节也能够在各种显而易见的方面进行适当修改，所有这些都不会偏离本公开发明的精神。因此，附图和说明书应被视为本质上是说明性的，而不是限制性的。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以相同程度并入本文，如同每个单独的出版物、专利或专利申请均被具体和单独指出通过引用并入。
附图说明
本发明的新颖特征在所附的权利要求中作了具体阐述。通过参考采用本发明原理阐述说明性实施方式的以下详细描述以及附图(也是本文中的“图(figure)”和“图(FIG.)”)将更好地理解本发明的特征和优点，其中：
图1示出了本申请的多特异性抗原结合蛋白的结构。
图2示出了本申请的多特异性抗原结合蛋白的Western印迹的结果。
图3示出了本申请的多特异性抗原结合蛋白的SDS-PAGE的结果。
图4示出了本申请的多特异性抗原结合蛋白的F(ab)'2片段结构。
图5示出了本申请的多特异性抗原结合蛋白的F(ab)'2片段结构。
图6-7示出了本申请的多特异性抗原结合蛋白的SDS-PAGE的结果。
图8示出了本申请的多特异性抗原结合蛋白与Jurkat细胞的结合亲和力。
图9示出了hHER2×CD3和rHER2×CD3对SK-BR-3细胞的细胞毒性。
图10示出了本申请的多特异性抗原结合蛋白对SK-BR-3细胞的细胞毒性。
图11示出了本申请的多特异性抗原结合蛋白对SU-DHL-8细胞的细胞毒性。
图12示出了pTT5载体的图。
图13A-13F示出了抗CD3 mAb的western印迹和SDS-PAGE的结果。图13A、图13C和图13E分别示出了C3000、C3002-1和C3002-2的Western印迹的结果。图13B、图13D和图13F的第1列分别示出了C3000、C3002-1和C3002-2的还原SDS-PAGE的结果。图13B、图13D和图13F的第2列分别示出了C3000、C3002-1和C3002-2的非还原SDS-PAGE的结果。
图14示出了抗CD3 mAb C3000、C3002-1和C3002-2与CD3ε和CD3γ异源二聚体蛋白的结合亲和力。
图15示出了由hHER2×CD3和rHER2×CD3介导的T细胞对SK-BR-3细胞的细胞毒性。
具体实施方式
虽然本文显示和描述了本发明的各种实施方式，但对于本领域技术人员显而易见的是，此类实施方式仅以示例的方式提供。本领域技术人员可以在不偏离本发明的情况下进行大量的变化、改动和替换。应该理解的是，可以采用本文所述的本发明实施方式的各种替代方式。
如本文所用，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”通常包括复数形式，除非上下文另有明确规定。
在本申请中，如本文所用，术语“抗原结合蛋白”一般是指蛋白质，其包含与抗原结合的部分以及任选的使抗原结合部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或框架部分。抗原结合蛋白的实例可以包括抗体、抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。例如，抗原结合蛋白可以具有天然存在的免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”是四聚体分子。在天然存在的免疫球蛋白中，每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对多肽链具有一条轻链(LC)和一条重链(HC)。每条链的氨基末端部分可以包含主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分定义主要负责效应子功能的恒定区。人轻链可以分类为κ或λ轻链。重链可以分类为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgM、IgG、IgD、IgA和IgE。天然存在的免疫球蛋白链的可变区可以表现出与三个超变区(也称为互补决定区或CDR)连接的相对保守的框架区(FR)相同的一般结构。从N末端到C末端，轻链和重链都可以包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
在本申请中，如本文所用，术语“CDR”一般是指抗原结合蛋白的互补决定区氨基酸序列。这些是免疫球蛋白重链和轻链的超变区。免疫球蛋白的可变部分中存在三个重链和三个轻链CDR(或CDR区域)。对于本领域的技术人员来说显而易见的是，存在针对CDR序列的多种编号系统，例如Chothia(Chothia等人，(1989)《自然》342:877-883)、Kabat(Kabat等人，具有免疫学意义的蛋白质序列，国家卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州。(1987和1991))。Chothia编号系统用于对本公开的抗体中的残基进行编号。
在本申请中，如本文所用，术语“抗原结合片段”一般是指免疫球蛋白分子的一部分。抗原结合片段可以包含一条轻链和重链带有单一抗原结合位点的部分。抗原结合片段可以通过酶消化免疫球蛋白分子获得。例如，抗原结合片段可以由重链和轻链中的每一个的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。可变结构域可以含有在免疫球蛋白分子氨基末端处的互补位(抗原结合位点)，其包含一组互补决定区。
在本申请中，如本文所用，术语“Fv片段”一般是指重链和轻链的全部或部分可变区，而不包括重链和轻链的恒定区。例如，重链和轻链的可变区可以包含CDR。
在本申请中，如本文所用，术语“ScFv”一般是指单链抗体片段。ScFv可以是重组单链多肽分子，其中抗体的轻链和重链可变区直接或经由肽接头连接。
在本申请中，如本文使用，术语“Fab”一般是指抗体片段，其包含含有由铰链区至少一个二硫键连接的重链多肽的两个N末端部分和两个完整的轻链多肽的片段。例如，每条轻链可以与重链的一个N末端部分络合。Fab还可以包含含有与重链多肽(例如VHCH1)的N末端部分络合的轻链多肽(例如VLCL)的全部或大部分的Fab片段。
在本申请中，如本文所用，术语“Fab”一般是指作为F(ab')2片段还原产物的抗体片段。Fab'片段与Fab片段的不同之处可以在于在CHI结构域的羧基末端处具有几个额外的残基，包括抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在本文可以指恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离硫醇基团的Fab'。
在本申请中，如本文所用，术语“F(ab)2”一般是指能够与抗原结合但没有Fc部分的单价抗体结构。F(ab)2可以是被木瓜蛋白酶消化产生两个F(ab)片段(每个片段约50kDa)和Fc片段的抗体。
在本申请中，如本文所用，术语“F(ab')2”一般是指包含由二硫键连接的两个Fab片段和部分铰链区的抗体片段。F(ab')2可以通过胃蛋白酶消化完整抗体产生。F(ab')2片段可以具有二价抗原结合活性并且可能能够与抗原交联。
在本申请中，如本文所用，术语“全人抗体”一般是指具有全人氨基酸序列衍生抗体的抗体，其中已经通过使用遗传修饰小鼠在体内选择或通过抗体工程化过程联合筛选选择抗原特异性。
在本申请中，术语“单克隆抗体”一般是指一组基本同源的抗体，也就是说，除了可能的痕量天然存在突变外，该组中包括的每个抗体都是相同的。单克隆抗体被理解为由相同细胞制成的抗体，这些细胞都是独特的母细胞的克隆，相比之下，多克隆抗体则是由若干不同的免疫细胞制备而成。例如，单克隆抗体可以通过杂交瘤技术制备，或通过DNA重组方法在细菌、真核动物或植物细胞中产生。另外，单克隆抗体也可以由噬菌体抗体文库通过使用如Clackson等人(《自然》,352:624-628(1991))和Marks等人(《分子生物学》，222:581-597(1991))中所述的技术来制备。
在本申请中，术语“嵌合抗体”一般是指以下抗体，其中每条重链或轻链的氨基酸序列的一部分与来自特定物种的抗体的相应氨基酸序列同源或属于特定类别，并且链的其余部分与另一物种的相应序列同源。例如，轻链和重链的可变区都可以源自来自一个动物物种(例如，小鼠、大鼠等)的抗体的可变区，而恒定部分则与来自另一物种(例如，人)的抗体序列同源。例如，为了获得嵌合抗体，可使用非人B细胞或杂交瘤细胞生成可变区，并且与该可变区组合的恒定区源自人类。可变区可以具有易于制备的优点，并且其特异性可能不会受到与其组合的恒定区来源的影响。同时，由于嵌合抗体的恒定区可以源自人类，因此嵌合抗体在注射时诱导免疫应答的可能性低于恒定区源自非人来源的抗体在注射时诱导免疫应答的可能性。
在本申请中，术语“人源化抗体”一般是指通过降低源自非人类物种(例如小鼠或大鼠)的抗体、免疫球蛋白结合蛋白和多肽对人类的免疫原性同时仍保留原始抗体的抗原结合特性而获得的工程化抗体。例如，可以使用包括以下的技术手段：CDR移植(Jones等人，《自然》，321:522(1986))及其变体，包括“重构”(Verhoeyen等人，1988《科学》，239:1534-1536；Riechmann等人，1988《自然》，332:323-337；Tempest等人，《生物技术》，19919:266-271)、“高度加成”(Queen等人，1989《美国国家科学院院刊》，86:10029-10033；Co等人，1991《美国国家科学院院刊》，88:2869-2873；Co等人，1992《免疫学杂志》，148:1149-1154)和“贴面”
(Mark等人，“具有治疗活性的人源化和贴面抗CD18抗体的衍生.”，MetcalfBW,Dalton BJ,eds.细胞粘附：治疗潜力的分子定义纽约：普伦姆出版社,1994:291-312)等以对非人结合结构域进行人源化。如果其他区域(诸如铰链区和恒定区结构域)也可以源自非人来源，则这些区域也可以被人源化。
在本申请中，如本文所用，术语“CD3”一般是指包含CD3的TCR复合物。在哺乳动物中，CD3是由四条链(即CD3γ、CD3δ和两条CD3ε链)构成的蛋白质复合物，可以与称为T细胞受体(TCR)的分子和ζ-链和η-链(作为同源或异源二聚体)结合并在T淋巴细胞中生成激活信号。这些CD3分子的细胞内尾包含单一的保守基序，称为“基于免疫受体酪氨酸的激活基序”或缩写为ITAM，该基序对TCR的信号传导能力至关重要。CD3-γ、-δ和-ε链以及ζ-和η-链(也称为CD3-ζ和CD3-η链)与TCR一起形成所谓的T细胞受体复合物。
在本申请中，如本文所用，术语“HER2”一般是指ErbB-2、NEU、HER-2或CD340，可以指表皮生长因子受体2(例如，人HER2，SwissProt P04626)及其任何变体、同种型和物种同源物。HER2可以在包括肿瘤细胞在内的细胞中天然表达，或者也可以通过转染HER2基因或cDNA在细胞中表达。
在本申请中，如本文所用，术语“CD20”一般是指骨髓衍生的淋巴细胞抗原CD20，也称为骨髓衍生的淋巴细胞表面抗原B1或白细胞表面抗原Leu-16，并且可以包括来自任何脊椎动物来源的任何天然CD20，包括哺乳动物，诸如为动态对象的灵长类动物(诸如人)、非人灵长类动物和啮齿类动物(诸如小鼠和大鼠)。Uniprot登录号PI 1836中显示的是人CD20的氨基酸序列。CD20是一种疏水性跨膜蛋白，分子量为约35kD，并且可以在前B淋巴细胞和成熟的骨髓衍生的淋巴细胞上表达。
在本申请中，如本文所用，术语“肿瘤相关抗原”一般是指可以由肿瘤细胞以比相同组织类型的非肿瘤细胞更高的频率或密度表达的分子或复合物。肿瘤相关抗原可以是宿主通常不表达的抗原；并且它们可以是宿主正常表达的分子的突变、截短、错误折叠或其他异常表现；它们可以与正常表达的分子相同，但表达水平异常高；或者它们可以在异常的环境或背景中表达。例如，肿瘤相关抗原可以是蛋白质或蛋白质片段、复合碳水化合物、神经节苷脂、半抗原、核酸，或这些或其他生物分子的任意组合。例如，肿瘤相关抗原可以包括HER2和/或CD20。
在本申请中，如本文所用，术语“激活”一般是指由刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体的结合诱导从而介导信号转导事件的主要应答。例如，激活可以包括经由TCR/CD3复合物的信号转导。
在本申请中，如本文所用，术语“T细胞与肿瘤细胞之间的相互作用”一般是指T细胞与肿瘤细胞之间的反应，该反应导致对免疫系统(例如，经由T细胞)识别的肿瘤细胞产生负选择压力。因此，在肿瘤细胞中，可以通过下调对抗原处理和呈递或共刺激而言重要的分子来降低T细胞识别。
在本申请中，如本文所用，术语“治疗”一般是指试图改变被治疗个体或细胞自然过程的临床干预。治疗可以出于预防目的而进行或者可以在临床病理过程期间进行。期望的效果可以包括防止疾病发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病进展速度、改善或缓和疾病状态、以及缓解或改进预后。
在本申请中，如本文所用，术语“受试者”一般是指哺乳动物。例如，受试者可以是人。例如，受试者可以是非人哺乳动物。非人哺乳动物可以包括农场动物、运动动物和宠物。
在本申请中，术语“多特异性”一般是指双特异性、三特异性或多特异性抗原结合的特征。多特异性抗原结合蛋白可以对一个靶多肽的不同表位具有特异性，或者可以含有对多于一个靶多肽的表位具有特异性的抗原结合结构域。多特异性抗原结合蛋白可以是单一的多功能多肽，或者可以是两个或更多个共价或非共价彼此结合的多肽的多聚体复合物。术语“多特异性抗原结合蛋白”可以包含本申请的抗体和/或本申请的抗原结合片段。例如，本申请的抗体和/或抗原结合片段可以与一个或多个其他分子实体(诸如蛋白质或其片段)功能连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)，以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗原结合蛋白。根据本申请，术语“多特异性抗原结合蛋白”还可以包含双特异性、三特异性或多特异性抗体或其抗原结合片段。
在本申请中，如本文所用，术语“一种或多种分离的核酸分子”一般是指从其天然环境中分离出来的或人工合成的任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。
在本申请中，如本文所用，术语“一种或多种载体”一般是指核酸媒介物，可以将编码蛋白质的多核苷酸插入该媒介物中并在该媒介物中进行表达。可以通过用载体转化、转导或转染宿主细胞在宿主细胞中表达载体所携带的遗传物质元件。载体的实施方式包括：质粒；噬菌体；粘粒；人工染色体，诸如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或PI衍生的人工染色体(PAC)；噬菌体，诸如λ噬菌体或M13噬菌体以及动物病毒。载体可以含有各种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。此外，载体还可以含有复制源。载体还可能包括有助于其进入细胞的组分，诸如病毒颗粒、脂质体或蛋白质壳，但不仅仅是这些物质。
在本申请中，如本文所用，术语“细胞”一般是指可以用于携带本公开的一种或多种载体，或用于表达或产生本公开的抗体、抗原结合片段或变体的细胞。本公开的细胞可以是宿主细胞。细胞可以是原核细胞(诸如大肠埃希菌(Escherichia coli)和枯草杆菌(Bacillus subtilis))、真菌细胞(诸如酵母细胞或曲霉(Aspergillus)细胞)、昆虫细胞(诸如S2果蝇(Drosophila)细胞或Sf9)或其他细胞(诸如CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HEK293细胞或其他适合抗体表达的细胞)。
在本申请中，如本文所用，术语“表达条件”一般是指使得能够表达本公开的多特异性抗原结合蛋白的条件。例如，条件可以包括孵育时间、温度、培养基且可以取决于细胞类型，并且可以由本领域技术人员容易地确定。
在本申请中，如本文所用，术语“T细胞衔接器”一般是指针对T细胞/CD3复合物的恒定组分和肿瘤相关抗原(TAA)的双特异性或多特异性抗体。通过绕过正常的TCR-MHC相互作用来触发T细胞激活，T细胞衔接器可以显示出两个益处：1)可以引发多克隆T细胞应答，2)可以不受涉及下调抗原呈递的逃避机制的影响。T细胞衔接器可以参考Methods 154(2019)102-117。
在本申请中，术语“约”一般是指给定值±0.5％～±10％范围内的变化，诸如给定值±0.5％、±1％、±1.5％、±2％、±2.5％、±3％、±3.5％、±4％、±4.5％、±5％、±5.5％、±6％、±6.5％、±7％、±7.5％、±8％、±8.5％、±9％、±9.5％或±10％范围内的变化。
针对CD3的结合部分
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含抗体或其抗原结合片段。在本申请中，针对CD3的结合部分可以特异性针对CD3。例如，针对CD3的结合部分可以是抗CD3抗体或针对CD3的抗原结合片段。在本申请中，术语“针对CD3的结合部分”和“CD3结合部分”可以互换使用。
在本申请中，抗体可以选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体。
在本申请中，抗原结合片段可以包含Fab、Fab'、F(ab)2、Fv片段、F(ab')2、scFv、di-scFv和/或dAb。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含来自SEQ ID NO:8的重链可变区VH的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3中的任一区域。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含HCDR1-3。HCDR1可以包含SEQ ID NO.4中所示的氨基酸序列，HCDR2可以包含SEQ ID NO.5中所示的氨基酸序列，并且HCDR3可以包含SEQ ID NO.6中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含来自SEQ ID NO:35的重链可变区VH的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3中的任一区域。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含HCDR1-3。HCDR1可以包含SEQ ID NO.37中所示的氨基酸序列，HCDR2可以包含SEQ ID NO.38中所示的氨基酸序列，并且HCDR3可以包含SEQ ID NO.39中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含来自SEQ ID NO:43的重链可变区VH的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3中的任一区域。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含HCDR1-3。HCDR1可以包含SEQ ID NO.45中所示的氨基酸序列，HCDR2可以包含SEQ ID NO.46中所示的氨基酸序列，并且HCDR3可以包含SEQ ID NO.47中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含来自SEQ ID NO:51的重链可变区VH的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3中的任一区域。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含HCDR1-3。HCDR1可以包含SEQ ID NO.53中所示的氨基酸序列，HCDR2可以包含SEQ ID NO.54中所示的氨基酸序列，并且HCDR3可以包含SEQ ID NO.55中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含VH。例如，针对CD3的结合部分的VH可以包含框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4。
在本申请中，针对CD3的结合部分的VH可以包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。在本申请中，针对CD3的结合部分的VH可以包含SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列。在本申请中，针对CD3的结合部分的VH可以包含SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列。在本申请中，针对CD3的结合部分的VH可以包含SEQ ID NO:51中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分为人源化来源。在本申请中，针对CD3的结合部分的VH可以包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列。在本申请中，针对CD3的结合部分的VH可以包含SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含抗体重链恒定区。
在本申请中，抗体重链恒定区包含IgG恒定区。
在本申请中，抗体重链恒定区包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含来自SEQ ID NO:7的轻链可变区VL的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3区域中的任一区域。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含LCDR1-3。LCDR1可以包含SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列，LCDR2可以包含SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列，并且LCDR3可以包含SEQ ID NO.3中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含来自SEQ ID NO:36的轻链可变区VL的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3区域中的任一区域。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含LCDR1-3。LCDR1可以包含SEQ ID NO.40中所示的氨基酸序列，LCDR2可以包含SEQ ID NO.41中所示的氨基酸序列，并且LCDR3可以包含SEQ ID NO.42中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含来自SEQ ID NO:44的轻链可变区VL的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3区域中的任一区域。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含LCDR1-3。LCDR1可以包含SEQ ID NO.48中所示的氨基酸序列，LCDR2可以包含SEQ ID NO.49中所示的氨基酸序列，并且LCDR3可以包含SEQ ID NO.50中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含来自SEQ ID NO:52的轻链可变区VL的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3区域中的任一区域。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含LCDR1-3。LCDR1可以包含SEQ ID NO.56中所示的氨基酸序列，LCDR2可以包含SEQ ID NO.57中所示的氨基酸序列，并且LCDR3可以包含SEQ ID NO.58中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含VL。例如，针对CD3的结合部分的VL可以包含框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。
在本申请中，针对CD3的结合部分的VL可以包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。在本申请中，针对CD3的结合部分的VL可以包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列。在本申请中，针对CD3的结合部分的VL可以包含SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列。在本申请中，针对CD3的结合部分的VL可以包含SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分为人源化来源。在本申请中，针对CD3的结合部分的VL可以包含SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含抗体轻链恒定区。
在本申请中，抗体轻链恒定区可以包含Igк恒定区。
在本申请中，抗体轻链恒定区可以包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含HCDR1-3和LCDR1-3。HCDR1可以包含SEQID NO.4中所示的氨基酸序列，HCDR2可以包含SEQ ID NO.5中所示的氨基酸序列，并且HCDR3可以包含SEQ ID NO.6中所示的氨基酸序列；LCDR1可以包含SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列，LCDR2可以包含SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列，LCDR3可以包含SEQ ID NO.3中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含HCDR1-3和LCDR1-3。HCDR1可以包含SEQID NO.37中所示的氨基酸序列，HCDR2可以包含SEQ ID NO.38中所示的氨基酸序列，并且HCDR3可以包含SEQ ID NO.39中所示的氨基酸序列；LCDR1可以包含SEQ ID NO.40中所示的氨基酸序列，LCDR2可以包含SEQ ID NO.41中所示的氨基酸序列，LCDR3可以包含SEQ IDNO.42中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含HCDR1-3和LCDR1-3。HCDR1可以包含SEQID NO.45中所示的氨基酸序列，HCDR2可以包含SEQ ID NO.46中所示的氨基酸序列，并且HCDR3可以包含SEQ ID NO.47中所示的氨基酸序列；LCDR1可以包含SEQ ID NO.48中所示的氨基酸序列，LCDR2可以包含SEQ ID NO.49中所示的氨基酸序列，LCDR3可以包含SEQ IDNO.50中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含HCDR1-3和LCDR1-3。HCDR1可以包含SEQID NO.53中所示的氨基酸序列，HCDR2可以包含SEQ ID NO.54中所示的氨基酸序列，并且HCDR3可以包含SEQ ID NO.55中所示的氨基酸序列；LCDR1可以包含SEQ ID NO.56中所示的氨基酸序列，LCDR2可以包含SEQ ID NO.57中所示的氨基酸序列，LCDR3可以包含SEQ IDNO.48中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含VH和VL。VH可以包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列，并且VL可以包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。VH可以包含SEQ IDNO:35中所示的氨基酸序列，并且VL可以包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列。VH可以包含SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列，并且VL可以包含SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列。VH可以包含SEQ ID NO:51中所示的氨基酸序列，并且VL可以包含SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含人源化的VH和人源化的VL。VH可以包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列，并且VL可以包含SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列。VH可以包含SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列，并且VL可以包含SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列。
在本申请中，多特异性抗原结合蛋白可以包含源自IgA、IgG、IgD、IgE或IgM抗体的恒定区。
参考抗体
在本公开中，针对CD3的结合部分可以与参考抗体竞争与CD3的结合。
在一些情况下，参考抗体可以包含至少一个来自SEQ ID NO:8的重链可变区VH的HCDR区域和至少一个来自SEQ ID NO:7的轻链可变区VL的LCDR区域。在一些情况下，参考抗体可以包含至少一个来自SEQ ID NO:35的重链可变区VH的HCDR区域和至少一个来自SEQID NO:36的轻链可变区VL的LCDR区域。在一些情况下，参考抗体可以包含至少一个来自SEQID NO:43的重链可变区VH的HCDR区域和至少一个来自SEQ ID NO:44的轻链可变区VL的LCDR区域。在一些情况下，参考抗体可以包含至少一个来自SEQ ID NO:51的重链可变区VH的HCDR区域和至少一个来自SEQ ID NO:52的轻链可变区VL的LCDR区域。
在本公开中，参考抗体可以包含HCDR1-3。HCDR1可以包含SEQ ID NO.4中所示的氨基酸序列，HCDR2可以包含SEQ ID NO.5中所示的氨基酸序列，并且HCDR3可以包含SEQ IDNO.6中所示的氨基酸序列。在一些情况下，参考抗体可以包含LCDR1-3。LCDR1可以包含SEQID NO.1中所示的氨基酸序列，LCDR2可以包含SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列，并且LCDR3可以包含SEQ ID NO.3中所示的氨基酸序列。
在本公开中，参考抗体可以包含HCDR1-3。HCDR1可以包含SEQ ID NO.37中所示的氨基酸序列，HCDR2可以包含SEQ ID NO.38中所示的氨基酸序列，并且HCDR3可以包含SEQID NO.39中所示的氨基酸序列。在一些情况下，参考抗体可以包含LCDR1-3。LCDR1可以包含SEQ ID NO.40中所示的氨基酸序列，LCDR2可以包含SEQ ID NO.41中所示的氨基酸序列，并且LCDR3可以包含SEQ ID NO.42中所示的氨基酸序列。
在本公开中，参考抗体可以包含HCDR1-3。HCDR1可以包含SEQ ID NO.45中所示的氨基酸序列，HCDR2可以包含SEQ ID NO.46中所示的氨基酸序列，并且HCDR3可以包含SEQID NO.47中所示的氨基酸序列。在一些情况下，参考抗体可以包含LCDR1-3。LCDR1可以包含SEQ ID NO.48中所示的氨基酸序列，LCDR2可以包含SEQ ID NO.49中所示的氨基酸序列，并且LCDR3可以包含SEQ ID NO.50中所示的氨基酸序列。
在本公开中，参考抗体可以包含HCDR1-3。HCDR1可以包含SEQ ID NO.53中所示的氨基酸序列，HCDR2可以包含SEQ ID NO.54中所示的氨基酸序列，并且HCDR3可以包含SEQID NO.55中所示的氨基酸序列。在一些情况下，参考抗体可以包含LCDR1-3。LCDR1可以包含SEQ ID NO.56中所示的氨基酸序列，LCDR2可以包含SEQ ID NO.57中所示的氨基酸序列，并且LCDR3可以包含SEQ ID NO.58中所示的氨基酸序列。
在本公开中，参考抗体可以包含VH和VL。VH可以包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列，并且VL可以包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。VH可以包含SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列，并且VL可以包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列。VH可以包含SEQ IDNO:43中所示的氨基酸序列，并且VL可以包含SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列。VH可以包含SEQ ID NO:51中所示的氨基酸序列，并且VL可以包含SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列。
在本公开中，参考抗体可以包含重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区可以包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列，并且轻链恒定区可以包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列。
针对CD3的结合部分还可以包含具有与其基本相同的功能/特性的同源物或变体。在一些情况下，同源物或变体可以是与抗原结合蛋白的区别之处在于至少一个氨基酸的多肽。例如，同源物或变体可以是通过一个或多个氨基酸(诸如1-50、1-40、1-30、1-20、1-15、1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2个氨基酸)的添加、缺失或取代而与抗原结合蛋白不同的多肽。
针对肿瘤相关抗原(TAA)的结合部分
在本申请中，多特异性抗原结合蛋白可以包含针对肿瘤相关抗原(TAA)的结合部分。
在本申请中，TAA选自包含以下的组：EPCAM、CCR5、CD19、HER2、HER3 neu、HER3、HER4、EGFR、PSMA、CEA、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUC7、βhCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神经节苷脂GD3、9-0-乙酰基-GD3、GM2、globo H、岩藻糖基GM1、Poly SA、GD2、RON、c-Met、CEACAM-6、PCTA-1、PSA、PAP、ALCAM(CD166)、PECAM-1、CD151、MAGE-1、TROP2、IGF1R.TGFBR2、GHRHR、GHR、IL-6R、gpl30、TNFR2、OSMRp、Patched-1、Frizzled.Robol、LTpR、CD26、CD27、CD44、CD80、CD81、CD86、CD100、CXCR4、SAS、BCMA、TWEAKR/Fnl4、FGFR4、VEGFR1、VEGFR2、SSX1和SSX2、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue-1、浆细胞抗原、(膜结合)IgE、黑色素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、CCR8、TNF-α前体、STEAP、间皮素、A33抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、Ly-6；桥粒芯蛋白4、E-钙粘蛋白新表位、胎儿乙酰胆碱受体、CD25、CA19-9标记物、CA-125标记物和穆勒氏抑制物质(MIS)受体II型、sTn(唾液酸Tn抗原，TAG72)、FAP(成纤维细胞激活抗原)、内皮唾酸蛋白、EGFRvIII、L6、SAS、CD63、TF-抗原、Cora抗原、CD7、CD79b、CD22、Igα、Igβ、gp100、MT-MMPs、F19-抗原、CO-29和EphA2。
在本申请中，多特异性抗原结合蛋白可以包含针对HER2的结合部分。
例如，针对HER2的结合部分可以是抗HER2抗体或针对HER2的抗原结合片段。
在本申请中，抗体可以选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体。
在本申请中，抗原结合片段可以包含Fab、Fab'、F(ab)2、Fv片段、F(ab')2、scFv、di-scFv和/或dAb。
在本申请中，针对HER2的结合部分可以包含来自SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:20的重链可变区VH的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3区域中的任一区域。
在本申请中，针对HER2的结合部分可以包含HCDR1-3。HCDR1可以包含SEQ IDNO.12中所示的氨基酸序列，HCDR2可以包含SEQ ID NO.13中所示的氨基酸序列，并且HCDR3可以包含SEQ ID NO.14中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对HER2的结合部分可以包含VH。例如，针对HER2的结合部分的VH可以包含框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4。
在本申请中，针对HER2的结合部分的VH可以包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对HER2的结合部分可以包含抗体重链恒定区。
在本申请中，抗体重链恒定区包含IgG恒定区。
在本申请中，抗体重链恒定区包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对HER2的结合部分可以包含来自SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:19的轻链可变区VL的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3区域中的任一区域。
在本申请中，针对HER2的结合部分可以包含LCDR1-3。LCDR1可以包含SEQ ID NO.9中所示的氨基酸序列，LCDR2可以包含SEQ ID NO.10中所示的氨基酸序列，并且LCDR3可以包含SEQ ID NO.11中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对HER2的结合部分可以包含VL。例如，针对HER2的结合部分的VL可以包含框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。
在本申请中，针对HER2的结合部分可以包含抗体轻链恒定区。
在本申请中，抗体轻链恒定区可以包含Igκ恒定区。
在本申请中，抗体轻链恒定区可以包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对HER2的结合部分可以包含HCDR1-3和LCDR1-3。HCDR1可以包含SEQ ID NO.12中所示的氨基酸序列，HCDR2可以包含SEQ ID NO.13中所示的氨基酸序列，并且HCDR3可以包含SEQ ID NO.14中所示的氨基酸序列；LCDR1可以包含SEQ ID NO.9中所示的氨基酸序列，LCDR2可以包含SEQ ID NO.10中所示的氨基酸序列，LCDR3可以包含SEQ IDNO.11中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对HER2的结合部分可以包含VH和VL。VH可以包含SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列，并且VL可以包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对HER2的结合部分可以包含VH和VL。VH可以包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列，并且VL可以包含SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列。
在本申请中，多特异性抗原结合蛋白可以包含针对CD20的结合部分。
例如，针对CD20的结合部分可以是抗CD20抗体或针对CD20的抗原结合片段。
在本申请中，抗体可以选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体。
在本申请中，抗原结合片段可以包含Fab、Fab'、F(ab)2、Fv片段、F(ab')2、scFv、di-scFv和/或dAb。
在本申请中，针对CD20的结合部分可以包含来自SEQ ID NO:24的重链可变区VH的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3区域中的任一区域。
在本申请中，针对CD20的结合部分的VH可以包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD20的结合部分可以包含抗体重链恒定区。
在本申请中，抗体重链恒定区包含IgG恒定区。
在本申请中，抗体重链恒定区包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD20的结合部分可以包含来自SEQ ID NO:23的轻链可变区VL的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3中的任一区域。
在本申请中，针对CD20的结合部分可以包含抗体轻链恒定区。
在本申请中，抗体轻链恒定区可以包含Igκ恒定区。
在本申请中，抗体轻链恒定区可以包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列。
在本申请中，针对CD20的结合部分可以包含VH和VL。VH可以包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列，并且VL可以包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列。
多特异性抗原结合蛋白
在本申请中，多特异性抗原结合蛋白可以是抗体或其抗原结合片段。例如，多特异性抗原结合蛋白可以是完整的抗体(例如，可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人抗体)。例如，多特异性抗原结合蛋白可以是IgG抗体。例如，多特异性抗原结合蛋白可以是其抗原结合片段，例如，多特异性抗原结合蛋白可以包含Fab、Fab'、F(ab)2、Fv片段、F(ab')2、scFv、di-scFv和/或dAb。例如，多特异性抗原结合蛋白可以是F(ab')2。
在本申请中，针对CD3的结合部分可以包含第一多肽链和第二多肽链，其中第一多肽链可以包含与CD3结合的抗体的重链可变区VH，第二多肽链可以包含与CD3结合的抗体的轻链可变区VL。
在本申请中，与CD3结合的抗体的重链可变区VH可以包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列，并且与CD3结合的抗体的轻链可变区VL可以包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。
在本申请中，第一多肽链可以包含与CD3结合的抗体的轻链。而且在本申请中，第二多肽链可以包含与CD3结合的抗体的重链。或者，
在本申请中，第一多肽链可以包含与CD3结合的抗体的VL和轻链恒定区。而且在本申请中，第二多肽链可以包含与CD3结合的抗体的VH、重链恒定区的CHI以及铰链。
例如，与CD3结合的抗体可以包含本申请的CD3抗体。
在本申请中，轻链恒定区可以源自IgG。例如，其可以源自IgG2，例如，还可以源自小鼠IgG2(例如，可以源自IgG2a)。
在本申请中，重链恒定区(例如，CHI)可以源自IgG。例如，其可以源自IgG2，例如，还可以源自大鼠IgG2(例如，可以源自IgG2b)。在本申请中，铰链可以源自IgG。例如，其可以源自IgG2，例如，还可以源自大鼠IgG2(例如，可以源自IgG2b)。
在本申请中，第二多肽链可以包含在铰链的C末端的接头。例如，接头可以是柔性接头。例如，接头为GGGGS。
在本申请中，第二多肽链可以包含在其C末端的标签。例如，标签可以是任何可用于蛋白质(例如，第二多肽链和/或针对CD3的结合部分)分离和/或纯化的标签。例如，标签可以是His-标签。
在本申请中，针对TAA的结合部分可以包含第三多肽链和第四多肽链，其中第三多肽链可以包含与TAA结合的抗体的重链可变区VH，并且第四多肽链可以包含与TAA结合的抗体的轻链可变区VL。
在本申请中，第三多肽链可以包含与HER2结合的抗体的重链可变区VH，并且第四多肽链可以包含与HER2结合的抗体的轻链可变区VL。
在本申请中，与HER2结合的抗体的重链可变区VH可以包含SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列，并且与HER2结合的抗体的轻链可变区VL可以包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列，或者与HER2结合的抗体的重链可变区VH可以包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列，并且与HER2结合的抗体的轻链可变区VL可以包含SEQ ID NO:19的轻链可变区VL中所示的氨基酸序列。
在本申请中，第三多肽链可以包含与CD20结合的抗体的重链可变区VH，并且第四多肽链可以包含与CD20结合的抗体的轻链可变区VL。
在本申请中，与CD20结合的抗体的重链可变区VH可以包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列，并且与CD20结合的抗体的轻链可变区VL可以包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列。
在本申请中，第三多肽链可以包含与HER2结合的抗体轻链。而且在本申请中，第四多肽链可以包含与HER2结合的抗体重链。或者，
在本申请中，第三多肽链可以包含与HER2结合的抗体的VL和轻链恒定区。而且在本申请中，第四多肽链可以包含与HER2结合的抗体的VH、重链恒定区的CHI和铰链。
例如，与HER2结合的抗体可以包含本申请的HER2抗体。
在本申请中，第三多肽链可以包含与CD20结合的抗体轻链。而且在本申请中，第四多肽链可以包含与CD20结合的抗体重链。或者，
在本申请中，第三多肽链可以包含与CD20结合的抗体的VL和轻链恒定区。而且在本申请中，第四多肽链可以包含与CD20结合的抗体的VH、重链恒定区的CHI和铰链。
例如，与CD20结合的抗体可以包含本申请的CD20抗体。
在本申请中，轻链恒定区可以源自IgG。例如，其可以源自IgG2，例如，还可以源自小鼠IgG2(例如，可以源自IgG2a)。
在本申请中，重链恒定区(例如，CHI)可以源自IgG。例如，其可以源自IgG2，例如，还可以源自小鼠IgG2(例如，可以源自IgG2a)。在本申请中，铰链可以源自IgG。例如，其可以源自IgG2，例如，还可以源自小鼠IgG2(例如，可以源自IgG2a)。
在本申请中，第四多肽链可以包含在铰链的C末端的接头。例如，接头可以是柔性接头。例如，接头为GGGGS。
在本申请中，第四多肽链可以包含在其C末端的标签。例如，标签可以是任何可用于蛋白质(例如，第四多肽链和/或针对HER2或CD20的结合部分)分离和/或纯化的标签。例如，标签可以是Strep-标签II。
在本申请中，多特异性抗原结合蛋白可以由一条第一多肽链、一条第二多肽链、一条第三多肽链和一条第四多肽链组成。在多特异性抗原结合蛋白中，第四多肽链可以与第三多肽链相对应，并且第三多肽链和第四多肽链可能能够与同一TAA结合。
在本申请中，多特异性抗原结合蛋白可以通过重组表达宿主细胞产生。
在本申请中，产生多特异性抗原结合蛋白的宿主细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞、哺乳动物细胞或病毒。
在本申请中，细菌细胞可以是大肠埃希菌(E.coli)。
在本申请中，真菌细胞可以是酵母细胞。
在本申请中，哺乳动物细胞可以是CHO、NSO、BHK或HEK293细胞。
在本申请中，多特异性抗原结合蛋白可以由杂交瘤细胞产生。
在本申请中，杂交瘤细胞可以来自小鼠、大鼠或兔。
在本申请中，多特异性抗原结合蛋白的形式可以是双特异性抗体、双特异性双链抗体、双特异性scFv、TandAb、三价结合分子或四价结合分子。
在本申请中，多特异性抗原结合蛋白可以包含源自IgA、IgG、IgD、IgE或IgM抗体的恒定区。
在本申请中，蛋白质还可以包含与该蛋白质的序列同一性为至少80％的多肽。例如，同源物或变体可以是与蛋白质的序列同一性为80％(例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高)的多肽。
在本文鉴定的多肽序列的上下文中使用的术语“序列同一性百分比(％)”一般是指在对序列进行比对并在必要时引入间隙以达到最大的序列同一性百分比且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分之后，查询序列中与第二参考多肽序列或其部分的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比。为确定氨基酸/核苷酸序列同一性百分比而进行的比对可以通过本领域技术人员掌握的各种方式例如使用可公开获得的计算机软件(诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件)来予以实现。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较序列的整个长度上实现最大比对所需的任何算法。同一性百分比可以在整个确定的多肽/多核苷酸序列的长度上测量，或者可以在较短的长度上测量，例如，在从较大的确定的多肽/多核苷酸序列中提取的片段的长度上测量。应当理解，本文表、图或序列表中所示序列支持的任何片段长度都可以用于描述可以测量同一性百分比的长度。
1-16中的任何氨基酸序列(和/或任何一个或多个片段和/或其衍生物)也可以根据本领域普通技术人员的需要被任何其他氨基酸取代。例如，本领域技术人员可以通过用下表1所示的其他氨基酸替代特定氨基酸来进行保守取代。所选的具体氨基酸取代可以取决于所选位点的位置。此类保守的氨基酸取代可以涉及用非天然残基取代天然氨基酸残基，使得对该位置氨基酸残基的大小、极性、电荷、疏水性或亲水性影响很小或不产生影响。
表1
核酸、载体和细胞
另一方面，本申请提供了一种或多种分离的核酸分子，其编码本申请的多特异性抗原结合蛋白。
另一方面，本申请提供了一种载体，其可以包含本申请的分离的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其可以包含本申请的分离的核酸分子和/或本申请的载体。
另一方面，本申请提供了一种制备本申请的多特异性抗原结合蛋白的方法，其中该方法可以包括在使得能够表达本申请的多特异性抗原结合蛋白的条件下培养本申请的细胞。
分离的核酸可以包含一个或多个核酸分子，每个核酸分子编码抗原结合蛋白(例如，针对CD3的结合部分和/或针对TAA的结合部分)。例如，分离的核酸可以包含至少两个核酸分子，其中一个编码抗体重链或其片段，另一个编码抗体轻链或其片段。
一个或多个分离的核酸可以使用本领域已知的重组技术合成。例如，一个或多个分离的核酸可以用自动DNA合成器合成。标准的DNA重组和分子克隆技术包括由Sambrook,J.、Fritsch,E.F.和Maniatis,T.分子克隆：实验室手册；美国冷泉港实验室出版社：冷泉港,(1989)(Maniatis)以及T.J.Si1havy、M.L.Bennan和L.W.Enquist，基因融合实验，美国冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港(1984)以及由GreenePublishingAssoc和Wiley-Interscience出版(1987)的Ausubel,F.M.等人，当前分子生物方案中所述的克隆技术。简而言之，主题核酸可以使用基因组DNA片段、cDNA和RNA制备，所有这些都可以直接从细胞中提取，或通过各种扩增过程(包括但不限于PCR和RT-PCR)重组产生。
核酸的直接化学合成过程通常涉及将3'-阻断和5'-阻断的核苷酸单体依次添加到生长的核苷酸聚合物链的末端5'-羟基，其中每次添加可以通过生长链的末端5'-羟基对所添加单体的3'-位的亲核攻击来实现，所添加的单体通常是磷衍生物，诸如磷酸三酯、亚磷酰胺等。参见例如Matteuci等人，Tet.Lett.521:719(1980)；Caruthers等人的美国专利号4,500,707；和Southern等人的美国专利号5,436,327和5,700,637。
载体可以是任何线性核酸、质粒、噬菌体、粘粒、RNA载体、病毒载体等。病毒载体的非限制性实例可以包括逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。在本申请中，载体可以是表达载体，例如质粒。
表达载体可以适合用于特定类型的宿主细胞，并且不适合用于其他类型的宿主细胞。例如，可以将表达载体引入宿主生物体，然后监测宿主生物体的活力和载体中所含基因/多核苷酸的表达情况。
表达载体还可以包含一个或多个可选择标记基因，这些基因在表达时赋予一个或多个可用于选择或以其它方式识别携带表达载体的宿主细胞的表型特征。适用于真核细胞的可选择标记物的非限制性实例可以包含二氢叶酸还原酶和新霉素抗性。
主题载体可以通过各种成熟技术稳定或瞬时引入宿主细胞。例如，一种方法可以涉及氯化钙处理，其中表达载体经由钙沉淀引入。其他盐类，例如磷酸钙，也可以按照类似的程序使用。此外，还可以使用电穿孔(即应用电流增加细胞对核酸的通透性)。其他转化方法的实例可以包括显微注射、DEAE葡聚糖介导的转化以及在醋酸锂存在条件下的热休克。脂质复合物、脂质体和树枝状聚合物也可以用于转染宿主细胞。
在本申请中，细胞可以表达本公开的多特异性抗原结合蛋白。细胞可以是真核细胞或原核细胞。适当的细胞可以用本申请的核酸或载体转化或转染，并且用于表达和/或分泌本申请的多特异性抗原结合蛋白。例如，细胞可以是HEK293细胞、其他细菌宿主细胞、酵母细胞或各种高等真核细胞。
在本申请中，该方法任选地可以进一步包括收获本申请的多特异性抗原结合蛋白。
药物组合物、用途和方法
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含本申请的多特异性抗原结合蛋白、本申请的分离的核酸分子、本申请的载体和/或本申请的细胞以及任选的药学上可接受的佐剂。
另一方面，本申请提供了本申请的多特异性抗原结合蛋白、本申请的分离的核酸分子、本申请的载体、本申请的细胞和/或本申请的药物组合物在制备预防、缓解和/或治疗肿瘤的药物中的用途。
另一方面，本申请提供了用于预防、缓解和/或治疗肿瘤的本申请的多特异性抗原结合蛋白、本申请的分离的核酸分子、本申请的载体、本申请的细胞和/或本申请的药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种预防、缓解和/或治疗肿瘤的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本申请的多特异性抗原结合蛋白、本申请的分离的核酸分子、本申请的载体、本申请的细胞和/或本申请的药物组合物。
在本申请中，“药学上可接受的佐剂”可以包括任何和所有的防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上文所述的灭菌程序以及加入各种抗细菌剂和抗真菌剂来确保防止微生物的存在。还可以在组合物中加入等渗剂。此外，通过加入延缓吸收的试剂可以延长可注射药物形式的吸收。
药物组合物在生产和储存条件下通常可以为无菌状态并具有稳定性。组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇及其适当的混合物。适当的流动性可以例如通过使用包衣来保持。通过在组合物中加入延缓吸收的试剂可以延长可注射组合物的吸收。
本申请的药物组合物可以包含用于治疗肿瘤的其他化合物、药物和/或试剂。
在本申请中，肿瘤可以包含实体瘤和/或血液肿瘤。例如，血液肿瘤可以包含B细胞淋巴瘤和/或白血病，例如急性T细胞白血病或人B细胞淋巴瘤。例如，实体瘤可以包含乳腺癌。
在本申请中，预防、缓解和/或治疗肿瘤可以包括抑制和/或减少肿瘤生长、抑制肿瘤进展。例如，预防、缓解和/或治疗肿瘤还可以包含施用另一种药剂，例如，本领域已知的任何治疗肿瘤的药剂。
本申请的药物组合物和/或本申请的多特异性抗原结合蛋白可以以任何合理的剂量、方案和/或形式向需要的受试者施用，并且所有这些施用条件可以根据肿瘤种类、受试者情况等进行适当调整。
另一方面，本申请提供了本申请的针对CD3的结合部分和/或本申请的多特异性抗原结合蛋白在制备T细胞衔接器中的用途。
在本申请中，T细胞衔接器可以包含双特异性T细胞衔接器(BiTE)。T细胞衔接器可以引导宿主的免疫系统，并且可以显示出更具特异性的针对肿瘤细胞的T细胞毒性活性。作为治疗肿瘤的药物，T细胞衔接器可能更安全。而且T细胞衔接器还可以表现出更有效的肿瘤细胞杀伤。
另一方面，本申请提供了一种激活T细胞的方法，该方法包括向需要的受试者施用本申请的多特异性抗原结合蛋白、本申请的分离的核酸分子、本申请的载体、本申请的细胞和/或本申请的药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种靶向在T细胞上表达的CD3的方法，该方法包括施用本申请的多特异性抗原结合蛋白、本申请的分离的核酸分子、本申请的载体、本申请的细胞和/或本申请的药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种促进T细胞和肿瘤细胞之间相互作用的方法，该方法包括施用本申请的多特异性抗原结合蛋白、本申请的分离的核酸分子、本申请的载体、本申请的细胞和/或本申请的药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种治疗鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、鳞状细胞肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠道癌、食管癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、泌尿系统癌、肝细胞癌(HCC)、肛门癌、阴茎癌、头颈癌或其他类型的癌症的方法。
实施例
列举以下实施例旨在向本领域的普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的完整公开和说明，并不是为了限制发明人所认为的本发明的范围，也不是为了表示下面的实验是所进行的全部或唯一的实验。已尽力确保所用数字(例如数量、温度等)的准确性，但也应考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份为重量份，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，并且压力为大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如：bp，碱基对；kb，千碱基；pi，皮升；s或sec，秒；
min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；nt，核苷酸；i.m.，肌内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下；等等。
实施例1杂交瘤HER2-CD3双特异性抗体的生产和筛选
将包含HER2和CD3抗原的组合物分别注射到小鼠和大鼠中以刺激脾脏中B淋巴细胞的增殖并分泌特异性针对HER2和CD3的抗体。在多次免疫后，手术切除小鼠和大鼠的脾脏，并使用聚乙二醇(PEG)与骨髓瘤细胞进行细胞融合。然后通过HAT选择性培养基筛选融合细胞。HAT选择性培养基包含三种组分：次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶(T)。HAT选择性培养基中的氨基蝶呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，其可以有效阻断DNA合成的内源性途径。融合前的骨髓瘤细胞无法产生抗体，并且缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)基因，使得它们对HAT选择性培养基敏感，因此无法存活。然而，融合细胞可以合成HGPRT酶，继承B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，因此可以在HAT选择性培养基中进行无限增殖。
将融合细胞在HAT选择性培养基中培养约10至14天，然后将培养基稀释后加入至多孔板中，使得每孔只包含一种杂交瘤细胞。通过ELISA从这些单细胞克隆中筛选出分泌预定特异性抗体的杂交细胞系。
所选杂交瘤中的一种是表达小鼠来源的抗HER2抗体(简称HER2抗体)的杂交瘤。
另外四种是表达大鼠来源的抗CD3抗体(简称CD3A抗体、CD3B抗体、CD3C抗体和CD3D抗体)的杂交瘤。
将表达HER2抗体的杂交瘤细胞和表达CD3D抗体的杂交瘤细胞融合以获得表达抗HER2×抗CD3双特异性抗体的双特异性杂交瘤，即杂交瘤HER2-CD3D双特异性抗体，下文称为hHER2×CD3D。
实施例2不同CD3抗体与人T细胞系的结合活性
a)试剂和消耗品：
1.人T细胞系：Jurkat(克隆E6-1，ATCC#TIB-152)
2.抗CD3抗体：
(i)抗CD3A抗体(具有包含SEQ ID No.35中所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ IDNo.36中所示的氨基酸序列的VL)
抗CD3B抗体(具有包含SEQ ID No.43中所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ IDNo.44中所示的氨基酸序列的VL)
(iii)抗CD3C抗体(具有包含SEQ ID No.51中所示的氨基酸序列的VH和包含SEQID No.52中所示的氨基酸序列的VL)
(iv)抗CD3D抗体(具有包含SEQ ID No.8中所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ IDNo.7中所示的氨基酸序列的VL)
(v)UCHT-l(eBioscience,2100293)
3.二抗：FITC偶联的AffmiPure大鼠抗小鼠IgG(H+L)(Jackson Imm.Res.,415-095-166)、FITC偶联的AffmiPure小鼠抗大鼠IgG(H+L)(Jackson Imm.Res.,212-095-168)
4.PBS(Senrui,CR20012)
5.U型底板的96孔板(Jetbio,TCP002096)
6.流式细胞仪(Beckmen,A00-1-1102)
b)方法：
为了比较本申请中的CD3抗体和市售UCHT-1与人CD3抗原的结合活性，使用体外细胞实验来检测抗体的结合活性。
首先，用PBS将Jurkat细胞的浓度调整至1×107个细胞/ml；并将这两种抗体的浓度调整至80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml、0.15625μg/ml、78.125ng/ml、39.0625ng/ml、19.53125ng/ml和0ng/ml。然后，在U型底板的96孔板中添加Jurkat细胞悬液(50μl/孔)，随后添加不同浓度的这五种CD3抗体(50μl/孔)。这五种CD3抗体在混合物中的最终浓度分别为40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml、0.15625μg/ml、78.125ng/ml、39.0625ng/ml、19.53125ng/ml、9.765625ng/ml和0ng/ml，并将混合物置4℃冰箱中孵育1小时。
孵育后，将混合物以300g离心5分钟以除去上清液，并用PBS(200μl/孔)洗涤两次。最后，分别使用二抗(FITC偶联的AffmiPure小鼠抗大鼠IgG(H+L)或FITC偶联的AffmiPure大鼠抗小鼠IgG(H+L))与抗-CD3抗体-Jurkat细胞复合物或UCHT-l-Jurkat细胞复合物结合以进行流式细胞术分析。计算FITC阳性的Jurkat细胞以评价抗体与Jurkat细胞的结合活性(图8)。
使用GraphPad Prism 7软件显示图并计算抗体与Jurkat细胞的结合活性的半数最大效应浓度(EC50)。CD3A、CD3B、CD3C、CD3D和UCHT-1抗体的EC50值分别为25.87pM、9.56pM、15.23pM、10.71pM和22.79pM。
实施例3重组HER2-CD3双特异性抗体在CHO中的表达
在该实施例中，对CHO细胞进行遗传修饰以表达和生产重组HER2×CD3D双特异性抗体，下文称为rHER2×CD3D。
1.蛋白质序列的合成
rHER2-CD3D双特异性抗体的结构如图1。该抗体包含两个不同的抗原结合部分，即HER2结合部分和CD3结合部分。HER2结合部分源自实施例1中的小鼠抗HER2抗体，而CD3结合部分源自实施例1中的大鼠抗CD3D抗体。
将实施例1中编码抗HER2抗体的重链和轻链的核酸序列分别插入p2MPT(包含嘌呤霉素抗性基因)的两个不同表达盒中以获得重组质粒p2MPT-EHEL。将实施例1中编码抗CD3D抗体的重链和轻链的核酸序列分别插入p2MPT(包含嘌呤霉素抗性基因)的两个不同表达盒中以获得重组质粒p2MPT-DHDL。
表2重组质粒的信息
将两种重组质粒以1:1的比例稳定共转染到CHO细胞中以表达rHER2-CD3D双特异性抗体。包含转座酶基因的重组质粒pHT-PBase-ori用作稳定转染的试剂。在转染期间，将细胞密度调整至4.0×106个细胞/ml，并用新鲜的proCH05培养基替换培养基。转染试剂为聚乙烯亚胺(PEI)，并且总DNA与PEI的比例为1:5。
根据表3，将DNA和PEI依次添加到重新悬浮在新鲜培养基中的CHO细胞中，快速混合，并将混合物置于37℃摇床中进行转染。
表3
2.rHER2-CD3D双特异性抗体的细胞池筛选
转染72小时后，向10ml体积中的5×106个细胞中添加10μg/ml嘌呤霉素，并在37℃下于摇床中培养细胞。培养基每2～3天更换一次，同时细胞以0.5×106个细胞/ml的密度传代，并在10μg/ml嘌呤霉素中维持。筛选10天后，获得活力超过97％的阳性细胞池。
3.rHER2-CD3D双特异性抗体的表达
将5.0×106个细胞/ml的阳性细胞在补充有2mM丁酸钠的培养基中于31℃下培养4天。通过以1500rpm离心5分钟收获上清液。
4.rHER2-CD3D双特异性抗体的纯化
将步骤3中得到的上清液以2000rpm离心以除去细胞碎片，并用0.45μm微孔膜过滤。使用Mabselect Sure亲和色谱柱从上清液中富集具有Fc部分的抗体，随后使用pH为5.8的枸橼酸钠缓冲液洗脱抗CD3D单克隆抗体。然后，从pH 5.8至pH 3.0进行20CV的梯度线性洗脱。
使用Tris-HCl将收集的样品调节至pH为5.4，然后用Capto S impact离子交换色谱柱分离rHER2-CD3D双特异性抗体和抗HER2单克隆抗体。纯化的rHER2-CD3D双特异性抗体是重组HER2-CD3D双特异性抗体，下文称为rHER2×CD3D。
进行30Kd截流超滤以用PBS溶液替代洗脱缓冲液。通过Western印迹和SDS-PAGE测定rHER2×CD3D的纯度。图2为Western印迹的结果。在图2中，M代表标记物，第1-2列代表rHER2×CD3D，第3列代表抗HER2单克隆抗体，以及第4列代表抗CD3D单克隆抗体。图3显示了SDS-PAGE的结果。第1列代表标记物，并且第2列代表rHER2×CD3D。
实施例4重组抗CD3双特异性抗体的F(ab)'2片段的制备
分别靶向HER2和CD20的重链可变区VH和轻链可变区VL获自市售赫赛汀和利妥昔单抗。重链恒定区CHI、CL的轻链恒定区及其铰链区源自小鼠IgG2a。将Strep-标签II与CHI的C末端连接以进行纯化。
靶向CD3的重链可变区VH和轻链可变区VL源自实施例1中的抗CD3D抗体或市售UCHT1。重链恒定区CHI、CL的轻链恒定区及其铰链区源自大鼠IgG2b。将His-标签与CHI的C末端连接以进行纯化。
大鼠来源的Fab和小鼠来源的Fab的两部分通过铰链区的二硫键连接以形成重组抗CD3双特异性抗体的F(ab)'2结构。
重组抗CD3双特异性抗体的F(ab)'2片段通过在宿主细胞中共表达两个不同的Fab抗体片段获得。包含重组抗CD3双特异性抗体的F(ab)'2片段的细胞池通过稳定基因表达(SGE)获得。聚合物聚乙烯亚胺(PEI)介导将DNA递送到宿主细胞中，并使用piggyBac转座子系统获得稳定的细胞池。通过将两种不同的质粒共转染到CHO细胞中，获得了完全组装的重组抗CD3双特异性抗体的F(ab)'2片段。
1.蛋白质序列分析与合成
合成以下八个基因：
1)基因1，其编码：赫赛汀VH(具有SEQ ID No.20中所示的氨基酸)-小鼠IgG2a的CH1-小鼠IgG2a的铰链-柔性接头G4S-Strep-标签II
2)基因2，其编码：赫赛汀VL(具有SEQ ID No.19中所示的氨基酸)-小鼠IgG2a的CL
3)基因3，其编码：利妥昔单抗VH(具有SEQ ID No.24中所示的氨基酸)-小鼠IgG2a的CH1-小鼠IgG2a的铰链-柔性接头G4S-Strep-标签II
4)基因4，其编码：利妥昔单抗VL(具有SEQ ID No.23中所示的氨基酸)-小鼠IgG2a的CL
5)基因5，其编码：抗CD3D VH(具有SEQ ID No.8中所示的氨基酸)-大鼠IgG2b的CHI-大鼠IgG2b的铰链-柔性接头G4S-His-标签
6)基因6，其编码：抗CD3D VL(具有SEQ ID No.7中所示的氨基酸)-小鼠IgG2a的CL
7)基因7，其编码：UCHT1 VH(具有SEQ ID No.22中所示的氨基酸)-大鼠IgG2b的CHI-大鼠IgG2b的铰链-柔性接头G4S-His-标签
和，8)基因8，其编码：UCHT1 VL(具有SEQ ID No.21中所示的氨基酸)-大鼠IgG2b的CL
将基因1-8连接到表达载体，转染到宿主细胞系中以产生重组抗CD3双特异性抗体的两个不同的F(ab)'2片段，并且结构如图4-5所示。抗体结构不包含Fc区。抗体包含两个不同的抗原结合部分，即HER2结合部分和CD3结合部分，或CD20结合部分和CD3结合部分。这种结构允许抗体同时与在肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原(TAA)和T细胞上的CD3分子结合。而且重组抗CD3双特异性抗体的F(ab)'2片段具有用于纯化的Strep-II和His肽。
2.质粒构建
将基因1-2或基因3-4分别插入p2MPT(包含嘌呤霉素抗性基因)的两个不同的表达盒中，并获得称为p2MPT-HH-HL和p2MPT-RH-RL的重组质粒。将基因5-6或基因7-8分别插入p2MPT(包含嘌呤霉素抗性基因)的两个不同的表达盒中，并获得称为p2MPT-CH-CL和p2MPT-UH-UL的重组质粒。
表4.重组质粒构建
使用表4中的重组质粒构建重组抗CD3双特异性抗体的总共4个F(ab)'2片段，即(1)赫赛汀×CD3D F(ab)'2；(2)赫赛汀×UCHT1 F(ab)'2；(3)利妥昔单抗×CD3D F(ab)'2；和(4)利妥昔单抗×UCHT1 F(ab)'2。
3.细胞转染
稳定转染CHO-DG44细胞以表达重组抗CD3双特异性抗体的上述四个F(ab)'2片段。
在转染期间，将细胞密度调整为3.0×106个细胞/ml，并将培养基更换为新鲜的proCH05培养基。转染试剂为聚乙烯亚胺(PEI)，并且总DNA与PEI的比例为1:3。
添加质粒p2MPT-HH-HL和p2MPT-CH-CL、p2MPT-RH-RL和p2MPT-CH-CL、p2MPT-HH-HL和p2MPT-UH-UL、以及p2MPT-RH-RL和p2MPT-UH-UL，并且质量比为1:1。同时，添加包含转座酶基因的重组质粒pHT-PBase-ori，并且添加量为DNA总量的1/10。根据表5，将DNA和PEI依次添加到重新悬浮在新鲜培养基中的CHO-DG44细胞中，快速混合，然后将混合物置于37℃摇床中进行转染。
表5
4.重组抗CD3双特异性抗体的F(ab)'2片段的细胞池筛选
转染96小时后，向10ml体积的1.0×107个细胞中加添加10μg/ml嘌呤霉素，并且于37℃下在摇床中培养细胞。培养基每2天更换一次，同时细胞以1.0×106个细胞/ml的密度传代，并在10μg/ml嘌呤霉素中维持。筛选12天后，获得活力超过95％的阳性细胞池。
5.重组抗CD3双特异性抗体的F(ab)'2片段的表达
将4.0×106个细胞/ml的阳性细胞在补充有2mM丁酸钠的培养基中于31℃培养7天。通过以1000rpm离心5分钟收获上清液。
6.重组CD3双特异性抗体的F(ab)'2片段的纯化
将步骤5中获得的上清液以2000rpm离心以除去细胞碎片，并用0.45μm微孔膜过滤。使用Histrap excel亲和色谱柱从CHO表达上清液中富集His标记的F(ab')2，然后用300mM的咪唑溶液洗脱来自Histrap亲和色谱柱的重组抗CD3双特异性抗体的富集F(ab')2片段。然后用StrepTrap HP亲和色谱柱富集洗脱的样品。富集后，使用5mM的脱硫的生物素(脱硫生物素)进行洗脱，并且获得带有His-标签和Strep-标签II的目标产物。进行30Kd截流超滤以用PBS溶液替代洗脱缓冲液。通过SDS-PAGE检测纯化的重组抗CD3双特异性抗体的F(ab')2片段，并且结果如图6-7所示。在图6中，第1列代表赫赛汀×CD3D F(ab)'2；第2列代表赫赛汀×UCHT1 F(ab)'2；并且第3列代表标记物；在图7中，第1列代表标记物；第2列代表利妥昔单抗×CD3D F(ab)'2；并且第3列代表利妥昔单抗×UCHT1 F(ab)'2。
HER2×CD F(ab)'2和CD20×CD F(ab)'2的结构如图4和图5。
实施例5rHER2×CD3D和hHER2×CD3D的体外SK-BR3细胞杀伤测定
a)试剂和消耗品：
1.细胞系：SK-BR-3(ATCC#HTB-30)
2.外周血单核细胞(PBMC)(Reid,PBMC-2020110403)
3.HER2×CD3双特异性抗体：
(i)rHER2×CD3D(在实施例3中产生)；
(ii)hHER2×CD3D(在实施例1中产生)
4.PBS(Senrui,CR20012)
5.RPMI1640(Gibco,22400089)
6.FBS(HyClone,SH30406.05)
7.Cell TraceTM远红细胞增殖试剂盒(Invitrogen,C34572)
8.碘化丙啶(PI)(sigma,P4170)
9.U型底板的96孔板(Jetbio,TCP002096)
流式细胞仪(Beckmen,A00-1-1102)
b)方法：
为了比较不同抗体制备方法生产的双特异性抗体的药效学活性，进行检测rHER2×CD3D和hHER2×CD3D对SK-BR-3细胞的杀伤作用的体外实验。
首先，通过细胞染色剂(远红)对表面高表达HER2的SK-BR-3进行染色。然后将细胞重悬于含10％FBS的RPMI-1640培养基中。随后将细胞浓度调整至8×105个细胞/ml。将来自健康供体的PBMC重悬于含10％FBS的RPMI-1640培养基中，并将细胞浓度调整至8×106个细胞/ml。最后，以1:1的体积比充分混合PBMC和SK-BR-3。
将rHER2×CD3D或hHER2×CD3D的浓度连续稀释至0、2×10-4、2×10-3、2×10-2、2×10-1、2×100、2×101、2×102、2×103和2×104pM。在96孔板中添加PBMC和SK-BR-3的细胞混合物(50μl/孔)，然后向细胞混合物中添加连续稀释的rHER2×CD3D或hHER2×CD3D(50μl/孔)。将rHER2×CD3D或hHER2×CD3D的最终浓度调整至0、10-4、10-3、10-2、10-1、100、101、102、103和104pM。
将双特异性抗体和细胞的混合物于37℃下在培养箱中孵育24小时，然后以400g离心5分钟以除去上清液。用胰蛋白酶消化细胞10分钟，并用PBS(200μl/孔)洗涤细胞两次。
最后，用PI染色死细胞，并通过流式细胞术分析残留的SK-BR-3细胞的量以确定抗体介导的细胞毒性对SK-BR-3细胞的杀伤效果。
在进行流式细胞术分析时，APC通道用于标记细胞悬液中的SK-BR-3细胞(远红染色)，并且PE通道用于区分活细胞与死细胞(PI染色)。由于PI能够对死细胞进行染色，因此最后使用由流式细胞术分析的APC阳性和PI阴性(APC+PI-)细胞的数目来量化残留的SK-BR-3细胞并计算杀伤率。
为了比较rHER2×CD3D和hHER2×CD3D对介导PBMC对SK-BR-3细胞的杀伤活性的影响，使用GraphPad Prism 7软件进行图形可视化，并使用四参数拟合曲线的非线性回归计算半数最大效应浓度(EC50)。rHER2×CD3D的EC50值为约3.33pM；hHER2×CD3D的EC50值为约22.52pM。因此，我们惊讶地发现，CHO细胞产生的rHER2×CD3D对肿瘤细胞的杀伤活性显著优于杂交瘤产生的hHER2×CD3D对肿瘤细胞的杀伤活性。图9显示了hHER2×CD3D和rHER2×CD3D介导的PBMC对SK-BR-3细胞的杀伤作用。
实施例6CD3结合部分有助于rHER2×CD3D对SK-BR3细胞杀伤的细胞毒性作用
a)试剂和消耗品：
细胞系：SK-BR-3(ATCC#HTB-30)
1.纯化自PBMC(健康供体#1：Reid，PBMC-2021110902；健康供体#2：Oricells，LP210818013，Z0231)的T细胞
2.HER2×CD3双特异性抗体：
(i)rHER2×CD3D(在实施例3中产生)；
(ii)hHER2×CD3D(在实施例1中产生)
3.PBS(Senrui,CR20012)
4.RPMI1640(Gibco,22400089)
5.FBS(HyClone,SH30406.05)
6.Cell TraceTM远红细胞增殖试剂盒(Invitrogen,C34572)
7.碘化丙啶(PI)(sigma,P4170)
8.U型底板的96孔板(Jetbio,TCP002096)
9.流式细胞仪(Beckmen,A00-1-1102)
b)方法：
基于实施例6，为了确定CD3结合部分是否有助于改善rHER2×CD3D对SK-BR3细胞杀伤的细胞毒性作用，进行检测rHER2×CD3D和hHER2×CD3D对SK-BR-3细胞的杀伤作用的体外实验。从健康供体的PBMC中纯化T细胞来进行实验。
通过细胞染色剂(远红)对表面高表达HER2的SK-BR-3细胞进行染色。然后将细胞重悬于含10％FBS的RPMI-1640培养基中。随后将细胞浓度调整至2×104个细胞/ml。将从健康供体的PBMC中纯化的T细胞重悬于含10％FBS的RPMI-1640培养基中，并将T细胞浓度调整至2×105个细胞/ml。最后，以1:1的体积比充分混合从PBMC和SK-BR-3中纯化的T细胞。
将rHER2×CD3D或hHER2×CD3D的浓度连续稀释至0、2×10-4、2×10-3、2×10-2、2×10-1、2×100、2×101、2×102、2×103和2×104pM。在96孔板中加入从PBMC和SK-BR-3中纯化的T细胞混合物(50μl/孔)，然后向细胞混合物中加入连续稀释的rHER2×CD3D或hHER2×CD3D(50μl/孔)。将rHER2×CD3D或hHER2×CD3D的最终浓度调整至0、10-4、10-3、10-2、10-1、100、101、102、103和104pM。
将双特异性抗体和细胞的混合物于37℃下在培养箱中孵育24小时，然后以400g离心5分钟以除去上清液。用胰蛋白酶消化细胞10分钟，并用PBS(200μl/孔)洗涤细胞两次。
最后，用PI染色死细胞，并通过流式细胞术分析残留的SK-BR-3细胞的量以确定抗体介导的细胞毒性对SK-BR-3细胞的杀伤效果。
在进行流式细胞术分析时，APC通道用于标记细胞悬液中的SK-BR-3细胞(远红染色)，并且PE通道用于区分活细胞与死细胞(PI染色)。由于PI能够对死细胞进行染色，因此最后使用由流式细胞术分析的APC阳性和PI阴性(APC+PI-)细胞的数目来量化残留的SK-BR-3细胞并计算杀伤率。
为了比较rHER2×CD3D和hHER2×CD3D对介导从PBMC中纯化的T细胞对SK-BR-3细胞的杀伤活性的影响，使用GraphPad Prism 7软件进行图形可视化，并使用四参数拟合曲线的非线性回归计算半数最大效应浓度(EC50)。对于rHER2×CD3D，供体1的EC50值为约7.65pM；对于hHER2×CD3D，供体1的EC50值为约12.75pM。对于rHER2×CD3D，供体2的EC50值为约3.73pM；对于hHER2×CD3D，供体2的EC50值为约7.28pM。因此，CD3结合部分有助于使rHER2×CD3D对SK-BR3细胞杀伤的细胞毒性作用显著优于hHER2×CD3D。图15显示了hHER2×CD3D和rHER2×CD3D介导的T细胞对SK-BR-3细胞的杀伤作用。
实施例7hHER2×CD3D和rHER2×CD3D诱导的IL-6释放
a)试剂和消耗品：
1.试剂盒：LEGEND MAXTM人IL-6ELISA(Biolegend,B329676)
2.试验样品：
(i)来自实施例5中hHER2×CD3D的上清液；(ii)来自实施例5中rHER2×CD3D的上清液；
3.U型底板的96孔板(Jetbio,TCP002096)
4.流式细胞仪(Beckmen,A00-1-1102)
b)方法：
由于细胞因子释放综合征(CRS)是临床应用中衔接双特异性抗体的T细胞的主要安全性问题，因此上清液中细胞因子的释放与施用本申请的抗CD3双特异性抗体的安全性有关。诱导CRS的细胞因子包括TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10等，其中IL-6是诱导CRS的最关键细胞因子。
rHER2×CD3D在浓度为102pM时诱导最大的细胞毒性效应，而hHER2×CD3D在浓度为104pM时诱导与rHER2×CD3D相当的细胞毒性效应(图9)。因此，分析了在抗体浓度为102pM和104pM时抗体诱导的细胞毒性与细胞因子IL-6释放之间的相关性。如表6所示，与hHER2×CD3D相比，当rHER2×CD3D在102pM浓度下介导的PBMC杀伤肿瘤细胞显著增加(分别为54.05％与16.18％)时，IL-6释放水平显著降低(分别为1795.5pg/ml与2928.79pg/ml)；与hHER2×CD3D相比，当rHER2×CD3D在104pM浓度下诱导的肿瘤细胞杀伤略有增加(分别为61.9％与58.35％)时，IL-6释放水平未显著增加(分别为3837pg/ml与3295.82pg/ml)。总之，与杂交瘤HER2×CD3D相比，重组HER2×CD3D使PBMC介导的抗肿瘤效果增强，而细胞因子释放较低，使其成为在临床应用中更为安全的选择。
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表6：SK-BR-3细胞毒性与细胞因子IL-6释放之间的相关性。
实施例8赫赛汀×CD3双特异性抗体的体外SK-BR3细胞杀伤测定
a)试剂和消耗品：
1.细胞系：SK-BR-3(ATCC#HTB-30)
2.PBMC：健康供体#1(Reid,PBMC-2021010602)；健康供体#2(Reid,PBMC-2021011802)
3.赫赛汀×CD3双特异性抗体：
(i)在实施例4中产生的赫赛汀×CD3D F(ab)’2；
(ii)在实施例4中产生的赫赛汀×UCHT1 F(ab)’2；
4.PBS(Senrui,CR20012)
5.RPMI1640(Gibco,22400089)
6.FBS(HyClone,SH30406.05)
7.Cell TraceTM远红细胞增殖试剂盒(Invitrogen,C34572)
8.碘化丙啶(PI)(sigma,P4170)
9.U型底板的96孔板(Jetbio,TCP002096)
10.流式细胞仪(Beckmen,A00-1-1102)
b)方法：
为了比较不同CD3抗体产生的双特异性抗体的药效学活性，进行了检测赫赛汀×CD3D F(ab)'2和赫赛汀×UCHT1 F(ab)'2对SK-BR-3细胞的杀伤作用的体外细胞实验。
首先，通过细胞染色剂(远红)对表面高表达HER2的SK-BR-3进行染色。然后将细胞重悬于含10％FBS的RPMI-1640培养基中。随后将细胞浓度调整至8×105个细胞/ml。将来自健康供体的PBMC重悬于含10％FBS的RPMI-1640培养基中，并将细胞浓度调整至8×106个细胞/ml。最后，以1:1的体积比充分混合PBMC和SK-BR-3。将赫赛汀×CD3D F(ab)'2或赫赛汀×UCHT1 F(ab)'2的浓度连续稀释至0、2×100、2×101、2×102、2×103、2×104、105和2×105pM。向96孔板中加入PBMC和SK-BR-3的细胞混合物(50μl/孔)，然后向细胞混合物中假如连续稀释的赫赛汀×CD3DF(ab)'2或赫赛汀×UCHT1 F(ab)'2(50μl/孔)。将赫赛汀×CD3DF(ab)'2或赫赛汀×UCHT1 F(ab)'2的最终浓度调整至0、100、101、102、103、104、5×104和105pM。
将双特异性抗体和细胞的混合物于37℃下在培养箱中孵育24小时，然后以400g离心5分钟以除去上清液。用胰蛋白酶消化细胞10分钟，并用PBS(200μl/孔)洗涤细胞两次。最后，用PI染色死细胞，并通过流式细胞术分析残留的SK-BR-3细胞的量以确定抗体介导的细胞毒性对SK-BR-3细胞的杀伤效果。
在进行流式细胞术分析时，APC通道用于标记细胞悬液中的SK-BR-3细胞(远红染色)，并且PE通道用于区分活细胞与死细胞(PI染色)。由于PI能够对死细胞进行染色，因此最后使用由流式细胞术分析的APC阳性和PI阴性(APC+PI-)细胞的数目来量化残留的SK-BR-3细胞并计算杀伤率。
为了比较赫赛汀×CD3D F(ab)'2和赫赛汀×UCHT1 F(ab)'2对介导PBMC对SK-BR-3细胞的杀伤活性的影响，使用GraphPad Prism 7软件进行图形可视化，并使用四参数拟合曲线的非线性回归计算半数最大效应浓度(EC50)。对于赫赛汀×CD3D F(ab)'2，第一供体的EC50值为约680.7pM，并且第二供体的EC50值为约82.58pM；对于赫赛汀×UCHT1 F(ab)'2，第一供体的EC50值为约1003pM，并且第二供体的EC50值为约941.2pM。这些结果表明，与赫赛汀×UCHT1 F(ab)'2相比，赫赛汀×CD3D F(ab)'2对肿瘤细胞的杀伤效果显著更好。图10显示了赫赛汀×CD3D F(ab)'2和赫赛汀×UCHT1 F(ab)'2对SK-BR-3细胞的杀伤效果。
实施例9利妥昔单抗×CD3双特异性抗体的体外SU-DHL-8细胞杀伤测定
a)试剂和消耗品：
1.细胞系：SU-DHL-8(ATCC#CRL-2961)
PBMC：健康供体#1(Reid,PBMC-2020122101)；健康供体#2(Reid,PBMC-2021010602)
2.利妥昔单抗×CD3双特异性抗体F(ab')2：
(i)实施例4中产生的利妥昔单抗×CD3D F(ab)'2；
(ii)实施例4中产生的利妥昔单抗×UCHT1 F(ab)'2；
3.PBS(Senrui,CR20012)
4.RPMI1640(Gibco,22400089)
5.FBS(HyClone,SH30406.05)
6.Cell TraceTM远红细胞增殖试剂盒(Invitrogen,C34572)
7.碘化丙啶(PI)(sigma,P4170)
8.U型底板的96孔板(Jetbio,TCP002096)
9.流式细胞仪(Beckmen,A00-1-1102)
b)方法：
为了比较不同CD3抗体产生的双特异性抗体的药效学活性，进行了检测利妥昔单抗×CD3DF(ab)'2和利妥昔单抗×UCHT1 F(ab)'2对SU-DHL-8细胞的杀伤作用的体外细胞实验。首先，通过细胞染色剂(远红)对表面表达CD20的SU-DHL-8进行染色。然后将细胞重悬于含10％FBS的RPMI-1640培养基中。随后将细胞浓度调整至8×105个细胞/ml。将来自健康供体的PBMC重悬在含10％FBS的RPMI-1640培养基中，并将细胞浓度调整至8×106个细胞/ml。最后，以1:1的体积比充分混合PBMC和SU-DHL-8。
连续稀释利妥昔单抗×CD3D F(ab)'2或利妥昔单抗×UCHT1 F(ab)'2的浓度。在96孔板中加入PBMC和SU-DHL-8的细胞混合物(50μl/孔)，然后向细胞混合物中加入连续稀释的利妥昔单抗×CD3D F(ab)'2或利妥昔单抗×UCHT1 F(ab)'2(50μl/孔)。将双特异性抗体和细胞的混合物于37℃下在培养箱中孵育24小时，然后以400g离心5分钟以除去上清液。用胰蛋白酶消化细胞10分钟，并用PBS(200μl/孔)洗涤细胞两次。最后，用PI对死细胞进行染色，通过流式细胞术分析残留的SU-DHL-8细胞的量以确定抗体介导的细胞毒性对SU-DHL-8细胞的杀伤效果。在进行流式细胞术分析时，APC通道用于标记细胞悬液中的SU-DHL-8细胞(远红染色)，并且PE通道用于区分活细胞与死细胞(PI染色)。由于PI能够对死细胞进行染色，因此最后使用由流式细胞术分析的APC阳性和PI阴性(APC+PI-)细胞的数目来量化残留的SU-DHL-8细胞并计算杀伤率。为了比较利妥昔单抗×CD3D F(ab)'2和利妥昔单抗×UCHT1 F(ab)'2对介导PBMC对SU-DHL-8细胞的杀伤活性的影响，使用GraphPadPrism 7软件进行图形显示，并使用四参数拟合曲线的非线性回归计算半数最大效应浓度(EC50)。对于利妥昔单抗×CD3D F(ab)'2，第一供体的EC50值为约72.83pM，并且第二供体的EC50值为约59.98pM；对于利妥昔单抗×UCHT1 F(ab)'2，第一供体的EC50值为约605.5pM，并且第二供体为约274.4pM。这些结果表明，与利妥昔单抗×UCHT1 F(ab)'2相比，利妥昔单抗×CD3D F(ab)'2对肿瘤细胞的杀伤效果显著更好。图11显示了利妥昔单抗×CD3DF(ab)'2和利妥昔单抗×UCHT1 F(ab)'2对SU-DHL-8细胞的杀伤效果。
实施例10颗粒酶B和穿孔素的释放
a)试剂和消耗品：
1.检测试剂盒：
(i)颗粒酶B ELISA试剂盒(Dayou，批次：2007-1)；
(ii)穿孔素ELISA试剂盒(Dayou，批次：2008-1)
2.试验样品：
(i)来自实施例8的上清液(来自健康供体#1)；
(ii)来自实施例9的上清液(来自健康供体#2)；
3.PBS(Senrui,CR20012)
4.U型底板的96孔板(Jetbio,TCP002096)
5.酶标仪(Thermo,Multiskan FC)
b)方法：
颗粒酶B和穿孔素途径被认为是细胞毒性淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的主要机制。为了证实重组CD3双特异性抗体的F(ab)'2片段能够介导PBMC杀伤靶细胞，且细胞毒性作用归因于CD3与T细胞之间的相互作用，对颗粒酶B和穿孔素的释放进行了定量测定。
将实施例8或9中收集的上清液用作样品，并使用颗粒酶B/穿孔素ELISA试剂盒定量测定颗粒酶B和穿孔素的释放。
结果显示，对于实施例8中赫赛汀×CD3D F(ab)'2的上清液，颗粒酶B和穿孔素的含量分别为21233.57pg/ml和1597.45pg/ml；对于赫赛汀×UCHT1 F(ab)'2的上清液，颗粒酶B和穿孔素的含量分别为38655.93pg/ml和2647.29pg/ml。对于实施例9中的利妥昔单抗×CD3D F(ab)'2的上清液，颗粒酶B和穿孔素的含量分别为24410.04pg/ml和1675.97pg/ml；对于利妥昔单抗×UCHT1 F(ab)'2的上清液，颗粒酶B和穿孔素的含量分别为48863.12pg/ml和2183.46pg/ml。
上述结果表明，本申请中的重组CD3双特异性抗体的F(ab)'2片段通过释放颗粒酶B和穿孔素的途径介导肿瘤细胞杀伤。
实施例11赫赛汀×CD3D F(ab)'2和赫赛汀×UCHT1 F(ab)'2诱导的细胞因子IL-6的释放
a)试剂和消耗品：
1.试剂盒：LEGENDplexTM人CD8/NKPane Panel(Biolegend,740267)
2.试验样品：
(i)来自实施例8的上清液(来自健康供体#1)；(ii)来自实施例9的上清液(来自健康供体#2)；
3.U型底板的96孔板(Jetbio,TCP002096)
4.流式细胞仪(Beckmen,A00-1-1102)
b)方法：
由于细胞因子释放综合征(CRS)是临床应用中衔接双特异性抗体的T细胞的主要安全性问题，因此上清液中细胞因子的释放与施用本申请的抗CD3双特异性抗体的安全性有关。诱导CRS的细胞因子包括TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10等，其中IL-6是诱导CRS的最关键细胞因子。
使用LEGENDplexTM人CD8/NK Pane Panel试剂盒测量从实施例8和实施例9收集的上清液中的IL-6水平。上清液中的IL-6含量在抗CD3抗体的105pM浓度下进行测量。结果如表7所示。
结果显示，在实施例8的上清液中，当赫赛汀×CD3D F(ab)'2表现出的肿瘤细胞杀伤效果显著优于赫赛汀×UCHT1 F(ab)'2时，上清液中的IL-6含量几乎相同。同时，结果显示，在实施例9的上清液中，当利妥昔单抗×CD3D F(ab)'2表现出的肿瘤细胞杀伤效果与利妥昔单抗×UCHT1 F(ab)'2相对类似时，利妥昔单抗×UCHT1 F(ab)'2上清液中的IL-6含量显著高于利妥昔单抗×CD3D F(ab)'2上清液中的IL-6含量并且甚至高于试剂盒的检测上限。
总之，与UCHT-1相比，抗CD3D双特异性抗体的细胞因子释放水平更低并且在介导肿瘤细胞杀伤时更安全。
表7：细胞因子IL-6释放的检测
实施例12人源化抗CD3单克隆抗体
12.1编码抗CD3单克隆抗体的质粒构建体的制备
将重链载体插入物或轻链载体插入物连接到pTT5载体中的表达盒，如图12所示(命名为pTT5-HC或pTT5-LC)。还对由此产生的含有信号肽的载体+插入物进行测序以确认正确的阅读框和编码DNA序列。表8中列出了插入每个质粒中的氨基酸序列。
/>
表8：插入质粒中的氨基酸序列
根据表8，C3000是大鼠来源的抗CD3抗体，而C3002-1和C3002-2是人源化的抗CD3抗体。
12.2转染方法
将质粒pTT5-HC和pTT5-LC瞬时转染到ExpiCHO-STM细胞以获得抗CD3单克隆抗体。将ExpiCHO-STM细胞以6.0×106个细胞/ml的密度于37℃下在ExpiCHOTM表达培养基中培养。制备以下两种溶液：1)溶液1：将64μl的Expifectamine CHO试剂与800μl的OptiPROTM培养基混合；2)溶液2：用800μl的Expifectamine CHO试剂稀释8μgpTT5-HC和8μgpTT5-LC的混合物。将溶液1和溶液2混合以形成ExpiFectamineTM CHO/质粒DNA混合物。孵育5分钟后，将ExpiFectamineTM CHO/质粒DNA混合物添加到ExpiCHO-STM细胞培养物中以形成20ml的培养体系。在37℃、8％CO2下培养细胞培养混合物。
12.3蛋白质表达
转染24小时后，将120μL ExpiCHOTM增强剂和4.8mL ExpiCHOTM辅料溶液补充至来自11.2的细胞培养物中。将培养混合物于31℃下进一步培养7天。通过离心收集上清液。
12.4纯化
使用MabSelect SuRe LX柱纯化步骤11.3中获得的上清液。将上清液用pH7.4 PBS洗涤，并用pH3.00.1M甘氨酸洗脱。将收集的样品用pH8.01M Tris缓冲溶液中和，然后进行超滤以用PBS溶液替代洗脱缓冲液。采用SDS-PAGE和western印迹进一步鉴别纯化的样品。图13A-13F示出了抗CD3 mAb的western印迹和SDS-PAGE结果。图13A、图13C和图13E分别示出了C3000、C3002-1C和3002-2的western印迹的结果。图13B、图13D和图13F分别示出了C3000、C3002-1C和3002-2的还原SDS-PAGE的结果。图13B、图13D和图13F的第2列分别示出了C3000、C3002-1C和3002-2的非还原SDS-PAGE的结果。
12.5抗CD3 mAb C3000、C3002-1C和3002-2与CD3ε和CD3γ异源二聚体蛋白质的结 合亲和力
在4℃下用100ng/孔的CD3ε和CD3γ异源二聚体蛋白质包被ELISA板过夜，并进一步用3％BSA的PBS溶液封闭板2小时，然后向板中加入连续稀释的抗CD3 mAb C3000、C3002-1C和3002-2并于37℃孵育1小时。洗板并干燥，然后向板中加入100μL/孔的检测抗体THETMHis标签抗体[HRP]并于37℃孵育1小时。洗板并干燥，然后向板中加入100μL/孔的TMB显色液并于37℃孵育10分钟。显色时，加入50μl/孔的终止液终止显色反应。在450nm处测量样品的光密度(OD450)。使用GraphPad Prism 8软件显示抗CD3 mAb C3000、C3002-1C和3002-2与CD3ε和CD3γ异源二聚体蛋白质的结合亲和力图，如图14。根据图14，与大鼠来源的C3000相比，人源化抗CD3抗体C3002-1C和3002-2显示出相当的与CD3ε和CD3γ异源二聚体蛋白质的结合亲和力。
尽管本文已经提供和描述了本发明的优选实施方式，但对于本领域的技术人员而言显而易见的是，此类实施方式只是通过示例的方式提供。本发明无意受限于说明书中提供的具体实施例。虽然本发明已参照上述说明书进行了描述，但本文对实施方式的描述和说明并非意在作限制性解释。在不脱离本发明的前提下，本领域技术人员现在还可以做出许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面并不局限于本文所阐述的具体描述、配置或相对比例，它们取决于各种条件和变量。应当理解，在实施本发明时，可以采用本文所述本发明实施方式的各种替代方式。因此，预期本发明也应包括任何此类替代方式、修改、变化或等同物。以下权利要求旨在限定本发明的范围，从而旨在涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
SEQUENCE LISTING
<110> Guangzhou LintonPharm Co.,Ltd.
<120> A MULTISPECIFIC ANTIGEN BINDING PROTEIN AND THE USE THEREOF
<130> 0163-PA-003
<160> 58
<170> PatentIn version 3.5
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Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
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180 185 190
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195 200 205
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245 250 255
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<220>
<223> Rituximab VL
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3C VH
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3C VL
<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3C HCDR1
<400> 53
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3C HCDR2
<400> 54
Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr
1 5
<210> 55
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3C HCDR3
<400> 55
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 56
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3C LCDR1
<400> 56
Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
1 5
<210> 57
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3C LCDR2
<400> 57
Tyr Thr Ser
1
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3C LCDR3
<400> 58
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr
1 5

Claims (39)

1.一种包含CD3结合部分的多特异性抗原结合蛋白，其中所述CD3结合部分包含与重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且所述HCDR1具有SEQIDNO:4、37、45和53中任一个所示的氨基酸序列；所述HCDR2具有SEQ ID NO:5、38、46和54中任一个所示的氨基酸序列；所述HCDR3具有SEQ ID NO:6、39、47和55中任一个所示的氨基酸序列，和/或
所述CD3结合部分包含与轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且所述LCDR1具有SEQ ID NO:1、40、48和56中任一个所示的氨基酸序列；所述LCDR2具有SEQ ID NO:2、41、49和57中任一个所示的氨基酸序列；所述LCDR3具有SEQ IDNO:3、42、50和58中任一个所示的氨基酸序列，其中所述CD3结合部分诱导T细胞激活。
2.根据权利要求1所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述CD3结合部分包含重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述HCDR1具有SEQ ID NO:4、37、45和53中任一个所示的氨基酸序列；所述HCDR2具有SEQ ID NO:5、38、46和54中任一个所示的氨基酸序列；
所述HCDR3具有SEQ ID NO:6、39、47和55中任一个所示的氨基酸序列，和/或
CD3结合部分包含轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且所述LCDR1具有SEQ ID NO:1、40、48和56中任一个所示的氨基酸序列；所述LCDR2具有SEQ ID NO:2、41、49和57中任一个所示的氨基酸序列；所述LCDR3具有SEQ ID NO:3、42、50和58中任一个所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有SEQ ID NO:4、5和6中所示的序列，和/或轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:1、2和3中所示的序列；所述重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有SEQ ID NO:37、38和39中所示的序列，和/或轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:40、41和42中所示的序列；
所述重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有SEQ ID NO:45、46和47中所示的序列，和/或轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:48、49和50中所示的序列；或者
所述重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有SEQ ID NO:53、54和55中所示的序列，和/或轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:56、57和58中所示的序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述CD3结合部分包含与重链可变区具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且所述重链可变区具有SEQ ID NO:8、35、43和51中任一个所示的氨基酸序列；和/或CD3结合部分包含与轻链可变区具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有SEQ ID NO:7、36、44和52中任一个所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述CD3结合部分包含所述重链可变区的氨基酸序列，并且所述重链可变区具有SEQ ID NO:8、35、43和51中任一个所示的氨基酸序列；和/或所述CD3结合部分包含所述轻链可变区的氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有SEQ ID NO:7、36、44和52中任一个所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中
所述CD3结合部分包含SEQ ID NO:8的重链可变区和/或SEQ ID NO:7的轻链可变区；
所述CD3结合部分包含SEQ ID NO:35的重链可变区和/或SEQ ID NO:36的轻链可变区；
所述CD3结合部分包含SEQ ID NO:43的重链可变区和/或SEQ ID NO:44的轻链可变区；或者
所述CD3结合部分包含SEQ ID NO:51的重链可变区和/或SEQ ID NO:52的轻链可变区。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述CD3结合部分为人源化来源。
8.根据权利要求7所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述人源化CD3结合部分包含与选自以下的所述重链可变区和/或所述轻链可变区具有至少80％同一性的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:27的重链可变区和/或SEQ ID NO:31的轻链可变区，或
(ii)SEQ ID NO:28的重链可变区和/或SEQ ID NO:31的轻链可变区。
9.根据权利要求8所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述人源化CD3结合部分包含选自以下的所述重链可变区和/或所述轻链可变区的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:27的重链可变区和/或SEQ ID NO:31的轻链可变区，或
(ii)SEQ ID NO:28的重链可变区和/或SEQ ID NO:31的轻链可变区。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述多特异性抗原结合蛋白通过从宿主细胞重组表达产生。
11.根据权利要求10所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞、植物细胞、哺乳动物细胞或病毒。
12.根据权利要求11所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述细菌细胞是大肠埃希菌。
13.根据权利要求11所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述真菌细胞是酵母细胞。
14.根据权利要求11所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述哺乳动物细胞选自CHO、NSO、BHK或HEK293细胞。
15.根据权利要求1-9中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述多特异性抗原结合蛋白由杂交瘤细胞产生。
16.根据权利要求15所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述杂交瘤细胞选自小鼠、大鼠或兔。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述多特异性抗原结合蛋白的形式选自双特异性抗体、双特异性双链抗体、双特异性scFv、TandAb、三价结合分子或四价结合分子。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述多特异性抗原结合蛋白是人源化抗体。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述多特异性抗原结合蛋白是全人抗体。
20.根据权利要求1-17中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述多特异性抗原结合蛋白是嵌合抗体。
21.根据权利要求1-17中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述多特异性抗原结合蛋白是单克隆抗体。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述多特异性抗原结合蛋白包含源自IgA、IgG、IgD、IgE或IgM抗体的恒定区。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述多特异性抗原结合蛋白包含Fab、Fab'、F(ab)2、Fv片段、F(ab')2、scFv、di-scFv和/或dAb。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述多特异性抗原结合蛋白包含与至少一种肿瘤相关抗原(TAA)结合的结合部分。
25.根据权利要求24所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述TAA选自包含以下的组：EPCAM、CCR5、CD19、HER2、HER3 neu、HER3、HER4、EGFR、PSMA、CEA、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUC7、βhCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神经节苷脂GD3、9-0-乙酰基-GD3、GM2、globoH、岩藻糖基GM1、Poly SA、GD2、RON、c-Met、CEACAM-6、PCTA-1、PSA、PAP、ALCAM(CD166)、PECAM-1、CD151、MAGE-1、TROP2、IGF1R、TGFBR2、GHRHR、GHR、IL-6R、gpl30、TNFR2、OSMRp、Patched-1、Frizzled、Robol、LTpR、CD26、CD27、CD44、CD80、CD81、CD86、CD100、CXCR4、SAS、BCMA、TWEAKR/Fnl4、FGFR4、VEGFR1、VEGFR2、SSX1和SSX2、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue-1、浆细胞抗原、(膜结合)IgE、黑色素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、CCR8、TNF-α前体、STEAP、间皮素、A33抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、Ly-6；桥粒芯蛋白4、E-钙粘蛋白新表位、胎儿乙酰胆碱受体、CD25、CA19-9标记物、CA-125标记物和穆勒氏抑制物质(MIS)受体II型、sTn(唾液酸Tn抗原，TAG72)、FAP(成纤维细胞激活抗原)、内皮唾酸蛋白、EGFRvIII、L6、SAS、CD63、TF-抗原、Cora抗原、CD7、CD79b、CD22、Igα、Igβ、gp100、MT-MMPs、F19-抗原、CO-29和EphA2。
26.根据权利要求24所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述TAA是HER2或CD20。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述HER2结合部分包含与分别具有SEQ ID NO:12、13和14中所示的序列的重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3，和/或分别具有SEQ ID NO:9、10和11中所示的序列的轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少95％同一性的氨基酸序列。
28.根据权利要求27所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述HER2结合部分包含分别具有SEQID NO:12、13和14中所示的序列的重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3，和/或分别具有SEQ ID NO:9、10和11中所示的序列的轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中CD3结合部分诱导T细胞激活。
29.根据权利要求27所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述HER2结合部分包含与SEQID NO:16的重链可变区和/或SEQ ID NO:15的轻链可变区具有至少80％同一性的氨基酸序列。
30.根据权利要求29所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述HER2结合部分包含SEQID NO:16的重链可变区和/或SEQ ID NO:15的轻链可变区。
31.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求1-30中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白。
32.一种载体，其包含根据权利要求31所述的分离的核酸分子。
33.一种宿主细胞，其包含根据权利要求32所述的载体。
34.一种制备根据权利要求1-30中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白的方法，其中所述方法包括在使得能够表达所述多特异性抗原结合蛋白的条件下培养根据权利要求33所述的宿主细胞。
35.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-30中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白、根据权利要求31所述的分离的核酸分子、根据权利要求32所述的载体和/或根据权利要求33所述的宿主细胞，以及任选的药学上可接受的佐剂。
36.根据权利要求1-30中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白、根据权利要求31所述的分离的核酸分子、根据权利要求32所述的载体、根据权利要求33所述的宿主细胞和/或根据权利要求35所述的药物组合物在制备用于激活T细胞、靶向在T细胞上表达的CD3和/或促进T细胞与肿瘤细胞之间相互作用的药物中的用途。
37.根据权利要求1-30中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白、根据权利要求31所述的分离的核酸分子、根据权利要求32所述的载体、根据权利要求33所述的细胞和/或根据权利要求35所述的药物组合物在制备用于预防、缓解和/或治疗肿瘤的药物中的用途。
38.一种预防、缓解和/或治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述方法包括向所述有需要的受试者施用根据权利要求1-30中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白、根据权利要求31所述的分离的核酸分子、根据权利要求32所述的载体、根据权利要求33所述的细胞和/或根据权利要求35所述的药物组合物。
39.根据权利要求38所述的预防、缓解和/或治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述癌症选自包含以下的组：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、鳞状细胞肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠道癌、食管癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、泌尿系统癌、肝细胞癌(HCC)、肛门癌、阴茎癌、头颈癌或其他类型的癌症。
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