CN111630067B - 针对muc17和cd3的双特异性抗体构建体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了双特异性抗体构建体,其特征在于包含与MUC17结合的第一结构域、与人和猕猴CD3ε链的细胞外表位结合的第二结构域以及任选地第三结构域,该第三结构域是特异性Fc模式。此外,本发明提供了编码该抗体构建体的多核苷酸、包含这种多核苷酸的载体、表达该构建体的宿主细胞以及包含该抗体构建体的药物组合物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术的产品和方法,具体地涉及双特异性抗体构建体、其制备及其用途。
背景技术
最快速且最有前景开发的治疗剂之一是基于蛋白质的药物,这些基于蛋白质的药物已经在几乎每个医学领域中发挥重要作用并且是临床(前)开发中和作为商业产品增长最快的治疗剂之一(Leader,Nature Reviews Drug Discovery[自然综述:药物发现]2008年1月7日,21-39)。与小化学药物相比,蛋白质药物在相对低的浓度下具有高特异性和活性,并且典型地提供高影响疾病,诸如各种癌症、自身免疫疾病和代谢性病症的疗法(Roberts,Trends Biotechnol.[生物技术趋势]2014年7月;32(7):372-80;Wang,Int JPharm.[国际药学杂志]1999年8月20日;185(2):129-88)。
此类新的基于蛋白质的药物包括,例如,双特异性(单克隆)抗体,这些抗体典型地可以同时与两种不同类型的抗原结合。它们以若干种结构形式已知,并且目前已经探究了用于癌症免疫疗法和药物递送的应用(Fan,Gaowei;Wang,Zujian;Hao,Mingju;Li,Jinming(2015)."Bispecific antibodies and their applications[双特异性抗体及其应用]".Journal of Hematology&Oncology.[血液学与肿瘤学杂志]8:130)。
双特异性抗体可以是IgG样的,即全长双特异性抗体,或者是为非全长抗体构建体的非IgG样双特异性抗体。全长双特异性抗体典型地保留具有两个Fab臂和一个Fc区的传统单克隆抗体(mAb)结构,不同的是两个Fab位点结合不同抗原。非全长双特异性抗体可以缺乏整个Fc区。这些包括化学连接的Fab、仅由Fab区组成、以及各种类型的二价和三价单链可变片段(scFv)。还存在模拟两种抗体的可变结构域的融合蛋白。这种形式的实例是双特异性T细胞接合器(Yang,Fa;Wen,Weihong;Qin,Weijun(2016)."BispecificAntibodies as a Development Platform for New Concepts and TreatmentStrategies[作为用于新的理念和治疗策略的开发平台的双特异性抗体]".InternationalJournal of Molecular Sciences[国际分子科学杂志].18(1):48)。
双特异性抗体衍生的分子诸如抗体构建体是由两个柔性连接的抗体衍生的结合结构域制备的重组蛋白质构建体。/>抗体构建体的一个结合结构域对靶细胞上选择的肿瘤相关表面抗原是特异性的;第二结合结构域对CD3(即T细胞上T细胞受体复合物的亚基)是特异性的。通过其特殊设计,/>抗体构建体独特地适合于将T细胞与靶细胞瞬时连接,并且同时强有力地激活T细胞对靶细胞的固有细胞溶解潜力。对作为AMG 103和AMG 110开发到临床中的第一代/>抗体构建体(参见WO 99/54440和WO 2005/040220)的重要的进一步开发是提供与CD3ε链的N末端处的背景独立表位结合的双特异性抗体构建体(WO 2008/119567)。与该选择的表位结合的/>抗体构建体不仅显示出对人和猕猴,或绒毛猴(Callithrixjacchus)、绒顶柽柳猴(Saguinus oedipus)或松鼠猴(Saimirisciureus)CD3ε链的跨物种特异性,而且由于识别该特异性表位(而不是先前描述的双特异性T细胞接合分子中CD3结合物的表位)而未展示出与对于前一代T细胞接合抗体所观察到的程度相同的T细胞的非特异性激活。T细胞激活的这种减少与患者中较少或减少的T细胞再分布相关,后者被鉴定为副作用的风险,例如,在帕索妥昔单抗(pasotuximab)中。
如WO 2008/119567中所述的抗体构建体的特征在于从身体快速清除;因此,虽然它们能够快速到达身体的大部分部位,但它们的体内应用可能受到其在体内的持久性短的限制。另一方面,它们在体内的浓度可以在短时间内进行调整和微调。因为这种小的单链分子的体内半衰期短,所以使用通过连续静脉内输注的长期施用来实现治疗效果。然而,现在可获得具有更有利的药代动力学特性(包括更长的半衰期)的双特异性抗体构建体。增加的半衰期通常在免疫球蛋白、特别是抗体并且最特别是小尺寸的抗体片段或构建体的体内应用中是有用的,例如为求患者顺应性。
粘蛋白已被鉴定为炎症和癌症疾病的令人感兴趣的标志物。粘蛋白是高分子量糖蛋白,其特征在于串联重复结构域内丝氨酸和苏氨酸残基处的高水平O-糖基化(Johansson和Hansson,Nat.Rev.Immunology[自然综述:免疫学]2016)。存在至少20个粘蛋白家族成员,包括分泌蛋白和跨膜蛋白,它们由不同组织中的上皮细胞表达(Corfield,Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学学报]2013)。粘蛋白的主要功能在于粘膜层的结构和粘膜层的调控,该粘膜层在上皮细胞与环境之间形成保护性屏障(Hollingsworth和Swanson,Nat.Rev.Cancer[自然综述:癌症]2004;Hattrup和Gendler,Annu.Rev.Physiol.[生理学年评]2008)。跨膜粘蛋白也在细胞信号传导(对包括增殖和细胞凋亡的调控),以及在肿瘤发生中起作用(Hollingsworth和Swanson,Nat.Rev.Cancer[自然综述:癌症]2004)。在粘蛋白中,粘蛋白17(MUC17)是最初通过其与MUC3的同源性鉴定的跨膜粘蛋白(Gum等人,Biochem.Biophys.Res.Comm.[生物化学与生物物理研究通讯]2002)。
对MUC17的完整编码序列的分析揭示,它具有由61个串联重复序列的中心区构成的大的细胞外结构域、表皮生长因子(EGF)结构域、海胆精子蛋白、肠激酶和集聚蛋白(SEA)结构域,以及第二EGF结构域。SEA结构域含有在其他粘蛋白中保守的推定的裂解位点(Moniaux等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]2006)。MUC17是单次跨膜蛋白,具有在细胞内的80个氨基酸的胞质尾(Moniaux等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]2006)。MUC17在健康成人中的表达局限于内衬于肠的肠上皮细胞或成熟吸收性上皮细胞的顶端表面(Moniaux等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]2006;Johanasson和Hansson,Nat.Rev.Immunology[自然综述:免疫学]2016)。MUC17也由胃和胰腺表达(Moniaux等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]2006;Moehle等人,J.Mol.Med.[分子医学杂志]2006)。MUC17的生物学功能被认为是维持肠道中的粘膜屏障完整性,诸如通过粘膜恢复(Luu等人,Int.J.Biochem.Cell Biol.[国际生物化学与细胞生物学杂志]2010;Resta-Lenert等人,Am.J.Physiology[美国生理学杂志]2011;Johanasson和Hansson,Nat.Rev.Immunology[自然综述:免疫学]2016)。
MUC17在一些癌症中异常表达。显示MUC17 mRNA在一种胰腺癌细胞系和三种结肠癌细胞系中表达(Gum等人2002)。免疫组织化学研究确认了MUC17蛋白在胰腺癌中的表达(Moniaux等人2006)。然而,在结肠癌中,MUC17蛋白表达显示出降低(Senapati等人,J.Clin.Pathol.[临床病理学杂志]2010)。虽然如此,MUC17的表达模式使其成为用于治疗不同形式的恶性肿瘤的潜在靶标。
发明内容
鉴于文献中关于作为其病理病状的潜在靶标的MUC17的相矛盾的结论,本发明的目的是清楚地鉴定与MUC17上调相关的特定病状并且提供双特异性抗体构建体,诸如T细胞衔接分子,这些双特异性抗体构建体特别适合于结合MUC17相关病状中的MUC17,优选地用于在所述特定病状的治疗中使用。因此,本发明提供了抗体构建体,其特征在于包含与MUC17结合的第一结构域、与人和非人(例如猕猴)CD3ε链的细胞外表位结合的第二结构域、以及优选的第三结构域,该第三结构域是特异性Fc模式。此外,本发明提供了编码该抗体构建体的多核苷酸、包含这种多核苷酸的载体、和表达该构建体的宿主细胞以及包含该抗体构建体的药物组合物。
在第一方面,在本发明的背景下设想提供一种抗体构建体,该抗体构建体包含:
·第一结构域,该第一结构域与MUC17结合,以及
·第二结构域,该第二结构域与人和猕猴CD3ε链的细胞外表位结合。
在所述方面内,在本发明的背景下进一步设想,该抗体构建体包含第三结构域,该第三结构域包含两个多肽单体,每个多肽单体包含铰链、CH2结构域和CH3结构域,其中所述两个多肽单体经由肽接头彼此融合。
在所述方面内,在本发明的背景下进一步设想提供一种抗体构建体,该抗体构建体是单链抗体构建体。
在所述方面内,在本发明的背景下还设想提供一种抗体构建体,其中所述第三结构域按氨基至羧基顺序包含:铰链-CH2-CH3-接头-铰链-CH2-CH3。
在所述方面内,在本发明的背景下进一步设想提供一种抗体构建体,其中所述多肽单体中的每一种具有与选自由SEQ ID NO:17-24组成的组的序列至少90%相同的氨基酸序列。
在所述方面内,在本发明的背景下还设想提供一种抗体构建体,其中所述多肽单体中的每一种具有选自SEQ ID NO:17-24的氨基酸序列。
在所述方面内,在本发明的背景下进一步设想提供一种抗体构建体,其中该CH2结构域包含结构域内半胱氨酸二硫桥。
在所述方面内,在本发明的背景下还设想提供一种抗体构建体,其中
(i)该第一结构域包含两个抗体可变结构域并且该第二结构域包含两个抗体可变结构域;
(ii)该第一结构域包含一个抗体可变结构域并且该第二结构域包含两个抗体可变结构域;
(iii)该第一结构域包含两个抗体可变结构域并且该第二结构域包含一个抗体可变结构域;或者
(iv)该第一结构域包含一个抗体可变结构域并且该第二结构域包含一个抗体可变结构域。
在所述方面内,在本发明的背景下还设想提供一种抗体构建体,其中该第一结构域和该第二结构域经由肽接头与该第三结构域融合。
在所述方面内,在本发明的背景下还设想提供一种抗体构建体,其中该抗体构建体按氨基至羧基顺序包含:
(a)该第一结构域;
(b)肽接头,该肽接头具有选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的氨基酸序列;
(c)该第二结构域。
在所述方面内,在本发明的背景下还设想提供一种抗体构建体,其中该抗体构建体除了(a)至(c)之外按氨基至羧基顺序包含:
(d)肽接头,该肽接头具有选自由SEQ ID NO:1、2、3、9、10、11和12组成的组的氨基酸序列;
(e)该第三结构域的该第一多肽单体;
(f)肽接头,该肽接头具有选自由SEQ ID NO:5、6、7和8组成的组的氨基酸序列;以及
(g)该第三结构域的该第二多肽单体。
在所述方面内,在本发明的背景下进一步设想提供一种抗体构建体,其中该抗体构建体的该第一结构域与MUC17内对应于SEQ ID NO.528(根据uniprot Q685J3编号的aa4171至4296)的表位结合。
在所述方面内,在本发明的背景下还设想提供一种抗体构建体,其中该抗体构建体的该第一结构域与MUC17内对应于SEQ ID NO.529(根据uniprot Q685J3编号的aa 4184至4291)的表位结合。
在所述方面内,在本发明的背景下进一步设想提供一种抗体构建体,其中该抗体构建体的该第一结构域与MUC17内对应于SEQ ID NO.530(根据uniprot Q685J3编号的aa4131至4243)的表位结合。
在所述方面内,在本发明的背景下还设想提供一种抗体构建体,其中该抗体构建体的该第一结构域与MUC17内对应于SEQ ID NO.531(根据uniprot Q685J3编号的aa 4244至4389)的表位结合。
在所述方面内,在本发明的背景下进一步设想提供一种抗体构建体,其中该抗体构建体的该第一结构域与MUC17内对应于SEQ ID NO.530(根据uniprot Q685J3编号的aa4131至4243)的表位结合,但不与MUC17内对应于SEQ ID NO.531(根据uniprot Q685J3编号的aa 4244至4389)的表位结合。
在所述方面内,在本发明的背景下还设想提供一种抗体构建体,其中该抗体构建体的该第一结构域与MUC17内对应于SEQ ID NO.532(根据uniprot Q685J3编号的aa 4171至4390)或SEQ ID NO.533(根据uniprot Q685J3编号的aa 4184至4390)的表位结合,但不与MUC17内对应于SEQ ID NO.534(根据uniprot Q685J3编号的aa 4291至4390)的表位或MUC17内对应于SEQ ID NO.535(根据uniprot Q685J3编号的aa 4341至4390)的表位结合。
在所述方面内,在本发明的背景下进一步设想提供一种抗体构建体,其中该VHVL安排的特征为4λ3。该命名在本领域中是已知的。
在所述方面内,在本发明的背景下进一步设想提供一种抗体构建体,其中细胞毒性与结合亲和力之间的比率(EC50/KD)*1000低于250,其中该细胞毒性以pM指示并且在将NUGC-4细胞作为靶细胞并且将huPBMC作为效应细胞中进行确定,并且其中该结合亲和力以nM指示并且通过表面等离子体共振(SPR)测定诸如Biacore测定来确定。考虑到典型的EC50与KD值之间的不同量纲,为了更好的可读性,引入了系数1000。
在所述方面内,在本发明的背景下还设想提供一种抗体构建体,其中细胞毒性与结合亲和力之间的比率(EC50/KD)*1000低于125,其中该细胞毒性以pM指示并且例如在将NUGC-4细胞作为靶细胞并且将huPBMC作为效应细胞中进行测定,并且其中该结合亲和力以nM指示并且例如通过基于表面等离子体共振的测定来测定。
在所述方面内,在本发明的背景下进一步设想提供一种抗体构建体,其中细胞毒性与结合亲和力之间的比率(EC50/KD)*1000低于21,其中该细胞毒性以pM指示并且例如在将NUGC-4细胞作为靶细胞并且将huPBMC作为效应细胞中进行测定,并且其中该结合亲和力以nM指示并且通过基于表面等离子体共振的测定来确定。优选地,细胞毒性(EC50)<100pM并且该结合亲和力(KD)<25nM。
在所述方面内,在本发明的背景下还设想提供一种抗体构建体,其中该第一结合结构域包含含有选自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区:
(a)如SEQ ID NO.33中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.34中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.35中所描绘的CDR-H3;
(b)如SEQ ID NO.44中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.45中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.46中所描绘的CDR-H3;
(c)如SEQ ID NO.55中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.56中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.57中所描绘的CDR-H3;
(d)如SEQ ID NO.66中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.67中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.68中所描绘的CDR-H3;
(e)如SEQ ID NO.77中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.78中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.79中所描绘的CDR-H3;
(f)如SEQ ID NO.88中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.89中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.90中所描绘的CDR-H3;
(g)如SEQ ID NO.99中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.100中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.101中所描绘的CDR-H3;
(h)如SEQ ID NO.110中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.111中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.112中所描绘的CDR-H3;
(i)如SEQ ID NO.121中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.122中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.123中所描绘的CDR-H3;
(j)如SEQ ID NO.132中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.133中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.134中所描绘的CDR-H3;
(k)如SEQ ID NO.143中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.144中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.145中所描绘的CDR-H3;
(l)如SEQ ID NO.154中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.155中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.156中所描绘的CDR-H3;
(m)如SEQ ID NO.165中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.166中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.167中所描绘的CDR-H3;
(n)如SEQ ID NO.176中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.177中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.178中所描绘的CDR-H3;
(o)如SEQ ID NO.187中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.188中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.189中所描绘的CDR-H3;
(p)如SEQ ID NO.198中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.199中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.200中所描绘的CDR-H3;
(q)如SEQ ID NO.209中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.210中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.211中所描绘的CDR-H3;
(r)如SEQ ID NO.220中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.221中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.222中所描绘的CDR-H3;
(s)如SEQ ID NO.231中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.232中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.233中所描绘的CDR-H3;
(t)如SEQ ID NO.242中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.243中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.244中所描绘的CDR-H3;
(u)如SEQ ID NO.253中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.254中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.255中所描绘的CDR-H3;
(v)如SEQ ID NO.264中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.265中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.266中所描绘的CDR-H3;
(w)如SEQ ID NO.275中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.276中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.276中所描绘的CDR-H3;
(x)如SEQ ID NO.286中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.287中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.288中所描绘的CDR-H3;
(y)如SEQ ID NO.297中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.298中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.299中所描绘的CDR-H3;
(z)如SEQ ID NO.308中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.309中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.310中所描绘的CDR-H3;
(aa)如SEQ ID NO.319中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.320中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.321中所描绘的CDR-H3;
(ab)如SEQ ID NO.330中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.331中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.332中所描绘的CDR-H3;
(ac)如SEQ ID NO.341中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.342中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.343中所描绘的CDR-H3;
(ad)如SEQ ID NO.352中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.353中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.354中所描绘的CDR-H3;
(ae)如SEQ ID NO.363中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.364中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.365中所描绘的CDR-H3;
(af)如SEQ ID NO.374中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.375中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.376中所描绘的CDR-H3;
(ag)如SEQ ID NO.385中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.386中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.386中所描绘的CDR-H3;
(ah)如SEQ ID NO.396中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.397中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.398中所描绘的CDR-H3;
(ai)如SEQ ID NO.407中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.408中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.409中所描绘的CDR-H3;
(aj)如SEQ ID NO.418中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.419中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.420中所描绘的CDR-H3;
(ak)如SEQ ID NO.429中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.430中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.431中所描绘的CDR-H3;
(al)如SEQ ID NO.440中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.441中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.442中所描绘的CDR-H3;
(am)如SEQ ID NO.451中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.452中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.453中所描绘的CDR-H3;
(an)如SEQ ID NO.462中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.463中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.464中所描绘的CDR-H3;
(ao)如SEQ ID NO.473中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.474中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.475中所描绘的CDR-H3;
(ap)如SEQ ID NO.484中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.485中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.486中所描绘的CDR-H3;
(aq)如SEQ ID NO.495中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.496中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.497中所描绘的CDR-H3;
(ar)如SEQ ID NO.506中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.507中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.508中所描绘的CDR-H3;以及
(as)如SEQ ID NO.517中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.518中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.519中所描绘的CDR-H3;其中优选的是
(c)如SEQ ID NO.55中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.56中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.57中所描绘的CDR-H3;
(n)如SEQ ID NO.176中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.177中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.178中所描绘的CDR-H3;
(ac)如SEQ ID NO.341中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.342中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.343中所描绘的CDR-H3;以及
(aj)如SEQ ID NO.418中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.419中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.420中所描绘的CDR-H3。
在所述方面内,在本发明的背景下还设想提供一种抗体构建体,其中该第一结合结构域包含含有选自以下的CDR-H1、CDR-L2和CDR-L3的VL区:
(a)如SEQ ID NO.36中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.37中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.38中所描绘的CDR-L3;
(b)如SEQ ID NO.47中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.48中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.49中所描绘的CDR-L3;
(c)如SEQ ID NO.58中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.59中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.60中所描绘的CDR-L3;
(d)如SEQ ID NO.69中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.70中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.71中所描绘的CDR-L3;
(e)如SEQ ID NO.80中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.81中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.82中所描绘的CDR-L3;
(f)如SEQ ID NO.91中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.92中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.93中所描绘的CDR-L3;
(g)如SEQ ID NO.102中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.103中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.104中所描绘的CDR-L3;
(h)如SEQ ID NO.113中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.114中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.115中所描绘的CDR-L3;
(i)如SEQ ID NO.124中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.125中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.126中所描绘的CDR-L3;
(j)如SEQ ID NO.135中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.136中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.137中所描绘的CDR-L3;
(k)如SEQ ID NO.146中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.147中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.148中所描绘的CDR-L3;
(l)如SEQ ID NO.157中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.158中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.159中所描绘的CDR-L3;
(m)如SEQ ID NO.168中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.169中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.170中所描绘的CDR-L3;
(n)如SEQ ID NO.179中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.180中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.181中所描绘的CDR-L3;
(o)如SEQ ID NO.190中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.191中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.192中所描绘的CDR-L3;
(p)如SEQ ID NO.201中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.202中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.203中所描绘的CDR-L3;
(q)如SEQ ID NO.212中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.213中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.214中所描绘的CDR-L3;
(r)如SEQ ID NO.223中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.224中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.225中所描绘的CDR-L3;
(s)如SEQ ID NO.234中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.235中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.236中所描绘的CDR-L3;
(t)如SEQ ID NO.245中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.246中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.247中所描绘的CDR-L3;
(u)如SEQ ID NO.256中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.257中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.258中所描绘的CDR-L3;
(v)如SEQ ID NO.267中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.268中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.269中所描绘的CDR-L3;
(w)如SEQ ID NO.278中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.279中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.280中所描绘的CDR-L3;
(x)如SEQ ID NO.289中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.290中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.291中所描绘的CDR-L3;
(y)如SEQ ID NO.300中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.301中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.302中所描绘的CDR-L3;
(z)如SEQ ID NO.311中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.312中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.313中所描绘的CDR-L3;
(aa)如SEQ ID NO.322中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.323中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.324中所描绘的CDR-L3;
(ab)如SEQ ID NO.333中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.334中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.335中所描绘的CDR-L3;
(ac)如SEQ ID NO.344中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.345中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.346中所描绘的CDR-L3;
(ad)如SEQ ID NO.355中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.356中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.357中所描绘的CDR-L3;
(ae)如SEQ ID NO.366中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.367中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.368中所描绘的CDR-L3;
(af)如SEQ ID NO.377中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.378中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.379中所描绘的CDR-L3;
(ag)如SEQ ID NO.388中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.389中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.390中所描绘的CDR-L3;
(ah)如SEQ ID NO.399中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.400中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.401中所描绘的CDR-L3;
(ai)如SEQ ID NO.410中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.411中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.412中所描绘的CDR-L3;
(aj)如SEQ ID NO.421中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.422中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.423中所描绘的CDR-L3;
(ak)如SEQ ID NO.432中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.433中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.434中所描绘的CDR-L3;
(al)如SEQ ID NO.443中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.444中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.445中所描绘的CDR-L3;
(am)如SEQ ID NO.454中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.455中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.456中所描绘的CDR-L3;
(an)如SEQ ID NO.465中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.466中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.467中所描绘的CDR-L3;
(ao)如SEQ ID NO.476中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.477中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.478中所描绘的CDR-L3;
(ap)如SEQ ID NO.487中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.488中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.489中所描绘的CDR-L3;
(aq)如SEQ ID NO.498中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.499中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.500中所描绘的CDR-L3;
(ar)如SEQ ID NO.509中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.510中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.511中所描绘的CDR-L3;以及
(as)如SEQ ID NO.520中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.521中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.522中所描绘的CDR-L3;其中优选的是
(c)如SEQ ID NO.58中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.59中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.60中所描绘的CDR-L3;
(n)如SEQ ID NO.179中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.180中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.181中所描绘的CDR-L3;
(ac)如SEQ ID NO.344中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.345中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.346中所描绘的CDR-L3;以及
(aj)如SEQ ID NO.421中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.422中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.423中所描绘的CDR-L3。
在所述方面内,在本发明的背景下还设想提供一种抗体构建体,其中该第一结合结构域包含选自下组的VL区和VH区,该组由以下组成:
(a)如SEQ ID NO.40中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.39中所描绘的VH区;
(b)如SEQ ID NO.51中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.50中所描绘的VH区;
(c)如SEQ ID NO.62中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.61中所描绘的VH区;
(d)如SEQ ID NO.73中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.72中所描绘的VH区;
(e)如SEQ ID NO.84中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.83中所描绘的VH区;
(f)如SEQ ID NO.95中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.94中所描绘的VH区;
(g)如SEQ ID NO.106中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.105中所描绘的VH区;
(h)如SEQ ID NO.117中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.116中所描绘的VH区;
(i)如SEQ ID NO.128中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.127中所描绘的VH区;
(j)如SEQ ID NO.139中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.138中所描绘的VH区;
(k)如SEQ ID NO.150中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.149中所描绘的VH区;
(l)如SEQ ID NO.161中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.160中所描绘的VH区;
(m)如SEQ ID NO.172中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.171中所描绘的VH区;
(n)如SEQ ID NO.183中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.182中所描绘的VH区;
(o)如SEQ ID NO.194中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.193中所描绘的VH区;
(p)如SEQ ID NO.205中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.204中所描绘的VH区;
(q)如SEQ ID NO.216中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.215中所描绘的VH区;
(r)如SEQ ID NO.227中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.226中所描绘的VH区;
(s)如SEQ ID NO.238中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.237中所描绘的VH区;
(t)如SEQ ID NO.249中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.248中所描绘的VH区;
(u)如SEQ ID NO.260中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.259中所描绘的VH区;
(v)如SEQ ID NO.271中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.270中所描绘的VH区;
(w)如SEQ ID NO.282中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.281中所描绘的VH区;
(x)如SEQ ID NO.293中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.292中所描绘的VH区;
(y)如SEQ ID NO.304中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.303中所描绘的VH区;
(z)如SEQ ID NO.315中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.314中所描绘的VH区;
(aa)如SEQ ID NO.326中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.325中所描绘的VH区;
(ab)如SEQ ID NO.337中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.336中所描绘的VH区;
(ac)如SEQ ID NO.348中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.347中所描绘的VH区;
(ad)如SEQ ID NO.359中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.358中所描绘的VH区;
(ae)如SEQ ID NO.370中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.369中所描绘的VH区;
(af)如SEQ ID NO.381中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.380中所描绘的VH区;
(ag)如SEQ ID NO.392中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.391中所描绘的VH区;
(ah)如SEQ ID NO.403中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.402中所描绘的VH区;
(ai)如SEQ ID NO.414中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.413中所描绘的VH区;
(aj)如SEQ ID NO.425中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.424中所描绘的VH区;
(ak)如SEQ ID NO.436中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.435中所描绘的VH区;
(al)如SEQ ID NO.447中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.446中所描绘的VH区;
(am)如SEQ ID NO.458中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.457中所描绘的VH区;
(an)如SEQ ID NO.469中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.468中所描绘的VH区;
(ao)如SEQ ID NO.480中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.479中所描绘的VH区;
(ap)如SEQ ID NO.491中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.490中所描绘的VH区;
(aq)如SEQ ID NO.502中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.501中所描绘的VH区;
(ar)如SEQ ID NO.513中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.512中所描绘的VH区;以及
(as)如SEQ ID NO.524中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.523中所描绘的VH区。
在所述方面内,在本发明的背景下进一步设想提供一种抗体构建体,其中该抗体构建体包含选自如以下任一者中所描绘的氨基酸序列的序列:SEQ ID NO:41、52、63、74、85、96、107、118、129、140、151、162、173、184、195、206、217、228、239、250、261、272、283、294、305、316、327、338、349、360、371、382、393、404、415、426、437、448、459、470、481、492、503、514和525。
在所述方面内,在本发明的背景下还设想提供一种抗体构建体,其中该抗体构建体按氨基至羧基顺序包含:
(a)该第一结构域,该第一结构域具有选自下组的氨基酸序列,该组由以下组成:SEQ ID NO:41、52、63、74、85、96、107、118、129、140、151、162、173、184、195、206、217、228、239、250、261、272、283、294、305、316、327、338、349、360、371、382、393、404、415、426、437、448、459、470、481、492、503、514和525;
(b)肽接头,该肽接头具有选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的氨基酸序列;
(c)该第二结构域,该第二结构域具有选自下组或如SEQ ID NO:15中所描绘的氨基酸序列,该组由以下组成:WO 2008/119567的SEQ ID NO:23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187;以及
(d)肽接头,该肽接头具有选自由SEQ ID NO:1、2、3、9、10、11和12组成的组的氨基酸序列;
在所述方面内,在本发明的背景下还设想提供一种抗体构建体,其中该抗体构建体除了(a)至(d)之外按氨基至羧基顺序进一步包含:
(e)该第三结构域的该第一多肽单体,该第一多肽单体具有选自由SEQ ID NO:17-24组成的组的多肽序列;
(f)肽接头,该肽接头具有选自由SEQ ID NO:5、6、7和8组成的组的氨基酸序列;以及
(g)该第三结构域的该第二多肽单体,该第二多肽单体具有选自由SEQ ID NO:17-24组成的组的多肽序列。
在所述方面内,在本发明的背景下还设想提供一种抗体构建体,该抗体构建体具有选自下组的氨基酸序列,该组由以下组成:SEQ ID NO:42、43、53、54、64、65、75、76、86、87、97、98、108、109、119、120、130、131、141、142、152、153、163、164、174、175、185、186、196、197、207、208、218、219、229、230、240、241、251、252、262、263、273、274、284、285、295、296、306、307、317、318、328、329、339、340、350、351、361、362、372、373、383、384、394、395、405、406、416、417、427、428、438、439、449、450、460、461、471、472、482、483、493、494、504、505、515、516、526和527。
在第二方面,在本发明的背景下进一步设想提供一种多核苷酸,该多核苷酸编码本发明的抗体构建体。
在第三方面,在本发明的背景下还设想提供一种载体,该载体包含本发明的多核苷酸。
在第四方面,在本发明的背景下进一步设想提供一种宿主细胞,该宿主细胞用本发明的多核苷酸或载体转化或转染。
在第五方面,在本发明的背景下还设想提供一种用于产生本发明的抗体构建体的方法,所述方法包括在允许表达该抗体构建体的条件下培养本发明的宿主细胞并且从该培养中回收所产生的抗体构建体。
在第六方面,在本发明的背景下进一步设想提供一种药物组合物,该药物组合物包含本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体。
在所述方面内,在本发明的背景下还设想该药物组合物在约-20℃下稳定至少四周。
在本发明的背景下进一步设想提供本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体,用于在选自增殖性疾病、肿瘤性疾病、癌症或免疫学病症的疾病的预防、治疗或缓解中使用。
在所述方面内,在本发明的背景下还设想该疾病是胃肠癌(例如胃癌、食道癌、胃食道癌或结肠直肠癌)或胰腺癌。
在所述方面内,在本发明的背景下还设想该疾病是胃癌。
在第七方面,在本发明的背景下进一步设想提供一种用于治疗或缓解增殖性疾病、肿瘤性疾病、癌症或免疫学病症的方法,该方法包括向有需要的受试者施用本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体的步骤,其中该疾病优选是胃肠癌或胰腺癌、最优选胃癌。
在第八方面,在本发明的背景下还设想提供一种试剂盒,该试剂盒包含本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体、本发明的多核苷酸、本发明的载体、和/或本发明的宿主细胞。
在第九方面,在本发明的背景下进一步设想提供一种用于治疗或缓解胃肠癌的方法,该方法包括向有需要的受试者施用针对MUC17和CD3的双特异性抗体构建体的步骤。
在第十方面,在本发明的背景下进一步设想提供针对MUC17和CD3的双特异性抗体构建体,用于在胃肠癌的治疗或缓解中使用。
附图说明
图1:图1示出了MUC17的表位聚簇。标出了表位E1、E2、E3、E4、E5A和5B以及E2的截短型式(分别为TR2、TR3、TR4和TR5)。对其中将人MUC17(褐色/灰色)被非功能性小鼠MUC3替换的构建体的实验揭示出对应的表位。鉴定出覆盖表位空间E2(包含SEA结构域)的45种MUC17-scFc双特异性抗体构建体。
图2:通过MUC17-scFc双特异性抗体构建体针对表达人/小鼠嵌合构建体的细胞的细胞上结合进行MUC17表位定位。通过荧光激活细胞分选法(FACS)评估细胞上结合,其中与嵌合构建体的结合的丧失表明对应的(突变型)结构域对于MUC17-scFc双特异性抗体构建体结合是必需的。例如,E2在突变时显示出结合的丧失。因此,E2对于所有四种检查的双特异性抗体构建体的结合是必需的。
图3:MUC17在胃癌、胰腺癌和结肠直肠癌细胞系中表达。通过活细胞的流式细胞术确定MUC17细胞表面蛋白表达并且描绘为FACS读取(A)。通过定量的聚合酶链式反应(qPCR)确定癌细胞系中的MUC17 mRNA水平。将值标准化为组成型表达基因的那些值(B)。
图4:对具有不同MUC17表达、携带三种不同的MUC17的细胞系的细胞毒性测定(A:GSU,B:NUGC-4和C:Ls174T)。测试的构建体为1=32-G6;2=1-B6;3=2-C2和4=8-B7。构建体8-B7在细胞毒性方面略微有利。
图5:将可溶性MUC17蛋白(sMUC17,aa 4131-4243Uniprot)以0-1000ng/ml添加到TDCC测定中,并且在孵育48h后评估MUC17-scFc双特异性抗体构建体的活性(靶细胞GSU(A)或NUGC-4(B),10:1的人T细胞比靶细胞,通过SteadyGlo读取)。sMUC17的添加不影响双特异性抗体构建体的细胞毒活性。
图6:MUC17-scFc抗体构建体8-B7在结肠直肠癌的异种移植模型中抑制肿瘤生长。向雌性NOD/SCID小鼠植入2×106个Ls174T结肠直肠癌细胞。在第15天,通过腹膜内(IP)注射施用2×107个扩增的激活T细胞。在第16天和第22天,IP给予MUC17-scFc抗体构建体。用卡尺测量肿瘤大小。
图7:对根据本发明的优选双特异性抗体构建体调查了组码(优化文库)、分子名称、对应构建体结合的表位簇、依据SPR、以[nM]计的亲和力(KD)、以[pM]计的NUGC-4细胞中细胞毒活性(EC50)、其比率(EC50/KD)*1000以及VH VL安排。
图8:MUC17-scFc抗体构建体8-B7在食蟹猴中具有延长的半衰期(A)。暴露水平与预测暴露一致。(B)在0h和168h时向食蟹猴(每组n=3)施用100mg/kg或1000mg/kg MUC17在所指示的时间点处收集血清并且使用基于抗CD3抗体或抗MUC17抗体的ELISA分析该血清中MUC17 scFc双特异性抗体构建体的存在。将数据拟合至两室模型。该图示出了单个数据(点)和平均值(线)。
具体实施方式
在本发明的背景下,提供了一种特异性靶向与恶性肿瘤相关的MUC17的双特异性抗体构建体。为此,首先将MUC17鉴定为相对于正常组织表达在胃肿瘤中上调的基因。在这方面,根据本领域常用的免疫组织化学方法显示MUC17蛋白在40%-77%的胃肿瘤中表达。通过流式细胞术还证明,除了一些胰腺癌细胞系和结肠直肠癌细胞系之外,MUC17蛋白在胃癌细胞系和食道癌细胞系的细胞表面上表达。甚至已经显示,这种表达在中国患者的胃肿瘤中特别高。因此,将MUC17鉴定为与胃肠癌,即胃癌、小肠癌和大肠癌(结肠癌)、食道癌和胰腺癌相关的有效靶标。
在本发明的背景下令人惊讶的发现是,根据本发明的双特异性抗体构建体优选靶向携带MUC17的癌细胞,诸如胃癌细胞和胃肠癌细胞,并且相比之下,较少地靶向非癌细胞。MUC17通常在非癌肠上皮细胞的顶端表面(即,位于对应细胞的基部的对面)上表达,并且形成粘膜层的一部分。然而,MUC 17在胃癌和胃肠癌中过表达,并且在这种情况下不限于顶端表面,而是也在非顶端表面上表达。不希望受理论束缚,认为顶端表面上的MUC17较不易于为根据本发明的双特异性抗体构建体所接近,而在癌细胞中的非顶端表面上表达的MUC17更易于接近。因此,根据本发明的双特异性抗体构建体优选靶向MUC17相关癌细胞并且较少地靶向非癌细胞。当比较健康动物中的良好耐受性与体内癌症模型中的高抗肿瘤功效时,已经令人惊讶地发现了这一点。详细地,尽管免疫组织化学确认了在从探究性毒理学研究中评价的猴取样的胃肠组织(诸如小肠)的顶端表面上的MUC17表达,但有利地,在表达MUC17的组织中没有组织病理学变化。同样在体外确认了非癌细胞对根据本发明的双特异性抗体构建体的良好耐受性。相比之下,当与对照组中的安慰剂治疗的小鼠相比时,用根据本发明的双特异性抗体构建体静脉内治疗携带肿瘤小鼠导致统计学上显著且剂量依赖性的肿瘤生长抑制。因此,根据本发明的双特异性抗体构建体优选地被患者耐受,并且特征在于先前未针对任何MUC17寻址剂描述的优选便于控制的治疗窗。
在本发明的背景下提供了针对MUC17蛋白的EGF-SEA-EGF区的双特异性抗体构建体。有利地,靶向蛋白质的该区提供相对于最近家族成员(MUC3A、MUC3B、MUC12;例如,Hollingsworth和Swanson,Nat.Rev.Cancer[自然综述:癌症]2004)的选择性,以及结合细胞膜相关MUC17的能力。与其他跨膜粘蛋白一样,MUC17在SEA结构域内含有潜在的裂解位点。
因此,在此设想了靶向MUC17 EGF-SEA-EGF区和CD3并具有单链Fc形式以延长半衰期靶向的双特异性抗体构建体。有利地,本发明的双特异性抗体构建体优选具有高的针对携带MUC17靶标的靶细胞的亲和力(单数位nM KD)和效能(<50pMEC50),以允许靶向感兴趣的肿瘤细胞中的低或非均匀水平的MUC17。
设想根据本发明的双特异性抗体构建体与例如食蟹猴MUC17(除了人MUC17之外)具有交叉反应性,以实现非临床毒理学研究。本文首次提出了食蟹猴MUC17的EGF-SEA-EGF结构域的序列细节的重要性。
在本发明的背景下,设想双特异性抗体构建体表现出结合亲和力、强有力的细胞毒活性,并且是对于SEA结构域最稳定的图谱。
在本发明的背景下,设想双特异性抗体构建体在靶标结合物中具有半胱氨酸夹钳,即分子内二硫键,以改善稳定性。
在本发明的背景下,设想具有作为半衰期延长(HLE)部分并且针对MUC17的单链Fc(scFc)的双特异性抗体构建体旨在用于在胃肠癌,包括胃癌、胃食道癌、食道癌、胰腺癌和结肠直肠癌的治疗中使用。
此外,在本发明的背景下,任选但有利地设想scFc即HLE抗体构建体能够静脉内给药,该静脉内给药每周仅施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次或甚至每四周施用一次,或更不频繁地施用。
在本发明的背景下,通过首先消除MUC17的串联重复序列(因为它们是高度糖基化的并且在序列上是重复的)来鉴定有待治疗靶向的优选表位。这导致例如376aa未定义区和177aa EGF样/SEA结构域区。有利地,靶向EGF样/SEA结构域允许相对于最近家族成员诸如MUC3的选择性、与食蟹猴MUC17的交叉反应性以及与细胞膜相关MUC17的结合。随后我们生成用于评价结合、T细胞重定向溶解、激活和细胞因子释放的试剂和测定。使用这些测定来确认优选的双特异性抗体构建体在亲和力、细胞毒活性和构建体稳定性方面满足预定义的候选产物特征。
为了确定针对MUC17的优选双特异性抗体构建体的一个或多个表位,如本文所述那样进行表位定位。优选的双特异性抗体构建体针对包含SEA结构域的表位E2。E2表位包含在本文中表征为SEQ ID NO:528的氨基酸(aa)序列。根据uniprot Q685J3编号,该氨基酸序列基本上对应于MUC17的aa 4171至4296。一般来讲,在本发明的背景下的MUC17 aa编号总是参考或旨在参考MUC17的uniprot Q685J3编号产生。相反,靶向MUC17的E1表位(即SEA结构域的N末端表位(参见图1))的双特异性抗体构建体令人惊讶地显示出与MUC3A和MUC3B的不期望的交叉反应性,这将导致脱靶活性并且最终导致副作用风险增加。此外,针对位于SEA结构域C末端的表位E3和E4(参见图1)的双特异性抗体构建体出乎意料地不与食蟹猴MUC17交叉反应。因此,设想根据本发明的双特异性抗体构建体特异性地且排他地结合MUC17的E2表位。
这种根据本发明的优选双特异性抗体构建体可以根据它们的结构或它们独特的详细表位结合特征进一步详细说明。根据本发明的优选双特异性抗体构建体可以通过计算如本文提供的细胞毒性与亲和力的新颖指示比率来确定。例如,所述比率(EC50/KD)*1000优选<(低于)250。这种比率典型地指示与表位E2的截短变体,即TR2(干体(trunk)2:SEQ IDNO 532)和TR3(干体3:SEQ ID NO:533)的良好结合,而比率>(高于)250典型地更加表明与TR2但不与TR3良好结合。详细地,最优选的构建体典型地结合表位簇E2/E5A/部分5B和/或TR2/TR3。它们显示出例如低于约21的(EC50:KD)*1000比率并且属于相关序列家族(例如优化(OPT)文库命名4a、4b、5a和10)。它们的VH/VL安排优选在本文中的特征为4λ3或“4I3”)。在本发明的背景下,将此类构建体鉴定为例如,8-A7、8-B7、8-B8、8-C7、8-H8、8-D7、4-E7、8-F9、1-A6、8-H9、1-B6、8-F11和5-H1。还优选的是与表位簇E2/E5A/部分5B和/或TR2/TR3结合并且显示EC50:KD比率低于约125且属于序列家族(OPT文库命名)1a、1c和9的构建体。它们的VH/VL安排的特征为3λ3或“3I3”。在本发明的背景下鉴定了此类构建体,例如,2-D11、8-E3、32-G6、2-C2、9-C2、1-B10、4-B1、4-F6、4-G4、4-A8、4-B10、4-H11和4-H2。优选但相比于前述两个序列家族次优选的是结合表位簇E2/部分E5A/部分5B和/或TR2/部分TR3且显示出(EC50/KD)*1000比率低于约1500,典型地在250与1450之间,且属于序列家族(OPT文库命名)6、7和8的结合物。它们的VH/VL安排的特征为2k3或“3k3”。本文特别优选的是构建体32-G6(SEQ ID NO:65)、1-B6(SEQ ID NO:483)、2-C2(SEQ ID NO:428)和8-B7(SEQ ID NO:186)。在本发明的背景下,通常通过SPC(诸如BiacoreB分析)测量亲和力,并且典型地将结果以nM给出。典型地,使用NUGC-4细胞作为MUC17靶细胞并且使用未刺激的人PBMC作为CD3效应细胞来确定细胞毒活性。
在本发明的背景下设想,优选的双特异性抗体构建体不仅显示出有利的细胞毒性与亲和力的比率,而且另外还显示出足够的稳定性特征,以便有助于配制、储存和施用所述构建体的实际操作。例如,足够的稳定性的特征在于标准制备后的高单体含量(即非聚集的和/或非缔合的天然分子),诸如如通过制备型尺寸排阻色谱法(SEC)确定的至少65%、更多优选至少70%并且甚至更优选至少75%。另外,例如在浓度为2.5mg/ml下以340nm作为光学吸收测量的浊度应该优选地等于或低于0.025、更优选0.020,例如,以便得出基本上不存在不希望的聚集体的结论。有利地,在应激条件(诸如冷冻/解冻)下孵育或在37℃或40℃下孵育之后保持高单体含量。
因此,本发明提供了一种抗体构建体,该抗体构建体包含:
·第一结构域,该第一结构域与MUC17结合,
·第二结构域,该第二结构域与人和猕猴CD3ε链的细胞外表位结合;以及任选地
·第三结构域,该第三结构域包含两个多肽单体,每个多肽单体包含铰链、CH2结构域和CH3结构域,其中所述两个多肽单体经由肽接头彼此融合。
在一个实施例中,本发明提供了包含所有三个这样的结构域的双特异性抗体构建体。
术语“抗体构建体”是指其中结构和/或功能是基于抗体,例如全长或整个免疫球蛋白分子的结构和/或功能的分子。因此,抗体构建体能够结合其特异性靶标或抗原并且/或者从抗体或其片段的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)结构域中提取。此外,将根据本发明与其结合配偶体结合的结构域在本文中理解为根据本发明的抗体构建体的结合结构域。典型地,根据本发明的结合结构域包含允许靶结合的抗体的最小结构要求。这种最小要求可以例如通过至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)、优选全部六个CDR的存在来定义。定义抗体的最小结构要求的替代方法是分别定义特异性靶标结构内的抗体表位、构成表位区(表位簇)的靶蛋白的蛋白结构域或通过参考与所定义抗体的表位竞争的特异性抗体。根据本发明的构建体所基于的抗体包括例如单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、去免疫抗体、人源化抗体和人抗体。
根据本发明的抗体构建体的结合结构域可以例如包含上文提及的CDR组。优选地,那些CDR包含在抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)的框架中;然而,它不一定包含两者。例如,Fd片段具有两个VH区并且通常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体片段、抗体变体或结合结构域的形式的另外实例包括(1)Fab片段,一种具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段;(2)F(ab')2片段,一种具有由二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段;(3)具有两个VH和CH1结构域的Fd片段;(4)具有抗体的单一臂的VL和VH结构域的Fv片段;(5)具有VH结构域的dAb片段(Ward等人,(1989)Nature[自然]341:544-546);(6)分离的互补决定区(CDR),以及(7)单链Fv(scFv),后者是优选的(例如,衍生自scFV文库)。根据本发明的抗体构建体的实施例的实例例如描述于以下中:WO 00/006605、WO2005/040220、WO 2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO 2013/026833、US2014/0308285、US 2014/0302037、WO 2014/144722、WO 2014/151910和WO 2015/048272。
另外,在“结合结构域”或“结合的结构域”的定义内是全长抗体的片段,诸如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab’、F(ab')2或“r IgG”(“半抗体”)。根据本发明的抗体构建体还可以包含抗体的修饰片段(也称为抗体变体),诸如scFv、二-scFv或二(双)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉链、scFab、Fab2、Fab3、双抗体、单链双抗体、串联双抗体(Tandab’s)、串联二-scFv、串联三-scFv、“多抗体”(诸如三抗体或四抗体),以及单结构域抗体(诸如纳米抗体)或仅包含一个可变结构域的单一可变结构域抗体,该一个可变结构域可以是独立于其他V区或结构域而特异性结合抗原或表位的VHH、VH或VL。
如本文使用的,术语“单链Fv”、“单链抗体”或“scFv”是指单一多肽链抗体片段,这些抗体片段包含来自重链和轻链的可变区,但缺乏恒定区。一般来讲,单链抗体进一步包含在VH与VL结构域之间的多肽接头,该多肽接头使得它形成所希望的将允许抗原结合的结构。单链抗体详细论述于以下中:Pluckthun,在ThePharmacology of MonoclonalAntibodies[单克隆抗体的药理学]中,第113卷,Rosenburg和Moore编辑Springer-Verlag[施普林格出版社],纽约,第269-315页(1994)。产生单链抗体的各种方法是已知的,包括以下中所描述的那些:美国专利号4,694,778和5,260,203;国际专利申请公开号WO 88/01649;Bird(1988)Science[科学]242:423-442;Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883;Ward等人(1989)Nature[自然]334:54454;Skerra等人(1988)Science[科学]242:1038-1041。在具体的实施例中,单链抗体还可以是双特异性的、多特异性的、人和/或人源化的和/或合成的。
此外,术语“抗体构建体”的定义包括单价、二价和多价(polyvalent/multivalent)构建体,并且因此包括仅与两个抗原结构特异性结合的双特异性构建体,以及通过不同的结合结构域特异性结合超过两个(例如三个、四个或更多个)抗原结构的多特异性构建体。此外,术语“抗体构建体”的定义包括仅由一条多肽链组成的分子以及由超过一条多肽链组成的分子,这些链可以是相同的(同源二聚体、同源三聚体或同源寡聚物)或不同的(异源二聚体、异源三聚体或异源寡聚物)。上文鉴定的抗体及其变体或衍生物的实例尤其描述于以下中:Harlow和Lane,Antibodies a laboratory manual[抗体:实验室手册],CSHL Press[冷泉港实验室出版社](1988)和Using Antibodies:a laboratorymanual[使用抗体:实验室手册],CSHL Press[冷泉港实验室出版社](1999);Kontermann和Dübel,Antibody Engineering[抗体工程],Springer[施普林格],第2版2010和Little,Recombinant Antibodies for Immunotherapy[用于免疫疗法的重组抗体],CambridgeUniversity Press[剑桥大学出版社]2009。
如本文使用的,术语“双特异性”是指“至少双特异性”的抗体构建体,即该抗体构建体至少包含第一结合结构域和第二结合结构域,其中第一结合结构域与一种抗原或靶标(此处:MUC17MUC17)结合,并且第二结合结构域与另一抗原或靶标(此处:CD3)结合。因此,根据本发明的抗体构建体包含针对至少两种不同抗原或靶标的特异性。例如,第一结构域优选不与如本文所述的物种中的一种或多种的CD3ε的细胞外表位结合。术语“靶细胞表面抗原”是指由细胞表达并且存在于细胞表面以使得为如本文所述的抗体构建体所接近的抗原结构。它可以是蛋白质,优选蛋白质的细胞外部分;或碳水化合物结构,优选蛋白质的碳水化合物结构,诸如糖蛋白。它优选是肿瘤抗原。术语本发明的“双特异性抗体构建体”还涵盖多特异性抗体构建体,诸如三特异性抗体构建体,后者包括三个结合结构域,或具有超过三种(例如四种、五种......)特异性的构建体。
鉴于根据本发明的抗体构建体是(至少)双特异性的,它们不是天然存在的并且与天然存在的产物明显不同。因此,“双特异性”抗体构建体或免疫球蛋白是具有至少两个具有不同特异性的不同结合侧的人工杂交抗体或免疫球蛋白。双特异性抗体构建体可以通过多种方法产生,包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见,例如Songsivilai和Lachmann,Clin.Exp.Immunol.[临床实验免疫学]79:315-321(1990)。
本发明的抗体构建体的至少两个结合结构域和可变结构域(VH/VL)可以包含或可以不包含肽接头(间隔肽)。根据本发明,术语“肽接头”包含这样的氨基酸序列:通过该氨基酸序列,本发明的抗体构建体的一个(可变和/或结合)结构域和另一(可变和/或结合)结构域的氨基酸序列彼此连接。肽接头也可以用于将第三结构域与本发明的抗体构建体的其他结构域融合。这种肽接头的基本技术特征在于它不包含任何聚合活性。合适的肽接头是在美国专利4,751,180和4,935,233或WO 88/09344中描述的那些。肽接头也可用于将其他结构域或模块或区(诸如半衰期延长结构域)连接到本发明的抗体构建体。
本发明的抗体构建体优选为“体外产生的抗体构建体”。这个术语是指根据上述定义的抗体构建体,其中在非免疫细胞选择,例如体外噬菌体展示、蛋白质芯片或其中可以测试候选序列与抗原结合的能力的任何其他方法中产生可变区(例如,至少一个CDR)的全部或一部分。因此,这个术语优选排除仅由动物中免疫细胞中基因组重排产生的序列。“重组抗体”是通过使用重组DNA技术或基因工程制得的抗体。
如本文使用的,术语“单克隆抗体”(mAb)或单克隆抗体构建体是指获得自基本上均质的抗体群体的抗体,即除了可以少量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如,异构化、酰胺化)外,构成该群体的单独抗体是相同的。与典型地包括针对不同决定簇(或表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比,单克隆抗体针对抗原上的单一抗原侧或决定簇具有高度特异性。除了它们的特异性之外,单克隆抗体还在它们通过杂交瘤培养物合成,因此不被其他免疫球蛋白污染方面是有优势的。修饰语“单克隆”指示获得自基本上均质的抗体群体的抗体的特征,并且不应理解为要求通过任何特定方法产生抗体。
对于单克隆抗体的制备,可以使用提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术。例如,有待使用的单克隆抗体可以通过Koehler等人,Nature[自然],256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法,或可以通过重组DNA方法(参见,例如美国专利号4,816,567)制备。用于产生人单克隆抗体的另外技术的实例包括三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor,Immunology Today[今日免疫学]4(1983),72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy[单克隆抗体和癌症治疗],Alan R.Liss公司(1985),77-96)。
然后可以使用标准方法(诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离子体共振分析例如BiacoreTM筛选杂交瘤以鉴定一种或多种产生与指定抗原特异性结合的抗体的杂交瘤。任何形式的相关抗原均可以用作免疫原,例如重组抗原、天然存在形式、其任何变体或片段以及其抗原肽。如在Biacore系统中采用的表面等离子体共振可以用于增加与靶细胞表面抗原的表位结合的噬菌体抗体的效率(Schier,Human Antibodies Hybridomas[人抗体杂交瘤]7(1996),97-105;Malmborg,J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]183(1995),7-13)。
另一种制备单克隆抗体的示例性方法包括筛选蛋白质表达文库,例如噬菌体展示或核糖体展示文库。噬菌体展示例如描述于以下中:Ladner等人,美国专利号5,223,409;Smith(1985)Science[科学]228:1315-1317;Clackson等人,Nature[自然],352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],222:581-597(1991)。
除了使用展示文库之外,还可以使用相关抗原来免疫非人动物,例如啮齿动物(诸如小鼠、仓鼠、兔或大鼠)。在一个实施例中,非人动物包括人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如,有可能用人Ig(免疫球蛋白)基因座的大片段来工程化小鼠抗体产生缺陷的小鼠品系。使用杂交瘤技术,可以产生并选择衍生自具有所希望的特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参见,例如XENOMOUSETM;Green等人(1994)Nature Genetics[自然遗传学]7:13-21;US 2003-0070185;WO 96/34096和WO 96/33735。
单克隆抗体也可以获得自非人动物,并且然后使用本领域中已知的重组DNA技术进行修饰,例如人源化、去免疫、呈现嵌合等。修饰的抗体构建体的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和力成熟”抗体(参见,例如Hawkins等人J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]254,889-896(1992)和Lowman等人,Biochemistry[生物化学]30,10832-10837(1991))和具有改变的一种或多种效应子功能的抗体突变体(参见,例如美国专利5,648,260;Kontermann和Dübel(2010),上述引文和Little(2009),上述引文)。
在免疫学中,亲和力成熟是这样的过程:通过该过程,在免疫应答的过程中B细胞产生与抗原的亲和力增加的抗体。由于反复暴露于相同的抗原,宿主会产生依次更大亲和力的抗体。如天然原型一样,体外亲和力成熟是基于突变和选择的原则。体外亲和力成熟已经成功地用于优化抗体、抗体构建体和抗体片段。使用辐射、化学诱变剂或易错PCR在CDR内引入随机突变。此外,遗传多样性可以通过链改组来增加。使用展示方法(如噬菌体展示)进行两轮或三轮突变和选择通常产生具有在低纳摩尔范围内的亲和力的抗体片段。
抗体构建体的氨基酸取代变化的优选类型涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个超变区残基。一般来讲,选择用于进一步开发的一种或多种所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改善的生物特性。用于产生此类取代变体的便利方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之,将若干个超变区侧(例如6-7个侧)突变以在每侧产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒展示为与每个颗粒内包装的M13的基因III产物的融合物。然后如本文所披露那样筛选噬菌体展示的变体的生物活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选超变区侧,可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有显著贡献的超变区残基。可替代地或另外,分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定结合结构域与例如人MUC17之间的接触点可能是有利的。根据本文阐述的技术,此类接触残基和相邻残基是用于取代的候选者。一旦产生了此类变体,就如本文所述对这组变体进行筛选,并且可以选择在一种或多种相关测定中具有优异特性的抗体用于进一步的开发。
本发明的单克隆抗体和抗体构建体具体地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白),其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源,而一个或多个链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源,以及此类抗体的片段,只要它们展现出所希望的生物活性即可(美国专利号4,816,567;Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],81:6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体,这些抗体包含衍生自非人灵长类动物(例如,旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。已经描述了多种用于制备嵌合抗体的方法。参见,例如Morrison等人,Proc.Natl.Acad.ScLU.S.A.[美国国家科学院院刊]81:6851,1985;Takeda等人,Nature[自然]314:452,1985;Cabilly等人,美国专利号4,816,567;Boss等人,美国专利号4,816,397;Tanaguchi等人,EP0171496;EP 0173494;和GB 2177096。
抗体、抗体构建体、抗体片段或抗体变体还可以通过例如WO 98/52976或WO 00/34317中披露的方法特定地缺失人T细胞表位(称为“去免疫”的方法)来进行修饰。简而言之,可以针对与II类MHC结合的肽分析抗体的重链和轻链可变结构域;这些肽代表潜在的T细胞表位(如WO 98/52976和WO 00/34317中所定义)。为了检测潜在T细胞表位,可以应用称为“肽穿线”的计算机建模方法,并且此外针对VH和VL序列中存在的基序,可以搜索人MHCII类结合肽的数据库,如WO 98/52976和WO 00/34317中所述。这些基序与18种主要的MHCII类DR同种异型中的任一种结合,并且因此构成潜在T细胞表位。检测到的潜在T细胞表位可以通过取代可变结构域中的少量氨基酸残基,或者优选通过单个氨基酸取代来消除。典型地,进行保守取代。通常但不排他地,可以使用人种系抗体序列中的位置共有的氨基酸。人种系序列例如披露于以下中:Tomlinson等人(1992)J.MoI.Biol.[分子生物学杂志]227:776-798;Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today[今日免疫学]第16卷(5):237-242;和Tomlinson等人(1995)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]14:14:4628-4638。V BASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的综合目录(由Tomlinson,LA.等人编辑MRC Centre forProtein Engineering[医学研究理事会蛋白质工程中心],Cambridge,UK[英国剑桥])。这些序列可以用作人序列的来源,例如用于框架区和CDR。也可以使用共有的人框架区,例如如美国专利号6,300,064中所述。
“人源化”抗体、抗体构建体、其变体或片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)是主要人序列的抗体或免疫球蛋白,这些主要人序列含有一种或多种衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。对于大部分来说,人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体),其中来自受体的高变区(也称为CDR)的残基被来自非人(例如啮齿动物)物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、仓鼠或兔)的具有所希望的特异性、亲和力和能力的高变区的残基替换。在一些情况下,人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人类残基替换。此外,如本文使用的,“人源化抗体”还可以包括在受体抗体或供体抗体中均未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。人源化抗体还可以包含典型地是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。对于更多的细节,参见Jones等人Nature[自然],321:522-525(1986);Reichmann等人,Nature[自然],332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[结构生物学新见],2:593-596(1992)。
人源化抗体或其片段可以通过用人Fv可变结构域的等效序列替换不直接参与抗原结合的Fv可变结构域的序列来产生。用于产生人源化抗体或其片段的示例性方法由以下提供:Morrison(1985)Science[科学]229:1202-1207;Oi等人(1986)BioTechniques[生物技术]4:214;以及US 5,585,089;US 5,693,761;US 5,693,762;US 5,859,205;和US 6,407,213。那些方法包括分离、操纵和表达编码来自重链或轻链中的至少一者的全部或部分免疫球蛋白Fv可变结构域的核酸序列。此类核酸可以获得自如上所述的产生针对预定靶标的抗体的杂交瘤,以及其他来源。然后可以将编码人源化抗体分子的重组DNA克隆到合适的表达载体中。
人源化抗体还可以使用转基因动物(诸如表达人重链和轻链基因但不能表达内源性小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因的小鼠)产生。Winter描述了可用于制备本文所述的人源化抗体的示例性CDR移植方法(美国专利号5,225,539)。特定人抗体的全部CDR可以用至少一部分非人CDR替换,或者仅一些CDR可以用非人CDR替换。仅需要替换用于将人源化抗体与预定抗原结合所希望的CDR数量。
可以通过引入保守取代、共有序列取代、种系取代和/或回复突变来优化人源化抗体。此类改变的免疫球蛋白分子可以通过本领域中已知的若干种技术中的任一种来制得(例如,Teng等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊],80:7308-7312,1983;Kozbor等人,Immunology Today[今日免疫学],4:7279,1983;Olsson等人,Meth.Enzymol.[酶学方法],92:3-16,1982和EP 239 400)。
术语“人抗体”、“人抗体构建体”和“人结合结构域”包括具有抗体区的抗体、抗体构建体和结合结构域,这些抗体区诸如基本上对应于本领域中已知的人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区或结构域,包括例如由Kabat等人(1991)(上述引文)描述的那些。本发明的人抗体、抗体构建体或结合结构域可以包含例如CDR中且特别是CDR3中不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。人抗体、抗体构建体或结合结构域可以具有至少1个、2个、3个、4个、5个或更多个被不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基替换的位置。然而,如本文使用的人抗体、抗体构建体和结合结构域的定义还涵盖“完全人抗体”,这些完全人抗体仅包含非人工和/或遗传改变的人抗体序列,如可通过使用诸如Xenomouse技术或系统衍生的那些。优选地,“完全人抗体”不包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基。
在一些实施例中,本发明的抗体构建体是“分离的”或“基本上纯的”抗体构建体。当用于描述本文披露的抗体构建体时,“分离的”或“基本上纯的”意指抗体构建体已从其产生环境的组分中鉴定、分离和/或回收。优选地,抗体构建体不与或基本上不与来自其产生环境的所有其他组分缔合。其产生环境的污染组分,诸如由重组转染细胞产生的污染组分,是典型地干扰多肽的诊断或治疗用途的物质,并且可能包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。抗体构建体可以例如占给定样品中总蛋白质的按重量计至少约5%或至少约50重量%。应理解,根据情况,分离的蛋白质可以占总蛋白质含量的按重量计5%至99.9%。通过使用诱导型启动子或高表达启动子,可以以显著更高的浓度制备多肽,以使得它以增加的浓度水平制备。该定义包括在本领域中已知的多种生物体和/或宿主细胞中产生抗体构建体。在优选的实施例中,抗体构建体(1)通过使用旋杯式序列分析仪纯化至足以获得至少15个N末端或内部氨基酸序列的残基的程度,或(2)可以通过SDS-PAGE在非还原或还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色纯化至均质。然而,通常通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体构建体。
术语“结合结构域”关于本发明表征了(特异性地)与靶分子(抗原)(此处:分别为MUC17和CD3)上的给定靶表位或给定靶侧结合/相互作用/识别该给定靶表位或给定靶侧的结构域。第一结合结构域(识别MUC17)的结构和功能以及优选还有第二结合结构域(识别CD3)的结构和/或功能是基于抗体,例如全长或完整免疫球蛋白分子的结构和/或功能,并且/或者是从抗体或其片段的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)结构域中提取。优选地,第一结合结构域的特征在于三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)的存在。第二结合结构域优选还包含允许靶结合的抗体的最小结构要求。更优选地,第二结合结构域包含至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)。设想第一结合结构域和/或第二结合结构域是通过噬菌体展示或文库筛选方法产生或可获得的,而不是通过将来自预先存在的(单克隆)抗体的CDR序列移植到支架中产生或可获得的。
根据本发明,结合结构域呈一种或多种多肽的形式。此类多肽可以包括蛋白质部分和非蛋白质部分(例如化学接头或化学交联剂,诸如戊二醛)。蛋白质(包括其片段、优选生物活性片段和通常具有少于30个氨基酸的肽)包含经由共价肽键彼此偶联的两个或更多个氨基酸(产生氨基酸链)。
如本文使用的,术语“多肽”描述了一组分子,这些分子通常由超过30个氨基酸组成。多肽可以进一步形成多聚体,诸如二聚体、三聚体和更高级的寡聚物,即由多于一个多肽分子组成。形成此类二聚体、三聚体等的多肽分子可以是相同的或不相同的。因此,此类多聚体的相应的更高级结构称为同源二聚体或异源二聚体、同源三聚体或异源三聚体等。异源多聚体的实例是在其天然存在形式下由两条相同的轻链多肽链和两条相同的重链多肽链组成的抗体分子。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”也是指天然修饰的肽/多肽/蛋白质,其中修饰是例如通过翻译后修饰(如糖基化、乙酰化、磷酸化等)来实现。当在本文中提及时,“肽”、“多肽”或“蛋白质”也可以是化学修饰的,诸如聚乙二醇化的。此类修饰在本领域中是熟知的并且在下文描述。
优选地,与MUC17结合的结合结构域和/或与CD3ε结合的结合结构域是人结合结构域。包含至少一个人结合结构域的抗体和抗体构建体避免了与具有非人(诸如啮齿动物(例如鼠类、大鼠、仓鼠或兔))可变区和/或恒定区的抗体或抗体构建体相关的一些问题。此类啮齿动物衍生的蛋白质的存在可以导致抗体或抗体构建体快速清除或可以导致患者产生针对抗体或抗体构建体的免疫应答。为了避免使用啮齿动物衍生的抗体或抗体构建体,可以通过将人抗体功能引入到啮齿动物中以使啮齿动物产生完全人抗体来产生人或完全人抗体/抗体构建体。
在酵母人工染色体YAC中克隆和重构兆碱基大小的人基因座并将它们引入到小鼠种系中的能力为阐明非常大或粗略定位的基因座的功能组分以及产生有用的人疾病模型提供了强有力的方法。此外,使用这种技术将小鼠基因座取代为其人等效物可以提供关于人基因产物在发育过程中的表达和调控、其与其他系统的通信以及其参与疾病诱导和进展的独特见解。
这种策略的重要实际应用是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入到其中内源性Ig基因已经失活的小鼠中提供了研究抗体的程序化表达和组装的根本机制以及其在B细胞发育中的作用的机会。此外,这种策略可以为完全人单克隆抗体(mAb)的产生提供理想来源-这是有助于实现抗体疗法在人疾病中的前景的重要里程碑。预期完全人抗体或抗体构建体将小鼠或小鼠衍生的mAb所固有的免疫原性和变应性应答最小化,并且由此增加施用的抗体/抗体构建体的功效和安全性。可以预期使用完全人抗体或抗体构建体可以在治疗需要重复施用化合物的慢性和复发性人疾病(诸如炎症、自体免疫和癌症)中提供显著的优势。
实现这一目标的一种方法是用人Ig基因座的大片段工程化小鼠抗体产生缺陷的小鼠品系,预期这种小鼠在不存在小鼠抗体的情况下将产生大的人抗体组库。大的人Ig片段将保持大的可变基因多样性以及对抗体产生和表达的适当调控。通过利用小鼠机构实现抗体多样化和选择以及缺乏对人蛋白质的免疫耐受性,在这些小鼠品系中再生的人抗体组库应产生针对任何感兴趣的抗原(包括人抗原)的高亲和力抗体。使用杂交瘤技术,可以容易地产生和选择具有所希望特异性的抗原特异性人mAb。结合第一种XenoMouse小鼠品系的产生证明了这个一般策略(参见Green等人Nature Genetics[自然遗传学]7:13-21(1994))。用含有人重链基因座和k轻链基因座的分别245kb和190kb大小的种系构型片段的YAC工程化XenoMouse品系,这些种系构型片段含有核心可变区和恒定区序列。证明含有人Ig的YAC与小鼠系统相容以重排和表达抗体,并且这些YAC能够取代失活的小鼠Ig基因。这通过其诱导B细胞发育、产生完全人抗体的成人样人组库和产生抗原特异性人mAb的能力来证明。这些结果还表明,引入含有更多数量的V基因、额外的调控元件和人Ig恒定区的更大部分的人Ig基因座可以基本上再现作为对感染和免疫的人体液应答的特征的完整组库。Green等人的工作最近扩展到通过分别引入兆碱基大小的人重链基因座和k轻链基因座的种系构型YAC片段来引入大于约80%的人抗体组库。参见Mendez等人Nature Genetics[自然遗传学]15:146-156(1997)和美国专利申请序列号08/759,620。
XenoMouse动物的产生进一步论述和描绘于以下中:美国专利申请序列号07/466,008、序列号07/610,515、序列号07/919,297、序列号07/922,649、序列号08/031,801、序列号08/112,848、序列号08/234,145、序列号08/376,279、序列号08/430,938、序列号08/464,584、序列号08/464,582、序列号08/463,191、序列号08/462,837、序列号08/486,853、序列号08/486,857、序列号08/486,859、序列号08/462,513、序列号08/724,752和序列号08/759,620;和美国专利号6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598以及日本专利号3 068 180 B2、3 068 506 B2和3 068 507 B2。还参见Mendez等人NatureGenetics[自然遗传学]15:146-156(1997)和Green和Jakobovits J.Exp.Med.[实验医学杂志]188:483-495(1998)、EP 0 463 151 B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO00/76310和WO 03/47336。
在一个替代性方法中,包括真药物国际公司(GenPharm International,Inc.)的其他公司利用了“微基因座”方法。在微基因座方法中,通过包含来自Ig基因座的碎片(单独的基因)来模拟外源性Ig基因座。因此,将一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、mu恒定区和第二恒定区(优选γ恒定区)形成为用于插入到动物中的构建体。该方法描述于以下中:授予Surani等人的美国专利号5,545,807和各自授予Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299和6,255,458;授予Krimpenfort和Berns的美国专利号5,591,669和6,023.010;授予Berns等人的美国专利号5,612,205、5,721,367和5,789,215;和授予Choi和Dunn的美国专利号5,643,763,以及真药物国际公司美国专利申请序列号07/574,748、序列号07/575,962、序列号07/810,279、序列号07/853,408、序列号07/904,068、序列号07/990,860、序列号08/053,131、序列号08/096,762、序列号08/155,301、序列号08/161,739、序列号08/165,699、序列号08/209,741。还参见EP 0 546 073B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884以及美国专利号5,981,175。进一步参见Taylor等人(1992)、Chen等人(1993)、Tuaillon等人(1993)、Choi等人(1993)、Lonberg等人(1994)、Taylor等人(1994)和Tuaillon等人(1995)、Fishwild等人(1996)。
Kirin也展示了从通过微细胞融合引入大段染色体或整个染色体的小鼠产生人抗体。参见欧洲专利申请号773 288和843 961。Xenerex Biosciences正在开发用于人抗体的潜在产生的技术。在这种技术中,用人淋巴细胞(例如B和/或T细胞)重构SCID小鼠。然后将小鼠用抗原免疫并且可产生针对抗原的免疫应答。参见美国专利号5,476,996、5,698,767和5,958,765。
人抗小鼠抗体(HAMA)应答已经导致该行业制备嵌合或其他人源化抗体。然而,预期特别是在抗体的长期或多剂量利用中会观察到某些人抗嵌合抗体(HACA)应答。因此,期望提供抗体构建体,这些抗体构建体包含针对MUC17的人结合结构域和针对CD3ε的人结合结构域以便消除HAMA或HACA应答的问题和/或效应。
术语“与......(特异性)结合”、“(特异性)识别”、“(特异性)针对”和“与......(特异性)反应”意指根据本发明,结合结构域与靶分子(抗原)(此处:分别为MUC17和CD3ε)上的给定表位或给定靶侧相互作用或特异性相互作用。
术语“表位”是指结合结构域(诸如抗体或免疫球蛋白,或抗体或免疫球蛋白的衍生物、片段或变体)特异性结合的抗原上的一侧。“表位”是抗原性的,并且因此术语表位在本文中有时也称为“抗原结构”或“抗原决定簇”。因此,结合结构域是“抗原相互作用侧”。所述结合/相互作用也被理解为定义“特异性识别”。
“表位”可以通过连续的氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。“线性表位”是这样的表位,其中氨基酸一级序列构成所识别表位。线性表位典型地在独特的序列中包含至少3个或至少4个、且更通常地至少5个或至少6个或至少7个,例如约8个至约10个氨基酸。
与线性表位相反,“构象表位”是这样的表位,其中构成表位的氨基酸的一级序列不是所识别表位的唯一限定组分(例如,其中氨基酸的一级序列不一定被结合结构域识别的表位)。典型地,构象表位包含相对于线性表位增加数量的氨基酸。关于构象表位的识别,结合结构域识别抗原、优选肽或蛋白质或其片段的三维结构(在本发明的背景下,一个结合结构域的抗原结构包括于靶细胞表面抗原蛋白质内)。例如,当蛋白质分子折叠以形成三维结构时,形成构象表位的某些氨基酸和/或多肽骨架并置,使得抗体能够识别表位。确定表位构象的方法包括但不限于x射线晶体学、二维核磁共振(2D-NMR)光谱学和定点自旋标记和电子顺磁共振(EPR)光谱学。
以下描述了用于表位定位的方法:当人MUC17蛋白中的区(连续氨基酸拉伸物)与其非人和非灵长类动物MUC17(例如小鼠MUC17,但其他如鸡、大鼠、仓鼠、兔等也是可能的)的相应区交换或替换时,预期发生结合结构域结合的降低,除非结合结构域对于所使用的非人、非灵长类动物MUC17具有交叉反应性。相比于与人MUC17蛋白中的对应区的结合,所述降低优选为至少10%、20%、30%、40%或50%;更优选至少60%、70%或80%,并且最优选90%、95%或甚至100%,由此将与人MUC17蛋白中对应区的结合设定为100%。设想前述人MUC17/非人MUC17嵌合体在CHO细胞中表达。还设想人MUC17/非人MUC17嵌合体与不同膜结合蛋白(诸如EpCAM)的跨膜结构域和/或细胞质结构域融合。
在用于表位定位的替代或额外的方法中,可以产生若干种截短型式的人MUC17细胞外结构域以便确定由结合结构域识别的特异性区。在这些截短型式中,不同的细胞外MUC17结构域/亚结构域或区从N末端开始逐步缺失。设想截短的MUC17型式可以在CHO细胞中表达。还设想截短的MUC17型式可以与不同膜结合蛋白(诸如EpCAM)的跨膜结构域和/或细胞质结构域融合。还设想截短的MUC17型式可以在其N末端涵盖信号肽结构域,例如衍生自小鼠IgG重链信号肽的信号肽。此外设想,截短的MUC17型式可以在其N末端(在信号肽后)涵盖v5结构域,这允许验证其在细胞表面上的正确表达。预期对不再涵盖由结合结构域识别的MUC17区的那些截短的MUC17型式发生结合的减少或丧失。结合减少优选为至少10%、20%、30%、40%、50%;更优选至少60%、70%、80%,并且最优选90%、95%或甚至100%,由此将与整个人MUC17蛋白(或其细胞外区或结构域)的结合设定为100。
确定MUC17的特定残基对抗体构建体或结合结构域的识别的贡献的另一种方法是丙氨酸扫描(参见,例如Morrison KL和Weiss GA.Cur Opin Chem Biol.[化学生物学新见]2001年6月;5(3):302-7),其中有待分析的每个残基例如经由定点诱变被丙氨酸替换。丙氨酸的使用是因为其具有非巨大的、化学惰性的甲基官能团,但仍然模仿许多其他氨基酸所具有的二级结构参考。在需要保守突变残基的大小的情形下,有时可以使用巨大的氨基酸(诸如缬氨酸或亮氨酸)。丙氨酸扫描是一项已经使用了很长一段时间的成熟技术。
结合结构域与表位或包含表位的区之间的相互作用意味着结合结构域对特定蛋白或抗原(此处:分别为MUC17和CD3)上的表位/包含表位的区表现出可观的亲和力,并且通常与MUC17或CD3以外的蛋白质或抗原不表现出显著反应性。“可观的亲和力”包括以约10-6M(KD)或更强的亲和力结合。优选地,当结合亲和力为约10-12至10-8M、10-12至10-9M、10-12至10-10M、10-11至10-8M,优选约10-11至10-9M时,认为该结合具有特异性。可以尤其通过比较结合结构域与靶蛋白或抗原的反应与所述结合结构域与MUC17或CD3以外的蛋白质或抗原的反应容易地测试所述结合结构域与靶标是否特异性反应或结合。优选地,本发明的结合结构域基本上或基本上不与MUC17或CD3以外的蛋白质或抗原结合(即,第一结合结构域不能与MUC17以外的蛋白质结合,并且第二结合结构域不能与CD3以外的蛋白质结合)。设想根据本发明的抗体构建体的特征为与其他HLE形式相比具有优异的亲和力特征。因此,这种优异的亲和力表明体内半衰期延长。根据本发明的抗体构建体的更长的半衰期可以减少典型地有助于改善患者顺应性的施用的持续时间和频率。这是特别重要的,因为本发明的抗体构建体对高度虚弱的或甚至多重性癌症患者特别有益。
术语“基本上/基本上不结合”或“不能结合”意指本发明的结合结构域不结合MUC17或CD3以外的蛋白质或抗原,即与MUC17或CD3以外的蛋白质或抗原不显示超过30%、优选不超过20%、更优选不超过10%、特别优选不超过9%、8%、7%、6%或5%的反应性,由此将与MUC17或CD3的结合分别设定为100%。
据信特异性结合是通过结合结构域和抗原的氨基酸序列中的特定基序实现的。因此,由于其一级、二级和/或三级结构以及所述结构的二次修饰的结果,实现了结合。抗原相互作用侧与其特异性抗原的特异性相互作用可以导致所述侧与抗原的简单结合。此外,抗原相互作用侧与其特异性抗原的特异性相互作用可以可替代地或另外地导致信号的引发,例如由于诱导抗原构象的变化、抗原的寡聚化等。
术语“可变”是指抗体或免疫球蛋白结构域表现出其序列可变性并且参与确定特定抗体的特异性和结合亲和力的部分(即“一个或多个可变结构域”)。可变重链(VH)和可变轻链(VL)的配对一起形成单一抗原结合位点。
可变性在整个抗体的可变结构域中并不均匀分布;它集中在重链可变区和轻链可变区中的每一个的子结构域中。这些子结构域称为“超变区”或“互补决定区”(CDR)。可变结构域的更保守的(即非超变)部分称为“框架”区(FRM或FR),并且为三维空间中的六个CDR提供支架以形成抗原结合表面。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FRM区(FR1、FR2、FR3和FR4),这四个FRM区主要采用β-片层构型,通过三个超变区连接,这三个超变区形成连接β-片层结构的环,并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每条链中的超变区通过FRM紧密靠近在一起,并与来自另一条链的超变区一起有助于抗原结合侧的形成(参见Kabat等人,上述引文)。
术语“CDR”及其复数“CDR”是指其中三个构成轻链可变区(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)的结合特征并且三个构成重链可变区(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)的结合特征的互补决定区。CDR含有大部分负责抗体与抗原特异性相互作用的残基,并且因此有助于抗体分子的功能活性:它们是抗原特异性的主要决定因素。
准确定义的CDR边界和长度受制于不同的分类和编号系统。因此,CDR可以通过Kabat、Chothia、contact或任何其他边界定义(包括本文所述的编号系统)来引用。尽管有不同的边界,但这些系统中的每一者在构成可变序列内所谓的“超变区”的方面具有一定程度的重叠。因此,根据这些系统的CDR定义可以在相对于相邻框架区的长度和边界区域中不同。参见,例如Kabat(一种基于跨物种序列变异性的方法)、Chothia(一种基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法)和/或MacCallum(Kabat等人,上述引文;Chothia等人,J.MoI.Biol[分子生物学杂志],1987,196:901-917;和MacCallum等人,J.MoI.Biol[分子生物学杂志],1996,262:732)。表征抗原结合侧的还另一标准是由牛津大学分子公司(OxfbrdMolecular)的AbM抗体建模软件使用的AbM定义。参见,例如Protein Sequence andStructure Analysis of Antibody Variable Domains[抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析],在Antibody Engineering Lab Manual[抗体工程实验室手册]中(编辑:Duebel,S.和Kontermann,R.,Springer-Verlag[施普林格出版社],Heidelberg[海德尔堡])。就两种残基鉴定技术定义重叠区而非相同区而言,可以将它们组合以定义杂合CDR。然而,根据所谓的Kabat系统进行编号是优选的。
典型地,CDR形成可以分类为规范结构的环结构。术语“规范结构”是指由抗原结合(CDR)环所采用的主链构象。从比较结构研究中,已经发现六个抗原结合环中的五个仅具有有限的可用构象组库。每个规范结构可以通过多肽骨架的扭转角来表征。因此,抗体之间的对应环可能具有非常相似的三维结构,但环的大多数部分具有高的氨基酸序列可变性(Chothia和Lesk,J.MoI.Biol.[分子生物学杂志],1987,196:901;Chothia等人,Nature[自然],1989,342:877;Martin和Thornton,J.MoI.Biol[分子生物学杂志],1996,263:800)。此外,所采用的环结构与其周围的氨基酸序列之间存在关系。特定规范类别的构象由环的长度和位于环内关键位置以及保守框架内(即,环外)的氨基酸残基决定。因此,可以基于这些关键氨基酸残基的存在对特定的规范类别进行分配。
术语“规范结构”还可以包括关于抗体的线性序列的考虑因素,例如,如通过Kabat(Kabat等人,上述引文)编目的。Kabat编号方案(系统)是以一致方式对抗体可变结构域的氨基酸残基进行编号的广泛采用的标准,并且是本发明应用的优选方案,也如本文其他地方所提及。另外的结构考虑因素也可以用于确定抗体的规范结构。例如,Kabat编号未完全反映的那些差异可以通过Chothia等人的编号系统来描述,并且/或者通过其他技术(例如结晶学和二维或三维计算建模)来揭示。因此,可以将给定的抗体序列置于规范的类别中,该类别尤其允许鉴定适当的基础结构(chassis)序列(例如,基于在文库中包括多种规范结构的期望)。文献中描述了抗体氨基酸序列的Kabat编号和如由Chothia等人,上述引文所述的结构考虑因素以及其参与解释抗体结构的规范方面。不同类别免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型在本领域中是熟知的。关于抗体结构的综述,参见Antibodies:A LaboratoryManual[抗体:实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室],Harlow等人编辑,1988。
轻链的CDR3以及特别是重链的CDR3可以构成轻链可变区和重链可变区内抗原结合中最重要的决定簇。在一些抗体构建体中,重链CDR3似乎构成抗原与抗体之间主要的接触区域。其中单独改变CDR3的体外选择方案可以用于改变抗体的结合特性或确定哪些残基有助于抗原的结合。因此,CDR3典型地是抗体结合侧内分子多样性的最大来源。例如,H3可以短至两个氨基酸残基或多于26个氨基酸。
在经典的全长抗体或免疫球蛋白中,每条轻(L)链通过一个共价二硫键与重(H)链连接,而两条H链通过一个或多个二硫键彼此连接,这取决于H链同种型。最靠近VH的CH结构域通常命名为CH1。恒定(“C”)结构域不直接参与抗原结合,但表现出各种效应子功能,诸如抗体依赖性、细胞介导的细胞毒性和补体激活。抗体的Fc区包括在重链恒定结构域内,并且例如能够与位于细胞表面的Fc受体相互作用。
组装和体细胞突变后的抗体基因的序列高度改变,并且估计这些改变的基因编码1010种不同抗体分子(Immunoglobulin Genes[免疫球蛋白基因],第2版,Jonio等人编辑,Academic Press[学术出版社],San Diego,CA[加利福尼亚州圣地亚哥],1995)。因此,免疫系统提供了免疫球蛋白组库。术语“组库”是指完全或部分衍生自至少一种编码至少一种免疫球蛋白的序列的至少一种核苷酸序列。一种或多种序列可以通过重链的V、D和J区段以及轻链的V和J区段的体内重排来产生。可替代地,一种或多种序列可以响应于发生重排、例如体外刺激而从细胞产生。可替代地,一种或多种序列的一部分或全部可以通过DNA剪接、核苷酸合成、诱变和其他方法获得,参见例如美国专利5,565,332。组库可以仅包括一种序列或可以包括多种序列,包括遗传多样性集合中的序列。
术语“Fc部分”或“Fc单体”关于本发明意指包含至少一个具有CH2结构域功能的结构域和至少一个具有免疫球蛋白分子的CH3结构域功能的结构域的多肽。如从术语“Fc单体”清楚的,包含那些CH结构域的多肽是“多肽单体”。Fc单体可以是至少包含排除重链的第一恒定区免疫球蛋白结构域(CH1)的免疫球蛋白恒定区的片段,但至少保持一个CH2结构域的功能部分和一个CH3结构域的功能部分的多肽,其中CH2结构域在CH3结构域的氨基末端。在这个定义的优选方面,Fc单体可以是包含Ig-Fc铰链区、CH2区和CH3区的一部分的多肽恒定区,其中铰链区在CH2结构域的氨基末端。设想本发明的铰链区促进二聚化。例如但不限于,此类Fc多肽分子可以通过木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白区(当然产生两个Fc多肽的二聚体)获得。在这个定义的另一方面,Fc单体可以是包含CH2区和CH3区的一部分的多肽区。例如但不限于,此类Fc多肽分子可以通过胃蛋白酶消化免疫球蛋白分子获得。在一个实施例中,Fc单体的多肽序列基本上与下列Fc多肽序列相似:IgG1 Fc区、IgG2 Fc区、IgG3 Fc区、IgG4 Fc区、IgM Fc区、IgA Fc区、IgD Fc区和IgE Fc区。(参见,例如Padlan,MolecularImmunology[分子免疫学],31(3),169-217(1993))。因为免疫球蛋白之间存在一些变化,并且仅为了清楚起见,所以Fc单体是指IgA、IgD和IgG的最后两个重链恒定区免疫球蛋白结构域,以及IgE和IgM的最后三个重链恒定区免疫球蛋白结构域。如上所提及,Fc单体还可以包括在这些结构域的N末端的柔性铰链。对于IgA和IgM,Fc单体可以包括J链。对于IgG,Fc部分包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3以及前两个结构域与CH2之间的铰链。尽管Fc部分的边界可以改变,但包含功能铰链、CH2和CH3结构域的人IgG重链Fc部分的实例可以定义为例如包含残基D231(铰链结构域的残基-对应于下表1中的D234)至CH3结构域的羧基末端的P476,分别地L476(对于IgG4),其中编号是根据Kabat的。经由肽接头彼此融合的两个Fc部分或Fc单体定义本发明的抗体构建体的第三结构域,该第三结构域也可以被定义为scFc结构域。
在本发明的一个实施例中,设想如本文披露的scFc结构域、分别地彼此融合的Fc单体仅包括在抗体构建体的第三结构域中。
与本发明一致,IgG铰链区可以通过使用如表1中示出的Kabat编号的类比来鉴定。与上述一致,设想对于本发明的铰链结构域/区,最小要求包含对应于根据Kabat编号的D231 D234至P243的IgG1序列拉伸物的氨基酸残基。同样设想,本发明的铰链结构域/区包含IgG1铰链序列DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:477)(对应于如下表1所示的拉伸物D234至P243-也设想所述序列的变体,前提是铰链区仍然促进二聚化)或由该IgG1铰链序列组成。在本发明的优选实施例中,通过N314X取代去除抗体构建体的第三结构域中CH2结构域的Kabat位置314处的糖基化位点,其中X是除Q之外的任何氨基酸。所述取代优选为N314G取代。在一个更优选的实施例中,所述CH2结构域另外包含以下取代(根据Kabat的位置):V321C和R309C(这些取代在Kabat位置309和321处引入结构域内半胱氨酸二硫桥)。
还设想本发明的抗体构建体的第三结构域按氨基至羧基顺序包含以下或由以下组成:DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:477)(即铰链)-CH2-CH3-接头-DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:477)(即铰链)-CH2-CH3。在一个优选实施例中,上述抗体构建体的肽接头的特征在于氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser,即Gly4Ser(SEQ ID NO:1),或其聚合物,即(Gly4Ser)x,其中x为5或更大的整数(例如5、6、7、8等或更大),优选为6((Gly4Ser)6)。所述构建体可以进一步包含上述取代N314X、优选N314G和/或另外的取代V321C和R309C。在如前文定义的本发明抗体构建体的优选实施例中,设想第二结构域与人和/或猕猴CD3ε链的细胞外表位结合。表1:铰链区的氨基酸残基的Kabat编号
在本发明的另外实施例中,铰链结构域/区包含以下或由以下组成:IgG2亚型铰链序列ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:478)、IgG3亚型铰链序列ELKTPLDTTHTCPRCP(SEQ ID NO:479)或ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO:486)和/或IgG4亚型铰链序列ESKYGPPCPSCP(SEQID NO:480)。IgG1亚型铰链序列可以是以下的一种:EPKSCDKTHTCPPCP(如表1和SEQ ID NO:487中所示)。这些核心铰链区因此也在本发明的背景下设想。
IgG CH2和IgG CD3结构域的位置和序列可以通过使用如表2中示出的Kabat编号进行类比鉴定:
表2:IgG CH2和CH3区的氨基酸残基的Kabat编号
在本发明的一个实施例中,使第一或两个Fc单体的CH3结构域中粗体强调的氨基酸残基缺失。
第三结构域的多肽单体(“Fc部分”或“Fc单体”)彼此融合的肽接头优选包含至少25个氨基酸残基(25、26、27、28、29、30等)。更优选地,这个肽接头包含至少30个氨基酸残基(30、31、32、33、34、35等)。还优选地,接头包含至多40个氨基酸残基、更优选至多35个氨基酸残基、最优选恰好30个氨基酸残基。该肽接头的优选实施例的特征在于氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser,即Gly4Ser(SEQ ID NO:1),或其聚合物,即(Gly4Ser)x,其中x为5或更大的整数(例如6、7或8)。优选地,整数为6或7,更优选整数为6。
在使用接头来将第一结构域融合至第二结构域或将第一结构域或第二结构域融合至第三结构域的情况下,该接头优选地具有足以确保第一结构域和第二结构域中的每一者均可以彼此独立地保留其差异结合特异性的长度和序列。对于连接本发明的抗体构建体中的至少两个结合结构域(或两个可变结构域)的肽接头,仅包含少数量的氨基酸残基(例如12个氨基酸残基或更少)的那些肽接头是优选的。因此,12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸残基的肽接头是优选的。设想的具有少于5个氨基酸的肽接头包含4、3、2或1个氨基酸,其中富含Gly的接头是优选的。用于融合第一结构域和第二结构域的肽接头的优选实施例在SEQID NO:1中描绘。用于融合第二结构域和第三结构域的肽接头的优选接头实施例是(Gly)4-接头,也称为G4-接头。
在上述“肽接头”之一的背景下特别优选的“单一”氨基酸是Gly。因此,所述肽接头可以由单一氨基酸Gly组成。在本发明的优选实施例中,肽接头的特征在于氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser,即Gly4Ser(SEQ ID NO:1),或其聚合物,即(Gly4Ser)x,其中x为1或更大的整数(例如2或3)。优选的接头在SEQ ID NOs:1至12中描绘。所述肽接头的特征包括不存在二级结构的促进、是本领域中已知的并且描述于例如Dall’Acqua等人(Biochem.[生物化学](1998)37,9266-9273)、Cheadle等人(Mol Immunol[分子免疫学](1992)29,21-30)和Raag和Whitlow(FASEB[美国实验生物学联合会会志](1995)9(1),73-80)中。此外不促进任何二级结构的肽接头是优选的。所述结构域彼此的连接可以例如通过基因工程提供,如实例中所述。用于制备融合的且可操作地连接的双特异性单链构建体并在哺乳动物细胞或细菌中表达它们的方法是本领域中熟知的(例如WO 99/54440或Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual[分子克隆:实验室手册],Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社],Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约,2001)。
在本发明的抗体构建体的优选实施例中,第一结构域和第二结构域以选自下组的形式形成抗体构建体,该组由以下组成:(scFv)2、scFv-单结构域mAb、双抗体和这些形式中的任一种的寡聚物。
根据特别优选的实施例,并如所附实例所记载,本发明抗体构建体的第一结构域和第二结构域是“双特异性单链抗体构建体”、更优选双特异性“单链Fv”(scFv)。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由独立的基因编码,但使用重组方法可以将这两个结构域通过合成接头接合,如上文所述,该合成接头使它们能够制得为单条蛋白质链,其中VL和VH区配对以形成单价分子;参见,例如Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段,并且按照与完整或全长抗体相同的方式评价片段的功能。因此,单链可变片段(scFv)是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白,通常利用约10至约25个氨基酸、优选约15至20个氨基酸的短接头肽酸连接。为了灵活性,接头通常富含甘氨酸,以及为了溶解性通常富含丝氨酸或苏氨酸,并且可以连接VH的N末端和VL的C末端,或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头,但该蛋白质保留了原始免疫球蛋白的特异性。
双特异性单链抗体构建体在本领域中是已知的并描述于以下中:WO 99/54440;Mack,J.Immunol.[免疫学杂志](1997),158,3965-3970;Mack,PNAS[美国国家科学院院刊],(1995),92,7021-7025;Kufer,Cancer Immunol.Immunother.[癌症免疫学免疫治疗],(1997),45,193-197;Blood[血液],(2000),95,6,2098-2103;Brühl,Immunol.[免疫学],(2001),166,2420-2426;Kipriyanov,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],(1999),293,41-56。描述的用于产生单链抗体的技术(尤其参见美国专利4,946,778;Kontermann和Dübel(2010),上述引文和Little(2009),上述引文)可以适用于产生特异性识别一种或多种所选择的靶标的单链抗体构建体。
二价(bivalent)(也称为双价(divalent))或双特异性单链可变片段(具有形式(scFv)2的联-scFv或二-scFv)可以通过连接两个scFv分子(例如利用如上文所述的接头)来工程化。如果这两个scFv分子具有相同的结合特异性,则所得(scFv)2分子将优选称为二价的(即,对于相同的靶表位具有两个价)。如果两个scFv分子具有不同的结合特异性,则所得(scFv)2分子将优选称为双特异性。连接可以通过产生具有两个VH区和两个VL区的单一肽链从而产生串联scFv来进行(参见,例如Kufer P.等人,(2004)Trends inBiotechnology[生物技术趋势]22(5):238-244)。另一种可能性是产生具有接头肽的scFv分子,这些接头肽对于两个可变区来说太短以致于不能折叠在一起(例如约五个氨基酸),从而迫使scFv二聚化。这种类型被称为双抗体(参见,例如Hollinger,Philipp等人,(1993年7月)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica[美国国家科学院院刊]90(14):6444-8)。
与本发明一致,第一结构域、第二结构域或第一结构域和第二结构域可以包含单结构域抗体、分别地单结构域抗体的可变结构域或至少CDR。单结构域抗体仅包含一个(单体)抗体可变结构域,该抗体可变结构域能够独立于其他V区或结构域而选择性结合特定抗原。第一单结构域抗体是从骆驼中发现的重链抗体工程化而来,并且这些被称为VHH片段。软骨鱼类也具有重链抗体(IgNAR),可以从这些重链抗体中获得称为VNAR片段的单结构域抗体。替代方法是将来自常见免疫球蛋白,例如来自人或啮齿动物的二聚体可变结构域分裂成单体,因此获得作为单结构域Ab的VH或VL。尽管对单结构域抗体的大多数研究目前都是基于重链可变结构域,但衍生自轻链的纳米抗体也显示出与靶表位特异性结合。单结构域抗体的实例是所谓的sdAb、纳米抗体或单一可变结构域抗体。
因此,(单结构域mAb)2是由(至少)两个单结构域单克隆抗体构成的单克隆抗体构建体,该两个单结构域单克隆抗体单独地选自由VH、VL、VHH和VNAR组成的组。接头优选呈肽接头的形式。类似地,“scFv-单结构域mAb”是由至少一个如上所述的单结构域抗体和一个如上所述的scFv分子构成的单克隆抗体构建体。同样,接头优选呈肽接头的形式。
抗体构建体是否与另一给定抗体构建体竞争结合可以在竞争测定(诸如竞争性ELISA或基于细胞的竞争测定)中测量。也可以使用抗生物素蛋白偶联的微粒(珠粒)。与抗生物素蛋白涂覆的ELISA板类似,当与生物素化蛋白质反应时,这些珠粒中的每一个都可用作可在其上进行测定的底物。将抗原涂覆在珠粒上,并且然后用第一抗体预涂覆。添加第二抗体并且确定任何额外的结合。读出的可能手段包括流式细胞术。
T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中发挥核心作用的一类淋巴细胞(其本身是一类白细胞)。有若干个T细胞亚组,每个亚组具有不同的功能。T细胞可以通过细胞表面上存在T细胞受体(TCR)而与其他淋巴细胞(诸如B细胞和NK细胞)区分开。TCR负责识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原,并且由两种不同的蛋白质链构成。在95%的T细胞中,TCR由阿尔法(α)和贝塔(β)链组成。当TCR与抗原肽和MHC(肽/MHC复合物)接合时,T淋巴细胞通过一系列由相关酶、共受体、专门化衔接子分子和激活或释放的转录因子介导的生物化学事件而被激活。
CD3受体复合物是一种蛋白质复合物,并且由四条链构成。在哺乳动物中,复合物含有CD3γ(伽马)链、CD3δ(德尔塔)链和两条CD3ε(伊普西龙)链。这些链与T细胞受体(TCR)和所谓的ζ(截塔)链缔合以形成T细胞受体CD3复合物并在T淋巴细胞中生成激活信号。CD3γ(伽马)、CD3δ(德尔塔)和CD3ε(伊普西龙)链是含有单一细胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3分子的细胞内尾含有对于TCR的信号传导能力所必需的单一保守基序,称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或简称ITAM。CD3ε分子是一种多肽,该多肽在人中由位于染色体11上的CD3E基因编码。CD3ε的最优选的表位包括在人CD3ε细胞外结构域的氨基酸残基1-27内。设想根据本发明的抗体构建体典型地并且有利地显示出更少的非特异性T细胞激活,该非特异性T细胞激活在特异性免疫疗法中是不需要的。这意味着副作用的风险降低。
经由多特异性、至少双特异性抗体构建体募集T细胞对靶细胞的重定向溶解涉及溶细胞突触形成以及穿孔素和颗粒酶的递送。接合的T细胞能够连续靶细胞溶解,并且不受干扰肽抗原加工和呈递或克隆T细胞分化的免疫逃逸机制的影响;参见,例如WO 2007/042261。
可以以各种方式测量由本发明的抗体构建体介导的细胞毒性。效应细胞可以是例如刺激的富集的(人)CD8阳性T细胞或未刺激的(人)外周血单核细胞(PBMC)。如果靶细胞是猕猴起源的或表达的或用由第一结构域结合的猕猴MUC17转染,则效应细胞也应是猕猴起源的,诸如猕猴T细胞系,例如4119LnPx。靶细胞应表达MUC17(例如人或猕猴MUC17)(至少其细胞外结构域)。靶细胞可以是用MUC17(例如人或猕猴MUC17)稳定或瞬时转染的细胞系(诸如CHO)。对于在细胞表面表达更高水平的MUC17的靶细胞系,预期EC50值通常更低。效应细胞与靶细胞(E:T)比率通常为约10:1,但也可改变。MUC17双特异性抗体构建体的细胞毒活性可以在51Cr-释放测定(约18小时的孵育时间)或在基于FACS的细胞毒性测定(约48小时的孵育时间)中测量。也可以对测定孵育时间(细胞毒性反应)进行修改。其他测量细胞毒性的方法对本领域技术人员来说是熟知的,并且包括MTT或MTS测定、基于ATP的测定(包括生物发光测定)、磺基罗丹明B(SRB)测定、WST测定、克隆生成测定和ECIS技术。
优选在基于细胞的细胞毒性测定中测量由本发明的MUC17xCD3双特异性抗体构建体介导的细胞毒活性。它也可以在51Cr-释放测定中测量。它由EC50值表示,该值对应于半数最大有效浓度(诱导在基线与最大值之间的中途的细胞毒性应答的抗体构建体的浓度)。优选地,MUC17xCD3双特异性抗体构建体的EC50值≤5000pM或≤4000pM、更优选≤3000pM或≤2000pM、甚至更优选≤1000pM或≤500pM、甚至更优选≤400pM或≤300pM、甚至更优选≤200pM、甚至更优选≤100pM、甚至更优选≤50pM、甚至更优选≤20pM或≤10pM,并且最优选≤5pM。
上述给定的EC50值可以在不同的测定中测量。本领域技术人员知道,当使用刺激/富集的CD8+T细胞作为效应细胞时,与未刺激的PBMC相比,可以预期EC50值较低。此外可以预期,与低靶标表达大鼠相比,当靶细胞表达高数量的MUC17时,EC50值较低。例如,当使用刺激/富集的人CD8+T细胞作为效应细胞(并且使用MUC17转染的细胞诸如CHO细胞或MUC17阳性人细胞系作为靶细胞)时,MUC17xCD3双特异性抗体构建体的EC50值优选≤1000pM、更优选≤500pM、甚至更优选≤250pM、甚至更优选≤100pM、甚至更优选≤50pM、甚至更优选≤10pM,并且最优选≤5pM。当使用人PBMC作为效应细胞时,MUC17xCD3双特异性抗体构建体的EC50值优选≤5000pM或≤4000pM(特别是当靶细胞是MUC17阳性人细胞系时)、更优选≤2000pM(特别是当靶细胞是MUC17转染的细胞诸如CHO细胞时)、更优选≤1000pM或≤500pM、甚至更优选≤200pM、甚至更优选≤150pM,甚至更优选≤100pM,并且最优选≤50pM或更低。当使用猕猴T细胞系诸如LnPx4119作为效应细胞并且使用猕猴MUC17转染的细胞系诸如CHO细胞作为靶细胞系时,MUC17xCD3双特异性抗体构建体的EC50值优选≤2000pM或≤1500pM、更优选≤1000pM或≤500pM、甚至更优选≤300pM或≤250pM、甚至更优选≤100pM,并且最优选≤50pM。
优选地,本发明的MUC17xCD3双特异性抗体构建体不诱导/介导溶解或基本上不诱导/介导MUC17阴性细胞诸如CHO细胞的溶解。术语“不诱导溶解”、“基本上不诱导溶解”、“不介导溶解”或“基本不介导溶解”意指本发明的抗体构建体不诱导或介导超过30%、优选不超过20%、更优选不超过10%、特别优选不超过9%、8%、7%、6%或5%的MUC17阴性细胞的溶解,由此将MUC17阳性人细胞系的溶解设定为100%。这通常适用于浓度高达500nM的抗体构建体。本领域技术人员知道如何毫不费力地测量细胞溶解。此外,本说明书教导了如何测量细胞溶解的具体说明。
单个的MUC17xCD3双特异性抗体构建体的单体与二聚体同种型之间细胞毒性活性的差异称为“效能间隙”。该效能间隙可以例如计算为分子的单体与二聚体形式的EC50值之间的比率。本发明的MUC17xCD3双特异性抗体构建体的效能间隙优选≤5、更优选≤4、甚至更优选≤3、甚至更优选≤2,并且最优选≤1。
本发明的抗体构建体的第一结合结构域和/或第二结合结构域(或任何其他)结合结构域优选对于灵长类哺乳动物目的成员具有跨物种特异性。跨物种特异性CD3结合结构域例如描述于WO 2008/119567中。根据一个实施例,除了分别与人MUC17和人CD3结合之外,第一结合结构域和/或第二结合结构域还将与灵长类动物的MUC17/CD3结合,灵长类动物包括(但不限于)新大陆灵长类动物(诸如狨毛猴、绒顶柽柳猴或松鼠猴)、旧大陆灵长类动物(诸如狒狒和猕猴)、长臂猿和非人类人亚科。
在本发明的抗体构建体的一个实施例中,第一结构域与人MUC17结合并且进一步与猕猴MUC17(诸如食蟹猴的MUC17)结合,并且更优选与细胞,例如诸如CHO或293细胞表面上表达的猕猴MUC17结合。第一结构域对MUC17、优选对人MUC17的亲和力优选≤100nM或≤50nM、更优选≤25nM或≤20nM、更优选≤15nM或≤10nM、甚至更优选≤5nM、甚至更优选≤2.5nM或≤2nM、甚至更优选≤1nM,甚至更优选≤0.6nM、甚至更优选≤0.5nM,并且最优选≤0.4nM。亲和力可以例如在BIAcore测定或Scatchard测定中测量。测定亲和力的其他方法也是本领域技术人员熟知的。第一结构域对猕猴MUC17的亲和力优选≤15nM、更优选≤10nM、甚至更优选≤5nM、甚至更优选≤1nM、甚至更优选≤0.5nM、甚至更优选≤0.1nM,并且最优选≤0.05nM或甚至≤0.01nM。
优选地,根据本发明的抗体构建体对结合猕猴MUC17对人MUC17[ma MUC17:huMUC17]的亲和力间隙(如例如通过BiaCore或通过Scatchard分析确定)<100、优选<20、更优选<15、进一步优选<10、甚至更优选<8、更优选<6,并且最优选<2。根据本发明的抗体构建体对结合猕猴MUC17对人MUC17的亲和性间隙的优选范围在0.1与20之间、更优选在0.2与10之间、甚至更优选在0.3与6之间、甚至更优选在0.5与3之间或在0.5与2.5之间,并且最优选在0.5与2之间或在0.6与2之间。
本发明的抗体构建体的第二结构域与人CD3ε和/或猕猴CD3ε结合。在一个优选实施例中,第二结构域进一步与狨毛猴、绒顶柽柳猴或松鼠猴CD3ε结合。狨毛猴和绒顶柽柳猴两者均是属于狨亚科(Callitrichidae)的新大陆灵长类动物,而松鼠猴是属于悬猴科(Cebidae)的新大陆灵长类动物。
对于本发明的抗体构建体优选的是,与人和/或猕猴CD3ε链的细胞外表位结合的第二结构域包含含有选自以下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区:
(a)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:27中所描绘的CDR-L1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:28中所描绘的CDR-L2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:29中所描绘的CDR-L3;
(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:117中所描绘的CDR-L1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:118中所描绘的CDR-L2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:119中所描绘的CDR-L3;以及
(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:153中所描绘的CDR-L1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:154中所描绘的CDR-L2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:155中所描绘的CDR-L3。
在本发明的抗体构建体的进一步优选的实施例中,与人和/或猕猴CD3ε链的细胞外表位结合的第二结构域包含含有选自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区:
(a)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:12中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:13中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:14中所描绘的CDR-H3;
(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:30中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:31中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:32中所描绘的CDR-H3;
(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:48中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:49中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:50中所描绘的CDR-H3;
(d)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:66中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:67中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:68中所描绘的CDR-H3;
(e)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:84中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:85中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:86中所描绘的CDR-H3;
(f)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:102中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:103中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:104中所描绘的CDR-H3;
(g)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:120中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:121中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:122中所描绘的CDR-H3;
(h)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:138中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:139中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:140中所描绘的CDR-H3;
(i)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:156中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:157中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:158中所描绘的CDR-H3;以及
(j)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:174中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:175中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:176中所描绘的CDR-H3。
在本发明的抗体构建体的优选实施例中,将上述三组VL CDR与第二结合结构域内的上述十组VH CDR组合形成(30)组,每组包含1-3个CDR-L和1-3个CDR-H。
优选的是,对于本发明的抗体构建体,与CD3结合的第二结构域包含选自下组的VL区,该组由以下组成:WO 2008/119567的SEQ ID NO:17、21、35、39、53、57、71、75、89、93、107、111、125、129、143、147、161、165、179或183中所描绘的或如根据本发明的SEQ ID NO:13中所描绘的那些。
还优选的是,与CD3结合的第二结构域包含选自下组的VH区,该组由以下组成:WO2008/119567的SEQ ID NO:15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181中所描绘的或如SEQ ID NO:14中所描绘的那些。
更优选地,本发明的抗体构建体的特征在于与CD3结合的第二结构域包含选自下组的VL区和VH区,该组由以下组成:
(a)如WO 2008/119567的SEQ ID NO.17或21中所描绘的VL区和如WO2008/119567的SEQ ID NO:15或19中所描绘的VH区;
(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO.35或39中所描绘的VL区和如WO2008/119567的SEQ ID NO:33或37中所描绘的VH区;
(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO.53或57中所描绘的VL区和如WO2008/119567的SEQ ID NO:51或55中所描绘的VH区;
(d)如WO 2008/119567的SEQ ID NO.71或75中所描绘的VL区和如WO2008/119567的SEQ ID NO:69或73中所描绘的VH区;
(e)如WO 2008/119567的SEQ ID NO.89或93中所描绘的VL区和如WO2008/119567的SEQ ID NO:87或91中所描绘的VH区;
(f)如WO 2008/119567的SEQ ID NO.107或111中所描绘的VL区和如WO2008/119567的SEQ ID NO:105或109中所描绘的VH区;
(g)如WO 2008/119567的SEQ ID NO.125或129中所描绘的VL区和如WO2008/119567的SEQ ID NO:123或127中所描绘的VH区;
(h)如WO 2008/119567的SEQ ID NO.143或147中所描绘的VL区和如WO2008/119567的SEQ ID NO:141或145中所描绘的VH区;
(i)如WO 2008/119567的SEQ ID NO.161或165中所描绘的VL区和如WO2008/119567的SEQ ID NO:159或163中所描绘的VH区;以及
(j)如WO 2008/119567的SEQ ID NO.179或183中所描绘的VL区和如WO2008/119567的SEQ ID NO:177或181中所描绘的VH区。
关于本发明的抗体构建体还优选的是,与CD3结合的第二结构域包含如SEQ IDNO:13中所描绘的VL区和如SEQ ID NO:14中所描绘的VH区。
根据本发明的抗体构建体的优选实施例,第一结构域和/或第二结构域具有以下形式:VH区和VL区的对是呈单链抗体(scFv)的形式。VH和VL区以VH-VL或VL-VH的顺序安排。优选的是,VH区位于接头序列的N末端,并且VL区位于接头序列的C末端。
上述的本发明的抗体构建体的优选实施例的特征在于,与CD3结合的第二结构域包含选自下组或如SEQ ID NO:15中所描绘的氨基酸序列,该组由以下组成:WO2008/119567的SEQ ID NO:23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187。
还设想,本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含含有选自下组的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区和含有选自下组的CDR-H1、CDR-H2和CDR-3的VH区,该组由以下组成:
(a)如SEQ ID NO.36中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.37中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.38中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.33中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.34中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.35中所描绘的CDR-H3;
(b)如SEQ ID NO.47中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.48中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.49中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.44中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.45中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.46中所描绘的CDR-H3;
(c)如SEQ ID NO.58中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.59中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.60中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.55中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.56中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.57中所描绘的CDR-H3;
(d)如SEQ ID NO.69中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.70中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.71中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.66中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.67中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.68中所描绘的CDR-H3;
(e)如SEQ ID NO.80中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.81中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.82中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.77中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.78中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.79中所描绘的CDR-H3;
(f)如SEQ ID NO.91中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.92中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.93中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.88中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.89中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.90中所描绘的CDR-H3;
(g)如SEQ ID NO.102中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.103中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.104中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.99中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.100中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.101中所描绘的CDR-H3;
(h)如SEQ ID NO.113中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.114中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.115中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.110中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.111中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.112中所描绘的CDR-H3;
(i)如SEQ ID NO.124中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.125中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.126中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.121中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.122中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.123中所描绘的CDR-H3;
(j)如SEQ ID NO.135中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.136中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.137中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.132中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.133中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.134中所描绘的CDR-H3;
(k)如SEQ ID NO.146中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.147中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.148中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.143中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.144中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.145中所描绘的CDR-H3;
(l)如SEQ ID NO.157中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.158中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.159中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.154中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.155中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.156中所描绘的CDR-H3;
(m)如SEQ ID NO.168中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.169中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.170中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.165中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.166中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.167中所描绘的CDR-H3;
(n)如SEQ ID NO.179中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.180中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.181中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.176中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.177中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.178中所描绘的CDR-H3;
(o)如SEQ ID NO.190中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.191中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.192中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.187中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.188中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.189中所描绘的CDR-H3;
(p)如SEQ ID NO.201中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.202中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.203中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.198中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.199中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.200中所描绘的CDR-H3;
(q)如SEQ ID NO.212中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.213中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.214中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.209中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.210中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.211中所描绘的CDR-H3;
(r)如SEQ ID NO.223中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.224中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.225中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.220中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.221中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.222中所描绘的CDR-H3;
(s)如SEQ ID NO.234中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.235中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.236中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.231中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.232中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.233中所描绘的CDR-H3;
(t)如SEQ ID NO.245中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.246中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.247中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.242中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.243中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.244中所描绘的CDR-H3;
(u)如SEQ ID NO.256中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.257中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.258中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.253中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.254中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.255中所描绘的CDR-H3;
(v)如SEQ ID NO.267中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.268中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.269中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.264中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.265中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.266中所描绘的CDR-H3;
(w)如SEQ ID NO.278中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.279中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.280中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.275中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.276中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.276中所描绘的CDR-H3;
(x)如SEQ ID NO.289中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.290中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.291中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.286中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.287中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.288中所描绘的CDR-H3;
(y)如SEQ ID NO.300中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.301中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.302中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.297中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.298中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.299中所描绘的CDR-H3;
(z)如SEQ ID NO.311中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.312中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.313中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.308中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.309中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.310中所描绘的CDR-H3;
(aa)如SEQ ID NO.322中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.323中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.324中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.319中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.320中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.321中所描绘的CDR-H3;
(ab)如SEQ ID NO.333中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.334中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.335中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.330中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.331中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.332中所描绘的CDR-H3;
(ac)如SEQ ID NO.344中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.345中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.346中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.341中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.342中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.343中所描绘的CDR-H3;
(ad)如SEQ ID NO.355中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.356中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.357中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.352中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.353中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.354中所描绘的CDR-H3;
(ae)如SEQ ID NO.366中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.367中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.368中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.363中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.364中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.365中所描绘的CDR-H3;
(af)如SEQ ID NO.377中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.378中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.379中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.374中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.375中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.376中所描绘的CDR-H3;
(ag)如SEQ ID NO.388中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.389中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.390中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.385中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.386中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.386中所描绘的CDR-H3;
(ah)如SEQ ID NO.399中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.400中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.401中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.396中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.397中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.398中所描绘的CDR-H3;
(ai)如SEQ ID NO.410中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.411中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.412中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.407中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.408中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.409中所描绘的CDR-H3;
(aj)如SEQ ID NO.421中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.422中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.423中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.418中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.419中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.420中所描绘的CDR-H3;
(ak)如SEQ ID NO.432中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.433中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.434中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.429中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.430中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.431中所描绘的CDR-H3;
(al)如SEQ ID NO.443中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.444中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.445中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.440中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.441中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.442中所描绘的CDR-H3;
(am)如SEQ ID NO.454中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.455中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.456中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.451中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.452中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.453中所描绘的CDR-H3;
(an)如SEQ ID NO.465中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.466中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.467中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.462中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.463中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.464中所描绘的CDR-H3;
(ao)如SEQ ID NO.476中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.477中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.478中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.473中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.474中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.475中所描绘的CDR-H3;
(ap)如SEQ ID NO.487中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.488中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.489中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.484中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.485中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.486中所描绘的CDR-H3;
(aq)如SEQ ID NO.498中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.499中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.500中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.495中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.496中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.497中所描绘的CDR-H3;
(ar)如SEQ ID NO.509中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.510中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.511中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.506中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.507中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.508中所描绘的CDR-H3;以及
(as)如SEQ ID NO.520中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.521中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.522中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.517中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.518中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.519中所描绘的CDR-H3;其中优选的是,例如,
(c)如SEQ ID NO.58中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.59中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.60中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.55中所描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO.56中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.57中所描绘的CDR-H3;
(n)如SEQ ID NO.179中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.180中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.181中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.176中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.177中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.178中所描绘的CDR-H3;
(ac)如SEQ ID NO.344中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.345中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.346中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.341中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.342中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.343中所描绘的CDR-H3;以及
(aj)如SEQ ID NO.421中所描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO.422中所描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO.423中所描绘的CDR-L3以及如SEQ ID NO.418中所描绘的CDR-H1、如SEQ IDNO.419中所描绘的CDR-H2和如SEQ ID NO.420中所描绘的CDR-H3。
进一步设想,本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自下组的VL区和VH区,该组由以下组成:
(a)如SEQ ID NO.40中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.39中所描绘的VH区;
(b)如SEQ ID NO.51中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.50中所描绘的VH区;
(c)如SEQ ID NO.62中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.61中所描绘的VH区;
(d)如SEQ ID NO.73中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.72中所描绘的VH区;
(e)如SEQ ID NO.84中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.83中所描绘的VH区;
(f)如SEQ ID NO.95中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.94中所描绘的VH区;
(g)如SEQ ID NO.106中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.105中所描绘的VH区;
(h)如SEQ ID NO.117中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.116中所描绘的VH区;
(i)如SEQ ID NO.128中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.127中所描绘的VH区;
(j)如SEQ ID NO.139中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.138中所描绘的VH区;
(k)如SEQ ID NO.150中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.149中所描绘的VH区;
(l)如SEQ ID NO.161中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.160中所描绘的VH区;
(m)如SEQ ID NO.172中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.171中所描绘的VH区;
(n)如SEQ ID NO.183中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.182中所描绘的VH区;
(o)如SEQ ID NO.194中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.193中所描绘的VH区;
(p)如SEQ ID NO.205中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.204中所描绘的VH区;
(q)如SEQ ID NO.216中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.215中所描绘的VH区;
(r)如SEQ ID NO.227中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.226中所描绘的VH区;
(s)如SEQ ID NO.238中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.237中所描绘的VH区;
(t)如SEQ ID NO.249中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.248中所描绘的VH区;
(u)如SEQ ID NO.260中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.259中所描绘的VH区;
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(as)如SEQ ID NO.524中所描绘的VL区和如SEQ ID NO.523中所描绘的VH区。
进一步设想,本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自下组的氨基酸序列,该组由以下组成:SEQ ID NO:41、52、63、74、85、96、107、118、129、140、151、162、173、184、195、206、217、228、239、250、261、272、283、294、305、316、327、338、349、360、371、382、393、404、415、426、437、448、459、470、481、492、503、514和525中所描绘的那些,或者具有与所述序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
本发明进一步提供了一种抗体构建体,该抗体构建体包含或具有选自下组的氨基酸序列(完全双特异性抗体构建体),该组由以下组成:SEQ ID NO:42、43、53、54、64、65、75、76、86、87、97、98、108、109、119、120、130、131、141、142、152、153、163、164、174、175、185、186、196、197、207、208、218、219、229、230、240、241、251、252、262、263、273、274、284、285、295、296、306、307、317、318、328、329、339、340、350、351、361、362、372、373、383、384、394、395、405、406、416、417、427、428、438、439、449、450、460、461、471、472、482、483、493、494、504、505、515、516、526和527,或者具有与所述序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
抗体构建体的共价修饰也包括在本发明的范围内,并且通常但不总是在翻译后进行。例如,通过使抗体构建体的特定氨基酸残基与能够与选择的侧链或N或C末端残基反应的有机衍生剂反应,将抗体构建体的若干种类型的共价修饰引入到分子中。
半胱氨酰残基最常见地与α-卤代乙酸酯(和相应的胺),诸如氯乙酸或氯乙酰胺反应,以得到羧甲基或羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酰残基还可以通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、磷酸氯乙酰酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸酯、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑反应来衍生出。
组氨酰残基是通过在pH 5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应衍生出,因为这种剂对组氨酰侧链相对具有特异性。对溴苯甲酰甲基溴也是有用的;该反应优选在pH 6.0的0.1M二甲胂酸钠中进行。赖氨酰残基和氨基末端残基与琥珀酸酐或其他羧酸酐反应。用这些剂衍生化具有逆转赖氨酰残基的电荷的效应。用于衍生含α-氨基的残基的其他合适试剂包括亚氨酸酯,诸如甲基吡啶亚胺甲酯;磷酸吡哆醛;吡哆醛;硼氢化氯;三硝基苯磺酸;O-甲基异脲;2,4-戊二酮;以及转氨酶催化的与乙醛酸盐的反应。
精氨酰残基通过与一种或多种常规试剂(其中苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮)反应而被修饰。由于胍官能团的高pKa,精氨酸残基的衍生化要求反应在碱性条件下进行。此外,这些试剂可以与赖氨酸基团以及精氨酸ε-氨基基团反应。
可以对酪氨酰残基进行特定修饰,特别感兴趣的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记引入到酪氨酰残基中。最常见地,将N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别用于形成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。使用125I或131I碘化酪氨酰残基以制备用于放射免疫测定的标记蛋白质,上述氯胺T法是合适的。
羧基侧基团(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳二亚胺(R'—N=C=N--R')反应而选择性地修饰,其中R和R'任选为不同的烷基基团,诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外,天冬氨酰残基和谷氨酰残基通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰残基和谷氨酰胺酰残基。
用双功能剂衍生化可用于将本发明的抗体构建体交联到水不溶性载体基质或表面以用于多种方法中。常用的交联剂包括例如1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如与4-叠氮基水杨酸的酯)、同双官能亚氨酸酯(包括二琥珀酰亚胺酯,诸如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯),和双官能马来酰亚胺,诸如双-N-马来酰亚胺-1,8-辛烷)。衍生剂诸如3-[(对叠氮基苯基)二硫代]丙酰亚胺酸甲基酯产生能够在光存在下形成交联的可光活化中间体。可替代地,将如美国专利号3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537和4,330,440中所述的反应性水不溶性基质诸如溴化氰活化的碳水化合物和反应性底物用于蛋白质固定化。
谷氨酰胺酰残基和天冬酰胺酰残基通常分别脱酰胺成相应的谷氨酰残基和天冬氨酰残基。可替代地,这些残基在弱酸性条件下脱酰胺。这些残基的任一形式都属于本发明的范围。
其他修饰包括对脯氨酸和赖氨酸的羟基化、对丝氨酰或苏氨酰残基的羟基基团的磷酸化、对赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基基团的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties[蛋白质:结构和分子特性],W.H.Freeman&Co.[W.H.弗里曼公司],San Francisco[旧金山],1983,第79-86页)、对N末端胺的乙酰化和对任何C末端羧基基团的酰胺化。
包括在本发明范围内的抗体构建体的另一种类型的共价修饰包括改变蛋白质的糖基化模式。如本领域中已知的,糖基化模式可以取决于蛋白质的序列(例如,下文论述的特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在)或其中产生蛋白质的宿主细胞或生物体。下面论述特定的表达系统。
多肽的糖基化典型地是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸以外的任何氨基酸)是将碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此,在多肽中这些三肽序列中的任一者的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种连接至羟基氨基酸,最常见的是丝氨酸或苏氨酸,但是也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列以使得它含有上述三肽序列中的一者或多者而方便地完成向抗体构建体添加糖基化位点(用于N-连接的糖基化位点)。还可以通过向起始序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或由一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代来作出改变(用于O-连接的糖基化位点)。为了方便起见,抗体构建体的氨基酸序列优选通过DNA水平的变化来改变,特别是通过在预选碱基处突变编码多肽的DNA,以使得产生将翻译成所希望氨基酸的密码子。
增加抗体构建体上的碳水化合物部分的数量的另一种手段是通过将糖苷化学或酶促偶联至蛋白质。这些程序的有利之处在于它们不需要在具有用于N-和O-连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质。取决于所使用的偶联方式,一种或多种糖可连接至(a)精氨酸和组氨酸,(b)游离羧基基团,(c)游离巯基基团,诸如半胱氨酸的那些,(d)游离羟基基团,诸如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些,(e)芳香族残基,诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些,或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些方法描述于WO 87/05330以及Aplin和Wriston,1981,CRC Crit.Rev.Biochem.[CRC生物化学关键评论],第259-306页中。
存在于起始抗体构建体上的碳水化合物部分的去除可以化学或酶促方式完成。化学去糖基化要求将蛋白质暴露于化合物三氟甲磺酸,或等效化合物。该处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)以外的大多数或所有糖裂解,同时使多肽保持完整。化学去糖基化由Hakimuddin等人,1987,Arch.Biochem.Biophys.[生物化学与生物物理学集刊]259:52和Edge等人,1981,Anal.Biochem.[分析生物化学]118:131描述。多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可以通过使用多种内切糖苷酶和外切糖苷酶实现,如由Thotakura等人,1987,Meth.Enzymol.[酶学方法]138:350所述的。可以通过使用化合物衣霉素预防潜在糖基化位点处的糖基化,如由Duskin等人,1982,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]257:3105所述的。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键的形成。
本文还考虑抗体构建体的其他修饰。例如,抗体构建体的另一种类型的共价修饰包括以美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中示出的方式将抗体构建体连接至各种非蛋白质聚合物,包括但不限于各种多元醇,诸如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。此外,如本领域中已知的,可以在抗体构建体内的不同位置进行氨基酸取代,例如以有利于添加聚合物诸如PEG。
在一些实施例中,本发明的抗体构建体的共价修饰包括添加一个或多个标记。标记基团可以经由各种长度的间隔臂与抗体构建体偶联以减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中是已知的并且可以用于进行本发明。术语“标记”或“标记基团”是指任何可检测的标记。一般来讲,标记属于多种类别,这取决于将检测它们的测定-以下实例包括但不限于:
a)同位素标记,这些同位素标记可以是放射性同位素或重同位素,诸如放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、89Zr、90Y、99Tc、111In、125I、131I)
b)磁性标记(例如磁性颗粒)
c)氧化还原活性部分
d)光学染料(包括但不限于,生色团、磷光体和荧光团),诸如荧光基团(例如FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、化学发光基团和荧光团,这些荧光团可以是“小分子”荧光剂或蛋白质荧光剂
e)酶促基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)
f)生物素化基团
g)由第二报道基因识别的预定多肽表位(例如,亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合侧、金属结合结构域、表位标签等)
“荧光标记”意指可以经由其固有的荧光特性检测到的任何分子。合适的荧光标记包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、赤藓红、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石绿、二苯乙烯、荧光黄、瀑布蓝J、德克萨斯红、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC红640、Cy5、Cy5.5、LC红705、俄勒冈绿、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、AlexaFluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、瀑布蓝、瀑布黄和R-藻红蛋白(PE)(俄勒冈州尤金市的分子探针公司(Molecular Probes,Eugene,OR))、FITC、罗丹明和德克萨斯红(伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯公司(Pierce,Rockford,IL))、Cy5、Cy5.5、Cy7(宾夕法尼亚州匹兹堡市的阿默舍姆生命科学公司(Amersham Life Science,Pittsburgh,PA))。合适的光学染料(包括荧光团)描述于Richard P.Haugland的Molecular Probes Handbook[分子探针手册]中。
合适的蛋白质荧光标记还包括但不限于绿色荧光蛋白,包括海肾(Renilla)、海笔(Ptilosarcus)或水母(Aequorea)物种的GFP(Chalfie等人,1994,Science[科学]263:802-805);EGFP(克罗泰克实验室有限公司(Clontech Laboratories,Inc.),基因库登录号U55762)、蓝色荧光蛋白(BFP,量子生物科技有限公司(Quantum Biotechnologies,Inc.),加拿大魁北克省蒙特利尔(Montreal,Quebec,Canada)迈松纳夫大道西部(de MaisonneuveBlvd.West)1801,第8层,H3H 1J9);Stauber,1998,Biotechniques[生物技术]24:462-471;Heim等人,1996,Curr.Biol.[当代生物学]6:178-182)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP,克罗泰克实验室有限公司)、萤光素酶(Ichiki等人,1993,J.Immunol.[免疫学杂志]150:5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]85:2603-2607)和海肾(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美国专利号5,292,658、5,418,155、5,683,888、5,741,668、5,777,079、5,804,387、5,874,304、5,876,995、5,925,558)。
本发明的抗体构建体还可以包含另外的结构域,这些结构域例如有助于分离分子或涉及分子的适应性药代动力学曲线。有助于分离抗体构建体的结构域可以选自肽基序或辅助性地引入的部分,这些部分可以在分离方法(例如分离柱)中捕获。此类另外的结构域的非限制性实施例包括称为Myc-标签、HAT-标签、HA-标签、TAP-标签、GST-标签、几丁质结合结构域(CBD-标签)、麦芽糖结合蛋白(MBP-标签)、Flag-标签、Strep-标签以及其变体(例如StrepII-标签)和His标签的肽基序。本文披露的所有抗体构建体都可以包含His-标签结构域,该His-标签结构域通常称为分子的氨基酸序列中的优选5个、且更优选6个His残基(六组氨酸)的连续His残基重复序列。His-标签可以位于例如抗体构建体的N或C末端,优选它位于C末端。最优选地,六组氨酸标签(HHHHHH)(SEQ ID NO:16)经由肽键连接至根据本发明的抗体构建体的C末端。另外,PLGA-PEG-PLGA的缀合体系可以与聚组氨酸标签组合用于缓释应用和改善的药代动力学曲线。
还考虑了本文所述的抗体构建体的氨基酸序列修饰。例如,可能需要改善抗体构建体的结合亲和力和/或其他生物特性。通过将适当核苷酸变化引入到抗体构建体核酸或通过肽合成来制备抗体构建体的氨基酸序列变体。所有下面描述的氨基酸序列修饰均应产生仍然保留未修饰的亲本分子的所希望生物活性(与MUC17和CD3结合)的抗体构建体。
术语“氨基酸”或“氨基酸残基”典型地是指具有其本领域公认的定义的氨基酸,诸如选自下组的氨基酸,该组由以下组成:丙氨酸(Ala或A);精氨酸(Arg或R);天冬酰胺(Asn或N);天冬氨酸(Asp或D);半胱氨酸(Cys或C);谷氨酰胺(Gln或Q);谷氨酸(Glu或E);甘氨酸(Gly或G);组氨酸(His或H);异亮氨酸(He或I);亮氨酸(Leu或L);赖氨酸(Lys或K);甲硫氨酸(Met或M);苯丙氨酸(Phe或F);脯氨酸(Pro或P);丝氨酸(Ser或S);苏氨酸(Thr或T);色氨酸(Trp或W);酪氨酸(Tyr或Y);以及缬氨酸(Val或V),但可以根据需要使用修饰的、合成的或稀有的氨基酸。通常,氨基酸可以分组为具有非极性侧链(例如Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val);具有带负电的侧链(例如Asp、Glu);具有带正电的侧链(例如Arg、His、Lys);或具有不带电的极性侧链(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。
氨基酸修饰包括例如抗体构建体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入和取代的组合以达到最终构建体,条件是最终的构建体具有所希望的特征。氨基酸变化还可以改变抗体构建体的翻译后过程,诸如改变糖基化位点的数目或位置。
例如,可以在每个CDR中插入、取代或缺失1、2、3、4、5或6个氨基酸(当然,取决于其长度),而可以在每个FR中插入、取代或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸。优选地,氨基酸序列插入到抗体构建体中包括长度范围为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基范围的氨基和/或羧基末端融合物插入到含有100个或更多个残基的多肽,以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。也可以在本发明的抗体构建体的第三结构域内进行相应的修饰。本发明的抗体构建体的插入变体包括与酶的抗体构建体的N末端或C末端的融合或与多肽的融合。
取代诱变最感兴趣的位点包括(但不限于)重链和/或轻链的CDR,特别是超变区,但也考虑重链和/或轻链的FR改变。取代优选地是如本文所述的保守取代。优选地,可以在CDR中取代1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸,而可以在框架区(FR)中取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸,这取决于CDR或FR的长度。例如,如果CDR序列包含6个氨基酸,则设想这些氨基酸中的1个、2个或3个被取代。类似地,如果CDR序列包含15个氨基酸,则设想这些氨基酸中的1个、2个、3个、4个、5个或6个被取代。
用于鉴定作为优选诱变位置的抗体构建体的某些残基或区的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”,如Cunningham和Wells于Science[科学],244:1081-1085(1989)中所述的。在此,鉴定了抗体构建体内的残基或靶标残基组(例如带电残基,诸如arg、asp、his、lys和glu)并且用中性或带负电的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替换以影响氨基酸与表位的相互作用。
然后通过在取代位点处或为取代位点引入进一步的或其他变体来精炼那些展示对取代的功能敏感性的氨基酸位置。因此,虽然用于引入氨基酸序列变化的位点或区是预定的,但突变本身的性质无需预定。例如,为了分析或优化给定位点处突变的性能,可以在靶密码子或区处进行丙氨酸扫描或随机诱变,并且筛选所表达的抗体构建体变体以获得所希望活性的最优组合。用于在具有已知序列的DNA中的预定位点进行取代突变的技术是熟知的,例如,M13引物诱变和PCR诱变。使用抗原结合活性(诸如MUC17或CD3结合)的测定来筛选突变体。
一般来讲,如果氨基酸在重链和/或轻链的一个或多个或所有CDR中被取代,则优选的是,之后获得的“取代的”序列与“初始”CDR序列至少60%或65%、更优选70%或75%、甚至更优选80%或85%并且特别优选90%或95%相同。这意指该取代取决于CDR与“取代”序列的相同程度的长度。例如,具有5个氨基酸的CDR优选与其取代序列80%相同,以便取代至少一个氨基酸。因此,抗体构建体的CDR可以与其取代的序列具有不同程度的同一性,例如CDRL1可以具有80%,而CDRL3可以具有90%。
优选的取代(或替换)是保守取代。然而,只要抗体构建体保留其经由第一结构域与MUC17结合并且经由第二结构域与CD3ε结合的能力并且/或者其CDR与之后取代的序列具有同一性(与“原始”CDR序列至少60%或65%、更优选70%或75%、甚至更优选80%或85%并且特别优选90%或95%相同),则设想出任何取代(包括非保守取代或来自下表3中列出的“示例性取代”的一个或多个)。
保守取代示于表3中“优选的取代”标题之下。如果此类取代导致生物活性变化,则可以将在表3中命名为“示例性取代”的、或如在下文进一步参考氨基酸类别所述的更多实质性变化引入,并且筛选所希望的特征。
表3:氨基酸取代
本发明的抗体构建体的生物特性的实质性修饰是通过选择在保持以下的效应方面显著不同的取代来完成:(a)取代区域中的多肽骨架的结构,例如呈片层或螺旋构象,(b)分子在靶位点的电荷或疏水性,或(c)侧链的大部分。基于共同的侧链特性将天然存在的残基分组:(1)疏水性:正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile;(2)中性亲水性:cys、ser、thr、asn、gln(3)酸性:asp、glu;(4)碱性:his、lys、arg;(5)影响链取向的残基:gly、pro;和(6)芳香族:trp、tyr、phe。
非保守性取代将需要将这些类别之一成员换成另一类别。任何不参与维持抗体构建体的适当构象的半胱氨酸残基通常可以被丝氨酸取代以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反,可以将一个或多个半胱氨酸键添加至抗体以改善其稳定性(特别是在抗体是抗体片段(诸如Fv片段)的情况下)。
对于氨基酸序列,序列同一性和/或相似性是通过使用本领域中已知的标准技术来确定,包括但不限于Smith和Waterman,1981,Adv.Appl.Math.[先进应用数学]2:482的局部序列同一性算法;Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443的序列同一性比对算法;Pearson和Lipman,1988,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]85:2444的相似性搜索方法;这些算法的计算机实现方式(遗传学计算机组(GeneticsComputer Group)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,科学驱动路575号(575Science Drive),威斯康星州麦迪逊(Madison,Wis.));由Devereux等人,1984,Nucl.Acid Res.[核酸研究]12:387-395描述的最佳拟合序列程序,优选使用默认设置,或通过检查来进行。优选地,通过FastDB基于以下参数计算同一性百分比:错配罚分为1;空位罚分为1;空位大小罚分为0.33;以及连接罚分为30,“Current Methods in Sequence Comparison and Analysis[序列比较和分析的当前方法]”,Macromolecule Sequencing and Synthesis[大分子测序与合成],SelectedMethods and Applications[所选择的方法与应用],第127-149页(1988),Alan R.Liss公司。
有用的算法的实例是PILEUP。PILEUP使用渐进式成对比对从一组相关序列中创建多序列比对。它还可以绘制显示用于创建比对的聚类关系的树形图。PILEUP使用Feng和Doolittle,1987,J.Mol.Evol.[分子进化杂志]35:351-360的渐进式比对方法的简单化;该方法类似于Higgins和Sharp,1989,CABIOS 5:151-153所述的方法。有用的PILEUP参数包括3.00的默认空位权重、0.10的默认空位长度权重和加权末端空位。
有用的算法的另一实例是BLAST算法,描述于以下中:Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410;Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402;和Karin等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:5873-5787。特别有用的BLAST程序是从Altschul等人,1996,Methods inEnzymology[酶学方法]266:460-480获得的WU-BLAST-2程序。WU-BLAST-2使用多个搜索参数,其中大部分都设定为默认值。可调参数设定为以下值:重叠间隔=1,重叠分数=0.125,字码阈值(T)=II。HSP S和HSP S2参数是动态值,并且由程序本身根据特定序列的组成和特定数据库的组成来确立,根据该特定数据库来搜索感兴趣的序列;然而,可以调整这些值以提高灵敏度。
另外有用的算法是由Altschul等人,1993,Nucl.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402报道的空位BLAST。空位BLAST使用BLOSUM-62取代评分;阈值T参数设定为9;触发非空位扩展的双击方法,对k的空位长度收取10+k的成本;Xu设定为16,并且Xg设定为40(用于数据库搜索阶段)以及67(用于算法的输出阶段)。空位比对由对应于约22比特的评分触发。
一般来讲,各个变体CDR或VH/VL序列之间的氨基酸同源性、相似性或同一性与本文描绘的序列是至少60%,并且更典型地具有至少65%或70%、更优选至少75%或80%、甚至更优选至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和几乎100%的优选增加的同源性或同一性。以相似的方式,相对于本文中鉴定的结合蛋白的核酸序列的“百分比(%)核酸序列同一性”被定义为候选序列中与抗体构建体的编码序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。具体方法是利用设定为默认参数的WU-BLAST-2的BLASTN模块,重叠间隔和重叠分数分别设定为1和0.125。
一般来讲,编码各个变体CDR或VH/VL序列的核苷酸序列与本文描绘的核苷酸序列之间的核酸序列同源性、相似性或同一性是至少60%,并且更典型地具有至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%和几乎100%的优选增加的同源性或同一性。因此,“变体CDR”或“变体VH/VL区”是与本发明的亲本CDR/VH/VL具有指定的同源性、相似性或同一性,并且共享生物功能,包括但不限于亲本CDR或VH/VL的特异性和/或活性的至少60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
在一个实施例中,根据本发明的抗体构建体对人种系的同一性百分比≥70%或≥75%,更优选≥80%或≥85%,甚至更优选≥90%,并且最优选≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%或甚至≥96%。与人抗体种系基因产物的同一性被认为是降低治疗期间治疗性蛋白引发患者中针对药物的免疫应答的风险的重要特征。Hwang和Foote(“Immunogenicity of engineered antibodies[工程化抗体的免疫原性]”;Methods[方法]36(2005)3-10)证明了药物抗体构建体的非人部分的减少导致治疗期间患者中诱导抗药物抗体的风险降低。通过比较无数临床评价的抗体药物和对应的免疫原性数据,显示以下趋势:抗体的V区的人源化使得蛋白质免疫原性(平均5.1%的患者)比携带未改变的非人V区的抗体(平均23.59%的患者)更低。因此,呈抗体构建体形式的基于V区的蛋白质治疗剂需要与人序列具有较高程度的同一性。出于确定种系同一性的目的,可以使用Vector NTI软件将VL的V区与人种系V区段和J区段(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)的氨基酸序列进行比对并且通过将相同的氨基酸残基除以VL的氨基酸残基总数计算氨基酸序列(以百分比计)。对于VH区段(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)同样适用的,只是由于VH CDR3的高度多样性和缺少现有人种系VH CDR3比对配偶体,可以排除VH CDR3。然后可以使用重组技术来增加与人抗体种系基因的序列同一性。
在又一实施例中,本发明的双特异性抗体构建体在标准研究规模条件下,例如在标准的两步纯化过程中表现出高单体产率。优选地,根据本发明的抗体构建体的单体产率为≥0.25mg/L上清液、更优选≥0.5mg/L、甚至更优选≥1mg/L,并且最优选≥3mg/L上清液。
同样地,可以确定抗体构建体的二聚体抗体构建体同种型的产率,并由此确定单体百分比(即,单体:(单体+二聚体))。单体和二聚体抗体构建体的生产率和计算的单体百分比可以例如在对来自在滚瓶中标准化研究规模生产的培养物上清液的SEC纯化步骤中获得。在一个实施例中,抗体构建体的单体百分比≥80%、更优选≥85%、甚至更优选≥90%,并且最优选≥95%。
在一个实施例中,抗体构建体的优选血浆稳定性(具有血浆的EC50与无血浆的EC50的比率)≤5或≤4、更优选≤3.5或≤3、甚至更优选≤2.5或≤2,并且最优选≤1.5或≤1。抗体构建体的血浆稳定性可以通过将构建体在37℃下在人血浆中孵育24小时、之后在51铬释放细胞毒性测定中测定EC50来测试。细胞毒性测定中的效应细胞可以为刺激的富集的人CD8阳性T细胞。靶细胞可以是例如用人MUC17转染的CHO细胞。效应细胞与靶细胞(E:T)比率可以选择为10:1或5:1。用于此目的的人血浆库来源于由EDTA涂覆的注射器收集的健康供体的血液。通过离心去除细胞组分,并且收集上层血浆相并随后汇集。作为对照,在RPMI-1640培养基中的细胞毒性测定之前立即稀释抗体构建体。血浆稳定性计算为EC50(血浆孵育后)与EC50(对照)的比率。
此外优选的是,本发明的抗体构建体的单体到二聚体的转化较低。可以在不同条件下测量转化并且通过高性能尺寸排阻色谱法进行分析。例如,抗体构建体的单体同种型的孵育可以在37℃以及例如100μg/ml或250μg/ml的浓度下在孵育箱中进行7天。在这些条件下,优选的是,本发明的抗体构建体显示出≤5%、更优选≤4%、甚至更优选≤3%、甚至更优选≤2.5%、甚至更优选≤2%、甚至更优选≤1.5%并且最优选≤1%或≤0.5%或甚至0%的二聚体百分比。
还优选的是,本发明的双特异性抗体构建体在多个冷冻/解冻循环后以非常低的二聚体转化存在。例如,将抗体构建体单体在例如通用配制缓冲液中调整至浓度为250μg/ml,并且进行三个冷冻/解冻循环(在-80℃下冷冻30min,之后在室温下解冻30min),之后进行高性能SEC以确定已经转化成二聚体抗体构建体的最初单体抗体构建体的百分比。优选地,例如在三个冷冻/解冻循环之后,双特异性抗体构建体的二聚体百分比优选≤5%,更优选≤4%,甚至更优选≤3%,甚至更优选≤2.5%,甚至更优选≤2%,甚至更优选≤1.5%,并且最优选≤1%或甚至≤0.5%。
本发明的双特异性抗体构建体优选显示出聚集温度≥45℃或≥50℃、更优选≥52℃或≥54℃、甚至更优选≥56℃或≥57℃,并且最优选≥58℃或≥59℃的有利热稳定性。热稳定性参数可以根据抗体聚集温度如下确定:将浓度为250μg/ml的抗体溶液转移到一次性比色杯中并置于动态光散射(DLS)装置中。将样品以0.5℃/min的加热速率从40℃加热至70℃,恒定获取测量的半径。使用指示蛋白质和聚集物熔融的半径增加来计算抗体的聚集温度。
可替代地,可以通过差示扫描量热法(DSC)确定温度熔融曲线以确定抗体构建体的固有生物物理学蛋白质稳定性。这些实验使用微凯尔有限公司(MicroCal LLC)(美国马萨诸塞州的北安普顿(Northampton,MA,U.S.A))VP-DSC装置进行。从20℃至90℃记录与仅含有配制缓冲液的样品相比含有抗体构建体的样品的能量摄取。例如在SEC运行缓冲液中将抗体构建体调整至终浓度为250μg/ml。为了记录对应的熔融曲线,逐步升高整个样品温度。在每个温度T下记录样品和配制缓冲液参考物的能量吸收。将样品的能量吸收Cp(千卡/摩尔/℃)减去参考物的差针对对应的温度作图。熔融温度被定义为第一次最大能量吸收时的温度。
还设想本发明的MUC17xCD3双特异性抗体构建体具有≤0.2、优选≤0.15、更优选≤0.12、甚至更优选≤0.1并且最优选≤0.08的浊度(如在将纯化的单体抗体构建体浓缩至2.5mg/ml并过夜孵育后通过OD340测量的)。
在另一个实施例中,根据本发明的抗体构建体在生理的或稍低的pH值、即约pH7.4至6.0下是稳定的。抗体构建体在非生理pH值(诸如约pH 6.0)下表现出的耐受性越大,从离子交换柱洗脱的抗体构建体相对于加载蛋白质的总量的回收率就越高。从约pH 6.0的离子(例如阳离子)交换柱的抗体构建体的回收率优选≥30%、更优选≥40%、更优选≥50%、甚至更优选≥60%、甚至更优选≥70%、甚至更优选≥80%、甚至更优选≥90%、甚至更优选≥95%,并且最优选≥99%。
此外设想,本发明的双特异性抗体构建体表现出治疗功效或抗肿瘤活性。这可以例如在以下晚期人肿瘤异种移植模型的一般化实例中披露的研究中评估:
在研究的第1天,将人靶细胞抗原(此处:MUC17)阳性癌细胞系的5×106个细胞皮下注射在雌性NOD/SCID小鼠的右背侧中。当平均肿瘤体积达到约100mm3时,通过将约2×107个细胞注射到动物的腹腔中将体外扩增的人CD3阳性T细胞移植到小鼠中。媒介物对照组1的小鼠不接受效应细胞并用作与媒介物对照组2(接受效应细胞)比较的未移植对照,以监测单独的T细胞对肿瘤生长的影响。当平均肿瘤体积达到约200mm3时开始抗体治疗。治疗开始当天每个治疗组的平均肿瘤大小与任何其他组均不应有统计学差异(方差分析)。通过静脉内快速浓注用0.5mg/kg/天的MUC17xCD3双特异性抗体构建体对小鼠进行治疗,持续约15至20天。在研究期间通过卡尺测量肿瘤并且通过肿瘤体积(TV)的组间比较评价进展。通过将TV计算为T/C%=100×(分析组的中值TV)/(对照组2的中值TV)来确定肿瘤生长抑制T/C[%]。
本领域技术人员知道如何修改或调整该研究的某些参数,诸如注射的肿瘤细胞的数量、注射位点、移植的人T细胞的数量、有待施用的双特异性抗体构建体的量以及时间线,同时仍然获得有意义且可再现的结果。优选地,肿瘤生长抑制T/C[%]≤70或≤60、更优选≤50或≤40、甚至更优选≤30或≤20并且最优选≤10或≤5或甚至≤2.5。肿瘤生长抑制优选接近于100%。
在本发明的抗体构建体的优选实施例中,抗体构建体是单链抗体构建体。
另外,在本发明的抗体构建体的优选实施例中,所述第三结构域按氨基至羧基顺序包含:
铰链-CH2-CH3-接头-铰链-CH2-CH3。
在本发明的一个实施例中,第三结构域的所述多肽单体中的每一个具有与选自由SEQ ID NO:17-24组成的组的序列至少90%相同的氨基酸序列。在本发明的优选实施例中,所述多肽单体中的每一个具有选自SEQ ID NO:17-24的氨基酸序列。
另外,在本发明的一个实施例中,第三结构域的一个或优选每个(两个)多肽单体的CH2结构域包含结构域内半胱氨酸二硫桥。如本领域中已知的,术语“半胱氨酸二硫桥”是指具有一般结构R–S–S–R的官能团。该键联也称为SS键或二硫桥,并且通过半胱氨酸残基的两个硫醇基团的偶联来衍生。对于本发明的抗体构建体特别优选的是,将成熟抗体构建体中形成半胱氨酸二硫桥的半胱氨酸引入到对应于309和321(Kabat编号)的CH2结构域的氨基酸序列中。
在本发明的一个实施例中,去除CH2结构域的Kabat位置314中的糖基化位点。优选的是,通过N314X取代实现糖基化位点的去除,其中X是除Q之外的任何氨基酸。所述取代优选为N314G。在一个更优选的实施例中,所述CH2结构域另外包含以下取代(根据Kabat的位置):V321C和R309C(这些取代在Kabat位置309和321处引入结构域内半胱氨酸二硫桥)。
假定与本领域中已知的双特异性异源Fc抗体构建体相比(图1b)本发明的抗体构建体的优选特征例如可以尤其涉及在CH2结构域中引入上述修饰。因此,对于本发明的构建体优选的是,本发明的抗体构建体的第三结构域中的CH2结构域在Kabat位置309和321处包含结构域内半胱氨酸二硫桥并且/或者Kabat位置314处的糖基化位点被去除、优选通过N314G取代去除。
在本发明的另一个优选实施例中,本发明的抗体构建体的第三结构域中的CH2结构域在Kabat位置309和321处包含结构域内半胱氨酸二硫桥并且Kabat位置314处的糖基化位点通过N314G取代去除。最优选地,本发明的抗体构建体的第三结构域的多肽单体具有选自由SEQ ID NO:17和18组成的组的氨基酸序列。
在一个实施例中,本发明提供了一种抗体构建体,其中:
(i)该第一结构域包含两个抗体可变结构域并且该第二结构域包含两个抗体可变结构域;
(ii)该第一结构域包含一个抗体可变结构域并且该第二结构域包含两个抗体可变结构域;
(iii)该第一结构域包含两个抗体可变结构域并且该第二结构域包含一个抗体可变结构域;或者
(iv)该第一结构域包含一个抗体可变结构域并且该第二结构域包含一个抗体可变结构域。
因此,第一结构域和第二结构域可以是各自包含两个抗体可变结构域(诸如VH和VL结构域)的结合结构域。此类包含两个抗体可变结构域的结合结构域的实例在上文进行了描述并且包括例如上文所述的Fv片段、scFv片段或Fab片段。可替代地,这些结合结构域中的一个或两个可以仅包含单一可变结构域。这种单结构域结合结构域的实例在上文进行了描述并且包括例如纳米抗体或仅包含一个可变结构域的单一可变结构域抗体,该一个可变结构域可以是独立于其他V区或结构域特异性结合抗原或表位的VHH、VH或VL。
在本发明的抗体构建体的优选实施例中,第一结构域和第二结构域经由肽接头与第三结构域融合。优选的肽接头已在上文描述并且特征在于氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser,即Gly4Ser(SEQ ID NO:1),或其聚合物,即(Gly4Ser)x,其中x为1或更大的整数(例如2或3)。用于第一结构域和第二结构域与第三结构域融合的特别优选的接头在SEQ ID NO:1中描绘。
在一个优选实施例中,本发明的抗体构建体的特征在于按氨基至羧基顺序包含:
(a)该第一结构域;
(b)肽接头,该肽接头具有选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的氨基酸序列;
(c)该第二结构域;
(d)肽接头,该肽接头具有选自由SEQ ID NO:1、2、3、9、10、11和12组成的组的氨基酸序列;
(e)该第三结构域的该第一多肽单体;
(f)肽接头,该肽接头具有选自由SEQ ID NO:5、6、7和8组成的组的氨基酸序列;以及
(g)该第三结构域的该第二多肽单体。
本发明的抗体构建体包含与MUC17、优选与MUC17的细胞外结构域(ECD)结合的第一结构域。应理解,在本发明的上下文中,术语“与MUC17的细胞外结构域结合”意味着结合结构域与在靶细胞表面上表达的MUC17结合。因此,当MUC17由天然表达细胞或细胞系和/或由用MUC17转化或(稳定/瞬时)转染的细胞或细胞系表达时,根据本发明的第一结构域优选与MUC17结合。在一个优选实施例中,当MUC17在体外结合测定(诸如BIAcore或Scatchard)中用作“靶”或“配体”分子时,第一结合结构域也与MUC17结合。“靶细胞”可以是在其表面上表达MUC17的任何原核或真核细胞;优选地,靶细胞是作为人体或动物体的一部分的细胞,诸如表达特定MUC17的癌症或肿瘤细胞。
优选地,第一结合结构域与人MUC17/MUC17 ECD结合。在另一个优选实施例中,它与猕猴MUC17/MUC17 ECD结合。根据最优选的实施例,它与人和猕猴MUC17/MUC17 ECD结合。“MUC17细胞外结构域”或“MUC17 ECD”是指基本上不含MUC17的跨膜和细胞质结构域的MUC17区或序列。本领域技术人员应理解,根据本领域常规使用的用于鉴定该疏水结构域类型的标准鉴定针对本发明的MUC17多肽所鉴定的跨膜结构域。跨膜结构域的确切边界可以改变,但最有可能的是在本文具体提及的结构域的任一末端改变不超过约5个氨基酸。
与MUC17结合的优选结合结构域披露于WO 2010/037836和WO 2011/121110中。这些申请中描述的用于MUC17的任何结合结构域可以在本发明的背景下使用。
在本发明的一方面,抗体构建体按氨基至羧基顺序包含:
(a)该第一结构域,该第一结构域具有选自下组的氨基酸序列,该组由以下组成:SEQ ID NO:50、56、68、74、86、92、104、110、122、128、140、146、158、164、176、182、194、200、212、218、230、236、248、254、266、272、284、290、302、308、320、335、350、365、380、395、410、425、440、455、470;
(b)肽接头,该肽接头具有选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的氨基酸序列;
(c)该第二结构域,该第二结构域具有选自下组或如SEQ ID NO:15中所描绘的氨基酸序列,该组由以下组成:WO 2008/119567的SEQ ID NO:23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187;
(d)肽接头,该肽接头具有选自由SEQ ID NO:1、2、3、9、10、11和12组成的组的氨基酸序列;
(e)该第三结构域的该第一多肽单体,该第一多肽单体具有选自由SEQ ID NO:17-24组成的组的多肽序列;
(f)肽接头,该肽接头具有选自由SEQ ID NO:5、6、7和8组成的组的氨基酸序列;以及
(g)该第三结构域的该第二多肽单体,该第二多肽单体具有选自由SEQ ID NO:17-24组成的组的多肽序列。
与该优选实施例一致,经由肽接头与单链多肽融合的第一结构域和第二结构域包含选自下组的序列,该组由以下组成:SEQ ID NO:51、57、69、75、87、93、105、111、123、129、141、147、159、165、177、183、195、201、213、219、231、237、249、255、267、273、285、291、303、309、321、324、336、339、351、354、366、369、381、384、396、399、411、414、426、429、441、444、456、459、471和474。
在一方面,本发明的抗体构建体的特征在于具有选自下组的氨基酸序列,该组由以下组成:SEQ ID NO:52、53、58、59、70、71、76、77、88、89、94、95、106、107、112、113、124、125、130、131、142、143、148、149、160、161、166、167、178、179、184、185、196、197、202、203、214、215、220、221、232、233、238、239、250、251、256、257、268、269、274、275、286、287、292、293、304、305、310、311、322、323、325、326、337、338、340、341、352、353、355、356、367、368、370、371、382、383、385、386、397、398、400、401、412、413、415、416、427、428、430、431、442、443、445、446、457、458、460、461、472、473、475和476。
本发明进一步提供了一种多核苷酸/核酸分子,该多核苷酸/核酸分子编码本发明的抗体构建体。多核苷酸是由共价键合在链中的13个或更多个核苷酸单体构成的生物聚合物。DNA(诸如cDNA)和RNA(诸如mRNA)是具有不同生物功能的多核苷酸的实例。核苷酸是充当核酸分子如DNA或RNA的单体或亚单位的有机分子。核酸分子或多核苷酸可以为双链和单链的、线性的和圆形的。它优选包括在载体中,该载体优选包括在宿主细胞中。所述宿主细胞例如在用本发明的载体或多核苷酸转化或转染后能够表达抗体构建体。为此目的,将多核苷酸或核酸分子可操作地连接至控制序列。
遗传密码是将遗传物质(核酸)内编码的信息翻译成蛋白质的一组规则。活细胞中的生物解码是通过以由mRNA指定的顺序连接氨基酸的核糖体、使用tRNA分子携带氨基酸并一次读出mRNA三个核苷酸来完成。该密码定义了这些核苷酸三联体的序列(称为密码子)如何指定在蛋白质合成期间接下来将添加哪种氨基酸。除了一些例外,核酸序列中的三核苷酸密码子指定单一氨基酸。因为绝大多数基因都使用完全相同的密码进行编码,所以该特定密码通常称为规范或标准遗传密码。虽然遗传密码决定给定编码区的蛋白质序列,但其他基因组区可能会影响这些蛋白质产生的时间和地点。
此外,本发明提供了一种载体,该载体包含本发明的多核苷酸/核酸分子。载体是用作将(外来)遗传物质转移到细胞中的媒介物的核酸分子。术语“载体”涵盖但不限于质粒、病毒、粘粒和人造染色体。一般来讲,工程化载体包含复制起点、多克隆位点和选择性标志物。载体本身通常是核苷酸序列,该核苷酸序列通常是包含插入物(转基因)和充当载体的“骨架”的更大序列的DNA序列。现代载体除转基因插入物和骨架外还可涵盖额外的特征:启动子、遗传标志物、抗生素抗性、报道基因、靶向序列、蛋白质纯化标签。称为表达载体(表达构建体)的载体尤其用于在靶细胞中表达转基因,并且通常具有控制序列。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如,适用于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合侧。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸置处于与另一核酸序列的功能关系中时,该核酸是“可操作地连接的”。例如,如果将前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白,则该前序列或分泌前导序列的DNA可操作地连接至该多肽的DNA;如果启动子或增强子影响编码序列的转录,则该启动子或增强子可操作地连接至该序列;或者如果核糖体结合侧被定位成使得有助于翻译,则该核糖体结合侧可操作地连接至编码序列。通常,“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的,并且在分泌性前导序列的情形下是连续的并处于阅读相(readingphase)中。然而,增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点进行接连接合来完成。如果不存在此类位点,则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
“转染”是有意将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入到靶细胞中的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。转导通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。转染动物细胞典型地涉及打开细胞膜中的瞬时孔或“洞”,以允许摄取物质。转染可以使用磷酸钙、通过电穿孔、通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与物质混合以产生脂质体(这些脂质体与细胞膜融合并将其货物存放在内部)来进行。
术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)向细菌中,以及向非动物真核细胞(包括植物细胞中的非病毒转移。因此,转化是细菌或非动物真核细胞的基因改变,该基因改变是因通过一个或多个细胞膜从其周围直接摄取并随后并入外源遗传物质(核酸分子)而产生。转化可以通过人为手段来实现。为了发生转化,细胞或细菌必须处于感受态,这可能作为对诸如饥饿等环境条件和细胞密度的时间限制应答而发生。
此外,本发明提供了一种宿主细胞,该宿主细胞用本发明的多核苷酸/核酸分子或载体转化或转染。如本文使用的,术语“宿主细胞”或“受体细胞”旨在包括可以是或已经是载体、外源性核酸分子和编码本发明抗体构建体的多核苷酸的受体和/或抗体构建体本身的受体的任何单个细胞或细胞培养物。通过转化、转染等方式将对应的物质引入到细胞中。术语“宿主细胞”还旨在包括单细胞的后代或潜在后代。因为某些改变可能由于天然的、意外的或有意的突变或由于环境影响而在随后世代中发生,所以这种后代事实上可能不会与亲本细胞完全相同(在形态或基因组或全部DNA补体中),但仍包括在本文所用术语的范围内。合适的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞,并且还包括但不限于细菌、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞,诸如昆虫细胞和哺乳动物细胞,例如鼠类、大鼠、猕猴或人。
本发明的抗体构建体可以在细菌中产生。表达后,将本发明的抗体构建体从大肠杆菌细胞糊中以可溶性级分分离,并且可以通过例如亲和色谱法和/或尺寸排除来纯化。最终纯化可以类似于用于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的方法进行。
除了原核生物之外,真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)是本发明的抗体构建体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而,许多其他属、物种和菌株通常可获得并且可用于本文中,诸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe);克鲁维酵母属(Kluyveromyce)宿主,诸如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24178)、瓦尔提鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus);耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402 226);巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183 070);假丝酵母属(Candida);里氏木霉菌(Trichoderma reesia)(EP 244 234);粗糙脉孢菌(Neurospora crassa);许旺酵母属(Schwanniomyces),诸如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis);和丝状真菌,诸如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主,诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于表达本发明的糖基化抗体构建体的合适的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了来自诸如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)的宿主的许多杆状病毒株和变体以及相应的许可性昆虫宿主细胞。用于转染的多种病毒株是公众可获得的,例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株,并且根据本发明,此类病毒可以用作本文的病毒,特别是用于转染草地贪夜蛾细胞。
棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、拟南芥和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。可用于在植物细胞培养物中产生蛋白质的克隆和表达载体是本领域技术人员已知的。参见,例如Hiatt等人,Nature[自然](1989)342:76-78;Owen等人(1992)Bio/Technology[生物/技术]10:790-794;Artsaenko等人(1995)The Plant J[植物杂志]8:745-750和Fecker等人(1996)Plant Mol Biol[植物分子生物学]32:979-986。
然而,对脊椎动物细胞的兴趣最大,并且培养物(组织培养物)中脊椎动物细胞的繁殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40(COS-7,ATCC CRL1651)转化的猴肾CV1系;人胚胎肾系(293细胞或亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293细胞,Graham等人,J.Gen Virol.[遗传病毒学杂志]36:59(1977));幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCCCCL 10);中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:4216(1980));小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.[生殖生物学]23:243-251(1980));猴肾细胞(CVI ATCC CCL 70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL1587);人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2);犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34);布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442);人肺细胞(W138,ATCC CCL 75);人肝细胞(Hep G2,1413 8065);小鼠乳房肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL5 1);TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y Acad.Sci.[纽约科学院年刊](1982)383:44-68);MRC 5细胞;FS4细胞;和人肝癌细胞系(Hep G2)。
在另一个实施例中,本发明提供了一种用于产生本发明的抗体构建体的方法,所述方法包括在允许表达本发明的抗体构建体的条件下培养本发明的宿主细胞并且从该培养中回收所产生的抗体构建体。
如本文使用的,术语“培养”是指细胞在合适的条件下在培养基中的体外维持、分化、生长、增殖和/或繁殖。术语“表达”包括涉及产生本发明的抗体构建体的任何步骤,包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
当使用重组技术时,抗体构建体可以在周质空间中细胞内产生,或直接分泌到培养基中。如果抗体构建体是在细胞内产生,则作为第一步,例如通过离心或超滤去除宿主细胞或溶解片段的微粒状碎片。Carter等人,Bio/Technology[生物/技术]10:163-167(1992)描述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的程序。简而言之,在约30min内,在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下使细胞糊解冻。可以通过离心去除细胞碎片。在将抗体分泌到培养基中的情况下,通常首先使用可商购的蛋白质浓缩滤器,例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元对来自此类表达系统的上清液进行浓缩。任何前述步骤中可以包括蛋白酶抑制剂(诸如PMSF)以抑制蛋白水解,并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法回收或纯化从宿主细胞制备的本发明的抗体构建体。取决于有待回收的抗体,也可使用其他用于蛋白质纯化的技术,诸如在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上进行的色谱法、在肝素上进行的色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上进行的SEPHAROSETM色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀。在本发明的抗体构建体包含CH3结构域的情况下,Bakerbond ABX树脂(新泽西州菲利普斯堡的马林克罗特贝克有限公司(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)可用于纯化。
亲和色谱法是一种优选的纯化技术。亲和配体所连接的基质最常为琼脂糖,但其他基质也是可用的。在机械上稳定的基质诸如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许比用琼脂糖可以实现的更快的流速和更短的处理时间。
此外,本发明提供了一种药物组合物,该药物组合物包含本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体。对于本发明的药物组合物优选的是,抗体构建体的均质性≥80%,更优选≥81%、≥82%、≥83%、≥84%或≥85%,进一步优选≥86%、≥87%、≥88%、≥89%或≥90%,还进一步优选≥91%、≥92%、≥93%、≥94%或≥95%并且最优选≥96%、≥97%、≥98%或≥99%。
如本文使用的,术语“药物组合物”涉及适合施用至患者、优选人患者的组合物。本发明的特别优选的药物组合物包含优选治疗有效量的一种或多种本发明的抗体构建体。优选地,药物组合物进一步包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的合适配制品。组合物的可接受成分优选在所采用的剂量和浓度下是对接受者无毒性的。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
本发明组合物可以包含药学上可接受的载剂。一般来讲,如本文使用的,“药学上可接受的载剂”意指与药物施用、特别是肠胃外施用相容的任何和所有的水性和非水性溶液、无菌溶液、溶剂、缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液)、水、悬浮液、乳液(诸如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、脂质体、分散介质和包衣。此类介质和剂在药物组合物中的使用在本领域中是熟知的,并且包含此类载剂的组合物可以通过熟知的常规方法配制。
某些实施例提供了药物组合物,这些药物组合物包含本发明的抗体构建体和另外一种或多种赋形剂,诸如在本部分和本文其他地方说明性描述的那些赋形剂。在这方面,赋形剂在本发明中可用于多种目的,诸如调整配制品的物理、化学或生物特性,诸如调整粘度和/或本发明的方法以改善有效性和/或稳定此类配制品和方法,以防止由于例如在制造、运输、存储、使用前准备、施用和之后过程中发生的压力而导致的降解和腐坏。
在某些实施例中,药物组合物可以含有用于改变、保持或保存组合物的以下方面的目的的配制物质:例如pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附性或渗透性(参见REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明登氏药学全书],第18"版,(A.R.Genrmo编辑),1990,Mack Publishing Company[马克出版公司])。在此类实施例中,合适的配制物质可以包括但不限于:
·氨基酸,诸如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、脯氨酸、2-苯丙氨酸,包括带电荷的氨基酸,优选赖氨酸、乙酸赖氨酸、精氨酸、谷氨酸盐和/或组氨酸
·抗微生物剂,诸如抗细菌剂和抗真菌剂
·抗氧化剂,诸如抗坏血酸、甲硫氨酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠;
·缓冲液、缓冲系统和缓冲剂,用于将组合物保持在生理pH值或稍低的pH值,优选4.0至6.5的较低pH下;缓冲液的实例是硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸、琥珀酸盐、磷酸盐和组氨酸;例如约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液;
·非水性溶剂,诸如丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油和可注射用有机酯诸如油酸乙酯;
·水性载剂包括水、醇/水性溶液、乳剂或悬浮液,包括盐水和缓冲的介质;
·生物可降解聚合物,诸如聚酯;
·增积剂,诸如甘露醇或甘氨酸;
·螯合剂,诸如乙二胺四乙酸(EDTA);
·等渗剂和吸收延迟剂;
·络合剂,诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)
·填充剂;
·单糖、二糖和其他碳水化合物,(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精);碳水化合物可以是非还原糖,优选海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、山梨醇或木糖醇;
·(低分子量)蛋白质、多肽或蛋白质载剂,诸如人或牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白,优选是人来源的;
·着色剂和调味剂;
·含硫还原剂,诸如谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、[α]-一硫代甘油和硫代硫酸钠
·稀释剂;
·乳化剂;
·亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮)
·成盐抗衡离子,诸如钠;
·防腐剂,诸如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等;实例是:苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢);
·金属络合物,诸如Zn-蛋白质络合物;
·溶剂和共溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇);
·糖和糖醇,诸如海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、甘露醇、山梨醇或木糖醇水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌糖(myoinisitose)、半乳糖、乳糖醇、核糖醇、肌肉肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油、环多醇(例如肌醇)、聚乙二醇;和多元糖醇;
·悬浮剂;
·表面活性剂或润湿剂,诸如普朗尼克(pluronics)、PEG、脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、曲拉通(triton)、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal);表面活性剂可以是洗涤剂,优选分子量>1.2KD,和/或聚醚,优选分子量>3KD;优选洗涤剂的非限制性实例是吐温20、吐温40、吐温60、吐温80和吐温85;优选聚醚的非限制性实例是PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000和PEG 5000;
·稳定性增强剂,诸如蔗糖或山梨醇;
·张力增强剂,诸如碱金属卤化物,优选氯化钠或氯化钾、甘露醇山梨醇;
·肠胃外递送媒介物,包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油;
·静脉内递送媒介物,包括流体和营养补充物、电解质补充物(诸如基于林格氏右旋糖的那些)。
在本发明的背景下,优选是液体组合物或可以是通过冻干获得的固体组合物或可以是重构的液体组合物的药物组合物包含
(a)含有至少三个结构域的抗体构建体,其中:
·第一结构域与靶细胞表面抗原结合并且具有在4至9,5范围内的等电点(pI);
·第二结构域与第二抗原结合;并且具有在8至10、优选8.5至9.0范围内的pI;以及
·任选地第三结构域,该第三结构域包含两个多肽单体,每个多肽单体包含铰链、CH2结构域和CH3结构域,其中所述两个多肽单体经由肽接头彼此融合;
(b)至少一种缓冲剂;
(c)至少一种糖;以及
(d)至少一种表面活性剂;
并且其中该药物组合物的pH在3.5至6的范围内。
[24]在本发明的背景下进一步设想至少一种缓冲剂以5至200mM的浓度范围、更优选以10至50mM的浓度范围存在。在本发明的背景下设想至少一种糖选自下组,该组由以下组成:单糖、二糖、环状多糖、糖醇、线性支链葡聚糖或线性非支链葡聚糖。在本发明的背景下还设想二糖选自下组,该组由以下组成:蔗糖、海藻糖和甘露糖醇、山梨醇及其组合。在本发明的背景下进一步设想糖醇为山梨醇。在本发明的背景下设想至少一种糖以1%至15%(m/V)的浓度范围、优选以9%至12%(m/V)的浓度范围存在。
在本发明的背景下还设想至少一种表面活性剂选自下组,该组由以下组成:聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆188、普朗尼克F68、曲拉通X-100、聚氧乙烯(polyoxyethylen)、PEG 3350、PEG 4000及其组合。在本发明的背景下进一步设想至少一种表面活性剂以0.004%至0.5%(m/V)的浓度范围、优选以0.001%至0.01%(m/V)的范围存在。在本发明的背景下设想该组合物的pH在4.0至5.0的范围内,优选4.2。在本发明的背景下还设想该药物组合物具有在150至500mOsm范围内的渗透压。在本发明的背景下进一步设想该药物组合物进一步包含选自下组的赋形剂,该组由以下组成:一种或多种多元醇和一种或多种氨基酸。在本发明的背景下设想所述一种或多种赋形剂以0.1%至15%(w/V)的浓度范围存在。
在本发明的背景下还设想该药物组合物包含
(a)如上文论述的抗体构建体,
(b)10mM谷氨酸盐或乙酸盐,
(c)9%(m/V)蔗糖或6%(m/V)蔗糖和6%(m/V)羟丙基-β-环糊精,
(d)0.01%(m/V)聚山梨醇酯80
并且其中该液体药物组合物的pH为4.2。
在本发明的背景下进一步设想该抗体构建体以0.1至8mg/ml、优选0.2-2.5mg/ml、更优选0.25-1.0mg/ml的浓度范围存在。
对于本领域技术人员来说明显的是,例如,药物组合物的不同成分(例如,上文列出的那些)可以具有不同的效应,并且氨基酸可以充当缓冲液、稳定剂和/或抗氧化剂;甘露醇可以充当增积剂和/或张力增强剂;氯化钠可以充当递送媒介物和/或张力增强剂;等等。
设想除了本文定义的本发明的多肽之外,本发明的组合物可以包含另外的生物活性剂,这取决于组合物的预期用途。此类剂可以是作用于胃肠系统的药物、充当细胞抑制剂的药物、预防高尿酸血症的药物、抑制免疫反应的药物(例如皮质类固醇)、调节炎症应答的药物、作用于循环系统的药物和/或本领域中已知的剂诸如细胞因子。还设想将本发明的抗体构建体应用于共疗法中,即与另一种抗癌药物组合。
在某些实施例中,最佳药物组合物将由本领域技术人员根据例如预期施用途径、递送形式和所希望剂量来确定。参见,例如REMINGTON'S PHARMACEUTICALSCIENCES[雷明登氏药学全书],同上。在某些实施例中,此类组合物可以影响本发明的抗体构建体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。在某些实施例中,药物组合物中的主要媒介物或载剂本质上可以是水性的或非水性的。例如,合适的媒介物或载剂可以是注射用水、生理盐水溶液或人造脑脊液,可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常见的其他物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。在某些实施例中,本发明抗体构建体组合物可以通过将具有所希望纯度的选择成分与任选配制剂(REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明登氏药学全书],同上)以冻干饼或水性溶液的形式混合来制备用于储存。此外,在某些实施例中,可以使用合适的赋形剂(诸如蔗糖)将本发明的抗体构建体配制成冻干物。
当考虑肠胃外施用时,用于本发明的治疗组合物可以以无热原的肠胃外可接受的水性溶液的形式提供,该水性溶液包含在药学上可接受的媒介物中的本发明的所希望抗体构建体。用于肠胃外注射的特别合适的媒介物是无菌蒸馏水,其中将本发明的抗体构建体配制成适当保存的无菌等渗溶液。在某些实施例中,该制备可以涉及用可以提供产物(该产物可以经由储库注射来递送)的受控或持续释放的剂(诸如可注射微球体、生物可侵蚀颗粒、聚合物化合物(诸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体)配制所希望分子。在某些实施例中,也可以使用透明质酸,该透明质酸具有促进循环持续时间的作用。在某些实施例中,可植入药物递送装置可用于引入所希望的抗体构建体。
另外的药物组合物对于本领域技术人员将是明显的,包括涉及将本发明的抗体构建体制成持续或控制递送/释放配制品的配制品。用于配制各种其他持续或控制递送方式的技术(诸如脂质体载剂、生物可侵蚀微粒或多孔珠粒和储库注射)也是本领域技术人员已知的。参见,例如国际专利申请号PCT/US93/00829,其描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的控制释放。持续释放制剂可以包括呈成型制品(例如膜或微胶囊)形式的半透性聚合物基质。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯(如美国专利号3,773,919和欧洲专利申请公开号EP 058481中所披露)、L-谷氨酸和γ-L-谷氨酸乙酯的共聚物(Sidman等人,1983,Biopolymers[生物聚合物]2:547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人,1981,J.Biomed.Mater.Res.[生物医学材料研究杂志]15:167-277和Langer,1982,Chem.Tech.[化学技术]12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人,1981,同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公开号EP133,988)。持续释放组合物还可以包括可以通过本领域中已知的若干种方法中的任一种制备的脂质体。参见,例如Eppstein等人,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]82:3688-3692;欧洲专利申请公开号EP 036,676、EP 088,046和EP 143,949。
也可以将抗体构建体包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中,包埋在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包埋在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明登氏药学全书],第16版,Oslo,A.编辑,(1980)中。
用于体内施用的药物组合物典型地作为无菌制剂提供。灭菌可以通过无菌滤膜过滤完成。当组合物冻干时,可以在冻干和重构之前或之后进行使用该方法的灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或于溶液中储存。通常将肠胃外组合物置入具有无菌输液港的容器(例如具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)中。
本发明的另一方面包括自缓冲的本发明抗体构建体配制品,这些配制品可用作药物组合物,如国际专利申请WO 06138181 A2(PCT/US2006/022599)中所述。在这方面有用的蛋白质稳定和配制物质和方法,可以获得各种各样的说明,诸如Arakawa等人,“Solventinteractions in pharmaceutical formulations[药物配制品中的溶剂相互作用],”Pharm Res.[药物研究]8(3):285-91(1991);Kendrick等人,“Physical stabilization ofproteins in aqueous solution[水性溶液中蛋白质的物理稳定化]”在RATIONAL DESIGNOF STABLE PROTEIN FORMULATIONS:THEORY AND PRACTICE[稳定蛋白质配制品的合理设计:理论与实践]中,Carpenter和Manning编辑Pharmaceutical Biotechnology[药物生物技术]13:61-84(2002)和Randolph等人,“Surfactant-protein interactions[表面活性剂-蛋白质相互作用]”,Pharm Biotechnol.[药物生物技术]13:159-75(2002),特别参见关于根据本发明的自缓冲蛋白质配制品的相关赋形剂和方法的相关部分,尤其是关于用于兽医和/或人医学用途的蛋白质药物产品和方法。
根据本发明的某些实施例,可以使用盐以例如调整配制品的离子强度和/或等渗性和/或改善根据本发明的组合物的蛋白质或其他成分的溶解度和/或物理稳定性。众所周知,离子可以通过与蛋白质表面上的带电荷的残基结合并通过屏蔽蛋白质中的带电荷基团和极性基团并降低其静电相互作用、吸引和排斥相互作用的强度来稳定蛋白质的天然状态。离子还可以通过特别地与蛋白质的变性肽键(--CONH)结合来稳定蛋白质的变性状态。此外,与蛋白质中的带电荷基团和极性基团的离子相互作用还可以减少分子间静电相互作用,并且从而防止或减少蛋白质聚集和不溶解。
离子物种对蛋白质的作用显著不同。已经开发了多种对可用于配制根据本发明的药物组合物的离子及其对蛋白质的作用的分类评级。一个实例是Hofmeister系列,该系列通过对溶液中蛋白质的构象稳定性的作用来对离子和极性非离子溶质进行评级。稳定溶质称为“亲液的”。不稳定溶质称为“离液的”。通常使用高浓度的亲液剂(例如,>1摩尔硫酸铵)以从溶液中沉淀蛋白质(“盐析”)。通常使用离液剂来使蛋白质变性和/或溶解(“盐溶”)。离子对“盐溶”和“盐析”的相对有效性限定了其在Hofmeister系列中的位置。
根据本发明的各种实施例,游离氨基酸可用于本发明抗体构建体配制品中以作为增积剂、稳定剂和抗氧化剂以及其他标准用途。赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可用于稳定配制品中的蛋白质。甘氨酸可用于冻干以确保正确的饼结构和特性。在液体配制品和冻干配制品两者中,精氨酸均可用于抑制蛋白质聚集。蛋氨酸可用作抗氧化剂。
多元醇包括糖,例如甘露醇、蔗糖和山梨醇以及多元醇,诸如例如甘油和丙二醇,并且出于本文论述的目的,包括聚乙二醇(PEG)和相关物质。多元醇是亲液的。它们是液体配制品和冻干配制品两者中有用的稳定剂,以保护蛋白质免受物理和化学降解过程的影响。多元醇也可用于调整配制品的张力。在本发明的选择实施例中有用的多元醇是甘露醇,甘露醇通常用于确保在冻干配制品中饼的结构稳定性。它确保了饼的结构稳定性。它通常与冻干保护剂(例如蔗糖)一起使用。山梨醇和蔗糖是用于调整张力且作为稳定剂以防止在运输过程中的冷冻-解冻应力或防止在制造过程中制备团块的优选剂。还原糖(含有游离醛或酮基团),诸如葡萄糖和乳糖,可以使表面赖氨酸和精氨酸残基糖基化。因此,它们通常不是根据本发明使用的优选多元醇。此外,在这方面,形成此类反应性物质的糖也不是本发明优选的多元醇,该糖诸如蔗糖,蔗糖在酸性条件下水解为果糖和葡萄糖并因此产生糖基化。PEG可用于稳定蛋白质并用作冷冻保护剂,并且在这方面可以用于本发明。
本发明抗体构建体配制品的实施例进一步包含表面活性剂。蛋白质分子可易于吸附在表面上,并且变性以及随后在空气-液体、固体-液体和液体-液体界面处聚集。这些效应通常与蛋白质浓度成反比。这些有害的相互作用通常与蛋白质浓度成反比,并且典型地因物理振荡(诸如在产品运输和处理过程中产生的物理振荡)而加剧。常规使用表面活性剂来防止、最小化或减少表面吸附。在这方面,本发明中有用的表面活性剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱水山梨醇聚乙氧基化物的其他脂肪酸酯、以及泊洛沙姆188。表面活性剂也常用于控制蛋白质构象稳定性。在这方面使用表面活性剂是蛋白质特异性的,因为任何给定的表面活性剂典型地会稳定一些蛋白质并使其他蛋白质不稳定。
聚山梨醇酯易于氧化降解,并且通常在应时含有足够量的过氧化物以引起蛋白质残基侧链、尤其是甲硫氨酸的氧化。因此,应谨慎使用聚山梨醇酯,并且在使用时应以其最低有效浓度采用。在这方面,聚山梨醇酯例示了赋形剂应以其最低有效浓度使用的一般规则。
本发明抗体构建体配制品的实施例进一步包含一种或多种抗氧化剂。通过保持适当水平的环境氧气和温度并避免暴露于光下,可以在某种程度上防止药物配制品中蛋白质的有害氧化。也可以使用抗氧化赋形剂来防止蛋白质的氧化降解。在这方面,有用的抗氧化剂是还原剂、氧/自由基清除剂和螯合剂。用于根据本发明的治疗性蛋白质配制品中的抗氧化剂优选是水溶性的并且在整个产品的储存寿命内保持其活性。在这方面,EDTA是根据本发明的优选的抗氧化剂。抗氧化剂可以破坏蛋白质。例如,还原剂,诸如特别是谷胱甘肽,可以破坏分子内二硫键。因此,用于本发明的抗氧化剂尤其被选择用于消除或足够降低其本身破坏配制品中的蛋白质的可能性。
根据本发明的配制品可以包含金属离子,这些金属离子是蛋白质辅助因子并且是形成蛋白质配位络合物所必需的,诸如形成某些胰岛素悬浮液所必需的锌。金属离子也可以抑制一些降解蛋白质的过程。然而,金属离子也催化降解蛋白质的物理和化学过程。镁离子(10-120mM)可用于抑制天冬氨酸异构化为异天冬氨酸。Ca+2离子(高达100mM)可以增加人脱氧核糖核酸酶的稳定性。然而,Mg+2、Mn+2和Zn+2可以使重组人类脱氧核糖核酸酶(rhDNase)不稳定。类似地,Ca+2和Sr+2可以稳定因子VIII,它可以被Mg+2、Mn+2和Zn+2、Cu+2和Fe+2去稳定,并且其聚集可以由Al+3离子增加。
本发明抗体构建体配制品的实施例进一步包含一种或多种防腐剂。当开发涉及从同一容器提取超过一次的多剂量肠胃外配制品时,防腐剂是必需的。其主要功能是抑制微生物生长并确保在药物产品的整个储放寿命或使用期限内的产品无菌性。常用的防腐剂包括苯甲醇、苯酚和间甲酚。尽管防腐剂在小分子肠胃外使用方面有着悠久的历史,但包含防腐剂的蛋白质配制品的开发可能具有挑战性。防腐剂几乎总是对蛋白质具有不稳定效应(聚集),并且这已成为限制其在多剂量蛋白质制剂中使用的主要因素。迄今为止,大部分蛋白质药物仅配制用于一次性使用。然而,当多剂量配制品是可能时,它们具有使患者方便的附加优势和增加的可销售性。一个良好的实例是人生长激素(hGH),其中防腐配制品的开发已经导致更方便、多次使用的注射笔展示的商业化。至少四种含有hGH的防腐配制品的此类笔装置目前可在市场上获得。Norditropin(液体,诺和诺德公司(Novo Nordisk))、Nutropin AQ(液体,基因泰克公司(Genentech))和Genotropin(冻干的--双室药筒,法玛西亚普强公司(Pharmacia&Upjohn))含有苯酚,而Somatrope(礼来公司(Eli Lilly))用间-甲酚进行配制。在防腐剂型的配制和开发期间需要考虑若干个方面。必须优化药物产品中有效的防腐剂浓度。这需要以赋予抗微生物有效性而不损害蛋白质稳定性的浓度范围测试剂型中给定的防腐剂。
正如可以预期的那样,含有防腐剂的液体配制品的开发比冻干配制品更具挑战性。冷冻干燥的产品可以在没有防腐剂的情况下冻干,并且在使用时用含有防腐剂的稀释剂重构。这缩短了防腐剂与蛋白质接触的时间,从而显著最小化相关的稳定性风险。在液体配制品的情况下,应在整个产品储放寿命(约18至24个月)内保持防腐剂有效性和稳定性。要指出的重要点是,防腐剂有效性应在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终配制品中得到证实。
本文披露的抗体构建体也可以配制为免疫脂质体。“脂质体”是由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的小囊泡,该小囊泡可用于将药物递送至哺乳动物。脂质体的组分通常是以双层形式安排的,类似于生物膜的脂质安排。含有抗体构建体的脂质体是通过本领域已知的方法制备,诸如Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],82:3688(1985);Hwang等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],77:4030(1980);美国专利号4,485,045和4,544,545;以及W0 97/38731中所述。具有延长的循环时间的脂质体披露于美国专利号5,013,556中。特别有用的脂质体可以通过反相蒸发方法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。使脂质体挤出通过具有限定孔径的滤器以产生具有所希望的直径的脂质体。本发明的抗体构建体的Fab’片段可以与脂质体经由二硫键交换反应缀合,如Martin等人J.Biol.Chem.[生物化学杂志]257:286-288(1982)中所述。化学治疗剂任选地包含在脂质体内。参见Gabizon等人J.National Cancer Inst.[国家癌症研究所杂志]81(19)1484(1989)。
一旦配制了药物组合物,可以将它作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。此类配制品可以以即用形式或以在施用前重构的形式(例如冻干形式)储存。
本文定义的药物组合物的生物活性可以例如通过细胞毒性测定来确定,如在以下实例、WO 99/54440中或由Schlereth等人(Cancer Immunol.Immunother.[癌症免疫学免疫治疗]20(2005),1-12)所述的。如本文使用的,“功效”或“体内功效”是指使用例如标准化NCI应答标准对本发明的药物组合物治疗的应答。使用本发明的药物组合物的疗法的成功或体内功效是指组合物对于其预期用途的有效性,即组合物引起其所希望效应,即耗尽病理细胞(例如肿瘤细胞)的能力。体内功效可以通过已建立的对应疾病实体的标准方法进行监测,这些方法包括但不限于白细胞计数、差异、荧光激活细胞分选法、骨髓抽吸。另外,可以使用各种疾病特异性临床化学参数和其他建立的标准方法。此外,可以使用计算机辅助断层摄影术、X射线、核磁共振断层摄影术(例如,用于基于国家癌症研究所标准的应答评估[Cheson BD,Horning SJ,Coiffier B,Shipp MA,Fisher RI,Connors JM,Lister TA,VoseJ,Grillo-Lopez A,Hagenbeek A,Cabanillas F,Klippensten D,Hiddemann W,Castellino R,Harris NL,Armitage JO,Carter W,Hoppe R,Canellos GP.Report of aninternational workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin'slymphomas[标准化非霍奇金淋巴瘤应答标准的国际研讨会报告].NCI SponsoredInternational Working Group[NCI资助的国际工作组].J Clin Oncol.[临床肿瘤学杂志]1999年4月;17(4):1244])、正电子发射断层摄影术扫描、白细胞计数、差异、荧光激活细胞分选法、骨髓抽吸、淋巴结活组织检查/组织学和各种淋巴瘤特异性临床化学参数(例如乳酸盐脱氢酶)和其他已建立的标准方法。
开发药物(诸如本发明的药物组合物)的另一主要挑战是药代动力学特性的可预测调节。为此,可以建立候选药物的药代动力学曲线,即影响特定药物治疗给定病状的能力的药代动力学参数的曲线。影响药物治疗某一疾病实体的能力的药物的动力学参数包括但不限于:半衰期、分布体积、肝脏首过代谢和血清结合的程度。给定药物剂的功效可以受到上文提及的每个参数的影响。本发明的抗体构建体的设想特征提供有它们包含的特定FC模式,例如药代动力学行为的差异。根据本发明的半衰期延长的靶向抗体构建体与所述抗体构建体的“规范的”非HLE型式相比优选显示体内滞留时间令人惊讶地增加。
“半衰期”意指通过生物过程(例如代谢、排泄等)消除50%的施用药物的时间。“肝脏首过代谢”意指药物在首次与肝脏接触时,即在首次通过肝脏期间代谢的倾向。“分布体积”意指药物在身体各个隔室(例如细胞内和细胞外空间、组织和器官等)中的滞留程度,以及药物在这些隔室内的分布。“血清结合程度”意指药物与血清蛋白(诸如白蛋白)相互作用并结合从而导致药物生物活性降低或丧失的倾向。
药代动力学参数还包括对于施用的给定量药物的生物利用度、滞后时间(T滞后)、Tmax、吸收速率、起效时间和/或Cmax。“生物利用度”意指血液隔室中药物的量。“滞后时间”意指药物施用与其在血液或血浆中的检测和可测量性之间的时间延迟。“Tmax”是药物达到最大血液浓度之后的时间,并且“Cmax”是用给定药物最大获得的血液浓度。达到其生物效应所需的药物的血液或组织浓度的时间受到所有参数的影响。表现出跨物种特异性的双特异性抗体构建体的药代动力学参数(其可以在如上所概述的非黑猩猩灵长类动物的临床前动物测试中确定)也示于例如Schlereth等人(Cancer Immunol.Immunother.[癌症免疫学免疫治疗]20(2005),1-12)中。
在本发明的优选方面,药物组合物在约-20℃下稳定至少四周。从附加实施例中明显的,本发明的抗体构建体的质量相对于相应现有技术抗体构建体的质量可以使用不同的系统进行测试。这些测试被理解为符合“ICH Harmonised Tripartite Guideline:Stability Testing of Biotechnological/Biological Products Q5C andSpecifications:Test procedures and Acceptance Criteria for BiotechBiotechnological/Biological Products Q6B[ICH三方协调指南:生物技术/生物产品的稳定性测试Q5C和规格:生物技术/生物产品的测试程序和验收准则Q6B]”,并且因此被选择以提供稳定性指示曲线,从而确定检测到产品的属性、纯度和效力的变化。人们普遍接受术语纯度是相对术语。由于糖基化、脱酰胺或其他异质性的效应,生物技术/生物产品的绝对纯度典型地应通过超过一种的方法进行评估,并且所导出的纯度值取决于方法。出于稳定性测试的目的,纯度测试应集中在确定降解产物的方法上。
为了评估包含本发明的抗体构建体的药物组合物的质量,可以例如通过分析溶液中可溶性聚集物的含量(根据尺寸排除的HMWS)来分析。优选的是,在约-20℃下稳定至少四周的特征在于小于1.5%HMWS、优选小于1%HMWS的含量。
作为药物组合物的抗体构建体的优选配制品可以例如包含如下所述的配制品的组分:
·配制品:
磷酸钾、L-精氨酸盐酸盐、海藻糖二水合物、聚山梨醇酯80,在pH 6.0下
在所附实例4-12中提供了用于评估呈药物组合物形式的本发明的抗体构建体的稳定性的其他实例。在那些实例中,关于不同药物配制品中的不同应力条件测试本发明的抗体构建体的实施例,并且将结果与本领域已知的双特异性T细胞接合抗体构建体的其他半衰期延长(HLE)形式进行比较。一般来讲,设想与具有不同HLE形式和不具有任何HLE形式的抗体构建体(即“规范的”抗体构建体)相比,根据本发明的提供有特定FC模式的抗体构建体在宽范围的应力条件(诸如温度和光应力)下典型地更稳定。所述温度稳定性可以涉及降低的温度(低于室温,包括冷冻)和升高的温度(高于室温,包括高达或高于体温的温度)两者。正如本领域技术人员将会认识到,在临床实践中难以避免的这种关于应力的改善稳定性使得抗体构建体更安全,这是因为在临床实践中会出现较少的降解产物。结果,所述增加的稳定性意味着安全性增加。
一个实施例提供了本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体,用于在与MUC17表达或MUC17过表达相关的癌症,诸如前列腺癌的预防、治疗或缓解中使用。
本文所述的配制品可作为药物组合物用于在有需要的患者中治疗、缓解和/或预防如本文所述的病理医学病状。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施两者。治疗包括将配制品施用或施用至患有疾病/病症、具有疾病/病症的症状或具有患疾病/病症的倾向的患者的体内、分离的组织或细胞,目的是治愈、痊愈、缓和、减轻、改变、补救、缓解、改善或影响该疾病、该疾病症状或患该疾病的倾向。
如本文使用的,术语“缓解”是指通过将根据本发明的抗体构建体施用至有需要的受试者而对具有如下文所指定的疾病的患者的疾病状态的任何改善。这种改善也可以看作是患者疾病进展的减慢或停止。如本文使用的,术语“预防”意指通过将本发明的抗体构建体施用至有需要的受试者来避免患有如下文所指定的肿瘤或癌症或转移性癌症的患者发生或复发。
术语“疾病”是指将受益于用本文所述的抗体构建体或药物组合物治疗的任何病状。这包括慢性和急性病症或疾病,包括那些使哺乳动物易患所考虑疾病的病理状况。
“赘生物”是组织的异常生长,通常但不总是形成肿块。当也形成肿块时,通常称之为“肿瘤”。赘生物或肿瘤可以是良性的、潜在恶性的(癌前)、或恶性的。恶性赘生物通常称为癌症。它们通常侵入并破坏周围组织,并可能形成转移,即它们扩散到身体的其他部位、组织或器官。因此,术语“转移性癌症”涵盖转移到原始肿瘤的组织或器官除外的其他组织或器官。淋巴瘤和白血病是淋巴赘生物。出于本发明的目的,它们也被术语“肿瘤”或“癌症”涵盖。
术语“病毒性疾病”描述了作为受试者病毒感染的结果的疾病。
如本文使用的,术语“免疫学病症”描述了符合这个术语的常见定义的免疫学病症,诸如自体免疫疾病、超敏反应、免疫缺陷。
在一个实施例中,本发明提供了一种用于治疗或缓解与MUC17表达或MUC17过表达相关的癌症的方法,该方法包括向有需要的受试者施用本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体的步骤。MUC17xCD3双特异性单链抗体对于癌症、优选实体肿瘤、更优选癌和前列腺癌的疗法特别有利。
术语“有需要的受试者”或“需要治疗的那些”包括已经患有病症的那些以及有待预防病症的那些。有需要的受试者或“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。
本发明的抗体构建体通常将针对特定施用途径和方法、特定施用剂量和频率、特定疾病的特定治疗、生物利用度和持久性范围等来设计。组合物的物质优选以对于施用位点可接受的浓度配制。
因此可以根据本发明设计配制品和组合物以通过任何合适的施用途径递送。在本发明的背景下,施用途径包括但不限于
·局部途径(诸如表皮、吸入、鼻、眼、耳(auricular/aural)、阴道、粘膜);
·肠内途径(诸如口服、胃肠道、舌下、唇下部、经颊、直肠);以及
·肠胃外途径(诸如静脉内、动脉内、骨内、肌内、脑内、脑室内、硬膜外、鞘内、皮下、腹膜内、羊膜外、关节内、心内、真皮内、病灶内、子宫内、膀胱内、玻璃体内、经皮、鼻内、经粘膜、滑膜内、管腔内)。
本发明的药物组合物和抗体构建体特别可用于肠胃外施用,例如皮下或静脉内递送,例如通过注射诸如快速浓注,或通过输注诸如连续输注。药物组合物可以使用医疗装置来施用。用于施用药物组合物的医疗装置的实例描述于美国专利号4,475,196、4,439,196、4,447,224、4,447,233、4,486,194、4,487,603、4,596,556、4,790,824、4,941,880、5,064,413、5,312,335、5,312,335、5,383,851和5,399,163中。
特别地,本发明提供了合适的组合物的不间断施用。作为非限制性实例,可以通过患者佩戴的用于计量治疗剂进入患者体内的流入的小型泵系统来实现不间断或基本上不间断(即连续)的施用。包含本发明的抗体构建体的药物组合物可以通过使用所述泵系统施用。此类泵系统在本领域中通常是已知的,并且通常依赖于含有待输注的治疗剂的药筒的定期更换。当更换这种泵系统中的药筒时,可能导致原本不间断地流入患者体内的治疗剂的暂时中断。在这种情况下,药筒替换之前的施用阶段和药筒替换之后的施用阶段仍将被认为在药物手段的含义内,并且本发明的方法一起构成这种治疗剂的一次“不间断施用”。
本发明的抗体构建体的连续或不间断施用可以通过流体递送装置或小型泵系统进行静脉内或皮下施用,该流体递送装置或小型泵系统包括用于将流体驱出储器的流体驱动机构和用于致动驱动机构的致动机构。用于皮下施用的泵系统可以包括用于穿透患者皮肤并将合适的组合物递送到患者体内的针或套管。所述泵系统可以独立于静脉、动脉或血管而直接固定或连接到患者皮肤,从而允许泵系统与患者皮肤直接接触。泵系统可以连接到患者皮肤上24小时至数天。泵系统可能尺寸较小,具有小容积的储器。作为非限制性实例,待施用的合适的药物组合物的储器容积可以在0.1与50ml之间。
连续施用也可以通过佩戴在皮肤上的贴片经皮施用,并且以一定间隔进行更换。本领域技术人员知道适用于该目的的用于药物递送的贴片系统。值得注意的是,经皮施用尤其适合于不间断施用,因为第一用尽的贴片的更换可以有利地与在将新的第二贴片放置在例如紧邻第一用尽的贴片的皮肤表面上的同时并在即将移除第一耗尽的贴片之前来完成。不会出现流动中断或电池故障的问题。
如果药物组合物已被冻干,则在施用之前首先将冻干物质在适当液体中重构。可以将冻干物质在例如抑菌注射用水(BWFI)、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或与冷冻干燥前蛋白质所处于的相同配制品中重构。
本发明的组合物可以合适的剂量施用至受试者,该剂量可以例如通过向非黑猩猩灵长类动物(例如猕猴)施用增加剂量的表现出本文所述的种间特异性的本发明的抗体构建体通过剂量递增研究来确定。如上所述,表现出本文所述的种间特异性的本发明的抗体构建体可以有利地以相同形式用于非黑猩猩灵长类动物的临床前测试并且作为药物用于人类中。剂量方案将由主治医师和临床因素决定。如在医学领域中熟知的,任何一个患者的剂量取决于许多因素,包括患者体型、体表面积、年龄、有待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况和同时施用的其他药物。
术语“有效剂量(effective dose或effective dosage)”定义为足以实现或至少部分实现所希望效应的量。术语“治疗有效剂量”定义为足以治愈或至少部分阻止已罹患疾病的患者的疾病及其并发症的量。对此用途有效的量或剂量将取决于有待治疗的病状(适应症)、递送的抗体构建体、治疗背景和目标、疾病的严重程度、先前疗法、患者的临床病史和对治疗剂的应答、施用途径、患者的体型(体重、体表或器官大小)和/或病状(年龄和一般健康状况)以及患者自体免疫系统的一般状态。可以根据主治医生的判断调整适当的剂量,以使得它可以一次施用至患者或经一系列施用而施用至患者,并且以便获得最佳治疗效应。
根据上文提及的因素,典型的剂量范围可以为从约0.1μg/kg至高达约30mg/kg或更多。在具体的实施例中,剂量范围可以为从1.0μg/kg至约20mg/kg、任选地从10μg/kg至约10mg/kg或从100μg/kg至约5mg/kg。
本发明的抗体构建体的治疗有效量优选导致疾病症状严重程度降低、无疾病症状期的频率或持续时间增加或预防由于疾病折磨而产生的损害或残疾。为了治疗如上所述的与MUC17表达相关的疾病,治疗有效量的本发明的抗体构建体(此处:抗MUC17/抗CD3抗体构建体)相对于未治疗的患者优选抑制细胞生长或肿瘤生长达至少约20%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%或至少约90%。可以在预测功效的动物模型中评价化合物抑制肿瘤生长的能力。
药物组合物可以作为单独的治疗剂或与额外的疗法(诸如视需要的抗癌疗法,例如其他蛋白质和非蛋白质药物)组合施用。这些药物可以与包含如本文定义的本发明的抗体构建体的组合物同时施用,或者在施用所述抗体构建体之前或之后以时间限定间隔和剂量分开施用。
如本文使用的,术语“有效且无毒的剂量”是指本发明抗体构建体的可耐受剂量,该可耐受剂量足够高以引起病理性细胞消耗、肿瘤消除、肿瘤缩小或疾病稳定,而没有或基本上没有主要毒性效应。这种有效且无毒的剂量可以例如通过本领域中描述的剂量递增研究来确定,并且应低于诱导严重不利副作用的剂量(剂量限制毒性,DLT)。
如本文使用的,术语“毒性”是指在不良事件或严重不良事件中表现的药物的毒性效应。这些副作用可能是指施用后对药物缺乏全身性耐受性和/或缺乏局部耐受性。毒性还可能包括由药物引起的致畸或致癌效应。
如本文使用的,术语“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”定义了药物的施用而在施用后未立即诱导严重不良事件(局部耐受性)以及在药物的较长施用时段期间未诱导严重不良事件。例如,可以在治疗和随访期期间以有规律的间隔评价“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”。测量包括临床评价,例如器官表现,以及实验室异常的筛选。可以进行临床评价,并且根据NCI-CTC和/或MedDRA标准记录/编码与正常发现的偏差。器官表现可以包括诸如过敏/免疫学、血液/骨髓、心律失常、凝血等的标准,如例如不良事件的通用术语标准v3.0(CTCAE)中所述的。可以测试的实验室参数包括例如血液学、临床化学、凝血曲线和尿液分析以及其他体液(诸如血清、血浆、淋巴或脊髓液、液体等)的检查。因此安全性可以通过例如身体检查、成像技术(即超声波、x射线、CT扫描、磁共振成像(MRI)、其他具有技术装置的措施(即心电图术))、生命体征、通过测量实验室参数和记录不良事件来评估。例如,根据本发明的用途和方法中非黑猩猩灵长类动物中的不良事件可以通过组织病理学和/或组织化学方法进行检查。
上述术语也在以下中提及:例如Preclinical safety evaluation ofbiotechnology-derived pharmaceuticals S6[生物技术衍生药物的临床前安全性评价S6];ICH Harmonised Tripartite Guideline[ICH三方协调指南];ICH SteeringCommittee meeting on July 16,1997[1997年7月16日的ICH指导委员会会议]。
最后,本发明提供了一种试剂盒,该试剂盒包含本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体、本发明的药物组合物、本发明的多核苷酸、本发明的载体和/或本发明的宿主细胞。
在本发明的背景下,术语“试剂盒”意指两种或更多种组分(其中一种对应于本发明的抗体构建体、药物组合物、载体或宿主细胞)一起包装在容器、接受器或其他中。因此,试剂盒可以被描述为足以实现某一目标的一组产品和/或器具,其可以作为单一单元销售。
试剂盒可以包括一个或多个具有任何适当形状、大小和材料(优选防水的,例如塑料或玻璃)的接受器(诸如小瓶、安瓿、容器、注射器、小瓶、袋),该一个或多个接收器含有适于施用的剂量的本发明的抗体构建体或药物组合物(参见上文)。试剂盒可以另外含有使用说明(例如呈小册子或说明手册的形式)、用于施用本发明的抗体构建体的手段(诸如注射器、泵、输注器等)、用于重构本发明的抗体构建体的手段和/或用于稀释本发明的抗体构建体的手段。
本发明还提供了用于单剂量施用单元的试剂盒。本发明的试剂盒还可以含有包含干燥/冻干的抗体构建体的第一接受器和包含水性配制品的第二接受器。在本发明的某些实施例中,提供了含有单室和多室预填充注射器(例如液体注射器和冻干注射器)的试剂盒。
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应指出的是,除非上下文另有明确指明,否则单数形式“一种(a)”、“一种(an)”和以及“该”包括复数个指示物。因此,例如,对“一种试剂”的提及包括此类不同试剂中的一种或多种,并且对“该方法”的提及包括提及本领域普通技术人员已知的可以修改或取代本文所述的方法的等效步骤和方法。
除非另外指明,否则在一系列元素前面的术语“至少”应被理解为指该系列中的每一个元素。本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等效物。此类等效物旨在由本发明所涵盖。
术语“和/或”在本文使用时包括“和”、“或”和“由所述术语连接的要素的全部或任何其他组合”的含义。
如本文使用的,术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的20%内、优选在10%内,并且更优选在5%内。然而,它也包括明确数字,例如约20包括20。
术语“小于”或“大于”包括明确数字。例如,小于20意指小于或等于。类似地,多于或大于分别意指多于或等于、或大于或等于。
贯穿本说明书及其后的权利要求书,除非上下文另有要求,否则字词“包含(comprise)”以及变型诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应当被理解成隐含包括所陈述的整体或步骤或者整体或步骤的组,但不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤的组。当在本文中使用时,术语“包含(comprising)”可以用术语“含有”或“包括(including)”来取代,或者有时在本文中使用时用术语“具有”取代。
如本文使用的“由......组成”排除了在权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。如本文使用的,“基本上由......组成”并不排除不实质性地影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。
在本文的每种情况下,术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任一者都可以用另外两个术语中的任一者来替环。
应理解,本发明不限于本文所述的特定方法、方案、材料、试剂和物质等,并且因此可以变化。本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的,而不打算限制仅由权利要求限定的本发明的范围。
本说明书全文中引用的所有出版物和专利(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等),无论是上文还是下文,均据此通过引用整体并入。本文没有任何内容应解释为承认本发明无权由于先前发明而早于这些披露内容。通过引用并入的材料在一定程度上与本说明书发生冲突或不一致时,本说明书将替代任何此类材料。
将从以下实例中获得对本发明及其优点的更好理解,这些实例仅用于说明目的。这些实例并不打算以任何方式限制本发明的范围。
实例
实例1:对MUC17细胞表面表达的评价。
使用QIFIkit(达科公司(Dako))通过流式细胞术确定MUC17的细胞表面水平。使用非酶促细胞解离缓冲液(Cellstripper,康宁公司(Corning))提取贴壁细胞,并且然后用抗MUC17抗体4C11染色。4C11抗体是用包含MUC17的EGF-SEA-EGF区(aa 4131-4493)的DNA构建体免疫B6小鼠而产生的单克隆抗体。通过与缀合至FITC的二抗一起孵育并通过流式细胞术分析来检测MUC17。使用试剂盒中提供的珠粒样品作为标准品,通过QIFIkit(达科公司)确定相对抗体结合能力。将结果描绘于图3(A)中。癌细胞系中的MUC17基因表达水平通过定量聚合酶链式反应(qPCR)使用来自应用生物系统公司(Applied Biosystems)/赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher)的方法和探针测定。从癌细胞系中分离RNA,并且然后转录至cDNA。使用qPCR,用MUC17特异性探针扩增MUC17 cDNA。将MUC17的基因表达水平标准化为组成型表达基因的基因表达水平并且描绘于图3(B)中。
实例2:对MUC17双特异性抗体构建体体外功效的评价
在T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定中评价MUC17 HLE抗体构建体的细胞活性。效应细胞获得自商业来源,诸如澳赛尔斯公司(AllCells)或Cepheus Biosciences有限公司。在一定剂量范围的抗体构建体存在下将人pan-T细胞、人PBMC或来自食蟹猴的PBMC以10:1或5:1与表达人或食蟹猴MUC17的靶细胞一起温育。孵育48h后,使用发光测定(Cell T-glo或Steady-glo(普洛麦格公司(Promega)))或高内涵成像(Cellomics ArrayScan)作为细胞的细胞毒性的读取来评估细胞的细胞毒性。将结果描绘于图4和图5中。
实例3:用于评价MUC17双特异性抗体构建体的体内功效的异种移植研究
异种移植物研究的目的是在雌性NOD/SCID小鼠中的人胃癌的晚期皮下GSU-luc异种移植模型中评估半衰期延长的MUC17/CD3双特异性抗体构建体静脉内施用后的抗肿瘤活性。
用于接种的靶细胞和效应细胞的制备
靶细胞:
将用载体LV417-Luc慢病毒转导以稳定表达萤火虫荧光素酶(GSU-luc)的人胃癌细胞GSU收获、离心、用冷DPBS洗涤、计数并调整至5×107个细胞/mL的浓度。将总共5×106个细胞/小鼠皮下(SC)注射到雌性NOD/SCID小鼠(供应商:Envigo公司)的右背侧中,最终体积为100μL。
效应细胞:
从健康供体(#0801)的新鲜血液中分离人T细胞,使用Pan T细胞分离试剂盒(#130-096-535)针对CD3+T细胞进行富集,并且使用人T细胞激活/扩增试剂盒(#130-091-441,两者均为美天旎公司(Miltenyi Biotec))根据制造商的说明书进行体外激活和扩增。
在注射当天,对T细胞进行计数、从珠粒分离并用冷DPBS洗涤2次。将细胞数调整至1×108个细胞/mL并储存在冰上直至注射。将总共2×107个细胞/小鼠注射到腹膜腔(IP)中,最终体积为200μL。在注射之前将细胞储存在冰上。实验设计
通过静脉内(IV)快速浓注(进入尾静脉)使动物接受MUC17双特异性抗体构建体或对照项。根据表4治疗小鼠。
表4研究设计功效研究
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研究顺序:
第1天:将肿瘤细胞(GSU-luc)皮下注射到雌性NOD/Scid小鼠的右侧背侧中(参见上文)。研究开始时动物为6周龄。
第7天:抗唾液酸治疗。
为了耗尽剩余的NK细胞/NK细胞活性,用单剂量的多克隆(兔抗小鼠)抗脱唾液酸GM1抗体治疗小鼠。根据制造商的说明书重构抗脱唾液酸GM1抗体,并且将50μl用蒸馏H2O的1:2.5稀释液IV注射到侧尾静脉中。
第8天:将CD3+T细胞注射到小鼠的腹膜腔中(参见上文)。
第11、18和25天:FcR阻断。
使测试项的Fc区突变以防止与Fcγ-受体结合。然而,由于NOD/Scid小鼠缺乏B细胞,导致免疫球蛋白水平低,因此进行FcR阻断以避免抗体依赖性细胞介导的细胞毒性导致CD3+效应细胞的潜在减少。在第11、18和25天,通过腹膜内快速浓注使小鼠接受2.4G2抗FcγR抗体(8mg/kg)和Kiovig(400mg/kg)的混合物,每次注射每只小鼠最终体积为200μl。
第12、19和26天:用测试项或对照项治疗(参见表4)。
根据表4,在第12、19和26天通过静脉内(IV)快速浓注到侧尾静脉中使动物接受测试项(MUC17/CD3双特异性抗体构建体)或对照项(媒介物)。每次注射,将剂量体积保持恒定至每只小鼠总共100μl。
将测试项以1.04mg/ml的原液浓度配制在10mM L-谷氨酸、9%(w/v)蔗糖、0.01%(w/v)PS80;pH 4.2中,并且根据最近确定的组平均体重(BW)在媒介物(在0.9%(w/v)氯化钠pH 7.0中的25mM L-赖氨酸单盐酸盐、0.002%(w/v)聚山梨醇酯80)中稀释。剂量浓度(c)使用下式计算:
第33天:研究结束
实验研究和计算。
在研究过程中,每天观察所有动物的一般外观、活动、行为和存活。所有发现和评论均在研究文件的相应表格中注明。在整个研究过程中每周测定体重3次。通过使用外部卡尺测量肿瘤高度和宽度来确定肿瘤生长的进展。每周测定肿瘤生长3次并且使用下式计算肿瘤体积(TV):其中宽度定义为两个测量值中较小者并且高度定义为两个测量值中较大者。
所有测量的原始数据都下载到计算机并自动导入VIVO Manager软件以进行进一步的数据管理。不是由VIVO计算程序计算的值是使用MS Excel电子表格程序或针对Windows的GraphPad Prism计算的。
将图形结果在图6中表示为组平均值±平均值的标准误差。通过单因素方差分析(ANOVA)分析数据,并且通过Dunnett的事后检验评估肿瘤生长的实验结果的差异,以与对照组2进行比较。
通过将第n天的组平均肿瘤体积除以治疗开始前一天(第11天)的组平均肿瘤体积来计算相对肿瘤体积(RTV)。
根据下式定量针对第20天(即对照组中的所有动物存活时的最后一天)的肿瘤生长抑制:
结果
当与对照组2中的媒介物治疗的小鼠相比时,用MUC17/CD3双特异性抗体构建体(测试项:SEQ ID NO:186)静脉内治疗携带GSU-luc肿瘤的小鼠导致统计学上显著且剂量依赖性的肿瘤生长抑制。在第12天开始治疗后,在第18天和第20天实现p<0.01(在0.25mg/kg下)或p<0.001(在2.5mg/kg下)的值。由于对照组中的大多数动物(6/10)必须终止,因此在第20天后未进行统计学分析。在第20天观察到的肿瘤生长抑制为24%(0.025mg/kg)、58%(0.25mg/kg)和77%(2.5mg/kg)。第20天的相对肿瘤体积(RTV)的比较显示,虽然在媒介物治疗的小鼠中生长的肿瘤相对于治疗开始前一天体积平均大4.2倍,但是测试项治疗的组中的RTV是3.4(0.025mg/kg),2.4(0.25mg/kg)和1.0(2.5mg/kg)。在以2.5mg/kg治疗后,RTV<2.0直至第29天。
两种载体治疗的对照组的比较显示,在不存在测试项下,T细胞对GSU-luc细胞的生长没有影响。由于小鼠是非相关物种,因此测试项耐受性良好,并且既未预期也未观察到与药物相关的不良事件。
总结:以2.5或0.25mg/kg静脉内施用根据本发明的双特异性抗体构建体(测试项SEQ ID NO:186)导致雌性NOD/Scid小鼠中皮下GSU-luc肿瘤生长的统计学上显著且剂量依赖性抑制。
实例4:在食蟹猴中的探究性毒理学研究
在食蟹猴中的探究性毒理学研究中评价了MUC17 HLE BiTE抗体构建体(SEQ ID:186,构建体8-B7)。在研究的第1天和第8天通过静脉内注射向三只猴施用100μg/kg或1000μg/kg的MUC17 scFc双特异性抗体构建体。MUC17 scFc双特异性抗体构建体(SEQ ID NO186)在两种剂量下均具有良好的耐受性,没有相关的临床体征或体重变化。在100μg/kg和1000μg/kg下记录到体温的瞬时增加。在来自用MUC17scFc双特异性抗体构建体治疗的猴的血液样品中观察到MUC17 scFc双特异性抗体构建体活性(淋巴细胞再分布、嗜中性粒细胞和单核细胞增加、c-反应蛋白增加、细胞因子轻微增加)的一些标志。尽管免疫组织化学确认了在从本探究性毒理学研究中评价的猴取样的小肠的顶端表面上的MUC17表达,但在表达MUC17的组织中没有组织病理学变化。
MUC17 scFc双特异性抗体构建体在食蟹猴中的毒代动力学参数
在取自在探究性毒理学研究中评价的猴的血液样品中评价MUC17 scFc双特异性抗体构建体(SEQ ID NO 186)的毒代动力学参数。在给药前和每次给药后0.083、4、8、24、48、96和168小时收集血液样品。通过免疫测定来确定MUC17 scFc双特异性抗体构建体的血清浓度,使用针对MUC17的钌化鼠类抗人IgG Fc 1.35.1mAb捕获抗体构建体并且使用针对Fc部分的抗体检测构建体。在第一次给药后分析的所有时间点检测MUC17 scFc双特异性抗体构建体的血清水平。将数据拟合至两室模型。图8(B)示出了单个数据(点)和平均值(线)。评估了若干个药代动力学参数,包括全身清除率(CL)、隔室间清除率(Q)、中央隔室的血清体积/体积(Vp)、组织隔室的组织体积/体积(Vt)、终末半衰期(t1/2),以及对于第二剂量1000mcg/kg剂量的平均最大浓度(Cmax)和血清浓度-时间下面积(AUCinf)。
实例5:正常肠细胞中的T细胞依赖性细胞毒性测定
为了进一步检验MUC17定位于人和食蟹猴的正常肠细胞顶端表面不易于为MUC17scFc双特异性抗体构建体(SEQ ID NO 186)的细胞毒活性所接近的观点,在体外正常细胞中评价MUC17表达和MUC17 scFc双特异性抗体构建体活性。通过荧光激活细胞分选法评估MUC17细胞表面表达。在T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定中评价MUC17 scFc双特异性抗体构建体的细胞毒活性,其中将MUC17 scFc双特异性抗体构建体与MUC17阳性靶细胞和人或猴效应细胞(即T细胞或外周血单核细胞)一起孵育并且然后评估细胞的存活力。最初使用标准二维细胞培养测试这些实验。然而,为了更好地观察MUC17向顶端表面的定位,以保持上皮细胞极性的方式(诸如在细胞外基质上或在有机体培养物中生长)培养正常细胞。MUC17 scFc双特异性抗体构建体相对于正常,即非癌肠细胞没有显示出显著增加的TDCC。
表5:序列表
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Claims (25)
1.一种双特异性抗体构建体,该双特异性抗体构建体包含:
·第一结构域,该第一结构域与MUC17结合,以及
·第二结构域,该第二结构域与人和猕猴CD3ε链的细胞外表位结合,
其中所述第一结构域包含VH区域和VL区域,所述VH区域包含SEQ ID NO.176所示的CDR-H1、SEQ ID NO.177所示的CDR-H2和SEQ ID NO.178所示的CDR-H3;所述VL区域包含SEQID NO.179所示的CDR-L1、SEQ ID NO.180所示的CDR-L2和SEQ ID NO.181所示的CDR-L3。
2.如权利要求1所述的双特异性抗体构建体,该双特异性抗体构建体进一步包含第三结构域,该第三结构域包含两个多肽单体,每个多肽单体包含铰链、CH2结构域和CH3结构域,其中所述两个多肽单体经由肽接头彼此融合。
3.如权利要求1或2所述的双特异性抗体构建体,其中该抗体构建体是单链抗体构建体。
4.根据权利要求1或2所述的双特异性抗体构建体,其中该第一结合结构域包含
SEQ ID NO.183所示的VL区和SEQ ID NO.182所示的VH区。
5.根据权利要求3所述的双特异性抗体构建体,其中该第一结合结构域包含SEQ IDNO.183所示的VL区和SEQ ID NO.182所示的VH区。
6.根据权利要求1-2和5中任一项所述的双特异性抗体构建体,其中该抗体构建体包含SEQ ID NO:184所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求3所述的双特异性抗体构建体,其中该抗体构建体包含SEQ ID NO:184所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求4所述的双特异性抗体构建体,其中该抗体构建体包含SEQ ID NO:184所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求1-2、5和7-8中任一项所述的双特异性抗体构建体,其中该抗体构建体按氨基至羧基顺序包含:
(a)该第一结构域,该第一结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:184;
(b)肽接头,该肽接头的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:1-3组成的组;
(c)该第二结构域,该第二结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示或选自下组:WO2008/119567的SEQ ID NO:23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187。
10.根据权利要求3所述的双特异性抗体构建体,其中该抗体构建体按氨基至羧基顺序包含:
(a)该第一结构域,该第一结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:184;
(b)肽接头,该肽接头的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:1-3组成的组;
(c)该第二结构域,该第二结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示或选自下组:WO2008/119567的SEQ ID NO:23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187。
11.根据权利要求4所述的双特异性抗体构建体,其中该抗体构建体按氨基至羧基顺序包含:
(a)该第一结构域,该第一结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:184;
(b)肽接头,该肽接头的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:1-3组成的组;
(c)该第二结构域,该第二结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示或选自下组:WO2008/119567的SEQ ID NO:23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187。
12.根据权利要求6所述的双特异性抗体构建体,其中该抗体构建体按氨基至羧基顺序包含:
(a)该第一结构域,该第一结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:184;
(b)肽接头,该肽接头的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:1-3组成的组;
(c)该第二结构域,该第二结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示或选自下组:WO2008/119567的SEQ ID NO:23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187。
13.根据权利要求9所述的双特异性抗体构建体,其中该抗体构建体按氨基至羧基顺序进一步包含:
(d)肽接头,该肽接头的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、2、3、9、10、11和12;
(e)该第三结构域的该第一多肽单体,该第一多肽单体的多肽序列选自SEQ ID NO:17-24;
(f)肽接头,该肽接头的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:5、6、7和8组成的组的氨基酸序列;
(g)该第三结构域的该第二多肽单体,该第二多肽单体的多肽序列选自由SEQ ID NO:17-24组成的组。
14.根据权利要求10-12中任一项所述的双特异性抗体构建体,其中该抗体构建体按氨基至羧基顺序进一步包含:
(d)肽接头,该肽接头的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、2、3、9、10、11和12;
(e)该第三结构域的该第一多肽单体,该第一多肽单体的多肽序列选自SEQ ID NO:17-24;
(f)肽接头,该肽接头的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:5、6、7和8组成的组的氨基酸序列;
(g)该第三结构域的该第二多肽单体,该第二多肽单体的多肽序列选自由SEQ ID NO:17-24组成的组。
15.根据权利要求1-2、5、7-8和10-13中任一项所述的双特异性抗体构建体,该双特异性抗体构建体的氨基酸序列选自由以下组成的组:
SEQ ID NO:185和186。
16.根据权利要求3所述的双特异性抗体构建体,该双特异性抗体构建体的氨基酸序列选自由以下组成的组:
SEQ ID NO:185和186。
17.根据权利要求4所述的双特异性抗体构建体,该双特异性抗体构建体的氨基酸序列选自由以下组成的组:
SEQ ID NO:185和186。
18.根据权利要求6所述的双特异性抗体构建体,该双特异性抗体构建体的氨基酸序列选自由以下组成的组:
SEQ ID NO:185和186。
19.根据权利要求9所述的双特异性抗体构建体,该双特异性抗体构建体的氨基酸序列选自由以下组成的组:
SEQ ID NO:185和186。
20.根据权利要求14所述的双特异性抗体构建体,该双特异性抗体构建体的氨基酸序列选自由以下组成的组:
SEQ ID NO:185和186。
21.一种多核苷酸,该多核苷酸编码如权利要求1-20中任一项中所定义的双特异性抗体构建体。
22.一种药物组合物,该药物组合物包含根据权利要求1至20中任一项所述的双特异性抗体构建体。
23.权利要求1至20中任一项所述的双特异性抗体构建体或权利要求22所述的药物组合物在制备用于治疗或缓解有需要的受试者中的选自胃肠癌、胃癌和胰腺癌的疾病的药物中的用途。
24.根据权利要求23所述的用途,其中该疾病是胃肠癌或胰腺癌。
25.根据权利要求23所述的用途,其中该疾病是胃癌。
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