CN114829408B - 用于免疫治疗的t细胞双特异性抗体生产中的优化抗cd3臂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了新型CD3抗原结合片段，其具有特别有利的特性，例如可生产性、稳定性、结合亲和力、生物学活性、特定T细胞的特异性靶向、靶向效率、剩余肿瘤细胞杀伤和降低的毒性。本发明还提供了用于激活T细胞的双特异性抗原结合分子。另外，本发明进一步提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法，这些方法包括向受试者施用包含上文所述双特异性抗原结合分子的药物组合物。
Description
本申请要求于2019年12月20日提交的题为“用于免疫治疗的T细胞双特异性抗体生产中的优化抗CD3臂(Optimized anti-CD3 arm in the generation of T-cellbispecific antibodies for immunotherapy)”的美国临时专利申请No.62/974,744和于2020年4月30日提交的题为“用于免疫治疗的T细胞双特异性抗体生产中的优化抗CD3臂(Optimized anti-CD3 arm in the generation of T-cell bispecific antibodies forimmunotherapy)”的美国临时专利申请No.63/017,999的权益；每个申请的内容通过全文引用的方式并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及用于激活T细胞的双特异性抗原结合分子。此外，本发明还涉及编码此类CD3结合片段和双特异性抗原结合分子的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还涉及用于产生本发明的双特异性抗原结合分子的方法。本发明进一步涉及治疗有需要的受试者的癌症的方法。
背景技术
近年来，利用T细胞特异性抗体的免疫疗法已经使癌症治疗发生了革命性巨变。这些双特异性抗体会募集和重定向T细胞以攻击肿瘤细胞，并且在治疗血液癌和实体癌方面具有巨大潜力(Labrijn AF,Janmaat ML,Reichert JM,Parren PWHI.Bispecificantibodies:a mechanistic review of the pipeline[双特异性抗体：管线机制综述].Nature Reviews Drug Discovery[自然综述：药物发现]2019；18)。针对实体瘤的双特异性药物的开发存在几个挑战，包括结合亲和力、效力、组织分布和毒性。高亲和力的CD3抗体可以促进细胞裂解突触形成增加，从而增强肿瘤细胞的清除。早前的文献已经提出了毒性方面的担忧和T细胞衔接器双特异性抗体驱动的多克隆T细胞激活引起的致命性细胞因子释放综合征(CRS)。CRS被认为是由于免疫细胞过度激活导致的，所述过度激活超出某个临界点使得这些免疫细胞不再能够自给自足。由于细胞因子释放与T细胞激活密切相关，在T细胞依赖性双特异性抗体的背景下，高亲和力的CD3结合导致高细胞因子释放。另一方面，一些证据表明，高CD3结合亲和力会损害双特异性抗体的肿瘤抗原依赖性组织分布，并增加双特异性抗体在T细胞区室中的积累。因此，挑战在于通过操纵抗CD3臂的亲和力来找到效力与毒性之间的最佳平衡。
CEA是一种分子量为约180kD的细胞表面糖蛋白，已被广泛用作胃肠癌的临床生物标志物。CEA的过表达已在以下中观察到：90％的胃肠恶性肿瘤，这些胃肠恶性肿瘤包括结肠肿瘤、胃肿瘤、直肠肿瘤和胰腺肿瘤；70％的肺癌；约30％-50％的乳腺癌；和头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。提出CEA的异位表达可促进上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞(例如白细胞和树突细胞)中的肿瘤形成。在几种肿瘤类型上的高表达(但在非恶性原发组织上的表达相对较低)使CEA成为治疗性抗体的理想靶标。在罗氏(Roche)的RG7802(CEA-TCB)双特异性抗体的1期临床试验中，45％的患者在超过60mg的单一疗法治疗时表现出疾病的部分缓解或疾病稳定(Tabernero J,Melero I,Ros W,Argiles G,Marabelle A,Rodriguez-Ruiz ME,Albanell J,Calvo E,Moreno V,Cleary JM等人,Phase Ia and Ib studies of thenovel carcinoembryonic antigen(CEA)T-cell bispecific(CEACD3 TCB)antibody as asingle agent and in combination with atezolizumab:Preliminary efficacy andsafety in patients with metastatic colorectal cancer(mCRC)[新型癌胚抗原(CEA)T细胞双特异性(CEACD3 TCB)抗体作为单一药剂和与阿特珠单抗联用的Ia期和Ib期研究：在转移性结直肠癌(mCRC)患者中的初步功效和安全性].Journal of Clinical Oncology[临床肿瘤学杂志]2017；35)。然而，罗氏的RG7802(CEA-TCB)仍然存在许多缺点，例如患者应答低，同时会诱导高细胞因子释放综合征。
为了满足广泛的临床需求，本发明提供了经优化的抗CD3抗体(其具有减少的与T细胞上的CD3的结合)，和具有经优化的抗CD3臂的新型双特异性形式(其显示出与肿瘤抗原的二价结合和与CD3的功能性单价结合)。
发明内容
本发明提供了新型CD3抗原结合片段，其具有特别有利的特性，例如可生产性、稳定性、结合亲和力、生物学活性、对某些T细胞的特异性靶向、靶向效率、剩余(remaining)肿瘤细胞杀伤和降低的毒性。本发明还提供了用于激活T细胞的双特异性抗原结合分子。另外，本发明进一步提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法，这些方法包括向受试者施用包含以上所述双特异性抗原结合分子的药物组合物。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。在以下具体实施方式中以实施例和样品展示的方式进行了解释，可以更好地理解本发明的特征和优点。
图1示出了CEA/CD3双特异性抗体结构的图示。抗CD3序列与抗CEA轻链的C末端连接。该抗CD3序列包含关键的点突变，这些点突变消除了Fc受体(FcγR、FcR)的结合，从而消除了抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)效应。
图2A示出了CEA/CD3亲本BsAb介导激活的PBMC产生的对表达CEA的LS-174T肿瘤细胞的细胞毒性。图2B示出了CEA/CD3亲本BsAb介导激活的PBMC产生的对表达CEA的LoVo肿瘤细胞的细胞毒性。图2C示出了LS-174T、LoVo、和HEK细胞的CEA表达水平。
图3A示出了CEA/CD3亲本BsAb介导新鲜分离的PBMC杀死表达CEA的HPAC靶细胞。图3B示出了CEA/CD3亲本BsAb介导新鲜分离的PBMC杀死表达CEA的KATO III靶细胞，而在阴性的HEK 293细胞中几乎没有观察到细胞裂解。
图4A示出了CEA/CD3亲本BsAb诱导的高水平的IFN-γ细胞因子释放。图4B示出了CEA/CD3亲本BsAb诱导的高水平的IFN-γ细胞因子释放。
图5A和5B示出了对突变的CD3结合物变体的结合的评估。CD3OPT变体的结合亲和力通过Jurkat细胞和PBMC用流式细胞术进行了评估。
图6示出了CD3结合物中的突变对与食蟹猴CD3的交叉反应性无影响。
图7A、7B和7C示出了CEA/CD3 BsAb变体介导的以表达CEA方式的NFAT信号传导。NFAT活性反映了T细胞的活性。
图8A示出了具有不同结合亲和力的CD3结合物变体对LS-174T细胞的裂解活性。图8B示出了具有不同结合亲和力的CD3结合物变体(CD3臂)对H929细胞的裂解活性。
图9A示出了LS-174T和KATO III细胞的CEA表达水平。图9B示出了在本发明的CD3结合物变体存在的情况下PBMC对KATO III肿瘤细胞的裂解。
图10A示出了本发明的CEA/CD3 BsAb变体与PBMC和LS-174T细胞一起培养时可诱导IFN-γ细胞因子释放。图10B示出了CEA/CD3 BsAb变体与PBMC和LS-174T细胞一起培养时可诱导TNF-α细胞因子释放。图10C示出了CEA/CD3 BsAb变体与PBMC和LS-174T细胞一起培养时可诱导IL-2细胞因子释放。
图11A示出了本发明的CEA/CD3 BsAb变体诱导IFN-γ细胞因子释放。图11B示出了这些CEA/CD3 BsAb变体诱导TNF-α细胞因子释放。
图12A-图12X示出了对CEA/CD3-OPT1a3b2b1 BsAb的结合特异性和组织交叉反应性的评估。用CEA/CD3-1a3b2b1-BsAb(也参见图12A-12X中的CEA/CD3-v2)(图12A、图12D、图12G)、对照抗CEAmAb(图12B、图12E、图12H)、或同型对照BsAb(图12C、图12F、图12I)对一组正常人组织(LS-174细胞，图12A-图12C)和癌组织(CRC IV期肿瘤细胞，图12D-图12F，和CRCIII期肿瘤细胞，图12G-图12I)进行染色并通过免疫组织化学(IHC)技术进行研究。表达CEA的LS-174细胞(图12A)、CRC IV期肿瘤细胞(图12D)和CRC III期肿瘤细胞(图12G)显示出明显的(+4级)CEA/CD3-OPT1a3b2b1 BsAb(也参见图12A-12X中的CEA/CD3-v2)以及对照抗CEAmAb(图12B、图12E和图12H)染色。同型对照BsAb(图12C、图12F、和图12I)染色切片中未发现特异性染色。正常人结肠、乳腺、肺、前列腺、肝、卵巢和脑组织未显示出与所测试的CEA/CD3-1a3b2b1 BsAb和对照抗体的任何脱靶反应性(图12J-图12X)。
图13示出了罗氏CEA-TCB和CEA/CD3双特异性抗体形式的示意图。CEA-TCB使用不对称的2比1(2-to-1)分子形式。相比之下，绿叶(Luye)CEA/CD3双特异性抗体使用对称的四价双特异性(TetraBi)抗体形式。
图14A-图14D示出了罗氏CEA-TCB和CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb的结合亲和力的比较。
图14A示出了罗氏CEA-TCB和CEA/CD3 OPT1a3b2b1 BsAb(又称为先导CEA/CD3(Lead CEA/CD3))与人PBMC的结合。图14B示出了罗氏CEA-TCB和CEA/CD3 OPT1a3b2b1 BsAb与Jurkat细胞的结合。将细胞用连续稀释的罗氏CEA-TCB和CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb或IgG对照染色，然后用缀合有PE的抗人IgG ab染色。通过流式细胞术确定平均荧光强度(MFI)。图14C示出了罗氏CEA-TCB和CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb与表达CEA的MKN-45细胞的结合。图14D示出了罗氏CEA-TCB和CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb与表达CEA的LS-174T细胞的结合。将细胞用连续稀释的罗氏CEA-TCB和CEA/CD3OPT1a3b2b1BsAb或IgG对照染色，然后用缀合有PE的抗人IgG Ab染色。通过流式细胞术确定平均荧光强度(MFI)。
图15A示出了罗氏CEA-TCB和CEA/CD3 OPT1a3b2b1 BsAb(又称为先导CEA/CD3)激活的T细胞对MKN-45肿瘤细胞的抗肿瘤作用。对MKN-45靶细胞进行收获、计数、并接种在96孔板中。将效应物PBMC以在RPMI1640中20:1的比例添加至每个孔。在PRMI1640培养基中进行所指示抗体的连续稀释并添加至含有靶标/效应物的孔中。将板孵育48小时，并测定荧光素酶强度。图15B至图15F：收集来自MKN-45和PBMC的共培养物的上清液，并通过ELISA测定对INF-γ(图15B)、TNF-α(图15C)、IL-2(图15D)、IL-6(图15E)、和IL-10(图15F)进行确定。
图16示出了在CEA/CD3-OPT1a3b2b1 BsAb存在的情况下(与罗氏CEA-TCB存在的情况下进行比较)基于对不同E/T比率下针对表达CEA的靶细胞的杀伤活性进行测试的杀伤测定而进行的E/T比率对杀伤效力影响的评估。将新鲜分离的PBMC与转染荧光素酶的LS-174T细胞以20:1、10:1、5:1、和2.5:1的四个E:T比率共培养。
图17示出了CEA表达对罗氏CEA-TCB和CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb(又称为先导CEA/CD3)的功效的影响使用与图15A相同的实验方案，通过不同的表达CEA的肿瘤细胞系(即MKN-45、LS-174T、KATO III、HT-29、和A549)对罗氏CEA-TCB和CEA/CD3OPT1a3b2b1的细胞裂解活性进行了测试。
图18A-图18B示出了CEA/CD3在体内诱导的强效的T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。图18A示出了用于CEA/CD3双特异性抗体的体内功效测试的人源化NSG模型。向雌性NSG小鼠接种人PBMC和LS-174T肿瘤细胞的混合物。在第7天以及随后每周两次用1mg/kg或3mg/kg(每只小鼠)剂量的所指示CEA/CD3双特异性抗体或溶媒治疗小鼠。监测肿瘤生长。该研究在移植肿瘤细胞后第24天终止。图18B示出了来自每个小鼠组的肿瘤体积数据。
图19A-图19B示出了罗氏CEA-TCB和绿叶CEA/CD3 BsAb在同一异种移植人源化动物模型中的体内功效比较。图19A示出了个体小鼠对所指示抗体和PBS对照的应答。图19B：该图引用自Bacac等人,A Novel Carcinoembryonic Antigen T-Cell BispecificAntibody(CEA TCB)for the Treatment of Solid Tumors[一种用于治疗实体瘤的新型癌胚抗原T细胞双特异性抗体(CEA TCB)],Clin Cancer Res[临床癌症研究]；22(13)2016年7月1日,3292(图4)，其示出了个体小鼠对罗氏CEA-TCB的应答。
一般定义
除非另外定义，否则本文所用的技术与科学术语具有如本发明所属领域通常所用的相同含义。出于解释本说明书的目的，以下定义将适用并且在适当时，以单数形式使用的术语也包括复数并且反之亦然。如本文和所附权利要求书中所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”也指复数形式，例如，提及“宿主细胞”包括多个此类宿主细胞。
如本文所用，术语“抗原结合片段”或“抗原结合分子”最广义上是指特异性地结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的实例为抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。本文中术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖多种抗体结构，这些抗体结构包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、以及抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用，术语“抗体”是指从基本上同种的抗体群体获得的抗体，即，包含该群体的单独抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在生产单克隆抗体制剂期间出现的可能的变体抗体，此类变体一般以少量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。
术语“双特异性”是指抗体能够特异性地结合至少两个不同的抗原决定簇，例如各自由一对抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)形成的两个结合位点与不同抗原或相同抗原上的不同表位结合。这样的双特异性抗体是1+1形式。其他双特异性抗体形式是2+1形式(包含针对第一抗原或表位的两个结合位点，以及针对第二抗原或表位的一个结合位点)或2+2形式(包含针对第一抗原或表位的两个结合位点，以及针对第二抗原或表位的两个结合位点)。典型地，双特异性抗体包含两个抗原结合位点，其中每个对不同的抗原决定簇具有特异性。本申请中使用的术语“价”表示抗原结合分子中存在指定数量的结合结构域。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗原结合分子中存在两个结合结构域、四个结合结构域和六个结合结构域。根据本发明的双特异性抗体至少是“二价的”并且可以是“三价的”或“多价的”(例如“四价的”或“六价的”)。在特定方面，本发明的抗体具有两个或更多个结合位点并且是双特异性的。也就是说，即使在存在多于两个结合位点的情况下(即抗体是三价或多价的)，抗体也可以是双特异性的。术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本相似的结构的抗体。“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG类抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由二硫键键合的两条轻链和两条重链组成。每条重链从N末端到C末端依序具有可变区(VH，又称为可变重结构域或重链可变结构域)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，又称为重链恒定区)。类似地，每条轻链从N末端到C末端依序具有可变区(VL，又称为可变轻结构域或轻链可变结构域)和轻链恒定结构域(CL，又称为轻链恒定区)。抗体的重链可以归为五种类型之一，称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)、或μ(IgM)，其中一些可以进一步分为亚型，例如，γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、αl(IgA1)和α2(IgA2)。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可以归为两种类型之一，称为κ(kappa)和λ(lambda)。“抗体片段”是指如下非完整抗体的分子，其包含可结合完整抗体能结合的抗原的该完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体、三抗体、四抗体、交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；由抗体片段形成的多特异性抗体和单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人,Nat Med[自然医学]9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如，Pliickthun,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies[单克隆抗体的药理学],第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag[施普林格出版社],纽约，第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合结构域的抗体片段，可以是二价或双特异性的，参见例如，EP 404,097；WO1993/01161；Hudson等人,Nat Med[自然医学]9,129-134(2003)；和Hollinger等人,ProcNatl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]90,6444-6448(1993)。三抗体和四抗体还描述于Hudson等人,Nat Med[自然医学]9,129-134(2003)中。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis公司(Domantis,Inc.)，马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA)；参见例如，美国专利号6,248,516Bl)。另外，抗体片段包含单链多肽，这些单链多肽具有VH结构域的特征，即能够与VL结构域一起组装到功能性抗原结合位点；或这些单链多肽具有VL结构域的特征，即能够与VH结构域一起组装到功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。抗体片段可以通过多种技术制备，这些技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生产，如本文所述。完整抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段包含重链和轻链可变结构域，还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CHI)。因此，如本文所用，术语“Fab片段”是指包含轻链片段(包含VL结构域)和轻链的恒定结构域(CL)，以及VH结构域和重链的第一恒定结构域(CHI)的抗体片段。Fab’片段与Fab片段的区别在于在包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的重链CHI结构域的羧基末端添加几个残基。Fab'-SH是Fab’片段，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带游离硫醇基团。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分的F(ab')2片段。
“单链可变片段(scFv)”是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白，用十至约25个氨基酸的短接头肽连接。该接头通常富含甘氨酸(针对灵活性)，以及丝氨酸或苏氨酸(针对溶解度)，并且可以将VH的N末端和VL的C末端连接起来，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但这种蛋白质保留了原始抗体的特异性。scFv抗体例如描述于Houston,J.S.,Methods in Enzymol.[酶学方法]203(1991)46-96中。另外，抗体片段包含单链多肽，这些单链多肽具有VH结构域的特征，即能够与VL结构域一起组装到功能性抗原结合位点；或这些单链多肽具有VL结构域的特征，即能够与VH结构域一起组装到功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。
“特异性结合”意指结合对抗原是选择性的并且可以区别于不需要的或非特异性的相互作用。抗原结合分子与特异性抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术进行测量，例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人,Glyco J[糖缀合物杂志]17,323-329(2000))和传统的结合测定(Heeley,Endocr Res[内分泌研究]28,217-229(2002))。在一个实施例中，抗原结合分子与不相关蛋白质的结合程度小于例如通过SPR所测量的抗原结合分子与抗原结合程度的约10％。在某些实施例中，与抗原结合的分子具有<1μΜ、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM、或<0.001nM(例如10-7M或更小，例如10-7M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如，抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，如本文所用，“结合亲和力”是指内部结合亲和力，其反映出结合对(例如，抗体与抗原)的成员之间1:1相互作用。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)表示，Kd是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的常用方法(包括本文所述的那些)测量。用于测量亲和力的一种特定方法是表面等离子体共振(SPR)。如本文所用，术语抗体的“高亲和力”是指针对靶抗原具有10-9M或更低并且甚至更特定地10-10M或更低的Kd的抗体。术语抗体的“低亲和力”是指具有10-8或更高Kd的抗体。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的、参与抗原结合分子与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域均包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人,Kuby Immunology[库比免疫学],第6版,W.H.Freeman and Co.[W.H.弗里曼公司],第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。
高变区(HVR)又称为互补决定区(CDR)，并且这些术语在本文中可互换使用，指的是形成抗原结合区的可变区的部分。该特定区已经由以下进行了描述：Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services[美国卫生与公众服务部],“Sequences ofProteins of Immunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质序列]”(1983)、和Chothia等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917(1987)，其中当相互比较时，定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，用于指代抗体或其变体的CDR的任一种定义的应用都旨在在本文所定义和使用的术语范围内。作为比较，下表A中阐述了如上述引用的参考文献中的每一个所定义的涵盖CDR的适当氨基酸残基。涵盖特定CDR的确切残基数量会根据CDR的序列和大小变化。本领域技术人员通常可以根据抗体的可变区氨基酸序列确定哪些残基包含特定的CDR。
Kabat等人还定义了针对可变区序列的编号系统，它可适用于任何抗体。本领域的普通技术人员可以将这一“Kabat编号”系统明确地分配给任何可变区序列，无需依靠除序列本身外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人,U.S.Dept.ofHealth and Human Services[美国卫生与公众服务部],“Sequence of ProteinsofImmunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质序列]”(1983)所阐述的编号系统。除非另外说明，否则提到的抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat编号系统。除了VH中的CDR l之外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，SDR是与抗原接触的残基。SDR包含在称为缩写CDR或a-CDR的CDR的区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、以及a-CDR-H3)发生在如下氨基酸残基处：LI的31-34、L2的50-55、L3的89-96、HI的31-35B、H2的50-58、以及H3的95-102。(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.[生物科学前沿]13:1619-1633(2008).)除非另外指明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人编号。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域(FR1、FR2、FR3和FR4)组成。相应地，HVR和FR序列在VH(或VL)中通常出现在以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含与其相同的氨基酸序列，或者它可以包含氨基酸序列变化。在一些实施例中，氨基酸变化的数目是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。在一些实施例中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列方面是相同的。
“融合到”或“连接到”是指组分(例如抗原结合结构域和FC结构域)通过肽键直接或经由一个或多个肽接头连接。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，包括原代转化细胞和由其衍生的子代，不考虑传代次数。
药剂例如药物组合物的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或防止疾病的不利影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类和非人类灵长类动物例如猴子)、兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。特别地，个体或受试者是人。术语“药物组合物”是指这样的制剂，其呈允许包含其中的活性成分的生物学活性有效的形式，并且不含对接受配制品施用的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。“药学上可接受的赋形剂”是指药物组合物中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的赋形剂包括但不限于缓冲剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体，例如治疗(treat或treating))”是指试图改变被治疗个体的自然过程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程期间进行。治疗的理想效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病状态、以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的分子用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
如本文所用，术语“癌症”是指增殖性疾病，例如淋巴瘤、淋巴细胞白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃部癌症(stomach cancer)、胃癌(gastriccancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，包括上述癌症中的任一种的难治性型式，或上述癌症中的一种或多种的组合。
具体实施方式
本发明提供了新型CD3抗原结合片段，其具有特别有利的特性，例如可生产性、稳定性、结合亲和力、生物学活性、对某些T细胞的特异性靶向、靶向效率、剩余肿瘤细胞杀伤和降低的毒性。
在一个实施例中，该CD3抗原结合片段包含重链可变区(VH结构域)，其中该VH结构域包含SEQ ID NO:1的经修饰型式(version)，该经修饰型式具有选自Q13K、K83R、L108T、N30S、K31T、F98W、K52bN、和Y58T的一个或多个突变，其中所述编号是按照Kabat编号进行的。
在一个实施例中，本发明提供了CD3抗原结合片段，其包含重链可变区，其中该VH结构域包含SEQ ID NO:1的经修饰型式，该经修饰型式具有选自N30S、K31T、F98W、K52bN、或Y58T的一个或多个突变，其中所述编号是按照Kabat编号进行的。
在一个实施例中，该CD3抗原结合片段包含重链可变区(VH结构域)，其中该VH结构域包含SEQ ID NO:1的经修饰型式，该经修饰型式具有突变N30S、K31T和F98W，其中所述编号是按照Kabat编号进行的。
在一个实施例中，该CD3抗原结合片段包含重链可变区(VH结构域)，其中该VH结构域包含SEQ ID NO:1的经修饰型式，该经修饰型式具有突变N30S、K31T、F98W和K52bN，其中所述编号是按照Kabat编号进行的。
在一个实施例中，该CD3抗原结合片段包含重链可变区(VH结构域)，其中该VH结构域包含SEQ ID NO:1的经修饰型式，该经修饰型式具有突变N30S、K31T、F98W和Y58T，其中所述编号是按照Kabat编号进行的。
在一个实施例中，本发明提供了CD3抗原结合片段，其包含重链可变区(VH结构域)，其中该VH结构域包含SEQ ID NO:1的经修饰型式，该经修饰型式具有选自Q13K、K83R、和L108T的一个或多个突变，其中所述编号是按照Kabat编号进行的。
在一个实施例中，该CD3抗原结合片段包含重链可变区(VH结构域)，其中该VH结构域包含SEQ ID NO:1的经修饰型式，该经修饰型式具有突变Q13K、K83R、和L108T，其中所述编号是按照Kabat编号进行的。
在一个实施例中，该CD3抗原结合片段包含重链可变区(VH结构域)，其中该VH结构域包含SEQ ID NO:1的经修饰型式，该经修饰型式具有突变Q13K、K83R、L108T、N30S、K31T、F98W和K52bN，其中所述编号是按照Kabat编号进行的。
在一个实施例中，该CD3抗原结合片段包含重链可变区(VH结构域)，其中该VH结构域包含SEQ ID NO:1的经修饰型式，该经修饰型式具有突变Q13K、K83R、L108T、N30S、K31T、F98W和Y58T，其中所述编号是按照Kabat编号进行的。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段进一步包含轻链可变区(VL结构域)，其中该VL结构域包含SEQ ID NO:2。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段进一步包含轻链可变区(VL结构域)，其中该VL结构域包含SEQ ID NO:4。
在一个实施例中，该CD3抗原结合片段包含重链可变区(VH结构域)和轻链可变区(VL结构域)，其中该VH结构域包含SEQ ID NO:1的经修饰型式，该经修饰型式具有突变Q13K、K83R、L108T、N30S、K31T、F98W和K52bN，其中所述编号是按照Kabat编号进行的，其中该VL结构域包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4。
在一个实施例中，该CD3抗原结合片段包含重链可变区(VH结构域)和轻链可变区(VL结构域)，其中该VH结构域包含SEQ ID NO:1的经修饰型式，该经修饰型式具有突变Q13K、K83R、L108T、N30S、K31T、F98W和Y58T，其中所述编号是按照Kabat编号进行的，其中该VL结构域包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:3的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:9的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:10的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:11的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:12的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:13的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的第一重链，以及含有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:14的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的第一轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:15的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的第一轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:16的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:17的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:18的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:19的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:20的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:21的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:22的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:23的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:24的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:25的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:26的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:27的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:28的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:29的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个特殊实施例中，该CD3抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO:30的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链，以及含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一个方面，上述CD3抗原结合片段中的任一个是经工程化的CD3抗原结合片段。
本发明还提供了新型双特异性抗原结合分子，其包含第一抗原结合结构域和与CD3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中本发明的新型双特异性抗原结合分子具有有利的特性，例如可生产性、稳定性、结合亲和力、生物学活性、特定T细胞的特异性靶向、靶向效率、剩余肿瘤细胞杀伤和降低的毒性。
在一个实施例中，这些双特异性抗原结合分子可以是双特异性抗体。
在一个方面，该第二抗原结合结构域包含上述CD3抗原结合片段。
在一个实施例中，该第一抗原结合结构域包含两条相同的重链和两条相同的轻链，并且该第二抗原结合结构域包含两个相同的CD3抗原结合片段，其中每个CD3抗原结合片段选自上述CD3抗原结合片段，并且其中该第一抗原结合结构域的每条所述轻链与该第二抗原结合结构域的每个所述CD3抗原结合片段融合。
在一个实施例中，该第一抗原结合结构域的每条所述轻链的恒定区的C末端直接或经由肽接头如GS接头、更具体地序列GGGGSGGGGSGGGGS与该第二抗原结合结构域的每个所述CD3抗原结合片段的重链可变区的N末端融合。
在一个实施例中，该第一抗原结合结构域是非糖基化的单克隆抗体，和/或该CD3抗原结合片段是scFv。
在一个实施例中，所述第一抗原结合片段是CEA抗原结合片段。
在一个特殊实施例中，该CEA抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:5的重链可变区和含有SEQ ID NO:6的轻链可变区。
在一个特殊实施例中，该CEA抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7的重链可变区和含有SEQ ID NO:8的轻链可变区。
本发明还提供了新型双特异性抗原结合分子，其包含与CEA特异性结合的第一抗原结合结构域和与CD3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中本发明的新型双特异性抗体具有有利的特性，例如可生产性、稳定性、结合亲和力、生物学活性、特定T细胞的特异性靶向、靶向效率、剩余肿瘤细胞杀伤和降低的毒性。
在一个特定实施例中，本文提供了双特异性抗原结合分子，其包含与CEA特异性结合的第一抗原结合结构域和与CD3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中与CEA特异性结合的第一抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的VL结构域，或含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQID NO:8的氨基酸序列的VL结构域，并且其中与CD3特异性结合的第二抗原结合结构域包含两个相同的CD3抗原结合片段，其中这些CD3抗原结合片段中的每一个均包含VH结构域和VL结构域，其中：
该VH结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者
该VH结构域包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且该VL结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
优选地，该第一抗原结合结构域包含两条相同的重链和两条相同的轻链，并且该第二抗原结合结构域包含两个相同的CD3抗原结合片段，其中该第一抗原结合结构域的每条所述轻链与该第二抗原结合结构域的每个所述CD3抗原结合片段融合；更优选地，该第一抗原结合结构域的每条所述轻链的恒定区的C末端直接或经由肽接头与该第二抗原结合结构域的每个所述CD3抗原结合片段的重链可变区的N末端融合。
在一个实施例中，本发明还提供了包括非糖基化的单克隆抗体的双特异性抗原结合分子，该非糖基化的单克隆抗体是与CEA结合的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含两条相同的重链和两条相同的轻链，所述轻链包含第一轻链和第二轻链，其中该第一轻链经由肽接头与第一单链可变片段(scFv)融合以产生第一轻链融合多肽，并且其中该第二轻链经由肽接头与第二scFv融合以产生第二轻链融合多肽，其中该第一scFv和第二scFv(i)是相同的，并且(ii)与CD3结合，并且其中该第一轻链融合多肽和第二轻链融合多肽是相同的。
在一个更具体的实施例中，该第一轻链的恒定区的C末端直接或经由肽接头与该第一scFv的重链可变区的N末端融合，并且该第二轻链的恒定区的C末端直接或经由肽接头与该第二scFv的重链可变区的N末端融合。
在一个特殊实施例中，该第一scFv和第二scFv中的每一个包含上述CD3抗原结合片段。
在一个方面，这些双特异性抗原结合分子可以是双特异性抗体。
在一些实施例中，本文所提供的双特异性抗原结合分子与CEA和CD3结合。
在一些实施例中，本文所提供的双特异性抗原结合分子介导T细胞杀伤表达CEA的靶细胞，这些靶细胞包括但不限于LS-174T、LoVo、MKN-45、KATO III、和HPAC靶细胞。
在一些实施例中，本文所提供的双特异性抗原结合分子或CD3抗原结合片段显示出与CD3的降低的结合亲和力。
在一些实施例中，本文所提供的双特异性抗原结合分子或CD3抗原结合片段显示出降低的TCR信号传导强度。
在一些实施例中，本文所提供的双特异性抗原结合分子或CD3抗原结合片段显示由CD3结合物突变体介导的细胞因子释放减少。
在一些实施例中，本文所提供的双特异性抗原结合分子或CD3抗原结合片段显示出对表达CEA的肿瘤细胞的肿瘤细胞裂解，这些表达CEA的肿瘤细胞包括但不限于LS-174T、LoVo、MKN-45、KATO III、和HPAC靶细胞。
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，其包含以上所述CD3抗原结合片段或双特异性抗原结合分子中的任一种。
在一个实施例中，本文提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用以上所述CD3抗原结合片段或以上所述双特异性抗原结合分子中的任一种。
在一个实施例中，该癌症是CEA阳性癌症。
在一个具体实施例中，该癌症是结直肠癌、胃癌、胰腺癌或其他胃肠癌。
在一个实施例中，本发明进一步提供了一种分离的核酸，其包含编码上述CD3抗原结合片段或以上所述双特异性抗原结合分子的核酸序列。在一个实施例中，本发明进一步提供了一种包含以上所述核酸序列的载体。在一个实施例中，本发明进一步提供了一种分离的宿主细胞，其包含以上所述核酸或以上所述载体。在一个实施例中，本发明进一步提供了一种产生抗原结合片段或双特异性抗原结合分子的方法，该方法包括培养以上所述宿主细胞以产生该抗原结合片段或该双特异性抗原结合分子。在一个特殊实施例中，上述方法进一步包括将由细胞产生的抗原结合片段或双特异性抗原结合分子回收。
定义
出于解释本说明书的目的，以下定义将适用。
所产生的不同形式的双功能抗体的定义：
CEA/CD3 BsAb(抗人CEA和CD3的双特异性抗体)，又称为绿叶CEA/CD3BsAb。
CEA/CD3OPT1a(结合了经优化的CD3OPT1a变体的CEA/CD3双特异性抗体)。
CEA/CD3OPT1a3b(结合了经优化的CD3OPT1a3b变体的CEA/CD3双特异性抗体)。
CEA/CD3OPT1a3b2a(结合了经优化的CD3OPT1a3b2a变体的CEA/CD3双特异性抗体)。
CEA/CD3OPT1a3b2b1(结合了经优化的CD31a3b2b1变体的CEA/CD3双特异性抗体)，又称为先导CEA/CD3。
绿叶制药集团CEA/CD3 BsAb的组分
表1示出了以下实例中所用的绿叶CEA/CD3 BsAb的组分
表1
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实施例1
构建CEA/CD3 T细胞双特异性抗体
目前为止所开发的大多数T细胞双特异性抗体都利用抗CD3部分进行T细胞的募集，并且OKT3、UCHT1、SP34和TR66(June等人,J.Immunol.[免疫学杂志]136:3945-3952(1986)；Yang等人,J.Immunol.[免疫学杂志]137:1097-1100(1986)；以及Hayward等人,Immunol.[免疫学]64:87-92(1988))最常用作抗CD3臂。为了进一步比较CEA-CD3形式的各种CD3结合物的特征，我们使用图1的形式产生了CEA T细胞双特异性抗体。将SP34及其变体用作CD3结合臂(CD3结合物变体)，并将hT84.66用作CEA结合臂(CEA结合物变体)。将SP34和hT84.66的经优化形式(即，OPT形式)进行设计用于稳定scFv的框架、影响半衰期并减少聚集(参见表2)。
表2
实施例2
CEA/CD3双特异性抗体介导T细胞杀伤表达CEA的靶细胞和细胞因子释放。
我们检验了CEA/CD3双特异性抗体对不同表达CEA的肿瘤细胞的抗肿瘤作用。在存在IL-2(20ng/ml)的情况下，将新鲜的人PBMC与抗CD3和抗CD28一起培养6天。以10:1的E/T(效应物:靶标)比率进行细胞毒性测定。通过在连续稀释的测试抗体中孵育18小时后从死亡肿瘤细胞释放的LDH评估不同抗体介导的细胞毒性。如图2A和2B所示，hT84.66/SP34双特异性抗体(称为CEA/CD3亲本BsAb，表1中序列表)以剂量依赖性方式增强了对表达CEA的LS-174T和LoVo肿瘤细胞的T细胞重定向的细胞毒性。
为了进一步评估CEA/CD3双特异性抗体的细胞毒性活性，从健康供体的新鲜血液中纯化出人PBMC，并用于进行杀伤测定。在存在CEA/CD3双特异性抗体(此处称为CEA/CD3亲本BsAb)的情况下，将新鲜的PBMC效应细胞和表达CEA的HPAC或KATO III靶细胞或CEA阴性的HEK 293细胞共培养(E:T比率为10:1)。通过24小时孵育后的ATP释放来评估PBMC的杀伤活性。如图3A和3B所示，CEA/CD3亲本双特异性抗体也可以介导新鲜分离的PBMC来杀伤表达CEA的靶细胞，而在PBMC和CEA/CD3亲本BsAb与CEA阴性HEK 293细胞存在的情况下，几乎没有观察到细胞裂解。尽管我们观察到了CEA/CD3亲本BsAb对肿瘤细胞的强力杀伤，但同时也可能发生高水平的细胞因子释放。
为了确认野生型CEA/CD3双特异性抗体是否在体外诱导强烈的细胞因子产生，分离了人PBMC，并将其与抗CD3/CD28包被的珠粒一起培养6天。随后，在存在或不存在CEA/CD3亲本双特异性抗体(CEA/CD3亲本BsAb)的情况下，将激活的T细胞与具有不同CEA表达水平的肿瘤靶细胞系(高表达CEA的HPAC和中等表达CEA的KATO III细胞)和CEA阴性的HEK293和Caco2细胞共培养。在PBMC与肿瘤靶细胞共培养24小时后收集上清液，并通过ELISA评估IL-2和IFN-γ的分泌。虽然CEA/CD3亲本双特异性抗体的处理确实使来自与具有中等CEA表达水平的KATO III肿瘤细胞共培养的PBMC的IFN-γ和IL-2的产生增加，但CEA/CD3亲本双特异性抗体引起了来自与高表达CEA的HPAC肿瘤细胞共培养的PBMC的INF-γ和IL-2远远更显著的增加。此外，在两种共培养条件下，来自CEA/CD3亲本双特异性抗体处理的PBMC的IFN-γ和IL-2的产生以抗体剂量依赖性方式增加(图4A和4B)。相比之下，在CEA阴性的HEK细胞和Caco2细胞中未观察到可检测水平的IFN-γ和IL-2产生。这些数据提供了强有力的证据，证明野生型CEA/CD3双特异性抗体(CEA/CD3亲本BsAb)可以增强强效的T细胞活性，包括对肿瘤细胞的裂解和细胞因子的释放。
实施例3
对CEA/CD3双特异性抗体中的CD3结合靶臂进行工程化以降低结合亲和力。
与CD3的高亲和力结合与固有挑战相关。携带高亲和力CD3结合物的T细胞衔接器双特异性抗体也可诱导细胞因子释放综合征(CRS)，进而导致由施用治疗性抗体引起的严重不良副作用。最重要的是，T细胞双特异性抗体的高结合亲和力对富含T细胞的组织(如脾脏和淋巴结)而不是肿瘤细胞具有高度偏向性。通常，如果CD3结合亲和力高(小于1nM/L)，则T细胞双特异性抗体将在淋巴器官中积累，而较低的CD3亲和力(大于50nM/L)将不足以影响抗体的组织分布。虽然我们所用的抗CD3单克隆抗体的亲和力相对低于OKT3，但它的亲和力仍然在纳摩尔范围内。因此，我们试图使用点突变技术基于该CD3单克隆抗体的VH序列产生较低的CD3结合物变体。众所周知，抗体的框架区不直接参与抗原结合，但它决定了分子的折叠，因此互补决定区(CDR)可以与抗原结合位点相互作用。随机框架突变研究还表明，框架中的某些残基稳定了抗体结构并在抗原结合中发挥了变构贡献作用。结果，抗体框架中那些残基的变化将影响结合亲和力。我们仔细研究了抗CD3与CD3相互作用的蛋白质晶体结构，并基于计算研究对抗CD3的VH框架区中的残基进行了选择性突变，并产生了十四(14)个CD3结合物变体。使用表达CD3的Jurkat细胞通过流式细胞术测量了CD3变体与人CD3的结合(图5A)。除了在Jurkat细胞上几乎完全失去与CD3结合的两个突变的CD3变体(CEA/CD3OPT2和CEA/CD3OPT3)外，其他五个CD3突变变体(CEA/CD3OPT1a、CEA/CD3OPT3a、CEA/CD3OPT3b、CEA/CD3OPT4和CEA/CD3OPT6)的CD3结合亲和力与其亲本克隆CEA/SP34相比均下降到不同程度，但在首次运行的突变的CD3变体中未观察到对CD3的结合亲和力大幅降低(图5A和表3)。为了获得具有低得多的结合亲和力的突变的CD3变体，基于CEA/CD3OPT1a和CEA/CD3OPT3b变体的序列对另外六个CD3结合物变体进行了工程化。因此，我们通过用这些CEA/CD3结合物变体对来自健康供体的新鲜分离的PBMC进行染色来检验它们对CD3的结合亲和力。事实上，FACS分析显示，突变体CEA/CD3OPT1a3b、CEA/CD3OPT1a3b2a、CEA/CD3OPT1a3b2b1、和CEA/CD3OPT1a3b2b2与单突变相比显示出显著降低的结合亲和力(图5B和表3)。本实施例中双特异性抗体的序列：CD3的VH序列列于表3，CD3的VL序列如SEQ IDNO:2所示，CEA的VH和VL序列分别如SEQ ID NO:5-6所示。
表3来自亲本和变体的CD3(衍生自SP34)VH结构域
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我们所用的抗CD3抗体的最重要特征之一是它显示出与食蟹猴CD3蛋白的交叉反应性。由于抗CD3变体衍生自亲本抗体的VH框架序列中的突变，因此可能会由于突变变体中的序列变化而丧失食蟹猴交叉反应性。随后，通过ELISA测定对与食蟹猴CD3蛋白的交叉反应性进行分析(图6和表4)。有趣的是，在对食蟹猴CD3蛋白的结合亲和力方面，所有CD3结合物都表现出与亲本克隆CEA/CD3双特异性抗体相当的结合亲和力。相比之下，用作阴性对照的CEA/OKT3双特异性抗体未显示出与食蟹猴CD3蛋白的交叉反应性，这表明我们的CD3结合物变体中的多个点突变显著降低了对CD3的结合亲和力，但这些突变对与食蟹猴CD3的交叉活性没有影响。
表4.(示出了CD3结合物中的突变对与食蟹猴CD3的交叉反应性没有影响)
实施例4
基于降低TCR信号传导强度选择CD3结合物变体
TCR和作为CD28的共刺激分子在T细胞表面的同时衔接导致T细胞完全激活。在正常情况下，T细胞中引发的信号传导途径包括NFAT转录因子的激活和核转位。为了评估CEA/CD3 BsAb中突变的CD3结合物介导的TCR信号传导强度，我们使用了Jurkat T细胞系，该细胞系在NFAT启动子作用下表达荧光素酶基因。当Jurkat细胞与表达CEA的肿瘤细胞共培养时，CEA/CD3 BsAb可以与Jurkat细胞上的TCR结合并使该TCR二聚化，从而驱动NFAT基因活性，以便由NFAT启动子控制的荧光素酶以抗体的剂量应答方式表达。正如图7A中所预期的那样，在存在CEA/CD3双特异性抗体而不是抗CD3 mAb的情况下，通过Jurkat细胞与表达CEA的LS-174T细胞的共培养物检测到强NFAT活性信号传导。另外，在使用CEA阴性的HEK 293细胞的相同实验环境中未观察到NFAT活性信号传导(图7A)。通过利用这种简单且可靠的测定，我们进一步评估了由所有突变的CEA/CD3变体介导的TCR信号传导的强度。有趣的是，在具有三突变变体(CEA/CD3OPT1a3b2a、CEA/CD3OPT1a3b2b1和CEA/CD3OPT1a3b2b2)的实验环境中检测到非常弱的NFAT活性，但双突变CEA/CD3OPT1a3b仍然保持相对较高的NFAT活性(图7B-7C和表5-6)，这与CEA/CD3变体的结合亲和力一致(图5B)。因此，该测定表明，抗CD3单克隆抗体的VH框架中的多次运行突变在降低CD3结合亲和力的同时还损害了其启动的TCR信号传导途径。本实施例中双特异性抗体的序列列于表1。
表5.(示出了CEA/CD3 BsAb变体介导的以表达CEA方式的NFAT信号传导)
表6.(示出了CEA/CD3 BsAb变体介导的以表达CEA方式的NFAT信号传导)
实施例5
使用CEA/CD3变体评估CD3亲和力对细胞毒性的影响
从理论上讲，T细胞双特异性抗体中的CD3结合臂需要相对较高的结合亲和力，以便它可以桥接T细胞与肿瘤细胞之间的持续相互作用，从而使T细胞最终激活并引发对肿瘤细胞的裂解(lysis)。然而，高CD3结合亲和力会诱发对免疫疗法的严重副作用。因此，评估T细胞双特异性抗体的CD3结合亲和力并在细胞因子释放水平与肿瘤裂解活性之间实现最佳平衡尤为重要。为了比较具有不同结合亲和力的6个抗CD3变体的细胞毒性活性，针对LS-174T Luc(高CEA表达)和KATO III Luc(中等CEA表达)人肿瘤细胞对由CEA/CD3变体抗体诱导的T细胞所介导靶细胞杀伤进行评估。将H929 Luc(CEA阴性的肿瘤细胞系)用作阴性对照。在存在IL-2(20ng/ml)的情况下，将从健康供体分离的人PBMC与抗CD3和抗CD28一起培养6天。对所得PBMC群体进行计数并将其以10:1的最终E:T比率添加到靶细胞中。在孵育18小时后通过荧光素酶强度单位的定量来确定特异性裂解。如图8A和表7所示，6个CEA/CD3双特异性抗体(CEA/CD3亲本BsAb、CEA/CD3OPT1a、CEA/CD3OPT3b、CEA/CD3OPT1a3b、CEA/CD3OPT1a3b2a、和CEA/CD3OPT1a3b2b1)以剂量依赖性方式增强了对表达CEA的LS-174T肿瘤细胞的T细胞重定向的细胞毒性，并且通过特异性裂解测量的IC50值在这些测定中所测试的这6个双特异性抗体之间没有显著差异，这表明CD3臂结合亲和力不会强烈影响由高表达CEA的LS-174T细胞诱导的细胞毒性活性。相比之下，在其他参数相同的测定中，未发现针对CEA阴性的H929Luc细胞的显著细胞毒性(图8B)。
我们接下来研究了靶细胞上的CEA表达水平是否对CEA/CD3 BsAb引发的细胞毒性活性有影响，特别是具有较低CD3结合亲和力的CEA/CD3 BsAb。因此，我们选择KATO III细胞作为靶标，因为该细胞系上表达中等水平的CEA(图9A)。进行了类似的细胞毒性测定，并且在18小时的KATO III和PBMC共培养后，通过荧光素酶强度单位评估了由不同CEA/CD3双特异性抗体介导的肿瘤裂解活性。显然，在所有测试的CEA/CD3 BsAb中，与杀伤LS-174T细胞相比，对KATO III细胞的裂解效率明显更低(图9B和表8)。此外，由双特异性抗体形式的较低CD3亲和力结合物介导的细胞毒性活性似乎受到靶细胞中CEA较低表达水平的显著影响(图9B和表8)。本实施例中双特异性抗体的序列列于表1。
表7.(示出了具有不同结合亲和力的CD3结合物变体对LS-174T细胞的裂解活性)
表8.(示出了在CD3结合物变体存在的情况下PBMC对KATO III肿瘤细胞的裂解)
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实施例6
评估由突变的CD3结合物变体介导的细胞因子释放
由激活的T细胞分泌的细胞因子可以深刻地影响体外和体内的免疫应答。其中，IL-2和INF-γ对各种细胞类型具有多种免疫调节作用，包括支持T细胞增殖和能够刺激细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞的激活。然而，最近人们非常重视减少T细胞介导的免疫疗法中的细胞因子分泌，因为高水平的细胞因子释放会导致固有的和可能致命的不利影响。因此，通过测量细胞因子释放水平来评估T细胞双特异性抗体的CD3结合亲和力至关重要。为了测试CEA/CD3结合物变体对细胞因子释放的直接影响，分离出人PBMC并将其与抗CD3/CD28包被的珠粒一起培养6天。随后，对在存在CEA/CD3双特异性抗体的情况下将与LS-174T细胞(CEA高表达)和KATO III细胞(CEA中等表达)共培养的激活T细胞进行连续稀释。共培养24小时后收集上清液，并通过ELISA评估IL-2、IFN-γ、和TNF-α的分泌。事实上，IFN-γ、TNF-α、和IL-2的水平与其CD3结合亲和力完全相关：在施用CEA/CD3亲本BsAb时细胞因子释放最高，而在施用三突变体CD3结合物时细胞因子释放最低(图10)。该细胞因子释放特征类似于NFAT活性的特征。由于在中等表达CEA的KATO III细胞中发现了较低的有效细胞毒性(图9B)，我们想探索CEA表达水平是否也有助于细胞因子的释放。虽然施用CEA/CD3亲本双特异性抗体确实会以抗体剂量依赖性方式诱导从PBMC和KATO III肿瘤细胞的共培养物中产生IFN-γ和TNF-α，但细胞因子分泌水平远低于在与高表达CEA的LS-174T细胞的共培养物中观察到的水平(图10A-图10C，图11A-图11B)。相比之下，在用CEA/CD3OPT1a3b2a和CEA/CD3OPT1a3b2b1双特异性抗体处理的类似共培养系统中几乎检测不到IFN-γ和TNF-α的产生(图11A-图11B)。这些数据提供了强有力的证据，证明由CEA/CD3双特异性抗体引发的细胞因子释放在很大程度上取决于CD3结合亲和力，并且靶标上的抗原表达水平也部分有助于细胞因子的释放。本实施例中双特异性抗体的序列列于表1。
实施例7
评估CEA/CD3-OPT1a3b2b1 BsAb的结合特异性和组织交叉反应性
为了确定CEA/CD3-OPT1a3b2b1 BsAb是否具有结合可能导致治疗相关毒性的非靶抗原决定簇的潜力，对一组正常人组织和癌组织进行染色并通过免疫组织化学(IHC)技术进行研究。简而言之，将载玻片上的FFPE组织切片脱石蜡，水合，并在低压下经受加热的柠檬酸盐缓冲剂抗原修复20分钟。将切片在PBS洗涤后用内源性过氧化物封闭(10分钟)、用蛋白质封闭(60分钟)，并在室温下先后与一级抗体(60分钟)和二级抗体(60分钟)一起孵育。利用二氨基联苯胺过氧化物酶使染色可视化(1-2分钟)，并用苏木精复染组织。对于细胞系，将先前固定的细胞涂在载玻片上，风干过夜，并储存于4℃。为了分析，将涂片在新鲜、冷的4％PFA中固定10分钟，然后用PBS洗涤。洗涤后，对切片进行抗原修复处理，然后进行针对FFPE切片所述的相同步骤。
TCR研究的结果表明，在3μg/ml的浓度下，表达CEA的LS-174细胞(图12A)、CRC IV期肿瘤细胞(图12D)和CRC III期肿瘤细胞(图12G)显示出较强的(+4级)CEA/CD3-OPT1a3b2b1 BsAb以及对照抗CEA mAb(图12B、图12E和图12H)染色。染色分别在CRC IV期和CRC III期组织中以多焦点和弥散模式分布。CEA/CD3-OPT1a3b2b1和抗CEA mAb(数据未示出)两者在上皮细胞中均显示出低级(+1级)阳性染色，并显示出与正常结肠的管腔粘液的中度非特异性交叉反应性。同型对照BsAb(图12C、图12F、和图12I)染色切片中未发现特异性染色。正常人结肠、乳腺、肺、前列腺、肝、卵巢和脑组织未显示出与所测试的CEA/CD3-OPT1a3b2b1BsAb和对照抗体的任何脱靶反应性(图12J-图12X)。这些研究表明，利用所测试的CEA/CD3-OPT1a3b2b1 BsAb和抗CEA mAb，IV期结直肠癌和胃腺癌展示了4级染色，但未观察到与正常组织的意外交叉反应性。
实施例8
罗氏CEA-TCB与CEA/CD3OPT1a3b2b1双特异性抗体的体外和体内功能比较分析
罗氏CEA-TCB和CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb的抗体形式
罗氏开发了CEA/CD3双特异性抗体，并在转移性结直肠癌的治疗中观察到了令人鼓舞的临床活性。罗氏CEA-TCB(又称为赛必妥(cibisatamab)、RG7802、RG-7802、RO6958688、或RO-6958688)CEA/CD3双特异性抗体的结构和序列信息获得自IMGT数据库。参见http://imgt.org/mAb-DB/search.action？innName＝cibisatamab。罗氏CEA-TCB形式是通过以不同比率一起转染以下四种构建体并对分子量大约为180kDa的全长抗体进行鉴定而产生的。序列如下：
(1)10636H|赛必妥|人源化的||VH-CH1-VH-C-KAPPA-CH2-CH3(VH(1-121)[D1]+
CH1(122-219)[D2]+VH(236-360)[D3]+C-KAPPA(362-467)[D4]+CH2(478-587)[D5]+CH3
(588-692)[D6])694
(2)10636L|赛必妥|人源化的||V-LAMBDA-CH1(V-LAMBDA(1-109)[D1]+CH1(112-
209)[D2])||214
(3)10636M|赛必妥|人源化的||H-GAMMA-1(VH(1-121)[D1]+CH1(122-219)[D2]+
CH2(235-344)[D3]+CH3(345-449)[D4])||451
(4)10636N|赛必妥|人源化的||L-KAPPA(V-KAPPA(1-108)[D1]+C-KAPPA(109-
215)[D2])||215
由于这种新型CEA/CD3双特异性抗体已在体外和体内研究中得到良好的表征，我们决定设计一系列研究来比较罗氏CEA-TCB与CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb。本实施例中CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb的序列列于表1。
CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb的抗体结构形式与罗氏CEA-TCB不同。罗氏CEA-TCB使用不对称的2比1分子形式(图13)。它被工程化为与T细胞上的CD3单价结合，且有两条臂与肿瘤细胞上的CEA结合。CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb使用对称的四价双特异性抗体形式，包括对肿瘤细胞上CEA的二价结合位点和结构上的两个臂，但功能上的一个臂，即对T细胞上CD3的结合位点(图13)。罗氏CEA-TCB和CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb两者的Fc区已发生突变，以消除潜在的Fc介导的ADCC和CDC副作用。两种CEA双特异性抗体之间的主要差异在于CEA/CD3形式的对称分子结构提供了对CEA同等的结合亲和力，并且与罗氏CEA-TCB的不对称形式相比，它被认为与肿瘤细胞的连接性更强。另外，CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb被设计为具有两条相同的重链和两条相同的轻链，这将消除不对称链引起的并发症，并使制造更容易且更经济。
CD3和人靶CEA结合
由于罗氏CEA-TCB和CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb(在图中又称为先导CEA/CD3)分子结构不同，我们首先比较了两种抗体对靶分子CEA和CD3的结合亲和力。研究了CEA-TCB和CEA/CD3OPT1a3b2b1与人PBMC和Jurkat人T淋巴细胞系的相互作用。如通过流式细胞术测定所评估的，罗氏CEA-TCB以比CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb(EC50＝81.03nM)高得多的亲和力(EC50＝0.34nM)与人PBMC T细胞结合(图14A和表9)。同与PBMC的结合相似，与CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb相比，罗氏CEA-TCB对Jurkat细胞显示出显著高的结合亲和力，其中罗氏CEA-TCB的结合EC50为0.2nM，CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb的结合EC50为112nM(图14B和表9)。通过流式细胞术在高表达CEA的MKN-45和LS-174T肿瘤细胞中评估罗氏CEA-TCB与CEA/CD3 OPT1a3b2b1 BsAb对抗原CEA的结合活性。与对CD3的结合相反，罗氏CEA-TCB对MKN-45和LS-174T细胞的结合活性远低于CEA/CD3 OPT1a3b2b1 BsAb的结合活性(图14C，图14D)。这些数据表明，由于CEA和CD3的分子结构或不同的结合物，罗氏CEA-TCB和CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb对靶标和CD3具有完全相反的结合活性。
表9.(示出了CEA/CD3 OPT1a3b2b1和罗氏CEA TCB与人PBMC和Jurkat细胞上的CD3的结合)
罗氏CEA-TCB与CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb的体外和体内功能活性比较
在证明了罗氏CEA-TCB与CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb(在图中又称为先导CEA/CD3)之间对CEA和CD3的不同结合亲和力之后，我们评估了这两种双特异性抗体介导表达CEA的靶细胞MKN-45的细胞裂解的体外功效。为了建立体外肿瘤裂解测定，从健康供体中新鲜分离出人PBMC，并将其以2x105个细胞/孔与1x104个细胞/孔的表达荧光素酶的MKN-45(E/T比率：20:1)一起铺板在一系列稀释的罗氏CEA-TCB和CEA/CD3 OPT1a3b2b1 BsAb中48小时。通过荧光素酶强度计算特异性裂解。如图15A所示，与罗氏CEA-TCB相比，CEA/CD3OPT1a3b2b1以剂量依赖性方式对MKN-45细胞表现出更强大、更显著的靶特异性细胞毒性，并且罗氏CEA-TCB的EC50值比CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb高50倍(图15A)。炎症细胞因子(如IL-6和TNF-α)和慢性炎症与肿瘤发病率增加和癌症患者的预后恶化相关。为了确定抗体介导的细胞毒性与细胞因子释放的关系，通过ELISA测定对来自PBMC和靶细胞MKN-45共培养物的上清液的细胞因子释放进行了平行分析。尽管与罗氏CEA-TCB相比，经CEA/CD3 OPT1a3b2b1 BsAb处理的PBMC和MKN-45的共培养物中IFN-γ、TNF-α、IL-2、和IL-6的水平似乎更高，但如在抗体诱导的EC50浓度下判断的，来自CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb的细胞因子释放水平与罗氏CEA-TCB相似(图15B至图15E)。(所示箭头指向肿瘤裂解的EC50浓度)。我们还观察了来自上清液的抗炎细胞因子IL-10的水平。从经罗氏CEA-TCB和CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb处理的共培养物上清液均检测到IL-10产生的抗体剂量依赖性应答，但经两种抗体处理的上清液之间不存在显著差异(图15F)。这些数据表明，CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb比罗氏CEA-TCB具有更强大的细胞裂解活性，但细胞因子释放水平与罗氏CEA-TCB相似。
为了进一步评估E/T比率对杀伤效力的影响，建立了如下杀伤测定，以测试在CEA/CD3-OPT1a3b2b1存在的情况下以不同E/T比率对表达CEA的靶细胞的杀伤活性，并与罗氏CEA-TCB进行比较。简而言之，将新鲜分离的PBMC与转染荧光素酶的LS-174T细胞以20:1、10:1、5:1、和2.5:1的四个E:T比率共培养。在共培养后48小时通过发光单位确定杀伤活性。如图16所示，在20:1的比率时观察到最高的杀伤活性，并且随着E:T比率的降低，杀伤活性逐渐降低。然而，由CEA/CD3-OPT1a3b2b1 BsAb介导的靶裂解优于由罗氏CEA-TCB介导的靶裂解。如图16所示，在E:T比率为5:1时，CEA/CD3-OPT1a3b2b1仍能介导对LS-174T细胞20％的杀伤活性，但未观察到由罗氏CEA-TCB介导的明显的杀伤。这些发现表明，在有限的T细胞存在的肿瘤微环境(TME)中，CEA/CD3-OPT1a3b2b1可能比罗氏CEA-TCB更有效。
确定CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb的有效性阈值
尽管CEA在许多人类癌症中过度表达，但这种细胞表面糖蛋白通常也在多种上皮组织(例如泌尿生殖道、呼吸道和胃肠道)中表达。因此，我们的CEA/CD3双特异性抗体理论上可以使效应T细胞与表达CEA的正常细胞接合并引起脱靶细胞毒性。因此，对由我们的CEA/CD3双特异性抗体介导的细胞毒性所需的最低CEA表达水平进行评估至关重要。通过对一百多个靶细胞系(其中有各种表达CEA的靶细胞系)进行杀伤测定来对罗氏CEA-TCB的细胞毒性活性进行适当表征。从这些细胞毒性实验中，注意到CEA-TCB双特异性抗体可以杀伤具有高于10,000个CEA结合位点的肿瘤靶细胞，但具有低于10,000个CEA结合位点的靶细胞多数情况下对CEA-TCB没有应答。为了确定我们的CEA/CD3双特异性抗体介导的细胞毒性所需的CEA表达阈值水平，我们选择了具有不同CEA表达水平的多个肿瘤细胞系。流式细胞术分析显示，CEA在胃肿瘤MKN-45细胞中表达最高，而在肺癌A549细胞中表达最低，LS-174T、KATO III和HT-29显示出中等CEA表达水平(图17和表10)。在存在或不存在CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb(在图中又称为先导CEA/CD3)或同型/CD3 BsAb(即非CEA抗体/CD3，其中非CEA抗体部分与艰难梭菌(Clostridium difficile)Tox B结合)的情况下将新鲜分离的人PBMC与肿瘤细胞以10:1的E/T比率共培养48小时并使用罗氏CEA-TCB抗体作为基准抗体(benchmark antibody)进行比较。正如预期的那样，CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb对高CEA表达的MKN-45和LS-174T靶细胞的细胞裂解(cytolysis)似乎比罗氏CEA-TCB对这些靶细胞的细胞裂解更强。在平行孔中，在经同型/CD3处理的共培养物中未观察到细胞毒性活性(图17和表10)。有趣的是，尽管CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb介导了对中等CEA表达的KATO III细胞的相对较弱的细胞裂解，但KATO III细胞对罗氏CEA-TCB双特异性抗体完全没有应答。更重要的是，与罗氏CEA-TCB一样，CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb不会触发对CEA表达相对较低的HT-29的细胞裂解活性。(图17和表10)。我们的数据表明，与肿瘤靶标的结合亲和力在细胞裂解的效力中起关键作用，正如罗氏CEA-TCB双特异性抗体在体外和体内肿瘤裂解中由于其较低的CEA结合亲和力而不能受益于高CD3亲和力结合物那样。
表10.(示出了CEA表达对罗氏CEA-TCB和绿叶CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb功效的影响。)
体内功效
最后，我们通过体内异种移植分析评估了CEA/CD3双特异性抗体对肿瘤发展的影响。在第0天向NSG小鼠右侧腹皮下注射LS-174T细胞，并在第7天注射人PBMC。每周两次腹膜内施用溶媒(PBS)或抗体(1或3mg/Kg)，持续14天(图18A)。对于抗肿瘤功效研究，每周用卡尺测量肿瘤体积并进行计算。在终点比较了CEA/CD3BsAb的抗肿瘤应答。与PBS对照组相比，以3mg/Kg处理时，CEA/CD3OPT1a3b2b1、CEA/CD3亲本、和CEA/CD3OPT1a3b BsAb完全抑制了LS-174T细胞诱导的肿瘤生长(图18B)。尽管在小鼠中，以1mg/kg处理时，七分之一的小鼠对CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb的处理没有完全应答，但观察到了对肿瘤生长的强烈抑制(图19A)。经PBS与抗体处理的小鼠之间的小鼠体重变化没有显著差异(数据未示出)。然而，如果与罗氏公布的数据相比，罗氏CEA-TCB并不完全有效，因为在接受更高剂量的罗氏CEA-TCB(2.5mg/kg)治疗的小鼠中未观察到完全的肿瘤应答(图19B)。
综合而言，CEA/CD3 OPT1a3b2b1 BsAb处理在体外和体内均强烈地抑制了癌细胞的生长，比罗氏CEA-TCB更有效，这表明CEA/CD3 OPT1a3b2b1 BsAb可能是一种潜在的抗肿瘤剂。
其他实施例
应当理解，虽然已经结合具体实施方式对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求的范围限定。其他方面、优点以及修改在以下权利要求的范围内。
上文描述的各种实施例可以进行组合以提供另外的实施例。本说明书中提及的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、国外专利、国外专利申请和非专利出版物，均通过全文引用的方式并入本文。如果需要采用各种专利、申请和出版物的概念来提供又另外的实施例，则可以修改这些实施例的各方面。
鉴于以上详细描述，可以对实施例做出这些和其他改变。总的来说，在以下权利要求中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限制于说明书和权利要求中披露的具体实施例，而是应被解释为包含所有可能的实施例以及这些权利要求有权具有的等同物的全部范围。因此，权利要求不受本发明的限制。
Claims (10)
1.一种CD3抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中
该重链可变区为SEQ ID NO:24所示氨基酸序列，并且该轻链可变区为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列；或
其中该重链可变区为SEQ ID NO:25所示氨基酸序列，并且该轻链可变区为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。
2.一种双特异性抗原结合分子，其包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中该第二抗原结合结构域包含根据权利要求1所述的CD3抗原结合片段。
3.根据权利要求2所述的双特异性抗原结合分子，其中该第一抗原结合结构域包含两条相同的重链和两条相同的轻链，并且该第二抗原结合结构域包含两个相同的根据权利要求1所述的CD3抗原结合片段，并且其中该第一抗原结合结构域的每条所述轻链与该第二抗原结合结构域的每个所述CD3抗原结合片段融合。
4.根据权利要求3所述的双特异性抗原结合分子，其中该第一抗原结合结构域的每条所述轻链的恒定区的C末端直接或经由肽接头与该第二抗原结合结构域的每个所述CD3抗原结合片段的重链可变区的N末端融合。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中该第一抗原结合结构域为非糖基化的单克隆抗体，和/或该CD3抗原结合片段为scFv。
6.根据权利要求2-4中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域是CEA抗原结合结构域。
7.根据权利要求5所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域是CEA抗原结合结构域。
8.根据权利要求6所述的双特异性抗原结合分子，其中该CEA抗原结合结构域包含SEQID NO:5所示的重链可变区和SEQ ID NO:6所示的轻链可变区；或者该CEA抗原结合结构域包含SEQ ID NO:7所示的重链可变区和SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。
9.根据权利要求7所述的双特异性抗原结合分子，其中该CEA抗原结合结构域包含SEQID NO:5所示的重链可变区和SEQ ID NO:6所示的轻链可变区；或者该CEA抗原结合结构域包含SEQ ID NO:7所示的重链可变区和SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。
10.权利要求6-9任一项所述的双特异性抗原结合分子在制备用于治疗有需要的受试者的癌症的方法的药物中的应用，其中该癌症为CEA阳性实体瘤，所述CEA阳性实体瘤为结直肠癌、胃癌和胰腺癌中的一种或多种。
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