CN115698072B

CN115698072B - 抗gpc3抗体，抗gpc3嵌合抗原受体和gpc3/cd3双特异性抗体

Info

Publication number: CN115698072B
Application number: CN202180039455.2A
Authority: CN
Inventors: 阿瓦尼许·瓦许尼; 赵克浩; 周立; 开心; 魏良君; 王宁海
Original assignee: Shandong Boan Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shandong Boan Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-07-01
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2041-06-30
Also published as: WO2022002112A1; US20230357385A1; CN115698072A

Abstract

本申请提供了新型的抗GPC3抗体，抗GPC3嵌合抗原受体和GPC3/CD3双特异性抗体，具有特别有利的特性，如高可生产性，稳定性，结合亲和力，生物活性，特异性靶向GPC3阳性细胞，靶向效率，剩余肿瘤细胞杀伤和降低的毒性。本申请还提供了包含该抗体或抗原结合片段的嵌合抗原受体、相关的CAR‑T细胞、以及制备方法和用途。本申请进一步提供了包含GPC3抗体或抗原结合片段、相关的GPC3/CD3双特异性抗体、相关的GPC3CAR或CAR‑T细胞的药物组合物，以及通过施用Glypican 3(GPC3)抗体或抗原结合片段、双特异性抗体、嵌合抗原受体、CAR‑T细胞或药物组合物治疗有需要的受试者的癌症方法。根据本申请治疗的癌症包括Glypican‑3阳性的癌症。

Description

抗GPC3抗体，抗GPC3嵌合抗原受体和GPC3/CD3双特异性抗体

本申请要求2020年7月1日提交的发明名称为“用于肝细胞癌治疗的GPC3/CD3双特异性抗体的开发”的美国临时申请No.63/047,239和2020年8月10日提交的发明名称为“GPC3/CD3双特异性抗体和抗GPC3嵌合抗原受体的开发”的美国临时申请No.63/063,550的优先权；其内容通过全文引用的方式并入本文。

技术领域

本申请涉及生物制药领域，特别是涉及一种抗GPC3抗体、抗GPC3嵌合抗原受体和GPC3/CD3双特异性抗体，以及其制备方法和用途。

背景技术

恶性肿瘤是导致人类死亡的重要原因之一，也是一个非常大的健康问题。肝癌是一种越来越普遍的恶性肿瘤。它是第五种最经常被诊断的肿瘤，也是癌症相关死亡的第三大原因。原发性肝癌被分为肝细胞癌(HCC)、肝内胆管癌(ICC)和混合型肝细胞和胆管癌瘤(CHC)。根据美国癌症协会的统计，肝细胞癌(HCC)约占肝癌病例的80％，对大多数化疗药物没有反应(1)。一些标记物已被用来区分HCC和其他肝脏肿瘤。Glypican 3(GPC3)是最重要的标志物之一，因为大约50-80％的HCC患者是Glypican 3阳性。此外，HCC中GPC3的表达与预后明显恶化有关(与Glypican 3阴性的HCC患者相比)，即使在完全切除肿瘤后也是如此，这可能是由于GPC3介导的肿瘤生长的信号传导。Glypican 3是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖glypican家族的一个成员，它通过一个糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白连接在成员身上(2)。从机制上讲，GPC3作为一些配体(如Wnt和FGF)的核心受体/储存部位，通过刺激典型的Wnt/β-catenin信号传导促进肝癌细胞的生长(3-5)。利用GPC3缺陷的小鼠进行的实验分析表明，GPC3参与调控Wnt、hedgehog和成纤维细胞生长因子通路，以控制发育过程中的细胞生长和凋亡。Glypican 3(GPC3)是一种高度肿瘤特异性的细胞表面抗原，在胎儿发育过程中表达，但在正常成人组织中被严格抑制(6)。它属于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族，通过一个糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白拴系在细胞表面。在其他类型的肿瘤中，如肺、胃、卵巢、食道等，也有GPC3表达升高的报道。它的癌胚表达和作为重要的信号调节器的作用表明，GPC3可能是癌症治疗中的一个潜在治疗靶点。

采用细胞毒性动员T细胞作为效应细胞作为其抗肿瘤作用的机制的T细胞重定向抗体，从20世纪80年代开始就被称为双特异性抗体。与采用ADCC动员NK细胞或巨噬细胞作为效应细胞作为其抗肿瘤作用机制的抗体不同，T细胞重定向抗体是针对T细胞上构成T细胞受体(TCR)复合体的任何一个亚基的抗体，具体来说是由一个与CD3 e链结合的抗体和一个与目标癌细胞上的抗原结合的抗体组成的双特异抗体。T细胞通过T细胞重定向抗体同时结合CD3 e链和癌抗原来接近癌细胞。因此，对癌细胞的抗肿瘤作用被认为是通过T细胞所拥有的细胞毒活性而发挥的。

使用双特异性抗体来重定向效应T细胞，以独立于TCR的方式靶向地杀死肿瘤细胞，在临床前和临床上都显示出相当大的前景(7)。开发GPC3双特异性抗体的原理是利用在抗体的一个臂上的抗CD3使T细胞参与，激活T细胞对与抗体的另一个GPC3特异性臂结合的表达GPC3的肿瘤细胞进行高效和靶向的杀伤。此外，双特异性抗体也可阻断GPC3信号通路，从而抑制肿瘤生长。

T淋巴细胞在肿瘤免疫反应中的作用被越来越关注。基于T淋巴细胞的过继性免疫疗法对某些肿瘤有一定的效果，而且这种免疫治疗方法可以克服抗体治疗的局限性。但是，对大多数肿瘤的治疗效果仍不理想(8)。近年来，基于发现细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对靶细胞的识别特别依赖于T淋巴细胞受体(T Cell receptor,TCR),针对肿瘤细胞相关抗原的抗体scFv与T淋巴细胞受体CD3ζ或FcεRIγ等细胞内信号激活基团融合，形成嵌合抗原受体(CAR)，并可通过慢病毒感染等手段在T淋巴细胞表面进行基因修饰。这种CAR T淋巴细胞可以选择性地将T淋巴细胞导向表达相应抗原的肿瘤细胞，并以独立于主要组织相容性复合体(MHC)的方式特异性地杀死肿瘤细胞。CAR T淋巴细胞是肿瘤免疫治疗领域的一种新的免疫治疗策略(9)。

在之后开发的第二代CAR T淋巴细胞中，进一步包括了CD28或CD137(也称为4-1BB)的细胞内信号域，并且嵌合抗原受体的部件以scFv-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-/CD137-ITAM的形式连接。B7/CD28或4-1BBL/CD137在细胞内信号域的共刺激作用诱导T淋巴细胞持续增殖，能够提高T淋巴细胞分泌的IL-2、IFN-γ等细胞因子的水平，并提高CAR-T的体内存活期和抗肿瘤效果(10)。

本申请旨在提供对GPC3阳性肿瘤细胞具有良好抗肿瘤作用的GPC3靶向抗体或抗原结合片段、嵌合抗原受体T细胞、或GPC3-CD3双特异性抗体。

发明内容

本申请提供了新的Glypican 3(GPC3)抗体或抗原结合片段和双特异性抗体，具有特别有利的特性，如高可生产性、稳定性、结合亲和力、生物活性、特异性靶向GPC3阳性细胞、靶向效率、剩余(remaining)肿瘤细胞杀伤力和降低的毒性。本申请还提供了包含所述抗体或抗原结合片段的嵌合抗原受体，相关的CAR-T细胞，以及制备方法和用途。本申请进一步提供了包含GPC3抗体或抗原结合片段、相关的GPC3/CD3双特异性抗体、相关的GPC3CAR或CAR-T细胞的药物组合物，以及通过施用Glypican 3(GPC3)抗体或抗原结合片段、双特异性抗体、嵌合抗原受体、CAR-T细胞或药物组合物治疗有需要的受试者的癌症方法。本申请治疗的癌症包括Glypican-3阳性的癌症。

在一个方面，本申请提供了一种抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与GPC3蛋白或其变体结合，其中所述抗体或抗原结合片段包括：轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包括含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的CDR1，含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的CDR2和含SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的CDR3，和/或所述重链可变区包括含SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的CDR1，含SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的CDR2和含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的CDR3。

在另一个方面，所述抗原结合片段选自Fab片段、Fab′片段、Fab′-SH片段、F(ab′)2片段、Fv片段和scFv片段。

在另一个方面，上述的GPC3抗体或抗原结合片段是单克隆抗体和/或人源化抗体。在另一个方面，所述单克隆抗体或人源化抗体包括由杂交瘤产生的抗体或用携带抗体基因的表达载体通过基因工程技术转化的宿主细胞产生的抗体。在另一个方面，所述单克隆抗体或人源化抗体可以是由两条重链和两条轻链组成的IgG抗体，并根据其重链的恒定区域进一步分为四个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，其中轻链可以是λ(lambda)或κ(kappa)型。

所述抗体或抗原结合片段(即GPC3抗体或抗原结合片段)特异性地与GPC3的一个或多个亚基或结构域(例如包括全长的人GPC3蛋白和/或GPC3蛋白的C端(C-terminal))结合。在另一个具体实施方式中，所述GPC3抗体或抗原结合片段特异性地与GPC3的C-端结合；全长人GPC3蛋白通过弗林蛋白酶(furin)在Arg358和Cys359之间裂解，产生一个40kDa的N-端亚基和一个30kDa的C-端亚基，通过二硫键连接，该30kDa的C-端亚基在本文被称为GPC3的C-端。

在另一个方面，所述GPC3抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和/或轻链可变区，并且所述重链可变区包括与SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区包括与SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.20或SEQ ID NO.9的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在另一个方面，所述GPC3抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，并且所述重链可变区包括与SEQ ID NO.7的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO.8的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或者所述重链可变区包括与SEQ ID NO.7的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO.9的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在另一个方面，本申请还提供了一种抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与GPC3蛋白或其变体结合，所述抗体或抗原结合片段包括：轻链可变区和/或重链可变区，其中所述轻链可变区包括含SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列的CDR1，含SEQ IDNO.22所示的氨基酸序列的CDR2，和含SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列的CDR3，和/或所述重链可变区包括含SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列的CDR1，含SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列的CDR2，和含SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列的CDR3。

在另一个方面，本发明提供了一种单克隆GPC3抗体，包括轻链可变区和/或重链可变区，其中所述重链可变区包括与SEQ ID NO.16的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区包括与SEQ ID NO.17的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明还提供了一种单克隆GPC3抗体，包括轻链可变区和/或重链可变区，其中所述重链可变区包括与SEQ ID NO.27的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区包括与SEQ ID NO.28的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在一个具体方面，本申请提供了一种特异性结合CD3的CD3抗原结合片段，其中所述抗原结合片段(例如单链抗体片段，scFv)包括重链可变区(VH结构域)和轻链可变区(VL结构域)，其中：

所述重链可变区包括与SEQ ID NO.10的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包括与SEQ ID NO.11的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列；

所述重链可变区包括与SEQ ID NO.12的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包括与SEQ ID NO.11的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列；或

所述重链可变区包括与SEQ ID NO.14的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包括与SEQ ID NO.11的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。

在另一个方面，本申请提供一种双特异性抗体，包括特异性结合GPC3或其变体的第一抗体或抗原结合片段，和特异性结合CD3的一个或多个亚基或结构域，或其变体的第二抗原结合片段。在另一个方面，所述第一抗体或抗原结合片段是上述的GPC3抗体或抗原结合片段，所述第二抗原结合片段是上述的CD3抗原结合片段。

在一个具体的实施方式中，所述第一抗体或抗原结合片段(即GPC3抗体或抗原结合片段)特异性地与GPC3的一个或多个亚基或结构域(如包括全长人GPC3蛋白和/或GPC3蛋白的C端)结合。在另一个实施方式中，GPC3抗体或抗原结合片段特异性地与GPC3的C-端结合；全长人GPC3蛋白通过弗林蛋白酶在Arg358和Cys359之间裂解产生一个40kDa的N-端亚基和一个30kDa的C-端亚基，通过二硫键连接，其中30kDa的C-端亚基在本文中被称为GPC3的C-端。

在一个具体的实施方式中，第二抗原结合片段(即CD3抗原结合片段)与CD3的一个或多个亚基或结构域特异性结合。在另一个实施方式中，CD3抗原结合片段特异性地与CD3ε的一个或多个结构域结合。

在另一个方面，该双特异性抗体包括两个相同的重链和两个相同的轻链融合多肽。具体来说，对于本申请的双特异性抗体，所述第一抗体或抗原结合片段包括两个相同的重链和两个相同的轻链，并且所述第二抗原结合片段包括两个相同的单链抗体片段(scFv)，其中第一抗体或抗原结合片段的轻链直接或通过连接物与第二抗原结合片段的单链抗体片段(scFv)融合，从而形成所述轻链融合多肽。优选地，所述第一抗体或抗原结合片段的每个轻链的恒定区的C端直接或通过连接物与第二抗原结合片段的每个所述单链抗体片段(scFv)的重链可变区的N端融合。此外，所述连接物是肽连接物。优选的，所述肽连接物可以是GGGGSGGGGSGGGGS。

在另一个实施方式中，所述双特异性抗体的Fc结构域包含一个或多个突变，这些突变使Fc与Fc受体(FcγRI-III)的结合失效，从而减少或消除抗体介导的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖细胞毒作用(CDC)的影响。

在另一个方面，上述双特异性抗体包括单克隆抗体，它是与GPC3结合的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包括两个相同的重链和两个相同的轻链，两个相同的轻链为第一轻链和第二轻链，其中第一轻链直接或通过肽连接物与第一单链抗体(scFv)融合，形成第一条轻链融合多肽，其中第二条轻链直接或通过肽连接物与第二单链抗体scFv融合，形成第二条轻链融合多肽，其中第一条和第二条scFv是相同的，并与CD3结合，而且第一条和第二条轻链融合多肽是相同的。进一步说，用于所述轻链融合多肽的肽连接物可以是GGGGSGGGGSGGGGS。

在一个具体方面，所述第二抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区通过肽连接物连接，所述肽连接物的序列可以是GGGGSGGGGSGGGGS；优选地，所述第二抗原结合片段从N端到C端以VH-GGGGSGGGGSGGGGS-VL的顺序连接。

在一个特定方面，本文还提供了一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包括与GPC3特异性结合的第一抗体或抗原结合片段和与CD3特异性结合的第二抗原结合片段，其中与GPC3特异性结合的第一抗体或抗原结合片段包括重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包括与SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包括与SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.20的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。可选地，所述第一抗体或抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括与SEQ ID NO.7的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO.8序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或者所述重链可变区包括与SEQID NO.7的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，以及所述轻链可变区包括与SEQ ID NO.9的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。并且在另一个方面，其中与CD3特异性结合的第二抗原结合片段包括重链可变区(VH结构域)和轻链可变区(VL结构域)，其中：

所述重链可变区包括与SEQ ID NO.10的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包括与SEQ ID NO.11的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或

所述重链可变区包括与SEQ ID NO.12的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包括与SEQ ID NO.11的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列；或

所述重链可变区包括与SEQ ID NO.14的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包括与SEQ ID NO.11的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。

本申请还提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，包括所述的抗GPC3抗体或抗原结合片段，相关的CAR-T细胞，以及其制备方法和用途。

具体来说，在一个方面，本申请的所述嵌合抗原受体(CAR)包括上述GPC3抗体或抗原结合片段中的任何一个，所述GPC3抗体或抗原结合片段包括轻链可变区和/或重链可变区；所述轻链可变区包括含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的CDR1、含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的CDR2和含SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的CDR3，和/或所述重链可变区包括含SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的CDR1，含SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的CDR2和含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的CDR3；优选地，所述抗原结合片段选自Fab片段、Fab′片段、Fab′-SH片段、F(ab′)2片段、Fv片段和scFv片段；更优选地，所述抗体是单克隆抗体和/或人源化抗体。

在另一个方面，本申请的所述嵌合抗原受体(CAR)包括上述GPC3抗体或抗原结合片段中的任何一个，所述GPC3抗体或抗原结合片段包括轻链可变区和/或重链可变区，所述重链可变区包括与SEQ ID NO.7的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区包括与SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性氨基酸序列；优选地，所述重链可变区包括与SEQ ID NO.7的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包括与SEQ ID NO.8的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在另一个方面，本申请的所述嵌合抗原受体依次包括GPC3抗体或抗原结合片段、细胞外铰链区、跨膜区和细胞内信号区。

在另一个方面，本申请的所述嵌合抗原受体的GPC3抗体或抗原结合片段是由信号肽引导的。

在另一方面，对于本申请的所述嵌合抗原受体，所述信号肽可以是CD8α信号肽、VH3信号肽、IL2信号肽或类似物；所述细胞外铰链区可以是CD8铰链区；CD28铰链区等；所述跨膜区可以是CD8跨膜区、CD28跨膜区、4-1BB跨膜区等；所述细胞内信号区可以是CD28信号区、4-1BB信号区、OX40信号区、CD3ζ信号区等中的一个或多个。

在另一个方面，对于本申请的所述嵌合抗原受体，所述细胞外铰链区是CD8铰链区，所述跨膜区是CD8跨膜区，所述细胞内信号区是4-1BB和CD3ζ，并且所述抗体或其抗原结合片段由CD8α信号肽引导。优选地，所述CD8α信号肽是SEQ ID NO：29所示的CD8α信号肽，所述细胞外铰链区是SEQ ID NO：30所示的CD8铰链区，所述跨膜区是SEQ ID NO：31所示的CD8跨膜区，并且所述细胞内信号区是SEQ ID NO：32所示的4-1BB和SEQ ID NO：33所示的CD3ζ。

在另一个方面，本申请还提供了一种分离的核酸，包括编码上述GPC3抗体或抗原结合片段、上述双特异性抗体或上述嵌合抗原受体的核酸序列。

在另一个方面，本申请涉及一种载体，包括编码上述GPC3抗体或抗原结合片段、上述双特异性抗体或上述嵌合抗原受体的核酸，或表达根据前述任何方面的所述抗体或其抗原结合片段、上述双特异性抗体或嵌合抗原受体的核酸。优选地，所述载体可以是病毒载体；优选地，所述病毒载体包括但不限于慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体；优选地，所述载体可以是非病毒载体；优选地，所述非病毒载体可以是转座子载体。优选地，所述转座子载体可以是睡美人载体、PiggyBac载体等；优选地，所述载体可以是哺乳动物表达载体；优选地，所述表达载体可以是细菌表达载体；优选地，所述表达载体可以是真菌表达载体。

在另一个方面，表达本申请的嵌合抗原受体的载体是一种慢病毒载体。在另一个方面，所述慢病毒载体是图11中所示的质粒pRRLSIN-GPC3 CAR-P2A-EGFRt。

在另一个方面，本申请还提供了一种包含上述载体或上述分离核酸的分离的宿主细胞。

用上述载体转化适当的宿主细胞，上述宿主细胞表达上述GPC3抗体或抗原结合片段，上述双特异性抗体，或上述嵌合抗原受体。

在另一个方面，本发明还提供了各种已知的宿主细胞/表达载体组合，用于通过将分离的抗体基因引入适当的宿主来制备抗体。用作宿主细胞的适当真核细胞包括动物细胞、植物细胞和真菌细胞。具体来说，动物细胞包括，例如，以下细胞：(1)哺乳动物细胞：CHO、COS、骨髓瘤、小仓鼠肾脏(BHK)、HeLa、Vero等细胞；(2)两栖动物细胞：爪蟾卵母细胞等；以及(3)昆虫细胞:sf9,sf21,Tn5等。

在另一个方面，本申请还提供了一种制备上述抗体或抗原结合片段或上述双特异性抗体的方法，包括培养上述宿主细胞，使其产生所述抗体或抗原结合片段，或所述双特异性抗体的方法。在另一个方面，所述方法进一步包括回收所述细胞产生的所述抗体或抗原结合片段或所述双特异性抗体。

在另一个方面，本申请提供了一种制备根据前述方面的CAR-T细胞的方法，包括用包含根据前述任何方面的嵌合抗原受体的载体的慢病毒转染T细胞以产生所述CAR-T细胞。

在另一个方面，本申请还提供了一种可以表达前述任何方面的嵌合抗原受体的细胞。优选地，该细胞是哺乳动物细胞；优选地，该哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人胚胎肾细胞(293)、B细胞、T细胞、DC细胞或NK细胞等。

在另一个方面，本申请还提供了分离的抗体或抗原结合片段或双特异性抗体，或通过上述方法产生的表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如CAR-T细胞)。

在另一个方面，本申请提供了上述GPC3抗体或抗原结合片段、上述双特异性抗体、嵌合抗原受体(CAR)或根据前述任何方面的编码其的核酸、载体或细胞在制备治疗或预防疾病的药物组合物中的用途。

在另一个方面，本申请提供了上述GPC3抗体或抗原结合片段、上述双特异性抗体、嵌合抗原受体(CAR)或根据前述任何方面的编码其的核酸、载体或细胞在治疗癌症中的用途。

在另一个方面，本申请提供了上述GPC3抗体或抗原结合片段、上述双特异性抗体、嵌合抗原受体(CAR)或根据前述任何方面的编码其的核酸、载体或细胞在制备治疗癌症的药物组合物中的用途。

在另一个方面，本申请还提供了一种药物组合物，包括(例如治疗有效量的)上述GPC3抗体或抗原结合片段、上述双特异性抗体、嵌合抗原受体(CAR)或编码其的核酸、或表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如CAR-T细胞)，以及可选的药学上可接受的载体。

在另一个方面，本申请还提供了GPC3抗体或抗原结合片段在制备用于鉴定GPC3阳性的肿瘤患者或鉴定GPC3阳性的肿瘤细胞的检测抗体或诊断抗体中的用途。此外，该方法还包括确定GPC3阳性癌细胞的百分比或水平的步骤，或确定GPC3抗体或其抗原结合片段在GPC3阳性癌细胞上的结合位点数量的步骤。

在一个实施方式中，在施用具有与GPC3结合能力的抗体或抗原结合片段或双特异性抗体或CAR T细胞之前，可从患者身上提取生物样本，如肿瘤样本(如肿瘤活检样本)，以确定GPC3阳性癌细胞的水平或确定GPC3阳性癌细胞上的GPC3表达水平。可取多个样本以确定平均水平，考虑到这些水平可能出现的波动。如果患者具有所需的GPC3阳性癌细胞百分比，或在GPC3阳性癌细胞上具有所需的GPC3表达水平，可施用具有与GPC3结合能力的抗体或抗原结合片段或双特异性抗体或CAR T细胞。

在另一个实施方式中，进行定量检测以确定GPC3抗体或其抗原结合片段在表达GPC3的细胞系上的细胞表面受体占有率(例如结合点的数量)。这样，所述GPC3抗体或其抗原结合片段可用于确定GPC3阳性癌细胞上的GPC3表达水平，因此可针对具有不同GPC3表达水平的癌细胞制定特定的给药策略。

在一个方面，本申请提供了一种试剂盒(如检测或诊断试剂盒)，包括本文所公开的所述抗体或其抗原结合片段、所述嵌合抗原受体或编码其的核酸。

在另一个方面，本申请还提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用上述GPC3抗体或抗原结合片段、上述双特异性抗体、所述嵌合抗原受体(CAR)或编码其的核酸、或表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如CAR-T细胞)、或上述药物组合物。可选的，在需要的受试者中治疗癌症的方法，包括施用治疗有效量的上述GPC3抗体或抗原结合片段、上述双特异性抗体、所述嵌合抗原受体(CAR)或编码其的核酸，或表达所述嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如CAR-T细胞)。

在另一个方面，上述癌症是Glypican-3阳性癌症；优选地，所述Glypican-3阳性癌症是实体癌。

在另一个方面，Glypican-3阳性癌症包括胃癌、胰腺癌、食道癌、肺癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、宫颈癌、肉瘤、细胞瘤、结肠癌、肾癌、大肠癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、骨髓瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤、卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤等中的一种或多种。而可选的是，所述Glypican-3阳性的癌症包括肝癌、黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤和神经母细胞瘤中的一种或多种。

在一个具体方面，所述药学上可接受的载体包括以下的一种或多种：药学上可接受的载体、分散剂、添加剂、增塑剂或赋形剂。

在一些实施方式中，所述药物组合物还可包括其他治疗剂。在一些实施方式中，其他治疗剂包括化学治疗剂、免疫治疗剂、激素治疗剂、放射治疗剂和手术治疗剂。所述抗体或抗原结合片段可与其他治疗剂结合使用，以提高药物组合物的疗效。

在一些实施方式中，“提高疗效”是指提高其他治疗剂或修饰剂的疗效。本文公开的抗体或抗原结合片段可单独或与其他治疗剂或修饰剂联合给药。在一些实施方式中，其他治疗剂或修饰剂包括化学治疗剂、免疫治疗剂、激素治疗剂、放射治疗剂和手术治疗剂。

本申请的药物组合物可以通过口服或肠外向患者给药，优选肠外给药。给药方法的具体实施方式包括注射给药、经鼻给药、经肺给药和经皮给药。注射给药包括静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射和皮下注射给药。给药方法可根据试验动物的年龄和症状适当选择。当作为水溶液给药时，可以使用只含有本申请的双特异性抗体的水溶液，或者也可以使用还含有表面活性剂、赋形剂、着色剂、香水、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等张化剂(isotonization agents)、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、调味剂等的溶液。剂量可以从每公斤体重0.0001毫克到1000毫克的范围内选择，用于单次给药。另外，例如，剂量可以从每个病人0.001毫克/人到100000毫克/人的范围内选择。然而，在本申请的治疗方法中施用的双特异性抗体的量并不限于这些剂量。

本申请的技术方案具有以下优点:

1.Glypican 3(GPC3)抗体或抗原结合片段对GPC3具有高度的选择性和特异性；所述双特异性抗体具有特别有利的特性，如高可生产性、稳定性、结合亲和力、生物活性、对GPC3阳性细胞的特异性靶向、高效的TCR信号传导强度、靶向效率、剩余肿瘤细胞杀伤力和降低的细胞毒性。

2.本申请提供的上述具有突变CD3结合部分的双特异性抗体与具有野生型CD3结合部分的双特异性抗体相比，显示出降低的与CD3的结合亲和力，以及由突变CD3结合部分介导的减少的细胞因子释放。

3.本申请的CAR-T细胞具有以下一个或多个优点：对表达GPC3的细胞有更好的杀伤能力；释放更多的IFN-γ细胞因子；更好的肿瘤抑制能力；更好的体内扩增能力。

4.本申请实现了对癌症的理想治疗，不仅具有较高的安全性，而且降低了身体负担，对患者来说非常方便。

附图说明

本申请的新颖特征在所附的权利要求中作了具体阐述。本申请的一些特征和优点在下面说明书的实施例中进行了解释。

图1显示了本申请的一个或多个实施例的GPC3/CD3双特异性抗体结构示意图。

图2A-图2B显示了由本申请的GPC3/CD3双特异性抗体介导的预激活的PBMCs对GPC3表达的HepG2肿瘤细胞的裂解活性。在GPC3/CD3双特异性抗体(GPC3/CD3-2、GPC3/CD3-40、GPC3/CD3-74、GPC3/CD3-109和GPC3/CD3-182)的连续稀释液中，将活化的T细胞(效应细胞)与HepG2 Luc靶细胞(T)以10/1的E/T比共培养16小时。进行荧光素酶定量检测，以确定对靶细胞的细胞毒性。

图3A-图3C显示GPC3/CD3双特异性抗体在预激活的人PBMC中诱导细胞因子的分泌。在GPC3/CD3双特异性抗体(GPC3/CD3-2、GPC3/CD3-40、GPC3/CD3-74、GPC3/CD3-109和GPC3/CD3-182 BsAbs)的连续稀释液中，将活化的T细胞(效应细胞)与HepG2 Luc靶细胞(T)以10/1的E/T比共培养16小时。收集上清液，通过ELISA检测分析IFN-γ、TNF-α和IL-2。

图4A-图4C.GPC3/CD3双特异性抗体以GPC3依赖的方式诱导Jurkat细胞中的NFAT活性。GPC3/CD3双特异性抗体以GPC3表达的方式介导NFAT信号传导。将GPC3转染的HEK293T细胞(图4A)或GPC3阴性的SK-Hep-1细胞(图4B)与NFAT报告Jurkat细胞在GPC3/CD3 BsAbs存在下共培养8小时。NFAT活性由荧光素酶强度反映。图4C.含Jurkat/NFAT活化的EC50和Span的分析结果。

图5A-图5C.人源化GPC3对GPC3阳性的HepG2肿瘤细胞保留了潜在的细胞毒性能力(即裂解能力)。在人源化GPC3/CD3双特异性抗体(H1L1/CD3，H1L3/CD3，H3L3/CD3双特异性抗体)观察到与嵌合GPC3-40/CD3双特异性抗体(嵌合克隆40/CD3，嵌合克隆2/CD3双特异性抗体)相当的裂解活性。发现双特异性抗体以剂量依赖的方式诱导表达GPC3的HepG2靶细胞的细胞裂解(图5A，图5C)。这种裂解活性被发现是抗原特异性的细胞毒性，因为在PBMCs与GPC3阴性的HPAC或LS-174T肿瘤细胞系的共培养中没有观察到细胞毒性活性(图5B)。

图6A-图6C.huGPC3/CD3双特异性抗体的结合亲和力分析。具有人源化GPC3抗体的GPC3/CD3双特异性抗体和具有亲本嵌合GPC3抗体的GPC3/CD3双特异性抗体与GPC3蛋白(Biacore)和膜结合的GPC3蛋白(FACS)的具有相似的结合亲和力。

图7A-图7D.人源化GPC3/CD3 BsAbs对CD3的各种结合亲和力对细胞毒性能力的影响。与具有较高CD3结合亲和力的野生型CD3结合部分的GPC3/CD3 BsAbs相比，具有突变型CD3结合部分的GPC3/CD3 BsAbs对CD3的结合亲和力较低，细胞毒性活性略有下降。

图8A-图8F.GPC3/CD3 BsAbs对CD3的结合亲和力影响细胞因子的释放。在各种GPC3/CD3 BsAbs的存在下，将活化的T细胞与GPC3阳性的HepG2细胞共培养18小时。收集上清液，用ELISA法测量IFN-γ、TNF-α和IL-2。

图9A：先导(lead)人源化抗GPC3/CD3双特异性抗体候选者(H1L1-CD3 1a3b、H1L3-CD3 1a3b和H1L3-CD3)在HepG2诱导的异种移植的人源化PBMC模型中的体内功效比较。单个小鼠对所述抗体的反应，以及对PBS对照的反应。图9B：研究结束时从HepG2诱导异种移植模型中回收的GPC3阳性细胞。与抗体治疗组相比，PBS对照组的GPC3阳性细胞明显更高。

图10.质粒pRRLSIN-EGFRt的结构示意图。

图11.重组质粒pRRLSIN-GPC3 CAR-P2A-EGFRt的结构示意图。

图12.不同嵌合抗原受体的慢病毒活性滴度。

图13.不同嵌合抗原受体对GPC3阳性肿瘤细胞的特异性杀伤能力测试结果。

图14.不同嵌合抗原受体对GPC3阴性肿瘤细胞的特异性杀伤能力测试结果。

图15.抗GPC3 CAR-T与GPC3阳性肿瘤细胞共培养的上清液中释放的IFN-γ细胞因子的检测结果。

图16.抗GPC3 CAR-T与GPC3阴性肿瘤细胞共培养的上清液中释放的IFN-γ细胞因子的检测结果。

图17.抗GPC3 CAR-T细胞在携带HepG2肿瘤细胞的雌性NCG小鼠中的测试结果：肿瘤体积。

图18.抗GPC3 CAR-T细胞在携带HepG2肿瘤细胞的雌性NCG小鼠中的测试结果：体重。

图19.抗GPC3 CAR-T细胞在携带HepG2肿瘤细胞的雌性NCG小鼠中的测试结果：肿瘤抑制率(TGI)。

图20.抗GPC3 CAR-T细胞在携带HepG2肿瘤细胞的雌性NCG小鼠中的测试结果：肿瘤重量。

图21.第2天小鼠外周血中的CAR-T扩增，通过qPCR方法检测。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文所用的技术与科学术语具有如本发明所属领域通常所用的相同含义。出于解释本说明书的目的，以下定义将适用并且在适当时，以单数形式使用的术语也包括复数并且反之亦然。如本文和所附权利要求书中所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”也指复数形式，例如，提及“宿主细胞”包括多个此类宿主细胞。

如本文所用，术语“抗原结合片段”或“抗原结合分子”最广义上是指特异性地结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的实例为抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。本文中术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖多种抗体结构，这些抗体结构包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、以及抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。

如本文所用，术语“抗体”是指从基本上同种的抗体群体获得的抗体，即，包含该群体的单独抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在生产单克隆抗体制剂期间出现的可能的变体抗体，此类变体一般以少量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。

人源化抗体也被称为重塑的人类抗体。具体来说，通过将非人类动物抗体，如小鼠抗体的CDR嫁接到人类抗体上而制备的人源化抗体是已知的。获得人源化抗体的常见基因工程技术也是已知的。具体来说，例如，重叠延伸PCR是已知的将小鼠抗体CDR嫁接到人类FR的方法。在重叠延伸PCR中，编码要嫁接的小鼠抗体CDR的核苷酸序列被添加到合成人类抗体FR的引物中。为四个FR中的每一个准备引物。一般认为，当把小鼠CDR嫁接到人的FR上时，选择与小鼠FR有高同一性的人的FR对保持CDR的功能是有利的。也就是说，一般来说，最好使用具有与要嫁接的小鼠CDR相邻的FR的氨基酸序列具有高的同一性的氨基酸序列的人类FR。

术语“双特异性”是指抗体能够特异性地结合至少两个不同的抗原决定簇，例如各自由一对抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)形成的两个结合位点与不同抗原或相同抗原上的不同表位结合。这样的双特异性抗体是1+1形式。其他双特异性抗体形式是2+1形式(包含针对第一抗原或表位的两个结合位点，以及针对第二抗原或表位的一个结合位点)或2+2形式(包含针对第一抗原或表位的两个结合位点，以及针对第二抗原或表位的两个结合位点)。典型地，双特异性抗体包含两个抗原结合位点，其中每个对不同的抗原决定簇具有特异性。本申请中使用的术语“价”表示抗原结合分子中存在指定数量的结合结构域。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗原结合分子中存在两个结合结构域、四个结合结构域和六个结合结构域。根据本申请的双特异性抗体至少是“二价的”并且可以是“三价的”或“多价的”(例如“四价的”或“六价的”)。在特定方面，本申请的抗体具有两个或更多个结合位点并且是双特异性的。也就是说，即使在存在多于两个结合位点的情况下(即抗体是三价或多价的)，抗体也可以是双特异性的。术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本相似的结构的抗体。“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG类抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由二硫键键合的两条轻链和两条重链组成。每条重链从N末端到C末端依序具有可变区(VH，又称为可变重结构域或重链可变结构域)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，又称为重链恒定区)。类似地，每条轻链从N末端到C末端依序具有可变区(VL，又称为可变轻结构域或轻链可变结构域)和轻链恒定结构域(CL，又称为轻链恒定区)。抗体的重链可以归为五种类型之一，称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)、或μ(IgM)，其中一些可以进一步分为亚型，例如，γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、αl(IgA1)和α2(IgA2)。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可以归为两种类型之一，称为κ(kappa)和λ(lambda)。“抗体片段”是指如下非完整抗体的分子，其包含可结合完整抗体能结合的抗原的该完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体、三抗体、四抗体、交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；由抗体片段形成的多特异性抗体和单结构域抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体。另外，抗体片段包含单链多肽，这些单链多肽具有VH结构域的特征，即能够与VL结构域一起组装到功能性抗原结合位点；或这些单链多肽具有VL结构域的特征，即能够与VH结构域一起组装到功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。抗体片段可以通过多种技术制备，这些技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生产，如本文所述。完整抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段包含重链和轻链可变结构域，还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，如本文所用，术语“Fab片段”是指包含轻链片段(包含VL结构域)和轻链的恒定结构域(CL)，以及VH结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)的抗体片段。Fab’片段与Fab片段的区别在于在包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的重链CH1结构域的羧基末端添加几个残基。Fab'-SH是Fab’片段，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带游离硫醇基团。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分的F(ab')2片段。

“单链可变片段(scFv)”是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白，用十至约25个氨基酸的短接头肽连接。该接头通常富含甘氨酸(针对灵活性)，以及丝氨酸或苏氨酸(针对溶解度)，并且可以将VH的N末端和VL的C末端连接起来，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但这种蛋白质保留了原始抗体的特异性。另外，抗体片段包含单链多肽，这些单链多肽具有VH结构域的特征，即能够与VL结构域一起组装到功能性抗原结合位点；或这些单链多肽具有VL结构域的特征，即能够与VH结构域一起组装到功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。

“特异性结合”意指结合对抗原是选择性的并且可以区别于与抗原外的物质不需要的或非特异性的相互作用。抗原结合分子与特异性抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术进行测量。在本申请的一个实施例中，抗原结合分子与不相关蛋白质的结合程度小于例如通过SPR所测量的抗原结合分子与抗原结合程度的约10％。在某些实施例中，与抗原结合的分子具有<1μΜ、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM、或<0.001nM(例如10-7M或更小，例如10-7M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。

“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如，抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，如本文所用，“结合亲和力”是指内部结合亲和力，其反映出结合对(例如，抗体与抗原)的成员之间1:1相互作用。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可以用解离常数(K_d)表示，K_d是解离速率常数与缔合速率常数(分别为k_off和k_on)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的常用方法(包括本文所述的那些)测量。用于测量亲和力的一种特定方法是表面等离子体共振(SPR)。如本文所用，术语抗体的“高亲和力”是指针对靶抗原具有10^-9M或更低并且甚至更特定地10^-10M或更低的K_d的抗体。术语抗体的“低亲和力”是指具有10^-8或更高K_d的抗体。

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的、参与抗原结合分子与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域均包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。

高变区(HVR)又称为互补决定区(CDR)，并且这些术语在本文中可互换使用，指的是形成抗原结合区的可变区的部分。该特定区已经由以下进行了描述：Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services[美国卫生与公众服务部]，其中当相互比较时，定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，用于指代抗体或其变体的CDR的任一种定义的应用都旨在在本文所定义和使用的术语范围内。作为比较，下表A中阐述了如上述引用的参考文献中的每一个所定义的涵盖CDR的适当氨基酸残基。涵盖特定CDR的确切残基数量会根据CDR的序列和大小变化。本领域技术人员通常可以根据抗体的可变区氨基酸序列确定哪些残基包含特定的CDR。

Kabat等人还定义了针对可变区序列的编号系统，它可适用于任何抗体。本领域的普通技术人员可以将这一“Kabat编号”系统明确地分配给任何可变区序列，无需依靠除序列本身外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人,U.S.Dept.ofHealth and Human Services[美国卫生与公众服务部]所阐述的编号系统。除非另外说明，否则提到的抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat编号系统。除了VH中的CDR1之外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，SDR是与抗原接触的残基。SDR包含在称为缩写CDR或a-CDR的CDR的区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、以及a-CDR-H3)发生在如下氨基酸残基处：LI的31-34、L2的50-55、L3的89-96、HI的31-35B、H2的50-58、以及H3的95-102。除非另外指明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人编号。

“融合到”或“连接到”是指组分(例如抗原结合结构域和FC结构域)通过肽键直接或经由一个或多个肽接头(peptide linkers)连接。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，包括原代转化细胞和由其衍生的子代，不考虑传代次数。

药剂例如药物组合物的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或防止疾病的不利影响。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类和非人类灵长类动物例如猴子)、兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。特别地，个体或受试者是人。术语“药物组合物”是指这样的制剂，其呈允许包含其中的活性成分的生物学活性有效的形式，并且不含对接受配制品施用的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。“药学上可接受的赋形剂”是指药物组合物中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的赋形剂包括但不限于缓冲剂、稳定剂或防腐剂。

如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体，例如治疗(treat或treating))”是指试图改变被治疗个体的自然过程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程期间进行。治疗的理想效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病状态、以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的分子用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。

如本文所用，术语“癌症”是指增殖性疾病，例如淋巴瘤、淋巴细胞白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃部癌症(stomach cancer)、胃癌(gastriccancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，包括上述癌症中的任一种的难治性型式，或上述癌症中的一种或多种的组合。

用于测量细胞毒性活性的细胞可以是所需的表达GPC3的细胞或含有这些细胞例如，表达GPC3的人类癌症细胞系HepG2、PC-10或NCI-H446的所需组织。GPC3阴性细胞HPAC和LS-174T肿瘤细胞系在本申请中作为对照。

本申请提供了一种新型的GPC3抗体或抗原结合片段和相关的双特异性抗体或嵌合抗原受体(CAR)，具有特别有利的特性，如高可生产性、稳定性、结合亲和力、生物活性、特异性靶向GPC3阳性细胞、靶向效率、剩余肿瘤细胞杀伤力和降低毒性。

本申请还涉及编码本申请的GPC3抗体或抗原结合片段、双特异性抗体或嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，它们可被插入任意的表达载体中。合适的宿主可以用表达载体进行转化，以产生表达本申请的GPC3抗体或抗原结合片段、双特异性抗体或嵌合抗原受体(CAR)的细胞。通过培养表达GPC3抗体或抗原结合片段、双特异性抗体或嵌合抗原受体(CAR)的细胞，可以获得所述多核苷酸编码的GPC3抗体或抗原结合片段、双特异性抗体或嵌合抗原受体(CAR)。也就是说，本申请涉及包含编码本申请的GPC3抗体或抗原结合片段、双特异性抗体或嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸的载体、携带所述载体的细胞以及生产本申请的GPC3抗体或抗原结合片段、双特异性抗体或嵌合抗原受体(CAR)的方法，其包括培养细胞并从培养上清液中收集GPC3抗体或抗原结合片段或双特异性抗体，或收集表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞。这些可以通过类似于上述重组抗体的技术获得。

定义:

以下是对本文所产生的不同构型的双功能(双特异性)抗体的命名的解释。

-GPC3/CD3双特异性抗体：(针对人Glypican 3和CD3的双特异性抗体)

-GPC3/CD3-2克隆(针对人Glypican 3和CD3的双特异性抗体嵌合体2)

-GPC3/CD3-40克隆(针对人Glypican 3和CD3的双特异性抗体嵌合体40)。

-GPC3/CD3-74克隆(针对人Glypican 3和CD3的双特异性抗体嵌合体74)。

-GPC3/CD3-109克隆(针对人Glypican 3和CD3的双特异性抗体嵌合体109)。

-GPC3/CD3-182克隆(针对人Glypican 3和CD3的双特异性抗体嵌合体182)。

-GPC3 H1(针对人Glypican 3的兔克隆40重链的人源化重链候选者)

-GPC3 H3(针对人Glypican 3的兔克隆40重链的人源化重链候选者)

-GPC3 L1(针对人Glypican 3的兔克隆40轻链的人源化轻链候选者)

-GPC3 L3(针对人Glypican 3的兔克隆40轻链的人源化轻链候选者)。

-GPC3 H1L1/CD3(针对人Glypican 3和CD3的兔克隆40的GPC3/CD3人源化双特异性抗体)

-GPC3 H1L1/CD3OPT1a3b(针对人Glypican 3和CD3的兔克隆40的GPC3/CD3双特异性抗体候选者)

-GPC3 H1L1/CD3OPT1a3b2b1(针对人Glypican 3和CD3的兔克隆40的GPC3/CD3双特异性抗体候选者)

-GPC3 H1L3/CD3(针对人Glypican 3和CD3的兔克隆40的GPC3/CD3双特异性抗体候选者)

-GPC3 H1L3/CD3OPT1a3b(针对人Glypican 3和CD3的兔克隆40的GPC3/CD3双特异性抗体候选者)

-GPC3 H1L3/CD3OPT1a3b2b1(针对人Glypican 3和CD3的兔克隆40的GPC3/CD3双特异性抗体候选者)

-GPC3 H3L3/CD3(针对人Glypican 3和CD3的兔克隆40的GPC3/CD3双特异性抗体候选者)

-GPC3 H3L3/CD3OPT1a3b(针对人Glypican 3和CD3的兔克隆40的GPC3/CD3双特异性抗体候选者)

-GPC3 H3L3/CD3OPT1a3b2b1(针对人Glypican 3和CD3的兔克隆40的GPC3/CD3双特异性抗体候选者)。

实施例

实施例1.抗人GPC3单克隆抗体的产生和鉴定

1.抗人GPC3单克隆抗体的产生

1)人GPC3蛋白：一个全长的人GPC3蛋白由580个氨基酸组成(GeneBank登录号：AFM30911.1)，具有两个靠近C-末端部分连接的硫酸肝素(HS)侧链。弗林蛋白酶在全长人GPC3蛋白的Arg358和Cys359之间进行裂解，产生一个40kDa的N端亚基和一个30kDa的C端亚基(即C端片段)，由一个二硫键连接。全长的人GPC3蛋白的C端接近细胞膜(即通过GPI锚定在细胞膜上)，抗体与近膜区域的结合将有助于T细胞衔接器(T cell engager)提高抗体的杀伤活性。

2)获得抗人GPC3单克隆抗体

用全长人GPC3蛋白免疫3只新英格兰白兔，用全长人GPC3蛋白的C端(如C端片段或C端亚基)筛选出针对膜锚定区(membrane-anchored)(即人GPC3蛋白的C端)的抗体。

进行ELISA检测，评估3只兔子对全长人GPC3蛋白以及全长人GPC3蛋白C端的免疫反应。选择了两只对全长人GPC3蛋白以及GPC3蛋白的C端具有最佳滴度的免疫兔来开发抗人GPC3单克隆抗体。

从对GPC3具有最佳滴度的两只免疫兔中分离出PBMCs，用Ficoll-Pague的密度梯度离心法富集抗原特异性B细胞，然后进行5至7天的培养将抗原特异性B细胞分化为浆细胞。进行ELISA检测以确定对全长人GPC3蛋白的C端选择性阳性的克隆。从重组表达中共回收了117个克隆。在这117个克隆中，选择了与人GPC3蛋白和猕猴GPC3蛋白结合亲和力最强的前15个克隆进行进一步测试。所述前15个克隆的VH和VL序列见表1。

表1.前15个克隆的VH或VL序列

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2.抗人GPC3 IgG1抗体的鉴定

将兔的抗人GPC3克隆中的兔CL、CH1、CH2和CH3序列替换为人CL、CH1、CH2和CH3序列，得到抗人GPC3 IgG1抗体。所述抗人GPC3 IgG1抗体的CL、CH1、CH2、CH3和铰链区的序列见表2。

表2抗人GPC3 IgG1抗体的CL、CH1、CH2、CH3和铰链区的序列

1)通过Biacore检测评估前15个克隆(即15个抗人GPC3 IgG1抗体)的抗原结合亲和力(数据显示于表3)。

一般来说，全长的人GPC3 His用胺耦合法固定在CM5传感器芯片上，然后在1μg/mL到0.125μg/mL HBS-EP缓冲液中将抗人GPC3 IgG1抗体固定在CM5芯片上。使用BiacoreT200仪器通过SPR测定结合亲和力。

表3.通过Biacore检测评估前15个克隆的抗原结合亲和力

2)通过流式细胞仪评估前15个克隆(即15个抗人GPC3 IgG1抗体)的HepG2细胞表面结合亲和力(数据显示于表4)。

表达全长人GPC3的HepG2细胞系被用于流式细胞仪分析。一般来说，将细胞解离并在PBS中清洗后，将1x10⁵个目标细胞接种在96孔板中。将制备的终浓度为25μg/mL的抗GPC3IgG1抗体与所述目标细胞在4℃下孵育1小时。用FACS洗涤缓冲液清洗后，用PE共轭的山羊抗人IgG，Fc片段特异性抗体(1:200稀释于FACS洗涤缓冲液中)在4℃下孵育板20分钟。使用NovoCyte 2060测量平均荧光强度(MFI)，并通过GraphPad软件分析结果。

表4.通过流式细胞仪评估前15个克隆的HepG2细胞表面结合亲和力

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3)通过ELISA确认抗GPC3抗体对GPC3蛋白(即C端片段)的结合特异性。

GPC3蛋白的N端可以脱落，存在于血液循环中。因此，感兴趣的抗体需要靶向GPC3蛋白的C端，避免与可溶性的N端片段结合。前15个克隆(即15个抗人GPC3IgG1抗体)中的GPC3结合表位通过它们与基准抗体GC33(其已知与GPC3蛋白的C端结合，参考US20180244805A1)的竞争性结合来确定，结果见表5，表5显示所有15个克隆都与全长人GPC3蛋白的C端片段特异性结合，并且这些克隆的结合表位与GC33的表位不重叠、重叠和部分重叠。

根据上述亲和力排序、细胞表面结合、结合特异性、结合表位和序列分析的结果，选择了前5个候选者(克隆2、克隆40、克隆74、克隆109和克隆182)用于开发GPC3/CD3双特异性抗体。

实施例2.兔-人嵌合GPC3/CD3双特异性抗体的产生

双特异性抗体的对称分子结构被选为GPC3/CD3双特异性抗体的开发形式。本申请的一个或多个实施方案的GPC3/CD3双特异性抗体结构示意图见图1。GPC3抗体(如GPC3IgG1抗体)的每个轻链的恒定区的C端直接或间接通过连接子与每个CD3单链抗体片段(scFv)的重链可变区的N端融合。图1中的连接子1和连接子2可以相同或不同，例如，连接子1和连接子2可以是序列为GGGGSGGGGSGGGGS的肽连接子。

此外，为了避免Ig Fc介导的-ADCC/CDC功能，在本申请中，在人IgG1 Fc区引入LALA突变(L234A，L235A)以消除效应子功能。本申请中IgG1 Fc区的突变位置为EuNumbering。

表6中显示了选择进行测试的5个嵌合型双特异性抗体的VH和VL序列。所选的5个嵌合体双特异性抗体的CL、CH1、CH2、CH3和铰链区的序列见表7。

表6选择的5个嵌合体双特异性抗体的VH和VL序列(下划线序列代表CDR，分析系统是Kabat系统)

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下划线为CDRs

表7选择的5个嵌合双特异性抗体的CL、CH1、CH2、CH3和铰链区的序列

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实施例3.嵌合GPC3/CD3双特异性抗体在体外介导T细胞对表达GPC3的靶细胞的杀伤

为了测试GPC3/CD3双特异性抗体是否使T细胞对GPC3阳性目标产生细胞毒性，我们进行了标准的细胞毒性试验。在IL2(20ng/mL)存在下用抗CD3抗体和抗CD28抗体(干细胞技术公司)，以10:1的E:T比例培养PBMCs 6天，对PBMCs进行预激活。不同的GPC3/CD3双特异性抗体介导的细胞毒性(即裂解活性)是用荧光素酶方法由活的HepG2 Luc细胞在连续稀释的测试GPC3/CD3双特异性抗体中孵育16小时后评估的。GPC3/CD3双特异性抗体(克隆GPC3/CD3-2和GPC3/CD3-40)以剂量依赖方式增强了T细胞对表达GPC3的HepG2肿瘤细胞的重定向细胞毒性。然而，在GPC3/CD3-74、GPC3/CD3-109和GPC3/CD3-182处理下，对表达GPC3的HepG2肿瘤细胞的裂解率较低(图2A，图2B)。

实施例4.嵌合型GPC3/CD3双特异性抗体诱导PBMCs释放细胞因子

由活化的T细胞分泌的细胞因子可以深刻地影响体外和体内的免疫反应。一些细胞因子通过直接的抗增殖或促凋亡活性，或间接通过刺激免疫细胞对肿瘤细胞的细胞毒性活性来限制肿瘤细胞的生长。IFN-γ和IL-2在固有和适应性免疫系统的界面上起着非常重要的作用。INF-α信号增加抗原肽对T淋巴细胞的呈递，并增加抗原特异性CD8+T细胞的激活和T细胞介导的肿瘤杀伤。为了明确确定GPC3/CD3双特异性抗体对体外效应细胞因子产生的影响，在连续稀释的GPC3/CD3双特异性抗体存在的情况下，将预激活的T细胞与表达GPC3的靶细胞共培养了16小时。收集上清液进行细胞因子检测。同样，IFN-γ、IL-2和TNF-α在GPC3/CD3-2克隆和GPC3/CD3-40克隆处理的PBMCs中的分泌明显增加(图3A-图3C)。有趣的是，尽管IFN-γ和TNF-α的产生在GPC3/CD3-74克隆、GPC3/CD3-109克隆和GPC3/CD3-182克隆处理的PBMC中略有增加(图3A和图3C)，但在与表达GPC3的HepG2细胞共培养时没有观察到明显的IL-2释放(图3B)。更重要的是，与GPC3阴性的HT29肿瘤细胞共培养时，没有检测到INF-γ、IL-2和TNF-α的释放，表明GPC3特异性细胞因子的释放。该数据提供了强有力的证据，证明GPC3/CD3双特异性抗体可以增强T细胞对GPC3阳性靶细胞的活性。

实施例5.在体外嵌合GPC3/CD3双特异性抗体触发TCR，诱导Jurkat细胞的GPC3依赖的-NFAT活性

抗原或抗CD3抗体与T细胞受体的结合启动了TCR/CD3介导的信号传导，从而导致NFAT途径的激活。激活的NFAT信号驱动T细胞增殖、细胞因子产生和激活细胞表面标志物表达。为了评估GPC3/CD3双特异性抗体交联TCR是否能诱导T细胞的激活信号，我们使用经典的TCR-NFAT-荧光素酶基因报告系统来进行NFAT活性检测。我们设计了三种设置来评估由GPC3/CD3抗体(表6中的具有野生型抗CD3序列的双特异性抗体)介导的T细胞免疫反应：a)在Jurkat细胞和GPC3转染的HEK293 T细胞的共培养物中加入GPC3/CD3双特异性抗体；b)在Jurkat细胞和GPC3阴性的SK-Hep-1细胞的共培养物中加入GPC3/CD3双特异性抗体；以及3)在Jurkat细胞和GPC3转染的HEK293 T细胞的共培养物中加入同型对照/CD3双特异性抗体(表6中具有野生型抗CD3序列的双特异性抗体)作为阴性对照。正如预期的那样，只有在用GPC3/CD3双特异性抗体克隆2和GPC3/CD3双特异性抗体克隆40处理Jurkat细胞与GPC3转染的HEK293 T细胞共培养物时，才观察到NFAT报告基因活性的强烈上调，然而用GPC3/CD3双特异性抗体克隆74、109和182，NFAT活性水平很低(图4A)，与观察到的由GPC3/CD3双特异性抗体克隆2和克隆40介导的细胞毒性和细胞因子释放是一致的。相反，用GPC3/CD3双特异性抗体处理Jurkat细胞与GPC3阴性的SK-Hep1细胞共培养物时，没有观察到NFAT的明显激活(图4B)。对于图4C，包括Jurkat/NFAT激活的EC50和Span的分析结果进一步表明，通过GPC3/CD3双特异性抗体将T细胞与GPC3阳性靶肿瘤细胞衔接后，启动了高效的TCR信号传导。IC(同型对照)抗体的VH和VL序列显示在表8中。

表8 IC(同种型对照)抗体的VH和VL序列

实施例6.先导(lead)抗GPC3候选者的人源化，以及最佳人源化抗GPC3候选者和人源化GPC3/CD3双特异性抗体的表征

基于更好的细胞毒性和更好的细胞因子读数，对选择的两个先导的候选抗GPC3(克隆#40和克隆#2)进行了人源化。对兔的抗GPC3抗体的序列进行数据库中的同源种系变量区域分析。进一步优化了抗体的热稳定性和可开发性评估。重链和轻链的人源化版本以组合方式被瞬时表达，以确定在体外保持最佳抗原结合、热稳定性和特异性结合能力的抗体变体。

由于嵌合抗体有可能在人类患者中引起免疫原性反应，先导(lead)的嵌合抗GPC3克隆40必须通过将非人的互补性决定区(CDRs)嫁接到人框架区进行人源化。因此，通过嫁接过程产生了三个人源化轻链L1、L2、L3和三个人源化重链H1、H2、H3。选择了两条人源化轻链L1、L3和两条人源化重链H1、H3。人源化抗GPC3克隆40的可变区序列显示在表9中。人源化抗GPC3克隆40的CL、CH1、CH2、CH3和铰链区的序列见表7。

表9.人源化抗GPC3克隆40的可变区域序列(下划线序列代表CDRs，分析系统为Kabat系统)

我们进一步评估了抗GPC3克隆40的人源化版本是否能够表现出与之前在抗GPC3克隆40的嵌合形式(即表6中具有野生型抗CD3序列的人化GPC3/CD3双特异性抗体)中看到的一样强的裂解活性，因此我们比较了CD3双特异性构型的人源化抗GPC3克隆H1L1、H1L3和H3L3对的体外细胞毒性。对人源化H1L1/CD3、H1L3/CD3和H3L3/CD3双特异性抗体重定向T细胞介导的针对GPC3阳性和GPC3阴性肿瘤细胞系的细胞毒性进行了测试。将HepG2肿瘤细胞与受刺激的人PBMCs在GPC3/CD3双特异性抗体的连续稀释液中以10:1的效靶比共培养16小时。发现双特异性抗体以剂量依赖的方式诱导表达GPC3的HepG2靶细胞的裂解(图5A，图5C)。这种裂解活性被认为是抗原特异性的细胞毒性，因为将GPC3阴性的HPAC或LS-174T肿瘤细胞系与PBMCs共培养时没有观察到细胞毒性活性(图5B)。有趣的是，H1L3和H3L3对保持了与嵌合亲本克隆40相似的强效裂解活性，而H1L1对(H1L1 pair)诱导的细胞毒性明显下降，这表明人源化L3在细胞毒性活性(即裂解活性)中起着关键作用。

实施例7.人源化抗GPC3/CD3双特异性抗体的表征

为了表征人源化GPC3抗体，将人源化的重链和轻链与各种CD3结合片段相结合，以产生人源化GPC3/CD3双特异性抗体。人源化的重要目标是保留高抗原结合亲和力，以及保留亲代嵌合抗体的优异的生物学特性。本文使用的各种CD3结合片段的可变区序列见表10。

表10各种CD3结合部分的可变区序列

基于我们的假设，即在双特异性抗体构型中减少对任一抗原的亲和力可能会减少细胞因子的释放，而不一定会减少细胞毒性活性(即裂解活性)，在双特异性抗体构型中产生和生产了对每种抗原具有不同亲和力的各种抗GPC3和抗CD3臂。由此产生的GPC3双特异性抗体被命名为H1L1/CD3、H1L1/CD3OPT1a3b、H1L1/CD3OPT1a3b2b1、H1L3/CD3、H1L3/CD3OPT1a3b和H1L3/CD3OPT1a3b2b1。抗GPC3(如H1L1或H1L3)的两条轻链中的每一条都通过肽连接子GGGGSGGGGSGGGGS与抗CD3(如CD3、CD3OPT1a3b或CD3OPT1a3b2b1)的单链可变片段(scFv)融合，从而产生两条轻链融合多肽。

人源化GPC3/CD3双特异性抗体与人GPC3蛋白的结合亲和力是通过Biacore和细胞结合试验测量的。如图6A-图6C所示，在Biacore分析中H1L1/1a3b2b1和H1L3/1a3b2b1(即H1L1/CD3OPT1a3b2b1和H1L3/CD3OPT1a3b2b1；或者H1L1/CD3 1a3b2b1和H1L3/CD31a3b2b1)对人GPC3蛋白的浓度为0.07nM和0.2nm(图6A-图6B)，在基于细胞的检测中，具有亲代嵌合GPC3克隆40的GPC3/CD3双特异性抗体和具有人源化GPC3抗体的GPC3/CD3双特异性抗体没有明显差异(图6C)。此外，人源化GPC3抗体还在ELISA检测中对猕猴(cynomolgus)的GPC3蛋白进行了滴定，H1L1和H1L3都与猕猴的GPC3有交叉反应性，与亲代克隆40相似。这些数据证实，嵌合GPC3抗体的人源化并没有改变与人或猕猴GPC3的结合亲和力。

由于T细胞双特异性抗体可能会诱发细胞因子释放综合征，并导致严重的输液相关反应，因此T细胞双特异性抗体开发的主要挑战是如何大幅减少细胞因子的释放，但保留显著的细胞毒性活性。

由此产生的人源化GPC3/CD3双特异性抗体H1L1/CD3、H1L1/CD3OPT1a3b、H1L1/CD3OPT1a3b2b1、H1L3/CD3、H1L3/CD3OPT1a3b和H1L3/CD3OPT1a3b2b1,其中OPT CD3结合片段在产生我们其他(非GPC3)双特异性抗体项目中通过细胞毒性和细胞因子释放试验进行了充分的表征(见US 62/974,744或PCT/CN2020/136452)。正如预期，人源化抗GPC3抗体与对CD3的结合亲和力较低的突变体CD3结合片段CD31a3b(EC50，H1L1：0.01nM和H1L3：0.004nM)和CD3 1a3b2b1(EC50，H1L1：0.0076nM和H1L3：0.00086nM)配对，相比于与野生型CD3结合片段(EC50，H1L1：0.00036nM和H1L3：0.00013nM)配对，在与活化的PBMCs(图7A,图7B)以及新鲜分离的PBMCs(图7C,图7D)的共培养中，具有降低的细胞毒活性，但剩余的细胞毒性活性仍然很显著。为了单独分析人源化GPC3/CD3 BsAb处理的PBMC和肿瘤靶细胞共培养物中释放的细胞因子，通过ELISA检测分析细胞培养物的上清液中的IFN-γ、TNF-α和IL-2。显然，与人源化GPC3/CD3 BsAbs相比，在GPC3/CD3 1a3b和GPC3/1a3b2b1 BsAbs观察到较低水平的IFN-γ(H1L1/CD3 1a3b减少112倍，H1L1/CD31a3b2b1构建体减少178倍)(图8A，图8B)，较低水平的TNF-α(H1L1/CD3 1a3b减少100倍，H1L1/CD3 1a3b2b1构建体减少62倍)(图8C，图8D)，以及较低水平的IL-2(图8E，图8F)的释放。这一数据表明，GPC3/CD3 BsAbs中对CD3的结合亲和力对细胞因子的产生有很大影响，因为野生型CD3结合片段对CD3的结合亲和力高于CD3OPT1a3b和CD3OPT1a3b2b1突变型CD3结合片段。此外，尽管H1L3和H3L3对诱导的细胞毒性比H1L1好，但L1与人类Ig的序列相似性更高。

实施例8.人源化抗GPC3/CD3双特异性抗体的体内疗效研究

我们评估了人源化抗GPC3/CD3双特异性抗体对体内异种移植模型中肿瘤发展的影响。NSG小鼠在第0天的右腹皮下注射HepG2细胞，然后在肿瘤生长到70-100mm³时静脉注射健康人捐赠的PBMC。从注射PBMC开始，在接下来的14天里，每周两次静脉注射载体(PBS)或治疗抗体(即人源化抗GPC3/CD3双特异性抗体)。为了测量抗肿瘤反应，每周用卡尺测量两次肿瘤生长，并进行计算。如图9A所示，与PBS对照组相比，人源化抗GPC3/CD3双特异性抗体H1L1-CD3 1a3b、H1L3-CD3 1a3b和H1L3-CD3在2mg/kg的剂量下可抑制HepG2诱导的肿瘤生长。由于PBMC诱导的GVHD发展，该研究在第19天终止。

研究结束时收集了肿瘤，并调查了肿瘤细胞中GPC3的表达。有趣的是，在PBS治疗组有45％的肿瘤细胞是GPC3阳性，而在H1L1-CD3 1a3b、H1L3-CD3 1a3b和H1L3-CD3组分别只有6.43％、2.13％和2.5％的GPC3阳性细胞(图9B)。这解释了在体内观察到的抗体处理组没有完全消退的现象。

实施例9.抗GPC3嵌合抗原受体的研究

9.1嵌合抗原受体基因片段的制备

本申请通过基因合成技术，按照以下编码基因的顺序设计了抗GPC3嵌合抗原受体的融合基因片段:CD8α信号肽编码基因、抗GPC3 scFv VH-连接子-抗GPC3 scFv VL编码基因、CD8铰链区编码基因、CD8跨膜(TM)区编码基因、4-1BB和CD3ζ胞内信号区编码基因。所表达的嵌合抗原受体的氨基酸结构为scFv VH-连接子-scFv VL-CD8铰链区-CD8TM-4-1BB-CD3ζ。连接子的序列为GGGGSGGGGSGGGGS，CD8α信号肽的序列为SEQ ID NO:29，CD8铰链区的序列为SEQ ID NO:30，CD8跨膜区(CD8TM)的序列为SEQ ID NO:31，4-1BB序列为SEQ ID NO:32，以及CD3ζ序列为SEQ ID NO:33。

pRRLSIN慢病毒载体是由pRRLSIN慢病毒载体的全基因合成的。该载体含有人类EF1α启动子，GFP(绿色荧光蛋白)序列被替换为EGFRt标记蛋白序列，以获得pRRLSIN-EGFRt载体(见图10)。

9.2嵌合抗原受体慢病毒表达载体的构建

本实施例中使用的载体系统属于第三代自失活的慢病毒载体系统。该系统由三个质粒组成，编码Gag/Pol蛋白包装质粒pMDLg-pRRE，编码Rev蛋白pRSV-rev；以及编码VSV-G蛋白包膜质粒PMD2.G。

在这个例子中，通过将第9.1节中获得的目标基因连接到pRRLSIN-EGFRt载体上，构建了共表达通过P2A(SEQ ID NO：34)连接的特定CAR(即抗GPC3嵌合抗原受体)和EGFRt(SEQ ID NO:35)的慢病毒表达载体。形成了一个重组质粒，命名为pRRLSIN-GPC3 CAR-P2A-EGFRt(见图11)。具体结构为pRRLSIN-CD8α-scFv VH-连接子-scFv VL-CD8铰链区-CD8TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-EGFRt。经过酶切和测序验证，成功构建的载体可以进行包装。CAR-P2A-EGFRt被转录成一个mRNA，但最终翻译成EGFRt和抗GPC3嵌合抗原受体的两条肽链。抗GPC3CAR在CD8α信号肽的引导下定位于细胞膜上。

对照组被命名为GC33基准组，它是由GC33 CAR、P2A和EGFRt串联而成。GC33CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:36中列出。

本例中获得的目标CAR结构如下：

scFv克隆40VH-克隆40VL-CD8铰链区-CD8TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-EGFRt(G8)

scFv VH1-VL1-CD8铰链区-CD8TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-EGFRt(VH1-VL1)

scFv VH1-VL2-CD8铰链区-CD8TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-EGFRt(VH1-VL2)

scFv VH1-VL3-CD8铰链区-CD8TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-EGFRt(VH1-VL3)

scFv VH2-VL1-CD8铰链区-CD8TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-EGFRt(VH2-VL1)

scFv VH2-VL2-CD8铰链区-CD8TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-EGFRt(VH2-VL2)

scFv VH2-VL3-CD8铰链区-CD8TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-EGFRt(VH2-VL3)

scFv VH3-VL1-CD8铰链区-CD8TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-EGFRt(VH3-VL1)

scFv VH3-VL2-CD8铰链区-CD8TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-EGFRt(VH3-VL2)

scFv VH3-VL3-CD8铰链区-CD8TM-4-1BB-CD3ζ-P2A-EGFRt(VH3-VL3)

GC33 CAR-P2A-EGFRt(GC33基准)

表11.CAR结构的相关序列

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9.3嵌合抗原受体慢病毒的制备

提取pRRLSIN-GPC3 CAR-P2A-EGFRt表达质粒和pMDLg-pRRE、pRSV-rev和pMD2.G辅助质粒(helper plasmids)，并与转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)按一定比例混合，共同转染293T细胞。主要步骤如下：

(1)将培养到5-8代的293T细胞(ATCC CRL-3216)以7x10⁶的细胞密度接种到75cm³的细胞培养瓶中，所述细胞培养瓶中具有含10％FBS(购自GIBCO)的DMEM培养基(购自GIBCO)。将细胞混合均匀后放在二氧化碳培养箱中24小时，为转染做准备。培养条件为37℃和5％ CO₂。第二天，观察到细胞汇合度约为70-80％，293T细胞可进行转染。

(2)24小时后，将目标表达质粒pRRLSIN-GPC3 CAR-P2A-EGFRt与pMDLg-PRRE、pRSV-rev和pMD2.G辅助质粒按照4：3：2：2的比例混合，用Opti-MEM培养基(购自GIBCO)稀释，得到溶液A。按照总质粒：PEI＝3:1的比例制备PEI稀释液，并用Opti-MEM培养基稀释，得到溶液B。将A液和B液混合后在室温下培养15分钟，得到质粒-PEI混合物。

(3)取出铺板的(plated)293T细胞，将质粒-PEI混合物慢慢加入到细胞上清液中。轻轻摇动得到的混合物，放入CO₂培养箱中4-6小时。培养条件为37℃，5％CO₂。培养结束后，用含有10％FBS的新鲜DMEM培养基替换培养基。

(4)转染后48h和96h后，收集含有病毒的细胞培养上清液，在4℃下以3000rpm离心5分钟。用0.45μm的过滤器过滤上清液后，与PEG8000/NaCl按4：1的比例混合。在4℃下放置2至3小时后，高速离心30分钟。弃去上清液，用预冷的T细胞培养基X-VIVO15(Lonza，04-418Q)或PBS重新悬浮沉淀，得到病毒浓缩液，储存在-80℃以备后用。

9.4慢病毒滴度检测

在本实施例中，采用了细胞感染法来确定慢病毒的生物活性滴度。293T细胞用于慢病毒活性测定，将1×10⁵个细胞接种到24孔培养板的每个孔中。在每个孔中加入1毫升含有10％ FBS的新鲜DMEM培养基。用转染添加剂聚丙烯酰胺将混合物稀释到最终浓度为6μg/mL。将慢病毒浓缩液连续稀释3倍至5倍浓度，以1μL/孔添加，一式两份(每个慢病毒浓度重复两次)，并混合均匀。将细胞在37℃/5％的二氧化碳培养箱中培养24小时。24小时后，消化细胞，用流式细胞仪检测CAR或EGFRt蛋白表达的阳性率，所述流式细胞仪使用抗人IgG(Fab)₂(Jackson ImmunoResearch，109-065-006)或抗人EGFRt(Biolegend，352904)流式染料。滴度按以下公式计算：慢病毒活性滴度(TU/mL)＝阳性率×稀释系数×100×10⁵。用PEI转染法包装的上述CARs(G8、VH1-VL1、VH1-VL2、VH1-VL3、VH2-VL1、VH2-VL2、VH2-VL3、VH3-VL1、VH3-VL2、VH3-VL3、GC33基准)的慢病毒浓缩物的活性滴度均大于1×10⁸TU/mL(图12)。

9.5T淋巴细胞的制备

通过CD3微珠人-冻干(MicroBeads human-lyophilized)试剂盒(购自MiltenyiBiotech)用微珠标记从AllCells购买的外周血单核细胞(PBMCs)。选择高纯度的CD3+T淋巴细胞，CD3阳性T细胞的比例超过95％。使用人CD3/CD28 T细胞激活剂(Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28,Thermo Fisher,11132D)使纯化的T细胞激活并增殖。

9.6慢病毒转染T淋巴细胞

用第9.3节中制备的慢病毒转染T细胞，获得CAR-T细胞。将第9.5节中的T淋巴细胞刺激24-48小时，然后进行显微镜检查以观察T淋巴细胞是否被激活。激活后，T淋巴细胞的体积变大，形状拉长或不规则。收集活化的T淋巴细胞，离心并重新悬浮在具有终浓度为10ng/mL IL-7和5ng/mL IL-15的T细胞培养基X-VIVO 15(Lonza，04-418Q)中。最终体积为1mL，并加入到12孔培养板中。用同样的培养基将慢病毒稀释到MOI＝5，并与1×10⁶个活化T淋巴细胞混合进行感染。将细胞和慢病毒混合物充分混合并加入到24孔板中，置于37℃，5％CO₂的培养箱中，培养过夜。第二天，再次离心细胞并更新培养基。此后每2天测量一次细胞密度，并进一步扩增细胞，细胞密度控制在NMT 2×10⁶个细胞/毫升。慢病毒感染48-72小时后，用流式细胞仪检测不同嵌合抗原受体的表达。以非转染的T淋巴细胞作为阴性对照，表达不同嵌合抗原受体的T淋巴细胞的阳性率见表12。

表12.表达不同嵌合抗原受体的T淋巴细胞的阳性率

CAR	CAR阳性率
		G8	18.8％
GC33基准	12.2％
		VH1-VL1	73.9％
VH1-VL2	78.2％
		VH1-VL3	79.7％
VH2-VL1	68.9％
		VH2-VL2	74.2％
VH2-VL3	74.0％
		VH3-VL1	69.7％
VH3-VL2	75.4％
		VH3-VL3	80.7％

用包装不同嵌合抗原受体的慢病毒感染后，T淋巴细胞在第9天培养扩增到约300倍，表明表达不同嵌合抗原受体的T淋巴细胞可以在体外扩增到一定程度，为后续体外功能研究和动物体内药效研究提供了足够数量的保证。

9.7体外毒性试验

肝细胞癌肿瘤细胞

人类HCC细胞系(HepG2,SK-HEP-1)从ATCC获得。这些细胞系通过多态短串联重复标记的DNA分析进行了测试和鉴定。HCC细胞在补充有10％ FBS的DMEM中培养。所有细胞都经过常规的支原体污染测试。通过流式细胞仪检测各种人HCC细胞系的表面GPC3表达。

目标特异性测试

在本例中，将过量表达GPC3蛋白的HepG2细胞(购自ATCC，HTB-8065)作为靶细胞，将不表达GPC3蛋白的SK-HEP-1细胞(购自ATCC，HTB-52)作为阴性靶细胞，将抗GPC3 CAR-T细胞用作效应细胞，按照不同的E：T(效应细胞：靶细胞)比例(如3：1，1：1，1：3)。体外实验结果(图13)显示，将抗GPC3 CAR-T(G8,VH1-VL1,VH1-VL2,VH1-VL3,VH2-VL1,VH2-VL2,VH2-VL3,VH3-VL1,VH3-VL2,GC33基准)与HepG2细胞共培养18小时，杀伤肿瘤细胞的效率(即特异性裂解)在24小时可以达到20％-50％(表13)。图14和表14显示了不同CAR-T细胞对GPC3阴性肿瘤细胞的特异性杀伤能力的结果。同时，通过检测培养基上清液中细胞因子(IFN-γ)的含量来评价CAR-T的特异性反应。将抗GPC3 CAR-T(G8、VH1-VL1、VH1-VL2、VH1-VL3、VH2-VL1、VH2-VL2、VH2-VL3、VH3-VL1、VH3-VL3、GC33基准)与HepG2细胞共培养18h后，共培养上清液中释放的IFN-γ细胞因子含量与杀伤试验结果一致(图15，表15)。VH1-VL1组的特异性裂解能力和上清液中释放的IFN-γ细胞因子明显高于其他CAR组。图16和表16显示了抗GPC3 CAR-T与GPC3阴性肿瘤细胞共培养的上清液中释放IFN-γ细胞因子的结果。

采用以下特异性杀伤检测方法：采用LDH释放检测试剂盒(Dojindo，CK12)进行检测，该检测是由硫辛酰胺脱氢酶催化的INT发色反应，通过比色法测量细胞毒性过程中释放的LDH活性。细胞凋亡或坏死引起的细胞膜结构的破坏将导致细胞质中的酶释放到培养物中，包括乳酸脱氢酶(LDH)，其酶活性相对稳定。细胞毒性可以通过裂解的细胞释放到培养物中的LDH的活性检测来定量分析。LDH的释放被认为是细胞膜完整性的一个重要指标，被广泛用作细胞毒性检测。

使用了以下细胞因子检测方法：人IFN-γELISA试剂盒(R&D系统公司，SIF50)用于测量细胞因子，它是基于固定化的抗原或抗体和酶标记的抗原或抗体。与固体载体表面结合的抗原或抗体保留了免疫活性，而酶标记的抗原或抗体则同时保留了免疫活性和酶活性。在检测过程中，样品中的测试物质(抗原或抗体)与固定化的抗体或抗原结合。非结合物质通过洗涤被去除，然后加入酶标记的抗原或抗体。在这种情况下，固定化的酶的量与样品中的测试物质的量有关。在加入与酶反应的底物进行显色后，可以通过颜色判断样品中测试物质的含量，进行定性或定量分析。

表13.不同细胞对GPC3阳性肿瘤细胞的特异性杀伤能力结果

表14.不同细胞对GPC3阴性肿瘤细胞的特异性杀伤能力结果

表15.抗GPC3 CAR-T与GPC3阳性肿瘤细胞共培养的上清液中释放的IFN-γ细胞因子的结果

表16.抗GPC3 CAR-T与GPC3阴性肿瘤细胞共培养的上清液中释放的IFN-γ细胞因子的结果

根据体外细胞毒性试验表明，表达不同嵌合抗原受体的T淋巴细胞对GPC3阳性肿瘤细胞有良好的杀伤作用，这为研究动物体内药效提供了合理依据。

9.8动物模型试验

在这个例子中，我们建立了一个荷肝细胞癌肿瘤(Hepatocellular Carcinomatumor)的免疫缺陷小鼠的药效学模型。HepG2癌细胞系在体外补充有10％胎牛血清的EMEM培养基中，在37℃、5％CO₂的湿润培养箱中进行单层培养。HepG2肿瘤细胞通过每周三次胰蛋白酶-EDTA处理进行常规的传代培养。收获处于指数增长期的HepG2肿瘤细胞，并计数用于接种。根据体内研究，将1×10⁷个HepG2肿瘤细胞注射到雌性NCG小鼠(购自GemPharmatech)的皮肤上。在接种后第16天给药(肿瘤体积约为80-120mm³)抗GPC3CAR-T细胞，溶剂对照组(Vehicle)给药0.9％生理盐水，Mock T(未转染质粒的T细胞)组给药2×10⁷抗GPC3 CAR-T细胞，抗GPC3 CAR-T低剂量和高剂量组(阳性细胞)分别给药3.00×10⁶和1.00×10⁷抗GPC3 CAR-T细胞。溶剂对照组(Vehicle)的给药量为200μL。Mock T组和CAR-T组的给药量为100μL。每组分配6只动物。给药后每周测量两次肿瘤体积；绘制肿瘤生长曲线，计算TGI和T/C，并在实验结束时对所有肿瘤进行拍照。在CAR-T细胞给药前(第2天)、给药后2天、9天和28天采集血液，用qPCR检测小鼠外周血中CAR的拷贝数(VCN)，以确认CAR-T细胞的扩增情况。肿瘤大小的测量是用卡尺进行的，肿瘤体积(mm³)是用公式：TV＝0.5a×b²，其中"a"和"b"分别为肿瘤的长径和短径估算的。

(1)抗肿瘤效果：结果显示，CAR-T细胞给药12天后，各药物组的疗效均显著。其中，VH1-VL1高剂量组(1×10⁷细胞)6只小鼠的肿瘤完全消退(6/6)，VH1-VL1低剂量组(3×10⁶细胞)6只小鼠中5只完全消退(5/6)，GC33基准组(1×10⁷细胞)6只小鼠中4只完全消退(4/6)(图17)。

(2)体重：由于小鼠的高肿瘤负担，溶剂对照组(Vehicle)和Mock T组在第38天体重都有明显的下降。而与溶剂对照组(Vehicle)和Mock T组相比，三个CAR-T治疗组的体重没有明显变化。抗GPC3 CAR-T细胞治疗组(VH1-VL1，3×10⁶个细胞；VH1-VL1，1×10⁷个细胞；GC33基准组，1×10⁷个细胞)之间的体重变化没有明显差异(图18)。

(3)肿瘤抑制率(TGI)统计：CAR-T细胞给药10天后，高剂量组VH1-VL1(1×10⁷细胞)的TGI高于低剂量组VH1-VL1(3×10⁶细胞)和GC33基准组(1×10⁷细胞)(图19)。

(4)肿瘤重量：实验结束后，杀死小鼠，取出肿瘤并称重。抗GPC3 CAR-T组的肿瘤重量要比溶剂对照组(Vehicle)和Mock T组轻(图20)。

(5)CAR-T扩增能力：通过qPCR方法检测CAR-T在小鼠外周血中的扩增情况，显示VH1-VL1 CAR-T在体内研究中比GC33基准具有更好的扩增能力(图21)。

其他实施方式

应当理解的是，虽然已经结合其详细描述对本申请内容进行了描述，但上述描述旨在说明而不是限制本申请的范围，本申请内容由所附权利要求的范围界定。其他方面、优点和修改都在随附权利要求的范围内。

上面描述的各种实施方式可以组合起来，以提供进一步的实施方式。本说明书中提到的和/或本申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物都通过引用全部纳入本文。本实施例的各个方面可以进行修改，以采用各种专利、申请和出版物的概念，提供进一步的实施例。

鉴于以上详细描述，可以对实施例做出这些和其他改变。总的来说，在以下权利要求中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限制于说明书和权利要求中披露的具体实施例，而是应被解释为包含所有可能的实施例以及这些权利要求有权具有的等同物的全部范围。因此，权利要求不受本发明的限制。

引用列表:

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序列表

<110> 山东博安生物技术股份有限公司

<120> 抗GPC3抗体，抗GPC3嵌合抗原受体和GPC3/CD3双特异性抗体

<130> BA10

<150> 63/047,239

<151> 2020-07-01

<150> 63/063,550

<151> 2020-08-10

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> HCDR1

<400> 1

Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Trp Met Thr

1 5 10

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> HCDR2

<400> 2

Ile Ile Ser Pro Ala Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> HCDR3

<400> 3

Ala Gly Gly Gly Gly Met Asp Pro

1 5

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> LCDR1

<400> 4

Gln Ser Ser Gln Ser Ile Val Lys Asn Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> LCDR2

<400> 5

Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> LCDR3

<400> 6

Ala Ala Ser Tyr Ser Asp Asn Ile Tyr Val

1 5 10

<210> 7

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> VH1

<400> 7

Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr

20 25 30

Tyr Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Ile Ile Ser Pro Ala Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala

50 55 60

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100 105 110

Ser Ser

<210> 8

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> VL1

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1 5 10 15

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20 25 30

Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> VL3

<400> 9

Asp Pro Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Ile Val Lys Asn

20 25 30

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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> anti-CD3-VH

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr

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35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

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65 70 75 80

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85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp

100 105 110

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115 120 125

<210> 11

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> anti-CD3-VL

<400> 11

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

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Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

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<210> 12

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> anti-CD3 OPT1a3b-VH

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

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115 120 125

<210> 13

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 13

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

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<210> 14

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> anti-CD3 OPT1a3b2b1-VH

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Thr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Trp Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

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<210> 15

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人IgGl重链的CH2

<400> 15

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105 110

<210> 16

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 克隆 40-VH

<400> 16

Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr

20 25 30

Tyr Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Ile Ile Ser Pro Ala Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Ala Thr Val Asp Leu

65 70 75 80

Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Gly Gly Gly Gly Met Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 17

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 克隆 40-VL

<400> 17

Asp Pro Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Ile Val Lys Asn

20 25 30

Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu

65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Tyr Ser Asp Asn

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> VH2

<400> 18

Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr

20 25 30

Tyr Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

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Ile Gly Ile Ile Ser Pro Ala Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Asn Ser Ala Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Gly Gly Gly Gly Met Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 19

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> VH3

<400> 19

Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr

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Tyr Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

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Ile Gly Ile Ile Ser Pro Ala Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Asn Ser Ala Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Gly Gly Gly Gly Met Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 20

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> VL2

<400> 20

Asp Pro Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Ile Val Lys Asn

20 25 30

Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Tyr Ser Asp Asn

85 90 95

Ile Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 21

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> HCDR1

<400> 21

Ser Thr Tyr Asn Met Gly

1 5

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> HCDR2

<400> 22

Thr Ile Ser Ser Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> HCDR3

<400> 23

Val Asn Asn Met Gly Asp Ile

1 5

<210> 24

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> LCDR1

<400> 24

Gln Ala Ser Glu Ser Val Tyr Lys Asp Asn Arg Leu Ala

1 5 10

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> LCDR2

<400> 25

Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> LCDR3

<400> 26

Gly Gly Tyr Lys Asp Ser Leu Phe Asp Gly Phe Pro

1 5 10

<210> 27

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 克隆 2-VH

<400> 27

Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr

20 25 30

Tyr Asn Met Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Tyr

35 40 45

Ile Gly Thr Ile Ser Ser Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp

50 55 60

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp

65 70 75 80

Leu Lys Ile Thr Asn Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Val Arg Val Asn Asn Met Gly Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Leu

115

<210> 28

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 克隆 2- VL

<400> 28

Ala Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Lys Ser Val Ala Val Gly

1 5 10 15

Asp Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Val Tyr Lys Asp

20 25 30

Asn Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val

65 70 75 80

Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Tyr Lys Asp Ser

85 90 95

Leu Phe Asp Gly Phe Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 29

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 29

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 30

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CD8铰链区

<400> 30

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

35 40 45

<210> 31

<211> 22

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 31

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 32

<211> 42

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 32

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 33

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 33

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 34

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> P2A

<400> 34

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 35

<211> 386

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 35

Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala

1 5 10 15

Phe Leu Leu Ile Pro Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu

20 25 30

Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val

35 40 45

Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn

50 55 60

Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp

65 70 75 80

Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr

85 90 95

Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu

100 105 110

Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp

115 120 125

Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln

130 135 140

His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu

145 150 155 160

Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser

165 170 175

Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu

180 185 190

Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu

195 200 205

Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro

210 215 220

Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn

225 230 235 240

Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly

245 250 255

Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro

260 265 270

Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro

275 280 285

Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val

290 295 300

Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp

305 310 315 320

Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys

325 330 335

Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly

340 345 350

Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu

355 360 365

Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His

370 375 380

Ile Val

385

<210> 36

<211> 507

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GC33 CAR

<400> 36

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

130 135 140

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

145 150 155 160

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

165 170 175

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe

180 185 190

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

195 200 205

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

245 250 255

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

260 265 270

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

275 280 285

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

290 295 300

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu

305 310 315 320

His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg

325 330 335

Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

340 345 350

Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

355 360 365

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

370 375 380

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser

385 390 395 400

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

405 410 415

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

420 425 430

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

435 440 445

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

450 455 460

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

465 470 475 480

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

485 490 495

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

500 505

Claims

1.一种抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与GPC3蛋白或其变体结合，所述抗体或抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区；所述重链可变区包括SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的CDR1，SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的CDR2和SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列的CDR3，和所述轻链可变区包括SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的CDR1，SEQID NO.5所示的氨基酸序列CDR2和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列CDR3。

2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，所述抗原结合片段选自Fab片段、Fab′片段、Fab′-SH片段、F(ab′)2片段、Fv片段和scFv片段。

3.根据权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体是单克隆抗体和/或人源化抗体。

4.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区包括与SEQIDNO.7所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区包括与SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

5.一种双特异性抗体，包括第一抗体或抗原结合片段以及第二抗原结合片段，所述第一抗体或抗原结合片段为根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特异性地与GPC3或其变体结合，所述第二抗原结合片段特异性地与CD3的一个或多个亚基或结构域，或其变体结合。

6.根据权利要求5所述的双特异性抗体，所述第二抗原结合片段选自scFv片段、Fv片段、F(ab')₂片段和Fab'片段。

7.根据权利要求6所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体或抗原结合片段包括两个相同的重链和两个相同的轻链，并且其中所述第二抗原结合片段包括两个相同的CD3单链抗体片段(scFv)，所述第一抗体或抗原结合片段的每个轻链直接或通过连接物与所述第二抗原结合片段的CD3单链抗体片段(scFv)融合。

8.根据权利要求7所述的双特异性抗体，所述CD3的单链抗体片段(scFv)包括：

SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的重链可变区，以及SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的轻链可变区；

SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的重链可变区，以及SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的轻链可变区；或

SEQ ID NO.14所示氨基酸序列的重链可变区，以及SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的轻链可变区。

9.一种嵌合抗原受体(CAR)，包括根据权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

10.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体依次包括所述抗体或其抗原结合片段、细胞外铰链区、跨膜区和细胞内信号区。

11.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体(CAR)，所述细胞外铰链区是CD8铰链区，所述跨膜区是CD8跨膜区，并且所述细胞内信号区是4-1BB和CD3ζ。

12.根据权利要求11所述的嵌合抗原受体(CAR)，所述细胞外铰链区包括SEQ ID NO:30所示的CD8铰链区，所述跨膜区包括SEQ ID NO:31所示的CD8跨膜区，以及所述细胞内信号区包括SEQ ID NO:32所示的4-1BB和SEQ ID NO:33所示的CD3ζ。

13.一种分离的核酸，包括编码根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或抗原结合片段、根据权利要求5-8中任一项所述的双特异性抗体或根据权利要求9-12任一项所述的嵌合抗原受体的核酸序列。

14.一种包含权利要求13所述核酸的载体。

15.一种分离的宿主细胞，包含权利要求13所述的核酸或权利要求14所述的载体。

16.一种药物组合物，包括根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或抗原结合片段、根据权利要求5-8中任一项所述的双特异性抗体或根据权利要求9-12任一项所述的嵌合抗原受体、根据权利要求13所述的核酸、根据权利要求14所述的载体，或根据权利要求15所述的宿主细胞。

17.根据权利要求16所述的药物组合物，还包括药学上可接受的载体。

18.权利要求16-17任一项所述的药物组合物、权利要求1-4中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求5-8中任一项所述的双特异性抗体、权利要求9-12任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求13所述的核酸、权利要求14所述的载体、或权利要求15所述的宿主细胞在制备治疗有需要的受试者的癌症的药物中的应用。

19.根据权利要求18所述的应用，所述癌症是Glypican-3阳性癌症。

20.根据权利要求19所述的应用，所述癌症是实体癌。

21.根据权利要求20所述的应用，所述Glypican-3阳性癌症包括肝癌、黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤和神经母细胞瘤中的一种或多种。