CN114222586A - 免疫检查点阻断性双特异性分子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了肿瘤靶向、免疫检查点阻断性双特异性分子。所述双特异性分子含有抗PD‑L1抗体或抗原结合片段和肽剂，所述肽剂与实体瘤的表面抗原或细胞标志物特异性地结合。本发明还提供了在多种治疗应用中使用这样的特异性分子的方法。

Description

免疫检查点阻断性双特异性分子
相关申请的交叉引用
本专利申请要求美国临时专利申请号62/861,524(2019年6月14日提交)的优先权权益。优先权申请的全部公开内容通过引用整体并出于所有目的并入本文。
背景技术
癌症药物开发的主要焦点是产生阻断癌细胞免疫逃逸的治疗。迄今为止，已经批准了调节免疫检查点的数种抗体作为药物。例如，抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4(cytotoxicT-lymphocyte antigen-4，CTLA-4)抗体伊匹单抗(Ipilimumab)于2011年被批准用于治疗黑素瘤，以及抗程序性细胞死亡1(programmed cell death-1，PD-1)抗体纳武单抗(Nivolumab)和派姆单抗(Pembrolizumab)于2014年分别被批准用于晚期黑素瘤和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。这些抗体的临床效力令人印象深刻，其中伊匹单抗和派姆单抗将患有黑素瘤的患者的三年存活提高至约70％，并且将总存活(>5年)提高至约30％。
然而，这些治疗的成功在一定程度上被许多患者响应的缺乏所阻碍。例如，在晚期NSCLC和SCLC中，用PD-1或PD-L1靶向抗体治疗的患者中仅15％至20％具有有效且持久的响应。为了克服这些缺点，已经采取了数种方法，包括将两种不同的免疫检查点阻断抗体组合以提高响应率，以及将免疫治疗与化学治疗或放射治疗组合以增强临床效力。然而，目前的免疫检查点抑制剂不是肿瘤特异性的，并且会在其他组织和器官中诱导全身免疫激活。组合免疫治疗进一步放大了这些毒性，例如，与单独的单一治疗相比，用伊匹单抗和纳武单抗的组合进行治疗使严重副作用的发生提高了2至4倍。
本领域需要用于癌症治疗的更好和更有效的免疫检查点靶向药物。本发明旨在解决这些需要和其他需要。
发明内容
在一个方面中，本发明提供了双特异性分子，所述双特异性分子含有PD-L1抗体或其抗原结合片段和至少一种肽剂，所述肽剂与肿瘤细胞表面上的抗原或分子标志物特异性地结合。在这些双特异性分子中的一些中，PD-L1抗体是单克隆抗体阿维单抗(Avelumab)、德瓦鲁单抗(Durvalumab)或阿特珠单抗(Atezolizumab)。在多个实施方案中，双特异性分子旨在靶向黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、肾癌细胞、食管癌细胞、胃肠癌细胞或胰腺癌细胞。在一些实施方案中，双特异性分子待靶向的肿瘤细胞是黑素瘤细胞，并且双特异性分子中的肽剂与MC1R特异性地结合。在这些实施方案中的一些中，肽剂是α-MSH、其类似物或其变体。在这些实施方案中的一些中，所采用的肽剂是NDP-MSH或其保守修饰变体。
在一些实施方案中，在本发明的双特异性分子中，PD-L1抗体或其抗原结合片段与肽剂共价融合。在一些实施方案中，肽剂与抗体的重链或轻链的恒定区融合。在一些实施方案中，肽剂与抗体的重链或轻链的N端融合。在这些实施方案中的一些中，肽剂通过抗体上的经改造N端残基(例如经改造Ser残基)与抗体或其抗原结合片段融合。在这些实施方案中的一些中，肽剂通过接头与抗体或其抗原结合片段融合。在一些实施方案中，采用的接头是PEG接头。在一些实施方案中，采用的接头是肽接头。在一些实施方案中，在本发明的双特异性分子中，每个抗体分子与约1至10个肽剂分子融合。
在另一个方面中，本发明提供了药物组合物，其含有治疗有效量的本文中所述的双特异性分子和可药用载体。
在另一个方面中，本发明提供了用于在对象中治疗实体瘤的方法。这些方法需要向对象施用含有双特异性分子的药物组合物，所述双特异性分子包含PD-L1抗体或其抗原结合片段和肽剂，所述肽剂与肿瘤的细胞表面抗原或分子标志物特异性地结合。在一些实施方案中，施用的双特异性分子包含PD-L1抗体阿维单抗、德瓦鲁单抗或阿特珠单抗。一些方法旨在治疗黑素瘤。在这些实施方案中的一些中，通过双特异性分子靶向的细胞表面抗原是MC1R，并且双特异性分子中的肽剂是α-MSH、其类似物或其变体。在一些方法中，在双特异性分子中，肽剂通过接头序列与抗体的重链恒定区或重链N端共价连接。在这些实施方案中的一些中，采用的接头是PEG接头。在一些实施方案中，采用的接头是肽接头。
可通过参考说明书的其余部分和权利要求书来实现对本发明的性质和优点的进一步理解。
附图说明
图1示出了NDP-MSH-αPD-L1抗体-肽缀合物的合成方案。示出了用于使抗体(NHS-BCN)和PEG衍生肽剂NDP-MSH功能化的接头的结构。还示出了NDP-MSH肽的氨基酸序列(SEQID NO:1)。
图2示出了抗PD-L1抗体和抗体缀合物的表征。(A)用SDS-PAGE对抗PD-L1抗体、NDP-MSH-αPD-L1和NR-αPD-L1缀合物的表征。在有或没有50uM DTT还原的情况下加载蛋白质。(B)MSH-αPD-L1缀合物的总配体抗体比(ligand-antibody ratio，LAR)为3.5。NDP-MSH-αPD-L1缀合位点的分布通过质谱来确定。(C)ESI-MS分析NDP-MSH-αPD-L1和NR-αPD-L1缀合物的分子量分布。通过与PNGase F(Promega，PBS pH7.4，37℃及12小时)一起孵育来去除N-聚糖。
图3示出了NDP-MSH-αPD-L1缀合物的体外活性。(A)使用ELISA通过HRP标记的多克隆抗人κ轻链抗体来检测NDP-MSH-αPD-L1、NR-αPD-L1和αPD-L1与Fc融合的人PD-L1胞外结构域的结合。误差棒表示一式三份样品的SD。(B)NDP-MSH-αPD-L1缀合物在细胞表面ELISA中以剂量依赖性方式与HEK293-MC1R(MC1R+/PD-L1-)细胞的细胞表面结合。(C)NDP-MSH-αPD-L1(30nM)与HEK293-MC1R细胞的结合被游离MSH肽剂量依赖性地竞争。αPD-L1在图中用“Ave”表示。
图4示出了NDP-MSH-αPD-L1的药代动力学和体内效力。(A)NDP-MSH-αPD-L1和对照在小鼠中的药代动力学。将PBS中的NDP-MSH-αPD-L1或对照以4mg/kg腹膜内注射到小鼠中(n＝3/组)，并分离血清以确定缀合物浓度。使用WinNonlin通过非房室分析评价浓度vs.时间曲线。示出的值是组中三只大鼠的平均值。t1/2，半衰期；tmax，最大浓度时间；Cmax，最大浓度；AUC0→inf，外推至无穷大的浓度-时间曲线下面积。(B)NDP-MSH-αPD-L1在小鼠B16-SIY黑素瘤同基因模型中的体内效力(n＝10/组)。每周3次用卡尺测量肿瘤并计算肿瘤体积。每个数据点表示每组中10只小鼠的平均肿瘤体积±SD。箭头表示药物注射的时间。与对照组(盐水)相比，p值<0.05被认为是显著的。αPD-L1在图中用“Ave”表示。
图5示出了NDP-MSH-抗PD-L1重链N端缀合物的LC-MS分析结果。
图6示出了具有用于与PD-L1抗体阿特珠单抗N端连接的不同接头和缀合位点的α-MSH类似物肽的结构。
图7示出了来自表征缀合物与人PD-L1和MC1R靶标的结合活性的研究的结果。
图8示出了来自小鼠中确定NDP-MSH-αPD-L1的血清半衰期和暴露的药代动力学(pharmacokinetic，PK)研究的结果。(A)MC1R功能测定用于计算血浆中的NDP-MSH暴露；以及(B)基于ELISA的测定用于量化PD-L1和Synagis骨架的血浆浓度。
图9示出了来自NDP-MSH-αPD-L1在小鼠B16-SIY黑素瘤同基因模型中的体内效力研究的结果。在第0天，将100μL PBS中的100万B16-SIY细胞皮下注射到C57/B6小鼠(n＝8)中，并在第5、8、11和14天以4MPK I.P.给药载剂、NDP-MSH-抗PD-L1、NDP-MSH-Synagis和PD-L1抗体。3次/周测量肿瘤尺寸。用NDP-MSH-抗PD-L1观察到了优异的抗肿瘤效力，在第26天(8只中6只)和第45天(8只中2只)动物无肿瘤。
具体实施方式
I.概述
本发明部分基于本发明人进行的关于将肿瘤特异性靶向元件引入到免疫检查点阻断剂中的研究，目的是降低由全身免疫应答引起的对正常组织的损伤。这种方法可导致治疗指数提高并促进组合检查点治疗。如本文中详述，本发明人通过将MSH类似物与抗PD-L1(αPD-L1)抗体阿维单抗或阿特珠单抗缀合来合成双特异性抗体NDP-MSH-αPD-L1。MSH特异性地靶向黑素细胞上的MC1R受体。观察到例示的双特异性抗体保持了对MC1R和PD-L1二者的结合亲和力，并显示出与其亲本αPD-L1抗体中相似的热稳定性、血清稳定性和PK特性。本发明人还检查了双特异性分子在已建立的B16-SIY黑素瘤同基因小鼠模型中的效力，并发现例示的抗体比αPD-L1抗体或NR-αPD-L1更有效。另外，肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)分析显示浸润性T细胞数目提高。总之，这些研究表明，相对于单独的抗免疫检查点治疗，将靶向元件并入到免疫检查点阻断抗体中可增强抗肿瘤活性，并且本文中例示的双特异性分子可促进使用检查点抗体组合的治疗。
因此，本发明提供了免疫检查点阻断性双特异性分子，其包含PD-L1抗体、或基于抗体的结合蛋白或来源于其的抗原结合片段，和至少一种肽或多肽剂，所述肽或多肽剂与肿瘤细胞表面上的抗原或分子标志物特异性地结合。本发明还提供了本文中所述的免疫检查点阻断性双特异性分子在治疗或预防多种实体瘤中的治疗应用。
以下部分提供了用于制备和使用本发明的组合物以及用于进行本发明的方法的更详细的指导。
II.定义
除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。以下参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Academic Press Dictionary of Science and Technology,Morris(Ed.),Academic Press(1st ed.,1992)；Oxford Dictionary of Biochemistry andMolecular Biology,Smith et al.(Eds.),Oxford University Press(修订版,2000)；Encyclopaedic Dictionary of Chemistry,Kumar(Ed.),Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002)；Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,Singleton et al.(Eds.),John Wiley&Sons(3rd ed.,2002)；Dictionary of Chemistry,Hunt(Ed.),Routledge(1st ed.,1999)；Dictionary of Pharmaceutical Medicine,Nahler(Ed.),Springer-Verlag Telos(1994)；Dictionary of Organic Chemistry,Kumar和Anandand(Eds.),Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002)；以及A Dictionary of Biology(OxfordPaperback Reference),Martin和Hine(Eds.),Oxford University Press(4th ed.,2000)。另外，提供了以下定义以帮助读者实践本发明。
术语“抗体”(也同义地称为“免疫球蛋白”(immunoglobulin，Ig))或“抗原结合片段”是指表现出与给定抗原、一种或更多种表位强烈的单价、二价或多价结合的多肽链。除非另有说明，否则本发明中使用的抗体或抗原结合片段可具有来源于任何脊椎动物物种的序列。它们可使用任何合适的技术产生，例如杂交瘤技术、核糖体展示、噬菌体展示、基因混编文库、半合成或全合成文库、或其组合。除非另有说明，否则本发明中使用的术语“抗体”包括完整抗体、抗原结合多肽片段以及下文描述或本领域公知的其他设计者抗体(参见，例如，Serafini,J Nucl.Med.34:533-6,1993)。
完整“抗体”通常包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链(约50至70kD)和两条轻(L)链(约25kD)。公认的编码抗体链的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其继而分别定义了免疫球蛋白类别：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
抗体的每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区。大多数IgG同种型(亚类)的重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3，一些IgG同种型，如IgM或IgE包含第四恒定区结构域CH4。每条轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞和经典补体系统的第一组分(Clq)的结合。
抗体的VH和VL区可进一步细分为高变区(也称为互补决定区(complementaritydetermining region，CDR))，其散布有更保守的框架区(framework regions，FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。CDR和FR区的位置和编号系统已由例如Kabat et al.,Sequences ofProteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and HumanServices,U.S.Government Printing Office(1987和1991)定义。
本文中使用的“基于抗体的结合蛋白”可表示在其他非免疫球蛋白或非抗体来源组分的情况下含有至少一个抗体来源VH、VL或CH免疫球蛋白结构域的任何蛋白质。这样的基于抗体的蛋白质包括但不限于(i)结合蛋白的Fc融合蛋白，所述结合蛋白包括具有全部或部分免疫球蛋白CH结构域的受体或受体组分，(ii)结合蛋白，其中VH和/或VL结构域与替代分子支架偶联，或(iii)分子，其中免疫球蛋白VH和/或VL和/或CH结构域以天然存在的抗体或抗体片段中通常不存在的方式组合和/或组装。
抗体片段(或“抗原结合片段”)是指保持结合同源抗原的能力的完整抗体的抗原结合部分。这样的抗体片段的一些实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含通过二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由完整抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)具有结构上保守的框架区之间改造的链间二硫键的二硫键稳定的Fv(disulfide stabilizedFv，dsFv)；(vi)由VH结构域组成的单结构域抗体(domain antibody，dAb)(参见，例如，Wardet al.,Nature 341:544-546,1989)；以及(vii)分离的互补决定区(CDR)。
“结合亲和力”通常以平衡缔合或解离常数(分别为KA或KD)表示，其继而是解离和缔合速率常数(分别为koff和kon)的倒数比。因此，等效亲和力可对应于不同的速率常数，只要速率常数的比例保持相同即可。抗体的结合亲和力通常表示为抗体的单价片段(例如Fab片段)的KD，其中单数位纳摩尔范围或更低(亚纳摩尔或皮摩尔)的KD值被认为是非常高的且具有治疗和诊断相关性。
本文中使用的术语“结合特异性”是指一种分子对另一种分子的选择性亲和力，例如抗体与抗原(或其表位或抗原决定簇)、受体与配体以及酶与底物的结合。因此，与实体的特定抗原决定簇(例如，ROR1或ROR2的特定表位)结合的所有单克隆抗体都被视为对该实体具有相同的结合特异性。
术语“保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列二者。关于特定的核酸序列，保守修饰变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中丙氨酸由密码子指定的每个位置处，密码子可改变为在不改变所编码多肽的情况下所描述的任何相应密码子。这样的核酸变异是“沉默变异”，其是一种保守修饰的变异。本文中编码多肽的每个核酸序列还描述了该核酸的每个可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(AUG和TGG除外，所述AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，所述TGG通常是色氨酸的唯一密码子)可被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异都隐含在每个描述的序列中。
对于多肽序列，“保守修饰变体”是指具有保守氨基酸替换的变体，即氨基酸残基被具有具类似电荷的侧链的其他氨基酸残基替代。具有具类似电荷的侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有以下的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
术语“接触”具有其通常含义并且指将两种或更多种试剂(例如，多肽或噬菌体)组合、将试剂和细胞组合，或将两个不同细胞群组合。接触可在体外发生，例如在试管或生长培养基中混合抗体和细胞或者混合抗体群与细胞群。接触也可在细胞中或在原位发生，例如，通过在细胞中共表达编码两种多肽的重组多核苷酸使两种多肽在细胞中接触，或者使两种多肽在细胞裂解物中接触。接触也可在对象内体内发生，例如通过向对象施用药剂以将药剂递送至靶细胞。
“人源化抗体”是包含与人VH或VL抗体框架序列的同源性T20评分大于80的抗体VH或VL结构域的抗体或抗体片段、抗原结合片段或基于抗体的结合蛋白，如由Gao et al.(2013)BMC Biotechnol.13,pp.55定义所定义。
术语“相同”或百分比“同一性”在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下是指相同的两个或更多个序列或子序列。当出于在比较窗口上或指定区域上针对最大对应性比较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过人工比对和目测所测量的，如果两个序列具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域，或在未指定时在整个序列上，具有60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，则该两个序列“基本上相同”。任选地，同一性存在于长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地存在于长度为100至500或者1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。
用于比较的序列比对方法是本领域公知的。可进行用于比较的序列的最佳比对，例如，通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482c,1970的局部同源性算法；通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970的同源性比对算法；通过Pearson和Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85:2444,1988的相似度检索方法；通过这些算法(WisconsinGenetics Software Package,Genetics Computer Group,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)的计算机实施；或通过人工对齐和目视检查(参见，例如Brent et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(ringbou ed.,2003))。适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul et al.,Nuc.Acids Res.25:3389-3402,1977和Altschulet al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990中。
程序性死亡配体1(programmed death-ligand 1，PD-L1)(也称为分化簇274(cluster of differentiation 274，CD274)或B7同源物1(B7 homolog1，B7-H1))是在人中由CD274基因编码的蛋白质。PD-L1是40kDa的1型跨膜蛋白，并在许多类型的人癌症中表达，包括在食管癌、胃肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌和肾癌中表达。PD-L1与抑制性检查点分子PD-1的结合基于与磷酸酶(SHP-1或SHP-2)的相互作用通过基于免疫受体酪氨酸的开关基序(Immunoreceptor Tyrosine-Based Switch Motif，ITSM)基序来传递抑制信号。这降低了抗原特异性T细胞在淋巴结中的增殖，同时降低了调节性T细胞(抗炎性、抑制性T细胞)的凋亡——进一步由Bcl-2基因的降低调节所介导。
术语“对象”是指人和非人动物(尤其是非人哺乳动物)。术语“对象”在本文中例如与治疗和诊断方法关联用于是指人或动物对象。动物对象包括但不限于动物模型，例如实体瘤的哺乳动物模型，所述实体瘤例如神经母细胞瘤、肉瘤、肾细胞癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、头颈癌、黑素瘤和其他癌症。非人对象的另一些具体实例包括例如牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴。
本文中使用的术语“治疗”及其变化形式和“治疗有效”不一定意味着100％或完全治疗。相反，存在被本领域普通技术人员认为具有潜在益处或治疗作用的不同程度的治疗。在这方面，本发明方法可提供任何量的任何水平的治疗。此外，本发明方法提供的治疗可包括所治疗疾病的一种或更多种病症或症状的治疗。
“载体”是可连接另一多核苷酸区段以引起所连接区段复制的复制子，例如质粒、噬菌体或黏粒。能够指导编码一种或更多种多肽的基因表达的载体被称为“表达载体”。
III.肿瘤靶向、免疫检查点阻断性双特异性分子
本发明提供了新的双特异性分子，所述双特异性分子含有PD-L1靶向抗体、或基于抗体的结合蛋白或来源于其的抗体片段和肽(或多肽)试剂，所述肽(或多肽)试剂可与实体瘤的细胞表面抗原或分子标志物特异性地结合。在本发明的双特异性分子中，肽剂可与抗体或抗体片段共价或非共价缀合。优选地，肽剂与抗体共价连接。在多个实施方案中，可使用任何类型的合适缀合将抗体与肽剂缀合。例如，重组工程和并入的硒代半胱氨酸(例如，如美国专利8,916,159中所述)可用于缀合肽剂。另一些缀合方法可包括与天然或经改造赖氨酸侧链胺或半胱氨酸侧链硫醇共价偶联。参见，例如，Wu et al.,Nat.Biotechnol,23:1137-1 146(2005)。
一般而言，肽剂与抗体或抗原结合片段的缀合不应显著影响抗体的PD-L1靶向功能。在一些实施方案中，肽剂在抗体链的CDR或可变区之外的位置与抗体缀合(例如，共价连接)。在一些实施方案中，肽剂与抗体或抗体片段的轻链恒定区连接。在一些实施方案中，肽剂与抗体或抗体片段的重链恒定区连接。在这些实施方案中的一些中，肽剂与抗体或抗体片段的Fc区连接。在本发明的一些实施方案中，所采用的PD-L1抗体不包含恒定区，例如单链抗体或单结构域抗体。在这些实施方案中，肽剂可在将对抗体的抗原识别活性影响最小的位置(例如在抗体可变结构域的框架区中)与抗体缀合。在另一些其他实施方案中，所采用的抗体可耐受在抗体的N端或C端插入缀合剂而不显著影响其结合PD-L1的能力。在这些实施方案中的一些中，肽剂可与抗体的N端连接，如本文中用PD-L1抗体阿特珠单抗所例示。在这些实施方案中的一些中，肽剂通过合适的接头在抗体链的N端与抗体缀合。在这些实施方案中的一些中，缀合在PD-L1抗体的重链N端通过经改造的N端连接位点(例如，如本文中例示的经改造的丝氨酸残基)进行。
在肽剂与抗体的缀合中可使用任何合适的连接部分。在多个实施方案中，接头部分可以是寡肽接头(包括可切割和不可切割的寡肽接头)、通过点击化学(clickchemistry)连接的化学部分、肼接头、硫脲接头、自牺牲性接头(self-immolativelinker)、琥珀酰亚胺基反式-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)接头、马来酰亚胺接头、二硫化物接头、硫醚接头和/或马来酰亚胺接头。技术人员会理解，许多其他接头也可适合于本发明。在多个实施方案中，接头可以是不可切割的或者可通过pH变化、氧化还原电位或特定胞内酶来切割。可切割寡肽接头包括蛋白酶或基质金属蛋白酶可切割的接头。应当理解，接头可包含上述的组合。例如，接头可以是缬氨酸-瓜氨酸PAB接头。在一些实施方案中，肽剂与PD-L1抗体的缀合通过经由点击化学反应的连接部分来实现。如本文中所例示的，NHS-BCN接头化合物可用于标记PD-L1靶向抗体以与肽剂缀合。通过这种连接化合物，NHS酯可与抗体中氨基酸残基(例如Fc区中的Lys残基)的伯胺(-NH2)反应。在此之后通过点击化学使BCN基团与经叠氮化物标记的肽剂反应。在另一些实施方案中，可使用短肽或寡肽接头以将肽剂与PD-L1靶向抗体的重链或轻链连接。如本文中所例示的，可将含有丝氨酸的肽接头例如G4S(GGGGS；SEQ ID NO:2)接头与PD-L1抗体阿特珠单抗的重链N端连接，以缀合MC1R靶向肽剂(例如，NDP-MSH)。在多个实施方案中，肽接头可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个G4S串联重复。在这些实施方案中，可通过例如重组技术来实现缀合。
任何PD-L1靶向抗体均可用于实践本发明。优选地，所采用的抗体或抗原结合片段是单克隆的。在一些实施方案中，所采用的PD-L1抗体与人PD-L1反应。在一些实施方案中，所采用的PD-L1抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。这些包括已被批准用于多种人治疗的数种单克隆PD-L1抗体。例如，阿特珠单抗(Tecentriq)是Roche Genentech开发的完全人源化的IgG1抗体。其被FDA批准用于尿路上皮癌和非小细胞肺癌。阿维单抗(Bavencio)是由Merck Serono和Pfizer开发的完全人IgG1抗体，并且被FDA批准用于治疗转移性梅克尔细胞癌(merkel-cell carcinoma)。德瓦鲁单抗(Imfinzi)是由AstraZeneca开发的完全人IgG1抗体，并且被FDA批准用于治疗化学放射治疗(chemoradiation)之后的尿路上皮癌和不可切除的非小细胞肺癌。如本文中用阿维单抗和阿特珠单抗例示的，这些人或人源化抗体，或来源于其的抗原结合片段(抗体片段)中的任一种均可用于实践本发明。
许多其他PD-L1抗体也是本领域已知的。参见，例如，美国专利/公开No.7943742、8383796、8217149、20090055944、20120003056、20130034559、20130045200、20130045201、20130045202、20170158767、20180196055、和20190106494、以及WO2007005874、WO2011066389、WO2010077634、WO2015112805、EP1907424和EP1899379。任何这些抗体，包括其抗体片段，也可用于构建本发明的双特异性分子。
在本发明的实践中，合适的PD-L1抗体或抗原结合片段包括完整抗体(例如，本文中例示的IgG1抗体)、抗体片段或抗原结合片段(例如，Fab片段)和基于抗体的结合蛋白，其含有保持结合同源抗原PD-L1的能力的完整抗体的抗原结合部分。这样的抗体片段的一些实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含通过二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由完整抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)具有结构上保守的框架区之间改造的链间二硫键的二硫键稳定的Fv(dsFv)；(vi)由VH或VL结构域组成的单结构域抗体(dAb)(参见，例如，Ward et al.,Nature 341:544-546,1989)；以及(vii)以及(vii)作为线性或环状肽的分离的互补决定区(CDR)。基于抗体的结合蛋白的另一些实例包括这样的多肽，其中抗体的结合结构域与其他多肽或多肽结构域(例如替代分子支架、Fc区)、其他多肽或抗体的其他功能或结合结构域组合，从而产生具有另外结合特性的分子，例如双特异性或多特异性蛋白质或抗体。这样的多肽可产生天然存在的抗体或抗体片段中通常不存在的结合或功能结构域的排列。
在本发明的一些实施方案中，所采用的PD-L1靶向抗体是抗体片段(或“抗原结合片段”)，如单链抗体。术语“单链抗体”是指包含以多肽连接通常通过间隔肽连接的VH结构域和VL结构域的多肽，并且其可在氨基和/或羧基末端包含另外的结构域或氨基酸序列。例如，单链抗体可包含用于与编码多核苷酸连接的系链区段。作为一个实例，单链可变区片段(scFv)是单链抗体。与由不同基因编码的Fv片段的VL和VH结构域相比，scFv具有通过合成接头连接(例如，通过重组方法)的两个结构域。这使得它们能够被制备为单蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子。
在一些实施方案中，本发明所采用的PD-L1靶向抗体是具有骆驼科支架的单结构域抗原结合单位。骆驼科动物包括骆驼(camel)、美洲驼(llamas)和羊驼(alpacas)。骆驼科产生不含轻链的功能性抗体。重链可变(VH)结构域自主折叠并作为抗原结合单位独立发挥作用。其结合表面与经典抗原结合分子(Fab)或单链可变片段(scFv)中的六个CDR相比仅涉及三个CDR。骆驼科抗体能够获得与常规抗体的结合亲和力相当的结合亲和力。
在一些优选实施方案中，用于实践本发明所采用的PD-L1抗体是人抗体或人源化抗体，所述人源化抗体在人源化抗体VH或VL结构域的氨基酸水平上具有与啮齿动物VH或VL结构域相比更高的与人抗体VH或VL结构域的同源性，优选具有大于80的T20评分，如Gao etal.(2013)BMC Biotechnol.13,pp.55所定义。在这些实施方案中的一些中，所采用的PD-L1抗体是阿维单抗、德瓦鲁单抗或阿特珠单抗、其抗原结合片段、或具有相同或基本上相同结合特性(例如，亲和力和/或特异性)的其他变体。在一些实施方案中，已知PD-L1抗体的变体包括含有一个或更多个保守氨基酸替换的变体。
在一些实施方案中，所采用的抗体、抗体片段或基于抗体的结合蛋白可具有这样的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，其与本文中所述的已知PD-L1靶向抗体的那些基本上相同。在这些实施方案中的一些中，除了一个或更多个氨基酸残基的保守替换，所采用的抗体可具有与已知PD-L1靶向抗体之一相同的重链CDR1至CDR3和轻链CDR1至CDR3序列。在一些实施方案中，所采用的抗体可具有分别与已知PD-L1靶向抗体的轻链可变结构域序列和重链可变序列基本上相同的轻链可变结构域序列和/或重链可变序列。在一些实施方案中，百分比同一性可以为至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，或甚至100％。在一些实施方案中，所采用的抗体、抗体片段或基于抗体的结合蛋白可以是保守修饰变体，即相对于参考抗体(例如，阿特珠单抗、阿维单抗或德瓦鲁单抗)的序列含有至少一个保守修饰残基的变体。例如，变体可在参考抗体的恒定区中、在重链或轻链可变结构域的框架区中、或甚至在重链或轻链CDR中的一个或更多个中具有一个或更多个保守修饰残基。优选地，相对于参考抗体，保守修饰变体应具有与同源靶分子基本上相同的结合特异性和/或相同或更好的结合亲和力。
本文中所述的多种PD-L1靶向抗体、抗体结合蛋白或其抗体片段可购自商业供应商或者可通过完整抗体的酶促或化学修饰来产生，或者使用重组DNA方法从头合成，或者使用噬菌体展示库来鉴定。如本文中所例示的，编码PD-L1抗体可变区序列的基因可从供应商例如Integrated DNA Technologies，Inc.(IDT)获得和通过标准PCR技术来扩增。用于产生抗体或抗原结合片段的另一些合适的方法都是本领域公知的。例如，可使用噬菌体展示文库或核糖体展示文库、基因混编文库来鉴定单链抗体(参见，例如，McCafferty et al.,Nature 348:552-554,1990；和美国专利No.4,946,778)。特别地，scFv抗体可使用描述于例如以下中的方法获得：Bird et al.,Science 242:423-426,1988；和Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883,1988。Fv抗体片段可按照Skerra和Plückthun,Science240:1038-41,1988.中所述产生。二硫键稳定的Fv片段(dsFv)可使用例如Reiteret al.,Int.J.Cancer 67:113-23,1996中描述的方法制备。类似地，单结构域抗体(dAb)可通过例如以下中描述的多种方法产生：Ward et al.,Nature 341:544-546,1989；和Cai和Garen,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:6280-85,1996。骆驼科单结构域抗体可使用本领域公知的方法产生，例如Dumoulin et al.,Nat.Struct.Biol.11:500–515,2002；Ghahroudi etal.,FEBS Letters 414:521–526,1997；和Bond et al.,J.Mol.Biol.332:643-55,2003。其他类型的抗原结合片段(例如，Fab、F(ab’)2或Fd片段)也可用常规实践的免疫学方法容易地产生。
用于本发明的多种PD-L1靶向抗体或抗体片段也可通过任何合适的技术来产生，所述技术例如，使用任何合适的真核或非真核表达系统。参见，例如Harlow&Lane,UsingAntibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,New York,1998。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可通过哺乳动物表达系统来产生。用于产生本发明的抗体基于抗体的结合蛋白或其抗体片段的一些具体技术在本文中例示，例如FreeStyle 293-F细胞表达系统。
在多个实施方案中，用于构建本发明的双特异性分子的肽或多肽剂涵盖能够与实体瘤的细胞表面抗原或分子标志物特异性地结合的任何天然存在的或合成的多肽或肽。这些包括例如在许多类型的癌症中上调的一些酪氨酸激酶受体(例如EGFR、FGFR、NGFR和ephrin受体)的配体和类似物。可用本发明的双特异性分子靶向的另一些肿瘤表面抗原或分子标志物包括例如黑皮质素1受体(melanocortin 1receptor，MC1R)，即位于黑素细胞质膜上的G蛋白偶联受体。特异性识别这些实体瘤表面抗原的许多配体是本领域公知的。例如，MC1R与一类称为黑皮质素的垂体肽激素结合，包括促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)和不同形式的黑素细胞刺激激素(melanocyte-stimulating hormone，MSH)。用于靶向肿瘤标志物的肽剂的另一些实例包括，例如，EGF、双调蛋白、肝素结合EGF样生长因子、上皮调节蛋白、转化生长因子-α和β-纤维素。参见，例如Kolonin et al.,Cancer Res.2006；66:34-40。
本发明的一些实施方案涉及靶向黑素瘤的双特异性分子。在这些实施方案中的一些中，所采用的肽剂是黑素瘤细胞表面标志物的已知配体。例如，肽剂可以是α-MSH，即在黑素瘤细胞上表达的MC1R受体的激素配体。在另一些实施方案中，所采用的肽剂可以是天然配体的合成类似物(例如，NDP-MSH)。为了靶向黑素瘤中的MC1R，合适的MSH类似物还可包括配体α-MSH或γ-MSH的任何其他已知类似物。参见，例如，Fung et al.,Curr Opin ChemBiol.2005,9:352–358；Grieco et al.,PLoS One.2013,8(4):e61614；和Zhou et al.,J.Med.Chem.2017,60,9320-9329。
除了多种已知的肽或多肽剂，它们共享相同结合功能的变体、类似物或衍生物也可用于实践本发明。这些包括，例如，具有与参考肽或多肽剂(例如，α-MSH)的序列基本上相同(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)的序列的变体肽或多肽。在这些实施方案中的一些中，所采用的变体肽或多肽剂可以是相对于参考肽或多肽含有至少一个(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个或更多个)保守修饰残基的肽或多肽剂，即保守修饰变体。
IV.双特异性分子的多核苷酸链或结构域
本发明提供了与编码包含本发明双特异性分子的链、区段或结构域的多肽的序列相同或互补的基本上纯化的多核苷酸(DNA或RNA)。本发明还提供了用于产生本文中所述的通过重组手段产生的一些双特异性功能抗体的链、区段或结构域的表达载体和宿主细胞。载体和宿主细胞的一些具体实例在本文中例示。也可使用多种其他表达载体来表达编码功能性抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的的表达载体和非病毒表达载体二者均可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质粒、附加型载体(通常带有用于表达蛋白质或RNA的表达盒)和人人工染色体(参见，例如Harrington et al.,Nat.Genet.15:345,1997)。例如，可用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达抗体多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pCEP4、pREP4、pThioHis A,B&C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A,B&C(Invitrogen，San Diego,CA)、MPSV载体和本领域已知的用于表达其他蛋白质的许多其他载体。另一些可用的非病毒载体包括包含可与Sleeping Beauty、PiggyBack和其他转座子系统一起移动的表达盒的载体。可用的病毒载体包括基于慢病毒或其他逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体、基于SV40的载体、乳头瘤病毒、HBP EB病毒(EpsteinBarr virus)、痘苗病毒载体和西门利克森林病毒(Semliki Forest virus，SFV)。参见，Brent et al.,supra；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995；和Rosenfeld et al.,Cell 68:143,1992。
用于容纳和表达功能性双特异性抗体链的宿主细胞可以是原核的或真核的。在一些优选实施方案中，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本发明的抗体多肽。例如，它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系或容纳外源表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常的普通人或正常或异常的永生性的动物或人细胞。除了本文中例示的细胞系之外，本领域还已知能够分泌完整免疫球蛋白的许多其他合适的宿主细胞系。这些包括，例如，CHO细胞系、多种HEK 293细胞系、多种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、经转化的B细胞和杂交瘤。使用哺乳动物组织细胞培养表达多肽在例如Winnacker,From Genes toClones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中进行了一般性讨论。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可包含表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子，以及必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有来源于哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的和/或可调节的或可调控的。可用的启动子包括但不限于本文中例示的EF1α和人UbC启动子、金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子(dexamethasone-inducible MMTV promoter)、SV40启动子、MRPpol III启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(例如人即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转化通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主(一般参见Sambrook et al.，同上)。另一些方法包括，例如，电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、冲击方法(ballistic method)、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22融合(Elliot和O'Hare,Cell 88:223,1997)，试剂增强的DNA摄取和离体转导。对于重组蛋白的长期高产率产生，将通常期望稳定表达。例如，可使用本发明的表达载体制备稳定表达抗体链或结合片段的细胞系，所述表达载体含有病毒复制起点或内源性表达元件和选择性标志物基因。在引入载体之后，可使细胞在富集培养基中培养1至2天，然后将其切换到选择性培养基。选择性标志物的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功表达引入序列的细胞在选择性培养基中生长。可使用适合于细胞类型的组织培养技术来增殖具抗性的、稳定转染的细胞。
V.治疗应用和相关药物组合物
本发明的肿瘤靶向双特异性分子可用于多种治疗或预防应用。根据双特异性分子中肽剂的靶标，可用本发明的双特异性分子治疗或预防多种类型的肿瘤。在多个实施方案中，可治疗的肿瘤包括例如黑素瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、神经母细胞瘤、肉瘤、肾细胞癌、头颈癌。通常来说，本发明的治疗方法需要向患有肿瘤、怀疑患有肿瘤或处于发展肿瘤风险的对象施用本文中所述的双特异性分子，所述肿瘤表达可被所采用的双特异性分子中的肽剂靶向的细胞标志物。在一些实施方案中，可用本发明的双特异性分子治疗患有黑素瘤或处于发展黑素瘤风险的对象。例如，本文中例示的MC1R靶向双特异性分子可容易地用于在对象中治疗黑素瘤、减慢黑素瘤进展或预防黑素瘤发展。
在一些实施方案中，本发明的双特异性分子可与其他治疗剂一起用于肿瘤的组合治疗。例如，双特异性分子可与其他免疫检查点抑制剂、细胞毒性剂、细胞抑制剂、抗血管生成剂或治疗性放射性同位素一起使用。在这些实施方案中的一些中，该方法可包括共施用适合于治疗癌症的细胞毒性剂、细胞抑制剂或抗血管生成剂或免疫刺激剂(例如免疫检查点抑制剂抗体，例如但不限于与PD1、PDL1、CTLA4、OX40、TIM3、GITR、LAG3等结合的那些)。因此，在用于治疗黑素瘤的多个实施方案中，本文中所述的黑素瘤靶向双特异性分子可与例如PD-1抑制剂例如派姆单抗(Keytruda)和纳武单抗(Opdivo)、CTLA-4抑制剂例如伊匹单抗(Yervoy)，或细胞因子例如干扰素α和IL-2α组合使用。类似地，本文中所述的用于靶向其他类型肿瘤的双特异性分子可与用于治疗相应肿瘤(例如食管癌、胃肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌和肾癌)的已知治疗组合使用。
为了用于本文中所述的治疗方法，本发明还提供了含有本发明双特异性分子以及可药用载体的药物组合物。药物组合物可由本文中所述的任何双特异性分子(例如，本文中例示的含有PD-L1抗体阿维单抗或阿特珠单抗的黑素瘤靶向双特异性分子)制备。可药用载体可以是任何合适的可药用载体。其可以是适合于施用到人或兽患者中的一种或更多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂、其他赋形剂、或包封物质(例如，生理学上可接受的载体或药理学上可接受的载体)。术语“载体”表示与活性成分组合以促进活性成分的使用，例如将活性成分施用于对象的天然或合成的有机或无机成分。可药用载体可与一种或更多种活性组分(例如杂交分子)共混，以及当在组合物中存在多于一种可药用载体时彼此共混，以使得基本上不损害所期望的药物效力的方式。可药用物质通常能够施用于对象，例如患者，而不会产生显著的不期望的生理作用，例如恶心、晕眩、疹或胃部不适。例如，当出于治疗目的施用于人患者时，则期望包含可药用载体的组合物不具有免疫原性。
本发明的药物组合物可另外含有合适的缓冲剂，包括例如盐形式的乙酸、盐形式的柠檬酸、盐形式的硼酸和盐形式的磷酸。组合物还可任选地含有合适的防腐剂，例如苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。本发明的药物组合物可以以单位剂型存在并且可通过任何合适的方法来制备，其中许多方法是药学领域公知的。这样的方法包括使本发明抗体与构成一种或更多种辅助成分的载体缔合的步骤。一般而言，组合物通过使活性剂与液体载体、细碎的固体载体或二者均匀且紧密地缔合，并随后如果需要的话，使产品成型来制备。
适合于肠胃外施用的组合物方便地包含本发明组合物的无菌水性制剂，其优选地与接受者的血液等张。该水性制剂可根据已知方法使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂来配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液剂或混悬剂，例如如在1,3-丁二醇中的溶液剂。可使用的可接受的载剂和溶剂是水、林格液(Ringer's solution)和等张氯化钠溶液。另外，常规使用无菌的不挥发性油作为溶剂或助悬介质。为此目的，可使用任何温和的不挥发性油，例如合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸(例如油酸)可用于制备注射剂。适合于经口、皮下、静脉内、肌内等施用的载体制剂可见于例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Mack PublishingCo.,20th ed.,2000中。
本发明药物组合物的制备及其多种施用途径可根据本领域公知的方法进行。参见，例如，Remington,同上；Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。可用于本发明背景中的递送系统包括时间释放、延迟释放和持续释放递送系统，使得本发明组合物的递送发生在待治疗部位的致敏之前，并且进行足够的时间以引起待治疗部位的致敏。本发明组合物可与其他治疗剂或治疗结合使用。这样的系统可避免重复施用本发明组合物，从而提高对象和医师的便利性，并且可特别适合于本发明的某些组合物。
许多类型的释放递送系统是本领域普通技术人员可用和已知的。合适的释放递送系统包括聚合物基质体系，例如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己内酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酸酐。包含药物的前述聚合物的微囊剂描述于例如美国专利5,075,109中。递送系统还包括非聚合物系统，它们是：脂质，包括固醇(例如胆固醇、胆固醇酯)和脂肪酸或中性脂肪(例如甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)；水凝胶释放系统；sylastic系统；基于肽的系统；蜡包衣；使用常规黏合剂和赋形剂的压制片剂；部分融合的植入物等。一些具体实例包括但不限于：(a)侵蚀系统，其中活性组合物以在基质中的形式被包含，例如描述于美国专利4,452,775、4,667,014、4,748,034和5,239,660中的那些，以及(b)扩散系统，其中活性组分以受控速率从聚合物中渗透，例如美国专利3,832,253和3,854,480中所述。另外，可使用基于泵的硬件递送系统，其中一些适合于植入。
实施例
提供以下实施例以进一步举例说明本发明但不限制其范围。本发明的其他变化形式对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的并且被所附权利要求书涵盖。
实施例1.NDP-MSH-αPD-L1缀合物的构建
作为黑素瘤风险的标志物，MC1R在超过80％的人黑素瘤中以显著更高的水平表达。多年来，放射性标记的α-MSH(MC1R的天然配体)及其类似物已被用于黑素瘤成像和治疗。因此，我们初始选择α-MSH作为靶向剂，并将α-MSH类似物与抗PD-L1单克隆抗体阿维单抗化学缀合。为了产生双特异性抗体，合成了具有PEG接头的强效的MSH类似物[Nle4,D-Phe7]-MSH(NDP-MSH)(叠氮基-PEG24-SYS-Nle-EHfRWGKPV-CONH2,Nle＝正亮氨酸,f＝D-形式Phe)(图1)。这种生物稳定的合成MSH类似物于2015年在欧洲获得批准，用于在患有红细胞生成性原卟啉症(erythropoietic protoporphyria，EPP)的人中预防UV皮肤损伤，并且与MC1R的结合亲和力高于α-MSH(0.67±0.09nM vs 2.58±0.33nM)，这有助于克服内源性配体的体内竞争。该肽在体内显示出高储存稳定性(shelf stability)和良好的生物稳定性。还合成了具有相似但非结合序列的肽并将其用作对照(NR,叠氮基-PEG24-SEGYHKSfRP-Nle-WV-CONH2)。人IgG1αPD-L1抗体阿维单抗具有人和小鼠的交叉反应性(Kd分别为0.3nM和1nM)，并因此被选为抗体骨架。将阿维单抗的重链和轻链基因克隆到pFuse载体中，并通过瞬时转染在FreeStyle 293F细胞中共表达，产量为30mg/L。SDS/PAGE分析显示>90％纯度(图2A)。在通过二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)还原之后，轻链迁移在25kDa处，并且重链迁移在50kDa处，与计算的重链和轻链分子量相匹配。
抗PD-L1/NDP-MSH(NDP-MSH-αPD-L1)双特异性抗体通过两步连接通过将NDP-MSH的NHS酯与αPD-L1抗体的赖氨酸残基非特异性地缀合来产生(图1)。简言之，将NHS-BCN与αPD-L1抗体(1mg/ml)的暴露赖氨酸的伯胺在pH 8.3的磷酸缓冲盐水(PBS)中在室温下缀合1小时以形成稳定的酰胺键。在使用脱盐柱去除未反应的NHS-BCN之后，将BCN缀合的αPD-L1抗体(0.8mg/ml)通过无催化剂的“点击反应”与叠氮基-PEG24-NDP-MSH(或-NR)以1:20摩尔比在pH 7.0和37℃下反应24小时。通过尺寸排阻色谱来纯化产物以去除过量的非缀合NDP-MSH肽。在还原和非还原条件下通过SDS/PAGE来分析抗体缀合物。在通过DTT还原之后，轻链迁移在25至35kDa处，并且重链迁移在50至65kDa处，以多个条带的形式，每个条带之间的增量为约3kDa(图2A)。该抗体在化学计量为1至8个MSH肽/抗体下90％缀合，如通过质谱分析用预期分子量所确定的(图2C)。基于质谱分析，平均的MSH配体与抗体比(LAR)为约3.5(图2B)。通过相同的方法来产生和分析抗PD-L1/NR(NR-αPD-L1)。纯化的缀合产物的总产率为30至40％，并且缀合物可浓缩至12mg/ml而不发生聚集。
实施例2.NDP-MSH-αPD-L1缀合物的体外活性
接下来，我们表征了缀合物与其各自受体的结合。NDP-MSH-αPD-L1和NR-αPD-L1通过ELISA显示出与单独αPD-L1抗体的与人PD-L1(胞外结构域)-Fc融合蛋白的结合亲和力(EC50＝0.19±0.01nM)几乎相同的与之结合亲和力(分别为EC50＝0.17±0.02nM和0.18±0.01nM)(图3A)。该结果表明LAR＝3.5不会显著影响缀合抗体与PD-L1的结合。NDP-MSH-αPD-L1与人MC1R的结合通过细胞表面ELISA用过表达人MC1R的HEK293细胞系进行分析，如Yang et al.,Molecular and Cellular Endocrinology 454:69-76,2017中报道的。NDP-MSH-αPD-L1以剂量依赖性方式结合HEK293-MC1R细胞(EC50＝1.72±0.31nM)(图3B)，并且这种特异性结合被游离MSH肽竞争(图3C)。还使用过表达MC1R并携带cAMP响应元件(cAMPresponse element，CRE)萤光素酶(Luc)报道子的HEK 293细胞检查了NDP-MSH-αPD-L1缀合物的活性。细胞表面MC1R被NDP-MSH-αPD-L1剂量依赖性地激活，并且下游信号转导以EC50＝2.70±1.03nM诱导，类似于来自细胞表面ELISA测定的值。该结果表明，NDP-MSH-αPD-L1可在这种基于细胞的报道测定中以纳摩尔效力激活MC1R，类似于叠氮基-PEG24-NDP-MSH的效力(EC50＝0.94±0.11nM)，但低于NDP-MSH肽的效力(EC50＝0.09±0.02nM)。鉴于叠氮基-PEG24-NDP-MSH和抗体缀合物的类似的EC50，这种对MC1R的亲和力降低可能是由于NDP-MSHN端的接头在某种程度上干扰了MC1R的接合。
阿维单抗与人和小鼠PD-L1有交叉反应，并因此适合于同基因小鼠模型中的体内效力研究和最终的人临床研究二者。同样，NDP-MSH与人和小鼠MC1R二者结合。我们进一步确定了NDP-MSH-αPD-L1缀合物与高度表达小鼠PD-L1和MC1R的小鼠B16-SIY细胞(来源于B16的黑素瘤细胞系)的结合。将500nMαPD-L1与B16-SIY细胞一起孵育导致流式细胞术分析出现峰移(peak shift)。用NDP-MSH-αPD-L1和NR-αPD-L1观察到类似的结合。这些结果表明双特异性缀合物可在体外以良好的亲和力结合MC1R和PD-L1二者，并表明B16-SIY小鼠黑素瘤模型可用于研究其效力。
实施例3.NDP-MSH-αPD-L1的血清稳定性和药代动力学分析
在新鲜收集的小鼠血清中检查了NDP-MSH-αPD-L1的稳定性。使用PD-L1(ECD)-Fc融合抗原通过ELISA确定缀合抗体的浓度。在72小时孵育期间，没有观察到显著的降解，表明肽缀合物不会降低抗体在小鼠血清中的稳定性。另外，NDP-MSH-αPD-L1在热稳定性测定中的熔解温度为64℃，与αPD-L1的熔解温度类似。我们接下来进行了NDP-MSH-αPD-L1在小鼠中的药代动力学(PK)分析，在血清稳定性测定中使用与上述相同的ELISA方法分析血浆样品。NDP-MSH-αPD-L1、NR-αPD-L1和αPD-L1抗体在腹膜内注射之后显示出相似的PK谱，其中终末半衰期为16至19小时(图4A)，这对于人IgG在小鼠中来说是典型的。
实施例4.NDP-MSH-αPD-L1缀合物的体内效力
荷B16-F10鼠黑素瘤模型用于研究MC1R靶向放射治疗。B16-SIY细胞来源于B16-F10，表达经改造的模型抗原SIYRYYGL(SIY)，所述B16-SIY细胞与B16细胞相比更具免疫原性并响应于αPD-L1处理。因此，我们选择B16-SIY细胞来开发小鼠MC1R+/PD-L1+黑素瘤同基因模型，并用其来比较αPD-L1、NR-αPD-L1和NDP-MSH-αPD-L1的体内效力。具体地，将C57BL/6小鼠在第0天s.c.接种1.5×106个B16-SIY肿瘤细胞，并在注射之后第5天，当肿瘤体积达到约100mm3时开始处理。所述处理由每两天四次腹膜内注射组成。对于每种构建体，以1mg/kg和5mg/kg的剂量处理小鼠组(n＝10/组)。将对照组仅用盐水处理。如图4B中所示，用NDP-MSH-αPD-L1处理表现出显著的抗肿瘤作用。用5mg/kg剂量的NDP-MSH-αPD-L1处理的小鼠表现出强烈的肿瘤生长抑制(第23天p<0.05)，在5mg/kg NDP-MSH-αPD-L1处理组中，80％的小鼠的肿瘤尺寸低于500mm3，并且20％的小鼠在处理时间期间显示出肿瘤消退。在用1mg/kg处理的小鼠中，在处理期间肿瘤生长减慢。相比之下，除仅用盐水观察到的之外，用5mg/kgαPD-L1抗体或NR-αPD-L1处理小鼠没有显示出显著的抗肿瘤作用(第23天分别为p＝0.174和0.345)。
为了更好地了解这种双特异性抗体如何降低肿瘤负荷，我们检查了肿瘤环境中小鼠T细胞的数目与NDP-MSH-αPD-L1对肿瘤生长的抑制是否相关。在第23天收获肿瘤，并通过酶消化从实体瘤中分离细胞。通过流式细胞术分析肿瘤内的T细胞群。在用小鼠CD3表面标志物染色之后，结果确定了，与用αPD-L1(0.45±0.6％)抗体或NR-αPD-L1(0.8±0.46％)处理的组相比，在5mg/kg NDP-MSH-αPD-L1处理(1.8±1.9％)之后，显著更高百分比的CD3+T细胞在肿瘤组织中积累。
实施例5.N端缀合的αPD-L1双特异性分子的产生和表征
除了具有在恒定区缀合的MC1R靶向剂的αPD-L1双特异性分子之外，我们还通过经改造的丝氨酸残基在N端通过位点特异性缀合产生了另外的靶向黑素瘤的MSH-αPD-L1缀合物。由于抗体的重链中仅存在一个经改造丝氨酸，因此所得缀合物是均质的，并且配体与抗体比(LAR)为2。这与一些其他缀合方案不同，例如，通过赖氨酸残基的缀合，其由于抗体上存在数个暴露的赖氨酸残基并且所有残基都可能与缀合配偶体反应的事实，可导致产生异质缀合产物。
具体地，我们使用了PD-L1抗体阿特珠单抗，其允许N端缀合而不影响PD-L1结合。我们首先在遗传上改造了丝氨酸残基，随后在重链结构域的N端添加了8x(G4S)接头，并将其在293F细胞中重组表达。然后将末端丝氨酸残基的2-氨基醇通过PH 7.4的磷酸缓冲盐水中的高碘酸钠在室温下氧化为醛，持续15分钟。将未反应的高碘酸钠通过丝氨酸中和并通过脱盐柱去除。最后，合成烷氧基胺衍生的肽剂(例如，NDP-MSH)，并将其在室温下在磷酸缓冲盐水PH 6中用催化剂对茴香胺通过肟连接来与抗PD-L1重链缀合，持续3小时。通过尺寸排阻色谱来纯化产物以去除过量的非缀合NDP-MSH肽。如图5中所示，使用LC-MS检查了抗体药物缀合物(antibody drug conjugate，ADC)，并且正如预期的那样，药物与抗体比(drug-to-antibody ratio，DAR)为2。
然后我们用对MC1R具有最高结合亲和力的MSH类似物优化ADC构建体。α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)(十三肽)是对MC-1R具有纳摩尔结合亲和力的天然配体。我们合成了具有不同接头和缀合位点的一系列α-MSH类似物。一些化合物示于图6中。我们将具有不同接头的MSH类似物通过N端丝氨酸缀合与对照抗体Synagis缀合，并通过LC-MS分析缀合物。结果表明缀合反应完成，并且缀合效率大于90％。
我们通过体外MC1R cAMP活性测定表征了多种肽和抗体缀合物。使用了B16-SIY细胞，其具有可被MSH激活的表面MC1R。下游cAMP信号传导可被诱导并通过cAMP-GloTM测定读出。具体地，将B16-SIY细胞在含有10％FBS和1％青霉素和链霉素的DMEM中培养。将细胞以每孔5000个细胞的密度接种在384孔板中，并用不同浓度的肽、Synagis缀合物或抗PD-L1缀合物在37℃和5％CO2下处理24小时。然后使用cAMP-Glo(Promega，WI)按照制造商说明来测量发光强度。在Graphpad Prizm中通过log(抑制剂)vs.响应模型中的非线性回归来绘制和分析数据。基于从测定中获得的结果，我们选择H2NO-NDP-MSH作为我们的靶向组分，并将其缀合在Synagis和抗PD-L1上。除了8xG4S接头之外，这些缀合物在肽类似物与抗体的N端之间不含有其他接头部分。
检查缀合物与PD-L1和MC1R的结合。结果示于图7中。具体地，NDP-MSH-αPD-L1通过ELISA显示出与单独αPD-L1抗体的与人PD-L1(胞外结构域)-Fc融合蛋白的结合亲和力(EC50＝0.074nM)几乎相同的与之结合亲和力(EC50＝0.087nM)。该结果表明该缀合位点不会显著影响缀合抗体与PD-L1的结合。通过B16-SIY细胞cAMP-GloTM测定来分析NDP-MSH-αPD-L1对人MC1R的效力。NDP-MSH-Synagis和NDP-MSH-抗PD-L1二者均显示出与单独的NDPMSH肽相似的效力，其表明NDP-MSH-αPD-L1和NDP-MSH-Synagis可在这种基于细胞的激活测定中以纳摩尔效力(分别为EC50＝0.02nM和0.06nM)激活MC1R，类似于NDP-MSH(EC50＝0.06nM)。基于此结果，我们选择NDPMSH-Synagis和抗PD-L1作为我们用于体内研究的对照。
实施例6.N端缀合的αPD-L1双特异性分子的体内活性
我们在小鼠中进行了药代动力学(PK)研究以确定NDP-MSH-αPD-L1的血清半衰期和暴露。将单剂量(4mg/kg)的PBS(pH 7.4)中的NDP-MSH-αPD-L1、NDP-MSH-Synagis和αPD-L1 I.P.给药于C57/B6小鼠(n＝6)并在7、24、72、144、168、192、240和336小时通过眶后出血收集血浆样品。将基于ELISA的测定用于量化PD-L1和Synagis骨架的血浆浓度，并使用MC1R功能测定来计算血浆中的NDP-MSH暴露。如图8中所示，所有受试分子都具有高至144小时的高水平暴露，并且NDP-MSH缀合是水解稳定的并且超过144小时超出有效浓度(0.02nM)。
我们进一步检查了缀合物在体内同基因模型中的活性。B16-F10是用于研究MC1R靶向放射治疗的MC1R+/PD-L1+黑素瘤细胞系。B16-SIY是来自B16-F10的表达经改造的模型抗原SIYRYYGL(SIY)的衍生细胞系，其与B16-F10细胞相比更具免疫原性，并响应于αPD-L1处理鼠。选择B16-SIY同基因小鼠模型来比较αPD-L1、NDP-MSH-Synagis和NDP-MSH-αPD-L1的体内效力。如图9中所示，结果表明用NDP-MSH-αPD-L1处理产生了显著的抗肿瘤作用。用4mg/kg剂量的NDP-MSH-αPD-L1处理的小鼠表现出强烈的肿瘤生长抑制。8只小鼠中有6只在第26天无肿瘤，并且8只小鼠中有2只在第45天没有长出肿瘤。与仅aPD-L1处理组相比，存活曲线显示出2星显著性。
实施例7.一些例示的材料和方法
化学品和肽。具有PEG接头的NDP-MSH([Nle4,D-Phe7]-MSH)(叠氮基-PEG24-SYS-Nle-EHfRWGKPV-CONH2,Nle＝正亮氨酸,f＝D-形式Phe)和具有肽PEG接头的NR-MSH(NR,叠氮基-PEG24-SEGYHKSfRP-Nle-WV-CONH2)通过Innopep In合成。(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(BCN-NHS)购自Sigma(目录号744867)。
抗体表达载体的克隆。编码αPD-L1抗体重链和轻链可变区的基因通过IDT(Coralville，IA)合成，并通过聚合酶链反应(PCR)使用PfuUltra II DNA聚合酶(AgilentTechnologies,CA)进行扩增。使用Gibson组装试剂盒(NEB，MA)将扩增的PCR产物克隆至pFuse-hIgG1-Fc骨架载体(InvivoGen，CA)。所得哺乳动物表达载体的序列通过DNA测序确定。
抗体表达和纯化。含有抗体重链和轻链的表达载体通过在FreeStyle293-F细胞(Thermo Fisher Scientific，IL)中根据制造商方案瞬时转染来共表达。在添加质粒-293fectin(plasmid-293fectin)混合物之后，将瓶中的细胞在37℃、5％CO2环境中以125rpm摇动。在96小时之后收获含有分泌蛋白的培养基并进行无菌过滤。通过蛋白A色谱(Thermo Fisher Scientific，IL)来纯化抗体，并在存在和不存在二硫苏糖醇(DTT)的情况下通过SDS-PAGE凝胶和ESI-Q-TOF蛋白MS进行分析。
抗体-肽缀合物的产生。NHS-BCN与αPD-L1抗体(1mg/ml)表面上暴露的赖氨酸的伯胺在弱碱性磷酸缓冲盐水(PBS)条件(pH 8.3)中在室温下反应1小时，以产生稳定的酰胺键。将NHS-BCN与αPD-L1抗体的摩尔比优化为40，以实现最佳缀合产率。将反应混合物加载到40KMWCO Spin Desalting Column(Thermofisher，目录号87766)上，以将BCN缀合的αPD-L1抗体与游离NHS-BCN分离。然后将BCN缀合的αPD-L1抗体(0.8mg/ml)与叠氮基-PEG24-NDP-MSH(或-NR)以1:20摩尔比混合。该反应在PBS(pH 7.0)及37℃中进行24小时，在此期间BCN部分通过无铜点击化学(copper-free click chemistry)与肽上的叠氮基共价连接，其中基于质谱分析缀合效率>90％。
抗体-肽缀合物的纯化和表征。NDP-MSH-αPD-L1(或NR-)缀合物通过FPLC在PBS(pH7.4)中以0.4ml/分钟的流量用尺寸排阻柱(Superdex200 10/300GL，GE Healthcare)进行纯化。将280nm处的UV吸光度相对于洗脱时间或洗脱体积绘制。配体与抗体比(LAR)通过ESI-Q-TOF蛋白MS来确定。
NDP-MSH-αPD-L1的PD-L1结合亲和力的测量。将100ng/孔人PD-L1-Fc融合体(SinoBiological，China)在96孔ELISA板上在PBS(pH7.4)中在4℃下包被过夜，随后用PBS(pH7.4)中的2％脱脂乳在37℃下封闭1小时。在用PBS中的0.05％吐温20洗涤之后，添加不同浓度的NDP-MSH-αPD-L1/NR-αPD-L1/αPD-L1，并在室温下孵育2小时。然后添加1:2000稀释的HRP标记的多克隆抗人κ轻链抗体(Thermo Fisher Scientific，IL)并在室温下孵育2小时。在洗涤之后，用QuantaBlu荧光过氧化物酶底物(Thermo Fisher Scientific，IL)来显影荧光，并使用Spectramax荧光读板仪在325nm激发和420nm发射下定量。在Graphpad Prizm中通过log(激动剂)vs.响应模型中的非线性回归来绘制和分析数据。
NDP-MSH-αPD-L1的MC1R结合亲和力的测量。将HEK29细胞在含有10％FBS和1％青霉素和链霉素的DMEM中培养。使用lipofectamine(Life Technologies，MD)用含有人MC1R基因的质粒转染细胞。通过对G418的抗性选择永久转染的克隆细胞系。将MC1R过表达细胞在平底96孔板(黑色)上培养过夜以使得附着(2×104/孔)。在用PBS缓冲液洗涤之后，通过旋转减慢并在8％多聚甲醛中孵育15分钟，将细胞固定到孔底上。添加不同浓度的NDP-MSH-αPD-L1或αPD-L1用于结合测定。对于竞争测定，将存在不同浓度MSH下的30nM的NDP-MSH-αPD-L1或αPD-L1与HEK293 MC1R细胞一起孵育。其他ELISA程序与由Abcam(ICE，ab111542)公开的那些相同。对于最后的步骤，将HRP标记的抗人IgG(Fc)抗体(ELITechGroup，Netherland)在封闭缓冲液(PBS/5％BSA/0.1％吐温20)中按1:1000稀释，并应用1小时，随后广泛洗涤。然后添加QuantaBlu荧光过氧化物酶底物并如上所述获得荧光信号。
体外MC1R激活测定。将过表达MC1R受体和CRE-Luc报告子的HEK 293细胞在含有10％FBS的DMEM中在37℃和5％CO2下培养。将细胞以每孔5000个细胞的密度接种在384孔板中，并用不同浓度的缀合物或对照在37℃和5％CO2下处理24小时。然后使用One-Glo(Promega，WI)按照制造商说明测量发光强度。在Graphpad Prizm中通过log(激动剂)vs.响应模型中的非线性回归来绘制和分析数据。
与B16-SIY细胞系结合的流式细胞术分析。将B16-SIY细胞在含有10％FBS和1％青霉素和链霉素的DMEM中培养。在分析之前，将细胞用冷PBS(pH7.4)洗涤3次，用PBS中的2％BSA封闭，并与500nM抗体在4℃下孵育1小时。在通过用PBS中的2％BSA洗涤来去除未结合的抗体之后，将细胞与FITC抗人IgG Fc(KPL，MD)在4℃下在轻轻混合下重悬1小时，随后用PBS中的2％FBS洗涤并通过配备的LSR II流式细胞仪(Becton Dickinson，NJ)进行分析。将所有结果均用FlowJo软件(TreeStar，OR)处理。
NDP-MSH-αPD-L1缀合物的体内效力研究。效力研究用6周龄雌性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory，n＝10)进行。B16-SIY细胞自黑素瘤细胞系B16F10改造而来，即可被CD8+T细胞识别的模型抗原SIYRYYGL(SIY)。在第0天，在每只C57BL/6小鼠的胁腹皮下(s.c.)注射总共1.5×106B16-SIY黑素瘤细胞。在肿瘤接种之后第5天，基于肿瘤体积对动物进行分选，并将每只小鼠腹膜内(i.p.)给药抗体或盐水4个剂量，间隔3天(第5天、第8天、第11天和第14天)，以1mg/kg或5mg/kg。每周3次用卡尺测量和记录肿瘤。基于长度×1/2(宽度)计算肿瘤体积。在肿瘤注射之后第23天将小鼠安乐死。收获肿瘤用于进一步分析。
肿瘤浸润性T淋巴细胞的分析。通过在含有1mg/ml胶原酶、0.1mg/ml DNase I和2.5U/ml透明质酸酶的HBSS(Thermo Fisher Scientific，IL)中在持续搅拌下于室温下酶消化2小时从实体瘤制备肿瘤细胞悬液。使所得悬液通过70um细胞过滤器，用HBSS洗涤一次，并重悬在含有3％BSA的PBS中，至浓度为1×106个细胞/ml以用于流式细胞术分析。CD3+T细胞的频率通过染色FITC标记的抗小鼠CD3抗体(eBioscience，San Diego，CA)来确定。使用LSR II流式细胞仪(Becton Dickinson，NJ)获取细胞并用FlowJo软件(TreeStar，OR)进行分析。将未配对t检验(双尾)用于在两个处理组之间进行比较。数据的所有统计学评价均使用Graph Pad Prism软件进行。在p值<0.05时达到统计学显著性。
***
尽管出于清楚理解的目的，已经通过举例说明和实例的方式详细地描述了前述发明内容，但是根据本发明的教导，对于本领域普通技术人员将显而易见的是，在不背离所附权利要求书的精神或范围的情况下，可以对其进行某些改变和修改。
在本说明书中引用的所有出版物、数据库、GenBank序列、专利和专利申请均通过引用并入本文，就如同每一个被具体地和单独地指明通过引用并入一样。

Claims (24)

1.双特异性分子，其包含PD-L1抗体或其抗原结合片段和至少一种肽剂，其中所述肽剂与肿瘤细胞表面上的抗原或分子标志物特异性地结合。
2.权利要求1所述的双特异性分子，其中所述PD-L1抗体是单克隆抗体阿维单抗、阿特珠单抗或德瓦鲁单抗。
3.权利要求1所述的双特异性分子，其中所述肿瘤细胞是黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、肾癌细胞、食管癌细胞、胃肠癌细胞或胰腺癌细胞。
4.权利要求1所述的双特异性分子，其中所述肿瘤细胞是黑素瘤细胞，并且所述肽剂与MC1R特异性地结合。
5.权利要求4所述的双特异性分子，其中所述肽剂是α-MSH、其类似物或其变体。
6.权利要求5所述的双特异性分子，其中所述肽剂是NDP-MSH或其保守修饰变体。
7.权利要求1所述的双特异性分子，其中所述PD-L1抗体或其抗原结合片段与所述肽剂共价融合。
8.权利要求7所述的双特异性分子，其中所述肽剂与所述抗体的重链恒定区或N端融合。
9.权利要求7所述的双特异性分子，其中所述肽剂通过接头与所述抗体或其抗原结合片段融合。
10.权利要求9所述的双特异性分子，其中所述接头是PEG接头或肽接头。
11.权利要求9所述的双特异性分子，其中每个抗体分子与约1至10个所述肽剂分子融合。
12.权利要求1所述的双特异性分子，其包含在重链恒定区与MC1R结合肽剂融合的PD-L1抗体阿维单抗。
13.权利要求12所述的双特异性分子，其包含通过PEG接头与所述抗体共价融合的NDP-MSH或其保守修饰变体。
14.权利要求1所述的双特异性分子，其包含在重链N端与MC1R结合肽剂融合的PD-L1抗体阿特珠单抗。
15.权利要求14所述的双特异性分子，其包含具有用于与所述MC1R结合肽剂缀合的经改造的N端丝氨酸残基的PD-L1抗体阿特珠单抗。
16.权利要求14所述的双特异性分子，其包含通过肽接头与所述抗体上的经改造N端丝氨酸残基共价融合的NDP-MSH或其保守修饰变体。
17.药物组合物，其包含(1)治疗有效量的权利要求1所述的双特异性分子和(2)可药用载体。
18.在对象中治疗实体瘤的方法，其包括向所述对象施用包含双特异性分子的药物组合物，其中所述双特异性分子包含PD-L1抗体或其抗原结合片段和肽剂，所述肽剂与所述实体瘤的细胞表面抗原或分子标志物特异性地结合。
19.权利要求18所述的方法，其中所述PD-L1抗体是单克隆抗体阿维单抗、阿特珠单抗或德瓦鲁单抗。
20.权利要求18所述的方法，其中所述实体瘤是黑素瘤。
21.权利要求20所述的方法，其中所述细胞表面抗原是MC1R，并且所述肽剂是α-MSH、其类似物或其变体。
22.权利要求21所述的方法，其中所述肽剂是NDP-MSH或其保守修饰变体。
23.权利要求18所述的方法，其中所述肽剂通过接头序列与所述抗体的重链恒定区或重链N端共价连接。
24.权利要求23所述的方法，其中所述接头是PEG接头或肽接头。
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