BR112020005402A2 - anticorpos, sequências de polinucleotídeo e de ácido nucleico, vetores, célula hospedeira, métodos de expressar o anticorpo e de modulação conjugado, composição farmacêutica, métodos para tratar uma doença, para detectar, para diagnosticar e para estimular uma resposta imune, método in vivo ou in vitro, uso, receptor de antígeno quimérico e célula t - Google Patents

anticorpos, sequências de polinucleotídeo e de ácido nucleico, vetores, célula hospedeira, métodos de expressar o anticorpo e de modulação conjugado, composição farmacêutica, métodos para tratar uma doença, para detectar, para diagnosticar e para estimular uma resposta imune, método in vivo ou in vitro, uso, receptor de antígeno quimérico e célula t Download PDF

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    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Abstract

A presente divulgação provê anticorpos anti-CD19 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, polinucleotídeos isolados que codificam os mesmos, composições farmacêuticas compreendendo os mesmos e usos dos mesmos.

Description

“ANTICORPOS, SEQUÊNCIAS DE POLINUCLEOTÍDEO E DE ÁCIDO NUCLEICO, VETORES, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS DE EXPRESSAR O ANTICORPO E DE MODULAÇÃO CONJUGADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODOS PARA TRATAR UMA DOENÇA, PARA DETECTAR, PARA DIAGNOSTICAR E PARA ESTIMULAR UMA RESPOSTA IMUNE, MÉTODO IN VIVO OU IN VITRO, USO, RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO E CÉLULA T” CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente divulgação refere-se de modo geral a novos anticorpos anti-CD19 e ao uso dos mesmos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] O CD19 (Cluster of Differentiation 19) é um receptor estruturalmente distinto da superfície celular expresso sobre a superfície de células B, incluindo, mas não se limitando a, todos os subtipos de linfoma de células B, de formas indolentes a agressivas, bem como leucemia linfocítica crônica de células B e leucemia linfoblástica aguda não T, células pré-B, células B em desenvolvimento inicial (ou seja, células B imaturas), células B maduras através da diferenciação terminal em células plasmáticas e células B malignas. O CD19 é expresso pela maioria das leucemias linfoblásticas agudas pré-B (ALL), linfomas não Hodgkin, leucemias linfocíticas crônicas de células B (CLL), leucemias pró-linfocíticas, leucemias de células pilosas, leucemias linfocíticas agudas comuns e algumas leucemias linfoblásticas agudas de células Null (Nadler et al., J. Immunol., 131: 244-250 (1983), Loken et al., Blood, 70: 1316-1324 (1987), Uckun et al., Blood, 71: 13-29 (1988).), Anderson et al., 1984. Blood, 63: 1424-1433 (1984), Scheuermann, Leuk. Lymphoma, 18: 385-397 (1995)). A expressão do CD19 nas células plasmáticas sugere ainda que ele possa ser expresso em tumores de células B diferenciados, como mieloma múltiplo, plasmocitomas, tumores de Waldenstrom (Grossbard et al.,
Br. J. Haematol. 102: 509-15 (1998); Treon et al., Semin. Oncol., 30: 248-52 (2003)). O CD19 também tem sido um dos muitos alvos propostos para imunoterapia. Ao contrário do CD20 (outro receptor da superfície da célula B), acreditava-se que o CD19 fosse expresso em níveis mais altos e internalizado pelas células quando ligado por um anticorpo anti-CD19.
[003] Permanece a necessidade de novos anticorpos anti-CD19, especialmente aqueles com capacidade de internalização favorável e alta afinidade de ligação.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[004] Ao longo da presente divulgação, os artigos “um/uma” e “o/a” são utilizados para se referirem a um ou a mais do que um (ou seja, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um anticorpo” significa um anticorpo ou mais do que um anticorpo.
[005] A presente divulgação provê novos anticorpos monoclonais anti-CD19, sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos mesmos, e usos dos mesmos.
[006] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona anticorpos monoclonais isolados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma ou mais (por exemplo, 1, 2, ou 3) sequências da região determinante de complementaridade (CDR) de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste nas: SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 44, 45, 136, 140 e 141, e/ou uma ou mais (por exemplo, 1, 2 ou 3) sequências CDR de cadeia leve kappa selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 5, 6, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 40, 41, 42, 137, 138 e
139.
[007] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem 1, 2 ou 3 sequências CDR de cadeia pesada com pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de identidade de sequência com as sequências de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 44, 45, 136, 140, ou 141. Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem 1, 2 ou 3 sequências CDR de cadeia leve com pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de identidade de sequência com as sequências de SEQ ID NOs: 4, 5, 6, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 40, 41, 42, 137, 138 ou 139.
[008] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3; b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9; c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15; d) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21; e) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24;
f) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27; g) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30; h) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33; i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36; j) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39; k) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45; l) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3; m) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 140 e SEQ ID NO: 9; e n) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 141 e SEQ ID NO: 15.
[009] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem uma região variável de cadeia leve kappa selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6; b) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12; c) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 e/ou SEQ ID NO: 18; d) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 42; e e) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 e SEQ ID NO: 139.
[010] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6; b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências
CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:
11 e SEQ ID NO: 12;
c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO:
13, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências
CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:
17 e SEQ ID NO: 18; d) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO:
19, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências
CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6;
e) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO:
22, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências
CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6;
f) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO:
25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências
CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6;
g) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO:
28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências
CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6;
h) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO:
31, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6;
i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO:
34, SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências
CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6;
j) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO:
37, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências
CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO:
41 e SEQ ID NO: 42;
k) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO:
43, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências
CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6; l) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 e SEQ ID NO: 139; m) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 140 e SEQ ID NO: 9; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12; ou n) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 141 e SEQ ID NO: 15; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18.
[011] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem: uma sequência CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, e SEQ ID NO: 45.
[012] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem: a) uma sequência CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13,
SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 136; b) uma sequência CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 140 e SEQ ID NO: 141; e c) uma sequência CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, e SEQ ID NO: 45.
[013] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem: a) uma sequência de CDR1 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 137; b) uma sequência de CDR2 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 138; e c) uma sequência de CDR3 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 139.
[014] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem: a) uma sequência CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13,
SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 136; b) uma sequência CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 140 e SEQ ID NO: 141; c) uma sequência CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, e SEQ ID NO: 45; d) uma sequência de CDR1 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 137; e) uma sequência de CDR2 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 138; e f) uma sequência de CDR3 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 139.
[015] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou de fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem ainda uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, ou 4) sequências da região estrutural/de arcabouço (FR - framework) de cadeia pesada selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 54, 55, 56, 57, 70, 71, 72, 73, 86, 87, 88 e 89 e/ou uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) sequências da região estrutural (FR) de cadeia leve kappa selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 58, 59, 60, 61, 74, 75, 76, 77, 90, 91, 92 e 93.
[016] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem ainda a sequência FR1 de cadeia pesada selecionada a partir das SEQ ID NOs: 54, 70 e 86; a sequência FR2 de cadeia pesada selecionada a partir das SEQ ID NOs: 55, 71 e 87; a sequência FR3 de cadeia pesada selecionada a partir das SEQ ID NOs: 56, 72 e 88; e/ou uma sequência FR4 de cadeia pesada selecionada a partir das SEQ ID NOs: 57, 73 e 89.
[017] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem ainda a sequência FR1 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NOs: 58, 74 e 90; a sequência FR2 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NOs: 59, 75 e 91; a sequência FR3 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NOs: 60, 76 e 92; e/ou uma sequência FR4 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NOs: 61, 77 e 93.
[018] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132 e uma sequência homóloga do mesmo possuindo, pelo menos, 80% (por exemplo, pelo menos 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) de identidade de sequência.
[019] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem uma região variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste na: SEQ ID
NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134 e uma sequência homóloga da mesma possuindo pelo menos, 80% (por exemplo pelo menos 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) de identidade de sequência.
[020] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem toda ou uma porção da sequência da região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 94, 98, 102, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 122, 124, 128 e 132; e/ou, toda ou uma porção da sequência da região variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 100, 104, 120, 126, 130 e 134. Em um exemplo de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são um anticorpo de domínio único que consiste em toda ou uma porção da região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 94, 98, 102, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 122, 124, 128 e 132.
[021] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 94 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 96; b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 98 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 100; c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 102 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 104; d) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 106 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 96;
e) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a
SEQ ID NO: 108 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 96;
f) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a
SEQ ID NO: 110 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 96;
g) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a
SEQ ID NO: 112 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 96;
h) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a
SEQ ID NO: 114 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 96;
i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a
SEQ ID NO: 116 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 96;
j) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a
SEQ ID NO: 118 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 120;
k) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a
SEQ ID NO: 122 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 96;
l) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a
SEQ ID NO: 124 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 126;
m) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a
SEQ ID NO: 128 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 130; ou n) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 132 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 134.
[022] Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ainda uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos e ainda mantém uma afinidade de ligação específica para o CD19.
[023] Em determinados exemplos de realização, a substituição está em uma ou mais sequências CDR, e/ou em uma ou mais sequências FR, em uma ou ambas as sequências de região variável, e/ou na região Fc. Em alguns exemplos de realização, pelo menos uma (ou todas) as substituições nas sequências CDR, sequências FR, sequências de regiões variáveis ou região Fc compreendem uma substituição conservadora.
[024] Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende não mais que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições de resíduos de aminoácidos em uma ou mais sequências CDRs selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 136, 137, 138, 139, 140 e 141.
[025] Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende não mais que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições de resíduos de aminoácidos em uma ou mais sequências FR selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 e 93. Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende não mais do que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições no total em sequências CDR e/ou sequências FR de sequências de regiões variáveis da cadeia pesada selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 94, 98, 102, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 122, 124, 128, e 132. Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende não mais que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições de resíduos de aminoácidos em todas as FRs de sequências da região variável da cadeia leve selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 96, 100, 104, 120, 126, 130 e 134.
[026] Em determinados exemplos de realização, a substituição confere uma ou mais propriedades desejáveis selecionadas a partir de: a) melhorar a afinidade de ligação ao CD19, b) introduzir ou remover um sítio de glicosilação, c) introduzir um resíduo de cisteína livre, d) melhorar ou reduzir o ADCC ou CDC, e) aumentar da meia-vida sérica; e f) aumentar a ligação ao FcRn.
[027] Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ainda uma região constante de imunoglobulina. Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região constante de IgG. Em um exemplo de realização, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região constante da IgG 1 de camundongo, IgG2a de camundongo, IgG2b de camundongo ou IgG1 humana.
[028] Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo não humano (por exemplo, murino ou de roedor) ou um anticorpo humanizado.
[029] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são; um anticorpo de domínio único camelizado, um diacorpo (diabody), um scFv, um dímero scFv, um BsFv, um dsFv, um (dsFv)2, um dsFv-dsFv’, um fragmento Fv, um Fab, um Fab’, um
F(ab')2, um diacorpo ds, um nanocorpo, um anticorpo de domínio ou um anticorpo de domínio bivalente.
[030] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são biespecíficos.
[031] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos estão ligados a um ou mais conjugados. Em certos exemplos de realização, o conjugado compreende um agente quimioterápico, uma toxina, um isótopo radioativo, um lantanídeo, um marcador luminescente, um marcador fluorescente ou um marcador de substrato enzimático. Em certos exemplos de realização, o conjugado é uma toxina. Em certos exemplos de realização, a toxina é uma citotoxina, um alquilante de DNA, um inibidor da topoisomerase, um ligante de tubulina ou outros medicamentos anticâncer. Em certos exemplos de realização, o medicamento anticâncer é um agente citotóxico maitansinoide. Em certos exemplos de realização, a toxina é DM1.
[032] Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é capaz de se ligar especificamente ao CD19. Em certos exemplos de realização, o CD19 é derivado de camundongo, rato, macaco ou humano.
[033] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são capazes de ligar especificamente ao CD19 humano, expresso em uma célula com um valor K D não superior a 5x10-9 M, não superior a 1x10-9 M, não superior a 9x10-10 M, não superior a 8x10-10 M, não superior a 7x10-10 M, não superior a 6x10-10 M, não superior a 5x10-10 M, não superior a 4x10-10 M, não superior a 4x10-10 M, não superior a 3x10-10 M, não superior a 2x10-10 M, não superior a 1x10-10 M, conforme medido pelo ensaio de citometria de fluxo.
[034] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são capazes de se ligar especificamente ao CD19 humano expresso em uma célula a uma EC 50 não maior do que 0,04 nM, não maior do que 0,05 nM, não maior do que 0,1 nM, não maior do que 0,2 nM, não maior do que 0,3 nM, não maior do que 0,4 nM, não maior do que 0,5 nM, não maior do que 0,5 nM, não maior do que 0,6 nM, não maior do que 0,7 nM, não maior do que 0,8 nM, não maior do que 0,9 nM ou não maior do que 1 nM, conforme medido pelo ensaio de citometria de fluxo.
[035] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são capazes de se ligar especificamente ao CD19 de macaco cinomolgo expresso em uma célula com uma EC50 não superior a 0,2 nM, não superior a 0,5 nM, não superior a 0,8 nM, não superior a 1 nM, não superior a 2 nM ou não superior a 3 nM, conforme medido por ensaio de citometria de fluxo.
[036] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são capazes de ser internalizados por uma célula que expressa CD19 a uma EC50 não maior do que 1pM, não maior do que 2 pM, não maior do que 3pM, não maior do que 4 pM, não maior do que 5pM, não maior do que 6 pM, não maior do que 7 pM, não maior do que 8 pM, não maior do que 9 pM, não maior do que 10 pM, não maior do que 11 pM, não maior do que 11 pM, não maior do que 12 pM, não mais de 13pM, não maior do que 14 pM, não maior do que 15 pM, não maior do que 16 pM, não maior do que 17 pM, não maior do que 18 pM, não maior do que 19 pM, não maior do que 20pM, não maior do que 21 pM, não maior do que 22 pM, não maior do que 23pM, não maior do que 24 pM, não maior do que 25pM, não maior do que 30pM, não maior do que 35pM, não maior do que 40pM, não maior do que 45pM ou não maior do que 50pM por Ensaio Fab-Zap.
[037] Em um aspecto, a presente divulgação provê anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que competem pela ligação ao mesmo epítopo com W7011-4.155.8, W7011-4.202.9, ou W7011-4.225.7.
[038] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui fornecido e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em certos exemplos de realização, a composição farmacêutica compreende ainda um segundo agente que é capaz de aumentar um efeito terapêutico do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e/ou é capaz de reduzir um efeito colateral do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[039] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona ainda polinucleotídeos isolados que codificam o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui proporcionado. Em certos exemplos de realização, o polinucleotídeo isolado compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de um grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 95, 99, 103, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 123, 125, 129 e 133, e/ou uma sequência nucleotídica selecionada a partir de um grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 97, 101, 105, 121, 127, 131 e 135, ou uma sequência homóloga da mesma com pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) de identidade de sequência, mas codificando a mesma sequência de proteína.
[040] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda vetores compreendendo o referido polinucleotídeo isolado.
[041] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda células hospedeiras compreendendo o referido vetor.
[042] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda métodos para expressar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui fornecido, compreendendo o cultivo da referida célula hospedeira sob a condição na qual o referido polinucleotídeo é expresso.
[043] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda conjugados anticorpo-droga compreendendo uma ou mais porções de droga covalentemente ligadas aos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno fornecidos na presente invenção, diretamente ou através de um ligante. Em certos exemplos de realização, o ligante é um ligante de hidrazona, um ligante dissulfeto, um ligante bifuncional, ligante dipeptídico, ligante glucuronídeo, um ligante tioéter. Em certos exemplos de realização, o ligante é SMCC.
[044] Em certos exemplos de realização, pelo menos uma fração de droga está ligada a um sítio específico dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Em certos exemplos de realização, o sítio específico é um resíduo de cisteína. Em certos exemplos de realização, as porções de droga são toxinas ou isótopos radioativos. Em certos exemplos de realização, as porções de drogas são toxinas, opcionalmente uma citotoxina, um alquilante de DNA, um inibidor de topoisomerase, um ligante de tubulina ou outros medicamentos anticâncer, opcionalmente um agente citotóxico maitansinoide, e opcionalmente a toxina é DM1.
[045] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos fornecidos na presente invenção, ou o conjugado anticorpo-droga fornecido na presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[046] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda métodos de tratamento de uma doença ou condição relacionada ao CD19 em um sujeito, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui fornecidos, os conjugados anticorpo-droga aqui fornecidos, ou a composição farmacêutica aqui fornecida, para o sujeito. Em determinados exemplos de realização, o sujeito é humano. Em certos exemplos de realização, a administração é feita por administração oral, nasal, intravenosa, subcutânea, sublingual ou intramuscular. Em certos exemplos de realização, a referida doença ou condição é câncer. Em certos exemplos de realização, o referido câncer é linfoma, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de colo do útero, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pâncreas, melanoma, glioblastoma, câncer de próstata, câncer de esôfago ou câncer gástrico. Em certos exemplos de realização, a referida doença ou condição é linfoma de células B, opcionalmente linfoma de Hodgkin ou linfoma não Hodgkin, em que o linfoma não Hodgkin compreende: Linfoma de células B grandes difuso (DLBCL), linfoma folicular, linfoma de células B da zona marginal (MZL), linfoma de tecido linfático associado à mucosa (MALT), linfoma linfocítico pequeno (leucemia linfocítica crônica, CLL), linfoma de células do manto (MCL), leucemia linfoblástica aguda (ALL) ou macroglobulinemia de Waldenstrom (WM).
[047] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda métodos de modular a atividade de CD19 em uma célula expressando CD19, compreendendo expor a célula expressando CD19 aos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos.
[048] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona ainda métodos in vivo ou in vitro de matar uma célula que expressa CD19, compreendendo o contato da célula que expressa CD19 com os conjugados anticorpo-droga proporcionados pela presente invenção.
[049] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda um método para detectar a presença ou quantidade de CD19 em uma amostra, compreendendo o contato da amostra com os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos fornecidos na presente invenção e determinando a presença ou quantidade de CD19 na amostra.
[050] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda métodos para diagnosticar uma doença ou condição relacionada ao CD19 em um sujeito, compreendendo: a) obter uma amostra do sujeito; b) colocar a amostra em contato com os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui proporcionados; c) determinar a presença ou quantidade de CD19 na amostra; d) correlacionar a presença ou a quantidade de CD19 a uma doença ou condição no sujeito.
[051] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda o uso dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui fornecidos na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou condição em um sujeito, em que o tratamento compreende.
administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos ao sujeito.
[052] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda o uso dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui fornecidos na fabricação de um reagente de diagnóstico para detectar uma doença ou condição relacionada ao CD19.
[053] Em um aspecto, a presente divulgação provê receptores de antígenos quiméricos (CARs) que compreendem o fragmento de ligação ao antígeno aqui proporcionado e uma porção de ativação de células T. Em alguns exemplos de realização, a porção de ativação de células T compreende uma porção de ativação de células T nativas de um receptor de células T (TCR). Em alguns exemplos de realização, a porção de ativação de células-T compreende um domínio transmembrana de um TCR e um domínio de transdução de sinal intracelular de um TCR. Em alguns exemplos de realização, o fragmento de ligação ao antígeno é um scFv.
[054] Em um aspecto, a presente divulgação provê ácidos nucleicos que codificam o CAR aqui proporcionado. Em certos exemplos de realização, os ácidos nucleicos compreendem uma primeira sequência de polinucleotídeos que codifica um fragmento de ligação ao antígeno dos anticorpos aqui proporcionados, operacionalmente ligada a uma segunda sequência de polinucleotídeo que codifica um domínio transmembrana do TCR e um domínio de transdução de sinalização intracelular de um TCR.
[055] Em um aspecto, a presente divulgação fornece vetores que compreendem a sequência de ácido nucleico que codifica o CAR aqui fornecido.
[056] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona células T isoladas que expressam o CAR aqui proporcionado.
[057] Em um aspecto, a presente divulgação fornece método s para estimular uma resposta imune mediada por células T a um alvo expressando CD19 em um sujeito, cujo método compreende a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz das células T aqui proporcionadas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[058] A Figura 1 mostra um SDS-PAGE de WBP701-BMK1 e WBP701-BMK2. M: marcador de proteína; Pista1: BMK1, reduzido; Pista2: BMK2, reduzido; Pista3: BMK1, não reduzido; Pista4: BMK4, não reduzido.
[059] A Figura 2 mostra um SDS-PAGE de WBP701-BMK3. M: marcador proteico; Pista1: BMK3, reduzido; Pista2: BMK3, não reduzido.
[060] A Figura 3A mostra histogramas de citometria de fluxo para a expressão de CD19 na linhagem de células 293F transfectadas com CD19 humano (WBP701.293F.hPro1.FL.A2). O pico à esquerda representa um sinal de controle negativo. O pico deslocado para a direita representa a expressão CD19 na linhagem de células detectada.
[061] A Figura 3B mostra histogramas de citometria de fluxo para a expressão de CD19 na linhagem de células CHO-K1 transfectadas com CD19 humano (WBP701.CHO-K1.hPro1.FL.B4). O pico à esquerda representa um sinal de controle negativo. O pico deslocado para a direita representa a expressão CD19 na linhagem de células detectada.
[062] A Figura 3C mostra histogramas de citometria de fluxo para a expressão de CD19 na linhagem de células 293 transfectadas com CD19 de macaco cinomolgo (WBP701.293F.cpro1.FL.C1). O pico à esquerda representa um sinal de controle negativo. O pico deslocado para a direita representa a expressão CD19 na linhagem de células detectada.
[063] A Figura 3D mostra histogramas de citometria de fluxo para a expressão de CD19 na linhagem de células CHO-K1 transfectadas com CD19 de macaco cinomolgo (WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9). O pico à esquerda representa um sinal de controle negativo. O pico deslocado para a direita representa a expressão CD19 na linhagem de células detectada.
[064] As Figuras 4A-4F mostram a ligação de subclones selecionados para célula Ramos por FACS.
[065] As Figuras 5A-5C mostram a ligação de subclones selecionados à célula que expressa CD19 de macaco cinomolgo (WBP701.CHO-K11.cynoPro1) por FACS.
[066] As Figuras 6A-6E mostram o teste Fab-Zap de subclones selecionados.
[067] As Figuras 7A-7C mostram a categorização (binning) do anticorpo candidato contra anticorpos BMK1, BMK2 e BMK3 por FACS.
[068] A Figura 8 mostra a análise de afinidade de ligação de Scarchard do anticorpo WBP7011-4.34.11-z1-m5-IgG1k à célula Ramos por FACS.
[069] A Figura 9 mostra a análise de afinidade de ligação de Scarchard do anticorpo WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K (N-S) à célula Ramos por FACS.
[070] A Figura 10 mostra a análise de afinidade de ligação de Scarchard do anticorpo W7011-4.155.8-z1-uIgG1K à célula Ramos por FACS.
[071] A Figura 11 mostra o ensaio de citotoxicidade de conjugados de anticorpo-droga humanizados W7011-4.155.8-z1-uIgG1K-DM1 e WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K (NS) -DM1 em células Daudi.
[072] A Figura 12 mostra o ensaio de citotoxicidade do conjugado anticorpo humanizado-droga WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K (NS) -DM1 em células Nalm-6.
[073] A Figura 13 mostra o ensaio de citotoxicidade de conjugados de anticorpo-droga humanizados W7011-4.155.8-z1-uIgG1K-DM1 e WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K (NS) -DM1 em células WSU-DLCL2.
[074] A Figura 14 mostra a eficácia antitumoral do anticorpo de referência (W7011-BMK1-DM1) e do anticorpo (W7011-4.87.6-z1-uIgG1k (NS) -DM1); os dados representam o volume tumoral nos diferentes grupos de tratamento de camundongos CB17-SCID fêmeas portadores de xenoenxertos de câncer de linfoma Nalm-6. Os pontos de dados representam média + EPM.
A seta representa os dias de dosagem.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[075] A descrição a seguir da presente divulgação é meramente destinada a ilustrar os diversos exemplos de realização da divulgação. Assim, as modificações específicas discutidas não devem ser interpretadas como limitações no escopo da divulgação. Será evidente para um especialista no assunto que vários equivalentes, alterações e modificações podem ser feitos sem nos afastarmos do escopo da divulgação, e entende-se que tais exemplos de realização equivalentes devem estar incluídos no presente pedido. Todas as referências aqui citadas, incluindo publicações, patentes e pedidos de patente, são integralmente incorporados ao presente como referência.
DEFINIÇÕES
[076] O termo “anticorpo”, conforme utilizado na presente invenção, inclui qualquer imunoglobulina, anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, anticorpo multivalente, anticorpo bivalente, anticorpo monovalente, anticorpo multiespecífico ou anticorpo biespecífico que se liga a um antígeno específico. Um anticorpo intacto nativo compreende duas cadeias pesadas (H) e duas leves (L). As cadeias pesadas de mamíferos são classificadas como alfa, delta, épsilon, gama e mu, e cada cadeia pesada é constituída por uma região variável (VH) e uma primeira, segunda, e terceira região constante (CH1, CH2, CH3, respectivamente); as cadeias leves de mamíferos são classificadas como λ ou κ, e cada cadeia leve é constituída por uma região variável (V L para a cadeia leve λ ou VK para a cadeia leve κ, respectivamente) e uma região constante (CL para a cadeia leve λ ou CK para cadeia leve κ, respectivamente).
O anticorpo tem a forma de “Y”, com o caule do Y consistindo na segunda e terceira regiões constantes de duas cadeias pesadas ligadas entre si por meio de ligação de dissulfeto. Cada braço do Y inclui a região variável e a primeira região constante de uma única cadeia pesada ligada às regiões variáveis e constantes de uma única cadeia leve. As regiões variáveis das cadeias leve e pesada são responsáveis pela ligação ao antígeno. As regiões variáveis em ambas as cadeias geralmente contêm três alças altamente variáveis denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) (CDRs de cadeia leve incluindo LCDR1, LCDR2 e LCDR3, e CDRs de cadeia pesada incluindo HCDR1, HCDR2, HCDR3). Os limites da CDR para os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno divulgados no presente podem ser definidos ou identificados pelas convenções de Kabat, IMGT, Chothia ou Al-Lazikani (Al- Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997); Chothia, C. et al., J Mol Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985); Chothia, C. e Lesk, A.M., J.
Mol. Biol., 196,901 (1987); Chothia, C. et al., Nature. Dec 21-28;342(6252):877- 83 (1989) ; Kabat E.A. et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md.
(1991)). As três CDRs são interpostas entre trechos de flanco conhecidos como regiões de arcabouço ou estruturais (FR do inglês, Framework), que são mais altamente conservadas que as CDRs e formam um andaime para suportar as alças hipervariáveis. As regiões constantes das cadeias pesadas e leves não estão envolvidas na ligação ao antígeno, mas exibem várias funções efetoras.
Os anticorpos são atribuídos a classes com base na sequência de aminoácidos da região constante de suas cadeias pesadas. As cinco principais classes ou isotipos de anticorpos são IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, caracterizadas pela presença de cadeias pesadas alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente.
Várias das principais classes de anticorpos são divididas em subclasses como IgG1(cadeia pesada gama1), IgG2 (cadeia pesada gama2), IgG3 (cadeia pesada gama3), IgG4 (cadeia pesada gama4), IgA1 (cadeia pesada α1) ou IgA2 (cadeia pesada α2).
[077] O termo “bivalente”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno possuindo dois locais de ligação ao antígeno; o termo “monovalente” refere-se a um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno possuindo apenas um único local de ligação ao antígeno; e o termo “multivalente” refere-se a um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno possuindo múltiplos locais de ligação ao antígeno. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são bivalentes.
[078] Conforme utilizado na presente invenção, um anticorpo “biespecífico” refere-se a um anticorpo artificial que tem fragmentos derivados de dois anticorpos monoclonais diferentes e é capaz de se ligar a dois epítopos diferentes. Os dois epítopos podem estar presentes no mesmo antígeno, ou podem estar em dois antígenos diferentes.
[079] O termo “fragmento de ligação ao antígeno”, como usado no presente pedido, refere-se a um fragmento de anticorpo formado a partir de uma porção de um anticorpo que compreende 1, 2 ou 3 CDRs, ou qualquer outro fragmento de anticorpo que se liga a um antígeno, mas não compreende uma estrutura intacta de anticorpo nativo. Exemplos de fragmento de ligação ao antígeno incluem, sem limitação, um diacorpo, um Fab, um Fab’, um F(ab’) 2, um fragmento Fv, um fragmento Fv estabilizado por bissulfeto (dsFv), um (dsFv)2, um dsFv biespecífico (dsFv-dsFv’), um diacorpo (diabody) estabilizado por ligações de bissulfeto (diacorpo ds), uma molécula de anticorpo de cadeia única (scFv), um dímero scFv (diacorpo bivalente), um anticorpo biespecífico, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo de domínio único camelizado, um nanocorpo, um anticorpo de domínio e um anticorpo de domínio bivalente. Um fragmento de ligação ao antígeno é capaz de se ligar ao mesmo antígeno ao qual o anticorpo parental se liga.
[080] “Fab”, com relação a um anticorpo, refere-se àquela porção do anticorpo que consiste em uma única cadeia leve (ambas as regiões variáveis e constantes) ligada à região variável e primeira região constante de uma única cadeia pesada por uma ligação de bissulfeto.
[081] “Fab’” refere-se a um fragmento Fab que inclui uma porção da região de dobradiça.
[082] “F(ab’)2” refere-se a um dímero de Fab’. “Fv”, com relação a um anticorpo, refere-se ao menor fragmento do anticorpo para suportar o sítio de ligação ao antígeno completo. Um fragmento Fv consiste na região variável de uma única cadeia leve ligada à região variável de uma única cadeia pesada.
[083] Um “dsFv” refere-se a um fragmento de Fv estabilizado com dissulfeto de modo que a ligação entre a região variável de uma única cadeia leve e a região variável de uma única cadeia pesada é uma ligação de bissulfeto. Em alguns exemplos de realização, um “(dsFv)2” ou “(dsFv-dsFv')” compreende três cadeias peptídicas: dias porções VH ligadas por um ligante peptídico (por exemplo, um ligante flexível longo) à duas porções VL, respectivamente, através de pontes de bissulfeto. Em alguns exemplos de realização, dsFv-dsFv’ é biespecífico, em que cada cadeia pesada e leve pareada com ligações de dissulfeto tem uma especificidade de antígeno diferente.
[084] “Anticorpo Fv de cadeia única” ou “scFv” refere-se a um anticorpo manipulado que consiste em uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada conectada uma à outra diretamente ou através de uma sequência de ligação peptídica (Huston J.S. et al. Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879 (1988)).
[085] “Fc”, com relação a um anticorpo, refere-se àquela porção do anticorpo que consiste na segunda e terceira regiões constantes de uma primeira cadeia pesada ligada à segunda e terceira regiões constantes de uma segunda cadeia pesada através de ligação de bissulfeto. A porção Fc do anticorpo é responsável por várias funções efetoras como citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC), e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), mas não funciona na ligação ao antígeno.
[086] “Anticorpo Fv de cadeia única–Fc” ou “scFv-Fc” refere-se a um anticorpo modificado que consiste em um scFv ligado à região Fc de um anticorpo.
[087] “Anticorpo de domínio único camelizado”, “anticorpo de cadeia pesada” ou “HCAb” refere-se a um anticorpo que contém dois domínios VH sem cadeias leves (Riechmann L. e Muyldermans S., J Immunol Methods, 10 de dezembro; 231(1-2):25-38 (1999); Muyldermans S., J Biotechnol. Jun; 74(4):277-302 (2001); documentos WO94/04678; WO94/25591; Patente US
6.005.079). Os anticorpos de cadeia pesada foram originalmente derivados de Camelidae (camelos, dromedários e lhamas). Embora desprovidos de cadeias leves, os anticorpos camelizados possuem um autêntico repertório de ligação ao antígeno (Hamers-Casterman C. et al., Nature. Jun 3;363(6428):446-8 (1993); Nguyen VK. et al. “Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation,” Immunogenetics. 54(1):39-47 (2002); Nguyen VK. et al. Immunology. 109(1):93-101 (2003)). O domínio variável de um anticorpo de cadeia pesada (domínio VHH) representa a menor unidade de ligação ao antígeno conhecida gerada por respostas imunes adaptativas (Koch-Nolte F. et al., FASEB J. Nov; 21 (13): 3490-8. Epub 2007 Jun 15 (2007)).
[088] Um “nanocorpo” ou “nanobody” refere-se a um fragmento de anticorpo que consiste em um domínio VHH a partir de um anticorpo de cadeia pesada e dois domínios constantes, CH2 e CH3.
[089] Os “diacorpos” ou “diabodies” ou “dAbs” incluem pequenos fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno, em que os fragmentos compreendem um domínio VH ligado a um domínio VL na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL ou VH-VL) (vide, por exemplo, Holliger P. et al. , Proc Natl Acad Sci USA. Jul 15; 90 (14): 6444-8 (1993); EP404097; WO93/11161).
Pelo uso de um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia, criando, desse modo, dois sítios de ligação ao antígeno. Os sítios de ligação ao antígeno podem ser direcionados ao mesmo antígeno (ou epítopos) ou a antígenos (ou epítopos) diferentes. Em certos exemplos de realização, um “diacorpo ds biespecífico” é um diacorpo direcionado a dois antígenos diferentes (ou epítopos). Em certos exemplos de realização, um “dímero scFv” é um diacorpo bivalente ou ScFv bivalente (BsFv) que compreende VH-VL (ligado por um ligante peptídico) dimerizado com outra porção VH-VL de tal modo que as VH's de uma porção coordenadas com as V L's da outra porção formam dois sítios de ligação que podem visar os mesmos antígenos (ou epítopos) ou antígenos diferentes (ou epítopos). Em outros exemplos de realização, um “dímero scFv” é um diacorpo biespecífico compreendendo VH1-VL2 (ligado por um ligante peptídico) associado a V L1-VH2 (também ligado por um ligante peptídico), de modo que V H1 e VL1 estão coordenados e VH2 e VL2 estão coordenados e cada par coordenado têm uma especificidade a diferentes antígenos.
[090] Um “anticorpo de domínio” refere-se a um fragmento de anticorpo contendo apenas a região variável de uma cadeia pesada ou a região variável de uma cadeia leve. Em certos casos, dois ou mais domínios VH são covalentemente ligados a um ligante peptídico para criar um anticorpo de domínio bivalente ou multivalente. Os dois domínios VH de um anticorpo de domínio bivalente podem se direcionar ao mesmo antígeno ou a antígenos diferentes.
[091] O termo “quimérico”, como usado no presente pedido, significa um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que tem uma porção de cadeia pesada e/ou cadeia leve derivada de uma espécie, e o resto da cadeia pesada e/ou cadeia leve derivado de uma espécie diferente. Em um exemplo ilustrativo, um anticorpo quimérico pode compreender uma região constante derivada de humano e uma região variável de uma espécie não humana, tal como de camundongo ou rato. Em alguns exemplos de realização, o animal não humano é um mamífero, por exemplo, um camundongo, um rato, um coelho, uma cabra, uma ovelha, um porquinho-da-índia ou um hamster.
[092] O termo “humanizado”, como usado no presente pedido, com referência ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, significa que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende CDRS derivadas de animais não humanos, regiões FR derivadas de humanos e, quando aplicável, as regiões constantes derivadas de humanos.
[093] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “CD19” refere-se à proteína Cluster of Differentiation 19, que é um determinante antigênico detectável nas células precursoras de leucemia. As sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos de CD19 humanas e camundongos podem ser encontradas em um banco de dados público, como GenBank, UniProt e Swiss- Prot. Por exemplo, a sequência de aminoácidos do CD19 humano pode ser encontrada como número de acesso UniProt/Swiss-Prot P15391 e a sequência nucleotídica que codifica o CD19 humano pode ser encontrada no Nº de Acesso NM _ 001178098. Como utilizado na presente invenção, o termo CD19 inclui proteínas compreendendo mutações, por exemplo, mutações pontuais, fragmentos, inserções, deleções e variantes de splicing do CD19 tipo selvagem de comprimento total. O CD19 é expresso na maioria dos cânceres da linhagem B, incluindo, por exemplo, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica e linfoma não-Hodgkin. Ele também é um marcador precoce de células B progenitoras. Consulte, por exemplo, Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). Em um aspecto, a proteína CD19 é expressa em uma célula cancerosa.
[094] O termo “ligação específica” ou “se ligar de maneira específica” ou “se ligar especificamente”, conforme utilizado no presente, refere-se a uma reação de ligação não aleatória entre duas moléculas, como, por exemplo, entre um anticorpo e um antígeno. Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno proporcionados no presente pedido se ligam especificamente ao CD19 humano com uma afinidade de ligação (KD) ≤ 10-6 M (por exemplo, ≤ 5x10-7 M, ≤ 2x10-7 M, ≤ 1x10- 7 M, ≤ 5x10-8 M, ≤ 2x10-8 M, ≤ 1x10-8 M, ≤ 5x10-9 M, ≤ 4x10-9 M, ≤ 3x10-9 M, ≤ 2x10-9 M, ou ≤ 10-9 M). O valor de KD aqui utilizado refere-se à relação entre a velocidade de dissociação pela velocidade de associação (koff/kon), que pode ser determinada por meio de qualquer método convencional conhecido no estado da técnica, incluindo, mas não se limitando ao método de ressonância plasmônica de superfície, método de termoforese em microescala, um método HPLC-MS e citometria de fluxo (tal como o método FACS). Em certos exemplos de realização, o valor KD pode ser adequadamente determinado pelo uso do método de citometria de fluxo.
[095] A capacidade de “bloquear a ligação” ou “competir pelo mesmo epítopo” conforme utilizado no presente refere-se à capacidade de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de inibir a interação de ligação entre duas moléculas (por exemplo, CD19 humano e um anticorpo anti-CD19) em qualquer grau detectável. Em certos exemplos de realização, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que bloqueia a ligação entre duas moléculas inibe a interação de ligação entre as duas moléculas em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% ou pelo menos 90%. Em certos exemplos de realização, essa inibição pode ser maior que 60%, maior que 70%, maior que 75%, maior que 80%, maior que 85% ou maior que 90%.
[096] O termo “epítopo”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se ao grupo específico de átomos ou aminoácidos em um antígeno ao qual um anticorpo se liga. Dois anticorpos podem se ligar ao mesmo epítopo ou a um epítopo estreitamente relacionado dentro de um antígeno se eles exibirem uma ligação competitiva para o antígeno. Por exemplo, se um anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno bloqueia a ligação de um anticorpo de referência ao antígeno (por exemplo, CD19 humano/de macaco) em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% ou pelo menos 90%, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser considerado como um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo/epítopo estreitamente relacionado como o anticorpo de referência.
[097] Os técnicos competentes na matéria reconhecerão que é possível determinar, sem experimentação indevida, se um anticorpo monoclonal humano se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo da presente divulgação (por exemplo, anticorpos monoclonais de camundongo WBP7011-
4.34.11, WBP7011-4.87. 6, WBP7011_4.155.8, WBP7011_4.56.1, WBP7011-
4.15.10, WBP7011-4.100.1, WBP7011-4.106.3, WBP7011_4.108.3,
WBP7011_4.191.6, WBP7011_4.194.10, WBP7011_4.231.5, e anticorpos humanizado W7011-4.34.11-z1-m5, W7011-4.87.6-z1 (NS) e W7011-4.155.8- z1-P15), determinando se o primeiro impede o último de se ligar a um polipeptídeo do antígeno CD19. Se o anticorpo teste competir com o anticorpo da presente divulgação, como mostrado por uma diminuição na ligação do anticorpo da presente divulgação ao polipeptídeo antígeno CD19, os dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo, ou a um epítopo estreitamente relacionado. Ou se a ligação de um anticorpo teste ao polipeptídeo antígeno CD19 foi inibida pelo anticorpo da presente divulgação, então os dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo ou a um epítopo intimamente relacionado.
[098] Os vários símbolos usados nos nomes de anticorpos, conforme fornecido na presente divulgação, são de representação diferente: “mIgG2” refere-se a um anticorpo com a região constante do camundongo do isotipo IgG2; “uIgG1” refere-se a um anticorpo com a região constante humana do isotipo IgG1; “K” ou “L” refere-se a um anticorpo usando a cadeia leve kappa ou lambda.
[099] Uma “substituição conservadora” com referência à sequência de aminoácidos refere-se à substituição de um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente possuindo uma cadeia lateral com propriedades físico-químicas semelhantes. Por exemplo, substituições conservadoras podem ser feitas entre resíduos de aminoácidos com cadeias laterais hidrofóbicas (por exemplo, Met, Ala, Val, Leu e Ile), entre resíduos com cadeias laterais hidrofílicas neutras (por exemplo, Cys, Ser, Thr, Asn e Gln), entre resíduos com cadeias laterais ácidas (por exemplo, Asp, Glu), entre aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, His, Lys e Arg) ou entre resíduos com cadeias laterais aromáticas (por exemplo, Trp, Tyr e Phe). Como conhecido no estado da técnica, a substituição conservadora geralmente não causa mudança significativa na estrutura conformacional da proteína e, portanto, pode reter a atividade biológica de uma proteína.
[100] O termo “homólogo” e “homólogo”, conforme usado no presente, são intercambiáveis e se referem a sequências de ácidos nucleicos (ou sua cadeia complementar) ou sequências de aminoácidos que possuem uma identidade de sequência de pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) com outras sequências quando alinhadas de maneira ideal.
[101] A “percentagem (%) de identidade de sequência”, em relação à sequência de aminoácidos (ou sequência de ácido nucleico), é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos (ou ácidos nucleicos) em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácido (ou ácidos nucleicos) em uma sequência de referência, após alinhar as sequências e, se necessário, introduzir lacunas (gaps), para atingir o número máximo de aminoácidos idênticos (ou ácidos nucleicos). A substituição conservadora dos resíduos de aminoácidos pode ou não ser considerada como resíduos idênticos. O alinhamento para determinar a percentagem de identidade de sequência de aminoácidos (ou ácidos nucleicos) pode ser conseguido, por exemplo, utilizando ferramentas publicamente disponíveis, tais como BLASTN, BLASTp (disponível no site do Centro Nacional de Informação Biotecnológica dos EUA (NCBI - US National Center for Biotechnology Information), vide também, Altschul SF et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990); Stephen F. et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997)), ClustalW2 (disponível no site do Instituto Europeu de Bioinformática, vide também Higgins D.G. et al, Methods in Enzymology, 266:383-402 ( 1996), Larkin M.A. et al., Bioinformatics (Oxford, Inglaterra), 23 (21):2947-8 (2007)) e programas ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos hábeis no assunto podem usar os parâmetros padrão fornecidos pela ferramenta, ou podem personalizar os parâmetros, conforme apropriado para o alinhamento, como, por exemplo, selecionando um algoritmo adequado.
[102] “Funções efetoras”, conforme utilizado na presente invenção, referem-se a atividades biológicas atribuíveis à ligação da região Fc de um anticorpo aos seus efetores, tais como, complexo C1 e receptor de Fc.
Funções efetoras exemplares incluem: citotoxicidade dependente do complemento (CDC) induzida pela interação de anticorpos e C1q no complexo C1; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) induzida pela ligação da região Fc de um anticorpo ao receptor de Fc em uma célula efetora; e fagocitose.
[103] Conforme utilizado na presente invenção, um anticorpo que “internaliza” ou “é capaz de ser internalizado” é o anticorpo que é absorvido por uma célula após a ligação ao seu antígeno na superfície da célula. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo e seus fragmentos fornecidos na presente invenção podem ser internalizados, pelo menos até certo ponto, por células que expressam CD19 em suas superfícies. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-CD19 fornecido na presente invenção pode ser internalizado por uma célula de linfoma de células B após a ligação ao CD19 expresso sobre a superfície da célula. A internalização pode ocorrer in vitro ou in vivo. Para aplicações terapêuticas, a internalização pode ocorrer in vivo. Determinar se um anticorpo internaliza após a ligação a uma célula de mamífero pode ser realizado por vários ensaios, incluindo os descritos nos Exemplos abaixo (por exemplo, o método Fab-Zap). Os métodos para detectar se um anticorpo internaliza em uma célula também estão descritos nas Patentes US 7.619.068, incorporadas ao presente por referência em sua totalidade. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno, capazes de serem internalizados, podem estar associados ou conjugados a agentes anticâncer, como porções citotóxicas que matam a célula após a internalização. Dependendo da potência do anticorpo ou conjugado de anticorpo, em alguns casos, a absorção de uma única molécula de anticorpo na célula é suficiente para matar a célula alvo à qual o anticorpo se liga. Por exemplo, certas toxinas são altamente potentes na morte, de modo que a internalização de uma molécula de toxina conjugada ao anticorpo seja suficiente para matar a célula tumoral.
[104] “Tratar” ou “tratamento de” uma condição, conforme utilizado na presente invenção, inclui a prevenção ou o alívio de uma condição, o retardo do início ou da taxa de desenvolvimento de uma condição, a redução do risco de desenvolver uma condição, a prevenção ou retardo do desenvolvimento de sintomas associados a uma condição, a redução ou término de sintomas associados a uma condição, a geração de uma regressão completa ou parcial de uma condição, a cura de uma condição ou combinações dos mesmos.
[105] Uma substância “isolada” foi alterada pela mão do homem a partir do estado natural. Se uma composição ou substância “isolada” ocorre na natureza, ela foi alterada ou removida do seu ambiente original, ou ambos.
Por exemplo, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo naturalmente presente em um animal vivo não está “isolado”, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo é “isolado” se for suficientemente separado dos materiais coexistentes em seu estado natural de modo a existir em um estado substancialmente puro. Um “ácido nucleico” ou “polinucleotídeo” isolado são utilizados indiferentemente e referem-se à sequência de uma molécula de ácido nucleico isolada. Em certos exemplos de realização, um “anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo isolado” refere-se a anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno possuindo uma pureza de, pelo menos, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, conforme determinado por métodos eletroforéticos (como SDS-PAGE, focalização isoelétrica, eletroforese capilar) ou métodos cromatográficos (como cromatografia de troca iônica ou HPLC de fase reversa).
[106] O termo “vetor” conforme utilizado na presente invenção refere-se a um veículo no qual um polinucleotídeo que codifica uma proteína pode ser operacionalmente inserido de modo a provocar a expressão dessa proteína. Um vetor pode ser usado para transformar, transduzir ou transfectar uma célula hospedeira de modo a provocar a expressão do elemento genético que ela transporta dentro da célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem plasmídeos, fagoides, cosmídeos, cromossomos artificiais, como cromossomo artificial de fermento (YAC), cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou cromossomo artificial derivado de P1 (PAC), bacteriófagos como fago lambda ou fago M13 e vírus de animais. As categorias de vírus animais utilizados como vetores incluem retrovírus (incluindo lentivírus), adenovírus, vírus adenoassociados, vírus da herpes (por exemplo, vírus herpes simplex), poxvírus, baculovírus, papilomavírus e papovavírus (por exemplo, SV40). Um vetor pode conter uma variedade de elementos para controlar a expressão, incluindo sequências promotoras, sequências iniciadoras da transcrição, sequências facilitadoras (enhancers), elementos selecionáveis e genes repórter. Além disso, o vetor pode conter uma origem de replicação. Um vetor também pode incluir materiais para auxiliar na sua entrada na célula, incluindo, mas não se limitando a, uma partícula viral, um lipossoma ou proteína de revestimento. Um vetor pode ser um vetor de expressão ou um vetor de clonagem. A presente divulgação provê vetores (por exemplo, vetores de expressão) contendo a sequência de ácido nucleico aqui fornecida que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pelo menos, um promotor (por exemplo, SV40, CMV, EF-1α) operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico e pelo menos um marcador selecionável.
Exemplos de vetores incluem, entre outros, de retrovírus (incluindo lentivírus), adenovírus, vírus adenoassociado, herpesvírus (por exemplo, vírus herpes simplex), poxvírus, baculovírus, papilomavírus, papovavírus (por exemplo, SV40), fago lambda e Fago M13, plasmídeo pcDNA3.3, pMD18-T, pOptivec, pCMV, pEGFP, pIRES, pQD-Hyg-GSeu, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS10, pLexA, pACT2.2, pCMV-SCRIPT.RTM., pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, PCR 2.1, pEF-1, pFB, pSG5, pXT1, pCDEF3, pSVSPORT, pEF-Bos e etc.
[107] A frase “célula hospedeira” tal como utilizada na presente invenção refere-se a uma célula na qual um polinucleotídeo exógeno e/ou um vetor foi introduzido.
[108] Uma frase “doença ou condição relacionada ao CD19”, conforme usada no presente pedido, refere-se a qualquer doença ou condição causada, exacerbada por, ou de outra forma ligada ao aumento ou diminuição da expressão ou atividades de CD19. Em alguns exemplos de realização, a referida doença ou condição relacionada ao CD19 é linfoma de células B, opcionalmente linfoma de Hodgkin ou linfoma não Hodgkin, em que o linfoma não Hodgkin compreende: Linfoma de células B grandes difuso (DLBCL), linfoma folicular, linfoma de células B da zona marginal (MZL), linfoma de tecido linfático associado à mucosa (MALT), linfoma linfocítico pequeno (leucemia linfocítica crônica, CLL), linfoma de células do manto (MCL), leucemia linfoblástica aguda (ALL) ou macroglobulinemia de Waldenstrom (WM).
[109] O termo “câncer”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a qualquer condição médica caracterizada pelo crescimento celular ou neoplasia maligna de células, proliferação anormal, infiltração ou metástase e inclui tumores sólidos e cânceres não sólidos (malignidades hematológicas),
como a leucemia.
Conforme utilizado na presente invenção, “tumor sólido”
refere-se a uma massa sólida de células neoplásicas e/ou malignas.
Exemplos de câncer incluem, entre outros, câncer de pulmão de células não pequenas
(escamoso/não escamoso), câncer de pulmão de pequenas células, câncer de células renais, câncer colorretal, câncer de cólon, câncer de ovário, câncer de mama (incluindo carcinoma basal de mama, carcinoma ductal) carcinoma lobular da mama), câncer de pâncreas, carcinoma gástrico, câncer de bexiga,
câncer de esôfago, mesotelioma, melanoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de tireóide, sarcoma, câncer de próstata, glioblastoma, câncer de colo do útero, carcinoma tímico, melanoma, mielomas, micoses fungoides, câncer de células de Merkel, carcinoma hepatocelular (CHC), fibrossarcoma,
mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico e outros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma,
rabdomiossarcoma, malignidade linfoide, carcinoma basocelular,
adenocarcinoma, carcinoma da glândula sudorípara, carcinoma medular da tireoide, carcinoma papilar da tireoide, feocromocitomas carcinoma da glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular,
carcinoma broncogênico, hepatoma, carcinoma do ducto biliar, coriocarcinoma,
tumor de Wilms, câncer do colo uterino, tumor testicular, seminoma, linfoma de
Hodgkin clássico (CHL), linfoma de grandes células b primário do mediastino,
linfoma linfócitos B/histiócitos ricos em células T, leucemia linfocítica aguda,
leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia mielocítica crônica (granulocítica), leucemia mieloide crônica, leucemia linfocítica crônica,
policitemia vera, tumores derivados de mastócitos, PTLD positivo e negativo para EBV, linfoma de grandes células B difuso (DLBCL), linfoma folicular,
linfoma de células B da zona marginal (MZL), linfoma de tecido linfático associado à mucosa (MALT), linfoma linfocítico pequeno (leucemia linfocítica crônica, CLL), linfoma de células do manto (MCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), linfoma plasmablástico, linfoma extranodal de células NK/T, carcinoma nasofaríngeo, linfoma de derrame primário associado ao HHV8, linfoma não- Hodgkin, mieloma múltiplo, macroglobulina de Waldenstrom (WM), doença da cadeia pesada, síndrome mielodisplásica, leucemia de células pilosas, e mielodisplasia, linfoma do SNC primário, tumor da coluna espinhal, glioma do tronco encefálico, astrocitoma, meduloblastoma, craniofariogioma, ependimoma, pinealoma, hemangiobla estoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma.
[110] O termo “farmaceuticamente aceitável” indica que o veículo, transportador, diluente, excipiente(s) e/ou sal designado é, em geral, quimicamente e/ou fisicamente compatível com os outros ingredientes que compreendem a formulação e fisiologicamente compatível com o seu receptor.
ANTICORPO ANTI-CD19
[111] A presente divulgação provê anticorpos anti-CD19 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6) sequências CDR de um anticorpo anti-CD19 selecionadas a partir de WBP7011-4.34.11, WBP7011-4.87.6, WBP7011_4.155.8, WBP7011_4.56.1, WBP7011-4.15.10, WBP7011-4.100.1, WBP7011-4.106.3, WBP7011_4.108.3, WBP7011_4.191.6, WBP7011_4.194.10, WBP7011_4.231.5, W7011-4.34.11-z1-m5, W7011-
4.87.6-z1(N-S), e W7011-4.155.8-z1-P15. Ao longo da presente divulgação, o termo “WBP7011” em relação aos nomes de anticorpos é usado de forma intercambiável com “W7011”. Por exemplo, o anticorpo WBP7011-4.34.11 também é referido como W7011-4.34.11 e esses nomes se referem ao mesmo anticorpo.
[112] “WBP7011-4.34.11”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 94, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 96.
[113] “WBP7011-4.87.6” conforme utilizado na presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 98, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 100.
[114] “WBP7011_4.155.8” conforme utilizado na presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 102, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 104.
[115] “WBP7011_4.56.1” conforme utilizado na presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 106, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 96.
[116] “WBP7011-4.15.10” conforme utilizado na presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 108, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 96.
[117] “WBP7011-4.100.1” conforme utilizado na presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 110, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 96.
[118] “WBP7011-4.106.3” conforme utilizado na presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 112, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 96.
[119] “WBP7011_4.108.3” conforme utilizado na presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 114, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 96.
[120] “WBP7011_4.191.6” conforme utilizado na presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 116, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 96.
[121] “WBP7011_4.194.10” conforme utilizado na presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 118, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 120.
[122] “WBP7011_4.231.5” conforme utilizado na presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 122, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO: 96.
[123] “W7011-4.34.11-z1-m5” conforme utilizado na presente invenção refere-se a um anticorpo humanizado baseado no WBP3311_2.166.48 que compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 124, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO:
126.
[124] “W7011-4.87.6-z1(N-S)” conforme utilizado na presente invenção refere-se a um anticorpo humanizado baseado no WBP3311_2.166.48 que compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 128 e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO:
130.
[125] “W7011-4.155.8-z1-P15” conforme utilizado na presente invenção refere-se a um anticorpo humanizado baseado no WBP3311_2.166.48 que compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 132, e uma região variável de cadeia leve kappa de SEQ ID NO:
134.
[126] A Tabela 1 mostra as sequências de CDR destes 11 anticorpos anti-CD19 de camundongo, e dos três anticorpos humanizados W7011-4.34.11-Z1-m5, W7011-4.87.6-Z1 (NS), e W7011- 4.155.8-z1-P15. As sequências da região variável de cadeia pesada e cadeia leve também são fornecidas abaixo.
TABELA 1 CDR1 CDR2 CDR3 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3
V WBP7011-4.34.11 YFNPYNDGTEYNEKFK
H GYTFTNYVIH GPYYYGSSPFDY
A SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
V WBP7011-4.34.11
K RSSQSLENSNGNTYL RVSNRFS LQVTHVPYT
N SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9
V WBP7011-4.87.6 QIYPGDDDTKYNGKFK RYFRYDYWYSD
H GYAFSTYWMN
G V V SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 WBP7011-4.87.6
K RASQDISNYLN YTSRLHS HQGNTLPLT SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15
V WBP7011_4.155.8 YIDPYNGDTTYNQKFK
H GYAFTSYNMY TAYAMDY
G V SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 WBP7011_4.155.8
K SASSTVNYMH STSNLAS HQWSSYPYT SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21
V WBP7011_4.56.1 YINPYNDGTEYNEKFK GPYYYGGSPFD
H GYTFTNYVIH
G Y SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
V WBP7011_4.56.1
K RSSQSLENSNGNTYL RVSNRFS LQVTHVPYT
N SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24
V WBP7011-4.15.10 YINPYNDGTEYHEKFK GPYYYGGSPFD
H GYTFTSYVMH
G F SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
V WBP7011-4.15.10
K RSSQSLENSNGNTYL RVSNRFS LQVTHVPYT
N SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27
V WBP7011-4.100.1 GPYYYGGSPFD
H GYTFTSYVIH YINPYNDGAEYTEKFKG
Y SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
V WBP7011-4.100.1 RSSQSLENSNGNTYL
K RVSNRFS LQVTHVPYT
N WBP7011-4.106.3 V SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30
CDR1 CDR2 CDR3
H YINPYNDGAEYAEKFK GPYYYGGSPFD GYTFSSYVIH
G Y SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
V WBP7011-4.106.3
K RSSQSLENSNGNTYL RVSNRFS LQVTHVPYT
N SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33
V WBP7011_4.108.3 YINPYNDGAEYNEKFK
H GYTFTSYVIH GPYYYGSSPFDY
G SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
V WBP7011_4.108.3
K RSSQSLENSNGNTYL RVSNRFS LQVTHVPYT
N SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36
V WBP7011_4.191.6 YINPYNDGSEYSEKFK GPYYYGGSPFD
H GYTFTDYVIH
G Y SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
V WBP7011_4.191.6
K RSSQSLENSNGNTYL RVSNRFS LQVTHVPYT
N SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 39
V WBP7011_4.194.10 YINPYNDGTKYNEKFK
H GYTFTSYVMH GPYYYGSSPFDY
G SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 42
V WBP7011_4.194.10
K RSSQTLENSNGNTYL RVSNRFS LQVTHVPYT
N SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 45
V WBP7011_4.231.5 YINPYNDGTQYNEKFK
H GYTFTSYVMH GPYYYSPSPFDY
G SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
V WBP7011_4.231.5
K RSSQSLENSNGNTYL RVSNRFS LQVTHVPYT
N SEQ ID NO: 136 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 W7011-4.34.11-z1- V m5 H GYTFTDYVIH YFNPYNDGTEYNEKFK
GPYYYGSSPFDY
A W7011-4.34.11-z1- V SEQ ID NO: 137 SEQ ID NO: 138 SEQ ID NO: 139 m5 K RSSQSLENSNHNTYIN RVSKRFS HQVTHVPYT SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 140 SEQ ID NO: 9 W7011-4.87.6-z1(N- V S) H GYAFSTYWMN QIYPGDDDTKYSGKFK RYFRYDYWYSD
G V W7011-4.87.6-z1(N- V SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 S) K RASQDISNYLN YTSRLHS HQGNTLPLT SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 141 SEQ ID NO: 15 W7011-4.155.8-z1- V P15 H GYAFTSYNMY YIDPYNADTTYNQKFK
TAYAMDY
G W7011-4.155.8-z1- V SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 P15 K SASSTVNYMH STSNLAS HQWSSYPYT
[127] As sequências de regiões variáveis de cadeia pesada ou leve kappa dos anticorpos WBP7011-4.34.11, WBP7011-4.87.6,
WBP7011_4.155.8, WBP7011_4.56.1, WBP7011-4.15.10, WBP7011-4.100.1, WBP7011-4.106.3, WBP7011_4.108.3, WBP7011_4.191.6, WBP7011_4.194.10, ou WBP7011_4.231.5 e anticorpos humanizados W7011-
4.34.11-z1-m5, W7011-4.87.6-z1 (NS) e W7011-4.155.8-z1-P15 são fornecidas abaixo.
[128] WBP7011-4.34.11-VH Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 94):
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYVIHWVKQKPGQGLEWIGYF NPYNDGTEYNEKFKAKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAKGPYYY
GSSPFDYWGQGTTLTVSS Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 95):
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTT CAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAACTATGTTA TTCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATAT TTTAATCCTTACAATGATGGTACTGAATACAATGAGAAGTTCAAAGCCAAG GCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAG CAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAAAGGTCCCTA CTACTACGGTAGTAGCCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCA CAGTCTCCTCA.
[129] WBP7011-4.34.11-VK Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 96):
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLI YRVSNRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQVTHVPYTFGG
GTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 97):
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGAT CAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGA AACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTC CTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGT GGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGC TGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACAC GTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA.
[130] WBP7011-4.87.6-VH Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 98):
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSTYWMNWVKQRPGQGLEWIGQI YPGDDDTKYNGKFKGKASLTADKSSSTAYMQLISLTSEDSAVYFCARRYFRY
DYWYSDVWGAGTTVTVTS Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 99):
CAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCT CAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTACCTATTGGA TGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACA GATTTATCCTGGAGATGATGATACTAAGTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAA AGCCTCACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACCGCCTACATGCAGCTCA TCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAAGATACT TTAGGTACGACTACTGGTATTCCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTC ACCGTCACCTCA.
[131] WBP7011-4.87.6-VK Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 100):
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRL
HSGVPARFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCHQGNTLPLTFGAGTKLELK Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 101):
GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGAC AGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAAC TGGTATCAGCAGAAACCGGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTATTACACA TCAAGATTACACTCAGGAGTCCCAGCAAGATTCAGTGGCAGTGGGTCTGG AACAGATTACTCTCTCACCATTAGTAACCTGGAACAAGAAGATATTGCCAC TTACTTTTGCCACCAGGGTAATACGCTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGAC CAAGCTGGAGCTGAAA.
[132] WBP7011-4.155.8-VH Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 102):
EIQLQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYAFTSYNMYWVKQSHGKSLEWIGYID PYNGDTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCLTTAYAMD
YWGQGTSVTVSS Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 103):
GAGATCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTT CAGTGAAGGTATCCTGCAAGGCTTCTGGTTATGCATTCACTAGCTACAACA TGTACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATAT ATTGATCCTTACAATGGTGATACTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAG GCCACATTGACTGTTGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGCATCTCAAC AGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTCTCACTACGGCCTAT GCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA.
[133] WBP7011-4.155.8-VK Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 104):
QIVLTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSTVNYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLA
SGVPSRFSGSGSGTFYSLTIRSVEAEDAADYYCHQWSSYPYTFGGGTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 105):
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAG GAGATCACCCTAACCTGCAGTGCCAGCTCGACTGTAAATTACATGCACTGG TACCAGCAGAAGTCAGGCACTTCTCCCAAACTCTTGATTTATAGCACATCC AACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGAC CTTTTATTCTCTCACAATCAGAAGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCGATTA TTACTGCCATCAGTGGAGTAGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCA AGCTGGAAATAAAA.
[134] WBP7011_4.56.1-VH
Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 106):
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYVIHWVKQKPGQGLEWIGYIN PYNDGTEYNEKFKGKATLTSDTSSSTAYMALSSLTSEDSAVYYCTRGPYYYG
GSPFDYWGQGTTLTVSS Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 107):
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTT CAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAACTATGTTA TACACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATAT ATTAATCCTTACAATGATGGTACTGAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAG GCCACACTGACTTCAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGGCGCTCAG CAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGAGGACCCT ATTACTACGGTGGTAGCCCCTTCGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTC ACAGTCTCCTCA.
[135] WBP7011_4.56.1-VK Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 96):
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLI YRVSNRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQVTHVPYTFGG
GTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 97):
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGAT CAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGA AACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTC CTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGT GGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGC TGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACAC GTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA.
[136] WBP7011_4.15.10-VH Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 108):
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWMKQKPGQGLEWIGYI NPYNDGTEYHEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVFYCARGPYYY
GGSPFDFWGQGTTLTVSS Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 109):
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGCCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTT CAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTA TGCACTGGATGAAACAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATAT ATTAATCCTTACAATGATGGTACTGAGTACCATGAGAAGTTCAAAGGCAAG GCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAG CAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTTTTACTGTGCAAGAGGACCCT ATTACTACGGTGGTAGCCCCTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTC ACGGTCTCCTCA.
[137] WBP7011_4.15.10-VK Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 96):
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLI YRVSNRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQVTHVPYTFGG
GTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 97):
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGAT CAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGA AACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTC CTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGT GGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGC TGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACAC GTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA.
[138] WBP7011_4.100.1-VH Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 110):
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVKQKPGQGLEWIGYIN PYNDGAEYTEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSTVYYCARGPYYYG
GSPFDYWGQGTTLTVSS Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 111):
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTT CAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTA TACACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATAT ATTAATCCTTACAATGATGGTGCTGAGTACACTGAGAAGTTCAAGGGCAAG GCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGTACTGCCTATATGGAGCTCAGC AGCCTGACCTCTGAGGACTCTACGGTCTATTACTGTGCACGAGGACCCTAT TACTACGGTGGTAGCCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCAC AGTCTCCTCA.
[139] WBP7011_4.100.1-VK Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 96):
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLI YRVSNRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQVTHVPYTFGG
GTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 97):
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGAT CAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGA AACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTC CTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGT GGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGC TGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACAC GTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA.
[140] WBP7011_4.106.3-VH Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 112):
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFSSYVIHWVKQKPGQGLEWIGYIN PYNDGAEYAEKFKGKATLTSDKSSSSAYMELGSLTSEDSAVYYCARGPYYYG
GSPFDYWGQGTTLTVSS Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 113):
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTT CAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCAGTAGTTATGTTA TACACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATAT ATTAATCCTTACAATGATGGTGCTGAGTATGCTGAGAAGTTCAAGGGCAAG GCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGTTCTGCCTATATGGAGCTCGGC AGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCACGAGGACCCTA TTACTACGGTGGTAGTCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCA CAGTCTCCTCA.
[141] WBP7011_4.106.3-VK Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 96):
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLI YRVSNRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQVTHVPYTFGG
GTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 97):
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGAT CAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGA AACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTC CTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGT GGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGC TGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACAC GTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA.
[142] WBP7011_4.108.3-VH Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 114):
EVQLQQSGPELVKPGASVEMSCKASGYTFTSYVIHWLKQKPGQGLEWIGYIN PYNDGAEYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMDLNSLTSEDSAVYYCARGPYYYG SSPFDYWGQGTTLTVSS
Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 115):
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTT CAGTGGAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTA TTCACTGGTTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATAT ATTAATCCTTACAATGATGGTGCTGAGTATAATGAGAAGTTCAAGGGCAAG GCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGTACAGCCTATATGGATCTCAAC AGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGACCCTA TTACTACGGTAGTAGCCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCA CAGTCTCCTCA.
[143] WBP7011_4.108.3-VK Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 96):
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLI YRVSNRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQVTHVPYTFGG
GTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 97):
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGAT CAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGA AACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTC CTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGT GGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGC TGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACAC GTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA.
[144] WBP7011_4.191.6-VH Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 116):
EVQLLQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYVIHWVKQRPGQGLEWIGYIN PYNDGSEYSEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGPYYYG
GSPFDYWGQGTTLTVSS Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 117):
GAGGTCCAGCTGCTGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTC AGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTATGTTAT ACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATAT ATTAATCCTTACAATGATGGTTCTGAGTACAGTGAGAAGTTCAAAGGCAAG GCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAG CAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGACCCT ATTACTACGGTGGTAGTCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCA CAGTCTCCTCA.
[145] WBP7011_4.191.6-VK Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 96):
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLI YRVSNRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQVTHVPYTFGG
GTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 97):
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGAT CAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGA AACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTC CTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGT GGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGC TGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACAC GTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA.
[146] WBP7011_4.194.10-VH Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 118):
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYI NPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGPYYY
GSSPFDYWGQGTTLTVSS Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 119):
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTT CAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTA TGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATAT ATTAATCCTTACAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAG GCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAACTCAG CAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGACCCT ATTACTACGGTAGTAGCCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCA CAGTCTCCTCA.
[147] WBP7011_4.194.10-VK Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 120):
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLI YRVSNRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFCLQVTHVPYTFGG
GTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 121):
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGAT CAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGACCCTTGAAAACAGTAATGGA AACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTC CTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTAGACAGGTTCAGT GGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGAC TGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGCCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACAC GTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA.
[148] WBP7011_4.231.5-VH Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 122):
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYI NPYNDGTQYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGPYYY
SPSPFDYWGQGTTLTVSS Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 123):
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTT CAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTCA TGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATAT ATTAATCCTTACAATGATGGTACTCAGTACAATGAGAAGTTTAAAGGCAAG GCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAG CAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGACCCT ATTACTACAGTCCTAGCCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCA CAGTCTCCTCA.
[149] WBP7011_4.231.5-VK Sequência de Aminoácidos (SEQ ID NO: 96):
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLI YRVSNRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQVTHVPYTFGG
GTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 97):
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGAT CAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGA AACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTC CTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGT GGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGC TGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACAC GTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA.
[150] Sabe-se que as CDRs são responsáveis pela ligação ao antígeno; entretanto, verificou-se que nem todas as 6 CDRs são indispensáveis ou imutáveis. Em outras palavras, é possível substituir ou alterar ou modificar uma, duas, ou três CDRs nos anticorpos anti-CD19 WBP7011-4.34.11, WBP7011-4.87.6, WBP7011_4.155.8, WBP7011_4.56.1, WBP7011-4.15.10, WBP7011-4.100.1, WBP7011-4.106.3, WBP7011_4.108.3, WBP7011_4.191.6, WBP7011_4.194.10, WBP7011_4.231.5, W7011-4.34.11-z1-m5, W7011-
4.87.6-z1(N-S), ou W7011-4.155.8-z1-P15, ainda reter substancialmente a afinidade de ligação específica para o CD19.
[151] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD19 e os fragmentos de ligação ao antígeno aqui proporcionados compreendem uma sequência de cadeia pesada CDR3 de um dos anticorpos anti-CD19 WBP7011-4.34.11, WBP7011-4.87.6, WBP7011_4.155.8, WBP7011_4.56.1, WBP7011-4.15.10, WBP7011-4.100.1, WBP7011-4.106.3, WBP7011_4.108.3, WBP7011_4.191.6, WBP7011_4.194.10, WBP7011_4.231.5, W7011-4.34.11- z1-m5, W7011-4.87.6-z1(N-S), ou W7011-4.155.8-z1-P15. Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD19 ou seus fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos compreendem uma sequência CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3, 9, 15, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39 e 45. As regiões CDR3 da cadeia pesada estão localizadas no centro do local de ligação ao antígeno e, portanto, acredita-se que elas façam o maior contato com o antígeno, fornecendo a energia mais livre à afinidade do anticorpo ao antígeno. Acreditasse também que a CDR3 de cadeia pesada é de longe a CDR mais diversa do sítio de ligação ao antígeno em termos de comprimento, composição de aminoácidos e conformação por múltiplos mecanismos de diversificação (Tonegawa S. Nature. 302: 575-81). A diversidade na cadeia pesada CDR3 é suficiente para produzir a maioria das especificidades de anticorpos (Xu J.L., Davis M.M.. Immunity. 13: 37-45), bem como a afinidade de ligação ao antígeno desejável (Schier R,. J Mol Biol. 263: 551 -67).
[152] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno fornecidos na presente invenção compreendem sequências adequadas da região de arcabouço ou estrutural (FR do inglês, Framework), desde que os anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno possam se ligar especificamente ao CD19. As sequências de CDR fornecidas na Tabela 1 são obtidas a partir de anticorpos de camundongo, mas podem ser enxertadas em quaisquer sequências FR adequadas de qualquer espécie adequada, como camundongo, humano, rato, coelho, entre outras espécies, usando métodos adequados conhecidos no estado da técnica, como técnicas recombinantes.
[153] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos são humanizados. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno humanizado é desejável por sua imunogenicidade reduzida em humanos. Um anticorpo humanizado é quimérico em suas regiões variáveis, uma vez que as sequências CDR não humanas são enxertadas em sequências FR humanas ou substancialmente humanas. A humanização de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser essencialmente realizada pela substituição de genes da CDR não humanos (por exemplo, murinos) pelos genes da CDR humanos correspondentes em um gene da imunoglobulina humana (consulte, por exemplo, Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536).
[154] Os domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve humanos adequados podem ser selecionados para alcançar esse objetivo usando métodos conhecidos no estado da técnica. Em um exemplo ilustrativo, a abordagem de “melhor ajuste” (best fit) pode ser usada, onde uma sequência de domínio variável de anticorpo não humano (por exemplo, de roedor) é rastreada ou submetida a comparação utilizando o programa BLAST contra um banco de dados de sequências conhecidas de domínio variável humano; e a sequência humana mais próxima da sequência de consulta não humana é identificada e usada como suporte humano para enxertar as sequências de CDR não humanas (consulte, por exemplo, Sims et al., (1993) J. Immunol. 151: 2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol 196: 901). Alternativamente, uma estrutura derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos pode ser utilizada para o enxerto de CDRs não humanas (consulte, por exemplo, Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285; Presta et al.
(1993) J. Immunol., 151: 2623).
[155] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno é composto de substancialmente todas as sequências humanas, exceto para as sequências CDR que são não humanas. Em alguns exemplos de realização, as FRs de região variável e regiões constantes, se presentes, são totalmente ou substancialmente de sequências de imunoglobulina humana. As sequências de FR humanas e as sequências da região constante humana podem ser derivadas de diferentes genes de imunoglobulina humana, por exemplo, sequências FR derivadas de um anticorpo humano e região constante de outro anticorpo humano. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno compreende FR1-4 de cadeia pesada/leve humano.
[156] Em certos exemplos de realização, os anticorpos humanizados e fragmentos de ligação ao antígeno dos memsos fornecidos na presente invenção compreendem uma ou mais sequências FR do W7011-
4.34.11-z1-m5, W7011-4.87.6-z1(N-S) ou W7011-4.155.8-z1-P15. A Tabela 2 abaixo mostra as sequências FR de W7011-4.34.11-z1-m5, W7011-4.87.6-z1 (NS) ou W7011-4.155.8-z1-P15. As sequências FR nativas de camundongo correspondentes também estão listadas na Tabela 2. As sequências da região variável de cadeia pesada e cadeia leve também são fornecidas abaixo.
TABELA 2 FR1 FR2 FR3 FR4 SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO:48 WBP7011- 47 NO: 49
4.34.11-VH EVQLQQSGPELVKPG WVKQRPGQ KATLTSDKSSSTAYMELSSL WGQGTT
ASVKMSCKAS GLEWIG TSEDSAVYYCAK LTVSS SEQ ID NO: SEQ ID W7011- SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 56 55 NO: 57
4.34.11-z1- m5-VH QVQLVQSGAEVKKPG WVRQAPGQ RVTITADKSTSTAYMELSSL WGQGTT
SSVKVSCKAS GLEWMG RSEDTAVYYCAR VTVSS
FR1 FR2 FR3 FR4 SEQ ID NO: SQ ID NO: SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 52 WBP7011- 51 53
4.34.11-VK DAVMTQTPLSLPVSL WYQQKPGQ GVLDRFSGSGSGTDFTLKIS FGGGTKL
GDQASISC SPKLLIY RVEAEDLGVYFC EIK SEQ ID NO: SEQ ID W7011- SEQ ID NO: 58 SEQ ID NO: 60 59 NO: 61
4.34.11-z1- m5-VK DIVMTQTPLSLPVTPG WYLQKPGQ GVPDRFSGSGSGTDFTLKI FGQGTKL
EPASISC SPQLLIY SRVEAEDVGVYYC EIK SEQ ID NO: SEQ ID NO: 64 SEQ ID SEQ ID NO: 62 WBP7011- 63 NO: 65
4.87.6-VH QVQLQQSGAELVRPG WVKQRPGQ KASLTADKSSSTAYMQLISL WGAGTT
SSVKISCKAS GLEWIG TSEDSAVYFCAR VTVTS SEQ ID NO: SEQ ID NO:72 SEQ ID W7011- SEQ ID NO: 70 71 NO: 73
4.87.6-z1(N- S)-VH QVQLVQSGAEVKKPG WVRQAPGQ RVTITADKSTSTAYMELSSL WGQGTT
ASVKVSCKAS GLEWMG RSEDTAVYYCAR VTVSS SEQ ID NO: SEQ ID NO: 68 SEQ ID SEQ ID NO: 66 WBP7011- 67 NO: 69
4.87.6-VK DIQMTQTTSSLSASLG WYQQKPDG GVPARFSGSGSGTDYSLTIS FGAGTKL
DRVTISC TVKLLIY NLEQEDIATYFC ELK SEQ ID NO: SEQ ID NO: 76 SEQ ID SEQ ID NO: 74 W7011- 75 NO: 77
4.87.6-z1(N- DIQMTQSPSSLSASV WYQQKPGK GVPSRFSGSGSGTDFTLTIS FGQGTKL S)-VK GDRVTITC VPKLLIY SLQPEDVATYYC EIK SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 80 WBP7011_4. 79 NO: 81
155.8-VH EIQLQQSGPELVKPGA WVKQSHGK KATLTVDKSSSTAYMHLNSL WGQGTS
SVKVSCKAS SLEWIG TSEDSAVYYCLT VTVSS SEQ ID NO: SEQ ID W7011- SEQ ID NO: 86 SEQ ID NO: 88 87 NO: 89
4.155.8-z1- P15-VH QMQLVQSGPEVKKP WVRQARGQ RVTITRDMSTSTAYMELSSL WGQGTL
GTSVKVSCKAS RLEWIG RSEDTAVYYCLT VTVSS SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID NO: 82 SEQ ID NO: 84 WBP7011_4. 83 NO: 85
155.8-VK QIVLTQSPAIMSASLG WYQQKSGT GVPSRFSGSGSGTFYSLTIR FGGGTKL
EEITLTC SPKLLIY SVEAEDAADYYC EIK SEQ ID NO: SEQ ID W7011- SEQ ID NO: 90 SEQ ID NO: 92 91 NO: 93
4.155.8-z1- P15-VK DIQLTQSPSFLSASVG WYQQKPGK GVPSRFSGSGSGTEFTLTIS FGQGTKL
DRVTITC APKLLIY SLQPEDFATYYC EIK
[157] W7011-4.34.11-z1-m5-VH Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 124):
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYVIHWVRQAPGQGLEWMGYF NPYNDGTEYNEKFKARVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGPYYYG SSPFDYWGQGTTVTVSS
Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 125):
CAGGTGCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAAGTGAAGAAGCCAGGATCCTC CGTGAAGGTCTCCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCGATTACGTGAT CCACTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGGCAAGGCTTGGAGTGGATGGGGTAC TTTAACCCCTACAACGATGGGACTGAGTACAATGAGAAGTTTAAAGCACGG GTGACCATTACCGCCGACAAGAGCACAAGCACAGCCTACATGGAGCTGTC CAGCCTCCGCAGCGAGGATACAGCCGTCTACTACTGCGCCAGAGGCCCTT ACTACTATGGGTCCAGCCCCTTCGACTATTGGGGCCAGGGGACTACAGTG ACTGTCAGTTCA.
[158] W7011-4.34.11-z1-m5-VK Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 126):
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLENSNHNTYINWYLQKPGQSPQLLIY RVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCHQVTHVPYTFGQG
TKLEIK Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 127):
GATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTTCCTGTGACCCCAGGAGA ACCAGCTTCTATCAGCTGTAGGTCCTCACAGAGCCTGGAGAACTCCAACC ACAACACCTACATAAACTGGTACCTCCAGAAGCCTGGGCAGTCTCCCCAG TTGCTGATCTACAGGGTCAGCAAACGCTTCTCCGGGGTGCCCGATCGGTT TAGTGGGAGCGGGAGCGGCACAGACTTTACACTCAAGATTTCCAGAGTGG AGGCCGAGGACGTCGGCGTCTATTACTGCCACCAAGTGACACACGTGCCC TACACATTCGGCCAGGGCACTAAACTGGAGATTAAG.
[159] W7011-4.87.6-z1(N-S)-VH Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 128):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFSTYWMNWVRQAPGQGLEWMG QIYPGDDDTKYSGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRYFR
YDYWYSDVWGQGTTVTVSS Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 129):
CAGGTCCAGCTTGTCCAGTCTGGAGCAGAAGTGAAGAAGCCAGGGGCTTC AGTGAAGGTGTCTTGCAAGGCTTCCGGATACGCCTTCTCCACTTACTGGAT GAACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGGCAGGGCTTGGAGTGGATGGGCCA GATCTATCCCGGCGATGACGACACAAAATACAGCGGGAAGTTCAAGGGGC GGGTGACCATTACCGCCGATAAAAGCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTC AGTTCCCTGAGAAGCGAGGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCAGGAGGTA CTTTCGGTACGACTACTGGTATAGCGACGTCTGGGGGCAAGGCACAACTG TCACAGTGAGCAGC.
[160] W7011-4.87.6-z1(N-S)-VK Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 130):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKVPKLLIYYTSRL
HSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCHQGNTLPLTFGQGTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 131):
GACATCCAAATGACCCAGAGCCCTTCCTCCTTGTCCGCAAGTGTGGGAGA TAGAGTGACCATCACCTGCAGGGCTTCTCAGGATATCTCCAACTACCTGAA CTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGTGCCAAAGCTCCTTATTTACTACAC CTCCCGGCTGCACAGCGGAGTCCCATCTCGCTTCAGCGGGTCAGGCAGC GGCACTGACTTTACTCTGACAATTAGCAGCCTCCAGCCTGAAGACGTCGC CACTTACTACTGTCATCAGGGGAATACACTCCCCCTGACATTCGGGCAGG GGACAAAACTGGAGATTAAG.
[161] W7011-4.155.8-z1-P15-VH Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 132):
QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYI DPYNADTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMD
YWGQGTLVTVSS Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 133):
CAAATGCAGCTCGTCCAGTCTGGACCTGAAGTGAAGAAGCCCGGGACATC CGTCAAGGTCTCATGTAAGGCTAGCGGGTACGCATTCACTTCCTACAACAT GTACTGGGTGCGCCAGGCCAGAGGACAGAGGTTGGAGTGGATCGGCTAC ATCGACCCATACAACGCCGATACTACCTACAATCAGAAGTTTAAAGGGCGG GTGACCATTACCCGGGATATGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAG CAGCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCCTGACAACAGCCT ATGCCATGGACTATTGGGGCCAGGGCACACTTGTGACTGTGAGCAGT.
[162] W7011-4.155.8-z1-P15-VK Sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 134):
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNL
ASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 135):
GACATCCAGCTCACCCAATCCCCTTCTTTCCTCTCCGCAAGTGTCGGAGAT AGGGTGACTATCACCTGCTCAGCTTCTTCAACCGTGAACTACATGCATTGG TACCAGCAGAAGCCCGGGAAAGCCCCAAAGCTGCTGATCTACAGCACCTC CAATCTGGCCAGTGGAGTGCCAAGCCGGTTTAGCGGGAGCGGCTCCGGC ACTGAATTCACTTTGACAATTAGCAGCCTTCAGCCTGAGGACTTTGCCACA TATTACTGTCACCAGTGGTCCAGCTACCCCTACACATTCGGGCAGGGCAC AAAGCTGGAGATTAAG.
[163] Todos os anticorpos anti-CD19 humanizados exemplares W7011-4.34.11-z1-m5, W7011-4.87.6-z1(N-S) ou W7011-4.155.8-z1-P151 mantiveram a afinidade de ligação específica para células que expressam CD19 (por exemplo, célula T CD4) e são pelo menos comparáveis, ou até melhores que, os anticorpos parentais de camundongos nesse aspecto.
[164] Em alguns exemplos de realização, as regiões FR derivadas de humanos podem compreender a mesma sequência de aminoácidos que da imunoglobulina humana da qual são derivadas. Em alguns exemplos de realização, um ou mais resíduos de aminoácidos da FR humana são substituídos pelos resíduos correspondentes do anticorpo não humano original. Isto pode ser desejável em certos exemplos de realização para fazer com que o anticorpo humanizado ou seu fragmento se aproxime a estrutura do anticorpo parental não humano. Em determinados exemplos de realização, o anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno aqui fornecido compreende não mais do que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições de resíduos de aminoácidos em cada uma das sequências FR humanas, ou não mais que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições de resíduos de aminoácidos em todas as FRs de um domínio variável de cadeia pesada ou leve. Em alguns exemplos de realização, essa alteração no resíduo de aminoácido pode estar presente apenas nas regiões FR da cadeia pesada, apenas nas regiões FR da cadeia leve ou em ambas as cadeias.
[165] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e seus fragmentos de ligação ao fornecidos na presente invenção compreendem uma sequência do domínio variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132. Em certos exemplos de realização, os anticorpos e seus fragmentos de ligação ao fornecidos na presente invenção compreendem uma sequência do domínio variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO:
134.
[166] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- CD19 e os fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos compreendem toda ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada e/ou toda ou uma porção do domínio variável da cadeia leve. Em um exemplo de realização, os anticorpos anti-CD19 e os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos fornecidos na presente invenção são anticorpos de domínio único que consistem em todo ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada aqui fornecido. Mais informações sobre esse anticorpo de domínio único estão disponíveis na técnica (consulte, por exemplo, a Patente US 6.248.516).
[167] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD19 e seus fragmentos fornecidos pela presente invenção compreendem ainda uma região constante de imunoglobulina. Em alguns exemplos de realização, uma região constante de imunoglobulina compreende uma região constante de cadeia pesada e/ou uma de cadeia leve. A região constante da cadeia pesada compreende as regiões CH1, de dobradiça, e/ou CH2-CH3. Em determinados exemplos de realização, a região constante da cadeia pesada compreende uma região Fc. Em certos exemplos de realização, a região constante de cadeia leve compreende Cκ.
[168] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- CD19 e seus fragmentos de ligação ao antígeno têm uma região constante do isotipo IgG1, IgG2a, ou IgG2b que possui função efetora reduzida ou depletada, tal como ADCC ou CDC, que pode ser avaliada usando vários ensaios conhecidos no estado da técnica, por exemplo, o ensaio de ligação ao receptor de Fc, ensaio de ligação ao C1q e ensaio de lise celular.
[169] A afinidade de ligação do anticorpo e fragmento fornecido pela presente invenção pode ser representada pelo valor KD, que representa a relação da velocidade de dissociação pela velocidade de associação (k off/kon) quando a ligação entre o antígeno e de ligação do antígeno molécula atinge equilíbrio. A afinidade de ligação ao antígeno (por exemplo, KD) pode ser adequadamente determinada utilizando métodos adequados conhecidos no estado da técnica, incluindo, por exemplo, o ensaio de citometria de fluxo. Em alguns exemplos de realização, a ligação do anticorpo ao antígeno em diferentes concentrações podem ser determinadas por citometria de fluxo, a intensidade de fluorescência média (MFI) determinada pode ser representada graficamente, primeiro contra a concentração de anticorpo, o valor K D pode depois ser calculado ajustando a dependência da intensidade de fluorescência da ligação específica (Y) e a concentração de anticorpos (X) na equação de saturação de um local: Y=Bmax*X/(KD+X) (Análise de Scarchard) usando o programa Prism versão 5 (GraphPad Software, San Diego, CA), em que Bmax refere-se à ligação específica máxima do anticorpo testado ao antígeno.
[170] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- CD19 e seus fragmentos de ligação ao antígeno fornecidos são capazes de se ligar especificamente ao CD19 humano/de macaco cinomolgo recombinante expresso de maneira natural ou artificial sobre a superfície de uma célula. Por exemplo, a sequência de DNA do CD19 humano/de macaco cinomolgo pode ser clonada em um vetor de expressão e depois transfectada e expressa em células 293F, de modo que a proteína CD19 humana/de macaco cinomolgo possa ser expressa na superfície das células 293F transfectadas.
[171] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- CD19 e seus fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos são capazes de ligar especificamente ao CD19 humano, expresso sobre a superfície de uma célula com uma afinidade de ligação (KD) não superior a 5x10-9 M, não superior a 1x10-9 M, não superior a 9x10-10 M, não superior a 8x10-10 M, não superior a 7x10-10 M, não superior a 6x10-10 M, não superior a 5x10-10 M, não superior a 4x10-10 M, não superior a 4x10-10 M, não superior a 3x10-10 M, não superior a 2x10-10 M ou não superior a 1x10-10 M, conforme medido pelo ensaio de citometria de fluxo.
[172] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD19 e seus fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos reagem de forma cruzada com o CD19 de macaco Cinomolgo expresso na superfície da célula.
[173] A ligação dos anticorpos ao CD19 expresso sobre uma célula também pode ser representada pelo valor da “metade da concentração máxima eficaz” (EC50), que se refere à concentração de um anticorpo na qual 50% de seu efeito máximo é observado (por exemplo, ligação ou inibição etc.).
O valor de EC50 pode ser medido por métodos conhecidos no estado da técnica, por exemplo, ensaios tipo sanduíche, como ELISA, Western Blot, ensaio de citometria de fluxo e outros ensaios de ligação. Em certos exemplos de realização, os anticorpos e os fragmentos dos mesmos aqui fornecidos se ligam especificamente ao CD19 humano expresso sobre uma célula a uma EC50 não maior que 0,01 nM, não maior que 0,02 nM, não maior que 0,03 nM, não maior que 0,04 nM, não maior que 0,05 nM, não maior que 0,1 nM, não maior que 0,2 nM, não maior que 0,3 nM, não maior que 0,4 nM, não maior que 0,5 nM, não maior que 0,6 nM, não maior que 0,7 nM, não maior que 0,8 nM, não maior que 0,9 nM ou não maior que 1 nM, conforme medido pelo ensaio de citometria de fluxo.
[174] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno se ligam ao CD19 de macaco cinomolgo com uma afinidade de ligação semelhante à do CD19 humano. Por exemplo, ligação dos anticorpos exemplares WBP7011-4.34.11, WBP7011-4.87.6, WBP7011_4.155.8, WBP7011_4.56.1, WBP7011-4.15.10, WBP7011-4.100.1, WBP7011-4.106.3, WBP7011_4.108.3, WBP7011_4.191.6, WBP7011_4.194.10, WBP7011_4.225.7 ou WBP7011_4.231.5 ao CD19 de macaco cinomolgo tem uma afinidade ou valor EC50 semelhante ao do CD19 humano.
[175] Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos fornecidos pela presente invenção se ligam especificamente ao CD19 de macaco cinomolgo expresso em uma célula com uma EC50 não superior a 0,2 nM, não superior a 0,5 nM, não superior a 0,8 nM, não superior a 1 nM, não superior a 2 nM ou não superior a 3 nM, conforme medido por ensaio de citometria de fluxo.
[176] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos fornecidos pela presente invenção são capazes de ser internalizados por uma célula que expressa CD19 a uma EC50 não maior do que 1pM, não maior do que 2 pM, não maior do que 3pM, não maior do que 4 pM, não maior do que 5pM, não maior do que 6 pM, não maior do que 7 pM, não maior do que 8 pM, não maior do que 9 pM, não maior do que 10 pM, não maior do que 11 pM, não maior do que 11 pM, não maior do que 12 pM, não mais de 13pM, não maior do que 14 pM, não maior do que 15 pM, não maior do que 16 pM, não maior do que 17 pM, não maior do que 18 pM, não maior do que 19 pM, não maior do que 20pM, não maior do que 21 pM, não maior do que 22 pM, não maior do que 23pM, não maior do que 24 pM, não maior do que 25pM, não maior do que 30pM, não maior do que 35pM, não maior do que 40pM, não maior do que 45pM ou não maior do que 50pM por Ensaio Fab-Zap.
[177] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e seus fragmentos fornecidos na presente invenção têm uma afinidade de ligação específica ao CD19 humano que é suficiente para fornecer uso diagnóstico e/ou terapêutico. Várias estratégias terapêuticas direcionadas às células B por anticorpos monoclonais anti-CD19 humano são usadas clinicamente.
[178] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui fornecidos podem ser um anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo recombinante, anticorpo biespecífico, anticorpo marcado, anticorpo bivalente ou anticorpo anti-idiotípico. Um anticorpo recombinante é um anticorpo preparado in vitro usando métodos recombinantes ao invés de animais.
VARIANTES DE ANTICORPOS
[179] A presente divulgação também abrange vários tipos variantes dos anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos. Em certos exemplos de realização, a presente divulgação abrange variantes de um anticorpo exemplar aqui fornecido, ou seja, WBP7011-4.34.11, WBP7011-4.87.6, WBP7011_4.155.8, WBP7011_4.56.1, WBP7011-4.15.10, WBP7011-4.100.1, WBP7011-4.106.3, WBP7011_4.108.3, WBP7011_4.191.6, WBP7011_4.194.10, WBP7011_4.231.5, W7011-4.34.11-z1-m5, W7011-
4.87.6-z1(N-S), ou W7011-4.155.8-z1-P15.
[180] Em certos exemplos de realização, os anticorpos variantes compreendem uma ou mais modificações ou substituições em 1, 2 ou 3 sequências de CDR, tal como previsto na Tabela 1, uma ou mais sequências FR fornecidas na Tabela 2, as sequências da região variável de cadeia pesada ou leve, e/ou a região constante (por exemplo, região Fc). Tais variantes de anticorpos retêm a afinidade de ligação específica para o CD19 dos anticorpos parentais, mas tem uma ou mais propriedades desejáveis conferidas pela(s) modificação(ões) ou substituição(ões). Por exemplo, as variantes de anticorpo podem ter afinidade de ligação ao antígeno aprimorada, padrão de glicosilação aprimorado, risco reduzido de glicosilação, desaminação reduzida, função(ões) efetora(s) reduzida(s) ou empobrecida(s), ligação ao receptor FcRn melhorada, meia-vida farmacocinética, sensibilidade ao pH e/ou compatibilidade com conjugação (por exemplo, um ou mais resíduos de cisteína introduzidos).
[181] Uma sequência de anticorpo parental pode ser rastreada para identificar resíduos adequados ou preferidos a serem modificados ou substituídos, usando métodos conhecidos no estado da técnica, por exemplo, “mutagênese de varredura de alanina” (consulte, por exemplo, Cunningham e Wells (1989) Science, 244: 1081 -1085). Resumidamente, os resíduos alvos (por exemplo, resíduos carregados como Arg, Asp, His, Lys e Glu) podem ser identificados e substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (por exemplo, alanina ou polialanina), e os anticorpos modificados são produzidos e rastreado para a propriedade interessada. Se a substituição em um determinado sítio de aminoácidos demonstrar uma mudança funcional de interesse, em seguida, a posição pode ser identificada como um resíduo potencial para a modificação ou substituição. Os resíduos potenciais podem ser avaliados posteriormente substituindo-os por um tipo diferente de resíduo (por exemplo, resíduo de cisteína, resíduo carregado positivamente, etc.). Variante De Afinidade
[182] Uma variante de afinidade pode conter modificações ou substituições em uma ou mais sequências de CDR, conforme fornecido na Tabela 1, em uma ou mais sequências FR fornecidas na Tabela 2, ou nas sequências de regiões variáveis de cadeia pesada ou leve aqui fornecidas. As variantes de afinidade retêm a afinidade de ligação específica ao CD19 do anticorpo parental, ou até apresentam uma afinidade de ligação específica ao CD19 melhorada sobre o anticorpo parental. Em certos exemplos de realização, pelo menos uma (ou todas) as substituições nas sequências CDR, sequências FR ou sequências de regiões variáveis compreendem uma substituição conservadora.
[183] Um especialista no assunto entenderá que nas sequências CDR e FR fornecidas na Tabela 1 e Tabela 2, um ou mais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, ainda que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno resultante retenha a afinidade de ligação ao CD19, ou mesmo tenha uma afinidade de ligação aprimorada. Diversos métodos conhecidos no estado da técnica podem ser utilizados para atingir esse objetivo. Por exemplo, uma biblioteca de variantes de anticorpo (como variantes de Fab ou scFv) pode ser gerada e expressa com a tecnologia de exibição de fagos e depois pesquisada quanto à afinidade de ligação ao CD19 humano. Por outro exemplo, o software de computador pode ser usado para simular virtualmente a ligação dos anticorpos ao CD19 humano e identificar os resíduos de aminoácidos nos anticorpos que formam a interface de ligação.
Tais resíduos podem ser evitados na substituição, de modo a evitar redução na afinidade de ligação, ou direcionados para a substituição, para proporcionar uma ligação mais forte.
[184] Em certos exemplos de realização, o anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno aqui fornecido compreende uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos em uma ou mais sequências de CDR e/ou uma ou mais sequências de FR. Em certos exemplos de realização, uma variante de afinidade compreende não mais do que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições nas sequências CDR e/ou sequências FR no total.
[185] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD19 e seus fragmentos de ligação ao antígeno compreendem 1, 2 ou 3 sequências de CDR com pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de identidade de sequência àquela (ou aquelas) listada(s) na Tabela 1, enquanto mantêm a afinidade de ligação ao CD19 em um nível semelhante ou até maior do que seu anticorpo parental.
[186] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD19 e seus fragmentos de ligação ao antígeno compreendem uma ou mais sequências FR com pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de identidade de sequência àquela (ou aquelas) listada(s) na Tabela 2, enquanto mantêm a afinidade de ligação ao CD19 em um nível semelhante ou até maior do que seu anticorpo parental.
[187] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD19 e seus fragmentos de ligação ao antígeno compreendem uma ou mais sequências de regiões variáveis com pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de identidade de sequência com aquela (ou aquelas) listada(s) na SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134, enquanto retém a afinidade de ligação ao CD19 em um nível semelhante ou até maior do que seu anticorpo parental. Em alguns exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos ou deletados na sequência selecionada a partir da SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, e SEQ ID NO: 134. Em alguns exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões CDRs (ou seja, nas FRs).
VARIANTE DE GLICOSILAÇÃO
[188] Os anticorpos anti-CD19 e os fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos também abrangem uma variante de glicosilação, que pode ser obtida para aumentar ou diminuir a extensão da glicosilação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.
[189] O anticorpo anti-CD19 ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode compreender um ou mais resíduos de aminoácidos com uma cadeia lateral à qual uma porção de carboidrato (por exemplo, uma estrutura de oligossacarídeo) pode ser ligada. A glicosilação de anticorpos é tipicamente N- ligada ou O-ligada. N-ligada refere-se à ligação da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina, por exemplo, um resíduo de asparagina em uma sequência de tripeptídeo, tal como asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina. A glicosilação O-ligada refere-se à ligação de um dos açúcares N-aceil- galactosamina, galactose ou xilose a um hidroxi-aminoácido, mais comumente a serina ou treonina. A remoção de um sítio de glicosilação nativo pode ser convenientemente realizada, por exemplo, alterando a sequência de aminoácidos de modo que uma das sequências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligada) ou resíduos de serina ou treonina (para sítios de glicosilação O-ligada) presentes na sequência são substituídos. Um novo sítio de glicosilação pode ser criado de uma maneira semelhante, introduzindo uma sequência de tripeptídeo ou resíduo de serina ou treonina.
VARIANTE COM MODIFICAÇÃO DE CISTEÍNA
[190] Os anticorpos anti-CD19 e os fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos também abrangem formas variantes com modificação / manipulação de cisteína, que compreende um ou mais resíduos de aminoácidos cisteína livres introduzidos.
[191] Um resíduo de cisteína livre é aquele que não faz parte de uma ponte dissulfeto. Uma variante com manipulação de cisteína é útil para conjugação com, por exemplo, um composto citotóxico e/ou de geração de imagens, um marcador ou um radioisótopo entre outros, no local da cisteína manipulada, através de, por exemplo, uma maleimida ou haloacetila. Os métodos para a modificação de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno para introdução de resíduos de cisteína livres são conhecidos no estado da técnica, veja, por exemplo, o documento WO2006/034488.
FC VARIANTE
[192] Os anticorpos anti-CD19 e fragmentos de ligação ao antígeno fornecidos na presente invenção também abrangem uma forma variante de Fc, que compreende uma ou mais modificações ou substituições de resíduos de aminoácidos em sua região Fc e/ou região de dobradiça.
[193] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD19 ou fragmentos de ligação ao antígeno compreendem uma ou mais substituições de aminoácidos que melhoram a ligação dependente do pH ao receptor Fc neonatal (FcRn). Essa variante pode ter uma meia-vida farmacocinética prolongada, pois se liga ao FcRn em pH ácido, o que lhe permite escapar da degradação no lisossomo e depois ser translocado e liberado para fora da célula. Os métodos de modificação de um anticorpo e seu fragmento de ligação ao antígeno para melhorar a afinidade de ligação ao FcRn são bem conhecidos no estado da técnica, vide, por exemplo, Vaughn, D. et al, Structure, 6(1): 63-73, 1998; Kontermann, R. et al, Antibody Engineering, Volume 1, Cap 27: Engineering of the Fc region for improved PK, publicado pela Springer, 2010; Yeung, Y. et al, Cancer Research, 70: 3269-3277 (2010); e Hinton, P. et al, J. Immunology, 176:346-356 (2006).
[194] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD19 ou fragmentos de ligação ao antígeno compreendem uma ou mais substituições de aminoácidos que alteram a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Certos resíduos de aminoácidos no domínio CH2 da região Fc podem ser substituídos para fornecer atividade ADCC aprimorada.
Alternativa ou adicionalmente, as estruturas de carboidratos no anticorpo podem ser alteradas para aumentar a atividade de ADCC. Os métodos para alterar a atividade de ADCC por manipulação por engenharia genética de anticorpos foram descritos no estado da técnica, consulte, por exemplo, Shields RL. et al., J Biol Chem. 2001. 276(9): 6591-604; Idusogie EE. et al., J Immunol.
2000.164(8):4178-84; Steurer W. et al., J Immunol. 1995, 155(3): 1165- 74; Idusogie EE. et al., J Immunol. 2001, 166(4): 2571-5; Lazar GA. et al., PNAS, 2006, 103(11): 4005-4010; Ryan MC. et al., Mol. Cancer Ther., 2007, 6: 3009- 3018; Richards JO,. et al., Mol Cancer Ther. 2008, 7(8): 2517-27; Shields R. L.
et al, J. Biol. Chem, 2002, 277: 26733-26740; Shinkawa T. et al, J. Biol. Chem,
2003, 278: 3466-3473.
[195] Em determinados exemplos de realização, os anticorpos anti-CD19 ou fragmentos de ligação ao antígeno compreendem uma ou mais substituições de aminoácidos que alteram a citotoxicidade dependente do complemento (CDC), por exemplo, melhorando ou diminuindo a ligação ao C1q e/ou a citotoxicidade dependente do complemento (CDC) (consulte, por exemplo, o documento WO99/51642; Duncan & Winter Nature 322: 738-40 (1988); Patente US 5.648.260; Patente US 5.624.821); e documento WO94/29351 relativos a outros exemplos de região Fc variantes.
[196] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD19 ou fragmentos de ligação ao antígeno compreendem uma ou mais substituições de aminoácidos na interface da região Fc para facilitar e/ou promover a heterodimerização. Essas modificações compreendem a introdução de uma protuberância em um primeiro polipeptídeo Fc e uma cavidade em um segundo polipeptídeo Fc, em que a protuberância pode ser posicionada na cavidade de modo a promover a interação do primeiro e do segundo polipeptídeo Fc para formar um heterodímero ou um complexo. Métodos para produção de anticorpos com estas modificações são conhecidos no estado da técnica, por exemplo, como descrito na Patente US 5.731.168.
FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO
[197] A presente invenção também provê fragmentos de ligação ao antígeno anti-CD19. Vários tipos de fragmentos de ligação ao antígeno são conhecidos no estado da técnica e podem ser desenvolvidos com base nos anticorpos anti-CD19 aqui fornecidos, incluindo, por exemplo, os anticorpos exemplares cujas sequências CDR e FR são mostradas nas Tabelas 1 e 2 e suas diferentes variantes (como variantes de afinidade, variantes de glicosilação, variantes de Fc, variantes com modificações de cisteína e assim por diante).
[198] Em certos exemplos de realização, um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD19 aqui fornecido é um anticorpo de domínio único camelizado, um diacorpo (diabody), um fragmento Fv de cadeia única (scFv), um dímero scFv, um BsFv, um dsFv, um (dsFv) 2, um dsFv-dsFv', um fragmento Fv, um Fab, um Fab', um F(ab')2, um anticorpo biespecífico, um diacorpo ds, um nanocorpo (nanobody), um anticorpo de domínio, um anticorpo de domínio único ou um anticorpo de domínio bivalente.
[199] Diversas técnicas podem ser usadas para a produção desses fragmentos de ligação ao antígeno. Os métodos ilustrativos incluem digestão enzimática de anticorpos intactos (consulte, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)), células hospedeiras de expressão recombinantes como E. Coli (por exemplo, para os fragmentos de anticorpo Fab, Fv e ScFv), triagem utilizando uma biblioteca de exibição em fago, como discutido acima (por exemplo, para ScFv), e o acoplamento químico de dois fragmentos Fab'-SH para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto.
[200] Em certos exemplos de realização, o fragmento de ligação ao antígeno é um scFv. A geração de scFv está descrita, por exemplo, no documento WO 93/16185; e Patentes US 5.571.894 e US 5.587.458. O scFv pode ser fundido com uma proteína efetora na extremidade amino- ou carbóxi- terminal para proporcionar uma proteína de fusão (consulte, por exemplo, Antibody Engineering, ed. Borrebaeck).
[201] Os anticorpos anti-CD19 ou seus fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos podem ser um anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo recombinante, anticorpo biespecífico, anticorpo marcado, anticorpo bivalente ou anticorpo anti-idiotípico. Um anticorpo recombinante é um anticorpo preparado in vitro usando métodos recombinantes ao invés de animais.
[202] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno podem ser usados como a base de anticorpos biespecíficos ou multivalentes, ou conjugados anticorpo-droga.
ANTICORPOS BIESPECÍFICOS, ANTICORPOS MULTIVALENTES
[203] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos são bivalentes, tetravalentes, hexavalentes ou multivalentes. Em certos exemplos de realização, os anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos monoespecíficos ou biespecíficos.
[204] O termo “valente”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se à presença de um número especificado de sítios de ligação ao antígeno em uma determinada molécula. Assim, os termos “bivalente”, “tetravalente” e “hexavalente” denotam a presença de dois sítios de ligação, quatro sítios de ligação e seis sítios de ligação, respectivamente, em uma molécula de ligação ao antígeno. Uma molécula bivalente pode ser monoespecífica se os dois sítios de ligação são ambos para ligação específica do mesmo antígeno ou do mesmo epítopo. Da mesma forma, uma molécula trivalente pode ser biespecífica, por exemplo, quando dois sítios de ligação são monoespecíficos para um primeiro antígeno (ou epítopo) e o terceiro sítios de ligação é específico para um segundo antígeno (ou epítopo).
[205] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno fornecidos na presente invenção podem ser monoespecíficos, mas bivalentes, trivalentes ou tetravalentes, com pelo menos dois sítios de ligação específicos para o mesmo antígeno ou epítopo. Isso, em certos exemplos de realização, proporciona uma ligação mais forte ao antígeno ou ao epítopo do que uma contraparte monovalente. Em certos exemplos de realização, em uma porção de ligação ao antígeno bivalente, a primeira valência de sítio de ligação e a segunda valência do sítio de ligação são estruturalmente idênticas (ou seja, possuem as mesmas sequências) ou estruturalmente diferentes (ou seja, possuem sequências diferentes, embora com a mesma especificidade).
[206] Em certos exemplos de realização, os anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos são biespecíficos. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos biespecíficos e seus fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos têm uma primeira especificidade para o CD19 e uma segunda especificidade. Em alguns exemplos de realização, a segunda especificidade é para CD19, mas para epítopos diferentes. Em alguns exemplos de realização, a segunda especificidade é para um segundo antígeno diferente do CD19, e é capaz de promover ou facilitar a resposta imune às células-alvo que expressam CD19, quando estão em estreita proximidade. Por exemplo, o anticorpo biespecífico pode aproximar as células alvo expressando CD19 de uma célula imune, tal como uma célula T ou célula NK, promovendo assim o reconhecimento ou eliminação dessa célula alvo pelo sistema imunológico.
[207] Os anticorpos biespecíficos e fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos podem ser feitos com quaisquer métodos adequados conhecidos no estado da técnica. Em uma abordagem convencional, dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina possuindo diferentes especificidades antigênicas podem ser coexpressos em uma célula hospedeira para produzir anticorpos biespecíficos de uma forma recombinante (vide, por exemplo, Milstein e Cuello, Nature, 305: 537 (1983)), seguido de purificação por cromatografia de afinidade.
[208] A abordagem recombinante também pode ser usada, em que as sequências que codificam os domínios variáveis de cadeia pesada do anticorpo para as duas especificidades são respectivamente fundidas às sequências do domínio constante da imunoglobulina, seguidas pela inserção em um vetor de expressão que é cotransfectado com um vetor de expressão com as sequências de cadeia leve em uma célula hospedeira adequada para expressão recombinante do anticorpo biespecífico (consulte, por exemplo, o documento WO 94/04690; Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)). De modo semelhante, os dímeros de scFv também podem ser recombinantemente construídos e expressos a partir de uma célula hospedeira (consulte, por exemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)).
[209] Em outro método, peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun podem ser ligados às porções Fab’ de dois anticorpos diferentes por meio de fusão gênica. Os anticorpos ligados são reduzidos na região da dobradiça para quatro meios-anticorpos (isto é, monômeros) e depois reoxidados para formar heterodímeros (Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992)).
[210] Os dois domínios de ligação ao antígeno também podem ser conjugados ou reticulados para formar um anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação ao antígeno. Por exemplo, um anticorpo pode ser acoplado à biotina enquanto o outro anticorpo à avidina, e a forte associação entre biotina e avidina complexaria os dois anticorpos juntos para formar um anticorpo biespecífico (consulte, por exemplo, a Patente US 4.676.980; WO 91/00360, WO 92/00373 e EP 03089). Para outro exemplo, os dois anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser reticulados por métodos convencionais conhecidos no estado da técnica, por exemplo, como divulgado na Patente US 4.676.980.
[211] Os fragmentos de ligação ao antígeno biespecíficos podem ser gerados a partir de um anticorpo biespecífico, por exemplo, por clivagem proteolítica ou por ligação química. Por exemplo, um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, Fab') de um anticorpo pode ser preparado e convertido em Fab'-tiol derivado e, em seguida, misturado e reagido com outro Fab' derivado convertido com uma especificidade antigênica diferente para formar um fragmento de ligação ao antígeno biespecífico (vide, por exemplo, Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)).
[212] Em certos exemplos de realização, o anticorpo biespecífico ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser manipulados na interface, de modo que uma associação do tipo “knobs-into-holes” (protuberâncias-em- cavidades) possa ser formada para promover a heterodimerização dos dois sítios de ligação ao antígeno diferentes. “Knob-in-hole”, conforme utilizado no presente, refere-se a uma interação entre dois polipeptídeos (tal como Fc), em que um polipeptídeo tem uma protuberância (ou seja, “knob” devido à presença de um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral volumosa (por exemplo, tirosina ou triptofano) e o outro polipeptídeo possui uma cavidade (por exemplo, “hole”) onde reside um resíduo de aminoácido de cadeia lateral pequena (por exemplo, alanina ou treonina), e a protuberância é posicionável na cavidade para promover a interação dos dois polipeptídeos para formar um heterodímero ou um complexo. Os métodos para produção de polipeptídeos com estas modificações knobs-into-holes são conhecidos no estado da técnica, por exemplo, como descrito na Patente US 5.731.168.
CONJUGADOS
[213] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- CD19 e os seus fragmentos de ligação ao antígeno estão ligados a um conjugado. Um conjugado é uma porção não proteinácea que pode ser ligada ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno. É contemplado que uma variedade de conjugados possa estar ligada aos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno fornecidos na presente invenção (vide, por exemplo, “Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse e R. E. Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, Nova Iorque, (1989)). Estes conjugados podem estar ligados aos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno por meio de ligação covalente, ligação por afinidade, intercalação, ligação de coordenadas, complexação, associação, mistura ou adição, entre outros métodos. Em certos exemplos de realização, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos estão ligados a um ou mais conjugados por um ligante. Em certos exemplos de realização, o ligante é um ligante de hidrazona, um ligante dissulfeto, um ligante bifuncional, ligante dipeptídico, ligante glucuronídeo, um ligante tioéter.
[214] Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD19 e os fragmentos de ligação ao antígeno descritos na presente invenção podem ser manipulados para conter sítios específicos fora da porção de ligação do epítopo que podem ser utilizados para ligação a um ou mais conjugados. Por exemplo, tal sítio pode incluir um ou mais resíduos de aminoácidos reativos, como, por exemplo, resíduos de cisteína ou histidina, para facilitar a ligação covalente a um conjugado.
[215] O conjugado pode ser um agente terapêutico (por exemplo, um agente quimioterápico), um isótopo radioativo, uma marcador detectável (por exemplo, um lantanídeo, um marcador luminescente, um marcador fluorescente ou um marcador enzima-substrato), uma porção de modificação da farmacocinética, ou porção purificadora (como uma esfera magnética ou nanopartícula).
[216] Exemplos de marcadores detectáveis podem incluir um marcador fluorescente (por exemplo, fluoresceína, rodamina, dansila, a ficoeritrina, ou vermelho Texas), marcadores di tipo enzima-substrato (por exemplo, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, luceriferase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo oxidase ou β-D-galactosidase), radioisótopos, outros lantanídeos, marcadores luminescentes, fração cromofórica, digoxigenina,
biotina/avidina, molécula de DNA ou ouro para detecção.
[217] Exemplos de radioisótopos podem incluir I123, I124, I125, I131, S35, H3, In111, In112, C14, Cu64, Cu67, Y86, Y88, Y90, Lu177, At211, Re186, Re188, Sm153, Bi212, e P32. Os anticorpos marcados com radioisótopos são úteis em experimentos de imagem direcionados a receptores.
[218] Em determinados exemplos de realização, o conjugado pode ser uma porção modificadora da farmacocinética, tal como PEG, que auxilia a aumentar a meia-vida do anticorpo. Outros polímeros adequados incluem, por exemplo, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, copolímeros de etilenoglicol/propileno glicol e similares.
[219] Em certos exemplos de realização, o conjugado pode ser uma fração de purificação, como uma esfera magnética ou uma nanopartícula.
CONJUGADOS ANTICORPO-DROGA
[220] Em certos exemplos de realização, a presente divulgação fornece conjugados anticorpo-droga (ADC) compreendendo qualquer um dos anticorpos anti-CD19 acima ou fragmentos de ligação ao antígeno conjugados com um agente citotóxico, tal como um agente quimioterápico, um medicamento, um agente inibidor do crescimento, toxina ou isótopo radioativo (ou seja, um radioconjugado).
[221] Um conjugado anticorpo-droga pode ser útil para a entrega local de agentes citotóxicos, por exemplo, no tratamento do câncer. Isso permite a entrega direcionada de agentes citotóxicos aos tumores e o acúmulo intracelular nos mesmos, o que é particularmente útil quando a administração sistêmica desses agentes citotóxicos não conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para as células normais, bem como células tumorais que procuram ser eliminadas (Baldwin et al. (1986) Lancet págs.603-05 (15 de março de 1986); Thorpe, (1985) “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” em Monoclonal Antibodies '84: Biological And
Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506; Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; Patente US 4.975.278).
[222] Em certos exemplos de realização, o agente citotóxico pode ser qualquer agente que é prejudicial para as células ou que possa danificar ou matar as células. Em certos exemplos de realização, o agente citotóxico é opcionalmente uma citotoxina, um alquilante de DNA, um inibidor da topoisomerase, um ligante de tubulina ou outros medicamentos anticâncer.
[223] Exemplos de citotoxinas enzimaticamente ativas incluem toxinas bacterianas e toxinas vegetais, como, por exemplo, toxina da difteria, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), ricina, abrina, modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PARI, PAPII e PAP-S), inibidor Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, restritocina, fenomicina, enomicina e tricotecenos (vide, por exemplo, o documento WO 93/21232). Tal toxina de molécula grande pode ser conjugada com os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno fornecidos na presente invenção usando métodos conhecidos no estado da técnica, por exemplo, conforme descrito em Vitetta et al (1987) Science, 238: 1098.
[224] O agente citotóxico pode também ser toxina de molécula pequena e medicamentos, tal como geldanamicina (Mandler et al (2000) Jour.
of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 93:8618-8623), caliqueamicina (Lode et al (1998) Cancer Res.
58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342), taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, vindesina, colquicina, doxorrubicina, daunorrubicina, daunorrubicina, di-hidroxi antracina diona, mitoxantrona,
mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina e seus análogos, antimetabolitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-mercaptopurina, 6- mercaptopurina decarbazina), agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucila, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotoesfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina(II) (DDP) (cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina) (anteriormente, actinomicina). mitramicina e antramicina (AMC)) e agentes antitimóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina), caliqueamicina, maitansinoides, dolastatinas, auristatinas, tricoteceno e CC1065 e seus derivados com atividade citotóxica.
[225] O agente citotóxico também pode ser um isótopo altamente radioativo. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Os métodos de conjugação de um radioisótopo a um anticorpo são conhecidos no estado da técnica, por exemplo, através de um reagente de ligante adequado (vide, por exemplo, o documento WO94/11026; Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, Nova Iorque, NY, Pubs. (1991)). Um reagente de ligante possui um ligante quelante que pode se ligar, quelar ou de outro modo complexar um radioisótopo metálico e também possui um grupo funcional que é reativo com um tiol de cisteína de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno. Ligantes quelantes exemplares incluem DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA e TETA (Macrocyclics, Dallas, Tex.).
[226] Os conjugados fornecidos no presente pedido de anticorpos (ou fragmentos de ligação ao antígeno) e agentes citotóxicos podem ser feitos usando uma variedade de agentes de ligação de proteínas bifuncionais. Exemplos adicionais de reagentes de ligação bifuncionais incluem propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), succinimidil-4-(N maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como cloreto de adipimidato de dimetila), ésteres ativos (tais como suberato de di-succinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis-(p-azidobenzoila)- hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)- etilenodiamina), di-isocianatos (tais como 2,6-di-isocianato de tolueno) e compostos fluorados bis-ativos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno).
[227] Em certos exemplos de realização, o ADC fornecido no presente é preparado com reagentes de ligação selecionados a partir do grupo que consiste em: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPRH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo - KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSG (succinimidil-4-vinilsulfona) benzoato). Esses reagentes ligantes estão disponíveis comercialmente (por exemplo, pela Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill., EUA, vide as páginas 467-498, do 2003-2004 Applications Handbook and Catalog).
[228] Em certos exemplos de realização, o ligante é clivável sob um ambiente fisiológico específico, facilitando assim a liberação do fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, o ligante pode ser um ligante ácido-lábil, ligante sensível à peptidase, ligante fotolábil, ligante dimetílico ou ligante contendo dissulfeto (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992); Patente US 5.208.020). Em alguns exemplos de realização, o ligante pode compreender resíduos de aminoácidos, como um dipeptídeo, um tripeptídeo, um tetrapeptídeo ou um pentapeptídeo. Os resíduos de aminoácidos no ligante podem ser resíduos de aminoácidos naturais ou não naturais. Exemplos de tais ligantes incluem: valina-citrulina (ve ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ou ala- phe), glicina-valina-citrulina (gly-yal-cit), glicina-glicina-glicina (gly-gly -gly), uma valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonila (“vc-PAB”). Componentes ligantes de aminoácidos podem ser concebidos e otimizados em sua seletividade para a clivagem enzimática por meio de enzimas específicas, por exemplo, uma protease associada ao tumor, catepsinas B, C e D, ou uma protease plasmina.
[229] Em certos exemplos de realização, no ADC aqui fornecido, um anticorpo (ou fragmento de ligação ao antígeno) é conjugado com um ou mais agentes citotóxicos em uma proporção de anticorpo:agente de cerca de 1 a cerca de 20, cerca de 1 a cerca de 6, cerca de 2 a cerca de 6, cerca de 3 a cerca de 6, cerca de 2 a cerca de 5, cerca de 2 a cerca de 4 ou cerca de 3 a cerca de 4.
[230] O ADC aqui fornecido pode ser preparado por quaisquer métodos adequados conhecidos no estado da técnica. Em certos exemplos de realização, um grupo nucleofílico do anticorpo (ou fragmento de ligação ao antígeno) é reagido primeiro com um reagente de ligação bifuncional e depois ligado ao agente citotóxico, ou vice-versa, isto é, primeiro reagindo um nucleofílico do agente citotóxico com um ligante bifuncional e, em seguida, ligando ao anticorpo.
[231] Em certos exemplos de realização, o agente citotóxico pode conter (ou ser modificado para conter) um grupo funcional reativo ao tiol que pode reagir com uma cisteína tiol de uma cisteína livre dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno fornecidos pela presente invenção. Grupo funcional tiol-reativo exemplar inclui, por exemplo, uma maleimida, uma iodoacetamida, um dissulfeto de piridila, haloacetila, éster succinimidila (por exemplo, NHS, N-hidroxisuccinimida), isotiocianato, cloreto de sulfonila, 2,6- diclorotriazinila, éster de pentafluorofenila fosforamidita (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London;
Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. em: Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671).
[232] O agente citotóxico ou o anticorpo pode reagir com um reagente de ligação antes de ser conjugado para formar o ADC. Por exemplo, o éster N-hidroxissuccinimidila (NHS) de um agente citotóxico pode ser pré- formado, isolado, purificado e/ou caracterizado, ou pode ser formado in situ e reagido com um grupo nucleofílico de um anticorpo. Normalmente, a forma carboxila do conjugado é ativada reagindo com alguma combinação de um reagente de carbodi-imida, por exemplo, diciclo-hexilcarbodi-imida; carbodi- imida de di-isopropil ou um reagente de urônio, por exemplo, TsTu (tetrafluoroborato de O-(N-succinimidil)-N,N,N',N'-tetrametilurônio, HBTU (Hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il)-N,N,N’N’-tetrametilurônio) ou HATU (hexafluorofosfato de O- (7-azabenzotriazol-1-il)-N, N,N',N'-tetrametilurônio), um ativador, como 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) e N-hidroxissuccinimida para dar o éster NHS. Em alguns casos, o agente citotóxico e o anticorpo podem ser ligados por ativação e reação in situ para formar o ADC em uma etapa. Outros reagentes de ativação e ligação incluem TBTU (hexafluorofosfato de 2-(1H- benzotriazo-1-il)-1-1,3,3-tetrametilurônio), TFFH (2-fluoro-hexafluorofosfato de N,N',N'',N'''- tetrametilurônio), PyBOP (benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino- fosfônio, hexafluorofosfato, EEDQ (2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-di-hidro- quinolina), DCC (diciclohexilcarbodi-imida), DIPCDI (di-isopropilcarbodi-imida), MSNT (1-(mesitileno-2-sulfonil)-3-nitro-1H-1,2,4-triazol e aril sulfonil haletos, por exemplo, cloreto de tri-isopropilbenzenossulfonila. Em outro exemplo, o anticorpo ou os fragmentos de ligação ao antígeno podem ser conjugados com a biotina, depois conjugados indiretamente com um segundo conjugado que está conjugado com a avidina.
MAITANSINA E MAITANSINOIDES
[233] Em um exemplo de realização, qualquer um dos anticorpos anti-CD19 ou fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos é conjugado com uma ou mais moléculas de maitansinoide. Os maitansinoides são inibidores mitóticos que agem através da inibição da polimerização de tubulina.
[234] Os compostos de maitansina (tais como ésteres de maitansinol e C-3 maitansinol) adequados para uso como porções de droga maitansinoide são bem conhecidos no estado da técnica e podem ser isolados a partir de fontes naturais de acordo com métodos conhecidos, produzidos usando técnicas de engenharia genética (consulte Yu et al. (2002) PNAS 99: 7968-7973), ou análogos de maitansinol e maitansinol preparados sinteticamente de acordo com métodos conhecidos (vide, por exemplo, as Patentes US 4.137.230; 4.248.870; 4256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757;
4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821;
4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; e 4.371.533).
[235] Maitansinoides adequados são descritos, por exemplo, na patente US 5.208.020 e em outras patentes e publicações não patentarias referidas abaixo na presente invenção. Maitansinoides exemplares são maitansinol e análogos de maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da molécula de maitansinol, vide, por exemplo, C-49-decloro (Patente US 4.256.746); C-20-hidroxi (ou C-20-demetil) +/-C-19-decloro (Patentes US 4.361.650 e 4.307.016); C-20-demetoxi. C-20-aciloxi (--OCOR), +/-decloro (Patente US 4.294.757). C-9-SH (Patente US 4.424.219); C-14- alcoximetil(demetoxi/C2OR)(Patente US 4.331.598); C-14-hidroximetil ou aciloximetila (C2OH ou C2OAc) (Patente US 4.450.254); C-15-hidroxi/aciloxi (Patente US 4.364.866); C-15-metoxi (Patente US 4.313.946 e 4.315.929); C- 18-N-demetil (Patente US 4.362.663 e 4.322.348); e 4,5-deoxi (Patente US
4.371.533) Em determinados exemplos de realização, o conjugado de maitansinoide com os anticorpos aqui fornecidos é DM1 (N2'-desacetil-N2'-(3-
mercapto-1-oxopropil)-Maitansina), ou DM4 (N2'-deacetil-N2'-(4-mercapto-4- metil-1-oxopentil)-6-metilmaitanosina).
[236] Os conjugados anticorpo antiCD19-maitansinoide podem ser preparados quimicamente ligando um anticorpo a uma molécula de maitansinoide sem diminuir significativamente a atividade biológica do anticorpo ou da molécula maitansinoide. Vide, por exemplo, a Patente US
5.208.020 (cuja divulgação é expressamente incorporada ao presente pela referência). Em certos exemplos de realização, uma média de 1 a 4, 2 a 4 ou 3 a 4 moléculas de maitansinoide é conjugada por molécula de anticorpo sem afetar negativamente a função ou solubilidade do anticorpo.
[237] Uma porção maitansinoide pode ser ligada a um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno através de quaisquer ligantes adequados conhecidos no estado da técnica, vide, por exemplo, a Patente US 5.208.020,
6.441.163 ou Patente EP 0 425 235 B1, Chari et al., Cancer Research 52: 127- 131 (1992) e Publicação US 2005/0169933 A1, cujas descrições são expressamente incorporadas ao presente por referência. Os ligantes no ADC aqui fornecidos incluem grupos dissulfeto, grupos tioéter, grupos ácido-lábeis, grupos fotolábeis, grupos peptidase-lábeis ou grupos esterase-lábeis. Em certos exemplos de realização, o ligante no ADC aqui fornecido é um agente de acoplamento de proteína bifuncional, como propionato de N-succinimidil-3- (2- piridilditio) (SPDP), ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N- maleimidometila) (SMCC), pentanoato de N-succinimidil-4- (2-piridiltio) (SPP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (como dimetil adipimidato, HCl), ésteres ativos (como o suerato de dissuccinimidila), aldeídos (como glutaraldeído), compostos de bis-azida (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (como bis-(p-diazônio-benzoil) etilenodiamina), di-isocianatos (como tolueno 2,6-di-isocianato) e compostos de flúor his-ativos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno).
[238] O ligante pode estar unido à molécula de maitansinóide em diversas posições, dependendo do tipo da ligação. Uma ligação éster pode ser formada, por exemplo, por meio da reação com um grupo hidroxila, utilizando- se técnicas convencionais de acoplamento. A reação pode ocorrer na posição C-3 que possui um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila, na posição C-15 modificada com um grupo hidroxila e na posição C-20 que possui um grupo hidroxila. Em uma realização preferida, a ligação é formada na posição C-3 de maitansinol ou um análogo do maitansinol.
AURISTATINAS E DOLOSTATINAS.
[239] Em um exemplo de realização, qualquer um dos anticorpos anti-CD19 ou fragmentos de ligação ao antígeno fornecidos no presente é conjugado com uma ou mais dolostatinas, análogos peptídicos da dolostatina e derivado ou auristatinas (Patentes US 5.635.483; 5.780.588). As dolastatinas e auristatinas têm atividade anticâncer e antifúngica, presumivelmente por interferência na dinâmica dos microtúbulos, hidrólise de GTP e divisão nuclear e celular (consulte, por exemplo, a Patente US 5.663.149; Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961 -2965; Woyke et al (2001) Antimicrob.
Agents and Chemother. 45 (12): 3580-3584).
[240] Auristatinas exemplares incluem MMAE e MMAF. As moléculas de droga auristatina/dolastatina podem ser preparadas de acordo com os métodos: US 2005/0238649; Patente US 5.635.483; Patente US
5.780.588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G. R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863; e Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784.
[241] A molécula de droga dolastatina ou auristatina pode ser unida covalentemente a um anticorpo através da extremidade N-terminal (amino) ou do C-terminal (carboxila) da fração peptídica da droga (documento
WO 02/088172).
COMPOSIÇÃO DO RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO (CAR)
[242] A presente divulgação também fornece receptores de antígeno quiméricos (CARs) compreendendo fragmento de ligação a antígeno do anticorpo aqui fornecido que se liga especificamente ao CD19 e a uma porção de ativação de células T. Em alguns exemplos de realização, a porção de ativação de células T compreende uma porção de ativação de células T nativa de um receptor de células T (TCR). Em alguns exemplos de realização, a porção de ativação de células-T compreende um domínio transmembrana e um domínio de sinalização intracelular de um TCR.
FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO
[243] Em alguns exemplos de realização, o fragmento de ligação ao antígeno pode ser qualquer fragmento que se liga ao CD19, incluindo, mas não se limitando a domínios de reconhecimento de antígenos derivados de qualquer um ou mais dos anticorpos aqui fornecidos. Em alguns exemplos de realização, é benéfico que o fragmento de ligação ao antígeno seja derivado da mesma espécie em que o CAR que será utilizado. Por exemplo, para uso em humanos, pode ser benéfico ter o fragmento de ligação ao antígeno usado no CAR derivado de um anticorpo humano ou de um anticorpo humanizado. Em alguns exemplos de realização, o fragmento de ligação ao antígeno é um fragmento variável de cadeia única (scFv). Em alguns exemplos de realização, o fragmento de ligação ao antígeno pode existir em uma variedade de outras formas, incluindo, por exemplo, Fv, Fab e (Fab')2, bem como fragmentos de anticorpos híbridos bifuncionais (ou seja, biespecíficos) (por exemplo, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)).
DOMÍNIO TRANSMEMBRANA
[244] Com relação ao domínio transmembrana, em vários exemplos de realização, o CAR é projetado para compreender um domínio transmembrana que é fundido ao domínio extracelular do CAR. Em um exemplo de realização, o domínio transmembrana que está naturalmente associado a um dos domínios no CAR é usado. Em alguns casos, o domínio transmembrana pode ser selecionado ou modificado por substituição de aminoácidos para evitar a ligação de tais domínios aos domínios transmembrana da mesma proteína ou de proteínas diferentes da superfície da membrana para minimizar as interações com outros membros do complexo receptor.
[245] O domínio transmembrana pode ser derivado de uma fonte natural ou de uma fonte sintética. Quando a fonte é natural, o domínio pode ser derivado de qualquer proteína ligada à membrana ou transmembrana. As regiões transmembranares de uso particular na presente invenção podem ser derivadas (ou seja, compreendem pelo menos a região transmembrana) da cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Em alguns casos, uma variedade de dobradiças (hinges) humanas também pode ser utilizada, incluindo a dobradiça da Ig (imunoglobulina) humana.
[246] Em um exemplo de realização, o domínio transmembrana pode ser sintético, caso em que compreenderá predominantemente resíduos hidrofóbicos, como leucina e valina. Num aspecto, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio transmembrana sintético. Opcionalmente, um ligante oligo- ou polipeptídico curto, com comprimento de 2 a 10 aminoácidos, pode formar a ligação entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização citoplasmático do CAR.
Um dupleto de glicina-serina fornece um ligante particularmente adequado.
DOMÍNIO DE TRANSDUÇÃO DE SINAL
[247] O domínio de transdução de sinal do CAR da presente divulgação é responsável pela ativação de pelo menos uma das funções efetoras do TCR normais da célula T na qual o CAR foi colocado. A função efetora TCR de uma célula T, por exemplo, pode ser atividade citolítica ou atividade auxiliar, incluindo a secreção de citocinas. Assim, o termo “domínio de transdução de sinal” refere-se à porção de uma proteína que transduz o sinal da função efetora do TCR e direciona a célula T para executar uma função especializada. Embora geralmente todo o domínio de transdução de sinal intracelular possa ser empregado, em muitos casos, não é necessário usar toda a cadeia. Na medida em que uma porção truncada do domínio de transdução de sinal intracelular é usada, essa porção truncada pode ser usada no lugar da cadeia intacta, desde que transduza o sinal da função efetora. O termo domínio de sinalização intracelular pretende assim incluir qualquer porção truncada do domínio de transdução de sinal intracelular suficiente para transduzir o sinal da função efetora do TCR.
[248] Exemplos de domínios de sinalização intracelular para uso no CAR da presente divulgação incluem as sequências citoplasmáticas do receptor de células T (TCR) e correceptores que atuam conjuntamente para iniciar a transdução de sinal após o envolvimento do receptor de antígeno, bem como qualquer derivado ou variante dessas sequências e qualquer sequência sintética que tenha a mesma capacidade funcional.
[249] Sabe-se que os sinais gerados apenas através do TCR são insuficientes para a ativação completa da célula T e que também é necessário um sinal secundário ou coestimulador. Assim, pode-se dizer que a ativação de células T é mediada por duas classes distintas de sequência de sinalização citoplasmática: aquelas que iniciam a ativação primária dependente de antígeno através do TCR (sequências primárias de sinalização citoplasmática) e aquelas que agem de maneira independente do antígeno para fornecer um sinal secundário ou coestimulador (sequências secundárias de sinalização citoplasmática).
[250] As sequências de transdução de sinal intracelular primário regulam a ativação primária do complexo TCR de maneira estimulatória ou inibitória. As sequências de sinalização intracelular primária que atuam de maneira estimulatória podem conter motivos de sinalização que são conhecidos como motivos de ativação com base em imunorreceptor tirosina ou ITAMs.
[251] Exemplos de ITAM contendo sequências de sinalização citoplasmáticas primárias que são de uso particular na invenção incluem aquelas derivadas de TCR zeta, FcR gama, FcR beta, CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b e CD66d. É particularmente preferido que a molécula de sinalização citoplasmática no CAR da invenção compreenda uma sequência de sinalização citoplasmática derivada de CD3-zeta.
[252] Em um exemplo de realização preferido, o domínio de sinalização intracelular do CAR é projetado para compreender o domínio de sinalização CD3-zeta sozinho ou combinado com qualquer(quaisquer) outro(s) domínio(s) citoplasmático(s) desejado(s) útil(úteis) no contexto do CAR da presente divulgação. Por exemplo, o domínio de sinalização intracelular do CAR pode compreender uma porção da cadeia CD3 zeta e uma região de sinalização coestimulatória. A região de sinalização coestimulatória refere-se a uma porção do CAR compreendendo o domínio intracelular de uma molécula coestimulatória. Uma molécula coestimulatória é uma molécula da superfície celular que não seja um receptor de antígeno ou ligantes destes que é necessária para uma resposta eficiente de linfócitos a um antígeno. Exemplos de tais moléculas incluem CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 associado à função de linfócitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, e um ligante que se liga especificamente ao CD83 e similares. A porção da cadeia zeta CD3 e a região de sinalização coestimulatória podem ser ligadas entre si de forma aleatória ou em uma ordem especificada. Opcionalmente, um ligante oligo- ou polipeptídico curto, por exemplo, possuindo entre 2 e 10 aminoácidos de comprimento, pode formar a ligação. Um dupleto de glicina-serina fornece um ligante particularmente adequado.
[253] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda sequências de ácidos nucleicos que codificam o CAR provido pela presente invenção, compreendendo uma primeira sequência polinucleotídica que codifica um fragmento de ligação ao antígeno dos anticorpos aqui fornecidos e, opcionalmente, uma segunda sequência polinucleotídica que codifica um domínio transmembrana e um domínio de transdução de sinal intracelular do TCR. Em alguns exemplos de realização, a sequência que codifica o fragmento de ligação ao antígeno está operacionalmente ligada à sequência que codifica o domínio transmembrana e o domínio de transdução de sinal do TCR. Em alguns exemplos de realização, a transdução de sinal compreende uma região de sinalização coestimulatória e/ou uma porção da cadeia CD3 zeta. As sequências de ácidos nucleicos que codificam as moléculas desejadas podem ser obtidas usando métodos recombinantes conhecidos no estado da técnica, como, por exemplo, pesquisando bibliotecas de células que expressam o gene, derivando o gene de um vetor conhecido por incluir o mesmo ou isolando diretamente de células e tecidos contendo os mesmos, usando técnicas padrão. Alternativamente, o gene de interesse pode ser produzido sinteticamente, em vez de clonado.
[254] Em um aspecto, a presente divulgação fornece vetores que compreendem a sequência de ácido nucleico que codifica o CAR aqui fornecido. Em alguns exemplos de realização, o vetor é uma construção de vetor retroviral e lentiviral que expressa o CAR da presente divulgação que pode ser diretamente transduzido em uma célula, ou uma construção de RNA que pode ser transfectada diretamente em uma célula.
[255] Em um aspecto, a presente divulgação proporciona células hospedeiras isoladas que expressam o CAR aqui proporcionado.
[256] Em um aspecto, a presente divulgação fornece ainda métodos para estimular uma resposta imune mediada por células T a um alvo expressando CD19 em um sujeito, cujo método compreende a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz das células T expressando CAR aqui fornecidas.
POLINUCLEOTÍDEOS E MÉTODOS RECOMBINANTES
[257] A presente divulgação fornece polinucleotídeos isolados que codificam os anticorpos anti-CD19 e seus fragmentos de ligação ao antígeno. Em certos exemplos de realização, os polinucleotídeos isolados compreendem uma ou mais sequências de nucleotídeos, como mostrado nas SEQ ID NOs: 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133 e/ou 135, que codificam a região variável dos anticorpos exemplares. O DNA codificante do anticorpo monoclonal é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (utilizando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo). O DNA codificante também pode ser obtido por métodos sintéticos.
[258] O polinucleotídeo isolado que codifica os anticorpos anti- CD19 e seus fragmentos de ligação ao antígeno (por exemplo, incluindo as sequências mostradas nas SEQ ID NOs: 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133 e/ou 135) pode ser inserido em um vetor para posterior clonagem (amplificação do DNA) ou expressão, utilizando técnicas recombinantes conhecidas no estado da técnica.
Muitos vetores estão disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não se limitam a, um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal, origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento acentuador (enhancer), um promotor (por exemplo, SV40, CMV, EF-1α) e uma sequência de término de transcrição.
[259] Em alguns exemplos de realização, o sistema de vetor inclui sistemas de mamífero, bactérias, leveduras, etc., e compreende plasmídeos tais como, mas não se limitando a, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pCMV, pEGFP, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO,pVIVO, pMAL, pMD18-T, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS420, pLexA, pACT2.2 etc. e outros vetores laboratoriais e comercialmente disponíveis. Os vetores adequados podem incluir plasmídeos ou vetores virais (por exemplo, retrovírus defeituosos de replicação, adenovírus e vírus adenoassociados).
[260] Vetores que compreendem a sequência polinucleotídica que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno podem ser introduzidos em uma célula hospedeira para clonagem ou expressão de genes.
Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do DNA nos vetores da presente invenção são células de procariotos, leveduras, ou células eucarióticas superiores descritas acima. Células hospedeiras apropriadas para este propósito incluem eubactérias, tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae como a Escherichia ou, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, tal como, Salmonella typhimurium, Serratia, tal como a Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli tal como o B. subtilis e B. licheniformis, Pseudomonas tal como a P. aeruginosa, e Streptomyces.
[261] Além dos procariotos, micróbios eucariotos tais como fungos filamentosos e leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para os vetores que codificam o anticorpo anti-CD19.
Saccharomyces cerevisiae ou fermento comum é o micro-organismo eucarioto mais comumente utilizado dentre os micro-organismos hospedeiros eucariotos inferiores. Entretanto, uma variedade de outros gêneros, espécies e cepas são comumente disponíveis e úteis para a presente invenção, tal como, Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces; hospediros como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K .
thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como, por exemplo, Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus, tal como A. nidulans e A. niger.
[262] As células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos glicosilados ou seus fragmentos de ligação ao antígeno são derivadas de organismos eucariotos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas cepas de baculovírus e células hospedeiras de insetos variantes e correspondentes permissivos a partir de hospedeiros como, Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquitos), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de fruta) e Bombyx mori. Uma variedade de cepas virais para a transfecção está disponível publicamente, por exemplo, o variante de L-1 da Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 da Bombyx mori NPV, e esses vírus podem ser usados como o vírus de acordo com a presente invenção, particularmente na transfecção de células da Spodoptera frugiperda.
Culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco também podem ser utilizadas como hospedeiras.
[263] Entretanto, há um maior interesse em células de vertebrados e propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) tornaram-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são: linhagem CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em suspensão de cultura, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster filhotes (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macacos (CV1 ATCC CCL 70); células de rim do macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células do fígado de ratos buffalo (buffalo rat liver cells) (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci.
383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2). Em alguns exemplos de realização preferidos, a célula hospedeira é a célula 293F.
[264] As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou de clonagem descritos acima para produção de anticorpos anti-CD19 e cultivadas em meio nutriente convencional modificado de forma a ser apropriado para a indução dos promotores, seleção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas. Em outro exemplo de realização, o anticorpo pode ser produzido por recombinação homóloga conhecida no estado da técnica.
[265] As células hospedeiras utilizadas para a produção dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios de cultura. Os meios de crescimento comercialmente disponíveis, tais como o meio Ham's F10 (Sigma),
Meio Essencial Mínimo (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio de Eagle modificado da Dulbecco (DMEM, Sigma) são adequados para o cultivo de células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descrito em Ham et al., Meth. Enzymol. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes US 4.767.704, US 4.657.866, US 4.927.762, US 4.560.655, US 5.122.469 documentos WO 90/03430; WO 87/00195; ou no pedido de Patente US 30.985, pode ser utilizado como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado, se necessário, com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (como a insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleotídeos (tais como a adenosina e timidina), antibióticos (como GENTAMYCINA®), oligoelementos (definidas como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar), e glicose ou uma fonte equivalente de energia. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos em concentrações adequadas que seria conhecida pelos técnicos no assunto. As condições de cultura tais como, temperatura, pH, e similares são aquelas anteriormente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e será evidente para o técnico hábil no assunto.
[266] Os anticorpos anti-CD19 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos preparados a partir das células podem ser purificados pelo uso, por exemplo, de cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise, cromatografia de troca iônica em DEAE-celulose, precipitação de sulfato de amônio, método de precipitação por salificação (salting out), cromatografia de afinidade, sendo a cromatografia de afinidade a técnica de purificação preferida.
[267] Em certos exemplos de realização, a proteína A imobilizada em uma fase sólida é usada para purificação por imunoafinidade do anticorpo e seu fragmento de ligação ao antígeno. A adequação da proteína A como ligante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que são baseados nas cadeias pesadas gama1, gama2, ou gama4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongos e para a gama3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:1567 1575 (1986)). A matriz ao qual o ligante de afinidade é acoplado é mais frequentemente, agarose, mas também outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro com poros controlados ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem velocidade de fluxo mais rápido e tempo de processamento mais curto do que aqueles que podem ser alcançados com a agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX® (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Outras técnicas para a purificação de proteína tais como fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação em etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE®, cromatografia em uma resina de troca catiônica ou aniônica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocusação, SDS-PAGE, e precipitação em sulfato de amônio também estão disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.
[268] Após qualquer(quaisquer) etapa(s) de purificação preliminar(es), a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida a cromatografia de interação hidrofóbica em pH baixo utilizando um tampão de eluição com um pH de cerca de 2,5 a 4,5, preferencialmente realizada sob baixas concentrações de sal (tal como, cerca de 0 a 0,25 M de sal).
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA
[269] A presente descrição proporciona ainda composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos anti-CD19 ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos ou o conjugado anticorpo -droga fornecido pela presente invenção e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.
[270] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis para uso nas composições farmacêuticas aqui reveladas podem incluir, por exemplo, veículos líquidos, gel ou sólidos farmaceuticamente aceitáveis, veículos aquosos, veículos não aquosos, agentes antimicrobianos, agentes isotônicos, tampões, antioxidantes, anestésicos, agentes de suspensão/dispersantes, agentes sequestradores ou quelantes, diluentes, adjuvantes, excipientes ou substâncias auxiliares não tóxicas, outros componentes conhecidos no estado da técnica, ou várias combinações dos mesmos.
[271] Os componentes úteis podem incluir, por exemplo, antioxidantes, cargas (fillers), aglutinantes, desintegrantes, tampões, conservantes, lubrificantes, aromatizantes, espessantes, agentes corantes, emulsificantes ou estabilizantes, tais como açúcares e ciclodextrinas. Os antioxidantes adequados podem incluir, por exemplo, metionina, ácido ascórbico, EDTA, tiossulfato de sódio, platina, catalase, ácido cítrico, cisteína, tioglicerol, ácido tioglicólico, tiosorbitol, hidroxanisol butilado, hidroxitolueno butilado e/ou galato propílico. Conforme descrito na presente invenção, a inclusão de um ou mais antioxidantes tais como a metionina em uma composição que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno e os conjugados, tal como proporcionado pela presente invenção, diminuem a oxidação do anticorpo ou de seu fragmento de ligação ao antígeno.
Esta redução na oxidação previne ou reduz a perda de afinidade de ligação, melhorando assim a estabilidade do anticorpo e maximizando a vida útil.
Consequentemente, em determinados exemplos de realização são proporcionadas composições que compreendem um ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno como os aqui revelados e um ou mais antioxidantes, tal como a metionina. São fornecidos ainda métodos para prevenir a oxidação, prolongar a vida útil e/ou melhorar a eficácia de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, tal como os proporcionados pela presente invenção, pela mistura do anticorpo ou dos fragmentos de ligação ao antígeno com um ou mais antioxidantes, tal como a metionina.
[272] Para ilustrar, os veículos farmaceuticamente aceitáveis podem incluir, por exemplo, veículos aquosos tal como cloreto de sódio para injeção, solução de Ringer para injeção, injeção isotônica de dextrose, água estéril para injeção ou dextrose e Ringer para injeção com lactato, veículos não aquosos, como óleos fixos de origem vegetal, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de sésamo ou óleo de amendoim, agentes antimicrobianos em concentrações bacteriostáticas ou fungistáticas, agentes isotônicos como cloreto de sódio ou dextrose, tampões como tampões de fosfato ou citrato, antioxidantes como bissulfato de sódio, anestésicos locais, tal como cloridrato de procaína, agentes de suspensão e dispersão tal como carboximetilceluose sódica, hidroxipropilmetilcelulose ou polivinilpirrolidona, agentes emulsificantes como o Polissorbato 80 (TWEEN-80), agentes sequestradores ou quelantes, tal como EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) ou EGTA (ácido etilenoglicol tetraacetico), álcool etílico, polietileno glicol, propileno glicol, hidróxido de sódio, ácido clorídrico, ácido cítrico ou ácido lático. Os agentes antimicrobianos utilizados como veículos podem ser adicionados a composições farmacêuticas em recipientes de doses múltiplas que incluem fenóis ou cresóis, mercuriais, álcool benzílico, clorobutanol, ésteres de ácido metil e porpil p-hidroxibenzoico, timerosal, cloreto de benzalcônio e cloreto de benzetônio. Os excipientes adequados podem incluir, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol ou etanol. As substâncias auxiliares não tóxicas adequadas podem incluir, por exemplo, agentes umectantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento de pH, estabilizantes, potenciadores da solubilidade ou agentes como acetato de sódio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina ou ciclodextrina.
[273] As composições farmacêuticas podem estar em uma solução líquida, suspensão, emulsão, pílula, cápsula, comprimido, formulação de libertação controlada ou pó. As formulações orais podem incluir veículos padrão tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, polivinil-pirrolidona, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc.
[274] Em determinados exemplos de realização, as composições farmacêuticas são formuladas em uma composição injetável. As composições farmacêuticas injetáveis podem ser preparadas em qualquer forma convencional, tal como, por exemplo, solução líquida, suspensão, emulsão ou formas sólidas adequadas para gerar solução líquida, suspensão ou emulsão.
As preparações para injeção podem incluir soluções estéreis e/ou apirogênicas prontas para injeção, produtos solúveis em seco estéril, como pó liofilizado, pronto para ser combinado com um solvente imediatamente antes do uso, incluindo comprimidos hipodérmicos, suspensões estéreis prontas para injeção, produtos estéreis insolúveis em seco prontos para serem combinados com um veículo imediatamente antes do uso, e emulsões estéreis e/ou não pirogênicas.
As soluções podem ser aquosas ou não aquosas.
[275] Em alguns exemplos de realização, as preparações parenterais de dose unitária são embaladas em uma ampola, frasco ou seringa com uma agulha. Todas as preparações para administração parenteral devem ser estéreis e não pirogênicas, tal como é conhecido e praticado no estado da técnica.
[276] Em alguns exemplos de realização, um pó estéril e liofilizado é preparado por dissolução de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como o descrito na presente invenção em um solvente adequado.
O solvente pode conter um excipiente que melhora a estabilidade ou outros componentes farmacológicos do pó ou solução reconstituída, preparados a partir do pó. Os excipientes que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, água, dextrose, sorbitol, frutose, xarope de milho, xilitol, glicerina, glicose, sacarose ou outro agente adequado. O solvente pode conter um tampão, tal como citrato, sódio ou fosfato de potássio ou outro tampão conhecido pelos especialistas na técnica, em um exemplo de realização, em pH próximo do neutro. A filtração esterilizada subsequente da solução seguida por liofilização sob condições padrão conhecidas pelos especialistas na técnica proporciona uma formulação desejável. Em um exemplo de realização, a solução resultante será distribuída em frascos para liofilização. Cada frasco pode conter uma dose única ou doses múltiplas do anticorpo anti-CD19 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou a sua composição. Os frascos cheios em demasia com uma pequena quantidade acima da necessária para uma dose ou conjunto de doses (por exemplo, cerca de 10%) são aceitáveis de modo a facilitar a retirada precisa da amostra e uma dosagem precisa. O pó liofilizado pode ser armazenado em condições adequadas, tal como cerca de 4 °C até à temperatura ambiente.
[277] A reconstituição de um pó liofilizado com água para injeção fornece uma formulação para uso na administração parenteral. Em um exemplo de realização, para a reconstituição, a água estéril e/ou não pirogênica ou outro veículo adequado líquido é adicionado ao pó liofilizado. A quantidade precisa depende da terapia selecionada sendo dada e pode ser determinada empiricamente.
MÉTODOS DE USO
[278] A presente divulgação também provê métodos terapêuticos compreendendo: a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como proporcionado pela presente invenção a um sujeito com tal necessidade, e, desse modo, tratando ou prevenindo uma condição ou um distúrbio relacionado ao CD19. Em alguns exemplos de realização, a condição ou distúrbio relacionado ao CD19 é o câncer. Em alguns exemplos de realização, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste de linfoma de células B, opcionalmente linfoma de Hodgkin ou linfoma não Hodgkin, em que o linfoma não Hodgkin compreende: Linfoma de células B grandes difuso (DLBCL), linfoma folicular, linfoma de células B da zona marginal (MZL), linfoma de tecido linfático associado à mucosa (MALT), linfoma linfocítico pequeno (leucemia linfocítica crônica, CLL), ou linfoma de células do manto (MCL), leucemia linfoblástica aguda (ALL) ou macroglobulinemia de Waldenstrom (WM). Em alguns exemplos de realização, o sujeito é humano.
[279] Em outro aspecto, são fornecidos métodos para tratar uma condição em um sujeito que se beneficiaria da modulação de CD19 / resposta imune, que compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, tal como fornecidos na presente invenção, ao sujeito com necessidade.
[280] A quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme fornecido no presente pedido, dependerá de vários fatores conhecidos no estado técnica como, por exemplo, peso corporal, idade, histórico médico, medicamentos atuais, estado de saúde do sujeito e o potencial de reação cruzada, alergias, sensibilidades e efeitos colaterais adversos, bem como a rota de administração e a extensão de desenvolvimento da doença. As dosagens podem ser proporcionalmente reduzidas ou aumentadas por um dos técnicos hábil no assunto (por exemplo, médico ou veterinário), conforme indicado por essas e outras circunstâncias ou exigências.
[281] Em determinados exemplos de realização, um anticorpo anti-CD19 ou fragmento de ligação ao antígeno conforme fornecido no presente pedido pode ser administrado em uma dosagem terapeuticamente eficaz de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 100 mg/kg (por exemplo, cerca de 0,01 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cerca de 55 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 65 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 75 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 85 mg/kg, cerca de 90 mg/kg, cerca de 95 mg/kg ou cerca de 100 mg/kg). Em alguns desses exemplos de realização, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é administrado a uma dosagem de cerca de 50 mg/kg ou menos, e em alguns desses exemplos de realização a dosagem é de 10 mg/kg ou menos, 5 mg/kg ou menos, 1 mg/kg ou menos, 0,5 mg/kg ou menos, ou 0,1 mg/kg ou menos. Em determinados exemplos de realização, a dosagem de administração pode mudar ao longo do tratamento. Por exemplo, em determinados exemplos de realização, a dosagem de administração inicial pode ser superior às dosagens de administração subsequentes. Em determinados exemplos de realização, a dosagem de administração pode variar ao longo do tratamento, dependendo da reação do sujeito.
[282] Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar uma resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, uma única dose pode ser administrada, ou várias doses podem ser administradas, divididas ao longo do tempo.
[283] Os anticorpos anti-CD19 e os fragmentos de ligação ao antígeno divulgados na presente invenção podem ser administrados por qualquer via/rota conhecida no estado da técnica, tal como, por exemplo, parenteral (por exemplo, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, incluindo a infusão intravenosa, injeção intramuscular ou intradérmica) ou não parenteral (por exemplo, oral, intranasal, intraocular, sublingual, retal ou tópica).
[284] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- CD19 ou fragmentos de ligação ao antígeno divulgados na presente invenção podem ser administrados sozinhos ou em combinação com um ou mais meios ou agentes terapêuticos adicionais. Por exemplo, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno divulgados na presente invenção podem ser administrados em combinação com outro agente terapêutico, por exemplo, um agente quimioterápico ou fármaco anticâncer.
[285] Em alguns desses exemplos de realização, um anticorpo anti-CD19 ou fragmento de ligação ao antígeno tal como divulgado na presente invenção que é administrado em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais pode ser administrado simultaneamente com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, e em alguns desses exemplos de realização o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno e o agente ou agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados como parte da mesma composição farmacêutica. No entanto, um anticorpo anti-CD19 ou fragmento de ligação ao antígeno administrado “em combinação” com outro agente terapêutico não tem necessariamente que ser administrado simultaneamente com ou na mesma composição que o agente. Um anticorpo anti-CD19 ou fragmento de ligação ao antígeno administrado antes ou depois de outro agente é considerado como sendo administrado “em combinação” com esse agente, tal como a frase aqui utilizada, mesmo que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno e o segundo agente sejam administrados através de rotas diferentes. Sempre que possível, os agentes terapêuticos adicionais administrados em combinação com os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno divulgados na presente invenção são administrados de acordo com o cronograma listado na folha de informações do produto de agente terapêutico adicional, ou de acordo com o Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57ª Ed, Medical Economics Company,
ISBN: 1563634457; 57ª edição (novembro de 2002)) ou protocolos bem conhecidos no estado técnica.
[286] A presente divulgação provê ainda métodos de uso de anticorpos anti-CD19 e seus fragmentos de ligação ao antígeno. Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação fornece ainda métodos de inibição do crescimento de células expressando CD19 in vivo ou in vitro, compreendendo; o contato das células T expressando CD19 com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui fornecido. Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação provê ainda métodos de modular a atividade de CD19 em uma célula expressando CD19, compreendendo expor a célula expressando CD19 ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno fornecido na presente invenção.
[287] Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação provê métodos para detectar a presença ou quantidade de CD19 em uma amostra, compreendendo o contato da amostra com o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e determinando a presença ou quantidade de CD19 na amostra.
[288] Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação provê métodos para diagnosticar uma doença ou condição relacionada ao CD19 em um sujeito, compreendendo a etapas de: a) obter uma amostra a partir do sujeito; b) colocar a amostra em contato com o anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo aqui proporcionado; c) determinar a presença ou quantidade de CD19 na amostra; e d) determinar a existência de uma doença ou condição relacionada ao CD19 no sujeito.
[289] Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação fornece kits compreendendo o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui fornecido, opcionalmente conjugado com uma fração detectável. Os kits podem ser úteis na detecção de CD19 ou no diagnóstico de doença relacionada ao CD19.
[290] Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação também fornece o uso do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui fornecido na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou condição relacionada ao CD19 em um sujeito, e na fabricação de um reagente de diagnóstico para diagnosticar uma doença ou condição relacionada ao CD19.
[291] Os exemplos a seguir são fornecidos para melhor ilustrar a invenção reivindicada e não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção. Todas as composições, materiais e métodos específicos descritos abaixo, no todo ou em parte, se enquadram no escopo da presente invenção. Estas composições específicas, materiais e métodos não são destinados a limitar a invenção, pois são utilizados apenas para ilustrar os exemplos de realização específicos abrangidas no escopo da invenção. Um técnico no assunto pode desenvolver composições equivalentes, materiais e métodos sem o exercício da capacidade inventiva e sem se afastar do escopo da invenção. Será compreendido que podem ser feitas muitas variações nos procedimentos descritos no presente pedido enquanto ainda permanecendo dentro dos limites da presente invenção. É intenção dos inventores que essas variações sejam incluídas no escopo da invenção.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
GERAÇÃO DE MATERIAL
1.1 GERAÇÃO DO ANTICORPO DE REFERÊNCIA
[292] O gene da região variável de anticorpos anti-CD19 de referência (WBP701-BMK1 corresponde a huB4 na patente US20140072587A1; WBP701-BMK2 corresponde a hBU12 na patente US8242252B2; WBP701-BMK3 corresponde a 21D4 na Patente
US8097703B2) foi clonado em um vetor de expressão contendo o gene da região Fc humana. Os plasmídeos de expressão foram transfectados para células Expi293 (Invitrogen-A14527) usando o Kit de Transfecção ExpiFectamine293 (Invitrogen-A14524). As células foram cultivadas em meio de expressão Expi293 (Invitrogen-A1435101) em uma plataforma agitadora orbital girando a 135 rpm, em uma Incubadora a 37ºC. O sobrenadante coletado foi purificado usando a coluna de Proteína A (GE Healthcare 17543802).
[293] Os anticorpos de referência WBP701-BMK1, WBP701- BMK2 e WBP701-BMK3 gerados de acordo com o método acima foram analisados por SDS PAGE. As Figuras 1 e 2 mostraram que todos os três anticorpos de referência gerados migraram com a massa molecular aparente de 25 kDa e 55 kDa em SDS-PAGE sob condição redutora que corresponde à cadeia leve e cadeia pesada. A banda principal em condição não redutora corresponde a toda a IgG com PM de ~ 150 KD. A pureza dos anticorpos de referência é superior a 95% (veja as Figuras 1 e 2).
1.2 GERAÇÃO DE LINHAGENS DE CÉLULAS QUE EXPRESSAM CD19 DE MACACO
CINOMOLGO E HUMANO
[294] O gene do CD19 humano ou de macaco cinomolgo de comprimento total foi clonado no vetor pcDNA3.3. Resumidamente, um volume de 30 mL de células FreeStyle 293F (ThermoFisher-R79007) a uma densidade de 1 × 106/mL foi transfectado com 30 µg de DNA usando o reagente Plasfect (Bioline-46025). As células transfectadas foram cultivadas em uma incubadora ajustada a 37ºC, 8% de CO2 e velocidade de agitação de 100 rpm. 24 horas após a transfecção, blasticidina (Invitrogen-A1113902) a uma concentração final de 4-10 µg/mL foi usada para gerar o pool estável. Os clones selecionados foram testados por FACS usando um anticorpo anti-CD19. Após duas a três passagens de seleção, as células foram enriquecidas por anticorpo anti-CD19 conjugado com PE e microesferas anti-PE (Miltenyi-013-048-801). Os clones de célula única estáveis foram isolados por diluição limitante e rastreados por FACS usando anticorpo anti-CD19.
[295] O gene do CD19 humano ou de macaco cinomolgo de comprimento total foi clonado no vetor pcDNA3.3. Cada vetor de expressão foi então transfectado em células CHO-K1, respectivamente, utilizando Lipofectamine 2000. As células foram cultivadas em F12-K com 10% de SBF.
Blasticidina foi adicionada 24-48 horas após a transfecção. Após duas a três passagens de seleção, as células foram enriquecidas por anticorpo anti-CD19 conjugado com PE e microesferas anti-PE (Miltenyi-013-048-801). Os clones de célula única estáveis foram isolados por diluição limitante e rastreados por FACS usando anticorpo anti-CD19.
[296] A expressão de CD19 humano e CD19 de macaco cinomolgo de linhagens de células transfectadas foi detectada utilizando o anticorpo anti-CD19 por citometria de fluxo. As linhas celulares transfectadas WBP701.293F.hPro1.FL.A2, WBP701.CHO-K1.hPro1.FL.B4, WBP701.cPro1.293F.FL.C1 e WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9 mostraram alta expressão de CD19 humano ou de macaco (Figuras 3A-3D).
EXEMPLO 2
GERAÇÃO DE ANTICORPOS
2.1 IMUNIZAÇÃO
[297] Camundongos Balb/c foram imunizados com células 293F transfectadas com CD19. O lisado da membrana celular foi misturado com adjuvante incluindo CpG-ODN e Adju-Phos ou Titer-Max. Os camundongos foram imunizados duas vezes no coxim plantar, vias subcutânea ou intraperitoneal com intervalo de duas semanas. Os camundongos com título sérico elevado receberam um reforço final com lisado de membrana celular de 1 x 106 células/Animal e 10 μg de proteína ECD/animal em PBS.
2.2 DETECÇÃO DE TÍTULO SÉRICO
[298] O título sérico foi detectado por citometria de fluxo. Células CHO-K1 transfectadas com CD19 foram espalhadas em placas de 96 poços de fundo em U (BD) a uma densidade de 1 x 105 células/poço. O soro de camundongo foi diluído na proporção de 1:3 a partir de uma diluição de 100 vezes utilizando tampão de coloração (PBS 1X/BSA a 1%). As amostras de soro foram incubadas com células por 1 hora a 4ºC. Após lavagem das células duas vezes com tampão de coloração, o anticorpo de cabra conjugado com PE anti-Fc de IgG de anticamundongo (Jackson) foi adicionado e incubado a 4ºC no escuro por 30 min. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em 100 μL de tampão de coloração. A intensidade da fluorescência foi medida por citometria de fluxo (BD Canto II) e analisada por FlowJo.
[299] Todos os camundongos exibiram títulos específicos de CD19. Os camundongos com alto título sérico foram selecionados para a fusão de hibridoma (Tabela 3).
TABELA 3
TÍTULO SÉRICO Camundongo# 1 2 3 4 5 Pré-sangria em célula CHO- <100 <100 <100 <100 <100 K1.CD19 Título em célula CHO-K1.CD19 1968300 656100 218700 656100 72900 Título em célula CHO –K1 parental 2700 2700 900 300 2700
2.3 GERAÇÃO HIBRIDOMA
[300] As células de linfonodos foram fundidas com células SP2/0 de mieloma por eletrofusão, de acordo com os procedimentos gerais de eletrofusão. Após a fusão celular, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços a 1x104 linfócitos/poço com meio DMEM com 20% de SBF e 1% de reagente HAT. As placas foram incubadas a 37ºC por 10-12 dias.
2.4 RASTREAMENTO DE ANTICORPOS
2.4.1 LIGAÇÃO AO CD19 HUMANO
[301] Células CHO-K1 transfectadas com CD19 humano foram plaqueadas em placas de 96 poços de fundo em U (BD) a uma densidade de 1 x 105 células/poço. Os sobrenadantes de hibridomas foram transferidos para as placas e incubados com células durante 1 hora a 4ºC. As células foram então lavadas duas vezes com tampão de coloração (BSA/1X PBS). Adicionou-se anticorpo de cabra anti-Fc de IgG de camundongo conjugado com PE (Jackson 115-115-164) e incubou-se a 4ºC no escuro por 30 min. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em 100 μL de tampão de coloração. A intensidade da fluorescência foi medida por citometria de fluxo (BD Canto II) e analisada por FlowJo.
2.4.2 LIGAÇÃO AO CD19 DE MACACO CINOMOLGO
[302] Células CHO-K1 transfectadas com CD19 de macaco cinomolgo foram plaqueadas em placas de 96 poços de fundo em U (BD) a uma densidade de 1 x 105 células/poço. Os sobrenadantes de hibridomas foram transferidos para as placas e incubados com células durante 1 hora a 4ºC. As células foram então lavadas duas vezes com tampão de coloração (BSA/1X PBS). Adicionou-se anticorpo de cabra anti-Fc de IgG de camundongo conjugado com PE (Jackson 115-115-164) e incubou-se a 4ºC no escuro por 30 min. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em 100 μL de tampão de coloração. A intensidade da fluorescência foi medida por citometria de fluxo (BD Canto II) e analisada por FlowJo.
2.4.3 ENSAIO INTERNALIZAÇÃO
[303] O Fab-ZAP é um conjugado químico de anticorpo de cabra monovalente anti-humano e a proteína inativadora de ribossomo, saporina. O Fab-ZAP é usado para determinar a capacidade de internalização dos anticorpos. A concentração de IgG nos sobrenadantes do hibridoma foi determinada por ELISA. Os sobrenadantes de hibridoma normalizados e Fab- ZAP foram misturados na proporção molar de 1:3. Células Ramos (5000/poço) foram incubadas com diferentes concentrações do conjugado em uma incubadora a 37ºC, 5% de CO2 durante 96 horas. A citotoxicidade celular foi determinada por CellTiter Glo (Promega). A viabilidade celular (%) foi calculada da seguinte forma: viabilidade celular (%) = RLU da amostra/RLU do controle × 100%, em que RLU significa unidades de luz relativa.
RESULTADOS
[304] O sobrenadante do hibridoma foi utilizado para a triagem primária. A triagem de ligação primária identificou 116 hibridomas que podem produzir anticorpos de ligação específicos ao antígeno. Os hibridomas específicos para o antígeno foram então confirmados como ligação na célula CHO-K1 transfectada com CD19 e rastreados na célula CHO-K1 parentais. As 40 linhagens de hibridoma selecionadas foram confirmadas como ligantes da célula Ramos. Os ligantes positivos foram então pesquisados no ensaio Fab- Zap. 13 linhagens de hibridoma foram selecionadas para subclonagem com base na capacidade de ligação e internalização.
2.5 SUBCLONAGEM DE HIBRIDOMA
[305] As células de hibridoma de cada linhagem selecionada foi colocada em placas de 96 poços a uma densidade de 1 célula/poço. As placas foram mantidas em uma incubadora umidificada a 37ºC, 6% de CO 2 durante 10-12 dias. Os clones únicos foram escolhidos e testados por FACS.
2.6 ISOTIPO
[306] O isotipo de anticorpo foi identificado por ELISA. As placas (Nunc) foram revestidas com anticorpos de cabra anti-IgG1 de camundongo, anti-IgG2a de camundongo, anti-IgG2b de camundongo, anti-IgG3 de camundongo, anticorpos anti-IgM de camundongo a 2 µg/mL durante a noite a 4ºC. Após o bloqueio e a lavagem, os sobrenadantes do hibridoma foram transferidos para as placas revestidas e incubados em temperatura ambiente por 1 h. As placas foram então incubadas com anticorpo secundário de cabra anti-kappa de camundongo – HRP ou cabra anti-lambda de camundongo – HRP (Southern Biotech) por 45 min. Após a lavagem, o substrato TMB foi adicionado e a reação foi parada por 2M HCl. A absorbância a 450 nm foi lida usando um leitor de microplacas (Molecular Device).
RESULTADOS
[307] Os subclones do hibridoma foram verificados por ligação a linhagem de células de CD19, e seus isotipos também foram detectados (vide a Tabela 4). Os subclones selecionados foram purificados e posteriormente avaliados em ensaio de ligação, ensaio de internalização, ensaio de ligação entre famílias e ensaio de categorização (binning).
TABELA 4
ISOTIPO DE ANTICORPO Anticorpo Isotipo WBP7011_4.34.11 IgG2a de camundongo, kappa WBP7011_4.87.6 IgG2a de camundongo, kappa WBP7011_4.100.1 IgG2a de camundongo, kappa WBP7011_4.106.3 IgG2a de camundongo, kappa WBP7011_4.155.8 IgG2a de camundongo, kappa WBP7011_4.15.10 IgG1 de camundongo, kappa WBP7011_4.56.1 IgG2a de camundongo, kappa WBP7011_4.202.9 IgG2a de camundongo, kappa WBP7011_4.231.5 IgG2b de camundongo, kappa WBP7011_4.108.3 IgG2a de camundongo, kappa WBP7011_4.191.3 IgG1 de camundongo, kappa WBP7011_4.194.10 IgG2b de camundongo, kappa WBP7011_4.225.7 IgG2a de camundongo, kappa
EXEMPLO 3
CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS CANDIDATOS
3.1 PURIFICAÇÃO DE ANTICORPO
[308] Os sobrenadantes de hibridoma coletados foram carregados na coluna de Proteína A (MabSelect SuRe, GE) após o ajuste do pH para 7,0. Os anticorpos foram eluídos por glicina seguida de neutralização imediata usando Tris a 1M. A concentração de anticorpos foi testada por Nano Drop (Thermal-Fisher). A pureza das proteínas foi avaliada por SDS- PAGE (Invitrogen, NuPAGE 4% -12% Bis-Tris Gel) e HPLC-SEC (Agilent).
3.2 AFINIDADE POR FACS
[309] Células CHO-K1 ou Ramos transfectadas com CD19 foram plaqueadas em placas de 96 poços (BD) a uma densidade de 5 x 10 4 células/poço. Os anticorpos a serem testados foram diluídos em série em tampão de coloração (1X PBS/1% BSA) e incubados com células a 4ºC por 1 hora. Após descartar os sobrenadantes, o anticorpo de cabra anti-Fc de IgG de camundongo conjugado com PE (Jackson 115-1154-164) foi adicionado e incubado a 4ºC no escuro por 30 min. As células foram lavadas uma vez e ressuspensas em 100 μL de tampão de coloração. A intensidade da fluorescência foi medida por citometria de fluxo (BD Canto II) e analisada por FlowJo. As concentrações de IgG ligada e IgG livre foram calculadas com base nas intensidades de fluorescência dos grânulos quantitativos (kit de quantificação de fluorescência PE, BD 340495). O valor K D foi calculado usando a Análise Scatchard.
RESULTADOS
[310] A afinidade dos anticorpos candidatos selecionados foi testada em células CHO- K1 transfectadas com CD19 por citometria de fluxo.
Os valores KD estão resumidos na Tabela 5. Todos os anticorpos candidatos mostraram afinidade de ligação para CD19 humano em escala subnanomolar.
TABELA 5
AFINIDADE DE ANTICORPOS CANDIDATOS Anticorpo KD (M) W7011-4.34.11 1,81E-10 W7011-4.87.6 9,55E-11 W7011-4.100.1 2,13E-10 W7011-4.106.3 2,31E-10 W7011-4.155.8 9,49E-10 W7011-4.15.10 1,70E-10 W7011-4.56.1 1,18E-10 W7011-4.202.9 8,47E-10 W7011-4.231.5 1,70E-10 W7011-4.108.3 2,52E-10 W7011-4.191.3 1,14E-10 W7011-4.194.10 4,20E-10 W7011-4.225.7 7,35E-10
3.3 LIGAÇÃO AO CD19 HUMANO
[311] Células Ramos foram plaqueadas em placas de 96 poços de fundo em U (BD) a uma densidade de 1 x 10 5 células/poço. Os anticorpos foram diluídos em série em tampão de coloração (1X PBS/1% BSA) e incubados com células a 4ºC por 1 hora. As células foram então lavadas duas vezes com tampão de coloração (BSA/1X PBS). Adicionou-se anticorpo de cabra anti-Fc de IgG de camundongo conjugado com PE (Jackson 115-115- 164) e incubou-se a 4ºC no escuro por 30 min. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em 100 μL de tampão de coloração. A intensidade da fluorescência foi medida por citometria de fluxo (BD Canto II) e analisada por FlowJo.
[312] A atividade de ligação dos subclones selecionados foi testada em células Ramos por citometria de fluxo (Figura 4). Os valores de
EC50 da ligação foram resumidos na Tabela 6. Todos os anticorpos candidatos mostraram uma EC50 em escala subnanomolar no ensaio de ligação.
TABELA 6
ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DE SUBCLONES SELECIONADOS Clone # EC50 (nM) W7011-4.34.11 0,23 W7011-4.34.17 0,21 W7011-4.34.18 0,24 W7011-4.87.6 0,10 W7011-4.87.8 0,09 W7011-4.87.18 0,09 W7011-4.100.1 0,17 W7011-4.100.14 0,17 W7011-4.100.18 0,18 W7011-4.106.3 0,23 W7011-4.106.9 0,18 W7011-4.106.20 0,19 W7011-4.155.8 0,85 W7011-4.155.14 0,82 W7011-4.155.17 0,69 W7011-4.15.10 0,31 W7011-4.15.13 0,32 W7011-4.56.1 0,10 W7011-4.56.2 0,08 W7011-4.202.9 0,64 W7011-4.231.5 0,12 W7011-4.231.6 0,05 W7011-4.231.15 0,09 W7011-4.108.3 0,19 W7011-4.108.6 0,09 W7011-4.108.11 0,05
Clone # EC50 (nM) W7011-4.202.3 0,58 W7011-4.202.8 0,34 W7011-4.191.3 0,04 W7011-4.191.6 0,07 W7011-4.191.16 0,13 W7011-4.194.10 0,15 W7011-4.194.11 0,26 W7011-4.194.13 0,34 W7011-4.225.7 0,45 W7011-4.225.9 0,39 WBP701.BMK3 0,11
3.4 LIGAÇÃO AO CD19 DE MACACO CINOMOLGO
[313] Células CHO-K1 transfectadas com CD19 de macaco cinomolgo foram plaqueadas em placas de 96 poços de fundo em U (BD) a uma densidade de 1 x 105 células/poço. Os anticorpos foram diluídos em série em tampão de coloração (1X PBS/1% BSA) e incubados com células a 4ºC por 1 hora. As células foram então lavadas duas vezes com tampão de coloração (BSA/1X PBS). Adicionou-se anticorpo de cabra anti-Fc de IgG de camundongo conjugado com PE (Jackson 115-115-164) e incubou-se a 4ºC no escuro por 30 min. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em 100 μL de tampão de coloração. A intensidade da fluorescência foi medida por citometria de fluxo (BD Canto II) e analisada por FlowJo.
[314] A atividade de ligação do anticorpo candidato ao CD19 de macaco cinomolgo foi avaliada usando a linhagem de células CHO-K1 transfectada com CD19 de macaco cinomolgo (Figura 5). Os valores de EC 50 da ligação foram resumidos na Tabela 7. Todos os clones selecionados mostraram forte ligação à célula CD19 de macaco cinomolgo.
TABELA 7 ATIVIDADE DE LIGAÇÃO AO CD19 DE MACACO CINOMOLGO Anticorpo EC50 (nM) W7011-4.34.11 0,4427 W7011-4.87.6 0,285 W7011-4.100.1 0,4384 W7011-4.106.3 0,4959 W7011-4.155.8 1,542 W7011-4.15.10 0,4598 W7011-4.56.1 0,4381 W7011-4.202.9 2,299 W7011-4.231.5 0,628 W7011-4.108.3 0,8634 W7011-4.191.3 0,5984 W7011-4.194.10 0,9959 W7011-4.225.7 1,77 WBP701-BMK1 0,4473 WBP701-BMK2 0,7407 WBP701-BMK3 0,1936
3.5 ENSAIO DE INTERNALIZAÇÃO
[315] O Fab-ZAP é usado para determinar a capacidade de internalização dos anticorpos. Os anticorpos diluídos em série foram misturados com Fab-Zap na razão molar de 1:3. Células Ramos (5000/poço) foram incubadas com diferentes concentrações do conjugado em uma incubadora a 37ºC, 5% de CO2 durante 96 horas. A citotoxicidade celular foi determinada por CellTiter Glo (Promega). A viabilidade celular (%) foi calculada da seguinte forma: viabilidade celular (%) = RLU da amostra/RLU do controle × 100%.
[316] A atividade de internalização dos subclones selecionados foi testada em células Ramos pelo ensaio Fab-Zap (Figura 6). A EC50 da viabilidade celular foi resumida na Tabela 8. Todos os anticorpos candidatos podem internalizar na célula Ramos e mostraram valores de EC 50 pico-molares no ensaio Fab-Zap.
TABELA 8 ENSAIO FAB-ZAP Anticorpo EC50 (pM) W7011-4.34.11 7 W7011-4.34.17 8,9 W7011-4.34.18 8,9 W7011-4.87.6 8,5 W7011-4.87.8 5,8 W7011-4.87.18 7,2 W7011-4.100.1 14,8 W7011-4.100.14 11,5 W7011-4.100.18 11 W7011-4.106.3 13,6 W7011-4.106.9 12,7 W7011-4.106.20 16,2 W7011-4.155.8 27,6 W7011-4.155.14 44,9 W7011-4.155.17 30,2 W7011-4.15.10 13,9 W7011-4.15.13 11 W7011-4.56.1 8,4 W7011-4.56.2 5,2 W7011-4.61.10 23,1 W7011-4.61.12 21,1 W7011-4.61.16 19,4 W7011-4.231.5 8,5 W7011-4.231.6 14,8 W7011-4.231.15 14,7
Anticorpo EC50 (pM) W7011-4.108.3 20,6 W7011-4.108.6 15,7 W7011-4.108.11 18,7 W7011-4.202.3 28,3 W7011-4.202.8 35,4 W7011-4.202.9 23,6 W7011-4.191.3 18,4 W7011-4.191.6 19,1 W7011-4.191.16 18,2 W7011-4.194.10 11,7 W7011-4.194.11 11,8 W7011-4.194.13 12,8 W7011-4.225.7 15 W7011-4.225.9 15,8
3.6 CATEGORIZAÇÃO (BINNING) DE EPÍTOPO
[317] Células WBP701.CHO-K1.hPro1.B4 transfectadas com CD19 foram plaqueadas em placas de 96 poços de (BD) a uma densidade de 1 x 105 células/poço. Os anticorpos testados foram diluídos em série e misturados com anticorpos de referência. As misturas foram adicionadas às placas e incubadas por 30 min a 4ºC. Após a lavagem, adicionou-se anticorpo de cabra anti-Fc de IgG humana conjugado com PE (Jackson 115-115-164) e incubou-se a 4ºC no escuro por 30 min. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em 100 μL de tampão de coloração (1X PBS/BSA 1%). A intensidade da fluorescência foi medida por citometria de fluxo (BD Canto II) e analisada por FlowJo.
[318] Os clones candidatos selecionados foram testados quanto à ligação competitiva contra anticorpos de referência BMK1, BMK2 e BMK3.
Alguns anticorpos candidatos podem bloquear a ligação de anticorpos de referência ao CD19. W7011-4.155.8, W7011-4.202.9 e W7011-4.225.7 não competem com os anticorpos de referência (Figura 7). Com base no resultado da ligação competitiva, os anticorpos são atribuídos a doi grupos de epítopos (Tabela 9).
TABELA 9
GRUPO DE EPÍTOPO DE ANTICORPOS CANDIDATOS Bin1 Bin2 WBP701-BMK1 W7011-4.155.8 WBP701-BMK2 W7011-4.202.9 WBP701-BMK3 W7011-4.225.7 W7011-4.34.11 W7011-4.87.6 W7011-4.100.1 W7011-4.106.3 W7011-4.15.10 W7011-4.56.1 W7011-4.231.5 W7011-4.108.3 W7011-4.191.3 W7011-4.194.10
[319] Após o sequenciamento dos clones de anticorpos, descobrimos que a sequência de aminoácidos dos clones de anticorpo W7011-
4.155.8, W7011-4.202.9 e W7011-4.225.7 são idênticas. As sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos dos clones de anticorpos estão listadas na seção da descrição detalhada.
EXEMPLO 4
HUMANIZAÇÃO DE ANTICORPOS E MATURAÇÃO POR AFINIDADE
4.1 SEQUENCIAMENTO DE HIBRIDOMA
[320] O RNA foi isolado das células de hibridoma usando o reagente Trizol (Invitrogen-15596018). O cDNA foi amplificado usando o kit 5'-
RACE (Takara-28001488), seguido de amplificação por PCR usando iniciadores degenerados em 3' e iniciadores adaptadores-3' (ExTaq: Takara- RR001B). Os fragmentos da PCR foram inseridos no vetor pMD18-T (Takara- D101C) e enviados para sequenciamento (Shanghai Biosune).
[321] As sequências de anticorpos (camundongos) do hibridoma são como mostrado pelas SEQ ID NOs: 94-123.
4.2 HUMANIZAÇÃO
[322] A abordagem de “melhor ajuste” (best fit) foi usada para humanizar as cadeias leve e pesada de anticorpo. Para cadeias leves, as sequências de aminoácidos dos genes V correspondentes foram submetidas a pesquisa Blast contra o banco de dados interno do gene V de linhagem germinativa humana. A sequência do gene VL humanizado foi derivada através da substituição de sequências de CDR humanas na melhor correspondência por sequências de CDR de camundongos usando a definição de CDR de Kabat. Para a cadeia pesada, 4 sequências humanizadas foram derivadas, para a cadeia leve 1 sequência humanizada foi derivada primeiro, de acordo com o método descrito acima, e foram criadas 3 sequências adicionais por pesquisa no Blast de estruturas de camundongos contra o banco de dados do gene V da linhagem germinativa humana. As regiões de arcabouço foram definidas usando a definição de CDR estendida, em que a CDR1 de Kabat foi estendida por 5 aminoácidos no N-terminal. Os três principais hits foram utilizados para derivar sequências de genes V humanizados. Os genes humanizados foram retrotraduzidos, códon-otimizados para expressão em mamíferos e sintetizados pela GeneArt Costum Gene Synthesis (Life Technologies). Os genes sintéticos foram reclonados no vetor de expressão de IgG, expressos e purificados.
4.3 MATURAÇÃO POR AFINIDADE
[323] Cada aminoácido das seis regiões determinantes complementares (CDRs) foi mutado individualmente para os 20 aminoácidos usando um método de mutagênese por hibridação (Kunkel, 1985). Os iniciadores de DNA contendo um códon NNS que codifica 20 aminoácidos foram utilizados para introduzir mutação em cada posição CDR alvo. Os iniciadores degenerados individuais foram utilizados em reações de mutagênese por hibridação. Os produtos da síntese para CDRs de VH e VL foram agrupados respectivamente. 200 ng do DNA da biblioteca agrupada foram transfectados para BL21 para a produção de fragmentos scFv.
[324] Os mutantes foram primeiramente rastreados por ELISA de captura utilizando extrato periplasmático de bactéria. Placas de 96 poços Maxisorp Immunoplate (Nunc) foram revestidas com o anticorpo anti-c-myc em tampão de revestimento (200 mM de Na2CO3/NaHCO3, pH 9,2) durante a noite a 4ºC. Após o bloqueio com caseína durante 1 hora à temperatura ambiente, amostras de extrato periplasmático foram então adicionadas à placa e incubadas à temperatura ambiente por 1 hora. Após a lavagem, a proteína ECD CD19 biotinilada foi adicionada e incubada por 1 hora à temperatura ambiente, seguida de incubação com Strepatavidina-HRP por 1 hora. Após a lavagem, o substrato TMB foi adicionado e a reação foi parada por 2M HCl. A absorbância a 450 nm foi lida usando um leitor de microplacas (Molecular Device).
[325] Os clones que exibem um sinal de densidade óptica (OD) a 450 nm maior que o clone parentais foram selecionados para sequenciamento.
Os clones únicos foram confirmados por FACS sob concentração normalizada de scFv, a fim de determinar a afinidade de ligação relativa do scFv mutante e do anticorpo parental.
[326] As mutações pontuais em VH e VL determinadas como benéficas para a ligação ao antígeno foram ainda combinadas para obter sinergia de ligação adicional. Os mutantes combinatórios foram expressos como scFvs e rastreados usando ELISA de captura. Os clones que exibem um sinal de densidade óptica (OD) a 450 nm maior que o clone parental foram sequenciados e posteriormente confirmados por ligação FACS.
4.4 AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS MANIPULADOS
4.4.1 WBP7011-4.34.11-z1-m5-IgG1k
[327] O anticorpo WBP7011-4.34.11 foi humanizado e maturados por afinidade. A afinidade do anticorpo manipulado WBP7011-4.34.11-z1-m5 foi medida na célula Ramos por FACS (Figura 8). O valor K D foi calculado usando a Análise Scatchard. A afinidade do WBP7011-4.34.11-z1-m5-IgG1k é de 0,23 nM.
4.4.2 WBP7011-4.87.6-z1-IgG1k (N-S)
[328] O anticorpo WBP7011-4.87.6 foi humanizado e manipulado em resíduos de risco PTM. A afinidade do anticorpo final WBP7011-4.87.6-z1- IgG1k (NS) foi medida na célula Ramos por FACS (Figura 9). O valor K D foi calculado usando a Análise Scatchard. A afinidade do WBP7011-4.87.6-z1- IgG1k (N-S) é de 0,25 nM.
4.4.3 W7011-4.155.8-z1-uIgG1K
[329] O anticorpo W7011-4.155.8 foi humanizado. A afinidade do anticorpo humanizado W7011-4.155.8-z1-uIgG1K foi medida na célula CHO-K1 transfectada com CD19 por FACS (Figura 10). O valor KD foi calculado usando a Análise Scatchard. A afinidade de W7011-4.155.8-z1-uIgG1K é de 0,82 nM.
4.5 SEQUÊNCIA DE ANTICORPOS MANIPULADOS
[330] As sequências de anticorpos manipulados são mostradas pelas SEQ ID NOs: 124-135.
EXEMPLO 5 GERAÇÃO DE CONJUGADO ANTICORPO-DROGA (ADC)
[331] Os anticorpos tiveram o tampão trocado para PBS (pH 7,4) e foram misturados com DMA (Alfa Aesar). DM1-SMCC (BrightGene) foi então adicionado e a mistura foi incubada a 22ºC com rotação suave para conjugação.
[332] Para remover a droga livre, o produto ADC foi trocado por tampão para um tampão de armazenamento ADC usando um tubo de ultrafiltração de 30 KDa (Millipore). Após a troca de tampão por 8 vezes, o produto ADC foi filtrado com membrana de 0,22 μm para caracterização final.
[333] A concentração de ADC foi caracterizada com UV-vis (NanoDrop). DAR foi determinada por UV-vis e SEC-HPLC. O nível de agregação e pureza foi determinado por SEC-HPLC. A droga livre foi determinada por RP-HPLC. O nível de endotoxina foi determinado por ensaio turbidimétrico cinético.
[334] Os anticorpos principais foram conjugados com DM1. A concentração, pureza, DAR, nível de agregação e % de droga livre foram avaliados após a conjugação (Tabela 10).
TABELA 10 CARACTERIZAÇÃO DO ANTICORPO CONJUGADO COM DM1 % UV- Conc. Endo. SEC- % de Anticorpo Pureza% droga mg/ml EU/mg DAR DAR Agr. livre W7011-BMK1- 14,2 95,45 0 0,039 3,57 3,57 4,54 DM1 W7011-4.87.6-z1- 9,71 97,7 1,06 2,36 3,38 2,95 2,31 lgG1K(N-S)-DM1 W7011-4.34.11-z1- 6,45 96,38 0 limite 3,32 3,38 3,02 m5-lgG1K-DM1 Controle isotípico 5,85 98,47 0 0,086 2,86 2,69 1,53 IgG1K-DM1 EXEMPLO 6
ANÁLISE DE TOXICIDADE CELULAR DO ADC
[335] As células de linfoma B (5000/poço) foram incubadas com várias concentrações de anticorpos conjugados com DM1 a 37ºC por 72 horas.
A citotoxicidade celular foi determinada por CellTiter Glo (Promega). A viabilidade celular (%) foi calculada da seguinte forma: viabilidade celular (%) = RLU da amostra/RLU do controle × 100%.
[336] Os anticorpos conjugados com DM1 foram testados no ensaio de citotoxicidade em células Daudi, Nalm-6 e WSU-DLCL2 (Figuras 11, 12, 13). Os valores de EC50 foram resumidos nas Tabelas 11, 12 e 13. O ADC WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K (NS)–DM1 mostrou melhor atividade de citotoxicidade do que o WBP701-BMK1-DM1 em todas as células tumorais testadas. O ADC WBP7011-4.34.11-z1-m5-uIgG1K-DM1 mostrou atividade de citotoxicidade comparável ao do WBP701-BMK1-DM1.
TABELA 11
ENSAIO DE CITOTOXICIDADE EM DAUDI Anticorpo EC50 (nM) WBP7011-4.34.11-z1-m5-uIgG1K-DM1 27 WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K (N-S)-DM1 1,9 WBP701-BMK1-DM1 22 Controle isotípico IgG1k -DM1 NA TABELA 12 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE EM CÉLULAS NALM-6 Anticorpo EC50 (nM) WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K (N-S)-DM1 0,73 WBP701-BMK1-DM1 NA Controle isotípico IgG1k-DM1 NA TABELA 13 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE EM CÉLULAS WSU-DLCL2 Anticorpo EC50 (nM) WBP7011-4.34.11-z1-m5-uIgG1K-DM1 10,1 WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K (N-S)-DM1 1,4 WBP701-BMK1-DM1 9,0
EXEMPLO 7
ANÁLISE ANTITUMORAL DE ADC
7.1 CULTURA CELULAR
[337] AS células tumorais Nalm-6 foram mantidas in vitro como uma cultura em suspensão em RPMI-1640 suplementado com soro fetal bovino a 10%, a 37 ºC em uma atmosfera umidificada (95% de ar e 5% de CO 2). As células tumorais eram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células que crescem em uma fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação de tumores.
7.2 INOCULAÇÃO DE TUMOR E ATRIBUIÇÃO DE GRUPOS
[338] Cada camundongo foi implantado por via subcutânea no flanco direito com células tumorais Nalm-6 (10 milhões + Matrigel) para o desenvolvimento do tumor. Os tratamentos foram iniciados quando o volume médio do tumor atingiu 113 mm3. A administração dos artigos teste e o número de animais em cada grupo são mostrados na tabela a seguir.
TABELA 14
TESTE A ADMINISTRAÇÃO DE ADCS E O NÚMERO DE ANIMAIS EM CADA GRUPO Volume de Dose Rota de Grupo Tratamento n dosagem Cronograma (mg/kg) Administração (μLg) Controle isotípico- 1 6 10 10 i.v. Biw*3 semanas DM1 2 W7011-BMK1-DM1 6 1 10 i.v. Biw*3 semanas 3 W7011-BMK1-DM1 6 10 10 i.v. Biw*3 semanas W7011-4.87.6-z1- 4 6 1 10 i.v. Biw*3 semanas ulgG1k (N-S)-DM1 W7011-4.87.6-z1- 5 6 3 10 i.v. Biw*3 semanas ulgG1k (N-S)-DM1 W7011-4.87.6-z1- 6 6 10 10 i.v. Biw*3 semanas ulgG1k (N-S)-DM1
7.3 OBSERVAÇÕES
[339] O protocolo e quaisquer alterações ou procedimentos que envolvam o cuidado e o uso de animais neste estudo serão revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) do WuXi AppTec antes da realização. Durante o estudo, o cuidado e o uso de animais foram conduzidos de acordo com os regulamentos da Associação para Avaliação e Acreditação de Cuidados com Animais de Laboratório (AAALAC).
Após a inoculação, os animais foram verificados diariamente quanto a morbidade e mortalidade. No momento do monitoramento de rotina, os animais foram verificados quanto a quaisquer efeitos do crescimento do tumor e tratamentos no comportamento normal, como mobilidade, consumo de alimentos e água, ganho/perda de peso corporal (pesos corporais foram medidos todos os dias), olhos/pelos e qualquer outro efeito anormal. A morte e os sinais clínicos observados foram registrados com base no número de animais dentro de cada subconjunto.
7.4 MEDIÇÕES DE TUMORES E DESFECHOS
[340] O principal desfecho era ver se o crescimento tumoral pode ser atrasado ou se os camundongos poderiam ser curados. O tamanho do tumor foi medido duas vezes por semana em duas dimensões usando um paquímetro, e o volume foi expresso em mm3 usando a fórmula: V = 0,5 a x b2; em que a e b são os diâmetros longo e curto do tumor, respectivamente. O tamanho do tumor foi então utilizado para cálculos do valor de T/C e TGI. O valor T/C (em porcentagem) é uma indicação da eficácia antitumoral; T e C são os volumes médios dos grupos tratados e controle, respectivamente, no dia 21 e no dia 28. O TGI foi calculado para cada grupo usando a fórmula: TGI (%) = [1- (Ti-T0)/(Vi-V0)] × 100; Ti é o volume médio do tumor de um grupo de tratamento no Dia 21 e Dia 28, T0 é o volume médio do tumor do grupo de tratamento no dia do início do tratamento, Vi é o volume médio do tumor do grupo de controle tratado com veículo no Dia 21 & dia 28, e V0 o volume médio do tumor do grupo tratado com veículo no dia do início do tratamento.
[341] Todos os grupos foram retirados no dia 28 de acordo com o protocolo.
[342] Todos os animais mantiveram bem seus pesos corporais durante o período do experimento.
7.5 ESTUDO DE EFICÁCIA EM MODELO DE XENOENXERTO DE CÂNCER COM CÉLULAS DE LINFOMA, NALM-6
[343] Neste estudo, a eficácia dos conjugados de referência anticorpo-droga W7011-BMK1-DM1 e W7011-4.87.6-z1-uIgG1k (NS)-DM1 foi avaliada no xenoenxerto de células de linfoma Nalm-6 em camundongos CB17- SCID fêmeas. Os volumes tumorais de todos os grupos em vários momentos são exibidos na Figura 14.
[344] No PG-D21, o volume médio do tumor do grupo tratado com controle isotípico atingiu 840 mm3. O tratamento com W7011-BMK1-DM1 a 1 mg/kg (TV = 364 mm3, TGI = 66%, p <0,01) e 10 mg/kg (TV = 327 mm 3, TGI = 71%, p <0,001) mostrou uma significativa atividade antitumoral. O ADC W7011-4.87.6-z1-uIgG1k (NS)-DM1 a 1 mg/kg (TV = 398 mm3, TGI = 61%, p <0,01), 3 mg/kg (TV = 387 mm 3, TGI = 62%, p <0,01) e 10 mg/kg (TV = 332 mm3, TGI = 70%, p <0,001), mostrou uma significativa atividade antitumoral.
[345] Depois da suspensão da dosagem por uma semana, o volume médio do tumor no grupo tratado com controle isotípico atingiu 1.266 mm3. O tratamento com W7011-BMK1-DM1 a 1 mg/kg (TV = 593 mm3, TGI = 58%, p <0,01) e 10 mg/kg (TV = 499 mm 3, TGI = 67%, p <0,001) mostrou uma significativa atividade antitumoral. O ADC W7011-4.87.6-z1-uIgG1k (NS)-DM1 a 1 mg/kg (TV = 562 mm3, TGI = 61%, p <0,01), 3 mg/kg (TV = 556 mm 3, TGI = 62%, p <0,01) e 10 mg/kg (TV = 502 mm 3, TGI = 66%, p <0,001), mostrou uma significativa atividade antitumoral.
[346] Todos os animais mantiveram bem seus pesos corporais durante o período do experimento.

Claims (58)

REIVINDICAÇÕES
1. ANTICORPO, isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender uma ou mais sequências de região determinante de complementaridade (CDR) de cadeia pesada selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 44, 45, 136, 140 e 141, e/ou uma ou mais sequências CDR de cadeia leve kappa selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 5, 6, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 40, 41, 42, 137, 138 e 139.
2. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3; b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9; c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15; d) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21; e) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24;
f) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27; g) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30; h) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33; i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36; j) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39; k) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45; l) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3; m) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 140 e SEQ ID NO: 9; e n) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 141 e SEQ ID NO: 15.
3. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve kappa selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6; b) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12; c) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18; d) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 42; e e) uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 e SEQ ID NO: 139.
4. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6; b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO:
7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências
CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:
11 e SEQ ID NO: 12;
c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO:
13, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:
17 e SEQ ID NO: 18;
d) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO:
19, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências
CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6;
e) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO:
22, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências
CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6;
f) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO:
25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências
CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6;
g) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO:
28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências
CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6;
h) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências
CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6;
i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO:
34, SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências
CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6;
j) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO:
37, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências
CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO:
41 e SEQ ID NO: 42;
k) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO:
43, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6; l) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 e SEQ ID NO: 139; m) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 140 e SEQ ID NO: 9; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12; ou n) uma região variável de cadeia pesada compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 141 e SEQ ID NO: 15; e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo 1, 2 ou 3 sequências CDR selecionadas a partir da SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18.
5. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender: a) uma sequência CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37,
SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 136.
b) uma sequência CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 140 e SEQ ID NO: 141; e c) uma sequência CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, e SEQ ID NO: 45.
6. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender: a) uma sequência de CDR1 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 137; b) uma sequência de CDR2 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 138; e c) uma sequência de CDR3 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 139.
7. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender: a) uma sequência CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13,
SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 136.
b) uma sequência CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 140 e SEQ ID NO: 141; c) uma sequência CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, e SEQ ID NO: 45; d) uma sequência de CDR1 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 137; e) uma sequência de CDR2 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 138; e f) uma sequência de CDR3 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 139.
8. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender ainda uma ou mais sequências da região de arcabouço de cadeia pesada selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 54, 55, 56, 57, 70, 71, 72, 73, 86, 87, 88 e 89 e/ou uma ou mais sequências da região de arcabouço (FR) de cadeia leve kappa selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 58, 59, 60, 61, 74, 75, 76, 77, 90, 91, 92 e 93.
9. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender ainda a sequência FR1 de cadeia pesada selecionada a partir das SEQ ID NOs: 54, 70 e 86; a sequência FR2 de cadeia pesada selecionada a partir das SEQ ID NOs: 55, 71 e 87; a sequência FR3 de cadeia pesada selecionada a partir das SEQ ID NOs: 56, 72 e 88; e uma sequência FR4 de cadeia pesada selecionada a partir das SEQ ID NOs: 57, 73 e 89.
10. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender ainda a sequência FR1 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NOs: 58, 74 e 90; a sequência FR2 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NOs: 59, 75 e 91; a sequência FR3 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NOs: 60, 76 e 92; e uma sequência FR4 de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NOs: 61, 77 e
93.
11. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132 e uma sequência homóloga destas com pelo menos 80% de identidade de sequência.
12. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve kappa selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134 e uma sequência homóloga destas com pelo menos 80% de identidade de sequência.
13. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 94 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 96; b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 98 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 100; c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 102 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 104; d) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 106 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 96; e) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 108 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 96; f) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 110 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 96; g) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 112 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 96;
h) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 114 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 96; i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 116 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 96; j) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 118 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 120; k) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 122 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 96; l) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 124 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 126; m) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 128 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 130; ou n) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 132 e uma região variável de cadeia leve kappa compreendendo a SEQ ID NO: 134.
14. ANTICORPO ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender ainda uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos e ainda manter a afinidade de ligação específica para o CD19.
15. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela substituição estar presente em uma ou mais sequências CDR e/ou em uma ou mais sequências FR, em uma ou ambas as sequências de região variável e/ou na região Fc.
16. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pela substituição conferir uma ou mais propriedades desejáveis selecionadas dentre: a) melhorar a afinidade de ligação ao CD19, b) introduzir ou remover de um sítio de glicosilação, c) introduzir um resíduo de cisteína livre, d) aumentar ou reduzir a ADCC ou CDC, e) aumentar da meia-vida sérica; e f) aumentar da ligação ao FcRn.
17. ANTICORPO ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender ainda uma região constante de imunoglobulina, opcionalmente uma região constante de IgG, opcionalmente uma região constante de IgG1 humana.
18. ANTICORPO ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser um anticorpo humanizado.
19. ANTICORPO ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser um anticorpo de domínio único camelizado, um diacorpo (diabody), um scFv, um dímero scFv, um BsFv, um dsFv, um (dsFv)2, um dsFv- dsFv’, um fragmento Fv, um Fab, um Fab’, um F(ab')2, um ds diacorpo, um nanocorpo, um anticorpo de domínio ou um anticorpo de domínio bivalente.
20. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,
caracterizado por ser biespecífico.
21. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por estar ligado a um ou mais conjugados.
22. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo conjugado compreender um agente quimioterápico, uma toxina, um isótopo radioativo, um lantanídeo, um marcador luminescente, um marcador fluorescente ou um marcador de substrato enzimático.
23. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser capaz de se ligar especificamente ao CD19, opcionalmente ao CD19 derivado de humanos ou macacos.
24. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser capaz de se ligar especificamente ao CD19 humano, expresso em uma célula a um valor KD não maior que 5x10-9 M, conforme medido por um ensaio de citometria de fluxo.
25. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser capaz de se ligar especificamente ao CD19 humano, expresso em uma célula a uma EC50 não maior do que 0,9 nM, ou não maior do que 1 nM por um ensaio de citometria de fluxo.
26. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser capaz de se ligar especificamente ao CD19 de macaco cinomolgo expresso em uma célula a uma EC50 não maior do que 3 nM quando mesurado por um ensaio de citometria de fluxo.
27. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser internalizado por uma célula que expressa CD19 em uma EC50 não maior que 50 pM quando mensurado pelo ensaio Fab-Zap.
28. ANTICORPO ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por competir com o W7011-4.155.8 pelo mesmo epítopo.
29. SEQUÊNCIA DE POLINUCLEOTÍDEO isolado, caracterizada por codificar o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
30. SEQUÊNCIA DE POLINUCLEOTÍDEO isolado, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica selecionada a partir de um grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 95, 99, 103, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 123, 125, 129 e 133, e/ou uma sequência nucleotídica selecionada a partir de um grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 97, 101, 105, 121, 127, 131 e 135, ou uma sequência homóloga da mesma possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência, mas codificando a mesma sequência de proteína.
31. VETOR, caracterizado por compreender o polinucleotídeo isolado da reivindicação 29 ou 30.
32. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por compreender o vetor da reivindicação 31.
33. MÉTODO DE EXPRESSAR O ANTICORPO ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 28, caracterizado por compreender o cultivo da célula hospedeira da reivindicação 32 sob condições em que o vetor da reivindicação 31 seja expresso.
34. CONJUGADO anticorpo-droga, caracterizado por compreender uma ou mais porções de fármacos covalentemente ligadas ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das reivindicações de 1 a 28, diretamente ou por um ligante.
35. CONJUGADO anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo ligante ser um ligante de hidrazona, um ligante de bissulfeto, um ligante bifuncional, um ligante dipeptídico, um ligante de glucuronídeo, um ligante de tioéter, e opcionalmente o ligante é SMCC.
36. CONJUGADO anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizado por pelo menos uma fração de droga estar ligada a um sítio específico do anticorpo ou de seu fragmento de ligação ao antígeno, opcionalmente o sítio específico é um resíduo de cisteína.
37. CONJUGADO anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pela porção droga ser uma citotoxina ou um isótopo radioativo.
38. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo conjugado ser uma toxina, opcionalmente uma citotoxina, um alquilante de DNA, um inibidor da topoisomerase, um ligante de tubulina ou outros medicamentos anticâncer, opcionalmente um agente citotóxico maitansinoide, e opcionalmente a toxina é DM1.
39. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das reivindicações de 1 a 28 ou o conjugado anticorpo-droga de qualquer das reivindicações de 34 a 37, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
40. MÉTODO PARA TRATAR UMA DOENÇA ou condição relacionada ao CD19 em um sujeito, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 28, o conjugado anticorpo-droga de acordo com qualquer uma das reivindicações de 34 a 37, ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 39 ao sujeito.
41. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pela doença ou condição ser o câncer.
42. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo câncer ser linfoma, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de colo do útero, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pâncreas, melanoma, glioblastoma, câncer de próstata, câncer de esôfago ou câncer gástrico.
43. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pela doença ou condição ser linfoma de células B, opcionalmente linfoma de Hodgkin ou linfoma não-Hodgkin, em que o linfoma não-Hodgkin compreende: Linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular, linfoma de células B da zona marginal (MZL), linfoma de tecido linfático associado à mucosa (MALT), linfoma linfocítico pequeno (leucemia linfocítica crônica, CLL), linfoma de células do manto (MCL), leucemia linfoblástica aguda (ALL), ou Macroglobulinemia de Waldenstrom (WM).
44. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pela administração ser feita por administração oral, nasal, intravenosa, subcutânea, sublingual ou intramuscular.
45. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo sujeito ser humano.
46. MÉTODO DE MODULAÇÃO da atividade de CD19 em uma célula que expressa CD19, caracterizado por compreender a exposição das células que expressam CD19 ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações de 1 a 28.
47. MÉTODO IN VIVO OU IN VITRO de matar célula que expressa CD19, caracterizado por compreender o contato da célula que expressa CD19 com o conjugado anticorpo-droga de qualquer uma das reivindicações de 34 a 37.
48. MÉTODO PARA DETECTAR a presença ou quantidade de CD19 em uma amostra, caracterizado por compreender o contato da amostra com o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de qualquer uma das reivindicações de 1 a 28; e determinar a presença ou quantidade de CD19 épsilon na amostra.
49. MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR uma doença ou condição relacionada ao CD19 em um sujeito, caracterizado por compreender: a) a obtenção de uma amostra a partir do sujeito; b) colocar a amostra em contato com o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 28; c) determinar a presença ou quantidade de CD19 na amostra; d) correlacionar a presença ou quantidade de CD19 a uma doença ou condição no sujeito.
50. USO, do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 28, do conjugado anticorpo-droga de qualquer uma das reivindicações de 34 a 37, ou da composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 39 na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou condição em um sujeito com tal necessidade, caracterizado pelo tratamento compreender: a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ao sujeito.
51. USO do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das reivindicações de 1 a 285, caracterizado pela fabricação de um reagente de diagnóstico para diagnosticar uma doença ou condição relacionada ao CD19.
52. RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO (CAR), caracterizado por compreender o fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das reivindicações de 1 a 28 e uma fração de ativação de células T, em que a fração de ativação de células T compreende um domínio transmembrana de um receptor de célula T e um domínio de transdução de sinal intracelular de um receptor de células T.
53. RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO (CAR), de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo o fragmento de ligação ao antígeno ser um scFv.
54. SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO, caracterizado por codificar o CAR, de acordo com a reivindicação 52.
55. SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 54, caracterizada por compreender a sequência de polinucleotídeo das reivindicações 29 ou 30, operacionalmente ligada a uma segunda sequência de polinucleotídeo que codifica um domínio transmembrana do receptor de células T e um domínio de transdução de sinal do receptor de células T.
56. VETOR, caracterizado por compreender a sequência de ácido nucleico de acordo com reivindicação 54 ou 55.
57. CÉLULA T isolada, caracterizada por expressar o CAR de acordo com a reivindicação 52.
58. MÉTODO PARA ESTIMULAR UMA RESPOSTA IMUNE mediada por células T em um alvo expressando CD19 em um sujeito, caracterizado pelo método compreender a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz das células T de acordo com a reivindicação 57.
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