CN109535253A - 新型抗cd19抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抗CD19的抗体或其抗原结合片段、编码其的分离的多核苷酸、包括其的药物组合物，及其用途。

Description

新型抗CD19抗体
发明领域
本发明总体上涉及新的抗CD19抗体及其用途。
背景技术
CD19(分化簇19)是表达在B细胞表面上的具有特别结构的细胞表面受体，包括但不限于B细胞淋巴瘤的所有亚型，从惰性型到侵袭型，以及B细胞慢性淋巴细胞白血病和非T细胞急性淋巴细胞白血病、前B细胞、早期发育阶段中的B细胞(即未成熟B细胞)、经历向浆细胞终末分化的成熟B细胞，以及恶性B细胞。CD19由多数前B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)、促淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、普通型急性淋巴细胞白血病，以及一些零型急性淋巴细胞白血病表达(Nadle等，J.Immunol.，131:244-250(1983)，Loken等，Blood，70:1316-1324(1987)，Uckun等，Blood，71:13-29(1988)，Anderson等，1984.Blood，63:1424-1433(1984)，Scheuermann，Leuk.Lymphoma，18:385-397(1995))。CD19在浆细胞上的表达进一步表明其可以在分化的B细胞肿瘤上表达，例如多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、瓦尔登斯特伦肿瘤(Grossbard等，Br.J.Haematol.，102:509-15(1998)；Treon等，Semin.Oncol.，30:248-52(2003))。CD19还是推荐用于免疫疗法的多种靶标之一。与CD20(另一种B细胞表面受体)不同，CD19被认为在与抗CD19抗体结合时以更高的水平被表达，并且被细胞内化。
仍然存在对新的抗CD19抗体的需要，特别是具有优越的内化能力以及高结合亲和性的抗CD19抗体。
发明简述
本申请全文中的冠词“一种”、“一个”和“所述”在此用于指代一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一种抗体”指一种抗体或多于一种抗体。
本申请提供新的抗CD19单克隆抗体、其氨基酸及核苷酸序列，以及其用途。
在一个方面，本申请提供分离的抗体或其抗原结合片段，其包括一个或多个(例如1、2或3个)选自下组的重链互补决定区(CDR)序列：SEQ ID NO:1、2、3、7、8、9、13、14、15、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、43、44、45、136、140和141，和/或一个或多个(例如1、2或3个)选自下组的κ轻链CDR序列：SEQ ID NO:4、5、6、10、11、12、16、17、18、40、41、42、137、138和139。
在某些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段包括1、2或3个与SEQ ID NO:1、2、3、7、8、9、13、14、15、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、43、44、45、136、140或141所示的序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的重链CDR序列。在某些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段包括1、2或3个与SEQ ID NO:4、5、6、10、11、12、16、17、18、40、41、42、137、138或139具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的轻链CDR序列。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区选自下组：
a)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的CDR序列；
b)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的CDR序列；
c)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的CDR序列；
d)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的CDR序列；
e)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的CDR序列；
f)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的CDR序列；
g)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的CDR序列；
h)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的CDR序列；
i)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的CDR序列；
j)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的CDR序列；
k)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45的CDR序列；
l)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的CDR序列；
m)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:9的CDR序列；和
n)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:15的CDR序列。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括κ轻链可变区，所述κ轻链可变区选自下组：
a)κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的CDR序列；
b)κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的CDR序列；
c)κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的CDR序列；
d)κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42的CDR序列；和
e)κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138和SEQ IDNO:139的CDR序列。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括：
a)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的CDR序列；
b)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的CDR序列；
c)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:18的CDR序列；
d)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6的CDR序列；
e)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6的CDR序列；
f)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6的CDR序列；
g)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6的CDR序列；
h)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6的CDR序列；
i)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6的CDR序列；
j)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ IDNO:42的CDR序列；
k)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6的CDR序列；
l)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138和SEQ IDNO:139的CDR序列；
m)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:9的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12的CDR序列；或
n)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:15的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:18的CDR序列。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括：重链CDR3序列，所述重链CDR3序列选自：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39和SEQID NO:45。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括：
a)重链CDR1序列，所述重链CDR1序列选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:136；
b)重链CDR2序列，所述重链CDR2序列选自：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:141；和
c)重链CDR3序列，所述重链CDR3序列选自：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:45。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括：
a)轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列选自：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:137；
b)轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列选自：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:138；和
c)轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列选自：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:139。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括：
a)重链CDR1序列，所述重链CDR1序列选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:136；
b)重链CDR2序列，所述重链CDR2序列选自：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:141；
c)重链CDR3序列，所述重链CDR3序列选自：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:45；
d)轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列选自：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:137；
e)轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列选自：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:138；和
f)轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列选自：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:139。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段进一步包括：一个或多个(例如1、2、3或4个)选自下组的重链框架区(FR)序列：SEQ ID NO:54、55、56、57、70、71、72、73、86、87、88和89，和/或一个或多个(例如1、2、3或4个)选自下组的κ轻链框架区(FR)序列：SEQ ID NO:58、59、60、61、74、75、76、77、90、91、92和93。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段进一步包括：重链FR1序列，所述重链FR1选自SEQ ID NO:54、70和86；重链FR2序列，所述重链FR2选自SEQ ID NO:55、71和87；重链FR3序列，所述重链FR3选自SEQ ID NO:56、72和88；和重链FR4序列，所述重链FR4选自SEQ ID NO:57、73和89。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段进一步包括：轻链FR1序列，所述轻链FR1选自SEQ ID NO:58、74和90；轻链FR2序列，所述轻链FR2选自SEQ ID NO:59、75和91；轻链FR3序列，所述轻链FR3选自SEQ ID NO:60、76和92；和轻链FR4序列，所述轻链FR4选自SEQ ID NO:61、77和93。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括：重链可变区，所述重链可变区选自下组：SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:106、SEQID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:132和与其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的同源序列。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括：轻链可变区，所述轻链可变区选自下组：SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:120、SEQID NO:126、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:134和与其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的同源序列。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括选自下组的重链可变区序列的全部或一部分：SEQ ID NO:94、98、102、106、108、110、112、114、116、118、122、124、128和132；和/或选自下组的轻链可变区序列的全部或一部分：SEQ ID NO:100、104、120、126、130和134。在一个实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段由选自下组的重链可变区序列的全部或一部分组成的单域抗体：SEQ ID NO:94、98、102、106、108、110、112、114、116、118、122、124、128和132。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括：
a)重链可变区，其包括SEQ ID NO:94和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:96；
b)重链可变区，其包括SEQ ID NO:98和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:100；
c)重链可变区，其包括SEQ ID NO:102和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:104；
d)重链可变区，其包括SEQ ID NO:106和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:96；
e)重链可变区，其包括SEQ ID NO:108和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:96；
f)重链可变区，其包括SEQ ID NO:110和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:96；
g)重链可变区，其包括SEQ ID NO:112和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:96；
h)重链可变区，其包括SEQ ID NO:114和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:96；
i)重链可变区，其包括SEQ ID NO:116和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:96；
j)重链可变区，其包括SEQ ID NO:118和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:120；
k)重链可变区，其包括SEQ ID NO:122和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:96；
l)重链可变区，其包括SEQ ID NO:124和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:126；
m)重链可变区，其包括SEQ ID NO:128和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:130；或
n)重链可变区，其包括SEQ ID NO:132和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:134。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段进一步包括一个或多个氨基酸残基替代，但仍然保持与CD19的特异性结合亲和性。
在某些实施方式中，所述替代在一个或多个CDR序列里，和/或在一个或多个FR序列里，在一个或两个可变区序列里，和/或在Fc区。在某些实施方式中，在CDR序列里、在FR序列里、在可变区序列里或在Fc区的所述替代中的至少一个(或全部)包括保守性替代。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段在选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、136、137、138、139、140和141的一个或多个CDR序列中包括不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基替代。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段在选自SEQ ID NO:54、55、56、57、58、59、60、61、70、71、72、73、74、75、76、77、86、87、88、89、90、91、92和93的一个或多个FR序列中包括不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基替代。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段在选自SEQ ID NO:94、98、102、106、108、110、112、114、116、118、122、124、128和132的重链可变区序列的CDR序列和/或FR序列中包括总共不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个替代。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段在选自SEQ ID NO:96、100、104、120、126、130和134的轻链可变区序列的所有FR序列中包括不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基替代。
在某些实施方式中，所述替代赋予一种或多种需要的性质，所述需要的性质选自：a)提高与CD19的结合亲和性，b)引入或移除糖基化位点，c)引入游离的半胱氨酸残基，d)提高或降低ADCC或CDC，e)增加血清半衰期；和f)增加FcRn结合。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段进一步包括免疫球蛋白恒定区。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括IgG的恒定区。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括鼠IgG1、鼠IgG2a、鼠IgG2b或人IgG1的恒定区。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段为非人(例如鼠科或啮齿类动物)抗体或人源化抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段为骆驼化单域抗体(camelized single chain domain antibody)、双功能抗体(diabody)、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、双特异性抗体、ds双功能抗体(ds diabody)、纳米抗体、域抗体或双价域抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段具有双特异性。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段与一种或多种缀合物连接。在某些实施方式中，所述缀合物包括化疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记，或酶底物标记。在某些实施方式中，所述缀合物为毒素。在某些实施方式中，所述毒素为细胞毒素、DNA烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂，或其他抗癌药物。在某些实施方式中，所述抗癌药物为美登素类细胞毒性剂。在某些实施方式中，所述毒素为DM1。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段能够特异性地与CD19结合。在某些实施方式中，所述CD19来源于小鼠、大鼠、猴或人。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段能够以不超过5×10-9M、不超过1×10-9M、不超过9×10-10M、不超过8×10-10M、不超过7×10-10M、不超过6×10-10M、不超过5×10-10M、不超过4×10-10M、不超过3×10-10M、不超过2×10-10M、不超过1×10-10M的KD值特异性地与表达在细胞上的人CD19结合，所述KD值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段能够以不超过0.04nM、不超过0.05nM、不超过0.1nM、不超过0.2nM、不超过0.3nM、不超过0.4nM、不超过0.5nM、不超过0.5nM、不超过0.6nM、不超过0.7nM、不超过0.8nM、不超过0.9nM或不超过1nM的EC50值特异性地与表达在细胞上的人CD19结合，所述EC50值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段能够以不超过0.2nM、不超过0.5nM、不超过0.8nM、不超过1nM、不超过2nM或不超过3nM的EC50值特异性地与表达在细胞上的食蟹猴CD19结合，所述EC50值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段能够以不超过1pM、不超过2pM、不超过3pM、不超过4pM、不超过5pM、不超过6pM、不超过7pM、不超过8pM、不超过9pM、不超过10pM、不超过11pM、不超过12pM、不超过13pM、不超过14pM、不超过15pM、不超过16pM、不超过17pM、不超过18pM、不超过19pM、不超过20pM、不超过21pM、不超过22pM、不超过23pM、不超过24pM、不超过25pM、不超过30pM、不超过35pM、不超过40pM、不超过45pM、不超过50pM的EC50值被表达CD19的细胞内化，所述EC50值通过Fab-Zap法测定。
在一个方面，本申请提供抗体或其抗原结合片段，其与W7011-4.155.8、W7011-4.202.9或W7011-4.225.7竞争相同的表位。
在一个方面，本申请进一步提供药物组合物，其包括本申请所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的运载体。在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包括第二药剂，其能够提高所述抗体或其抗原结合片段的治疗效果，和/或能够降低所述抗体或其抗原结合片段的副作用。
在一个方面，本申请进一步提供分离的多核苷酸，其编码本申请所述的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸包括选自下组的核苷酸序列：SEQID NO:95、99、103、107、109、111、113、115、117、119、123、125、129和133，和/或选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:97、101、105、121、127、131和135，或与其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性但编码同一蛋白序列的同源序列。
在一个方面，本申请进一步提供包括所述分离的多核苷酸的载体。
在一个方面，本申请进一步提供包括所述载体的宿主细胞。
在一个方面，本申请进一步提供表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在表达所述多核苷酸的条件下培养所述宿主细胞。
在一个方面，本申请进一步提供抗体-药物缀合物，其包括一个或多个药物部分，所述药物部分直接或经由接头共价连接至本申请所述的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述接头为腙接头、二硫接头、双官能接头、二肽接头、葡糖苷酸接头、硫醚接头。在某些实施方式中，所述接头是SMCC。
在某些实施方式中，至少一个药物部分连接至本申请所述的抗体或其抗原结合片段的特定位点。在某些实施方式中，所述特定位点为半胱氨酸残基。在某些实施方式中，所述药物部分为细胞毒素或放射性同位素。在某些实施方式中，所述药物部分为毒素可选地为细胞毒素、DNA烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂，或其他抗癌药物，可选地为美登素类细胞毒性剂，可选地，所述毒素为DM1。
在一个方面，本申请进一步提供药物组合物，其包括本申请所述的抗体或其抗原结合片段，或本申请提供抗体-药物缀合物，以及药学上可接受的运载体。
在一个方面，本申请进一步提供在受试者中治疗与CD19相关的疾病或状况的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本申请所述的抗体或其抗原结合片段、本申请所述的抗体-药物缀合物，或本申请所述的药物组合物。在某些实施方式中，所述受试者是人类。在某些实施方式中，所述施用是经由口服、鼻内、静脉内、皮下、舌下或肌内施用。在某些实施方式中，所述疾病或状况是癌症。在某些实施方式中，所述癌症为淋巴癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌、食道癌或胃癌。在某些实施方式中，所述疾病或状况是B细胞淋巴瘤，可选地为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，其中所述非霍奇金淋巴瘤包括：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞性淋巴瘤(慢性淋巴细胞白血病，CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)，或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。
在一个方面，本申请进一步提供在表达CD19的细胞中调节CD19活性的方法，其包括将所述表达CD19的细胞暴露于本申请所述的抗体或其抗原结合片段。
在一个方面，本申请进一步提供在体内或体外杀死表达CD19的细胞的方法，其包括将所述表达CD19的细胞与本申请所述的抗体-药物缀合物接触。
在一个方面，本申请进一步提供检测样品中CD19的存在或含量的方法，其包括将所述样品与本申请所述的抗体或其抗原结合片段接触，以及确定样品中CD19的存在或含量。
在一个方面，本申请进一步提供诊断在受试者中与CD19相关的疾病或状况的方法，其包括：a)获取来自所述受试者的样品；b)将所述样品与本申请所述的抗体或其抗原结合片段接触；c)确定在所述样品中CD19的存在或含量；d)将所述CD19的存在或含量与所述受试者的疾病或状况相关联。
在一个方面，本申请进一步提供本申请所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗受试者中的疾病或状况的药物中用途，其中所述治疗包括：向所述受试者施用治疗有效量的所述抗体或其抗原结合片段。
在一个方面，本申请进一步提供本申请所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测与CD19相关的疾病或状况的诊断试剂中的用途。
在一个方面，本申请提供嵌合抗原受体(CAR)，其包括本申请所述的抗原结合片段和T细胞活化部分。在某些实施方式中，所述T细胞活化部分包括T细胞受体(TCR)的天然T细胞活化部分。在某些实施方式中，所述T细胞活化部分包括TCR的跨膜结构域和TCR的胞内信号转导结构域。在某些实施方式中，所述抗原结合片段为scFv。
在一个方面，本申请提供编码本申请所述的CAR的核酸序列。在某些实施方式中，所述核酸序列包括编码本申请所述的抗体的抗原结合片段的第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列可操作地连接至编码所述TCR的跨膜结构域和TCR的胞内信号转导结构域的第二多核苷酸序列。
在一个方面，本申请提供载体，其包括编码本申请所述的CAR的核酸序列。
在一个方面，本申请提供分离的T细胞，其表达本申请所述的CAR。
在一个方面，本申请提供用于在受试者中激活T细胞介导的针对表达CD19的靶标的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本申请所述的T细胞。
附图简述
图1显示了WBP701-BMK1和WBP701-BMK2的SDS-PAGE。M：蛋白标记；1道：BMK1，还原条件；2道：BMK2，还原条件；3道：BMK1，非还原条件；4道：BMK4，非还原条件。
图2显示了WBP701-BMK3的SDS-PAGE。M：蛋白标记；1道：BMK3，还原条件；2道：BMK3，非还原条件。
图3A显示了在人CD19转染的293F细胞系(WBP701.293F.hPro1.FL.A2)中CD19表达的流式细胞直方图。左边的峰代表阴性对照信号。向右偏移的峰代表被检测的细胞系中的CD19表达。
图3B显示了在人CD19转染的CHO-K1细胞系(WBP701.CHO-K1.hPro1.FL.B4)中CD19表达的流式细胞直方图。左边的峰代表阴性对照信号。向右偏移的峰代表被检测的细胞系中的CD19表达。
图3C显示了在食蟹猴CD19转染的293细胞系(WBP701.293F.cpro1.FL.C1)中CD19表达的流式细胞直方图。左边的峰代表阴性对照信号。向右偏移的峰代表被检测的细胞系中的CD19表达。
图3D显示了在食蟹猴CD19转染的CHO-K1细胞系(WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9)中CD19表达的流式细胞直方图。左边的峰代表阴性对照信号。向右偏移峰代表被检测的细胞系中的CD19表达。
图4A-4F显示了通过FACS测定的所选取的亚克隆与Ramos细胞的结合。
图5A-5C显示了通过FACS测定的所选取的亚克隆与表达食蟹猴CD19的细胞(WBP701.CHO-K11.cynoPro1)的结合。
图6A-6E显示了所选取的亚克隆的Fab-Zap测定。
图7A-7C显示了通过FACS测定的针对BMK1、BMK2和BMK3抗体的候选抗体分组。
图8显示了通过FACS测定的抗体WBP7011-4.34.11-z1-m5-IgG1k与Ramos细胞结合的Scarchard结合亲和性分析。
图9显示了通过FACS测定的抗体WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K(N-S)与Ramos细胞结合的Scarchard结合亲和性分析。
图10显示了通过FACS测定的抗体W7011-4.155.8-z1-uIgG1K与Ramos细胞的Scarchard结合亲和性分析。
图11显示了在Daudi细胞上进行的人源化的抗体-药物缀合物W7011-4.155.8-z1-uIgG1K-DM1和WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K(N-S)-DM1的细胞毒性测试。
图12显示了在Nalm-6细胞上进行的人源化的抗体-药物缀合物WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K(N-S)-DM1的细胞毒性测试。
图13显示了在WSU-DLCL2细胞上进行的人源化的抗体-药物缀合物W7011-4.155.8-z1-uIgG1K-DM1和WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K(N-S)-DM1的细胞毒性测试。
图14显示了基准抗体(W7011-BMK1-DM1)，以及抗体(W7011-4.87.6-z1-uIgG1k(N-S)-DM1)的抗肿瘤效力，数据表示带有Nalm-6淋巴细胞癌症异种移植的雌性CB17-SCID小鼠的不同处理组中的肿瘤体积。数据点表示为平均值+SEM。箭头表示给药天数。
发明详述
本申请的以下描述只为说明本申请的多种实施方式。因此，此处讨论的具体修改方式不应理解为对申请范围的限制。本领域的技术人员在不偏离本申请范围的情况下即可很容易地得出多种等同方式，变化和修改，应理解这样的等同实施方式包括在本发明范围内。在本申请中引用的所有文献，包括公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入。
定义
本发明中的“抗体”一词包括任意可结合某特定抗原的免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、双价抗体、单价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。一个天然的完整抗体包含两条重(H)链和两条轻(L)链。哺乳动物的重链可分为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由一个可变区(VH)以及第一、第二和第三恒定区(分别为CH1、CH2、CH3)组成；哺乳动物的轻链可分为λ或κ，而每条轻链由一个可变区(分别为λ轻链的VL或κ轻链的VK)以及一个恒定区(分别为λ轻链的CL或κ轻链的CK)组成。抗体呈“Y”型，“Y”型结构的颈部由两条重链的第二和第三恒定区组成，其通过二硫键结合。“Y”型结构的每条臂包括其中一条重链的可变区和第一恒定区，其与一条轻链的可变区和恒定区结合。轻链和重链的可变区决定抗原的结合。每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(轻链的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重链的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本发明中公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani命名法命名或识别。(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.，J.Mol.Biol.，273(4)，927(1997)；Chothia,C.等，J Mol Biol.Dec 5；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.，J.Mol.Biol.，196,901(1987)；Chothia,C.等，Nature.Dec 21-28；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等，National Institutes ofHealth，马里兰贝塞斯达(1991))。其中，三个CDR由被称为框架区(FR)的侧面连续部分间隔开，框架区比CDR更加高度保守并形成一个支架支撑超变环。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类。根据是否含有α、δ、ε、γ和μ重链，抗体可分别分为五个主要的分类或异构体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。几个主要的抗体分类还可分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)等。
本申请中的“二价”一词，指具有两个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；“单价”一词指仅具有一个单一抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；而“多价”一词指具有多个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段。在一些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段是二价的。
在本申请中，“双特异性”抗体指具有来源于两个不同的单克隆抗体的片段，并且能够与两个不同的表位结合的人造抗体。所述两个表位可以存在于同一个抗原，或者其可以存在于两个不同的抗原。
本申请中的“抗原结合片段”一词，指由含有1、2或3个CDR的抗体部分或者任何其他结合抗原但不具有完整抗体结构的抗体片段所形成的一种抗体片段。抗原结合片段的例子包括，但不限于，如双功能抗体(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv－dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(dsdiabody)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(双价的双功能抗体)、双价单链抗体(BsFv)、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼化单域抗体(camelized single domain antibody)、纳米抗体、域抗体和双价域抗体。抗原结合片段可以与母体抗体结合相同的抗原。
抗体的“Fab”片段是指由一条轻链(包括可变区和恒定区)和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的那部分抗体分子。
“Fab'”片段是指包含了部分铰链区的Fab片段。
“F(ab')2”指的是Fab’的二聚体。抗体的“Fv”指的是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由一条轻链的可变区和一条重链的可变区组成。
“dsFv”是指二硫键稳定的Fv片段，其单条轻链的可变区与单条重链的可变区之间的连接是二硫键。在一些实施方式中“(dsFv)2”或“(dsFv-dsFv')”含有三条肽链：两个VH部分通过肽接头(例如长的弹性接头)相连，并通过二硫键分别与两个VL部分结合。在一些实施方式中，dsFv-dsFv'具有双特异性，其中每对通过二硫键配对的重链轻链具有不同的抗原特异性。
“单链Fv抗体”或“scFv”是指由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体(Huston JS等，Proc Natl Acad Sci USA、85:5879(1988))。
抗体的“Fc”指的是由第一重链的第二和第三恒定区经由二硫键与第二重链的第二和第三恒定区连接组成的那部分抗体。抗体的Fc段负责多种不同的效应功能，如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)，但在抗原结合中不起作用。
“单链抗体Fv-Fc”或“scFv-Fc”是指由连接到某抗体Fc段的scFv组成的工程抗体。
“骆驼化单域抗体(Camelized single domain antibody)”、“重链抗体”或“HCAb(Heavy-chain-only antibodies，HCAb)”都是指含有两个VH域而不含有轻链的抗体(Riechmann L.和Muyldermans S.，J Immunol Methods.Dec 10；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.，J Biotechnol.Jun；74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利号6,005,079)。重链抗体最初来源于驼科(骆驼、单峰驼和美洲驼)。虽然缺失轻链，骆驼化抗体(camelized antibodies)有确证的抗原结合全部功能(Hamers-Casterman C.等，Nature.Jun 3；363(6428):446-8(1993)；Nguyen VK.等，“Heavy-chain antibodies inCamelidae；a case of evolutionary innovation”Immunogenetics.Apr；54(1):39-47(2002)；Nguyen VK.等，Immunology.May；109(1):93-101(2003))。重链抗体的可变区(VHH域)是最小的已知的获得性免疫产生的抗原结合单位(Koch-Nolte F.等，FASEB J.Nov；21(13):3490-8.Epub 2007Jun 15(2007))。
“纳米抗体”是指一种抗体片段，其由一个来自重链抗体的VHH域和两个恒定区CH2和CH3组成。
“双功能抗体(diabody)”或“dAb”包括带有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中该片段含有在同一条多肽链上相连的VH域和VL域(VH-VL或VH-VL)(请参见Holliger P.等，Proc Natl Acad Sci USA.，7月15日；90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。两个域之间衔接物很短，使同一条链上的两个域不能互相配对，从而迫使两个域与另一条链的互补域配对，形成两个抗体结合位点。这两个抗体结合位点可靶向结合相同或不同的抗原(或抗原表位)。在某些实施方式中，“双特异性ds双功能抗体”是靶向两个不同的抗原(或抗原表位)的双功能抗体。在某些实施方式中，“scFv二聚体”是双价双功能抗体或双价单链抗体(BsFv)，含有二聚化的两个VH-VL(由多肽衔接物连接)基团，其中一个基团的VH与另一个基团的VL协作形成两个结合位点，这两个结合位点可靶向结合相同抗原(或抗原表位)或不同抗原(或抗原表位)。在另一些实施方式中，“scFv二聚体”是双特异性双功能抗体，含有相互连接的VL1-VH2(由多肽衔接物连接)和VH1-VL2(由多肽衔接物连接)，其中VH1和VL1协作，VH2和VL2协作，且每个协作的配对具有不同的抗原特异性。
“域抗体”是指仅含有重链可变区或轻链可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或多个VH域由肽连接子共价结合形成双价域或多价域抗体。双价域抗体的两个VH域可靶向作用于相同或不同的抗原。
本申请中使用的术语“嵌合”是指具有来源于一种物种的重链和/或轻链的一部分，和所述重链和/或轻链其余部分来源于不同物种的抗体或抗原结合片段。在一个示例性的实例中，嵌合抗体可以包括来源于人的恒定区和来源于非人动物(例如小鼠或大鼠)的可变区。在一些实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。
本申请中使用的术语“人源化”是指包括来源于非人动物的CDR、来源于人的FR区，以及来源于人的恒定区(当适用时)的抗体或抗原结合片段。
本申请中使用的术语“CD19”是指分化簇19蛋白，其为可以在白血病前体细胞上检测到的抗原决定簇。人和小鼠CD19的氨基酸和核酸序列可以在公众数据库中找到，如GenBank、UniProt和Swiss-Prot。例如，以UniProt/Swiss-Prot登录号P15391可以找到人CD19的氨基酸序列，以登录号NM_001178098可以找到编码人CD19的核酸序列。本申请中使用的术语CD19包括包含突变的蛋白，例如全长野生型CD19的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体。CD19表达于大多B细胞型癌症中，包括例如急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤。CD19还是祖B细胞的早期标记物。参见例如Nicholson等，Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)。在一个方面，CD19蛋白表达在癌细胞上。
本申请中的“特异性结合”或“特异性的结合”是指两分子间的非随机结合反应，如抗体和抗原间的反应。在某些实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合片段与人和/或猴CD19特异性结合，并且其结合亲和力(KD)≤10-6M(如：≤5×10-7M、≤2×10-7M、≤10-7M、≤5×10-8M、≤2×10-8M、≤10-8M、≤5×10-9M、≤4x10-9M、≤3x10-9M、≤2×10-9M或≤10-9M)。本申请中的KD是指解离速度与结合速度的比值(koff/kon)，其可通过使用任何本领域公知的传统方法测定，包括但不限于表面等离子共振法、微量热泳法、HPLC-MS方法和流式细胞术(例如FACS)方法。在某些实施方式中，通过使用流式细胞术方法可以适当地确定KD值。
本申请中的“阻断结合”或“竞争性同样的表位”的能力是指抗体或其抗原结合片段将两个分子间结合(例如人CD19和抗CD19抗体)的相互作用抑制到任何可检测的程度的能力。在某些实施方式中，阻断两个分子间结合的抗体或抗原结合片段可将两个分子间结合的相互作用抑制至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。在某些实施方式中，这样的抑制作用可以大于60％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％或大于90％。
本申请中使用的“表位”是指抗原分子中与抗体结合的那部分氨基酸或原子基团。如果两种抗体表现出对抗原的竞争性结合，则可能结合抗原上相同或密切相关的表位。例如，如果抗体或其抗原结合片段对参照抗体结合至抗原(例如人/猴CD19)的阻断达到至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％，那么所述抗体或其抗原结合片段可以被认为与所述参照抗体结合相同/密切相关的表位。
本领域的技术人员将认识到，无需过度的实验即可判断人单克隆抗体是否与本申请所述的抗体(例如小鼠单克隆抗体WBP7011-4.34.11、WBP7011-4.87.6、WBP7011_4.155.8、WBP7011_4.56.1、WBP7011-4.15.10、WBP7011-4.100.1、WBP7011-4.106.3、WBP7011_4.108.3、WBP7011_4.191.6、WBP7011_4.194.10、WBP7011_4.231.5和人源化抗体W7011-4.34.11-z1-m5、W7011-4.87.6-z1(N-S)和W7011-4.155.8-z1-P15)结合至相同的表位，通过确定前者是否阻止后者与CD19抗原多肽结合。如果测试抗体与本申请所述的抗体竞争，显示为本申请所述的抗体与CD19抗原多肽的结合减少，则这两种抗体与相同或密切相关的表位结合。或者如果本申请所述的抗体抑制测试抗体与CD19抗原多肽的结合，则这两种抗体与相同或密切相关的表位结合。
本申请使用的抗体名称中的符号具有不同代表意义：“mIgG2”是指具有小鼠IgG2同种型恒定区的抗体；“uIgG1”是指具有人IgG1同种型恒定区的抗体；“K”或“L”是指所述抗体使用κ轻链或λ轻链。
在本申请中当“保守替代”用于氨基酸序列时，是指将一个氨基酸残基用另一个具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基替代。例如，可以在疏水侧链氨基酸残基间(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile)、中性亲水侧链残基间(例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)、酸性侧链残基间(例如Asp、Glu)、碱性侧链氨基酸间(例如His、Lys和Arg)或方向侧链残基间(例如Trp、Tyr和Phe)进行保守替代。本领域已知保守替代通常不会引起蛋白构象结构的显著变化，因此能够保留蛋白质的生物活性。
本申请所述的术语“同源”和“同源的”可以互换使用，指当最佳比对时核酸序列(或其互补链)或氨基酸序列具有与另一条序列至少80％(如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的同一性。
当“百分比序列同一性”用于氨基酸序列(或核酸序列)时，是指在进行序列比对，并且必要时引入间隔使相同氨基酸(或核酸)数目达到最多后，在候选序列中，与参比序列相同的氨基酸(或核酸)残基占所述候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。所述氨基酸残基的保守替代可以认为或可以不认为是相同残基。可以通过本领域公开的工具，例如BLASTN、BLASTp(美国国家生物技术信息中心网站(NCBI)，也可参见Altschul S.F.等，J.Mol.Biol.，215:403–410(1990)；Stephen F.等，Nucleic Acids Res.，25:3389–3402(1997))、ClustalW2(欧洲生物信息研究所网站，可参见Higgins D.G.等，Methods inEnzymology，266:383-402(1996)；Larkin M.A.等，Bioinformatics(英国牛津)，23(21):2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，对序列进行比对以确定氨基酸(或核酸)序列的百分比序列同一性。本领域技术人员可以使用所述工具的默认参数或根据比对的需要适当调整参数，例如通过挑选合适的算法。
本申请中使用的“效应功能”是指抗体的Fc区与其效应器例如C1复合体和Fc受体结合的生物活性。示例性的效应功能包括抗体与C1复合体上的C1q相互作用诱导的补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体的Fc区与效应细胞上的Fc受体结合诱导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及吞噬。
本申请中使用的“内化”或“能够被内化”的抗体是在细胞表面上与其抗原结合之后被该细胞摄取的抗体。在一些实施方式中，本申请所述的抗体及其片段可以至少在一定程度上被在其表面表达CD19的细胞内化。例如，在一些实施方式中，本申请所述的抗CD19抗体可以在与表达在细胞表面上的CD19结合后被B淋巴细胞内化。内化可以在体外或体内发生。为了治疗中的应用，内化可以在体内发生。抗原在与哺乳动物细胞结合后是否发生内化可以通过各种检验确定，包括如下实施例中所记述的(例如Fab-Zap方法)。检测抗体是否内化进入细胞的方法还描述于美国专利号7,619,068，其通过引用整体并入本申请。在一些实施方式中，能够被内化的抗体及其抗原结合片段可以与抗癌剂(例如在内化后杀死细胞的细胞毒性部分)相连接或缀合。依据抗体或抗体缀合物的效力，在某些情况下，将单个抗体分子摄入细胞足以杀死与抗体结合的靶细胞。例如，某些毒素杀灭效力很高，将与抗体缀合的该毒素的一个分子内化即足以杀死肿瘤细胞。
对某种状况的“治疗”或“疗法”包括预防或减轻某种状况，降低某种状况兴起或发展的速度，减少发展出某种状况的风险，预防或延迟与某种状况相关的症状发展，减少或终止与某种状况相关的症状，产生某种状况的完全或部分的逆转，治愈某种状况，或以上的组合。
“被分离”的物质已经经人工由自然状态改变。如果自然界中出现某种“被分离”的物质或成分，那么其已经被改变或脱离其原始状态，或二者均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在的多核苷酸或多肽是未被分离的，但如果这些多核苷酸或多肽与之在天然状态下共存的物质足够分离并以足够纯的状态存在，则可以认为是“被分离”。被分离“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，是指被分离的核酸分子的序列。在某些实施方式中，“分离的抗体或其抗原结合片段”是指的纯度为至少60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗体或抗原结合片段，其由电泳方法(如SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳)，或色谱法(如离子交换色谱或反相HPLC)确定。
本发明中“载体”是指，可将编码某蛋白的多核苷酸操作性地插入其中并使该蛋白获得表达的一种运载工具。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。载体可以是表达载体或克隆载体。本申请提供的载体(例如表达载体)含有本申请所述的编码抗原或其抗原结合片段的核酸序列、至少一个可操作地连接至所述核酸序列的启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)，以及至少一个选择标记。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
本发明中“宿主细胞”是指导入外源多核苷酸和/或载体的细胞。
本申请中使用的“与CD19相关的疾病或状况”是指由CD19提高或减少的表达或活性引起、恶化，或通过其他方式产生联系的任何疾病或状况。在一些实施方式中，与CD19相关的状况为B细胞淋巴瘤，可选地为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，其中所述非霍奇金淋巴瘤包括：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞性淋巴瘤(慢性淋巴细胞白血病，CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)，或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。
本申请中使用的“癌症”是指以恶性细胞生长或肿瘤、异常增生、浸润或转移为特征的任何医学状况，并且包括实体肿瘤和例如白血病的非实体癌症(血液恶性肿瘤)。本申请中使用的“实体瘤”是指肿瘤和/或恶性细胞的实体团块。癌症的实例包括但不限于非小细胞肺癌(鳞状/非鳞状)、小细胞肺癌、肾细胞癌、结直肠癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌(包括基底乳腺癌、乳腺导管内癌和乳腺小叶癌)、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、胸腺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、mycoses fungoids、梅克尔细胞癌、肝细胞癌(HCC)、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤以及其他肉瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、淋巴恶性肿瘤、基底细胞癌、腺癌、肝腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、精原细胞瘤、经典型霍奇金淋巴瘤(CHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富于T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、真性红细胞增多症、肥大细胞源性肿瘤、EBV阳性和阴性PTLD、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞性淋巴瘤(慢性淋巴细胞白血病，CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、浆母细胞淋巴瘤、淋巴结外NK/T细胞淋巴瘤、鼻咽癌、HHV8相关原发渗出淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)、重链疾病、骨髓增生异常综合症、多毛细胞白血病和脊髓发育不良、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
“药用可接受的”是指所指的运载体、溶媒、稀释剂、赋形剂和/或盐，总的来说在化学上和/或在物理上与制剂中的其他配料相兼容，并在生理上与接受者相兼容。
抗CD19抗体
本申请提供包含选自下组的抗CD19抗体的一个或多个(例如1、2、3、4、5或6个)CDR序列的抗CD19抗体及其抗原结合片段：WBP7011-4.34.11、WBP7011-4.87.6、WBP7011_4.155.8、WBP7011_4.56.1、WBP7011-4.15.10、WBP7011-4.100.1、WBP7011-4.106.3、WBP7011_4.108.3、WBP7011_4.191.6、WBP7011_4.194.10、WBP7011_4.231.5、W7011-4.34.11-z1-m5、W7011-4.87.6-z1(N-S)和W7011-4.155.8-z1-P15。在本申请全文中，当涉及抗体名称时，术语“WBP7011”与“W7011”可互换使用。例如，抗体WBP7011-4.34.11也被指代为W7011-4.34.11，并且该名称指代同一抗体。
本申请中使用的“WBP7011-4.34.11”是指具有如SEQ ID NO:94所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:96所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
本申请中使用的“WBP7011-4.87.6”是指具有如SEQ ID NO:98所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:100所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
本申请中使用的“WBP7011_4.155.8”是指具有如SEQ ID NO:102所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:104所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
本申请中使用的“WBP7011_4.56.1”是指具有如SEQ ID NO:106所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:96所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
本申请中使用的“WBP7011-4.15.10”是指具有如SEQ ID NO:108所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:96所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
本申请中使用的“WBP7011-4.100.1”是指具有如SEQ ID NO:110所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:96所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
本申请中使用的“WBP7011-4.106.3”是指具有如SEQ ID NO:112所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:96所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
本申请中使用的“WBP7011_4.108.3”是指具有如SEQ ID NO:114所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:96所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
本申请中使用的“WBP7011_4.191.6”是指具有如SEQ ID NO:116所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:96所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
本申请中使用的“WBP7011_4.194.10”是指具有如SEQ ID NO:118所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:120所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
本申请中使用的“WBP7011_4.231.5”是指具有如SEQ ID NO:122所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:96所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
本申请中使用的“W7011-4.34.11-z1-m5”是指基于WBP3311_2.166.48的人源化抗体，其包含如SEQ ID NO:124所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:126所示的κ轻链可变区。
本申请中使用的“W7011-4.87.6-z1(N-S)”是指基于WBP3311_2.166.48的人源化抗体，其包含如SEQ ID NO:128所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:130所示的κ轻链可变区的。
本申请中使用的“W7011-4.155.8-z1-P15”是指基于WBP3311_2.166.48的人源化抗体，其包含如SEQ ID NO:132所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:134所示的κ轻链可变区的。
表1示出了这11个小鼠抗CD19抗体，以及3个人源化抗体W7011-4.34.11-z1-m5、W7011-4.87.6-z1(N-S)和W7011-4.155.8-z1-P15的CDR序列。以下还提供了重链和轻链的可变区序列。
表1
以下提供了WBP7011-4.34.11、WBP7011-4.87.6、WBP7011_4.155.8、WBP7011_4.56.1、WBP7011-4.15.10、WBP7011-4.100.1、WBP7011-4.106.3、WBP7011_4.108.3、WBP7011_4.191.6、WBP7011_4.194.10或WBP7011_4.231.5，以及人源化的W7011-4.34.11-z1-m5、W7011-4.87.6-z1(N-S)和W7011-4.155.8-z1-P15抗体的重链或κ轻链可变区序列。
WBP7011-4.34.11-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:94)：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYVIHWVKQKPGQGLEWIGYFNPYNDGTEYNEKFKAKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAKGPYYYGSSPFDYWGQGTTLTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:95)：
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAACTATGTTATTCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATTTTAATCCTTACAATGATGGTACTGAATACAATGAGAAGTTCAAAGCCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAAAGGTCCCTACTACTACGGTAGTAGCCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
WBP7011-4.34.11-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:96)：
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQVTHVPYTFGGGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:97)：
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
WBP7011-4.87.6-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:98)：
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSTYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDDDTKYNGKFKGKASLTADKSSSTAYMQLISLTSEDSAVYFCARRYFRYDYWYSDVWGAGTTVTVTS
核酸序列(SEQ ID NO:99)：
CAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTACCTATTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGATGATACTAAGTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCTCACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACCGCCTACATGCAGCTCATCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAAGATACTTTAGGTACGACTACTGGTATTCCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCACCTCA
WBP7011-4.87.6-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:100)：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPARFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCHQGNTLPLTFGAGTKLELK
核酸序列(SEQ ID NO:101)：
GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCGGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTATTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCAGCAAGATTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTACTCTCTCACCATTAGTAACCTGGAACAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCACCAGGGTAATACGCTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
WBP7011-4.155.8-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:102)：
EIQLQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYAFTSYNMYWVKQSHGKSLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCLTTAYAMDYWGQGTSVTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:103)：
GAGATCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTATCCTGCAAGGCTTCTGGTTATGCATTCACTAGCTACAACATGTACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTGATCCTTACAATGGTGATACTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTTGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGCATCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTCTCACTACGGCCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
WBP7011-4.155.8-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:104)：
QIVLTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSTVNYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTIRSVEAEDAADYYCHQWSSYPYTFGGGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:105)：
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAGGAGATCACCCTAACCTGCAGTGCCAGCTCGACTGTAAATTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACTTCTCCCAAACTCTTGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTTTTATTCTCTCACAATCAGAAGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCGATTATTACTGCCATCAGTGGAGTAGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
WBP7011_4.56.1-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:106)：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYVIHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTEYNEKFKGKATLTSDTSSSTAYMALSSLTSEDSAVYYCTRGPYYYGGSPFDYWGQGTTLTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:107)：
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAACTATGTTATACACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTGAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGGCGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGAGGACCCTATTACTACGGTGGTAGCCCCTTCGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
WBP7011_4.56.1-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:96)：
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQVTHVPYTFGGGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:97)：
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
WBP7011_4.15.10-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:108)：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWMKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTEYHEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVFYCARGPYYYGGSPFDFWGQGTTLTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:109)：
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGCCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGATGAAACAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTGAGTACCATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTTTTACTGTGCAAGAGGACCCTATTACTACGGTGGTAGCCCCTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACGGTCTCCTCA
WBP7011_4.15.10-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:96)：
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQVTHVPYTFGGGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:97)：
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
WBP7011_4.100.1-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:110)：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGAEYTEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSTVYYCARGPYYYGGSPFDYWGQGTTLTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:111)：
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATACACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTGCTGAGTACACTGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGTACTGCCTATATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTACGGTCTATTACTGTGCACGAGGACCCTATTACTACGGTGGTAGCCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
WBP7011_4.100.1-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:96)：
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQVTHVPYTFGGGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:97)：
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
WBP7011_4.106.3-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:112)：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFSSYVIHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGAEYAEKFKGKATLTSDKSSSSAYMELGSLTSEDSAVYYCARGPYYYGGSPFDYWGQGTTLTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:113)：
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCAGTAGTTATGTTATACACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTGCTGAGTATGCTGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGTTCTGCCTATATGGAGCTCGGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCACGAGGACCCTATTACTACGGTGGTAGTCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
WBP7011_4.106.3-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:96)：
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核酸序列(SEQ ID NO:97)：
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
WBP7011_4.108.3-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:114)：
EVQLQQSGPELVKPGASVEMSCKASGYTFTSYVIHWLKQKPGQGLEWIGYINPYNDGAEYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMDLNSLTSEDSAVYYCARGPYYYGSSPFDYWGQGTTLTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:115)：
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGGAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATTCACTGGTTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTGCTGAGTATAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGTACAGCCTATATGGATCTCAACAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGACCCTATTACTACGGTAGTAGCCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
WBP7011_4.108.3-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:96)：
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQVTHVPYTFGGGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:97)：
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
WBP7011_4.191.6-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:116)：
EVQLLQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYVIHWVKQRPGQGLEWIGYINPYNDGSEYSEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGPYYYGGSPFDYWGQGTTLTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:117)：
GAGGTCCAGCTGCTGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTATGTTATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTTCTGAGTACAGTGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGACCCTATTACTACGGTGGTAGTCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
WBP7011_4.191.6-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:96)：
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQVTHVPYTFGGGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:97)：
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
WBP7011_4.194.10-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:118)：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGPYYYGSSPFDYWGQGTTLTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:119)：
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAACTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGACCCTATTACTACGGTAGTAGCCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
WBP7011_4.194.10-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:120)：
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFCLQVTHVPYTFGGGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:121)：
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGACCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTAGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGACTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGCCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
WBP7011_4.231.5-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:122)：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTQYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGPYYYSPSPFDYWGQGTTLTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:123)：
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTCATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTCAGTACAATGAGAAGTTTAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGACCCTATTACTACAGTCCTAGCCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
WBP7011_4.231.5-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:96)：
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQVTHVPYTFGGGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:97)：
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
已知CDR负责抗原结合，然而已发现6个CDR并不都是不可缺少或不可改变的。换言之，可以替换或改变或修饰抗CD19抗体WBP7011-4.34.11、WBP7011-4.87.6、WBP7011_4.155.8、WBP7011_4.56.1、WBP7011-4.15.10、WBP7011-4.100.1、WBP7011-4.106.3、WBP7011_4.108.3、WBP7011_4.191.6、WBP7011_4.194.10、WBP7011_4.231.5、W7011-4.34.11-z1-m5、W7011-4.87.6-z1(N-S)或W7011-4.155.8-z1-P15中的1、2或3个CDR，而基本上保持与CD19特异性结合的亲和力。
在某些实施方式中，本申请所述的抗CD19抗体及其抗原结合片段包含抗CD19抗体WBP7011-4.34.11、WBP7011-4.87.6、WBP7011_4.155.8、WBP7011_4.56.1、WBP7011-4.15.10、WBP7011-4.100.1、WBP7011-4.106.3、WBP7011_4.108.3、WBP7011_4.191.6、WBP7011_4.194.10、WBP7011_4.231.5、W7011-4.34.11-z1-m5、W7011-4.87.6-z1(N-S)或W7011-4.155.8-z1-P15之一的重链CDR3序列。在某些实施方式中，本申请所述的抗CD19抗体和抗原结合片段包含选自由SEQ ID NO:3、9、15、21、24、27、30、33、36、39和45组成的组的重链CDR3序列。重链CDR3区位于抗原结合位点的中心，并因此被认为与抗原接触最多，而且对抗体与抗原的亲和力提供最多的自由能。此外还认为重链CDR3由于多种多样化机制在长度、氨基酸组成和构象方面是目前抗原结合位点最多样化的CDR(Tonegawa S.，Nature.302:575-81)。重链CDR3的多样化足以产生多数抗体特异性(Xu JL,DavisMM.Immunity.13:37-45)以及所需的抗原结合亲和性(Schier R等，J Mol Biol.263:551-67)。
在某些实施方式中，只要本申请所述的抗体及其抗原结合片段在可以特异性地结合至CD19，则所述的抗体及其抗原结合片段包含框架区(FR)序列。表1中所示的CDR序列获取自小鼠抗体，但其可使用本领域公知的合适方法(如重组技术)移植至任何合适物种(如小鼠、人、大鼠、兔以及其他)的任何合适的FR序列。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段是人源化的。人源化的抗体或抗原结合片段理想地在人体具有降低的免疫原性。人源化的抗体或其抗原结合片段在其可变区是嵌合的，因为非人CDR序列移植至人或基本上是人的FR序列中。抗体或抗原结合片段的人源化基本上可通过在人免疫球蛋白基因上将非人(如小鼠)CDR基因替换为对应的人CDR基因来完成(参见例如Jones等(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyen等(1988)Science 239:1534-1536)。
可以使用本领域公知的方法选择合适的人重链和轻链可变域，以达到这一目的。在一个示例性的实例中，可以使用最佳拟合的方法，其中对非人(例如啮齿动物)抗体可变域序列进行筛选，或者将其与已知的人可变域序列的数据库进行BLAST比对，并且识别出最接近非人查询序列的人序列，用作用于移植非人CDR序列的人框架(参见例如Sims等(1993)J.Immunol.151:2296；Chothia等(1987)J.Mot.Biol.196:901)。或者，可以将源自所有人抗体的共有序列的框架用于移植非人CDR(参见例如Carter等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285；Presta等(1993)J.Immunol.，151:2623)。
在某些实施方式中，本申请所述的人源化抗体或抗原结合片段除了非人的CDR序列以外，基本上全部由人序列组成。在一些实施方式中，可变区FR和恒定区(如果存在)全部或基本上来自人免疫球蛋白序列。人FR序列和人恒定区序列可以源自不同的人免疫球蛋白基因，例如，FR序列源自一个人抗体，恒定区来自另一个人抗体。在一些实施方式中，人源化抗体或抗原结合片段包含人重/轻链FR1-4。
在某些实施方式中，本申请所述的人源化抗体及其抗原结合片段包含W7011-4.34.11-z1-m5、W7011-4.87.6-z1(N-S)或W7011-4.155.8-z1-P15的一个或多个FR序列。下文的表2示出了W7011-4.34.11-z1-m5、W7011-4.87.6-z1(N-S)或W7011-4.155.8-z1-P15的FR序列。对应的天然小鼠FR序列也示于表2。下文还提供了重链和轻链可变区序列。
表2
W7011-4.34.11-z1-m5-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:124):
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYVIHWVRQAPGQGLEWMGYFNPYNDGTEYNEKFKARVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGPYYYGSSPFDYWGQGTTVTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:125):
CAGGTGCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAAGTGAAGAAGCCAGGATCCTCCGTGAAGGTCTCCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCGATTACGTGATCCACTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGGCAAGGCTTGGAGTGGATGGGGTACTTTAACCCCTACAACGATGGGACTGAGTACAATGAGAAGTTTAAAGCACGGGTGACCATTACCGCCGACAAGAGCACAAGCACAGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTCCGCAGCGAGGATACAGCCGTCTACTACTGCGCCAGAGGCCCTTACTACTATGGGTCCAGCCCCTTCGACTATTGGGGCCAGGGGACTACAGTGACTGTCAGTTCA
W7011-4.34.11-z1-m5-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:126)：
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLENSNHNTYINWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCHQVTHVPYTFGQGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:127)：
GATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTTCCTGTGACCCCAGGAGAACCAGCTTCTATCAGCTGTAGGTCCTCACAGAGCCTGGAGAACTCCAACCACAACACCTACATAAACTGGTACCTCCAGAAGCCTGGGCAGTCTCCCCAGTTGCTGATCTACAGGGTCAGCAAACGCTTCTCCGGGGTGCCCGATCGGTTTAGTGGGAGCGGGAGCGGCACAGACTTTACACTCAAGATTTCCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTCGGCGTCTATTACTGCCACCAAGTGACACACGTGCCCTACACATTCGGCCAGGGCACTAAACTGGAGATTAAG
W7011-4.87.6-z1(N-S)-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:128)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFSTYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDDDTKYSGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRYFRYDYWYSDVWGQGTTVTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:129)：
CAGGTCCAGCTTGTCCAGTCTGGAGCAGAAGTGAAGAAGCCAGGGGCTTCAGTGAAGGTGTCTTGCAAGGCTTCCGGATACGCCTTCTCCACTTACTGGATGAACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGGCAGGGCTTGGAGTGGATGGGCCAGATCTATCCCGGCGATGACGACACAAAATACAGCGGGAAGTTCAAGGGGCGGGTGACCATTACCGCCGATAAAAGCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTCAGTTCCCTGAGAAGCGAGGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCAGGAGGTACTTTCGGTACGACTACTGGTATAGCGACGTCTGGGGGCAAGGCACAACTGTCACAGTGAGCAGC
W7011-4.87.6-z1(N-S)-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:130)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKVPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCHQGNTLPLTFGQGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:131)：
GACATCCAAATGACCCAGAGCCCTTCCTCCTTGTCCGCAAGTGTGGGAGATAGAGTGACCATCACCTGCAGGGCTTCTCAGGATATCTCCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGTGCCAAAGCTCCTTATTTACTACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTCCCATCTCGCTTCAGCGGGTCAGGCAGCGGCACTGACTTTACTCTGACAATTAGCAGCCTCCAGCCTGAAGACGTCGCCACTTACTACTGTCATCAGGGGAATACACTCCCCCTGACATTCGGGCAGGGGACAAAACTGGAGATTAAG
W7011-4.155.8-z1-P15-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:132)：
QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNADTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:133)：
CAAATGCAGCTCGTCCAGTCTGGACCTGAAGTGAAGAAGCCCGGGACATCCGTCAAGGTCTCATGTAAGGCTAGCGGGTACGCATTCACTTCCTACAACATGTACTGGGTGCGCCAGGCCAGAGGACAGAGGTTGGAGTGGATCGGCTACATCGACCCATACAACGCCGATACTACCTACAATCAGAAGTTTAAAGGGCGGGTGACCATTACCCGGGATATGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCCTGACAACAGCCTATGCCATGGACTATTGGGGCCAGGGCACACTTGTGACTGTGAGCAGT
W7011-4.155.8-z1-P15-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:134)：
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:135)：
GACATCCAGCTCACCCAATCCCCTTCTTTCCTCTCCGCAAGTGTCGGAGATAGGGTGACTATCACCTGCTCAGCTTCTTCAACCGTGAACTACATGCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGGAAAGCCCCAAAGCTGCTGATCTACAGCACCTCCAATCTGGCCAGTGGAGTGCCAAGCCGGTTTAGCGGGAGCGGCTCCGGCACTGAATTCACTTTGACAATTAGCAGCCTTCAGCCTGAGGACTTTGCCACATATTACTGTCACCAGTGGTCCAGCTACCCCTACACATTCGGGCAGGGCACAAAGCTGGAGATTAAG
示例性的人源化抗CD19抗体W7011-4.34.11-z1-m5、W7011-4.87.6-z1(N-S)或W7011-4.155.8-z1-P15都保持与表达CD3的细胞(例如CD4 T细胞)特异性结合的亲和力，并且在这方面至少可与亲本小鼠抗体相当，甚至优于亲本小鼠抗体。
在一些实施方式中，源自人的FR区可以包含与其所源自的人免疫球蛋白相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，人FR的一个或多个氨基酸残基由来自亲本非人抗体的对应残基取代。这在某些实施方式中是需要的，以使人源化抗体或其片段密切接近非人亲本抗体结构。在某些实施方式中，本申请所述的人源化抗体或抗原结合片段包含在各个人FR序列中不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代，或者在重或轻链可变域的所有FR不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代。在一些实施方式中，这种氨基酸残基的变化可能仅存在于重链FR区、仅存在于轻链FR区，或在两条链上都存在。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段包含选自下组的重链可变域序列：SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:132。在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段包含选自下组的轻链可变域序列：SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:134。
在一些实施方式中，本申请所述的抗CD19抗体和抗原结合片段包含重链可变域的全部或部分，和/或轻链可变域的全部或部分。在一个实施方式中，本申请所述的抗CD19抗体和抗原结合片段为由本申请所述的重链可变区域的全部或部分组成的单域抗体。这种单域抗体的更多信息可以在现有技术中得到(参见例如美国专利号6,248,516)。
在某些实施方式中，本申请所述的抗CD19抗体及其抗原结合片段进一步包含免疫球蛋白恒定区。在一些实施方式中，免疫球蛋白恒定区包含重链和/或轻链恒定区。重链恒定区包含CH1、铰链和/或CH2-CH3区。在某些实施方式中，重链恒定区包含Fc区。在某些实施方式中，轻链恒定区包含Cκ。
在一些实施方式中，所述抗CD19抗体及其抗原结合片段具有IgG1、IgG2a或IgG2b同种型的恒定区，其具有可以通过本领域公知的各种测定来评估的减少的或耗竭的效应功能(如ADCC或CDC)，例如Fc受体结合测定、C1q结合测定和细胞裂解测定。
本申请所述的抗体和抗原结合片段的结合亲和力可以由KD值表示，其表示当抗原和抗原结合分子之间的结合达到平衡时解离速率与结合速率的比值(koff/kon)。使用本领域公知的合适的方法，包括例如流式细胞术测定，可恰当地确定抗原结合亲和力(例如KD)。在一些实施方式中，可通过流式细胞术确定不同浓度下抗体与抗原的结合，可首先将确定的平均荧光强度(MFI)对抗体浓度制图，此时通过使用Prism第5版本(GraphPad Software，圣地亚哥，CA)，将特异性结合荧光强度(Y)与抗体浓度(X)的相关性拟合至单址饱和等式：Y＝Bmax*X/(KD+X)(Scarchard分析)，可计算出KD值，其中Bmax是指测试抗体与抗原的最大特异性结合。
在某些实施方式中，本申请所述的抗CD19抗体及其抗原结合片段能够特异性地与自然或人工表达在细胞表面上的人/食蟹猴CD19结合。例如，人/食蟹猴CD19DNA序列可被克隆至表达载体内，并且随后转染并在293F细胞中表达，以使得人/食蟹猴CD19蛋白可表达在转染的293F细胞表面上。
在一些实施方式中，本申请所述的抗CD19抗体及其抗原结合片段能够以不超过5×10-9M、不超过1×10-9M、不超过9×10-10M、不超过8×10-10M、不超过7×10-10M、不超过6×10-10M、不超过5×10-10M、不超过4×10-10M、不超过3×10-10M、不超过2×10-10M或不超过1×10-10M的结合亲和力(KD)特异性地与表达在细胞表面上的人CD19结合，所述KD值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，本申请所述的抗CD19抗体及其抗原结合片段与表达在细胞表面上的食蟹猴CD19交叉反应。
抗体与表达在细胞上的CD19的结合还可以用“半最大效应浓度”(EC50)值表示，其是指观察到其最大效应(例如结合或抑制等)的50％时抗体的浓度。EC50值可通过本领域公知的方法测得，例如夹心法(如ELISA)、Western印记、流式细胞术，以及其他结合试验。在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其片段以不超过0.01nM、不超过0.02nM、不超过0.03nM、不超过0.04nM、不超过0.05nM、不超过0.1nM、不超过0.2nM、不超过0.3nM、不超过0.4nM、不超过0.5nM、不超过0.6nM、不超过0.7nM、不超过0.8nM、不超过0.9nM或不超过1nM的EC50值特异性地与表达在细胞上的人CD19结合，所述EC50值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，抗体及其抗原结合片段以与人CD19相似的结合亲和力与食蟹猴CD19结合。例如，示例性抗体WBP7011-4.34.11、WBP7011-4.87.6、WBP7011_4.155.8、WBP7011_4.56.1、WBP7011-4.15.10、WBP7011-4.100.1、WBP7011-4.106.3、WBP7011_4.108.3、WBP7011_4.191.6、WBP7011_4.194.10、WBP7011_4.225.7或WBP7011_4.231.5以与人CD19相似的亲和力或EC50值与食蟹猴CD19结合。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段以不超过0.2nM、不超过0.5nM、不超过0.8nM、不超过1nM、不超过2nM或不超过3nM的EC50值特异性地与表达在细胞上的食蟹猴CD19结合，所述EC50值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其片段以不超过1pM、不超过2pM、不超过3pM、不超过4pM、不超过5pM、不超过6pM、不超过7pM、不超过8pM、不超过9pM、不超过10pM、不超过11pM、不超过12pM、不超过13pM、不超过14pM、不超过15pM、不超过16pM、不超过17pM、不超过18pM、不超过19pM、不超过20pM、不超过21pM、不超过22pM、不超过23pM、不超过24pM、不超过25pM、不超过30pM、不超过35pM、不超过40pM、不超过45pM、不超过50pM的EC50值被表达CD19的细胞内化，所述EC50值通过Fab-Zap法测定。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其片段具有足以用于诊断和/或治疗用途的与人CD19特异结合的亲和力。许多靶向B细胞的治疗方案是通过临床使用抗人CD19单克隆抗体。
本申请所述的抗体或其片段可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、双特异性抗体、标记抗体、二价抗体或抗独特型抗体。重组抗体是在体外而不是在动物体内使用重组方法制备的抗体。
抗体变体
本申请还涵盖本申请所述的抗体及其片段的多种变体。在某些实施方式中，本申请涵盖本申请所述的示例性抗体的变体，即WBP7011-4.34.11、WBP7011-4.87.6、WBP7011_4.155.8、WBP7011_4.56.1、WBP7011-4.15.10、WBP7011-4.100.1、WBP7011-4.106.3、WBP7011_4.108.3、WBP7011_4.191.6、WBP7011_4.194.10、WBP7011_4.231.5、W7011-4.34.11-z1-m5、W7011-4.87.6-z1(N-S)或W7011-4.155.8-z1-P15的变体。
在某些实施方式中，抗体变体在表1所示的1、2或3个CDR序列中、一个或多个表2所示的FR序列中、本申请所述的重或轻链可变区序列中，和/或恒定区(例如Fc区)中包含一个或多个修饰或取代。这些抗体变体保持其亲本与CD19特异结合的亲和力，但具有一种或多种所述修饰或取代带来的所需要的特性。例如抗体变体可以具有改进的抗原结合亲和力、改进的糖基化模式、减少的糖基化风险、减少的脱氨基作用、减少的或耗竭的效应功能、改进的FcRn受体结合、提高的药代动力学半衰期、pH敏感性，和/或对缀合的兼容性(例如一个或多个引入的半胱氨酸残基)。
可以使用本领域公知的方法，例如“丙氨酸扫描诱变”，筛选亲本抗体序列以识别合适的或优选的待修饰或取代的残基(参见例如Cunningham和Wells，(1989)Science，244:1081-1085)。简要地说，可以识别靶标残基(例如带正电的残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并由不带电的或带负电的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)取代，产生被修饰的抗体，并且针对目标特性对其进行筛选。如果在一个特定的氨基酸位置上的取代表现出了目标功能性改变，则该位置可以被识别为潜在的用于修饰或取代的残基。可以通过用另一种残基(例如半胱氨酸残基、带正电荷的残基等)取代来进一步评估所述潜在的残基。
亲和力变体
亲和力变体可以含有如表1所示的一个或多个CDR序列、表2所示的一个或多个FR序列，或者本申请所述的重链或轻链可变区序列中的修饰或取代。所述亲和力变体保持亲本抗体的与CD19特异性结合的亲和力，或者甚至相对于亲本抗体具有改进的与CD19特异性结合的亲和力。在某些实施方式中，CDR序列、FR序列或可变区序列中的至少一个(或全部)取代包含保守取代。
本领域技术人员将理解，在表1和表2所示的CDR序列和FR序列中，一个或多个氨基酸残基可以被取代，而得到的抗体或抗原结合片段仍然保持与CD19结合的亲和力，或甚至具有改进的结合亲和力。可以使用本领域公知的各种方法来达到这一目的。例如，可以生成抗体变体库(如Fab或scFv变体)，并用噬菌体展示技术表达，随后针对与人CD19结合的亲和力对其进行筛选。又例如，可以使用电脑软件虚拟抗体与人CD19的结合，并识别抗体上形成结合界面的氨基酸残基。在取代中可以避开这些残基以防止结合亲和力的降低，或者可以做为取代的靶标以获得更强的结合。
在某些实施方式中，本申请所述的人源化抗体或抗原决定片段在一个或多个CDR序列和/或一个或多个FR序列中包含一个或多个氨基酸残基取代。在某些实施方式中，亲和力变体在CDR序列和/或FR序列中包含总共不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
在某些实施方式中，所述抗CD19抗体及其抗原结合片段包含1、2或3个与表1中列出的序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性的CDR序列，而同时保持相对于其亲本抗体水平相似或更高的与CD19结合的亲和力。
在某些实施方式中，所述抗CD19抗体及其抗原结合片段包含一个或多个与表2中列出的序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性的FR序列，而同时保持相对于其亲本抗体水平相似或更高的与CD19结合的亲和力。
在某些实施方式中，所述抗CD19抗体及其抗原结合片段包含一个或多个与下列序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性的可变区序列：SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ IDNO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:126、SEQ IDNO:130、SEQ ID NO:134，而同时保持相对于其亲本抗体水平相似或更高的与CD19结合的亲和力。在一些实施方式中，在选自SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:102、SEQ IDNO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:132、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:134的序列中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入或缺失。在一些实施方式中，所述取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即在FR)。
糖基化变体
本申请所述的抗CD19抗体和抗原结合片段还包含糖基化变体。可以获取该糖基化变体以提高或降低抗体或抗原结合片段糖基化的程度。
所述抗CD19抗体或其抗原结合片段可以包括一个或多个带有侧链的氨基酸残基，碳水化合物部分(例如寡糖结构)可以附接至所述侧链。抗体的糖基化通常是N连接的或O连接的。N连接的是指碳水化合物部分附接至天冬氨酸残基的侧链，例如，三肽序列中的天冬氨酸残基，如天冬氨酸-X-丝氨酸和天冬氨酸-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。O连接的糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一的糖附接至羟基氨基酸，最常见的是附接至丝氨酸或苏氨酸。对天然糖基化位点的移除可以方便地完成，例如通过改变氨基酸序列，使得存在于该序列中的上述三肽序列(对于N连接的糖基化位点)或者丝氨酸或苏氨酸残基(对于O连接的糖基化位点)中的一个被取代。用相似的方式，可以通过引入这样的三肽序列或者丝氨酸或苏氨酸残基，产生新的糖基化位点。
半胱氨酸工程化的变体
本申请所述的抗CD19抗体和抗原结合片段还涵盖半胱氨酸工程化的变体，其包括一个或多个引入的游离半胱氨酸氨基酸残基。
游离半胱氨酸残基是不为二硫键的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸工程化的变体可用于通过例如马来酰亚胺或卤乙酰基，在工程化的半胱氨酸的位点与例如细胞毒性和/或成像化合物、标签或放射性同位素，以及其他物质缀合。用于改造抗体或抗原结合片段以引入游离半胱氨酸残基的方法是本领域公知的，参见例如WO2006/034488。
Fc变体
本申请所述的抗CD19抗体和抗原结合片段还包括Fc变体，其包括一个或多个在其Fc区和/或铰链区的氨基酸残基修饰或取代。
在某些实施方式中，所述抗CD19抗体或抗原结合片段包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代改进与新生儿Fc受体(FcRn)pH依赖性的结合。这种变体在酸性pH下与FcRn结合，使其得以免于在溶酶体中降解，并且随后被转移并释放到细胞外，因此，这种变体可具有更长的药代动力学半衰期。工程化抗体及其抗原结合片段以提高与FcRn的结合亲和力的方法是本领域公知的，参见例如Vaughn,D.等，Structure，6(1):63-73，1998；Kontermann,R.等，Antibody Engineering，第1卷第27章：Engineering of the Fc regionfor improved PK，Springer出版，2010；Yeung,Y.等，Cancer Research，70:3269-3277(2010)；和Hinton,P.等，J.Immunology，176:346-356(2006)。
在某些实施方式中，所述抗CD19抗体或抗原结合片段包含一个或多个改变抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的氨基酸取代。在Fc区的CH2域的某些氨基酸残基可被取代以提高ADCC活性。可替代地或额外地，可以改变所述抗体上的碳水化合物结构，以提高ADCC活性。通过抗体工程化改变ADCC活性的方法已经记述于现有技术中，参见例如Shields RL等，JBiol Chem.2001.276(9):6591-604；Idusogie EE等，J Immunol.2000.164(8):4178-84；Steurer W.等，J Immunol.1995，155(3):1165-74；Idusogie EE.等，J Immunol.2001，166(4):2571-5；Lazar GA.等，PNAS，2006，103(11):4005-4010；Ryan MC.等，Mol.CancerTher.，2007，6:3009-3018；Richards JO.等，Mol Cancer Ther.2008，7(8):2517-27；Shields R.L.等，J.Biol.Chem，2002，277:26733-26740；Shinkawa T.等，J.Biol.Chem，2003，278:3466-3473。
在某些实施方式中，所述抗CD19抗体或抗原结合片段包含一个或多个改变补体依赖毒性(CDC)的氨基酸取代，例如通过增强或减弱C1q结合和/或补体依赖毒性(CDC)(关于其他Fc区变体的实例，参见例如WO99/51642；Duncan&Winter Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO94/29351)。
在某些实施方式中，所述抗CD19抗体或抗原结合片段包含一个或多个位于Fc区界面的氨基酸取代，以便于和/或促进异二聚体化。这些修饰包含将突起引入第一Fc多肽，以及将腔引入第二Fc多肽，其中所述突起可位于所述空腔内，以促进所述第一和第二Fc多肽的相互作用，以形成异二聚体或复合体。生成具有这些修饰的抗体的方法是本领域公知的，例如，如美国专利号5,731,168所述。
抗原结合片段
本申请还提供抗CD19抗原结合片段。抗原结合片段的多种类型是本领域公知的，并且可基于本申请所述的抗CD19抗体进行研发，包括例如其CDR和FR序列示于表1和表2的示例性抗体，及其不同的变体(如亲和力变体、糖基化变体、Fc变体、半胱氨酸工程化抗体等等)。
在某些实施方式中，本申请所述的抗CD19抗原结合片段是骆驼化单域抗体(camelized single chain domain antibody)、双功能抗体(diabody)、单链Fv片段(scFv)、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、双特异性抗体、双功能抗体(ds diabody)、纳米抗体、域抗体、单域抗体或双价域抗体。
多种技术可用于这种抗原结合片段的生产。示例性的方法包括对完整抗体进行酶消化(参见例如Morimoto等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)；以及Brennan等，Science，229:81(1985))、由宿主细胞(如大肠杆菌)重组表达(例如对于Fab、Fv和ScFv抗体片段)、如上文讨论的噬菌体展示文库筛选(例如对于ScFv)，以及化学耦合两个Fab'-SH片段以形成F(ab')2片段(Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992))。生产抗体片段的其它技术对于本领域技术人员将是显而易见的。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段是scFv。scFv的生成记述于例如WO 93/16185；美国专利号5,571,894；和5,587,458。scFv可以在氨基末端或羧基末端与效应蛋白融合以获得融合蛋白(参见例如Antibody Engineering，Borrebaeck编)。
本申请所述的抗CD19抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、双特异性抗体、标记抗体、二价抗体或抗独特型抗体。重组抗体是在体外使用重组方法而非动物制备的抗体。
在某些实施方式中，所述抗体及其抗原结合片段可用作双特异性或多价抗体或抗体-药物缀合物的基础。
双特异性抗体、多价抗体
在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段是二价、四价、六价或多价的。在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段是单特异性或双特异性的。
本申请中使用的术语“价”是指给定分子中存在特定数量的抗原结合位点。由此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗原结合分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。如果两个结合位点都用于与同一抗原或同一表位特异性结合，则二价分子可以是单特异性的。同样，三价分子可以是双特异性的，例如当两个结合位点是针对第一抗原(或表位)单特异性的，而第三个结合位点是针对第二抗原(或表位)特异性的。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段可以是单特异性的，然而是二价、三价或是价的，其具有至少两个对相同抗原或表位具有特异性的结合位点。在某些实施方式中，与单价的对应抗体相比，这具有与抗原或表位更强的的结合。在某些实施方式中，在二价抗原结合部分中，结合位点的第一价和结合位点的第二价结构上相同(即具有相同序列)或结构上不同(即具有不同序列但特异性相同)。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段是双特异性的。在一些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段具有针对CD19的第一特异性，以及第二特异性。在一些实施方式中，所述第二特异性针对CD19，但针对不同的表位。在一些实施方式中，所述第二特异性针对不同于CD19的第二抗原，而且能够在与所述第二抗原紧密靠近时促进或有助于针对表达CD19的靶细胞的免疫应答。例如，所述双特异性抗体可以将表达CD19的靶细胞与免疫细胞如T细胞或NK细胞紧密接近，由此促进免疫系统对该靶细胞的识别或消除。
本申请所述的双特异性抗体和抗原结合片段可用本领域公知的任意合适的方法制备。在传统方法中，可以在宿主细胞中共表达两个具有不同抗原特异性的免疫球蛋白重链-轻链对，以用重组方式产生双特异性抗体(参见例如Milstein和Cuello，Nature，305:537(1983))，随后通过亲和色谱纯化。
还可以使用重组方法，其中编码两个特异性的抗体重链可变域的序列分别与免疫球蛋白恒定域序列融合，随后插入表达载体，其与轻链序列的表达载体共转染至合适的宿主细胞，以重组表达所述双特异性抗体(参见例如WO 94/04690；Suresh等，Methods inEnzymology，121:210(1986))。相似地，scFv二聚体也可以重组构建，并且自宿主细胞表达(参见例如Gruber等，J.Immunol.，152:5368(1994))。
在另一种方法中，来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽可通过基因融合连接至两个不同抗体的Fab'部分。连接的抗体在铰链区被还原成四个半抗体(即单体)，并随后再氧化以形成异二聚体(Kostelny等，J.Immunol.，148(5):1547-1553(1992))。
所述两个抗原结合域还可以被缀合或交联以形成双特异性抗体或抗原结合片段。例如，一个抗体可以与生物素耦合而另一个抗体与亲和素耦合，并且生物素与亲和素之间的强连接会使所述两个抗体络合在一起，以形成双特异性的抗体(参见例如美国专利号4,676,980；WO 91/00360、WO 92/00373和EP 03089)。又例如，所述两个抗体或抗原结合片段可通过本领域公知的传统方法交联，例如，如美国专利号4,676,980所述。
双特异性的抗原结合片段可以生成自双特异性抗体，例如通过蛋白水解裂解或通过化学连接。例如，可以制备抗体的抗原结合片段(例如Fab’)，并转变为Fab'-巯基衍生物并随后与具有不同的抗原特异性的另一转变的Fab'衍生物混合并发生反应，以形成双特异性的抗原结合片段(参见例如Brennan等，Science，229:81(1985))。
在某些实施方式中，所述双特异性抗体或抗原结合片段可以在界面处改造，使得可以形成knob-into-hole连接，以促进两个不同的抗原结合位点的异二聚体化。用于本申请的“knob-into-hole”是指两个多肽(如Fc)之间的相互作用，其中一个多肽由于存在具有庞大侧链的氨基酸残基(例如酪氨酸或色氨酸)而具有突起(即“knob”)，而另一个多肽具有有小侧链氨基酸残基(例如丙氨酸或苏氨酸)位于其中的空腔(即“hole”)，并且所述突起可置于所述空腔内以促进所述两个多肽的相互作用，以形成异二聚体或复合体。用knobs-into-holes生成多肽的方法是本领域公知的，例如，如美国专利号5,731,168所述。
缀合物
在一些实施方式中，所述抗CD19抗体及其抗原结合片段与缀合物连接。缀合物是可以附接至所述抗体或其抗原结合片段的非蛋白质部分。可以设想，本申请所述的抗体或抗原结合片段可以与多种缀合物连接(参见例如“Conjugate Vaccines”，Contributionsto Microbiology and Immunology，J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr.(编)，Carger Press，纽约(1989))。这些缀合物可以通过共价结合、亲和结合、嵌入、协同结合(coordinatebinding)、络合、结合、混合或加入等其他方式与所述抗体或抗原结合片段连接。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段经连接子与一个或多个缀合物连接。在某些实施方式中，所述连接子是腙连接子、二硫连接子、双官能连接子、二肽连接子、葡萄糖醛酸连接子、硫醚连接子。
在某些实施方式中，本申请中公开的抗CD19抗体和抗原结合片段可以工程化以在表位结合部分之外含有特定位点，所述特定位点可以用于与一个或多个缀合物结合。例如，该位点可以包括一个或多个反应性的氨基酸残基(例如半胱氨酸或组氨酸残基)，以便于与缀合物的共价连接。
所述缀合物可以是治疗剂(例如化疗剂)、放射性同位素、可检测的标记(例如镧系元素、发光标记、荧光标记或酶-底物标记)、药代动力学修饰部分或纯化部分(如磁珠或纳米颗粒)。
可检测的标记的例子可以包括荧光标记(例如荧光素、罗丹明、丹磺酰、藻红蛋白或德克萨斯红)、酶-底物标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素、其他镧系元素、发光标记、发色团部分、地高辛、生物素/亲和素、DNA分子或金以进行检测。
放射性同位素的实例可以包括123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi和32P。放射性同位素标记的抗体可用于受体靶向的成像实验。
在某些实施方式中，所述缀合物可以是药代动力学修饰部分，如PEG，其帮助延长抗体的半衰期。其他适宜的聚合物包括例如羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇共聚物等。
在某些实施方式中，所述缀合物可以是纯化部分，如磁珠或纳米颗粒
抗体-药物缀合物
在某些实施方式中，本公开提供抗体-药物缀合物(ADC)，其包含上文所述的任意与细胞毒性剂(如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素或放射性同位素(即放射缀合物))缀合的抗CD19抗体或抗原结合片段。
抗体-药物缀合物可用于细胞毒性剂的局部递送，例如在癌症治疗中。这使得可以将细胞毒性剂定向递送至肿瘤，并在其中进行胞内积累。这一效果格外有意义，因为如果将这些未缀合的细胞毒性剂全身施用对正常细胞和要消除和肿瘤细胞，可能都造成无法接受的水平的毒性(Baldwin等(1986)Lancet pp.(1986年3月15日):603-05；Thorpe，(1985)“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”inMonoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications，A.Pinchera等(编)，pp.475-506；Syrigos和Epenetos(1999)Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz和Springer(1997)Adv.Drg Del.Rev.26:151-172；美国专利号4,975,278)。
在某些实施方式中，所述细胞毒性剂可以是对细胞有害的或可能损坏或杀死细胞的任何试剂。在某些实施方式中，所述细胞毒性剂任选地是细胞毒素、DNA烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂或其他抗癌药物。
酶活性细胞毒素的实例包括细菌毒素和植物毒素，例如白喉毒素、外毒素A链(来自绿脓杆菌)、蓖麻毒素、相思豆毒素、蒴莲根毒素、八叠球菌毒素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PARI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素以及单端孢霉烯族毒素(参见例如WO 93/21232)。作用本领域公知的方法(例如，如Vitetta等(1987)Science，238:1098所述)，这种大分子毒素可与本申请所述的抗体或抗原结合片段缀合。
所述细胞毒性剂还可以是小分子毒素和药物，如格尔德霉素(Mandler等(2000)Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581；Mandler等(2002)BioconjugateChem.13:786-791)、美登素类化合物(EP 1391213；Liu等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623)、卡奇霉素(Lode等(1998)Cancer Res.58:2928；Hinman等(1993)CancerRes.53:3336-3342)、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊甙、长春新碱、长春碱、长春地辛、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物、抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)、卡奇霉素、美登素类化合物、海兔毒素、奥利他汀、单端孢霉烯族毒素和CC1065，及其具有细胞毒性活性的衍生物。
所述细胞毒性剂还可以是高放射性同位素。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Sm153、Bi212、P32、Pb212，以及Lu的放射性同位素。放射性同位素与抗体缀合的方法是本领域公知的，例如经由适宜的配体试剂(参见例如WO94/11026；Current Protocols inImmunology，卷1和卷2，Coligen等编，Wiley-Interscience，纽约，N.Y.,Pubs.(1991))。配体试剂具有可以与放射性同位素金属结合、螯合或以其他方式络合的螯合配体，还具有易与抗体或抗原结合片段的半胱氨酸的巯基起反应的官能团。示例性的螯合配体包括DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA和TETA(Macrocyclics，德州达拉斯)。
本申请所述的抗体(或抗原结合片段)与细胞毒性剂的缀合物可以使用各种双功能蛋白连接剂产生。示例性的双功能连接试剂包括如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸(SPDP)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸(SMCC)、亚氨基硫代烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰)己二胺)、双重氮盐衍生物(如双(对重氮苯甲酰)乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
在某些实施方式中，本申请所述的ADC用选自下组的连接试剂制备：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPRH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基EMCS、磺基GMBS、磺基KMUS、磺基MBS、磺基SIAB、磺基SMCC和磺基SMPB，以及SVSG(琥珀酰亚胺-(4-乙烯砜)苯甲酸)。这些连接试剂可在市场上购得(例如来自Pierce生物技术公司，美国伊利诺伊罗克福德，参见2003-2004Applications Handbook and Catalog第467-498页)。
在某些实施方式中，所述接头在特定的生理环境下可裂解，从而有助于释放细胞内的细胞毒性药物。例如，所述接头可以是酸不稳定的接头、对肽酶敏感的接头、光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等，Cancer Research52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。在一些实施方式中，所述接头可以包含氨基酸残基，如二肽、三肽、四肽或五肽。所述接头中的所述氨基酸残基可以是天然的或非天然存在的氨基酸残基。这种接头的实例包括：缬氨酸-瓜氨酸(ve或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)、甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-yal-cit)、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)、缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(“vc-PAB”)。在氨基酸接头组分对酶裂解的选择性方面，可以通过特定的酶进行设计和优化，例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D，或纤溶蛋白酶。
在某些实施方式中，在本申请所述的ADC中，抗体(或抗原结合片段)以约1到约20、约1到约6、约2到约6、约3到约6、约2到约5、约2到约4或约3到约4的抗体：药剂比例，与一个或多个细胞毒性剂缀合。
本申请所述的ADC可以通过本领域公知的任意适宜的方法制备。在某些实施方式中，所述抗体(或抗原结合片段)的亲核基团首先与双功能接头试剂反应，并随后与所述细胞毒性剂连接，或者反方向进行，即所述细胞毒性剂的亲核基团首先与双功能接头反应，并随后与所述抗体连接。
在某些实施方式中，所述细胞毒性剂可以含有(或被修饰为含有)巯基反应性的官能团，其可以与本申请所述的抗体或抗原结合片段的游离半胱氨酸的半胱氨酸巯基发生反应。示例性的巯基反应性的官能团包括例如马来酰亚胺、碘乙酰胺、吡啶二硫、卤乙酰基、琥珀酰亚胺酯(例如NHS，N-羟基琥珀酰亚胺)、异硫氰酸酯、磺酰氯、2,6-二氯三嗪、五氟苯基酯或亚磷酰胺(Haugland，2003，Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probesand Research Chemicals，Molecular Probes,Inc.；Brinkley，1992，BioconjugateChem.3:2；Garman，1997，Non-Radioactive Labelling:A Practical Approach，AcademicPress，伦敦(1990)Bioconjugate Chem.1:2；Hermanson,G.in Bioconjugate Techniques(1996)Academic Press，圣地亚哥，pp.40-55，643-671)。
所述细胞毒性剂或所述抗体在相缀合以形成所述ADC之前，可以与连接试剂反应。例如，可以预先形成、分离、纯化和/或表征细胞毒性剂的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)，或者，NHS可以原位形成并与抗体的亲核基团反应。通常，所述缀合物的羧基形式通过与下列试剂的某些组合反应而激活：碳二亚胺试剂(例如二环己基碳二亚胺；二异丙基碳二亚胺)或脲试剂(例如TsTu(O--(N-琥珀酰亚胺)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐)、HBTU(O-苯并三唑-1-基)-N,N,N'N'-四甲基脲六氟磷酸盐)或HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐))、激活剂(如1-羟基苯并三唑(HOBt)，以及给出NHS酯的N-羟基琥珀酰亚胺。在某些情况下，可以通过原位激活和反应连接所述细胞毒性剂和所述抗体，以一步形成所述ADC。其他激活和连接试剂包括TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1-1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)、TFFH(N,N',N”,N”'-四甲基脲-2-氟-六氟磷酸盐)、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基膦六氟磷酸盐)、EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧羰基-1,2-二氢喹啉)、DCC(二环己基碳二亚胺)；DIPCDI(二异丙基碳二亚胺)、MSNT(1-(均三甲苯基-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1,2,4-三唑)，以及芳基磺酰卤化物(例如三异丙基苯磺酰氯化物。在另一个实例中，所述抗体或抗原结合片段可以与生物素缀合，随后与亲和素缀合的第二缀合物间接缀合。
美登素和美登素类化合物
在一个实施方式中，本申请所述的任意抗CD19抗体或抗原结合片段与一个或多个美登素类分子缀合。美登素类化合物是通过抑制微管蛋白的聚合作用的有丝分裂抑制剂。
适于用作美登素类药物部分的美登素化合物(如美登醇和C-3美登醇酯)是本领域公知的，并且其可以依照已知方法从天然来源中分离、使用基因工程技术生产(参见Yu等(2002)PNAS 99:7968-7973)或者可以依照已知方法合成制备美登醇和美登醇类似物(参见例如美国专利号4,137,230；4,248,870；4256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533)。
适宜的美登素类化合物公开于例如美国专利号5,208,020，以及本申请提及的其他专利或非专利出版物中。示例性的美登素类化合物为美登醇，以及在美登醇分子的芳环中或在其他位置上被修饰的美登醇类似物，参见例如C-49-去氯(美国专利号4,256,746)；C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美国专利号4,361,650和4,307,016)；C-20-去甲氧基、C-20-酰氧基(--OCOR)+/-去氯(美国专利号4,294,757)、C-9-SH(美国专利号4,424,2190)；C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(美国专利号4,331,598)；C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利号4,450,254)；C-15-羟基/酰氧基(美国专利号4,364,866)；C-15-甲氧基(美国专利号4,313,946和4,315,929)；C-18-N-去甲基(美国专利号4,362,663和4,322,348)；以及4,5-去氧基(美国专利号4,371,533)。在某些实施方式中，本申请所述的与所述抗体缀合的美登素类化合物是DM1(N2'-去乙酰-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素)或DM4(N2'-去乙酰-N2'-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-6-甲基美登素)。
可以通过将抗体化学连接至美登素类分子来制备抗CD19抗体-美登素类化合物缀合物，而所述抗体或所述美登素类分子的生物活性都不会显著减少。参见例如美国专利号5,208,020(其公开内容明确地通过引用并入本申请)。在某些实施方式中，每个抗体分子平均与1至4个、2至4个或3至4个美登素类分子缀合，而对所述抗体的功能或溶解性无负面影响
美登素类部分可经由本领域公知的任意适宜的接头，与抗体或抗原结合片段连接，参见例如美国专利号5,208,020、6,441,163或欧洲专利0 425 235 B1、Chari等，CancerResearch 52:127-131(1992)，以及US 2005/0169933 A1，其公开内容明确地通过引用并入本申请。本申请所述的ACD中的接头包括二硫基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团。在某些实施方式中，本申请所述的ACD中的接头是双功能蛋白耦合剂，如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸(SPDP)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸(SMCC)、N-琥珀酰亚胺-4-(2-吡啶巯基)戊酸(SPP)、亚氨基硫杂(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰)己二胺)、双重氮盐衍生物(如双(对重氮苯甲酰)乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)，以及组氨反应性的氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
根据接头的不同类型，所述接头可以在各种位置附接至所述美登素类分子。例如，使用传统的耦合技术，可以通过与羟基反应形成酯接头。所述反应可以发生在具有羟基的C-3位置、用羟甲基修饰的C-14位置、用羟修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方式中，所述接头形成于美登醇或美登醇类似物的C-3位置。
奥利他汀和海兔毒素
在一个实施方式中，本申请所述的任意抗CD19抗体或抗原结合片段与一个或多个海兔毒素、海兔毒素肽类似物及衍生物，或奥利他汀缀合(美国专利号5,635,483；5,780,588)。海兔毒素和奥利他汀推测通过干扰微管动力学、GTP水解，以及核分裂和细胞分裂，而具有抗癌和抗真菌活性(参见例如美国专利号5,663,149；Pettit等(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965；Woyke等(2001)Antimicrob.Agents andChemother.45(12):3580-3584)。
示例性的奥利他汀包括MMAE和MMAF。所述奥利他汀/海兔毒素药物部分可以依照以下方法制备：US 2005/0238649；美国专利号5,635,483；美国专利号5,780,588；Pettit等(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465；Pettit等(1998)Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit,G.R.等，Synthesis，1996，719-725；Pettit等(1996)J.Chem.Soc.PerkinTrans.1 5:859-863；和Doronina(2003)Nat Biotechnol 21(7):778-784。
所述海兔毒素或奥利他汀药物部分可以通过所述肽药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端附接至所述抗体(WO 02/088172)。
嵌合抗原受体(CAR)组合物
本公开还提供嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包含本申请所述的与CD19和T细胞活化部分特异性结合的抗体的抗原结合片段。在一些实施方式中，所述T细胞活化部分包含TCR的天然T细胞活化部分。在一些实施方式中，所述T细胞活化部分包含TCR的跨膜域和胞内信号域。
抗原结合片段
在一些实施方式中，所述抗原结合片段可以是来源于本申请所述的任意一个或多个抗体的与CD19结合的任意片段，包括但不限于抗原识别域。在一些实施方式中，所述抗原结合片段最好来源于所述CAR最终会用于其中的同一物种。例如用于人时，用于所述CAR的抗原结合片段最好来源于人抗体或人源化抗体。在一些实施方式中，所述抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。在一些实施方式中，所述抗原结合片段可以以多种其他的形式存在，包含例如Fv、Fab和(Fab')2，以及双功能的(即双特异性的)杂合抗体片段(例如Lanzavecchia等，Eur.J.Immunol.17，105(1987))。
跨膜域
关于跨膜域，在各种实施方式中，所述CAR设计为包含与所述CAR的胞外域融合的跨膜域。在一个实施方式中，使用与所述CAR中的一个域天然相连的跨膜域。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸取代修饰所述跨膜域，以避免该跨膜域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜域结合，从而使与受体复合体的其他部件的相互作用最小化。
所述跨膜域可以来源于天然或合成的来源。当所述来源是天然的时，所述域可以来源于任意膜结合或跨膜蛋白。本发明中特定用途的跨膜域可以来源于下组(即至少包含下组的跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在一些情况下，也可以采用多种人铰链，包括人Ig(免疫球蛋白)铰链。
在一个实施方式中，所述跨膜域可以是合成的，此时其包含主要为疏水性的残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一个方面，在合成的跨膜域的两端各可见苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，长度为2至10个氨基酸之间的短寡肽或多肽接头可以形成所述CAR的跨膜域和胞质信号域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供格外适宜的接头。
信号传导域
本公开所述的CAR的信号传导域负责对所述CAR所在的T细胞的至少一个正常TCR效应功能的激活。T细胞的TCR效应功能可以是例如细胞杀伤活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此术语“信号转导域”是指转导TCR效应功能信号并且引导T细胞进行指定功能的蛋白的部分。虽然通常可以采用整个胞内信号转导域，但在很多情况下，没有必要使用整条链。对于使用胞内信号转导域的截短的部分的情况，该截短的部分只要能转导效应功能信号，则可以代替完整链使用。术语胞内信号域因而意在包括胞内信号转导域的足以转导TCR效应功能信号的任意截短的部分。
用于本公开所述的CAR的胞内信号域的实例包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，以及在抗原受体参与后协同作用以启动信号转导的共受体，以及这些序列的任意衍生物或变体，及具有相同功能性性能的任意合成的序列。
已知由TCR单独生成的信号不足以使T细胞完全活化，而还需要二级或共刺激信号。因此，T细胞活化可以说是由两类不同的胞质信号序列介导的：一类通过TCR启动抗原依赖的初级活化的(初级胞质信号序列)，一类以抗原非依赖的方式作用，以提供二级或共刺激信号(二级胞质信号序列)。
初级胞内信号转导序列以刺激性的方式或以抑制性的方式调节TCR复合体的初级活化。以刺激性的方式作用的初级胞内信号序列可以含有称为免疫受体基于酪氨酸的活化基序或ITAM的信号基序。
在本发明中有特别用途的含有初级胞质信号序列的ITAM的实例包括来源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的ITAM。特别优选地，本发明所述的CAR中的胞质信号分子包含来源于CD3-ζ的胞质信号序列。
在一个优选的实施方式中，所述CAR的胞内信号域设计为仅包含CD3-ζ信号域本身，或包含其与可用于本公开所述的CAR的背景下的任意其他理想的胞质域的组合。例如，所述CAR的胞内信号域可包含CD3ζ链部分和共刺激信号区。所述共刺激信号区是指所述CAR的包含共刺激分子的胞内域的部分。共刺激分子是细胞表面分子，而非抗原受体或其配体，其是用于淋巴细胞对抗原的有效应答所需的。这种分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能关联抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，以及与CD83特异性结合的配体等。所述CD3ζ链部分和所述共刺激信号区可以以随机的或指定的顺序彼此连接。任选地，例如长度为2至10个氨基酸之间的短寡肽或多肽接头可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸的二联体提供格外适宜的接头。
在一个方面，本公开进一步提供编码本申请所述的CAR的核酸序列，包含编码本申请所述的抗体的抗原结合片段的第一多核苷酸序列，以及任选地，编码TCR的跨膜域和胞内信号传导域的第二多核苷酸序列。在一些实施方式中，编码所述抗原结合片段的序列与编码TCR的所述跨膜域和所述信号传导域的序列可操作地连接。在一些实施方式中，所述信号传导域包含共刺激信号区和/或CD3ζ链部分。编码所需分子的核酸序列可以使用本领域公知的重组方法获得，例如使用标准技术，通过筛选来自表达所述基因的细胞的文库、通过从已知包括所述基因的载体中获得所述基因，或者通过从含有所述基因细胞和组织中直接分离。或者，目标基因可以通过合成产生，而不是通过克隆产生。
在一个方面，本公开提供包含编码本申请所述的CAR的核酸序列的载体。在一些实施方式中，所述载体是可被直接转导入细胞的表达本公开所述的CAR的逆转录病毒和慢病毒载体构建，或可被直接转导入细胞的RNA构建。
在一个方面，本公开提供表达本申请所述的CAR的分离的宿主细胞。
在一个方面，本公开进一步提供一种用于在个体中激活T细胞介导的针对表达CD19的靶标的免疫应答的方法，所述方法包含向所述个体施用有效量的表达本申请所述的CAR的T细胞。
多核苷酸和方法
本公开提供编码所述抗CD19抗体及其抗原结合片段的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸包含一个或多个如下所示的编码示例性的抗体的可变区的核苷酸序列：SEQ ID NO：95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133和/或135。使用传统的步骤，可以容易地对编码所述单克隆抗体的DNA进行分离和测序(例如通过使用能够与编码所述抗体的重和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。编码的DNA也可以通过合成方法获得。
使用本领域公知的重组技术，可以将编码所述抗CD19抗体及其抗原结合片段的分离的多核苷酸(例如包括如下所示的序列：SEQ ID NO：95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133和/或135)插入载体，用于进一步的克隆(DNA的扩增)或用于表达。多种载体可供选择。载体组分通常包括但不限于下列的一种或多种：信号序列、复制起始点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)和转录终止序列。
在一些实施方式中，载体体系包括哺乳动物、细菌、酵母体系等，并且包含质粒，例如但不限于pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pCMV、pEGFP、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMD18-T、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS420、pLexA、pACT2.2等，以及其他可从实验室获得或市售的载体。适宜的载体可以包括质粒或病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
可以将包含编码所述抗体或抗原结合片段的多核苷酸序列的载体引入宿主细胞，用于克隆或基因表达。本申请中适用于克隆或表达所述的载体中的DNA的宿主细胞为上述的原核、酵母或高等真核细胞。适用于本申请用途的原核细胞包括真细菌，如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，例如，肠杆菌科，如，大肠杆菌，肠杆菌属，欧文氏菌属，克雷白氏杆菌属，变形杆菌属，沙门氏菌属，如，鼠伤寒沙门(氏)杆菌，沙雷氏菌属，如，粘质沙雷氏菌，以及志贺氏菌属，及杆菌属如，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，假单胞菌如，绿脓杆菌和链霉菌。
除了原核细胞以外，真核微生物如丝状真菌或酵母也可作宿主细胞克隆或表达编码抗CD19抗体的载体。酿酒酵母，或面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。但是，许多其他属、种和株都比较常用且在本发明中适用，如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母属宿主如，乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(ATCC 16,045)、魏氏克鲁维酵母(ATCC 24,178)、克鲁雄酵母(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母；解脂耶氏酵母(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(EP183,070)；假丝酵母；里氏木霉(EP 244,234)；链孢霉；西方许旺酵母，如：西方许旺酵母；和丝状真菌，如：脉孢菌、青霉菌、弯颈霉和曲霉菌，如：钩巢曲霉和黑曲霉。
本发明中提供的适用于表达糖基化抗体或其抗原结合片段的宿主细胞由多细胞生物衍生得到。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已发现多种杆状病毒株(baculoviral strains)及其变体以及对应的许可性昆虫宿主细胞(permissive insecthost cells)，来自于诸如以下的宿主：草地夜蛾(毛虫)、埃及斑蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)及家蚕。多种用于转染的病毒株为公众可得，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒的Bm-5变种，这些病毒都可在本发明中使用，特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛花、西红柿和烟草的植物细胞培养也可用作宿主。
但是，最感兴趣的是脊椎细胞，且脊椎细胞的培养(组织培养)已经成为常规操作。可用的哺乳动物宿主细胞实例有，SV40转化的猴肾细胞CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(293或悬浮培养的293细胞亚克隆，Graham等，J.Gen Virol.36:59(1977))；幼地鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；及人肝癌细胞系(Hep G2)。在某些优选的实施方式中，所述宿主细胞是293F细胞。
用上述的可产生抗CD19抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并将其在常规的营养培养基中培养，所述营养培养基经修饰后适宜于诱导启动子、选择转化细胞或扩增编码目的序列的基因。在另一实施方式中，所述抗体可通过本领域公知的同源重组的方法制得。
本发明中用于产生所述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售的培养基如Ham's F10(Sigma)、最低基本培液(MEM，(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)及Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)，Sigma)可用于培养所述宿主细胞。另外，任何在Ham等，Meth.Enz.58:44(1979)，Barnes等Anal.Biochem.102:255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利申请Re.30,985中说明的培养基都可以用作所述宿主细胞的培养基。这些培养基都可添加必要的激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、氯化钙、氯化镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷酸和胸腺嘧啶)、抗生素(如庆大霉素)、微量元素(定义为终浓度通常在微摩尔范围无机化合物)，和葡萄糖或与之等同的能量源。所述培养基还可含有本领域公知的适当浓度的任何其他必要的添加剂。所述培养基的条件，如温度、pH值等类似条件，为选择用于表达的宿主细胞此前所使用的条件，为普通技术人员所熟知。
从所述细胞中制得的抗CD19抗体或其抗原结合片段可采用纯化方法进行纯化，例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱柱、硫酸铵沉淀、盐析以及亲和色谱，其中亲合色谱为优选的纯化技术。
在某些实施方式中，固定于固相的蛋白A用于所述抗体及其抗原结合片段的免疫亲和纯化。所述抗体的种类以及所述抗体中存在任何免疫球蛋白的Fc结构域决定了蛋白A作为亲和配体是否适合。蛋白A可用于纯化基于人γ1，γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G适用于所有鼠源异构体和人γ3(Guss等，EMBOJ.5:1567 1575(1986))。琼脂糖是最常用的亲和配体附着基质，但也可选用其他基质。机械力稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯与用琼脂糖相比可实现更快的流速和更短的处理时间。如该抗体含有CH3结构域，则可用Bakerbond ABX.TM树脂进行纯化(J.T.Baker，新泽西菲利普斯堡)。也可根据需要获得的抗体确定其他蛋白纯化的技术，如离子交换柱中的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、基于阴离子或阳离子交换树脂的肝素琼脂糖凝胶色谱(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀。
在任意初步纯化步骤之后，可用低pH疏水相互作用色谱的方法处理含有感兴趣的抗体和杂质的混合物，用pH约2.5-4.5的洗涤缓冲液，优选地在低盐浓度下进行(例如，从约0到0.25M盐浓度)。
药物组合物
本申请进一步提供包含本申请所述的抗CD19抗体或其抗原结合片段或抗体-药物缀合物的药物组合物，和一个或多个药学上可接受的运载体。
用本申请中公开的药物组合物中的药学上可接受的运载体可包括，例如，药用可接受的液体、凝胶或固体载剂、水相溶媒、非水相溶媒、抗微生物物质、等渗物质、缓冲液、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、螯合剂、稀释剂、佐剂、辅料或无毒辅助物质，其他本领域公知的组分或以上的多种组合。
适用的组分可包括，例如，抗氧剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、搅味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂例如糖和环糊精。适用的抗氧剂可包括，例如，甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘油、巯基乙酸、巯基山梨醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本发明所公开，在一种含有本发明公开的抗体或其抗原结合片段的组合物中包括一种或多种抗氧剂如甲硫氨酸，可将降低所述抗体或其抗原结合片段的氧化。对氧化作用的减少可防止或减少结合亲和力的降低，从而提高抗体稳定性并延长保质期。因此，在某些实施方式中，本发明提供的组合物中含有一种或多种所述的抗体或其抗原结合片段以及一种或多种抗氧化剂例如甲硫氨酸。本发明进一步提供多种方法，通过将本发明中提供的抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧剂混合，例如甲硫氨酸，可防止所述抗体或其抗原结合片段氧化、延长其保质期和/或提高其活性。
进一步的说，药用可接受的载剂可包括，例如，水相介质如氯化钠注射液、林格氏液注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、或葡萄糖和乳酸林格注射液、非水介质例如：植物来源的不挥发性油、棉花子油、玉米油、芝麻油、或者花生油、细菌抑制或真菌抑制浓度下的抗菌物质、等渗剂如：氯化钠或葡萄糖、缓冲液如：磷酸盐或枸橼酸酸盐缓冲液，抗氧化剂如：硫酸氢钠，局部麻醉剂如：盐酸普鲁卡因，助悬剂和分散剂如：羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如：聚山梨醇酯80(吐温-80)、螯合试剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。作为载剂的抗菌剂可加入多次剂量容器中的药物组合物中，其包括酚类或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯代丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷铵和氯苯乙铵。适用的辅料可包括，例如，水、盐、葡萄糖、甘油或乙醇。适用的无毒辅助物质可包括，例如，乳化剂、pH值缓冲剂、稳定剂、增溶剂，或者醋酸钠、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或者环糊精之类的物质。
所述药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、丸剂、胶囊、片剂、持续释放制剂或粉末。口服制剂可以包括标准运载体如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
在某些实施方式中，所述药物组合物被制剂成可注射的组合物。可注射的药物组合物可以任何常规的形式制备，例如，液体溶剂、悬浮剂、乳化剂或适用于产生液体溶剂、悬浮剂或乳化剂的固体形式。注射制剂可包括现用的无菌和/或无热原溶液、使用前现与溶剂结合的无菌干燥的可溶物，如冻干粉，包括皮下片、注射即用的无菌悬浮剂、使用前现与介质结合的无菌干燥不溶产品，和无菌和/或无热原的乳剂。溶剂可以为水相或非水相。
在某些实施方式中，单位剂量的注射制剂包装在一个安瓿、一支管或一支带有针的针筒中。本领域习知，所有注射给药的制剂应为无菌无热原。
在某些实施方式中，通过将本申请中公开的抗体或其抗原结合片段溶解于某适当的溶剂中可制备无菌冻干的粉末。所述溶剂可含有一种可提高粉或由粉末制得的重组溶液的稳定性，或改善粉末或重组溶液的其他药理组分。适用的辅料包括，但不限于，水、葡萄糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他适用的物质。溶剂可含有缓冲液，如枸橼酸缓冲液、磷酸钠或磷酸钾缓冲液或其他本技术熟练人员公知的缓冲液，在一种实施方式中，缓冲液的pH为中性。在本领域公知的标准条件下进行对所述溶解进行随后的过滤除菌，然后冻干制得理想的制剂。在一种实施方式中，将所得的溶剂分装至小管中冻干。每支小管可容纳单次剂量或多次剂量的所述抗CD19抗体或其抗原结合片段或其组合物。每支小管中的装入量可略微高于每次剂量所需或多次剂量所需(例如10％过量)，从而保证取样精确和给药精确。冻干粉可在适当的条件下储存，如在约4℃到室温范围。
用注射用水将冻干粉重溶得到用于注射给药的制剂。在一种实施方式中，可将冻干粉加至无菌无热原水或其他适用的液体载剂中重溶。精确的量由选择的疗法决定，可根据经验值决定。
使用方法
本公开还提供治疗方法，所述治疗方法包含：向需要其的个体施用治疗有效量的如本申请所述的抗体或其抗原结合片段，从而治疗或预防与CD19相关的病症或状况。在一些实施方式中，所述与CD19相关的病症或状况是癌症。在一些实施方式中，所述癌症选自由B细胞淋巴瘤，任选地霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤组成的组，其中所述非霍奇金淋巴瘤包含：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞性淋巴瘤(慢性淋巴细胞白血病，CLL)或套细胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)，或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。在一些实施方式中，所述个体是人。
在另一个方面，提供在会从免疫应答的CD19的调节中受益的个体中治疗状况的方法，所述方法包含向需要其的个体施用如本申请所述的治疗有效量的抗体或抗原结合片段。
本申请所述的抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量依赖于本领域公知的多种因素，例如体重、年龄、过往病史、现用治疗、对象的健康状况和交叉感染的潜力、过敏、超敏和副作用，以及给药途径和肿瘤发展的程度。本领域熟练人员(例如医生或兽医)可根据这些或其它条件或要求按比例降低或升高剂量。
在某些实施方式中，如本申请所述的抗CD19抗体或抗原结合片段可以在治疗有效剂量约约0.01mg/kg到约100mg/kg之间给药(例如约0.01mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg)。在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段以约50mg/kg或更少的剂量施用，并且在某些这样的实施方式中，所述剂量是10mg/kg或更少、5mg/kg或更少、3mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少或0.1mg/kg或更少。在某些实施方式中，给药剂量可随治疗进程变化。例如，在某些实施方式中，初始给药剂量可比后续给药剂量高。在某些实施方式中，给药剂量在治疗进程中根据给药对象的反应进行调整。
给药方案可通过调整达到最优反应(如治疗反应)。例如，可进行单剂量给药或在一段时间分多个分隔的剂量给药。
本申请中公开的抗CD19抗体和抗原结合片段可通过本领域公知的给药方式给药，例如肠胃外给药(如，皮下注射、腹腔注射、静脉注射，包括静脉滴注，肌肉注射或皮内注射)或非肠胃外给药途径(如，口服给药、鼻腔给药、舌下给药、直肠给药或外用给药)。
在一些实施方式中，本申请中公开的抗CD19抗体或抗原结合片段可以单独给药或与一种或多种其他治疗手段或物质联合给药。例如，本发明公开的抗体和抗原结合片段可以与另一种治疗剂，例如化疗剂或抗癌药联合给药。
在某些这样的实施方式中，本申请中公开的抗CD19抗体或抗原结合片段与一种或多种另外的治疗物质联用时，可与所述的一种或多种另外的治疗物质同时给药，在某些这样的实施方式中，所述的抗体和抗原结合片段可作为同一个药物组合物的一部分同时给药。但是，与其他治疗物质“联用”的抗CD19抗体或抗原结合片段不需要同时给药或与该治疗物质在同一组合物中给药。本申请中“联用”的含义还包括，在另一个治疗物质之前或之后给药的抗CD19抗体或抗原结合片段也被认为是与该治疗物质“联用”，即使所述抗体或其抗原结合片段与第二种物质通过不同给药方式给药。在可能的情况下，与本申请中公开的抗体或其抗原结合片段联用的其他治疗物质可参照该其他治疗物质的产品说明书的方法用药，或参照外科医生的案头参考书2003(Physicians'Desk Reference，第57版；MedicalEconomics Company；ISBN:1563634457；第57版(2002年11月))，或参照其他本领域公知的方法。
本公开进一步提供使用所述抗CD19抗体或其抗原结合片段的方法。在一些实施方式中，本公开提供在体内或在体外抑制表达CD19的细胞的生长的方法，包含：将所述表达CD19的细胞与本申请所述的抗体或其抗原结合片段接触。在一些实施方式中，本公开提供在表达CD19的细胞中调节CD19活性的方法，包含将所述表达CD19的细胞暴露于本申请所述的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，本公开提供检测样品中CD19的存在或含量的方法，其包括将所述样品与所述抗体或其抗原结合片段接触，以及确定样品中CD19的存在或含量。
在一些实施方式中，本公开提供诊断在个体中与CD19相关的疾病或状况的方法，其包括：a)获取来自所述个体的样品；b)将所述样品与本申请所述的抗体或其抗原结合片段接触；c)确定在所述样品中CD19的存在或含量；以及d)判断所述与CD19相关的疾病或状况在个体中的存在情况。
在一些实施方式中，本公开提供试剂盒，所述试剂盒包含任选地与可检测的部分缀合的本申请所述的抗体或其抗原结合片段。所述试剂盒可以用于检测CD19或诊断与CD19相关疾病。
在一些实施方式中，本公开还提供本申请所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于在个体中治疗与CD19相关疾病或状况的药物中的用途、在制备用于诊断与CD3相关的疾病或状况的诊断试剂中的用途。
以下实施例旨在更好地说明本发明，且不应理解为限制本发明的范围。所有下述的特定组合物、材料和方法，其整体或部分，都在本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不是为了限制本发明，而只是为说明特定的实施方式在本发明的范围内。本领域熟练技术人员可不添加创造性及不偏离本发明范围而开发出等同的组合物、材料和方法。应理解，在对本发明的方法作出的多种改动可以仍然包括在本发明范围内。发明人意在将这样的变动包括在本发明的范围内。
实施例1：材料的产生
1.1参照抗体的产生
将抗CD19参照抗体的各区基因(WBP701-BMK1对应于专利US20140072587A1中的huB4；WBP701-BMK2对应于专利US8242252B2中的hBU12；WBP701-BMK3对应于专利US8097703B2中的21D4)克隆进入含有人Fc区基因的表达载体。使用ExpiFectamine293转染试剂盒(Invitrogen-A14524)，将表达质粒转染进入Expi293细胞。所述细胞在以135rpm旋转的定轨振荡平台上的37℃培养箱内，培养于Expi293表达培养基(Invitrogen-A1435101)中。使用Protein A柱(GE Healthcare 17543802)对收集的上清进行纯化。
用SDS PAGE分析依照上述方法产生的参照抗体WBP701-BMK1、WBP701-BMK2和WBP701-BMK3。图1和2显示，三个产生的参照抗体全部在还原条件下的SDS-PAGE上的以明显的25kDa和55kDa的分子量迁移，分别对应抗体的轻链和重链。在非还原SDS-PAGE上的主条带对应了完整的IgG分子，分子量约150KD。参照抗体的纯度大于95％(参见图1和2)。
1.2人或食蟹猴CD19表达细胞系的产生
将全长人或食蟹猴CD19的基因克隆至pcDNA3.3载体中。简要地说，使用PlasfectReagent(Bioline-46025)，用30μg DNA转染30mL体积的密度为1×106/mL的FreeStyle293F细胞(ThermoFisher-R79007)。经转染的细胞培养于设为37℃，8％CO2和100rpm振速的培养箱中。转染24小时后，使用终浓度为4-10μg/mL的杀稻瘟菌素(Invitrogen-A1113902)产生稳定的库。使用抗CD19抗体，通过FACS检验所选取的克隆。2至3轮的筛选之后，通过PE缀合的抗CD19抗体和抗PE微珠(Miltenyi-013-048-801)富集所述细胞。通过有限稀释，以及使用抗CD19抗体通过FACS筛选，来分离稳定的单细胞克隆。
将全长人或食蟹猴CD19的基因克隆至pcDNA3.3载体中。随后使用Lipofectamine2000将各表达载体分别转染进入CHO-K1细胞。所述细胞培养于含10％FBS的F12-K。转染24-48小时后加入杀稻瘟菌素。2至3轮的筛选之后，通过FACS检验所选取的克隆。2至3轮的筛选之后，通过PE缀合的抗CD19抗体和抗PE微珠(Miltenyi-013-048-801)富集所述细胞。通过有限稀释，以及使用抗CD19抗体通过FACS筛选，来分离稳定的单细胞克隆。
使用抗CD19抗体，通过流式细胞术检测到经转染的细胞系表达人CD19和食蟹猴CD19。经转染的细胞系WBP701.293F.hPro1.FL.A2、WBP701.CHO-K1.hPro1.FL.B4、WBP701.cPro1.293F.FL.C1和WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9全部表现出对人或猴CD19的高表达(图3A-3D)。
实施例2：抗体的产生
2.1免疫
Balb/c小鼠用CD19转染的293F细胞免疫。细胞膜裂解产物与佐剂(包括CpG-ODN和Adju-Phos或Titer-Max)混合。所述小鼠经由足底、皮下或腹腔途径免疫两次，其间间隔两周。用溶于PBS中的1×106细胞/动物的细胞膜裂解产物和10μg ECD蛋白/动物，给予具有高血清效价的小鼠加强免疫。
2.2血清效价检测
血清效价通过流式细胞术检测。CD19转染的CHO-K1细胞以1×105细胞/孔的密度铺于96孔U型底板(BD)中。小鼠血清使用染色缓冲液(1×PBS/1％BSA)从100倍稀释开始以1:3比例稀释。血清样品与细胞一起在4℃下培养1小时。用染色缓冲液将所述细胞洗涤两次后，加入PE缀合的山羊抗小鼠IgG Fc抗体(Jackson)，并在4℃下在避光培养30分钟。随后将所述细胞洗涤两次，并在100μL染色缓冲液中重悬。通过流式细胞术(BD Canto II)测量荧光强度，并用FlowJo分析。
全部小鼠都显示CD19特异性的效价。选取具有高血清效价的小鼠用于杂交瘤细胞融合(表3)。
表3.血清效价
小鼠# 1 2 3 4 5
CHO-K1.CD19细胞的预放血 <100 <100 <100 <100 <100
CHO-K1.CD19细胞的效价 1968300 656100 218700 656100 72900
亲本CHO-K1细胞的效价 2700 2700 900 300 2700
2.3杂交瘤细胞的产生
依照通用的电融合流程，通过电融合将淋巴结细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。细胞融合之后，将所述细胞以1×104淋巴细胞/孔，与含有20％FBS和1％HAT的DMEM培养基一起，铺板于96孔板中。所述96孔板在37℃下培养10-12天。
2.4抗体筛选
2.4.1与人CD19的结合
人CD19转染的CHO-K1细胞以1×105细胞/孔的密度铺板于96孔U型底板(BD)中。将杂交瘤细胞上清转移至所述96孔板，并与细胞一起在4℃下培养1小时。随后将所述细胞用染色缓冲液(BSA/1×PBS)洗涤两次。加入PE缀合的山羊抗小鼠IgG Fc抗体(Jackson 115-115-164)，并在4℃下避光培养30分钟。随后将所述细胞洗涤两次，并在100μL染色缓冲液中重悬。通过流式细胞术(BD Canto II)测量荧光强度，并用FlowJo分析。
2.4.2与食蟹猴CD19的结合
食蟹猴CD19转染的CHO-K1细胞以1×105细胞/孔的密度铺板于96孔U型底板(BD)中。将杂交瘤上清液转移至所述96孔板，并与细胞一起在4℃下培养1小时。随后将所述细胞用染色缓冲液(BSA/1×PBS)洗涤两次。加入PE缀合的山羊抗小鼠IgG Fc抗体(Jackson115-115-164)，并在4℃下避光培养30分钟。随后将所述细胞洗涤两次，并在100μL染色缓冲液中重悬。通过流式细胞术(BD Canto II)测量荧光强度，并用FlowJo分析。
2.4.3内化测试
Fab-ZAP是羊抗人单价抗体与核糖体失活蛋白皂草素的化学缀合。使用Fab-ZAP确定抗体的内化能力。通过ELISA确定杂交瘤细胞上清中的IgG浓度。以1:3的摩尔比将归一化的杂交瘤细胞上清与Fab-ZAP混合。Ramos细胞(5000/孔)与不同浓度的缀合物一起在37℃，5％CO2的培养箱中培养96小时。通过CellTiter Glo(Promega)确定细胞毒性。细胞存活率(％)计算如下：细胞存活率(％)＝样品的RLU/对照的RLU×100％，其中RLU代表相对光单位。
结果
首轮筛选用杂交瘤细胞上清进行。首轮结合筛选识别出116个可以产生与抗原特异性结合的抗体的杂交瘤。随后在CD19转染的CHO-K1细胞上证实了这些具有抗原特异性的杂交瘤的结合，并且在亲本CHO-K1细胞上进行反筛。在Ramos细胞上证实了所选取的40个杂交瘤细胞系的结合。随后在Fab-Zap测试中筛选阳性粘合剂。选取13个杂交瘤细胞系用于基于结合和内化能力的亚克隆。
2.5杂交瘤细胞的亚克隆
所选取的各细胞系的杂交瘤细胞以1细胞/孔的密度铺板于96孔板中。所述96孔板在加湿的37℃，6％CO2的培养箱中存放10-12天。挑选单个克隆并用FACS检验。
2.6同种型
用ELISA鉴定抗体同种型。将板(Nunc)用山羊抗小鼠IgG1、抗小鼠IgG2a、抗小鼠IgG2b、抗小鼠IgG3、抗小鼠IgM的抗体在4℃以2μg/ml包被过夜。封闭和洗板后，将杂交瘤细胞上清液转移至所述包被的板中并室温孵育1小时。随后将板与山羊抗小鼠kappa HRP或山羊抗小鼠lambda HRP二抗(Southern Biotech)孵育45分钟。洗板后加入TMB底物显色液，用2M HCl终止显色。使用酶标仪(Molecular Device)读取在450纳米处的吸光值。
结果：
通过与CD19细胞系的结合验证杂交瘤细胞的亚克隆，也检测了其同种型(参见表4)。纯化所选取的亚克隆，并且在结合测试、内化测试、交叉家族结合测试和分组(binning)测试中进一步评估。
表4.抗体同种型
实施例3候选抗体表征
3.1抗体纯化
在将pH调节到7.0后，将收集的杂交瘤上清上样到蛋白A柱(MabSelect SuRe，GE)。用Glycine洗脱抗体，并立即用1M Tris中和。用Nano Drop(Thermal-Fisher)检测抗体浓度。蛋白的纯度通过SDS-PAGE(Invitrogen，NuPAGE 4％-12％Bis-Tris胶)和HPLC-SEC(Agilent)检测。
3.2通过FACS检测亲和力
所述CD19转染的CHO-K1细胞或Ramos细胞以5×104细胞/孔的密度铺板于96孔板(BD)中。测试抗体在染色缓冲液(1×PBS/1％BSA)中连续稀释，并在4℃下与细胞培养1小时。弃去上清后，加入PE缀合的山羊抗小鼠IgG Fc抗体(Jackson 115-1154-164)，并在4℃下在避光培养30分钟。将所述细胞洗涤一次，并在100μL染色缓冲液中重悬。通过流式细胞术(BD Canto II)测量荧光强度，并用FlowJo分析。基于定量珠(PE荧光定量试剂盒，BD340495)的荧光强度，计算结合的IgG和游离的IgG浓度。使用Scatchard分析计算KD。
结果
通过流式细胞术，在CD19转染的CHO-K1细胞上检测所选取的候选抗体的亲和力。KD值总结于表5中。全部候选抗体表现出亚纳摩尔级的与人CD19的结合亲和力。
表5.候选抗体的亲和力
3.3与人CD19的结合
Ramos细胞以1×105细胞/孔的密度铺板于96孔U型底板(BD)中。纯化的抗体在染色缓冲液(1×PBS/1％BSA)中连续稀释，并在4℃下与细胞孵育1小时。随后将所述细胞用染色缓冲液(BSA/1×PBS)洗涤两次。加入PE缀合的山羊抗小鼠IgG Fc抗体(Jackson 115-115-164)，并在4℃下在避光培养30分钟。随后将所述细胞洗涤两次，并在100μL染色缓冲液中重悬。通过流式细胞术(BD Canto II)测量荧光强度，并用FlowJo分析。
通过流式细胞术，在Ramos细胞上检验所选取的亚克隆的结合亲和力(图4)。结合EC50值总结于表6中。全部候选抗体表现出亚纳摩尔级的与人CD19的结合亲和力。
表6.所选取的亚克隆的结合活性
3.4与食蟹猴CD19的结合
将食蟹猴CD19转染的CHO-K1细胞以1×105细胞/孔的密度铺板于96孔U型底板(BD)中。将纯化的抗体在染色缓冲液(1×PBS/1％BSA)中连续稀释，并在4℃下与细胞培养1小时。用染色缓冲液(1×PBS/1％BSA)洗涤细胞两次。加入PE缀合的山羊抗小鼠IgG Fc抗体(Jackson 115-115-164)，并在4℃下在避光培养30分钟。随后将所述细胞洗涤两次，并在100μL染色缓冲液中重悬。通过流式细胞术(BD Canto II)测量荧光强度，并用FlowJo分析。
使用食蟹猴CD19转染的CHO-K1细胞系评估候选抗体与食蟹猴CD19的结合活性(图5)。将结合EC50值总结于表7中。所选取的克隆全部表现出与食蟹猴CD19细胞的强结合。
表7.与食蟹猴CD19的结合活性
3.5内化测试
使用Fab-ZAP确定抗体的内化能力。连续稀释的抗体与Fab-Zap以1:3的摩尔比混合。Ramos细胞(5000/孔)与不同浓度的缀合物一起在37℃，5％CO2的培养箱中孵育96小时。通过CellTiter Glo(Promega)确定细胞毒性。细胞存活率(％)计算如下：细胞存活率(％)＝样品的RLU/对照的RLU×100％。
使用Fab-Zap测试，在Ramos细胞上检验所选取的亚克隆的内化活性(图6)。细胞存活率的EC50总结于表8中。全部候选抗体都可以在Ramos细胞上内化，并且在Fab-Zap测试中显示皮摩尔级的EC50值。
表8.Fab-Zap测试
3.6表位分组(binning)
将CD19转染的细胞WBP701.CHO-K1.hPro1.B4以1×105细胞/孔的密度铺板于96孔U型底板(BD)中。连续稀释测试抗体并与参照抗体混合。将混合物加入96孔板，并在4℃下培养30分钟。洗涤后，加入PE缀合的山羊抗人IgG Fc抗体(Jackson)，并在4℃下在避光培养30分钟。随后将所述细胞洗涤两次，并在100μL染色缓冲液(1×PBS/1％BSA)中重悬。通过流式细胞术(BD Canto II)测量荧光强度，并用FlowJo分析。
检验所选取的候选克隆针对BMK1、BMK2和BMK3参照抗体的竞争性结合。一些候选抗体可以阻断参照抗体与CD19的结合。W7011-4.155.8、W7011-4.202.9和W7011-4.225.7不与参照抗体竞争(图7)。根据竞争性结合的结果，将所述抗体分配至两个表位组(bin)(表9)。
表9.候选抗体的表位分组
对所述抗体克隆测序后，我们发现抗体克隆W7011-4.155.8、W7011-4.202.9和W7011-4.225.7的氨基酸序列完全相同。所述抗体克隆的氨基酸和核酸序列列于发明详述部分。
实施例4抗体人源化和亲和力成熟
4.1杂交瘤细胞测序
采用Trizol试剂盒(Invitrogen-15596018)从杂交瘤细胞中分离出RNA，再利用5’-RACE试剂盒(Takara-28001488)扩增得到cDNA，然后通过3’-简并引物和3’-接头引物(ExTaq：Takara-RR001B)PCR扩增cDNA。将PCR片段插入到pMD18-T载体(Takara-D101C)中并送测序(上海铂尚公司)。
来自杂交瘤细胞的抗体序列(小鼠)如SEQ ID NO:94-123所示。
4.2人源化
使用“最佳拟合”法对抗体轻链和重链进行人源化。对应V基因的轻链氨基酸序列与公司内部的人种系V基因数据库进行比对。通过使用Kabat CDR定义，用命中最高的人CDR序列取代小鼠CDR序列，得到人源化的VL基因的序列。对于重链，得到了4条人源化序列，对于轻链，首先依照上述方法得到了1条人源化序列，然后通过将小鼠框架与人种系V基因数据库比对，产生了另外3条序列。使用延长CDR定义来定义框架，其中Kabat CDR1在N末端延长5个氨基酸。使用命中最高的三个序列得到人源化的V基因。对人源化的基因进行回译、密码子优化用于哺乳动物表达，以及经GeneArt Costum Gene Synthesis(LifeTechnologies)合成。将合成的基因重克隆至IgG表达载体内，表达并纯化。
4.3亲和力成熟
使用杂交突变方法(Kunkel，1985)，将6个互补决定区(CDR)的每个氨基酸独立地突变为20种氨基酸。使用含有编码20个氨基酸的NNS密码子的DNA引物，将突变引入每个靶CDR位置。在杂交突变反应中使用单独的简并引物。分别汇集VH和VL CDR的合成产物。将200ng汇集的文库DNA转染至BL21中，用于生产scFv片段。
首先使用细菌的周质提取物，通过捕获ELISA筛选突变。96孔Maxisorp免疫板(Nunc)用包被缓冲液(200mM Na2CO3/NaHCO3，pH9.2)中的抗c-myc抗体在4℃下包被过夜。用酪蛋白在室温下阻断1小时后，将周质提取物样品加入96孔板，并在室温下孵育1小时。洗涤后，加入生物素化的CD19ECD蛋白，并在室温下孵育1小时，随后用链球菌亲和素-HRP孵育1小时。洗涤后，加入TMB底物，并用2M HCl停止反应。用酶标仪(Molecular Device)读取波长450nm处的吸光度。
挑选在波长450nm处显示出大于亲本克隆的光密度(OD)信号的克隆用于测序。这些独特的克隆通过在归一化的scFv浓度下的FACS证实，以确定突变scFv和亲本抗体的相对结合亲和力。
将VH和VL中确定益于与抗原的结合的点突变进一步组合，以获取额外的结合协同作用。将这些组合的突变表达为scFv，并使用捕获ELISA筛选。对在波长450nm处显示出大于亲本克隆的光密度(OD)信号的克隆进行测序，并进一步通过结合FACS证实。
4.4工程化改造的抗体的结合亲和力
4.4.1 WBP7011-4.34.11-z1-m5-IgG1k
抗体WBP7011-4.34.11是人源化的，并且经亲和力成熟的。在Ramos细胞上通过FACS测量工程化改造的抗体WBP7011-4.34.11-z1-m5的亲和性(图8)。使用Scatchard分析计算KD。WBP7011-4.34.11-z1-m5-IgG1k的亲和力是0.23nM。
4.4.2 WBP7011-4.87.6-z1-IgG1k(N-S)
抗体WBP7011-4.87.6是人源化的，并且是在PTM风险残基上进行工程化改造的。在Ramos细胞上通过FACS测量终选抗体WBP7011-4.87.6-z1-IgG1k(N-S)的亲和力(图9)。使用Scatchard分析计算KD。WBP7011-4.87.6-z1-IgG1k(N-S)的亲和力是0.25nM。
4.4.3 W7011-4.155.8-z1-uIgG1K
抗体W7011-4.155.8是人源化的。在CD19转染的CHO-K1细胞上通过FACS测量人源化抗体W7011-4.155.8-z1-uIgG1K的亲和力(图10)。使用Scatchard分析计算KD。W7011-4.155.8-z1-uIgG1K的亲和力是0.82nM。
4.5工程化改造的抗体序列
改造的抗体序列如SEQ ID NO:124-135所示。
实施例5：抗体-药物缀合物(ADC)的产生
将抗体通过缓冲液交换到PBS(pH7.4)缓冲液中，并与DMA混合(Alfa Aesar)。然后加入DM1-SMCC(BrightGene)，并且在22℃在温和旋转下培养混合物进行缀合。
为移除游离药物，使用30KDa超滤管(Millipore)将ADC产物缓冲液交换到ADC贮存缓冲液中。缓冲液交换8次后，用0.22μm膜过滤ADC产物，用于最终表征。
用UV-vis(NanoDrop)表征ADC的浓度。通过UV-vis和SEC-HPLC确定DAR值。通过SEC-HPLC确定聚集水平以及纯度。通过RP-HPLC确定游离药物。通过动态浊度测试确定内毒素水平。
将候选抗体与DM1缀合。在缀合后评估浓度、纯度、DAR、聚集水平以及游离药物％(表10)。
表10.DM1缀合抗体的表征
实施例6：ADC的细胞毒性分析
B淋巴细胞(5000/孔)与不同浓度的DM1缀合的抗体一起在37℃下培养72小时。通过CellTiter Glo(Promega)确定细胞毒性。细胞存活率(％)计算如下：细胞存活率(％)＝样品的RLU/对照的RLU×100％。
在Daudi、Nalm-6和WSU-DLCL2细胞上，在细胞毒性测试中检验DM1缀合的抗体(图11、12、13)。EC50值总结于表11、12和13中。ADC WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K(N-S)-DM1在所有被测的肿瘤细胞上都表现出优于WBP701-BMK1-DM1的细胞毒性。ADC WBP7011-4.34.11-z1-m5-uIgG1K-DM1表现出可与WBP701-BMK1-DM1媲美的细胞毒性。
表11.Daudi上的细胞毒性测试
表12.Nalm-6细胞上的细胞毒性测试
表13.WSU-DLCL2细胞上的细胞毒性测试
实施例7：ADC的抗肿瘤分析
7.1细胞培养
将Nalm-6肿瘤细胞在体外以10％胎牛血清的RPMI-1640中悬浮培养于潮湿的环境(95％空气和5％CO2)下。所述肿瘤细胞用常规方法每周传代培养两次。收集在指数生长期的细胞并计数，用于肿瘤接种。
7.2肿瘤接种以及分组
每只小鼠在右侧皮下植入Nalm-6肿瘤细胞(1千万+Matrigel)，用于肿瘤发生。当平均肿瘤体积达到113mm3时开始治疗。试验用品的施用和各组中的小鼠数量示于下表中。
表14.试验ADC的施用以及各组中的小鼠数量
7.3观察
本研究中涉及对动物的看护和使用的方案，以及任何修改或流程，在实施前将由药明康德的机构动物看护及使用委员会(IACUC)审阅并批准。在研究期间，对动物的看护和使用依照实验动物看护评估和认定协会(AAALAC)的规定进行。接种后，每天检查小鼠的发病率和死亡率。例行监控时，检查小鼠是否出现任何肿瘤生长的影响，以及对正常行为，如行动能力、食物和水的消耗、体重增/减(每天测量体重)、眼睛/毛发无光泽等，以及任何其他异常影响的处理。基于各子集内小鼠的数量记录死亡情况以及观察到的临床症状。
7.4肿瘤测量和终点
主要的终点是要看是否可以延缓肿瘤生长或小鼠是否可被治愈。每周两次使用游标卡尺在两个维度上测量肿瘤的大小，并且使用以下公式计算体积并以mm3的单位表示：V＝0.5a×b2，其中a和b分别为肿瘤的长径和短径。肿瘤的大小用于计算T/C值和TGI。T/C值(单位为百分比)是抗肿瘤作用的指示；T和C是处理组和对照组分别在第21天和在第28天的平均体积。各组的TGI使用以下公式计算：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100；Ti是处理组在第21天和第28天的平均肿瘤体积，T0是处理组在处理开始当天的平均肿瘤体积，Vi是载剂对照组在第21天和第28天的平均肿瘤体积，而V0是载剂组在处理开始当天的平均肿瘤体积。
将所有组在第28天依照方案记录下来。
所有小鼠在实验阶段中良好地保持体重。
7.5在Nalm-6淋巴瘤癌症异种移植模型中的效能研究
在这一研究中，在雌性CB17-SCID小鼠中的Nalm-6淋巴瘤癌症异种移植中评估参照抗体-药物-缀合物W7011-BMK1-DM1和W7011-4.87.6-z1-uIgG1k(N-S)-DM1的效能。所有组在不同时间点的肿瘤体积展示于图14中。
在PG-D21上，同种型对照处理组的平均肿瘤体积达到840mm3。用1mg/kg(TV＝364mm3，TGI＝66％，p<0.01)和10mg/kg(TV＝327mm3，TGI＝71％，p<0.001)的W7011-BMK1-DM1处理，显示出显著的抗肿瘤活性。1mg/kg(TV＝398mm3，TGI＝61％，p<0.01)、3mg/kg(TV＝387mm3，TGI＝62％，p<0.01)和10mg/kg(TV＝332mm3，TGI＝70％，p<0.001)的ADC W7011-4.87.6-z1-uIgG1k(N-S)-DM1都显示出显著的抗肿瘤活性。
悬液给药1周后，同种型对照处理组的平均肿瘤体积达到1266mm3。用1mg/kg(TV＝593mm3，TGI＝58％，p<0.01)和10mg/kg(TV＝499mm3，TGI＝67％，p<0.001)的W7011-BMK1-DM1处理，显示出显著的抗肿瘤活性。1mg/kg(TV＝562mm3，TGI＝61％，p<0.01)、3mg/kg(TV＝556mm3，TGI＝62％，p<0.01)和10mg/kg(TV＝502mm3，TGI＝66％，p<0.001)的ADC W7011-4.87.6-z1-uIgG1k(N-S)-DM1都显示出显著的抗肿瘤活性。
所有小鼠在实验阶段中良好地保持体重。
序列表
<110> 上海药明生物技术有限公司
<120> 新型抗CD19抗体
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<170> PatentIn version 3.5
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<213> 小鼠
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Gly Val Leu Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
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<210> 62
<211> 25
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 62
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 63
<211> 14
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 63
Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 64
<211> 32
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 64
Lys Ala Ser Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
1 5 10 15
Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 65
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Thr Ser
1 5 10
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<211> 23
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 66
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys
20
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<211> 15
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 67
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 68
<211> 32
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 68
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys
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<213> 小鼠
<400> 69
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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<212> PRT
<213> 智人
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
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<213> 智人
<400> 71
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
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<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
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Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
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<213> 智人
<400> 73
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 74
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
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<213> 智人
<400> 75
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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<213> 智人
<400> 76
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
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Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
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<400> 77
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<211> 25
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<213> 小鼠
<400> 78
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 79
Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly
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<212> PRT
<213> 小鼠
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Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met His
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Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Thr
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<213> 小鼠
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Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 82
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser
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Leu Thr Ile Arg Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys
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<213> 小鼠
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Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
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Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
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<213> 小鼠
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<212> DNA
<213> 小鼠
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gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
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<213> 小鼠
<400> 96
Asp Ala Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
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Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser
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<212> DNA
<213> 小鼠
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<212> PRT
<213> 小鼠
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
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Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 99
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<213> 小鼠
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr
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Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
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Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
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Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Arg Ser Val Glu Ala Glu
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<211> 363
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 113
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggata cacattcagt agttatgtta tacactgggt gaagcagaag 120
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<211> 121
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 114
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 115
<211> 363
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 115
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtggagatg 60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtta ttcactggtt gaagcagaag 120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tgctgagtat 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag tacagcctat 240
atggatctca acagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggaccc 300
tattactacg gtagtagccc ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360
tca 363
<210> 116
<211> 121
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 116
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Val Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Glu Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 117
<211> 363
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 117
gaggtccagc tgctgcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactatgtta tacactgggt gaagcagagg 120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg ttctgagtac 180
agtgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggaccc 300
tattactacg gtggtagtcc ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360
tca 363
<210> 118
<211> 121
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 118
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 119
<211> 363
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 119
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtta tgcactgggt gaagcagaag 120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactaagtac 180
aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atggaactca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggaccc 300
tattactacg gtagtagccc ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360
tca 363
<210> 120
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 120
Asp Ala Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Leu Glu Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Leu
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Thr Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Val
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 121
<211> 336
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 121
gatgctgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca ggtctagtca gacccttgaa aacagtaatg gaaacaccta tttgaactgg 120
tacctccaga aaccaggcca gtctccacag ctcctgatct acagggtttc caaccgattt 180
tctggggtcc tagacaggtt cagtggtagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagagtgg agactgagga tttgggagtt tatttctgcc tccaagttac acatgtcccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 122
<211> 121
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 122
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr Tyr Ser Pro Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 123
<211> 363
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 123
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtca tgcactgggt gaagcagaag 120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactcagtac 180
aatgagaagt ttaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggaccc 300
tattactaca gtcctagccc ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360
tca 363
<210> 124
<211> 121
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 124
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ala Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 125
<211> 363
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 125
caggtgcagc ttgtgcagtc tggagctgaa gtgaagaagc caggatcctc cgtgaaggtc 60
tcctgtaagg cttctggcta caccttcacc gattacgtga tccactgggt caggcaggcc 120
cctgggcaag gcttggagtg gatggggtac tttaacccct acaacgatgg gactgagtac 180
aatgagaagt ttaaagcacg ggtgaccatt accgccgaca agagcacaag cacagcctac 240
atggagctgt ccagcctccg cagcgaggat acagccgtct actactgcgc cagaggccct 300
tactactatg ggtccagccc cttcgactat tggggccagg ggactacagt gactgtcagt 360
tca 363
<210> 126
<211> 112
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 126
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser
20 25 30
Asn His Asn Thr Tyr Ile Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys His Gln Val
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 127
<211> 336
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 127
gatatcgtga tgacccagac tcccctgtcc cttcctgtga ccccaggaga accagcttct 60
atcagctgta ggtcctcaca gagcctggag aactccaacc acaacaccta cataaactgg 120
tacctccaga agcctgggca gtctccccag ttgctgatct acagggtcag caaacgcttc 180
tccggggtgc ccgatcggtt tagtgggagc gggagcggca cagactttac actcaagatt 240
tccagagtgg aggccgagga cgtcggcgtc tattactgcc accaagtgac acacgtgccc 300
tacacattcg gccagggcac taaactggag attaag 336
<210> 128
<211> 121
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 128
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Thr Lys Tyr Ser Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Phe Arg Tyr Asp Tyr Trp Tyr Ser Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 129
<211> 363
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 129
caggtccagc ttgtccagtc tggagcagaa gtgaagaagc caggggcttc agtgaaggtg 60
tcttgcaagg cttccggata cgccttctcc acttactgga tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctgggcagg gcttggagtg gatgggccag atctatcccg gcgatgacga cacaaaatac 180
agcgggaagt tcaaggggcg ggtgaccatt accgccgata aaagcacctc caccgcctac 240
atggagctca gttccctgag aagcgaggat acagccgtgt actactgtgc caggaggtac 300
tttcggtacg actactggta tagcgacgtc tgggggcaag gcacaactgt cacagtgagc 360
agc 363
<210> 130
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 130
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 131
<211> 321
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 131
gacatccaaa tgacccagag cccttcctcc ttgtccgcaa gtgtgggaga tagagtgacc 60
atcacctgca gggcttctca ggatatctcc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggtgc caaagctcct tatttactac acctcccggc tgcacagcgg agtcccatct 180
cgcttcagcg ggtcaggcag cggcactgac tttactctga caattagcag cctccagcct 240
gaagacgtcg ccacttacta ctgtcatcag gggaatacac tccccctgac attcgggcag 300
gggacaaaac tggagattaa g 321
<210> 132
<211> 116
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 132
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Leu Thr Thr Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 133
<211> 348
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 133
caaatgcagc tcgtccagtc tggacctgaa gtgaagaagc ccgggacatc cgtcaaggtc 60
tcatgtaagg ctagcgggta cgcattcact tcctacaaca tgtactgggt gcgccaggcc 120
agaggacaga ggttggagtg gatcggctac atcgacccat acaacgccga tactacctac 180
aatcagaagt ttaaagggcg ggtgaccatt acccgggata tgtccacctc caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgag gagcgaggac acagccgtgt actactgcct gacaacagcc 300
tatgccatgg actattgggg ccagggcaca cttgtgactg tgagcagt 348
<210> 134
<211> 106
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 134
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Thr Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 135
<211> 318
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 135
gacatccagc tcacccaatc cccttctttc ctctccgcaa gtgtcggaga tagggtgact 60
atcacctgct cagcttcttc aaccgtgaac tacatgcatt ggtaccagca gaagcccggg 120
aaagccccaa agctgctgat ctacagcacc tccaatctgg ccagtggagt gccaagccgg 180
tttagcggga gcggctccgg cactgaattc actttgacaa ttagcagcct tcagcctgag 240
gactttgcca catattactg tcaccagtgg tccagctacc cctacacatt cgggcagggc 300
acaaagctgg agattaag 318
<210> 136
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 136
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val Ile His
1 5 10
<210> 137
<211> 16
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 137
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser Asn His Asn Thr Tyr Ile Asn
1 5 10 15
<210> 138
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 138
Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser
1 5
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 139
His Gln Val Thr His Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 140
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 140
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Thr Lys Tyr Ser Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 141
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 141
Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly

Claims (58)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包括一个或多个选自下组的重链互补决定区(CDR)序列：SEQ ID NO:1、2、3、7、8、9、13、14、15、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、43、44、45、136、140和141，和/或一个或多个选自下组的κ轻链CDR序列：SEQ ID NO:4、5、6、10、11、12、16、17、18、40、41、42、137、138和139。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区，所述重链可变区选自下组：
a)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的CDR序列；
b)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的CDR序列；
c)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的CDR序列；
d)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的CDR序列；
e)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的CDR序列；
f)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的CDR序列；
g)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的CDR序列；
h)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的CDR序列；
i)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的CDR序列；
j)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的CDR序列；
k)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45的CDR序列；
l)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的CDR序列；
m)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:9的CDR序列；和
n)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:15的CDR序列。
3.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其包括κ轻链可变区，所述κ轻链可变区选自下组：
a)κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的CDR序列；
b)κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的CDR序列；
c)κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的CDR序列；
d)κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42的CDR序列；和
e)κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:139的CDR序列。
4.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其包括：
a)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的CDR序列；
b)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的CDR序列；
c)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的CDR序列；
d)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的CDR序列；
e)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的CDR序列；
f)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的CDR序列；
g)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的CDR序列；
h)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的CDR序列；
i)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的CDR序列；
j)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42的CDR序列；
k)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的CDR序列；
l)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138和SEQ IDNO:139的CDR序列；
m)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:9的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的CDR序列；
n)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:15的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的CDR序列。
5.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其包括：
a)重链CDR1序列，所述重链CDR1序列选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:136；
b)重链CDR2序列，所述重链CDR2序列选自：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:141；和
c)重链CDR3序列，所述重链CDR3序列选自：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:45。
6.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其包括：
a)轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列选自：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:137；
b)轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列选自：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:138；和
c)轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列选自：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:139。
7.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其包括：
a)重链CDR1序列，所述重链CDR1序列选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:136；
b)重链CDR2序列，所述重链CDR2序列选自：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:141；
c)重链CDR3序列，所述重链CDR3序列选自：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:45；
d)轻链CDR1序列，所述轻链CDR1序列选自：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:137；
e)轻链CDR2序列，所述轻链CDR2序列选自：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:138；和
f)轻链CDR3序列，所述轻链CDR3序列选自：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:139。
8.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括：一个或多个选自下组的重链框架区(FR)序列：SEQ ID NO:54、55、56、57、70、71、72、73、86、87、88和89，和/或一个或多个选自下组的κ轻链框架区(FR)序列：SEQ ID NO:58、59、60、61、74、75、76、77、90、91、92和93。
9.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括：重链FR1序列，所述重链FR1选自SEQ ID NO:54、70和86；重链FR2序列，所述重链FR2选自SEQ ID NO:55、71和87；重链FR3序列，所述重链FR3选自SEQ ID NO:56、72和88；和重链FR4序列，所述重链FR4选自SEQ ID NO:57、73和89。
10.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括：轻链FR1序列，所述轻链FR1选自SEQ ID NO:58、74和90；轻链FR2序列，所述轻链FR2选自SEQ IDNO:59、75和91；轻链FR3序列，所述轻链FR3选自SEQ ID NO:60、76和92；和轻链FR4序列，所述轻链FR4选自SEQ ID NO:61、77和93。
11.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其包括：重链可变区，所述重链可变区选自下组：SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ IDNO:118、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:132和与其具有至少80％序列同一性的同源序列。
12.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其包括：κ轻链可变区，所述κ轻链可变区选自下组：SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:134和与其具有至少80％序列同一性的同源序列。
13.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其包括：
a)重链可变区，其包括SEQ ID NO:94；和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:96；
b)重链可变区，其包括SEQ ID NO:98；和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:100；
c)重链可变区，其包括SEQ ID NO:102；和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:104；
d)重链可变区，其包括SEQ ID NO:106；和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:96；
e)重链可变区，其包括SEQ ID NO:108；和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:96；
f)重链可变区，其包括SEQ ID NO:110；和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:96；
g)重链可变区，其包括SEQ ID NO:112；和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:96；
h)重链可变区，其包括SEQ ID NO:114；和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:96；
i)重链可变区，其包括SEQ ID NO:116；和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:96；
j)重链可变区，其包括SEQ ID NO:118；和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:120；
k)重链可变区，其包括SEQ ID NO:122；和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:96；
l)重链可变区，其包括SEQ ID NO:124；和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:126；
m)重链可变区，其包括SEQ ID NO:128；和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:130；或
n)重链可变区，其包括SEQ ID NO:132；和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:134。
14.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括一个或多个氨基酸残基替代，但仍然保持与CD19的特异性结合亲和性。
15.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述替代在一个或多个CDR序列里，和/或在一个或多个FR序列里，在一个或多个可变区序列里，和/或在Fc区。
16.根据权利要求14或15所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述替代赋予一种或多种需要的性质，所述需要的性质选自：
a)提高与CD19的结合亲和性，
b)引入或移除糖基化位点，
c)引入游离的半胱氨酸残基，
d)提高或降低ADCC或CDC，
e)增加血清半衰期，和
f)增加FcRn结合。
17.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括免疫球蛋白恒定区，可选地包括IgG的恒定区，可选地包括人IgG1的恒定区。
18.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其为人源化抗体。
19.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其为骆驼化单域抗体(camelized single chain domain antibody)、双功能抗体(diabody)、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds双功能抗体(ds diabody)、纳米抗体、域抗体或双价域抗体。
20.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其具有双特异性。
21.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其与一种或多种缀合物连接。
22.根据权利要求21所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述缀合物包括化疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记，或酶底物标记。
23.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其能够特异性地与CD19结合，可选地，能够特异性地与来源于人或猴的CD19结合。
24.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过5×10-9M的KD值特异性地与表达在细胞上的人CD19结合，所述KD值通过流式细胞术测定。
25.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过0.9nM或不超过1nM的EC50值特异性地与表达在细胞上的人CD19结合，所述EC50值通过流式细胞术测定。
26.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过3nM的EC50值特异性地与表达在细胞上的食蟹猴CD19结合，所述EC50值通过流式细胞术测定。
27.根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过50pM的EC50值被表达CD19的细胞内化，所述EC50值通过Fab-Zap法测定。
28.一种抗体或其抗原结合片段，其与W7011-4.155.8竞争相同的表位。
29.一种分离的多核苷酸序列，其编码根据前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段。
30.根据权利要求29所述的分离的多核苷酸序列，其包括选自下组的核苷酸序列：SEQID NO:95、99、103、107、109、111、113、115、117、119、123、125、129和133，和/或选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:97、101、105、121、127、131和135，或与其具有至少80％序列同一性，但编码同一蛋白序列的同源序列。
31.一种载体，其包括根据权利要求29或30所述的分离的多核苷酸。
32.一种宿主细胞，其包括根据权利要求31所述的载体。
33.一种表达根据权利要求1-28中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在表达根据权利要求31所述的载体的条件下培养根据权利要求32所述的宿主细胞。
34.一种抗体-药物缀合物，其包括一个或多个药物部分，所述药物部分直接或经由接头共价连接至根据权利要求1-28中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段。
35.根据权利要求34所述的抗体-药物缀合物，其中所述接头为腙接头、二硫接头、双官能接头、二肽接头、葡糖苷酸接头、硫醚接头，可选地，所述接头为SMCC。
36.根据权利要求34或35所述的抗体-药物缀合物，其中至少一个药物部分连接至所述抗体或其抗原结合片段的特定位点，可选地，所述特定位点为半胱氨酸残基。
37.根据权利要求36所述的抗体-药物缀合物，其中所述药物部分为细胞毒素或放射性同位素。
38.根据权利要求21所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述缀合物为毒素，可选地为细胞毒素、DNA烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂，或其他抗癌药物，可选地为美登素类细胞毒性剂，可选地，所述毒素为DM1。
39.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-28中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求34-37中任意一项所述的抗体-药物缀合物，以及药学上可接受的运载体。
40.一种在受试者中治疗与CD19相关的疾病或状况的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-28中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求34-37中任意一项所述的抗体-药物缀合物，或根据权利要求39所述的药物组合物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述疾病或状况是癌症。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述癌症为淋巴癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌、食道癌或胃癌。
43.根据权利要求40所述的方法，其中所述疾病或状况是B细胞淋巴瘤，可选地为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，其中所述非霍奇金淋巴瘤包括：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞性淋巴瘤(慢性淋巴细胞白血病，CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)，或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。
44.根据权利要求40所述的方法，其中所述施用是经由口服、鼻内、静脉内、皮下、舌下或肌内施用。
45.根据权利要求40所述的方法，其中所述受试者是人类。
46.一种在表达CD19的细胞中调节CD19活性的方法，其包括将所述表达CD19的细胞暴露于根据权利要求1-28中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段。
47.一种在体内或体外杀死表达CD19的细胞的方法，其包括将所述表达CD19的细胞与根据权利要求34-37中任意一项所述的抗体-药物缀合物接触。
48.一种检测样品中CD19的存在或含量的方法，其包括将所述样品与根据权利要求1-28中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段接触，和确定样品中CD19的存在或含量。
49.一种诊断在受试者中与CD19相关的疾病或状况的方法，其包括：a)获取来自所述受试者的样品；b)将所述样品与根据权利要求1-28中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；c)确定在所述样品中CD19的存在或含量；d)将所述CD19的存在或含量与所述受试者的疾病或状况相关联。
50.根据权利要求1-28中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求34-37中任意一项所述的抗体-药物缀合物，或根据权利要求39所述的药物组合物在制备用于治疗需要其的受试者中的疾病或状况的药物中的用途，其中所述治疗包括：向所述受试者施用治疗有效量的所述抗体或其抗原结合片段。
51.根据权利要求1-28中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断与CD19相关的疾病或状况的诊断试剂中的用途。
52.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包括根据权利要求1-28中任意一项所述的抗原结合片段和T细胞活化部分，其中所述T细胞活化部分包括T细胞受体的跨膜结构域和T细胞受体的胞内信号转导结构域。
53.根据权利要求52所述的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述抗原结合片段为scFv。
54.一种核酸序列，其编码根据权利要求52所述的CAR。
55.根据权利要求54所述的核酸序列，其包括根据权利要求29或30所述的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列可操作地连接至编码T细胞受体的跨膜结构域和T细胞受体的信号转导结构域的第二多核苷酸序列。
56.一种载体，其包括根据权利要求54或55所述的核酸序列。
57.一种分离的T细胞，其表达根据权利要求52所述的CAR。
58.一种用于在受试者中激活T细胞介导的针对表达CD19的靶标的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求57所述的T细胞。
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