CN109535257A - 新型双特异性cd3/cd19多肽复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含有第一抗原结合部分和第二抗原结合部分的双特异性抗CD3xCD19多肽复合物、生产所述双特异性抗CD3xCD19多肽复合物的方法、使用所述双特异性抗CD3xCD19多肽复合物治疗疾病或病况的方法、编码所述双特异性抗CD3xCD19多肽复合物的多核苷酸、含有所述多核苷酸的载体和宿主细胞和包含所述双特异性抗CD3xCD19多肽复合物的组合物和药物组合物。

Description

新型双特异性CD3/CD19多肽复合物
交叉引用
本申请要求2017年9月22日提交的国际专利申请号 PCT/CN2017/103032的优先权。
发明领域
本发明总体上涉及包含融合至TCR恒定区的抗体可变区的双特 异性抗CD3xCD19多肽复合物。
背景技术
双特异性抗体在逐步成为一类新的治疗性抗体。它们可以结合两 个不同的靶标或者一个靶标上的两个不同的表位，从而产生优于单个 抗体作用的加成或协同作用。对设计新的双特异性形式(如DVD-Ig、 CrossMab、BiTE等)做了许多抗体工程化的尝试，(Spiess等，Molecular Immunology，67(2)，pp.95–106(2015))。然而，这些形式可潜在地具 有在稳定性、溶解性、短半衰期和免疫原性方面的各种限制。
在这些双特异性抗体形式中，一种IgG样的双特异性抗体是通用 形式：一条臂结合至靶标A，且另一条臂结合至靶标B。结构上其由 抗体A的一半和抗体B的一半构成，具有与天然IgG相似的大小和形 状。为了便于下游开发，期望这种双特异性分子可以像正常IgG一样 容易地以高表达水平从单个宿主细胞产生和正确组装。遗憾地是，无 法自动控制同源轻-重链的配对以及两个不同的半抗体的组装。随机方 式的各种错配都可能导致显著的产物异质性。
通过向Fc区中引入突变，如“把手入孔”(knobs-into-holes) (Ridgway等，Protein Engineering，9(7)，pp.617–21(1996)；Merchant 等，Nature Biotechnology，16(7)，pp.677–681(1998))、静电 (Gunasekaran等，Journal of Biological Chemistry，285(25)， pp.19637–19646(2010))，或负状态设计(Kreudenstein等，mAbs，5(5)，pp.646–654(2013)；Leaver-Fay等，Structure，24(4)，pp.641–651 (2016))，实现了两个不同的重链的优选的异源二聚组装。然而，单个 抗体各自的轻-重链的选择性配对仍然具有挑战性。轻-重链之间的界 面包含可变结构域(VH-VL)和恒定结构域(CH1-CL)。已有数种方案应 用于正交界面的设计，以便于同源配对。Roche交换了CH1和CL的 结构域，并且创造了CrossMab平台(Schaefer等，Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America，108(27)， pp.11187–11192(2011))，MedImmune替代性地引入了二硫键(Mazor 等，mAbs，7(2)，pp.377–389(2015))，Amgen在CH1-CL区进一步 做了静电作用修饰(Liu等，Journal of Biological Chemistry，290(12)， pp.7535–7562(2015))，并且Lilly(Lewis等，Nature Biotechnology， 32(2)，pp.191–198(2014))和Genentech(Dillon等，mAbs，9(2)， pp.213–230(2017))在可变结构域和恒定结构域均引入了突变。
人CD19是属于免疫球蛋白超家族的I型跨膜蛋白(Carter等， Curr DirAutoimmun，7：4-32(2004))。它在大多数B细胞上表 达，但在浆细胞、干细胞或正常骨髓谱系上未检测到(Tedder，Nat Rev Rheumatol，5(10)：572-577(2009))。CD19通过调节B细胞受 体(BCR)依赖性和非依赖性信号传导而关键性地参与建立内在B细 胞信号传导阈值(Wang等，Experimental Hematology&Oncology，1： 36(2012))。CD19具有比CD20更广泛的表达。CD19表达的模式 保持在B细胞恶性肿瘤中，涵盖B细胞淋巴瘤的所有亚型(从无痛形式到侵袭性形式)，以及B细胞慢性淋巴细胞白血病和非T急性淋巴 细胞白血病，并允许靶向早期B细胞的肿瘤适应症例如急性淋巴细胞 白血病(ALL)(其不能被利妥昔单抗靶向)。已经研究了几种CD19 单克隆抗体用于淋巴瘤治疗(美国专利申请公开号20140072587 A1，美国专利号8,242,252 B2和美国专利号8,097,703 B2)。
CD3 T细胞共受体是由四条不同的链(CD3γ链、CD3δ链和两条 CD3ε链)组成的蛋白质复合物。这四条链与被称为T细胞受体(TCR) 的分子和ζ链缔合以在T淋巴细胞中产生激活信号。TCR、ζ链和CD3 分子组成TCR复合物，其中TCR作为亚基用于识别和结合抗原，并且CD3作为亚基用于将抗原刺激转移和运载至信号传导途径，并最终 调节T细胞活性。CD3蛋白几乎存在于所有T细胞中。CD3-TCR复 合物调节固有和适应性免疫应答中的T细胞功能，以及细胞和体液免 疫功能。这些包含通过广泛的细胞毒性作用消除病原生物和控制肿瘤 生长。对人CD3特异的小鼠单克隆抗体，例如OKT3(Kung等， Science，206：347-9(1979))，是开发用于治疗的第一代CD3抗体。 尽管OKT3具有强免疫抑制效力，但其临床应用受到与其免疫原性和 促有丝分裂潜能相关的严重副作用的阻碍(Chatenoud，NatureReviews，3：123-132(2003))。OKT3诱导抗球蛋白反应，促进其 自身的快速清除和中和(Chatenoud等，Eur.J.Immunol。，137：830-8 (1982))。另外，OKT3体外诱导T细胞增殖和细胞因子产生，并 体内导致细胞因子的大规模释放(Hirsch等，J.Immunol，142：737-43(1989))。这种严重的副作用限制了OKT3在移植中的更广泛使用 以及将其应用扩展至其他临床领域如自身免疫。
靶向CD3和CD19的双特异性抗体可以同时结合T细胞和B细 胞。在双特异性抗体与CD3阳性T细胞和CD19阳性B细胞结合后， 形成细胞溶解性突触。然后通过在细胞毒性T细胞中从颗粒释放穿孔 素和颗粒酶来诱导细胞毒性，后者诱导恶性B细胞的细胞凋亡和裂解。
非常需要设计针对CD3和CD19两者的具有所需表达水平和体内 半衰期的双特异性分子。这种双特异性抗CD3xCD19多肽复合物可用 于治疗CD19相关病况，包含癌症。
发明简述
在一个方面，本发明提供一种双特异性多肽复合物，其包含与第 二抗原结合部分相缔合的第一抗原结合部分，其中：
所述第一抗原结合部分包含：
第一多肽，所述第一多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一 重链可变结构域(VH)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定 区(C1)，和
第二多肽，所述第二多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一 轻链可变结构域(VL)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)，
其中：
C1包含工程化的Cβ，所述Cβ包含SEQ ID NO:1，并且C2包 含工程化的Cα，所述Cα包含SEQ ID NO:2，
SEQ ID NO:1中的氨基酸C48和SEQ ID NO:2中的氨基酸C41 能够形成非天然的链间二硫键，
C1和C2能够形成二聚体，并且所述非天然的链间二硫键能够稳 定所述二聚体，
以及
所述第二抗原结合部分包含：
第二抗体的第二重链可变结构域(VH2)，其可操作地连接至抗体 重链CH1结构域，和
第二抗体的第二轻链可变结构域(VL2)，其可操作地连接至抗体轻 链恒定(CL)结构域，
其中：
所述第一和所述第二抗原结合部分中的一个是抗CD3结合部分， 并且另一个是抗CD19结合部分，
抗CD3结合部分来源于抗CD3抗体，其包含：
a)包含SEQ ID NO：3的重链CDR1，b)包含SEQ ID NO：4 的重链CDR2，c)包含SEQ IDNO：5的重链CDR3，d)包含SEQ ID NO：6的κ轻链CDR1，e)包含SEQ ID NO：7的κ轻链CDR2， 和f)包含SEQ ID NO：8的κ轻链CDR3，
抗CD19结合部分来源于抗CD19抗体，其包含：
a)包含SEQ ID NO：9的重链CDR1，b)包含SEQ ID NO：10 的重链CDR2，c)包含SEQID NO：11的重链CDR3，d)包含SEQ ID NO：12的κ轻链CDR1，e)包含SEQ ID NO：13的κ轻链CDR2， 和f)包含SEQ ID NO：14的κ轻链CDR3，
并且
相比于第一和所述第二抗原结合部分均为天然Fab的对应部分的 情况，所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分更不容易发生 错配。
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物的抗CD3结合部分 来源于抗CD3抗体，其包含含有SEQ ID NO：15的重链可变结构域 序列和含有SEQ ID NO：17的轻链可变结构域序列。
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物的抗CD19结合部 分来源于抗CD19抗体，其包含含有SEQ ID NO：19的重链可变结构 域序列和含有SEQ ID NO：21的轻链可变结构域序列。
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物包含以下四个多肽 序列的组合：SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,和 SEQ ID NO:29。
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物包含以下四个多肽 序列的组合：SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28 和SEQ ID NO：30。
在一个方面，本发明提供一种缀合物，其包含缀合至一个部分的 本发明所述的双特异性多肽复合物。
在一个方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其编码本发明所 述的双特异性多肽复合物。
在一个方面，本发明提供一种分离的载体，其包含本发明所述的 多核苷酸。
在一个方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明所述的分 离的多核苷酸，或本发明所述的分离的载体。
在一个方面，本发明提供一种表达本发明所述的双特异性多肽复 合物的方法，所述方法包括在所述双特异性多肽复合物被表达的条件 下培养本发明所述的宿主细胞。
在一个方面，本发明提供一种组合物，其包含本发明所述的双特 异性多肽复合物。
在一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明所述的 双特异性多肽复合物，以及药学上可接受的运载体。
在一个方面，本发明提供一种在需要其的受试者中治疗与CD19 相关的疾病或病况的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的本 发明所述的双特异性多肽复合物。在某些实施方式中，当所述第一抗 原和所述第二抗原均被调节时，所述疾病或病况可以被缓解、消除、 治疗或预防。
在某些实施方式中，所述第一VH在第一接合结构域可操作地连 接至Cβ，其包含抗体V/C接合子的C末端片段并具有SEQ ID NO： 23的氨基酸序列(LEDLKNVFPP)，并且所述第一VL在第二接合 结构域可操作地连接至Cα，其包含TCR V/C接合子的N末端片段并 具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列(KPDIQNPDP)。
在某些实施方式中，所述第一抗原结合部分连接至第一二聚化结 构域，并且所述第二抗原结合部分连接至第二二聚化结构域，其中所 述第一和所述第二二聚化结构域是相缔合的。在某些实施方式中，所 述缔合是经由连接子、二硫键、氢键、静电相互作用、盐桥或疏水- 亲水相互作用或其组合实现的。
在某些实施方式中，所述第一和/或所述第二二聚化结构域包含抗 体铰链区的至少一部分，其可选地来源于IgG1、IgG2或IgG4。
在某些实施方式中，C1包含工程化的Cβ，并且所述第一二聚化 结构域在第三接合结构域(其包含SEQ ID NO:25 (YGPPCPPCPAPEFLGGP))可操作地连接至所述工程化的Cβ。
在某些实施方式中，所述第二二聚化结构域可操作地连接至所述 第二抗原结合部分的重链可变结构域。
在某些实施方式中，所述第一和所述第二二聚化结构域是不同的， 并且以阻碍同源二聚化和/或促成异源二聚化的方式相缔合。
在某些实施方式中，所述第一和所述第二二聚化结构域能够经由 把手入孔、疏水相互作用、静电相互作用、亲水相互作用或增加的柔 性而缔合成为异源二聚体。
在另一个方面，本发明提供一种用于检测、诊断、预后或治疗疾 病或病况的试剂盒，其包含本发明所述的多肽复合物。
本发明的前述和其他特征以及优势在下文引用附图进行的对几个 实施方式的详述中将变得明显。
附图简述
图1呈现了所研究的抗体和形式的示意图。开发了抗CD3抗体 T3和抗CD19抗体U4。T3的恒定区(CL和CH1)被TCR的恒定结构 域取代，以设计与普通抗体正交的独特的轻-重链界面。TCR修饰的 T3和天然的U4与Fc结构域中的“把手入孔”突变共同用于设计双 特异性抗体形式E17和F16。
图2A-2D呈现了在抗体Fv与TCR恒定区的融合中的抗体Fv模 型和TCR结构的叠加形态提供的引导图。图2A呈现了基于公司内部 开发的抗CD3抗体T3的序列构造的抗体Fv结构模型。图2B呈现了 来自PDB 4L4T的TCR结构。图2C呈现了以不同的方向叠加在TCR 可变区上的抗体Fv结构模型。通过移除叠加形态中的TCR可变结构 域产生大体上的嵌合蛋白，如图2D所示的。接合区域中的重叠的残 基辅助设计接合区。将抗体VL链和TCRα链标为白色。将VH和β 链标为黑色。
图3A示出了天然TCRα链的序列及其具有突变的半胱氨酸残基 的对应序列。TRAC_人是α链恒定区的天然序列。4L4T_α_晶体为具 有可以形成链间二硫键的S55C突变的晶体结构(PDB码4L4T)的序 列。灰色区域为本发明中用于嵌合蛋白的骨架的恒定区。
图3B示出了天然TCRβ链的序列及其具有突变的半胱氨酸残基 的对应序列。
图4A-4B示出了具有移除的N-糖基化的TCR Cα和Cβ恒定区的 序列和编号。图4A示出了TCRα恒定区的序列和编号。图4B示出 了TCRβ恒定区的序列和编号。
图5示出了食蟹猴CD19转染的细胞系 WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9和CHO-K1亲本细胞系的流式细胞术 直方图。
图6示出了W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP的SDS-PAGE。M：蛋 白质标记物；1泳道：W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP，非还原；3泳道： W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP，还原。
图7示出了W3438-T3U4.F16-1.uIgG4的SEC-HPLC色谱图。
图8示出了W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP的SDS-PAGE。M：蛋 白质标记物；1泳道：W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP，非还原；2泳道： W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP，还原。
图9示出了W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP的SEC-HPLC色谱图。
图10A-10B示出了通过FACS测量的 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP与Ramos细胞(图10A)和Jurkat细 胞(图10B)的结合。
图11A-11B示出了通过FACS测量的 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP与Ramos细胞(图11A)和Jurkat细 胞(图11B)的结合。
图12示出了通过FACS测量的W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP与 表达食蟹猴-CD19的细胞的结合。
图13示出了通过ELISA测量的W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP与 食蟹猴CD3的结合。
图14A-14B示出了通过与Ramos(图14A)和Jurkat(图14B) 细胞的结合测量的W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP对人CD19和CD3 的亲和力。
图15A-15B示出了W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP与CD19和CD3 的双重结合(图15A)；以及阴性对照(图15B)。
图16A-16B示出了W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP对Raji细胞的 细胞杀伤活性(图16A)和W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP对Raji细胞 的细胞杀伤活性(图16B)。
图17A-17D示出了在存在或不存在CD19+靶细胞的情况下T细 胞上的CD69和CD25表达。示出了CD4+ T细胞亚群中CD69表达T 细胞的百分比(图17A)；CD8+ T细胞亚群中CD69表达T细胞的 百分比(图17B)；CD4+ T细胞亚群中CD25表达T细胞的百分比 (图17C)；CD8+T细胞亚群中CD25表达T细胞的百分比(图17D)。
图18A-18D示出了在存在或不存在CD19+靶细胞的情况下T细 胞的IFN-γ和TNF-α细胞因子释放。示出了CD4+ T细胞亚群中IFN-γ 的释放(图18A)；CD4+ T细胞亚群中TNF-α的释放(图18B)； CD8+ T细胞亚群中IFN-γ的释放(图18C)；CD8+ T细胞亚群中 TNF-α的释放(图18D)。
图19A-19B示出了W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP在人血清中的稳 定性。示出了在指定时间血清孵育的W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP样 品与Ramos细胞的结合(图19A)；在指定时间血清孵育的 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP样品与Jurkat的结合(图19B)。
图20示出了通过ELISA测量的W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP与 C1Q的结合。IgG1抗体用作测定对照。
图21示出了在将W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP以不同剂量施用 给携带Raji异种移植物肿瘤的混合人源PBMC小鼠后的肿瘤体积迹 线。数据点代表组平均值，误差条代表平均值的标准误差(SEM)。 不相关的IgG4抗体用作阴性对照。
图22示出了在1mg/kg的单次剂量后在食蟹猴血清中的 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP的浓度。通过ELISA检测来自两只猴的 血清样品。
图23A-23B示出了来自猴#1(图23A)和猴#2(图23B)的血 清样品中的抗药物抗体(ADA)，包括在W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP 给药前和给药后的。
发明详述
本发明的以下描述只为说明本发明的多种实施方式。
定义
冠词“一种”、“一个”和“所述”在此用于指代该冠词的语法 对象的一个/种或多于一个/种(即至少一个/种)。举例来说，“一种/个 多肽复合物”指一种/个多肽复合物或多于一种/个多肽复合物。
用于本发明的术语“约”或“大约”是指与参照量、水平、值、 数量、频率、百分比、维度、大小、量、重量或长度相差30、25、20、 25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的定量、水平、值、数量、 频率、百分比、维度、大小、量、重量或长度。在特定实施方式中， 当术语“约”或“大约”位于数值之前时，表示所述值加上或减去15％、 10％、5％或1％的范围。
在本申请全文中，除非上下文另有规定，词语“包含”、“包括” 和“含有”将被理解为表示包括所述的步骤或要素或一组步骤或要素， 但不排除任何其他步骤或要素或一组步骤或要素。“由……组成”所 表示的是包括并且限于短语“由……组成”之后的内容。因此，短语 “由……组成”表示所列出的要素是需要的或必需的，并且没有其他 要素可存在。“基本由……组成”所表示的是包括列于此短语之后的 任意要素，并且限于有助于或不妨碍所列的要素的如在本申请中详述 的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本由……组成”表示所列 出的要素是需要的或必需的，但其他要素是可选地并可取决于其是否 影响所列出的要素的活性或作用而存在或不存在。
在本申请全文中提及的“一个实施方式”、“实施方式”、“特 定实施方式”、“相关实施方式”、“某种实施方式”、“另外的实 施方式”或“进一步的实施方式”或其组合表示所描述的与所述实施 方式相关的特定特征、结构或特性包含于本申请的至少一个实施方式中。因此，在本说明书全文各处出现前述用语未必都指同一实施方式。 此外，所述特定特征、结构或特性可在一个或多个实施方式中以任意 适宜方式组合。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本申请中可互换使用，其指 氨基酸残基的聚合物，或多个氨基酸残基聚合物的集合体。这些术语 应用于其中的一个或多个氨基酸残基为对应的天然存在的氨基酸的人 造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天 然存在的氨基酸聚合物。术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨 基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式作用的氨基酸类似物和 氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸为由遗传密码编码的氨基酸，以及 之后经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝 氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即α碳结合至氢、羧基、氨基和R基)的化合物，例如高丝氨酸、 去甲亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这样的类似物具有经修饰 的R基(例如去甲亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保持与天然存在的 氨基酸相同的基本化学结构。α-碳是指附接至官能团(如羰基)的第 一个碳原子。β碳是指连接至α碳的第二个碳原子，并且此体系依希 腊字母的字母排列顺序继续命名碳原子。氨基酸模拟物是指具有不同 于氨基酸的一般化学结构的结构，但以与天然存在的氨基酸相似的方 式作用的化学化合物。术语“蛋白”通常是指大多肽。术语“肽”通常是指短多肽。多肽序列通常记述为多肽序列的左手端为氨基末端(N 末端)；多肽序列的右手端为羧基末端(C末端)。用于本申请的“多 肽复合物”是指包含一个或多个与实现某些功能相关的多肽的复合物。 在某些实施方式中，所述多肽是免疫相关的。
本发明中使用的术语“抗体”涵盖任意可结合某特定抗原的免疫球 蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或双特异性(双价) 抗体。一个天然的完整抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链由一 个可变区(“HCVR”)以及第一、第二和第三恒定区(分别为CH1、 CH2、CH3)组成，而每条轻链由一个可变区(“LCVR”)以及一个 恒定区(L)组成。哺乳动物的重链可分为α、δ、ε、γ和μ，哺乳动 物的轻链可分为λ或κ。抗体呈“Y”型，“Y”型结构的主干由两条重链 的第二和第三恒定区组成，其通过二硫键结合。“Y”型结构的每条臂 包含其中一条重链的可变区和第一恒定区，其与一条轻链的可变区和 恒定区结合。轻链和重链的可变区负责抗原的结合。每条链的可变区 均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(轻(L)链的CDR包含 LCDR1、LCDR2、LCDR3，重(H)链的CDR包含HCDR1、HCDR2、 HCDR3)。抗体的CDR边界可通过Kabat、Chothia或Al-Lazikani 命名法命名或识别。(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.，J.Mol. Biol.，273(4)，927(1997)；Chothia,C.等，J Mol Biol.Dec 5； 186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.，J.Mol.Biol.，196,901 (1987)；Chothia,C.等，Nature.Dec 21-28；342(6252):877-83(1989)； Kabat E.A.等，National Institutesof Health，马里兰贝塞斯达(1991))。 其中，三个CDR由被称为框架区(FR)的侧面连续部分间隔开，框 架区比CDR更加高度保守并形成一个支架支撑超变环。HCVR和 LCVR各包含4个FR，并且CDR和FR自氨基端至羧基端依以下顺 序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻 链的恒定区不参与抗原结合，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒 定区的氨基酸序列可以分成几类。根据是否含有α、δ、ε、γ和μ重链， 抗体可分别分为五个主要的分类或同种型：IgA、IgD、IgE、IgG和 IgM。几个主要的抗体分类还可分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2 (γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链) 或IgA2(α2重链)等。
用于本申请的术语“可变结构域”用于抗体时，是指包含一个或 多个CDR的抗体可变区或其片段。尽管可变结构域可包含完整可变 区(如HCVR或LCVR)，其也可能包含小于完整可变区但仍保持与 抗原结合或形成抗原结合位点的能力。
用于本申请的术语“抗原结合部分”是指由含有一个或多个CDR 的抗体部分或者任何其他结合抗原但不具有完整抗体结构的抗体片段 所形成的抗体片段。抗原结合部分的例子包含但不限于可变结构域、 可变区、双功能抗体(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二 硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv－dsFv')、 二硫键稳定的双功能抗体(ds diabody)、多特异性抗体、骆驼化单 域抗体(camelized single domainantibody)、纳米抗体、域抗体和双 价域抗体。抗原结合部分可以与母体抗体结合相同的抗原。在某些实 施方式中，抗原结合部分可包含来自特定人抗体的一个或多个CDR 移植至来自一个或多个不同的人抗体的框架区。抗原结合部分的更多 详细的形式记述于Spiess等，2015(同上)和Brinkman等，mAbs， 9(2)，pp.182–212(2017)，其全部内容通过引用并入本文。
抗体的“Fab”片段是指由一条轻链(包含可变区和恒定区)和 一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的那部分抗体分子。在 某些实施方式中，轻链和重链的恒定区均由TCR恒定区取代。
“Fab'”是指包含了部分铰链区的Fab片段。
“F(ab')2”指的是Fab的二聚体。
抗体的“fragment difficult(Fd)”是指可以与轻链组合以形成 Fab的重链片段氨基末端的半段。
抗体的“Fc”指的是由第一重链的第二(CH2)、第三(CH3) 恒定区经二硫键结合第二重链的第二和第三恒定区而组成的抗体的部 分。抗体的Fc部分负责多种不同的效应功能，如ADCC和CDC，但 不参与抗原的结合。
就抗体而言的“铰链区”包含将CH1域连接至CH2域的重链分 子的部分。此铰链区包含大约25个氨基酸残基且是柔性的，从而使得 两个N末端抗原结合区可以独立移动。
用于本申请的术语“CH2域”是指包含重链分子自IgG抗体的例 如约氨基酸244延伸至氨基酸360的部分，使用常规编号方案(氨基 酸244至360，Kabat编号系统；以及氨基酸231-340，EU编号系统； 参见Kabat,E.等，U.S.Department of Health and HumanServices (1983))。
“CH3结构域”自IgG分子的CH2域延伸至C末端，并且包含大 约108个氨基酸。某些免疫球蛋白类别，例如IgM，进一步包含CH4 区。
抗体的“Fv”指的是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv 片段由一条轻链的可变区结合一条重链的可变区组成。提供了数种Fv 设计，包含dsFv，其中两个域之间的连接通过引入的二硫键增强；并 且可以使用肽连接子将两个域结合在一起成为单个多肽而形成scFv。 已产生了含有重免疫球蛋白链或轻免疫球蛋白链的可变结构域连接至 对应的免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域和恒定结构域的Fv构建 体。还已将Fv多聚化以形成双功能抗体和三功能抗体(Maynard等， Annu Rev Biomed Eng 2 339-376(2000))。
“ScFab”是指具有经由多肽连接子将Fd连接至轻链的融合多 肽，产生了单链Fab片段(scFab)。
“TriFab”是指由3个具有Fab功能的单位组成的三价、双特异 性的融合蛋白。TriFab容纳两个普通Fab融合至不对称的类Fab部 分。
“Fab-Fab”是指通过将第一Fab臂的Fd链融合至第二Fab臂 的Fd链的N末端形成的融合蛋白。
“Fab-Fv”是指通过将HCVR融合至Fd链的C末端，且将LCVR 融合至轻链的C末端形成的融合蛋白。“Fab-dsFv”分子可以通过在 HCVR域和LCVR域间引入域间二硫键而形成。
“MAb-Fv”或“IgG-Fv”是指通过HCVR域融合至一条Fc链 的C末端和LCVR域单独表达或融合至另一条Fc链的C末端而形成 的融合蛋白，从而产生双特异性、三价的IgG-Fv(mAb-Fv)融合蛋 白，其Fv通过域间二硫键稳定。
“ScFab-Fc-scFv2”和“ScFab-Fc-scFv”是指单链Fab与Fc和 二硫键稳定的Fv域融合形成的融合蛋白。
“附接IgG”是指Fab臂融合至IgG以形成双特异性(Fab)2-Fc 的形式的融合蛋白。其可以形成Fab融合至IgG分子的C末端或N 末端的“IgG-Fab”或“Fab-IgG”，无论是否存在连接子。在某些实 施方式中，附接IgG可以被进一步修饰为IgG-Fab4的形式(参见Brinkman等2017，同上)。
“DVD-Ig”是指双可变结构域抗体，其通过第二特异性的另外的 HCVR域和LCVR域融合至IgG重链和轻链形成。“CODV-Ig”是 指其中两个HCVR和两个LCVR域以允许可变HCVR-LCVR域交叉 配对的方式连接的相关形式，其(自N至C末端)以HCVRA-HCVRB 和LCVRB-LCVRA的顺序，或以HCVRB-HCVRA和LCVRA-LCVRB的顺序排列。
“CrossMab”是指将未经修饰的轻链与对应的未经修饰的重链配 对，以及将经修饰的轻链与对应的经修饰的重链配对，从而产生轻链 中错配减少的抗体的技术。
“BiTE”是双特异性的T-细胞参与分子，包含具有LCVR-HCVR 方向上的第一抗原特异性的第一scFv连接至具有HCVR-LCVR方向 上的第二抗原特异性的第二scFv。
“WuXiBody”是包含可溶性嵌合蛋白的双特异性抗体，其具有抗 体的可变结构域和TCR的恒定结构域，其中TCR恒定结构域的亚基 (例如α和β结构域)通过工程化的二硫键连接。
当“百分比序列同一性”用于氨基酸序列(或核酸序列)时，是 指在进行序列比对，并且必要时引入间隔使相同氨基酸(或核酸)数 目达到最多后，在候选序列中，与参比序列相同的氨基酸(或核酸) 残基占所述候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。所述氨基酸 残基的保守取代可认为或可不认为是相同残基。可以通过本领域公开 的工具，例如BLASTN、BLASTp(美国国家生物技术信息中心网站 (NCBI)，也可参见Altschul S.F.等，J.Mol.Biol.，215:403–410(1990)； Stephen F.等，Nucleic Acids Res.，25:3389–3402(1997))、ClustalW2 (欧洲生物信息研究所网站，可参见Higgins D.G.等，Methods inEnzymology，266:383-402(1996)；Larkin M.A.等，Bioinformatics(英 国牛津)，23(21):2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR) 软件，对序列进行比对以确定氨基酸(或核酸)序列的百分比序列同 一性。本领域技术人员可使用所述工具的默认参数或可根据比对的需 要适当调整参数，例如通过挑选适宜的算法。
用于本申请的“抗原”或“Ag”是指可以在细胞培养或在动物体 内刺激产生抗体或T细胞应答的化合物、组合物、肽、多肽、蛋白或 物质，包含加入细胞培养物(如杂交瘤)中，或经注射或吸收进入动 物的组合物(如包含癌特异性蛋白的组合物)。抗原与特异性的体液 或细胞免疫的产物(如抗体)反应，包含由异源抗原诱导的产物。
“表位”或“抗原决定簇”是指抗原中与结合剂(如抗体)结合 的区域。表位可以形成自连续的氨基酸(也称为线性或顺序表位)或 通过蛋白的三级折叠而并列的非连续的氨基酸(也称为构型或构象表 位)。形成自连续的氨基酸的表位通常在蛋白上沿着一级氨基酸残基 线性排列，且连续的氨基酸的小段可以由与主要组织相容性复合体 (MHC)分子结合的抗原消化，或在暴露于变性溶剂时保留，而通过 三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位在一个独特 的空间构象中通常包含至少3个，更常见地包含至少5个、约7个或 约8-10个氨基酸。
本申请中的“特异性结合”或“特异性的结合”是指两分子间的 非随机结合反应，如抗体和抗原间的反应。在某些实施方式中，本申 请所述的多肽复合物和双特异性多肽复合物与抗原特异性结合，并且 其结合亲和力(KD)≤10-6M(例如≤5×10-7M、≤2×10-7M、≤10-7M、 ≤5×10-8M、≤2×10-8M、≤10-8M、≤5×10-9M、≤2×10-9M、≤10-9M或 ≤10-10M)。用于本申请的KD是指解离速率与结合速率的比值(koff/kon)， 可通过使用表面等离子共振法，例如使用如Biacore的仪器确定。
术语“可操作地连接”或“可操作地连接的”是指两个或更多个 目标生物学序列的以使其处于使其以目的方式作用的关系的方式并 列，无论是否存在间隔子或接头。当用于多肽时，该术语旨在表示多 肽序列以使所连接的产物具有目的生物学功能的方式连接。例如，可 将抗体可变区可操作地连接至恒定区，以形成具有抗原结合活性的稳 定产物。所述术语还可用于多核苷酸。举例来说，当编码多肽的多核 苷酸可操作地连接至调控序列(例如启动子、增强子、沉默子序列等) 时，该术语旨在表示所述多核苷酸序列以允许所述多肽由所述多核苷 酸调控表达的方式连接。
术语“融合”或“融合的”在用于氨基酸序列(例如肽、多肽或 蛋白)时，是指例如通过化学键合或重组手段，将两个或更多个氨基 酸序列组合成为非天然存在的单一氨基酸序列。融合氨基酸序列可通 过两个编码多核苷酸序列的基因重组产生，并且可以通过将含有重组 的多核苷酸的构建体引入宿主细胞的方法来表达。
用于本申请的术语“间隔子”是指具有1、2、3、4或5个氨基酸 残基，或长度为5至15、20、30、50或更多个氨基酸残基之间的通过 肽键连接且用于连接一个或多个多肽的人造氨基酸序列。间隔子可具 有或可不具有二级结构。间隔子序列是本领域公知的，参见例如 Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)；Poljak 等，Structure2:1121-1123(1994)。可以使用本领域公知的任意适宜的 间隔子。
术语“抗原特异性”是指被抗原结合分子选择性地识别的特定抗 原或其表位。
用于本申请的术语“取代”在用于氨基酸残基时是指在肽、多肽 或蛋白中将天然存在的或引入的一个或多个氨基酸用另一个取代。多 肽中的取代可导致多肽功能的减弱、增强或消除。
取代还可以是“保守取代”，其针对氨基酸序列时是指将一个氨 基酸残基用另一个具有相似理化性质的侧链的不同氨基酸残基取代， 或者对那些对多肽的活性并非至关重要的氨基酸的取代。例如，可以 在非极性侧链氨基酸残基间(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile、Pro、 Phe、Trp)、不带电的极性侧链残基间(例如Cys、Ser、Thr、Asn、 Gly和Gln)、酸性侧链残基间(例如Asp、Glu)、碱性侧链氨基酸 间(例如His、Lys和Arg)、β分支侧链氨基酸间(例如Thr、Val 和Ile)、含硫侧链氨基酸间(例如Cys和Met)或芳香侧链残基间(例 如Trp、Tyr、His和Phe)进行保守取代。在某些实施方式中，取代、 删除或添加也可以认为是“保守取代”。插入或删除的氨基酸的数量 的范围可以为约1至5。保守取代通常不引起蛋白构象结构上的显著 变化，并且因此能保持蛋白的生物学活性。
本申请使用的术语“突变”或“突变的”在用于氨基酸残基时是 指氨基酸残基的取代、插入或添加。
本申请使用的术语“T细胞”是指在细胞介导的免疫中起着重要 作用的一类淋巴细胞，包含辅助性T细胞(例如CD4+ T细胞、T辅 助性1型T细胞、T辅助性2型T细胞、T辅助性3型T细胞、T辅 助性17型T细胞)、细胞毒性T细胞(例如CD8+ T细胞)、记忆T 细胞(例如中央型记忆T细胞(TCM细胞)、效应型记忆T细胞(TEM 细胞和TEMRA细胞)和常驻型记忆T细胞(TRM)，其为CD8+ 或CD4+)、自然杀伤T(NKT)细胞和抑制性T细胞。
天然“T细胞受体”或天然“TCR”是与不变的CD3链结合以形 成能够介导信号转导的复合物的异二聚T细胞表面蛋白。TCR属于免 疫球蛋白超家族，且与具有单一重链和单一轻链的半抗体相似。天然 TCR具有胞外部分、跨膜部分和胞内部分。TCR的胞外结构域具有近膜恒定区和远膜可变区。
本申请使用的术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者” 是指需要诊断、预后、缓解、预防和/或治疗疾病或病症的人或非人动 物，包含哺乳动物或灵长类。哺乳类受试者包含人、畜养动物、农场 动物，以及动物园、体育或宠物动物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、 小鼠、马、猪、牛、熊等等。
双特异性多肽复合物
在一个方面，本申请提供双特异性多肽复合物。用于本申请的术 语“双特异性”表示存在两个抗原结合部分，其各自能够与不同抗原 或相同抗原上的不同表位特异性结合。本申请提供的双特异性多肽复 合物包含与第二抗原结合部分相缔合的第一抗原结合部分，并且其中 之一与CD3特异性结合，另一个与CD19特异性结合。也就是说，所 述第一抗原结合部分可与CD3特异性结合，且所述第二抗原结合部分 可与CD19特异性结合。或者，所述第一抗原结合部分可与CD19特 异性结合，且所述第二抗原结合部分可与CD3特异性结合。
在某些实施方式中，本申请提供一种双特异性多肽复合物，其包 含与第二抗原结合部分相缔合的第一抗原结合部分，其中：
所述第一抗原结合部分包含：
第一多肽，所述第一多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一 重链可变结构域(VH)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR) 恒定区(C1)，和
第二多肽，所述第二多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一 轻链可变结构域(VL)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)，
其中：
C1包含工程化的Cβ，所述Cβ包含SEQ ID NO:1，并且C2包 含工程化的Cα，所述Cα包含SEQ ID NO:2，
SEQ ID NO:1中的氨基酸C48和SEQ ID NO:2中的氨基酸C41 能够形成非天然的链间二硫键，
C1和C2能够形成二聚体，并且所述非天然的链间二硫键能够稳 定所述二聚体，以及
所述第二抗原结合部分包含：
第二抗体的第二重链可变结构域(VH2)，其可操作地连接至抗 体重链CH1结构域，和
第二抗体的第二轻链可变结构域(VL2)，其可操作地连接至抗 体轻链恒定(CL)结构域，
其中：
所述第一和所述第二抗原结合部分中的一个是抗CD3结合部分， 并且另一个是抗CD19结合部分，
抗CD3结合部分来源于抗CD3抗体，其包含：
a)包含SEQ ID NO：3的重链CDR1，b)包含SEQ ID NO：4 的重链CDR2，c)包含SEQ IDNO：5的重链CDR3，d)包含SEQ ID NO：6的κ轻链CDR1，e)包含SEQ ID NO：7的κ轻链CDR2， 和f)包含SEQ ID NO：8的κ轻链CDR3，
抗CD19结合部分来源于抗CD19抗体，其包含：
a)包含SEQ ID NO：9的重链CDR1，b)包含SEQ ID NO：10 的重链CDR2，c)包含SEQID NO：11的重链CDR3，d)包含SEQ ID NO：12的κ轻链CDR1，e)包含SEQ ID NO：13的κ轻链CDR2， 和f)包含SEQ ID NO：14的κ轻链CDR3，
并且
相比于第一和所述第二抗原结合部分均为天然Fab的对应部分的 情况，所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分更不容易发生 错配。
在某些实施方式中，本申请提供的双特异性多肽复合物包含含有 来源于TCR恒定区的序列的第一抗原结合部分，但所述第二抗原结 合部分不含有来源于TCR恒定区的序列。
本申请提供的双特异性多肽复合物显著地更不容易具有错配的重 链和轻链可变结构域。不希望受限于任何理论，据信所述第一抗原结 合部分中的稳定的TCR恒定区可以彼此特异性连接，并因此有助于 目标VH1和VL1的高度特异性的配对，同时阻碍VH1或VL1与不 提供目标抗原结合位点的其他可变区形成不想要的错配。
在某些实施方式中，所述第二抗原结合部分进一步包含可操作地 连接至VH2的抗体恒定CH1结构域，以及可操作地连接至VL2的抗 体轻链恒定结构域。因此，所述第二抗原结合部分包含Fab。
当第一、第二、第三和第四可变结构域(例如VH1、VH2、VL1 和VL2)在一个细胞中表达时，期望的是VH1与VL1特异性配对且 VH2与VL2特异性配对，以使得到的双特异性蛋白产物会具有正确 的抗原结合特异性。然而在诸如杂交-杂交瘤(或四源杂交瘤)的现有 技术中，VH1、VH2、VL1和VL2发生随机配对，从而导致多达10 种不同分子的生成，其中仅有一种为有功能的双特异性抗原结合分子。 这不仅降低了产率，还使目标产物的纯化变得复杂。
相比于第一和所述第二抗原结合部分均为天然Fab的对应部分的 情况，由于可变结构域更不容易发生错配，因而本申请所述的双特异 性多肽复合物是优越的。在一个示例性的实例中，所述第一抗原结合 结构域包含与VL1-C2配对的VH1-C1，且所述第二抗原结合结构域 包含与VL2-CL配对的VH2-CH1。已出人意料地发现C1和C2优先 与彼此相缔合，而且不太容易与CL或CH1相缔合，由此阻碍并显著 减少诸如C1-CH、C1-CL、C2-CH和C2-CL的不想要的配对的形成。 由于C1-C2的特异性缔合，VH1与VL1特异性配对并且从而形成所 述第一抗原结合位点，以及CH1与CL特异性配对，从而形成所述第 二抗原结合位点的VH2-VL2的特异性配对。相应地，所述第一抗原 结合部分和所述第二抗原结合部分更不容易错配，并且相比于所述第 一和所述第二抗原结合部分均为天然Fab的对应部分(例如为 VH1-CH1、VL1-CL、VH2-CH1和VL2-CL的形式)的情况，例如 VH1-VL2、VH2-VL1、VH1-VH2、VL1-VL2之间的错配显著减少。
在某些实施方式中，本申请所述的双特异性多肽复合物自细胞表 达时，相比于在可比的条件下表达的参照分子，具有显著更少的错配 产物(例如减少至少1、2、3、4、5或更多种错配产物)和/或显著更 高的产率(例如提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或更 多的产率)，其中所述参照分子除了以天然CH1取代C1和以天然 CL取代C2之外，在其他方面与所述双特异性多肽复合物相同。
包含工程化的Cα和Cβ的抗原结合部分
本申请所述的第一抗原结合部分包含可操作地连接至第一T细胞 受体(TCR)恒定区的第一抗体重链可变结构域，以及可操作地连接 至第二TCR恒定区的第一抗体轻链可变结构域，其中所述第一TCR 恒定区和第二TCR恒定区经由至少一个非天然链间二硫键相缔合。 所述第一抗原结合部分包含至少两条多肽链，其各自包含来源于抗体 的可变结构域和来源于TCR的恒定区。因此，所述第一抗原结合部 分包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其分别可操作地连接至一 对TCR恒定区。在某些实施方式中，第一抗原结合部分中的TCR恒 定区的配对是α/βTCR恒定区。本申请所述的多肽复合物的TCR恒 定区能够通过至少一个非天然的二硫键彼此缔合以形成二聚体。
出人意料地发现，可以将本申请所述的具有至少一个非天然二硫 键的第一抗原结合部分重组表达，并组装成所需的构象，其稳定化 TCR恒定区二聚体并提供抗体可变区的良好的抗原结合活性。另外， 发现所述第一抗原结合部分良好地承受常规的抗体工程化，例如糖基 化位点的修饰和一些天然序列的移除。此外，本申请所述的多肽复合 物可以被并入双异特性形式，其由于在所述第一抗原结合部分中存在TCR恒定区，可以容易地以抗原结合序列的最少错配或几乎无错配被 表达和组装。本申请所述的第一抗原结合部分和构建体的其他优势在 以下的公开内容中将变得更加明显。
总而言之，本申请提供的第一抗原结合部分包含第一多肽和第二 多肽，所述第一多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一重链可变 结构域(VH)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区 (C1)，所述第二多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一轻链 可变结构域(VL)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)，其 中：C1包含工程化的Cβ，所述Cβ包含SEQ ID NO:1，并且C2包 含工程化的Cα，所述Cα包含SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:1中的氨基酸C48和SEQ ID NO:2中的氨基酸C41能够形成非天然的链间二 硫键，C1和C2能够形成二聚体，并且C1和C2之间的非天然的链 间二硫键能够稳定所述二聚体。
TCR恒定区
本申请所述的第一抗原结合部分包含来源于TCR的α或β恒定 区。
图3A和3B列出了TCRα和β链的天然TCR恒定区的氨基酸序 列。为明确和一致性起见，在图4A和4B中对这些序列中的每个氨基 酸残基进行编号，并且这些编号在本申请全文中用于指代特定TCR 恒定区上的特定氨基酸残基。
人TCRα链恒定区被称为TRAC，其NCBI登录号为P01848， 或其氨基酸序列为SEQ IDNO:31。
人TCRβ链恒定区有两个不同的变体，称为TRBC1和TRBC2 (IMGT命名法)(亦参见Toyonaga B等，PNAs，Vol.82， pp.8624-8628，Immunology(1985))。TRBC1序列(SEQ ID NO:33) 被选择作为骨架来设计本申请所述的多肽复合物。
具体来说，天然TCRβ链在位置74含有天然半胱氨酸残基(参 见图4B)，其未配对并且因此不形成天然α/βTCR中的二硫键。在 本申请所述的多肽复合物中，TCRβ链的位置74处的此天然半胱氨 酸残基被突变为丙氨酸残基。这可有助于避免错误的链内或链间配对。在某些实施方式中，某些实施方式中的取代可以提高TCR的体外重 折叠效率。
在本申请中，本申请所述的第一抗原结合部分的所述第一和所述 第二TCR恒定区能够形成二聚体，所述二聚体包含所述TCR恒定区 之间的至少一个能够稳定所述二聚体的非天然链间二硫键。
用于本申请的术语“二聚体”是指由两个分子(如多肽或蛋白) 经由共价或非共价的相互作用形成的相缔合的结构。同源二聚体或同 源二聚化由两个相同的分子形成，而异源二聚体或异源二聚化由两个 不同的分子形成。由所述第一和所述第二TCR恒定区形成的二聚体 为异源二聚体。
“突变的”氨基酸残基是指被取代、插入或添加并且不同于其对 应的天然TCR恒定区中对应的天然残基的氨基酸残基。例如，如果 将野生型TCR恒定区中特定位点处的氨基酸残基称为“天然”残基， 那么其对应的突变残基为不同于所述天然残基但位于所述TCR恒定 区上的相同位置的任何残基。突变残基可以是在相同位置取代天然残 基的不同残基，或在天然残基之前插入并因此占据其原位置。
在本文提供的多肽复合物中，所述第一和/或所述第二TCR恒定 区已被工程化以包含一个或多个负责形成所述非天然链间二硫键的突 变氨基酸残基。为了将这样的突变残基引入所述TCR恒定区，可以 操纵TCR区的编码序列，以例如将编码天然残基的密码子取代为编 码突变残基的密码子，或者以将编码突变残基的密码子插入天然残基 的密码子之前。
在本文提供的多肽复合物中，所述第一和/或所述第二TCR恒定 区已被工程化以包含一个或多个突变的半胱氨酸残基，使得在取代半 胱氨酸残基之后，在两个TCR恒定区之间能形成非天然链间二硫键。
非天然链间二硫键能够稳定所述第一抗原结合部分。这种稳定方 面的效果可以以各种方式体现。例如，突变氨基酸残基或非天然链间 二硫键的存在可以使所述多肽复合物能够稳定表达，和/或以高水平表 达，和/或缔合至具有理想的生物活性(例如抗原结合活性)的稳定复 合物，和/或表达并组装为高水平的具有理想的生物活性的理想的稳定 复合物。可以使用本领域公知的适宜方法(如在SDS-PAGE上显示分 子量，或通过差示扫描量热法(DSC)或差示扫描荧光法(DSF)测 量热稳定性)来评估链间二硫键稳定所述第一和第二TCR恒定区的 能力。在一个示例性的实例中，如果产物显示分子量与所述第一和所 述第二多肽的组合的分子量相当，则可以通过SDS-PAGE确认形成了 稳定的本申请所述的第一抗原结合部分。在某些实施方式中，本申请 所述的第一抗原结合部分是稳定的，体现于其热稳定性不少于天然 Fab的50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施方式中，本申请 所述的第一抗原结合部分是稳定的，体现于其热稳定性可与天然Fab 相当。
不希望受到任何理论的限制，据信形成于所述第一抗原结合部分 中的所述第一和所述第二TCR恒定区之间的所述非天然链间二硫键 能够稳定TCR恒定区的异二聚体，从而增强所述异二聚体的和所述 第一抗原结合部分的正确折叠水平、结构稳定性和/或表达水平。不同 于T细胞表面的细胞膜上锚定的天然TCR，发现天然TCR胞外结构 域的异二聚体更不稳定，尽管其在3D结构上与抗体Fab相似。事实 上，天然TCR在溶解状态中的不稳定性曾是使其晶体结构难以阐明 的显著阻碍(参见Wang，Protein Cell，5(9)，pp.649–652(2014))。 通过将一对半胱氨酸(Cys)突变引入TCR恒定区并且从而使链间非 天然二硫键能够形成，可以稳定表达所述第一抗原结合部分同时保留 抗体可变区的抗原结合能力。
包含突变残基的TCR恒定区在本申请中也称为“工程化的”TCR 恒定区。在某些实施方式中，所述多肽复合物的第一TCR恒定区(C1) 包含工程化的TCRα链(Cα)，并且所述第二TCR恒定区(C2)包 含工程化的TCRβ链(Cβ)。在本文提供的多肽复合物中，C1包含 工程化的Cβ，且C2包含工程化的Cα。
在本文提供的多肽复合物中，所述工程化的TCR恒定区包含一 个或多个突变的半胱氨酸残基，所述一个或多个突变的残基包含于所 述第一和/或所述第二工程化的恒定区的接触界面内。
用于本申请的术语“接触界面”是指在所述多肽上所述多肽彼此 相互作用/相缔合的特定区域。接触界面包含一个或多个氨基酸残基， 其能够在相互作用发生时与接触或缔合的对应的氨基酸残基相互作 用。接触界面中的氨基酸残基可处于或可不处于连续的序列中。例如， 当所述界面是三维的时，所述界面内的氨基酸残基可以在线性序列上 的不同位置彼此分开。
在某些实施方式中，所述工程化的Cα与所述工程化的Cβ之间可 以形成一个或多个二硫键。在某些实施方式中，Cβ中的突变的半胱氨 酸残基是S56C(对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸C48)，并且Cα 中的突变的半胱氨酸残基是T49C(对应于SEQ ID NO:2中的氨基酸C41)，并且其中所述半胱氨酸残基的配对能够形成非天然链间二硫 键。
用于本申请全文的关于TCR恒定区的“XnY”旨在表示TCR恒 定区上的第n个氨基酸残基X(基于如本申请所提供的图4A-4B中的 编号)被取代为氨基酸残基Y，其中X和Y分别为特定氨基酸残基的 单字母缩写。应当注意，数字n仅基于图4A-4B中提供的编号，且其 可能看起来与其实际位置不同。为了说明，使用SEQ ID NO:1中所 示的Cβ(S56C)(N69Q)的序列作为示例。尽管由S至C的取代发生于 SEQ ID NO:1的第48个残基处，但基于图4A-4B中的编号系统，这 一残基被命名为第56个残基，且因此由S至C的取代被命名为S56C 而不是S48C。相似地，由N至Q的取代基于图4A-4B中的编号系统 也被命名为N69Q。除非另外明确说明，否则这一氨基酸残基取代的 命名规则应用于本申请中的全部TCR恒定区。
在本文提供的多肽复合物中，所述工程化的Cβ包含或为SEQ ID NO:1，并且所述工程化的Cα包含或为SEQ ID NO:2。
SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列提供于下文：
SEQ ID NO:1
EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNG KEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRN HFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
SEQ ID NO:2
AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKC VLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPES S
在本申请所述的多肽复合物中，天然TCR恒定区中存在的一个 或多个天然糖基化位点可被修饰(例如移除)。用于本申请的术语“糖 基化位点”用于多肽序列时是指带有碳水化合物部分(例如寡糖结构) 可以附接至其的侧链的氨基酸残基。多肽(诸如抗体)的糖基化通常 是N连接的或O连接的。N连接的是指碳水化合物部分附接至天冬酰 胺残基的侧链，例如三肽序列如天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏 氨酸中的天冬酰胺残基，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。O连 接的糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附接至羟基氨基 酸，最常见的是附接至丝氨酸或苏氨酸。通过改变氨基酸序列，使得 存在于该序列中的上述三肽序列(对于N连接的糖基化位点)中的一 个或多个或者丝氨酸或苏氨酸残基(对于O连接的糖基化位点)中的 一个或多个被取代，可以方便地实现对天然糖基化位点的移除。
在某些实施方式中，在本申请所述的第一抗原结合部分中，至少 一个天然糖基化位点在所述工程化的TCR恒定区中(例如在所述第 一和/或所述第二TCR恒定区中)不存在。不希望受限于任何理论， 据信本申请所述的第一抗原结合部分可以允许移除全部或部分糖基化 位点，而不影响蛋白表达和稳定性，这与现有教导相反，即N连接的 糖基化位点在TCR恒定区如Cα(即N34、N68和N79)和Cβ(即 N69)上的存在对于蛋白表达和稳定性是必要的(参见Wu等，Mabs， 7:2，364-376，2015)。
在某些实施方式中，在本申请所述的第一抗原结合部分中所述工 程化的Cα中在N34、N68和N79处的N-糖基化位点不存在。在某些 实施方式中，不存在糖基化位点的工程化的Cα序列包含或为SEQ ID NO:2。在所述第一抗原结合部分中，所述工程化的Cβ中在N69处的 N-糖基化位点不存在。不存在糖基化位点的工程化的Cβ序列 (TRBC1)包含或为SEQ IDNO:1。
在本申请所述的第一抗原结合部分中，来源于TCR的恒定区可 操作地连接至来源于抗体的可变区。
在某些实施方式中，所述第一抗体可变结构域(VH)在第一接合 结构域融合至所述第一TCR恒定区(C1)，所述第一抗体可变结构 域(VL)在第二接合结构域融合至所述第二TCR恒定区(C2)。
用于本申请的术语“接合结构域”是指两个氨基酸序列融合或组 合的交界或边界区。
在某些实施方式中，所述第一接合结构域包含抗体V/C接合子的 C末端片段的至少一部分，以及第二接合结构域包含TCR V/C接合子 的N末端片段的至少一部分。
用于本申请的术语“抗体V/C接合子”是指抗体可变结构域和恒 定结构域的交界，例如重链可变结构域与CH1结构域之间或轻链可变 结构域与轻链恒定结构域之间的交界。相似地，术语“TCR V/C接合 子”是指TCR可变结构域和恒定结构域的交界，例如TCRα可变结构域与恒定结构域之间或TCRβ可变结构域与恒定结构域之间的交 界。
在某些实施方式中，所述第一多肽包含序列，所述序列包含如式 (I)可操作连接的结构域：VH-HCJ-C1，且所述第二多肽包含序列， 所述序列包含如式(II)可操作连接的结构域：VL-LCJ-C2，其中：
VH为抗体的重链可变结构域；
HCJ为如上文定义的第一接合结构域；
C1为如上文定义的第一TCR恒定结构域；
VL为抗体的轻链可变结构域；
LCJ为如上文定义的第二接合结构域；
C2为如上文定义的第二TCR恒定结构域。
在此类实施方案中，C1是工程化的Cβ，其包含或是SEQ ID NO： 1，并且C2是工程化的Cα，其包含或是SEQ ID NO：2，HCJ包含 或是SEQ ID NO：23，并且LCJ包含或是SEQ ID NO：24。
抗体可变区
本申请所述的双特异性多肽复合物包含与第二抗原结合部分缔合 的第一抗原结合部分，且其中的一个特异性地与CD3结合，另一个特 异性地与CD19结合。在某些实施方式中，所述第一抗原结合部分包 含第一抗体的第一重链可变结构域(VH1)和第一轻链可变结构域 (VL1)，并且所述第二抗原结合部分包含第二抗体的第二重链可变 结构域(VH2)和第二轻链可变结构域(VL2)，其中所述第一抗体 和所述第二抗体是不同的并且选自由抗CD3抗体和抗CD19抗体组成 的组。在某些实施方式中，所述第一抗体是抗CD3抗体，第二抗体是抗CD19抗体。在某些其他实施方式中，所述第一抗体为抗CD19抗 体，且所述第二抗体为抗CD3抗体。
在常规的天然抗体中，可变区包含由侧翼的框架(FR)区间隔开 的3个CDR区，例如自N末端至C末端以下式所列出的： FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
a)抗-CD3结合部分
在本文提供的多肽复合物中，所述第一抗原结合部分或所述第二 抗原结合部分为抗CD3结合部分。在某些实施方式中，所述抗CD3 结合部分来源于下表A显示的抗CD3抗体WBP3311_2.306.4-z1。以 下提供了WBP3311_2.306.4-z1抗体的CDR序列。
表A
以下提供了WBP3311_2.306.4-z1抗体的重链和κ轻链可变区序 列。
WBP3311_2.306.4-z1-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:15)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQA PGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMEL SSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:16)：
CAGGTGCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCAGAAGTGAAGAA GCCTGGGTCTAGTGTCAAGGTGTCATGCAAGGCTAGCGGGT TCGCCTTTACTGACTACTACATCCACTGGGTGCGGCAGGCTC CCGGACAAGGGTTGGAGTGGATGGGATGGATCTCCCCAGGC AATGTCAACACAAAGTACAACGAGAACTTCAAAGGCCGCGTC ACCATTACCGCCGACAAGAGCACCTCCACAGCCTACATGGAG CTGTCCAGCCTCAGAAGCGAGGACACTGCCGTCTACTACTGT GCCAGGGATGGGTACTCCCTGTATTACTTTGATTACTGGGGC CAGGGCACACTGGTGACAGTGAGCTCC
WBP3311_2.306.4-z1-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:17)：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAW YQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQ AEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIK
核酸序列(SEQ ID NO:18)：
GATATCGTGATGACCCAGAGCCCAGACTCCCTTGCTGTC TCCCTCGGCGAAAGAGCAACCATCAACTGCAAGAGCTCCCAA AGCCTGCTGAACTCCAGGACCAGGAAGAATTACCTGGCCTG GTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATCTA CTGGGCCTCCACCCGGCAGTCTGGGGTGCCCGATCGGTTTA GTGGATCTGGGAGCGGGACAGACTTCACATTGACAATTAGCT CACTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGTACTCAG AGCCACACTCTCCGCACATTCGGCGGAGGGACTAAAGTGGA GATTAAG
已知CDR负责抗原结合。
在某些实施方案中，本文提供的抗CD3结合部分包含 WBP3311_2.306.4-z1的重链CDR3序列。在某些实施方案中，本文提 供的抗CD3结合部分包含重链CDR3，其包含SEQ IDNO：5。重链 CDR3区位于抗原结合位点的中心，因此被认为与抗原接触最多并为 抗体对抗原的亲和力提供最多自由能。还认为，通过多种多样化机制， 重链CDR3在长度、氨基酸组成和构象方面是迄今为止抗原结合位点 中最多样的CDR(Tonegawa S.，Nature.302：575-81(1983))。重 链CDR3的多样性足以产生大多数抗体特异性(Xu JL，Davis MM。，Immunity.13：37-45(2000))以及所需的抗原结合亲和力(Schier R， 等，J.Mol Biol.263：551-67(1996))。
本文提供的抗CD3结合部分还包含合适的框架区(FR)序列， 只要抗CD3结合部分可以特异性结合CD3。
人源化抗CD3抗体WBP3311_2.306.4-z1对表达CD3的细胞(例 如CD4T细胞)具有特异性结合亲和力，并且可以激活人T细胞并触 发TNFα和IFNγ的细胞因子释放。
在某些实施方案中，本文提供的抗CD3结合部分包含含有SEQ ID NO：15的重链可变域序列和含有SEQ ID NO：17的轻链可变域 序列。
本申请所述的抗CD3结合部分的结合亲和力可以由KD值表示， 其表示当抗原和抗原结合分子之间的结合达到平衡时解离速率与缔合 速率的比值(koff/kon)。使用本领域公知的适宜方法，包括例如流式 细胞术测定，可以恰当地确定抗原结合亲和力(例如KD)。在一些实 施方式中，可以通过流式细胞术确定不同浓度下抗体与抗原的结合， 可以首先将确定的平均荧光强度(MFI)对抗体浓度制图，随后可以 通过使用Prism版本5(GraphPadSoftware，圣地亚哥，加利福尼亚) 将特异性结合荧光强度(Y)与抗体浓度(X)的依赖性拟合至单位点 饱和方程式：Y＝Bmax*X/(KD+X)，从而计算出KD值，其中Bmax是指待测抗体与抗原的最大特异性缔合。
在某些实施方式中，本申请所述的抗CD3结合部分能够特异性地 与表达在细胞表面上的人CD3或重组人CD3结合。CD3为在细胞上 表达的受体。重组CD3为重组表达且不与细胞膜缔合的可溶性CD3。 重组CD3可以通过多种重组技术制备。在一个实例中，编码人CD3胞外结构域(NP_000724.1)(Met1-Asp126)的CD3DNA序列可在 表达载体中在C末端处与聚组氨酸标签融合，并随后在293E细胞中 被转染与表达，并通过镍亲和层析纯化。
在一些实施方式中，本申请所述的抗CD3结合部分能够以不超过 5×10-9M、不超过4×10-9M、不超过3×10-9M、不超过2×10-9M、不超 过10-9M、不超过5×10-10M、不超过4×10- 10M、不超过3×10-10M、不 超过2×10-10M、不超过10-10M、不超过5×10-11M或不超过4×10-11M、不超过3×10-11M或不超过2×10-11M或不超过10-11M的结合亲和力 (KD)特异性地与表达在细胞表面上的人CD3结合，所述KD值是通 过流式细胞术测定的。
在某些实施方式中，本申请所述的抗CD3结合部分与食蟹猴CD3 (例如表达在细胞表面上的食蟹猴CD3，或可溶性的重组食蟹猴 CD3)交叉反应。
抗CD3结合部分与重组CD3或表达在细胞表面上的CD3的结合 可以通过本领域公知的方法测定，例如夹心法(如ELISA)、Western 印迹、流式细胞术和其他结合试验。在某些实施方式中，本申请所述 的抗CD3结合部分以不超过0.01nM、不超过0.02nM、不超过0.03nM、不超过0.04nM、不超过0.05nM、不超过0.06nM、不超过0.07 nM或不超过0.08nM的EC50(即50％结合浓度)特异性地与重组人 CD3结合，所述EC50值通过ELISA测定。在某些实施方式中，本申 请所述的抗CD3结合部分以不超过0.5nM、不超过0.6nM、不超过 0.7nM、不超过0.8nM、不超过0.9nM、不超过1nM、不超过2nM、 不超过3nM、不超过4nM、不超过5nM、不超过6nM、不超过7nM、 不超过8nM、不超过9nM或不超过10nM的EC50特异性地与表达 在细胞表面上的人CD3结合，所述EC50值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，所述抗CD3结合部分以与人CD3相似的结 合亲和力与食蟹猴CD3结合。例如，示例性抗体WBP3311_2.306.4 以与人CD3相似的亲和力或EC50值与食蟹猴CD3结合。
在某些实施方式中，本申请所述的抗CD3结合部分以不超过0.001 nM、不超过0.005nM、不超过0.01nM、不超过0.02nM、不超过0.03 nM、不超过0.04nM或不超过0.05nM的EC50特异性地与重组食蟹 猴CD3结合，所述EC50值通过ELISA测定。
在某些实施方式中，本申请所述的抗CD3结合部分具有足以用于 诊断性和/或治疗性应用的与人CD3的特异性结合亲和力。许多治疗 方案通过靶向TCR信号传导，特别是通过临床使用的抗人CD3单克 隆抗体调节T细胞免疫力。
b)抗CD19抗体
在本文提供的多肽复合物中，所述第一抗原结合部分或所述第二 抗原结合部分为来源于抗CD19抗体的抗CD19结合部分。在某些实 施方案中，抗CD19结合部分来源于下表B显示的抗CD19抗体 W7011-4.155.8-z1-P15。以下提供了抗CD19抗体的CDR序列。
表B
以下提供了WBP7011_4.155.8-z1-P15抗体的重链和κ轻链可变区 序列。
W7011-4.155.8-z1-P15-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:19)：
QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQ ARGQRLEWIGYIDPYNADTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYME LSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:20)：
CAAATGCAGCTCGTCCAGTCTGGACCTGAAGTGAAGAAG CCCGGGACATCCGTCAAGGTCTCATGTAAGGCTAGCGGGTA CGCATTCACTTCCTACAACATGTACTGGGTGCGCCAGGCCAG AGGACAGAGGTTGGAGTGGATCGGCTACATCGACCCATACA ACGCCGATACTACCTACAATCAGAAGTTTAAAGGGCGGGTGA CCATTACCCGGGATATGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGC TGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGC CTGACAACAGCCTATGCCATGGACTATTGGGGCCAGGGCAC ACTTGTGACTGTGAGCAGT
W7011-4.155.8-z1-P15-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:21)：
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGK APKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC HQWSSYPYTFGQGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:22)：
GACATCCAGCTCACCCAATCCCCTTCTTTCCTCTCCGCA AGTGTCGGAGATAGGGTGACTATCACCTGCTCAGCTTCTTCA ACCGTGAACTACATGCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGGAA AGCCCCAAAGCTGCTGATCTACAGCACCTCCAATCTGGCCAG TGGAGTGCCAAGCCGGTTTAGCGGGAGCGGCTCCGGCACTG AATTCACTTTGACAATTAGCAGCCTTCAGCCTGAGGACTTTG CCACATATTACTGTCACCAGTGGTCCAGCTACCCCTACACATTCGGGCAGGGCACAAAGCTGGAGATTAAG
已知CDR负责抗原结合。
在某些实施方案中，本文提供的抗CD19结合部分包含 W7011-4.155.8-z1-P15的重链CDR3序列。在某些实施方案中，本文 提供的抗CD19结合部分包含重链CDR3，其包含SEQID NO：11。 重链CDR3区位于抗原结合位点的中心，因此被认为与抗原接触最多 并为抗体对抗原的亲和力提供最多自由能。还认为，通过多种多样化 机制，重链CDR3在长度、氨基酸组成和构象方面是迄今为止抗原结 合位点中最多样的CDR(Tonegawa S.，Nature.302：575-81(1983))。 重链CDR3的多样性足以产生大多数抗体特异性(Xu JL，Davis MM。，Immunity.13：37-45(2000))以及所需的抗原结合亲和力(Schier R， 等，J.Mol Biol.263：551-67(1996))。
在某些实施方案中，本文提供的抗CD19结合部分包含含有SEQ ID NO：19的重链可变域序列和含有SEQ ID NO：21的轻链可变域 序列。
在一些实施方式中，本申请所述的抗CD19结合部分能够以不超 过5×10-9M、不超过1×10-9M、不超过9×10-10M、不超过8×10-10M、 不超过7×10-10M、不超过6×10-10M、不超过5×10-10M、不超过4×10-10M、 不超过3×10-10M、不超过2×10-10M或不超过1×10-10M的结合亲和力 (KD)，特异性地与表达在细胞表面上的人CD19结合，所述KD值 通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，本申请所述的抗CD19结合部分与食蟹猴 CD19(例如在细胞表面表达的食蟹猴CD19或可溶性重组食蟹猴 CD19)交叉反应。
所述抗CD19结合部分与表达在细胞上的CD19的结合可以通过 本领域公知的方法测定，例如夹心法(如ELISA)、Western印迹、 流式细胞测定和其他结合试验。在某些实施方式中，本申请所述的抗 CD19结合部分以不超过0.01nM、不超过0.02nM、不超过0.03nM、 不超过0.04nM、不超过0.05nM、不超过0.1nM、不超过0.2nM、 不超过0.3nM、不超过0.4nM、不超过0.5nM、不超过0.6nM、不 超过0.7nM、不超过0.8nM、不超过0.9nM或不超过1nM的EC50特异性地与表达在细胞上的人CD19结合，所述EC50值通过流式细胞 术测定。
在某些实施方式中，抗CD19结合部分以与人CD19相似的结合 亲和力结合食蟹猴CD19。在某些实施方式中，本申请所述的抗CD19 结合部分以不超过0.2nM、不超过0.5nM、不超过0.8nM、不超过1 nM、不超过2nM或不超过3nM的EC50特异性地与表达在细胞上的 食蟹猴CD19结合，所述EC50值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，本申请所述的抗CD19结合部分以不超过1 pM、不超过2pM、不超过3pM、不超过4pM、不超过5pM、不超 过6pM、不超过7pM、不超过8pM、不超过9pM、不超过10pM、 不超过11pM、不超过12pM、不超过13pM、不超过14pM、不超 过15pM、不超过16pM、不超过17pM、不超过18pM、不超过19 pM、不超过20pM、不超过21pM、不超过22pM、不超过23pM、 不超过24pM、不超过25pM、不超过30pM、不超过35pM、不超过 40pM、不超过45pM或不超过50pM的EC50被CD19表达细胞内化， 所述EC50值通过Fab-Zap试验测定。
双特异性多肽复合物
在某些实施方式中，所述第一和/或所述第二抗原结合部分是多价 的，如二价、三价、四价的。用于本申请的术语“价”是指给定分子 中存在指定数量的抗原结合位点。由此，术语“二价”、“四价”和 “六价”分别表示抗原结合分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。如果两个结合位点都用于与同一抗原或同一表位特 异性结合，则二价分子可以是单特异性的。同样，三价分子可以是双 特异性的，例如当两个结合位点是针对第一抗原(或表位)单特异性 的，而第三个结合位点是针对第二抗原(或表位)特异性的。在某些 实施方式中，本申请所述的双特异性多肽复合物中的所述第一和/或所 述第二抗原结合部分可以是二价、三价或四价的，其具有至少两个针 对同一抗原或表位的结合位点。在某些实施方式中，这提供了比单价 的对应抗体更强的与所述抗原或表位的结合。在某些实施方式中，在 二价抗原结合部分中，结合位点的第一价和结合位点的第二价在结构 上相同(即具有相同序列)或在结构上不同(即具有不同序列但特异 性相同)。
在某些实施方式中，所述第一和/或所述第二抗原结合部分是多价 的，并且包括两个或更多个可操作地互相缔合在一起的抗原结合位点， 具有或不具有间隔子。
在某些实施方式中，所述第二抗原结合部分包含所述第二抗体的 两个或更多个Fab。两个Fab可以可操作地互相缔合，例如，第一Fab 可以经由重链共价附接至第二Fab，之间存在或不存在间隔子。
在某些实施方式中，所述第一抗原结合部分连接至第一二聚化结 构域，且所述第二抗原结合部分连接至第二二聚化结构域。用于本申 请的术语“二聚化结构域”是指能够相互缔合以形成二聚体的肽结构 域，或者在一些示例中，使两个肽能够自发二聚化的肽结构域。
在某些实施方式中，所述第一二聚化结构域可以与所述第二二聚 化结构域相缔合。所述缔合可以经由任何适宜的相互作用或联接或键 合(例如经由连接子、二硫键、氢键、静电相互作用、盐桥，或疏水- 亲水相互作用，或其组合)实现。示例性的二聚化结构域包括但不限 于抗体铰链区、抗体CH2结构域、抗体CH3结构域，以及其他能够 二聚化及互相缔合的适宜的蛋白单体。铰链区、CH2和/或CH3结构 域可以来源于任何抗体同种型，如IgG1、IgG2和IgG4。
“二硫键”是指具有R-S-S-R’结构的共价键。氨基酸半胱氨酸包 含巯基，其可以与例如来自另一半胱氨酸残基的第二巯基形成二硫键。 所述二硫键可以在分别存在于两个多肽链上的两个半胱氨酸残基的巯 基之间形成，从而形成链间桥或链间键。
氢键是当氢原子共价结合至高度电负性的原子(如氮、氧或氟) 时，由两个极性基团之间的静电相互作用形成。氢键可以在多肽中两 个残基各自的骨架氧(例如硫族基团)与酰胺氢(氮基团)之间形成， 如Asn中的氮基团与His中的氧基团，或Asn中的氧基团与Lys中的 氮基团。氢键强于范德瓦尔斯相互作用，但弱于共价键或离子键，对 于维持二级结构和三级结构十分关键。例如，当氨基酸残基的间隔在 位置i和i+4之间规律发生时，形成α螺旋，而β折叠为当两条肽段 通过至少两个或三个骨架氢键连接时形成的长度为3-10个氨基酸的 肽链段，其形成扭转、褶皱的片层。
静电相互作用为非共价相互作用，在蛋白折叠、稳定性、柔性和 功能中十分重要，包含离子相互作用、氢键合和卤键合。静电相互作 用可以形成于多肽中，例如在Lys与Asp之间、在Lys与Glu之间、 在Glu与Arg之间，或在第一链上的Glu、Trp与第二链上的Arg、 Val或Thr之间。
盐桥为近距离的静电相互作用，其主要产生于Asp或Glu的阴离 子羧酸根和来自Lys的阳离子铵或来自Arg的胍根，其为天然蛋白 结构中空间上靠近的带相反电荷的残基对。主要疏水的界面中的带电 和极性残基可作为用于结合的热点。包含具有可电离的侧链的残基(如 His、Tyr和Ser)在内的其他残基也可以参与盐桥的形成。
疏水相互作用可以在第一链上的一个或多个Val、Tyr和Ala与 第二链上的一个或多个Val、Leu和Trp之间形成，或第一链上的His 和Ala与第二链上的Thr和Phe之间形成(参见Brinkmann等，2017， 同上)。
在某些实施方式中，所述第一和/或所述第二二聚化结构域包含抗 体铰链区的至少一部分。在某些实施方式中，所述第一和/或所述第二 二聚化结构域可进一步包含抗体CH2结构域和/或抗体CH3结构域。 在某些实施方式中，所述第一和/或所述第二二聚化结构域包含铰链 -Fc区的至少一部分，即铰链-CH2-CH3结构域。在某些实施方式中， 所述第一二聚化结构域可以可操作地连接至第一TCR恒定区的C末 端。在某些实施方式中，所述第二二聚化结构域可以可操作地连接至 第二抗原结合部分的抗体CH1恒定区的C末端。
在本文提供的多肽复合物中，C1包含工程化的CBeta，并且第一 二聚化结构域在第三连接结构域可操作地连接至工程化的CBeta，第 三连接结构域包含SEQ ID NO：25。
在本文提供的多肽复合物中，所述第一二聚化结构域可操作地连 接至工程化的TCR恒定区的C末端，并且一起形成嵌合恒定区。也 就是说，所述嵌合恒定区包括所述第一二聚化结构域与所述工程化的 TCR恒定区可操作地连接。
在某些实施方式中，所述嵌合恒定区包括附接至来源于IgG1、 IgG2或IgG4的第一铰链-Fc区的工程化的Cβ。这种嵌合恒定区的示 例性序列提供于实施例2中。
在某些实施方式中，所述嵌合恒定区进一步包含第一抗体CH2 结构域和/或第一抗体CH3结构域。例如，所述嵌合恒定区进一步包 含附接至所述第三接合结构域的C末端的第一抗体CH2-CH3结构域。 这种嵌合恒定区的示例性序列提供于实施例2中。
这些嵌合恒定区和第二TCR恒定区对是有用的，因为其可以被 操作以融合至理想的抗体可变区，以提供本申请所述的多肽复合物。 例如，抗体重链可变区可以融合至所述嵌合恒定区(包括C1)，从而 提供本申请所述的多肽复合物的所述第一多肽链；并且相似地，抗体 轻链可变区可以融合至所述第二TCR恒定区(包括C2)，从而提供 本申请所述的多肽复合物的所述第二多肽链。
在某些实施方式中，所述第二二聚化结构域包括铰链区。所述铰 链区可来源于抗体，如IgG1、IgG2或IgG4。在某些实施方式中，所 述第二二聚化结构域可选地可进一步包括抗体CH2结构域和/或抗体 CH3结构域，例如铰链-Fc区。所述铰链区可附接至所述第二抗原结 合位点的抗体重链(例如Fab)。
在所述双特异性多肽复合物，所述第一和所述第二二聚化结构域 能够缔合成为二聚体。在某些实施方式中，所述第一和所述第二二聚 化结构域是不同的，并且以不利于同源二聚化和/或有利于异源二聚化 的方式相缔合。例如，可以选择所述第一和所述第二二聚化结构域， 使得其不相同，且其优先在彼此之间形成异源二聚体，而不是与自身 形成同源二聚体。在某些实施方式中，所述第一和所述第二二聚化结 构域能够经由形成把手-into-孔、疏水相互作用、静电相互作用、亲水 相互作用或增加的柔性而缔合成为异源二聚体。
在某些实施方式中，所述第一和所述第二二聚化结构域包含CH2 和/或CH3结构域，其分别突变为能够形成把手-into-孔。可以通过在 第一CH2/CH3多肽用大氨基酸残基取代小氨基酸残基来获得把手， 并且可以通过用小氨基酸残基取代大氨基酸残基来获得孔。关于把手 into孔的突变位点的详情请参见Ridgway等，1996，同上，Spiess等， 2015，同上，以及Brinkmann等，2017，同上。
双特异性形式
在本文所述的多肽复合物中，所述第一抗原结合部分和所述第二 结合部分可以缔合成为Ig样结构。Ig样结构类似天然抗体，具有Y 型构造，有两条用于抗原结合的臂和一个用于缔合和稳定的茎部。与 天然抗体的相似性可以提供多种优势，如良好的体内药代动力学、理 想的免疫应答和稳定性等。已发现包括本申请所述的第一抗原结合部 分与本申请所述的第二抗原结合部分相缔合的Ig样结构具有与Ig(例 如IgG)相当的热稳定性。在某些实施方式中，本申请所述的Ig样结 构为天然IgG的至少70％、80％、90％、95％或100％。
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物包括4条多肽链： i)VH1-C1-铰链-CH2-CH3；ii)VL1-C2；iii)VH2-CH1-铰链 -CH2-CH3，和iv)VL2-CL，其中C1和C2能够形成包括至少一个非 天然链间键的二聚体，并且两个铰链区和/或两个CH3结构域能够形 成一个或多个可以协助二聚化的链间键。
当与其他形式的双特异性多肽复合物相比较时，本申请所述的双 特异性多肽复合物具有更长的体内半衰期并且相对容易地制造。
双特异性复合物序列
在一些实施方案中，双特异性复合物的第一抗原结合部分能够特 异性结合CD3，并且第二抗原结合部分能够特异性结合CD19。在其 他实施方式中，所述双特异性复合物的所述第一抗原结合部分能够特 异性地与CD19结合，且所述第二抗原结合部分能够特异性地与CD3 结合。
在某些实施方案中，双特异性多肽复合物包含四种多肽序列的组 合：SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28和SEQ ID NO： 29(E17)，如实施例2所示。在某些实施方案中，双特异性多肽复 合物包含四种多肽序列的组合：SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27， SEQID NO：28和SEQ ID NO：30(F16)，如实施例2所示。在这 样的实施方案中，所述第一抗原结合部分与CD3结合，且所述第二抗 原结合部分与CD19结合。E17的设计为双特异性、二价的抗体，F16 的设计为具有两个重复的抗CD19抗体Fab的双特异性、三价的抗原 结合复合物。
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物包含4个多肽链， 其包含：i)可操作地连接至第一嵌合恒定区的VH1；ii)可操作地连接 至第二嵌合恒定区的VL1；iii)可操作地连接至常规抗体重链恒定区的 VH2，以及iv)可操作地连接至常规抗体轻链恒定区的VL2。在某些实 施方式中，所述第一嵌合恒定区可以包含C1-铰链-CH2-CH3，其各部 分如上文所定义。在某些实施方式中，所述第二嵌合恒定区可以包含 C2，其如上文所定义。在某些实施方式中，所述常规抗体重链恒定区 可以包含CH1-铰链-CH2-CH3，其各部分如上文所定义。在某些实施 方式中，所述常规抗体轻链恒定区可以包含CL，其如上文所定义。
制备方法
本申请提供了编码本申请所述的多肽复合物和双特异性抗CD3x CD19多肽复合物的分离的核酸或多核苷酸。
用于本申请的术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸 (DNA)或核糖核酸(RNA)及其单或双链形式的多聚物。除非经明 确限制，该术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的多核苷酸，所述 天然核苷酸类似物具有与参照核酸相似的结合特性，并且以与天然存 在的核苷酸相似的方式被代谢。除非另外指出，特定的多核苷酸序列 还暗含其经保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、同 源基因、SNP和互补序列，以及明确指出的序列。具体地，简并密码 子取代可通过生成序列实现，其中一个或多个所选的(或全部)密码 子的第三位置用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(参见Batzer等， NucleicAcid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem. 260:2605-2608(1985)；以及Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98 (1994))。
可以使用重组技术构建编码本申请所述的多肽复合物和双特异性 多肽复合物的核酸或多核苷酸。为此，编码亲本抗体的抗原结合部分 (如CDR或可变区)的DNA可以使用常规步骤分离和测序(例如通 过使用能够特异性地与编码所述抗体的重链和轻链的基因结合的寡核 苷酸探针)。编码TCR恒定区的DNA也可以同样地获取。作为示例， 获取并可操作地连接编码所述可变结构域(VH)的多核苷酸序列和编 码所述第一TCR恒定区(C1)的多核苷酸序列，以允许宿主细胞中 的转录和表达，以产生所述第一多肽。相似地，编码VL的多核苷酸 序列可操作地连接至编码C1的多核苷酸序列，以使得允许所述第二 多核苷酸在宿主细胞中的表达。如果需要，一个或多个间隔子的编码 多核苷酸序列也可操作地连接至其他编码序列，以使所需产物表达。
所述编码多核苷酸序列可以进一步可操作地连接至一个或多个调 控序列，可选地在表达载体中，以使得所述第一和所述第二多肽的表 达或产生是可行的，且在适宜的控制下进行。
使用本领域公知的重组技术，可以将所述编码多核苷酸序列插入 载体，用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。在另一个实施方 式中，本申请所述的多肽复合物和双特异性多肽复合物可通过本领域 公知的同源重组产生。多种载体可供选择。载体组分通常包含但不限 于以下的一种或多种：信号序列、复制起始点、一种或多种标记基因、 增强子元件、启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)和转录终止序列。
用于本申请的术语“载体”是指可将编码蛋白的多核苷酸可操作 性地插入其中并使该蛋白获得表达的一种运载工具。通常，其构造还 包含适当的调控序列。例如，所述多核苷酸分子可以包含位于编码向 导RNA的核酸序列和/或编码定点修饰的多肽的核酸序列的5’侧翼区 的调控序列，以能够在宿主细胞中表达所述的转录/基因的方式可操作 地连接至所述编码序列。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使 其携带的遗传元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包含：质 粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细 菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、噬菌体如λ 噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类包 含逆转录病毒(包含慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如 单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病 毒(如SV40)。载体可含有多种控制表达的元件，包含启动子序列、 转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可 含有复制起始位点。载体还可包含协助其进入细胞的成分，包含但不 限于病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。
在一些实施方式中，所述载体系统包含哺乳动物、细菌、酵母系 统等，并且包含质粒，诸如但不限于pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、 pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pCMV、pEGFP、pEGFT、pSV2、 pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、 pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、 pRS420、pLexA、pACT2.2等，以及其他实验室用的和市售的载体。 适宜的载体可包含质粒或病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺 病毒和腺相关病毒)。
包含本申请所述的多核苷酸序列的载体可以导入宿主细胞用于克 隆或基因表达。用于本申请的用语“宿主细胞”是指导入外源多核苷 酸和/或载体的细胞。
适用于克隆或表达本申请所述载体中的DNA的宿主细胞为上文 所述的原核细胞、酵母或高级真核细胞。适用于本发明用途的原核细 胞包含真细菌，如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，例如肠杆菌科，如 大肠杆菌，肠杆菌属，欧文氏菌属，克雷白氏杆菌属，变形杆菌属， 沙门氏菌属，如鼠伤寒沙门(氏)杆菌，沙雷氏菌属，如粘质沙雷氏 菌，以及志贺氏菌属，及杆菌属，如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌， 假单胞菌，如绿脓杆菌和链霉菌。
除了原核细胞以外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适用于克 隆或表达编码所述多肽复合物和所述双特异性多肽复合物的载体的宿 主细胞。酿酒酵母，或面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。但 是，许多其他属、种和株都比较常用且在本发明中适用，如粟酒裂殖 酵母；克鲁维酵母属宿主，如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(ATCC 16,045)、魏氏克鲁维酵母 (ATCC 24,178)、克鲁雄酵母(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母 (ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母；解脂耶氏 酵母(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(EP 183,070)；假丝酵母；里 氏木霉(EP244,234)；链孢霉；西方许旺酵母，如：西方许旺酵母； 和丝状真菌，如：脉孢菌、青霉菌、弯颈霉和曲霉菌，如：钩巢曲霉 和黑曲霉。
适用于表达糖基化本申请所述的多肽复合物和双特异性多肽复合 物的宿主细胞由多细胞生物衍生得到。无脊椎细胞的实例包含植物和 昆虫细胞。已发现多种杆状病毒株(baculoviral strains)及其变体以 及对应的许可性昆虫宿主细胞(permissive insecthost cells)，来自于 诸如以下的宿主：草地夜蛾(毛虫)、埃及斑蚊(蚊子)、白纹伊蚊 (蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)及家蚕。多种用于转染的病毒株为公众 可得，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒的 Bm-5变种，这些病毒都可在本发明中使用，特别是用于转染草地夜 蛾细胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛花、西红柿和烟草的植物 细胞培养也可以用作宿主。
但是，最感兴趣的是脊椎动物细胞，且脊椎动物细胞的培养(组 织培养)已经成为常规操作。可用的哺乳动物宿主细胞实例有，SV40 转化的猴肾细胞CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾细 胞系(293或悬浮培养的293细胞亚克隆，Graham等，J.Gen Virol. 36:59(1977))，如Expi293；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)； 链仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod. 23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾 细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞 (BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)； 人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68 (1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；及人肝癌细胞系(Hep G2)。
用上述的表达或克隆载体转化宿主细胞，并可以将其在常规的营 养培养基中培养，所述营养培养基按需要改动以用于诱导启动子、选 择转化细胞或扩增克隆载体。
为了生产本申请所述的多肽复合物和双特异性多肽复合物，用所 述表达载体转化的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售的培养基如 Ham's F10(Sigma)、最低基本培液(MEM，(Sigma))、RPMI-1640 (Sigma)及Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM，Sigma) 适用于培养所述宿主细胞。另外，任何在Ham等，Meth.Enz.58:44 (1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102:255(1980)，美国专利号 4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469；WO 90/03430； WO 87/00195或美国专利申请Re.30,985中描述的培养基都可用作所 述宿主细胞的培养基。在需要时这些培养基都可添加激素和/或其他生 长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、 氯化钙、氯化镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷 酸和胸腺嘧啶)、抗生素(如庆大霉素)、微量元素(定义为终浓度 通常在微摩尔浓度范围的无机化合物)，和葡萄糖或与之等同的能量 源。所述培养基还可含有本领域公知的适当浓度的任何其他必要的添 加剂。所述培养基的条件，如温度、pH值等类似条件，为选择用于 表达的宿主细胞此前所使用的条件，为普通技术人员所熟知。
在一个方面，本公开提供了一种表达本申请所述的多肽复合物和 双特异性多肽复合物的方法，其包含在所述多肽复合物或所述双特异 性多肽复合物被表达的条件下培养本申请所述的宿主细胞。
在某些实施方式中，本公开提供了一种产生本申请所述的双特异 性多肽复合物的方法，其包含a)将编码第一抗原结合部分的一个或多 个多核苷酸包括编码第一多肽的第一多核苷酸(所述第一多肽自N末 端至C末端包含第一抗体的第一重链可变结构域(VH)，其可操作 地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1))，编码第二多肽的 第二多核苷酸(所述第二多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一 轻链可变结构域(VL)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)) 以及编码第二抗原结合部分的一个或多个另外的多核苷酸导入宿主细 胞，其中：C1包含工程化的Cβ，所述Cβ包含SEQ ID NO:1，并且C2包含工程化的Cα，所述Cα包含SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:1 中的氨基酸C48和SEQ ID NO:2中的氨基酸C41能够形成非天然的 链间二硫键，C1和C2能够形成二聚体，并且所述非天然的链间二硫 键能够稳定所述二聚体，并且所述非天然的链间键能够稳定C1和C2 的二聚体，相比于第一抗原结合部分和第二抗原结合部分均为天然 Fab的对应部分的情况，所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合 部分具有减少的错配，并且所述第一抗体具有第一抗原特异性且所述 第二抗体具有第二抗原特异性，b)使所述宿主细胞表达所述双特异性 多肽复合物。
在某些实施方式中，所述方法进一步包含分离所述双特异性多肽 复合物。
在使用重组技术时，本申请所述的双特异性多肽复合物可以在胞 内、壁膜空间生产，或被直接分泌到培养基中。如果所述抗体在胞内 生产，首先除去宿主细胞或裂解片断的颗粒残骸，例如可通过离心或 超声的方法。Carter等，Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了将 分泌到大肠杆菌壁膜空间的抗体分离的方法。简要地说，在醋酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲磺酰氟(PMSF)存在的条件下化开细胞糊(cell paste)约30分钟以上。细胞碎片可以通过离心除去。如所述抗体分 泌到培养基中，则通常首先使用市售的蛋白浓度过滤器，如Amicon 或Millipore Pellicon超滤装置，浓缩该表达系统的上清液。在任何前述的步骤中都可加入蛋白酶抑制剂(如PMSF)以抑制蛋白降解，以 及可加入抗生素以防止偶然污染物的生长。
从所述细胞中制得的本申请所述的双特异性多肽复合物可以采用 以下方法进行纯化，例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE-纤 维素离子交换色谱柱、硫酸铵沉淀、盐析以及亲和色谱，其中亲合色 谱为优选的纯化技术。
当本申请所述的双特异性多肽复合物包含免疫球蛋白Fc结构域 时，则依赖于存在于所述多肽复合物中的Fc结构域的种类和同种型， 蛋白A可以用作亲和配体。蛋白A可以用于基于人γ1，γ2或γ4重链 的多肽复合物的纯化(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62:1-13 (1983))。蛋白G适用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J. 5:1567 1575(1986))。琼脂糖是最常用的亲和配体附着基质，但也可 选用其他基质。机械力稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯 与用琼脂糖相比可以实现更快的流速和更短的处理时间。
当本申请所述的双特异性多肽复合物包含CH3结构域时，则可用 BakerbondABX.TM树脂进行纯化(J.T.Baker，新泽西菲利普斯堡)。 根据需要回收的抗体，其他蛋白纯化的技术也可使用，如离子交换柱 中的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、基于阴离子或阳离子 交换树脂的肝素琼脂糖凝胶色谱(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、 SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀。
在任意初步纯化步骤之后，可用低pH疏水相互作用色谱的方法 处理含有关注的多肽复合物和杂质的混合物，用pH约2.5-4.5的洗脱 缓冲液，优选地在低盐浓度下进行(例如从约0到0.25M盐浓度)。
在某些实施方式中，可以容易地使用常规方法以高产率纯化本申 请所述的双特异性多肽复合物。所述双特异性多肽复合物的一个优势 为重链和轻链可变结构域序列之间的错配显著减少。这减少了不要的 副产物的产生，并且使得使用相对简单的纯化过程以高产率获得高纯 度产物成为可能。
衍生物
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物可以用作与所需的 缀合物缀合的基础。
可以设想，本申请所述的多肽复合物或双特异性多肽复合物可以 与多种缀合物连接(参见例如“Conjugate Vaccines”，Contributions to Microbiology andImmunology，J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr. (编)，Carger Press，纽约(1989))。这些缀合物可通过共价结合、 亲和结合、嵌入、配位结合(coordinate binding)、络合、缔合、混 合或加入及其他方式，与所述多肽复合物或双特异性多肽复合物连接。
在某些实施方式中，本申请所述的双特异性多肽复合物可通过工 程化的方法使其在表位结合部分以外含有可用来结合一种或多种缀合 物的特定位点。例如，这样的位点可包含一种或多种反应性氨基酸残 基，例如半胱氨酸残基或组氨酸残基，用于促进与缀合物的共价连接。
在某些实施方式中，所述双特异性多肽复合物可直接，或者例如 通过另一个缀合物或通过接头间接连于缀合物。
例如，具有反应性残基(如半胱氨酸)的双特异性多肽复合物可 与巯基反应性试剂连接，其中反应性基团为例如马来酰亚胺、碘乙酰 胺、吡啶二硫化物或其他巯基反应性缀合伴侣(Haugland，2003， Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals，Molecular Probes,Inc.；Brinkley，1992，Bioconjugate Chem.3:2；Garman，1997，Non-Radioactive Labelling:A Practical Approach，Academic Press，伦敦；Means(1990)Bioconjugate Chem. 1:2；Hermanson,G.in Bioconjugate Techniques(1996)Academic Press，圣地亚哥pp.40-55，643-671)。
再例如，所述双特异性多肽复合物可与生物素缀合，随后间接与 缀合至亲和素的第二缀合物缀合。又例如，所述多肽复合物或所述双 特异性多肽复合物可与进一步连接至缀合物的接头连接。接头的实例 包含双功能耦联剂(如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯 (SPDP)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯 (SMCC)、亚氨基硫代烷(IT))、亚氨酸酯的双功能衍生物(如 己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(如 戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰)己二胺)、双重氮衍 生物(如双(对双重氮苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二 异氰酸酯)，以及组氨活性的氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。 特别优选的耦联剂包含N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯 (SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173:723-737(1978))和N-琥珀 酰亚胺-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，以提供二硫键。
所述缀合物可以是可检测的标记、药代动力学修饰部分、纯化部 分或细胞毒性部分。可检测的标记的例子可包含荧光标记(例如荧光 素、罗丹明、丹磺酰、藻红蛋白或德克萨斯红)、酶-底物标记物(例 如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、 糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如123I、124I、125I、 131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、 211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi和32P、其他镧系元素、发光标记)、 发色团部分、地高辛、生物素/亲和素、DNA分子或金以进行检测。 在某些实施方式中，所述缀合物可以是药代动力学修饰部分如PEG， 其帮助延长抗体的半衰期。其他适宜的聚合物包含例如羧甲基纤维素、 葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇共聚物等。在某 些实施方式中，所述缀合物可以是纯化部分例如磁珠。“细胞毒性部分” 可以是对细胞有害的或可能损坏或杀死细胞的任何试剂。细胞毒性部 分的示例包含但不限于紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙 锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、 秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光 神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、 利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物、抗代谢物(例如甲氨蝶 呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷 化剂(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法 仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、 二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP) 顺铂)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素 和氨茴霉素(AMC))以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
用于将缀合物与蛋白(如抗体、免疫球蛋白或其片段)缀合的方 法见于例如美国专利号5,208,020；美国专利号6,4411,163； WO2005037992；WO2005081711和WO2006/034488，其全部内容通 过引用并入本文。
药物组合物
本申请还提供了药物组合物，其包含本申请所述的双特异性多肽 复合物和药学上可接受的运载体。
术语“药学上可接受的”表示所指的运载体、媒介物、稀释剂、 赋形剂和/或盐，总的来说在化学上和/或在物理上与制剂中的其他成 分相兼容，并在生理上与接受者相兼容。
“药学上可接受的运载体”是指药物制剂中不同于活性成分的成 分，其生物活性可接受并且对受试者无毒。用于本申请公开的药物组 合物中的药学上可接受的运载体可包含例如药学上可接受的液体、凝 胶或固体运载体、水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物物质、等渗 物质、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、螯合剂、稀释剂、 佐剂、赋形剂或无毒辅助物质，本领域公知的其他组分或以上的多种 组合。
适宜的组分可包含例如抗氧化剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓 冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂 例如糖和环糊精。适宜的抗氧化剂可包含例如甲硫氨酸、抗坏血酸、 EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘 油、巯基乙酸、巯基山梨醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羟基甲苯和/ 或没食子酸丙酯。如本发明所公开，在本申请所述的药物组合物中包 含一种或多种抗氧剂如甲硫氨酸，可将降低所述多肽复合物或双特异 性多肽复合物的氧化。对氧化作用的减少可防止或减少结合亲和力的 降低，从而提高蛋白稳定性并延长保质期。因此，在某些实施方式中， 本申请所述的组合物中包含本申请所述的多肽复合物或双特异性多肽 复合物，以及一种或多种抗氧化剂例如甲硫氨酸。
为进一步说明，药用可接受的载剂可包含例如水相介质如氯化钠 注射液、林格氏液注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、或葡 萄糖和乳酸林格注射液、非水介质例如：植物来源的不挥发性油、棉 花子油、玉米油、芝麻油、或者花生油、细菌抑制或真菌抑制浓度下 的抗菌物质、等渗剂如：氯化钠或葡萄糖、缓冲液如：磷酸盐或枸橼 酸酸盐缓冲液，抗氧化剂如：硫酸氢钠，局部麻醉剂如：盐酸普鲁卡 因，助悬剂和分散剂如：羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙 烯吡咯烷酮，乳化剂如：聚山梨醇酯80(吐温-80)、螯合试剂如EDTA (乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)、 乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。作为载 剂的抗菌剂可加入多次剂量容器中的药物组合物中，其包含酚类或甲 酚、汞制剂、苯甲醇、氯代丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷铵和氯苯乙铵。适宜的辅料可包含例如水、盐、葡萄糖、 甘油或乙醇。适宜的无毒辅助物质可包含例如乳化剂、pH值缓冲剂、 稳定剂、增溶剂，或者醋酸钠、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油 酸酯或者环糊精之类的物质。
所述药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、丸剂、胶囊、 片剂、持续释放制剂或粉末。口服制剂可以包含标准运载体如药物级 的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维 素、碳酸镁等。
在某些实施方式中，所述药物组合物被制剂成可注射的组合物。 可注射的药物组合物可以任何常规的形式制备，例如液体溶剂、悬浮 剂、乳化剂或适用于产生液体溶剂、悬浮剂或乳化剂的固体形式。注 射制剂可包含注射即用的无菌和/或无热原溶液、使用前现与溶剂结合 的无菌干燥的可溶物，如冻干粉，包含皮下片、注射即用的无菌悬浮 剂、使用前现与介质结合的无菌干燥不溶产品，和无菌和/或无热原的 乳剂。溶剂可为水相或非水相。
在某些实施方式中，单位剂量的注射制剂包装在一个安瓿、一支 管或一支带有针的针筒中。本领域熟知，所有用于注射施用的制剂应 为无菌无热原。
在某些实施方式中，通过将如本申请所公开的多肽复合物或双特 异性多肽复合物溶解于某适宜的溶剂中可制备无菌冻干的粉末。所述 溶剂可含有一种可提高粉或由粉末制得的重组溶液的稳定性，或改善 粉末或重组溶液的其他药理组分。可用的辅料包含但不限于水、葡萄 糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其 他适宜的物质。溶剂可含有缓冲液，如枸橼酸缓冲液、磷酸钠或磷酸 钾缓冲液或其他本技术熟练人员公知的缓冲液，在一种实施方式中， 缓冲液的pH为中性。在本领域公知的标准条件下进行对所述溶解进 行随后的过滤除菌，然后冻干制得理想的制剂。在一种实施方式中， 将所得的溶剂分装至小管中冻干。每支小管可以容纳单次剂量或多次 剂量的本申请所述的多肽复合物、双特异性多肽复合物或其组合物。 每支小管中的装入量可略微高于每次剂量所需或多次剂量所需(例如 10％过量)，从而协助精确取样和精确给药。冻干粉可以在适当的条 件下储存，如在约4℃到室温范围。
用注射用水将冻干粉重溶得到用于注射施用的制剂。在一种实施 方式中，可将冻干粉加至无菌无热原水或其他适宜的液体载剂中重溶。 精确的量由选择的疗法决定，且可以根据经验值决定。
治疗方法
还提供了治疗方法，包括将治疗有效量的本申请所述的多肽复合 物或双特异性多肽复合物施用给需要其的受试者，由此治疗或预防病 况或病症。在某些实施方式中，所述受试者已被确认为具有很可能响 应于本申请所述的多肽复合物或双特异性多肽复合物的病症或病况。
对某种病况的“治疗”或“疗法”包括预防或减轻某种病况，降 低某种病况兴起或发展的速度，减少发展出某种病况的风险，预防或 延迟与某种病况相关的症状发展，减少或终止与某种病况相关的症状， 产生某种病况的完全或部分的逆转，治愈某种病况，或以上的组合。
本申请所述的双特异性多肽复合物的治疗有效剂量将依赖于本领 域公知的多种因素，例如体重、年龄、过往病史、现用治疗、对象的 健康病况和交叉反应的潜力、过敏、超敏和副作用，以及施用途径和 疾病发展的程度。本领域熟练人员(例如医生或兽医)可根据这些和 其它情形或要求按比例降低或升高剂量。
在某些实施方式中，本申请所述的双特异性多肽复合物可在治疗 有效剂量约0.01mg/kg到约100mg/kg之间施用(例如约0.01mg/kg、 约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约 15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约 65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约 90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg)。在这些实施方式的某些中，本申请所述的多肽复合物或双特异性多肽复合物以约50mg/kg或更 少的剂量施用，且在这些实施方式的某些中，剂量为10mg/kg或更少、 5mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少或0.1mg/kg或更 少。在某些实施方式中，施用剂量可随治疗进程变化。例如，在某些实施方式中，初始施用剂量可比后续施用剂量高。在某些实施方式中， 可在治疗进程中根据受试者的反应调整施用剂量。
给药方案可通过调整达到最优反应(如治疗反应)。例如可施用 单剂量，或者可在一段时间施用多个分隔的剂量。
本申请所述的双特异性多肽复合物可通过本领域公知的途径施 用，例如肠胃外(如皮下注射、腹腔注射、静脉注射，包含静脉滴注， 肌肉注射或皮内注射)或非肠胃外(如口服、鼻内、眼内、舌下、直 肠或局部)途径。
在某些实施方式中，本申请所述的双特异性多肽复合物治疗的病 况或病症为癌症或癌性病况、自身免疫疾病、感染性和寄生虫疾病、 心血管疾病、神经病变、神经精神病学病况、损伤、炎症或凝血障碍。
用于本申请的“癌症”或“癌性病况”是指由肿瘤性或恶性的细 胞生长、增生或转移介导医疗病况，并且既包含实体癌症也包含非实 体癌症，如白血病。用于本申请的“肿瘤”是指肿瘤性和/或恶性细胞 的实体团块。
对于癌症，“治疗”或“疗法”可指抑制或减缓肿瘤性或恶性的 细胞生长、增生或转移，预防或延缓肿瘤性或恶性的细胞生长、增生 或转移的发展，或其一些组合。对于肿瘤，“治疗”或“疗法”包含 除掉全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或延缓肿瘤的发展，或其一些组合。
例如，对于本申请公开的双特异性多肽复合物用于治疗癌症的用 途，治疗有效量为能够除掉全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长、 抑制介导癌性病况的细胞的生长或增生、抑制肿瘤细胞转移、改善与 肿瘤或癌性病况相关的任何症状或标记、预防或延缓肿瘤或癌性病况 的发展，或其一些组合的所述多肽复合物的剂量或浓度。
在某些实施方式中，所述病况或病症包含肿瘤和癌症，例如非小 细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胰 腺癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈癌、甲状腺 癌、肉瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、胸腺癌、白血病、淋 巴瘤、骨髓瘤、真菌病、默克尔细胞癌，以及其他恶性血液病，如经 典型霍奇金淋巴瘤(CHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富于T细 胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、EBV阳性和阴性PTLD、EBV相关的 弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、浆母细胞淋巴瘤、淋巴结外NK/T 细胞淋巴瘤、鼻咽癌，以及HHV8相关的原发性渗出性淋巴瘤、霍奇 金淋巴瘤、中枢神经系统(CNS)肿瘤，如原发性CNS淋巴瘤、脊髓 肿瘤、脑干胶质瘤。
在某些实施方式中，所述病况和病症包含CD19相关病况，如B 细胞淋巴癌，可选地为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，其中所述非 霍奇金淋巴瘤包含：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋 巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤 (MALT)、小淋巴细胞性淋巴瘤(慢性淋巴细胞白血病，CLL)， 或套细胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)，或瓦尔登 斯特伦巨球蛋白血症(WM)。
所述双特异性多肽复合物可单独施用或与一种或多种其他治疗手 段或物质联合施用。
在某些实施方式中，当用于治疗癌症或肿瘤或增生性疾病时，本 申请所述的双特异性多肽复合物可与化学疗法、放射疗法、用于治疗 癌症的外科手术(例如肿瘤切除术)、一种或多种止吐剂，或者用于 化学疗法产生的并发症的其他疗法，或用于治疗癌症或相关的任何医 疗病症的任何其他治疗剂联合施用。用于本申请的“联合施用”包含 作为相同的药物组合物的一部分同时施用、作为不同的药物组合物同 时施用或作为不同的药物组合物在不同时间施用。用于本申请的用语 “联用”的含义还包含，在另一个治疗剂之前或之后施用的组合物也 被认为是与该治疗剂“联合”施用，即使所述组合物与第二药剂是通 过不同途径施用的。在可能的情况下，与本申请所述的多肽复合物或 双特异性多肽复合物联合施用的其他治疗剂参照列于该其他治疗剂的 产品说明书中的方案施用，或参照外科医生的案头参考书(Physicians' Desk Reference，第70版(2016))，或参照其他本领域公知的方案。
在某些实施方式中，所述治疗剂可以诱导或促进针对癌症的免疫 应答。例如，可以使用肿瘤疫苗诱导对某些肿瘤或癌症的免疫应答。 还可以使用细胞因子疗法增加肿瘤抗原向免疫系统的呈递。细胞因子 疗法的实例包含但不限于干扰素(如干扰素α、β和γ)、集落刺激因 子(如巨噬细胞CSF、粒细胞巨噬细胞CSF和粒细胞CSF)、白细 胞介素(如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、 IL-9、IL-10、IL-11和IL-12)、肿瘤坏死因子(如TNF-α和TNF-β)。 还可以使用使免疫抑制靶标灭活的药剂，例如TGF-β抑制剂、IL-10抑制剂和Fas配体抑制剂。另一组药剂包含激活对肿瘤或癌症细胞的 免疫应答性的药剂，例如增强T细胞活化的药剂(例如T细胞共刺激 分子的激动剂，如CTLA-4、ICOS和OX-40)，以及增强树突细胞 功能和抗原呈递的药剂。
试剂盒
本公开进一步提供了包含本申请所述的双特异性多肽复合物的试 剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒可用于检测其存在或水平、或 捕获或富集生物样品中一个或多个感兴趣的靶标。所述生物样品可以 包括细胞或组织。
在一些实施方式中，所述试剂盒包含本申请所述的双特异性多肽 复合物，其与可检测标记缀合。在某些其他的实施方式中，所述试剂 盒包含未标记的本申请所述的双特异性多肽复合物，并进一步包含能 够与所述未标记的本申请所述的双特异性多肽复合物结合的标记的第 二抗体。所述试剂盒可进一步包含使用说明和在试剂盒中将每个组件 分隔开的包装。
在某些实施方式中，本申请所述的双特异性多肽复合物与基底或 仪器结合。有用的基底或仪器可以是例如磁珠、微孔板或试纸，其可 以用于结合试验(如ELISA)、免疫图试验、捕获或富集生物样品中 的靶标分子。
提供以下实施例以便更好地说明本发明，它们不应被理解为限制 本发明的范围。所有下述的特定组合物、材料和方法，其整体或部分， 都在本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不是为了限制 本发明，而只是为了举例说明落入本发明范围内的特定实施方式。本 领域熟练技术人员在不发挥创造性及不偏离本发明范围的情况下可以 开发出等同的组合物、材料和方法。应理解，在对本发明的方法作出 的多种改动可以仍然包括在本发明范围内。发明人意在将这样的变动 包括在本发明的范围内。
实施例
实施例1：抗体和TCR嵌合蛋白的设计和工程化
TCR序列
TCR为由两条链构成的异二聚蛋白。约95％的人T细胞具有由α 和β链构成的TCR。考虑到更多的晶体结构对于β链TRBC1是可获 得的，因此选择TRBC1序列作为设计本申请公开的多肽复合物 (“WuXiBody”)的骨架。TRBC1的典型氨基酸序列可见于Protein DataBank(PDB)结构4L4T。
TCR的链间二硫键
使用TCR晶体结构来引导我们的WuXiBody设计。不同于T细 胞表面膜上锚定的天然TCR，可溶性TCR分子较不稳定，尽管其3D 结构非常近似于抗体Fab。事实上，TCR在溶解状态中的不稳定性曾 是使其晶体结构难以阐明的很大阻碍(Wang，2014，同上)。我们采 用了在TCR恒定区中引入一对Cys突变的方案，并发现其可以显著 地改善链组装并增强表达。
连接抗体可变结构域和TCR恒定结构域的接合区、其相对的融 合定向以及连接Fc的接合区都经过仔细的精细调制以制得稳定且有 功能的WuXiBody。由于TCR结构非常近似于抗体Fab，我们将抗体 Fv同源模型叠加在TCR可变区上(PDB 4L4T，图2)。经叠加的结 构表明抗体Fv在结构上与TCR恒定结构域兼容。全部相关的工程化 参数基于这一结构比对以及对应的序列设计。合适的接合子区域描述 于实施例2中。
实施例2：双特异性抗CD13xCD19WuXiBody
表达食蟹猴CD19的细胞系的产生
将全长人或食蟹猴CD19的基因克隆到pcDNA3.3载体中。然后 使用Lipofectamine2000将每种表达载体分别转染到CHO-K1细胞 中。将细胞在含有10％FBS的F12-K中培养。转染后24-48小时加入 杀稻瘟素。选择2至3代后，通过PE缀合的抗CD19抗体和抗PE微 珠(Miltenyi-013-048-801)富集细胞。稳定的单细胞克隆通过有限稀 释分离，并使用抗CD19抗体通过FACS进行筛选。
表达靶标的肿瘤系
Raji和Jurkat细胞来自ATCC。Ramos细胞来自ECACC。所有 肿瘤细胞均在RPMI1640/10％FBS中培养。
WuXiBody W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP和 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP的生成
通过PCR从公司内的现有DNA模板扩增VL、VH、Ck、CH1 基因。由Genewiz Inc.合成Cα和Cβ基因。将抗CD19天然或抗CD3 嵌合轻链基因插入含有CMV启动子和κ信号肽的线性化载体中。将 抗CD3VH-Cβ的DNA片段插入含有具有把手突变的人IgG4S228P 恒定区CH2-CH3的线性化载体中。将抗CD19VH-CH1的DNA片段 插入含有具有孔突变的人IgG4S228P恒定区CH2-CH3的线性化载体 中。载体含有CMV启动子和人抗体重链信号肽。
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP和W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP的 表达和纯化
根据制造商的说明书，使用Expi293表达系统试剂盒 (ThermoFisher-A14635)将重链和轻链表达质粒共转染到Expi293 细胞中。转染后5天，收集上清液，使用蛋白A柱(GEHealthcare-17543802)和另外的尺寸排阻柱(GE Healthcare-17104301)纯化蛋白质。通过Nano Drop测量抗体浓度。 通过SDS-PAGE和HPLC-SEC评估蛋白质的纯度。
通过FACS测量靶标结合
分别使用Jurkat和Ramos评估双特异性抗体与表达CD3和CD19 的细胞的结合。使用非相关抗体作为同亚型对照。将细胞以105个细 胞/孔的密度涂布在96孔板(Corning-3799)中，并用PBS/1％BSA 洗涤。将抗体连续稀释并与细胞在4℃孵育1小时。将PE缀合的山羊 抗人IgG Fc抗体(Jackson-109-115-098)用于检测。洗涤和重悬后， 通过流式细胞术(Canto II，BD Biosciences)分析细胞。使用FlowJo 软件分析数据。使用Prism GraphPad软件，利用四参数非线性回归 分析来计算EC50值。
与食蟹猴CD3的结合
通过蛋白质结合ELISA测试CD3×CD19双特异性抗体与食蟹猴 CD3的结合。用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(20mM Na2CO3,180mM NaHCO3,PH9.2)中的1μg/ml食蟹猴CD3ε蛋白(Acro，# CDE-C5226)100ul对96孔高蛋白结合ELISA板(Nunc MaxiSorp， ThermoFisher，Thermo-442404)在4℃下包被过夜。用每孔300μL 的PBS/0.5‰Tween-20(v/v)洗涤所有孔一次。然后将孔在室温下用 200μL/孔的PBS/2％BSA(BOVOGEN，#BSAS)封闭1小时，并用 每孔300μL的PBS/0.5‰Tween-20(v/v)洗涤三次。对于一抗结合， 将在PBS/2％BSA中连续稀释的CD3×CD19双特异性抗体加入相关孔 中，并在室温下孵育2小时。将板洗涤三次，随后加入100μl 100ng/ml 的二抗即山羊抗人IgG Fc-HRP(Bethyl，#A80-304P)。将板在室温 下孵育1小时，然后如上所述进行6次洗涤。对于结合检测，将100μl 四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(Sigma-860336)在室温下于黑暗中 加入所有孔中10分钟，然后用100μl 2M HCl终止反应。通过使用 酶标仪测量OD450吸光度来确定双特异性抗体与食蟹猴CD3的结合程度。在适当的情况下，使用GraphPad Prism5 软件通过四参数非线性回归分析获得结合的EC50值。
与食蟹猴CD19的结合
通过流式细胞术测定CD3×CD19双特异性抗体与CHOK1细胞上 表达的食蟹猴CD19靶蛋白的结合。简而言之，用胰蛋白酶收获过表 达食蟹猴CD19的稳定细胞系(WBP701.CHOK1.cPro1.C9，WuXi Biologics)，并在1％BSA/1XPBS中稀释至1×106个细胞/ml。以1×105个细胞/孔(100μl)将细胞加入到96孔U板(Corning，#3799)的 每个孔中，并以1500rpm(Eppendorf，#5810R)离心5分钟，然后 除去上清液。将在1％BSA/1XPBS中连续稀释的抗体以100μl/孔加入 到沉淀的细胞中，并在4℃下孵育1小时。使用非相关的hIgG4抗体作为同亚型对照。通过在4℃下以1500rpm离心5分钟，用180ul/孔 的1％BSA/1XPBS洗涤细胞两次。将沉淀的细胞重悬于在1％ BSA/1XPBS中以1：150稀释的100μl/孔荧光标记的抗人IgG Fc抗体 (Jackson，#109-115-098)，在4℃于黑暗中30分钟。然后如上所 述洗涤细胞两次。最后一次洗涤后，将细胞重悬于80μl 1％BSA/1X PBS中，并用FACS Canto II细胞计数器(BD Biosciences)测量荧光 值。通过测量平均荧光(MFI)评估细胞表面结合的抗CD19和CD3 双特异性抗体的量。通过FlowJo软件分析FACS原始数据，使用不 含抗体或仅含有二抗的孔来建立背景荧光。使用GraphPad Prism 5 软件通过四参数非线性回归分析获得结合的EC50值。
通过FACS测量亲和力
分别使用Jurkat和Ramos细胞通过流式细胞术测定对CD3和 CD19的结合亲和力。将细胞以5×104个细胞/孔的密度转移到96孔U 形底板(BD)中。将待测抗体在1％的1XPBS/1％BSA中以1：2连 续稀释，并与细胞在4℃孵育1小时。然后，将板以1500rpm离心4 分钟，弃去上清液。将二抗即Alexa647缀合的山羊抗人IgG Fc (Jackson，Cat#109-605-098)或FITC缀合的山羊抗His(Bethyl， Cat#A190-113F)加入到经重悬的细胞中并在4℃于黑暗中孵育30 分钟。将细胞洗涤一次并重悬于100μL的1XPBS/1％BSA中。通过流 式细胞术(BD CantoII)测量并通过FlowJo分析荧光强度。基于定 量珠(QuantumTM MESF Kits，BangsLaboratories)将荧光强度转 化为结合的分子/细胞。KD由Graphpad Prism5计算。
对靶细胞的双重结合
通过FACS测试双特异性抗体桥接CD3 T细胞和CD19 B细胞的 能力。将Jurkat细胞和Raji细胞分别用20nM CellTrace Far Red (Invitrogen-C34564)和50nM钙黄绿素-AM(Invitrogen-C3099) 在37℃以1×106个细胞/ml的密度预标记30分钟。将预标记的细胞沉淀用PBS/1％BSA洗涤两次，然后以1：1混合至1×106/ml的最终密 度。将细胞混合物离心并用10nM抗体重悬浮，然后孵育1小时。孵 育后立即通过流式细胞术分析细胞混合物。桥接百分比计算为同时标 记有Far-Red和钙黄绿素的事件的百分比。
细胞毒性测定
通过Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare-17-1440-03)密度离心 从肝素化的静脉血中新鲜分离外周血单个核细胞(PBMC)。然后将 获得的PBMC通过EasySep(Stemcell-19053)柱以富集CD8+ T细 胞，其用作效应细胞。通过流式细胞术测定抗体介导CD8+ T细胞的 肿瘤细胞裂解的功效。在细胞毒性测定中，将Raji CD19 B细胞作为 靶细胞用20nMCellTrace Far Red(Invitrogen-C34564)在37℃预标 记30分钟，然后用不含酚的补充有1％FBS的RPMI 1640 (Invitrogen-11835030)洗涤细胞沉淀两次。将Far Red染色的Raji(每孔20000个细胞)在96孔圆底板(Corning-3799)中与分离的 CD8+ T细胞(效应细胞/靶细胞比例为5：1)和连续稀释的抗体在37℃ 孵育4小时。孵育后，加入3μM碘化丙锭(PI，Invitrogen-P3566) 并充分混合以鉴定死细胞。15分钟后，使用FACSCanto II细胞计数 器通过流式细胞术分析细胞。Ab介导的细胞毒性可以定义为Far Red 阳性靶细胞中PI阳性靶细胞的百分比。使用Prism测定细胞毒性的 EC50。
T细胞活化测定
分泌的细胞因子TNFα和IFNγ
分泌到上清液中的TNFα和IFNγ的量可以用来反映T细胞是否 被激活。CD4和CD8阳性T细胞的分离程序在“T细胞活化(细胞内 细胞因子TNFα和IFNγ染色)”部分中进行了描述。将Raji人B细 胞(2×104/孔)、CD4或CD8 T细胞(1×105/孔)和抗体的混合物在 37℃下共孵育24小时。收集上清液，然后以1500rpm离心反应混合 物5分钟。通过人TNF ELISA试剂盒(R&D-DY210)和人IFNγELISA 试剂盒(捕获抗体：Thermo Fisher-M700A，检测抗体：Thermo Fisher-M701B，标准物质：PEROTECH-300-02)分别测定上清液中 TNFα和IFNγ的量。
夹心ELISA的程序如下。根据试剂盒的说明书，用碳酸盐-碳酸 氢盐缓冲液(20mMNa2CO3,180mM NaHCO3,PH9.2)中的50μl/ 孔捕获抗体对96孔高蛋白结合ELISA板(ThermoFisher-442404)在 4℃或室温下包被过夜。将所有孔用每孔300μl的PBS/0.5％Tween-20 (v/v)洗涤三次，并且在测定的所有后续洗涤步骤中均进行相同的此 程序。然后针对TNFα用PBS/2％BSA(BovoGen Biologicals-BSAS) 和针对IFNγ用100％酪蛋白(Pierce-37528)封闭孔1小时，然后洗 涤3次，随后在室温下使如上收集的上清液或标准物质(50μl/孔)结 合1小时，之后洗涤3次。对于抗体结合的检测，将针对TNFα在 PBS/2％BSA中和针对IFNγ在50％酪蛋白中稀释的相应抗体加入相 关孔中，并在室温下孵育2小时。将板洗涤三次，随后加入50μl的 SA-HRP二抗。将板在室温下孵育1小时，然后如上所述进行6次洗 涤。对于结合检测，将50μl四甲基联苯胺(TMB)底物溶液 (Sigma-860336)加入所有孔中10分钟，然后用50μl 2M HCl终止反 应。通过使用酶标仪测量OD450吸光度来确定 TNFα和IFNγ的量。
T细胞活性测定-表面标志物CD25和CD69的表达
通过表面受体CD25和CD69的染色信号反映T细胞是否被激活。 CD4和CD8阳性T细胞的分离程序在“T细胞活化(细胞内细胞因子 TNFα和IFNγ染色)”部分中进行了描述。将Raji人B细胞(2×104/ 孔)、CD4或CD8 T细胞(1×105/孔)和抗体的混合物在37℃下共孵 育24小时。用1％BSA洗涤一次后，将细胞沉淀重悬浮于含有FITC 小鼠抗人CD4(BD-550628)或PerCpCy5.5小鼠抗人CD8 (BD-560662)、PE小鼠抗人CD69(BD-560968)和APC小鼠抗 人CD25(BD-555434)的染色缓冲液中，然后在4℃孵育30分钟。 洗涤细胞两次后，通过流式细胞术测定FITC或PerCpCy5.5阳性细 胞中PE和APC阳性细胞的百分比。
热稳定性(DSF)
使用QuantStudioTM 7 Flex实时PCR系统(Applied Biosystems) 研究抗体的熔解温度(Tm)。将19μL抗体溶液与1μL 62.5X SYPRO Orange溶液(Invitrogen)混合，并转移至96孔板(Biosystems)。 将板以0.9℃/min的速率从26℃加热至95℃，并收集所得的荧光数据。 计算相对于不同温度的荧光变化的负导数，并将最大值定义为熔解温 度Tm。如果蛋白质具有多个去折叠转变，则报告前两个Tm，命名为 Tm1和Tm2。数据收集和Tm计算由操作软件自动进行。
血清稳定性
从选择的供体新鲜收集人血液到没有抗凝血剂的聚苯乙烯管中。 在室温下静置30分钟后，将人血液以4000rpm离心10分钟以收集血 清层。重复离心步骤直至血清澄清。将待检测的抗体与收集的血清以 1：9的比例混合，并在37℃下在指定的时间：0天、1天、4天、7天和14天抽取等分样品。将不同时间点的样品在液氮中快速冷冻并储 存在-80℃直至使用。通过FACS分析样品，并通过与没有血清处理的 相应抗体进行比较来评估Jurkat CD3 T细胞和Ramos CD19 B细胞的 结合能力。
SPR的Fcγ受体结合亲和力
使用Biacore T200(或Biacore 8K)检测针对FcγR的抗体结合 亲和力。在固定有抗his抗体的CM5传感器芯片(GE)上捕获每种 受体。将不同浓度的抗体以30uL/min的流速注射到传感器芯片上， 进行60s的结合阶段，然后进行60s的解离阶段。然后在每个结合循环后通过10mM甘氨酸(pH 1.5)使芯片再生。
从测试传感图中减去空白表面和缓冲液通道的传感图。使用 Langmiur分析(对于FcγRI)或稳态模型(对于其他受体)通过1： 1模型拟合实验数据。将150KDa的分子量用于计算抗体的摩尔浓度。
通过ELISA测量C1q结合
用抗体样品以3μg/mL在4℃下对ELISA板(Nunc)包被过夜。 封闭和洗涤后，从600μg/mL开始梯度稀释C1q，并在室温下孵育2 小时。然后洗涤平板，随后与绵羊抗人C1q Ab-HRP一起孵育1小时。 洗涤后，加入TMB底物并用2M HCl终止相互作用。使用酶标仪(Molecular Device)读取450nm处的吸光度。
通过SPR测量FcRn结合亲和力
使用Biacore T200(或Biacore 8K)检测针对FcRn的抗体结合 亲和力。将每种抗体固定在CM5传感器芯片(GE)上。将运行缓冲 液(50mM Na2HPO4/NaH2PO4,150mM NaCl,0.05％Tween20,pH 6.0)中的不同浓度的FcRn以30uL/min的流速注射到传感器芯片上， 进行60s的结合阶段，接着进行60s的解离阶段。然后在每个结合循 环后通过1XPBS(pH 7.4)使芯片再生。
从测试传感图中减去空白表面和缓冲液通道的传感图。通过稳态 模型拟合实验数据。使用45KDa的分子量来计算FcRn的摩尔浓度。
鼠Raji/PBMC模型中的功效研究
将Raji肿瘤细胞( CCL-86TM)在补充有10％胎牛血清、 100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基中于37℃在 含5％CO2的空气气氛中体外维持为单层培养物。每周两次对肿瘤细 胞进行常规传代培养。收获在指数生长期生长的细胞并对其计数以用 于肿瘤接种。
根据制造商的说明书，使用Ficoll-Paque Plus从肝素全血中分离 人PBMC。
在D0用在0.2ml PBS中与Matrigel和新鲜分离的PBMC混合的 Raji肿瘤细胞在右侧腹皮下共接种每只小鼠。从D3进行抗体注射 (i.v.BIW×4次)。
测试物品制备
肿瘤测量和终点
主要终点是观察是否可以延迟肿瘤生长或是否可以治愈小鼠。使 用卡尺在两个维度上每周两次测量肿瘤大小，并且使用以下公式以 mm3表示体积：V＝0.5a x b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。 T/C值(以百分比表示)表示抗肿瘤效果。
使用下式计算每组的TGI：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100； Ti是治疗组在给定日的平均肿瘤体积，T0是治疗组在治疗开始当天 的平均肿瘤体积，Vi是与Ti同日的媒介物对照组的平均肿瘤体积， V0是治疗开始当天的媒介物组的平均肿瘤体积。
食蟹猴PK、毒性和免疫原性
通过静脉内推注对一只雄性和一只雌性食蟹猴施用一次1mg/kg 的WBP3438。将制剂配制在pH5.0的20mM NaAc-HAc、7.0％(w/w) 蔗糖、0.02％(w/v)PS80中。在给药前(第-1天)、0.25h、0.5h、 1h、4h、8h、24h、第3天、第7天、第14天、第21天和第28天收 集PK血液样品。在第3天、14天(312小时)和28天(480小时) 收集抗药物抗体(ADA)样品。
通过ELISA测定血清样品中WBP3438和ADA的血清浓度。通 过使用PhoenixWinNonlin软件(版本6.3，Pharsight，Mountain View， CA)对猴中WBP3438的血清浓度进行非房室药代动力学分析。线性 /对数梯形法则用于获得PK参数。
针对一般健康和外观、尤其是皮肤刺激进行了笼侧观察。通过血 液学分析仪(ADVIA2120)和化学法(HITACHI 7180)分别进行血 液学(CBC)的全血样品分析和化学检测的血清分析。
结果
表达食蟹猴CD19的细胞系的产生
通过流式细胞术使用抗CD19抗体检测表达食蟹猴CD19的细胞 系WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9的表达。 WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9显示猴CD19的高表达(图19)。
WuXiBody生成和优化
图1呈现了研究的抗体和形式的示意图。开发了抗CD3抗体T3 和抗CD19抗体U4。T3的恒定区(CL和CH1)被TCR的恒定结构 域取代以设计与常规抗体正交的独特的轻-重链界面。将TCR修饰的 T3和天然的U4与Fc结构域中的“把手入孔”突变共同用于设计双 特异性抗体形式E17和F16。
来自W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP和 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP的抗CD3和抗CD19结合部分的可变重 链和轻链序列提供如下：
全长W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP
和W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP序列提供如下：
W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP的制备
通过瞬时表达，抗体W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP的表达效价高 于90mg/L。在2步纯化后，W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP的纯度达到 97.5％(SEC-HPLC，图21)。W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP在还原 条件下在SDS-PAGE上以75kDa、55kDa和25kDa的表观分子量迁 移，对应于两条重链和两条轻链。由于相似的分子量，两条轻链可能 重叠。抗体在非还原条件下以200kDa的表观分子量迁移，表明完整 的双特异性分子(图6)。
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP的制备
通过瞬时表达，抗体W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP的表达效价为 高于100mg/L。在2步纯化后，W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP的纯度 达到95％(SEC-HPLC，图9)。W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP在还 原条件下在SDS-PAGE上以54kDa、56kDa和25kDa的表观分子量迁移，对应于两条重链和两条轻链。由于相似的分子量，两条轻链可 能重叠。抗体在非还原条件下以150kDa的表观分子量迁移，表明完 整的双特异性分子(图8)。
靶结合
通过流式细胞术在Ramos和Jurkat细胞上测试 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP与CD19和CD3的结合(图10A-B)。 抗体W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP显示出对Ramos和Jurkat细胞的 强结合活性，EC50值分别为15.6nM和47nM。
通过流式细胞术在Ramos和Jurkat细胞上测试 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP与CD19和CD3的结合(图11A-B)。 抗体W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP显示出对Ramos和Jurkat细胞的 强结合活性，EC50值分别为1.8nM和19.3nM。
跨物种结合
通过流式细胞术在WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9细胞(表达 CD19的细胞)上测试W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP与食蟹猴CD19 的结合(图12)。结合EC50为26nM。使用W331-cynoPro1.ECD.His (食蟹猴CD3ε蛋白)通过ELISA测试W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP 与食蟹猴CD3的结合(图13)。结合EC50为0.04nM。
对靶细胞的亲和力
通过流式细胞术在Ramos和Jurkat细胞上测试 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP与人CD19和CD3的结合亲和力。结合 的IgG/游离的IgG针对结合的IgG的作图显示于图14A-B中。与CD19 和CD3结合的拟合KD值为23nM和9.0nM。
靶细胞的双重结合
通过流式细胞术使用预标记的Jurkat和Raji细胞测试 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP桥接CD3 T细胞和CD19 B细胞的活性 (图15A-B)。Q2显示了桥接的Jurkat和Raji细胞的数量。与阴性 对照相比，大约18％的细胞通过双特异性抗体 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP桥接。
细胞毒性测定
使用CD8+ T细胞和Raji细胞评估W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP 的细胞杀伤活性。孵育4小时后，W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP诱导 快速和有效的细胞裂解(图16A)，EC50值为15nM。最大细胞杀灭 百分比为90％。
使用CD8+ T细胞和Raji细胞评估W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP 的细胞杀伤活性。培养4小时后，W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP诱导 快速且有效的细胞裂解(图16B)，EC50值为3.2nM。最大细胞杀灭 百分比为90％。
靶特异性T细胞活化
在存在或不存在CD19+靶细胞的情况下在通过活化标志物CD69 和CD25表明T细胞活化的测定中研究了 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP。结果证明 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP仅在CD19+靶细胞的存在下以剂量依赖 性方式诱导T细胞活化标志物CD25和CD69的表达(图17A-D)。 当B细胞不存在时，在CD4+和CD8+ T细胞亚群中均未观察到CD25和CD69的表达。
还在存在或不存在CD19+靶细胞的情况下在细胞因子释放的T细 胞活化测定中研究了W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP。结果证明 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP仅在CD19+靶细胞的存在下以剂量依赖 性方式诱导IFN-γ和TNF-α释放(图18A-D)。当B细胞不存在时， 在CD4+和CD8+ T细胞亚群中均未检测到IFN-γ和TNF-α。
热稳定性
使用实时PCR研究W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP的热稳定性。 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP的Tm1和Tm2为60.2℃和72.7℃。
血清稳定性
将W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP在血清中于37℃孵育14天。通 过流式细胞术检测孵育0、1、4、7和14天的抗体的结合活性。结果 显示，在人血清中孵育14天后，W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP对CD3 和CD19细胞的结合活性没有变化(图19A-B)。
Fcγ受体结合
通过SPR研究W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP与FcγRI、FcγRIIa (H167)、FcγRIIa(R167)，FcγRIIb、FcγRIIIa(F176)、FcγRIIIa (V176)和FcγRIIIb的结合活性。亲和力总结在表1中。 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP对所有Fcγ受体显示出典型的人IgG4 结合亲和力。
表1.通过SPR研究W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP与Fc受体的亲 和力
Fc受体 K<sub>D</sub>(M)
FcγRI 9.79E-09
FcγRIIa(H167) 2.05E-05
FcγRIIa(R167) 1.58E-05
FcγRIIb 2.41E-05
FcγRIIIa(F176) 2.93E-05
FcγRIIIa(V176) 1.40E-05
FcγRIIIb >4.10E-05
通过ELISA测试抗体对C1Q的结合活性。 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP在ELISA中未显示结合信号(图20)， 并且对照人IgG1抗体显示正常结合信号。
FcRn结合
通过SPR在pH6.0测试W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP与FcRn 的结合。亲和力拟合为2.58μM，这是人IgG4与FcRn的典型亲和力。
体内表征
PBMC/Raji异种移植模型中的功效研究
在该研究中，研究了W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP在NOG小鼠 中携带Raji细胞的混合PBMC人源化模型中的抗肿瘤功效。肿瘤生 长曲线如图21所示。
在D14，同亚型对照治疗组的平均肿瘤大小达到342mm3。用 1.5mg/kg和0.5mg/kgW3438-T3U4.E17-1.uIG4.SP处理产生明显的抗 肿瘤活性。平均肿瘤大小分别为78mm3(T/C＝23.0％，TGI＝93.9％， p＝0.016)和75mm3(T/C＝22.0％，TGI＝95.3％，p＝0.014)，并且在高剂量水平组中一只动物的肿瘤被根除。极低剂量(0.06mg/kg) 的W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP未显示出任何抗肿瘤活性。
WuXiBody在食蟹猴中的药代动力学
通过ELISA测试食蟹猴血清中W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP的 浓度(图22)。计算的PK参数列于表2中。对于1mg/kg的单次IV
表2.W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP的食蟹猴PK
毒性
在整个研究过程中，所有猴子都能很好地耐受药物。在研究的生 命期内没有观察到不良反应。饮食和体重没有明显变化。血液学和临 床化学的参数，包括AST、ALT、WBC、HGB和HCT，通常在参考 范围内。
免疫原性
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP的抗药物抗体(ADA)的结果显示 在图23A-B中。给药后3、14和28天在猴血清中检测到的针对 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP的抗药物抗体(ADA)的滴度显示与给 药前没有显著差异。因此，以1mg/kg单次IV注射 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP未在猴子中出现免疫原性。
序列表
<110> 上海药明生物技术有限公司
<120> 新型双特异性CD3/CD19多肽复合物
<130> IDC186003
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln
1 5 10 15
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val
20 25 30
Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys
35 40 45
Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg
50 55 60
Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn
65 70 75 80
Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu
85 90 95
Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val
100 105 110
Ser Ala Glu Ala
115
<210> 2
<211> 87
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys
1 5 10 15
Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp
20 25 30
Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met
35 40 45
Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe
50 55 60
Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe
65 70 75 80
Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
85
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 3
Gly Phe Ala Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 4
Trp Ile Ser Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 5
Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 6
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 7
Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 8
Thr Gln Ser His Thr Leu Arg Thr
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 9
Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr Asn Met Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 11
Thr Ala Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 12
Ser Ala Ser Ser Thr Val Asn Tyr Met His
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 13
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 14
His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 15
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 357
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
caggtgcagc ttgtgcagtc tggggcagaa gtgaagaagc ctgggtctag tgtcaaggtg 60
tcatgcaagg ctagcgggtt cgcctttact gactactaca tccactgggt gcggcaggct 120
cccggacaag ggttggagtg gatgggatgg atctccccag gcaatgtcaa cacaaagtac 180
aacgagaact tcaaaggccg cgtcaccatt accgccgaca agagcacctc cacagcctac 240
atggagctgt ccagcctcag aagcgaggac actgccgtct actactgtgc cagggatggg 300
tactccctgt attactttga ttactggggc cagggcacac tggtgacagt gagctcc 357
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser His Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 336
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
gatatcgtga tgacccagag cccagactcc cttgctgtct ccctcggcga aagagcaacc 60
atcaactgca agagctccca aagcctgctg aactccagga ccaggaagaa ttacctggcc 120
tggtatcagc agaagcccgg ccagcctcct aagctgctca tctactgggc ctccacccgg 180
cagtctgggg tgcccgatcg gtttagtgga tctgggagcg ggacagactt cacattgaca 240
attagctcac tgcaggccga ggacgtggcc gtctactact gtactcagag ccacactctc 300
cgcacattcg gcggagggac taaagtggag attaag 336
<210> 19
<211> 116
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Leu Thr Thr Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 348
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
caaatgcagc tcgtccagtc tggacctgaa gtgaagaagc ccgggacatc cgtcaaggtc 60
tcatgtaagg ctagcgggta cgcattcact tcctacaaca tgtactgggt gcgccaggcc 120
agaggacaga ggttggagtg gatcggctac atcgacccat acaacgccga tactacctac 180
aatcagaagt ttaaagggcg ggtgaccatt acccgggata tgtccacctc caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgag gagcgaggac acagccgtgt actactgcct gacaacagcc 300
tatgccatgg actattgggg ccagggcaca cttgtgactg tgagcagt 348
<210> 21
<211> 106
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Thr Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 318
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
gacatccagc tcacccaatc cccttctttc ctctccgcaa gtgtcggaga tagggtgact 60
atcacctgct cagcttcttc aaccgtgaac tacatgcatt ggtaccagca gaagcccggg 120
aaagccccaa agctgctgat ctacagcacc tccaatctgg ccagtggagt gccaagccgg 180
tttagcggga gcggctccgg cactgaattc actttgacaa ttagcagcct tcagcctgag 240
gactttgcca catattactg tcaccagtgg tccagctacc cctacacatt cgggcagggc 300
acaaagctgg agattaag 318
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro
1 5 10
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
Lys Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro
1 5
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
1 5 10 15
Pro
<210> 26
<211> 207
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser His Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
130 135 140
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
145 150 155 160
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
165 170 175
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
180 185 190
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
<210> 27
<211> 472
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu
115 120 125
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
130 135 140
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu
145 150 155 160
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr
165 170 175
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr
180 185 190
Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
195 200 205
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
210 215 220
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
225 230 235 240
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
340 345 350
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
465 470
<210> 28
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Thr Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 29
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Leu Thr Thr Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 30
<211> 667
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Leu Thr Thr Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
225 230 235 240
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr
245 250 255
Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
260 265 270
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
275 280 285
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
290 295 300
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
305 310 315 320
Leu Thr Thr Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
325 330 335
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
340 345 350
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
355 360 365
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
370 375 380
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
385 390 395 400
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
405 410 415
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
420 425 430
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
435 440 445
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
450 455 460
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
465 470 475 480
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
485 490 495
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
500 505 510
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
515 520 525
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
530 535 540
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
545 550 555 560
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
565 570 575
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
580 585 590
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
595 600 605
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
610 615 620
Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
625 630 635 640
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
645 650 655
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
660 665
<210> 31
<211> 142
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
85 90 95
Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn
100 105 110
Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val
115 120 125
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 32
<211> 95
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
85 90 95
<210> 33
<211> 177
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
85 90 95
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
130 135 140
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
145 150 155 160
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
165 170 175
Phe
<210> 34
<211> 130
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu
65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
85 90 95
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala Asp
130
<210> 35
<211> 95
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
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35 40 45
Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
85 90 95
<210> 36
<211> 95
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
85 90 95
<210> 37
<211> 95
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 47
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
85 90 95
<210> 38
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
85 90 95
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala
<210> 39
<211> 130
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg Ala
130
<210> 40
<211> 130
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg Ala
130

Claims (31)

1.一种双特异性多肽复合物，其包含与第二抗原结合部分相缔合的第一抗原结合部分，其中：
所述第一抗原结合部分包含：
第一多肽，所述第一多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一重链可变结构域(VH)，其可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)，和
第二多肽，所述第二多肽自N末端至C末端包含第一抗体的第一轻链可变结构域(VL)，其可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)，
其中：
C1包含工程化的Cβ，所述Cβ包含SEQ ID NO:1，并且C2包含工程化的Cα，所述Cα包含SEQID NO:2，
SEQ ID NO:1中的氨基酸C48和SEQ ID NO:2中的氨基酸C41能够形成非天然的链间二硫键，
C1和C2能够形成二聚体，并且所述非天然的链间二硫键能够稳定所述二聚体，以及
所述第二抗原结合部分包含：
第二抗体的第二VH，其可操作地连接至抗体重链CH1结构域，和
第二抗体的第二VL，其可操作地连接至抗体轻链恒定(CL)结构域，
其中：
所述第一和所述第二抗原结合部分中的一个是抗CD3结合部分，并且另一个是抗CD19结合部分，
抗CD3结合部分来源于抗CD3抗体，其包含：
a)包含SEQ ID NO：3的重链CDR1，b)包含SEQ ID NO：4的重链CDR2，c)包含SEQ ID NO：5的重链CDR3，d)包含SEQ ID NO：6的κ轻链CDR1，e)包含SEQ ID NO：7的κ轻链CDR2，和f)包含SEQ ID NO：8的κ轻链CDR3，
抗CD19结合部分来源于抗CD19抗体，其包含：
a)包含SEQ ID NO：9的重链CDR1，b)包含SEQ ID NO：10的重链CDR2，c)包含SEQ ID NO：11的重链CDR3，d)包含SEQ ID NO：12的κ轻链CDR1，e)包含SEQ ID NO：13的κ轻链CDR2，和f)包含SEQ ID NO：14的κ轻链CDR3，
并且
相比于所述第一和所述第二抗原结合部分均为天然Fab的对应部分的情况，所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分更不容易发生错配。
2.根据权利要求1所述的双特异性多肽复合物，所述双特异性多肽复合物的抗CD3结合部分来源于抗CD3抗体，其包含含有SEQ ID NO：15的重链可变结构域序列和含有SEQ IDNO：17的轻链可变结构域序列。
3.根据前述任意一项权利要求所述的双特异性多肽复合物，所述双特异性多肽复合物的抗CD19结合部分来源于抗CD19抗体，其包含含有SEQ ID NO：19的重链可变结构域序列和含有SEQ ID NO：21的轻链可变结构域序列。
4.根据前述任意一项权利要求所述的双特异性多肽复合物，其中：
所述第一VH在第一接合结构域可操作地连接至C1，并且；
所述第一VL在第二接合结构域可操作地连接至C2。
5.根据权利要求4所述的双特异性多肽复合物，其中所述第一连接结构域包含SEQ IDNO：23或者是SEQ ID NO：23，和/或所述第二连接结构域包含SEQ ID NO：24或者是SEQ IDNO：24。
6.前述权利要求中任一项的双特异性多肽复合物，其中第一抗原结合部分与第一二聚化结构域连接，第二抗原结合部分与第二二聚化结构域连接，其中第一和第二二聚化结构域是相缔合的。
7.根据权利要求6所述的双特异性多肽复合物，其中所述缔合是经由连接子、二硫键、氢键、静电相互作用、盐桥或疏水-亲水相互作用或其组合实现的。
8.根据权利要求6所述的双特异性多肽复合物，其中所述第一和/或所述第二二聚化结构域包含抗体铰链区的至少一部分，其可选地来源于IgG1、IgG2或IgG4。
9.根据权利要求6所述的双特异性多肽复合物，其中所述第一和/或所述第二二聚化结构域进一步包含抗体CH2结构域，和/或抗体CH3结构域。
10.根据权利要求6所述的双特异性多肽复合物，其中所述第一二聚化结构域在第三接合结构域可操作地连接至所述第一TCR恒定区(C1)。
11.根据权利要求10所述的双特异性多肽复合物，其中所述第三接合结构域包含SEQID NO:25。
12.根据权利要求6所述的双特异性多肽复合物，其中所述第二二聚化结构域可操作地连接至所述第二抗原结合部分的重链可变结构域。
13.根据权利要求6-12中任意一项所述的双特异性多肽复合物，其中所述第一和所述第二二聚化结构域是不同的，并且以不利于同源二聚化和/或有利于异源二聚化的方式相缔合。
14.根据权利要求13所述的双特异性多肽复合物，其中所述第一和所述第二二聚化结构域能够经由把手入孔、疏水相互作用、静电相互作用、亲水相互作用或增加的柔性而缔合成为异源二聚体。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的双特异性多肽复合物，其中所述双特异性多肽复合物包含四种多肽序列的组合：SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28和SEQ IDNO：29。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的双特异性多肽复合物，其中所述双特异性多肽复合物包含四种多肽序列的组合：SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28和SEQ IDNO：30。
17.一种缀合物，其包含缀合至一个部分的根据前述任意一项权利要求所述的双特异性多肽复合物。
18.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1-36中任意一项所述的双特异性多肽复合物。
19.一种分离的载体，其包含根据权利要求18所述的多核苷酸。
20.一种宿主细胞，其包含根据权利要求18所述的分离的多核苷酸，或根据权利要求19所述的分离的载体。
21.一种表达根据权利要求1-16中任意一项所述的双特异性多肽复合物的方法，所述方法包括在所述双特异性多肽复合物被表达的条件下培养根据权利要求21所述的宿主细胞。
22.一种生产双特异性多肽复合物的方法，所述方法包括：
a)将一个或多个编码根据权利要求1-16中任意一项所述的的多核苷酸引入宿主细胞；和
b)使所述宿主细胞表达所述双特异性多肽复合物。
23.根据权利要求21-22中任意一项所述的方法，所述方法进一步包括分离所述双特异性多肽复合物。
24.一种组合物，其包含根据权利要求1-16中任意一项所述的双特异性多肽复合物。
25.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-16中任意一项所述的双特异性多肽复合物，以及药学上可接受的运载体。
26.一种在需要其的受试者中治疗与CD19相关的疾病或病况的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-16中任意一项所述的双特异性多肽复合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述疾病或病况是癌症。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述癌症是淋巴癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌、食道癌或胃癌。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述疾病或病况是B细胞淋巴癌，可选地为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，其中所述非霍奇金淋巴瘤包括：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞性淋巴瘤(慢性淋巴细胞白血病，CLL)，或套细胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)，或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。
30.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-16中任意一项所述的双特异性多肽复合物。
31.根据权利要求30所述的试剂盒，其用于检测、诊断、预后或治疗CD19相关疾病或病症。
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