CN111108119B - 新型抗CD3ε抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供分离的抗CD3ε的单克隆抗体或其抗原结合片段、编码其的分离的多核苷酸、包括其的药物组合物，及其用途，所述抗体或其抗原结合片段包含一个或多个选自下组的重链CDR序列：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47，和/或一个或多个选自下组的κ轻链CDR序列：SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48。

Description

新型抗CD3ε抗体
发明领域
本发明总体上涉及新的抗CD3ε抗体及其用途。
背景技术
CD3(分化簇3)T细胞共受体是一种蛋白复合体，由四条不同的链组成：CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链。这些链与称为T细胞受体(TCR)的分子以及ζ链结合，以在T淋巴细胞中产生活化信号。TCR、ζ链和CD3分子共同组成了TCR复合体，其中作为亚单元的TCR识别抗原并与抗原连结，并且作为亚单元的CD3将抗原刺激转移并传递至信号通路，并且最终调节T细胞活性。CD3蛋白存在于几乎所有的T细胞中。
CD3与TCR共同形成CD3-TCR复合体，其在调节T细胞先天性和获得性免疫应答的大多数功能，以及细胞免疫功能和体液免疫功能方面起到关键作用。这些作用包括消除病原体，以及通过多种细胞毒性作用控制肿瘤生长。
特异性针对人CD3的小鼠单克隆抗体，如OKT3(Kung等(1979)Science 206:347-9)是第一代用于治疗的CD3抗体。尽管OKT3具有很强的免疫抑制效力，与其免疫原性的和有丝分裂的潜能有关的严重的副作用阻碍了其临床使用(Chatenoud(2003)Nature Reviews 3:123-132)。OKT3诱导抗球蛋白反应，促进其自身的迅速清理和中和作用(Chatenoud等(1982)Eur.J.Immunol.137:830-8)。另外，OKT3诱导T细胞增殖以及细胞因子的体外产生，并且引起大规模的细胞因子的体内释放(Hirsch等(1989)J.Immunol 142:737-43,1989)。细胞因子的释放(又称为“细胞因子风暴”)转而引起“流感样”的症状，其特征为发热、寒战、头痛、恶心、呕吐、腹泻、呼吸困难、脓毒性脑膜炎和低血压(Chatenoud，2003)。该等严重副作用限制了OKT3在移植中更广泛的使用，并且限制了其扩展至其他临床领域(如自身免疫)的使用(参考文献同上)。
对新的抗CD3抗体存在很大的需求。
发明简述
本申请全文中的冠词“一种”、“一个”和“所述”在此用于指代一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一种抗体”指一种抗体或多于一种抗体。
本申请提供新的抗CD3ε单克隆抗体、其氨基酸及核苷酸序列，以及其用途。
在一个方面，本申请提供分离的抗体或其抗原结合片段，其包括1、2或3个选自下组的CDR序列：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47，和/或1、2或3个选自下组的κ轻链CDR序列：SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48。
在某些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段包括1、2或3个与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45或47所示的序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的重链CDR序列。在某些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段包括1、2或3个与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46或48具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的轻链CDR序列。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区选自下组：
a)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的CDR序列；
b)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的CDR序列；
c)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17的CDR序列；
d)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23的CDR序列；
e)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29的CDR序列；
f)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:35的CDR序列；
g)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41的CDR序列；和
h)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:47的CDR序列。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括κ轻链可变区，所述κ轻链可变区选自下组：
a)κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的CDR序列；
b)κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12的CDR序列；
c)κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18的CDR序列；
d)κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24的CDR序列；
e)κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30的CDR序列；
f)κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:36的CDR序列；
g)κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:42的CDR序列；和
h)κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:48的CDR序列。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括选自下组的重链CDR3序列：SEQ ID NO:5、11、17、23、29、35、41和47。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括：
a)选自下组的重链CDR1序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:43；
b)选自下组的重链CDR2序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:45；和
c)选自下组的重链CDR3序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:47。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括：
a)选自下组的轻链CDR1序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:44；
b)选自下组的轻链CDR2序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:46；和
c)选自下组的轻链CDR3序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:48。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括：
a)选自下组的重链CDR1序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:43；
b)选自下组的重链CDR2序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:45；
c)选自下组的重链CDR3序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:47；
d)选自下组的轻链CDR1序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:44；
e)选自下组的轻链CDR2序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:46；和
f)选自下组的轻链CDR3序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:48。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括：
a)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的CDR序列；
b)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:12的CDR序列；
c)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16和SEQ IDNO:18的CDR序列；
d)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ IDNO:24的CDR序列；
e)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28和SEQ IDNO:30的CDR序列；
f)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:35的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34和SEQ IDNO:36的CDR序列；
g)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40和SEQ IDNO:42的CDR序列；
h)重链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:47的CDR序列；和κ轻链可变区，其包括1、2或3个选自SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46和SEQ IDNO:48的CDR序列。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段进一步包括：1、2、3或4个选自下组的重链框架区(FR)序列：SEQ ID NO:57、59、61、63、73、75、77和79，和/或1、2、3或4个选自下组的轻链框架区(FR)序列：SEQ ID NO:58、60、62、64、74、76、78和80。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段进一步包括：重链FR1序列，所述重链FR1选自SEQ ID NO:57和73；重链FR2序列，所述重链FR2选自SEQ ID NO:59和75；重链FR3序列，所述重链FR3选自SEQ ID NO:61和77；和重链FR4序列，所述重链FR4选自SEQ ID NO:63和79。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段进一步包括：轻链FR1序列，所述轻链FR1选自SEQ ID NO:58和74；轻链FR2序列，所述轻链FR2选自SEQ ID NO:60和76；轻链FR3序列，所述轻链FR3选自SEQ ID NO:62和78；和轻链FR4序列，所述轻链FR4选自SEQ ID NO:64和80。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括：重链可变区，所述重链可变区选自下组：SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:93、SEQ IDNO:97、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:117和与其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的同源序列。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括：轻链可变区，所述轻链可变区选自下组：SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:95、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:119和与其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的同源序列。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括选自下组的重链可变区序列的全部或一部分：SEQ ID NO:81、85、89、93、97、101、105、109、113和117；和/或选自下组的轻链可变区序列的全部或一部分：SEQ ID NO:83、87、91、95、99、103、107、111、115和119。在一个实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段由选自下组的重链可变区序列的全部或一部分组成的单域抗体：SEQ ID NO:81、85、89、93、97、101、105、109、113和117。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括：
a)重链可变区，其包括SEQ ID NO:81和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:83；
b)重链可变区，其包括SEQ ID NO:85和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:87；
c)重链可变区，其包括SEQ ID NO:89和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:91；
d)重链可变区，其包括SEQ ID NO:93和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:95；
e)重链可变区，其包括SEQ ID NO:97和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:99；
f)重链可变区，其包括SEQ ID NO:101和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:103；
g)重链可变区，其包括SEQ ID NO:105和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:107；
h)重链可变区，其包括SEQ ID NO:109和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:111；
i)重链可变区，其包括SEQ ID NO:113和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:115；
j)重链可变区，其包括SEQ ID NO:117和κ轻链可变区，其包括SEQ ID NO:119。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括一个或多个氨基酸残基替代，但仍然保持与CD3ε的特异性结合亲和力。
在某些实施方式中，所述替代在一个或多个CDR序列里，或在一个或多个FR序列里，或在一个或两个可变区序列里，或在Fc区。在某些实施方式中，在CDR序列里、在FR序列里、在可变区序列里或在Fc区的所述替代中的至少一个(或全部)包括保守性替代。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段在选自SEQ ID NO:1-48的一个或多个CDR序列中包括不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基替代。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段在选自SEQ ID NO:57-80的一个或多个FR序列中包括不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基替代。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段在选自SEQ ID NO:81、85、89、93、97、101、105、109、113和117的重链可变区序列的CDR序列和/或FR序列中包括总共不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个替代。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段在选自SEQ ID NO:83、87、91、95、99、103、107、111、115和119的轻链可变区序列的所有FR序列中包括不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基替代。
在某些实施方式中，所述替代赋予一种或多种需要的性质，所述需要的性质选自：a)提高与CD3ε的结合亲和力，b)引入或移除糖基化位点，c)引入游离的半胱氨酸残基，d)提高或降低ADCC或CDC，e)增加血清半衰期；和f)增加FcRn结合。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段进一步包括免疫球蛋白恒定区。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括IgG的恒定区。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段包括人IgG1的恒定区。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段为鼠科抗体或人源化抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段为骆驼化单域抗体(camelized single chain domain antibody)、双功能抗体(diabody)、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、双特异性抗体、ds双功能抗体(ds diabody)、纳米抗体、域抗体或双价域抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段具有双特异性。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段具有针对CD3ε的第一抗原特异性和第二抗原特异性。在某些实施方式中，所述第二抗原特异性针对不同于CD3ε的第二抗原，其中所述第二抗原存在于表达CD3ε的T细胞附近，这是免疫系统识别所述第二抗原所需的。在某些实施方式中，所述第一抗原特异性针对CD3ε，并且所述第二抗原特异性针对与肿瘤相关的抗原。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段与一种或多种缀合物连接。在某些实施方式中，所述缀合物可以是化疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记，或酶底物标记。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段能够特异性地与CD3ε结合。在某些实施方式中，所述CD3ε来源于小鼠、大鼠、猴或人。在某些实施方式中，所述CD3ε是重组CD3ε或表达在细胞表面上的CD3ε。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段能够以不超过5×10-9M、不超过4×10-9M、不超过3×10-9M、不超过2×10-9M、不超过10-9M、不超过5×10-10M、不超过4×10-10M、不超过3×10-10M、不超过2×10-10M、不超过10-10M的KD、不超过5×10-11M、不超过4×10-11M、不超过3×10-11M、不超过2×10-11M或不超过10-11M值特异性地与表达在细胞表面上的人CD3ε结合，所述KD值通过流式细胞术测定。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段能够以不超过0.50nM或不超过1.10nM的EC50值特异性地与表达在细胞表面上的人CD3ε结合，所述EC50值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段能够以不超过0.001nM、不超过0.005nM、不超过0.01nM、不超过0.02nM或不超过0.03nM、不超过0.04nM或不超过0.05nM的EC50值特异性地与重组食蟹猴CD3ε结合，所述EC50值通过ELISA测定。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段能够以不超过0.01nM、不超过0.02nM、不超过0.03nM、不超过0.04nM、不超过0.05nM、不超过0.06nM、不超过0.07nM或不超过0.08nM的EC50值特异性地与重组人CD3ε结合，所述EC50值通过ELISA测定。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段能够以不超过0.5nM、不超过0.6nM、不超过0.7nM、不超过0.8nM、不超过0.9nM、不超过1nM、不超过2nM、不超过3nM、不超过4nM、不超过5nM、不超过6nM、不超过7nM、不超过8nM、不超过9nM或不超过10nM的EC50值特异性地与表达在表达CD3的细胞表面上的人CD3ε结合，所述EC50值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其能够以不超过0.50nM或不超过1.10nM的EC50值特异性地与表达在表达CD4的细胞表面上的人CD3ε结合，所述EC50值通过流式细胞术测定。
在一个方面，本申请提供抗体或其抗原结合片段，其与本申请提供的抗体或其抗原结合片段竞争相同的表位。
在一个方面，本申请进一步提供药物组合物，其包括本申请所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的运载体。在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包括第二药剂，其能够提高所述抗体或其抗原结合片段的治疗效果，和/或能够降低所述抗体或其抗原结合片段的副作用。
在一个方面，本申请进一步提供分离的多核苷酸，其编码本申请所述的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸包括选自下组的核苷酸序列：SEQID NO:82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118和120。
在一个方面，本申请进一步提供包括所述分离的多核苷酸的载体。
在一个方面，本申请进一步提供包括所述载体的宿主细胞。
在一个方面，本申请进一步提供表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在表达所述多核苷酸的条件下培养所述宿主细胞。
在一个方面，本申请进一步提供在会从对CD3ε活性的调节中受益的受试者中治疗疾病或状况的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本申请所述的抗体或其抗原结合片段或本申请所述的药物组合物。在某些实施方式中，所述受试者是人类。在某些实施方式中，所述疾病或状况是与CD3相关的疾病或状况。在某些实施方式中，所述疾病或状况是癌症、自体免疫疾病、炎性疾病或感染性疾病。
在一个方面，本申请进一步提供一种在体内或在体外活化表达CD3ε的T细胞的方法，其包括将所述表达CD3ε的T细胞与本申请提供的抗体或其抗原结合片段接触。
在一个方面，本申请进一步提供在表达CD3ε的细胞中的调节CD3活性的方法，其包括将所述表达CD3ε的细胞暴露于本申请所述的抗体或其抗原结合片段。
在一个方面，本申请进一步提供一种通过表达CD3ε的T细胞来促进第二抗原的体内或体外加工的方法，所述方法包括将所述表达CD3ε的T细胞与本申请所述的双特异性抗体或其抗原结合片段接触，其中所述双特异性抗体或抗原结合片段能够与所述表达CD3ε的T细胞和第二抗原特异性地结合，从而使两者接近。
在一个方面，本申请进一步提供检测样品中CD3ε的存在或含量的方法，其包括将所述样品与本申请所述的抗体或其抗原结合片段接触，以及确定样品中CD3ε的存在或含量。
在一个方面，本申请进一步提供在受试者中诊断与CD3相关的疾病或状况的方法，其包括：a)获取来自所述受试者的样品；b)将所述样品与本申请所述的抗体或其抗原结合片段接触；c)确定在所述样品中CD3ε的存在或含量；d)将所述CD3ε的存在或含量与所述受试者的疾病或状况相关联。
在一个方面，本申请进一步提供本申请所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗受试者中与CD3相关的疾病或状况的药物中用途。
在一个方面，本申请进一步提供本申请所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断与CD3相关的疾病或状况的诊断试剂中的用途。
在一个方面，本申请进一步提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本申请提供的抗体或其抗原结合片段，所述试剂盒用于检测CD3ε。在某些实施方式中，所述试剂盒包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段用于检测重组CD3ε、表达在细胞表面上的CD3ε，或者表达CD3ε的细胞。
附图简述
图1示出了单克隆抗体，WBP3311_2.166.48-uIgG1K、WBP3311_2.306.4-uIgG1K和WBP3311_2.166.48与重组食蟹猴CD3ε蛋白的结合，其通过ELISA测定。
图2示出了单克隆抗体，WBP3311_2.166.48-uIgG1K,WBP3311_2.306.4-uIgG1K、WBP3311_2.166.48和WBP3311_2.306.4与人CD4 T细胞的结合，其通过流式细胞术测定。
图3示出了8个小鼠抗体(W3311-2.166.48、W3311-2.306.4、W3311-2.383.47、W3311-2.400.5、W3311-2.482.5、W3311-2.488.33、W3311-2.615.8和W3311-2.844.8)与表达人CD3的细胞(Jurkat细胞)的结合亲和力，其通过流式细胞术测定。
图4A示出了人源化抗体WBP3311_2.166.48-z1-uIgG1K与表达人CD3的细胞(Jurkat细胞)的结合亲和力，其通过流式细胞术测定。
图4B示出了人源化抗体WBP3311_2.306.4-z1-uIgG1K与表达人CD3的细胞(Jurkat细胞)的结合亲和力的结果，其通过流式细胞术测定。
图4C示出了阳性对照OKT3与表达人CD3的细胞(Jurkat细胞)的结合亲和力的结果，其通过流式细胞术测定。
图5示出了8个小鼠抗体(W3311-2.166.48、W3311-2.306.4、W3311-2.383.47、W3311-2.400.5、W3311-2.482.5、W3311-2.488.33、W3311-2.615.8和W3311-2.844.8)对表达人CD3的细胞(Jurkat细胞)的细胞内化率，其通过流式细胞术测定。
图6示出了8个小鼠抗体(W3311-2.166.48、W3311-2.306.4、W3311-2.383.47、W3311-2.400.5、W3311-2.482.5、W3311-2.488.33、W3311-2.615.8和W3311-2.844.8)对人T细胞活化的结果，其通过细胞内细胞因子TNFα和IFNγ染色测得。
图7示出了两个人源化抗体(WBP3311_2.166.48-z1-uIgG1K和WBP3311_2.306.4-z1-uIgG1K)对人T细胞活化的结果，其通过细胞内细胞因子TNFα和IFNγ染色测得。
图8示出了7个小鼠抗体(W3311-2.166.48、W3311-2.306.4、W3311-2.400.5、W3311-2.482.5、W3311-2.488.33、W3311-2.615.8和W3311-2.844.8)针对克隆WBP3311_2.383.47的表位分组的结果。
发明详述
本申请的以下描述只为说明本申请的多种实施方式。因此，此处讨论的具体修改方式不应理解为对申请范围的限制。本领域的技术人员在不偏离本申请范围的情况下即可很容易地得出多种等同方式，变化和修改，应理解这样的等同实施方式包括在本发明范围内。在本申请中引用的所有文献，包括公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入。
定义
本发明中的“抗体”一词包括任意可结合某特定抗原的免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、双价抗体、单价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。一个天然的完整抗体包含两条重(H)链和两条轻(L)链。哺乳动物的重链可分为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由一个可变区(VH)以及第一、第二和第三恒定区(分别为CH1、CH2、CH3)组成；哺乳动物的轻链可分为λ或κ，而每条轻链由一个可变区(分别为λ轻链的VL或κ轻链的VK)以及一个恒定区(分别为λ轻链的CL或κ轻链的CK)组成。抗体呈“Y”型，“Y”型结构的颈部由两条重链的第二和第三恒定区组成，其通过二硫键结合。“Y”型结构的每条臂包括其中一条重链的可变区和第一恒定区，其与一条轻链的可变区和恒定区结合。轻链和重链的可变区决定抗原的结合。每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(轻链的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重链的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本发明中公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani命名法命名或识别。(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.，J.Mol.Biol.，273(4)，927(1997)；Chothia,C.等，J Mol Biol.Dec5；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.，J.Mol.Biol.，196,901(1987)；Chothia,C.等，Nature.Dec 21-28；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等，National Institutes ofHealth，马里兰贝塞斯达(1991))。其中，三个CDR由被称为框架区(FR)的侧面连续部分间隔开，框架区比CDR更加高度保守并形成一个支架支撑超变环。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类。根据是否含有α、δ、ε、γ和μ重链，抗体可分别分为五个主要的分类或异构体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。几个主要的抗体分类还可分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)等。
本申请中的“二价”一词，指具有两个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；“单价”一词指仅具有一个单一抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；而“多价”一词指具有多个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段。在一些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段是二价的。
在本申请中，“双特异性”抗体指具有来源于两个不同的单克隆抗体的片段，并且能够与两个不同的表位结合的人造抗体。所述两个表位可以存在于同一个抗原，或者其可以存在于两个不同的抗原。
本申请中的“抗原结合片段”一词，指由含有1、2或3个CDR的抗体部分或者任何其他结合抗原但不具有完整抗体结构的抗体片段所形成的一种抗体片段。抗原结合片段的例子包括，但不限于，如双功能抗体(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv－dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(dsdiabody)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(双价的双功能抗体)、双价单链抗体(BsFv)、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼化单域抗体(camelized single domain antibody)、纳米抗体、域抗体和双价域抗体。抗原结合片段可以与母体抗体结合相同的抗原。
抗体的“Fab”片段是指由一条轻链(包括可变区和恒定区)和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的那部分抗体分子。
“Fab'”片段是指包含了部分铰链区的Fab片段。
“F(ab')2”指的是Fab’的二聚体。抗体的“Fv”指的是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由一条轻链的可变区和一条重链的可变区组成。
“dsFv”是指二硫键稳定的Fv片段，其单条轻链的可变区与单条重链的可变区之间的连接是二硫键。在一些实施方式中“(dsFv)2”或“(dsFv-dsFv')”含有三条肽链：两个VH部分通过肽接头(例如长的弹性接头)相连，并通过二硫键分别与两个VL部分结合。在一些实施方式中，dsFv-dsFv'具有双特异性，其中每对通过二硫键配对的重链轻链具有不同的抗原特异性。
“单链Fv抗体”或“scFv”是指由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体(Huston JS等，Proc Natl Acad Sci USA、85:5879(1988))。
抗体的“Fc”指的是由第一重链的第二和第三恒定区经由二硫键与第二重链的第二和第三恒定区连接组成的那部分抗体。抗体的Fc段负责多种不同的效应功能，如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)，但在抗原结合中不起作用。
“单链抗体Fv-Fc”或“scFv-Fc”是指由连接到某抗体Fc段的scFv组成的工程抗体。
“骆驼化单域抗体(Camelized single domain antibody)”、“重链抗体”或“HCAb(Heavy-chain-only antibodies，HCAb)”都是指含有两个VH域而不含有轻链的抗体(Riechmann L.和Muyldermans S.，J Immunol Methods.Dec 10；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.，J Biotechnol.Jun；74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利号6,005,079)。重链抗体最初来源于驼科(骆驼、单峰驼和美洲驼)。虽然缺失轻链，骆驼化抗体(camelized antibodies)有确证的抗原结合全部功能(Hamers-Casterman C.等，Nature.Jun 3；363(6428):446-8(1993)；Nguyen VK.等，“Heavy-chain antibodies inCamelidae；a case of evolutionary innovation”Immunogenetics.Apr；54(1):39-47(2002)；Nguyen VK.等，Immunology.May；109(1):93-101(2003))。重链抗体的可变区(VHH域)是最小的已知的获得性免疫产生的抗原结合单位(Koch-Nolte F.等，FASEB J.Nov；21(13):3490-8.Epub 2007 Jun 15(2007))。
“纳米抗体”是指一种抗体片段，其由一个来自重链抗体的VHH域和两个恒定区CH2和CH3组成。
“双功能抗体(diabody)”或“dAb”包括带有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中该片段含有在同一条多肽链上相连的VH域和VL域(VH-VL或VH-VL)(请参见Holliger P.等，Proc Natl Acad Sci USA.，7月15日；90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。两个域之间衔接物很短，使同一条链上的两个域不能互相配对，从而迫使两个域与另一条链的互补域配对，形成两个抗体结合位点。这两个抗体结合位点可靶向结合相同或不同的抗原(或抗原表位)。在某些实施方式中，“双特异性ds双功能抗体”是靶向两个不同的抗原(或抗原表位)的双功能抗体。在某些实施方式中，“scFv二聚体”是双价双功能抗体或双价单链抗体(BsFv)，含有二聚化的两个VH-VL(由多肽衔接物连接)基团，其中一个基团的VH与另一个基团的VL协作形成两个结合位点，这两个结合位点可靶向结合相同抗原(或抗原表位)或不同抗原(或抗原表位)。在另一些实施方式中，“scFv二聚体”是双特异性双功能抗体，含有相互连接的VL1-VH2(由多肽衔接物连接)和VH1-VL2(由多肽衔接物连接)，其中VH1和VL1协作，VH2和VL2协作，且每个协作的配对具有不同的抗原特异性。
“域抗体”是指仅含有重链可变区或轻链可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或多个VH域由肽连接子共价结合形成双价域或多价域抗体。双价域抗体的两个VH域可靶向作用于相同或不同的抗原。
本申请中使用的术语“嵌合”是指具有来源于一种物种的重链和/或轻链的一部分，和所述重链和/或轻链其余部分来源于不同物种的抗体或抗原结合片段。在一个示例性的实例中，嵌合抗体可以包括来源于人的恒定区和来源于非人动物(例如小鼠)的可变区。在一些实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。
本申请中使用的术语“人源化”是指包括来源于非人动物的CDR、来源于人的FR区，以及来源于人的恒定区(当适用时)的抗体或抗原结合片段。
本申请中使用的“CD3”是指来源于任何脊椎动物来源的分化簇3蛋白，包括哺乳动物，如灵长类动物(例如人、猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在哺乳动物中，CD3分子是六条链的多蛋白质复合体，包括：CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链和CD3ζ链的同源二聚体，其中CD3ζ链是CD3分子的细胞内尾巴，并且CD3γ链、CD3δ链和CD3ε链全部含有表达在T细胞表面上的胞外域(ECD)。人CD3的示例性的序列包括人CD3ε蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_000724)、人CD3δ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_000723)和人CD3γ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_000064)。非人CD3的示例性的序列包括食蟹猴(Macaca fascicularis)(猴)CD3ε蛋白(NCBIRef Seq No.NP_001270544)、食蟹猴(Macaca fascicularis)(猴)CD3δ蛋白(NCBI Ref SeqNo.NP_001274617)、食蟹猴(Macaca fascicularis)(猴)CD3γ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_001270839)；小鼠CD3ε蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_031674)、小鼠CD3δ蛋白(NCBI Ref SeqNo.NP_038515)、小鼠CD3γ蛋白(NCBI Ref Seq No.AAA37400)；褐家鼠(大鼠)CD3ε蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_001101610)、褐家鼠(大鼠)CD3δ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_037301)、褐家鼠(大鼠)CD3γ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_001071114)。在某些实施方式中，用于本申请的CD3还可以是重组CD3，例如，包括重组CD3ε蛋白、重组CD3δ蛋白和重组CD3γ蛋白，其可以可选地表达为重组CD3复合体。重组CD3复合体可以在细胞表面上表达，或者可以表达为不结合在细胞表面上的可溶形式。
本申请中使用的术语“CD3ε”旨在包含任何形式的CD3ε，例如，1)天然未经加工的CD3ε分子，“全长”CD3ε链或天然存在的CD3ε变体，包括例如剪接变体或等位基因变体；2)由在细胞中的加工产生的任何形式的CD3ε；或3)通过重组方法产生的CD3ε亚单位的全长、片段(例如截短的形式、胞外域/跨膜域)或修饰的形式(例如突变的形式、糖基化/聚乙二醇化的、组氨酸-标记/免疫荧光融合的形式)。
术语“抗CD3ε抗体”是指能够与CD3ε(例如人或猴CD3ε)特异性结合的抗体。
本申请中的“特异性结合”或“特异性的结合”是指两分子间的非随机结合反应，如抗体和抗原间的反应。在某些实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合片段与人和/或猴CD3ε特异性结合，并且其结合亲和力(KD)≤10-6M(如：≤5×10-7M、≤2×10-7M、≤10-7M、≤5×10-8M、≤2×10-8M、≤10-8M、≤5×10-9M、≤4x10-9M、≤3x10-9M、≤2×10-9M或≤10-9M)。本申请中的KD是指解离速度与结合速度的比值(koff/kon)，其可通过使用任何本领域公知的传统方法测定，包括但不限于表面等离子共振法、微量热泳法、HPLC-MS方法和流式细胞术(例如FACS)方法。在某些实施方式中，通过使用流式细胞术可以适当地确定KD值。
本申请中的“阻断结合”或“竞争性同样的表位”的能力是指抗体或其抗原结合片段将两个分子间结合(例如人CD3ε和抗CD3ε抗体)的相互作用抑制到任何可检测的程度的能力。在某些实施方式中，阻断两个分子间结合的抗体或抗原结合片段可将两个分子间结合的相互作用抑制至少85％或至少90％。在某些实施方式中，这样的抑制作用可以大于85％或大于90％。
本申请中使用的“表位”是指抗原分子中与抗体结合的那部分氨基酸或原子基团。如果两种抗体表现出对抗原的竞争性结合，则可能结合抗原上相同或密切相关的表位。例如，如果抗体或其抗原结合片段对参照抗体结合至抗原(例如本申请所述的重组人/猴CD3ε或表达在细胞表面上的CD3ε)的阻断达到至少85％或至少90％，那么所述抗体或其抗原结合片段可以被认为与所述参照抗体结合相同/密切相关的表位。
本领域的技术人员将认识到，无需过度的实验即可判断人单克隆抗体是否与本申请所述的抗体(例如小鼠单克隆抗体WBP3311_2.166.48、WBP3311_2.306.4、WBP3311_2.383.47、WBP3311_2.400.5、WBP3311_2.482.5、WBP331_2.488.33、WBP3311_2.615.8、WBP3311_2.844.8和人源化抗体WBP3311_2.166.48-z1和WBP3311_2.306.4-z1)结合至相同的表位，通过确定前者是否阻止后者与CD3ε抗原多肽结合。如果待测抗体与本申请所述的抗体竞争，显示为本申请所述的抗体与CD3ε抗原多肽的结合减少，则这两种抗体与相同或密切相关的表位结合。或者如果本申请所述的抗体抑制待测抗体与CD3ε抗原多肽的结合，则这两种抗体与相同或密切相关的表位结合。
本申请使用的抗体名称中的符号具有不同代表意义：“mIgG2”是指具有小鼠IgG2同种型恒定区的抗体；“uIgG1”是指具有人IgG1同种型恒定区的抗体；“K”或“L”是指所述抗体使用κ轻链或λ轻链。
在本申请中当“保守替代”用于氨基酸序列时，是指将一个氨基酸残基用另一个具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基替代。例如，可以在疏水侧链氨基酸残基间(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile)、中性亲水侧链残基间(例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)、酸性侧链残基间(例如Asp、Glu)、碱性侧链氨基酸间(例如His、Lys和Arg)或方向侧链残基间(例如Trp、Tyr和Phe)进行保守替代。本领域已知保守替代通常不会引起蛋白构象结构的显著变化，因此能够保留蛋白质的生物活性。
本申请所述的术语“同源”和“同源的”可以互换使用，指当最佳比对时核酸序列(或其互补链)或氨基酸序列具有与另一条序列至少80％(如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的同一性。
当“百分比序列同一性”用于氨基酸序列(或核酸序列)时，是指在进行序列比对，并且必要时引入间隔使相同氨基酸(或核酸)数目达到最多后，在候选序列中，与参比序列相同的氨基酸(或核酸)残基占所述候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。所述氨基酸残基的保守替代可以认为或可以不认为是相同残基。可以通过本领域公开的工具，例如BLASTN、BLASTp(美国国家生物技术信息中心网站(NCBI)，也可参见Altschul S.F.等，J.Mol.Biol.，215:403–410(1990)；Stephen F.等，Nucleic Acids Res.，25:3389–3402(1997))、ClustalW2(欧洲生物信息研究所网站，可参见Higgins D.G.等，Methods inEnzymology，266:383-402(1996)；Larkin M.A.等，Bioinformatics(英国牛津)，23(21):2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，对序列进行比对以确定氨基酸(或核酸)序列的百分比序列同一性。本领域技术人员可以使用所述工具的默认参数或根据比对的需要适当调整参数，例如通过挑选合适的算法。
本申请中使用的“效应功能”是指抗体的Fc区与其效应器例如C1复合体和Fc受体结合的生物活性。示例性的效应功能包括抗体与C1复合体上的C1q相互作用诱导的补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体的Fc区与效应细胞上的Fc受体结合诱导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及吞噬。
对某种状况的“治疗”或“疗法”包括预防或减轻某种状况，降低某种状况兴起或发展的速度，减少发展出某种状况的风险，预防或延迟与某种状况相关的症状发展，减少或终止与某种状况相关的症状，产生某种状况的完全或部分的逆转，治愈某种状况，或以上的组合。
“被分离”的物质已经经人工由自然状态改变。如果自然界中出现某种“被分离”的物质或成分，那么其已经被改变或脱离其原始状态，或二者均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在的多核苷酸或多肽是未被分离的，但如果这些多核苷酸或多肽与之在天然状态下共存的物质足够分离并以足够纯的状态存在，则可以认为是“被分离”。“分离的核酸”序列是指被分离的核酸分子的序列。在某些实施方式中，“分离的抗体或其抗原结合片段”是指的纯度为至少60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗体或抗原结合片段，其由电泳方法(如SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳)，或色谱法(如离子交换色谱或反相HPLC)确定。
本发明中“载体”是指，可将编码某蛋白的多核苷酸操作性地插入其中并使该蛋白获得表达的一种运载工具。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。载体可以是表达载体或克隆载体。本申请提供的载体(例如表达载体)含有本申请所述的编码抗原或其抗原结合片段的核酸序列、至少一个可操作地连接至所述核酸序列的启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)，以及至少一个选择标记。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
本发明中“宿主细胞”是指导入外源多核苷酸和/或载体的细胞。
本申请中使用的“与CD3相关的疾病或状况”是指由CD3提高或减少的表达或活性引起、恶化，或通过其他方式产生联系的任何疾病或状况。在一些实施方式中，与CD3相关的状况为与免疫相关的病症，例如癌症、自体免疫疾病、炎性疾病或感染性疾病。
本申请中使用的“癌症”是指以恶性细胞生长或肿瘤、异常增生、浸润或转移为特征的任何医学状况，并且包括实体肿瘤和例如白血病的非实体癌症(血液恶性肿瘤)。本申请中使用的“实体瘤”是指肿瘤和/或恶性细胞的实体团块。
“药用可接受的”是指所指的运载体、溶媒、稀释剂、赋形剂和/或盐，总的来说在化学上和/或在物理上与制剂中的其他配料相兼容，并在生理上与接受者相兼容。
抗CD3ε抗体
本申请提供包含选自下组的抗CD3ε抗体的一个或多个(例如1、2、3、4、5或6个)CDR序列的抗CD3ε抗体及其抗原结合片段：WBP3311_2.166.48、WBP3311_2.306.4、WBP3311_2.383.47、WBP3311_2.400.5、WBP3311_2.482.5、WBP331_2.488.33、WBP3311_2.615.8或WBP3311_2.844.8。在本申请全文中，当涉及抗体名称时，术语“WBP3311”与“W3311”可互换使用。例如，抗体WBP3311_2.166.48也被指代为W3311_2.166.48，并且该名称指代同一抗体。
本申请中使用的“WBP3311_2.166.48”是指具有如SEQ ID NO:81所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:83所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
本申请中使用的“WBP3311_2.306.4”是指具有如SEQ ID NO:85所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:87所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
本申请中使用的“WBP3311_2.383.47”是指具有如SEQ ID NO:89所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:91所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
本申请中使用的“WBP3311_2.400.5”是指具有如SEQ ID NO:93所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:95所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
本申请中使用的“WBP3311_2.482.5”是指具有如SEQ ID NO:97所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:99所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
本申请中使用的“WBP331_2.488.33”是指具有如SEQ ID NO:101所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:103所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
本申请中使用的“WBP3311_2.615.8”是指具有如SEQ ID NO:105所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:107所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
本申请中使用的“WBP3311_2.844.8”是指具有如SEQ ID NO:109所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:111所示的κ轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
表1示出了这8个抗CD3ε抗体的CDR序列。以下还提供了重链和轻链的可变区序列。
表1
Figure BDA0002395348420000211
以下提供了WBP3311_2.166.48、WBP3311_2.306.4、WBP3311_2.383.47、WBP3311_2.400.5、WBP3311_2.482.5、WBP331_2.488.33、WBP3311_2.615.8和WBP3311_2.844.8，以及人源化的WBP3311_2.166.48和WBP3311_2.306.4抗体的重链或κ轻链可变区序列。
WBP3311_2.166.48-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:81)：
QVQLQQSGPELVKPGASVKIACKASGYSFTTYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIFPGNDNIKYSEKFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAIDSVSIYYFDYWGQGTTLTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:82)：
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAACCTGGGGCTTCAGTGAAGATTGCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGCTTCACAACCTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTTTCCTGGAAATGATAATATTAAGTACAGTGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACGGCAGACACTTCCTCCAGTACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCTATAGACTCCGTTAGTATCTACTACTTTGACTATTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
WBP3311_2.166.48-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:83)：
DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCTQSFILRTFGGGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:84)：
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGAAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAACAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCACGCAATCTTTTATTCTTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
WBP3311_2.306.4-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:85)：
QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGFAFTDYYIHWVKQRPGQGLEWIGWISPGNVNTKYNENFKGRATLTADLSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDGYSLYYFDYWGQGTTLTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:86)：
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAATTGGTGAAGCCTGGGGCTTCCGTGAGGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTTCGCCTTCACAGACTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGATGGATTTCTCCTGGAAATGTTAATACTAAATACAATGAAAACTTCAAGGGCAGGGCCACACTGACTGCAGACCTATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGATGGATATTCCCTGTATTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
WBP3311_2.306.4-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:87)：
DIVMSQSPSSLTVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRQSGVPDRFTGSGSGTAFTLTISGVQAEDLAVYFCTQSHTLRTFGGGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:88)：
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCTAAACTACTAATCTACTGGGCATCCACTAGGCAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGCTTTCACTCTCACCATCAGCGGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTTCTGCACGCAATCTCATACTCTTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
WBP3311_2.383.47-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:89)：
QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKTSGFTFTNYYIHWVIQRPGQGLEWIGWISPENGNTKYNENFQDKATLTADISSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCARDGYSLYYFDYWGQGTTLTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:90)：
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAATTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGCAAGACTTCTGGCTTCACCTTCACAAACTACTATATACACTGGGTGATACAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGTTGGATTTCTCCTGAAAATGGTAATACTAAATACAATGAAAACTTCCAGGACAAGGCCACACTGACTGCAGACATATCGTCCAGCACAGCCTACATGCACCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGATGGGTATTCCCTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
WBP3311_2.383.47-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:91)：
DIVMSQSPSSLTVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASIRVSGVPDRFTGSGSGTTFTLTISGVQAEDLAVYYCTQSHTLRTFGGGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:92)：
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAGCTACTGATCTACTGGGCATCCATTAGGGTATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAACTTTCACTCTCACCATCAGCGGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTATTGCACGCAATCTCATACTCTTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
WBP3311_2.400.5-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:93)：
QVQLQQSGPELVNPGASVKISCKASGYSFTNYYLHWVKQRPGQGLEWIGWIFPESDNTKYNEKLKGKATLTADTSSDTAYMHLSSLTFEDSAVYFCARDSVGNYFFDFWGQGTTLTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:94)：
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAATCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGTTTCACAAACTACTATTTACACTGGGTGAAACAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTTTCCTGAAAGTGATAATACCAAGTACAATGAGAAATTGAAGGGCAAGGCCACACTGACGGCAGACACATCCTCCGATACAGCCTACATGCACCTCAGCAGCCTGACATTTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAGACTCCGTTGGAAACTACTTCTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
WBP3311_2.400.5-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:95)：
DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMRCKSSQSLVNNRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCAQSFILRTFGGGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:96)：
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCGGGAGAGAAGGTCACTATGAGGTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGGTCAACAATAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCATGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTATTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCGCGCAATCTTTTATTCTTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAA
WBP3311_2.482.5-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:97)：
QVQLQQSGPELVKPGSSVKISCKPSGYTFTTYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIFPGSDNIKYNENFKDKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDSVSRYYFDYWGQGTILTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:98)：
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAACCTGGGTCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAACCTTCTGGCTACACCTTCACAACTTACTATATACATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTTTCCTGGAAGTGATAATATTAAATACAATGAGAATTTCAAGGACAAGGCCACACTGACGGCAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAAGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAGACTCCGTCAGTAGGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCATTCTCACAGTTTCTTCA
WBP3311_2.482.5-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:99)：
DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLVNDRTRKNYLAWYQQKPGLSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCAQSFILRTFGGGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:100)：
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGGTCAATGATAGAACCCGAAAAAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCTGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCTTCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCTGTTTATTACTGCGCGCAATCTTTTATTCTTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
WBP331_2.488.33-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:101)：
QVQLQQSGPELVKPGTSVKISCKASGFSFTNYYIHWVKQRPGQGPEWIGWIFPGTVNTKYNEKFKGKATLTADTSSNTAFMQLSSLTSADSAVYFCARDSVGIYYFDFWGLGTTLTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:102)：
CAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAACCTGGGACTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTTCAGCTTCACAAACTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACCTGAGTGGATTGGATGGATTTTTCCTGGAACTGTTAATACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGGTAAGGCCACACTGACGGCAGACACATCCTCCAATACAGCCTTCATGCAGCTCAGCAGCCTGACTTCTGCGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAGACTCCGTTGGTATCTACTACTTTGACTTCTGGGGCCTAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
WBP331_2.488.33-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:103)：
DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTVSCKSSQSLLNNRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCTQSFILRTFGGGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:104)：
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTGTGAGTTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAATAGAACCCGAAAAAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTACTAATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCACGCAATCTTTTATTCTTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAAA
WBP3311_2.615.8-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:105)：
QVQLQQSGPELVKPGTSMKISCKASGYSFTDFYTHWVRQRPGQGLEWIGWIFPGSDNIKYNEKFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDSVSVYYFDYWGQGTTLTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:106)：
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAACCTGGGACTTCAATGAAAATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGTTTCACAGACTTCTATACACACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTTTCCTGGAAGTGATAATATTAAATACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACGGCAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAGACTCCGTTAGTGTCTACTACTTTGACTATTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
WBP3311_2.615.8-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:107)：
DIVMSQSPSSLAVTAGEKVTMSCKSSQSLLNIRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCTQSFILRTFGGGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:108)：
GACATCGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACATTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAACAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGACTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCACGCAATCTTTTATTCTTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
WBP3311_2.844.8-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:109)：
QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGFAFTDYYIHWVKQRPGQGLEWIGWISPGNVNTKYNENFKGRATLTADLSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDGYSLYYFDYWGQGTTLTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:110)：
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAATTGGTGAAGCCTGGGGCTTCCGTGAGGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTTCGCCTTCACAGACTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGATGGATTTCTCCTGGAAATGTTAATACTAAATACAATGAAAACTTCAAGGGCAGGGCCACACTGACTGCAGACCTATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGATGGATATTCCCTGTATTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
WBP3311_2.844.8-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:111)：
DIVMSQSPSSLTVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTAFTLTISGVQAEDLAVYFCTQSHTLRTFGGGTKLEIK
核酸序列(SEQ ID NO:112)：
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAGCTACTAATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGCTTTCACTCTCACCATCAGCGGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTTCTGCACGCAATCTCATACTCTTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
已知CDR负责抗原结合，然而已发现6个CDR并不都是不可缺少或不可改变的。换言之，可以替换或改变或修饰抗CD3ε抗体WBP3311_2.166.48、WBP3311_2.306.4、WBP3311_2.383.47、WBP3311_2.400.5、WBP3311_2.482.5、WBP331_2.488.33、WBP3311_2.615.8或WBP3311_2.844.8中的一个或多个CDR，而基本上保持与CD3ε特异性结合的亲和力。
在某些实施方式中，本申请所述的抗CD3ε抗体及其抗原结合片段包含抗CD3ε抗体WBP3311_2.166.48、WBP3311_2.306.4、WBP3311_2.383.47、WBP3311_2.400.5、WBP3311_2.482.5、WBP331_2.488.33、WBP3311_2.615.8和WBP3311_2.844.8之一的重链CDR3序列。在某些实施方式中，本申请所述的抗CD3ε抗体和抗原结合片段包含选自由SEQ ID NO:5、11、17、23、29、35、41和47组成的组的重链CDR3序列。重链CDR3区位于抗原结合位点的中心，并因此被认为与抗原接触最多，而且对抗体与抗原的亲和力提供最多的自由能。此外还认为重链CDR3由于多种多样化机制在长度、氨基酸组成和构象方面是目前抗原结合位点最多样化的CDR(Tonegawa S.,Nature.302:575-81)。重链CDR3的多样化足以产生多数抗体特异性(Xu JL,Davis MM.Immunity.13:37-45)以及所需的抗原结合亲和力(Schier R等，J MolBiol.263:551-67)。
在某些实施方式中，只要本申请所述的抗体及其抗原结合片段在可以特异性地结合至CD3ε，则所述的抗体及其抗原结合片段包含框架区(FR)序列。表1中所示的CDR序列获取自小鼠抗体，但其可使用本领域公知的合适方法(如重组技术)移植至任何合适物种(如小鼠、人、大鼠、兔以及其他)的任何合适的FR序列。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段是人源化的。人源化的抗体或抗原结合片段理想地在人体具有降低的免疫原性。人源化的抗体或其抗原结合片段在其可变区是嵌合的，因为非人CDR序列移植至人或基本上是人的FR序列中。抗体或抗原结合片段的人源化基本上可通过在人免疫球蛋白基因上将非人(如小鼠)CDR基因替换为对应的人CDR基因来完成(参见例如Jones等(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyen等(1988)Science 239:1534-1536)。
可以使用本领域公知的方法选择合适的人重链和轻链可变域，以达到这一目的。在一个示例性的实例中，可以使用最佳拟合的方法，其中对非人(例如啮齿动物)抗体可变域序列进行筛选，或者将其与已知的人可变域序列的数据库进行BLAST比对，并且识别出最接近非人查询序列的人序列，用作用于移植非人CDR序列的人框架(参见例如Sims等(1993)J.Immunol.151:2296；Chothia等(1987)J.Mot.Biol.196:901)。或者，可以将源自所有人抗体的共有序列的框架用于移植非人CDR(参见例如Carter等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285；Presta等(1993)J.Immunol.，151:2623)。
在某些实施方式中，本申请所述的人源化抗体或抗原结合片段除了非人的CDR序列以外，基本上全部由人序列组成。在一些实施方式中，可变区FR和恒定区(如果存在)全部或基本上来自人免疫球蛋白序列。人FR序列和人恒定区序列可以源自不同的人免疫球蛋白基因，例如，FR序列源自一个人抗体，恒定区来自另一个人抗体。在一些实施方式中，人源化抗体或抗原结合片段包含人FR1-4以及人JH和Jκ。
在某些实施方式中，本申请所述的人源化抗体及其抗原结合片段包含WBP3311_2.166.48-z1或WBP3311_2.306.4-z1的一个或多个FR序列。下文的表2示出了WBP3311_2.166.48-z1或WBP3311_2.306.4-z1的FR序列。天然小鼠FR序列也列于表2。下文还提供了重链和轻链可变区序列。
本申请中使用的“WBP3311_2.166.48-z1”是指基于WBP3311_2.166.48的人源化抗体，其包含如SEQ ID NO:113所示的重链可变区和如SEQ ID NO:115所示的κ轻链可变区。WBP3311_2.166.48-z1具有与其亲本抗体WBP3311_2.166.48相当的针对抗原的亲和力。
本申请中使用的“WBP3311_2.306.4-z1”是指基于WBP3311_2.306.4的人源化抗体，其包含如SEQ ID NO:117所示的重链可变区和如SEQ ID NO:119所示的κ轻链可变区。WBP3311_2.306.4-z1具有与其亲本抗体WBP3311_2.306.4相当的针对抗原的亲和力。
表2
Figure BDA0002395348420000281
WBP3311_2.166.48-z1-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:113):
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTTYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIFPGNDNIKYSEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIDSVSIYYFDYWGQGTLVTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:114):
CAGGTGCAACTCGTGCAGTCTGGAGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGTCTTCAGTCAAGGTCAGTTGCAAGGCCAGTGGGTATTCCTTCACTACCTACTACATCCACTGGGTGCGGCAGGCACCAGGACAGGGGCTTGAGTGGATGGGCTGGATCTTTCCCGGCAACGATAATATTAAGTACAGCGAGAAGTTCAAAGGGAGGGTCACCATTACCGCCGACAAATCCACTTCCACAGCCTACATGGAGTTGAGCAGCCTGAGATCCGAGGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCATTGACAGCGTGTCCATCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTGAGCAGC
WBP3311_2.166.48-z1-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:115)：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGGGTKVEIK
核酸序列(SEQ ID NO:116)：
GACATCGTCATGACCCAGTCCCCAGACTCTTTGGCAGTGTCTCTCGGGGAAAGAGCTACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGTCCCTTCTGAACAGCAGGACCAGGAAGAATTACCTCGCCTGGTACCAACAGAAGCCCGGACAGCCTCCTAAGCTCCTGATCTACTGGGCCTCAACCCGGAAGAGTGGAGTGCCCGATCGCTTTAGCGGGAGCGGCTCCGGGACAGATTTCACACTGACAATTTCCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTCGCCGTGTATTACTGTACTCAGAGCTTCATTCTGCGGACATTTGGCGGCGGGACTAAAGTGGAGATTAAG
WBP3311_2.306.4-z1-VH
氨基酸序列(SEQ ID NO:117)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSS
核酸序列(SEQ ID NO:118)：
CAGGTGCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCTGGGTCTAGTGTCAAGGTGTCATGCAAGGCTAGCGGGTTCGCCTTTACTGACTACTACATCCACTGGGTGCGGCAGGCTCCCGGACAAGGGTTGGAGTGGATGGGATGGATCTCCCCAGGCAATGTCAACACAAAGTACAACGAGAACTTCAAAGGCCGCGTCACCATTACCGCCGACAAGAGCACCTCCACAGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTCAGAAGCGAGGACACTGCCGTCTACTACTGTGCCAGGGATGGGTACTCCCTGTATTACTTTGATTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACAGTGAGCTCC
WBP3311_2.306.4-z1-VK
氨基酸序列(SEQ ID NO:119)：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIK
核酸序列(SEQ ID NO:120)：
GATATCGTGATGACCCAGAGCCCAGACTCCCTTGCTGTCTCCCTCGGCGAAAGAGCAACCATCAACTGCAAGAGCTCCCAAAGCCTGCTGAACTCCAGGACCAGGAAGAATTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATCTACTGGGCCTCCACCCGGCAGTCTGGGGTGCCCGATCGGTTTAGTGGATCTGGGAGCGGGACAGACTTCACATTGACAATTAGCTCACTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGTACTCAGAGCCACACTCTCCGCACATTCGGCGGAGGGACTAAAGTGGAGATTAAG
这两个示例性的人源化抗CD3ε抗体WBP3311_2.166.48-z1或WBP3311_2.306.4-z1均保持与表达CD3的细胞(例如CD4 T细胞)特异性结合的亲和力，并且在这方面至少可与亲本小鼠抗体相当，甚至优于亲本小鼠抗体。这两个示例性的人源化抗体均保持其与表达CD3的细胞的功能性相互作用，体现为其均可以活化人T细胞并且引起TNFα和IFNγ的细胞因子释放。
在一些实施方式中，源自人的FR区可以包含与其所源自的人免疫球蛋白相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，人FR的一个或多个氨基酸残基由来自亲本非人抗体的对应残基取代。这在某些实施方式中是需要的，以使人源化抗体或其片段密切接近非人亲本抗体结构。在某些实施方式中，本申请所述的人源化抗体或抗原结合片段包含在各个人FR序列中不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代，或者在重或轻链可变域的所有FR不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代。在一些实施方式中，这种氨基酸残基的变化可能仅存在于重链FR区、仅存在于轻链FR区，或在两条链上都存在。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段包含选自下组的重链可变域序列：SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:97、SEQID NO:101、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:117。在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段包含选自下组的轻链可变域序列：SEQ IDNO:83、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:103、SEQID NO:107、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:119。
在一些实施方式中，本申请所述的抗CD3ε抗体和抗原结合片段包含重链可变域的全部或部分，和/或轻链可变域的全部或部分。在一个实施方式中，本申请所述的抗CD3ε抗体和抗原结合片段为由本申请所述的重链可变区域的全部或部分组成的单域抗体。这种单域抗体的更多信息可以在现有技术中得到(参见例如美国专利号6,248,516)。
在某些实施方式中，本申请所述的抗CD3ε抗体及其抗原结合片段进一步包含免疫球蛋白恒定区。在一些实施方式中，免疫球蛋白恒定区包含重链和/或轻链恒定区。重链恒定区包含CH1、铰链和/或CH2-CH3区。在某些实施方式中，重链恒定区包含Fc区。在某些实施方式中，轻链恒定区包含Cκ。
在一些实施方式中，所述抗CD3ε抗体及其抗原结合片段具有IgG1或IgG2a同种型的恒定区，其具有可以使用各种测定来评估的减少的或耗竭的效应功能(如ADCC或CDC)，例如Fc受体结合测定、C1q结合测定和细胞裂解测定。
本申请所述的抗体和抗原结合片段的结合亲和力可以由KD值表示，其表示当抗原和抗原结合分子之间的结合达到平衡时解离速率与结合速率的比值(koff/kon)。使用本领域公知的合适的方法，包括例如流式细胞术测定，可恰当地确定抗原结合亲和力(例如KD)。在一些实施方式中，可通过流式细胞术确定不同浓度下抗体与抗原的结合，可首先将确定的平均荧光强度(MFI)对抗体浓度制图，此时通过使用Prism第5版本(GraphPad Software，圣地亚哥，CA)，将特异性结合荧光强度(Y)与抗体浓度(X)的相关性拟合至单址饱和等式：Y＝Bmax*X/(KD+X)，可计算出KD值，其中Bmax是指待测抗体与抗原的最大特异性结合。
在某些实施方式中，本申请所述的抗CD3ε抗体及其抗原结合片段能够特异性地与表达在细胞表面上的人CD3ε或者重组人CD3ε结合。CD3ε是表达在细胞上的受体。重组CD3ε是重组表达的，并且不与细胞膜结合的可溶性CD3ε。重组CD3ε可通过和各种重组技术制备。在一个实例中，编码人CD3ε胞外域(NP_000724.1)(Met1-Asp126)的CD3εDNA序列可以在表达载体中在C末端处与多组氨酸标记融合，并且随后转染并在293E细胞中表达，并且通过镍亲和层析纯化。
在一些实施方式中，本申请所述的抗CD3ε抗体及其抗原结合片段能够以不超过5×10-9M、不超过4×10-9M、不超过3×10-9M、不超过2×10-9M、不超过10-9M、不超过5×10-10M、不超过4×10-10M、不超过3×10-10M、不超过2×10-10M、不超过10-10M、不超过5×10-11M、不超过4×10-11M、不超过3×10-11M、不超过2×10-11M或不超过10-11M的结合亲和力(KD)特异性地与表达在细胞表面上的人CD3ε结合，所述KD值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，本申请所述的抗CD3ε抗体及其抗原结合片段与食蟹猴CD3ε(例如表达在细胞表面上的食蟹猴CD3ε或可溶性重组食蟹猴CD3ε)交叉反应。
抗体与重组CD3ε或表达在细胞表面上的CD3ε的结合还可以用“半最大效应浓度”(EC50)值表示，其是指观察到其最大效应(例如结合或抑制等)的50％时抗体的浓度。EC50值可通过本领域公知的方法测得，例如夹心法(如ELISA)、Western印记、流式细胞术，以及其他结合试验。在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其片段以不超过0.01nM、不超过0.02nM、不超过0.03nM、不超过0.04nM、不超过0.05nM、不超过0.06nM、不超过0.07nM、不超过0.08nM的EC50值(即50％结合浓度)特异性地与重组人CD3ε结合，所述EC50值通过ELISA测定。在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其片段以不超过0.5nM、不超过0.6nM、不超过0.7nM、不超过0.8nM、不超过0.9nM、不超过1nM、不超过2nM、不超过3nM、不超过4nM、不超过5nM、不超过6nM、不超过7nM、不超过8nM、不超过9nM或不超过10nM的EC50值特异性地与表达在细胞表面上的人CD3ε结合，所述EC50值通过流式细胞术测定。
在某些实施方式中，抗体及其抗原结合片段以与人CD3ε相似的结合亲和力与食蟹猴CD3ε结合。例如，示例性抗体WBP3311_2.166.48、WBP3311_2.306.4、WBP3311_2.383.47、WBP3311_2.400.5、WBP3311_2.482.5、WBP3311_2.488.33、WBP3311_2.615.8、WBP3311_2.844.8以与人CD3ε相似的亲和力或EC50值与食蟹猴CD3ε结合。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段以不超过0.001nM、不超过0.005nM、不超过0.01nM、不超过0.02nM、不超过0.03nM、不超过0.04nM或不超过0.05nM的EC50值特异性地与重组食蟹猴CD3ε结合，所述EC50值通过ELISA测定。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其片段具有足以用于诊断和/或治疗用途的与人CD3ε特异结合的亲和力。许多治疗方案通过靶向TCR信号转导，特别是通过临床使用的抗人CD3单克隆抗体，来调节T细胞免疫。
本申请所述的抗体或其片段可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、双特异性抗体、标记抗体、二价抗体或抗独特型抗体。重组抗体是在体外而不是在动物体内使用重组方法制备的抗体。
抗体变体
本申请还涵盖本申请所述的抗体及其片段的多种变体。在某些实施方式中，本申请涵盖本申请所述的示例性抗体的多种变体，即WBP3311_2.166.48、WBP3311_2.306.4、WBP3311_2.383.47、WBP3311_2.400.5、WBP3311_2.482.5、WBP331_2.488.33、WBP3311_2.615.8和WBP3311_2.844.8的变体。
在某些实施方式中，抗体变体在表1所示的一个或多个CDR序列中、一个或多个表2所示的FR序列中、本申请所述的重或轻链可变区序列中，和/或恒定区(例如Fc区)中包含一个或多个修饰或取代。这些变体保持其亲本与CD3ε特异结合的亲和力，但具有一种或多种所述修饰或取代带来的所需要的特性。例如抗体变体可以具有改进的抗原结合亲和力、改进的糖基化模式、减少的糖基化风险、减少的脱氨基作用、减少的或耗竭的效应功能、改进的FcRn受体结合、提高的药代动力学半衰期、pH敏感性，和/或对缀合的兼容性(例如一个或多个引入的半胱氨酸残基)。
可以使用本领域公知的方法，例如“丙氨酸扫描诱变”，筛选亲本抗体序列以识别合适的或优选的待修饰或取代的残基(参见例如Cunningham和Wells，(1989)Science，244:1081-1085)。简要地说，可以识别靶标残基(例如带正电的残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并由不带电的或带负电的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)取代，产生被修饰的抗体，并且针对目标特性对其进行筛选。如果在一个特定的氨基酸位置上的取代表现出了目标功能性改变，则该位置可以被识别为潜在的用于修饰或取代的残基。可以通过用另一种残基(例如半胱氨酸残基、带正电荷的残基等)取代来进一步评估所述潜在的残基。
亲和力变体
亲和力变体可以含有如表1所示的一个或多个CDR序列、表2所示的一个或多个FR序列，或者本申请所述的重链或轻链可变区序列中的修饰或取代。所述亲和力变体保持亲本抗体的与CD3ε特异性结合的亲和力，或者甚至相对于亲本抗体具有改进的与CD3ε特异性结合的亲和力。在某些实施方式中，CDR序列、FR序列或可变区序列中的至少一个(或全部)取代包含保守取代。
本领域技术人员将理解，在表1和表2所示的CDR序列和FR序列中，一个或多个氨基酸残基可以被取代，而得到的抗体或抗原结合片段仍然保持与CD3ε结合的亲和力，或甚至具有改进的结合亲和力。可以使用本领域公知的各种方法来达到这一目的。例如，可以生成抗体变体库(如Fab或scFv变体)，并用噬菌体展示技术表达，随后针对与人CD3ε结合的亲和力对其进行筛选。又例如，可以使用电脑软件虚拟抗体与人CD3ε的结合，并识别抗体上形成结合界面的氨基酸残基。在取代中可以避开这些残基以防止结合亲和力的降低，或者可以做为取代的靶标以获得更强的结合。
在某些实施方式中，本申请所述的人源化抗体或抗原决定片段在一个或多个CDR序列和/或一个或多个FR序列中包含一个或多个氨基酸残基取代。在某些实施方式中，亲和力变体在CDR序列和/或FR序列中包含总共不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
在某些实施方式中，所述抗CD3ε抗体及其抗原结合片段包含1、2或3个与表1中列出的序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性的CDR序列，而同时保持相对于其亲本抗体水平相似或更高的与CD19结合的亲和力。
在某些实施方式中，所述抗CD3ε抗体及其抗原结合片段包含一个或多个与表2中列出的序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性的FR序列，而同时保持相对于其亲本抗体水平相似或更高的与CD3ε结合的亲和力。
在某些实施方式中，所述抗CD3ε抗体及其抗原结合片段包含一个或多个与下列序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性的可变区序列：SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:89、SEQID NO:93、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:95、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:119，而同时保持相对于其亲本抗体水平相似或更高的与CD3ε结合的亲和力。在一些实施方式中，在选自SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:97、SEQID NO:101、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:103、SEQ IDNO:107、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:119的序列中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入或缺失。在一些实施方式中，所述取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即在FR)。
糖基化变体
本申请所述的抗CD3ε抗体和抗原结合片段还包含糖基化变体。可以获取该糖基化变体以提高或降低抗体或抗原结合片段糖基化的程度。
所述抗体或其抗原结合片段可以包括一个或多个带有侧链的氨基酸残基，碳水化合物部分(例如寡糖结构)可以附接至所述侧链。抗体的糖基化通常是N连接的或O连接的。N连接的是指碳水化合物部分附接至天冬氨酸残基的侧链，例如，三肽序列中的天冬氨酸残基，如天冬氨酸-X-丝氨酸和天冬氨酸-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。O连接的糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一的糖附接至羟基氨基酸，最常见的是附接至丝氨酸或苏氨酸。对天然糖基化位点的移除可以方便地完成，例如通过改变氨基酸序列，使得存在于该序列中的上述三肽序列(对于N连接的糖基化位点)或者丝氨酸或苏氨酸残基(对于O连接的糖基化位点)中的一个被取代。用相似的方式，可以通过引入这样的三肽序列或者丝氨酸或苏氨酸残基，产生新的糖基化位点。
半胱氨酸工程化的变体
本申请所述的抗CD3ε抗体和抗原结合片段还涵盖半胱氨酸工程化的变体，其包括一个或多个引入的游离半胱氨酸氨基酸残基。
游离半胱氨酸残基是不为二硫键的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸工程化的变体可用于通过例如马来酰亚胺或卤乙酰基，在工程化的半胱氨酸的位点与例如细胞毒性和/或成像化合物、标签或放射性同位素，以及其他物质缀合。用于改造抗体或抗原结合片段以引入游离半胱氨酸残基的方法是本领域公知的，参见例如WO2006/034488。
Fc变体
本申请所述的抗CD3ε抗体和抗原结合片段还包括Fc变体，其包括一个或多个在其Fc区和/或铰链区的氨基酸残基修饰或取代。
在某些实施方式中，所述抗CD3ε抗体或抗原结合片段包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代改进与新生儿Fc受体(FcRn)pH依赖性的结合。这种变体在酸性pH下与FcRn结合，使其得以免于在溶酶体中降解，并且随后被转移并释放到细胞外，因此，这种变体可具有更长的药代动力学半衰期。工程化抗体及其抗原结合片段以提高与FcRn的结合亲和力的方法是本领域公知的，参见例如Vaughn,D.等，Structure，6(1):63-73，1998；Kontermann,R.等，Antibody Engineering，第1卷第27章：Engineering of the Fc regionfor improved PK，Springer出版，2010；Yeung,Y.等，Cancer Research，70:3269-3277(2010)；和Hinton,P.等，J.Immunology，176:346-356(2006)。
在某些实施方式中，所述抗CD3ε抗体或抗原结合片段包含一个或多个改变抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的氨基酸取代。在Fc区的CH2域的某些氨基酸残基可被取代以提高ADCC活性。可替代地或额外地，可以改变所述抗体上的碳水化合物结构，以提高ADCC活性。通过抗体工程化改变ADCC活性的方法已经记述于现有技术中，参见例如Shields RL等，JBiol Chem.2001.276(9):6591-604；Idusogie EE等，J Immunol.2000.164(8):4178-84；Steurer W.等，J Immunol.1995,155(3):1165-74；Idusogie EE.等，J Immunol.2001,166(4):2571-5；Lazar GA.等，PNAS,2006,103(11):4005-4010；Ryan MC.等，Mol.CancerTher.,2007,6:3009-3018；Richards JO.等，Mol Cancer Ther.2008,7(8):2517-27；Shields R.L.等，J.Biol.Chem,2002,277:26733-26740；Shinkawa T.等，J.Biol.Chem,2003,278:3466-3473。
在某些实施方式中，所述抗CD3ε抗体或抗原结合片段包含一个或多个改变补体依赖毒性(CDC)的氨基酸取代，例如通过增强或减弱C1q结合和/或CDC(关于其他Fc区变体的实例，参见例如WO99/51642；Duncan&Winter Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO94/29351)。
在某些实施方式中，所述抗CD3ε抗体或抗原结合片段包含一个或多个位于Fc区界面的氨基酸取代，以便于和/或促进异二聚体化。这些修饰包含将突起引入第一Fc多肽，以及将腔引入第二Fc多肽，其中所述突起可位于所述空腔内，以促进所述第一和第二Fc多肽的相互作用，以形成异二聚体或复合体。生成具有这些修饰的抗体的方法是本领域公知的，例如，如美国专利号5,731,168所述。
抗原结合片段
本申请还提供抗CD3ε抗原结合片段。抗原结合片段的多种类型是本领域公知的，并且可基于本申请所述的抗CD3ε抗体进行研发，包括例如其CDR和FR序列示于表1和表2的示例性抗体，及其不同的变体(如亲和力变体、糖基化变体、Fc变体、半胱氨酸工程化抗体等等)。
在某些实施方式中，本申请所述的抗CD3ε抗原结合片段是骆驼化单域抗体(camelized single chain domain antibody)、双功能抗体(diabody)、单链Fv片段(scFv)、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、双特异性抗体、双功能抗体(ds diabody)、纳米抗体、域抗体、单域抗体或双价域抗体。
多种技术可用于这种抗原结合片段的生产。示例性的方法包括对完整抗体进行酶消化(参见例如Morimoto等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)；以及Brennan等，Science，229:81(1985))、由宿主细胞(如大肠杆菌)重组表达(例如对于Fab、Fv和ScFv抗体片段)、如上文讨论的噬菌体展示文库筛选(例如对于ScFv)，以及化学耦合两个Fab'-SH片段以形成F(ab')2片段(Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992))。生产抗体片段的其它技术对于本领域技术人员将是显而易见的。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段是scFv。scFv的生成记述于例如WO 93/16185；美国专利号5,571,894；和5,587,458。scFv可以在氨基末端或羧基末端与效应蛋白融合以获得融合蛋白(参见例如Antibody Engineering，Borrebaeck编)。
双特异性抗体、多价抗体
在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段是二价、四价、六价或多价的。在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段是单特异性或双特异性的。
本申请中使用的术语“价”是指给定分子中存在特定数量的抗原结合位点。由此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗原结合分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。如果两个结合位点都用于与同一抗原或同一表位特异性结合，则二价分子可以是单特异性的。同样，三价分子可以是双特异性的，例如当两个结合位点是针对第一抗原(或表位)单特异性的，而第三个结合位点是针对第二抗原(或表位)特异性的。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段可以是单特异性的，然而是二价、三价或是价的，其具有至少两个对相同抗原或表位具有特异性的结合位点。在某些实施方式中，与单价的对应抗体相比，这具有与抗原或表位更强的的结合。在某些实施方式中，在二价抗原结合部分中，结合位点的第一价和结合位点的第二价结构上相同(即具有相同序列)或结构上不同(即具有不同序列但特异性相同)。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段是双特异性的。在一些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段具有针对CD3ε的第一特异性，以及第二特异性。在一些实施方式中，所述第二特异性针对CD3ε，但针对不同的表位。在一些实施方式中，所述第二特异性针对不同于CD3ε的第二抗原，而且所述第二抗原存在于表达CD3ε的T细胞附近，这是免疫系统识别所述第二抗原所需要的。例如，将表达CD3ε的T细胞与肿瘤抗原或病原体抗原紧密接近，并由此促进免疫系统对该抗原的识别或消除。
在某些实施方式中，所述第二特异性针对与肿瘤相关的抗原或其表位。术语“与肿瘤相关的抗原”是指在肿瘤细胞表面上呈递，或可以在肿瘤细胞表面上呈递，并且位于肿瘤细胞上或肿瘤细胞内的抗原。在一些实施方式中，与肿瘤相关的抗原仅可以由肿瘤细胞呈递，而不能由正常细胞，即非肿瘤细胞呈递。在另一些实施方式中，与肿瘤相关的抗原可以唯一地在肿瘤细胞上表达，或者与非肿瘤细胞相比可以显示出肿瘤特异性的突变。在另一些实施方式中，在肿瘤细胞和非肿瘤细胞中均可以存在与肿瘤相关的抗原，但与非肿瘤细胞相比，与肿瘤相关的抗原在肿瘤细胞上过表达，或者由于与非肿瘤组织相比，肿瘤组织结构的致密性较低，与肿瘤相关的抗原在肿瘤细胞中易于与抗体结合。在一些实施方式中，与肿瘤相关的抗原位于肿瘤的脉管系统上。
与肿瘤相关的抗原的示例性的实例为CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD34、CD37、CD44v6、CD45、CD133、Fms样酪氨酸激酶3(FLT-3，CD135)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4，与黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖)、表皮生长因子受体(EGFR)、Her2、Her3、IGFR、IL3R、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CDCP1、Derlin1、肌腱蛋白、frizzled 1-10、血管抗原VEGFR2(KDR/FLK1)、VEGFR3(FLT4、CD309)、PDGFR-α(CD140a)、PDGFR-β(CD140b)、内皮糖蛋白、CLEC14、Tem1-8，以及Tie2。进一步的实例可以包括A33、CAMPATH-1(CDw52)、癌胚抗原(CEA)、羧化酶IX(MN/CA IX)、de2-7、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、Ep-CAM、叶酸结合蛋白、G250、Fms样酪氨酸激酶3(FLT-3，CD135)、c-Kit(CD117)、CSF1R(CD115)、HLA-DR、IGFR、IL-2受体、IL3R、MCSP(与黑色素瘤相关的细胞表面硫酸软骨素蛋白聚糖)、Muc-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性抗原(PSA)和TAG-72。
本申请所述的双特异性抗体和抗原结合片段可用本领域公知的任意合适的方法制备。在传统方法中，可以在宿主细胞中共表达两个具有不同抗原特异性的免疫球蛋白重链-轻链对，以用重组方式产生双特异性抗体(参见例如Milstein和Cuello，Nature，305:537(1983))，随后通过亲和色谱纯化。
还可以使用重组方法，其中编码两个特异性的抗体重链可变域的序列分别与免疫球蛋白恒定域序列融合，随后插入表达载体，其与轻链序列的表达载体共转染至合适的宿主细胞，以重组表达所述双特异性抗体(参见例如WO 94/04690；Suresh等，Methods inEnzymology，121:210(1986))。相似地，scFv二聚体也可以重组构建，并且自宿主细胞表达(参见例如Gruber等，J.Immunol.，152:5368(1994))。
在另一种方法中，来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽可通过基因融合连接至两个不同抗体的Fab'部分。连接的抗体在铰链区被还原成四个半抗体(即单体)，并随后再氧化以形成异二聚体(Kostelny等，J.Immunol.，148(5):1547-1553(1992))。
所述两个抗原结合域还可以被缀合或交联以形成双特异性抗体或抗原结合片段。例如，一个抗体可以与生物素耦合而另一个抗体与亲和素耦合，并且生物素与亲和素之间的强连接会使所述两个抗体络合在一起，以形成双特异性的抗体(参见例如美国专利号4,676,980；WO 91/00360、WO 92/00373和EP 03089)。又例如，所述两个抗体或抗原结合片段可通过本领域公知的传统方法交联，例如，如美国专利号4,676,980所述。
双特异性的抗原结合片段可以生成自双特异性抗体，例如通过蛋白水解裂解或通过化学连接。例如，可以制备抗体的抗原结合片段(例如Fab’)，并转变为Fab'-巯基衍生物并随后与具有不同的抗原特异性的另一转变的Fab'衍生物混合并发生反应，以形成双特异性的抗原结合片段(参见例如Brennan等，Science，229:81(1985))。
在某些实施方式中，所述双特异性抗体或抗原结合片段可以在界面处改造，使得可以形成knob-into-hole连接，以促进两个不同的抗原结合位点的异二聚体化。用于本申请的“knob-into-hole”是指两个多肽(如CH3结构域)之间的相互作用，其中一个多肽由于存在具有庞大侧链的氨基酸残基(例如酪氨酸或色氨酸)而具有突起(即“knob”)，而另一个多肽具有有小侧链氨基酸残基(例如丙氨酸或苏氨酸)位于其中的空腔(即“hole”)，并且所述突起可置于所述空腔内以促进所述两个多肽的相互作用，以形成异二聚体或复合体。用knobs-into-holes生成多肽的方法是本领域公知的，例如，如美国专利号5,731,168所述。
缀合物
在一些实施方式中，所述抗CD3ε抗体及其抗原结合片段进一步包含缀合物。缀合物可以与抗体及其抗原结合片段连接。缀合物是可以附接至所述抗体或其抗原结合片段的非蛋白质部分。可以设想，本申请所述的抗体或抗原结合片段可以与多种缀合物连接(参见例如“Conjugate Vaccines”，Contributions to Microbiology and Immunology，J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr.(编)，Carger Press，纽约(1989))。这些缀合物可以通过共价结合、亲和结合、嵌入、协同结合(coordinate binding)、络合、结合、混合或加入等其他方式与所述抗体或抗原结合片段连接。
在某些实施方式中，本申请中公开的抗体和抗原结合片段可以工程化以在表位结合部分之外含有特定位点，所述特定位点可以用于与一个或多个缀合物结合。例如，该位点可以包括一个或多个反应性的氨基酸残基(例如半胱氨酸或组氨酸残基)，以便于与缀合物的共价连接。
在某些实施方式中，所述抗体可以与缀合物间接连接，或者通过另一个缀合物连接。例如，所述抗体或抗原结合片段可以与生物素缀合，随后与第二缀合物间接缀合，所述第二经合物与抗生物素蛋白缀合。所述缀合物可以是毒素(例如化疗剂)、可检测的标记(例如放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记或酶-底物标记)。
“毒素”可以是对细胞有害的或可能损坏或杀死细胞的任何试剂。毒素的实例包括但不限于紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊甙、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物、抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
可检测的标记的例子可包括荧光标记(例如荧光素、罗丹明、丹磺酰、藻红蛋白或德克萨斯红)、酶-底物标记物(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi和32P、其他镧系元素、发光标记)、发色团部分、地高辛、生物素/亲和素、DNA分子或金以进行检测。
在某些实施方式中，所述缀合物可以是药代动力学修饰部分，其帮助延长抗体的半衰期。示例性的实例包括水溶性聚合物，例如PEG、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇共聚物等。所述聚合物可以具有任何分子质量，并且可以是分支或不分支的。与抗体结合的聚合物的数量是可变的，并且当多于一个聚合物与抗体结合，其可以是相同或不同的分子。
在某些实施方式中，所述缀合物可以是纯化部分例如磁珠。
在某些实施方式中，本公开所述的抗体及其抗原结合片段用于作为缀合物的基底。
多核苷酸和重组方法
本公开提供编码所述抗CD3ε抗体及其抗原结合片段的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸包含一个或多个如下所示的编码本申请提供的示例性的抗体的可变区的核苷酸序列：SEQ ID NO：82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118和/或120。使用传统的步骤，可以容易地对编码所述单克隆抗体的DNA进行分离和测序(例如通过使用能够与编码所述抗体的重和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。编码的DNA也可以通过合成方法获得。
使用本领域公知的重组技术，可以将编码所述抗CD3ε抗体及其抗原结合片段的分离的多核苷酸(例如包括如下所示的序列：SEQ ID NO：82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118和/或120)插入载体，用于进一步的克隆(DNA的扩增)或用于表达。多种载体可供选择。载体组分通常包括但不限于下列的一种或多种：信号序列、复制起始点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)和转录终止序列。
在一些实施方式中，载体体系包括哺乳动物、细菌、酵母体系等，并且包含质粒，例如但不限于pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pCMV、pEGFP、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMD18-T、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS420、pLexA、pACT2.2等，以及其他可从实验室获得或市售的载体。适宜的载体可以包括质粒或病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
可以将包含编码所述抗体或抗原结合片段的多核苷酸序列的载体引入宿主细胞，用于克隆或基因表达。本申请中适用于克隆或表达所述的载体中的DNA的宿主细胞为上述的原核、酵母或高等真核细胞。适用于本申请用途的原核细胞包括真细菌，如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，例如，肠杆菌科，如，大肠杆菌，肠杆菌属，欧文氏菌属，克雷白氏杆菌属，变形杆菌属，沙门氏菌属，如，鼠伤寒沙门(氏)杆菌，沙雷氏菌属，如，粘质沙雷氏菌，以及志贺氏菌属，及杆菌属如，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，假单胞菌如，绿脓杆菌和链霉菌。
除了原核细胞以外，真核微生物如丝状真菌或酵母也可作宿主细胞克隆或表达编码抗CD3ε抗体的载体。酿酒酵母，或面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。但是，许多其他属、种和株都比较常用且在本发明中适用，如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母属宿主如，乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(ATCC 16,045)、魏氏克鲁维酵母(ATCC 24,178)、克鲁雄酵母(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母；解脂耶氏酵母(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(EP183,070)；假丝酵母；里氏木霉(EP 244,234)；链孢霉；西方许旺酵母，如：西方许旺酵母；和丝状真菌，如：脉孢菌、青霉菌、弯颈霉和曲霉菌，如：钩巢曲霉和黑曲霉。
本发明中提供的适用于表达糖基化抗体或其抗原结合片段的宿主细胞由多细胞生物衍生得到。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已发现多种杆状病毒株(baculoviral strains)及其变体以及对应的许可性昆虫宿主细胞(permissive insecthost cells)，来自于诸如以下的宿主：草地夜蛾(毛虫)、埃及斑蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)及家蚕。多种用于转染的病毒株为公众可得，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒的Bm-5变种，这些病毒都可在本发明中使用，特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛花、西红柿和烟草的植物细胞培养也可用作宿主。
但是，最感兴趣的是脊椎细胞，且脊椎细胞的培养(组织培养)已经成为常规操作。可用的哺乳动物宿主细胞实例有，SV40转化的猴肾细胞CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(293或悬浮培养的293细胞亚克隆，Graham等，J.Gen Virol.36:59(1977))；幼地鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；及人肝癌细胞系(Hep G2)。在某些优选的实施方式中，所述宿主细胞是293F细胞。
用上述的可产生抗CD3ε抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并将其在常规的营养培养基中培养，所述营养培养基经修饰后适宜于诱导启动子、选择转化细胞或扩增编码目的序列的基因。在另一实施方式中，所述抗体可通过本领域公知的同源重组的方法制得。
本发明中用于产生所述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售的培养基如Ham's F10(Sigma)、最低基本培液(MEM，(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)及Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)，Sigma)可用于培养所述宿主细胞。另外，任何在Ham等，Meth.Enz.58:44(1979)，Barnes等Anal.Biochem.102:255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利申请Re.30,985中说明的培养基都可以用作所述宿主细胞的培养基。这些培养基都可添加必要的激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、氯化钙、氯化镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷酸和胸腺嘧啶)、抗生素(如庆大霉素)、微量元素(定义为终浓度通常在微摩尔范围无机化合物)，和葡萄糖或与之等同的能量源。所述培养基还可含有本领域公知的适当浓度的任何其他必要的添加剂。所述培养基的条件，如温度、pH值等类似条件，为选择用于表达的宿主细胞此前所使用的条件，为普通技术人员所熟知。
使用重组技术时，可以在壁膜间隙细胞内产生抗体，或者直接分泌进入基质。如果在细胞内产生抗体，则第一步是移除颗粒碎片(宿主细胞或裂解的片段)，例如通过离心或超滤。Carter等，Bio/Technology 10:163-167(1992)记述了将分泌至大肠杆菌的壁膜间隙的抗体分离的方法。简要地说，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下将细胞浆解冻30分钟以上。可以通过离心移除细胞碎片。抗体分泌进入基质时，通常首先使用市售的蛋白浓缩过滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置，将来自该表达系统的上清浓缩。任何前述步骤可以包括蛋白酶抑制剂，如PMSF，以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素，以防止偶然污染物的生长。
从所述细胞中制得的抗CD3ε抗体及其抗原结合片段可采用纯化方法进行纯化，例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱柱、硫酸铵沉淀、盐析以及亲和色谱，其中亲合色谱为优选的纯化技术。
在某些实施方式中，固定于固相的蛋白A用于所述抗体及其抗原结合片段的免疫亲和纯化。所述抗体的种类以及所述抗体中存在任何免疫球蛋白的Fc结构域决定了蛋白A作为亲和配体是否适合。蛋白A可用于纯化基于人γ1，γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G适用于所有鼠源异构体和人γ3(Guss等，EMBOJ.5:1567 1575(1986))。琼脂糖是最常用的亲和配体附着基质，但也可选用其他基质。机械力稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯与用琼脂糖相比可实现更快的流速和更短的处理时间。如该抗体含有CH3结构域，则可用Bakerbond ABX.TM树脂进行纯化(J.T.Baker，新泽西菲利普斯堡)。也可根据需要获得的抗体确定其他蛋白纯化的技术，如离子交换柱中的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、基于阴离子或阳离子交换树脂的肝素琼脂糖凝胶色谱(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀。
在任意初步纯化步骤之后，可用低pH疏水相互作用色谱的方法处理含有感兴趣的抗体和杂质的混合物，用pH约2.5-4.5的洗涤缓冲液，优选地在低盐浓度下进行(例如，从约0到0.25M盐浓度)。
药物组合物
本申请进一步提供包含抗CD3ε抗体或其抗原结合片段的药物组合物，和一个或多个药学上可接受的运载体。
用本申请中公开的药物组合物中的药学上可接受的运载体可包括，例如，药用可接受的液体、凝胶或固体载剂、水相溶媒、非水相溶媒、抗微生物物质、等渗物质、缓冲液、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、螯合剂、稀释剂、佐剂、辅料或无毒辅助物质，其他本领域公知的组分或以上的多种组合。
适用的组分可包括，例如，抗氧剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、搅味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂例如糖和环糊精。适用的抗氧剂可包括，例如，甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘油、巯基乙酸、巯基山梨醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本发明所公开，在一种含有本发明公开的抗体或其抗原结合片段的组合物中包括一种或多种抗氧剂如甲硫氨酸，可将降低所述抗体或其抗原结合片段的氧化。对氧化作用的减少可防止或减少结合亲和力的降低，从而提高抗体稳定性并延长保质期。因此，在某些实施方式中，本发明提供的组合物中含有一种或多种所述的抗体或其抗原结合片段以及一种或多种抗氧化剂例如甲硫氨酸。本发明进一步提供多种方法，通过将本发明中提供的抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧剂混合，例如甲硫氨酸，可防止所述抗体或其抗原结合片段氧化、延长其保质期和/或提高其活性。
进一步的说，药用可接受的载剂可包括，例如，水相介质如氯化钠注射液、林格氏液注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、或葡萄糖和乳酸林格注射液、非水介质例如：植物来源的不挥发性油、棉花子油、玉米油、芝麻油、或者花生油、细菌抑制或真菌抑制浓度下的抗菌物质、等渗剂如：氯化钠或葡萄糖、缓冲液如：磷酸盐或枸橼酸酸盐缓冲液，抗氧化剂如：硫酸氢钠，局部麻醉剂如：盐酸普鲁卡因，助悬剂和分散剂如：羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如：聚山梨醇酯80(吐温-80)、螯合试剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。作为载剂的抗菌剂可加入多次剂量容器中的药物组合物中，其包括酚类或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯代丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷铵和氯苯乙铵。适用的辅料可包括，例如，水、盐、葡萄糖、甘油或乙醇。适用的无毒辅助物质可包括，例如，乳化剂、pH值缓冲剂、稳定剂、增溶剂，或者醋酸钠、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或者环糊精之类的物质。
所述药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、丸剂、胶囊、片剂、持续释放制剂或粉末。口服制剂可以包括标准载体如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
在某些实施方式中，所述药物组合物被制剂成可注射的组合物。可注射的药物组合物可以任何常规的形式制备，例如，液体溶剂、悬浮剂、乳化剂或适用于产生液体溶剂、悬浮剂或乳化剂的固体形式。注射制剂可包括现用的无菌和/或无热原溶液、使用前现与溶剂结合的无菌干燥的可溶物，如冻干粉，包括皮下片、注射即用的无菌悬浮剂、使用前现与介质结合的无菌干燥不溶产品，和无菌和/或无热原的乳剂。溶剂可以为水相或非水相。
在某些实施方式中，单位剂量的注射制剂包装在一个安瓿、一支管或一支带有针的针筒中。本领域习知，所有注射给药的制剂应为无菌无热原。
在某些实施方式中，通过将本申请中公开的抗体或其抗原结合片段溶解于某适当的溶剂中可制备无菌冻干的粉末。所述溶剂可含有一种可提高粉或由粉末制得的重组溶液的稳定性，或改善粉末或重组溶液的其他药理组分。适用的辅料包括，但不限于，水、葡萄糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他适用的物质。溶剂可含有缓冲液，如枸橼酸缓冲液、磷酸钠或磷酸钾缓冲液或其他本技术熟练人员公知的缓冲液，在一种实施方式中，缓冲液的pH为中性。在本领域公知的标准条件下进行对所述溶解进行随后的过滤除菌，然后冻干制得理想的制剂。在一种实施方式中，将所得的溶剂分装至小管中冻干。每支小管可容纳单次剂量或多次剂量的所述抗CD3ε抗体或其抗原结合片段或其组合物。每支小管中的装入量可略微高于每次剂量所需或多次剂量所需(例如10％过量)，从而保证取样精确和给药精确。冻干粉可在适当的条件下储存，如在约4℃到室温范围。
用注射用水将冻干粉重溶得到用于注射给药的制剂。在一种实施方式中，可将冻干粉加至无菌无热原水或其他适用的液体载剂中重溶。精确的量由选择的疗法决定，可根据经验值决定。
使用方法
本公开还提供治疗方法，所述治疗方法包含：向需要其的个体施用治疗有效量的如本申请所述的抗体或其抗原结合片段，从而治疗或预防与CD3ε相关的病症或状况。在一些实施方式中，所述与CD3ε相关的病症或状况是癌症、自体免疫疾病、炎性疾病或感染性疾病。
癌症的实例包括但不限于非小细胞肺癌(鳞状/非鳞状)、小细胞肺癌、肾细胞癌、结直肠癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌(包括基底乳腺癌、乳腺导管内癌和乳腺小叶癌)、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、胸腺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、mycoses fungoids、梅克尔细胞癌、肝细胞癌(HCC)、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤以及其他肉瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、淋巴恶性肿瘤、基底细胞癌、腺癌、肝腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、精原细胞瘤、经典型霍奇金淋巴瘤(CHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富于T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、真性红细胞增多症、肥大细胞源性肿瘤、EBV阳性和阴性PTLD和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、浆母细胞淋巴瘤、淋巴结外NK/T细胞淋巴瘤、鼻咽癌、与HHV8相关的原发性渗出性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓增生异常、原发性CNS淋巴瘤、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
自体免疫疾病包含但不限于获得性免疫缺陷综合征(AIDS，其为具有自体免疫成分的病毒疾病)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS),自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、乳糜泻乳糜性皮炎；慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、CREST综合征、克罗恩氏病、德哥斯病、幼年皮肌炎、盘状狼疮、原发性混合冷球蛋白血症、纤维肌痛性纤维肌炎、Graves病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、幼年型慢性关节炎(斯蒂尔病)、幼年类风湿性关节炎、梅尼埃氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、顽固性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、牛皮癣关节炎、雷诺现象、莱特尔氏综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性系统性硬化症(PSS)，又称系统性硬化症(SS))、干燥综合征、全身肌强直综合征、系统性红斑狼疮、高安动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风和韦格纳肉芽肿病。炎性疾病包含例如慢性和急性炎性疾病。炎性疾病的示例包含阿尔茨海默病、哮喘、特应性变态反应、过敏、动脉粥样硬化、支气管哮喘、湿疹、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、溶血性贫血、骨关节炎、脓毒病、中风、组织和器官移植、血管炎、糖尿病性视网膜病变和呼吸机所致肺损伤。在一些实施方式中，与CD3相关的状况是炎性疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)、肠黏膜炎、与结肠炎相关的消耗性疾病、多发性硬化、病毒感染、类风湿性关节炎、骨关节炎、克罗恩病，以及炎性肠病、牛皮癣、系统性硬皮病、自体免疫性糖尿病等等。
感染性疾病包含但不限于真菌感染、寄生虫/原生动物感染或慢性病毒感染，例如疟疾、球孢子菌病、组织胞浆菌病、甲真菌病、曲霉病、芽生菌病、白色念珠菌病、副球孢子菌病、微孢子虫病、棘阿米巴角膜炎、阿米巴病、蛔虫病、巴贝斯虫病、小袋虫病、贝利斯虫病、美洲锥虫病、华支睾吸虫病、锥蝇病、隐孢子虫病、裂头绦虫病、龙线虫病、棘球蚴病、象皮肿、蛲虫病、片形吸虫病、姜片吸虫病、丝虫病、贾第虫病、颌口线虫病、膜壳绦虫病、等孢子球虫病、钉螺热、利什曼病、莱姆病、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、疥疮、血吸虫病、昏睡病、圆线虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形虫病、旋毛虫病、鞭虫病、锥虫病、蠕虫感染、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、疱疹病毒、EB病毒、HIV、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、人乳头瘤病毒、腺病毒、人类免疫缺陷病毒I、人类免疫缺陷病毒II、卡波西西肉瘤相关疱疹病毒流行病、薄环病毒(指环病毒)、人T淋巴营养性病毒I型人T淋巴营养性病毒II型、水痘带状疱疹、JC病毒或BK病毒的感染。
在另一个方面，提供在会从免疫应答的上调中受益的个体中治疗状况的方法，所述方法包含向需要其的个体施用如本申请所述的治疗有效量的抗体或抗原结合片段。
本申请所述的抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量依赖于本领域公知的多种因素，例如体重、年龄、过往病史、现用治疗、对象的健康状况和交叉感染的潜力、过敏、超敏和副作用，以及给药途径和肿瘤发展的程度。本领域熟练人员(例如医生或兽医)可根据这些或其它条件或要求按比例降低或升高剂量。
在某些实施方式中，如本申请所述的抗体或抗原结合片段可以在治疗有效剂量约约0.01mg/kg到约100mg/kg之间给药(例如约0.01mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg)。在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段以约50mg/kg或更少的剂量施用，并且在某些这样的实施方式中，所述剂量是10mg/kg或更少、5mg/kg或更少、3mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少或0.1mg/kg或更少。在某些实施方式中，给药剂量可随治疗进程变化。例如，在某些实施方式中，初始给药剂量可比后续给药剂量高。在某些实施方式中，给药剂量在治疗进程中根据给药对象的反应进行调整。
给药方案可通过调整达到最优反应(如治疗反应)。例如，可进行单剂量给药或在一段时间分多个分隔的剂量给药。
本申请中公开的抗体和抗原结合片段可通过本领域公知的给药方式给药，例如肠胃外给药(如，皮下注射、腹腔注射、静脉注射，包括静脉滴注，肌肉注射或皮内注射)或非肠胃外给药途径(如，口服给药、鼻腔给药、舌下给药、直肠给药或外用给药)。
在一些实施方式中，本申请中公开的抗体或抗原结合片段可以单独给药或与一种或多种其他治疗手段或物质联合给药。例如，本发明公开的抗体和抗原结合片段可以与另一种治疗剂，例如化疗剂或抗癌药联合给药。
在某些这样的实施方式中，本申请中公开的抗体或抗原结合片段与一种或多种另外的治疗物质联用时，可与所述的一种或多种另外的治疗物质同时给药，在某些这样的实施方式中，所述的抗体和抗原结合片段可作为同一个药物组合物的一部分同时给药。但是，与其他治疗物质“联用”的抗体或抗原结合片段不需要同时给药或与该治疗物质在同一组合物中给药。本申请中“联用”的含义还包括，在另一个治疗物质之前或之后给药的抗体或抗原结合片段也被认为是与该治疗物质“联用”，即使所述抗体或其抗原结合片段与第二种物质通过不同给药方式给药。在可能的情况下，与本申请中公开的抗体或其抗原结合片段联用的其他治疗物质可参照该其他治疗物质的产品说明书的方法用药，或参照外科医生的案头参考书2003(Physicians'Desk Reference，第57版；Medical Economics Company；ISBN:1563634457；第57版(2002年11月))，或参照其他本领域公知的方法。
本公开进一步提供使用所述抗CD3ε抗体或其抗原结合片段的方法。在一些实施方式中，本公开提供在体内或在体外活化表达CD3ε的T细胞的方法，包含：将所述表达CD3ε的T细胞与本申请所述的抗体或其抗原结合片段接触。在一些实施方式中，本公开提供在表达CD3ε的细胞中调节CD3活性的方法，包含将所述表达CD3ε的细胞暴露于本申请所述的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，本公开提供通过表达CD3ε的T细胞来促进第二抗原的体内或体外加工的方法，所述方法包括将所述表达CD3ε的T细胞与本申请所述的双特异性抗体或其抗原结合片段接触，其中所述双特异性抗体或抗原结合片段能够与所述表达CD3ε的T细胞和第二抗原特异性地结合，从而使两者接近。
在一些实施方式中，本公开提供检测样品中CD3ε的存在或含量的方法，其包括将所述样品与所述抗体或其抗原结合片段接触，以及确定样品中CD3ε的存在或含量。
在一些实施方式中，本公开提供诊断在个体中与CD3相关的疾病或状况的方法，其包括：a)获取来自所述个体的样品；b)将所述获取自所述个体的样品与本申请所述的抗体或其抗原结合片段接触；c)确定在所述样品中CD3ε的存在或含量；以及d)将所述CD3ε的存在情况与个体中的与CD3相关的疾病或状况相关联。
在一些实施方式中，本公开还提供本申请所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于在个体中治疗与CD3相关疾病或状况的药物中的用途、在制备用于诊断与CD3相关的疾病或状况的诊断试剂中的用途。
以下实施例旨在更好地说明本发明，且不应理解为限制本发明的范围。所有下述的特定组合物、材料和方法，其整体或部分，都在本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不是为了限制本发明，而只是为说明特定的实施方式在本发明的范围内。本领域熟练技术人员可不添加创造性及不偏离本发明范围而开发出等同的组合物、材料和方法。应理解，在对本发明的方法作出的多种改动可以仍然包括在本发明范围内。发明人意在将这样的变动包括在本发明的范围内。
实施例1：杂交瘤抗体的产生
1.1动物免疫
重组人CD3胞外域(ECD)蛋白，组氨酸标记的人CD3ε(目录号：10977-H08H；中国北京Sino Biological Inc.)、人CD3γ(目录号：ab140563；中国上海Abcam)和人CD3δ(目录号：10977-H08H；中国北京Sino Biological Inc.)，作为动物免疫的免疫原。Balb/c小鼠购自上海SLAC实验动物有限公司，笼养在IACUC批准的动物设施中。每两周通过皮下和足垫注射途径，用CD3ε、CD3γ和CD3δ的ECD蛋白或每只小鼠用7×106个新鲜分离的人T细胞与Titermax佐剂的混合物免疫小鼠。
在免疫前和免疫后采集小鼠血液，通过ELISA监测对目标免疫蛋白的血清滴度。
1.2杂交瘤的产生
选择血清滴度最高的小鼠用于细胞融合。根据电融合的一般步骤，采用小鼠脾和淋巴结的B细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。细胞融合后，将细胞铺板于含有补充了20％FBS和1％HAT选择性试剂的DMEM培养基的96孔板中。
存在于杂交瘤培养基上清液中的抗体通过流式细胞术(FACS)，使用表达CD3的Jurkat细胞进行筛选，并且通过FACS使用CD3阴性的MOLT-4T细胞进行反向筛选。收集具有与Jurkat细胞的结合活性，但不与MOLT-4细胞交叉结合的杂交瘤细胞，作为阳性杂交瘤细胞系，并随后采用半固体培养基的方法进行亚克隆阶段。
将单一细胞群落挑入含有补充了10％FBS的DMEM培养基的96孔板中2～3日，通过流式细胞术(FACS)，使用表达CD3的Jurkat细胞针对CD3的靶标进行复筛，并且通过FACS测定，使用CD3阴性的MOLT-4T细胞进行反向筛选。
1.3杂交瘤测序
从杂交瘤细胞中提取出RNA，并通过使用5’-RACE试剂盒，随后通过使用3’简并引物PCR扩增cDNA。随后将PCR产物克隆至pMD18-T载体，进行转化、扩增和测序。
产生了八个小鼠单克隆抗体，其CDR序列示于上文的表1中。
实施例2：人源化抗体的产生
2.1 IgG转换和人源化
鼠源单抗产生嵌合抗体：WBP3311_2.166.48、WBP3311_2.306.4和WBP3312_3.179.16的VH和VL基因用含有适当的限制性位点的克隆引物进行再扩增，并且克隆至WuXiBiologics专有的表达载体中，以产生具有人IgG1的恒定区的嵌合抗体的对应克隆。
人源化和人源化V基因的合成：使用最佳拟合法对WBP3311_2.166.48和WBP3311_2.306.4的轻链和重链进行人源化。对于轻链，将对应的V基因的氨基酸序列与公司内部的人种系V基因数据库进行BLAST比对。人源化VL基因的序列来源于使用Kabat CDR定义，将相似度最高的人CDR序列替换为小鼠CDR序列。使用扩展的CDR定义框架，其中Kabat CDR1在N末端延长5个氨基酸。通过将小鼠框架与人种系免疫球蛋白数据库进行BLAST比对，每条重链和轻链均产生了多个人源化序列。产生了不同的FR组合，并分析其结合活性，使用相似度最高的三个序列得到人源化的VH基因。对人源化的基因进行回译、密码子优化用于哺乳动物表达，以及通过GeneArt Costum Gene Synthesis(Life Technologies)合成。将合成的基因重新克隆至IgG表达载体内，表达并纯化。两个人源化抗体及其亲本小鼠抗体的FR示于上文的表2中。
嵌合抗体和人源化抗体的瞬时表达和纯化：将如上文所述的嵌合抗体和人源化抗体构建至WuXi Biologics专有的表达载体中，并由293F细胞表达。使用Protein A层析柱收集含有对应抗体的培养上清并进一步纯化。
实施例3：体外表征
3.1 ELISA和FACS测得的抗体结合
下述用于ELISA和FACS的抗原、抗体和细胞列于表3中。
表3.用于ELISA和FACS的抗原、抗体和细胞
Figure BDA0002395348420000521
ELISA和EC50检测抗体与蛋白的结合力：在96孔板中分别预包被人CD3ε、CD3δ和CD3γ蛋白。通过对应的HRP标记的二抗测定八个单抗在不同浓度与这三种不同的CD3蛋白胞外域结合的活性。通过使用GraphPad Prism软件公式：非线性回归(曲线拟合)–对数(激动剂)vs.应答–可变斜率，来分析结合EC50(待测抗体在达到最大结合的一半时的浓度)。
ELISA检测抗体与人CD3ε蛋白的特异性结合：八个小鼠单抗表现出与人CD3ε高度特异性结合的活性，而不与CD3γ和CD3δ结合，数据如表5所示。
表5.针对人CD3ε亚单位蛋白的特异性结合
Figure BDA0002395348420000531
FACS和EC50检测抗体的细胞结合力：将不同浓度的待测单抗加至Jurkat细胞，随后通过二抗-FITC检测单抗结合到细胞表面上的活性。使用OKT3作为阳性对照。通过使用BDBiosciences FACSCanto II工具和Flow Jo Version软件来分析染色的细胞。通过使用GraphPad Prism软件公式：非线性回归(曲线拟合)–对数(激动剂)vs.应答–可变斜率，来计算结合EC50。
与T细胞表面上的人CD3受体的特异性结合：在表6中，八个单抗表现出与表达人CD3的细胞(Jurkat细胞)高度特异性的结合活性，而不结合CD3阴性的细胞(MOTL-4细胞和293F细胞)。
表6.FACS测得的跨多个细胞系的与人CD3受体的特异性结合
Figure BDA0002395348420000532
3.2 ELISA和FACS检测抗体跨种属靶蛋白的结合力
对待测抗体与来自不同种属的CD3进行结合活性的分析。人、猴、大鼠和小鼠CD3的参照序列的同源性如下所示。
表4.人、猴、大鼠和小鼠CD3结构域的序列同源性
Figure BDA0002395348420000541
ELISA检测抗体与食蟹猴CD3ε和小鼠CD3ε的交叉结合：将不同浓度的待测抗体、阳性对照和阴性对照加入预包被有食蟹猴CD3ε蛋白及小鼠CD3ε的96孔板中。抗体与食蟹猴CD3ε蛋白及小鼠CD3ε蛋白的结合力通过对应的HRP标记的二抗(BETHYL,A90-231P)进行检测。使用GraphPad Prism软件计算EC50。
数据显示八个单抗均与食蟹猴CD3ε有较强交叉结合活性，但不结合小鼠CD3ε。阳性对照OKT3与食蟹猴CD3ε及小鼠CD3ε均无交叉结合的活性(表7)。
表7.针对食蟹猴CD3ε和小鼠CD3ε的交叉结合
Figure BDA0002395348420000542
FACS检测抗体与食蟹猴CD3ε交叉结合力：通过使用Ficoll-Paque PLUS梯度离心，及100g离心步骤去除血小板，从健康食蟹猴的全血中分离出食蟹猴PBMC。在完全RPMI-1640培养基中培养PBMC待用。将不同浓度的待测抗体加至食蟹猴PBMC，随后通过二抗-FITC(Jackson,115-095-008)检测抗体与细胞表面的结合活性。通过使用BD BiosciencesFACSCanto II和FlowJo Version软件分析染色的细胞。通过使用GraphPad Prism软件公式：非线性回归(曲线拟合)计算结合力的EC50。
FACS检测抗体表位分组(Epitope binning)：将不同浓度的待测抗体分别与一定量W3311-2.383.47的生物素化的抗体混合。混合物随后加至96孔板中的表达CD3的细胞，4℃孵育1小时。使用PE缀合的抗生物素抗体检测目标抗体与表达CD3的细胞的结合。通过流式细胞术测试样品，并且通过FlowJo分析数据。
ELISA方法检测针对人CD3ε和食蟹猴CD3ε蛋白的结合力以及计算EC50 ：在表8中，八个单抗表现出与人CD3ε较强的结合活性以及与食蟹猴CD3ε蛋白的交叉结合，并且表现出人CD3ε和食蟹猴CD3ε之间相似的较低nM范围的EC50。
表8.八个单抗针对人CD3ε和食蟹猴CD3ε的EC50
单抗 人CD3εEC<sub>50</sub>(nM) 食蟹猴CD3εEC<sub>50</sub>(nM)
W3311-2.166.48 0.049 0.033
W3311-2.306.4 0.012 0.011
W3311-2.383.47 0.074 0.028
W3311-2.400.5 0.053 0.024
W3311-2.482.5 0.069 0.028
W3311-2.488.33 0.026 0.019
W3311-2.615.8 0.033 0.025
W3311-2.844.8 0.011 0.009
WBP331-BMK1(UCHT1) 0.186 NA
同种型对照 NA NA
4.3人源化抗体的跨种属结合检测
两个人源化单抗与食蟹猴CD3ε蛋白的结合力及EC50值：在表9中，所有数据表明两个人源化单抗均保持了其与食蟹猴CD3ε蛋白的高度结合活性(见图1)，两个人源化抗体的EC50值均为0.043nM。
表9.两个人源化单抗针对食蟹猴CD3ε的EC50。
单抗 EC<sub>50</sub>(nM)
W3311-2.166.48-z1-uIgG1K 0.043
W3311-2.306.4-z1-uIgG1K 0.043
W3311-2.166.48 0.125
同种型对照 N/A
FACS检测抗体亲和力：Jurkat细胞以5×104个/孔接种至96孔板中，随后将不同浓度的纯化的待测候选抗体作为一抗加入，4℃培养1小时。加入山羊抗小鼠二抗IgG Fc-FITC，4℃孵育30分钟，随后通过FACS检测经FITC染色的细胞。根据上述方法计算KD值。
两个人源化单抗与人CD4 T细胞的结合活性检测：在表10中，数据表明两个人源化抗体均保持与CD4 T细胞的高度结合活性(参见图2)，WBP3311-2.166.48-z1-uIgG1k和WBP3311-2.306.4-z1-uIgG1k的EC50值分别低至1.01和0.46nM，比其各自的亲本抗体低0.5-1倍。
表10.FACS和EC50测得的两个人源化单抗与hCD4 T细胞的结合
单抗 EC<sub>50</sub>(nM)
W3311-2.166.48-z1-uIgG1K 1.01
W3311-2.166.48-mIgG2aK 3.514
W3311-2.306.4-z1-uIgG1K 0.253
W3311-2.306.4-mIgG2bK 0.461
OKT3 0.202
同种型对照 N/A
4.5 FACS检测抗体亲和力及EC50
通过FACS检测了8个单抗的EC50，并且检测了其与表达人CD3的细胞(Jurkat细胞)的亲和力。这8个单抗的EC50的范围为0.57nM至6.91nM(参见表11)，并且在表12中，其亲和力范围为1.3×10-9至9.3×10-10M。
表11.FACS检测与Jurkat细胞结合的EC50
单抗 EC<sub>50</sub>(nM)
W3311-2.166.48 6.91
W3311-2.306.4 0.57
W3311-2.383.47 0.91
W3311-2.400.5 2.5
W3311-2.482.5 3.71
W3311-2.488.33 2.97
W3311-2.615.8 4.65
W3311-2.844.8 0.77
OKT3 0.2
表12.FACS检测8个单抗在Jurkat细胞上的KD值
Figure BDA0002395348420000561
4.6 FACS检测两个人源化单抗亲和力和动力学KD值
通过FACS检测了两个人源化单抗与Jurkat细胞的亲和力。在图4和表13中，数据表明两个人源化抗体均保持其与Jurkat细胞的高度亲和活性，其KD值与其各自的亲本单抗相似。
表13.FACS检测两个人源化单抗与Jurkat细胞结合的动力学KD值
Figure BDA0002395348420000571
3.3基于细胞的功能性测定
通过FACS检测抗体的细胞内化：Jurkat细胞1×105个细胞/孔接种在96孔板中。将待测抗体(1μg/mL)加至细胞，4℃孵育1小时。孵育后，洗去未结合的抗体，随后将细胞在4℃或37℃，5％CO2下孵育3小时。孵育后，通过二抗(Abcam，ab98742)检测抗体在细胞表面的留存量。通过使用BD Biosciences FACSCanto II和FlowJo Version软件分析染色的细胞。内化率计算如下：[(MFI0小时–MFI3小时)/MFI0小时]*100％.
4.7细胞内化率测定
通过FACS使用Jurkat细胞检测内化率。在图5中，数据表明在3小时的研究期之后，8个单抗全部表现出范围在86-94％的抗体内化的高内化率，而OKT3表现出约72％的内化率。
细胞内细胞因子染色法检测抗体的T细胞活化：细胞内细胞因子染色法是一种基于流式细胞术的测定，其可以通过免疫细胞结合细胞表面标记物检测细胞因子的产生。从健康供体中分离出人PBMC。简要地说，使用Ficoll-Paque PLUS梯度离心，随后进行100g离心的步骤来去除血小板。在完全RPMI-1640培养基中培养PBMC。在补充了Golgi Stop的细胞培养基中重悬PBMC，并且以2×105个/孔加入到96孔板中。加入不同浓度的待测抗体、阳性对照和阴性对照，随后在37℃下与细胞一起孵育4.5个小时。孵育后，用1％BSA将细胞洗涤两次，并且随后通过使用抗人CD4-FITC抗体(BD，550628)和抗人CD8-PE抗体(BD，560959)对其表面标记物染色，然后使用人调节性T细胞染色试剂盒(eBioscience，88-8999)固化并透化。在固化/透化之后，通过使用抗人TNF-APC抗体(BD，554514)和抗人IFN-PerCP-Cy5.5抗体(eBioscience，45-7319-42)检测细胞的细胞因子产生。通过使用BD BiosciencesFACSCanto II和FlowJo Version软件分析染色的细胞。
T细胞活化：通过细胞内细胞因子染色方法，使用人PBMC评估T细胞活化，并且监测TNFα和INFγ细胞因子。数据表明在8个待测单克隆抗体中，2.306.4和2.844.8没有显示出显著的T细胞活化现象，同时也没有监测到显著的TNFα和INFγ细胞因子释放，而其他6个待测单抗全部显示出与OKT3相似的T细胞活化程度，除了克隆2.383.47，其显示出弱于OKT3的T细胞活化，数据示于图6中。
两个人源化单抗的人T细胞活化：通过细胞内细胞因子染色方法检测两个人源化单抗对人PBMC的T细胞活化的活性，并且监测TNFα和INFγ细胞因子。数据表明两个人源化抗体均显示出与OKT3阳性对照相似的对CD8+T细胞的T细胞活化程度，而两个人源化单抗对CD4+T细胞均显示出低于OKT3的活化程度。还注意到，亲本小鼠抗体克隆2.306.4重复性地显示无T细胞活化。数据示于图7中。
3.4 FACS检查抗体表位分组
表位分组：针对克隆2.383.47对8个单抗中的7个进行表位分组，结果显示8个单抗全部具有相同的表位分组(图8)。
序列表
<110> 上海药明生物技术有限公司
<120> 新型抗CD3ε抗体
<130> 053674-8012CN01
<160> 119
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> 小鼠
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<212> PRT
<213> 小鼠
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<212> PRT
<213> 小鼠
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Gly
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<212> PRT
<213> 小鼠
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<212> PRT
<213> 小鼠
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<212> PRT
<213> 小鼠
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<212> PRT
<213> 小鼠
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<212> PRT
<213> 小鼠
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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
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Ala
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<212> PRT
<213> 小鼠
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Gly
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<212> PRT
<213> 小鼠
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<212> PRT
<213> 小鼠
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<212> PRT
<213> 小鼠
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<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 13
Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr Ile His
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<210> 14
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<212> PRT
<213> 小鼠
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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
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Ala
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<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
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Trp Ile Ser Pro Glu Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Gln
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Asp
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<212> PRT
<213> 小鼠
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Trp Ala Ser Ile Arg Val Ser
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<213> 小鼠
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Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 小鼠
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Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Tyr Leu His
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<212> PRT
<213> 小鼠
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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val Asn Asn Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
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Ala
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Trp Ile Phe Pro Glu Ser Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Leu Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 小鼠
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Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
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Asp Ser Val Gly Asn Tyr Phe Phe Asp Phe
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<212> PRT
<213> 小鼠
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Ala
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<213> 小鼠
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Asp
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<213> 小鼠
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 29
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<212> PRT
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<213> 小鼠
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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Asn Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
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Ala
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Gly
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<212> PRT
<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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Ala
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Gly
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<212> PRT
<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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Asp Ser Val Ser Val Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 小鼠
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Thr Gln Ser Phe Ile Leu Arg Thr
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 43
Gly Phe Ala Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile His
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<213> 小鼠
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Ala
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<212> PRT
<213> 小鼠
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Gly
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<213> 小鼠
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Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 47
Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 48
Thr Gln Ser His Thr Leu Arg Thr
1 5
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<211> 25
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 49
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ala Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 50
<211> 23
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 50
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys
20
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 51
Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
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<211> 15
<212> PRT
<213> 小鼠
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Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 53
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ile
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 54
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 55
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
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<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
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<212> PRT
<213> 智人
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Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 61
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ile
20 25 30
<210> 62
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 65
<211> 25
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 65
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
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<211> 23
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 66
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys
20
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<211> 14
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<213> 小鼠
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Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
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<210> 68
<211> 15
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 68
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 69
<211> 32
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 69
Arg Ala Thr Val Thr Ala Asp Leu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
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<210> 70
<211> 32
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 70
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys
20 25 30
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<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 71
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
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<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 72
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 73
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人
<400> 73
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 74
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 74
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
<210> 75
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 75
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
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<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 77
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 77
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 78
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ala Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ile Asp Ser Val Ser Ile Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 82
<211> 357
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 82
caggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaaac ctggggcttc agtgaagatt 60
gcctgcaagg cttctggcta cagcttcaca acctactata tacactgggt gaagcagagg 120
cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttttcctg gaaatgataa tattaagtac 180
agtgagaagt tcaagggcaa ggccacactg acggcagaca cttcctccag tacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc tatagactcc 300
gttagtatct actactttga ctattggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357
<210> 83
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 83
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
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Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<213> 小鼠
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<400> 109
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<211> 357
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 110
caggtccagc tgcagcagtc tggacctgaa ttggtgaagc ctggggcttc cgtgaggata 60
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100 105 110
<210> 112
<211> 336
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 112
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60
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atcagcggtg tgcaggctga agacctggca gtttatttct gcacgcaatc tcatactctt 300
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<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
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115
<210> 114
<211> 357
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 114
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<220>
<223> 合成的
<400> 115
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 116
<211> 336
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 116
gacatcgtca tgacccagtc cccagactct ttggcagtgt ctctcgggga aagagctacc 60
atcaactgca agagcagcca gtcccttctg aacagcagga ccaggaagaa ttacctcgcc 120
tggtaccaac agaagcccgg acagcctcct aagctcctga tctactgggc ctcaacccgg 180
aagagtggag tgcccgatcg ctttagcggg agcggctccg ggacagattt cacactgaca 240
atttcctccc tgcaggccga ggacgtcgcc gtgtattact gtactcagag cttcattctg 300
cggacatttg gcggcgggac taaagtggag attaag 336
<210> 117
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 117
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 118
<211> 357
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 118
caggtgcagc ttgtgcagtc tggggcagaa gtgaagaagc ctgggtctag tgtcaaggtg 60
tcatgcaagg ctagcgggtt cgcctttact gactactaca tccactgggt gcggcaggct 120
cccggacaag ggttggagtg gatgggatgg atctccccag gcaatgtcaa cacaaagtac 180
aacgagaact tcaaaggccg cgtcaccatt accgccgaca agagcacctc cacagcctac 240
atggagctgt ccagcctcag aagcgaggac actgccgtct actactgtgc cagggatggg 300
tactccctgt attactttga ttactggggc cagggcacac tggtgacagt gagctcc 357
<210> 119
<211> 112
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 119
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser His Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 120
<211> 336
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 120
gatatcgtga tgacccagag cccagactcc cttgctgtct ccctcggcga aagagcaacc 60
atcaactgca agagctccca aagcctgctg aactccagga ccaggaagaa ttacctggcc 120
tggtatcagc agaagcccgg ccagcctcct aagctgctca tctactgggc ctccacccgg 180
cagtctgggg tgcccgatcg gtttagtgga tctgggagcg ggacagactt cacattgaca 240
attagctcac tgcaggccga ggacgtggcc gtctactact gtactcagag ccacactctc 300
cgcacattcg gcggagggac taaagtggag attaag 336

Claims (34)

1.一种分离的抗CD3抗体或其抗原结合片段，其包括：
a)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 1所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 3所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 5所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 2所示的LCDR1、如SEQID NO: 4所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 6所示的LCDR3；
b)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 7所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 9所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 11所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 10所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 12所示的LCDR3；
c)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 13所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 15所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 17所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 14所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 16所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 18所示的LCDR3；
d)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 19所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 21所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 23所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 20所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 22所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 24所示的LCDR3；
e)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 25所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 27所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 29所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 26所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 28所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 30所示的LCDR3；
f)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 31所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 33所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 35所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 32所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 34所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 36所示的LCDR3；
g)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 37所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 39所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 41所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 38所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 40所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 42所示的LCDR3；或
h)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 43所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 45所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 47所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 44所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 46所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 48所示的LCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包括：
a)重链可变区，其如SEQ ID NO: 81所示；和κ轻链可变区，其如SEQ ID NO: 83所示；
b)重链可变区，其如SEQ ID NO: 85所示；和κ轻链可变区，其如SEQ ID NO: 87所示；
c)重链可变区，其如SEQ ID NO: 89所示；和κ轻链可变区，其如SEQ ID NO: 91所示；
d)重链可变区，其如SEQ ID NO: 93所示；和κ轻链可变区，其如SEQ ID NO: 95所示；
e)重链可变区，其如SEQ ID NO: 97所示；和κ轻链可变区，其如SEQ ID NO: 99所示；
f)重链可变区，其如SEQ ID NO: 101所示；和κ轻链可变区，其如SEQ ID NO: 103所示；
g)重链可变区，其如SEQ ID NO: 105所示；和κ轻链可变区，其如SEQ ID NO: 107所示；
h)重链可变区，其如SEQ ID NO: 109所示；和κ轻链可变区，其如SEQ ID NO: 111所示；
i)重链可变区，其如SEQ ID NO: 113所示；和κ轻链可变区，其如SEQ ID NO: 115所示；或
j)重链可变区，其如SEQ ID NO: 117所示；和κ轻链可变区，其如SEQ ID NO: 119所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括免疫球蛋白恒定区。
4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白恒定区是IgG的恒定区。
5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述IgG的恒定区是IgG1的恒定区。
6.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其为人源化抗体。
7.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其为双功能抗体（diabody）、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、双特异性抗体或ds双功能抗体（ds diabody）。
8.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其具有双特异性。
9.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有针对CD3ε的第一特异性，以及第二特异性。
10.根据权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗原特异性针对CD3ε，并且所述第二抗原特异性针对与肿瘤相关的抗原或者病原体抗原。
11.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其与一种或多种缀合物连接。
12.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述缀合物是化疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记，或酶底物标记。
13.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其能够特异性地与CD3ε结合。
14.根据权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CD3ε来源于猴或人。
15.根据权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CD3ε是重组CD3ε或表达在细胞表面上的CD3ε。
16.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过5×10-9M、不超过4×10-9M、不超过3×10-9M、不超过2×10-9M、不超过10-9M、不超过5×10-10M、不超过4×10-10M、不超过3×10-10M、不超过2×10-10M、不超过10-10M、不超过5×10-11M、不超过4×10-11M、不超过3×10-11M、不超过2×10-11M或不超过10-11M的KD值特异性地与表达在细胞表面上的人CD3ε结合，所述KD值通过流式细胞术测定。
17.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过0.001nM、不超过0.005nM、不超过0.01nM、不超过0.02nM、不超过0.03nM、不超过0.04nM或不超过0.05nM的EC50值特异性地与重组的食蟹猴CD3ε结合，所述EC50值通过ELISA测定。
18.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过0.01nM、不超过0.02nM、不超过0.03nM、不超过0.04nM、不超过0.05nM、不超过0.06nM、不超过0.07nM或不超过0.08nM的EC50值特异性地与重组的人CD3ε结合，所述EC50值通过ELISA测定。
19.一种药物组合物，其包括抗CD3抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的运载体，其中所述抗体或其抗原结合片段包括：
a)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 1所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 3所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 5所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 2所示的LCDR1、如SEQID NO: 4所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 6所示的LCDR3；
b)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 13所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 15所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 17所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 14所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 16所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 18所示的LCDR3；
c)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 19所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 21所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 23所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 20所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 22所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 24所示的LCDR3；
d)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 25所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 27所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 29所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 26所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 28所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 30所示的LCDR3；
e)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 31所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 33所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 35所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 32所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 34所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 36所示的LCDR3；
f)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 37所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 39所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 41所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 38所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 40所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 42所示的LCDR3；或
g)重链可变区，其如SEQ ID NO: 117所示；和κ轻链可变区，其如SEQ ID NO: 119所示。
20.一种分离的多核苷酸序列，其编码根据权利要求1-18所述的抗体或其抗原结合片段。
21.根据权利要求20所述的分离的多核苷酸序列，其包括：
a) 如SEQ ID NO: 82和SEQ ID NO: 84所示的核苷酸序列；
b) 如 SEQ ID NO: 86和SEQ ID NO: 88所示的核苷酸序列；
c) 如SEQ ID NO: 90和SEQ ID NO: 92所示的核苷酸序列；
d) 如SEQ ID NO: 94和SEQ ID NO: 96所示的核苷酸序列；
e) 如SEQ ID NO: 98和SEQ ID NO: 100所示的核苷酸序列；
f) 如SEQ ID NO: 102和SEQ ID NO: 104所示的核苷酸序列；
g) 如SEQ ID NO: 106和SEQ ID NO: 108所示的核苷酸序列；
h) 如SEQ ID NO: 110和SEQ ID NO: 112所示的核苷酸序列；
i) 如SEQ ID NO: 114和SEQ ID NO: 116所示的核苷酸序列；或
j) 如SEQ ID NO: 118和SEQ ID NO: 120所示的核苷酸序列。
22.一种载体，其包括根据权利要求20或21所述的分离的多核苷酸。
23.一种宿主细胞，其包括根据权利要求22所述的载体。
24.一种表达根据权利要求1-18中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在可使权利要求22中所述的载体表达的条件下培养根据权利要求23所述的宿主细胞。
25.抗CD3抗体或其抗原结合片段在制备用于在会从对CD3ε活性的调节中受益的受试者中治疗疾病或状况的药物中的用途，其中所述疾病或状况是癌症、炎性疾病或感染性疾病，其中所述抗体或其抗原结合片段包括：
a)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 1所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 3所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 5所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 2所示的LCDR1、如SEQID NO: 4所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 6所示的LCDR3；
b)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 13所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 15所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 17所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 14所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 16所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 18所示的LCDR3；
c)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 19所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 21所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 23所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 20所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 22所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 24所示的LCDR3；
d)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 25所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 27所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 29所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 26所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 28所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 30所示的LCDR3；
e)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 31所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 33所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 35所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 32所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 34所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 36所示的LCDR3；
f)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 37所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 39所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 41所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 38所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 40所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 42所示的LCDR3；或
g)重链可变区，其如SEQ ID NO: 117所示；和κ轻链可变区，其如SEQ ID NO: 119所示。
26.根据权利要求19所述的药物组合物在制备用于在会从对CD3ε活性的调节中受益的受试者中治疗疾病或状况的药物中的用途，其中所述疾病或状况是癌症、炎性疾病或感染性疾病。
27.根据权利要求25或26所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段是双特异性的，并且所述疾病或状况是癌症。
28.根据权利要求25或26所述的用途，其中所述受试者是人类。
29.抗CD3抗体或其抗原结合片段在制备用于在体内或在体外活化表达CD3ε的T细胞的药物中的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段包括：
a)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 1所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 3所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 5所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 2所示的LCDR1、如SEQID NO: 4所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 6所示的LCDR3；
b)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 13所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 15所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 17所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 14所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 16所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 18所示的LCDR3；
c)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 19所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 21所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 23所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 20所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 22所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 24所示的LCDR3；
d)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 25所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 27所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 29所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 26所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 28所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 30所示的LCDR3；
e)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 31所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 33所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 35所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 32所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 34所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 36所示的LCDR3；
f)重链可变区，其包括如SEQ ID NO: 37所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 39所示的HCDR2和如SEQ ID NO: 41所示的HCDR3；和κ轻链可变区，其包括如SEQ ID NO: 38所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 40所示的LCDR2和如SEQ ID NO: 42所示的LCDR3；或
g)重链可变区，其如SEQ ID NO: 117所示；和κ轻链可变区，其如SEQ ID NO: 119所示。
30.根据权利要求8-10中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于通过表达CD3ε的T细胞来促进第二抗原的体内或体外加工的药物中的用途，所述用途包括将所述表达CD3ε的T细胞与所述抗体或其抗原结合片段接触，其中所述抗体或抗原结合片段能够与所述表达CD3ε的T细胞和第二抗原特异性地结合，从而使两者接近，其中所述第二抗原是肿瘤抗原或病原体抗原，其中将所述表达CD3ε的T细胞与所述肿瘤抗原或病原体抗原紧密接近，并由此促进免疫系统对该抗原的识别或消除。
31.根据权利要求1-18中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测样品中CD3ε的存在或含量的试剂盒中的用途。
32.根据权利要求1-18中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断在受试者中与CD3相关的疾病或状况的诊断试剂中的用途，其包括：a)获取来自所述受试者的样品；b)将获取自所述受试者的所述样品与所述诊断试剂接触；c) 确定在所述样品中CD3ε的存在或含量；以及d)将所述CD3ε的存在或含量与所述受试者中与CD3相关的疾病或状况的存在或状态相关联；其中所述与CD3相关的疾病或状况是癌症、自体免疫疾病、炎性疾病或感染性疾病。
33.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-18中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述试剂盒用于检测CD3ε。
34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于检测重组CD3ε、表达在细胞表面上的CD3ε，或者表达CD3ε的细胞。
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