CN110305216B - 新型抗tim-3抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了抗TIM‑3的抗体或其抗原结合片段、编码其的分离的多核苷酸、包含其的药物组合物，及其用途。

Description

新型抗TIM-3抗体

优先权要求

本申请要求2018年3月20日提交的PCT申请号PCT/CN2018/079624和2018年5月24日提交的中国申请号201810506745.3的优先权。

发明领域

本发明涉及新的抗人TIM-3抗体。

背景技术

TIM家族的成员T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(TIM-3)是I型跨膜蛋白，其具有V型的N末端Ig域，后接包含潜在的糖基化位点的粘蛋白域。TIM-3优选地表达在活化的Th1细胞、分泌IFNγ的细胞毒性CD8T细胞、树突细胞(DC)、单核细胞和NK细胞上。TIM-3是活化诱导的抑制性分子，能够诱导Th1细胞的凋亡，导致慢性病毒感染和癌症病人的T细胞衰竭。

据报道有4种分子是TIM-3的配体，包含癌胚抗原细胞黏附分子1(CEACAM1)、磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)和半乳糖凝集素-9(Gal-9)。据报道，在这些配体中，CEACAM1、HMGB1以及Gal-9都可负向调控免疫应答。近期的研究显示，已知在活化的T细胞上表达并且参与T细胞抑制的CEACAM1，可以形成与TIM-3的顺式和反式相互作用，以抑制抗肿瘤T细胞应答。HMGB1与处于坏死过程中的细胞所释放的DNA结合，并且通过晚期糖基化终末产物的受体(RAGE)和/或Toll样受体介导先天免疫细胞的活化。通过与HMGB1结合，TIM-3阻止HMGB1与DNA结合，并且因此干扰HMGB1在肿瘤组织中活化先天免疫应答的功能。尽管Gal-9对于人T细胞的作用存在争议，已经表明Gal-9与小鼠TIM-3结合能够负向调控Th-1免疫应答。另据近期报道，白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2(LILRB2)与TIM-3相互作用可以调控DC、巨噬细胞和T细胞的功能。对TIM-3/LILRB2相互作用的阻断可增强巨噬细胞的活化；提高T细胞应答和增殖。

在实体瘤和恶性血液病的临床前模型中，以及患有晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)或滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤的病人中，TIM-3均在最受抑制的或功能紊乱的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上表达，由此启示TIM-3可能是肿瘤诱导的免疫抑制中关键的免疫检查点。在多种临床前肿瘤模型中，抗TIM-3的治疗单用或与其它免疫检查点疗法(如抗PD-1)联用，可以大幅抑制肿瘤生长。

对新的抗TIM-3抗体存在很大的需求。

发明简述

本申请全文中的冠词“一种”、“一个”和“所述”在此用于指代一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一种抗体”指一种抗体或多于一种抗体。

本申请提供了分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段，其包含：

a)1、2或3个选自下组的重链互补决定区(CDR)序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5；和/或

b)1、2或3个选自下组的轻链CDR序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6。

在某些实施方式中，所述分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所示的3个CDR序列。

在某些实施方式中，所述分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6所示的3个CDR序列。

在某些实施方式中，所述分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所示的3个CDR序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6所示的3个CDR序列。

在某些实施方式中，所述分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区选自下组：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11和与其具有至少80％序列同一性但仍然保持与TIM-3的特异性的结合亲和力的同源序列

在某些实施方式中，所述分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区选自下组：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13和与其具有至少80％序列同一性但仍然保持与TIM-3的特异性的结合亲和力的同源序列。

在某些实施方式中，所述分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段包含：

a)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:7，和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:9；和

b)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:11，和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:13。

在某些实施方式中，所述分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段进一步包含一个或多个氨基酸残基替代或修饰，但仍然保持与TIM-3的特异性的结合亲和力。在某些实施方式中，其中至少一个所述替代或修饰在一个或多个所述CDR序列里，和/或在一个或多个所述重链可变区或轻链可变区序列里而不在任何所述CDR序列里。

在某些实施方式中，所述分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段进一步包含免疫球蛋白恒定区，可选地包含免疫球蛋白(Ig)的恒定区，或可选地包含人Ig的恒定区，或可选地包含人IgG的恒定区。

在某些实施方式中，所述分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段包含人IgG4恒定区，所述人IgG4恒定区包含S228P的氨基酸取代。

在某些实施方式中，所述分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段包含人IgG1恒定区，所述人IgG1恒定区包含L234F、L235E和/或P331S的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方式中，所述抗TIM-3抗体或其抗原结合片段包含人IgG1恒定区，其中除了L328R之外还将Arg插入位置236之后。

在某些实施方式中，所述分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段为人源化的。

在某些实施方式中，所述分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段为骆驼化单域抗体(camelized single chain domain antibody)、双功能抗体(diabody)、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)₂、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds双功能抗体(ds diabody)、纳米抗体、域抗体、scFv-Fc抗体或双价抗体。

在某些实施方式中，所述分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段能够以不超过5×10^-9M(例如不超过4×10^-9M、不超过3×10^-9M、不超过2×10^-9M、不超过10^-9M、不超过5×10^{- 10}M、不超过4×10^-10M、不超过3×10^-10M、不超过2×10^-10M、不超过10^-10M、不超过5×10^-11M、不超过4×10^-11M、不超过3×10^-11M、不超过2×10^-11M或不超过10^-11M)的K_D值特异性地与人TIM-3结合，所述K_D值通过表面等离子共振(SPR)测定。

在某些实施方式中，所述分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段能够以不超过10nM(例如9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.2nM、0.1nM、0.05nM或0.01nM)的EC₅₀值特异性地与表达在细胞表面上的人TIM-3结合，所述EC₅₀值通过流式细胞术测定。

在某些实施方式中，所述分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段能够特异性地与食蟹猴TIM-3结合。

在某些实施方式中，所述分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段与一种或多种缀合部分连接。在某些实施方式中，所述缀合部分包含清除调节剂、毒素、可检测标记、化疗剂或纯化部分。

本申请还提供一种抗体或其抗原结合片段，其与本申请所述的抗体或其抗原结合片段竞争相同的表位。

本申请还提供一种药物组合物，其包含本申请所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂。

本申请还提供一种分离的多核苷酸，其编码本申请所述的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14，和/或与其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的同源序列，和/或其仅具有简并替代的变体。。

本申请还提供一种载体，其包含本申请所述的分离的多核苷酸。

本申请还提供一种宿主细胞，其包含本申请所述的载体。

本申请还提供一种表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包含在表达本申请所述的载体的条件下培养本申请所述的宿主细胞。

本申请还提供一种在个体中治疗可受益于TIM-3活性调节的疾病或状况的方法，其包含向所述个体施用治疗有效量的本申请所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。在某些实施方式中，所述疾病或状况是与TIM-3相关的疾病或状况。在某些实施方式中，所述疾病或状况是癌症、自体免疫疾病、炎性疾病或感染性疾病。在某些实施方式中，所述个体是人。在某些实施方式中，所述施用是经由口服、鼻内、静脉内、皮下、舌下或肌内施用。

在某些实施方式中，所述癌症是淋巴瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑与中枢神经系统癌、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、绒毛膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、结缔组织癌、食道癌、间皮瘤、鼻咽癌、眼癌、头颈癌、肛门癌、胃肠癌、胶质母细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌(例如非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、生殖细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾腺癌、恶性肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌或外阴癌。

在某些实施方式中，所述疾病或状况是B细胞淋巴瘤，可选地为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤(NHL)，其中所述NHL包含：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中度/滤泡性NHL、中度弥漫性NHL、高度免疫母细胞性NHL、高度淋巴母细胞性NHL、高度恶性小无核裂细胞性NHL、巨块型NHL、套细胞淋巴瘤、艾滋相关淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、多毛细胞白血病、慢性髓细胞白血病和移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，以及瘢痣病、水肿和梅格斯综合征相关的异常血管增生。

本申请还提供一种在表达TIM-3的细胞中调节TIM-3活性的方法，其包含将所述表达TIM-3的细胞暴露于本申请所述的抗体或其抗原结合片段。

本申请还提供一种在样品中检测TIM-3的存在或含量的方法，其包含将所述样品与本申请所述的抗体或其抗原结合片段接触，以及确定样品中TIM-3的存在或含量。

本申请还提供一种在个体中诊断与TIM-3相关的疾病或状况的方法，其包含：a)将获取自所述个体的样品与本申请所述的抗体或其抗原结合片段接触；b)确定在所述样品中TIM-3的存在或含量；和c)将所述TIM-3的存在或含量与所述与TIM-3相关的疾病或状况在所述个体中的存在或状态相关联。

本申请还提供本申请所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗个体中的与TIM-3相关的疾病或状况的药物中的用途。

本申请还提供本申请所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断TIM-3相关的疾病或状况的诊断试剂中的用途。

本申请还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本申请所述的抗体或其抗原结合片段，其可用于检测TIM-3。

附图简述

图1示出了W3402-z3与细胞表面人TIM-3(图1A)和食蟹猴TIM-3(图1B)结合。

图2示出了W3402-z3与活化的而非静息CD4⁺T细胞结合的结果。图2A示出了活化后的或未经活化的CD4⁺T细胞上的W3402-z3的结合直方图。结合到活化CD4⁺T细胞上的W3402-z3的结合曲线示于图2B。

图3示出了跨家族测试的结果。W3402-z3与人TIM-3特异性地结合(图3A)，与人TIM-1(图3B)或TIM-4(图3C)没有交叉反应结合。

图4示出了表位鉴定的结果，表明W3402-z3与基准W340-BMK4(图4B)，而非W340-BMK6(图4A)竞争结合人TIM-3蛋白。

图5示出了报告基因测定的结果，表明W3402-z3可以抵消TIM-3的作用并且调节TIM-3⁺Jurkat活化后的表现。

图6示出了人同种异型MLR的结果，显示W3402-z3可以以剂量依赖的方式增强人CD4⁺T细胞生产IFNγ。

图7示出了人抗原特异性MLR的结果，显示出W3402-z3可以以剂量依赖的方式增强人CD4⁺T细胞分泌IL-2(图7A)，W3402-z3可以增强人CD4⁺T细胞分泌IFNγ(图7B)以及增殖(图7C)。

图8显示了W3402-z3可以部分阻碍Treg在调控CD4T细胞增殖方面的抑制性功能。图8A示出了在W3402-z3单独存在或W3402-z3与Treg细胞同时存在的条件下的CD4⁺T细胞增殖。图8B示出了在W3402-z3或同种型对照存在的条件下，由Treg介导的抑制性作用的百分比。

图9示出了ADCC测试的结果，显示了W3402-z3在活化的CD4⁺T细胞上不介导ADCC活性。将赫赛汀(Herceptin)诱导的BT474细胞裂解用作检测系统的阳性对照。

图10示出了CDC测试的结果，显示了W3402-z3在活化CD4⁺T细胞上不介导CDC活性。将

诱导的Raji细胞裂解用作检测系统的阳性对照。

图11表示W3402-z3在37℃下稳定存在于人血清中至少14天。

图12显示了W3402-z3能够剂量依赖性阻断PtdSer-TIM-3之间的相互作用，IC₅₀为35.47nM。

图13显示了在将W3402-z3加入细胞培养物后4小时就可以检测到显著的剂量依赖性的细胞表面hTIM-3下调。

发明详述

本申请的以下描述只为说明本申请的多种实施方式。因此，此处讨论的具体修改方式不应理解为对申请范围的限制。本领域的技术人员在不偏离本申请范围的情况下即可很容易地得出多种等同方式，变化和修改，应理解这样的等同实施方式包含在本发明范围内。在本申请中引用的所有文献，包含公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入。

定义

本发明中的“抗体”一词包含可结合某特定抗原的任意免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、双价抗体或单价抗体。一个天然的完整抗体包含两条重(H)链和两条轻(L)链。哺乳动物的重链可分为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由一可变区(V_H)和第一、第二、第三恒定区(分别为C_H1、C_H2、C_H3)组成；哺乳动物的轻链可分为λ或κ，每条轻链由一可变区(V_L)和一恒定区组成。抗体呈“Y”型，“Y”型结构的颈部由两条重链的第二和第三恒定区组成，其通过二硫键结合。“Y”型结构的每条臂包含其中一条重链的可变区和第一恒定区，其与一条轻链的可变区和恒定区结合。轻链和重链的可变区决定抗原的结合。每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(轻链的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重链的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本发明中公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat，IMGT，AbM，Chothia或Al-Lazikani命名法命名或识别。(Al-Lazikani,B.，Chothia,C.，Lesk,A.M.，J.Mol.Biol.，273(4),927(1997)；Chothia,C.等，J Mol Biol.Dec 5；186(3):651-63(1985)；Chothia,C和Lesk,A.M.，J.Mol.Biol.，196,901(1987)；Chothia,C.等，Nature.Dec 21-28；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等，National Institutes ofHealth，马里兰州Bethesda(1991)；Marie-Paule Lefranc等,Developmental andComparative Immunology,27:55-77(2003)；Marie-Paule Lefranc等,ImmunomeResearch,1(3),(2005)；Marie-Paule Lefranc,Molecular Biology of B cells(第2版),第26章,481-514,(2015))。其中，三个CDR由被称为框架区(FR)的侧面连续部分间隔开，框架区比CDR更加高度保守并形成一个支架支撑超变环。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类。根据是否含有α、δ、ε、γ和μ重链，抗体可分别分为五个主要的分类或异构体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。几个主要的抗体分类还可分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)等。

本申请中的术语“双价”是指具有两个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；术语“单价”是指仅具有一个单一抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；而术语“多价”是指具有多个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是双价的。

本申请中的“抗原结合片段”一词，指由含有一个或多个CDR的抗体部分或者任何其他结合抗原但不具有完整抗体结构的抗体片段所形成的一种抗体片段。抗原结合片段的例子包含，但不限于，如双功能抗体(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、二硫键稳定的双功能抗体(ds diabody)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(双价的双功能抗体)、双价单链抗体(BsFv)、骆驼化单域抗体(camelizedsingle domain antibody)、纳米抗体、域抗体和双价域抗体。抗原结合片段可以与母体抗体结合相同的抗原。

抗体的“Fab”片段是指由一条轻链(包含可变区和恒定区)和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的那部分抗体分子。

“Fab'”片段是指包含了部分铰链区的Fab片段。

“F(ab')₂”指的是Fab’的二聚体。抗体的“Fv”段指的是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由单条轻链的可变区结合到单条重链的可变区组成。

“dsFv”是指二硫键稳定的Fv片段，其单条轻链的可变区与单条重链的可变区之间的连接键是二硫键。在一些实施方式中，“(dsFv)₂”含有三条肽链：两个V_H部分通过多肽连接子(例如长的柔性连接子)相连，并经由二硫键分别与两个V_L部分结合。

“单链Fv抗体”或“scFv”是指由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过肽链序列连接组成的工程化抗体(Huston JS等，Proc Natl Acad Sci USA、85:5879(1988))。

抗体的“Fc”指的是由第一重链的第二和第三恒定区经由二硫键与第二重链的第二和第三恒定区连接组成的那部分抗体。抗体的Fc段负责多种不同的效应功能如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)，但在抗原结合中不起作用。

“单链抗体Fv-Fc抗体”或“scFv-Fc”是指由连接到抗体Fc段的scFv组成的工程化抗体。

“骆驼化单域抗体(Camelized single domain antibody)”、“重链抗体”或“HCAb(Heavy-chain-only antibodies，HCAb)”都是指含有两个V_H域而不含有轻链的抗体(Riechmann L.和Muyldermans S.，J Immunol Methods.Dec10；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.,J Biotechnol.Jun；74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；U.S.专利号6,005,079)。重链抗体最初从驼科(骆驼、单峰驼和美洲驼)衍生得到。虽然缺失轻链，骆驼化抗体(camelized antibodies)有确证的抗原结合全部功能(Hamers-Casterman C.等，Nature.Jun 3；363(6428):446-8(1993)；Nguyen VK.等，“Heavy-chainantibodies in Camelidae；a case of evolutionary innovation,”Immunogenetics.Apr；54(1):39-47(2002)；

Nguyen VK.等，Immunology.May；109(1):93-101(2003))。重链抗体的可变区(VHH域)是最小的已知的获得性免疫产生的抗原结合单位(Koch-Nolte F.等，FASEB J.Nov；21(13):3490-8.Epub 2007Jun 15(2007))。

“纳米抗体”是指一种抗体片段，其由一个来自重链抗体的VHH域和两个恒定区CH2和CH3组成。

“双功能抗体(diabody)”或“dAb”包含带有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中该片段含有在同一条多肽链上相连的V_H域和V_L域(V_H-V_L或V_H-V_L)(请参见，Holliger P.等，Proc Natl Acad Sci USA.Jul 15；90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。两个域之间衔接物很短，使同一条链上的两个域不能互相配对，从而迫使两个域与另一条链的互补域配对，形成两个抗体结合位点。在某些实施方式中，“scFv二聚体”是双价双功能抗体或双价ScFv(BsFv)，包含V_H-V_L与另一个V_H-V_L部分的二聚化(由多肽连接子连接)，使得一个部分的V_H与另一个部分的V_L协作形成两个结合位点，这两个结合位点可靶向相同抗原(或抗原表位)。

“域抗体”是指仅含有重链可变区或轻链可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或多个V_H域由肽连接子共价结合并形成双价域或多价域抗体。双价域抗体的两个V_H域可靶向作用于相同的抗原。

本申请中使用的术语“嵌合”是指具有来源于一种物种的重链和/或轻链的一部分，和所述重链和/或轻链其余部分来源于不同物种的抗体或抗原结合片段。在一个示例性的例子中，嵌合抗体可以包含来源于人的恒定区和来源于非人动物例如小鼠的可变区。在一些实施方式中，所述非人动物为哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。

本申请中使用的术语“人源化”是指包含来源于非人动物的CDR、来源于人的FR区，以及来源于人的恒定区(如果适用的话)的抗体或抗原结合片段。

本申请中的“TIM-3”来源于任何脊椎动物来源，包含哺乳物动，如灵长类(例如人、猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。人TIM-3的示例性序列包含人TIM-3蛋白(NCBI登录号GI:18182535)。TIM-3的示例性序列包含Mus musculus(小鼠)TIM-3蛋白(NCBI登录号GI:18182531)、Rattus norvegicus(大鼠)TIM-3蛋白(NCBI登录号GI:39725405)和Macacafascicularis(猴)TIM-3蛋白(NCBI登录号GI:355750365)。

本申请中的术语“TIM-3”旨在涵盖任意形式的TIM-3，例如1)天然未经处理的TIM-3分子、“全长”TIM-3链或TIM-3天然存在的变体(包含例如剪接变体或等位基因变体)；2)TIM-3由在细胞中的处理而产生的任何形式；或3)通过重组方法产生的TIM-3亚单位的全长、片段(例如截短的形式、胞外/跨膜域)或修饰的形式(例如突变形式、糖基化/聚乙二醇化的形式、组氨酸标签/免疫荧光融合的形式)。

术语“抗TIM-3抗体”是指能够特异性地结合TIM-3(例如人或猴TIM-3)的抗体。

本申请中的“特异性结合”或“特异性的结合”是指，指两分子间的非随机结合反应，如抗体和抗原间的反应。在某些实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合片段与人和/或猴TIM-3特异性结合，并且其结合亲和力(K_D)≤10^-6M(如：≤5×10^-7M、≤2×10^-7M、≤10^{- 7}M、≤5×10^-8M、≤2×10^-8M、≤10^-8M、≤5×10^-9M、≤4×10^-9M、≤3×10^-9M、≤2×10^-9M，≤10^{- 9}M，5×≤10^-10M或5×10^-11M)。本申请中的KD是指解离速度与结合速度的比值(koff/kon)，其可通过使用任何本领域常用的方法测定，包含但不限于表面等离子共振法、微量热流动法、HPLC-MS法和流式细胞术(如FACS)。在某些实施方式中，K_D值可以适当地通过使用流式细胞术测定。

本申请中的“阻断结合”或“竞争性同样的表位”的能力是指抗体或其抗原结合片段将两个分子间结合(例如人TIM-3和抗TIM-3抗体)的相互作用抑制到任何可检测的程度的能力。在某些实施方式中，阻断两个分子间结合的抗体或抗原结合片段可将两个分子间结合的相互作用抑制至少85％或至少90％。在某些实施方式中，这样的抑制作用可以大于85％或大于90％。

本申请中使用的“表位”是指抗原分子中与抗体结合的那部分氨基酸或原子基团。如果两种抗体表现出对抗原的竞争性结合，则可能结合抗原上的相同或密切相关的表位。例如，如果抗体或其抗原结合片段阻断参比抗体与抗原至少85％或至少90％或至少95％的结合，那么所述抗体或其抗原结合片段可以被认为与所述参比抗体结合相同/密切相关的表位。

本领域技术人员将认识到，可以通过有限的实验，确定给定的抗体是否阻止本申请所述的抗体(例如大鼠单克隆抗体W3402-2.131.17(在本申请中也称为“W3402”)和人源化抗体W3402-2.131.17-z3(在本申请中也称为“W3402-z3”))结合至TIM-3抗原多肽，从而确定给定的抗体与本申请所述的抗体是否结合至相同表位。如果本申请所述的抗体与TIM-3抗原多肽的结合下降，表示所述给定的抗体与本申请所述的抗体竞争，则这两个抗体结合至相同或密切相关的表位。或者，如果给定的抗体与TIM-3抗原多肽的结合受到本申请所述的抗体的抑制，那么这两个抗体结合至相同或密切相关的表位。

在本申请中当“保守替代”用于氨基酸序列时，是指将一个氨基酸残基用另一个具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基替代。例如，可以在疏水侧链氨基酸残基间(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile)、中性亲水侧链残基间(例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)、酸性侧链残基间(例如Asp、Glu)、碱性侧链氨基酸间(例如His、Lys和Arg)或方向侧链残基间(例如Trp、Tyr和Phe)进行保守替代。本领域已知保守替代通常不会引起蛋白构象结构的显著变化，因此能够保留蛋白质的生物活性。

本申请所述的术语“同源”和“同源的”可以互换使用，指当最佳比对时核酸序列(或其互补链)或氨基酸序列具有与另一条序列至少80％(如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的同一性。

当“百分比序列同一性”用于氨基酸序列(或核酸序列)时，是指在进行序列比对，并且必要时引入间隔使相同氨基酸(或核酸)数目达到最多后，在候选序列中，与参比序列相同的氨基酸(或核酸)残基占所述候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。所述氨基酸残基的保守替代可以认为或可以不认为是相同残基。可以通过本领域公开的工具，例如BLASTN,BLASTp(美国国家生物技术信息中心网站(NCBI)，也可参见，Altschul S.F.等，J.Mol.Biol.，215:403–410(1990)；Stephen F.等，Nucleic Acids Res.，25:3389–3402(1997))、ClustalW2(欧洲生物信息研究所网站，可参见，Higgins D.G.等，Methods inEnzymology，266:383-402(1996)；Larkin M.A.等，Bioinformatics(Oxford、England)，23(21):2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，对序列进行比对以确定氨基酸(或核酸)序列的百分比序列同一性。本领域技术人员可以使用所述工具的默认参数或根据比对的需要适当调整参数，例如通过挑选合适的算法。

本申请中使用的“效应功能”是指抗体的Fc区与其效应器例如C1复合物和Fc受体结合的生物活性。示例性的效应功能包含抗体与C1复合物上的C1q相互作用诱导的补体依赖的细胞毒性(CDC)、抗体的Fc区与效应细胞上的Fc受体结合诱导的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及吞噬。

对某种状况的“治疗”或“疗法”包含预防或减轻某种状况，降低某种状况兴起或发展的速度，减少发展出某种状况的风险，预防或延迟与某种状况相关的症状发展，减少或终止与某种状况相关的症状，产生某种状况的完全或部分的逆转，治愈某种状况，或以上的组合。

“被分离”的物质已经经人工由自然状态改变。如果自然界中出现某种“被分离”的物质或成分，那么其已经被改变或脱离其原始状态，或二者均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在的多核苷酸或多肽是未被分离的，但如果这些多核苷酸或多肽与之在天然状态下共存的物质足够分离并以足够纯的状态存在，则可以认为是“被分离”。“被分离的核酸序列”是指被分离的核酸分子的序列。在某些实施方式中，“被分离的抗体或其抗原结合片段”是指纯度为至少60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗体或抗原结合片段，其由电泳方法(如SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳)，或色谱法(如离子交换色谱或反相HPLC)确定。

本发明中“载体”是指，可将编码某蛋白的多核苷酸操作性地插入其中并使该蛋白获得表达的一种运载工具。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。载体可以是表达载体或克隆载体。本申请提供的载体(例如表达载体)含有本申请所述的编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列、至少一个可操作地连接至所述核酸序列的启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)，以及至少一个选择标记。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。

本发明中“宿主细胞”是指导入外源多核苷酸和/或载体的细胞。

本发明中的“与TIM-3相关的”疾病或状况是指任何由TIM-3增加或减少的表达或活动所引起、加剧的，或另外与其相关的疾病或症状。在一些实施方式中，TIM-3相关的状况是免疫相关的疾病，例如癌症、自身免疫疾病、炎性疾病或感染性疾病。本申请中使用的“癌症”是指以恶性细胞生长或肿瘤、异常增生、浸润或转移为特征的任何医学状况，并且包括实体肿瘤和例如白血病的非实体癌症(血液恶性肿瘤)。本申请中使用的“实体瘤”是指肿瘤和/或恶性细胞的实体团块。癌症或肿瘤的实例包括血液科恶性疾病、口腔癌(例如唇、舌或咽的癌症)、消化器官癌(例如食道、胃、小肠、结肠、大肠或直肠)、腹膜癌、肝或胆道癌、胰腺癌、呼吸系统，如喉或肺(小细胞或非小细胞)癌、骨癌、结缔组织癌、皮肤癌(例如黑色素瘤)、乳腺癌、生殖器官(输卵管、子宫、宫颈、睾丸、卵巢或前列腺)癌、尿道(例如膀胱或肾)癌、脑和内分泌腺(如甲状腺)癌。在某些实施方式中，癌症选自卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、膀胱癌、肝细胞癌，以及结直肠癌。在某些实施方式中，癌症选自淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和B细胞淋巴瘤。

“药用可接受的”是指所指的载剂、溶媒、稀释剂、辅料和/或盐，总的来说在化学上和/或在物理上与制剂中的其他配料相兼容，并在生理上与接受者相兼容。

抗TIM-3抗体

本申请提供了抗TIM-3抗体及其抗原结合片段，其包含抗TIM-3抗体3402-2.131.17(在本申请中也称为“W3402”)的一个或多个(例如1、2、3、4、5或6个)CDR序列。

本申请中的“W3402”是指具有如SEQ ID NO:7所示的重链可变区和如SEQ ID NO:9所示的κ轻链可变区的大鼠单克隆抗体。

本申请中的“W3402-z3”是指具有如SEQ ID NO:11所示的重链可变区和如SEQ IDNO:13所示的κ轻链可变区的人源化单克隆抗体。

表1示出了这2个抗TIM-3抗体的CDR序列。下文还在表2和表3中提供了重链和轻链可变区序列。

表1.CDR氨基酸序列

表2.可变区氨基酸序列

表3.可变区核酸序列

已知CDR负责抗原结合，然而已发现6个CDR并不都是不可缺少或不可改变的。换言之，可以替换或改变或修饰SEQ ID NO:1-6中的一个或多个CDR，而基本上保持与TIM-3特异性结合的亲和力。

在某些实施方式中，本申请所述的抗TIM-3抗体和抗原结合片段包含如SEQ IDNO:5所示的重链CDR3序列。重链CDR3区位于抗原结合位点的中心，并因此被认为与抗原接触最多，而且对抗体与抗原的亲和力提供最多的自由能。此外还认为重链CDR3由于多种多样化机制在长度、氨基酸组成和构象方面是目前抗原结合位点最多样化的CDR(TonegawaS.，Nature.302:575-81)。重链CDR3的多样化足以产生多数抗体特异性(Xu JL,DavisMM.Immunity.13:37-45)以及所需的抗原结合亲和性(Schier R等，J Mol Biol.263:551-67)。

在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段包含适当的框架区(FR)序列，只要所述的抗体及其抗原结合片段可以特异性地结合至TIM-3即可。表1中所示的CDR序列获取自大鼠抗体，但其可使用本领域公知的合适方法(如重组技术)移植至任何合适物种(如小鼠、人、大鼠、兔以及其他)的任何合适的FR序列。

在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段是人源化的。人源化的抗体或抗原结合片段理想地在人体具有降低的免疫原性。人源化的抗体或其抗原结合片段在其可变区是嵌合的，因为非人CDR序列移植至人或基本上是人的FR序列中。抗体或抗原结合片段的人源化基本上可通过在人免疫球蛋白基因上将非人(如小鼠)CDR基因替换为对应的人CDR基因来完成(参见例如Jones等(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyen等(1988)Science 239:1534-1536)。

可以使用本领域公知的方法选择合适的人重链和轻链可变域，以达到这一目的。在一个示例性的实例中，可以使用最佳拟合的方法，其中对非人(例如啮齿动物)抗体可变域序列进行筛选，或者将其与已知的人可变域序列的数据库进行BLAST比对，并且识别出最接近非人查询序列的人序列，用作用于移植非人CDR序列的人框架(参见例如Sims等(1993)J.Immunol.151:2296；Chothia等(1987)J.Mot.Biol.196:901)。或者，可以将源自所有人抗体的共有序列的框架用于移植非人CDR(参见例如Carter等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285；Presta等(1993)J.Immunol.，151:2623)。

在某些实施方式中，本申请所述的人源化抗体或抗原结合片段除了非人的CDR序列以外，基本上全部由人序列组成。在一些实施方式中，可变区FR和恒定区(如果存在)全部或基本上来自人免疫球蛋白序列。人FR序列和人恒定区序列可以源自不同的人免疫球蛋白基因，例如，FR序列源自一个人抗体，恒定区来自另一个人抗体。在一些实施方式中，人源化抗体或抗原结合片段包含人FR1-4。

在某些实施方式中，本申请所述的人源化抗体及其抗原结合片段包含W3402-z3的一个或多个FR序列。

示例性的人源化抗TIM-3抗体W3402-z3保持针与表达TIM-3的细胞特异性结合的亲和力，并且在这方面至少可与亲本大鼠抗体相当，甚至优于亲本大鼠抗体。示例性的人源化抗体保持其与TIM-3表达细胞(如CD4⁺T细胞)的功能性相互作用，体现在其可以引发活化的CD4⁺T细胞释放细胞因子IFNγ和IL-2，以及部分阻断Treg细胞在CD4⁺T细胞增殖调控中的抑制性功能。

在一些实施方式中，源自人的FR区可以包含与其所源自的人免疫球蛋白相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，人FR的一个或多个氨基酸残基由来自亲本非人抗体的对应残基取代。这在某些实施方式中是需要的，以使人源化抗体或其片段密切接近于非人亲本抗体结构。在某些实施方式中，本申请所述的人源化抗体或抗原结合片段包含在各个人FR序列中不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代，或者在重或轻链可变域的所有FR不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代。在一些实施方式中，这种氨基酸残基的变化可能仅存在于重链FR区、仅存在于轻链FR区，或在两条链上都存在。

在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段包含选自下组的重链可变域序列：SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:11。在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段包含选自下组的轻链可变域序列：SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13。

在一些实施方式中，本申请所述的抗TIM-3抗体和抗原结合片段包含重链可变域的全部或部分，和/或轻链可变域的全部或部分。在一个实施方式中，本申请所述的抗TIM-3抗体和抗原结合片段为由本申请所述的重链可变域的全部或部分组成的单域抗体。这种单域抗体的更多信息可以在现有技术中得到(参见例如美国专利号6,248,516)。

在某些实施方式中，本申请所述的抗TIM-3抗体及其抗原结合片段进一步包含免疫球蛋白恒定区。在一些实施方式中，免疫球蛋白恒定区包含重链和/或轻链恒定区。重链恒定区包含CH1、铰链和/或CH2-CH3区。在某些实施方式中，重链恒定区包含Fc区。在某些实施方式中，轻链恒定区包含Cκ或Cλ。

在一些实施方式中，本申请所述的抗TIM-3抗体及其抗原结合片段具有免疫球蛋白(Ig)，优选地人Ig，优选地人IgG的恒定区。在某些实施方式中，本申请所述的抗TIM-3抗体及其抗原结合片段包括IgG1同种型的恒定区，其可能导致ADCC或CDC，或者IgG4或IgG2同种型的恒定区，其具有减少的或消除的效应功能。可以使用各种测定来评估效应功能，如Fc受体结合测定、C1q结合测定和细胞裂解测定。

本申请所述的抗体和抗原结合片段的结合亲和力可以由K_D值表示，其表示当抗原和抗原结合分子之间的结合达到平衡时解离速率与结合速率的比值(k_off/k_on)。使用本领域公知的合适的方法，包括例如流式细胞术测定，可恰当地确定抗原结合亲和力(例如K_D)。在一些实施方式中，可通过流式细胞术确定不同浓度下抗体与抗原的结合，可首先将确定的平均荧光强度(MFI)对抗体浓度制图，此时通过使用Prism第5版(GraphPad Software，圣地亚哥，CA)，将特异性结合荧光强度(Y)与抗体浓度(X)的相关性拟合至一个位点的饱和公式：Y＝B_max*X/(K_D+X)，可计算出K_D值，其中B_max是指待测抗体与抗原的最大特异性结合。

在一些实施方式中，本申请所述的抗TIM-3抗体及其抗原结合片段能够以不超过5×10^-9M、不超过4×10^-9M、不超过3×10^-9M、不超过2×10^-9M、不超过10^-9M、不超过5×10^-10M、不超过4×10^-10M、不超过3×10^-10M、不超过2×10^-10M、不超过10^-10M、不超过5×10^-11M或不超过4×10^-11M的结合亲和力(K_D)特异性地与人TIM-3结合，所述K_D值通过表面等离子共振(SPR)测定。

在某些实施方式中，本申请所述的抗TIM-3抗体及其抗原结合片段与食蟹猴TIM-3交叉反应。

抗体与人TIM-3的结合还可以用“半最大效应浓度”(EC₅₀)值表示，其是指观察到其最大效应(例如结合或抑制等)的50％时抗体的浓度。EC₅₀值可通过本领域公知的方法测得，例如夹心法(如ELISA、Western印记)、流式细胞术，以及其他结合试验。在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其片段以不超过0.25nM、不超过0.3nM、不超过0.35nM、不超过0.4nM、不超过0.45nM、不超过0.5nM、不超过0.6nM、不超过0.7nM、不超过0.8nM、不超过0.9nM、不超过1nM、不超过1.5nM、不超过2nM、不超过2.5nM或不超过5nM的EC₅₀值(即50％结合浓度)特异性地与人TIM-3结合，所述EC₅₀值通过流式细胞术测定。

在某些实施方式中，抗体及其抗原结合片段以与人TIM-3相似的结合亲和力与食蟹猴TIM-3结合。例如，示例性抗体W3402-z3以与人TIM-3相似的EC₅₀值与食蟹猴TIM-3结合。

在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其片段以不超过0.35nM、不超过0.4nM、不超过0.45nM、不超过0.5nM、不超过0.6nM、不超过0.7nM、不超过0.8nM、不超过0.9nM、不超过1nM、不超过1.5nM、不超过2nM、不超过2.5nM或不超过5nM的EC₅₀值特异性地食蟹猴TIM-3结合，所述EC₅₀值通过流式细胞术测定。

在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其片段具有足以用于诊断和/或治疗用途的与人TIM-3特异结合的亲和力。

在某些实施方式中，本申请所述抗体及其片段抑制TIM-3与其配体结合，并且从而提供生物活性，包括例如诱导由活化的T细胞(如CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞)产生细胞因子，诱导活化的T细胞(如CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞)的增殖，以及逆转Treg细胞的抑制性功能。示例性的细胞因子包括IL-2和IFNγ。术语“IL-2”是指白细胞介素2，免疫系统中的一种调节白血球(例如白细胞)活性的细胞因子信号分子。术语“干扰素gamma(IFNγ)”是由天然杀伤细胞(NK)、NK T细胞、CD4⁺和CD8⁺T细胞产生的细胞因子，其是巨噬细胞的重要活化因子，以及主要组织相容性复合物(MHC)分子表达的诱导因子。细胞因子的产生可以使用本领域公知的方法确定，例如通过ELISA。还可以使用包括[³H]胸腺嘧啶掺入法的方法检测T细胞的增殖。

本申请所述的抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、标记抗体、二价抗体或抗独特型抗体。重组抗体是在体外而不是在动物体内使用重组方法制备的抗体。

抗体变体

本申请所述的抗体及其抗原结合片段还涵盖其多种变体。在某些实施方式中，所述抗体及其抗原结合片段涵盖本申请所述的示例性抗体(即W3402和W3402-z3)的多种变体。

在某些实施方式中，抗体变体在表1所示一个或多个的CDR序列中、一个或多个表2所示的可变区序列中(但不在任何所述CDR序列中)，和/或恒定区(例如Fc区)中包含一个或多个修饰或取代。这些变体保持其亲本与TIM-3特异结合的亲和力，但具有一种或多种所述修饰或取代带来的所需要的特性。例如抗体变体可以具有改进的抗原结合亲和力、提高的产量、改进的稳定性、改进的糖基化模式、减少的糖基化风险、减少的脱氨基作用、减少的或消除的效应功能、改进的FcRn受体结合、提高的药代动力学半衰期、pH敏感性，和/或对缀合的兼容性(例如一个或多个引入的半胱氨酸残基)。

可以使用本领域公知的方法，例如“丙氨酸扫描诱变”，筛选亲本抗体序列以识别合适的或优选的待修饰或取代的残基(参见例如Cunningham和Wells，(1989)Science，244:1081-1085)。简要地说，可以识别靶残基(例如带正电的残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并由不带电的或带负电的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)取代，产生被修饰的抗体，并且针对目标特性对其进行筛选。如果在一个特定的氨基酸位置上的取代表现出了目标功能性改变，则该位置可以被识别为潜在的用于修饰或取代的残基。可以通过用另一种残基(例如半胱氨酸残基、带正电荷的残基等)取代来进一步评估所述潜在的残基。

亲和力变体

亲和力变体可以含有在如表1所示的一个或多个CDR序列中、一个或多个FR序列中，或者表2所示的重链或轻链可变区序列中的修饰或取代。本领域公知，在可变区中CDR区侧接两个FR区，因此本领域的技术人员基于表1中的CDR序列和表2中的可变区序列，可以容易地识别出FR序列。所述亲和力变体保持亲本抗体的与TIM-3特异性结合的亲和力，或者甚至相对于亲本抗体具有改进的与TIM-3特异性结合的亲和力。在某些实施方式中，CDR序列、FR序列或可变区序列中的至少一个(或全部)取代包含保守取代。

本领域技术人员将理解，在表1和表2所示的CDR序列和可变区序列中，一个或多个氨基酸残基可以被取代，而得到的抗体或抗原结合片段仍然保持与TIM-3结合的亲和力，或甚至具有改进的结合亲和力。可以使用本领域公知的各种方法来达到这一目的。例如，可以生成抗体变体库(如Fab或scFv变体)，并用噬菌体展示技术表达，随后针对与人TIM-3结合的亲和力对其进行筛选。又例如，可以使用电脑软件虚拟抗体与人TIM-3的结合，并识别抗体上形成结合界面的氨基酸残基。在取代中可以避开这些残基以防止结合亲和力的降低，或者可以做为取代的靶标以获得更强的结合。

在某些实施方式中，本申请所述的亲和力变体在一个或多个CDR序列和/或一个或多个FR序列中包含一个或多个氨基酸残基取代。在某些实施方式中，亲和力变体在CDR序列和/或FR序列中包含总共不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。

在某些实施方式中，所述抗TIM-3抗体及其抗原结合片段包含1、2或3个与表1中列出的序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性的CDR序列，而同时保持相对于其亲本抗体水平相似或更高的与TIM-3结合的亲和力。

在某些实施方式中，所述抗TIM-3抗体及其抗原结合片段包含一个或多个与表2中列出的序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性的可变区序列，而同时保持相对于其亲本抗体水平相似或更高的与TIM-3结合的亲和力。在一些实施方式中，在选自表2的可变区序列中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入或缺失。在一些实施方式中，所述取代、插入或缺失发生在CDR之外的区(例如在FR)。

糖基化变体

本申请所述的抗TIM-3抗体和抗原结合片段还包含糖基化变体。可以获取该糖基化变体以提高或降低抗体或抗原结合片段糖基化的程度。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含一个或多个带有侧链的氨基酸残基，碳水化合物部分(例如寡糖结构)可以附接至所述侧链。抗体的糖基化通常是N连接的或O连接的。N连接的是指碳水化合物部分附接至天冬氨酸残基的侧链，例如，三肽序列中的天冬氨酸残基，如天冬氨酸-X-丝氨酸和天冬氨酸-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。O连接的糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一的糖附接至羟基氨基酸，最常见的是附接至丝氨酸或苏氨酸。对天然糖基化位点的移除可以方便地完成，例如通过改变氨基酸序列，使得存在于该序列中的上述三肽序列(对于N连接的糖基化位点)或者丝氨酸或苏氨酸残基(对于O连接的糖基化位点)中的一个被取代。用相似的方式，可以通过引入这样的三肽序列或者丝氨酸或苏氨酸残基，产生新的糖基化位点。

半胱氨酸工程化的变体

本申请所述的抗TIM-3抗体和抗原结合片段还涵盖半胱氨酸工程化的变体，其包含一个或多个引入的游离半胱氨酸氨基酸残基。

游离半胱氨酸残基是不作为二硫键的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸工程化的变体可用于通过例如马来酰亚胺或卤乙酰基，在工程化的半胱氨酸的位点与例如细胞毒性和/或成像化合物、标签或放射性同位素，以及其他物质缀合。用于工程化抗体或抗原结合片段以引入游离半胱氨酸残基的方法是本领域公知的，参见例如WO2006/034488。

Fc变体

本申请所述的抗TIM-3抗体和抗原结合片段还包括Fc变体，其包含一个或多个在其Fc区和/或铰链区的氨基酸残基修饰或取代。

在某些实施方式中，所述抗TIM-3抗体或抗原结合片段包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代改进与新生儿Fc受体(FcRn)pH依赖性的结合。这种变体在酸性pH下与FcRn结合，使其得以免于在溶酶体中的降解，并且随后被转移并释放到细胞外，因此，这种变体可具有更长的药代动力学半衰期。工程化的抗体及其抗原结合片段以提高与FcRn的结合亲和力的方法是本领域公知的，参见例如Vaughn,D.等，Structure，6(1):63-73，1998；Kontermann,R.等，Antibody Engineering，第1卷第27章：Engineering of the Fc regionfor improved PK，Springer出版，2010；Yeung,Y.等，Cancer Research，70:3269-3277(2010)；和Hinton,P.等，J.Immunology，176:346-356(2006)。

在某些实施方式中，所述抗TIM-3抗体或抗原结合片段包含一个或多个改变抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的氨基酸取代。在Fc区(例如，在下铰链和/或CH2域)的某些氨基酸残基可被取代以改变(例如，提高、或降低、或消除)ADCC活性。可替代地或额外地，可以改变所述抗体上的碳水化合物结构，以改变(例如，提高、或降低、或消除)ADCC活性。通过抗体工程化改变ADCC活性的方法已经记述于现有技术中，参见例如Shields RL等，J BiolChem.2001.276(9):6591-604；Idusogie EE等，J Immunol.2000.164(8):4178-84；SteurerW.等，J Immunol.1995，155(3):1165-74；Idusogie EE.等，J Immunol.2001，166(4):2571-5；Lazar GA.等，PNAS，2006，103(11):4005-4010；Ryan MC.等，Mol.Cancer Ther.，2007，6:3009-3018；Richards JO.等，Mol Cancer Ther.2008，7(8):2517-27；Shields R.L.等，J.Biol.Chem，2002，277:26733-26740；Shinkawa T.等，J.Biol.Chem，2003，278:3466-3473；以及Oganesyan V.等，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.2008,64:700-704；Chu SY等，Mol Immunol.2008,45:3926-3933。

可以采用不同组的取代来消除IgG1效应功能。例如，L234F/L235E/P331S可以显著降低IgG1-Fc与C1q、CD64、CD32A和CD16之间的结合(Oganesyan V.等，Acta Crystallogr DBiol Crystallogr.2008,64：700-704)。此外，IgG1-Fc携带^236R/L238R修饰，其具有除了L328R之外还在位置236之后插入Arg，显示出IgG1-Fc与Fcγ受体的结合活性显著降低(ChuSY.等，Mol Immunol.2008,45:3926-3933)。

在某些实施方式中，所述抗TIM-3抗体或抗原结合片段包含一个或多个改变补体依赖的细胞毒性(CDC)的氨基酸取代，例如通过增强或减弱C1q结合和/或CDC(关于其他Fc区变体的实例，参见例如WO99/51642；Duncan&Winter Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO94/29351)。

在某些实施方式中，所述抗TIM-3抗体或抗原结合片段包含人IgG4恒定区，其中改变第228个氨基酸残基，例如Ser228Pro(S228P其可能阻止或减少链交换)，和/或改变第235个氨基酸残基，例如Leu235Glu(L235E，其可能改变Fc受体相互作用)。

在某些实施方式中，所述抗TIM-3抗体或抗原结合片段包含人IgG1恒定区，其中改变第234、235或331位的氨基酸残基，例如，以引入L234F、L235E和/或P331S的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方式中，所述抗TIM-3抗体或抗原结合片段包含人IgG1恒定区，其中除了L328R之外还将Arg插入位置236之后。

在某些实施方式中，所述抗TIM-3抗体或抗原结合片段包含一个或多个位于Fc区界面的氨基酸取代，以便于和/或促进异二聚体化。这些修饰包含在第一Fc多肽中引入突起，以及第二Fc多肽中引入空洞，其中所述突起可位于所述空洞内，以促进所述第一和第二Fc多肽的相互作用，以形成异二聚体或复合体。生成具有这些修饰的抗体的方法是本领域公知的，例如，如美国专利号5,731,168所述。

抗原结合片段

本申请还提供抗TIM-3抗原结合片段。抗原结合片段的多种类型是本领域公知的，并且可基于本申请所述的抗TIM-3抗体进行研发，包括例如其CDR和可变序列示于表1和表2的示例性抗体，及其不同的变体(如亲和力变体、糖基化变体、Fc变体、半胱氨酸工程化抗体等等)。

在某些实施方式中，本申请所述的抗TIM-3抗原结合片段是骆驼化单域抗体(camelized single chain domain antibody)、双功能抗体(diabody)、单链Fv片段(scFv)、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)₂、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')₂、双功能抗体(dsdiabody)、纳米抗体、域抗体、单域抗体或双价域抗体。

多种技术可用于这种抗原结合片段的生产。示例性的方法包括对完整抗体进行酶消化(参见例如Morimoto等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)；以及Brennan等，Science，229:81(1985))、由宿主细胞(如大肠杆菌)重组表达(例如对于Fab、Fv和ScFv抗体片段)、如上文讨论的噬菌体展示文库筛选(例如对于ScFv)，以及化学耦合两个Fab'-SH片段以形成F(ab')₂片段(Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992))。生产抗体片段的其它技术对于本领域技术人员将是显而易见的。

在某些实施方式中，所述抗原结合片段是scFv。scFv的生成记述于例如WO 93/16185；美国专利号5,571,894；和5,587,458。scFv可以在氨基末端或羧基末端与效应蛋白融合以获得融合蛋白(参见例如Antibody Engineering，Borrebaeck编)。

缀合物

在某些实施方式中，所述抗TIM-3抗体及其抗原结合片段进一步包含缀合物部分。所述缀合物部分可以连接至所述抗体及其抗原结合片段。缀合物部分是可以附接至所述抗体或其抗原结合片段的非蛋白质部分。可以设想，本发明中的抗体或其抗原结合片段可与多种缀合物部分连接(见例如"Conjugate Vaccines"，Contributions to Microbiologyand Immunology，J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr.(编)，Carger Press，纽约(1989))。这些缀合物部分可以通过共价结合、亲和结合、嵌入、协同结合(coordinate binding)、络合、结合、混合或加入等其他方式与所述抗体或抗原结合片段连接。

在某些实施方式中，本发明公开的抗体和抗原结合片段可以工程化以在表位结合部分之外含有特定位点，所述特定位点可以用于与一个或多个缀合物部分结合。例如，该位点可以包含一个或多个反应性的氨基酸残基(例如半胱氨酸或组氨酸残基)，以便于与缀合物部分的共价连接。

在某些实施方式中，抗体可间接连于缀合物部分，或通过另一个缀合物部分相连。例如，所述抗体或其抗原结合片段可结合生物素，然后间接结合第二个缀合物部分，其与亲和素相连。所述缀合物部分可以是清除调节剂、毒素(例如化疗剂)、可检测标记(例如放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记或酶底物标记)或纯化部分。

“毒素”可以是对细胞有害的或可能损坏或杀死细胞的任何试剂。毒素的示例包括但不限于，紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴)、烷化剂(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))、抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)、拓扑异构酶抑制剂，以及微管蛋白粘合剂。

可检测的标记的示例可以包括荧光标记(例如荧光素、罗丹明、丹酰、藻红蛋白或德克萨斯红)、酶-底物标记物(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S、³H、¹¹¹In、¹¹²In、¹⁴C、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、²¹¹At、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹²Bi、and ³²P、其他镧系元素)、发光标记、发色基团、地高辛、生物素/亲和素、用于检测的DNA分子或金。

在某些实施方式中，所述缀合部分可以是帮助增加抗体半衰期的清除调节剂。说明性的示例包括水溶性聚合物，如PEG、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇共聚物等等。聚合物可以是任意分子量的，并且可以是支链的或非支链的。附接至抗体的聚合物的数量可以不同，而且如果附接了多于一个聚合物，其可以是相同或不同的分子。

在某些实施方式中，所述缀合部分可以是纯化部分，如磁珠。

在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段用作缀合部分的基底。

多核苷酸和重组方法

本申请提供了编码抗TIM-3抗体和其抗原结合片段的分离的多核苷酸。

本申请所用的术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的多核苷酸，其具有与参照核酸相似的结合性质并且以与天然核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则特定多核苷酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生这样的序列来实现：其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(参见Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。

在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸包含一个或多个如SEQ ID NO:8、10、12和/或14所示的核酸序列，和/或与之具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性的同源序列，和/或仅具有简并替代的变体，并且编码如本申请所述的示例性抗体。编码所述单克隆抗体的DNA可以通过常规的方法分离和测序(例如可以使用寡核苷酸探针，该探针可特异性与编码所述抗体的重链和轻链的基因结合)。所述编码DNA也可以通过合成的方法获得。

使用本领域公知的重组技术，可以将包含编码所述抗-TIM-3抗体和其抗原结合片段的多核苷酸(例如包含表3所示的序列)引入载体用于克隆(扩增DNA)或基因表达。多种载体可供选择。载体组分通常包括，但不限于，以下的一种或多种：信号序列、复制起始点、一种或多种标记基因、增强序列、启动子(例如：SV40、CMV、EF-1α)和转录终止序列。

本申请提供的载体(例如表达载体)含有本申请所述的编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸序列、至少一个可操作地连接至所述核酸序列的启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)，以及至少一个选择标记。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。

可以将包含编码所述抗体和其抗原结合片段的多核苷酸的载体引入宿主细胞用于克隆或基因表达。本发明中适用于克隆或表达所述载体中的DNA的宿主细胞为原核细胞、酵母或上述高级真核细胞。适用于本发明用途的原核细胞包含真细菌如，革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，例如，肠杆菌科，如，大肠杆菌，肠杆菌属，欧文氏菌属，克雷白氏杆菌属，变形杆菌属，沙门氏菌属，如，鼠伤寒沙门(氏)杆菌，沙雷氏菌属，如，粘质沙雷氏菌，以及志贺氏菌属，及杆菌属如，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，假单胞菌如，绿脓杆菌和链霉菌。

除了原核细胞以外，真核微生物如丝状真菌或酵母也可作宿主细胞克隆或表达编码抗TIM-3抗体的载体。酿酒酵母，或面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。但是，许多其他属、种和株都比较常用且在本发明中适用，如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母属宿主如，乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(ATCC 16,045)、魏氏克鲁维酵母(ATCC 24,178)、克鲁雄酵母(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母；解脂耶氏酵母(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(EP183,070)；假丝酵母；里氏木霉(EP 244,234)；链孢霉；西方许旺酵母，如：西方许旺酵母；和丝状真菌，如：脉孢菌、青霉菌、弯颈霉和曲霉菌，如：钩巢曲霉和黑曲霉。

本发明中提供的适用于表达糖基化抗体或其抗原结合片段的宿主细胞由多细胞生物衍生得到。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已发现多种杆状病毒株(baculoviral strains)及其变体以及对应的许可性昆虫宿主细胞(permissive insecthost cells)，来自于诸如以下的宿主：草地夜蛾(毛虫)、埃及斑蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)及家蚕。多种用于转染的病毒株为公众可得，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒的Bm-5变种，这些病毒都可在本发明中使用，特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛花、西红柿和烟草的植物细胞培养也可用作宿主。

但是，最感兴趣的是脊椎细胞，且脊椎细胞的培养(组织培养)已经成为常规操作。可用的哺乳动物宿主细胞实例有，SV40转化的猴肾细胞CV1系(COS-7,ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(293或悬浮培养的293细胞亚克隆，Graham等，J.Gen Virol.36:59(1977))；幼地鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；及人肝癌细胞系(Hep G2)。在某些优选的实施方式中，所述宿主细胞是293F细胞。

用上述的可产生抗TIM-3抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并将其在常规的营养培养基中培养，所述营养培养基经修饰后适宜于诱导启动子、选择转化细胞或扩增编码目的序列的基因。在另一实施方式中，所述抗体可通过本领域公知的同源重组的方法制得。

本发明中用于产生所述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售的培养基如Ham's F10(Sigma)、最低基本培液(MEM，(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)及Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)，Sigma)可用于培养所述宿主细胞。另外，任何在Ham等，Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利申请Re.30,985中说明的培养基都可以用作所述宿主细胞的培养基。这些培养基都可添加必要的激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、氯化钙、氯化镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷酸和胸腺嘧啶)、抗生素(如庆大霉素)、微量元素(定义为终浓度通常在微摩尔范围无机化合物)，和葡萄糖或与之等同的能量源。所述培养基还可含有本领域公知的适当浓度的任何其他必要的添加剂。所述培养基的条件，如温度、pH值等类似条件，为选择用于表达的宿主细胞此前所使用的条件，为普通技术人员所熟知。

在使用重组技术时，所述抗体可在胞内、壁膜空间生成，或直接分泌到培养基中。如果所述抗体在胞内生成，首先除去宿主细胞或裂解片断的颗粒残骸，例如，可通过离心或超声的方法。Carter等，Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了将分泌到大肠杆菌壁膜空间的抗体分离的方法。简要地说，在醋酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲磺酰氟(PMSF)存在的条件下化开细胞糊(cell paste)约30分钟以上。离心除去细胞碎片。如所述抗体分泌到培养基中，则通常首先使用市售的蛋白浓度过滤器，如Amicon或Millipore Pelliconultrafiltration unit，浓缩该表达系统的上清液。在任何前述的步骤中都可加入蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白降解，以及抗生素以防止偶然污染物的生长。

从所述细胞中制得的抗体可采用纯化方法进行纯化，例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱柱、硫酸铵沉淀、盐析以及亲和色谱，其中亲合色谱为优选的纯化技术。

在某些实施方式中，使用固定在固相上的蛋白A用于对所述抗体和抗原结合片段进行免疫亲和纯化。所述抗体的种类以及所述抗体中存在任何免疫球蛋白的Fc结构域决定了蛋白A作为亲和配体是否适合。蛋白A可用于纯化基于人γ1，γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G适用于所有鼠源异构体和人γ3(Guss等，EMBO J.5:1567 1575(1986))。琼脂糖是最常用的亲和配体附着基质，但也可选用其他基质。机械力稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯与用琼脂糖相比可实现更快的流速和更短的处理时间。如该抗体含有CH3结构域，则可用Bakerbond ABX^TM树脂进行纯化(J.T.Baker，新泽西菲利普斯堡)。也可根据需要获得的抗体确定其他蛋白纯化的技术，如离子交换柱中的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、基于阴离子或阳离子交换树脂的肝素琼脂糖凝胶色谱(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀。

在任意初步纯化步骤之后，可用低pH疏水相互作用色谱的方法处理含有感兴趣的抗体和杂质的混合物，用pH约2.5-4.5的洗涤缓冲液，优选地在低盐浓度下进行(例如，从约0到0.25M盐浓度)。

药物组合物和治疗方法

本申请进一步提供了包含所述抗-TIM-3抗体或其抗原结合片段的药物组合物和一个或多个药学上可接受的载剂。

用在本申请公开的药物组合物中的药用可接受载剂可包含，例如，药用可接受的液体、凝胶或固体载剂、水相介质、非水相介质、抗微生物物质、等渗物质、缓冲液、抗氧剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、螯合剂、稀释剂、佐剂、辅料或无毒辅助物质，其他本领域公知的组分或以上的多种组合。

适用的组分可包括，例如，抗氧剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、搅味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂例如糖和环糊精。适用的抗氧剂可包括，例如，甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘油、巯基乙酸、巯基山梨醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本发明所公开，在一种含有本发明公开的抗体或其抗原结合片段的组合物中包括一种或多种抗氧剂如甲硫氨酸，可将降低所述抗体或其抗原结合片段的氧化。对氧化作用的减少可防止或减少结合亲和力的降低，从而提高抗体稳定性并延长保质期。因此，在某些实施方式中，本发明提供的组合物中含有一种或多种所述的抗体或其抗原结合片段以及一种或多种抗氧剂例如甲硫氨酸。本发明进一步提供了多种方法，通过将本发明中提供的抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧剂混合，例如甲硫氨酸，可防止所述抗体或其抗原结合片段氧化、延长其保质期和/或提高其活性。

进一步的说，药用可接受的载剂可包含，例如，水相介质如氯化钠注射液、林格氏液注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、或葡萄糖和乳酸林格注射液、非水介质例如：植物来源的不挥发性油、棉花子油、玉米油、芝麻油、或者花生油、细菌抑制或真菌抑制浓度下的抗菌物质、等渗剂如：氯化钠或葡萄糖、缓冲液如：磷酸盐或枸橼酸酸盐缓冲液，抗氧化剂如：硫酸氢钠，局部麻醉剂如：盐酸普鲁卡因，助悬剂和分散剂如：羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如：聚山梨醇酯80(吐温-80)、螯合试剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。作为载剂的抗菌剂可加入多次剂量容器中的药物组合物中，其包含酚类或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯代丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷铵和氯苯乙铵。适用的辅料可包含，例如，水、盐、葡萄糖、甘油或乙醇。适用的无毒辅助物质可包含，例如，乳化剂、pH值缓冲剂、稳定剂、增溶剂，或者醋酸钠、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或者环糊精之类的物质。

所述药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、丸剂、胶囊、片剂、持续释放制剂或粉末。口服制剂可以包含标准载体如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

在某些实施方式中，所述药物组合物被制剂成可注射的组合物。可注射的药物组合物可以任何常规的形式制备，例如，液体溶剂、悬浮剂、乳化剂或适用于产生液体溶剂、悬浮剂或乳化剂的固体形式。注射制剂可包含现用的无菌和/或无热原溶液、使用前现与溶剂结合的无菌干燥的可溶物，如冻干粉，包含皮下片、注射即用的无菌悬浮剂、使用前现与介质结合的无菌干燥不溶产品，和无菌和/或无热原的乳剂。溶剂可以为水相或非水相。

在某些实施方式中，单位剂量的注射制剂包装在一个安瓿、一支管或一支带有针的针筒中。本领域习知，所有注射给药的制剂应为无菌无热原。

在某些实施方式中，通过将本申请公开的抗体或其抗原结合片段溶解于某适当的溶剂中可制备无菌冻干的粉末。所述溶剂可含有一种可提高粉或由粉末制得的重组溶液的稳定性，或改善粉末或重组溶液的其他药理组分。适用的辅料包含，但不限于，水、葡萄糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他适用的物质。溶剂可含有缓冲液，如枸橼酸缓冲液、磷酸钠或磷酸钾缓冲液或其他本技术熟练人员公知的缓冲液，在一种实施方式中，缓冲液的pH为中性。在本领域公知的标准条件下进行对所述溶解进行随后的过滤除菌，然后冻干制得理想的制剂。在一种实施方式中，将所得的溶剂分装至小管中冻干。每支小管可容纳单次剂量或多次剂量的所述抗TIM-3抗体或其抗原结合片段或其组合物。每支小管中的装入量可略微高于每次剂量所需或多次剂量所需(例如10％过量)，从而保证取样精确和给药精确。冻干粉可在适当的条件下储存，如在约4℃到室温范围。

用注射用水将冻干粉重溶得到用于注射给药的制剂。在一种实施方式中，可将冻干粉加至无菌无热原水或其他适用的液体载剂中重溶。精确的量由选择的疗法决定，可根据经验值决定。

使用方法

本申请还提供了治疗方法，包含将治疗有效量的本申请所述的抗体或其抗原结合片段施用给需要其的个体，由此治疗或预防与TIM-3相关的状况或病症。在一些实施方式中，所述与TIM-3相关的状况或病症是癌症、自体免疫疾病、炎性疾病或感染性疾病。在一些实施方式中，所述与TIM-3相关的状况或病症是实体肿瘤。

癌症的实例包含但不限于癌症为淋巴瘤、膀胱癌、骨癌、脑与中枢神经系统癌、乳腺癌、子宫或子宫内膜癌、直肠癌、食道癌、头颈癌、肛门癌、胃肠癌、上皮内肿瘤、肾癌、白血病、肝癌、肺癌(例如非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、黑色素瘤、骨髓瘤、胰腺癌、前列腺癌、恶性肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、外阴癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、阴茎癌、儿童实体肿瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、垂体腺瘤或表皮样癌。

自体免疫疾病的实例包含但不限于获得性免疫缺陷综合征(AIDS，其为具有自体免疫成分的病毒疾病)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、乳糜泻乳糜性皮炎；慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、CREST综合征、克罗恩氏病、德哥斯病、幼年皮肌炎、盘状狼疮、原发性混合冷球蛋白血症、纤维肌痛性纤维肌炎、Graves病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、幼年型慢性关节炎(斯蒂尔病)、幼年类风湿性关节炎、梅尼埃氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、顽固性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、牛皮癣关节炎、雷诺现象、莱特尔氏综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性系统性硬化症(PSS)，又称系统性硬化症(SS))、干燥综合征、全身肌强直综合征、系统性红斑狼疮、高安动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风和韦格纳肉芽肿病。

炎性疾病包含例如慢性和急性炎性疾病。炎性疾病的示例包含阿尔茨海默病、哮喘、特应性变态反应、过敏、动脉粥样硬化、支气管哮喘、湿疹、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、溶血性贫血、骨关节炎、脓毒病、中风、组织和器官移植、血管炎、糖尿病性视网膜病变和呼吸机所致肺损伤。

感染性疾病的示例包含但不限于真菌感染、寄生虫/原生动物感染或慢性病毒感染，例如疟疾、球孢子菌病、组织胞浆菌病、甲真菌病、曲霉病、芽生菌病、白色念珠菌病、副球孢子菌病、微孢子虫病、棘阿米巴角膜炎、阿米巴病、蛔虫病、巴贝斯虫病、小袋虫病、贝利斯虫病、美洲锥虫病、华支睾吸虫病、锥蝇病、隐孢子虫病、裂头绦虫病、龙线虫病、棘球蚴病、象皮肿、蛲虫病、片形吸虫病、姜片吸虫病、丝虫病、贾第虫病、颌口线虫病、膜壳绦虫病、等孢子球虫病、钉螺热、利什曼病、莱姆病、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、疥疮、血吸虫病、昏睡病、圆线虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形虫病、旋毛虫病、鞭虫病、锥虫病、蠕虫感染、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、疱疹病毒,EB病毒、HIV、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、人乳头瘤病毒、腺病毒、人类免疫缺陷病毒I,人类免疫缺陷病毒II、卡波西西肉瘤相关疱疹病毒流行病、薄环病毒(指环病毒)、人T淋巴营养性病毒I型人T淋巴营养性病毒II型、水痘带状疱疹、JC病毒或BK病毒的感染。

本申请中提供的抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量依赖于本领域公知的多种因素，例如体重、年龄、过往病史、现用治疗、对象的健康状况和交叉感染的潜力、过敏、超敏和副作用，以及给药途径和疾病发展的程度。本领域熟练人员(例如医生或兽医)可根据这些或其它条件或要求按比例降低或升高剂量。

在某些实施方式中，本发明提供的抗体或其抗原结合片段可在治疗有效剂量约0.01mg/kg到约100mg/kg之间给药。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以约50mg/kg或更少的剂量给药，在某些实施方式中，给药剂量为10mg/kg或更少、5mg/kg或更少、3mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少或0.1mg/kg或更少。某特定剂量可在多个间隔给药，例如每天一次、每天两次或更多、每月两次或更多、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次或每两月或更多月一次。在某些实施方式中，给药剂量可随治疗进程变化。例如，在某些实施方式中，初始给药剂量可比后续给药剂量高。在某些实施方式中，给药剂量在治疗进程中根据给药对象的反应进行调整。

给药方案可通过调整达到最优反应(如治疗反应)。例如，可进行单剂量给药或在一段时间分多个分隔的剂量给药。

本发明中公开的抗体和抗原结合片段可通过本领域公知的给药方式给药，例如注射给药(如，皮下注射、腹腔注射、静脉注射，包含静脉滴注，肌肉注射或皮内注射)或非注射给药(如，口服给药、鼻腔给药、舌下给药、直肠给药或外用给药)。

在一些实施方式中，本发明公开的抗体和抗原结合片段可单独给药或与一种或多种其他治疗手段或物质联合给药。例如，本发明公开的抗体和抗原结合片段可与另一种治疗剂，例如化疗剂或抗癌药联合施用。

在某些这样的实施方式中，本发明公开的抗体和抗原结合片段与一种或多种上述治疗物质联用时，可与所述的一种或多种治疗物质同时给药，在某些这样的实施方式中，所述的抗体和抗原结合片段可作为同一个药物组合物的一部分同时给药。但是，与其他治疗物质“联用”的抗体和抗原结合片段不需要同时给药或与该治疗物质在同一组合物中给药。本发明中“联用”的含义还包含在另一个治疗物质之前或之后给药的抗体和抗原结合片段也被认为是与该治疗物质“联用”，即使所述抗体或其抗原结合片段与第二种物质通过不同给药方式给药。在可能的情况下，与本发明公开的抗体或其抗原结合片段联用的其他治疗物质可参照该其他治疗物质的产品说明书的方法用药，或参照外科医生的案头参考书2003(Physicians'Desk Reference，57th Ed；Medical Economics Company；ISBN:1563634457；第57版(2002年11月))，或参照其他本领域公知的方法。

本申请进一步提供了使用所述抗TIM-3抗体或其抗原结合片段的方法。

在一些实施方式中，本申请提供了检测样品中TIM-3的存在或含量的方法，其包含将所述样品与所述抗体或其抗原结合片段接触，以及确定样品中TIM-3的存在或含量。

在一些实施方式中，本申请提供了诊断在个体中与TIM-3相关的疾病或状况的方法，其包含：a)将获取自所述个体的样品与所述抗体或其抗原结合片段接触；b)确定在所述样品中TIM-3的存在或含量；和c)将所述TIM-3的存在与所述个体中的所述与TIM-3相关的疾病或状况相关联。

在一些实施方式中，本申请提供了试剂盒，所述试剂盒包含本申请所述的抗体或其抗原结合片段，任选地与可检测部分缀合。所述试剂盒可以用于检测TIM-3或诊断TIM-3相关的疾病。

在一些实施方式中，本申请还提供了本申请所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗个体中的与TIM-3相关的疾病或状况的药物中的用途，在制备用于诊断TIM-3相关的疾病或状况的诊断试剂中的用途。

优势

本申请所述的抗体在许多方面优于现有的疗法。例如，本申请所述的抗体优于现有的TIM-3抗体，体现在本申请所述的抗体在人MLR测定中表现出更好的调节T细胞功能的体外效力，特异性地与人TIM-3蛋白结合而无跨家族反应，并且高效调节免疫应答。

以下实施例旨在更好地说明本发明，且不应理解为限制本发明的范围。所有下述的特定组合物、材料和方法，其整体或部分，都在本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不是为了限制本发明，而只是为说明特定的实施方式在本发明的范围内。本领域熟练技术人员可不添加创造性及不偏离本发明范围而开发出等同的组合物、材料和方法。应理解，在对本发明的方法作出的多种改动可以仍然包含在本发明范围内。发明人意在将这样的变动包含在本发明的范围内。

实施例

实施例1：杂交瘤抗体的产生

1.研究材料的制备

1.1抗原：编码截短的(ECD和跨膜的)或全长人TIM-3(NM 032782.3)、小鼠TIM-3(NM 134250.2)和食蟹猴TIM-3(EHH54703.1)的DNA序列由Sangon Biotech(上海，中国)合成，然后亚克隆到C末端具有不同标签(如6xhis、AVI-6xhis、人Fc或小鼠Fc)的修饰的pcDNA3.3表达载体中。

用纯化的表达载体转染Expi293细胞。将细胞培养5天，收集上清液，用Ni-NTA柱、蛋白A柱或蛋白G柱进行蛋白质纯化。获得的人TIM-3.ECD.MBPAVIHIS、小鼠TIM-3.ECD.mFc通过SDS-PAGE和SEC进行分析，然后在-80℃下储存。

1.2基准(BMK)抗体：现存的抗TIM-3抗体用作基准抗体。这些抗体包括：W340-BMK4(美国专利号US9605070中公开为ABTIM3)和W340-BMK6(US20160200815中公开为mAb15)。编码W340-BMK4和W340-BMK6可变区的DNA序列在Sangon Biotech(上海，中国)合成，然后分别亚克隆到具有小鼠IgG1和人IgG4(S228P)恒定区的修饰的pcDNA3.3表达载体中。

将含有VH和VL基因的质粒共转染到Expi293细胞中。将细胞培养5天，收集上清液，用蛋白A柱或蛋白G柱进行蛋白质纯化。获得的抗体通过SDS-PAGE和SEC进行分析，然后在-80℃下储存。

1.3稳定细胞系：采用Lipofectamine 2000，用含有编码全长人TIM-3、小鼠TIM-3或食蟹猴TIM-3的基因的表达载体转染CHO-K1或293F细胞。在含有适当选择标记的培养基中培养细胞。在有限稀释后选择人TIM-3高表达稳定细胞系(W340-CHO-K1.hPro1.G2)、低表达稳定细胞系(W340-CHO-K1.hPro1.H1)和小鼠TIM-3高表达稳定细胞系(W340.CHO-K1.mPro1.D3)、食蟹猴TIM-3高表达稳定细胞系(W3-293F.cynoPro1.FL-17)，低表达稳定细胞系(W340-293F.cynoPro1.FL-4)。

根据制造商的说明，通过SE Cell Line

X试剂盒使用质粒IL-2PLuc转染Jurkat E6-1细胞。转染后48小时，将潮霉素加入细胞培养物中以选择IL-2P Luc稳定转染的Jurkat E6-1细胞(Jurkat E6-1.IL-2P)。然后使用相同的方法将含有全长hTIM-3的质粒转染到Jurkat E6-1.IL-2P细胞中。转染后48小时，将杀稻瘟菌素S加入到细胞培养物中以形成Jurkat E6-1.IL-2P.hTIM-3的稳定细胞库。通过有限稀释获得稳定的细胞系。

2.杂交瘤的产生

2.1免疫：每周通过足垫和皮下轮流注射溶于佐剂的25μg/只动物的W340-hPro1.ECD.mFc或25μg/只动物W340-mPro1.ECD.hFc，来免疫6-8周龄的SD大鼠。

2.2血清效价检测：在第4次免疫后，每两周收集血清样品，通过ELISA测定血清中的抗hTIM-3和抗mTIM-3抗体滴度。简言之，稀释的大鼠血清(首先1:100，随后在2％BSA/PBS中3倍稀释)在涂覆有hTIM-3.ECD.His或mTIM-3.ECD.His的平底板中孵育两个小时并洗清后，加入山羊抗大鼠IgG-Fc-HRP作为二抗。通过加入100μL TMB底物来显色，随后用100μL的2N HCl终止反应。在450nM处使用微孔板分光光度计读取吸光度。

2.3杂交瘤产生：当血清抗体滴度足够高时，最后用不含佐剂的溶于D-PBS中的人和小鼠TIM-3ECD蛋白对大鼠进行加强免疫。融合当天，在无菌条件下从经免疫的大鼠中移除淋巴结和脾，并且制备为单细胞悬液。随后将分离的细胞与骨髓瘤细胞SP2/0以1:1的比例混合。依照制造商的使用说明，使用BTX 2001电促细胞操作器进行电促细胞融合。随后将细胞以1×10⁴细胞/孔的密度接种到96孔板中，并且在37℃，5％CO₂下培养直至筛选。

2.4抗体筛选和亚克隆：通过mirrorball使用表达人TIM-3的细胞的结合测定作为检测杂交瘤上清与人TIM-3的结合的初次筛选方法。简言之，将杂交瘤上清样品、阳性对照和阴性对照加入384孔板，并且与人TIM-3转染细胞(W340.CHO-K1.hPro1.G2)共孵育。使用山羊抗大鼠IgG Fc PE抗体测定抗hTIM-3抗体与细胞的结合。MFI≥100的样品认为是阳性的hTIM-3结合剂(NC：-15～10)。

为了证实初筛结果，使用W340.CHO-K1.hPro1.G2，通过FACS进一步检测阳性杂交瘤细胞系，如下所述：将杂交瘤上清加至细胞，通过Alexa647标记的山羊抗大鼠抗体检测大鼠抗体至细胞表面上的结合。通过流式细胞仪评估MFI并且通过FlowJo分析。使用结合至亲本CHO-K1细胞的抗体作为阴性对照。

通过初次和确认筛选验证了特异性结合之后，通过使用半固体培养基法亚克隆阳性杂交瘤细胞，以得到单克隆抗hTIM-3抗体。通过如上所述的结合ELISA和FACS方法确定针对人TIM-3的阳性克隆。收集所选单克隆的耗尽上清液用于纯化。

3.杂交瘤测序及抗体人源化

3.1杂交瘤细胞测序：通过使用RNeasy Plus微型试剂盒，自单克隆杂交瘤细胞分离总RNA。如下制备第一链cDNA：

cDNA扩增反应(20μL)

cDNA扩增反应条件

	步骤1	步骤2	步骤3	步骤4
					温度(℃)	25	50	85	4
时间	10分钟	50分钟	5分钟	∞

以cDNA为模板，使用与Ig可变序列的上游信号序列编码区互补的3’恒定区简并引物和5’简并引物组的扩增抗体的VH和VL基因。PCR反应如下进行：

PCR反应体系(50μL)

组分	含量
		cDNA	2.0μL
Premix Ex Taq	25μL
		5’-简并引物组(10pM)	2.5μL
3’-恒定区简并引物组(10pM)	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	19.5μL

PCR反应条件

将PCR产物(10μL)连接到pMD18-T载体中，并将10μL连接产物转导入Top10感受态细胞。将转导的细胞铺在2-YT+Cab平板上，并在37℃下孵育过夜。随机挑取15个阳性克隆采用Biosune进行测序。

3.2嵌合抗体的构建(W3402-x)

通过PCR扩增TIM-3杂交瘤抗体的VH和VL。用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。将VL和VH依次克隆到含有人IgG4Fc的pCI载体中。得到的表达嵌合抗体W3402-x的构建体包含W3402的可变区和人IgG4的恒定区。

一旦通过测序验证了插入的VL和VH的序列，含有嵌合TIM-3抗体的完整IgG序列的表达载体用于瞬时生产。

3.3人源化

使用“最佳拟合(Best Fit)”方法对W3402的轻链和重链进行人源化。将VH和VL的氨基酸序列与公司内部的人种系V-基因数据库比对。人源化的VH和VL的第一序列来源于使用Kabat CDR定义，将命中最高的人CDR序列替换为W3402的CDR序列。使用扩展的CDR定义来定义框架，其中Kabat CDR1在N末端延长5个氨基酸。对于重链，通过基于第一人源化VH序列增加回复突变，另产生16条序列。

人源化基因经回译、用于哺乳动物表达的密码子优化，通过GENEWIZ合成，构建至WuXi Biologics专有的表达载体中，并且使用293F或Expi-293F细胞表达。通过使用SPR进行的K_off排序，比较人源化变体(表5)与hTIM-3)和嵌合抗体与hTIM-3(见表4)的结合亲和力。

表4示出了亲本嵌合抗体W3402-x与人TIM-3结合的完全动力学结合亲和力，其通过SPR测定。

靶标	抗体	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
					hTIM-3.ECD.his	亲本嵌合的W3402-x	2.26E+06	2.12E-05	9.37E-12

表5示出了人源化的变体W3402-z3的人源化得分分析。

3.4 K_off排序：将人源化变体、亲本嵌合抗体，以及阴性对照注入预涂覆有抗人IgG的传感器芯片(GLM)。洗涤芯片以获取稳定的基线，随后以100μL/分钟的流速将分析物W340-hPro1.ECD.His注入芯片，样品结合时间为100秒，随后的解离时间为2400秒(参见表6)。

表6示出了人源化变体W3402-z3的K_off排序结果。

类别	抗体名称	kd(1/s)
			亲本xAb	嵌合的W3402-x	1.95E-06
人源化变体	W3402-z3	<1.00E-06

PTM去除

位于W3402-z3的VH-CDR3中具有潜在的异构化位点“DG”。通过在潜在的PTM位点引入直接突变来去除PTM。然而，所有去除PTM的变体均显示出显著的结合亲和力丧失，这表明该位点对抗体/抗原相互作用是很关键的。

实施例2：体外表征

1.通过表面等离子共振(SPR)测定与人TIM-3结合的完全动力学结合亲和力：将W3402-z3注入预涂覆有抗人IgG的传感器芯片(CM5)。洗涤芯片以获取稳定的基线，随后以30μL/分钟的流速，将不同浓度的分析物人TIM-3以及运行缓冲液注入芯片，样品结合时间为180秒，随后的解离时间为2400秒。使用ProteOn软件将结合和解离曲线拟合至1:1Langmiur结合模型(参见表7)。

表7示出了人源化变体W3402-z3(其被选为用于完整表征的终选抗体)与人TIM-3结合的完全动力学结合亲和力，其通过SPR测定。

靶标	抗体	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
					hTIM-3.ECD.his	W3402-z3	2.41E+06	1.01E-04	4.21E-11

2.通过表面等离子共振(SPR)测得的与食蟹猴TIM-3结合的完全动力学结合亲和力：用食蟹猴TIM-3.ECD蛋白预涂覆传感器芯片(CM5)。以30μL/分钟的流速将不同浓度的W3402-z3注入传感器芯片，样品结合时间为200秒，随后的解离时间为2400秒。使用Biacore8K软件将结合和解离曲线拟合至1:1动力学模式(表8)。

表8示出了W3402-z3与食蟹猴TIM-3结合的完全动力学结合亲和力，其通过SPR测定。

3.人TIM-3结合(FACS)：将不同浓度的W3402-z3、阳性和阴性对照加至表达hTIM-3的转染细胞，随后通过PE标记的山羊抗人IgG-Fc抗体检测结合至细胞表面上的抗体。细胞的MFI通过流式细胞仪测量并且通过FlowJo分析。

人源化W3402-z3在人TIM-3转染细胞上的结合如图1A所示。抗体可以与细胞表面人TIM-3牢固结合，EC₅₀为0.23nM

4.跨物种结合(FACS)：通过FACS测定TIM-3抗体与食蟹猴TIM-3的结合。将不同浓度的W3402-z3、阳性和阴性对照加至表达食蟹猴TIM-3的转染细胞，随后通过PE标记的山羊抗人IgG-Fc抗体检测结合到细胞表面上的抗体。细胞的MFI通过流式细胞仪测量并且通过FlowJo分析。图1B表明抗体与食蟹猴TIM-3牢固结合，EC₅₀为0.32nM。

5.静息和活化人CD4T细胞的结合：已知在体外激活后可在人CD4⁺T细胞上诱导TIM-3表达(Hastings WD等，TIM-3is expressed on activated human CD4+T cells andregulates Th1and Th17cytokines.Eur J Immunol.2009；39:2492-501.)。为了确定W3402-z3是否可以与天然人TIM-3结合，将新鲜纯化的人CD4⁺T细胞激活以诱导TIM-3表达。使用Ficoll-Paque PLUS梯度离心，从健康的供体中新鲜分离人外周血单核细胞(PBMC)。依照制造商的操作指南，使用人CD4⁺T细胞富集试剂盒分离人CD4⁺T细胞。纯化的人CD4⁺T细胞用PHA刺激三天，或者不给刺激三天。将不同浓度的W3402-z3以及阴性对照加至静息或活化的人CD4⁺T细胞，随后通过PE标记的山羊抗人IgG-Fc抗体检测抗体结合至人CD4⁺T细胞的表面上。细胞的MFI通过流式细胞仪测量并且通过FlowJo分析。

如图2A-2B所示，W3402-z3与活化细胞结合，但不与静息CD4⁺T细胞结合。图2A示出了W3402-z3与活化和未活化的CD4⁺T细胞结合的直方图。W3402-z3与活化CD4⁺T细胞的结合曲线如图2B所示。

6.旁系同源/特异性(ELISA)：为了测试W3402-z3是否与人TIM-3特异性结合，但不与其他TIM家族成员交叉反应，通过ELISA测定W3402-z3与人TIM-1和TIM-4的结合。将W3402-z3、阳性和阴性对照抗体加至用人TIM-1或TIM-4预涂覆的平底板。用相应的与HRP缀合的二抗来检测抗体与平底板的结合(参见图3A-3C)。图3示出W3402-z3与人TIM-3特异性结合(图3A)，而与人TIM-1(图3B)和TIM-4(图3C)无交叉反应结合。

7.与BMK抗体的表位鉴定：将不同浓度的测试抗体分别与一定含量的W340-BMK4.mIgG1或经生物素标记的W340-BMK6.hIgG混合。随后将混合物加至用人TIM-3蛋白预涂覆的平底板。分别通过与HRP缀合的抗mFc抗体和SA-HRP，检测W340-BMK4.mIgG1和W340-BMK6.hIgG与平底板的结合(参见图4)。图4A和4B显示W3402-z3与基准W340-BMK4(US20150218274)(图4B)，而非W340-BMK6(US20160200815)(图4A)结合在人TIM-3相同或接近的表位上。

8.体外功能测试

8.1报告基因测定：为了测试W3402-z3是否能在功能上抵消TIM-3在调节T细胞应答中的作用，我们用TIM-3和IL-2荧光素酶报告基因转染Jurkat细胞。Ferris等人已指出，至少在急性条件下，TIM-3可能通过增强TCR信号传导促进T细胞衰竭(Ferris RL、Lu B、Kane LP,Too much of a good thing？Tim-3and TCR signaling in T cellexhaustion.J Immunol.2014；193:1525-30.)。与Ferris的发现一致，过表达TIM-3的Jurkat细胞在抗CD3/CD28刺激后显示出增强的IL-2报告基因信号。

在存在不同浓度的测试抗体的条件下，将TIM-3⁺Jurkat细胞在37℃，5％CO₂下使用抗CD28抗体和抗CD3抗体活化过夜。孵育后，加入重组的荧光素酶底物，通过微板分光光度计测量荧光素酶强度。

图5示出了W3402-z3可以抵消TIM-3的作用并且调节活化后的TIM-3⁺Jurkat细胞的功能。

8.2同种异型混合淋巴细胞反应(MLR)：如上所述分离和纯化PBMC和人CD4⁺T细胞。依照制造商的使用说明，使用CD14微珠分离单核细胞。细胞在含有GM-CSF和IL-4的培养基中培养5至7日以产生树突细胞(DC)。纯化的CD4⁺T细胞连同不同浓度的W3402-z3在96孔板中与同种异型成熟DC(mDC)共培养。在第5天，收获培养上清用于IFNγ测试。

图6显示了W3402-z3可以以剂量依赖的方式增强人CD4⁺T细胞产生IFNγ。

8.3抗原特异性MLR：如上所述获取PBMC和iDC。用CMV-pp65和IL-2处理PBMC 5天，随后如上所述分离CD4⁺T细胞。用CMV-pp65对自体iDC进行脉冲刺激。在存在自体iDC的条件下将纯化的CD4⁺T细胞与不同浓度的W3402-z3在96孔板中共培养。分别在第3天和第5天测定IL-2和IFNγ的分泌量。在第5天收获细胞以³H-胸腺嘧啶掺入法测量CD4⁺T细胞增殖。

人IFNγ和IL-2ELISA：分别用针对人IFNγ(cat#Pierce-M700A)或IL-2(cat#R&D-MAB602)具有特异性的捕获抗体预涂覆细胞板。使用与生物素缀合的抗IFNγ抗体(cat#Pierce-M701B)或抗IL-2抗体(cat#R&D-BAF202)作为检测抗体。

增殖测定：³H-胸腺嘧啶核苷(cat#PerkinElmer-NET027001MC)在0.9％NaCl溶液中以1:20稀释，并且以0.5uCi/孔加至细胞培养板。细胞板在37℃，5％CO₂下培养16至18小时，之后测定掺入增殖细胞的³H-胸腺嘧啶核苷。

图7A-7C显示了W3402-z3可以以剂量依赖的方式增强人CD4⁺T细胞的IL-2产量(图7A)，W3402-z3可以增强人CD4⁺T细胞的IFNγ产量(图7B)以及增殖(图7C)。

8.4调节T细胞抑制测定：如上所述分离CD4⁺T细胞。然后根据制造商的说明书，使用人CD4⁺CD25^high T细胞分离试剂盒将CD4⁺T细胞分离成Treg(CD4⁺CD25⁺)和CD4⁺CD25^low/-T细胞。在96孔板中培养同种异型DC、CD4⁺CD25^-T细胞、Treg细胞和TIM-3抗体。细胞板在37℃下在5％CO₂的培养箱中存放5天。在第5天通过³H-胸腺嘧啶掺入法测定CD4⁺CD25^-细胞的增殖。

图8A和8B显示了W3402-z3可以部分阻断Treg在调控CD4T细胞增殖方面的抑制性功能。图8A示出了在仅存在W3402-z3或W3402-z3与Treg细胞共同存在的条件下的CD4T细胞增殖。图8B示出了在存在W3402-z3或同种型对照的条件下，由Treg介导的抑制性作用的百分比。

9.抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)：如上所述，活化人CD4⁺T细胞以诱导TIM-3表达。活化的人CD4⁺T细胞和不同浓度的测试抗体在96孔板中预孵育30分钟，随后以50:1的效应子/靶标比例加入PBMC。细胞板在37℃下在5％CO₂的培养箱中存放4-6小时。通过基于LDH的细胞毒性检测试剂盒测定靶细胞裂解。将

(Herceptin)诱导的对BT474细胞的ADCC作用用作阳性对照。

图9示出了ADCC测试的结果，显示W3402-z3对活化的CD4⁺T细胞不介导ADCC活性，这可以避免在用于治疗患者时对TIM-3阳性细胞的潜在损害。

还测试了W3402-z3的IgG1形式(其中人IgG1恒定区含有L234F、L235E和P331S的氨基酸取代，或具有除L328R之外还在位置236之后插入Arg)的ADCC和CDC活性。W3402-z3的IgG1形式显示对TIM-3的结合活性和阻断活性水平与W3402-z3的IgG4形式相当或相似，并且不在活化的CD4⁺T细胞上介导ADCC或CDC活性(数据未显示)。

10.补体依赖的细胞毒性(CDC)：活化的人CD4⁺T细胞和不同浓度的测试抗体在96孔板中混合。在1:50的稀释度下加入人补体。细胞板在37℃下在5％CO₂的培养箱中存放2-3小时。通过CellTiter-Glo测定靶标细胞裂解。将

诱导的Raji细胞裂解用作阳性对照。

图10示出了CDC测试的结果，显示W3402-z3对活化的CD4⁺T细胞不介导CDC活性。

11.血清稳定性测试：W3402-z3在新鲜收集的人血清中1:50稀释、等分，并且在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。在指定的时间点，将一份W3402-z3从培养箱中移出、急冻，并且随后在-20℃下存放，待通过如上所述的FACS进行结合滴度测试。

图11示出了W3402-z3在37℃下稳定存在于人血清中至少14天。

12.PtdSer(磷脂酰丝氨酸)竞争测试：

Sabatos-Peyton等人(Sabatos-Peyton CA等人，Blockade of Tim-3 binding tophosphatidylserine and CEACAM1is a shared feature of anti-Tim-3 antibodiesthat have functional efficacy.Oncoimmunology.2017；7:e1385690)已经提出阻断PtdSer是具有功能的抗TIM-3抗体的共有性质。为了确定W3402-z3是否可以阻断人TIM-3和PtdSer之间的结合，Jurkat E6.1细胞用紫杉醇(Paclitaxel)处理2天以诱导细胞凋亡。不同浓度的W3402-z3、阳性和阴性对照与mFc标记的人TIM-3预混合，并且随后加至凋亡的Jurkat细胞。通过PE标记的抗小鼠IgG Fc抗体检测人TIM-3结合到凋亡的Jurkat细胞的表面上。如图12所示，W3402-z3表现出PtdSer-TIM-3相互作用的剂量依赖性阻断，IC₅₀为35.47nM。

13.人TIM-3表面下调(FACS)：如Waight J.等报道的，功能性抗TIM-3抗体可快速诱导TIM-3内化作为阻断TIM-3信号传导的一种可能的作用机制(Waight J等人，INCAGN02390,a novel antagonist antibody that targets the co-inhibitoryreceptor TIM-3.摘要3825，AACR年会2018；2018年4月14-18日；芝加哥，伊利诺伊州)。为了确定W3402-z3是否可以诱导细胞表面hTIM-3下调，将表达hTIM-3的细胞与W3402-z3或同种型对照抗体一起培养。将各种浓度的测试抗体加入到表达人TIM-3的转染细胞中，并在37℃、5％CO₂下培养。在不同的时间点，收集细胞；通过生物素标记的多克隆TIM-3抗体和PE标记的SA检测细胞表面上hTIM-3的存在。细胞的MFI通过流式细胞仪测量并且通过FlowJo分析。

早在将W3402-z3添加到细胞培养物中后4小时，就检测到了显著的剂量依赖性hTIM-3下调(图13)。已知高渗蔗糖可以阻断内化(Hansen SH,Sandvig K,van DeursB.Clathrin and HA2adaptors:effects of potassium depletion,hypertonic medium,and cytosol acidification.J Cell Biol.1993；121(1):61-72.)。通过在高渗培养基(补充有1M蔗糖的完全RPMI 1640)中培养完全消除了TIM-3的下调，这表明W3402-z3诱导的hTIM-3下调是通过内化介导的，不是通过脱落介导(数据未显示)。

14.应激测试：由于W3402-z3在其VH-CDR3区中含有潜在的异构化PTM位点，因此进行应激测试以评估抗体的结合亲和力在用于异构化的应激条件下是否受到影响。

通过使用微量离心脱盐柱(7K MWCO，Thermo Fisher)将W3402-z3交换到20mMTris、150mM NaCl、pH8.5缓冲液中，并使用Amicon超滤过滤器(30K MWCO，MerckMillipore)进一步浓缩至1mg/ml来制备W3402-z3的应激样品。抗体在37℃下孵育5天，以提供W3402-z3的应激样品(W3402-z3-应激)。如上所述，通过SPR测定应激抗体和非应激抗体对人TIM-3的结合亲和力。

表9示出了应激样品(W3402-z3-应激)对人TIM-3的结合亲和力与非应激样品的结合亲和力相当，这表明W3402-z3的活性不受应激条件的影响。

表9.

序列表

<110> 无锡智康弘义生物科技有限公司

<120> 新型抗TIM-3抗体

<130> 053674-8020CN02

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 1

Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 2

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ser Asp Ser Ala Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 3

Ile Met Thr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Arg Ala

1 5 10 15

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 4

Leu Ala Ser Asn Leu Gly Ser

1 5

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 5

Asp Gly Thr Thr Val Glu Thr Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 6

Met Gln Gly Ile His Val Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 119

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 7

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Ser Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Ile Met Thr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Arg

50 55 60

Ala Arg Leu Asn Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Glu Val Asn Ser Leu His Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Thr

85 90 95

Arg Asp Gly Thr Thr Val Glu Thr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Leu Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 357

<212> DNA

<213> 大鼠

<400> 8

caggtgcagc tgaaagagtc aggacctggt ctggtgcagt cctcacagac tctgtctctc 60

acctgcactg tctctggatt ctcattaacc aactatggtg tagggtggat tcgccagcct 120

ccagggaagg gtctggagtg gattgcaata atgacaagtg gtggaagcac atattacaat 180

tcagctctca gagcccgact gaacatcaac agggacacct ccaagagcca agttttctta 240

gaagtgaaca gtctgcacac tgaagacaca gccacttact tctgtaccag ggatgggact 300

acggtagaaa ccctctttga ttactggggc caaggactca tggtcacagt ctcctca 357

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 9

Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ile Ile Gly

1 5 10 15

Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ser Asp Ser

20 25 30

Ala Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Gly Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Gly Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Val Tyr His Cys Met Gln Gly

85 90 95

Ile His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 10

<211> 336

<212> DNA

<213> 大鼠

<400> 10

gatgttgtgc tgacccagac tccatccaca ttatcggcta ttattggaca atcggtctcc 60

atctcttgca ggtcaagtca gagtctctca gatagtgctg gaatcaccta tttgtattgg 120

tatctacaga ggcctggcca atctccacag cttctaattt atctggcatc caacctggga 180

tctggggtcc ccaacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgatttcac actcaaaatc 240

agtggagtgg agcctgagga tttgggagtt tatcactgca tgcaaggaat ccatgttccg 300

ctcacgttcg gttctgggac caagctggag atcaaa 336

<210> 11

<211> 119

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成的

<400> 11

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Met Thr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Arg

50 55 60

Ala Arg Val Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr

85 90 95

Arg Asp Gly Thr Thr Val Glu Thr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 357

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成的

<400> 12

caggtgcagc tgcaggagag cggccctgga ctggtgaagc ccagcgagac cctgtccctg 60

acctgcaccg tgtccggctt ctccctgacc aactacggcg tgggctggat caggcagcct 120

cctggaaagg gcctggagtg gatcggcatc atgacctccg gcggctccac ctactacaac 180

tccgccctga gggccagggt gaccatcaac agggacacct ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgtcct ccgtgaccgc tgccgatacc gccgtgtact actgcaccag ggacggcacc 300

accgtggaga ccctgttcga ctactggggc cagggcacca tggtgaccgt gtcctcc 357

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成的

<400> 13

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ser Asp Ser

20 25 30

Ala Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Gly Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly

85 90 95

Ile His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 14

<211> 336

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成的

<400> 14

gacatcgtga tgacccagac ccctctgtcc ctgtccgtga cccctggaca gcccgctagc 60

atctcctgca ggtcctccca gtccctgtcc gattccgccg gcatcaccta cctgtactgg 120

tacctgcaga agcctggcca gtccccccag ctgctgatct acctggcttc caacctgggc 180

tccggcgtgc ctgacaggtt ctccggatcc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240

tccagggtgg aggccgagga tgtgggcgtg tactactgca tgcagggcat ccacgtgccc 300

ctgaccttcg gccagggcac caagctggag atcaag 336

Claims (39)

1.一种分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段，其包含：

重链可变区，所述重链可变区包含序列如SEQ ID NO: 1所示的CDR1、序列如SEQ IDNO: 3所示的CDR2和序列如SEQ ID NO: 5所示的CDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含序列如SEQ ID NO: 2所示的CDR1、序列如SEQ ID NO: 4所示的CDR2和序列如SEQ ID NO: 6所示的CDR3。

2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区选自下组：SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 11。

3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，所述轻链可变区选自下组：SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 13。

4.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：

a)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 7，和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 9；或

b)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 11，和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 13。

5.如前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含免疫球蛋白恒定区。

6.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白恒定区包含人Ig的恒定区。

7.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白恒定区包含人IgG的恒定区。

8.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含人IgG4恒定区、人IgG1恒定区。

9.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，所述人IgG4恒定区包含S228P的氨基酸取代。

10.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，所述人IgG1恒定区包含L234F、L235E和/或P331S的一个或多个氨基酸取代。

11.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，所述人IgG1恒定区包含L328R，并且在位置236之后插入Arg。

12.如权利要求1-4中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为人源化的。

13.如权利要求1-4中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为双功能抗体、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)₂、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv-Fc抗体或双价抗体。

14.如权利要求1-4中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为ds双功能抗体。

15.如权利要求1-4中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过5×10^{- 9}M的K_D值特异性地与人TIM-3结合，所述K_D值通过表面等离子共振测定。

16.如权利要求1-4中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过5×10^-10M的K_D值特异性地与人TIM-3结合，所述K_D值通过表面等离子共振测定。

17.如权利要求1-4中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过5×10^-11M的K_D值特异性地与人TIM-3结合，所述K_D值通过表面等离子共振测定。

18.如权利要求1-4中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过5nM的EC₅₀值特异性地与表达在细胞表面上的人TIM-3结合，所述EC₅₀值通过流式细胞术测定。

19.如权利要求1-4中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过1nM的EC₅₀值特异性地与表达在细胞表面上的人TIM-3结合，所述EC₅₀值通过流式细胞术测定。

20.如权利要求1-4中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过0.2nM的EC₅₀值特异性地与表达在细胞表面上的人TIM-3结合，所述EC₅₀值通过流式细胞术测定。

21.如权利要求1-4中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，其能够特异性地与食蟹猴TIM-3结合。

22.如权利要求1-4中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与一种或多种缀合部分连接。

23.如权利要求22所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述缀合部分包含清除调节剂、毒素、可检测标记、或化疗剂。

24.一种药物组合物，其包含如前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂。

25.一种分离的多核苷酸，其编码如权利要求1-23所述的抗体或其抗原结合片段。

26.如权利要求25所述的分离的多核苷酸，其包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 14，和/或其仅具有简并替代的变体。

27.一种载体，其包含如权利要求25或26所述的分离的多核苷酸。

28.一种宿主细胞，其包含如权利要求27所述的载体。

29.一种表达如权利要求1-23中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包含在使如权利要求27所述的载体表达的条件下培养如权利要求28所述的宿主细胞。

30.如权利要求1-23中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段或如权利要求24所述的药物组合物在制备用于治疗一种疾病或状况的药物中的用途，其中所述的治疗包括将所述药物施用于个体，其中所述疾病或状况是癌症、自体免疫疾病、炎性疾病或感染性疾病。

31.如权利要求30所述的用途，其中所述癌症是淋巴瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑与中枢神经系统癌、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、绒毛膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、结缔组织癌、食道癌、间皮瘤、鼻咽癌、眼癌、头颈癌、肛门癌、胃肠癌、胶质母细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、生殖细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾腺癌、恶性肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌或外阴癌。

32.如权利要求30所述的用途，其中所述癌症是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。

33.如权利要求30-31中任意一项所述的用途，其中所述疾病或状况是B细胞淋巴瘤。

34.如权利要求33所述的用途，其中所述B细胞淋巴瘤为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤（NHL），其中所述NHL包含：弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、小淋巴细胞（SL）NHL、中度/滤泡性NHL、中度弥漫性NHL、高度免疫母细胞性NHL、高度淋巴母细胞性NHL、高度恶性小无核裂细胞性NHL、巨块型NHL、套细胞淋巴瘤、艾滋相关淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、急性淋巴细胞性白血病（ALL）、多毛细胞白血病、慢性髓细胞白血病和/或移植后淋巴增生性疾病（PTLD），以及瘢痣病、水肿和梅格斯综合征相关的异常血管增生。

35.如权利要求30-32中任意一项所述的用途，其中所述个体是人。

36.如权利要求30-32中任意一项所述的用途，其中所述施用是经由口服、鼻内、静脉内、皮下、舌下或肌内施用。

37.如权利要求1-23中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于一种在样品中检测TIM-3的存在或含量的方法的试剂盒中的用途。

38.如权利要求1-23中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断与TIM-3相关的疾病或状况的诊断试剂中的用途。

39.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1-23中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，其可用于检测TIM-3。

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