CN112062850B - Tim3抗体及其在治疗癌症中应用 - Google Patents

Tim3抗体及其在治疗癌症中应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及TIM3抗体及其在治疗癌症中应用,所述抗体能够更好地结合TIM3蛋白,抑制PtdSer与TIM3的结合同时促进T细胞活化、增加IFNγ分泌，有着广泛的药用前景。

Description

TIM3抗体及其在治疗癌症中应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体的涉及一种TIM3抗体及其在治疗癌症中应用。
技术背景
T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子(T cell immunoglobulin and mucin-domaincontaining molecules,TIM),它属于T细胞表面跨膜蛋白家族。该家族在人类中有3个成员，分别为TIM1，TIM3和TIM4。其中TIM3由信号肽、特征性的免疫球蛋白V区(Ig V)结构域、粘蛋白样区、跨膜区和含有磷酸化位点的胞内尾巴区五个domain构成。TIM3主要选择性表达于CD4+辅助性T细胞(Th1)与CD8+T毒性T细胞(TC)表面上。通过与其配体磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、半乳凝素-9(Galectin-9)、高迁移率族蛋白(HMGB1)和癌胚抗原相关细胞黏附分子-1(CEACAM-1)结合负向调节免疫应答。其中TIM3与配体Galectin-9结合后，会通过阻碍Th1和Th17结合从而诱导外周耐受反应以及Th1细胞的凋亡；TIM3与CECAM1的相互作用，抑制T细胞活化，促使T细胞耐受和耗竭。TIM3与HMGB1结合可以防止HMGB1与释放的DNA结合，阻止HMGB1的预警作用，也阻断了肿瘤组织中固有免疫反应的应答。
研究表明TIM3表达的异常与许多疾病有密切的关系。正常情况下CD4+或CD8+效应T细胞单独具有显著抗肿瘤活性，而TIM3+CD4+T细胞积聚在人体肿瘤组织内并产生较低水平的Th1型细胞因子并且，TIM3+CD4+T细胞能显著抑制自体产生的CD8+T细胞。阻断TIM3可以拯救肿瘤浸润性T细胞的功能，从而增强宿主的抗肿瘤能力。TIM3不仅抑制抗肿瘤免疫反应，而且直接促进卵巢癌、黑色素瘤，脑膜瘤，胶质瘤和滤泡性淋巴瘤的肿瘤发展。在T细胞中表达的TIM3具有促进免疫抑制的功能，使得T细胞淋巴瘤小鼠髓源性细胞扩张。另外，研究发现下调TIM3的表达明显抑制HeLa细胞的侵袭、迁移。TIM3在免疫应答调解中显示着重要的作用，因此TIM3成为一个新的、热门的肿瘤治疗靶点。
TIM3抗体的开发具有十分重要的临床意义，而目前进入临床阶段的TIM3抗体较少且肿瘤免疫治疗价格昂贵，因此急需开发出活性更好的TIM3抗体，进一步以提高治疗效果、降低成本。
发明内容
基于上述发现，本发明提供一种TIM3抗体,其能够更好地结合人TIM3蛋白,抑制PtdSer与TIM3的结合同时促进T细胞活化增加IFN-γ分泌。
本发明提供以下技术方案：
一种分离的单克隆抗体(例如，人源化抗体)含有轻链可变区，该轻链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含SEQ ID NO:3、4和5；此外还含有重链可变区，该重链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，重链CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含SEQ ID NO:6、7和8；其中该抗体或其抗原结合部分与TIM3结合。
在一些实施方案中，本发明所述的抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中轻链可变区序列为SEQ ID NO:1，重链可变区序列为SEQ ID NO:2；其中该抗体或其抗原结合部分与TIM3结合。
在一些实施方案中，本发明所述的抗体包含重链和轻链，该重链包含重链可变区和重链恒定区，轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，其中，重链可变区和轻链可变区含有上述的氨基酸序列，轻链恒定区和重链恒定区分别包含SEQ ID NO:9和10的氨基酸序列,其中该抗体或其抗原结合部分与TIM3结合。
在一些实施方案中，本发明所述的抗体包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列或CDR序列。本发明的抗体可以是全长抗体，例如IgG1、IgG2或IgG4亚型。在一些实施方式中，本发明的抗体可以是单链抗体，或由抗体片段构成，例如Fab或Fab’2片段。
在一些实施方案中，本发明所述TIM3抗体轻链恒定区进一步优选为κ链。所述抗体重链恒定区进一步优选为IgG4。
在一些实施方案中,本发明的抗TIM3抗体或其片段与人TIM3特异结合。
在一些实施方案中,本发明的抗TIM3抗体或其片段阻断或抑制PtdSer与TIM3的结合相互作用。
在一些实施方案中,本发明的抗TIM3抗体或其片段能够活化T细胞。
在一些实施方案中,本发明的抗TIM3抗体或其片段增强CD4+效应T细胞功能,例如通过提高CD4+效应T细胞增殖和/或提高CD4+效应T细胞的细胞因子生成(例如与本发明的抗TIM3抗体处理之前的细胞因子生成相比,或者与阴性对照抗体(例如IgG4抗体)处理的细胞因子生成相比)。在一些实施方案中,该细胞因子是γ-干扰素或白细胞介素,例如IL-2。
在一些实施方案中,本发明所述TIM3抗体对人TIM3的结合通过Elisa或流式细胞术(例如FACS)测定法进行测定。
本发明提供了一种药物组合，包括本发明所述的TIM3抗体，此外还可包括第二药物或活性剂。第二药物可以是PD-1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗GITR抗体和/或抗PD-L1抗体。
本发明所述的TIM3抗体可应用于制备治疗和/或预防癌症的药物中，所述癌症选自下组：膀胱癌、乳腺癌、子宫/子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结肠直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、病毒相关癌症其任何组合。
本文所用的术语“抗TIM3抗体”是指能够以足够的亲合力结合人TIM3蛋白或其片段以致所述抗体可以用作靶向人TIM3的诊断剂和/或治疗剂。
本文所用术语术语“抗体”包括具有免疫球蛋白样结合功能的任何部分。该术语包括完整的抗体分子和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链，骆驼科抗体包括例如纳米抗体，噬菌体展示结合构建体等等。天然“抗体”包含至少一条重(H)链和一条轻(L)链。每条重链均由重链可变区(VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域，CH1、CH2以及CH3组成。每条轻链均由轻链可变区(VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步再分成称为互补决定区(CDR)的高变区、其中夹杂着称为框架区(FR)或连接(J)区(分别存重链和轻链中的JH或JL)的更加保守的区域。
本文所用术语“单克隆抗体”是指来源于例如真核生物的、原核生物的或噬菌体克隆的单一拷贝或克隆的抗体,而不指其产生的方法。单克隆抗体或其抗原结合片段可以例如通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术例如CDR嫁接、或此类或其它。
本领域已知五个主要类别的抗体:IgA,IgD,IgE,IgG和IgM,并且这些抗体中的数个可以进一步被划分为亚类(同种型),例如,IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α,δ,ε,γ和μ。
本文所用术语“活化T细胞”意指诱导,引起或刺激效应或记忆T细胞具有更新,持续或放大的生物学功能。增强T细胞功能的例子包括:相对于干预前的此类水平,升高的来自CD8+效应T细胞的γ-干扰素(例如IFNγ)或白细胞介素(例如IL-2)分泌,升高的来自CD4+记忆和/或效应T细胞的γ-干扰素(例如IFNγ)或白细胞介素(例如IL-2)分泌。
本文所用术语“CDR区”或“互补决定区”，是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。CDR区序列可以由Kabat、Chothia方法来定义或本领域熟知的任何CDR区序列确定方法而鉴定的可变区内的氨基酸残基。本发明所用的方法可利用或根据这些方法中的任一种所定义的CDR，包括但不限于Kabat定义、Chothia定义中的任一者来定义。具体地，本发明提供的CDR序列根据Kabat定义。
本文所用术语“人源化抗体”通常是指获得抗TIM3特异抗体(例如，鼠类抗体或由杂交瘤产生的抗体)VH-CDR和VL-CDR序列将其移植到所选的人抗体框架编码序列上来产生人源化抗体。任选地，可通过随机诱变或在特定位置诱变来优化CDR区，以在将CDR区移植到框架区中之前用不同的氨基酸置换CDR中的一个或更多个氨基酸。或者，可使用本领域技术人员可获得的方法在将CDR区插入人框架区后对其进行优化。优选地,“人源化抗体”具有起源于或来自亲本抗体(即非人抗体，优选小鼠单克隆抗体)的CDR，而在其存在的程度上框架区和恒定区(或其主要部分或基本部分，即至少约90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同人类种系免疫球蛋白区或其重组或突变形式中，无论所述抗体是否在人类细胞中产生。
本文所用的术语“Kassoc”或“Ka”意指特定抗体-抗原相互作用的缔合比率，本文所用的术语“Kdis”或“Kd”，意指特定抗体-抗原相互作用的解离比率。本文所用的术语“KD”意指获自Kd对Ka(即Kd/Ka)比率并表示为摩尔浓度(M)的解离常数。可以利用本领域公认的方法测定抗体的KD值。如使用表面等离子体共振测定、细胞结合测定或平衡透析测定测量。
本文所用的术语“亲和性”或“亲和力”是指在单一抗原性位点上抗体和称作“表位”的抗原部分之间相互作用的强度。在每一个抗原性位点内，抗体“臂”的可变区通过弱非共价力与抗原在抗体的多个原子位置或氨基酸残基原子上相互作用；一般地，这种相互作用的数目越大，抗体对抗原的亲和性就越强。
有益效果
本发明的有益效果主要体现在：提供一种新的TIM3抗体,其能够更好地结合人TIM3蛋白,抑制PtdSer与TIM3的结合同时促进T细胞活化增加IFN-γ分泌。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1抗TIM3抗体阻断或抑制人TIM3与PtdSer的结合
图2抗TIM3抗体对T细胞分泌细胞因子的影响
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1.免疫原的制备
将含有编码人源TIM3蛋白胞外区22-200位氨基酸序列(人源TIM3蛋白序列来源于Genbank,NM_032782.4)的核苷酸序列克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pTT5载体并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒。在37℃，5％CO2培养箱中培养HEK293F细胞，待细胞达到合适密度时，将制备好的质粒和PEI(1μg/μl)按照1:3的转染标准，细胞按照1×106cells/ml中加入1μg质粒的标准对HEK293细胞进行瞬时转染并进行扩大培养。4天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，得含TIM3蛋白胞外区的培养上清液。先用0.8mm滤膜过滤，再使用0.45mm滤膜过滤第二次。将过滤后蛋白样品用AKTA Purifier机器进行蛋白的纯化。首先开机后先用蒸馏水冲洗管道排尽空气。再用PBS冲洗管道直至压力降至0.1Mpa以下。Protein A的柱子，用PBS冲洗平衡至UV平坦。流速设置1.5ml/min，待全部上完样品后用PBS冲洗至UV平坦。用pH 5.0buffer(sigma)洗脱杂蛋白，至UV平坦。再用pH 2.0buffer(sigma)洗脱目的蛋白，流速设置1ml/min，收集到含有pH 8.0的0.1M Tris-HCl缓冲液中，迅速混匀。使用AKTA_Purifier机器对收集的目的蛋白需要进行脱盐处理，向脱盐柱中加入全部蛋白样品，用PBS冲洗直至出现波峰，离心管收集脱盐后的蛋白样品，4℃，2000r/min，蛋白浓缩管millipore对蛋白样品进行浓缩处理，最终获得纯化的免疫原TIM3ECD-hFc。
实施例2.抗TIM3抗体制备
将实施例1制备的免疫抗原TIM3ECD-hFc溶于PBS，用等体积的完全弗氏佐剂(Sigma)与免疫抗原混合、乳化。初次免疫的接种方式为腹腔注射，免疫剂量为50μg/只。初次免疫14天后，使用不完全弗氏佐剂(Sigma)与免疫抗原等体积混合、乳化，以皮下注射的方式接种，免疫剂量为50μg/只。之后每隔14天加强免疫数次，使小鼠血清的抗体效价达一万以上。在细胞融合的前三天进行冲击免疫，取PBS溶解的免疫抗原TIM3ECD-hFc，采用腹腔注射，免疫剂量为25μg/只。
3天后，将小鼠脱颈处死，取出脾脏，在PBS中制备成单细胞混悬液。脾细胞用DMEM培养基清洗3次。取处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与上述分离的小鼠脾细胞按1：4的比例混匀后用DMEM清洗2次。细胞融合通过PEG融合的方式进行。融合后的细胞用DEME清洗3次，并重悬在细胞生长培养基中(RPMI 1640+10％FBS+1XHAT)。将细胞混悬液在96孔培养板上铺板，每孔200μl，5×104细胞每孔，将细胞放于37℃、5％CO 2的潮湿细胞培养箱培养7天。在第7天时，将培养基换成新鲜培养基(DMEM+10％FBS+1XHAT)。2-3天以后，吸取细胞培养液上清，通过高通量的ELISA结合检测来筛选与人TIM3结合的杂交瘤克隆。取阳性克隆，利用有限稀释法筛选单克隆化阳性杂交瘤细胞株。取ELISA实验中与人TIM-3胞外区蛋白反应活性较好且能刺激T细胞活性的阳性杂交瘤细胞进行扩大培养，冻存保种。将最终筛选出的阳性杂交瘤细胞株命名为7E5.3。
实施例3.抗体人源化
取实施例2中获得的杂交瘤细胞5×107个，加入1ml Trizol混匀并转移到1.5mL离心管中，室温静置5分钟；加0.2ml氯仿，振荡15秒，静置2分钟后于4℃，12000g离心5分钟，取上清转移到新的1.5ml离心管中；加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟后于4℃，12000g离心15分钟，弃上清；加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，12000g离心5分钟后弃上清，将沉淀物晾干，加入DEPC水溶解，即获得总RNA。取总RNA，随后用反转录试剂盒(PrimeScript RT Master Mix，购自Takara)合成cDNA第一条链；以cDNA为模板，利用PCR扩增出含有抗体重链可变区和轻链可变区的DNA产物，取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品使用柱回收试剂盒(TIANGEN)纯化。酶切后将其连接到pGEM-T载体上，取5μl连接产物转化感受态细胞，取感受态细胞涂布于含抗生素的LB固体培养基上于37℃孵箱过夜培养；次日挑取单菌落扩增并进行菌落PCR，选取阳性克隆测序，根据测序结果获得7E5.3克隆的可变区氨基酸序列。
通过序列比对(NCBI-Igblast)选择与7E5.3重链可变区，轻链可变区同源性最高的胚系基因序列作为可变区移植骨架。在选定人抗体骨架后，通过同源建模，预测在鼠抗恒定区中可能决定结构的关键氨基酸，对嫁接的骨架区进行回复突变设计，确定最终改造后的人源化抗体轻重链可变区序列。合成抗体VH结构域和VK结构域，通过PCR方法分别扩增轻链和重链的可变区，将重链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体重链IgG4恒定区的表达载体(购自Invitrogen)，将轻链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达载体(购自Invitrogen)。将质粒转化感受态细胞，按照前述筛选方法筛选阳性克隆，并将阳性样品进行测序。
将序列正确的重组抗体重、轻链的表达载体进行扩增，随后瞬时转染HEK293F细胞。4天后收集细胞培养液，3000g离心细胞培养液30分钟，收集上清液，0.22μm滤器过滤。用1ml Mab SelectTM SuReTM column(购自GE Healthcare)纯化200ml澄清上清液中的单克隆抗体。Mab SelectTM SuReTM column先用平衡缓冲液(PBS磷酸缓冲液，pH7.2)平衡。上样完毕后用平衡缓冲液清洗Mab SelectTM SuReTM column，平衡缓冲液的体积为蛋白A柱柱床体积的5倍。用洗脱液(0.1M甘氨盐酸缓冲液，pH3.0)洗脱结合在Mab SelectTM SuReTM column上的单克隆抗体。收集洗脱的抗体，加入10％(v/v)1.0M Tris-HCl缓冲液中和pH。然后立即用PBS磷酸缓冲液透析过夜。收集透析后的单克隆抗体，用0.22μm的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得到纯化的TIM3人源化抗体。
将人源化改造后的抗体命名为h7E5.3-IgG4，测序结果显示，上述单克隆抗体轻重链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；按Kabat定义CDR序列，上述单克隆抗体的轻、重链的可变区CDR氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；上述单克隆抗体轻重链的氨基酸序列为如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。
实施例4.TIM3抗体抑制TIM3与PtdSer结合
对纯化的TIM3抗体进一步测试其阻碍人PtdSer对人TIM3结合的能力。首先，用紫杉醇处理Jurkat E6-1细胞以诱导细胞凋亡，促进PtdSer在所述细胞表面的积累。将不同浓度的TIM3抗体h7E5.3-IgG4以及对照抗体与mFc标记的TIM3蛋白混合后，加入紫杉醇处理过的Jurkat细胞中。用PE标记的抗鼠Fc抗体检测与凋亡细胞表面PtdSer结合的TIM3蛋白，通过流式细胞仪检测各个样品的荧光强度MFI，计算出藻红蛋白(PE)阳性的占比。荧光强度高，证明PE标记的TIM3含量越高，即与PtdSer结合越多。结果如图1所示：随着TIM3抗体h7E5.3-IgG4的浓度增加，荧光强度下降，即PE阳性的百分比下降。表明TIM3抗体h7E5.3-IgG4以剂量依赖的方式抑制TIM3与PtdSer的结合。
实施例5.人源化TIM3抗体与人TIM3的亲和力
用HBS-EP缓冲液平衡芯片后，用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片，即CM5芯片。将抗原蛋白(TIM3-HIS)用10mM pH4.8的醋酸钠稀释至5μg/ml，然后以10μl/min的流速注射3min进行抗原偶联，再以10μl/min的流速注入乙醇胺以封闭未反应基团。将抗TIM3抗体h7E5.3-IgG4以及对照抗体sabatolimab设置6个不同浓度梯度，用HBS-EP缓冲液依次进行2倍梯度稀释，浓度从50nM到1.56nM。对照抗体sabatolimab的序列参照INN:列表122(2019)(参见http://www.who.int/medicines/publications/druginformation/innlists/en/)。从低浓度开始，将抗TIM3抗体以50μL/min的流速注射3min，再用HBS-EP缓冲液以50μL/min的流速解离时间为10min。使用3M MgCl2作为再生缓冲液，按照再生程序对芯片进行再生。此后以同样的方法对其它浓度的抗体进行测定。通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(Ka)和解离速率(Kd)。平衡解离常数(Kd)用解离速率(Kd)/结合速率(Ka)计算。结果表明本发明的抗体h7E5.3-IgG4对TIM3蛋白的亲和力优于对照抗体，比对照抗体的亲和力提升至少一倍。
表一
抗体 K<sub>a</sub>(1/Ms) K<sub>d</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(nM)
h7E5.3-IgG4 3.31x10<sup>5</sup> 3.64x10<sup>-5</sup> 0.11
sabatolimab 1.39x10<sup>5</sup> 3.71x10<sup>-5</sup> 0.27
实施例6.TIM3抗体对T细胞的活化
可以通过DC-T细胞共培养测定法测量IFN-γ分泌来评估抗TIM3抗体的功能活性。取肝素钠抗凝的正常人新鲜外周血,按常规的Ficoll(购自GE Healthcare)梯度离心分离法获得单个核细胞(PBMC)。将PBMC铺在6孔组织培养板中，2X106个/孔。将细胞孵育2-3小时,以允许单核细胞的附着。通过在含有1％AB血清、10mM HEPES、50μMβ-Me、IL-4(1000U/ml)和GM-CSF(1000U/ml)的培养基中培养来自PBMC的单核细胞(1X106个细胞/ml)产生未成熟骨髓moDC。2天后,加入补充有IL-4和GM-CSF的新鲜培养基。在第5天,加入含有TNF-α(1000U/ml)、IL-1b(5ng/ml)、IL-6(10ng/ml)和PGE2(1μM)的刺激混合物继续培养2天，即得到成熟树突状细胞。
取另一供体提供的肝素钠抗凝的正常人新鲜外周血,按常规的Ficoll(购自GEHealthcare)梯度离心分离法获得单核细胞(PBMC)。用人记忆性CD4+T细胞提取试剂盒(购自Stem Cell)从人外周血单核淋巴细胞PBMC中分离得到纯化的记忆性CD4+T细胞。将1X105个分离的T细胞(来自供体)与1X104个同种异体的树突状细胞混合后，加入到用固定化抗CD3抗体(购自Biolegend)包被的96孔板中。在混合淋巴细胞反应的开始加入相应的抗体,包括阴性抗体，TIM3对照抗体、TIM3抗体h7E5.3-IgG4，抗体的终浓度分别为0.5、1、2μg/m1，并在整个培养期间孵育。细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱孵育6天后，取出细胞培养板，3000rpm离心10min，每孔取出150μl上清进行IFN-γ的检测。结果如图2所示：在DC-T细胞共培养试验中TIM3抗体h7E5.3-IgG4以及sabatolimab均可不同程度地增加T细胞IFN-γ的分泌，且h7E5.3-IgG4效果更优。
序列表
<110> 北京广未生物科技有限公司
<120> TIM3抗体及其在治疗癌症中应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Gln Ala Ser Ile Gly Phe Asp Asn Val Lys
20 25 30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Glu Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val
65 70 75 80
Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Asp Ala
85 90 95
Ile His Tyr Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Gly Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Glu Thr Ala Gly Cys Leu Ser Pro Arg Phe Tyr Asp Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Gly Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ala Ile Asp Arg Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Ala Ser Ile Gly Phe Asp Asn Val Lys Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Ala Ser Lys Leu Glu Thr
1 5
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Gln Ser Lys Asp Ala Ile His Tyr Pro Thr
1 5 10
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ser Tyr Ala Gly Lys
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Trp Ile Glu Thr Ala Gly Cys Leu Ser Pro Arg Phe Tyr Asp Leu Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Ile Asp Arg Gly Asn Phe Asp Tyr
1 5
<210> 9
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Gln Ala Ser Ile Gly Phe Asp Asn Val Lys
20 25 30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Glu Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val
65 70 75 80
Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Asp Ala
85 90 95
Ile His Tyr Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 10
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Gly Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Glu Thr Ala Gly Cys Leu Ser Pro Arg Phe Tyr Asp Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Gly Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ala Ile Asp Arg Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445

Claims (7)

1.一种抗TIM3抗体，含有轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区分别如SEQ ID NO:3、4和5所示；该重链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，重链CDR1区、CDR2区和CDR3区分别如SEQ ID NO:6、7和8所示。
2.根据权利要求1所述的抗TIM3抗体，其包含如SEQ ID NO:1所示的轻链可变区序列和如SEQ ID NO:2所示的重链可变区序列。
3.根据权利要求1-2任一项所述的抗TIM3抗体，其包含如SEQ ID NO:9所示的轻链9和如SEQ ID NO:10所示的重链。
4.原核或真核细胞系中复制的表达载体，其特征在于：其编码权利要求1-3任一项所示的抗体。
5.一种药物组合物，其特征在于包含权利要求 1-3任一项所述的抗体。
6.权利要求1-3任一项的抗TIM3抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫/子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结肠直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤和病毒相关的癌症。
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CN114478778B (zh) * 2022-04-01 2022-06-28 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 抗Tim-3纳米抗体及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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