WO2023093744A1 - 一种双特异性抗原结合蛋白 - Google Patents

一种双特异性抗原结合蛋白 Download PDF

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WO2023093744A1
WO2023093744A1 PCT/CN2022/133618 CN2022133618W WO2023093744A1 WO 2023093744 A1 WO2023093744 A1 WO 2023093744A1 CN 2022133618 W CN2022133618 W CN 2022133618W WO 2023093744 A1 WO2023093744 A1 WO 2023093744A1
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seq
antigen
antibody
binding protein
polypeptide
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PCT/CN2022/133618
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姜晓玲
秦春铃
周冲
吴崇兵
殷刘松
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盛禾(中国)生物制药有限公司
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    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the invention relates to the fields of tumor immunotherapy and molecular immunology, in particular to a bispecific antigen-binding protein specifically binding to CD24 and 4-1BB.
  • Tumor-targeting monoclonal antibodies are one of the important means in the field of tumor immunotherapy.
  • the phagocytosis of macrophages requires two signals to work at the same time: one is the activation of the "eat me” signal targeting the surface of the cell, and the other is the inactivation of the "don't eat me” signal on the surface of the same cell. The absence of either signal is not sufficient to initiate phagocytosis.
  • CD24 is a type of "don't eat me” signal. Tumor cells highly express CD24. By binding to Siglec-10 on the surface of macrophages, the "don't eat me” signal is released, thereby preventing tumor cells from being phagocytized by macrophages.
  • 4-1BB (CD137, TNFRSF9) is a transmembrane protein of the tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRS). 4-1BB is expressed in the form of monomer or dimer on the cell surface. After binding to its ligand (4-1BBL), it undergoes trimerization for signal transduction. It is CD8+ and CD4+ T cells, regulatory T cells (Tregs ), costimulatory molecules of NK cells and NKT cells, B cells and neutrophils, etc.
  • Tregs regulatory T cells
  • 4-1BB On T cells, 4-1BB is not constitutively expressed, but is induced upon activation of the T cell receptor (TCR), stimulated by its natural ligand 4-1BBL or antibody agonists, via TNFR-associated factor (TRAF) -2 and TRAF-1 for signaling.
  • TCR T cell receptor
  • TRAF TNFR-associated factor
  • Early signaling of 4-1BB involves polyubiquitination of K-63, activation of nuclear factor (NF)- ⁇ B and mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways, and signaling leads to co-stimulation of T cells, cell proliferation, cell Factor production, maturation and prolonged survival of CD8+ T cells.
  • TCR T cell receptor
  • NF nuclear factor
  • MAPK mitogen-activated protein kinase
  • the present invention develops a bispecific antigen-binding protein that binds 4-1BB and CD24 for the first time.
  • the bispecific antigen-binding protein also has the following advantages: it can specifically recognize CD24 and 4-1BB; it can effectively exert the ADCC and ADCP effects on tumor cells expressing CD24 through NK cells and macrophages; it can rely on the anti-CD24 terminal Cross-linking, specifically activates the 4-1BB signaling pathway, activates CD8+ T cells, thereby stimulating T cell proliferation and secreting cytokines, specifically killing tumor cells expressing CD24, and improving the body's anti-tumor effect; ADCC activity kills regulatory T cells (Tregs) with high expression of 4-1BB, relieves the immunosuppression of the tumor microenvironment, promotes the infiltration of CD8+ T cells, and achieves anti-tumor effects.
  • Regs regulatory T cells
  • the present invention provides a bispecific antigen-binding protein, comprising:
  • the first antigen is CD24, and the second antigen is 4-1BB; or, the first antigen is 4-1BB, and the second antigen is CD24.
  • said first antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain and a light chain
  • the second antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a scFv
  • the scFv is linked to the N-terminal or C-terminal of the heavy chain or light chain of the first antibody or its antigen-binding fragment.
  • the heavy chain variable region of one heavy chain of the first antibody or antigen-binding fragment thereof forms an antigen-binding site with the light chain variable region of one light chain
  • the heavy chain of the other heavy chain The variable region forms an antigen-binding site with the light chain variable region of another light chain.
  • the bispecific antigen-binding protein comprises a primary antibody or antigen-binding fragment thereof and one or more scFvs.
  • said bispecific antigen binding protein comprises a primary antibody or antigen-binding fragment thereof and two scFvs.
  • one of the scFvs is linked to the N-terminus of the heavy or light chain of the first antibody or antigen-binding fragment thereof, and the other scFv is linked to the first antibody or antigen-binding fragment thereof. C-terminus of the heavy or light chain of the fragment.
  • the two scFvs are respectively linked to the N-terminals of the two heavy chains or the two light chains of the first antibody or antigen-binding fragment thereof; or, the two scFvs are respectively linked to The C-termini of the two heavy chains or the two light chains of the first antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the bispecific antigen binding protein comprises two first polypeptide chains and two second polypeptide chains, for each of said polypeptide chains:
  • said first polypeptide chain each independently comprises the heavy chain of said first antibody or antigen-binding fragment thereof and said scFv;
  • said second polypeptide chains each independently comprise a light chain of said first antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the bispecific antigen binding protein comprises two first polypeptide chains and two second polypeptide chains, for each of said polypeptide chains:
  • each of said first polypeptide chains independently comprises a heavy chain of said first antibody or antigen-binding fragment thereof;
  • said second polypeptide chains each independently comprise the light chain of said first antibody or antigen-binding fragment thereof and said scFv.
  • the two first polypeptide chains are the same or different, and/or the two second polypeptide chains are the same or different.
  • the heavy chain variable region of the scFv is connected to the light chain variable region through a linker L1, and/or the two scFvs are respectively connected to the first antibody or its antibody through a linker L2.
  • the N- or C-termini of the two heavy chains or the two light chains of the antigen-binding fragment are linked.
  • said linker L1 and linker L2 are the same or different.
  • the linker L1 and/or the linker L2 has an amino acid sequence shown as (G 4 S) x , where x is an integer selected from 1-6; preferably, the linker L1 and/or L2 is (G 4 S) 3 or (G 4 S) 4 .
  • the heavy chain of said first antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable region and a heavy chain constant region, and said light chain comprises a light chain variable region and a light chain constant region;
  • the first antibody or antigen-binding fragment thereof is a full-length antibody.
  • the heavy chain of the first antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a first Fc region and a second Fc region.
  • first Fc region and the second Fc region are the same Fc or different Fc.
  • the Fc region is selected from IgG, IgA, IgD, IgE and/or IgM.
  • the Fc region is selected from IgG1, IgG2, IgG3 and/or IgG4.
  • said first antibody or antigen-binding fragment thereof specifically binds CD24, and said scFv specifically binds 4-1BB, wherein,
  • the first antibody or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • HCDR1 as shown in SEQ ID NO: 2, HCDR2 as shown in SEQ ID NO: 3, HCDR3 as shown in SEQ ID NO: 4; and LCDR1 as shown in SEQ ID NO: 6, as shown in LCDR2 as set forth in SEQ ID NO: 7, LCDR3 as set forth in SEQ ID NO: 8; or
  • HCDR1 as shown in SEQ ID NO: 10
  • HCDR2 as shown in SEQ ID NO: 11
  • HCDR3 as shown in SEQ ID NO: 12
  • LCDR1 as shown in SEQ ID NO: 14, as shown in LCDR2 shown in SEQ ID NO: 15, LCDR3 shown in SEQ ID NO: 16;
  • the scFv comprises:
  • HCDR1 as shown in SEQ ID NO: 18, HCDR2 as shown in SEQ ID NO: 19, HCDR3 as shown in SEQ ID NO: 20; and LCDR1 as shown in SEQ ID NO: 22, as shown in SEQ ID NO : LCDR2 shown in 23, LCDR3 shown in SEQ ID NO: 24.
  • the first antibody or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • the scFv comprises:
  • Heavy chain variable region VH as shown in SEQ ID NO: 17 light chain variable region VL as shown in SEQ ID NO: 21.
  • said first antibody or antigen-binding fragment thereof specifically binds 4-1BB, and said scFv specifically binds CD24, wherein,
  • the first antibody or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • HCDR1 as shown in SEQ ID NO: 18, HCDR2 as shown in SEQ ID NO: 19, HCDR3 as shown in SEQ ID NO: 20; and LCDR1 as shown in SEQ ID NO: 22, as shown in SEQ ID NO : LCDR2 shown in 23, LCDR3 shown in SEQ ID NO: 24.
  • the scFv comprises:
  • HCDR1 as shown in SEQ ID NO: 2, HCDR2 as shown in SEQ ID NO: 3, HCDR3 as shown in SEQ ID NO: 4; and LCDR1 as shown in SEQ ID NO: 6, as shown in LCDR2 as set forth in SEQ ID NO: 7, LCDR3 as set forth in SEQ ID NO: 8; or
  • HCDR1 as shown in SEQ ID NO: 10
  • HCDR2 as shown in SEQ ID NO: 11
  • HCDR3 as shown in SEQ ID NO: 12
  • LCDR1 as shown in SEQ ID NO: 14, as shown in LCDR2 shown in SEQ ID NO: 15, LCDR3 shown in SEQ ID NO: 16.
  • the first antibody or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • the scFv comprises:
  • said bispecific antigen binding protein comprises:
  • the present invention also provides an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding the bispecific antigen-binding protein described in any one of the above;
  • the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence encoding the first polypeptide chain of the bispecific antigen-binding protein described in any one of the above;
  • the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence encoding the second polypeptide chain of the bispecific antigen binding protein of any one of the above.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising the above-mentioned isolated nucleic acid molecule.
  • the present invention also provides a recombinant cell comprising the above-mentioned isolated nucleic acid molecule and/or the above-mentioned recombinant vector.
  • the present invention also provides the use of a bispecific antigen-binding protein, nucleic acid molecule, recombinant vector and/or recombinant cell in the preparation of medicines for treating and/or preventing and/or diagnosing diseases.
  • the present invention also provides the use of a bispecific antigen binding protein, nucleic acid molecule, recombinant vector and/or recombinant cell in the preparation of a drug for treating cancer.
  • bispecific antigen binding protein refers to a protein molecule capable of specifically binding to two target antigens or target antigen epitopes.
  • "bispecific antigen-binding protein” comprising an antibody or antigen-binding fragment (such as Fab, scFv, etc.) can be used interchangeably with “bispecific antibody” and "double antibody”.
  • antibody generally refers to an immunoglobulin molecule consisting of two pairs of polypeptide chains, each pair having a light chain and a heavy chain. Heavy chains can be classified as mu, delta, gamma, alpha, or epsilon, and define the antibody's isotype as IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE, respectively. Antibody light chains can be classified as kappa and lambda light chains. Each heavy chain consists of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH), which consists of 3 domains (CH1, CH2 and CH3).
  • VH heavy chain variable region
  • CH heavy chain constant region
  • Each light chain consists of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL), which consists of one domain, CL.
  • the constant domains are not directly involved in antibody-antigen binding, but exhibit various effector functions.
  • the VH and VL regions can also be subdivided into regions of high variability called complementarity determining regions (CDRs) interspersed with more conserved regions called framework regions (FRs).
  • CDRs complementarity determining regions
  • FRs framework regions
  • Each VH and VL is composed of 3 CDRs and 4 FRs arranged in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 from the amino terminus to the carboxy terminus.
  • the variable regions (VH and VL) of each heavy chain/light chain pair form the antigen binding site, respectively.
  • CDR complementarity determining region
  • CDRs may be defined by Kabat's rules for CDR1, CDR2, and CDR3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) of the light chain variable domain, and CDR1, CDR2, and CDR3 of the heavy chain variable domain ( HCDR1, HCDR2, HCDR3); as used in some embodiments herein, CDR can also be defined by IMGT as CDR1, CDR2, and CDR3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) of the light chain variable domain, and of the heavy chain variable domain. CDR1, CDR2 and CDR3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3).
  • antibody includes, but is not limited to, monoclonal antibodies, murine antibodies, camelid antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, fully human antibodies, bispecific or multispecific antibodies. These antibodies may be of any isotype/type (eg, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY) or subclass (eg, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, and IgA2).
  • isotype/type eg, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY
  • subclass eg, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, and IgA2
  • antigen-binding fragment or "antigen-binding portion” refers to one or more portions of an antibody that retain the ability to bind an antigen to which the antibody binds.
  • "antigen-binding fragments" of antibodies include (1) Fab fragments, monovalent fragments consisting of VL, VH, CL, and CH1 domains; (2) F(ab')2 fragments, contained in the hinge bivalent fragments of two Fab fragments whose domains are linked by a disulfide bridge; (3) scFv fragments, consisting of the VL and VH domains of an antibody, or consisting of the VH and VL domains of an antibody; (4) CDRs, isolated Complementarity Determining Region.
  • polypeptide refers to a chain of amino acids of any length, regardless of modifications such as phosphorylation or glycosylation.
  • polypeptide includes proteins and fragments thereof.
  • Polypeptides may be "exogenous” in the sense that they are “heterologous”, ie, foreign to the host cell utilized, eg, human polypeptides produced by bacterial cells.
  • a polypeptide is disclosed herein as a sequence of amino acid residues. Those sequences are written left to right in amino-terminal to carboxy-terminal orientation.
  • amino acid residue sequences are designated by three-letter or one-letter codes, as follows: alanine (Ala, A), arginine (Arg, R), asparagine (Asn, N), asparagine Aspartic acid (Asp, D), cysteine (Cys, C), glutamine (Gln, Q), glutamic acid (Glu, E), glycine (Gly, G), histidine (His, H), Isoleucine (Ile, I), Leucine (Leu, L), Lysine (Lys, K), Methionine (Met, M), Phenylalanine (Phe, F) , proline (Pro, P), serine (Ser, S), threonine (Thr, T), tryptophan (Trp, W), tyrosine (Tyr, Y) and valine (Val, V).
  • SEQ ID NO: 2-4 amino acid positions described herein such as the amino acid residues of the Fc region
  • target region such as CDR
  • SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 5-53 amino acid positions Numbering eg, amino acid residues of the Fc region
  • regions of interest eg, CDRs
  • scFv refers to a molecule comprising an antibody heavy chain variable domain (VH) and an antibody light chain variable domain (VL) connected by a linker.
  • VH antibody heavy chain variable domain
  • VL antibody light chain variable domain
  • Such scFv molecules may have the general structure: NH2-VL-Linker-VH-COOH or NH2-VH-Linker-VL-COOH.
  • Suitable prior art linkers consist of repeated GGGGS amino acid sequences or variants thereof, for example using 1-6 repeats of the GGGGS amino acid sequence or variants thereof.
  • host cell refers to a cell that has been or can be transformed with a nucleic acid sequence and thereby express a selected gene of interest.
  • the term includes progeny of a parental cell, whether or not the progeny is morphologically or genetically identical to the original parental cell, as long as the progeny has the selected gene of interest.
  • Commonly used host cells include bacteria, yeast, mammalian cells, and the like.
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of multiplying another nucleic acid to which it has been linked.
  • the term includes vectors that are self-replicating nucleic acid structures as well as vectors that are incorporated into the genome of a host cell into which they are introduced. Certain vectors are capable of directing the expression of nucleic acids to which they are operably linked.
  • ADCC refers to antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity), which means that the Fab segment of the antibody binds to the epitope of virus-infected cells or tumor cells, and its Fc segment binds to the killer cell ( FcR binding on the surface of NK cells, macrophages, neutrophils, etc.) mediates killer cells to directly kill target cells, which is an important mechanism for the action of anti-tumor therapeutic antibody drugs.
  • ADCP refers to Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis (Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis), which is an important mechanism for identifying and mediating the action of therapeutic antibodies and tumor cells.
  • the bispecific antigen-binding protein can specifically recognize CD24 and 4-1BB; can effectively exert ADCC and ADCP effects on tumor cells expressing CD24 through NK cells and macrophages; can rely on the cross-linking effect of anti-CD24, and can specifically sexually activate the 4-1BB signaling pathway, activate CD8+ T cells, thereby stimulating T cell proliferation and secreting cytokines, specifically killing tumor cells expressing CD24, and improving the body's anti-tumor effect; it can also kill high-expressing tumor cells through ADCC activity Regulatory T cells (Tregs) of 4-1BB relieve the immunosuppression of the tumor microenvironment, promote the infiltration of CD8+ T cells, and achieve anti-tumor effects.
  • Tregs Regulatory T cells
  • Figures 1a-1d are schematic structures of bispecific antigen-binding proteins.
  • the IgG part in the schematic diagram of Figure 1a is an anti-4-1BB antibody (anti-4-1BB IgG), and the light and heavy chain variable regions of the anti-CD24 antibody are connected through the linker L1 to form a scFv (VL CD24 -L1-VH CD24 or VH CD24 -L1-VL CD24 ), the anti-CD24 scFv part is connected to the N-terminal of the anti-4-1BB IgG light chain by the linker L2;
  • the IgG part in the schematic diagram of Figure 1b is an anti-4-1BB antibody (anti-4-1BB IgG), and the The light and heavy chain variable regions of the anti-CD24 antibody are linked by linker L1 to form scFv (VL CD24 -L1-VH CD24 or VH CD24 -L1-VL CD24 ), and the anti-CD24 scFv part is linked
  • 2a-2c are schematic diagrams showing the binding activity of the bispecific antigen-binding protein to CHOK1-4-1BB cells.
  • 3a-3b are schematic diagrams showing the binding activity of the bispecific antigen binding protein to CD24-MDA-MB-231 cells.
  • Fig. 4 is a schematic diagram of the binding activity of the bispecific antigen binding protein to MCF-7 cells.
  • Fig. 5 is a schematic diagram of the activation effect of the bispecific antigen binding protein on HEK-293/NF ⁇ B-Luci/4-1BB cells in the presence of the target cell CHOK1-CD24.
  • 6a-6b are schematic diagrams showing the activation of HEK-293/NF ⁇ B-Luci/4-1BB cells by the bispecific antigen binding protein in the presence of the target cell CD24-MDA-MB-231.
  • Fig. 7 is a schematic diagram of the activation effect of the bispecific antigen binding protein on HEK-293/NF ⁇ B-Luci/4-1BB cells in the presence of the target cell SKOV3.
  • Fig. 8 is a schematic diagram of the activation effect of the bispecific antigen binding protein on HEK-293/NF ⁇ B-Luci/4-1BB cells in the presence of the target cell MCF-7.
  • Fig. 9a is a schematic diagram of the release of cytokine IFN ⁇ from PBMCs pre-coated with PBS.
  • Fig. 9b is a schematic diagram showing the result of release of cytokine IFN ⁇ by PBMC preactivated with anti-human CD3 antibody.
  • Fig. 10 is a schematic diagram of the results of the killing experiment of the bispecific antigen-binding protein on SKOV3 cells.
  • 11a-11b are schematic diagrams of the ADCC effect of bispecific antigen binding proteins.
  • 12a-12b are schematic diagrams of the ADCP effect of bispecific antigen binding proteins.
  • Fig. 13 is a schematic diagram of the in vivo pharmacodynamic results of the bispecific antigen-binding protein.
  • the heavy chain of CD24 monoclonal antibody-1 is shown in SEQ ID NO: 48, the light chain is shown in SEQ ID NO: 49; the heavy chain of CD24 monoclonal antibody-2 is shown in SEQ ID NO: 50 The light chain is shown in SEQ ID NO: 51; the heavy chain of 4-1BB monoclonal antibody is shown in SEQ ID NO: 52, and the light chain is shown in SEQ ID NO: 53.
  • IgG1 isotype control (Sino biological) and IgG4 isotype control (Keytruda Merck) were purchased commercially.
  • the sequence 1 of the present invention is the CD24 monoclonal antibody-1 sequence
  • the sequence 2 is the CD24 monoclonal antibody-2 sequence
  • the sequence 3 is the anti-4-1BB antibody sequence.
  • the amino acid sequences of the CDRs and variable regions of Sequence 1, Sequence 2 and Sequence 3 are shown in Table 1, respectively.
  • sequence 1 sequence 2 sequence 3 heavy chain variable region SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 17 HCDR1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 18 HCDR2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 19
  • HCDR3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 20 light chain variable region SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 21 LCDR1 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 22 LCDR2 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 23 LCDR3 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 24
  • the peptide chains in Table 2 can be formed by connecting Sequence 1 and Sequence 3 in a certain order through linkers L1 and L2.
  • linkers L1 and L2 the linker 1 (L1) and linker 2 (L2) of the bispecific antigen binding protein used in this example have the same sequence structure, which are three GGGGS repeats, namely GGGGSGGGGSGGGGS.
  • the peptide chains in Table 3 can be formed by linking Sequence 2 and Sequence 3 in a certain order through linkers L1 and L2.
  • the bispecific antigen-binding proteins shown in Table 4 can be formed by combining the peptide chains in Table 2 and Table 3.
  • the lentiviral vector carrying human 4-1BB was transfected into CHOK1 cell line (ATCC), and the cells were sorted to establish the stable expression cell line CHOK1-4-1BB of human 4-1BB.
  • the MDA-MB-231 breast cancer cell line (ATCC) was transfected with a lentiviral vector carrying human CD24, and the cells were sorted to establish the CD24-MDA-MB-231 cell line stably expressing human CD24.
  • the natural tumor cell line MCF-7 is derived from ATCC (American Type Culture Collection) and highly expresses CD24. Take various types of cells and transfer to the centrifuge tube for 5 minutes at 1000rpm. Spread 100 ⁇ L of each cell on a 96U plate and wash twice with PBS.
  • the bispecific antigen-binding proteins with different structures were added to the 96U plate with tumor cells at the initial concentration of 200nM, 4-fold dilution, 6 gradients, and 100 ⁇ L/well. Cells were incubated at 37°C for 60 minutes and then washed twice with excess FACS buffer. Cells were resuspended in 100 ⁇ L FACS buffer, and fluorescent secondary antibody (FITC F(ab')2 goat anti-human IgG Fc ⁇ antibody) was added to the sample, incubated at 37°C for 30 minutes and washed twice with excess FACS buffer. Cells were fixed in fixation buffer and then analyzed by flow cytometry. The experimental results are shown in Fig. 2a-2c, Fig. 3a-3b and Fig. 4 .
  • Example 3 The activation effect of bispecific antigen binding protein on HEK-293/NF ⁇ B-Luci/4-1BB cells
  • SKOV3 was obtained from the Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences.
  • the bispecific antigen-binding protein has a good activation effect on HEK-293/NF ⁇ B-Luci/4-1BB cells in the presence of the target cell CHOK1-CD24, and the EC 50 reaches 0.2184-5.505nM, 4 -1BB monoclonal antibody has no activation effect.
  • the bispecific antigen binding protein has a good activation effect on HEK-293/NF ⁇ B-Luci/4-1BB cells in the presence of the target cell CD24-MDA-MB-231, and the EC 50 reaches 0.5113-10.27nM, 4-1BB monoclonal antibody has no activation effect.
  • the bispecific antigen binding protein has a good activation effect on HEK-293/NF ⁇ B-Luci/4-1BB cells in the presence of the target cell SKOV3, and the EC 50 reaches 0.7292-1.481nM, 4-1BB Monoclonal antibodies have no activating effect.
  • the bispecific antigen-binding protein has a great effect on the 4-1BB signaling pathway through the cross-linking effect of the CD24 end. Strong activating activity.
  • Example 4 The ability of bispecific antigen binding protein to activate PBMC to release cytokines and its killing effect on tumor cells
  • PBMC 1 ⁇ 10 6 cells/mL PBMC were preactivated with 5 ⁇ g/mL anti-human CD3 antibody (BioGems; FPB004-C) or an equal amount of PBS at 37°C for 24 hours.
  • the target cell SKOV3 was plated at 5000 cells/100 ⁇ L/well, and after incubation overnight at 37°C, the medium of the target cell plate was discarded and replaced with 1640+10% FBS, 50 ⁇ L/well. Then, 50 ⁇ L/well of antibodies of different structures were added, starting at a final concentration of 100 nM, and then diluted 6 times. At the same time, pre-activated PBMCs were added according to the effect-to-target ratio of 5:1. After incubating at 37° C.
  • Fig. 9a is the result of release of cytokine IFN ⁇ from PBMC pre-coated with PBS
  • Fig. 9b is the result of release of cytokine IFN ⁇ from PBMC pre-activated with anti-human CD3 antibody.
  • 1-C2-IgG4 can activate PBMC pre-coated with PBS or pre-activated with anti-human CD3 antibody to release cytokine IFN ⁇ in a dose-dependent manner.
  • CD24 mAb-1 and 4-1BB mAb could not activate PBMC to release cytokine IFN ⁇ at any dose.
  • CHOK1-4-1BB or MCF-7 cells centrifuge at 1000rpm for 4 minutes at room temperature, resuspend with RPMI1640 basal medium (containing 5% FBS), and spread in 96-well plates at 1 ⁇ 10 4 /well, 50 ⁇ L/well;
  • the target cell is CHOK1-4-1BB with a time-target ratio of 3:1, and the target cell is MCF-7 with a time-target ratio of 5:1.
  • the target cell maximum lysis well (M), the target cell spontaneous release well (ST), the effector cell spontaneous release well (SE), the total volume correction blank well (BV) and the medium blank control well (BM) were set. After standing still for 10 minutes, centrifuge at 1000 rpm for 4 minutes at room temperature, and incubate for 4 hours in a 5% CO 2 , 37° C. carbon dioxide cell incubator. Add lysate to wells M and BV 45 minutes in advance, mix well, and centrifuge at 1000 rpm for 4 minutes at room temperature after incubation.
  • Monocytes were cultured in RPMI1640 medium containing 50ng/mL rhM-CSF (Kactus, CSF-HM401) for 10 days. Centrifuge and wash MCF-7 cells (or CD24-SKOV3 cells) with PBS. Then stained with CFSE and incubated at 37°C for 20 minutes. Add 50 ⁇ L of MCF-7 cells to the plate and add 50 ⁇ L of the bispecific antigen binding protein dilution to the cells. Add 100 ⁇ L of macrophage suspension to the cells and incubate at 37°C for 3 hours.
  • both 1-C2-IgG1 and 1-D2-IgG4 can significantly induce the phagocytosis of MCF-7 cells by macrophages, with EC 50 of 0.004nM and 0.002nM, respectively, and the phagocytosis is much stronger than that of IgG1 isotype control.
  • both 1-C2-IgG1 and 1-D2-IgG4 can significantly induce the phagocytosis of CD24-SKOV3 cells by macrophages . control.
  • the h4-1BB transgenic mouse purchased from Shanghai N forcing Model Biotechnology Co., Ltd.
  • colorectal cancer CD24-MC38 cells was constructed by the colorectal cancer cell line CD24-MC38 (Jiman Biology, GM-C15769) stably expressing human CD24 Subcutaneous tumor model. Resuscitate tumor cells, carry out cell culture and adjust the cell state to the best, and make cell suspension after digestion. When the cells were cultured to the logarithmic growth phase, the cells were collected, and the tumor cell suspension was injected subcutaneously into mice, and each mouse was inoculated with 100 ⁇ L of the cell suspension, containing 5 ⁇ 10 6 cells. When the subcutaneously grown tumors grew to about 100 mm 3 , the animals were randomly divided into groups according to the tumor volume, and treated with the bispecific antigen-binding protein.
  • the grouped tumor-bearing mice were given intraperitoneal injection of bispecific antigen-binding protein and PBS, 2 times a week, 10.0 mg/kg each time, 5 times in total.
  • TGI (%) [1-(average tumor volume at the end of administration of a treatment group-average tumor volume at the beginning of administration of this treatment group)/(average tumor volume at the end of treatment of the solvent control group Volume - average tumor volume at the beginning of treatment in the solvent control group)] ⁇ 100%.
  • the tumor growth curve of the mouse subcutaneous tumor model of colorectal cancer given to the bispecific antigen-binding protein is shown in Figure 13, where the abscissa indicates the number of days after starting treatment, and the ordinate indicates the tumor volume.
  • the tumor inhibition rate TGI (%) was 100%.

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Abstract

一种特异性抗原结合蛋白，其包含（a）特异性结合第一抗原的第一抗体或其抗原结合片段；和（b）特异性结合第二抗原的第二抗体或其抗原结合片段。具体的，所述第一抗原为CD24，并且所述第二抗原为4-1BB；或者，所述第一抗原为4-1BB，并且所述第二抗原为CD24。

Description

一种双特异性抗原结合蛋白 技术领域
本发明涉及肿瘤免疫疗法和分子免疫学领域，具体涉及一种特异性结合CD24和4-1BB的双特异性抗原结合蛋白。
背景技术
肿瘤靶向单克隆抗体是肿瘤免疫治疗领域的重要手段之一。巨噬细胞发挥吞噬效应需要两个信号同时起作用：一个是靶向细胞表面的“吃我”信号的激活，另一个是同一细胞表面“别吃我”信号的失活。任何一个信号的缺少都不足以引发吞噬效应的发生。CD24是一类“别吃我”信号，肿瘤细胞高表达CD24，通过与巨噬细胞表面的Siglec-10结合，释放“别吃我”信号，从而防止肿瘤细胞被巨噬细胞吞噬。
4-1BB(CD137，TNFRSF9)是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRS)的一种跨膜蛋白质。4-1BB在细胞表面以单体或二聚体形式表达，与其配体(4-1BBL)结合后通过三聚体化以进行信号传导，是CD8+和CD4+T细胞、调节性T细胞(Tregs)、NK细胞和NKT细胞、B细胞和中性粒细胞等的共刺激分子。在T细胞上，4-1BB并非组成型表达，而是在T细胞受体(TCR)激活后诱导的，通过其天然配体4-1BBL或抗体激动剂的刺激，经由TNFR相关因子(TRAF)-2和TRAF-1进行信号传导。4-1BB的早期信号传导涉及K-63的多泛素化，激活核因子(NF)-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径，信号传导导致T细胞的共刺激，细胞增殖，细胞因子产生，成熟和CD8+T细胞存活延长。
现有技术中没有可以同时特异性结合4-1BB和CD24的双特异性抗原结合蛋白的报道，本发明首次开发了结合4-1BB与CD24的双特异性抗原结合蛋白。本双特异性抗原结合蛋白同时具有以下优势：能够特异性识别CD24和4-1BB；能够通过NK细胞和巨噬细胞有效发挥对表达CD24的肿瘤细胞的ADCC作用和ADCP作用；可以依赖抗CD24端的交联作用，特异性激活4-1BB的信号通路，激活CD8+T细胞，从而可刺激T细胞增殖并分泌细胞因子，特异性杀伤表达CD24的肿瘤细胞，提高机体的抗肿瘤作用；还可以通过ADCC活性杀伤高表达4-1BB的调节性T细胞(Tregs)，解除肿瘤微环境的的免疫抑制，促进CD8+T 细胞的浸润，达到抗肿瘤的作用。
发明内容
本发明提供了一种双特异性抗原结合蛋白，包含：
(a)特异性结合第一抗原的第一抗体或其抗原结合片段；和
(b)特异性结合第二抗原的第二抗体或其抗原结合片段；
其中：
所述第一抗原为CD24，并且所述第二抗原为4-1BB；或者，所述第一抗原为4-1BB，并且所述第二抗原为CD24。
在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链；和
第二抗体或其抗原结合片段包含scFv；
其中，所述scFv连接于第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N端或C端。
在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段的一条重链的重链可变区与一条轻链的轻链可变区形成抗原结合部位，另一条重链的重链可变区与另一条轻链的轻链可变区形成抗原结合部位。
在可选的实施方案中，所述的双特异性抗原结合蛋白包含一个第一抗体或其抗原结合片段和一个或多个scFv。
在可选的实施方案中，所述的双特异性抗原结合蛋白包含一个第一抗体或其抗原结合片段和两个scFv。
在可选的实施方案中，一个所述scFv连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N端，另一个所述scFv连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的C端。
在可选的实施方案中，两个所述scFv分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链或两条轻链的N端；或者，两个所述scFv分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链或两条轻链的C端。
在可选的实施方案中，所述双特异性抗原结合蛋白包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，对于所述每条多肽链：
(a)所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的重链和所述scFv；和
(b)所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链。
在可选的实施方案中，所述双特异性抗原结合蛋白包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，对于所述每条多肽链：
(a)所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的重链；和
(b)所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链和所述scFv。
在可选的实施方案中，两条第一多肽链相同或不同，和/或两条第二多肽链相同或不同。
在可选的实施方案中，所述scFv的重链可变区与轻链可变区通过连接子L1连接，和/或所述两个scFv通过连接子L2分别与所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链或两条轻链的N端或C端连接。
在可选的实施方案中，所述连接子L1和连接子L2相同或不同。
在可选的实施方案中，所述连接子L1和/或连接子L2具有如(G 4S) x所示的氨基酸序列，x为选自1-6的整数；优选地，所述连接子L1和/或L2为(G 4S) 3或(G 4S) 4。
在可选的实施方案中，所述scFv的重链可变区和轻链可变区之间存在二硫键。
在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链包含重链可变区和重链恒定区，并且所述轻链包含轻链可变区和轻链恒定区；优选地，所述第一抗体或其抗原结合片段为全长抗体。
在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链包含第一Fc区和第二Fc区。
在可选的实施方案中，第一Fc区和第二Fc区是相同的Fc或不同的Fc。
在可选的实施方案中，所述Fc区选自IgG、IgA、IgD、IgE和/或IgM。
在可选的实施方案中，所述Fc区选自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4。
在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合CD24，并且所述scFv特异性结合4-1BB，其中，
所述第一抗体或其抗原结合片段包含：
(a)如SEQ ID NO：2所示的HCDR1，如SEQ ID NO：3所示的HCDR2，如SEQ ID NO：4所示的HCDR3；以及，如SEQ ID NO：6所示的LCDR1，如SEQ ID NO：7所示的LCDR2，如SEQ ID NO：8所示的LCDR3；或
(b)如SEQ ID NO：10所示的HCDR1，如SEQ ID NO：11所示的HCDR2，如SEQ ID NO：12所示的HCDR3；以及，如SEQ ID NO：14所示的LCDR1，如SEQ ID NO：15所示的LCDR2，如SEQ ID NO：16所示的LCDR3；
并且，所述scFv包含：
如SEQ ID NO：18所示的HCDR1，如SEQ ID NO：19所示的HCDR2，如SEQ ID NO：20所示的HCDR3；以及，如SEQ ID NO：22所示的LCDR1，如SEQ ID NO：23所示的LCDR2，如SEQ ID NO：24所示的LCDR3。
在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段包含：
(a)如SEQ ID NO：1所示的重链可变区VH，如SEQ ID NO：5所示的轻链可变区VL；或
(b)如SEQ ID NO：9所示的重链可变区VH，如SEQ ID NO：13所示的轻链可变区VL；
并且，所述scFv包含：
如SEQ ID NO：17所示的重链可变区VH，如SEQ ID NO：21所示的轻链可变区VL。
在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合4-1BB，并且所述scFv特异性结合CD24，其中，
所述第一抗体或其抗原结合片段包含：
如SEQ ID NO：18所示的HCDR1，如SEQ ID NO：19所示的HCDR2，如SEQ ID NO：20所示的HCDR3；以及，如SEQ ID NO：22所示的LCDR1，如SEQ ID NO：23所示的LCDR2，如SEQ ID NO：24所示的LCDR3。
并且，所述scFv包含：
(a)如SEQ ID NO：2所示的HCDR1，如SEQ ID NO：3所示的HCDR2，如SEQ ID NO：4所示的HCDR3；以及，如SEQ ID NO：6所示的LCDR1，如SEQ ID NO：7所示的LCDR2，如SEQ ID NO：8所示的LCDR3；或
(b)如SEQ ID NO：10所示的HCDR1，如SEQ ID NO：11所示的HCDR2，如SEQ ID NO：12所示的HCDR3；以及，如SEQ ID NO：14所示的LCDR1， 如SEQ ID NO：15所示的LCDR2，如SEQ ID NO：16所示的LCDR3。
在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段包含：
如SEQ ID NO：17所示的重链可变区VH，如SEQ ID NO：21所示的轻链可变区VL；
并且，所述scFv包含：
(a)如SEQ ID NO：1所示的重链可变区VH，如SEQ ID NO：5所示的轻链可变区VL；或
(b)如SEQ ID NO：9所示的重链可变区VH，如SEQ ID NO：13所示的轻链可变区VL。
在可选的实施方案中，所述的双特异性抗原结合蛋白包含：
(1)如SEQ ID NO：25所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：35所示的第二多肽链；
(2)如SEQ ID NO：25所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：36所示的第二多肽链；
(3)如SEQ ID NO：27所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：33所示的第二多肽链；
(4)如SEQ ID NO：28所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：33所示的第二多肽链；
(5)如SEQ ID NO：29所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：34所示的第二多肽链；
(6)如SEQ ID NO：30所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：34所示的第二多肽链；
(7)如SEQ ID NO：31所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：34所示的第二多肽链；
(8)如SEQ ID NO：32所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：34所示的第二多肽链；
(9)如SEQ ID NO：26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：37所示的第二多肽链；
(10)如SEQ ID NO：26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：38所示的第二多肽链；
(11)如SEQ ID NO：39所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：45所示的第二多肽链；
(12)如SEQ ID NO：40所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：45所示的第二多肽链；
(13)如SEQ ID NO：41所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：46所示的第二多肽链；
(14)如SEQ ID NO：42所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：46所示的第二多肽链；
(15)如SEQ ID NO：43所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：47所示的第二多肽链；或
(16)如SEQ ID NO：44所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：47所示的第二多肽链。
本发明还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码上述任一项所述的双特异性抗原结合蛋白的核苷酸序列；
优选地，所述分离的核酸分子包含编码上述任一项所述的双特异性抗原结合蛋白的第一多肽链的核苷酸序列；
优选地，所述分离的核酸分子包含编码上述任一项所述的双特异性抗原结合蛋白的第二多肽链的核苷酸序列。
本发明还提供了重组载体，其包含上述所述的分离的核酸分子。
本发明还提供了重组细胞，其包含上述所述的分离的核酸分子和/或上述所述的重组载体。
本发明还提供了一种双特异性抗原结合蛋白、核酸分子、重组载体和/或重组细胞在制备用于治疗和/或预防和/或诊断疾病的药物中的用途。
本发明还提供了一种双特异性抗原结合蛋白、核酸分子、重组载体和/或重组细胞在制备治疗癌症的药物中的用途。
术语
术语“双特异性抗原结合蛋白”是指能够与两个目标抗原或目标抗原表位特异性结合的蛋白分子。在本发明中，包含抗体或抗原结合片段(例如Fab、scFv等)的“双特异性抗原结合蛋白”与“双特异性抗体”、“双抗”可以互换使用。
术语“抗体”通常是指，由两对多肽链(每对具有一条轻链和一条重链)组成的免疫球蛋白分子。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成，重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成，轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。
术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A.等人，((1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中一些实施方式中使用的，CDR可以以Kabat规则定义轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，以及重链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)；本文中一些实施方式中使用的，CDR也可以以IMGT定义轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，以及重链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)。
术语“抗体”包括但不限于：单克隆抗体、鼠源抗体、骆驼抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、双特异性或多特异性抗体。这些抗体可以属于任何同种型/类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
术语“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指抗体的一个或多个保留结合所述抗体结合的抗原的能力的部分。在某些实施例中，抗体的“抗原结合片段”包括(1)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(2)F(ab′)2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(3)scFv片段，由抗体的VL和VH结构域组成，或由抗体的VH和VL结构域组成；(4)CDR，经分离互补决定区。
术语“多肽”是指任何长度的氨基酸链，而与修饰(例如磷酸化或糖基化)无关。 术语多肽包括蛋白质及其片段。多肽可以是“外源的”，意指它们是“异源的”，即是所利用的宿主细胞外来的，例如由细菌细胞产生的人多肽。本文将多肽公开为氨基酸残基序列。那些序列按氨基末端到羧基末端的方向从左到右书写。根据标准命名法，氨基酸残基序列以三字母或单字母代码命名，如下所示：丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。本文所述SEQ ID NO：2-4氨基酸位置的编号(例如Fc区的氨基酸残基)和目标区域(例如CDR)使用IMGT系统，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5-53氨基酸位置的编号(例如Fc区的氨基酸残基)和目标区域(例如CDR)使用Kabat系统。
术语“scFv”指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-连接子-VH-COOH或NH2-VH-连接子-VL-COOH。合适的现有技术连接子由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-6个重复的GGGGS氨基酸序列或其变体。
术语“宿主细胞”指已经或者能够用核酸序列转化并从而表达所选的目的基因的细胞。该术语包括亲本细胞的后代，无论该后代与原来的亲本细胞在形态或基因组成上是否相同，只要后代存在所选目的基因即可。常用的宿主细胞包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。
“ADCC”指抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity)，是指抗体的Fab段结合病毒感染的细胞或肿瘤细胞的抗原表位，其Fc段与杀伤细胞(NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等)表面的FcR结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞，是抗肿瘤的治疗性抗体药物发生作用的一种作用重要机制。
“ADCP”指抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(Antibody-Dependent Cellular  Phagocytosisi)，是用于识别和介导治疗性抗体作用与肿瘤细胞的一种重要机制。
有益效果
本双特异性抗原结合蛋白能够特异性识别CD24和4-1BB；能够通过NK细胞和巨噬细胞有效发挥对表达CD24的肿瘤细胞的ADCC作用和ADCP作用；可以依赖抗CD24端的交联作用，特异性激活4-1BB的信号通路，激活CD8+T细胞，从而可刺激T细胞增殖并分泌细胞因子，特异性杀伤表达CD24的肿瘤细胞，提高机体的抗肿瘤作用；还可以通过ADCC活性杀伤高表达4-1BB的调节性T细胞(Tregs)，解除肿瘤微环境的免疫抑制，促进CD8+T细胞的浸润，达到抗肿瘤的作用。
附图说明
图1a-1d为双特异性抗原结合蛋白的结构示意图。其中，图1a示意图中IgG部分为抗4-1BB抗体(抗4-1BB IgG)，将抗CD24抗体的轻重链可变区通过连接子L1连接，可形成scFv(VL CD24-L1-VH CD24或VH CD24-L1-VL CD24)，抗CD24scFv部分由连接子L2连接在抗4-1BB IgG轻链的N末端；图1b示意图中IgG部分为抗4-1BB抗体(抗4-1BB IgG)，将抗CD24抗体的轻重链可变区通过连接子L1连接，可形成scFv(VL CD24-L1-VH CD24或VH CD24-L1-VL CD24)，抗CD24scFv部分由连接子L2连接在抗4-1BB IgG重链的N末端；图1c示意图中IgG部分为抗CD24抗体(抗CD24IgG)，将抗4-1BB抗体的轻重链可变区通过连接子L1连接，可形成scFv(VL 4-1BB-L1-VH 4-1BB或VH 4-1BB-L1-VL 4-1BB)，抗4-1BB scFv部分由连接子L2连接在抗CD24IgG重链的C末端；图1d示意图中IgG部分为抗CD24抗体(抗CD24IgG)，将抗4-1BB抗体的轻重链可变区通过连接子L1连接，可形成scFv(VL 4-1BB-L1-VH 4-1BB或VH 4-1BB-L1-VL 4-1BB)，抗4-1BB scFv部分由连接子L2连接在抗CD24IgG轻链的C末端。
图2a-图2c为双特异性抗原结合蛋白与CHOK1-4-1BB细胞的结合活性示意图。
图3a-3b为双特异性抗原结合蛋白与CD24-MDA-MB-231细胞的结合活性示意图。
图4为双特异性抗原结合蛋白与MCF-7细胞的结合活性示意图。
图5为双特异性抗原结合蛋白在靶细胞CHOK1-CD24的存在下，对 HEK-293/NFκB-Luci/4-1BB细胞的激活作用示意图。
图6a-6b为双特异性抗原结合蛋白在靶细胞CD24-MDA-MB-231的存在下，对HEK-293/NFκB-Luci/4-1BB细胞的激活作用示意图。
图7为双特异性抗原结合蛋白在靶细胞SKOV3的存在下，对HEK-293/NFκB-Luci/4-1BB细胞的激活作用示意图。
图8为双特异性抗原结合蛋白在靶细胞MCF-7的存在下，对HEK-293/NFκB-Luci/4-1BB细胞的激活作用示意图。
图9a为用PBS预包板的PBMC释放细胞因子IFNγ的结果示意图。
图9b为用抗人CD3抗体预激活的PBMC释放细胞因子IFNγ的结果示意图。
图10为双特异性抗原结合蛋白对SKOV3细胞的杀伤实验结果示意图。
图11a-11b为双特异性抗原结合蛋白的ADCC效应示意图。
图12a-12b为双特异性抗原结合蛋白的ADCP效应示意图。
图13为双特异性抗原结合蛋白的体内药效结果示意图。
具体实施方式
本发明的实施例中，CD24单抗-1的重链如SEQ ID NO：48所示，轻链如SEQ ID NO：49所示；CD24单抗-2的重链如SEQ ID NO：50所示，轻链如SEQ ID NO：51所示；4-1BB单抗的重链如SEQ ID NO：52所示，轻链如SEQ ID NO：53所示。IgG1同型对照(Sino biological)和IgG4同型对照(Keytruda Merck)均为商业购买。
实施例1不同结构的双特异性抗原结合蛋白的制备
本发明的序列1为CD24单抗-1序列，序列2为CD24单抗-2序列，序列3为抗4-1BB抗体序列。序列1、序列2和序列3的CDR和可变区的氨基酸序列分别如表1所示。
表1
  序列1 序列2 序列3
重链可变区 SEQ ID NO：1 SEQ ID NO：9 SEQ ID NO：17
HCDR1 SEQ ID NO：2 SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：18
HCDR2 SEQ ID NO：3 SEQ ID NO：11 SEQ ID NO：19
HCDR3 SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：20
轻链可变区 SEQ ID NO：5 SEQ ID NO：13 SEQ ID NO：21
LCDR1 SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：22
LCDR2 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：23
LCDR3 SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：24
由序列1和序列3通过连接子L1和L2按照一定的顺序连接，可形成表2中的肽链。其中，双特异性抗原结合蛋白在本实施例中使用的连接子1(L1)和连接子2(L2)的序列结构相同，分别为3个GGGGS重复，即GGGGSGGGGSGGGGS。
表2
肽链名称 连接顺序 氨基酸序列
DBH1 VH 4-1BB-Fc4 SEQ ID NO：25
DBH2 VH CD24-Fc4 SEQ ID NO：26
DBH3 VL CD24-L1-VH CD24-L2-VH 4-1BB-Fc4 SEQ ID NO：27
DBH4 VH CD24-L1-VL CD24-L2-VH 4-1BB-Fc4 SEQ ID NO：28
DBH5 VH CD24-Fc4-L2-VL 4-1BB-L1-VH 4-1BB SEQ ID NO：29
DBH6 VH CD24-Fc4-L2-VH 4-1BB-L1-VL 4-1BB SEQ ID NO：30
DBH7 VH CD24-Fc1-L2-VL 4-1BB-L1-VH 4-1BB SEQ ID NO：31
DBH8 VH CD24-Fc1-L2-VH 4-1BB-L1-VL 4-1BB SEQ ID NO：32
DBL1 VL 4-1BB-CL SEQ ID NO：33
DBL2 VL CD24-CL SEQ ID NO：34
DBL3 VL CD24-L1-VH CD24-L2-VL 4-1BB-CL SEQ ID NO：35
DBL4 VH CD24-L1-VL CD24-L2-VL 4-1BB-CL SEQ ID NO：36
DBL5 VL CD24-CL-L2-VL 4-1BB-L1-VH 4-1BB SEQ ID NO：37
DBL6 VL CD24-CL-L2-VH 4-1BB-L1-VL 4-1BB SEQ ID NO：38
由序列2和序列3通过连接子L1和L2按照一定的顺序连接，可形成表3中的肽链。
表3
肽链名称 结构顺序 氨基酸序列
H1 VH CD24-L1-VL CD24-L2-VH 4-1BB-Fc1 SEQ ID NO：39
H2 VH CD24-L1-VL CD24-L2-VH 4-1BB-Fc4 SEQ ID NO：40
H3 VH CD24-Fc1-L2-VH 4-1BB-L1-VL 4-1BB SEQ ID NO：41
H4 VH CD24-Fc4-L2-VH 4-1BB-L1-VL 4-1BB SEQ ID NO：42
H5 VH CD24-Fc4 SEQ ID NO：43
H6 VH CD24-Fc1 SEQ ID NO：44
L1 VL 4-1BB-CL SEQ ID NO：45
L2 VL CD24-CL SEQ ID NO：46
L3 VL CD24-CL-L2-VH 4-1BB-L1-VL 4-1BB SEQ ID NO：47
由表2和表3中的肽链组合，可形成表4所示的双特异性抗原结合蛋白。
表4
Figure PCTCN2022133618-appb-000001
将上述设计的不同结构的双特异性抗原结合蛋白各条链进行基因合成，构建到人IgG框架中，而后利用分子克隆技术，将抗体片段插入PCDNA3.1载体中，构建成哺乳动物细胞表达质粒，利用脂质体转染方式，导入宿主细胞株CHO细 胞，利用细胞fed-batch获得发酵上清液，取发酵液上清进行亲和层析、离子交换层析等一系列步骤的纯化，最终纯化得到构建的抗体。对纯化后的抗体检测表达量、纯度、SDS-PAGE等，确认所述双特异性抗原结合蛋白。
实施例2双特异性抗原结合蛋白与CHOK1-4-1BB、CD24-MDA-MB-231、MCF-7的结合活性
用携带人4-1BB的慢病毒载体转导入CHOK1细胞系(ATCC)，分选细胞以建立人4-1BB稳定表达细胞系CHOK1-4-1BB。用携带人CD24的慢病毒载体转导入MDA-MB-231乳腺癌细胞系(ATCC)，分选细胞以建立人CD24稳定表达细胞系CD24-MDA-MB-231。天然肿瘤细胞系MCF-7来源于ATCC(美国模式培养物集存库)，高表达CD24。取各种类细胞转至离心管1000rpm离心5分钟。分别将100μL的各细胞铺于96U型板中，PBS洗2次。将不同结构的双特异性抗原结合蛋白以终浓度200nM起始，4倍稀释，6个梯度，100μL/孔添加到铺有肿瘤细胞的96U型板中。将细胞在37℃下孵育60分钟，然后用过量FACS缓冲液洗涤两次。将细胞重新悬浮于100μL FACS缓冲液中，加荧光二抗(FITC F(ab')2羊抗人IgG Fcγ抗体)添加到样品中，37℃下孵育30分钟并用过量FACS缓冲液洗涤两次。将细胞在固定缓冲液中固定，随后通过流式细胞术进行分析。实验结果如图2a-2c、图3a-3b和图4所示。
由图2a-2c可知，构建的不同结构的双特异性抗原结合蛋白与CHOK1-4-1BB细胞都有非常好的结合活性，EC 50达到0.5793-33.09μg/mL或2.188-15.31nM，结合活性都显著优于IgG1同型对照和IgG4同型对照。
由图3a-3b可知，构建的不同结构的双特异性抗原结合蛋白与CD24-MDA-MB-231细胞都有非常好的结合活性，EC 50达到14.32-106.9nM，结合活性都显著优于IgG1同型对照和IgG4同型对照。
由图4可知，构建的不同结构的双特异性抗原结合蛋白与MCF-7细胞都有很好的结合活性，EC 50达到11.16-36.95nM，显著优于4-1BB单抗。
实施例3双特异性抗原结合蛋白对HEK-293/NFκB-Luci/4-1BB细胞的激活作用
通过酶标仪检测细胞荧光值，反应出不同结构的双特异性抗原结合蛋白在不 同靶细胞(CHOK1-CD24、CD24-MDA-MB-231、MCF-7、SKOV3)的存在下，对HEK-293/NFκB-Luci/4-1BB细胞的激活作用。其中，SKOV3来源于中国科学院细胞库。
将HEK-293/NFκB-Luci/4-1BB细胞(购自瀚科迈博)(3×10 4个/孔，40μL/孔)铺于96孔板中，再加入各靶细胞40μL，1×10 4个/孔。再分别加入各结构的抗体，抗体终浓度200nM起始，5倍稀释，8个梯度，20μL/孔。将96孔板于37℃培养箱孵育18h，最后加入显色剂显色，在570nm处检测荧光值。实验结果如图5、图6a-6b、图7和图8所示。
由图5可知，双特异性抗原结合蛋白在靶细胞CHOK1-CD24的存在下，对HEK-293/NFκB-Luci/4-1BB细胞有很好的激活作用，EC 50达到0.2184-5.505nM，4-1BB单抗没有激活作用。
由图6a-6b可知，双特异性抗原结合蛋白在靶细胞CD24-MDA-MB-231的存在下，对HEK-293/NFκB-Luci/4-1BB细胞有很好的激活作用，EC 50达到0.5113-10.27nM，4-1BB单抗没有激活作用。
由图7可知，双特异性抗原结合蛋白在靶细胞SKOV3的存在下，对HEK-293/NFκB-Luci/4-1BB细胞有很好的激活作用，EC 50达到0.7292-1.481nM，4-1BB单抗没有激活作用。
由图8可知，双特异性抗原结合蛋白在靶细胞MCF-7的存在下，对HEK-293/NFκB-Luci/4-1BB细胞有很好的激活作用，EC 50达到0.48-0.9688nM，4-1BB单抗与CD24单抗-2均没有激活作用。
由此可知，双特异性抗原结合蛋白在靶细胞CHOK1-CD24、CD24-MDA-MB-231、MCF-7或SKOV3存在的情况下，通过CD24端的交联作用，对4-1BB信号通路有很强的激活活性。
实施例4双特异性抗原结合蛋白激活PBMC释放细胞因子的能力及对肿瘤细胞的杀伤作用
将1x10 6个细胞/mL的PBMC用5μg/mL的抗人CD3抗体(BioGems；FPB004-C)或是等量的PBS在37℃条件下预激活24h。将靶细胞SKOV3按照5000个/100μL/孔进行铺板，在37℃条件下孵育过夜后，弃掉靶细胞板培养基，更换为1640+10％FBS，50μL/孔。然后加入各不同结构的抗体50μL/孔，抗体按 照终浓度100nM起始，6倍稀释。同时按照效靶比5:1加入预激活的PBMC。在37℃条件下孵育24h后取上清，用ELISA法，用试剂盒(R&D Systems，SIF50)检测IFN-γ的释放量。剩下的细胞以20μL/孔加入CCK8显色液，在37℃条件下孵育4h后用酶标仪在490nm处检测OD值，分析靶细胞存活率。实验结果如图9a-9b和图10所示。其中，图9a为用PBS预包板的PBMC释放细胞因子IFNγ的结果，图9b为用抗人CD3抗体预激活的PBMC释放细胞因子IFNγ的结果。
由图9a-9b可知，相比于IgG1同型对照，1-C2-IgG4能以剂量依赖的方式激活用PBS预包板或抗人CD3抗体预激活的PBMC释放细胞因子IFNγ。CD24单抗-1和4-1BB单抗在任何剂量都不能激活PBMC释放细胞因子IFNγ。
由图10可知，1-C2-IgG4显示出对SKOV3细胞的杀伤能力，杀伤率大于10％，而4-1BB单抗仅在高浓度的情况下才显示出对SKOV3细胞的弱杀伤，表明1-C2-IgG4杀伤靶细胞是靶细胞依赖的特异性杀伤。
实施例5双特异性抗原结合蛋白对靶细胞的ADCC活性
使用CHOK1-4-1BB或MCF-7细胞，1000rpm室温离心4分钟并使用RPMI1640基础培养基(含5％FBS)重悬后，以1×10 4/孔、50μL/孔铺于96孔板；使用RPMI1640基础培养基(含5％FBS)稀释构建的双抗至50nM，而后5倍梯度稀释，共7个浓度梯度，100μL/孔；重悬NK细胞，以50μL/孔加入对应孔中，其中靶细胞为CHOK1-4-1BB时效靶比为3：1，靶细胞为MCF-7时效靶比为5：1。同时设置靶细胞最大裂解孔(M)、靶细胞自发释放孔(ST)、效应细胞自发释放孔(SE)、总体积校正空白孔(BV)和培养基空白对照孔(BM)。静置10分钟后，1000rpm室温离心4分钟，于5％CO 2、37℃二氧化碳细胞培养箱中孵育4h。提前45分钟在M、B-V孔加入裂解液，混匀，孵育结束后1000rpm室温离心4分钟。吸取50μL上清至LDH分析板，加入50μL/孔分析缓冲液(assay buffer)溶解的底物，室温避光反应30分钟。加入50μL/孔终止液，静置10分钟，于490nm进行读数，计算细胞死亡率。
Figure PCTCN2022133618-appb-000002
由图11a可知，IgG1同型对照和IgG4同型对照未显示对CHOK-4-1BB细胞的杀伤，2-D2-IgG1显示对CHOK-4-1BB细胞的裂解死亡，且呈浓度依赖性， EC 50为1.211nM。
由图11b可知，IgG1同型对照和IgG4同型对照未显示对MCF-7细胞的杀伤，2-C2-IgG1和2-D2-IgG1均显示对MCF-7细胞的裂解死亡，且呈浓度依赖性，EC 50分别为0.1516nM和0.4143nM。
实施例6双特异性抗原结合蛋白的ADCP效应
单核细胞在含有50ng/mL rhM-CSF(Kactus，CSF-HM401)的RPMI1640培养基中培养10天。离心并用PBS洗涤MCF-7细胞(或CD24-SKOV3细胞)。然后用CFSE染色，37℃孵育20分钟。向板中加入50μL MCF-7细胞，将50μL双特异性抗原结合蛋白稀释液加入细胞中。向细胞中加入100μL巨噬细胞悬液，37℃孵育3小时。离心并弃去上清液，将100μL APC标记的抗人CD14(eBioscienceTM,17-0149-42)添加到细胞中，4℃孵育20分钟。离心并用FACS缓冲液洗涤细胞两次，用FACS缓冲液重悬细胞。通过流式细胞术测试，结果如图12a-12b。
由图12a可知，1-C2-IgG1和1-D2-IgG4都能显著诱导巨噬细胞对MCF-7细胞的吞噬作用，EC 50分别为0.004nM和0.002nM，吞噬作用远远强于IgG1同型对照。
由图12b可知，1-C2-IgG1和1-D2-IgG4都能显著诱导巨噬细胞对CD24-SKOV3细胞的吞噬作用，EC 50分别为0.013nM和0.004nM，吞噬作用远远强于IgG1同型对照。
实施例7双特异性抗原结合蛋白对CD24-MC38移植瘤的体内药效
通过稳定表达人CD24的结直肠癌细胞系CD24-MC38(吉满生物，GM-C15769)，构建h4-1BB转基因小鼠(购自上海南方模式生物科技股份有限公司)结直肠癌CD24-MC38细胞皮下瘤模型。复苏肿瘤细胞，进行细胞培养并调整细胞状态至最佳，消化后制成细胞悬液。细胞培养至对数生长期时，收集细胞，将肿瘤细胞悬液注射到小鼠皮下，每只接种100μL细胞悬液，包含5×10 6个细胞。当皮下生长的肿瘤生长至100mm 3左右时，将动物按肿瘤体积随机分组，并给与双特异性抗原结合蛋白治疗。
分别给与分组后的荷瘤小鼠腹腔注射双特异性抗原结合蛋白和PBS，每周给 药2次，每次10.0mg/kg，共给药5次。
化合物的抑瘤疗效用TGI(％)评价。TGI(％)的计算公式为：TGI(％)＝【1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积－溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)】×100％。
小鼠结直肠癌皮下瘤模型荷瘤鼠给予双特异性抗原结合蛋白的肿瘤生长曲线如图13所示，其中横坐标表示开始治疗后的天数，纵坐标表示肿瘤体积。肿瘤抑瘤率TGI(％)为100％。
由图13可知，1-C2-IgG4有很好的肿瘤抑制作用，且肿瘤体积下降非常显著。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims (29)

  1. 一种双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，包含：
    (a)特异性结合第一抗原的第一抗体或其抗原结合片段；和
    (b)特异性结合第二抗原的第二抗体或其抗原结合片段；
    其中：
    所述第一抗原为CD24，并且所述第二抗原为4-1BB；或者，所述第一抗原为4-1BB，并且所述第二抗原为CD24。
  2. 根据权利要求1所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，
    第一抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链；和
    第二抗体或其抗原结合片段包含scFv；
    其中，所述scFv连接于第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N端或C端。
  3. 根据权利要求1或2所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一抗体或其抗原结合片段的一条重链的重链可变区与一条轻链的轻链可变区形成抗原结合部位，另一条重链的重链可变区与另一条轻链的轻链可变区形成抗原结合部位。
  4. 根据权利要求2或3所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，其包含一个第一抗体或其抗原结合片段和一个或多个scFv。
  5. 根据权利要求4所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，其包含一个第一抗体或其抗原结合片段和两个scFv。
  6. 根据权利要求5所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，一个所述scFv连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N端，另一个所述scFv连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的C端。
  7. 根据权利要求5所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，两个所述scFv分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链或两条轻链的N端；或者，两个所述scFv分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链或两条轻链的C端。
  8. 根据权利要求7所述的双特异性抗原结合蛋白，其包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，其特征在于，对于所述每条多肽链：
    (a)所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的重链和所述scFv；和
    (b)所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链。
  9. 根据权利要求7所述的双特异性抗原结合蛋白，其包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，其特征在于，对于所述每条多肽链：
    (a)所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的重链；和
    (b)所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链和所述scFv。
  10. 根据权利要求8或9所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，两条第一多肽链相同或不同，和/或两条第二多肽链相同或不同。
  11. 根据权利要求8-10任一项所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述scFv的重链可变区与轻链可变区通过连接子L1连接，和/或所述两个scFv通过连接子L2分别与所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链或两条轻链的N端或C端连接。
  12. 根据权利要求11所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述连接子L1和连接子L2相同或不同。
  13. 根据权利要求12所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述连接子L1和/或连接子L2具有如(G 4S) x所示的氨基酸序列，x为选自1-6的整数；优选地，所述连接子L1和/或L2为(G 4S) 3或(G 4S) 4。
  14. 根据权利要求2-13任一项所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述scFv的重链可变区和轻链可变区之间存在二硫键。
  15. 根据权利要求1-14任一项所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链包含重链可变区和重链恒定区，并且所述轻链包含轻链可变区和轻链恒定区；优选地，所述第一抗体或其抗原结合片段为全长抗体。
  16. 根据权利要求1-15任一项所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链包含第一Fc区和第二Fc区。
  17. 根据权利要求16所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，第一Fc区和第二Fc区是相同的Fc或不同的Fc。
  18. 根据权利要求16或17所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所 述Fc区选自IgG、IgA、IgD、IgE和/或IgM。
  19. 根据权利要求18所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述Fc区选自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4。
  20. 根据权利要求1-19任一项所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合CD24，并且所述scFv特异性结合4-1BB，其中，
    所述第一抗体或其抗原结合片段包含：
    (a)如SEQ ID NO：2所示的HCDR1，如SEQ ID NO：3所示的HCDR2，如SEQ ID NO：4所示的HCDR3；以及，如SEQ ID NO：6所示的LCDR1，如SEQ ID NO：7所示的LCDR2，如SEQ ID NO：8所示的LCDR3；或
    (b)如SEQ ID NO：10所示的HCDR1，如SEQ ID NO：11所示的HCDR2，如SEQ ID NO：12所示的HCDR3；以及，如SEQ ID NO：14所示的LCDR1，如SEQ ID NO：15所示的LCDR2，如SEQ ID NO：16所示的LCDR3；
    并且，所述scFv包含：
    如SEQ ID NO：18所示的HCDR1，如SEQ ID NO：19所示的HCDR2，如SEQ ID NO：20所示的HCDR3；以及，如SEQ ID NO：22所示的LCDR1，如SEQ ID NO：23所示的LCDR2，如SEQ ID NO：24所示的LCDR3。
  21. 根据权利要求20所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一抗体或其抗原结合片段包含：
    (a)如SEQ ID NO：1所示的重链可变区VH，如SEQ ID NO：5所示的轻链可变区VL；或
    (b)如SEQ ID NO：9所示的重链可变区VH，如SEQ ID NO：13所示的轻链可变区VL；
    并且，所述scFv包含：
    如SEQ ID NO：17所示的重链可变区VH，如SEQ ID NO：21所示的轻链可变区VL。
  22. 根据权利要求1-19任一项所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合4-1BB，并且所述scFv特异性结合CD24，其中，
    所述第一抗体或其抗原结合片段包含：
    如SEQ ID NO：18所示的HCDR1，如SEQ ID NO：19所示的HCDR2，如SEQ ID NO：20所示的HCDR3；以及，如SEQ ID NO：22所示的LCDR1，如SEQ ID NO：23所示的LCDR2，如SEQ ID NO：24所示的LCDR3。
    并且，所述scFv包含：
    (a)如SEQ ID NO：2所示的HCDR1，如SEQ ID NO：3所示的HCDR2，如SEQ ID NO：4所示的HCDR3；以及，如SEQ ID NO：6所示的LCDR1，如SEQ ID NO：7所示的LCDR2，如SEQ ID NO：8所示的LCDR3；或
    (b)如SEQ ID NO：10所示的HCDR1，如SEQ ID NO：11所示的HCDR2，如SEQ ID NO：12所示的HCDR3；以及，如SEQ ID NO：14所示的LCDR1，如SEQ ID NO：15所示的LCDR2，如SEQ ID NO：16所示的LCDR3。
  23. 根据权利要求22所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述第一抗体或其抗原结合片段包含：
    如SEQ ID NO：17所示的重链可变区VH，如SEQ ID NO：21所示的轻链可变区VL；
    并且，所述scFv包含：
    (a)如SEQ ID NO：1所示的重链可变区VH，如SEQ ID NO：5所示的轻链可变区VL；或
    (b)如SEQ ID NO：9所示的重链可变区VH，如SEQ ID NO：13所示的轻链可变区VL。
  24. 根据权利要求1-23任一项所述的双特异性抗原结合蛋白，其特征在于，所述的双特异性抗原结合蛋白包含：
    (1)如SEQ ID NO：25所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：35所示的第二多肽链；
    (2)如SEQ ID NO：25所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：36所示的第二多肽链；
    (3)如SEQ ID NO：27所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：33所示的第二多肽链；
    (4)如SEQ ID NO：28所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：33所示的第二多肽链；
    (5)如SEQ ID NO：29所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：34所示的第 二多肽链；
    (6)如SEQ ID NO：30所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：34所示的第二多肽链；
    (7)如SEQ ID NO：31所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：34所示的第二多肽链；
    (8)如SEQ ID NO：32所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：34所示的第二多肽链；
    (9)如SEQ ID NO：26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：37所示的第二多肽链；
    (10)如SEQ ID NO：26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：38所示的第二多肽链；
    (11)如SEQ ID NO：39所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：45所示的第二多肽链；
    (12)如SEQ ID NO：40所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：45所示的第二多肽链；
    (13)如SEQ ID NO：41所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：46所示的第二多肽链；
    (14)如SEQ ID NO：42所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：46所示的第二多肽链；
    (15)如SEQ ID NO：43所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：47所示的第二多肽链；或
    (16)如SEQ ID NO：44所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：47所示的第二多肽链。
  25. 一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-24任一项所述的双特异性抗原结合蛋白的核苷酸序列；
    优选地，所述分离的核酸分子包含编码权利要求1-24任一项所述的双特异性抗原结合蛋白的第一多肽链的核苷酸序列；
    优选地，所述分离的核酸分子包含编码权利要求1-24任一项所述的双特异性抗原结合蛋白的第二多肽链的核苷酸序列。
  26. 重组载体，其包含权利要求25所述的分离的核酸分子。
  27. 重组细胞，其包含权利要求25所述的分离的核酸分子和/或权利要求24所述的重组载体。
  28. 权利要求1-24任一项所述的双特异性抗原结合蛋白、权利要求25所述的核酸分子、权利要求26所述的重组载体或权利要求27所述的重组细胞在制备用于治疗和/或预防和/或诊断疾病的药物中的用途。
  29. 权利要求1-24任一项所述的双特异性抗原结合蛋白、权利要求25所述的核酸分子、权利要求26所述的重组载体或权利要求27所述的重组细胞在制备治疗癌症的药物中的用途。
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