CN117321087A - 包含与细胞因子融合用于nk细胞衔接的nkp46结合位点、癌抗原结合位点的多特异性蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了多特异性蛋白质，这些多特异性蛋白质与NK细胞上的NKp46和细胞因子受体结合，并且任选地进一步结合NK细胞上的CD16A，并且还与靶细胞(例如癌细胞)上的感兴趣的抗原(例如癌抗原)结合。这些多特异性蛋白质能够增加NK细胞对表达该感兴趣的抗原的靶细胞(例如，导致疾病的细胞、癌细胞)的细胞毒性。

Description

包含与细胞因子融合用于nk细胞衔接的nkp46结合位点、癌抗 原结合位点的多特异性蛋白质
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年3月26日提交的美国临时申请第63/166,374号的权益，该临时申请的公开内容全文以引用方式并入本文；包括任何附图和序列表。
序列表参考
本申请连同电子格式的序列表一起提交。序列表以2022年3月22日创建的名称为“NKp46-12 PCT_ST25 txt”的文件提供，其大小为820KB。该序列表的电子格式中的信息全文以引用方式并入本文。
技术领域
提供了经由与多种受体相互作用而结合并特异性地重定向效应细胞以裂解感兴趣的靶细胞的多特异性蛋白质。这些蛋白质可用于治疗疾病，特别是癌症或感染性疾病。
背景技术
白介素2(IL2或IL-2)是作用于由NK细胞表达的细胞因子受体的多能细胞因子的一个示例。IL-2主要由活化的T细胞，尤其是CD4+T辅助性细胞产生，并且在辅助B细胞、T细胞和NK细胞的增殖和分化中起作用。IL-2还是Treg功能和存活所必需的。在真核细胞中，人IL-2(uniprot：P60568)被合成为具有20个残基信号序列的153个氨基酸的前体肽，从而产生具有SEQ ID NO:404的氨基酸序列的成熟分泌的IL-2。白介素2具有四个反向平行的两亲性α螺旋。这四个α螺旋是形成其功能所必需的四级结构。在大多数情况下，IL-2通过三种不同受体起作用：白介素2受体α(IL-2Rα；CD25)、白介素2受体β(IL-2Rβ；CD122)和白介素2受体γ(IL-2Rγ；CD132)。IL-2Rβ和IL-2Rγ是IL-2信号传导所必需的，虽然IL-2Rα(CD25)不是信号传导所必需的，但可赋予IL-2与受体的高亲和力结合。由IL-2Rα、β和γ的组合形成的三聚体受体(IL-2αβγ)是IL-2高亲和力受体(KD约10pM)，二聚体受体(IL-2βγ)是中等亲和力受体(KD约1nM)。
免疫细胞表达二聚体或三聚体IL-2受体。二聚体受体在细胞毒性CD8+T细胞和自然杀伤细胞(NK)上表达，而三聚体受体主要在活化淋巴细胞和CD4+CD25+FoxP3抑制性调节性T细胞(Treg)上表达。因为静息效应T细胞和NK细胞在细胞表面上不具有CD25，所以它们对IL-2相对不敏感。Treg细胞在体内始终表达最高水平的CD25。由于通常存在于组织中的低浓度的IL-2，IL-2优先激活表达高亲和力受体复合物(CD25:CD122:CD132)的细胞，因此在正常情况下，IL-2将优先刺激Treg细胞增殖。
IL-15、IL-12、IL-7、IL-27、IL-18、IL-21和IFN-α共享与IL-2的受体结合、复合物组装和信号传导的许多方面。例如，IL-15、IL-21和IL-7像IL-2一样都经由共同的γ链受体(CD132)作用于NK细胞。IL-15与IL-15受体(IL-15R)结合，该受体由三个亚基：IL-15Rα、CD122和CD132组成。这些亚基中的两者(即CD122和CD132)与IL-2的受体共享，但IL-2受体具有附加亚基(CD25)。IL-15Rα(CD215)以非常高的亲和力特异性地结合IL15，并且能够独立于其他亚基而结合IL-15。IL-21是I型细胞因子的另一个示例，并且其IL-21受体(IL-21R)已被证明与IL-2/IL-15受体共同γ链(CD132)形成异源二聚体受体复合物。
NK细胞具有介导抗肿瘤免疫的潜力。然而，当IL-2与IFN-α一起施用时，NK细胞已被证明通过它们的过度活化以及分泌多种炎性细胞因子而在小鼠中引起毒性(Rothschilds等人，Oncoimmunology.，2019年，第8卷第5期：)。此外，NK细胞还被证明引起细胞因子IL-15的毒性，该细胞因子也通过IL-2Rβy进行传导信号(参见引用以下文献的WO2020247843：Guo等人，J Immunol.，2015年，第195卷第5期：第2353-64页)。
由细胞因子诸如IL-2介导的免疫毒性的一个潜在解决方案是将该细胞因子与肿瘤特异性抗体融合或缔合。然而，据发现，虽然IL-2与抗肿瘤抗体在体内抗肿瘤中确实有协同作用，但在相同分子中包含IL-2和抗肿瘤抗原抗体没有呈现出疗效或毒性优势。IL-2部分完全控制生物分布，这解释了以下观察结果：当与抗体组合时，识别无关抗原的免疫细胞因子的表现与肿瘤特异性免疫细胞因子相当(Tzeng等人，Proc Natl Acad Sci USA.，2015年3月17日，第112卷第11期：第3320-332页)。
关于细胞因子对NK细胞的影响的研究通常集中在单一细胞因子或简单的组合。最近，已经报道了单独和组合的IL-15、IL-18、IL-21和IFN-α，以及它们与IL-2协同作用的潜力，并且非常低浓度的先天性和适应性共同γ链细胞因子与同样低浓度的IL-18协同作用以驱动快速和有效的NK细胞的CD25和IFN-γ表达(Nielsen等人，Front Immunol.，2016年，第7卷：第101页)。然而，向人类施用细胞因子涉及毒性，这使得与细胞因子的组合治疗具有挑战性。此外，对NK细胞中的细胞因子受体信号传导途径与其他活化受体之间的潜在协同作用或相互作用知之甚少。因此，需要在疾病、特别是癌症的治疗中动员NK细胞的新方法。
发明内容
本发明源于对功能性多特异性蛋白质的这种发现：这些功能性多特异性蛋白质与NK细胞上的NKp46和细胞因子受体结合，并且任选地进一步结合NK细胞上的CD16A，并且还与靶细胞(例如癌细胞)上的感兴趣的抗原(例如癌抗原)结合。这些多特异性蛋白质能够增加NK细胞对表达该感兴趣的抗原的靶细胞(例如，导致疾病的细胞、癌细胞)的细胞毒性。
据信多特异性蛋白质在NK细胞表面以顺式与NKp46和细胞因子受体(并且任选地进一步通过CD16A)结合的能力导致特别有利的细胞表面受体信号传导，继而导致NK细胞的有效抗肿瘤应答。
已知IL2-介导的免疫毒性由NK细胞驱动。然而，本公开的带有IL-2部分的多特异性蛋白质表现出强的NK细胞介导的抗肿瘤活性而没有免疫毒性。与单独的细胞因子相比，在多特异性蛋白质中掺入细胞因子使细胞因子-受体介导的活性在NK细胞中的效力增加两个数量级。同时，当结合NKp46和CD16A两者并且包含细胞因子(IL-2变体)(该细胞因子基本上保留了对其在野生型IL-2的NK细胞上的受体的亲和力)时，多特异性蛋白质示出了用于诱导肿瘤细胞的细胞毒性的EC50，这远低于该蛋白质诱导NK细胞增殖的EC50。因此，多特异性蛋白质在它们开始诱导显著的细胞因子-受体信号传导和/或NK细胞增殖的浓度下，甚至当细胞因子被减毒时，在激活NK细胞介导的细胞毒性方面将是高度有效的。这可以解释所观察到的毒性缺乏，因为所使用(例如施用)的蛋白质的浓度(例如剂量)可以是高度有效的，但仍保持低于引起NK细胞介导的免疫毒性的水平。因此，这些蛋白质代表了一种通用平台，该通用平台能够容易地整合不同细胞因子和细胞因子的不同减毒水平。
当将该蛋白质制成掺入CD122 ABD(其体现为失去与CD25的结合的IL2变体)时，与天然IL-2相比，多特异性蛋白质在诱导Treg细胞中的信号传导和/或活化的能力方面表现出4-log降低。当与前述的和天然IL-2相比诱导NK细胞中的信号传导的能力的2-log增加组合时，与在Tregs中相比，多特异性蛋白质在诱导NK细胞中的细胞因子受体信号传导的效力方面具有1,000,000倍的增加。因此，结合CD122的多特异性蛋白质可以这样的浓度使用：其中它们介导NK细胞增殖和/或浸润，同时尽量减少可能对抗肿瘤应答造成负面影响的Treg增殖。
尽管所采用的蛋白质被设计成仅以单价方式结合其在肿瘤细胞上的靶标，但这些蛋白质表现出高度有利的体内功效。通过避免由与肿瘤细胞上的靶抗原的多价结合引起的亲和力增加，与肿瘤抗原、NKp46(和CD16A)和细胞因子受体的单价结合使多特异性蛋白质易于调节。据观察，每种ABD(即，肿瘤抗原ABD、CD16A ABD、NKp46 ABD和细胞因子受体ABD)对体内NK细胞介导的抗肿瘤活性的增强做出了不同贡献。将具有单价肿瘤抗原结合的示例性蛋白质掺入具有亲和力的细胞因子，该亲和力使得这些蛋白质与NK细胞上的该细胞因子的受体结合，并且该亲和力不高于由NKp46 ABD赋予NKp46的亲和力。抗肿瘤细胞活性高于相当的常规抗体，即使常规抗体是以二价结合的，因此通常对其靶标具有相当高的结合亲和力。
在体内，多特异性蛋白质显著增加肿瘤中的NK细胞浸润；与共享相同抗肿瘤VH/VL对的金标准ADCC诱导性抗体奥妥珠单抗(obinutuzumab)的1.3倍增加相比，以及与缺乏CD122 ABD的相同多特异性蛋白质的1.6倍增加相比，多特异性蛋白质导致肿瘤中表达NKp46的NK细胞的9倍增加。
这些示例使用变体IL-2细胞因子(IL-2v)，该细胞因子经修饰以降低对其在T细胞(CD25)上的受体的亲和力，但基本上保留了对其在NK细胞上的受体(CD122和/或CD132)的基本上全部的亲和力(与野生型IL-2相当)。结合NKp46的结构域(以包含在Fab或scFv中的VH/VL对为例)、结合CD16的Fc结构域和细胞因子在该蛋白质内彼此相邻串联放置，各自仅通过短的柔性肽接头与相邻元件(即，NKp46 ABD、Fc结构域或细胞因子)分开。多特异性蛋白质的这些构型被设计为呈递相应抗原结合结构域以便允许NKp46和细胞因子受体在相同细胞表面平面上的共衔接(即，在NKp46中，细胞因子受体(和另外的CD16A)以顺式结合)。此外，这些示例使用结合CD16A的Fc结构域，表明与CD16A结合不会对肿瘤和靶向NK的生物分布造成负面影响，而是导致NKp46、CD16A和细胞因子受体的三重共衔接，并且继而允许掺入一种细胞因子，该细胞因子保留了对其在NK细胞上的受体的结合亲和力。通过掺入多特异性蛋白质抗NKp46VH/VL结构域而在KD的低纳摩尔范围(KD为约15nM)内赋予对NKp46的结合亲和力，可使用保留了对其在NK细胞上的受体的良好亲和力(任选地基本上全部的结合亲和力)的细胞因子，从而足以介导NK细胞中的有效信号传导。通常，细胞因子(诸如本文所述的细胞因子)通常具有与其在NK细胞上的受体结合的亲和力，该亲和力不强于多特异性蛋白质对NKp46的亲和力(亲和力可确定为KD)。
考虑到这些结果，据信将细胞因子(例如1型细胞因子(诸如IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27或IL-12细胞因子、IL-18细胞因子)或1型干扰素(例如IFN-α、IFN-β))靶向带有NKp46的NK细胞表面，从而促进向细胞因子的受体(例如IL2/15βγ、IL-21R、IL-7Ra、IL-27Ra、IL-12R、IL-18R、IFNAR)的顺式呈递，如图1所示的细胞因子IL2和细胞因子受体复合物IL2βγ)。如本文所示，紧邻结合CD16A的ABD或结合NKp46的ABD(并且在其C末端侧上)放置的IL2v允许发生三重受体顺式呈递(IL2v通过具有少至五个氨基酸残基的接头肽连接至相邻结构域)。有利地，使用二聚体Fc结构域nas、结合CD16A的ABD提供了FcRn，继而赋予足够长的半衰期以在体内诱导肿瘤浸润和NK细胞的增殖。
针对NK细胞上的NKp46的多特异性蛋白质具有以下优点：这些蛋白质允许使用和/或测试一系列细胞因子，而不需要降低对其在NK细胞上的受体(例如CD122)的结合亲和力。因此，可对细胞因子进行或不进行修饰以减弱或降低对其受体的结合亲和力。因此，针对NK细胞上的NKp46的多特异性蛋白质可利用以野生型形式存在的几种细胞因子中的任一种，特别是在细胞因子对其在NK细胞上的受体的活性没有显著降低的情况下，以及/或者在细胞因子对其受体的亲和力不强于NKp46 ABD对NKp46的亲和力的情况下。因此，在任何实施方案中，可将细胞因子ABD(例如多特异性蛋白质内的细胞因子部分)指定为对其在NK细胞上的受体具有结合亲和力和/或活性(例如诱导信号传导)，该结合亲和力和/或活性与细胞因子的野生型形式的结合亲和力和/或活性相比没有显著降低。任选地，细胞因子部分在NK细胞上的其受体(例如CD122)处诱导信号转导，该信号转导是用细胞因子的野生型形式观察到的信号转导的至少70％或80％。因此，在任何实施方案中，可将细胞因子ABD(例如多特异性蛋白质内的细胞因子部分)指定为对其在NK细胞上的受体具有亲和力，该亲和力与细胞因子的野生型形式的亲和力相比没有显著降低。在一些实施方案中，细胞因子部分对其在NK细胞上的受体在(例如CD122)具有结合亲和力，该结合亲和力在细胞因子的野生型形式的结合亲和力的3-log、2-log或1-log内(例如，细胞因子部分具有与细胞因子受体结合的KD，该KD比所观察到的细胞因子的野生型形式的KD高不超过3-log、2-log或1-log)。亲和力可以是与重组受体蛋白质结合的KD，如使用SPR所测定的。可将细胞因子的信号传导或受体结合亲和力指定为当掺入在其他方面等价的多特异性蛋白质中时。
因此，高疗效与低免疫毒性的组合是治疗分子的一个特殊优势，该治疗分子组合了结合个体NK细胞上的NKp46、细胞因子受体(例如CD122)和另外的CD16A中的每一者的能力，特别是对于具有长的体内半衰期的治疗剂而言。具体地，结合FcRn的Fc结构域的掺入允许足够长的半衰期，从而允许NK细胞在体内的肿瘤部位处增殖和累积。
多特异性蛋白质是特别有利的，因为其不仅在增强NK细胞活性(例如NK细胞增殖、活化、细胞毒性和/或细胞因子释放，包括通过肿瘤浸润的NK细胞)方面具有高效力，而且还具有低免疫毒性，如通过细胞因子IL-6和TNF-α的低全身增加或释放所证明的。本公开提供了使用蛋白质形式的示例，这些蛋白质形式允许NKp46与细胞因子受体(例如CD122)和CD16A结合结构域之间有足够的距离以允许所有三种受体与单个NK细胞结合，从而提供组合的NK细胞受体活化。重要的是，在单个细胞上的组合结合可以解释表达NKp46和/或表达CD16的效应细胞(例如，NK细胞)的最小的脱靶免疫毒性并且没有自相残杀，因为多特异性蛋白质除了与NKp46和/或CD16+效应细胞表面上的细胞因子受体(例如，CD122)结合之外，还与至少一种活化受体结合。
多特异性蛋白质具有进一步的优势，因为它们能够增强NKp46+CD16+NK细胞和NKp46+CD16A-NK细胞两者的活性和/或增殖。如本文所示，在不存在与CD16A结合的情况下，与NKp46和CD122的组合双重结合展示出NK细胞活性的明显增强作用。在健康个体中，CD16-群体占总NK细胞群体的5％-15％，而在一些癌症患者中，CD16-NK细胞的比例大大增加，占总NK细胞群体的多达50％。此外，已经显示肿瘤微环境通过诱导CD16A从细胞表面脱落或促进CD16A+NK细胞向CD16-NK细胞的转化来影响CD16A+NK细胞的表型。此外，由于CD16A多态性，一些个体具有CD16A中的突变(例如在CD16A的残基158处)，这导致介导ADCC的能力降低。克服例如可能发生于肿瘤环境中的CD16A缺陷，同时增加肿瘤中NKp46+NK细胞的数量和活化，这是特别有利的。此外，多特异性蛋白质不需要经由NKG2D进行结合或信号传导，并且可用于在具有NK和/或T细胞的患者中增强NK细胞活性，这些NK和/或T细胞的特征在于所活化受体NKG2D的相对低水平的表面表达，例如已知是胃癌和前列腺癌中的普遍或共同特征。
尤其提供了一种多特异性蛋白质，其包含：(a)与人NKp46多肽结合的结合NKp46的结构域，(b)结合感兴趣的抗原(例如肿瘤相关抗原或癌抗原；由靶细胞表达呈递的感兴趣的抗原)的结合结构域，(c)与人CD16A多肽结合的任选的结合CD16A的结构域(例如Fc二聚体)，和(c)与NK细胞上表达的人细胞因子受体多肽(例如受体，诸如如CD122(IL2/15Rβ)、IL-21R、IL-7Ra、IL-27Ra、IL-12R、IL-18R、IFNAR(IFNAR1和/或IFNAR2))结合的抗原结合结构域。还提供了一种多特异性蛋白质，其包含：与人NKp46多肽结合的结合NKp46的结构域，结合感兴趣的抗原(例如肿瘤相关抗原或癌抗原；由靶细胞表达呈递的感兴趣的抗原)的结合结构域，与人FcRn结合(并且任选地进一步与人CD16A多肽结合)的Fc结构域(例如Fc结构域二聚体)，以及与人细胞因子受体多肽(例如CD122(IL2/15Rβ)、IL-21R、IL-7Ra、IL-27Ra、IL-12R、IL-18R、IFNAR(IFNAR1和/或IFNAR2))结合的抗原结合结构域。结合细胞因子受体的抗原结合结构域可以是变体细胞因子，其与其野生型形式相比具有这样的修饰：该修饰降低了与非NK细胞(例如T细胞、Treg细胞)上发现的受体对应物的结合。
在任何实施方案中，可将与人NKp46多肽结合的ABD和与人细胞因子受体结合的ABD指定为被构造成能够采用膜平面结合确认。
在任何实施方案中，可将多特异性蛋白质指定为能够与NK细胞表面上的NKp46和细胞因子受体以及任选的另外的CD16A相互作用、结合或共衔接。
在任何实施方案中，任选地将与人NKp46多肽结合的ABD和与人细胞因子受体结合的ABD以及任选的另外的Fc结构域指定为在多特异性蛋白质内串联定位或连接(例如，相对于多特异性蛋白质的N末端和C末端)。
可将结合NKp46的ABD(例如Fab、单可变结构域或scFv)任选地指定为通过Ig衍生的结构域接头(例如来自铰链结构域或者重链或轻链恒定结构域的肽)或非Ig衍生的结构域接头连接至结合CD16A的结构域(例如Fc结构域)，任选地其中该结构域接头是柔性多肽接头。可将结合细胞因子受体的ABD任选地指定为包含野生型或变体细胞因子，该野生型或变体细胞因子通过结构域接头(任选的柔性多肽接头)连接至多特异性蛋白质的其余部分或NKp46 ABD。可将细胞因子任选地指定为定位在多特异性蛋白质上的结合NKp46的结构域和结合CD16A的结构域两者的C末端，并且任选地进一步，细胞因子经由具有15个、10个或5个残基或更少个残基的肽接头连接至多特异性蛋白质的其余部分(或例如，其结构域，NKp46ABD)。可将结合NKp46的结构域和结合CD16A的结构域任选地指定为在多特异性蛋白质上彼此相邻放置并且任选地通过具有15个、10个或5个残基或更少个残基的长度的肽接头(例如免疫球蛋白衍生的接头(诸如铰链衍生的接头)、非免疫球蛋白衍生的接头、柔性接头)彼此连接。
在一个实施方案中，将与人NKp46多肽结合的ABD定位成与蛋白质内的Fc结构域相邻(或在其多肽链上)，并且其中将与人NKp46多肽结合的ABD和Fc结构域中的一者定位成与结合人细胞因子受体的ABD相邻，任选地进一步地，其中结合人细胞因子的ABD通过具有20个或少于20个氨基酸残基、任选地少于15个氨基酸残基、任选地少于10个氨基酸残基、任选地介于5个和15个残基之间、任选地介于5个和10个残基之间、任选地介于3个和5个残基之间的接头肽连接至与人NKp46多肽结合的ABD或Fc结构域。
在任何方面，结合细胞因子受体的ABD可以是人细胞因子多肽，例如CD122(IL2/15Rβ)、IL-21R、IL-7Ra、IL-27Ra、IL-12R、IL-18R、IFNAR(IFNAR1和/或IFNAR2)。结合细胞因子受体的ABD可以任选地是人细胞因子多肽(例如IL-2、IL-15、IL-21)，其经修饰(例如通过引入氨基酸修饰)以降低对其所结合的细胞因子受体的结合亲和力，任选地其中对不在NK细胞表面表达的受体或者也在非NK细胞(例如T细胞、Treg细胞)表面表达的受体的结合亲和力被选择性地降低。例如，结合人细胞因子受体的ABD可以是变体细胞因子，与未修饰的或野生型细胞因子多肽相比，该变体细胞因子表现出降低的对T细胞上存在的细胞因子受体的结合亲和力。
如本文进一步所述的，当细胞因子具有多于一个受体作为其天然结合的配偶体并且这些受体中的一个受体在非NK细胞上表达时，细胞因子多肽与其野生型细胞因子对应物相比可经修饰以减少与在非NK细胞(例如Treg细胞、T细胞)上表达的此类受体的结合。
在一个实施方案中，以掺入NKp46-1 VH/VL对的CDR的蛋白质为例，结合NKp46的结构域与NKp46多肽的D1/D2结合部结合。基于与结合NKp46的结构域复合的NKp46的x射线晶体研究，据信结合NKp46的多肽和IL-2部分的结合部定位在距细胞表面约70埃处，这对应于CD122的细胞因子结合位点距细胞表面的预测距离。如图1C所示，与NKp46多肽的D1/D2结合部结合以及/或者与结合到NKp46-1的区域或表位结合可提供NKp46 ABD在距NK细胞表面一定距离处的定位，该定位允许细胞因子受体诸如CD122的最佳衔接。继而，长度缩短的结构域接头(例如介于2个和5个残基之间，介于2个和10个残基之间；3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个残基)可用于细胞因子和NKp46 ABD或多特异性蛋白质的其余部分之间，而效力没有任何降低。当结合NKp46上的其他结构域时，可使用更长的结构域接头，例如介于5个和15个残基、介于10个和15个残基之间或更多个残基。因此，本文描述的具有有限数量的非常短的接头的蛋白质具有以下优点：具有最少的非天然(或非免疫球蛋白衍生的)氨基酸序列。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质包含结合NKp46的结构域或其部分，该结合NKp46的结构域或其部分任选地经由结构域接头与结合细胞因子受体的结构域(例如与在NK细胞表面表达的受体结合的细胞因子)融合。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质包含结合NKp46的结构域或其部分，该结合NKp46的结构域或其部分任选地经由结构域接头与结合细胞因子受体的结构域(例如与在NK细胞表面表达的受体结合的细胞因子)融合。在一个实施方案中，结合NKp46的结构域的部分包括单一可变结构域(例如，与第一恒定结构域融合的第一可变结构域)，该单一可变结构域与互补可变结构域(例如，与第二恒定区融合的第二可变结构域)一起形成结合NKp46的ABD(例如，Fab)。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质包含：(i)第一多肽链，该第一多肽链从N末端至C末端包含结合NKp46的结构域或其部分，该结合NKp46的结构域或其部分包括可变结构域、人CH1或CL恒定结构域、任选的结构域接头，以及野生型或变体IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽；和
(ii)第二多肽链，该第二多肽链从N末端至C末端包含可变结构域和人CH1或CL恒定结构域，该可变结构域与(i)的可变结构域缔合以形成结合NKp46的结构域；
其中(i)和(ii)的恒定结构域中的一者是CH1并且另一者是CL，使得(i)和(ii)的恒定结构域通过CH1-CL二聚化缔合。在一个实施方案中，该蛋白质还包含二聚体Fc结构域和结合感兴趣的抗原的ABD。
在一个实施方案中，提供了一种包含NKp46 ABD细胞因子单位的蛋白质。在一个实施方案中，该蛋白质是多特异性蛋白质，该多特异性蛋白质包含VH和VL以及NKp46 ABD-细胞因子单位(和任选的另外的CD16AABD(例如二聚体Fc结构域))，该VH和该VL缔合以形成结合癌抗原或其他感兴趣的抗原的ABD。NKp46 ABD-细胞因子单元包含NKp46 ABD，该NKp46 ABD任选地经由结构域接头与结合在NK细胞表面表达的受体的细胞因子融合。
在本文的任何实施方案中，多特异性蛋白质因此可包含NKp46 ABD-细胞因子单元，该NKp46 ABD-细胞因子单元由两条多肽链缔合形成并且具有以下结构之一：
或
或
其中：
Va-2和Vb-2各自是VH结构域或VL结构域，其中Va-2和Vb-2中的一者是VH并且另一者是VL，并且其中Va-2和Vb-2形成结合NKp46的ABD；
CH1是人免疫球蛋白CH1结构域，并且CL是人轻链恒定结构域；
(CH1或CL)a和(CH1或CL)b中的一者是CH1并且另一者是CL，从而形成(CH1/CL)对；
L、L1和L2各自是氨基酸结构域接头，其中L、L1和L2可以是不同的或相同的，其中L1是将NKp46 ABD-细胞因子单元连接至多特异性蛋白质(例如，包含VH和VL的蛋白质，并且该VH和该VL缔合形成结合癌抗原的ABD)的其余部分的接头；并且Cyt是与NK细胞上存在的细胞因子受体结合的细胞因子多肽或其部分，任选地其中Cyt是野生型或变体人IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽。可将Cyt指定为具有游离的C末端(没有另外的结构域或氨基酸序列在Cyt的游离末端与其融合)。任选地，可将链1指定为具有游离的C末端。可将“-”指定为表示经由共价键(例如肽键)与其他氨基酸残基连接。
在一个实施方案中，NKp46 ABD-细胞因子单位包含：(i)第一多肽链，该第一多肽链从N末端至C末端包含结合NKp46的结构域或其部分，该结合NKp46的结构域或其部分包括可变结构域、人CH1或CL恒定结构域、任选的结构域接头和野生型或变体IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽，该可变结构域包含与SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、112、113、115、116、117、119、120、121、123、124、125、127、128、129或236-313中任一项的氨基酸序列至少80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列，该野生型或变体多肽包含与SEQ ID NO:404-439中任一项的氨基酸序列或其至少40、50、60、80或100个连续氨基酸的片段至少80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列；和
(ii)第二多肽链，该第二多肽链从N末端至C末端包含可变结构域和人CH1或CL恒定结构域，该可变结构域与(i)的可变结构域缔合以形成结合NKp46的结构域，其中该可变结构域包含与SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、114、118、122、126、130或314-403中任一项的氨基酸序列至少80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，NKp46 ABD-细胞因子单位包含：(i)第一多肽链，该第一多肽链从N末端至C末端包含结合NKp46的结构域或其部分，该结合NKp46的结构域或其部分包括可变结构域、人CH1或CL恒定结构域、任选的结构域接头和野生型或变体IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽，该可变结构域包含与SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、114、118、122、126、130或314-403中任一项的氨基酸序列至少80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列，该野生型或变体多肽包含与SEQ ID NO:404-439中任一项的氨基酸序列或其至少40、50、60、80或100个连续氨基酸的片段至少80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列；和
(ii)第二多肽链，该第二多肽链从N末端至C末端包含可变结构域和人CH1或CL恒定结构域，该可变结构域与(i)的可变结构域缔合以形成结合NKp46的结构域，其中该可变结构域包含与SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、112、113、115、116、117、119、120、121、123、124、125、127、128、129或236-313中任一项的氨基酸序列至少80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在其中NKp46 ABD-细胞因子单元置于蛋白质的一条多肽链上的另一个实施方案中，NKp46 ABD-细胞因子单元可具有以下结构：
–L1–Va-2–L2–Vb-2–L3–Cyt
其中：
Va-2和Vb-2各自是VH结构域或VL结构域，其中Va-2和Vb-2中的一者是VH并且另一者是VL，并且其中Va-2和Vb-2形成结合NKp46的ABD；
L1、L2和L3各自是氨基酸结构域接头，其中L1、L2和L3可以是不同的或相同的，其中L1是将NKp46 ABD-细胞因子单元连接至多特异性蛋白质(例如，包含VH和VL的蛋白质，并且该VH和该VL缔合形成结合癌抗原的ABD)的其余部分的接头；并且Cyt是与NK细胞上存在的细胞因子受体结合的细胞因子多肽或其部分，任选地其中Cyt是野生型或变体人IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽。可将L1、L2和L3各自独立地指定为具有15个、10个或5个残基或更少个残基的长度。
在本文任何实施方案的一个方面，细胞因子或细胞因子受体ABD(作为游离细胞因子或掺入到多特异性蛋白质中)结合其受体，如通过SPR测定的，其中结合亲和力(KD)为1μM或更低、200nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、或25nM或更低。在一个实施方案中，细胞因子或细胞因子受体ABD结合其受体，如通过SPR测定的，其中结合亲和力(KD)为1nM或高于1nM、任选地高于10nM、任选地高于15nM。在一个实施方案中，细胞因子或细胞因子受体ABD结合其受体，如通过SPR测定的，其中结合亲和力(KD)介于约1nm至约200nm之间、任选地介于约1nm至约100nm之间、任选地介于约10nM至约1μM之间、任选地介于约10nM至约200μM之间、任选地介于约10nM至约100nM之间、任选地介于约15nM至约1μM之间、或任选地介于约15nM至约200nM之间。
在一个实施方案中，细胞因子是野生型细胞因子或其片段或变体，该细胞因子具有野生型细胞因子对应物诱导NK细胞中信号传导的能力的至少80％，任选地其中通过使分离的细胞因子部分与NK细胞接触并测量NK细胞中的STAT磷酸化来评估信号传导。在一个实施方案中，细胞因子是野生型细胞因子或其片段，该细胞因子与野生型细胞因子对应物相比保留了对NK细胞上存在的其细胞因子受体的亲和力的至少70％、80％或90％。在一个实施方案中，细胞因子是变体细胞因子，其中该细胞因子与野生型细胞因子对应物相比保留了对NK细胞上存在的其细胞因子受体的亲和力的至少70％、80％或90％。在一个实施方案中，细胞因子不包含显著降低细胞因子对NK细胞上存在的细胞因子受体的亲和力的突变。在一个实施方案中，多特异性蛋白质(或当包含在多特异性蛋白质中时的细胞因子)在NK细胞中表现出用于细胞因子途径信号传导的EC50，其低于单独使用其野生型细胞因子对应物观察到的EC50。在一个实施方案中，多特异性蛋白质(或当包含在多特异性蛋白质中时的细胞因子)在NK细胞中表现出用于细胞因子途径信号传导的EC50，其低于单独使用细胞因子或在相当结构但缺乏NKp46ABD和/或CD16 ABD的蛋白质中观察到的EC50。任选地，用于NK细胞中细胞因子途径信号传导的EC50低到至少1/10或1/100，任选地，其中通过使相应的细胞因子或多特异性蛋白质与NK细胞接触并测量NK细胞中的STAT磷酸化来评估细胞因子途径信号传导。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质被构造成使得Fc结构域(或结合CD16的结构域)、结合NKp46的结构域和结合细胞因子受体的结构域各自能够结合它们的相应NKp46、CD16A或细胞因子受体结合配偶体，当此类结合配偶体一起存在于细胞(例如NK细胞)的表面时。在一些实施方案中，多特异性蛋白质的特征可在于通过与NKp46单价结合(例如多特异性蛋白质仅包含一个NKp46 ABD)、与感兴趣的抗原单价(或任选地二价)结合、与CD16A单价结合(例如多特异性蛋白质仅包含一个Fc结构域二聚体)，以及与细胞因子受体单价结合(例如多特异性蛋白质仅包含一个细胞因子受体ABD)。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质通过以下方式来构造：例如通过多特异性蛋白质内的结构域的布置或构型，任选地通过使用一个或多个结构域接头，这些结构域接头当处于拉伸构型时具有18埃(5个氨基酸残基)、36埃(10个残基)或54埃(15个残基)的最大潜在长度，使得结合NKp46的结构域和结合细胞因子受体的结构域以及当存在并能够结合CD16时的结合CD16的结构域可呈现膜平面结合构象，从而使得NKp46、CD16A和细胞因子受体中的每一者结合在NK细胞的表面。
多特异性蛋白质因此可被构造成使得结合细胞因子受体的结构域拓扑地置于多聚体蛋白质内，置于多特异性蛋白质内结合NKp46的结构域和结合CD16A的结构域两者的末端(例如C末端)。例如，可将细胞因子受体ABD置于多特异性蛋白质的多肽链的C末端，使得该定位允许细胞因子受体ABD在多聚体蛋白质内为拓扑C末端)。NKp46 ABD和CD16A ABD(例如，二聚体Fc结构域)可在蛋白质中彼此拓扑地相邻定位，任选地经由短结构域接头彼此连接。NKp46 ABD、CD16A ABD和细胞因子(或其部分)因此可在蛋白质中(或在其多肽链上)串联连接或定位。有利地，该蛋白质包含二聚体Fc结构域(Fc结构域例如被指定为由置于单独的多肽链上的两个Fc单体组成)。因此，在多特异性蛋白质中，NKp46 ABD、二聚体Fc结构域和细胞因子有利地彼此拓扑地相邻定位(在多特异性蛋白质的拓扑结构内)。在一个实施方案中，结合NKp46的结构域(或其部分，例如VH或VL)和Fc结构域单体(或结合CD16A的结构域)彼此相邻地置于相同多肽链上，例如相邻的结合NKp46的结构域和结合CD16A的结构域可由结构域接头分开，但不需要任何居间蛋白质结构域(例如不需要与抗原结合的居间结构域)，并且细胞因子部分可置于其C末端。
例如，在具有特别有利的NK细胞增强活性的优选多特异性蛋白质中，该多特异性蛋白质包含由定位在不同多肽链上的第一和第二Fc结构域单体组成的Fc结构域二聚体(其经由CH3-CH3缔合进行二聚化)。第一Fc结构域单体可在其C末端与抗NKp46 ABD(或其部分)融合，并且抗NKp46ABD(或其部分)继而在其C末端与细胞因子融合。抗NKp46 ABD的部分可以是例如((VH或VL)-CH1)单元或((VH或VL)-CL)单元，其中ABD是Fab。图2A至图2C、图2E、图2G至图2J、图2L、图2M示出了示例性结构域构型，其中抗NKp46 ABD和细胞因子相对于N末端和C末端彼此拓扑地相邻并且经由一个Fc结构域单体融合。图2D、图2F、图2K和图2N示出了其中抗NKp46 ABD和细胞因子各自与不同Fc结构域单体的C末端融合的结构域构型。
在任何实施方案中，可将结合细胞因子受体的结构域(细胞因子受体ABD)、结合NKp46的结构域(NKp46 ABD)和结合CD16的结构域(CD16 ABD)指定为置于构成多特异性蛋白质的一条或多条多肽链内，使得这些结构域以其中它们在多聚体(例如异源多聚体)蛋白质上彼此相邻或从N末端至C末端串联的构型取向。结构域可任选地由结构域接头分开，例如具有5个至20个残基的连接肽，该连接肽本身不与预先确定的抗原结合。
在任何实施方案中，可将多特异性蛋白质指定为例如通过多特异性蛋白质内的结构域的布置或构型来构造，使得NKp46 ABD和细胞因子受体ABD(例如细胞因子部分)具有呈现它们在多特异性蛋白质分子内的Fc结构域二聚体的相同侧或面的位置的能力，以便增强以膜平面结合构象结合NKp46、CD16A和细胞因子受体的能力。这种构型可容易地在本公开的异源二聚体、异源三聚体或异源四聚体蛋白质中的任一者中以任何方式实施，例如通过将NKp46 ABD(或其部分，如果ABD由两条多肽链缔合而成)和细胞因子受体ABD(或其部分，如果ABD由两条多肽链缔合而成)与Fc结构域单体之一一起定位在相同多肽链上。
多特异性蛋白质可具有式(X1)-L1-(X2)-L2-(X3)，其中X1和X2中的一者是NKp46ABD(例如，Fab、scFv、VHH)或其部分(例如，该部分可以是VH或VL、VH-CH1、VH-CL、VL-CL、VL-CH1)并且另一者是Fc二聚体或其部分(例如，Fc单体)，并且X3是细胞因子，其中L1和L2各自是任选的结构域接头。细胞因子定位在其(或其部分)所在的多肽链的C末端。L1经由共价键(例如肽键)连接X1和X2。L2经由共价键(例如肽键)连接X2和X3。可将X1至X3任选地指定为从蛋白质的拓扑N末端至C末端排列。多特异性蛋白质还可包含结合感兴趣的抗原的ABD，例如连接在N末端oif X1或定位在蛋白质的拓扑结构内的N末端。
如本文所证明的，应当理解，不同的元件X1、X2和X3(以及进一步结合感兴趣的抗原的ABD)可各自容易地分布到蛋白质内的两条或更多条不同多肽链上。在一个实施方案中，多特异性蛋白质可任选地被表征为包含第一多肽链，该第一多肽链包含式(X1)-L1-(X2)-L2-(X3)，其中X1和X2中的一者是NKp46 ABD或其部分并且另一者是Fc单体，并且X3是细胞因子或其部分，其中L1和L2各自是任选的结构域接头。因此，细胞因子可定位在其(或其部分)所在的多肽链的C末端。多特异性蛋白质还可包含结合感兴趣的抗原的ABD，其中ABD(或其部分)置于第一多肽链上，或置于与第一多肽链(或与蛋白质的任何其他链)缔合(例如二聚化)的单独多肽链上。然后，蛋白质可包含一条、两条或更多条附加多肽链，这些多肽链提供了以下项的互补结构域：NKp46 ABD(当NKp46 ABD是ABD的一部分时)、Fc单体(以便形成Fc二聚体)、细胞因子(其中该细胞因子是一种细胞因子的一部分)和/或结合感兴趣的抗原的ABD。因此，此类附加多肽链可经由非共价相互作用和任选地进一步的共价相互作用与蛋白质的第一或其他多肽链缔合(例如二聚化)。
在另一个实施方案中，多特异性蛋白质可任选地被表征为包含：(i)第一多肽链，该第一多肽链包含式(X1)-L1-(X2a)，其中X1是第一Fc单体并且X2a是NKp46 ABD的第一部分；和(ii)第二多肽链，该第二多肽链包含式(X2b)-L2-(X3)，其中X2b是NKp46 ABD的第二部分(例如VH或VL、VH-CH1、VH-CL、VL-CL、VL-CH1)，该第二部分与X2a缔合形成NKp46ABD，并且X3是细胞因子或其部分。L1和L2各自是结构域接头。多特异性蛋白质还可包含结合感兴趣的抗原的ABD，其中ABD(或其部分)置于第一多肽链上(例如X1的N末端)，或置于与第一多肽链(或与蛋白质的任何其他链)缔合(例如二聚化)的单独多肽链上。多特异性蛋白质还可包含结合CD16A的ABD，任选地，ABD是二聚体Fc结构域；可将结合CD16A(或其部分)的ABD置于第一多肽链上(例如X1的N末端)，并且当ABD是二聚体Fc结构域时，可将Fc单体之一置于第一多肽链上，并且可将第二Fc单体置于与第一多肽链缔合(例如二聚化)的单独多肽链上。
在一个实施方案中，结合NKp46的结构域结合NKp46，使得当与细胞表面处的NKp46结合时，多特异性蛋白质的结合NKp46的结构域距细胞膜约70埃。在一个此类实施方案中，以掺入NKp46-1 VH/VL对的CDR的蛋白质为例，结合NKp46的结构域与NKp46多肽的D1/D2结合部结合。任选地，与野生型NKp46多肽相比，结合NKp46的结构域显示与NKp46突变体2(在残基K41、E42和E119处具有突变)和突变体Supp7(在残基Y121和Y194处具有突变)的结合减少。在一个实施方案中，与野生型NKp46多肽相比，NKp46抗原结合结构域可被表征为显示与具有突变K41、E42、E119、Y121和Y194中的一者、两者、三者、四者或五者的NKp46突变体多肽的结合减少。
在一个实施方案中，结合NKp46的结构域结合NKp46，使得当与细胞表面处的NKp46结合时，多特异性蛋白质的结合NKp46的结构域距细胞膜小于约70埃，任选地小于约50埃。在一个此类实施方案中，以掺入NKp46-4 VH/VL对的CDR的蛋白质为例，结合NKp46的结构域与NKp46多肽的D1结构域结合，与D1/D2结合部相比，该NKp46多肽的D1结构域被定位成更接近NK细胞膜。任选地，与野生型NKp46多肽相比，结合NKp46的结构域显示与NKp46突变体6(在残基R101和V102处具有突变)和突变体Supp6(在残基E104和L105处具有突变)的结合减少。在一个实施方案中，与野生型NKp46多肽相比，NKp46抗原结合结构域可被表征为显示与具有突变R101、V102、E104和L105中的一者、两者、三者或四者的NKp46突变体多肽的结合减少。在一个实施方案中，多特异性蛋白质包含具有至少10个氨基酸残基的结构域接头，该结构域接头位于在D1结构域内结合的结合NKp46的结构域与细胞因子之间。
在另一个实施方案中，以掺入NKp46-3 VH/VL对的CDR的蛋白质为例，结合NKp46的结构域与NKp46多肽的D2结构域结合，与D1/D2结合部相比，该NKp46多肽的D2结构域被定位成更接近NK细胞膜。任选地，与野生型NKp46多肽相比，结合NKp46的结构域显示与NKp46突变体19(在残基I135和S136处具有突变)和突变体Supp8(在残基P132和E133处具有突变)的结合减少。在一个实施方案中，与野生型NKp46多肽相比，NKp46抗原结合结构域可被表征为显示与具有突变I135、S136、P132和E133中的一者、两者、三者或四者的NKp46突变体多肽的结合减少。在一个实施方案中，多特异性蛋白质包含具有至少10个氨基酸残基的结构域接头，该结构域接头位于在D2结构域内结合的结合NKp46的结构域与细胞因子之间。
在本文的任何实施方案中，多特异性蛋白质的特征可在于仅具有一个细胞因子受体结合结构域。
在本文的任何实施方案中，多特异性蛋白质的特征可在于仅具有一个结合NKp46的结构域。
某些示例性异源多聚体蛋白质可包含以下结构1a或1b的一般结构域组织，其中CD16 ADC(例如Fc结构域)和NKp46 ABD在蛋白质内彼此紧邻，并且NKp46 ABD紧邻细胞因子受体ABD(体现为细胞因子(Cyt))，并且其中NKp46 ABD插置在CD16 ABD与Cyt之间：
(CD16 ABD)(NKp46 ABD)(Cyt)(结构1a)
或
(Fc结构域二聚体)(NKp46 ABD)(Cyt) (结构1b)
其中NKp46 ABD和CD16ABD(例如Fc结构域二聚体)通过结构域接头连接，并且NKp46 ABD和Cyt通过结构域接头连接。
NKp46 ABD可以方便地是Fab、单域抗体或scFv。CD16 ABD可以是Fc结构域、Fc结构域二聚体、人IgG1亚型的Fc结构域。Cyt可以是例如IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β)多肽，任选地其中该多肽是与野生型人细胞因子对应物相差至少一个残基的变体细胞因子。
结构1a的蛋白质可包含与靶细胞上的感兴趣的抗原结合的ABD(抗原ABD)，该抗原ABD置于CD16 ABD(例如Fc结构域二聚体)的末端(例如N末端)，如在具有以下结构1c或1d的异源多聚体蛋白质中：
(抗原ABD)n(CD16 ABD)(NKp46 ABD)(Cyt) (结构1c)
或
(抗原ABD)n(Fc结构域二聚体)(NKp46 ABD)(Cyt) (结构1d)其中“n”为1或2，并且抗原ABD和CD16 ABD(例如Fc结构域二聚体)通过接头连接，任选地其中接头是免疫球蛋白铰链多肽，其中CD16 ABD和NKp46 ABD通过接头连接，并且NKp46 ABD和Cyt通过接头连接。当“n”为2时，结构1d也可表示为结构1e:
(抗原ABD)
(Fc结构域二聚体)(NKp46 ABD)(Cyt) (结构1e)
(抗原ABD)
在任何实施方案中，多特异性蛋白质可被表征为与NKp46多肽和细胞因子受体中的每一者以单价结合，并且能够指导表达NKp46的NK细胞裂解表达感兴趣的抗原的靶细胞。有利地，在一个实施方案中，在存在NK细胞和靶细胞的情况下，多特异性蛋白质可结合(i)靶细胞上的感兴趣的抗原、(ii)NK细胞上的NKp46、(iii)NK细胞上的CD16A和(iv)NK细胞上的细胞因子受体(例如CD122、IL-21R、IL-7Ra、IL-27Ra、IL-12R、IL-18R、IFNAR)，当与靶细胞和NK细胞上的这些蛋白质结合时，可通过NKp46(该蛋白质充当NKp46激动剂)和细胞因子受体(该蛋白质充当细胞因子受体激动剂)诱导NK细胞中的信号传导和/或NK细胞的活化，从而促进NK细胞的活化和/或靶细胞的裂解，特别是经由NKp46传递的活化信号。
在一个实施方案中，在存在NK细胞和靶细胞的情况下，多特异性蛋白质可诱导NK细胞中的细胞因子受体途径信号传导的细胞毒性(如通过STAT信号传导评估的)和/或NK细胞的活化，其中这种细胞毒性、活化和/或信号传导比在不存在靶细胞的情况下使多特异性蛋白质与NK细胞接触时所观察到的细胞毒性、活化和/或信号传导更大(例如，低到至少1/100或1/1000的EC50值)。
任选地，多特异性蛋白质可结合NK细胞上的NKp46和CD122(例如，该蛋白质包含IL2或IL15部分，任选地与CD25的结合减少的经修饰的或变体IL2或IL15)，并且当与NKp46和CD122两者结合时，可通过NKp46和CD122两者诱导NK细胞中的信号传导。任选地，多特异性蛋白质可结合NK细胞上的NKp46、CD16A和CD122，并且当与NKp46、CD16和CD122结合时，可通过NKp46、CD16A和CD122诱导NK细胞中的信号传导。可通过测量STAT5来评估细胞因子受体信号传导，任选地其中所观察到的信号传导大于使用其中结合NKp46的结构域被对照ABD(例如，其不与测定系统中存在的任何蛋白质结合)取代的比较蛋白质所观察到的信号传导。
任选地，多特异性蛋白质可结合NK细胞上的NKp46和IL-21R(例如，该蛋白质包含IL21部分)，并且当与NKp46和IL-21R两者结合时，可通过NKp46和IL-21R两者诱导NK细胞中的信号传导。任选地，多特异性蛋白质可结合NK细胞上的NKp46、CD16A和IL-21R，并且当与NKp46、CD16A和IL-21R结合时，可通过NKp46、CD16A和IL-21R诱导NK细胞中的信号传导。任选地，通过测量STAT3来评估细胞因子信号传导，其中所观察到的信号传导大于使用其中结合NKp46的结构域被对照ABD(例如，其不与测定系统中存在的任何蛋白质结合)取代的比较蛋白质所观察到的信号传导。
任选地，多特异性蛋白质可结合NK细胞上的NKp46和IL-18R(例如，该蛋白质包含IL18部分)，并且当与NKp46和IL-18R两者(IL-18Rα和/或IL-18Rβ)结合时，可通过NKp46和IL-18R两者诱导NK细胞中的信号传导。任选地，多特异性蛋白质可结合NK细胞上的NKp46、CD16A和IL-18R，并且当与NKp46、CD16A和IL-18R结合时，可通过NKp46、CD16A和IL-18R诱导NK细胞中的信号传导。任选地，通过测量STAT3来评估细胞因子信号传导，其中所观察到的信号传导大于使用其中结合NKp46的结构域被对照ABD(例如，其不与测定系统中存在的任何蛋白质结合)取代的比较蛋白质所观察到的信号传导。
任选地，多特异性蛋白质可结合NK细胞上的NKp46和IL-7R(例如IL-7Rα(CD127)和/或CD132)(例如，该蛋白质包含IL-7部分)，并且当与NKp46和IL-7R两者结合时，可通过NKp46和IL-7Rα两者诱导NK细胞中的信号传导。任选地，多特异性蛋白质可结合NK细胞上的NKp46、CD16A和IL-7R，并且当与NKp46、CD16A和IL-7R结合时，可通过NKp46、CD16A和IL-7R诱导NK细胞中的信号传导。任选地，通过测量STAT5来评估细胞因子信号传导，其中所观察到的信号传导大于使用其中结合NKp46的结构域被对照ABD(例如，其不与测定系统中存在的任何蛋白质结合)取代的比较蛋白质所观察到的信号传导。
任选地，多特异性蛋白质可结合NK细胞上的NKp46和IL-27R(例如IL-27Rα和/或GP130)(例如，该蛋白质包含IL-27部分)，并且当与NKp46和IL-27R两者结合时，可通过NKp46和IL-27R两者诱导NK细胞中的信号传导。任选地，多特异性蛋白质可结合NK细胞上的NKp46、CD16A和IL-27R，并且当与NKp46、CD16A和IL-27R结合时，可通过NKp46、CD16A和IL-27R诱导NK细胞中的信号传导。经由NKp46和/或CD16A的信号传导可通过NK细胞活化的标志物(例如在实施例中使用的标志物、CD69表达等)来评估。任选地，通过测量STAT1来评估细胞因子信号传导，其中所观察到的信号传导大于使用其中结合NKp46的结构域被对照ABD(例如，其不与测定系统中存在的任何蛋白质结合)取代的比较蛋白质所观察到的信号传导。
任选地，多特异性蛋白质可结合NK细胞上的NKp46和IL-12R(例如IL-12Rβ1和/或IL-12Rβ2)(例如，该蛋白质包含IL-27部分)，并且当与NKp46和IL-12R两者结合时，可通过NKp46和IL-12R两者诱导NK细胞中的信号传导。任选地，多特异性蛋白质可结合NK细胞上的NKp46、CD16A和IL-12R，并且当与NKp46、CD16A和IL-12R结合时，可通过NKp46、CD16A和IL-12R诱导NK细胞中的信号传导。任选地，通过测量STAT4来评估细胞因子信号传导，其中所观察到的信号传导大于使用其中结合NKp46的结构域被对照ABD(例如，不与测定系统中存在的任何蛋白质结合)取代的比较蛋白质所观察到的信号传导。
任选地，多特异性蛋白质可结合NK细胞上的NKp46和IFNAR，并且当与NKp46和IFNAR(IFNAR1和/或IFNAR2)两者结合时，可通过NKp46和IFNAR两者诱导NK细胞中的信号传导。例如，多特异性蛋白质可包含IFN-α或IFN-β部分)任选地，多特异性蛋白质可结合NK细胞上的NKp46、CD16A和IFNAR，并且当与NKp46、CD16A和IFNAR两者结合时，可通过NKp46、CD16A和IFNAR诱导NK细胞中的信号传导。任选地，通过测量STAT(例如，STAT1、STAT2或IFN调节因子(IRF)-9)来评估细胞因子信号传导，其中所观察到的信号传导大于使用其中结合NKp46的结构域被对照ABD(例如，其不与测定系统中存在的任何蛋白质结合)取代的比较蛋白质所观察到的信号传导。
经由NKp46和/或CD16A的信号传导可通过NK细胞活化的标志物(例如在实施例中使用的标志物、CD69表达等)来评估。
在一些实施方案中，多特异性蛋白质包含人Fc结构域的至少一部分，例如足以使得Fc结构域与人FcRn多肽结合的部分，任选地其中如通过SPR评估的所述FcRn结合亲和力在常规人IgG1抗体的FcRn结合亲和力的1-log内。
多特异性蛋白质有利地能够有效地动员CD16+和CD16-NK细胞两者(所有NK细胞是NKp46+)。
在一个方面，多特异性蛋白质包含两条或更多条多肽链，即，该多特异性蛋白质包含多链蛋白质(也称为多聚体蛋白质)。例如，多特异性蛋白质或多链蛋白质可以是异源二聚体、异源三聚体或异源四聚体，或者可包含多于四条多肽链。
任何抗原结合结构域(例如结合感兴趣的抗原(例如肿瘤抗原)、NKp46或细胞因子受体的ABD)可完整包含在单一多肽链上，例如作为scFv或单抗原结合结构域(诸如sdAb或纳米抗体、VNAR或VHH结构域)或蛋白质模块)。另选地，抗原结合结构域可由置于单独多肽链上的两个或更多个蛋白质结构域组成，使得当两个或更多个互补蛋白质结构域(例如作为VH/VL对)缔合在多聚体蛋白质中时，抗原结合结构域结合其靶标。
多特异性蛋白质可以单价或多价方式结合感兴趣的抗原(例如癌抗原)。当多特异性蛋白质以单价结合感兴趣的抗原、以单价结合NK46并且以单价结合细胞因子受体时，可将多特异性蛋白质指示为具有1:1:1构型。当多特异性蛋白质以二价结合感兴趣的抗原、以单价结合NK46并且以单价结合细胞因子受体时，可将多特异性蛋白质可指示为具有2:1:1构型。不同的1:1:1和2:1:1构型的代表性示例示于图2中。
在任何方面，多特异性蛋白质可被表征为具有这样的结构：其中一个或多个抗原结合结构域(ABD)的运动自由度(链内结构域运动)或灵活性增加，例如与常规人IgG抗体的ABD相比。在一个实施方案中，提供了一种多特异性蛋白质，其包含这样的结构：该结构允许第一抗原结合结构域的抗原结合位点和第二抗原结合结构域的抗原结合位点分开一定距离，该距离导致增强的功能，例如多特异性蛋白质诱导NKp46信号传导和裂解靶细胞的能力，例如任选地小于80埃的距离。其中ABD具有更大的灵活性和/或以优化的距离分开的多特异性蛋白质可增强裂解性NKp46-靶突触的形成，从而增强NKp46介导的信号传导。这种灵活性和/或运动结构域可通过使用接头(例如，基于柔性氨基酸的接头)而容易地实现，这些接头将结合NKp46的结构域与Fc结构域(例如，Fc结构域二聚体，或更一般地，多特异性蛋白质的其余部分)分开。
在任何方面，多特异性蛋白质可被表征为具有增加的抗原结合结构域的运动自由度(例如，与常规人IgG抗体(例如人IgG1抗体)的ABD相比)。此类蛋白的一个示例是含有多聚体Fc结构域的蛋白质(例如异源二聚体或异源三聚体)，其中抗原结合结构域(例如结合NKp46的ABD)经由柔性接头与Fc结构域连接或融合。接头可通过赋予弯曲能力从而潜在地减小接头处的ABD与Fc结构域之间(或两个ABD之间)的角度来提供一个或多个ABD的灵活性或运动自由度。任选地，两个抗原结合结构域(并且如果附加的ABD存在于多特异性蛋白质中，则任选地更多个抗原结合结构域)经由接头(通常为柔性肽接头)与Fc结构域连接或融合。任选地，具有增加的运动自由度的蛋白质允许蛋白质采取这样的构象：其中NKp46结合位点与感兴趣的抗原结合位点之间的距离小于在其中两个结合结构域都是Fab的蛋白质中观察到的距离，或者小于在全长抗体中观察到的距离。
ABD可经由结构域接头连接至Fc结构域单体(或其CH2或CH3结构域)。接头可以是多肽接头，例如包含至少5个残基、至少10个残基、至少15个残基、至少20个残基或更多个残基的长度的肽接头。在其他实施方案中，接头包含介于2个至4个残基之间、介于2个至5个残基之间、介于2个至6个残基之间、介于2个至8个残基之间、介于5个至10个残基之间、介于2个至15个残基之间、介于4个至15个残基之间、介于3个至15个残基之间、介于5个至15个残基之间、介于10个至15个残基之间、介于4个至20个残基之间、介于5个至20个残基之间、介于2个至20个残基之间、介于10个至30个残基之间、或介于10个至50个残基之间的长度。任选地，接头包含源自抗体恒定区的氨基酸序列，例如来自CH1或Cκ结构域的氨基酸序列(例如来自CH1或Cκ结构域的N末端序列)，或源自铰链的氨基酸序列。任选地，接头包含氨基酸序列RTVA。任选地，接头是柔性接头，其主要或仅由甘氨酸和/或丝氨酸残基组成，例如包含氨基酸序列(GxS)n，其中G为1、2、3或4，并且n为1至10、1至6或1至4的整数。任选地，接头包含1个至20个或1个至10个另外的氨基酸残基。
在一个实施方案中，提供了具有多肽链1、2和3的异源三聚体：
其中：
Va-1、Vb-1、Va-2和Vb-2各自是VH结构域或VL结构域，其中Va-1和Vb-1结合感兴趣的抗原(任选地，其中Va-1和Vb-1中的一者是VH并且另一者是VL，并且其中Va-1和Vb-1形成结合感兴趣的抗原的第一抗原结合结构域(ABD))，其中Va-2和Vb-2中的一者是VH并且另一者是VL，并且其中Va-2和Vb-2形成结合NKp46的第二ABD；
CH1是人免疫球蛋白CH1结构域，并且CL是人轻链恒定结构域；
(CH1或CL)a和(CH1或CL)c中的一者是CH1并且另一者是CL，从而形成(CH1/CL)对；
(CH1或CL)b和(CH1或CL)d中的一者是CH1并且另一者是CL，从而形成(CH1/CL)对；
铰链是免疫球蛋白铰链区或其部分；
L1和L2各自是氨基酸结构域接头，其中L1和L2能够是不同的或相同的；
CH2和CH3分别是人免疫球蛋白CH2和CH3结构域；并且
Cyt是与NK细胞上存在的细胞因子受体结合的细胞因子多肽或其部分，任选地其中Cyt是野生型或变体人IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽。在可使用相同结构域和结构域接头制备的另一个实施方案中，提供了具有多肽链1、2和3的异源三聚体：
在一个实施方案中，提供了具有多肽链1和2的异源二聚体：
其中：
Va-1、Vb-1、Va-2和Vb-2各自是VH结构域或VL结构域，其中Va-1和Vb-1结合感兴趣的抗原(任选地，其中Va-1和Vb-1中的一者是VH并且另一者是VL，并且其中Va-1和Vb-1形成结合感兴趣的抗原的第一抗原结合结构域(ABD))，其中Va-2和Vb-2中的一者是VH并且另一者是VL，并且其中Va-2和Vb-2形成结合NKp46的第二ABD；
CH1是人免疫球蛋白CH1结构域，并且CL是轻链恒定结构域；
(CH1或CL)a和(CH1或CL)b中的一者是CH1并且另一者是CL，从而形成(CH1/CL)对；
铰链是免疫球蛋白铰链区或其部分；
L1、L2和L3各自是氨基酸结构域接头，其中L1、L2和L3能够是不同的或相同的；
CH2和CH3分别是人免疫球蛋白CH2和CH3结构域；并且
Cyt是与NK细胞上存在的细胞因子受体结合的细胞因子多肽或其部分，任选地其中Cyt是野生型或变体人IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽。
本公开还提供了如本文进一步所述的另外的异源二聚体、异源三聚体和异源四聚体多特异性分子和结构域排列。在一个方面，多特异性蛋白质是具有如图2A至图2N中任一者所示的结构或结构域排列的异源多聚体、异源二聚体、异源三聚体、异源四聚体。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，可将ABD(例如，抗NKp46ABD、结合感兴趣的抗原或肿瘤抗原的ABD)指定为包含免疫球蛋白重链可变结构域(VH)和免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)，其中每个VH和VL包含三个互补决定区(CDR-1至CDR-3)。在本文所述的任何实施方案的一个方面，可将VH指定为具有人VH结构域的氨基酸序列。在本文所述的任何实施方案的一个方面，可将VL指定为具有人VL结构域的氨基酸序列。
在任何实施方案的一个方面，VH区包含与由人V基因组的基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，该人V基因组选自IGHV1-18、IGHV1-2、IGHV1-24、IGHV1-3、IGHV1-45、IGHV1-46、IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV1-69-2、IGHV1-69D、IGHV1-8、IGHV2-26、IGHV2-5、IGHV2-70、IGHV2-70D、IGHV3-11、IGHV3-13、IGHV3-15、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-23D、IGHV3-30、IGHV3-30-3、IGHV3-30-5、IGHV3-33、IGHV3-43、IGHV3-43D、IGHV3-48、IGHV3-49、IGHV3-53、IGHV3-62、IGHV3-64、IGHV3-64D、IGHV3-66、IGHV3-7、IGHV3-72、IGHV3-73、IGHV3-74、IGHV3-9、IGHV3-NL1、IGHV4-28、IGHV4-30-2、IGHV4-30-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-38-2、IGHV4-39、IGHV4-4、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV5-10-1、IGHV5-51、IGHV6-1、IGHV7-4-1、IGHV1-38-4、IGHV1/OR15-1、IGHV1/OR15-5、IGHV1/OR15-9、IGHV1/OR21-1、IGHV2-70、IGHV2/OR16-5、IGHV3-16、IGHV3-20、IGHV3-25、IGHV3-35、IGHV3-38、IGHV3-38-3、IGHV3/OR15-7、IGHV3/OR16-10、IGHV3/OR16-12、IGHV3/OR16-13、IGHV3/OR16-17、IGHV3/OR16-20、IGHV3/OR16-6、IGHV3/OR16-8、IGHV3/OR16-9、IGHV4-61、IGHV4/OR15-8、IGHV7-81和IGHV8-51-1。任选地，VH区包含有包含来自所述基因的氨基酸序列(例如，CDR和/或人框架区，例如根据Kabat编号)的VH。在任何实施方案的一个方面，VH区包含与SEQ ID NO:236-313的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在任何实施方案的一个方面，VL区包含与由人V基因组的基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，该人V基因组选自IGKV1-12、IGKV1-13、IGKV1-16、IGKV1-17、IGKV1-27、IGKV1-33、IGKV1-39、IGKV1-5、IGKV1-6、IGKV1-8、IGKV1-9、IGKV1-NL1、IGKV1D-12、IGKV1D-13、IGKV1D-16、IGKV1D-17、IGKV1D-33、IGKV1D-43、IGKV1D-8、IGKV2-24、IGKV2-28、IGKV2-29、IGKV2-30、IGKV2-40、IGKV2D-26、IGKV2D-28、IGKV2D-29、IGKV2D-30、IGKV2D-40、IGKV3-11、IGKV3-15、IGKV3-20、IGKV3D-11、IGKV3D-15、IGKV3D-20、IGKV3D-7、IGKV4-1、IGKV5-2、IGKV6-21、IGKV6D-21、IGKV1-37、IGKV1/OR2-0、IGKV1/OR2-108、IGKV1D-37、IGKV1D-42、IGKV2D-24、IGKV3-7、IGKV3/OR2-268、IGKV3D-20、IGKV6D-41、IGLV1-36、IGLV1-40、IGLV1-44、IGLV1-47、IGLV1-51、IGLV10-54、IGLV2-11、IGLV2-14、IGLV2-18、IGLV2-23、IGLV2-8、IGLV3-1、IGLV3-10、IGLV3-12、IGLV3-16、IGLV3-19、IGLV3-21、IGLV3-22、IGLV3-25、IGLV3-27、IGLV3-9、IGLV4-3、IGLV4-60、IGLV4-69、IGLV5-37、IGLV5-39、IGLV5-45、IGLV5-52、IGLV6-57、IGLV7-43、IGLV7-46、IGLV8-61、IGLV9-49、IGLV1-41、IGLV1-50、IGLV11-55、IGLV2-33、IGLV3-32、IGLV5-48和IGLV8/OR8-1。任选地，VL区包含有包含来自所述基因的氨基酸序列(例如，CDR和/或人框架区，例如根据Kabat编号)的VL。在任何实施方案的一个方面，VL区包含与SEQID NO:314-403的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案的一个方面中，ABD包含scFv或Fab，其中该scFv包含VH、结构域接头和VL，该VH包含与选自SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、112、113、115、116、117、119、120、121、123、124、125、127、128、129、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154和236-313中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列，该VL包含与选自SEQ IDNO:4、6、8、10、12、14、114、118、122、126、130、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155和314-403中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列；并且其中该Fab包含一个VH、一个VL、一个人CH1结构域和一个人CL结构域，该一个VH包含与选自SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、112、113、115、116、117、119、120、121、123、124、125、127、128、129、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154和236-313中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列，该一个VL包含与选自SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、114、118、122、126、130、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155和314-403中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列，该一个人CH1结构域包含与SEQ ID NO:156至少90％相同的氨基酸序列，该一个人CL结构域包含与SEQ ID NO:159至少90％相同的氨基酸序列，其中该VH与该CH1结构域或该CL结构域中的一者融合，并且该VL与该CH1结构域或该CL结构域中的另一者融合。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，IL2包含与SEQ ID NO:404-417中任一项的IL-2多肽或与其至少40个、50个、60个、70个、80个或100个氨基酸残基的连续序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。任选地，IL2还包含2、3、4、5个或更多个减少与CD25结合的氨基酸取代，例如在本公开的任何残基处的取代。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，IL15包含与SEQ ID NO:418中任一项的IL-15多肽或与其至少40个、50个、60个、70个、80个或100个氨基酸残基的连续序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，IL12包含与SEQ ID NO:438和/或439中任一项的IL-12多肽或与其至少40个、50个、60个、70个、80个或100个氨基酸残基的连续序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，IL7包含与SEQ ID NO:435中任一项的IL-7多肽或与其至少40个、50个、60个、70个、80个或100个氨基酸残基的连续序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，IL27包含与SEQ ID NO:436和/或437中任一项的IL-21多肽或与其至少40个、50个、60个、70个、80个或100个氨基酸残基的连续序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，IL21包含与SEQ ID NO:420或421中任一项的IL-27多肽或与其至少40个、50个、60个、70个、80个或100个氨基酸残基的连续序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，IL18包含与SEQ ID NO:422中任一项的IL-18多肽或与其至少40个、50个、60个、70个、80个或100个氨基酸残基的连续序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，IFN-α与SEQ ID NO:423-433中任一项的IFN-α多肽或与其至少40个、50个、60个、70个、80个或100个氨基酸残基的连续序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，IFN-β与SEQ ID NOS:434中任一项的IFN-α多肽或与其至少40个、50个、60个、70个、80个或100个氨基酸残基的连续序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，Fc结构域包含与SEQ ID NO:160-165中任一项的Fc多肽或与其至少40个、50个、60个、70个、80个或100个氨基酸残基的连续序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，CH1、CH2和CH3结构域分别包含与SEQ IDNO:156、157或158的CH1多肽或与其至少40个、50个、60个、70个、80个或100个氨基酸残基的连续序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，CK或CL结构域包含与SEQ ID NO:159中任一项的CK多肽或与其至少40个、50个、60个、70个、80个或100个氨基酸残基的连续序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，铰链结构域包含与SEQ ID NO:166-170中任一项的CK多肽具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，多特异性蛋白质包含：
(a)与感兴趣的抗原结合的ABD，其中该ABD包含
VH、结构域接头和VL，该VH包含与选自SEQ ID NO:132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154和236-313中任一项的序列至少70％、80％或90％相同的氨基酸序列，该VL包含与选自SEQ ID NO:133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155和314-403中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列；和
(b)与人NKp46多肽结合的ABD，其中该ABD包含VH、结构域接头和VL，该VH包含与选自SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、112、113、115、116、117、119、120、121、123、124、125、127、128、129和236-313中任一项的序列至少70％、80％或90％相同的氨基酸序列，该VL包含与选自SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、114、118、122、126、130和314-403中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列；
(c)包含两个Fc结构域单体多肽的Fc结构域二聚体，其中每个Fc结构域单体多肽包含与选自SEQ ID NO:160-165的序列至少70％、80％或90％相同的氨基酸序列；和
(d)细胞因子多肽，其包含与选自SEQ ID NO:404-436的序列或其至少40个、50个、60个、70个、80个或100个氨基酸残基的连续序列至少70％、80％或90％相同的氨基酸序列，该细胞因子多肽经由结构域接头与该多特异性蛋白质的多肽链中的一者的C末端融合。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，铰链结构域包含与SEQ ID NO:166-170中任一项的CK多肽具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，多特异性蛋白质包含：
(a)与感兴趣的抗原结合的ABD，其中该ABD包含scFv或Fab，
a.其中该scFv包含VH、结构域接头和VL，该VH包含与选自SEQ ID NO:132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154和236-313中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列，该VL包含与选自SEQ ID NO:133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155和314-403中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列；并且
b.其中该Fab包含一个VH、一个VL、一个人CH1结构域和一个人CL结构域，该一个VH包含与选自SEQ ID NO:132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154和236-313中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列，该一个VL包含与选自SEQ ID NO:133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155和314-403中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列，该一个人CH1结构域包含与SEQ ID NO:156至少90％相同的氨基酸序列，该一个人CL结构域包含与SEQ ID NO:159至少90％相同的氨基酸序列，其中该VH与该CH1结构域或该CL结构域中的一者融合，并且该VL与该CH1结构域或该CL结构域中的另一者融合，
(b)与人NKp46多肽结合的ABD，其中该ABD包含scFv或Fab，
a.其中该scFv包含VH、结构域接头和VL，该VH包含与选自SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、112、113、115、116、117、119、120、121、123、124、125、127、128、129和236-313中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列，该VL包含与选自SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、114、118、122、126、130和314-403中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列；并且
b.其中该Fab包含一个VH、一个VL、一个人CH1结构域和一个人CL结构域，该一个VH包含与选自SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、112、113、115、116、117、119、120、121、123、124、125、127、128、129和236-313中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列，该一个VL包含与选自SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、114、118、122、126、130和314-403中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列，该一个人CH1结构域包含与SEQ ID NO:156至少90％相同的氨基酸序列，该一个人CL结构域包含与SEQ ID NO:159至少90％相同的氨基酸序列，其中该VH与该CH1结构域或该CL结构域中的一者融合，并且该VL与该CH1结构域或该CL结构域中的另一者融合，
(c)包含两个Fc结构域单体多肽的Fc结构域二聚体，其中每个Fc结构域单体多肽包含与选自SEQ ID NO:160-165的序列至少或90％相同的氨基酸序列；和
(d)细胞因子多肽，其包含与选自SEQ ID NO:404-436的序列或其至少40个、50个、60个、70个、80个或100个氨基酸残基的连续序列至少90％相同的氨基酸序列，该细胞因子多肽经由结构域接头与该多特异性蛋白质的多肽链中的一者的C末端融合。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质包含：包含与本文所述异源三聚体蛋白质的第一链的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽，包含与本文所述异源三聚体蛋白质的第二链的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽，以及包含与本文所述异源三聚体蛋白质的第三链的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，多特异性蛋白质包含：包含与本文所述异源二聚体蛋白质的第一链的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽，以及包含与本文所述异源二聚体蛋白质的第二链的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质包含：包含本文所述异源三聚体蛋白质的第一链的氨基酸序列的多肽，包含本文所述异源三聚体蛋白质的氨基酸序列的多肽，以及包含本文所述异源三聚体蛋白质的第三链的氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，多特异性蛋白质包含：包含本文所述异源二聚体蛋白质的第一链的氨基酸序列的多肽，以及包含本文所述异源二聚体蛋白质的第二链的氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质包含：包含与SEQ ID NO:175的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:176的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽，以及包含与SEQ ID NO:177的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质包含：包含与SEQ ID NO:193的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:185的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽；以及包含与SEQ ID NO:194的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质包含：包含与SEQ ID NO:199的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:200的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽；以及包含与SEQ ID NO:201的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质包含：包含与SEQ ID NO:209的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:210的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽；以及包含与SEQ ID NO:211的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质包含：包含与SEQ ID NO:212的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:213的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽；以及包含与SEQ ID NO:214的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质包含：包含与SEQ ID NO:215的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:216的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽；以及包含与SEQ ID NO:217的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质包含：包含与SEQ ID NO:218的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽，包含与SEQ ID NO:219的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽；以及包含与SEQ ID NO:220的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供了分离的多特异性异源三聚体蛋白质，其包含第一多肽链、第二多肽链和任选的第三多肽链，该第一多肽链包含与本文公开的T5、T6、T25或T26蛋白质的第一多肽链的序列至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列；该第二多肽链包含与本文公开的相应T5、T6、T25或T26蛋白质的第二多肽链的序列至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列；该第三多肽链包含与本文公开的T5、T6、T25或T26蛋白质的第三多肽链的序列至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，CDR被排除在考虑用于计算序列同一性的序列之外。在一个实施方案中，VH和/或VL可变区域被排除在考虑用于计算多肽链序列同一性的序列之外。任选地，每个VH区包含与SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、112、113、115、116、117、119、120、121、123、124、125、127、128、129、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154或236-313中任一项的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。任选地，每个VL区包含与SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、114、118、122、126、130、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155或314-403中任一项的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，提供了编码第一多肽链和/或第二多肽链和/或第三多肽链和/或第四多肽的重组核酸。在本文所述的任何实施方案的一个方面，本发明提供了包含编码第一多肽链和/或第二多肽链和/或第三多肽链的核酸的重组宿主细胞，任选地其中该宿主细胞以至少1mg/L、2mg/L、3mg/L或4mg/L的产率(纯化之前或之后的最终生产率或浓度)产生根据本发明的多聚体或其他蛋白质。还提供了核酸试剂盒或核酸组，其包含编码根据本发明的第一多肽链的重组核酸、编码根据本发明的第二多肽链的重组核酸，以及任选的编码根据本发明的第三多肽链的重组核酸。还提供了制备根据本发明的二聚体、三聚体和四聚体蛋白质的方法。
在另一个实施方案中，本公开提供了新型变体IL-2多肽，其特别适用于抗原结合蛋白，特别是具有Fc结构域的抗原结合蛋白，更进一步地，其中该Fc结构域经修饰以降低或消除结合CD16A和/或其他Fcγ受体的能力。本文提供了包含氨基酸取代T41A的经修饰的或变体IL-2多肽，其中残基的编号是相对于SEQ ID NO:404的IL-2多肽而言的。在一个实施方案中，本文提供了包含至少两个、三个、四个、五个、六个或更多个氨基酸取代的经修饰的或变体IL-2多肽，其中该多肽包含取代T41A。在一个实施方案中，本文提供了包含至少三个氨基酸取代的经修饰的或变体IL-2多肽，其中与人野生型IL-2多肽相比，该多肽包含残基R38、F42和T41处的取代，其中残基数量是相对于SEQ ID NO:404的IL-2多肽而言的。在一个方面，与人野生型IL-2多肽相比，经修饰的或变体IL-2多肽包含至少三个氨基酸取代，其中该多肽包含以下取代：R38A、F42K和T41X，其中X是任何氨基酸残基。在一个方面，与人野生型IL-2多肽相比，经修饰的或变体IL-2多肽包含至少三个(例如3个、4个、5个、6个或更多个)氨基酸取代，其中该多肽包含以下取代：R38A、F42K和T41A。在一个方面，经修饰的或变体IL2包含SEQ ID NO:408的氨基酸序列。在一个方面，经修饰的或变体IL2包含与SEQ IDNO:408的IL-2多肽或与其至少40个、50个、60个、70个、80个或100个氨基酸残基的连续序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。还提供了包含上述经修饰的或变体IL-2多肽的蛋白质或多肽。在一个实施方案中，提供了与异源氨基酸序列或多肽融合(例如，在其N末端)的经修饰的或变体IL-2多肽。在一个实施方案中，提供了结合感兴趣的抗原(例如，癌抗原或免疫细胞(任选的NK细胞)上的受体)的多肽或蛋白质(例如含Fc结构域的蛋白质、抗原结合蛋白、多特异性蛋白质或抗体)，该多肽或蛋白质包含经修饰的或变体IL-2多肽，任选地其中IL-2多肽经由结构域接头与多肽或蛋白质融合，任选地其中IL-2多肽经由结构域接头与蛋白质或多肽的C末端融合。在一个实施方案中，包含变体IL-2的蛋白质或多肽包含人Fc结构域，更进一步地，其中该Fc结构域经修饰以降低或消除结合CD16A和/或其他Fcγ受体的能力。在一些实施方案中，相对于野生型IL-2，经修饰的IL-2具有降低的对CD25的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于野生型IL-2，经修饰的IL-2具有降低的对静息或活化的T细胞的活性。
任何方法可进一步被表征为包括描述于本申请中的任何步骤，特别包括描述于“本发明的具体实施方式”中的步骤。本发明还涉及鉴定、测试和/或制备本文所述的蛋白质的方法。本发明还涉及可通过本发明的任何方法获得的多特异性蛋白质。本公开还涉及含有本文公开的多特异性蛋白质中的至少一种的药物或诊断制剂。本公开还涉及在治疗或诊断方法中使用本发明的多特异性蛋白质的方法。
本发明的这些和另外的有利方面和特征可在本文的其他地方进一步描述。
附图说明
图1A、图1B、图1C和图1D示出了包含变体IL2(IL2v)的多特异性NK细胞衔接子(NKCE)蛋白质的结构/功能关系，该变体IL2的一面与肿瘤细胞上的肿瘤抗原结合，另一面经由IL2βγ复合物、NKp46和CD16A的三重受体顺式呈递与NK细胞结合。将IL2v捕获在NK细胞上可改善与CD122的结合并且模拟CD25介导的IL-2呈递。
图2A示出了T5格式的示例性多特异性蛋白质，其与NK细胞上的NKp46、CD16A和CD122结合，并且与肿瘤细胞上的CD20结合。图2B至图2N示出了多特异性蛋白质的不同构型，这些多特异性蛋白质的不同之处在于在感兴趣的抗原(例如癌抗原)结合位点(1个或2个位点)的数量和围绕Fc结构域二聚体的结构域的构型。在图2G、图2H、图2J、图2K、图2L、图2M和图2N中，CH3结构域中的星号表示突变H435R和Y436F(Kabat EU编号)。
图3通过T6格式蛋白质来活化TReg细胞，该蛋白质含有野生型IL-2或变体IL2并且缺乏与NKp46、CD16A和感兴趣的抗原的结合。与含有野生型IL-2的T6蛋白质相比，含有变体IL2的T6蛋白质显示出明显降低的活化Treg细胞的能力。
图4示出了NK细胞中pSTAT5细胞的％。CD20-T5-NKp46-IL2v和IC-T6-IC-IL2v表现出相当的Treg细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞的活化。然而，与不结合NKp46或CD16A的IC-T6-IC-IL2相比，CD20-T5-NKp46-IL2v导致NK细胞中pSTAT5+细胞的百分比增加约2-log。CD20-T5-NKp46-IL2v蛋白质允许对NK细胞的选择性活化优于Treg细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞。
图5示出了NK细胞中pSTAT5细胞的％。与CD20-T6-NKp46-IL2v相比，结合CD16和NKp46两者(除IL2v部分之外)的CD20-T5-NKp46-IL2v导致NK细胞中pSTAT5+细胞的百分比的效力的明显增加(增加约1-log)。因此，NK细胞中的IL-2R信号传导被NKp46和CD16中的每一者增强，并且当除IL-2R之外还结合NKp46和CD16时具有特别明显的增强。
图6示出了在不存在肿瘤细胞的情况下表达CD69的NK细胞的％。结合CD20、NKp46和CD16但缺乏IL2v部分的CD20-T5-NKp46在不存在肿瘤细胞的情况下不活化NK细胞，而所有含有IL2v部分的蛋白质导致明显的NK细胞活化，与缺乏CD16和NKp46结合的IC-T6-IC-IL2v蛋白质相比，对于具有结合NKp46的结构域和野生型Fc结构域的蛋白质观察到另外的益处。
图7示出了在不存在肿瘤细胞的情况下，y轴上的增殖的NK细胞的％和x轴上的测试蛋白质的浓度。结合CD20、NKp46和CD16但缺乏IL2v部分的CD20-T5-NKp46不诱导NK细胞的增殖，而所有含有IL2v部分的蛋白质导致明显的NK细胞增殖，尽管在效力上有所差异。与缺乏CD16和NKp46结合的IC-T6-IC-IL2v蛋白质相比，具有结合NKp46的结构域和/或野生型Fc结构域(除IL2v之外)的所有NK细胞衔接子蛋白质在诱导NK细胞增殖方面更有效。
图8A和图8B示出了在ET比例为10:1的细胞毒性测定中由NK细胞诱导的特异性裂解％。图8C和图8D示出了在ET比例为2:1的细胞毒性测定中由NK细胞诱导的特异性裂解％。在诱导NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性方面，保留结合CD16和NKp46(除CD20之外)两者的能力的所有NK细胞衔接子在EC50值方面表现出相似的高效力。IL-2多肽(野生型或突变的IL2v)的性质似乎无差别地影响NK细胞的细胞毒性，此外IL2(无论是野生型还是IL2v)的存在并未导致诱导细胞毒性的EC50值提高。
图9示出了在存在NK细胞衔接子和肿瘤细胞的情况下由NK细胞产生的细胞因子。具有结合NKp46的结构域和野生型Fc结构域的NK细胞衔接子蛋白质在诱导NK细胞产生MIP1b和IFN方面更有效γ。在不存在肿瘤靶向的情况下，以不结合CD20的IC-T5-NKp46-IL2v构建体为例，NK细胞衔接子不会引起NK细胞产生细胞因子。
图10表明，与奥妥珠单抗(左图)相比，对小鼠施用结合CD20、NKp46、CD16A和CD122的CD20-T5-NKp46-IL2v NK细胞衔接子蛋白质(右图)作为单次注射显示出强抗肿瘤功效。
图11表明，施用25μg剂量的CD20-T5-NKp46-IL2v对小鼠的大体积肿瘤产生非常强且长时间的抗肿瘤活性，这允许肿瘤的体积在研究期间通常保持低于300mm3。
图12表明，当从肿瘤移植后第9天开始(此时肿瘤已经生长到60mm3的体积)以间隔一周的两次注射给药时，结合CD20、NKp46、CD16A和CD122的CD20-T5-NKp46-IL2v NK细胞衔接子蛋白质在小鼠肿瘤模型中显示出强功效。相比之下，在CD20-T5-IC-IL2v组和CD20-F5-NKp46组中，肿瘤在治疗之后的起初一周期间被稍微控制，但之后的体积迅速生长超过300mm3。NKp46和CD122结合对于有效控制肿瘤生长是至关重要的，并且它们的同时靶向驱动CD20-T5-NKp46-IL2v分子的强抗肿瘤功效。
图13左图显示，从用结合CD20、NKp46、CD16A和CD122的CD20-T5-NKp46-IL2v NK细胞衔接子蛋白质处理的小鼠收获的肿瘤显示出ncr1转录物(编码NKp46蛋白质并且对NK细胞具有高度特异性)的高表达，这表明肿瘤中的NK细胞浸润增加。相比之下，在用CD20-F5-NKp46蛋白质或奥妥珠单抗处理的小鼠中收获的肿瘤仅显示出ncr1转录物的少量增加，这表明肿瘤中的NK细胞浸润低得多。右图显示，在用CD20-T5-NKp46-IL2v NK细胞衔接子蛋白质处理的小鼠中收获的肿瘤显示出与其他处理条件相比干扰素γ(ifng)转录物的更高表达，这表明NK细胞被活化。
图14显示，右上图中示出了用CD20-T5-NKp46-IL2v NK细胞衔接子处理使肿瘤生长得到控制(处理天数用箭头显示)。然而，NK细胞耗竭导致肿瘤生长在约第30天时失控(右下图)，而未耗竭NK细胞的小鼠中的肿瘤仍然得到控制。
图15示出了PBMC中pSTAT5细胞的％。无论IL2v与结合NKp46的Fab的C末端之间的接头的长度如何，所有GA101-T5-NKp46-IL2v NK细胞衔接子蛋白质在NK细胞中优于TReg细胞、CD8 T细胞和CD4 T细胞而优先诱导IL2R信号传导的能力是相当的。
图16示出了由“T5”和“T6”格式的NKCE蛋白质增强的细胞毒性，其中基于NKp46-1VH/VL对的结合NKp46的结构域被定位在Fc结构域二聚体与C末端IL2v之间，具有10个氨基接头、短(5aa)接头或长(15aa)接头；这些蛋白质在增强NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性的能力方面都是相当的。
图17示出了由“T5”和“T6”格式的NKCE蛋白质增强的细胞毒性，其中基于NKp46-4VH/VL对的结合NKp46的结构域被定位在Fc结构域二聚体与C末端IL2v之间，具有10个氨基接头、短(5aa)接头或长(15aa)接头；这些蛋白质在增强NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性的能力方面都是相当的。
图18示出了图15、图16和图17中所测试的蛋白质的结构。
图19示出了PBMC细胞中pSTAT5细胞的％。与包含野生型IL-2且不结合NKp46或CD16A的IC-T6-IC-IL2(IL2pWT)相比，具有不同IL-2部分的CD20-T5-NKp46-IL2v、CD20-T5-NKp46-IL2v2和CD20-T5-NKp46-IL2v3是相当的，并且各自都导致NK细胞中pSTAT5+细胞的百分比增加约2-log。因此，CD20-T5-NKp46-IL2v蛋白质允许对NK细胞的选择性活化优于Treg细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞。不同“非α”细胞因子变体的取代不影响NKCE-IL2v蛋白质对NK细胞的选择性活化优于Treg细胞、CD4T细胞和CD8 T细胞的能力。
图20示出了IL-6产量，并且右图示出了在用25μg或70μg剂量的CD20-T5-NKp46-IL2v NK细胞衔接子处理之后，TNFα随时间推移的产生；左柱表示70μg剂量的细胞因子的血浆浓度，并且右柱表示25μg剂量的细胞因子的血浆浓度。
图21A和图21B示出了用于研究多特异性蛋白质的作用机制的缺乏细胞因子部分的不同多特异性蛋白质的结构域结构，包括格式2(F2)、格式5(F5)、格式7(F7)、格式13(F13)和格式14(F14)蛋白质。
图22(图22A：CD107和图22B：CD69)显示，在存在表达靶抗原的细胞的情况下，通过结合CD19、CD16A和NKp46的多特异性蛋白质来活化NK细胞。CD19×NKp46结合蛋白质(分别包含NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4或NKp46-9可变区)中的每一者在存在Daudi细胞的情况下活化NK细胞。
图23示出了通过CD19×NKp46结合蛋白质指导纯化的NK细胞裂解CD19阳性Daudi肿瘤靶细胞的能力。CD19-F6-NKp46蛋白质(其Fc结构域由于N297取代而不结合CD16A)在介导Daudi靶细胞的NK细胞裂解方面与结合二价CD19的全长IgG1抗CD19抗体一样有效，并且CD19-F5-NKp46(F5格式蛋白，其Fc结构域结合CD16A)甚至更有效。
图24表明，NKp46×EGFR NKCE蛋白质(其Fc结构域结合CD16)在介导A549靶细胞溶解方面非常有效。
图25表明，NKp46×ROR1 NKCE蛋白质(其Fc结构域结合CD16)在介导Mino肿瘤靶细胞溶解方面非常有效。
图26表明，NKp46×KIR3DL2 NKCE蛋白质(其Fc结构域结合CD16)在介导HUT78肿瘤靶细胞溶解方面非常有效。
图27示出了在与CD20-T5A-NKp46-IL15一起温育后，y轴上的NK细胞中pSTAT5细胞的％和x轴上的测试蛋白质的浓度，与不结合NKp46或CD16A的CD20-T6AB3-ICb-IL15相比，该CD20-T5A-NKp46-IL15诱导用于NK细胞中STAT5磷酸化的EC50的降低。
图28示出了在与CD20-T5A-NKp46-IL15一起温育后，y轴上的增殖的NK、CD4 T或CD8 T细胞的％和x轴上的测试蛋白质的浓度，与不结合NKp46或CD16A的CD20-T6AB3-IC-IL15蛋白质相比，该CD20-T5A-NKp46-IL15导致明显的NK细胞增殖，其效力增加。效力的增加对NK细胞具有选择性，因为CD20-T5A-NKp46-IL15诱导CD4和CD8 T细胞增殖的效力没有增加。
图29示出了y轴上的NK细胞对肿瘤细胞的特异性裂解％和x轴上的测试蛋白质的浓度。缺乏与靶细胞上的CD20结合的IC-T5A-NKp46-IL15不会对肿瘤细胞产生强细胞毒性，而CD20-T5A-NKp46-IL15显示出高效力。
图30，左图示出了y轴上的表达CD69的NK细胞的％和x轴上的测试蛋白质的浓度，并且右图示出了NK细胞中CD69表达的中值荧光强度(medFI)。与不结合NK细胞上的CD16A或NKp46的GA101-T6AB3-IC-IL18v相比，CD20-T5A-NKp46-IL18v诱导了用于NK细胞活化的EC50在两个数量级范围内的降低。
图31示出了在与CD20-T5A-NKp46-IL18v一起温育后，y轴上的表达IFN-γ的NK细胞的％和x轴上的测试蛋白质的浓度，与不结合NK细胞上的CD16A或NKp46的CD20-T6AB3-IC-IL18v相比，该CD20-T5A-NKp46-IL18v诱导用于NK细胞活化的EC50中在两个数量级范围内的降低。
图32示出了在与CD20-T5A-NKp46-IL18v蛋白质一起温育后，y轴上的增殖的NK、CD4 T或CD8 T细胞的％和x轴上的测试蛋白质的浓度，该CD20-T5A-NKp46-IL18v蛋白质导致比CD4和CD8 T细胞更具选择性的明显的NK细胞增殖。不结合CD16A或NKp46的CD20-T6AB3-IC-IL18v蛋白质未示出NK细胞的显著活化。
图33示出了在与CD20-T5A-NKp46-IL18v蛋白质一起温育后，y轴上的NK细胞对肿瘤细胞的特异性裂解％和x轴上的测试蛋白质的浓度。缺乏与靶细胞上的CD20结合的IC-T5A-NKp46-IL18v不诱导显著的细胞毒性。
图34示出了在与CD20-T5A-NKp46-IFNαv一起温育后，y轴上的NK细胞、CD4 T或CD8T细胞中pSTAT3细胞的％和x轴上的测试蛋白质的浓度，与不诱导任何显著NK细胞活化的CD20-T6AB3-IC-IFNαv相比，该CD20-T5A-NKp46-IFNαv在NK细胞中选择性地诱导有效的STAT3磷酸化优于CD4或CD8 T细胞。
图35示出了在与CD20-T5A-NKp46-IFNαv一起温育后，y轴上的NK细胞对肿瘤细胞的特异性裂解％和x轴上的测试蛋白质的浓度，该CD20-T5A-NKp46-IFNαv在诱导NK细胞细胞毒性中在EC50值方面表现出高效力。
图36示出了在用NKCE蛋白质处理非人灵长类动物之前14天和之后30天内的B细胞计数(细胞/μL)与基线的差异，表明NKCE蛋白质诱导B细胞耗竭，而对照(媒介物)不诱导B细胞耗竭
图37示出了在向非人灵长类动物施用NKCE蛋白质后24小时过程内的不同细胞因子的产生。
图38示出了用NKCE或媒介物处理的非人灵长类动物在从处理前14天至处理后30天的时间段内的红细胞、血小板、血红蛋白、血细胞比容、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白和平均红细胞血红蛋白浓度的平均值
图39示出了在从处理前14天至处理后30天的时间段内，非人灵长类动物中的白细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱细胞的水平
图40示出了在从处理前14天至处理后30天的时间段内，非人灵长类动物中NK细胞、CD8+T细胞、FoxP3-CD4+T细胞和FoxP3+CD4+T细胞的水平。
图41示出了在用CD20-T5-NKp46-IL2v处理后，对来自小鼠肿瘤的细胞中NK1.1和CD3的表达进行染色的流式细胞术的结果，这些结果表明CD20-T5-NKp46-IL2v刺激了NK细胞(NK1.1+CD3-)在肿瘤部位的累积。
图42示出了在处理小鼠后，NK细胞数量/脾、脾中表达CD69的NK细胞的％和脾中表达Ki67的NK细胞的％。CD20-F5-NKp46蛋白质和奥妥珠单抗没有增加NK细胞的数量，而用CD20-T5-NKp46-IL2v处理引起了脾中NK细胞的明显增加。另外，CD20-T5-NKp46-IL2v引起总NK细胞中活化或增殖的NK细胞的明显增加。
图43示出了在处理小鼠后，NK细胞数量/μL血液、血液中表达CD69的NK细胞的％、脾中表达CD69的NK细胞的％和脾中表达Ki67的NK细胞的％。用CD20-T5-NKp46-IL2v处理引起每μl血液和脾中NK细胞数量的明显增加，以及在血液和脾中NK细胞中的活化的(表达CD69的)NK细胞的明显增加。
具体实施方式
定义
如本说明书中所用，“一个”或“一种”可意指一个(种)或多个(种)。如权利要求中所用，当与词语“包含”结合使用时，词语“一个”或“一种”可意指一个(种)或超过一个(种)。
在使用“包含”的情况下，这可任选地被替代为“基本上由...组成”，或任选地被替代为“由...组成”。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”或“ABD”是指包括能够免疫特异性结合于表位的三维结构的结构域。因此，在一个实施方案中，所述结构域可包括高变区，任选地抗体链的VH和/或VL结构域，任选地至少VH结构域。在另一个实施方案中，结合结构域可包括抗体链的至少一个互补性决定区(CDR)。在另一个实施方案中，结合结构域可包括来自非免疫球蛋白支架的多肽结构域。
本文的术语“抗体”以最广泛的意义使用并且具体地包括全长单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及抗体片段和衍生物，只要它们表现出期望的生物活性即可。例如Harlow等人，“抗体：实验室手册(ANTIBODIES:A LABORATORYMANUAL)”，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(ColdSpring Harbor)，纽约(N.Y.)，1988年中提供了与抗体产生相关的各种技术。“抗体片段”包括全长抗体的一部分，例如其抗原结合区或可变区。抗体片段的示例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab’)2、F(ab)3、Fv(通常为抗体的单臂的VL和VH结构域)、单链Fv(scFv)、dsFv、Fd片段(通常为VH和CH1结构域)和dAb(通常为VH结构域)片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体和κ抗体(参见例如Ill等人，Protein Eng，1997年，第10卷：第949-57页)；骆驼IgG；IgNAR；以及由抗体片段和一个或多个分离的CDR或功能互补位形成的多特异性抗体片段，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可缔合或连接在一起而形成功能抗体片段。各种类型的抗体片段已在例如Holliger和Hudson，Nat Biotechnol，2005年，第23卷第1126-1136页；WO2005040219以及公开的美国专利申请20050238646和20020161201中描述或综述。
术语“高变区”在本文中使用时是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，1991年)和/或来自“高变环”的那些残基(例如，轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol，1987年，第196卷：第901-917页)。通常，该区域中的氨基酸残基的编号通过Kabat等人，出处同上中所述的方法执行。诸如“Kabat位置”、“如Kabat中的可变结构域残基编号”和“根据Kabat”之类的短语在本文中是指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的该编号系统。使用Kabat编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可包含与可变结构域的FR或CDR的缩短或向其中的插入相对应的更少或附加氨基酸。例如，重链可变结构域可包含在CDR H2的残基52之后的单氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后插入的残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可通过在同源性区域处对给定抗体的序列与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定该抗体的残基的Kabat编号。
如本文所用，所谓“框架”或“FR”残基意指除被定义为CDR的那些区域之外的抗体可变结构域的区域。每个抗体可变结构域框架可被进一步细分为由这些CDR分开的连续区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
如本文所定义，所谓“恒定区”意指由轻链或重链免疫球蛋白恒定区基因编码的抗体衍生的恒定区。
如本文所用，所谓“恒定轻链”或“轻链恒定区”或“CL”意指由κ(Cκ)或λ(Cλ)轻链编码的抗体的区域。恒定轻链通常包含单个结构域，并且如本文所定义，是指Cκ的位置108-214或Cλ，其中编号根据EU索引(Kabat等人，1991年，“免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”，第5版，美国公共卫生署(United States Public Health Service)，国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)，贝塞斯达(Bethesda))。
如本文所用，所谓“恒定重链”或“重链恒定区”意指由μ、δ、γ、α或ε基因编码的抗体的区域以将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA或IgE。对于全长IgG抗体而言，如本文所定义的恒定重链是指CH1结构域的N末端至CH3结构域的C末端，因此包含位置118-447，其中编号根据EU索引。
如本文所用，所谓“Fab”或“Fab区”意指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的单位。术语Fab包括包含与VL-CL部分缔合的VH-CH1部分的单位，以及其中在轻链结构域和重链结构域之间存在交叉或互换的交叉Fab结构。例如，Fab可具有与VL-CH1单元缔合的VH-CL单元。Fab可孤立地指该区域，或指在蛋白质、多特异性蛋白质或ABD的背景下的该区域，或如本文所概述的任何其他实施方案。
如本文所用，所谓“单链Fv”或“scFv”意指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般来讲，Fv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头使scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。用于产生scFv的方法在本领域中是熟知的。有关用于产生scFv的方法的综述，参见Pluckthun，《单克隆抗体的药理学》(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，施普林格出版社(Springer-Verlag)，纽约(New York)，第269-315页(1994)。
如本文所用，所谓“Fv”或“Fv片段”或“Fv区域”意指包含单一抗体的VL和VH结构域的多肽。
如本文所用，所谓“Fc”或“Fc区域”意指包含将第一恒定区免疫球蛋白结构域排除在外的抗体的恒定区的多肽。因此Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，及这些结构域N末端的柔性铰链。对于IgA和IgM而言，Fc可包含J链。对于IgG而言，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2(CH2)和Cγ3(CH3)以及任选的Cγ1与Cγ2之间的铰链。尽管Fc区的边界可改变，但是人类IgG重链Fc区通常被定义为包含残基C226、P230或A231到其羧基端，其中该编号根据EU索引。Fc可孤立地指该区域，或指Fc多肽的背景下的该区域，如下所述。如本文所用，所谓“Fc多肽”或“Fc衍生的多肽”意指包含全部或部分Fc区的多肽。本文的Fc多肽包括但不限于抗体、Fc融合体和Fc片段。此外，根据本发明的Fc区包括至少一个变体，该变体含有改变(增强或减弱)Fc相关效应功能的修饰。此外，根据本发明的Fc区包括嵌合Fc区，该嵌合Fc区包含不同Fc区的不同部分或结构域，例如，源自不同同种型或物种的抗体。
如本文所用，所谓“可变区”意指包含基本上由分别构成轻链(包括κ和λ)和重链免疫球蛋白基因座的VL(包括Vκ(Vκ)和Vλ)和/或VH基因中的任一者编码的一个或多个Ig结构域的抗体的区域。轻链或重链可变区(VL或VH)由被称为“互补决定区”或“CDR”的三个高变区中断的“框架”或“FR”区组成。框架区和CDR的范围已如Kabat(参见“免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”，E.Kabat等人，美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，(1983))中及如Chothia中精确定义。抗体的框架区(即，成分轻链和重链的组合框架区)用于定位并对齐主要负责结合抗原的CDR。
术语“特异性结合”意指抗体或多肽可在竞争性结合测定中优选地与结合配偶体结合，例如NKp46，如使用重组形式的蛋白质、其中的表位或存在于分离的靶细胞表面上的天然蛋白质评估的。竞争性结合测定法和其他用于确定特异性结合的方法在下文进一步描述并且是本领域中熟知的。
当抗体或多肽被称为“竞争”特定的多特异性蛋白质或特定的单克隆抗体(例如，在抗NKp46单特异性抗体或多特异性蛋白质的上下文中的NKp46-1、NKp46-2、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9)时，其意指抗体或多肽在使用重组靶(例如NKp46)分子或表面表达的靶(例如NKp46)分子的结合测定中与特定的多特异性蛋白质或单克隆抗体竞争。例如，如果测试抗体在结合测定中降低NKp46-1、NKp46-2、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9与NKp46多肽或表达NKp46的细胞的结合，则抗体被称为分别与NKp46-1、NKp46-2、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9“竞争”。
如本文所用，术语“亲和力”意指抗体或蛋白质与表位的结合强度。抗体的亲和力由被定义为[Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]的解离常数KD给定，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合抗体的摩尔浓度，并且[Ag]是未结合抗原的摩尔浓度。亲和常数KA由1/KD定义。用于确定蛋白质亲和力的优选方法可见于Harlow等人，“抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)”，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1988年)；Coligan等人编辑，“当代免疫学方案(Current Protocols in Immunology)”，格林出版联合公司(Greene Publishing Assoc.)和威利跨学科出版社(Wiley Interscience)，纽约，(1992年、1993年)；以及Muller，Meth.Enzymol.，第92卷：第589-601页(1983年)，这些参考文献全文以引用方式并入本文。本领域中熟知的用于确定蛋白质亲和力的一种优选的标准方法是使用表面等离子共振(SPR)筛选(诸如通过用BIAcoreTMSPR分析设备分析)。
在本发明的上下文中，“决定簇”是指多肽上相互作用或结合的位点。
术语“表位”是指抗原决定簇，并且是抗体或蛋白质结合的抗原上的区域或区。蛋白质表位可包含直接参与结合的氨基酸残基以及被特异性抗原结合抗体或肽有效封闭的氨基酸残基，即，抗体的“足迹”内的氨基酸残基。其是可与例如抗体或受体组合的复合抗原分子上的最简单形式或最小结构区域。表位可为线性的或构象/结构的。术语“线性表位”被定义为由线性氨基酸序列上连续的氨基酸残基构成的表位(一级结构)。术语“构象或结构表位”被定义为由并不都连续并因此代表通过分子折叠而彼此接近的线性氨基酸序列的分开部分的氨基酸残基构成的表位(二级、三级和/或四级结构)。构象表位取决于3维结构。因此术语“构象”通常可与“结构”互换使用。表位可通过本领域已知的不同方法鉴定，包括但不限于丙氨酸扫描、噬菌体展示、X射线晶体学、基于阵列的寡肽扫描或肽扫描分析、定点诱变、高通量诱变作图、H/D-Ex质谱、同源建模、对接、氢-氘交换等。(参见例如Tong等人，“预测免疫原性表位的方法和方案(Methods and Protocols for prediction ofimmunogenic epitopes)”，Briefings in Bioinformatics，第8卷第2期：第96-108页；Gershoni,Jonathan M；Roitburd-Berman,Anna；Siman-Tov,Dror D；Tarnovitski Freund,Natalia；Weiss,Yael(2007年)，“表位绘制(Epitope Mapping.)”，BioDrugs，第21卷第3期：第145–56页；以及Flanagan,Nina(2011年5月15日)，“用H/D-Ex Mass Spec绘制表位：ExSAR扩展了蛋白质表征以外的技术平台(Mapping Epitopes with H/D-Ex Mass Spec:ExSARExpands Repertoire of Technology Platform Beyond Protein Characterization)”，Genetic Engineering&Biotechnology News第31卷第10期。
“化合价”或“原子价”表示在结合抗原的蛋白质中存在确定数量的结合抗原的部分。天然IgG具有两个抗原结合部分并且是二价的。对特定抗原具有一个结合部分的分子对该抗原是单价的。
所谓“氨基酸修饰”在本文中意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。氨基酸修饰在本文中的一个示例是取代。所谓“氨基酸修饰”在本文中意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。所谓“氨基酸取代”或“取代”在本文中意指蛋白质序列中的给定位置处的氨基酸替换为另一个氨基酸。例如，取代Y50W是指亲本多肽的变体，其中位置50处的酪氨酸被替换为色氨酸。氨基酸取代通过列出野生型蛋白质中存在的残基/突变体蛋白质中存在的残基位置/残基来表示。多肽的“变体”是指具有与参考多肽(通常为天然或“亲本”多肽)基本上相同的氨基酸序列的多肽。多肽变体在天然氨基酸序列内的某些位置处可具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。
“保守”氨基酸取代是氨基酸残基被替换为具有类似物理化学特性的侧链的氨基酸残基的那些取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中是已知的，并且包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
术语“同一性”或“相同”在两个或更多个多肽的序列之间的关系中使用时是指多肽之间的序列相关性的程度，如通过两个或更多个氨基酸残基的链之间的匹配数所确定。“同一性”度量通过特定数学模型或计算机程序(即，“算法”)解决的具有空位对齐(如果有的话)的两个或更多个序列中的更小序列之间的相同匹配的百分比。可易于通过已知方法计算相关多肽的同一性。此类方法包括但不限于以下文献中描述的那些：“计算分子生物学(Computational Molecular Biology)”，Lesk,A.M.编辑，牛津大学出版社(OxfordUniversity Press)，纽约，1988年；“生物计算：信息学和基因组计划(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)”，Smith,D.W.编辑，学术出版社(Academic Press)，纽约，1993年；“序列数据的计算机分析第1部分(Computer Analysis of Sequence Data,Part 1)”，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑，胡马纳出版社(Humana Press)，新泽西州，1994年；“分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)”，vonHeinje,G.，学术出版社，1987年；“序列分析引物(Sequence Analysis Primer)”，Gribskov,M.和Devereux,J.编辑，M.斯托克顿出版社(M.Stockton Press)，纽约，1991年；以及Carillo等人，SIAM J.Applied Math.第48卷第1073页(1988年)。
用于确定同一性的优选方法被设计为给出所测试的序列之间的最大匹配。确定同一性的方法在公开可用的计算机程序中有所描述。用于确定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等人，Nucl.Acid.Res.第12卷第387页(1984年)；威斯康星大学遗传学计算机小组(Genetics Computer Group,University ofWisconsin)，威斯康星州麦迪逊(Madison,Wis.))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，J.Mol.Biol.，第215卷第403-410页(1990年))。BLASTX程序可从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)和其他来源(“BLAST手册(BLAST Manual)”，Altschul等人，NCB/NLM/NIH贝塞斯达(Bethesda)，马里兰州(Md.)，20894，Altschul等人，出处同上)公开获得。熟知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。
“分离的”分子是这样的分子，其是发现该分子的组合物中相对于该分子所属于的分子类别而言主要的物质(即，其构成该组合物中的该分子类型的至少约50％并且通常将构成该组合物中的该分子物质(例如肽)的至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多)。通常，多肽的组合物对于该组合物中的所有存在的肽物质的背景下的多肽或至少相对于所提议用途的背景下的基本上活性的肽物质将表现出98％、98％或99％同源性。
在本文的上下文中，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指预防、缓解、管理、治愈或减轻疾病或障碍的一种或多种症状或临床相关表现，除非与上下文相矛盾。例如，尚未鉴别出疾病或障碍的症状或临床相关表现的患者的“治疗”是预防或预防性疗法，而已鉴别出疾病或障碍的症状或临床相关表现的患者的“治疗”通常不构成预防或预防性疗法。
如本文所用，短语“NK细胞”是指参与非常规免疫的淋巴细胞亚群。NK细胞可通过某些特征和生物学性质来鉴定，诸如人NK细胞的特异性表面抗原(包括CD56和/或NKp46)的表达、细胞表面上α/β或γ/δTCR复合物的缺失、通过活化特异性溶解细胞机制结合和杀伤无法表达“自身”MHC/HLA抗原的细胞的能力、杀伤表达NK活化受体的配体的肿瘤细胞或其他患病细胞的能力，以及释放刺激或抑制免疫应答的蛋白质分子(称为细胞因子)的能力。使用本领域熟知的方法，可将这些特征和活性中的任一种用于鉴定NK细胞。NK细胞的任何亚群也涵盖在术语NK细胞中。在本文的上下文中，“活性”NK细胞指生物活性NK细胞，包括具有裂解靶细胞或增强其他细胞的免疫功能的能力的NK细胞。NK细胞可通过本领域已知的各种技术获得，诸如从血样中分离、细胞单采法、组织或细胞收集等。涉及NK细胞的有用的试验方案可以在“自然杀伤细胞方案(Natural Killer Cells Protocols)”(由Campbell KS和Colonna M编辑)中找到。胡马纳出版社，第219-238页(2000年)。
如本文所用，对NKp46具有“激动”活性的药剂是能够引起或增加“NKp46信号传导”的药剂。“NKp46信号传导”是指NKp46多肽活化或转导细胞内信号传导途径的能力。NKp46信号传导活性的变化可通过以下方式来测量：例如通过设计成测量NKp46信号传导途径的变化的测定法(例如通过监测信号转导组分的磷酸化)、测量某些信号转导组分与其他蛋白质或细胞内结构的缔合的测定法、或测量组分(诸如激酶)的生物化学活性的测定法、或设计成测量在NKp46敏感性启动子和增强子的控制下的报道基因的表达的测定法、或间接通过NKp46多肽介导的下游效应(例如NK细胞中特异性细胞解机制的活化)。报道基因可以是天然存在的基因(例如监测细胞因子产生)或者它们可以是人工引入细胞中的基因。可将其他基因置于此类调控元件的控制下，并因此用于报告NKp46信号传导的水平。
“NKp46”是指由Ncr1基因或由从此类基因制备的cDNA编码的蛋白质或多肽。任何天然存在的同种型、等位基因、直系同源物或变体均涵盖在术语NKp46多肽中(例如，与SEQID NO:1或与其至少20个、30个、50个、100个或200个氨基酸残基的连续序列90％、95％、98％或99％相同的NKp46多肽)。人NKp46(同种型a)的304个氨基酸残基序列如下所示：
MSSTLPALLC VGLCLSQRIS AQQQTLPKPF IWAEPHFMVPKEKQVTICCQ GNYGAVEYQLHFEGSLFAVD RPKPPERINKVKFYIPDMNS RMAGQYSCIY RVGELWSEPS NLLDLVVTEMYDTPTLSVHPGPEVISGEKV TFYCRLDTAT SMFLLLKEGRSSHVQRGYGK VQAEFPLGPV TTAHRGTYRCFGSYNNHAWSFPSEPVKLLV TGDIENTSLA PEDPTFPADT WGTYLLTTETGLQKDHALWD HTAQNLLRMGLAFLVLVALV WFLVEDWLSRKRTRERASRA STWEGRRRLN TQTL(SEQ ID NO:1)。
SEQ ID NO:1对应于NCBI登录号NP_004820，其公开内容以引用方式并入本文。人NKp46 mRNA序列描述于NCBI登录号NM_004829中，其公开内容以引用方式并入本文。
生产多肽
使用熟知的免疫球蛋白衍生的结构域，特别是重链和轻链可变结构域、铰链区、CH1恒定结构域、CL恒定结构域、CH2恒定结构域和CH3恒定结构域以及野生型或变体细胞因子多肽，可方便地构造并生产本文所述的蛋白质。位于共同多肽链上的结构域可彼此直接融合或经由接头连接，这取决于所涉及的特定结构域。免疫球蛋白衍生的结构域优选是人源化的或人源的，从而在施用于人体时提供降低的免疫原性风险。如本文所示，描述了有利的蛋白质格式，这些蛋白质格式使用最少的非免疫球蛋白连接氨基酸序列(例如不超过4个或5个结构域接头，在一些情况下少至1个或2个结构域接头，并且使用短长度的结构域接头)，从而进一步降低免疫原性的风险。
免疫球蛋白可变结构域通常源自抗体(免疫球蛋白链)，例如，以在两条多肽链或单链抗原结合结构域上发现的相关的VL和VH结构域的形式，诸如scFv、VH结构域、VL结构域、dAb、V-NAR结构域或VHH结构域。在本文公开的某些有利的蛋白质格式中，这些蛋白质格式能够直接使用来自Fab或scFv的宽范围的可变区而基本上不需要配对和/或折叠，抗原结合结构域(例如，ABD1和ABD2)也可容易地源自抗体作为Fab或scFv。
术语“抗原结合蛋白”可用于指具有抗原结合特性的免疫球蛋白衍生物。这些结合蛋白包含能够与靶抗原结合的免疫功能免疫球蛋白部分。免疫功能免疫球蛋白部分可包含免疫球蛋白或其部分、源自免疫球蛋白部分的融合肽、或结合免疫球蛋白部分的缀合物，该缀合物形成抗原结合位点。每个抗原结合部分包含抗原结合部分所衍生的免疫球蛋白重链和/或轻链的至少必需的一个、两个或三个CDR。在一些方面，抗原结合蛋白可由单条多肽链(单体)组成。在其他实施方案中，抗原结合蛋白包含至少两条多肽链。此类抗原结合蛋白是多聚体，例如二聚体、三聚体或四聚体。抗原结合蛋白的示例包括对其抗原保留特异性和亲和力的抗体片段、抗体衍生物或抗体样结合蛋白质。
通常，最初通过用包含期望获得抗体的多肽或其片段或衍生物(通常是免疫原性片段)的免疫原(例如人多肽)免疫非人动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠或兔)来获得抗体。用抗原免疫非人哺乳动物的步骤可以本领域熟知的任何方式进行，用于刺激小鼠中抗体的产生(参见例如，E.Harlow和D.Lane，“抗体：实验室手册(Antibodies:A LaboratoryManual.)”，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1988年)，该文献的全部公开内容以引用方式并入本文)。还可通过使用转基因动物进行免疫来产生人抗体，这些转基因动物已经被工程化以表达人抗体库(Jakobovitz等人，Nature，第362卷(1993年)第255页)，或者通过使用噬菌体展示方法选择抗体库来产生人抗体。例如，XenoMouse(Abgenix，Fremont，CA)可用于免疫。XenoMouse是一种小鼠宿主，其免疫球蛋白基因已被功能性人免疫球蛋白基因替换。因此，由此小鼠或由此小鼠的B细胞制备的杂交瘤产生的抗体已经人源化。XenoMouse描述于美国专利号6,162,963中，该专利全文以引用方式并入本文。还可通过选择免疫球蛋白的组合文库来产生抗体，如例如(Ward等人，Nature，第341卷(1989年)第544页，该文献的全部公开内容以引用方式并入本文)中所公开。噬菌体展示技术(McCafferty等人(1990年)，Nature，第348卷：第552-553页)可用于从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库产生抗体。参见例如Griffith等人(1993年)，EMBO J.，第12卷：第725-734页；US 5,565,332；US 5,573,905、US 5,567,610、和US 5,229,275)。当组合文库包含人源可变(V)结构域基因库时，从组合文库中选择将产生人抗体。
在任何实施方案中，抗原结合结构域可获自人源化抗体，其中来自人抗体的互补决定区(CDR)的残基被来自原始抗体(亲本或供体抗体，例如小鼠或大鼠抗体)的CDR的残基取代，同时保持原始抗体的期望的特异性、亲和力和能力。亲本抗体的CDR(其中一些或全部由源自非人生物体的核酸编码)全部或部分地移植到人抗体可变区的β-片层框架中以产生抗体，该抗体的特异性由所移植的CDR决定。此类抗体的产生描述于以下文献中例如WO 92/11018；Jones，1986年，Nature，第321卷：第522-525页；Verhoeyen等人，1988年，Science，第239卷：第1534-1536页。因此，抗原结合结构域可具有非人高变区或CDR和人构架区序列(任选地具有回复突变)。
另外，科学和专利文献中有多种抗体可供选择，包括DNA和/或氨基酸序列，或者这些抗体来自商业供应商。抗体通常针对预先确定的抗原。抗体的示例包括识别由待消除的靶细胞表达的抗原的抗体，该靶细胞例如增殖细胞或导致疾病病理的细胞。示例包括识别肿瘤抗原、微生物(例如细菌或寄生虫)抗原或病毒抗原抗体。
另选地，本文所述的蛋白质中使用的抗原结合结构域可容易地源自多种非免疫球蛋白支架中的任一种，例如基于葡萄球菌蛋白A的Z结构域的亲和体、工程化的Kunitz结构域、基于人纤连蛋白III的第10个细胞外结构域的单体或粘附素(adnectin)、源自脂质运载蛋白的抗运载蛋白(anticalin)、(设计的锚蛋白重复结构域、多聚化LDLR-A模块、高亲和力多聚体(avimer)或富含半胱氨酸的结蛋白肽。参见例如Gebauer和Skerra(2009年)，Current Opinion in Chemical Biology，第13卷：第245-255页，其公开内容以引用方式并入本文。
如本文进一步举例说明的，抗原结合结构域方便地包含VH和VL(VH/VL对)。在一些实施方案中，可将VH/VL对整合在进一步包含CH1和CL结构域(CH1/CL对)的Fab结构中。VH/VL对是指彼此缔合以形成抗原结合结构域的一个VH和一个VL结构域。CH1/CL对是指通过共价或非共价相互作用(优选非共价相互作用)彼此缔合的一个CH1结构域和一个CL结构域，从而形成异源二聚体(例如，在诸如异源三聚体、异源四聚体、异源五聚体的蛋白质内，该蛋白质可包含一条或多条另外的多肽链)。形成该对的恒定链结构域可以任何合适的组合存在于相同或不同的多肽链上。
结合NKp46的示例性CDR或VH和VL结构域可源自本文提供的抗NKp46抗体(参见“NKp46可变区和CDR序列”部分)，或可选自PCT公开号WO2016/207278和WO2017/114694的CDR、VH和VL结构域中的任一者，这些文献和专利的公开内容以引用方式并入本文。可变区可直接使用，或者可通过从NKp46抗体中选择高变区或CDR区并将它们置于期望的VL或VH框架(例如人框架)中而进行修饰。结合NKp46的抗原结合结构域还可使用产生抗体的方法从头衍生。可测试抗体与NKp46多肽的结合。在本文任何实施方案的一个方面，与NKp46结合的多肽(例如多特异性蛋白质)将能够与在细胞表面上表达的NKp46结合，例如由NK细胞表达的天然NKp46。
结合感兴趣的抗原的抗原结合结构域(ABD)可基于期望的预先确定的感兴趣的抗原(例如，除NKp46之外的抗原)来选择，并且可包括例如癌抗原，诸如存在于肿瘤细胞上和/或免疫细胞上的能够介导促肿瘤作用的抗原，例如单核细胞或巨噬细胞，任选地抑制性T细胞、调节性T细胞或髓源性抑制性细胞(用于治疗癌症)；细菌或病毒抗原(用于治疗感染性疾病)；或存在于促炎性免疫细胞上的抗原，例如T细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞等(用于治疗炎性和/或自身免疫性病症)。
如本文所用，术语“细菌抗原”包括但不限于完整的、减毒的或杀伤的细菌，任何结构或功能的细菌蛋白质或碳水化合物，或具有足够抗原性的长度(通常约8个氨基酸或更长)的细菌蛋白质的任何肽部分。示例包括革兰氏阳性细菌抗原和革兰氏阴性细菌抗原。在一些实施方案中，细菌抗原源自选自以下的细菌：螺杆菌属物种，特别是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)；疏螺旋体物种，特别是伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)；军团菌属物种，特别是嗜肺性军团杆菌(Legionella pneumophilia)；分枝杆菌属物种，特别是结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)；葡萄球菌属物种，特别是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；奈瑟氏球菌属物种，特别是淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)；李斯特氏菌属物种，特别是单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)；链球菌属物种，特别是酿脓链球菌(S.pyogenes)、无乳链球菌(S.agalactiae)；粪链球菌(S.faecalis)；牛链球菌(S.bovis)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)；厌氧链球菌(anaerobic Streptococcus)物种；致病性弯曲杆菌(pathogenic Campylobacter)物种；肠球菌属物种；嗜血杆菌属物种，特别是流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；芽孢杆菌属物种，特别是炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)；棒状杆菌属物种，特别是白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)；丹毒丝菌属物种，特别是猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)；梭菌属物种，特别是产气荚膜梭菌(C.perfringens)、破伤风梭菌(C.tetani)；肠杆菌属物种，特别是产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)；克雷伯氏菌属物种，特别是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella 1S pneumoniae)；巴斯德氏菌属物种，特别是败血性巴斯德菌(Pasteurella multocida)；类杆菌属物种；梭杆菌属物种，特别是具核梭状芽胞杆菌(Fusobacterium nucleatum)；链杆菌属物种，特别是念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)；密螺旋体物种，特别是细弱密螺旋体(Treponemapertenue)；钩端螺旋体；病原性大肠埃希菌属物种；和放线菌物种，特别是以色列放线菌(Actinomyces israeli)。
如本文所用，术语“病毒抗原”包括但不限于完整的、减毒的或杀伤的完整病毒，任何结构或功能的病毒蛋白质，或具有足够抗原性的长度(通常约8个氨基酸或更长)的病毒蛋白质的任何肽部分。病毒抗原的来源包括但不限于来自以下家族的病毒：逆转录病毒科(例如人类免疫缺陷病毒，诸如HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III；和其他分离物，诸如HIV-LP；小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒)；肠道病毒、人柯萨奇病毒(human Coxsackie viruses)、鼻病毒、埃可病毒(echoviruses))；杯状病毒科(Calciviridae)(例如，引起胃肠炎的菌株)；披盖病毒科(Togaviridae)(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviviridae)(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(Coronaviridae)(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如，水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(Filoviridae)(例如埃博拉病毒)；副黏液病毒科(Paramyxoviridae)(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；本扬病毒科(Bunyaviridae)(例如汉坦病毒、布尼亚病毒、白蛉热病毒和纳伊罗病毒(Nairoviruses))；沙粒病毒科(Arenaviridae)(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如，呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；玻那病毒科(Bornaviridae)；肝病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(Parvoviridae)(parvoviruses)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如，非洲猪瘟病毒)；以及未分类的病毒(例如，δ肝炎的病原体(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷型卫星)、丙型肝炎；诺沃克(Norwalk)及其相关病毒，以及星状病毒)。另选地，可重组产生病毒抗原。
如本文所用，术语“癌抗原”和“肿瘤抗原”可互换使用，并且是指由癌细胞差异表达或由具有促肿瘤作用(例如免疫抑制作用)的非肿瘤细胞(例如免疫细胞)表达的抗原(不同于在NK细胞、NKp46和CD16上表达的细胞因子受体)，并且因此可被利用以靶向癌细胞。癌抗原可以是潜在地刺激强肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些抗原由正常细胞编码，尽管不一定被所述正常细胞表达，或以较低水平或较低频率表达。这些抗原可被表征为在正常细胞中通常沉默(即不表达)的抗原、仅在某些分化阶段表达的抗原以及暂时表达的抗原，诸如胚胎和胎儿抗原。其他癌抗原由突变体细胞基因编码，诸如癌基因(例如，活化的ras癌基因)、抑制基因(例如，突变体p53)、由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白。其他癌抗原还可以由病毒基因编码，诸如RNA和DNA肿瘤病毒上携带的那些基因。还可在能够促成或介导促肿瘤作用的免疫细胞上表达其他癌抗原，例如有助于免疫逃避的细胞、单核细胞或巨噬细胞，任选地抑制性T细胞、调节性T细胞或髓源性抑制性细胞。
癌抗原通常是正常细胞表面抗原，它们要么过度表达，要么在异常时间表达，或者由目标细胞群表达。理想情况下，靶抗原仅在增殖细胞(例如，肿瘤细胞)或促肿瘤细胞(例如具有免疫抑制作用的免疫细胞)上表达，但在实践中很少观察到这种情况。结果，在许多情况下，靶抗原是根据增殖性/疾病组织和健康组织之间的差异表达来选择的。癌抗原的示例包含：受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、Crypto、CD4、CD19、CD20、CD30、CD38、CD47、糖蛋白NMB、CanAg、Her2(ErbB2/Neu)、Siglec家族成员，例如CD22(Siglec2)或CD33(Siglec3)、CD79、CD123、CD138、CD171、PSCA、L1-CAM、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、BCMA、CD52、CD56、CD80、CD70、E-选择素、EphB2、黑转铁蛋白、Mud 6和TMEFF2。癌抗原的示例还包含免疫球蛋白超家族(IgSF)，诸如细胞因子受体、杀伤细胞Ig样受体、CD28家族蛋白，例如杀伤细胞Ig样受体3DL2(KIR3DL2)、B7-H3、B7-H4、B7-H6、PD-L1。示例还包括MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、主要组织相容性复合物I类-相关链A和B多肽(MICA和MICB)、HLA-G、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)、感受器蛋白酪氨酸激酶3(TYRO-3)、nectins(例如nectin-4)、主要组织相容性复合物I类-相关链A和B多肽(MICA和MICB)、UL16结合蛋白(ULBP)家族的蛋白、视黄酸早期转录物-1(RAET1)家族的蛋白、癌胚性抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)、T-细胞感受器/CD3-ζ链、肿瘤抗原的MAGE家族、肿瘤抗原的GAGE家族、抗苗勒(anti-Müllerian)激素II型感受器、δ样配体4(DLL4)、DR5、ROR1(也称为受体酪氨酸激酶样孤儿受体1或NTRKR1(EC 2.7.10.1))、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、MUC家族、VEGF、VEGF感受器、血管生成素-2、PDGF、TGF-α、EGF、EGF感受器、人EGF样感受器家族的成员，例如HER-2/neu、HER-3、HER-4或由至少一个HER亚基组成的异源二聚体受体、胃泌素释放肽受体抗原、Muc-1、CA125、整联蛋白受体、αvβ3整联蛋白、α5β1整联蛋白、αIIbβ3整联蛋白、PDGFβ受体、SVE-钙粘蛋白、hCG、CSF1R(肿瘤相关单核细胞和巨噬细胞)、α-甲胎蛋白、E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白和γ-连环蛋白、p120ctn、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig-独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物诸如人乳头瘤病毒蛋白、imp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7以及c-erbB-2，尽管这些并非是详尽无遗的。
任选地，可将多特异性蛋白质指定为排除或不需要基质修饰部分，例如，能够改变或降解基质组分诸如ECM组分的部分，例如，糖胺聚糖，例如玻尿酸(也称为透明质酸或HA)、硫酸软骨素、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸肝素、肝素、巢蛋白、腱生蛋白、聚集蛋白和硫酸角蛋白；或胞外蛋白，例如胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白和玻连蛋白。例如，基质修饰部分可以是玻尿酸降解酶、抑制玻尿酸合成的化学剂或针对透明质酸的抗体分子。任选地，可将多特异性蛋白质指定为排除间皮素靶向部分或结合间皮素的ABD。任选地，可将多特异性蛋白质指定为排除PD-L1靶向部分、HER3靶向部分、IGFIR靶向部分或透明质酸酶1靶向部分，或者基质靶向部分或ABD与癌抗原靶向部分的组合。任选地，可将癌抗原或感兴趣的抗原指定为不同于PD-L1、HER3、IGFIR或透明质酸酶1。
举例来说，当结合感兴趣的抗原的ABD与HER2多肽结合时，示例性VH和VL对可选自抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗或马吉妥昔单抗(margetuximab)：
曲妥珠单抗重链可变区
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTI SADTSKNTAYLQMNSLRAED TAVYYCSRWG GDGFYAMDYW GQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:132)。
曲妥珠单抗轻链可变区
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKPGKAPKLLIYS ASFLYSGVPSRFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQHYTTPPTFGQ GTKVEIK
(SEQ ID NO:133)。
马吉妥昔单抗VH：
QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIYPTNGYTRYDPKFQDKATI TADTSSNTAY LQVSRLTSEDTAVYYCSRWG GDGFYAMDYW GQGASVTVSS(SEQ ID NO:134)。
马吉妥昔单抗VL：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKPGHSPKLLIYS
ASFRYTGVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQHYTTPPTFGG
GTKVEIK(SEQ ID NO:135)。
在另一个示例中，当结合感兴趣的抗原的ABD与CD19多肽结合时，示例性VH和VL对可选自来自博纳吐单抗(blinatumomab)的VH和VL对。
博纳吐单抗VH：
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:136)。
博纳吐单抗VL：
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:137)。
在另一个示例中，当结合感兴趣的抗原的ABD与CD20多肽结合时，示例性VH和VL对可选自利妥昔单抗(rituximab)和奥妥珠单抗的VH和VL对：
利妥昔单抗VH：
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA(SEQ ID NO:138)。
利妥昔单抗VL：
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:139)。
奥妥珠单抗VH：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:140)。
奥妥珠单抗VL：
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:141)。
在另一个示例中，当结合感兴趣的抗原的ABD与EGFR多肽结合时，示例性VH和VL对可选自来自西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、迪妥昔珠单抗(depatuxizumab)和耐昔妥珠单抗(necitumumab)的结合EGFR的VH和VL对：
西妥昔单抗VH：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:142)。
西妥昔单抗VL：
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:143)。
帕尼单抗VH：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:144)。
帕尼单抗VL：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:145)。
尼妥珠单抗VH：
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:146)。
尼妥珠单抗VL：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQI(SEQ ID NO:147)。
耐昔妥珠单抗VH：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:148)。
耐昔妥珠单抗VL：
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQYGSTPLTFGGGTKAEIK(SEQ ID NO:149)。
迪妥昔珠单抗VH：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSISSDFAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGNTRYQPSLKSRITISRDTSKNQFFLKLNSVTAADTATYYCVTAGRGFPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:150)。
迪妥昔珠单抗VL：
DIQMTQSPSSMSVSVGDRVTITCHSSQDINSNIGWLQQKPGKSFKGLIYHGTNLDDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCVQYAQFPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:151)。
在另一个示例中，当结合感兴趣的抗原的ABD与BCMA多肽结合时，示例性VH和VL对可选自来自贝兰妥单抗(belantamab)、特立妥单抗(teclistamab)、埃纳妥单抗(elranatamab)或帕武鲁他单抗(pavurutamab)的结合BCMA的VH和VL对：
贝兰妥单抗VH：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGAIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:152)。
贝兰妥单抗VL：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPS
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:153)。
帕武鲁他单抗VH：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNHIIHWVRQAPGQCLEWMGYINPYPGYHAYNEKFQGRATMTSDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYYRDTDVLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:154)。
帕武鲁他单抗VL：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEPEDIATYYCQQGNTLPWTFGCGTKVEIK(SEQ ID NO:155)。
在另一个示例中，当结合感兴趣的抗原的ABD与PD-L1多肽结合时，示例性VH和VL对可选自来自以下项的结合PD-L1的VH和VL对：示于美国专利号7,943,743中的抗体3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4，其公开内容以引用方式并入本文；或任何抗体MPDL3280A(阿特朱单抗(atezolizumab)、TecentriqTM，参见例如美国专利号8,217,149，来自Roche/Genentech的抗-PD-L1)、MDX-1105(来自Bristol-Myers Squibb的抗-PD-L1)、MSB0010718C(阿维鲁单抗(avelumab)；来自Pfizer的抗-PD-L1)和MEDI4736(度伐鲁单抗(Durvalumab)；来自AstraZeneca的抗-PD-L1)。
在另一个示例中，当结合感兴趣的抗原的ABD与B7-H3多肽结合时，示例性VH和VL对可选自来自以下项的结合B7-H3的VH和VL对：依布妥组单抗(enoblituzumab)、示于PCT公开号WO2018/129090中的TRL4542、示于PCT公开号WO2018/209346中的8H9，或PCT公开号WO2016/106004、WO2017/180813、WO2019/024911、WO2019/225787、WO2020/063673、WO2020/094120、WO2020/102779、WO2020/140094和WO2020/151384中的任何抗体。可使用的单域B7H3 ABD的示例包括描述于PCT公开WO2020/041626中的AffibodyTM格式和PCT公开号WO2020/076970和WO2021/247794的单域抗体(sdAb)。上述VH、VL和CDR序列的公开内容以引用方式并入本文。
在另一个示例中，当结合感兴趣的抗原的ABD与B7-H6多肽结合时，示例性VH和VL对可选自来自以下项的结合B7-H6的VH和VL对：示于美国专利号US 11,034,766、US 8,822,652、US 9,676,855、US 11,034,766、US 11,034,767或PCT公开号WO2013/037727或WO2021/064137。
在另一个示例中，当结合感兴趣的抗原的ABD与B7-H4多肽结合时，示例性VH和VL对可选自艾司沃利单抗(alsevalimab)的结合B7-H4的VH和VL对或者来自以下项的VH和VL对：示于美国专利号US 10,626,176、US 9,676,854、US 9,574,000、US 10,150,813、US 10,814,011或PCT公开号WO2009/073533、WO2019/165077、WO2019/169212、WO2019/147670、WO2021/155307、WO2022/039490、WO2019/154315或WO2021/185934。
在一个实施方案中，结合感兴趣的抗原的ABD与以下项结合：癌抗原、病毒抗原、微生物抗原或存在于感染细胞(例如病毒感染)上或促炎免疫细胞上的抗原。在一个实施方案中，所述抗原是在肿瘤细胞和感染细胞或促炎细胞上选择性表达或过表达的多肽。在一个实施方案中，所述抗原是当受抑制时会降低肿瘤细胞、感染细胞或促炎细胞的增殖和/或存活的多肽。
在被包含结合多特异性NKp46的蛋白质中之前，可测试掺入到多肽中的ABD的任何期望活性，例如可以合适的格式(例如作为常规IgG抗体、fab、Fab'2或scFv)测试ABD与其结合配偶体的结合(例如结合亲和力)。
源自抗体的ABD通常包含至少足以赋予结合活性的高变区。应当理解，ABD可根据需要包含其他氨基酸或功能结构域，包括但不限于接头元件(例如接头肽、CH1、CK或Cλ结构域、铰链或其片段)。在一个示例中，ABD包含scFv、VH结构域和VL结构域，或单域抗体(纳米抗体或dAb)诸如V-NAR结构域或VHH结构域。ABD可由彼此缔合以形成ABD的VH和VL结构域组成。
在一个实施方案中，形成NKp46和感兴趣的抗原的ABD的VH和VL对中的一者或两者位于串联可变区内(由柔性多肽接头分开的VH和VL结构域)，诸如scFv。
在一个实施方案中，NKp46和感兴趣的抗原的一个或两个ABD可具有常规或非常规的Fab结构。Fab结构可被表征为与CH1结构域连接的VH或VL可变结构域，以及与互补CK(或Cλ)恒定结构域连接的互补可变结构域(分别为VL或VH)，其中CH1和CK(或Cλ)恒定结构域缔合(二聚化)。例如，Fab可由第一多肽链上的VH-CH1单元(VH与CH1融合)形成，该VH-CH1单元与第二链上的VL-CK单元(VL与CK融合)二聚化。另选地，Fab可由第一多肽链上的VH-CK单元(VH与CK融合)形成，该VH-CK单元与第二链上的VL-CH1单元(VL与CH1融合)二聚化。
在一些实施方案中，NKp46和感兴趣的抗原的ABD之一包含Fab结构，其中可变结构域与CH1结构域连接，并且互补可变结构域与互补CK(或Cλ)恒定结构域连接，其中CH1和CK(或Cλ)恒定结构域缔合形成异源二聚体蛋白质，并且另一ABD包含scFv或单结合结构域(例如VhH结构域、AffibodyTM、DARPin)或由其组成。scFv或单结合结构域可任选地与CK或Cλ结构域或铰链结构域融合。
然后可将CH1和/或CK结构域与CH2结构域连接，任选地在每种情况下经由铰链区(或合适的结构域接头)。然后将CH2结构域与CH3结构域连接。因此CH2-CH3结构域可任选地体现为全长Fc结构域(任选的全长Fc结构域，除了缺乏C末端赖氨酸的CH3结构域)。
当存在时，CD16 ABD可容易地体现为能够与人CD16A和任选的其他Fcγ受体(例如CD16B、CD32A、CD32B和/或CD64)结合的Fc结构域二聚体。在一个实施方案中，Fc部分可通过在宿主细胞中产生多肽或通过产生N297连接的糖基化的方法(例如哺乳动物细胞)来获得。在一个实施方案中，Fc部分包含人γ同种型恒定区，该恒定区包含一个或多个氨基酸修饰(例如在CH2结构域中)，这些修饰增加与CD16或CD16A的结合。
另选地，当存在时，CD16A ABD可包含SEQ ID NO:504和505的结合CD16A的VH和VL对的氨基酸序列，或SEQ ID NO:506和507的结合CD16A的VH和VL对的氨基酸序列，或者可包含其重链和轻链Kabat CDR。此外，另选地，当存在时，CD16A ABD可体现为结合CD16A的单个VH结构域(参见例如，Genbank登录号ABQ52435；Behar等人(2008年)，Protein Eng DesSel.，第1卷：第1-10页)，该单个VH结构域具有SEQ ID NO:508所示的氨基酸序列。
细胞因子受体抗原结合结构域可容易地体现为细胞因子(例如1型细胞因子(诸如IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27或IL-12细胞因子、IL-18细胞因子)或1型干扰素(诸如IFN-α或IFN-β))。示例性细胞因子受体ABD和经修饰的细胞因子在本文中进一步描述。
一旦鉴定了具有期望特异性和/或活性的合适的抗原结合结构域，则编码每种或ABD的核酸可与编码任何元件(诸如CH1、CK、CH2和CH3结构域或其部分)、突变的IL2多肽和任何其他任选元件的DNA(例如编码铰链衍生的或接头元件的DNA)一起以合适的排列单独放置在合适的表达载体或载体组中，以用于转染到合适的宿主中。ABD将根据待产生的多肽类型排列在表达载体中，或排列在单独的载体中，以便产生具有彼此可操作地连接的期望结构域的Fc多肽。然后将该宿主用于多特异性多肽的重组生产。
例如，多肽融合产物可由载体产生，其中一个ABD或其部分(例如VH、VL或VH/VL对)可操作地连接(例如直接地或经由CH1、Cκ或Cλ恒定区和/或铰链区)至CH2结构域的N末端，并且CH2结构域在其C末端可操作地连接至CH3结构域的N末端。另一个ABD或其部分可位于第二多肽链上，其与包含第一ABD的多肽形成二聚体，例如异源二聚体。
然后可在合适的宿主细胞中或通过任何合适的合成方法产生多特异性多肽。选择用于表达多特异性多肽的宿主细胞是最终组成的重要贡献者，包括但不限于在免疫球蛋白CH2结构域中修饰蛋白质的寡糖部分组成的变化。因此，本发明的一个方面涉及选择合适的宿主细胞以供使用和/或开发表达期望的治疗性蛋白质的生产细胞，使得多特异性多肽保留FcRn和CD16结合。宿主细胞可以是哺乳动物来源的，或者可选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞，或它们的任何衍生的、永生化的或转化的细胞。宿主细胞可以是能够产生N连接的糖基化多肽的任何合适的物种或生物体，例如能够产生人或啮齿类动物IgG型N-连接糖基化的哺乳动物宿主细胞。
蛋白质格式
多聚体、多特异性蛋白质诸如异源二聚体、异源三聚体和异源四聚体可根据多种格式产生。不同的结构域结合到不同的多肽链上以形成多聚体蛋白质。因此，可在Fc结构域二聚体周围构建宽范围的蛋白质格式，该Fc结构域二聚体能够与人FcRn多肽(新生儿Fc受体)结合，另外地结合或不结合CD16或CD16A和任选的其他Fcγ受体(例如CD16B、CD32A、CD32B和/或CD64)，这取决于是否期望存在结合CD16的ABD。如本文所示，通过使用与活化的人CD16受体(CD16A)结合具有充分结合的Fc部分，可获得NK细胞细胞毒性的最大增强；此类CD16结合可通过使用合适的CH2和/或CH3结构域获得，如本文进一步所述。在一个实施方案中，Fc部分源自人IgG1同种型恒定区。使用经修饰的CH3结构域也有助于使用宽范围的异源多聚体蛋白质结构的可能性。因此，蛋白质包含第一多肽链和第二多肽链，该第一多肽链和第二多肽链各自包含与人Fc结构域单体(即CH2-CH3单元)融合的可变结构域，任选地Fc结构域单体包含CH3结构域，该CH3结构域能够经历优先的CH3-CH3异源二聚化，其中第一链和第二链经由CH3-CH3二聚化结合，并且该蛋白质因此包含Fc结构域二聚体。每条链的可变结构域可以是相同或不同抗原结合结构域的一部分。
因此，可使用排列为scFv或Fab结构的VH和VL对与CH1结构域、CL结构域、Fc结构域和细胞因子以及结构域接头一起方便地构建多特异性蛋白质。优选地，蛋白质将使用最少的非天然序列，例如使用最少的非Ig接头，任选地不超过5个、4个、3个、2个或1个不是抗体衍生序列的结构域接头，任选地其中结构域接头长度不超过15个、10个或5个氨基酸残基。在一个实施方案中，CD16 ABD是Fc结构域二聚体。Fc结构域dimerFc结构域二聚体。
在一些实施方案中，多特异性蛋白质(例如二聚体、三聚体、四聚体)可包含以下项中的任一种的结构域排列：其中结构域可置于2条、3条或4条多肽链中的任一条多肽链上；其中NKp46 ABD插置在Fc结构域和细胞因子受体ABD之间(例如该蛋白质在C末端处具有末端或远端细胞因子受体ABD并且在拓扑N末端处具有末端或远端感兴趣的抗原(抗原)ABD)；其中NKp46 ABD经由铰链多肽或柔性接头与FC结构域二聚体的多肽链中的一条多肽链连接；并且其中结合细胞因子受体的ABD经由柔性接头(例如包含G和S残基的接头)与NKp46ABD连接(例如当NKp46 ABD包含在两条链上时连接到其多肽链中的一条多肽链)，其中“n”为1或2：
(抗-抗原ABD)n-(Fc结构域二聚体)-(NKp46 ABD)-(细胞因子受体ABD)。
细胞因子受体ABD可以是IL2、IL15、IL18、IL21或IFN-α多肽。可将Fc结构域指定为Fc结构域二聚体(例如，其结合人FcRn和/或Fcγ受体)。在一个实施方案中，感兴趣的抗原(例如癌抗原)ABD和NKp46ABD中的一者或两者由串联可变区内存在的两个可变区形成，其中缔合形成特定ABD的可变区可位于相同多肽链上或位于不同多肽链上。在另一个实施方案中，感兴趣的抗原ABD和NKp46 ABD中的一者或两者包含串联可变区，并且另一者包含Fab结构。在另一个实施方案中，感兴趣的抗原和NKp46 ABD中的两者包含Fab结构。在另一个实施方案中，感兴趣的抗原和NKp46 ABD中的一者包含Fab结构，并且另一者包含scFv结构。
异源二聚体和异源三聚体
本公开提供了制备多聚体多特异性蛋白质的有利方法，该多聚体多特异性蛋白质(以单价或以二价)结合感兴趣的抗原，并且单价地结合NKp46、CD16A和细胞因子受体中的每一者。该方法容易允许NKp46 ABD定位在Fc结构域和细胞因子多肽之间的结构域构型。这些构型可通过组装本文所述的不同多肽链来实现，这些多肽链各自包含至少一个与人CH1或Cκ恒定结构域(V-(CH1/Cκ)单元)融合的重链或轻链可变结构域，其中蛋白质链经历CH1-Cκ二聚化，并且通过非共价相互作用以及任选地进一步在相应CH1和Cκ结构域之间形成的二硫键而彼此结合。
示例性的异源二聚体或异源三聚体多肽具有结合NKp46的ABD、结合感兴趣的抗原的ABD、结合细胞因子受体的ABD(例如IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽)，并且Fc结构域二聚体可任选地产生为一条或多条链，其中每条链与中心链缔合，例如通过CH1-Cκ异源二聚化以及/或者通过CH3-CH3二聚化。可产生不同的变体，如本文实施例中所示。
在一个实施方案中，分离的或纯化的异源二聚体或异源三聚体蛋白质包含至少两条或三条多肽链，其中每条链包含V-(CH1/Cκ)单元，由此这些链通过非共价相互作用彼此结合，并且任选地经由CH1和Cκ结构域之间的二硫键进一步结合，并且仍然进一步任选地，由此这些链通过相应可变区、CH1和Cκ结构域，以及Fc部分的CH3结构域之间的非共价相互作用结合。
在一个示例中，蛋白质包含第一多肽链和第二多肽链，该第一多肽链和第二多肽链各自包含与CH1或Cκ结构域(V-(CH1/Cκ)单元)融合的可变结构域，继而在其C末端处与人Fc结构域单体融合，该人Fc结构域单体包含能够经历CH3-CH3二聚化的CH2结构域和CH3结构域的，其中第一链和第二链经由CH1-Cκ和CH3-CH3二聚化缔合，使得蛋白质包含Fc结构域二聚体。每条链的可变结构域可以是相同或不同抗原结合结构域的一部分。
可选择并构造可变区和恒定区，使得每条链将优先与其期望的互补配偶体链缔合。可使用常规生产方法使用重组宿主细胞可靠地且高生产率地生产所得多聚体蛋白质。在单元中选择哪个VH或VL与CH1和Cκ缔合，取决于待配对的单元之间的亲和力，以便驱动期望多聚体的形成。所得多聚体将通过以下方式结合：通过互补VH和VL结构域之间的非共价相互作用，通过互补CH1和Cκ结构域之间的非共价相互作用，以及任选地通过互补CH1和Cκ结构域之间的其他二硫键(以及任选地互补铰链结构域之间的其他二硫键)。VH-VL缔合强于VH-VH或VL-VL，因此，如本文所示，可将VH或VL紧邻CH1或Cκ放置，并且所得V-C单元将优选与其V-C对应物配对。例如VH-Cκ将优于VH-CH1与VL-CH1配对。另外，优选的链配对通过包含Fc结构域而得到进一步改善，因为两个含Fc单体的链通过Fc结构域单体的CH3结构域之间的非共价相互作用结合。不同的V-C组合，任选地进一步与Fc配对组合，从而提供了制备包含细胞因子(例如IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽)的异源多聚体蛋白质的工具，这些细胞因子在结构域排列中以“Cyt”表示。
在一个示例中，多特异性蛋白质是包含第一多肽链和第二多肽链的异源二聚体，该第一多肽链和第二多肽链各自包含与CH1或Cκ结构域(V-(CH1/Cκ)单元)融合的可变结构域，继而在其C末端处与人Fc结构域单体融合，其中第一链的V-(CH1/Cκ)单元与第二链的V-(CH1/Cκ)经历CH1-Cκ二聚化从而形成第一抗原结合结构域(ABD1)和Fc结构域二聚体，其中这些多肽链中的一条多肽链还包含形成第二抗原结合结构域(ABD2)的抗原结合结构域，并且其中Fc结构域二聚体与人CD16多肽结合，其中ABD1和ABD2中的一者结合NKp46，并且另一者结合感兴趣的抗原(例如肿瘤抗原)。
在一个示例中，蛋白质具有以下结构域排列：
其中Va-1、Vb-1、Va-2和Vb-2各自是VH结构域或VL结构域，并且其中Va-1和Vb-1中的一者是VH并且另一者是VL，使得Va-1和Vb-1形成第一抗原结合结构域(ABD)；其中Va-2和Vb-2中的一者是VH并且另一者是VL，使得Va-2和Vb-2形成第二抗原结合结构域，其中这些ABD中的一者结合NKp46并且另一者结合感兴趣的抗原。
在其他示例中，蛋白质是异源三聚体并且包含三条多肽链，每条多肽链包含与CH1或Cκ结构域(V-(CH1/Cκ)单元)融合的可变结构域，其中第一(中心)链包含两个V-(CH1/Cκ)单元和插置在这些单元之间的人Fc结构域，第二链包含一个V-(CH1/Cκ)单元和人Fc结构域单体，并且第三链包含一个V-(CH1/Cκ)单元和细胞因子多肽(Cyt)，其中该中心链的这些V-(CH1/Cκ)单元中的一者与第二链的V-(CH1/Cκ)单元经历CH1-Cκ二聚化从而形成第一抗原结合结构域(ABD1)和Fc结构域二聚体，并且其中该中心链的这些V-(CH1/Cκ)单元中的另一者与第三链的V-(CH1/Cκ)单元经历CH1-Cκ二聚化从而形成第二抗原结合结构域(ABD2)，并且其中Fc结构域与人CD16多肽结合。在一个实施方案中，Fc结构域包含残基N297处的N-连接糖基化(Kabat EU编号)。
在一个示例中，蛋白质具有以下结构域排列：
/>
在另一个示例中，蛋白质具有一下结构域排列：
在上述异源三聚体蛋白质的一个具体示例中，插置在Fc结构域和细胞因子之间的Fab结构是结合NKp46的ABD(即，结合NKp46的ABD插置在Fc结构域和C末端细胞因子之间)。第一多肽中的Fc结构域在其C末端处经由接头与VH结构域的N末端连接(例如融合)。第三多肽中的恒定结构域(相应结构域排列中的CH1或CK结构域)在其C末端处经由接头与细胞因子多肽的N末端连接(例如融合)。作为Fc结构域的N末端的每个恒定结构域(相应结构域排列中的CH1或CK结构域)在恒定结构域的C末端处经由铰链区与Fc结构域的N末端融合。
任选地，本发明的任何多特异性蛋白质可包含CH1、CL或CH3结构域，这些结构域包含促进异源二聚化的氨基酸修饰(例如取代)。例如，异源二聚化修饰通常涉及空间排斥、电荷转向相互作用或链间二硫键形成，其中抗体Fc区的CH3结构域界面发生突变以产生跨Fc二聚体界面的改变的电荷极性，使得静电匹配的Fc链的共表达支持有利的吸引相互作用，从而促进期望的Fc异源二聚体形成，而不利的排斥电荷相互作用抑制不需要的Fc同源二聚体形成。
在一个示例中，第一(中心)多肽链将提供一个可变结构域和Fc结构域，该可变结构域将与第二多肽链上的互补可变结构域一起形成第一抗原结合结构域(例如结合感兴趣的抗原的ABD)。第一(中心)多肽链还将提供第二可变结构域(例如，置于所插置的Fc结构域的与第一可变结构域相对的末端，在Fc结构域的C末端处)，该第二可变结构域将与互补可变结构域配对以形成第二抗原结合结构域(例如，结合NKp46的ABD)；与第二可变结构域互补的可变结构域可被置于中心多肽上(例如在串联可变结构域构建体诸如scFv中与第二可变结构域相邻)，或可被置于单独的多肽链上，特别是第三多肽链上。第二多肽链(和第三多肽链，如果存在)将通过CH1-Cκ异源二聚化与中心多肽链缔合，形成非共价相互作用和任选的在互补CH1和Cκ结构域之间的其他链间二硫键(和任选的在铰链区之间的链间二硫键)，其中只要选择CH/CK和VH/Vκ结构域，就可形成初级多聚体多肽，以产生优选的二聚化构型，该构型优先产生期望的VH-VL配对。其余的不需要的配对可在生产期间保持最少，以及/或者在纯化步骤期间被除去。在三聚体中，或者当构建多肽用于制备三聚体时，通常存在一条包含非天然存在的VH-CK或VK-CH1结构域排列的多肽链。然后可将细胞因子(例如，IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β)置于多肽链之一的C末端。细胞因子可经由结构域接头融合，并且尽管在本文的某些结构域排列中未示出，但可将任何结构域排列指定为包含单独两个结构域的结构域接头。例如，在这些结构中，可将细胞因子置于第一(中心)多肽链的C末端或第三多肽链的C末端(当此类第三链存在时)。
用于异源二聚体蛋白质(其中NKp46 ABD插置在Fc结构域和细胞因子(Cyt)之间并且其中细胞因子部分置于不同多肽链(例如第二多肽链)上)的中心多肽链的结构域排列(从左至右为N末端至C末端)的示例包括以下项中的任一种，其中每个V是可变结构域：
Va-1–(CH1或Cκ)–Fc结构域–Va-2–Vb-2(第一/中心链)
或
Va-1–Vb-1–Fc结构域–Va-2–(CH1或Cκ) (第一/中心链)
用于异源二聚体蛋白质(其中细胞因子部分置于中心链上)的中心多肽链的结构域排列的其他示例包括：
Va-1–(CH1或Cκ)–Fc结构域–Va-2–Vb-2–Cyt (第一/中心链)
或
Va-1–Vb-1–Fc结构域–Va-2–(CH1或Cκ)–Cyt (第一/中心链)
用于异源三聚体蛋白质(其中NKp46 ABD插置在Fc结构域和细胞因子(Cyt)之间并且其中细胞因子部分置于不同多肽链(例如第二多肽链或第三多肽链)上)的中心多肽链的结构域排列(从左至右为N末端至C末端)的示例可包括：
Va-1–(CH1或Cκ)a–Fc结构域–Va-2–(CH1或Cκ) (第一/中心链)
用于异源三聚体蛋白质(其中细胞因子部分置于中心链上)的中心多肽链的结构域排列的其他示例包括：
Va-1–(CH1或Cκ)a–Fc结构域–Va-2–(CH1或Cκ)–Cyt (第一/中心链)
在上述示例中，当V结构域在链上串联地彼此紧邻排列时，一个V是轻链并且另一个V是重链可变结构域，并且两个V结构域由柔性多肽接头分开并且一起形成scFv。
中心多肽链的其他示例包括：
Va-1–(CH1或CK)a–Fc结构域–V2–Cyt
或
V2–Fc结构域–Va-1–(CH1或CK)–Cyt
其中V2是单域ABD(例如dAb、VHH、DARPin)。
当中心链的Fc结构域与第二多肽链的Fc结构域形成二聚体Fc时，该中心链的Fc结构域可以是足以赋予期望功能性(例如结合FcRn、结合CD16、CH3-CH3二聚化)的完整Fc结构域或其部分。
然后可构建第二多肽链，该第二多肽链将包含免疫球蛋白可变结构域和CH1或Cκ恒定区，例如选择(CH1或Cκ)b单元以允许CH1-Cκ与中心多肽链进行异源二聚化；将选择免疫球蛋白可变结构域，以便与相邻CH1或Cκ结构域的中心链的可变结构域互补，由此互补可变结构域形成第一感兴趣的抗原的抗原结合结构域。
例如，用于蛋白质(其中NKp46 ABD插置在Fc和细胞因子之间)的第二多肽链可包含以下结构域排列：
Vb-1–(CH1或Cκ)b–Fc结构域
使得(CH1或Cκ)b与中心链上的(CH1或Cκ)a进行二聚化，并且Vb-1与中心链的Va-1一起形成抗原结合结构域。如果中心链的Va-1是轻链可变结构域，则Vb-1将是重链可变结构域；并且如果中心链的Va-1是重链可变结构域，则Vb-1将是轻链可变结构域。
在异源二聚体中，然后可由Va-2和Vb-2形成第二感兴趣的抗原的抗原结合结构域，该Va-2和Vb-2在形成ABD(例如形成scFv单元)的中心链上被构造成串联可变结构域。
所得异源二聚体可例如具有以下构型(参见如格式T13和T13A所示的此类蛋白质的其他示例，示于图2C、图2D和图2G和图2H中)：
其中第一多肽链的Va-1和第二多肽链的Vb-1中的一者是轻链可变结构域并且另一者是重链可变结构域，并且其中Va-2和Vb-2中的一者是轻链可变结构域并且另一者是重链可变结构域。可将Va-2和Vb-2指定为由多肽接头分开(Va-2和Vb-2形成scFv)。Va-2和Vb-2形成结合NKp46的ABD，并且Va-1和Vb-1形成结合感兴趣的抗原(例如癌抗原)的ABD。
异源多聚体蛋白质(任选地其中一个或两个铰链结构域被柔性接头多肽取代，其中NKp46 ABD是scFv或单域ABD(例如dAb、VHH、DARPin)并且Fc结构域与NKp46 ABD、接头多肽融合，并且其中NKp46 ABD通过结构域接头(例如柔性多肽接头)与细胞因子多肽融合)的结构域排列的示例包括以下项：
或
或
或
异源三聚体蛋白质(其中NKp46 ABD插置在Fc结构域和细胞因子多肽之间)可例如通过使用中心(第一)多肽链形成，该中心(第一)多肽链包含：与第一CH1或Cκ恒定区融合的第一可变结构域(V)、与第二CH1或Cκ恒定区融合的第二可变结构域(V)，以及插置在第一和第二可变结构域之间的Fc结构域或其部分(即，Fc结构域插置在第一和第二(V-(CH1/Cκ)单元之间。例如，用于根据本发明的异源三聚体蛋白质的中心多肽链可具有如下的结构域排列(N末端至C末端)：
Va-1–(CH1或Cκ)a–Fc结构域–Va-2–(CH1或Cκ)b。
第一多肽链可任选地进一步具有位于其C末端处的Cyt。
然后第二多肽链可包含结构域排列(从左至右为N末端至C末端)：
Vb-1–(CH1或Cκ)c–Fc结构域
使得(CH1或Cκ)c与中心链上的(CH1或Cκ)a进行二聚化，并且Va-1和Vb-1形成结合感兴趣的抗原的抗原结合结构域。
然后第三多肽链可包含以下结构域排列(从左至右为N末端至C末端)：
Vb-2–(CH1或Cκ)d–Cyt。
使得(CH1或Cκ)d与中心链上的(CH1或Cκ)b单元进行二聚化，并且Va-2和Vb-2形成结合NKp46的结构域。
任选地，当Cyt置于第一多肽链的C末端时，则第三多肽链可包含以下结构域排列(从左至右为N末端至C末端)：
Vb-2–(CH1或Cκ)d
所得异源三聚体(其中Cyt置于第三多肽链上)的结构域构型的示例(在图2中也以格式T5、T6示出)如下所示：
所得异源三聚体(其中Cyt置于第一多肽链上)的结构域构型如下所示：
因此，在三聚体多肽(其中NKp46 ABD插置在Fc结构域和细胞因子多肽之间)中，第一多肽可具有两个可变结构域，每个可变结构域与单独多肽链上的可变结构域(即第二链和第三链的可变结构域)形成抗原结合结构域，第二多肽链具有一个可变结构域，并且第三多肽具有一个可变结构域，并且这些多肽链中的一条多肽链包含与其C末端融合的细胞因子多肽。
三聚体多肽可任选地包含三条多肽链，这些多肽链的被表征为如下：
(a)第一多肽链，其从N末端至C末端包含：与第一CH1或Cκ恒定区融合的第一可变结构域(V)、铰链结构域或其部分、Fc结构域或其部分，以及与第二CH1或Cκ恒定区融合的第二可变结构域(V)；
(b)第二多肽链，其从N末端至C末端包含：与CH1或Cκ恒定区融合的可变结构域、铰链结构域或其部分以及Fc结构域，该CH1或Cκ恒定区被选择为与第一多肽链的第一CH1或Cκ恒定区互补，使得第一多肽和第二多肽形成CH1-Cκ异源二聚体；和
(c)第三多肽链，其从N末端至C末端包含：与CH1或Cκ恒定区和细胞因子多肽融合的可变结构域(例如经由柔性多肽接头与该恒定区融合)，其中该可变结构域和该恒定区被选择为与第一多肽链的第二可变结构域和第二CH1或Cκ恒定区互补，使得第一多肽和第三多肽形成通过非共价相互作用结合的CH1-Cκ异源二聚体，并且任选的其他二硫键在第三多肽的CH1或Cκ恒定区和第一多肽的第二CH1或Cκ恒定区之间形成但不在第三多肽的CH1或Cκ恒定区和第一多肽的第一CH1或Cκ恒定区之间形成其中第一多肽、第二多肽和第三多肽形成异源三聚体，并且其中第一多肽链的第一可变结构域和第二多肽链的可变结构域形成对感兴趣的抗原(例如在靶细胞、癌抗原上)具有特异性的抗原结合结构域，并且第一多肽链的第二可变结构域和第三多肽链上的可变结构域形成结合NKp46的抗原结合结构域。
此类三聚体双特异性多肽的潜在结构域排列的示例包括但不限于下表2中所示的那些：
表2
在另一个方面，三聚体多肽可任选地被表征为包含以下三条多肽链：
(a)第一多肽链，其从N末端至C末端包含：与第一CH1或Cκ恒定区融合的第一可变结构域(V)、铰链结构域或其部分、Fc结构域或其部分，以及与第二CH1或Cκ恒定区和细胞因子多肽融合的第二可变结构域(V)(例如，经由柔性多肽接头与第二CH1或Cκ恒定区融合)；
(b)第二多肽链，其从N末端至C末端包含：与CH1或Cκ恒定区融合的可变结构域、铰链结构域或其部分以及Fc结构域，该CH1或Cκ恒定区被选择为与第一多肽链的第一CH1或Cκ恒定区互补，使得第一多肽和第二多肽形成CH1-Cκ异源二聚体；和
(c)第三多肽链，其从N末端至C末端包含：与CH1或Cκ恒定区融合的可变结构域，其中该可变结构域和该恒定区被选择为与第一多肽链的第二可变结构域和第二CH1或Cκ恒定区互补，使得第一多肽和第三多肽形成通过非共价相互作用结合的CH1-Cκ异源二聚体，并且任选的其他二硫键在第三多肽的CH1或Cκ恒定区和第一多肽的第二CH1或Cκ恒定区之间形成但不在第三多肽的CH1或Cκ恒定区和第一多肽的第一CH1或Cκ恒定区之间形成其中第一多肽、第二多肽和第三多肽形成CH1-Cκ异源三聚体，并且其中第一多肽链的第一可变结构域和第二多肽链的可变结构域形成对感兴趣的抗原(例如在靶细胞、癌抗原上)具有特异性的抗原结合结构域，并且第一多肽链的第二可变结构域和第三多肽链上的可变结构域形成结合NKp46的抗原结合结构域。
此类三聚体双特异性多肽的潜在结构域排列的示例包括但不限于下表3中所示的那些：
表3
使用类似的架构，还可产生以二价结合感兴趣的抗原、以单价结合NKp46并且以单价结合细胞因子受体的多特异性蛋白质，即，该多特异性蛋白质具有2:1:1构型。实施例示于图2中。
在具有各自结合感兴趣的抗原的两个ABD的多特异性蛋白质的一个示例中，异源二聚体蛋白质包含以下结构域排列：
在这些结构中，第一链和第二链的Fc结构域经由CH3-CH3二聚化缔合，并且第二链上的(CH1或Cκ)b和第一链上的(CH1或Cκ)a经历CH1-Cκ二聚化，其中结合NKp46的ABD1以及ABD2和ABD3各自是独立的抗原结合结构域，这些抗原结合结构域可结合感兴趣的抗原(例如癌抗原)而不与不同多肽链上的互补结构域缔合，其中每个(CH1或Cκ)b和(CH1或Cκ)a经由免疫球蛋白铰链氨基酸序列与Fc结构域融合，并且其中Cyt是细胞因子多肽(例如，经由柔性多肽接头与ABD1融合)。异源二聚体蛋白质的另一个代表是：
其中每个V结构域对Va1–Vb1、Va2–Vb2和Va3–Vb3包含经由结构域接头融合的VH和VL，使得该对形成scFv抗原结合结构域。
在具有各自结合感兴趣的抗原的两个ABD的多特异性蛋白质的示例中，异源三聚体蛋白质包含以下结构域排列：
或
在这些结构中，第一链和第三链的Fc结构域经由CH3-CH3二聚化缔合，第三链上的(CH1或Cκ)c和中心链上的(CH1或Cκ)a经历CH1-Cκ二聚化，并且第一链上的(CH1或Cκ)b和第二链上的(CH1或Cκ)d经历二聚化CH1-Cκ。Va1和Vb1形成结合NKp46的第一抗原结合结构域。ABD2和ABD3各自是独立的抗原结合结构域，这些抗原结合结构域可结合感兴趣的抗原(例如癌抗原)，例如不需要与不同多肽链上的互补可变结构域缔合。ABD2和ABD3可例如各自包含单域ABD或VH和VK对(以任何期望的顺序)，其置于单链上并且由柔性肽接头(例如作为scFv)分开，使得异源三聚体蛋白质可包含：
所得异源三聚体的可能构型的示例是从N末端至C末端具有以下结构域排列的结构：
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
在具有各自结合感兴趣的抗原的两个ABD的多特异性蛋白质的另一个示例中，可构建异源四聚体蛋白质，其中NKp46 ABD插置在Fc结构域和细胞因子之间，例如具有以下结构域排列的分子，其中结构域：
其中第一链和第二链通过CH3-CH3二聚化缔合，并且第一链和第三链通过CH1或Cκ二聚化缔合，其中第一链和第三链的结构域被选择为互补以允许第一链和第三链通过CH1-Cκ二聚化缔合，其中第二链和第四链的结构域被选择为互补以允许第二链和第四链通过CH1-Cκ二聚化缔合，并且其中每个V结构域对Va1和Vb1、Va2和Vb2以及Va3和Vb3包含VH和VL，使得该对形成ABD，其中Va-1和Vb-1由结构域接头分开以形成结合NKp46的scFv，并且其中Va1和Vb1对以及Va2和Vb2对各自形成结合感兴趣的抗原的ABD。
此类构型的示例包括示于下表4中的那些：
表4
结构域排列也可分别表示如下，其中每个L是结构域接头：
当NKp46 ABD和细胞因子受体ABD相对于Fc结构域的N末端和C末端以“顺式”定位时(例如，两者都置于二聚体Fc的C末端侧上)，它们将优选地定位以增强以膜平面结合构型结合NKp46、CD16A和细胞因子受体的能力。在一个实施方案中，顺式构型通过以下方式获得：通过将NKp46 ABD(例如作为scFv)定位在包含Fc结构域的多肽链上，其中NKp46 ABD定位在Fc结构域的C末端(顺式)，并且将细胞因子受体ABD(例如细胞因子)拓扑地定位在NKp46 ABD的C末端。在一个实施方案中，顺式构型(相对于Fc结构域的末端)通过以下方式获得：通过将结合NKp46的Fab的一部分定位在包含Fc结构域的第一多肽链上，并且将细胞因子受体ABD(例如细胞因子)定位在第一链上或定位在第二多肽链上，该第二多肽链与第一链缔合并且包含结合NKp46的Fab的互补部分，任选地其中该第二多肽链缺乏Fc结构域。在示例性顺式构型中，可将NKp46ABD的第一部分定位在包含Fc结构域的第一多肽链上，并且将细胞因子受体ABD(例如细胞因子)定位在缺乏Fc结构域但具有NKp46 ABD的互补第二部分的不同第二多肽链上，其中第二多肽链和第二部分与第一多肽链和第一部分缔合以形成NKp46 ABD(例如结合NKp46的Fab)。ABD或Fab的一部分可以是例如其VH或VL结构域、VH-CH1、VK-CH1、VL-CL或VL-CL结构域。可任选地指定的是，将细胞因子受体ABD定位在第一链或第二链上NKp46 ABD的互补VH-CH1、VK-CH1、VL-CL或VL-CL组分的C末端附近，或定位在第一链上Fc结构域的C末端附近。
在任何实施方案中，可以指定的是，蛋白质具有Fc结构域二聚体，该Fc结构域二聚体由置于单独链上的第一和第二Fc结构域单体组成，这些单独链经由CH3-CH3缔合进行二聚化，其中Fc结构域单体中的一个Fc结构域单体连接至抗NKp46 ABD和细胞因子两者，并且另一个(第二个)Fc结构域单体具有游离的C末端(其C末端不与抗NKp46 ABD或细胞因子融合)。
任选地，在本文的任何实施方案中，相同多肽链上不同结构域之间(例如，串联放置的两个V结构域之间、V结构域与CH1或Cκ结构域之间、CH1或Cκ结构域与Fc结构域之间、Fc结构域单体与V结构域之间、Fc结构域单体与细胞因子之间)的融合或连接可经由居间氨基酸序列发生，例如经由铰链区或接头肽发生。一般而言，本文描述的结构域排列或结构没有示出结构域接头，并且应当理解，可将结构域排列指定为在指定结构域之间具有结构域接头。例如，可将细胞因子指定为经由结构域接头与相邻结构域融合，并且可将结构域接头以相关结构域排列或结构插入。在另一个示例中，可将串联可变结构域(例如在scFv中)指定为经由结构域接头彼此融合，并且可将结构域接头以相关结构域排列或结构插入在两个V区之间。在另一个示例中，CH1或CL(或CK)恒定区可经由结构域接头或铰链结构域或其部分与其Fc结构域或CH2结构域融合，并且因此可将结构域接头或铰链结构域或其部分以相关结构域排列或结构在插入在CH1或CL结构域与Fc结构域或CH2结构域之间。对于格式“T5”的代表性异源三聚体，图2A中示出了具有所示接头的多特异性蛋白质的结构域排列的示例，示出了结构域接头诸如铰链和甘氨酸-丝氨酸接头，以及链间二硫桥。
在本文的任何实施方案中，可将多肽链(例如链1、2、3或4)指定为具有游离的N和/或C末端(在该多肽链的末端没有其他蛋白质结构域)。
在本文的任何实施方案中，可将本文所述的蛋白质结构域任选地指定为从N末端至C末端示出。出于说明的目的，本公开的蛋白质排列从N末端(左侧)至C末端(右侧)示出。可将多肽链上的相邻结构域称为彼此融合(例如，可将结构域称为在其左侧与结构域的C末端融合，并且/或者可将结构域称为在其右侧与结构域的N末端融合)。本文所述的蛋白质结构域可彼此直接融合(例如，V结构域直接与CH1或CL结构域融合)，或者经由接头或短的居间氨基酸序列彼此融合，这些接头或短的居间氨基酸序列用于连接多肽链上的结构域(例如，可将它们任选地指定为缺乏其他预先确定的功能性，或者缺乏与预先确定的配体的特异性结合)。两条多肽链将通过非共价相互作用彼此结合(用“|”表示)，并且任选地进一步可经由在互补CH1和Cκ结构域内的半胱氨酸残基之间形成的链间二硫键进行连接。
连接部和接头
通常，存在许多可用于多特异性蛋白质的合适接头，包括通过重组技术产生的传统肽键。在一些实施方案中，接头是“结构域接头”，其用于将本文概述的任何两个结构域连接在一起。可将相邻的蛋白质结构域指定为通过结构域接头彼此连接或融合。示例性结构域接头是(多)肽接头，任选地是柔性(多)肽接头。本文可互换使用的肽接头或多肽接头可具有源自特定结构域(诸如铰链、CH1或CL结构域)的亚序列，或者可主要包括以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。接头肽应具有足以连接两个分子的长度，以便使得它们相对于彼此呈现正确的构象，从而使得它们保留期望的活性。在一个实施方案中，接头长度为约1个至50个氨基酸，优选长度为约2个至30个氨基酸。在一个实施方案中，可使用长度为4个至20个氨基酸的接头，在一些实施方案中可使用约5个至约15个氨基酸。虽然可使用任何合适的接头，但在许多实施方案中，接头(例如柔性接头)可采用甘氨酸-丝氨酸多肽或聚合物，包括例如包含(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n、(GSSS)n、(GSSSS)n和(GGGS)n，其中n是至少一个整数(任选地n为1、2、3或4)，甘氨酸-丙氨酸多肽、丙氨酸-丝氨酸多肽和其他柔性接头。。包含甘氨酸和丝氨酸残基的接头通常提供蛋白酶抗性。(GS)1接头的一个示例是具有STGS氨基酸序列的接头；此类接头可用于使结构域与Fc结构域(或其CH3结构域)的C末端融合。在一些实施方案中，使用包含(G2S)n的肽接头，其中例如n＝1至20，例如(G2S)、(G2S)2、(G2S)3、(G2S)4、(G2S)5、(G2S)6、(G2S)7或(G2S)8、或(G3S)n，其中例如n为1至15的整数。在一个实施方案中，结构域接头包含(G4S)n肽，其中例如n为1至10、任选地1至6、任选地1至4的整数。在一些实施方案中，使用包含(GS2)n、(GS3)n或(GS4)n的肽接头，其中例如n＝1至20，例如(GS2)、(GS2)2、(GS2)3、(GS3)1、(GS3)2、(GS3)3、(GS4)1、(GS4)2、(GS4)3，其中例如n为1至15的整数。在一个实施方案中，结构域接头包含(GS4)n肽，其中例如，n为1至10、任选地1至6、任选地1至4的整数。在一个实施方案中，结构域接头包含C末端GS二肽，例如该接头包含(GS4)并且具有氨基酸序列GSSSS、GSSSSGSSSS、GSSSSGSSSSGS或GSSSSGSSSSGSSSS。
可将任何肽或结构域接头指定为包含至少2个残基、3个残基、4个残基、至少5个残基、至少10个残基、至少15个残基、至少20个残基或更多个氨基酸的长度。在其他实施方案中，接头包含介于2个至4个残基之间、介于2个至4个残基之间、介于2个至6个残基之间、介于2个至8个残基之间、介于2个至10个残基之间、介于2个至12个残基之间、介于2个至14个残基之间、介于3个至15个残基之间、介于4个至15个残基之间、介于2个至16个残基之间、介于2个至18个残基之间、介于2个至20个残基之间、介于2个至22个残基之间、介于2个至24个残基之间、介于2个至26个残基之间、介于2个至28个残基之间、介于2个至30个残基之间、介于2个和50个残基之间、或介于10个和50个残基之间的长度。
多肽接头的示例可包括来自CH1或CL结构域的序列片段；例如CL/CH1结构域的前4个至12个或5个至12个氨基酸残基特别适用于scFv部分的连接。接头可源自免疫球蛋白轻链，例如CK或Cλ。接头可源自任何同种型的免疫球蛋白重链，包括例如Cy1、Cy2、Cy3、Cy4和Cμ。接头序列还可源自其他蛋白质，诸如Ig样蛋白质(例如TCR、FcR、KIR)、铰链区衍生序列以及来自其他蛋白质的其他天然序列。在某些结构域排列中，VH和VL结构域与由接头肽(例如scFv)分开的另一个结构域串联连接，并且继而与Fc结构域(或其CH2结构域)的N末端或C末端融合。此类串联可变区或scFv可经由铰链区或其部分、CH1或CL结构域的N末端片段、或含甘氨酸和丝氨酸的柔性多肽接头与Fc结构域连接。
Fc结构域可经由免疫球蛋白衍生的序列或经由非免疫球蛋白序列(包括任何合适的连接氨基酸序列)与其他结构域连接。有利地，可在CH1或CL结构域与Fc结构域之间容易地使用免疫球蛋白衍生的序列，特别地，其中CH1或CL结构域在其C末端与Fc结构域(或CH2结构域)的N末端融合。免疫球蛋白铰链区或铰链区的一部分可以并且通常存在于CH1结构域与CH2结构域之间的多肽链上。当CL与多肽链上的Fc结构域相邻时，还可将铰链或其部分置于CL(例如Cκ)结构域与Fc结构域的CH2结构域之间的多肽链上。然而，应当理解，铰链区可任选地被例如合适的接头肽(例如柔性多肽接头)取代。
NKp46 ABD和细胞因子受体ABD(例如细胞因子)有利地经由柔性接头(例如多肽接头)与多特异性蛋白质的其余部分连接(例如，或者与其恒定结构域或Fc结构域连接)，该柔性接头与常规(例如野生型全长人IgG)抗体相比导致更低的结构刚性或硬度(例如，在ABD与Fc结构域之间或之中)。例如，多特异性蛋白质可具有NKp46 ABD与恒定结构域或Fc结构域之间的结构或柔性接头，该结构或柔性接头允许与常规(例如野生型全长人IgG)抗体中的两个ABD相比增加的结构域运动范围。特别地，与常规人IgG1抗体中的抗原结合位点相比，该结构或柔性接头可被构造成赋予抗原结合位点更大的链内结构域运动。刚性或结构域运动/链间结构域运动可通过以下方法测定：例如计算机建模、电子显微镜、光谱学(诸如核磁共振(NMR)、X-射线晶体学)或沉降速度分析超速离心(AUC)，以测量或比较包含接头或铰链的蛋白质的回转半径。如果测试蛋白质从前一句中所述的测试之一获得的值与比较蛋白质(例如IgG1抗体或铰链)的值相差至少5％、10％、25％、50％、75％或100％，则该测试蛋白质或接头相对于比较蛋白质可具有较低的刚性。细胞因子可例如通过选自GSSSS(SEQ IDNO:171)、GSSSSGSSSS(SEQ ID NO:172)、GSSSSGSSSSGS(SEQ ID NO:173)或GSSSSGSSSSGSSSS(SEQ ID NO:174)的接头与CH3结构域的C末端融合。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质可在NKp46 ABD与Fc结构域之间具有这样的结构或柔性接头：其允许NKp46 ABD和结合感兴趣的抗原的ABD在所述ABD之间具有包含小于约80埃、小于约60埃、或范围为约40埃至60埃的间距。
在Fc结构域(或其CH3结构域)的C末端处可经由多肽接头(例如含甘氨酸-丝氨酸的接头，任选地具有氨基酸序列STGS的接头)连接至NKp46 ABD或细胞因子多肽的N末端。
在某些实施方案中，Fab的CH1或CL结构域(例如NKp46 ABD)经由柔性多肽接头(例如含甘氨酸-丝氨酸的接头)在其C末端处与细胞因子的N末端融合。优选地，接头将具有至少4个氨基酸残基的链长度，任选地，接头具有5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸残基的长度。
在某些实施方案中，NKp46 ABD置于Fc结构域的C末端，并且NKp46定位在多特异性蛋白质中的Fc结构域与细胞因子多肽之间。NKp46 ABD将在其N末端(VH或VL结构域的N末端)处经由足够长度的接头(例如，含有甘氨酸和丝氨酸的接头、具有序列STGS的接头、柔性多肽接头)连接或融合至Fc结构域的C末端，使得结合NKp46的ABD能够折叠和/或采用一定取向，从而允许在NK细胞的表面上结合NKp46，同时相对于相邻Fc结构域(或更一般地，相对于多特异性蛋白质的其余部分)具有足够的距离和运动范围，使得FC结构域也可同时由在相同NK细胞表面表达的CD16发现。另外，当NKp46 ABD置于多特异性蛋白质中的Fc结构域与细胞因子多肽之间时，scFv NKp46 ABD的VH或VL或者Fab NKp46 ABD的CH1或CL结构域的C末端将经由足够长度的柔性接头(例如柔性多肽接头)连接或融合至细胞因子多肽的N末端，使得结合NKp46的ABD能够折叠和/或采取一定取向，从而允许在NK细胞的表面处结合NKp46，同时相对于相邻细胞因子多肽提供足够距离和运动范围，使得细胞因子多肽也可同时由其在NK细胞的表面处表达的细胞因子受体结合。优选地，接头将具有至少4个氨基酸残基的链长度，任选地，接头具有5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸残基的长度。
在串联可变区(例如scFv)中，两个V结构域(例如VH结构域和VL结构域)通常通过足够长度的接头连接在一起，使得ABD能够折叠，从而允许与ABD意图结合的抗原结合。接头的示例包括包含甘氨酸和丝氨酸残基的接头，例如氨基酸序列GEGTSTGSGGSGGSGGAD(SEQ IDNO:509)。在另一个具体实施方案中，scFv的VH结构域和VL结构域通过氨基酸序列(G4S)3连接在一起。
在一个实施方案中，用于将scFv的VH或VL结构域连接至Fc结构域的CH2结构域的(多)肽接头包含CH1结构域或CL结构域和/或铰链区的片段。例如，可将CH1的N末端氨基酸序列与可变结构域融合，以尽可能接近地模拟野生型抗体的天然结构。在一个实施方案中，接头包含来自铰链结构域或N末端CH1氨基酸的氨基酸序列。在一个实施方案中，接头肽模拟常规VK-CK肘部结合部，例如，接头包含氨基酸序列RTVA或由其组成。
在一个实施方案中，用于连接(例如Fab的)CH1或CK结构域的C末端与CH2结构域的N末端的铰链区将是铰链区(例如没有半胱氨酸残基的截短的铰链区)的片段，或者可包含一个或多个氨基酸修饰，这些氨基酸修饰去除(例如被另一个氨基酸取代，或缺失)半胱氨酸残基，任选地铰链区中的两个半胱氨酸残基。去除半胱氨酸可用于防止不期望的二硫键形成，例如在单体多肽中形成二硫键。
“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”在本文中指抗体的第一恒定结构域和第二恒定结构域之间的柔性多肽或接头。在结构上，IgG CH1结构域在EU位置220处结束，并且IgGCH2结构域在残基EU位置237处开始。因此，对于IgG，铰链通常包括位置221(IgG1中的D221)至236(IgG1中的G236)，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。在IgG抗体的上下文中，除非另外指明或如上下文另有说明，否则提及在多肽内发现的恒定区结构域内的特定氨基酸残基将根据Kabat来定义。
在一个实施方案中，铰链区(或其片段)源自人IgG1抗体的铰链结构域。例如，铰链结构域可包含氨基酸序列：THTCPPCPAPELL(SEQ ID NO:166)或包含其前8个残基的片段，或与前述氨基酸序列中任一项至少60％、70％、80％或90％相同的氨基酸序列，任选地其中一个或两个半胱氨酸缺失或被不同的氨基酸残基(任选地丝氨酸)取代。
在一个实施方案中，铰链区(或其片段)源自人IgM抗体的Cμ2-CCμ3铰链结构域。例如，铰链结构域可包含氨基酸序列：NASSMCVPSPAPELL(SEQ ID NO:167)，或与其至少60％、70％、80％或90％相同的氨基酸序列，任选地其中一个或两个半胱氨酸缺失或被不同的氨基酸残基取代。
经由非共价键或相互作用二聚化并彼此缔合的多肽链可以或可以不另外通过在相应CH1与Cκ结构域之间以及/或者链上相应铰链结构域之间形成的链间二硫键结合。CH1、Cκ和/或铰链结构域(或其他合适的连接氨基酸序列)可任选地被构造成使得链间二硫键在链之间形成，从而使得期望的链配对是有利的并且避免不期望的或不正确的二硫键形成。例如，当待配对的两条多肽链各自具有与铰链结构域相邻的CH1或Cκ时，多肽链可被构造成使得可用于在相应CH1/Cκ-铰链区段之间形成链间二硫键的半胱氨酸的数量减少(或完全消除)。例如，相应CH1、Cκ和/或铰链结构域的氨基酸序列可经修饰以去除多肽的CH1/Cκ和铰链结构域两者中的半胱氨酸残基；由此，这两条链的CH1和Cκ结构域将经由非共价相互作用缔合进行二聚化。
在另一个示例中，与铰链结构域相邻(例如，其N末端)的CH1或Cκ结构域包含能够形成链间二硫键的半胱氨酸，并且置于CH1或Cκ的C末端处的铰链结构域包含铰链的一个或两个半胱氨酸的缺失或取代(例如Cys239和Cys 242，根据Kabat对人IgG1铰链进行编号)。在一个实施方案中，铰链区(或其片段)包含氨基酸序列：THTSPPSPAPELL(SEQ ID NO:168)，或与其至少60％、70％、80％或90％相同的氨基酸序列。
在另一个示例中，与铰链结构域相邻(例如，其N末端)的CH1或Cκ结构域包含能够形成链间二硫键的半胱氨酸残基处的缺失或取代，并且置于CH1或Cκ的C末端处的铰链结构域包含铰链的一个或两个半胱氨酸(例如Cys 239和Cys 242，根据Kabat对人IgG1铰链进行编号)。在一个实施方案中，铰链区(或其片段)包含氨基酸序列：THTCSSCPAPELL(SEQ IDNO:169)，或与其至少60％、70％、80％或90％相同的氨基酸序列。
在另一个示例中，铰链区源自IgM抗体。在此类实施方案中，CH1/CK配对模拟IgM抗体中的Cμ2结构域同源二聚化。例如，与铰链结构域相邻(例如，其N末端)的CH1或Cκ结构域包含能够形成链间二硫键的半胱氨酸处的缺失或取代，并且置于CH1或Cκ的C末端处的IgM铰链结构域包含铰链的一个或两个半胱氨酸。在一个实施方案中，铰链区(或其片段)包含氨基酸序列：THTCSSCPAPELL(SEQ ID NO:170)，或与其至少60％、70％、80％或90％相同的氨基酸序列。
作为多肽接头的另选方案，发现多种非蛋白性聚合物或化学接头可用于多特异性蛋白质。例如非蛋白质聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或者聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物，可用作接头。在一些示例中，多特异性蛋白质的多肽链中的氨基酸序列可经修饰以引入反应性基团，任选地受保护的反应性基团，并且经此修饰的蛋白质或链然后与接头或包含互补反应性基团的多肽反应。在一些示例中，多特异性蛋白质的多肽链中的氨基酸残基可与包含反应性基团的接头结合(用于与用具有互补反应性基团的接头进行官能化的第二多肽进一步反应)，或经由酶催化反应与第二多肽直接结合。例如，包含受体谷氨酰胺或赖氨酸的多肽可在存在转谷氨酰胺酶(例如细菌性转谷氨酰胺酶，BTG)的情况下与包含伯胺的接头反应，使得转谷氨酰胺酶催化接头与多肽初级结构内(例如在免疫球蛋白恒定结构域内或在插入或附加到(例如融合到)恒定区的TGase识别标签内)的受体谷氨酰胺残基的缀合。第二多肽也可以类似方式用接头进行官能化，并且当所缀合的接头各自携带互补反应性基团(例如一个多肽的接头上的R和另一个多肽的接头上的R')时，两个官能化的多肽可发生反应，使得它们经由包含该反应的残基的接头或R与R'结合。反应性基团对R和R'的示例包含一系列基团，这些基团能够进行双正交反应，例如叠氮化物和环辛炔之间的1,3-偶极环加成(无铜点击化学)、硝酮和环辛炔之间的1,3-偶极环加成、由醛和酮形成肟/腙以及四嗪连接(另见WO2013/092983)。所得接头和官能化抗体或其Y元件因此可以包括由R和R'反应产生的RR'基团，例如三唑。用BTG介导的与抗体缀合的方法和接头描述于PCT公开号WO2014/202773中，其公开内容以引用方式并入。“转谷氨酰胺酶”，可与“TGase”或“TG”互换使用，是指能够通过肽结合型谷氨酰胺的γ-羧酰胺基团与赖氨酸或结构相关的伯胺(诸如氨基戊基，例如肽结合型赖氨酸)的ε-氨基之间的酰基转移反应来交联蛋白质从而产生ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键的酶。TGase尤其包含细菌性转谷氨酰胺酶(BTG)，诸如具有EC参考EC 2.3.2.13的酶(蛋白质-谷氨酰胺-γ-谷氨酰转移酶)。术语“受体谷氨酰胺”残基，当提及抗体的谷氨酰胺残基时，是指被TGase识别并且可以通过谷氨酰胺和赖氨酸或结构相关的伯胺(诸如氨基戊基)之间的反应被TGase交联的谷氨酰胺残基。优选地，受体谷氨酰胺残基是表面暴露的谷氨酰胺残基。术语“TGase识别标签”是指包括受体谷氨酰胺残基的氨基酸序列，并且当在合适的条件下掺入(例如附加到)多肽序列中时，所述氨基酸序列被TGase识别并通过氨基酸序列内的氨基酸侧链和反应伙伴之间的反应导致TGase交联。识别标签可以是不天然存在于包括酶识别标签的多肽中的肽序列。TGase识别标签的示例包括WO2012/059882和WO2014/072482中公开的氨基酸序列，这些文献的公开内容以引用方式并入本文。
恒定区
恒定区结构域可源自任何合适的人抗体，特别是γ同种型的人抗体，包括恒定重(CH1)结构域和轻(CL、Cκ或Cλ)结构域、铰链结构域、CH2和CH3结构域。
关于重链恒定结构域，“CH1”通常是指根据Kabat中的EU索引的位置118-220。根据上下文，CH1结构域(例如，如结构域排列中所示)可任选地包含延伸到铰链区中的残基，使得CH1包含铰链区的至少一部分。例如，当定位在多肽链上的C末端和/或Fc结构域的C末端，以及/或者定位在Fc结构域的Fab结构或C末端内时，CH1结构域可任选地包含铰链区的至少一部分，例如CH1结构域可包含至少上铰链区，例如人IgG1铰链的上铰链区，任选地进一步其中上铰链的末端苏氨酸可被丝氨酸取代。因此，这种CH2结构域可在其C末端包含氨基酸序列：EPKSCDKTHS(SEQ ID NO:440)。
示例性人CH1结构域氨基酸序列包括：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR V(SEQ ID NO:156)
或
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHS(SEQ ID NO:157)。
或
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT(SEQ ID NO:158)。
示例性人Cκ结构域氨基酸序列包括：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:159)。
在一些示例性构型中，多特异性蛋白质可以是包含一个或两个Fab的异源二聚体、异源三聚体或异源四聚体(例如，一个Fab结合NKp46，而另一个结合感兴趣的抗原)，其中可变区、CH1和/或CL结构域通过在旋钮插入孔(knob-in-hole)或静电导向方法中引入氨基酸取代来工程化，以促进CH1结构域与CK结构域的期望的链配对。在一些示例性构型中，多特异性蛋白质可以是包含一个或两个Fab的异源二聚体、异源三聚体或异源四聚体(例如，一个Fab结合NKp46，而另一个结合感兴趣的抗原)，其中Fab具有VH/VL交叉(VH和VL彼此取代)或CH1/CL交叉(CH1和CL彼此取代)，并且其中CH1和/或CL结构域包含氨基酸取代，以通过旋钮插入孔或静电导向来促进正确的链缔合。
“CH2”通常是指根据如在Kabat中的EU索引的位置237-340，并且“CH3”通常是指根据如在Kabat中的EU索引的位置341-447。CH2和CH3结构域可源自任何合适的抗体。此类CH2和CH3结构域可用作野生型结构域或可用作经修饰的CH2或CH3结构域的基础。任选地，CH2和/或CH3结构域是人源的，或者可包含另一个物种(例如，啮齿动物、兔、非人灵长类动物)的结构域，或者可包含经修饰的或嵌合的CH2和/或CH3结构域，例如包含来自不同CH2或CH3结构域(例如，来自不同抗体同种型或物种抗体)的部分或残基的结构域。
在任何结构域排列中，Fc结构域单体可包含CH2-CH3单元(全长CH2和CH3结构域或其片段)。在包含具有Fc结构域单体的两条链的异源二聚体或异源三聚体(即，异源二聚体或异源三聚体包含Fc结构域二聚体)中，CH3结构域将能够CH3-CH3二聚化(例如，其将包含野生型CH3结构域或经修饰以促进期望的CH3-CH3二聚化的CH3结构域)。
示例性人IgG1 CH2-CH3(Fc)结构域氨基酸序列包括：APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:160)。
Fc结构域可任选地进一步包含C末端赖氨酸(K)。在一些示例性构型中，多特异性蛋白质可以是异源二聚体、异源三聚体或异源四聚体，其中多肽链被工程化用于彼此之间的异源二聚化，以便产生期望的蛋白质。在其中期望的链配对不受CH1-Cκ二聚化驱动或通常其中期望配对增强的实施方案中，这些链可包含具有氨基酸修饰(例如，取代)的恒定或Fc结构域，这些氨基酸修饰有利于优先链配对，例如有利于两条不同链的期望异源二聚化超过两条相同链的同源二聚化。
在一些实施方案中，使用“旋钮插入孔”方法，其中结构域界面(例如，抗体Fc区的CH3结构域界面)被突变，使得抗体优先异源二聚化。可引入突变以产生跨越界面(例如，Fc二聚体界面)的改变的电荷极性，使得静电匹配链(例如，含Fc链)的共表达支持有利的吸引相互作用，从而促进期望的异源二聚体(例如，Fc异源二聚体)形成，而不利的排斥电荷相互作用抑制不需要的异源二聚体(例如，Fc同源二聚体)形成。参见例如Brinkmann和Kontermann，2017年，MAbs，第9卷第2期：第182-212页中综述的突变和方法，其公开内容以引用方式并入本文。例如，一条重链包含T366W取代，并且第二条重链包含T366S、L368A和Y407V取代，参见例如Ridgway等人(1996年)，Protein Eng.，第9卷：第617-621页；Atwell(1997年)，J.Mol.Biol.，第270卷：第26-35页；和WO2009/089004，这些文献和专利的公开内容以引用方式并入本文。例如，第一Fc单体上的“Hole”突变可包括Y349C/T366S/L368A/Y407V，并且第二Fc单体上的互补“Knob”突变可包括S354C/T366W(Kabat EU编号)。在另一种方法中，一条重链包含F405L取代，并且第二条重链包含K409R取代，参见例如Labrijn等人(2013年)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第110卷：第5145-5150页。在另一种方法中，一条重链包含T350V、L351Y、F405A和Y407V取代，并且第二条重链包含T350V、T366S、K392L和T394W取代，参见例如Von Kreudenstein等人，2013年，mAbs，第5卷：第646-654页。在另一种方法中，一条重链包含K409D和K392D取代，并且第二条重链包含D399K和E356K取代，参见例如Gunasekaran等人，2010年，J.Biol.Chem.，第285卷：第19637-19646页。在另一种方法中，一条重链包含D221E、P228E和L368E取代，并且第二条重链包含D221R、P228R和K409R取代，参见例如Strop等人，2012年，J.Mol.Biol.，第420卷：第204-219页。在另一种方法中，一条重链包含S364H和F405A取代，并且第二条重链包含Y349T和T394F取代，参见例如Moore等人，2011年，mAbs，第3卷：第546-557页。在另一种方法中，一条重链包含H435R取代，并且第二条重链任选地可包含或可不包含取代，参见例如美国专利号8,586,713。当此类异源多聚体抗体具有源自人IgG2或IgG4的Fc区时，这些抗体的Fc区可被工程化以包含允许CD16结合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，抗体可包含在残基N297(Kabat EU编号)处的哺乳动物抗体型N-连接糖基化。
在一些实施方案中，多特异性蛋白质在CH3结构域中包含一个或多个氨基酸修饰(例如取代)，该一个或多个氨基酸修饰影响与亲和纯化介质(例如，蛋白质A)的结合。将减少与蛋白质A结合的突变引入CH3结构域之一中可用于将不需要的链配对与期望的蛋白质区分开来。例如，可在氨基酸H435和Y436(Kabat EU编号)，例如H435R和Y436F处引入突变。在一个实施方案中，在具有经修饰以保持与CD16A结合的二聚体Fc结构域的多特异性蛋白中，第一Fc单体(例如，在多肽链中的一者上)包含与SEQ ID NO:161至少90％、95％或99％相同的氨基酸序列，并且第二Fc单体(例如，在多肽链的另一者上)包含与SEQ ID NO:162至少90％、95％或99％相同的氨基酸序列。任选地，Fc单体中的每一者在其N末端与SEQ IDNO:166的铰链氨基酸序列融合。
在一些实施方案中，将一对或多对二硫键诸如A287C和L306C、V259C和L306C、R292C和V302C以及V323C和I332C引入到Fc区以增加稳定性，例如进一步导致由其他Fc修饰引起的稳定性损失。另外的示例包括引入K338I、A339K和K340S突变以增强Fc稳定性和聚集抗性(Gao等人，2019年，Mol Pharm.，2019年，第16卷：第3647页)。
在一些实施方案中，其中多特异性蛋白质旨在降低与人Fcγ受体的结合。在一些实施方案中，其中多特异性蛋白质旨在降低与人CD16A多肽的结合(并且任选地进一步降低与CD32A、CD32B和/或CD64的结合)，Fc结构域是人IgG4 Fc结构域，任选地进一步其中Fc结构域包含S228P突变以稳定铰链二硫化物。在一个实施方案中，Fc结构域具有与人IgG4 Fc结构域至少90％、95％或99％相同的氨基酸序列，任选地进一步包含Kabat S228P突变。
在其中多特异性蛋白质旨在降低与人CD16A多肽的结合(并且任选地进一步降低与CD32A、CD32B和/或CD64的结合)的实施方案中，CH2和/或CH3结构域(或包含其的Fc结构域)可包含修饰以降低或消除与FcγRIIIA(CD16)的结合。例如，Fc结构域二聚体蛋白质中在残基N297处的CH2突变(Kabat编号)可基本上消除CD16A结合。然而，本领域技术人员将了解，可实施其他构型。例如，在人IgG1或IgG2中位置233-236处的残基和/或位置327、330和331处的残基的取代示出极大地降低了与Fcγ受体的结合，并因此降低了ADCC和CDC。此外，Idusogie等人(2000年)，J.Immunol.，第164卷第8期：第4178-84页证明了在不同位置的丙氨酸取代(包括K322)显著降低了补体活化。
在一个实施方案中，Kabat重链残基297处的天冬酰胺(N)可被除天冬酰胺之外的残基(例如，谷氨酰胺、除谷氨酰胺之外的残基，例如丝氨酸)取代。
在一个实施方案中，经修饰以降低与CD16A结合的Fc结构域包含Fc结构域中在Kabat残基234、235和322处的取代。在一个实施方案中，蛋白质包含Fc结构域中在Kabat残基234、235和331处的取代。在一个实施方案中，蛋白质包含Fc结构域中在Kabat残基234、235、237和331处的取代。在一个实施方案中，蛋白质包含Fc结构域中在Kabat残基234、235、237、330和331处的取代。在一个实施方案中，Fc结构域是人IgG1亚型的。氨基酸残基根据Kabat的EU编号来指示。
在一个实施方案中，经修饰以降低与CD16A结合的Fc结构域包含在Kabat残基233-236中的一者或多者、任选地残基233-237中的一者或多者、或残基234、235和/或237中的一者、两者或三者处的氨基酸修饰(例如，取代)，以及在Kabat残基330和/或331处的氨基酸修饰(例如，取代)。这种Fc结构域的一个示例包含在Kabat残基L234、L235和P331处的取代(例如，L234A/L235E/P331S或L234F/L235E/P331S)。这种Fc结构域的另一个示例包含在Kabat残基L234、L235、G237和P331(例如，L234A/L235E/G237A/P331S)处的取代。这种Fc结构域的另一个示例包含在Kabat残基L234、L235、G237、A330和P331(例如，L234A/L235E/G237A/A330S/P331S)处的取代。在一个实施方案中，抗体包含人IgG1 Fc结构域，其包含L234A/L235E/N297X/P331S取代、L234F/L235E/N297X/P331S取代、L234A/L235E/G237A/N297X/P331S取代或L234A/L235E/G237A/N297X/A330S/P331S取代，其中X可以是除天冬酰胺之外的任何氨基酸。在一个实施方案中，X是谷氨酰胺；在另一个实施方案中，X是除谷氨酰胺之外的残基(例如，丝氨酸)。
在一个实施方案中，与CD16A结合低或降低的Fc结构域包含人IgG4Fc结构域，其中该Fc结构域具有以下氨基酸序列(具有S228P取代的人IgG4)，或与其至少90％、95％或99％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，经修饰以降低与CD16A结合的Fc结构域包含以下氨基酸序列，或与其至少90％、95％或99％相同但保留位于Kabat位置234、235和331处的氨基酸残基的氨基酸序列(下划线)：A S T K GPS V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V KD Y F P E P VT V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V VT V P S SS L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C D K T H TC PP C P A P E F E G GPS V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V VD VS H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S TY R V V S VL T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A S I E K TI S K A K G Q P RE P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G FY P SD I A V E W E S NG Q P E N N Y K T T P P V L D SD G S F F L Y S KL T V D K S R W Q Q G N V F SC S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S PG(SEQ ID NO:163)
在一个实施方案中，经修饰以降低与CD16A结合的Fc结构域包含以下氨基酸序列，或与其至少90％、95％或99％相同但保留位于Kabat位置234、235、237、330和331处的氨基酸残基的氨基酸序列(下划线)：A S T K GPS V F P L A P S S K S T S G G T A A L GC L V K D Y F P E P VT V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S LS S V V T V P S SS L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C DK T H T C PP C P A P E A E G A P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V TC V V VD V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S TYR V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P S S I E K TI S K AK G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G FY P SD I A VE W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D SD G S F F L Y S KL T V D K S R W Q QG N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S PG(SEQ ID NO:164)
任何上述Fc结构域序列可任选地进一步包含C末端赖氨酸(K)，即如在天然存在的序列中。
在本文其中需要与CD16(CD16A)结合的某些实施方案中，CH2和/或CH3结构域(或包含其的Fc结构域)可以是野生型结构域或具有来自野生型人IgG1结构域的CD16界面残基的结构域，或可包含一个或多个增加与人CD16和任选地另一个受体诸如FcRn的结合的氨基酸修饰(例如，氨基酸取代)。任选地，修饰将不会显著降低或消除Fc源性多肽与新生儿Fc受体(FcRn)结合的能力，例如人FcRn。典型的修饰包含经修饰的人IgG1源性恒定区，其包括至少一个氨基酸修饰(例如，取代、缺失、插入)和/或改变的糖基化类型，例如低岩藻糖基化。此类修饰可以影响与Fc受体的相互作用：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、和FcγRIII(CD16)。FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)和FcγRIII(CD16)是活化(即，免疫系统增强)受体，而FcγRIIB(CD32B)是抑制(即，免疫系统抑制)受体。修饰可以例如增加Fc结构域与效应子(例如，NK)细胞上的FcγRIIIa的结合和/或减少与FcγRIIB的结合。在PCT公开号WO2014/044686中提供了修饰的示例，所述文献的公开内容以引用方式并入本文。下文还阐述了影响(增强)FcγRIIIa或FcRn结合的特异性突变(在IgG1 Fc结构域中)。
在一些实施方案中，多特异性蛋白质包含变体Fc区，在Fc区的CH2和/或CH3结构域中包括至少一个氨基酸修饰(例如，具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个氨基酸修饰)，其中修饰增强了与人CD16多肽的结合。在其他实施方案中，多特异性蛋白质包含来自氨基酸237-341的Fc区的CH2结构域中的或包括残基231-341的下铰链-CH2区内的至少一个氨基酸修饰(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个氨基酸修饰)。在一些实施方案中，多特异性蛋白质包含至少两个氨基酸修饰(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个氨基酸修饰)，其中此类修饰中的至少一个修饰位于CH3区内，并且至少一个此类修饰位于CH2区内。还涵盖铰链区中的氨基酸修饰。在一个实施方案中，涵盖了CH1结构域中，任选地在包括残基216-230(Kabat EU编号)的上铰链区中的氨基酸修饰。可进行Fc修饰的任何合适的功能性组合，例如在以下中的任一者中公开的不同Fc修饰的任何组合：美国专利号US,7,632,497、7,521,542、7,425,619、7,416,727、7,371,826、7,355,008、7,335,742、7,332,581、7,183,387、7,122,637、6,821,505和6,737,056；以及/或者PCT公开号WO2011/109400、WO 2008/105886、WO 2008/002933、WO 2007/021841、WO2007/106707、WO 06/088494、WO 05/115452、WO 05/110474、WO 04/1032269、WO 00/42072、WO 06/088494、WO 07/024249、WO 05/047327、WO 04/099249和WO 04/063351；以及/或者Lazar等人(2006年)，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，第103卷第11期：第405-410页；Presta,L.G.等人(2002年)，Biochem.Soc.Trans.，第30卷第4期：第487-490页；Shields,R.L.等人(2002年)，J.Biol.Chem.，26，第277卷第30期：第26733-26740页；以及Shields,R.L.等人(2001年)，J.Biol.Chem.，第276卷第9期：第6591-6604页)。
在一些实施方案中，多特异性蛋白质包含Fc结构域，其相对于野生型Fc区包含至少一个氨基酸修饰(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个氨基酸修饰)，使得该分子相对于包含野生型Fc区的相同分子具有增强的对人CD16的结合亲和力，任选地其中变体Fc区在位置221、239、243、247、255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、308、309、310、311、312、316、320、322、326、329、330、332、331、332、333、334、335、337、338、339、340、359、360、370、373、376、378、392、396、399、402、404、416、419、421、430、434、435、437、438和/或439(Kabat EU编号)中的任一者或多者处包含取代。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质包含Fc结构域，其相对于野生型Fc区包含至少一个氨基酸修饰(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个氨基酸修饰)，使得该分子相对于包含野生型Fc区的分子具有增强的对人CD16的结合亲和力，任选地其中变体Fc区在位置239、298、330、332、333和/或334的任一者或多者处包含取代(例如，S239D、S298A、A330L、I332E、E333A和/或K334A取代)，任选地其中变体Fc区在残基S239和I332处包含取代，例如S239D和I332E取代(Kabat EU编号)。
在一些实施方案中，多特异性蛋白质包含Fc结构域，其在Kabat残基N297处包含N-连接糖基化。在一些实施方案中，多特异性蛋白质包含Fc结构域，其包含增加对人CD16的结合亲和力的改变的糖基化模式。此类碳水化合物修饰可通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达编码多特异性蛋白质的核酸来完成。具有改变的糖基化机制的细胞是本领域已知的，并且可用作宿主细胞，在其中表达重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。参见例如Shields,R.L.等人(2002年)，J.Biol.Chem.，第277卷：第26733-26740页；Umana等人(1999年)，Nat.Biotech.，第17卷：第176-1页，以及欧洲专利号：EP 1176195；PCT公开WO 06/133148、WO 03/035835、WO 99/54342，这些文献和专利中的每一者全文以引用方式并入本文。在一个方面，多特异性蛋白质包含一个或多个低岩藻糖基化恒定区。这种多特异性蛋白质可包含氨基酸改变或可不包含氨基酸改变和/或可在导致低岩藻糖基化的条件下进行表达或合成或处理。在一个方面，多特异性蛋白质组合物包含本文所述的多特异性蛋白质，其中组合物中至少20％、30％、40％、50％、60％、75％、85％、90％、95％或基本上所有的抗体种类具有包含缺乏岩藻糖的核心碳水化合物结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的恒定区。在一个实施方案中，提供了不含N-连接聚糖的多特异性蛋白质组合物，其包含具有岩藻糖的核心碳水化合物结构。核心碳水化合物将优选为Asn297处的糖链。
任选地，包含Fc结构域二聚体的多特异性蛋白质的特征可在于对人CD16A多肽具有在常规人IgG1抗体的结合亲和力的1-log内的结合亲和力，例如，如通过表面等离子共振评估的。
在一个实施方案中，包含其中Fc结构域被工程化以增强Fc受体结合的Fc结构域二聚体的多特异性蛋白质的特征可在于对人CD16A多肽的结合亲和力比常规或野生型人IgG1抗体的结合亲和力大至少1-log，例如，如通过表面等离子共振评估的。
在一个实施方案中，包含Fc结构域二聚体的多特异性蛋白质的特征可在于对人FcRn(新生儿Fc受体)多肽具有在常规人IgG1抗体的结合亲和力的1-log内的结合亲和力，例如，如通过表面等离子共振评估的。
任选地，包含Fc结构域二聚体的多特异性蛋白质的特征可在于与人Fc受体多肽(例如，CD16A)结合(单价)的Kd小于10-5M(10μmolar)，任选地小于10-6M(1μmolar)，如通过表面等离子共振评估的(例如，如在本文的实施例中，在Biacore T100设备(通用电气医疗集团的Biacore)上进行的SPR测量，其中双特异性抗体固定在传感器芯片CM5上并且将可溶性CD16多肽的系列稀释液注射到固定的双特异性抗体上。
细胞因子受体ABD
与NK细胞上的细胞因子受体(细胞因子受体ABD)结合的抗原结合结构域可有利地包含合适的细胞因子多肽或多肽片段，使得细胞因子受体ABD结合NK细胞表面上的细胞因子受体。细胞因子可以是例如全长野生型IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽、其足以与此类细胞因子的NK细胞受体结合的片段、或前述任一者的变体。细胞因子分子可以是包含人细胞因子的至少20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个或100个连续氨基酸的片段，其中细胞因子保留结合NK细胞的表面上存在的其细胞因子受体的能力。在某些实施方案中，与野生型人细胞因子相比，细胞因子是包含一个或多个氨基酸修饰(例如，氨基酸取代)的人细胞因子的变体，例如以降低对非NK细胞(例如，Treg细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞)上存在的受体的结合亲和力。细胞因子可以是例如I型细胞因子和常见细胞因子受体γ链(cg链)细胞因子家族的成员，其经由由与常见γ链(CD132)缔合的受体亚基(例如，IL-2Rβ/IL-15Rβ或IL-21R)亚基组成的异源多聚体或异源二聚体受体复合物发出信号。
在一个实施方案中，与NKp46和任选的另外的CD16A结合的多特异性蛋白质掺入细胞因子(或其变体的片段)，与人野生型细胞因子对应物相比，该细胞因子(或其变体的片段)经修饰减弱(降低)了对NK细胞上表达的细胞因子受体的结合亲和力。与人野生型细胞因子对应物相比，经修饰的细胞因子(或其变体的片段)保留了对NK细胞上表达的细胞因子受体的部分活性和/或结合亲和力。在一个实施方案中，细胞因子保留了野生型细胞因子对应物通过其在NK细胞上的受体诱导信号传导的能力的至少5％、10％、20％或50％。
在一个实施方案中，与NKp46和任选的另外的CD16A结合的多特异性蛋白质允许掺入野生型细胞因子(或其变体的片段)，与人野生型细胞因子对应物相比，该野生型细胞因子(或其变体的片段)保留了在NK细胞上表达的细胞因子受体的基本上全部的活性和/或结合亲和力。在一个实施方案中，细胞因子是野生型细胞因子或其片段，或者是经修饰的细胞因子，其中细胞因子不具有显著降低的诱导信号传导的能力和/或不具有显著降低的对其受体在NK细胞上的结合亲和力(例如，CD122、IL-21R、IL-7Ra、IL-27Ra、IL-12R、IL-18R)。在一个实施方案中，细胞因子不包含显著降低其通过其在NK细胞(例如，CD122、IL-21R、IL-7Ra、IL-27Ra、IL-12R、IL-18R)上的受体诱导信号传导的能力的修饰(例如，取代、缺失等)。在一个实施方案中，细胞因子保留了野生型细胞因子对应物通过其在NK细胞上的受体(例如，CD122、IL-21R、IL-7Ra、IL-27Ra、IL-12R、IL-18R)诱导信号传导的能力的至少80％、90％。任选地，通过使细胞因子(例如，作为重组蛋白质结构域或在本公开的多特异性蛋白质内)与NK细胞接触并测量信号传导，例如测量NK细胞中的STAT磷酸化来评估信号传导。
在一些实施方案中，当本文所公开的对NKp46具有在约15nM范围内的KD的示例性抗NKp46 VH/VL对或其功能上保守的变体用于多特异性蛋白质中时，可将细胞因子或细胞因子受体ABD(作为游离细胞因子或掺入到多特异性蛋白质中)指定为结合其受体，如通过SPR测定的，其中结合亲和力(KD)为200nM或更小、100nM或更小、50nM或更小或25nM或更小。在一个实施方案中，细胞因子或细胞因子受体ABD结合其受体，如通过SPR测定的，其中结合亲和力(KD)为1nM或高于1nM、任选地高于10nM、任选地高于15nM。在一个实施方案中，细胞因子或细胞因子受体ABD结合其受体，如通过SPR测定的，其中结合亲和力(KD)介于约1nm至约200nm之间、任选地介于约1nm至约100nm之间、任选地介于约10nM至约200nM之间、任选地介于约10nM至约100nM之间、任选地介于约15nM至约100nM之间。
当结合细胞因子的ABD是结合CD122的ABD时，ABD可以是或包含合适的白介素-2(IL-2)多肽，使得CD122 ABD结合CD122。如本文举例说明的，ABD有利地是变体或经修饰的IL-2多肽，其与野生型人白介素-2相比具有降低的与CD25(IL-2Rα)的结合(例如，降低的或消除的结合亲和力，例如如通过SPR测定的)。这种变体或经修饰的IL-2多肽在本文中也称为“IL2v”或“非αIL-2”。可将结合CD122的ABD任选地指定为对人CD122具有基本上等同于野生型人IL-2的结合亲和力，或与野生型人IL-2相比降低的结合亲和力。可将结合CD122的ABD任选地指定为具有诱导CD122信号传导和/或对CD122的结合亲和力的能力，该能力基本上等同于野生型人IL-2的能力。在一个实施方案中，结合CD122的ABD对CD25的结合亲和力的降低大于对CD122的结合亲和力的降低，例如对CD25的结合亲和力降低至少1-log、2-log或3-log，并且对CD122的结合亲和力降低小于1-log。
例如，可将异源多聚体多特异性蛋白质指定为能够与NK细胞上的NKp46和CD122以及任选的另外的CD16A结合，并且其能够增强NK细胞对表达感兴趣的抗原的靶细胞的细胞毒性，并且包含：
(a)与感兴趣的抗原结合的ABD，
(b)与人NKp46多肽结合的ABD，
(c)能够结合FcRn并任选地进一步与CD16A结合的Fc结构域或其部分，和
(d)结合人CD122多肽的ABD，其中ABD被置于包含这种ABD的多肽链的C末端处，任选地其中这种ABD包含结合CD122的IL-2多肽或其部分，并且与人野生型IL-2多肽相比，分别显示出对人CD25降低的结合亲和力。因此，可将结合CD122的ABD置于例如多肽链上的C末端和/或邻近Fc结构域和/或结合NKp46的ABD。
据信IL-2以其作为单体IL-2受体(IL-2R)的格式结合IL-2Rβ(CD122)，随后募集IL-2Rγ(CD132；也称为常见γ链)亚基。因此，在其表面不表达CD25的细胞中，可将与CD122的结合(例如，降低的结合)任选地指定为在CD122:CD132复合物中结合或与其结合。可将CD122(或CD122:CD132复合物)任选地指定为存在于NK细胞的表面。在其表面表达CD25的细胞中，据信IL-2以单体IL-2受体的格式结合CD25(IL-2Rα)，随后缔合亚基IL-2Rβ和IL-2Rγ。因此，可将与CD25的结合(例如，降低的结合、部分降低的结合)任选地指定为在CD25:CD122复合物或CD25:CD122:CD132复合物中结合或者与其结合。
在本文的多特异性蛋白质中，可将多特异性蛋白质任选地指定为被构造和/或处于构象(或能够采取构象)，其中当多特异性蛋白质在细胞(例如NK细胞、CD122+CD25-细胞)的表面处与NKp46(并且任选地进一步与CD16)结合时，CD122 ABD(例如，IL2v)能够与所述细胞的表面处的CD122结合。任选地进一步，多特异性蛋白质:CD122复合物能够在所述细胞的表面处与CD132结合。
CD122 ABD或IL2v可以是经修饰的IL-2多肽，例如通过引入一个或多个氨基酸取代、插入或缺失而修饰的单体IL-2多肽，该一个或多个氨基酸取代、插入或缺失降低了与CD25的结合，降低或不降低与CD122的结合。
在一些实施方案中，当试图选择性降低与CD25的结合时，IL-2多肽可通过使其与一种或多种其他附加分子(诸如，聚合物或(多)肽)结合或缔合来修饰，该一种或多种其他附加分子导致与CD25的结合进一步降低或消除。例如，野生型或突变的IL-2多肽可通过与其另一部分结合而被修饰或进一步修饰，该另一部分屏蔽、掩蔽、与人IL-2的结合CD25的位点结合或相互作用，从而降低与CD25的结合。在一些示例中，将分子诸如聚合物(例如，PEG聚合物)缀合至IL-2多肽以屏蔽或掩蔽IL-2上被CD25结合的表位，例如通过引入(例如，取代)以在IL-2多肽上的特定位点处安装含有专用化学钩的氨基酸。在其他示例中，野生型或变体IL-2多肽与抗IL-2单克隆抗体或抗体片段结合，该单克隆抗体或抗体片段与人IL-2的结合CD25的位点结合或相互作用，从而降低与CD25的结合。
在任何实施方案中，IL2多肽可以是全长IL-2多肽或它可以是IL-2多肽片段，只要包含它的片段或IL2v保留特定活性(例如，与野生型IL-2多肽相比，保留至少部分CD122结合)。
如本文所示，IL2v多肽可有利地包含含有一个或多个氨基酸突变的IL-2多肽，该一个或多个氨基酸突变被设计成降低其与人CD25(IL-2Rα)结合的能力，同时保留至少一些或任选地基本上全部的结合人CD122的能力。
已经描述了各种IL2v或非αIL-2部分，这些部分降低了IL-2对CD25+细胞的活化倾向。这种IL2v降低了与IL-2Rα的结合，并且维持与IL-2Rβ的至少部分结合。已经描述了几种IL2v多肽，许多在IL-2多肽的氨基酸残基区35-72和/或79-92中具有突变。例如，对IL-2Rα降低的亲和力可通过取代野生型IL-2多肽序列中的以下残基中的一者或多者来获得：R38、F42、K43、Y45、E62、P65、E68、V69和L72(氨基酸残基编号参考SEQ ID NO:404中所示的成熟IL-2多肽)。
野生型成熟人IL-2蛋白和缺乏前三个残基APT的野生型成熟IL-2p蛋白质片段分别示于以下SEQ ID NO:404和405中：
野生型成熟人IL-2
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:404)
野生型成熟IL-2p：
SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:405)
示例性IL2v(在本文中在实施例中也称为IL2v)可具有如下所示的具有五个氨基酸取代T3A、F42A、Y45A、L72G和C125A的野生型IL-2的氨基酸，任选地进一步缺失三个N末端残基APA：
APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT(SEQ ID NO:406)
少至一个或两个突变可降低与IL-2Rα和L-2Rβ的结合。例如，如在本文的多特异性蛋白质中举例说明的，在野生型IL-2p氨基酸序列中具有两个氨基酸取代R38A和F42K的IL2v多肽显示出与IL-2Rα的合适的降低的结合，其中保留了与IL-2Rβ的结合，从而产生高度活性的多特异性蛋白质，在本文中称为IL2v2。
IL2v2(R38A/F42K取代)：
SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:407)
在一个实施方案中，IL2v多肽具有如下所示的具有三个氨基酸取代R38A、F42K和T41A的野生型IL-2p氨基酸序列，本文称为IL2v3：
IL2v3(R38A/T41A/F42K取代)：
SSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLAKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:408)
因此，在一个实施方案中，与人野生型IL-2多肽相比，IL2变体包含至少一个或至少两个氨基酸修饰(例如，取代、插入、缺失)。在一个实施方案中，与人野生型IL-2多肽相比，IL2v包含R38取代(例如，R38A)和F42取代(例如，F42K)。在一个实施方案中，与人野生型IL-2多肽相比，IL2v包含R38取代(例如，R38A)、F42取代(例如，F42K)和T41取代(例如，T41A)。在一个实施方案中，与人野生型IL-2多肽相比，IL2v包含T3取代(例如，T3A)、F42取代(例如，F42A)、Y45取代(例如，Y45A)、L72取代(例如，L72G)和C125取代(例如，C125A)。任选地，IL2v包含与SEQ ID NO:404-409的多肽相同或至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。任选地，IL2v包含人IL-2多肽的片段，其中该片段具有与SEQ IDNO:404-409的多肽的40个、50个、60个、70个或80个氨基酸的连续序列相同或至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列。
可修改这些位置的任何组合。在一些实施方案中，IL-2变体包含两个或更多个修饰。在一些实施方案中，IL-2变体包含三个或更多个修饰。在一些实施方案中，IL-2变体包含四个、五个或六个或更多个修饰。
IL2变体多肽可例如包含两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸修饰(例如，取代)。例如，美国专利号5,229,109(其公开内容以引用方式并入本文)提供了具有R38A和F42K取代的人IL2多肽。美国专利号9,447,159(其公开内容以引用方式并入本文)描述了具有取代T3A、F42A、Y45A和L72G取代的人IL2多肽。美国专利号9,266,938(其公开内容以引用方式并入本文)描述了在残基L72(例如，L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R和L72K)、残基F42(例如，F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R和F42K)；和在残基Y45(例如，Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R和Y45K)处具有取代的人IL2多肽，包括例如降低或消除对IL-2Rα受体的亲和力的三突变F42A/Y45A/L72G。更进一步，WO2020/057646(其公开内容以引用方式并入本文)涉及包含氨基酸残基K35、T37、R38、F42、Y45、E61和E68中不同组合的氨基酸取代的IL-2v多肽的氨基酸序列。更进一步，WO2020252418(其公开内容以引用方式并入本文)涉及具有至少一个氨基酸残基位置R38、T41、F42、F44、E62、P65、E68、Y107或S125被另一个氨基酸取代的IL-2v多肽的氨基酸序列，例如其中该氨基酸取代选自：位置19处的L19D、L19H、L19N、L19P、L19Q、L19R、L19S、L19Y的取代，位置38处的R38A、R38F、R38G的取代，位置41处的T41A、T41G和T41V的取代，位置42处的F42A的取代，位置44处的F44G和F44V的取代，位置62处的E62A、E62F、E62H和E62L的取代，位置65处的P65A、P65E、P65G、P65H、P65K、P65N、P65Q、P65R的取代，位置68处的E68E、E68F、E68H、E68L和E68P的取代，位置107处的Y107G、Y107H、Y107L和Y107V的取代，以及位置125处的S125I的取代，位置126处的Q126E的取代。位置的编号是相对于野生型成熟人IL-2。
与野生型人IL-2多肽(例如，包含SEQ ID NO:404的氨基酸序列)相比，可将经修饰的IL-2任选地指定为表现出与CD25结合或与CD25:CD122:CD132复合物结合的KD降低至少1-log，任选地至少2-log，任选地至少3-log。与野生型人IL-2多肽相比，可将经修饰的IL-2任选地指定为对CD25或对CD25:CD122:CD132复合物表现出小于20％、30％、40％或50％的结合亲和力。与野生型人IL-2多肽相比，可将IL2任选地指定为对CD122或对CD122:CD132复合物表现出至少50％、70％、80％或90％的结合亲和力。在一些实施方案中，与野生型人IL-2多肽相比，IL2对CD122或对CD122:CD132复合物表现出至少50％、60％、70％或80％但小于100％的结合亲和力。在一些实施方案中，与野生型IL-2多肽相比，IL2v对CD25表现出小于50％的结合亲和力并且对CD122表现出至少50％、60％、70％或80％的结合亲和力。
野生型和所公开的突变体多肽对CD25和CD122以及它们的复合物的结合亲和力的差异可例如在本领域技术人员熟悉的测量蛋白质-蛋白质相互作用的亲和力的标准表面等离子共振(SPR)测定中测量。
相对于具有SEQ ID NO:404的氨基酸序列的野生型成熟IL-2多肽，示例性IL2变体多肽具有一个或多个、两个或更多个、或三个或更多个降低CD25亲和力的氨基酸取代。在一个实施方案中，示例性IL2v多肽包含选自下组的一个或多个、两个或更多个、或者三个或更多个取代的残基：Q11、H16、L18、L19、D20、D84、S87、Q22、R38、T41、F42、K43、Y45、E62、P65、E68、V69、L72、D84、S87、N88、V91、I92、T123、Q126、S127、I129和S130。
在一个实施方案中，示例性IL2变体多肽具有被另一个氨基酸取代的氨基酸残基位置R38、T41、F42、F44、E62、P65、E68、Y107或S125中的一者、两者、三者、四者、五者或更多者。
在一个实施方案中，对CD25或包含其的蛋白质复合物(例如，CD25:CD122:CD132复合物)的降低的亲和力可通过取代野生型成熟IL-2多肽序列中的以下残基中的一者或多者来获得：R38、F42、K43、Y45、E62、P65、E68、V69和L72。
在一个实施方案中，CD122 ABD或IL-2多肽是IL-2模拟多肽。合成IL-2/IL-15多肽模拟物可经计算被设计成与CD122结合，但不与CD25结合，例如如以下中所述：Silva等人，2019年，Nature，第565卷第7738期：第186-191页以及WO2020/005819(这些文献和专利的公开内容以引用方式并入本文)，还提供了结合CD122但不结合CD25的IL-2和IL-15模拟多肽。
例如，IL-2模拟多肽可被表征为包含结构域X1、X2、X3和X4的非天然存在的多肽，其中：
(a)X1是包含与EHALYDAL(SEQ ID NO:409)至少85％相同的氨基酸序列的肽；
(b)X2是长度为至少8个氨基酸的螺旋肽；
(c)X3是包含与YAFNFELI(SEQ ID NO:410)至少85％相同的氨基酸序列的肽；
(d)X4是包含与ITILQSWIF(SEQ ID NO:411)至少85％相同的氨基酸序列的肽；
其中X1、X2、X3和X4在多肽中可以是任何顺序，
其中氨基酸接头可存在于任何结构域之间，并且其中多肽与CD122(或与CD122:CD132异源二聚体)结合。任选地，多肽以200nM或更小、100nM或更小、50nM或更小、或25nM或更小的结合亲和力结合CD122:CD132异源二聚体。
在一个方面，本发明提供了包含结构域X1、X2、X3和X4的非天然存在的多肽，其中：
(a)X1是包含氨基酸序列EHALYDAL(SEQ ID NO:409)的肽；
(b)X2是长度为至少8个氨基酸的螺旋肽；
(c)X3是包含氨基酸序列YAFNFELI(SEQ ID NO:410)的肽；
(d)X4是包含氨基酸序列ITILQSWIF(SEQ ID NO:411)的肽；
其中X1、X2、X3和X4在多肽中可以是任何顺序，
其中氨基酸接头可存在于任何结构域之间，并且其中多肽与CD122(或与CD122:CD132异源二聚体)结合。任选地，多肽以200nM或更小、100nM或更小、50nM或更小、或25nM或更小、任选地介于约1nm至约100nm之间、任选地介于约10nM至约200nM之间、任选地介于约10nM至约100nM之间、任选地介于约15nM至约100nM之间的结合亲和力结合CD122:CD132异源二聚体。
在一个示例中，X1、X3和X4可以是任何合适的长度，这意味着每个结构域可分别包含除SEQ ID NO:409、410和411的肽之外的任何合适数量的附加氨基酸。在一个实施方案中，X1是包含沿其长度与肽PKKKIQLHAEHALYDALMILNI(SEQ ID NO:412)至少25％、27％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列的肽；X3是包含沿其长度与氨基酸序列LEDYAFNFELILEEIARLFESG(SEQ ID NO:413)至少25％、27％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列的肽；X4是包含沿其长度与氨基酸序列EDEQEEMANAIITILQSWIFS(SEQ ID NO:414)至少25％、27％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列的肽。
在一个示例中，经计算设计的合成IL-2多肽或模拟物(或CD122 ABD)包含以下所示的氨基酸序列(neoleukin)(具有或不具有(GS4)3结构域接头：
PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS(SEQ ID NO:415)
或
GSSSSGSSSSGSSSSPKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS(SEQ ID NO:416)。
在其他示例中，IL-2多肽通过将其与一种或多种其他附加化合物、化学化合物、聚合物(例如，PEG)或导致与CD25的结合降低的多肽或多肽链连接、融合、结合或缔合来修饰。例如，野生型IL-2多肽或其片段可通过将其与CD25结合肽或多肽结合来修饰，包括但不限于与人IL-2的结合CD25的位点结合或相互作用的抗IL-2单克隆抗体或其抗体片段，从而降低与CD25的结合。
在一个示例中，IL-2进一步包含受体结构域，例如，细胞因子受体结构域。在一个实施方案中，细胞因子分子包含IL-2受体或其片段(例如，IL-2受体α的IL-2结合结构域)。在一个示例中，CD25衍生多肽与IL-2多肽融合，如Lopes等人，J Immunother Cancer.，2020年，第8卷第1期中所述，其公开内容以引用方式并入本文。在一个示例中，IL-2是包含与CD25多肽融合的循环排列(cp)IL-2的变体融合蛋白(参见例如，PCT公开号WO2020/249693，其公开内容以引用方式并入本文)。其中CD122 ABD包含与CD25多肽融合的循环排列(cp)IL-2，ABD可包含在PCT公开号WO2013/184942(其公开内容以引用方式并入本文)中所述的cpIL-2:IL-2Ra多肽或蛋白质。例如，与CD25多肽融合的排列(cp)IL-2变体可具有氨基酸序列：
SKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQ
SIISTLTGGSS
STKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELK
HLQCLEEELK
PLEEVLNLAQGSGGGSELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRG
FRRIKSGSLY
MLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPM
QPVDQASLP
GHCREPPPWENEATERIYHFWGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWT QPQLICTG(SEQID NO:417)，或在SEQ ID NO:417的约20个氨基酸直至全长的连续段上具有约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一个示例中，IL-2与特异性抗IL-2单克隆抗体(mAb)缔合，从而形成IL-2/抗IL-2mAb复合物(IL-2cx)。此类复合物已经示出克服了CD25结合(Boyman等人，Science，第311卷，第1924-1927页，2006年。示例性抗IL2抗体是抗体NARA1。PCT公开号WO2017/122130(其公开内容以引用方式并入本文)描述了融合蛋白，其中柔性接头用于将IL-2连接至NARA1的轻链或重链的可变区。Sahin等人(Nature Communications，第11卷，文章号：6440(2020年))描述了一种改善的构建体，其中使IL-2与NARA1的轻链的互补决定区1(L-CDR1)接触并结合，这产生了一种蛋白质复合物，其中IL-2与抗体片段(或该片段的多肽链)上的其结合抗原的沟结合。
在其他示例中，IL-2多肽或其片段可通过与感兴趣的部分(例如，化合物、化学化合物、聚合物、直链或支链PEG聚合物)结合来修饰，该感兴趣的部分与天然氨基酸或与安装在所选位置的非天然氨基酸共价连接。这种经修饰的白介素2(IL-2)多肽可在多肽上降低经修饰的IL-2多肽和CD25之间的结合但保留对CD122:CD132信号传导复合物的显著结合的位置处包含至少一个非天然氨基酸，其中将对CD25的降低的结合与野生型IL-2多肽和CD25之间的结合相比。非天然氨基酸可定位在IL-2的残基K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E60、E61、E62、K64、P65、E68、V69、N71、L72、M104、C105和Y107中的任一者或多者处。如PCT公开号WO2019/028419和WO2019/014267(其公开内容以引用方式并入本文)中所公开的，非天然氨基酸可通过正交tRNA合成酶/tRNA对掺入到经修饰的IL-2多肽中。非天然氨基酸可例如包含赖氨酸类似物、芳族侧链、叠氮基团、炔基团、或醛或酮基团。经修饰的IL-2多肽然后可通过非天然氨基酸与水溶性聚合物、脂质、蛋白质或肽共价连接。合适的聚合物的示例包括聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化的多羟基化合物)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)、聚(糖)、聚(α-羟酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉)或它们的组合，或多糖诸如葡聚糖、多唾液酸(PSA)、透明质酸(HA)、直链淀粉、肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、葡聚糖或羟乙基淀粉(HES)。
在一些示例中，示例性IL2v/非αIL-2缀合物可包含IL-2多肽的全长或片段，其中IL-2多肽中的氨基酸残基(例如，选自K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69和L72的位置处的残基)被经由化学接头连接到聚合物上的天然或非天然氨基酸残基取代。聚合物可以是PEG聚合物，例如具有选自5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa和60kDa的平均分子量的PEG基团。
经修饰的IL2多肽可在多肽上降低经修饰的IL-2多肽和CD25之间的结合但保留与CD122:CD132信号传导复合物的显著结合以形成CD122:CD132复合物的位置处包含至少一个非天然氨基酸，其中将对CD25的降低的结合与野生型IL-2多肽和CD25之间的结合相比示例性Il2v/非αIL-2缀合物是THOR-707(Synthorx inc)。
例如，如PCT公开号WO2020/163532(其公开内容以引用方式并入本文)中所述，IL-2缀合物中的氨基酸残基被式(I)的结构取代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是
或者，
Y是CH2并且Z是
并且其中，W是具有选自5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa和60kDa的平均分子量的PEG基团；并且
X具有以下结构：
在一个实施方案中，IL-2包含可释放聚合物(例如，可释放PEG聚合物)，例如，IL-2与可释放聚合物缀合、连接或结合，这导致体内和/或体外CD25结合降低。这种经修饰的IL-2的示例包括Bempegaldesleukin或RSLAIL-2(Nektar Therapeutics inc.)，其对CD25的亲和力相对于IL-2降低至约1/60，但对CD122的亲和力相对于IL-2仅降低到约1/5。“Bempegaldesleukin”(CAS号1939126-74-5)是一种IL-2，其中人白介素-2(des-1-丙氨酸，125-丝氨酸)在其氨基残基处被平均六个[(2,7-双{[甲基聚(氧乙烯)iokD]氨基甲酰基}-9H-芴-9-基)甲氧基]羰基部分N-取代。如PCT公开号WO2020/095183(其公开内容以引用方式并入本文)中所公开的，所包含的可释放PEG可基于2,7,9-取代的芴，具有经由酰胺键(芴-C(0)-NH～)从芴环上的2和7位延伸的聚(乙二醇)链，并且经由连接到经由亚甲基(-CH2-)连接到芴环的9位的氨基甲酸酯氮原子而与IL-2具有可释放共价连接。经修饰的IL-2可包含由下式所涵盖的化合物：
其中每个“n”，CH2CH2O单元的数量)是约3至约4000的整数，或更优选地是约200至300的整数。“m”，是指与IL-2连接的聚乙二醇部分的数量，是选自1、2、3、7和大于7的整数。在一些实施方案中，每个“n”大致相同，即共价连接至芴基核上的每个聚乙二醇“臂”的重均分子量大致相同。任选地，每个PEG臂的重均分子量为约10,000道尔顿，使得整个支化聚合物部分的重均分子量为约20,000道尔顿。
在另一个实施方案中，在结合细胞因子的ABD是结合CD122的ABD的情况下，ABD可以是或包含合适的白介素-15(IL-15)多肽，使得CD122 ABD结合CD122。在一些实施方案中，细胞因子分子是IL-15分子，例如IL-15(例如，人IL-15)的全长、片段或变体(IL-15v)。在一些实施方案中，IL-15分子包含野生型人IL-15氨基酸序列，例如，具有SEQ ID NO:418的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-15分子包含与SEQ ID NO:418的成熟野生型人IL-15氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列。在其他实施方案中，IL-15分子是人IL-15的变体，例如，具有一个或多个氨基酸修饰。任选地，IL-15包含人IL-15多肽的片段，其中该片段具有与SEQ ID NO:418的野生型成熟人IL-15多肽的40个、50个、60个、70个或80个氨基酸的连续序列相同或至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列。
野生型成熟人IL-15：
NW VNVISDLKKI EDLIQSMHID ATLYTESDVH PSCKVTAMKCFLLELQVISL ESGDASIHDTVENLIILANN SLSSNGNVTE SGCKECEELEEKNIKEFLQS FVHIVQMFIN TS(SEQ ID NO:418)
在一些实施方案中，IL-15变体在位置45、51、52或72处包含修饰(例如，取代)(参考人IL-15的序列，SEQ ID NO:418)，例如如US 2016/0184399中所述。在一些实施方案中，IL-15变体包含四个、五个或六个或更多个修饰。在一些实施方案中，IL-15变体在氨基酸位置8、10、61、64、65、72、101或108(参考人IL-15的序列，SEQ ID NO:418)处包含一个或多个修饰。在一些实施方案中，与野生型IL-15相比，IL-15变体对CD122具有增加的亲和力。在一些实施方案中，与野生型IL-15相比，IL-15变体对CD122具有降低的亲和力。在一些实施方案中，突变选自D8N、K10Q、D61N、D61H、E64H、N65H、N72A、N72H、Q101N、Q108N或Q108H(参考人IL-15的序列，SEQ ID NO:418)。可突变这些位置的任何组合。在一些实施方案中，IL-15变体包含两个或更多个突变。在一些实施方案中，IL-15变体包含三个或更多个突变。在一些实施方案中，IL-15变体包含四个、五个或六个或更多个突变。在一些实施方案中，IL-15变体在位置61和64处包含突变。在一些实施方案中，位置61和64处的突变是D61N或D61H和E64Q或E64H。在一些实施方案中，IL-15变体在位置61和108处包含突变。在一些实施方案中，位置61和108处的突变是D61N或D61H和Q108N或Q108H。
IL-15Rα的细胞外结构域包含被称为sushi结构域的结构域，其结合IL-15。一般sushi结构域，也称为补体控制蛋白(CCP)模块或短共有重复序列(SCR)，是在几种蛋白质(包括补体系统的多个成员)中发现的蛋白质结构域。sushi结构域采用β-夹心折叠，其由四个高度保守的半胱氨酸残基的第一个和第四个半胱氨酸界定，包含大约60个氨基酸的序列延伸(Norman、Barlow等人，J Mol Biol.，1991年，第219卷第4期：第717-25页)。由sushi结构域IL-15Rα的第一个和第四个半胱氨酸结合的氨基酸残基包含被称为最小结构域的62个氨基酸的多肽。在最小sushi结构域的N和C末端处包括IL-15Rα的附加氨基酸，诸如包括N末端Ile和Thr以及C末端Ile和Arg残基导致65个氨基酸延伸的sushi结构域。
CD122 ABD可进一步包含受体结构域，例如，细胞因子受体结构域。在一个实施方案中，细胞因子分子包含IL-15受体或其片段(例如，IL-15受体α的IL-15结合结构域)。
在一些实施方案中，CD122 ABD结合IL-15受体α(IL-15Rα)sushi结构域、第一结构域接头和IL-15多肽，例如从N至C末端，IL-15Rαsushi结构域与结构域接头融合，继而与IL-15多肽融合。任选地，IL-15多肽是变体IL-15多肽，例如，包含一个或多个氨基酸取代。在其他实施方案中，变体IL-15结构域包含SEQ ID NO:418的氨基酸序列和选自N4D/N65D、D30N/N65D和D30N/E64Q/N65D的氨基酸取代。
相对于野生型sushi结构域，本文所述的sushi区域可包含一个或多个突变。在一些实施方案中，IL-l5Rαsushi结构域包含氨基酸序列：ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKAT NVAHWTTPSLKCIR(SEQ ID NO:419)
IL-15多肽可通过使用几种已知技术中的任一种将其与一种或多种其他附加化合物连接、融合、结合或缔合，例如通过与导致与IL-15Rα的结合降低的化学化合物、聚合物(例如PEG)或多肽或多肽链缀合或结合来修饰。在一个示例中，野生型IL-15多肽或其片段可通过将其与IL-15Rα结合肽或多肽结合来修饰，包括但不限于与人IL-15的结合IL-15Rα的位点结合或相互作用的抗IL-15单克隆抗体或其抗体片段，从而降低与IL-15Rα的结合。
在另一个示例中，IL-15多肽或其片段可通过与感兴趣的部分(例如，化合物、化学化合物、聚合物、直链或支链PEG聚合物)结合来修饰，该感兴趣的部分与安装在所选位置的新型氨基酸共价连接。这种经修饰的IL-15多肽可在多肽上降低经修饰的IL-15多肽和IL-15Rα之间的结合但保留与CD122:CD132信号传导复合物的显著结合以形成CD122:CD132复合物的位置处包含至少一个非天然氨基酸，其中将对IL-15Rα的降低的结合与野生型IL-15多肽和IL-15Rα之间的结合相比。非天然氨基酸可定位在IL-15的残基N1、W2、V3、N4、16、S7、D8、K10、K11、E13、D14、L15、Q17、S18、M19、H20、121、D22、A23、T24、L25、Y26、E28、S29、D30、V31、H32、P33、S34、C35、K36、V37、T38、K41、L44、E46、Q48、V49、S51、L52、E53、S54、G55、D56、A57、S58、H60、D61、T62、V63、E64、N65、I67、I68、L69、N71、N72、S73、L74、S75、S76、N77、G78、N79、V80、T81、E82、S83、G84、C85、K86、E87、C88、E89、E90、L91、E92、E93、K94、N95、196、K97、E98、L100、Q101、S102、V104、H105、Q108、M109、F110、I111、N112、T113和S114中的任一者或多者处。如WO2019165453、WO2019/028419和WO2019/014267(其公开内容以引用方式并入本文)中所公开的，非天然氨基酸可通过正交tRNA合成酶/tRNA对掺入到经修饰的IL-2多肽中。非天然氨基酸可例如包含赖氨酸类似物、芳族侧链、叠氮基团、炔基团、或醛或酮基团。经修饰的IL-15多肽然后可通过非天然氨基酸与水溶性聚合物、脂质、蛋白质或肽共价连接。合适的聚合物的示例包括聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化的多羟基化合物)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)、聚(糖)、聚(α-羟酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉)或它们的组合，或多糖诸如葡聚糖、多唾液酸(PSA)、透明质酸(HA)、直链淀粉、肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、葡聚糖或羟乙基淀粉(HES)。
例如，如WO2020/163532(其公开内容以引用方式并入本文)中所述，IL-15缀合物中的氨基酸残基被式(I)的结构取代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是
或者，
Y是CH2并且Z是
/>
并且其中，W是具有选自5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa和60kDa的平均分子量的PEG基团；并且
X具有以下结构：
在一个实施方案中，IL-15包含可释放聚合物(例如，可释放PEG聚合物)，例如，IL-15与可释放聚合物缀合、连接或结合，这导致体内和/或体外IL-15R结合降低。示例包括在PCT公开号WO2020/097556(其公开内容以引用方式并入本文)中公开的化合物。例如，经修饰的IL-15可包含具有以下结构的化合物：
其中(n)是约150至约3000的整数，(m)是选自2、3、4和5的整数，(n')是1，并且～NH～表示IL-15多肽的氨基基团。
在其中结合细胞因子的ABD与结合IL-21受体(IL-21R)ABD结合的另一个实施方案中，ABD可以是或包含合适的白介素-21(IL-21)多肽，使得IL-21R ABD结合NK细胞表面上的IL-21R。IL-21R在结构上类似于IL-2受体和IL-15受体，因为这些细胞因子受体的每一者都包含共同的γ链(γc)。在一些实施方案中，细胞因子分子是IL-21分子，例如IL-21(例如，人IL-21)的全长、片段或变体。在实施方案中，IL-21分子是野生型人IL-21，例如，具有SEQID NO:420的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-15分子包含与SEQ ID NO:420的成熟野生型人IL-21氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列。在其他实施方案中，IL-21分子是人IL-21的变体，例如，具有一个或多个氨基酸修饰。任选地，IL-21包含人IL-21多肽的片段，其中该片段具有与SEQ ID NO:420的多肽的40个、50个、60个、70个或80个氨基酸的连续序列相同或至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列。
野生型成熟人IL-21：
HKSSSQ GQDRHMIRMR QLIDIVDQLK NYVNDLVPEFLPAPEDVETN CEWSAFSCFQKAQLKSANTG NNERIINVSI KKLKRKPPSTNAGRRQKHRL TCPSCDSYEK KPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSE DS(SEQ ID NO:420)
在一些实施方案中，IL-21变体可包含IL-21多肽，该多肽包含一个或多个氨基酸突变，该一个或多个氨基酸突变被设计成降低其与人IL-21R结合的能力，同时保留结合人IL-21R的基本能力。例如，IL-21可被表征为以大于或为约0.04nM的KD与人IL-21R结合，如通过SPR测定的。
在PCT公开号WO2019028316(其公开内容以引用方式并入本文)中提供了此类IL-21变体的示例。在示例性方面，氨基酸取代位于根据SEQ ID NO:420的编号选自10、14、20、75、76、77、78和81的两个氨基酸位置处，或者在根据SEQ ID NO:421的氨基酸位置编号选自5、9、15、70、71、72、73和76的两个氨基酸位置处。在示例性方面，IL-21变体包含氨基酸序列：
QGQDX HMXXM XXXXX XVDXL KNXVN DLVPE FLPAP EDVET NCEWSAFSCF QKAQLKSANT GNNEX XIXXX XXXLX XXXXX TNAGR RQKHRLTCPS CDSYE KKPPK EFLXX FXXLL XXMXXQHXSS RTHGS EDS(SEQID NO:421)，
其中X表示任何氨基酸，并且其中IL-21变体氨基酸序列与人IL-21的氨基酸序列(SEQ ID NO:420)有至少1个氨基酸不同。
在示例性方面，IL-21变体包含SEQ ID NO:421的序列，其中SEQ ID NO:421与SEQID NO:420在SEQ ID NO:421中由X指定的位置处有至少一个氨基酸不同。在示例性方面，IL-21变体与SEQ ID NO:420具有至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或具有大于约90％(例如，约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％)序列同一性。
在示例性实施方案中，根据SEQ ID NO:420的氨基酸位置编号，相对于野生型IL-21氨基酸序列，IL-21变体在氨基酸序列的N末端半部分内，例如在位置10-30或13-28(包括两者)内的位置处包含氨基酸取代。在其他示例性实施方案中，根据SEQ ID NO:420的氨基酸位置编号，相对于野生型IL-21氨基酸序列，IL-21变体在氨基酸序列的C末端半部分内，例如在位置105-138或114-128(包括两者)内的位置处包含氨基酸取代。在其他示例性实施方案中，根据SEQ ID NO:420的氨基酸位置编号，相对于野生型IL-21氨基酸序列，IL-21变体在氨基酸序列的中间三分之一处，例如在位置60-90或70-85(包括两者)内的位置处包含氨基酸取代。
任选地，相对于野生型IL-21氨基酸序列，IL-21变体仅包含一个氨基酸取代。任选地，根据SEQ ID NO:420的氨基酸位置编号，氨基酸取代位于选自以下的氨基酸位置处：10、13、14、16、17、18、19、20、21、24、28、70、71、73、74、75、76、77、78、80、81、82、83、84、85、114、115、117、118、121、122、124、125或128。
在其中结合细胞因子的ABD与结合IL-18受体(IL-18Rα)ABD结合的另一个实施方案中，ABD可以是或包含合适的白介素-18(IL-18)多肽，使得IL-18R ABD结合NK细胞表面上的IL-18Rα。在一些实施方案中，细胞因子分子是IL-18分子，例如IL-18(例如，人IL-18)的全长、片段或变体。在实施方案中，IL-18分子是野生型人IL-18，例如，具有SEQ ID NO:422的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-18分子包含与SEQ ID NO:422的成熟野生型人IL-18氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列。在其他实施方案中，IL-18分子是人IL-18的变体，例如，具有一个或多个氨基酸修饰。任选地，IL-18包含人IL-18多肽的片段，其中该片段具有与SEQ ID NO:422的多肽的40个、50个、60个、70个或80个氨基酸的连续序列相同或至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列。
野生型成熟人IL-18：
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ ID NO:422)
在一个实施方案中，IL-18经修饰以降低其对IL-18BP的结合亲和力，同时基本上不降低对IL-18Rα的亲和力。例如，IL-18可包含修饰，诸如在不参与IL-18Rα结合的位置M51、S55、R104和/或N110处的氨基酸取代，任选地进一步与在K53和/或M60处的取代组合(位置参考野生型成熟IL-18氨基酸序列)。在一个实施方案中，IL-18具有M51S、S55A、R104Q、R104K或R104S和/或N110A取代。在一个实施方案中，IL-18包含K53S或K53A取代。在一个实施方案中，IL-18包含M60S或M60K取代。
在另一个实施方案中，结合细胞因子的ABD结合I型干扰素受体，例如干扰素-α受体(IFN-αR)。ABD可以是或包含合适的I型干扰素，例如干扰素-α(IFN-α)或干扰素-β(IFN-β)多肽，使得IFN-αABD结合NK细胞表面上的IFN-αR。干扰素-α受体也称为干扰素α/β受体(IFNAR)，它是由两个亚基IFNAR1和IFNAR2组成的异源二聚体跨膜受体。对于I型IFN，主要的STAT信号传导复合物由IFN刺激的基因因子3形成，该因子由STAT1、STAT2和IFN调节因子(IRF)-9组成。在一些实施方案中，细胞因子分子是IFN-α或IFN-β分子，例如IFN-α或IFN-β的全长、片段或变体，例如人IFN-α或IFN-β，例如人IFN-α1、IFN-α2、IFN-α4、IFN-α5、IFN-α6、IFN-α7、IFN-α8、IFN-α10、IFN-α12、IFN-α14、IFN-α16或IFN-α17多肽。在一些实施方案中，IFN-α或IFN-β分子是野生型人IFN-α或IFN-β，例如，具有SEQ ID NO:423-434中任一项的氨基酸序列。在其他实施方案中，IFN-α或IFN-β分子是人IFN-α或IFN-β的变体，例如，具有一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，IFN-α或IFN-β分子包含分别与SEQ ID NO:423-434的成熟野生型人IFN-α或IFN-β氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列。在其他实施方案中，IFN-α或IFN-β分子是人IFN-α或IFN-β的变体，例如，具有一个或多个氨基酸修饰。任选地，IFN-α或IFN-β包含人IFN-α或IFN-β多肽的片段，其中该片段具有与SEQ ID NO:423-434的多肽的40个、50个、60个、70个或80个氨基酸的连续序列相同或至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列。
野生型人IFN-α成熟蛋白质：
IFNα2
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKA
ETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQ
GVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE(SEQID NO:423)
IFNα1
CDLPETHSLDNRRTLMLLAQMSRISPSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQK
APAISVLHELIQQIFNLFTTKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACV
MQEERVGETPLMNADSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE(SEQ ID NO:424)
IFNα4
CDLPQTHSLGNRRALILLAQMGRISHFSCLKDRHDFGFPEEEFDGHQFQK
TQAISVLHEMIQQTFNLFSTEDSSAAWEQSLLEKFSTELYQQLNDLEACVI
QEVGVEETPLMNEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSFSTNLQKRLRRKD(SEQID NO:425)
IFNα5
CDLPQTHSLSNRRTLMIMAQMGRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQK
AQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSATWDETLLDKFYTELYQQLNDLEAC
MMQEVGVEDTPLMNVDSILTVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSANLQERLRRKE(SEQ ID NO:426)
IFNα6
CDLPQTHSLGHRRTMMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFRFPQEEFDGNQFQ
KAEAISVLHEVIQQTFNLFSTKDSSVAWDERLLDKLYTELYQQLNDLEAC
VMQEVWVGGTPLMNEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSSSRNLQERLRRKE(SEQ ID NO:427)
IFNα7
CDLPQTHSLRNRRALILLAQMGRISPFSCLKDRHEFRFPEEEFDGHQFQKT
QAISVLHEMIQQTFNLFSTEDSSAAWEQSLLEKFSTELYQQLNDLEACVIQ
EVGVEETPLMNEDFILAVRKYFQRITLYLMEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSFSTNLKKGLRRKD(SEQID NO:428)
IFNα8
CDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFEFPQEEFDDKQFQK
AQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSAALDETLLDEFYIELDQQLNDLESCV
MQEVGVIESPLMYEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSSCAWEVVRAEIMRSFSLSINLQKRLKSKE(SEQ ID NO:429)
IFNα10
CDLPQTHSLGNRRALILLGQMGRISPFSCLKDRHDFRIPQEEFDGNQFQKA
QAISVLHEMIQQTFNLFSTEDSSAAWEQSLLEKFSTELYQQLNDLEACVIQ
EVGVEETPLMNEDSILAVRKYFQRITLYLIERKYSPCAWEVVRAEIMRSLSFSTNLQKRLRRKD(SEQID NO:430)
IFNα14
CNLSQTHSLNNRRTLMLMAQMRRISPFSCLKDRHDFEFPQEEFDGNQFQ
KAQAISVLHEMMQQTFNLFSTKNSSAAWDETLLEKFYIELFQQMNDLEA
CVIQEVGVEETPLMNEDSILAVKKYFQRITLYLMEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSFSTNLQKRLRRKD(SEQ ID NO:431)
IFNα16
CDLPQTHSLGNRRALILLAQMGRISHFSCLKDRYDFGFPQEVFDGNQFQK
AQAISAFHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYIELFQQLNDLEACV
TQEVGVEEIALMNEDSILAVRKYFQRITLYLMGKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSFSTNLQKGLRRKD(SEQ ID NO:432)
IFNα17
CDLPQTHSLGNRRALILLAQMGRISPFSCLKDRHDFGLPQEEFDGNQFQK
TQAISVLHEMIQQTFNLFSTEDSSAAWEQSLLEKFSTELYQQLNNLEACVI
QEVGMEETPLMNEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSFSTNLQKILRRKD(SEQID NO:433)
在某些方面，IFN-α或IFN-β变体多肽具有分别与SEQ ID NO:423-434具有至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或具有大于约90％(例如，约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，野生型或经修饰的信号传导剂是对其受体(特别是IFNAR2)具有降低的结合亲和力的经修饰的干扰素-α。在此类实施方案中，经修饰的IFNα1、IFNα2、IFNα4、IFNα5、IFNα6、IFNα7、IFNα8、IFNα10、IFNα12、IFNα14、IFNα16或IFNα17试剂对IFNAR(IFNAR1和/或IFNAR2链)具有降低的亲和力和/或对该处的信号传导具有降低的诱导。
除野生型IFNα1外，野生型IFN以介于0.1nM至5nM之间的亲合力(KD)与IFNAR2结合，例如通过微量热技术(microcal)或SPR测定的，并且以约1μM的亲合力与IFNAR1结合。IFNα1以约200nM的KD与IFNAR2结合。在一些实施方案中，IFN经修饰以使其对IFNAR1和/或IFNAR2的亲和力等于或小于NKp46 ABD对NKp46的亲和力。在一些实施方案中，IFN经修饰以使其对IFNAR1和/或IFNAR2的亲和力比NKp46 ABD对NKp46的亲和力低至少1-log。
例如，在本文所示的示例性NKp46 ABD中，NKp46 ABD对NKp46结合的KD为约15nM。因此，可通过引入导致结合亲和力降低到介于1/10(1-log)至1/1000(3-log)之间(KD增加介于1-log至3-log之间)的修饰来修饰IFN。IFN可包括下表中所示的任何氨基酸取代。下表示出了降低IFN-α多肽与IFNAR2的结合亲和力的示例性单氨基酸取代，与野生型对应物相比亲和力降低(更高的KD)至少1log，并且与野生型对应物相比不超过3log。该表示出了与野生型细胞因子相比，突变细胞因子对IFNAR2的基于KD值的相对亲和力。
下表示出降低IFN-α多肽与IFNAR1的结合亲和力的示例性单氨基酸取代，其中亲和力降低到至少1/2。该表示出了与野生型细胞因子相比，突变细胞因子对IFNAR1的基于KD值的相对亲和力。
IFNα2的突变体格式也在例如PCT公开号WO2008/124086、WO2010/030671、WO2013/059885、WO2013/107791、WO2015/007520和WO2020/198661中所述，其公开内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，所述IFNα2突变体(IFNα2a或IFNα2b)在位置144-154的一个或多个氨基酸处突变，诸如氨基酸位置148、149和/或153。在一些实施方案中，IFNα2突变体包含选自WO2013/107791中所述的L153A、R149A和M148A的一个或多个突变。在一些实施方案中，IFNα2突变体对IFNAR1具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，IFNα2突变体包含选自F64A、N65A、T69A、L80A、Y85A和Y89A的一个或多个突变，如WO2010/030671中所述。在一些实施方案中，IFNα2突变体包含选自如WO2008/124086中所述的K133A、R144A、R149A和L153A的一个或多个突变。在一些实施方案中，IFNα2突变体包含选自如WO2015/007520和WO2010/030671中所述的R120E和R120E/K121E的一个或多个突变。在一个实施方案中，突变体人IFNα2包含与SEQ ID NO:423具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中突变体IFNα2在相对于SEQ ID NO:423的位置L15、A19、R22、R23、L26、F27、L30、L30、K31、D32、R33、H34、D35、Q40、H57、E58、Q61、F64、N65、T69、L80、Y85、Y89、D 114、L117、R120、R125、K 133、K 134、R144、A145、M 148、R149、S152、L153和N156处具有一个或多个突变。在一些实施方案中，人IFNα2突变体包含选自如WO 2013/059885中所公开的L15A、A19W、R22A、R23A、L26A、F27A、L30A、L30V、K31A、D32A、R33K、R33A、R33Q、H34A、D35A、Q40A、T106A、T106E、D114R、L117A、R120A、R125A、K134A、R144A、A145G、A145M、M148A、R149A、S152A、L153A和N156A的一个或多个突变，例如在一些实施方案中，人IFNα2突变体包含突变H57Y、E58N、Q61S和/或L30A；突变H57Y、E58N、Q61S和/或R33A；突变H57Y、E58N、Q61S和/或M148A；突变H57Y、E58N、Q61S和/或L153A；突变N65A、L80A、Y85A和/或Y89A；或突变N65A、L80A、Y85A、Y89A和/或D114A。
在实施方案中，野生型或经修饰的信号传导剂是对其受体(特别是IFNAR2)具有降低的结合亲和力的经修饰的干扰素-α。在此类实施方案中，经修饰的IFNα2试剂对IFNAR(IFNAR1和/或IFNAR2链)具有降低的亲和力和/或对该处的信号传导具有降低的诱导。
在一些实施方案中，IFNα1干扰素经修饰以参考SEQ ID NO:424在位置L15、A19、R23、S25、L30、D32、R33、H34、Q40、C86、D115、L118、K121、R126、E133、K134、K135、R145、A146、M149、R150、S153、L154和N157处的一个或多个氨基酸处具有突变。突变可任选地是疏水突变，并且可例如选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。在一些实施方案中，FNα1干扰素经修饰以参考SEQ ID NO:424具有选自L15A、A19W、R23A、S25A、L30A、L30V、D32A、R33K、R33A、R33Q、H34A、Q40A、C86S、C86A、D115R、L118A、K121A、K121 E、R126A、R126E、E133A、K134A、K135A、R145A、R145D、R145E、R145G、R145H、R145I、R145K、R145L、R145N、R145Q、R145S、R145T、R145V、R145Y、A146D、A146E、A146G、A146H、A146I、A146K、A146L、A146M、A146N、A146Q、A146R、A146S、A146T、A146V、A146Y、M149A、M149V、R150A、S153A、L154A和N157A的一个或多个突变。在一些实施方案中，FNα1突变体包含参考SEQ ID NO:424选自L30A/H58Y/E59N/Q62S 、 R33A/H58Y/E59N/Q62S 、M149A/H58Y/E59N/Q62S 、 L154A/H58Y/E59N/Q62S、R145A/H58Y/E59N/Q62S、D115A/R121A、L118A/R121A、L118A/R121A/K122A、R121A/K122A和R121 E/K122E的一个或多个多重突变。在一些实施方案中，IFN-α1是包含减少不期望的二硫化物配对的一个或多个突变的变体，其中该一个或多个突变例如在参考SEQ ID NO:424的氨基酸位置C1、C29、C86、C99或C139处。在一些实施方案中，位置C86处的突变可以是例如C86S或C86A或C86Y。
在实施方案中，野生型或经修饰的信号传导剂是IFN-β。在一些实施方案中，IFN-β是具有如下所示序列的人：
MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQ
FQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKT
VLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN(SEQ ID NO:434)。
在一些实施方案中，人IFN-β是具有Met-1缺失和Cys-17至Ser突变的非糖基化格式的人IFN-β。在各种实施方案中，经修饰的IFN-β具有降低其与IFNAR的IFNAR1亚基的结合或对其亲和力的一个或多个突变。在一个实施方案中，经修饰的IFN-β对IFNAR1具有降低的亲和力和/或活性。在不同的实施方案中，经修饰的IFN-β是人IFN-β并且在位置F67、R71、L88、Y92、195、N96、K123和R124处具有一个或多个突变。在一些实施方案中，该一个或多个突变是选自F67G、F67S、R71A、L88G、L88S、Y92G、Y92S、I95A、N96G、K123G和R124G的取代。
在一些实施方案中，经修饰的IFN-β具有降低其与IFNAR的IFNAR2亚基的结合或对其亲和力的一个或多个突变。在一个实施方案中，经修饰的IFN-β对IFNAR2具有降低的亲和力和/或活性。在不同的实施方案中，经修饰的IFN-β是人IFN-β并且在位置W22、R27、L32、R35、V148、L151、R152和Y155处具有一个或多个突变。在一些实施方案中，该一个或多个突变是选自W22G、R27G、L32A、L32G、R35A、R35G、V148G、L151G、R152A、R152G和Y155G的取代。
示例性IFN-β突变描述于PCT公开号WO2020/198661、WO2000/023114和US20150011732中，其公开内容以引用方式并入本文。
在其中结合细胞因子的ABD与结合IL-7受体(IL-7R)的ABD结合的另一个实施方案中，ABD可以是或包含合适的白介素-7(IL-7)多肽，使得IL-7R ABD结合NK细胞表面上的IL-7Rα。在一些实施方案中，细胞因子分子是IL-7分子，例如IL-7的全长、片段或变体，例如人IL-7。在实施方案中，IL-7分子是野生型人IL-7，例如，具有SEQ ID NO:435的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-7分子包含与SEQ ID NO:435的成熟野生型人IL-7氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列。在其他实施方案中，IL-7分子是人IL-7的变体，例如，具有一个或多个氨基酸修饰。任选地，IL-7包含人IL-7多肽的片段，其中该片段具有与SEQ ID NO:435的多肽的40个、50个、60个、70个或80个氨基酸的连续序列相同或至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列。野生型成熟人IL-7：
DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDAN
KEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGR
KPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH(SEQ ID NO:435)。
野生型IL-7以例如通过微量热技术或SPR测定的介于约50nM至100nM之间的亲和力(KD)与IL-7Rα结合。在一些实施方案中，IL-7经修饰以使其对IL-7Rα的亲和力等于或小于NKp46对NKp46 ABD的亲和力。在一些实施方案中，IL-7经修饰以使其对IL-7Rα的亲和力比NKp46 ABD对NKp46的亲和力小至少1-log。在一些实施方案中，IL-7经修饰以使其对IL-7Rα的亲和力比NKp46 ABD对NKp46的亲和力小至少1-log，但比NKp46 ABD对NKp46的亲和力小不超过3-log，或任选地不超过2-log。例如，在本文所示的示例性NKp46 ABD中，NKp46ABD对NKp46结合的KD为约15nM。因此，可通过引入导致IL-7和IL-7Rα之间的亲和力降低的修饰诸如氨基酸取代Q22A、D74A和/或K81A(参考野生型成熟IL-7氨基酸序列)来修饰IL-7。
在其中结合细胞因子的ABD与结合IL-27受体(IL-27R)的ABD结合的另一个实施方案中，ABD可以是或包含合适的白介素-27(IL-27)多肽，使得IL-27R ABD结合NK细胞表面上的IL-27R(WSX-1和/或gp130)。在一些实施方案中，细胞因子分子是IL-27分子，例如包含P28和EBI3亚基的全长、片段或变体，例如包含P28和EBI3亚基的人单链或异源二聚体IL-27，任选地其中IL-27的EBI3和p28亚基通过结构域接头(例如，柔性多肽接头、含有甘氨酸、丝氨酸残基的接头、(G4S)2或(G4S)3接头)连接成单链格式。可产生单链格式的IL-27，其由p28亚基和EBI3亚基通过柔性接头连接而组成，通过p28的C末端连接至EBI3的N末端或反之亦然。在实施方案中，IL-27分子是野生型人IL-27，例如，包含SEQ ID NO:436和437的氨基酸序列或SEQ ID NO:436和437中的任一者的结合IL27R的片段的单链融合产物或异源二聚体。在一些实施方案中，IL-27分子包含与SEQ ID NO:436的成熟野生型人IL-27p28亚基氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列和/或与SEQ ID NO:437的成熟野生型人IL-27EBI3亚基氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列。在其他实施方案中，IL-27分子是人IL-27的变体，例如，具有一个或多个氨基酸修饰。任选地，IL-27包含人IL-27p28亚基多肽的片段，其中该片段具有与SEQ ID NO:436的多肽的40个、50个、60个、70个或80个氨基酸的连续序列相同或至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列，和/或人IL-27EBI3亚基多肽的片段，其中该片段具有与SEQID NO:437的多肽的40个、50个、60个、70个或80个氨基酸的连续序列相同或至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列。可将p28亚基指定为在其N末端连接至多特异性蛋白质(或其NKp46 ABD)。可将EBI3亚基指定为在其N末端连接至p28亚基的C末端，任选地经由结构域接头，或可指定为置于与p28亚基缔合的单独多肽上。
野生型成熟人IL-27p28亚基：
FPRPPGRPQLSLQELRREFTVSLHLARKLLSEVRGQAHRFAESHLPGVNL
YLLPLGEQLPDVSLTFQAWRRLSDPERLCFISTTLQPFHALLGGLGTQGR
WTNMERMQLWAMRLDLRDLQRHLRFQVLAAGFNLPEEEEEEEEEEEEE
RKGLLPGALGSALQGPAQVSWPQLLSTYRLLHSLELVLSRAVRELLLLSKAGHSVWPLGFPTLSPQP(SEQ ID NO:436)
野生型成熟人IL-27EBI3亚基：
RKGPPAALTLPRVQCRASRYPIAVDCSWTLPPAPNSTSPVSFIATYRLGM
AARGHSWPCLQQTPTSTSCTITDVQLFSMAPYVLNVTAVHPWGSSSSFVP
FITEHIIKPDPPEGVRLSPLAERQLQVQWEPPGSWPFPEIFSLKYWIRYKRQ
GAARFHRVGPIEATSFILRAVRPRARYYVQVAAQDLTDYGELSDWSLPATATMSLGK(SEQ ID NO:437)
在一些实施方案中，IL-27经修饰以使其对WSX-1和/或gp130的亲和力等于或小于NKp46 ABD对NKp46的亲和力。在一些实施方案中，IL-27经修饰以使其对WSX-1和/或gp130的亲和力比NKp46 ABD对NKp46的亲和力低至少1-log。在一些实施方案中，IL-27经修饰以使其对WSX-1和/或gp130的亲和力比NKp46 ABD对NKp46的亲和力小至少1-log，但比NKp46ABD对NKp46的亲和力小不超过3-log，或任选地不超过2-log。
在其中结合细胞因子的ABD与结合IL-12受体(IL-12R)的ABD结合的另一个实施方案中，ABD可以是或包含合适的白介素-12(IL-12)多肽，使得IL-12R ABD结合NK细胞表面上的IL-12R(IL-12Rβ1和/或IL-12Rβ2)。在一些实施方案中，细胞因子分子是IL-12分子，例如包含P35和P40亚基的全长、片段或变体，例如包含P35和P40亚基的人单链或异源二聚体IL-12，任选地其中IL-12的p40和p35亚基通过结构域接头(例如，柔性多肽接头、含有甘氨酸、丝氨酸残基的接头、(G4S)2或(G4S)3接头)连接成单链格式。可产生单链格式的IL-12，其由p35亚基和p40亚基通过柔性接头连接而组成，通过p35的C末端连接至p40的N末端或反之亦然。在实施方案中，IL-12分子是野生型人IL-12，例如，包含SEQ ID NO:438和439的氨基酸序列或SEQ ID NO:438或439中的任一者的结合IL12R的片段的单链融合产物或异源二聚体。在一些实施方案中，IL-12分子包含与SEQ ID NO:438的成熟野生型人IL-12p35亚基氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列和/或与SEQ ID NO:439的成熟野生型人IL-12p40亚基氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列。在其他实施方案中，IL-12分子是人IL-12的变体，例如，具有一个或多个氨基酸修饰。任选地，IL-12包含人IL-12p35亚基多肽的片段，其中该片段具有与SEQ ID NO:438的多肽的40个、50个、60个、70个或80个氨基酸的连续序列相同或至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列，和/或人IL-12p40亚基多肽的片段，其中该片段具有与SEQ IDNO:439的多肽的40个、50个、60个、70个或80个氨基酸的连续序列相同或至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基序列。可将p35(α)和P40(β)指定为通过P35亚基的Cys74和P40亚基的Cys177之间的二硫键连接。可将p35亚基指定为在其N末端连接至多特异性蛋白质(或其NKp46 ABD)。可将p40亚基指定为在其N末端连接至p35亚基的C末端，任选地经由结构域接头，或可指定为置于与p35亚基缔合的单独多肽上。
野生型成熟人IL-12p35亚基：
RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS(SEQ ID NO:438)
野生型成熟人IL-12p40亚基：
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS(SEQ ID NO:439)
野生型IL-12二聚体与IL-12Rβ1和IL-12Rβ2结合，其中亲和力(KD)(例如通过微量热技术或SPR测定的)分别为约5nM至7nM和5nM，并且IL-12二聚体与IL12Rβ1:IL-12Rβ2二聚体结合，其中KD为约50pM。在一些实施方案中，IL-12经修饰以使其对IL-12Rβ1和/或IL-12Rβ2的亲和力等于或小于NKp46 ABD对NKp46的亲和力。在一些实施方案中，IL-12经修饰以使其对IL-12Rβ1和/或IL-12Rβ2的亲和力比NKp46 ABD对NKp46的亲和力低至少1-log。在一些实施方案中，IL-12经修饰以使其对IL-12Rβ1和/或IL-12Rβ2的亲和力比NKp46对NKp46 ABD的亲和力低至少1-log(高1-log的KD)，但比NKp46对NKp46 ABD的亲和力低不超过3-log，或任选地不超过2-log。
NKp46可变区和CDR序列
在一些实施方案中，多特异性蛋白质或其NKp46 ABD(或ABD所来源的抗NKp46抗体)结合NKp46的D1结构域、NKp46的D2结构域，或结合SEQ ID NO:1的NKp46多肽的跨越D1和D2结构域的区域(在D1和D2结构域的边界，D1/D2结合部处)。在一些实施方案中，多特异性蛋白质包含来自对人NKp46具有亲和力的抗NKp46抗体的VH/VL对，如全长IgG抗体，其特征在于小于10-8M、小于10-9M或小于10-10M的KD。在一些实施方案中，多特异性蛋白质(或其结合NKp46的ABD)对人NKp46的亲和力(KD)介于1nM至100nM之间、任选地介于1nM至50nM之间、任选地介于1nM至20nM之间、任选地为约10nM或15nM，如通过SPR测定的。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质(或其结合NKp46的ABD或VH/VL对，例如当在多特异性蛋白质中构造或作为常规全长抗体时)在与抗体NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9基本上相同的NKp46上的区域、位点或表位处结合NKp46。在另一个实施方案中，抗体至少部分重叠，或在NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9结合的区段或表位中包括至少一个残基。在一个实施方案中，表位的所有关键残基在对应于结构域D1或D2的区段中。在一个实施方案中，抗体或多特异性蛋白质结合D1结构域中存在的残基以及D2结构域中存在的残基。在一个实施方案中，抗体结合表位，该表位包含对应于SEQ ID NO:1的NKp46多肽的结构域D1或D2的区段中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个残基。在一个实施方案中，抗体结合结构域D1并进一步结合包含残基R101、V102、E104和/或L105中的1个、2个、3个或4个的表位。
在另一个实施方案中，抗体或多特异性蛋白质在D1/D2结构域结合部处结合NKp46，并且结合包含残基K41、E42、E119、Y121和/或Y194中的1个、2个、3个、4个或5个或由其组成的表位。
在另一个实施方案中，抗体或多特异性蛋白质结合结构域D2并且结合包含残基P132、E133、I135和/或S136中的1个、2个、3个或4个的表位。
所提供的实施例部分描述了一系列突变体人NKp46多肽。在实施例中，测量多特异性蛋白质与用NKp46突变体转染的细胞的结合，并将其与抗NKp46抗体结合野生型NKp46多肽的能力(SEQ ID NO:1)相比。如本文所述的抗NKp46抗体或结合NKp46的多特异性蛋白质和突变的NKp46多肽之间结合的降低意指结合亲和力降低(例如，如通过已知方法，如表达特定突变体的细胞的FACS测试，或通过与突变体多肽结合的Biacore测试所测量的)和/或抗NKp46抗体的总结合能力的降低(例如，如通过抗NKp46抗体浓度对多肽浓度的图中的Bmax的降低所证明)。结合的显著降低表明，突变残基直接参与抗NKp46抗体与NKp46的结合，或者当抗NKp46抗体或NKp46结合多特异性蛋白质与NKp46结合时，突变残基与结合蛋白质非常接近。抗体表位将因此优选地包含这种残基，并且可包含与这种残基相邻的附加残基。
在一些实施方案中，结合的显著降低意指相对于抗体和野生型NKp46多肽(例如，在SEQ ID NO:1中所示的多肽)之间的结合，NKp46 ABD或结合NKp46的多特异性蛋白质和突变体NKp46多肽之间的结合亲和力和/或能力降低大于40％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。在某些实施方案中，结合降低到可检测限度以下。在一些实施方案中，当抗NKp46抗体与突变体NKp46多肽的结合小于在抗NKp46抗体和野生型NKp46多肽(例如，在SEQ ID NO:1中所示的多肽(或其胞外结构域))之间观察到的结合的50％(例如，小于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％)时，证明结合显著降低。可以使用本领域已知的各种结合测定进行此类结合测量。实施例部分中描述了一个此类测定的具体示例。
在一些实施方案中，结合NKp46的多特异性蛋白质针对其中野生型NKp46多肽(例如，SEQ ID NO:1)中的残基被取代的突变体NKp46多肽展现出显著更低的结合。在此使用的简化符号中，格式为：野生型残基：多肽中的位置：突变体残基，其中残基的编号如SEQ IDNO:1所示。
在一些实施方案中，结合NKp46的多特异性体结合野生型NKp46多肽，但降低了与具有残基R101、V102、E104和/或L105中的任一个或多个突变(例如，丙氨酸取代)的突变体NKp46多肽的结合(参考SEQ ID NO:1)和与野生型NKp46结合相比)。
在一些实施方案中，结合NKp46的多特异性蛋白质结合野生型NKp46多肽，但降低了与在残基K41、E42、E119、Y121和/或Y194中的一者或多者处具有突变(例如，丙氨酸取代)的突变体NKp46多肽的结合(参考SEQ ID NO:1)和与野生型NKp46结合相比)。
在一些实施方案中，结合NKp46的多特异性蛋白质结合野生型NKp46多肽，但降低了与在残基P132、E133、I135和/或S136中的一者或多者处具有突变(例如，丙氨酸取代)的突变体NKp46多肽的结合(参考SEQ ID NO:1)和与野生型NKp46结合相比)。
抗体NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6和NKp46-9的重链可变区的氨基酸序列在本文的表B中列出(分别为SEQ ID NO:3、5、7、9、11和13)，抗体NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6和NKp46-9的轻链可变区的氨基酸序列在本文的表B中列出(分别为SEQ ID NO:4、6、8、10、12和14)。
结合NKp46的多特异性蛋白质，其结合与单克隆抗体NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9基本上相同的表位或决定簇；任选地，抗体包含抗体NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9的高变区。在本文的任何实施方案中，抗体NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9的特征可在于其氨基酸序列和/或编码它的核酸序列。在一个实施方案中，抗体包含NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9的Fab或F(ab')2部分。还提供了包含NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9的重链可变区的抗体。根据一个实施方案，抗体包含NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9的重链可变区的三个CDR。还提供了进一步包含NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个的多肽。任选地，所述轻链或重链CDR中的任一个或多个轻链或重链CDR可包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如，取代、插入或缺失)。
多特异性蛋白质或结合NKp46的ABD可例如包含：
(a)如表B中所示的NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9的重链可变区，任选地其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可被不同的氨基酸取代；
(b)如表B中所示的轻链可变区NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9，任选地其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可被不同的氨基酸取代；
(c)如表B中所示的NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9的重链可变区，任选地其中这些氨基酸中的一者或多者可被不同的氨基酸取代；和如表B中所示的NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9的相应轻链可变区，任选地其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可被不同的氨基酸取代；
(d)如表A中所示的NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2)氨基酸序列，任选地其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可被不同的氨基酸取代；
(e)如表A中所示的NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，任选地其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可被不同的氨基酸取代；或
(f)如表A中所示的NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，任选地其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可被不同的氨基酸取代；和如表A中所示的相应NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9抗体的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，任选地其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可被不同的氨基酸取代。
在一个实施方案中，前述CDR根据Kabat编号，例如如表A中所示。在一个实施方案中，前述CDR根据Chothia编号，例如如表A中所示。在一个实施方案中，前述CDR根据IMGT编号，例如如表A中所示。
在本文的任何实施方案中的另一方面，重链和轻链的任何CDR1、CDR2和CDR3的特征可在于其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，和/或具有与特定CDR或对应的SEQ ID NO或表A中列出的CDR组共有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一方面，多特异性蛋白质与根据上述(a)至(f)的单克隆抗体竞争与NKp46上的表位结合。
根据IMGT、Kabat和Chothia定义系统，CDR的序列总结在下表A中。下表B列出了根据本发明的抗体的可变链的序列。在本文的任何实施方案中，可指定或编号VL或VH序列，以包含或缺乏信号肽或其任何部分。
表A
/>
表B
/>
NKp46 ABD的VH和VL对可任选地是抗体NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9中的任一者的VH和VL的功能保守变体。“功能保守变体”是指蛋白质(例如抗体或抗体片段)中的给定氨基酸残基已经改变而不更改蛋白质的整体构象和功能的变体，包含但不限于用具有类似性质(诸如例如，极性、氢键合潜力、酸性、碱性、疏水性、芳香族等)的氨基酸取代氨基酸。除被指示为保守的那些氨基酸之外的氨基酸在蛋白质中可不同，使得类似功能的任何两种蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似度百分比可变化并且可为例如70％至99％，如根据比对方案(诸如通过聚类方法(Cluster Method))确定，其中相似度基于MEGALIGN算法。“功能保守变体”还包含如通过BLAST或FASTA算法测定的与能够特异性结合上文所定义的NKp46多肽的抗体具有至少60％氨基酸同一性的多肽，优选至少75％，更优选至少85％，仍优选至少90％，甚至更优选至少95％，并且其具有与如上所定义的能够特异性结合NKp46多肽的抗体相同或基本上相似的性质或功能。
示例性人源化VH和VL结构域可包含抗体NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9的所有抗原结合区，例如具有表5中所示的SEQ ID NO的氨基酸。
NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp-46-4、NKp46-6或NKp46-9抗体的轻链可变区对于相应抗体可包含：人轻链FR1框架区；包含如表A中所述的氨基酸序列的LCDR1区或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；人轻链FR2框架区；包含如表A中所述的氨基酸序列的LCDR2区或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；人轻链FR3框架区；和包含如表A中所述的氨基酸序列的LCDR3区或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可缺失或被不同氨基酸取代。任选地，可变区进一步包括人轻链FR4框架区。NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp-46-4和NKp46-9 VH/VL结构域的人源化描述于PCT公开号WO2017114694中，其公开内容以引用方式并入本文，氨基酸序列如下所示。
NKp46-1：“H1”重链可变区
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSDYVINWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGTNYYNEKFKAKATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGRYGLYAMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:112)
NKp46-1：“H3”重链可变区
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYVINWGRQAPGQGLEWIGEIYPGSGTNYYNEKFKAKATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARRGRYGLYAMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:113)
NKp46-1：“L1”轻链可变区
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTRPWTFGGG
TKVEIK
(SEQ ID NO:114)
NKp46-2：“H1”重链可变区
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSISSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYITYSGSTSYNPSLESRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYYGSSWGVFAYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:115)
NKp46-2：“H2”重链可变区
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSISSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYITYSGSTSYNPSLESRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYYGSSWGVFAYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:116)
NKp46-2：“H3”重链可变区
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYITYSGSTSYNPSLESRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYYGSSWGVFAYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:117)
NKp46-2：“L1”轻链可变区
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPWTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:118)
NKp46-3：“H1”重链可变区
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSEYTMHWVRQAPGQGLEWMGGISPNIGGTSYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGGSFDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:119)
NKp46-3：“H3”重链可变区
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSEYTMHWVRQAPGQGLEWIGGISPNIGGTSYNQKFKGRATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGGSFDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:120)
NKp46-3：“H4”重链可变区
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSEYTMHWVRQAPGQGLEWIGGISPNIGGTSYNQKFKGRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGGSFDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:121)
NKp46-3：“L1”轻链可变区
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISDYLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQNGHSFPLTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO:122)
NKp46-4：“H1”重链可变区
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSFTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSGYTEYNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGSSRGFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:123)
NKp46-4：“H2”重链可变区
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSFTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSGYTEYNQKFKDRTTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGSSRGFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:124)
NKp46-4：“H3”重链可变区
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSFTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSSGYTEYNQKFKDRTTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGSSRGFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:125)
NKp46-4：“L2”轻链可变区
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWFQQKPGKAPKLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:126)
NKp46-9：“H1”重链可变区
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYITYSGSTNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARCWDYALYAMDCWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:127)
NKp46-9：“H2”重链可变区
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSISSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYITYSGSTNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARCWDYALYAMDCWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:128)
NKp46-9：“H3”重链可变区
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSISSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYITYSGSTNYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARCWDYALYAMDCWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:129)
NKp46-9：“L1”轻链可变区
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYSYLAWCQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYDTPLTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO:130)
NKp46-9：“L2”轻链可变区
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYSYLAWCQQKPGKAPKLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYDTPLTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO:131)
VH和VL组合的示例包括：
(a)VH和VL，该VH包含SEQ ID NO:3的CDR1、2和3，以及源自人IGHV1-69基因区段的FR1、2和3，该VL包含SEQ ID NO:4的CDR1、2和3，以及源自人IGKV1-33基因区段的FR1、2和3；
(b)VH和VL，该VH包含SEQ ID NO:5的CDR1、2和3，以及人IGHV4-30-4基因区段的FR1、2和3，该VL包含SEQ ID NO:6的CDR1、2和3，以及源自人IGKV1-39基因区段的FR1、2和3；
(c)VH和VL，该VH包含SEQ ID NO:7的CDR1、2和3，以及源自人IGHV1-69基因区段的FR1、2和3，该VL包含SEQ ID NO:8的CDR1、2和3，以及源自人IGKV3-11和/或IGKV3-15基因区段的FR1、2和3；
(d)VH和VL，该VH包含SEQ ID NO:9的CDR1、2和3，以及源自人IGHV1-46和/或IGHV1-69基因区段的FR1、2和3，该VL包含SEQ ID NO:10的CDR1、2和3，以及源自人IGKV1-NL1基因区段的FR1、2和3；或
(e)VH和VL，该VH包含SEQ ID NO:13的CDR1、2和3，以及源自人IGHV4-30-4基因区段的FR1、2和3，该VL包含SEQ ID NO:14的CDR1、2和3，以及源自人IGKV1-39基因区段的FR1、2和3。
在另一个方面，人源化抗NKp46 VH和VL组合的示例包括：
(a)VH和VL，该VH包含与NKp46-1 H1或H3可变结构域的氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列，该VL包含与NKp46-1 L1可变结构域的氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列；
(b)VH和VL，该VH包含与NKp46-2 H1、H2或H3可变结构域的氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列，该VL包含与NKp46-2 L1可变结构域的氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列；
(c)VH和VL，该VH包含与NKp46-3 H1、H3或H4可变结构域的氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列，该VL包含与NKp46-3 L1可变结构域的氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列；
(d)VH和VL，该VH包含与NKp46-4 H1可变结构域的氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列，该VL包含与NKp46-4 L2可变结构域的氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列；
(e)VH和VL，该VH包含与NKp46-9 H2可变结构域的氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列，该VL包含与NKp46-9 L1或L2可变结构域的氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列；或
(f)VH和VL，该VH包含与NKp46-9 H3可变结构域的氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列，该VL包含与NKp46-9 L1或L2可变结构域的氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列。
表5
抗体 VH(SEQ ID NO) VL(SEQ ID NO)
NKp46-1H1L1 112 114
NKp46-1H3L1 113 114
NKp46-2H1L1 115 118
NKp46-2H2L1 116 118
NKp46-2H3L1 117 118
NKp46-3H1L1 119 122
NKp46-3H3L1 120 122
NKp46-3H4L1 121 122
NKp46-4H1L2 123 126
NKp46-4H2L2 124 126
NKp46-4H3L2 125 126
NKp46-9H2L1 128 130
NKp46-9H2L2 128 131
NKp46-9H3L1 129 130
NKp46-9H3L2 129 131
活性测试
可评估多特异性蛋白质的生物活性，例如抗原结合、引发NK细胞增殖的能力、引发通过NK的靶细胞溶解和/或引发NK细胞活化的能力，包括由此引发的任何特异性信号传导活性，例如细胞因子产生或活化标志物的细胞表面表达。在一个实施方案中，提供了评估本公开的多特异性蛋白质的生物活性(例如抗原结合、引发靶细胞裂解的能力和/或由此引发的特异性信号传导活性)的方法。应当理解，当要评估多特异性蛋白质的组分之一(例如结合NKp46的ABD、结合感兴趣的抗原的ABD、Fc结构域、细胞因子受体ABD等)的特异性贡献或活性时，可以允许评估感兴趣的组分(例如结构域)的合适格式产生多特异性格式。本公开还提供了用于测试、评估、制备和/或生产多特异性蛋白质的此类方法。例如，当评估细胞因子的贡献或活性时，多特异性蛋白质可作为具有该细胞因子的蛋白质和其中该细胞因子经修饰以使其缺失或以其他方式调节其活性的另一种蛋白质(例如，其中两种多特异性蛋白质以其他方式具有相同或相当的结构)产生，并且在感兴趣的测定中测试。例如，当评估抗NKp46 ABD的贡献或活性时，多特异性蛋白质可作为具有ABD的蛋白质和其中ABD不存在或被不结合NKp46的ABD取代的另一种蛋白质(例如，结合测定系统中不存在的抗原的ABD)产生，其中两种多特异性蛋白质以其他方式具有相同或相当的结构，并且两种多特异性蛋白质在感兴趣的测定中测试。又如，当评估感兴趣的抗抗原(例如肿瘤抗原)ABD的贡献或活性时，多特异性蛋白质可作为具有ABD的蛋白质和其中ABD不存在或被不结合肿瘤抗原或感兴趣的抗-抗原的ABD(例如，结合测定系统中不存在的抗原的ABD、结合不同肿瘤抗原的ABD)取代而产生，其中两种多特异性蛋白质以其他方式具有相同或相当的结构，并且两种多特异性蛋白质在感兴趣的测定中测试。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，当在存在表达NKp46的细胞(例如纯化的NK细胞)和表达感兴趣的抗原(例如肿瘤抗原)的靶细胞(例如肿瘤细胞)的情况下温育蛋白质时，多特异性蛋白质能够诱导表达NKp46的细胞(例如NK细胞、报告细胞)的活化。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，当在存在表达NKp46的细胞(例如纯化的NK细胞)和表达感兴趣的抗原的靶细胞)的情况下温育蛋白质时，多特异性蛋白质能够在表达NKp46的细胞(例如NK细胞、报告细胞)中诱导NKp46信号传导。在本文所述的任何实施方案的一个方面，当在存在CD16A和表达NKp46的细胞(例如纯化的NK细胞)和表达感兴趣的抗原的靶细胞)的情况下温育蛋白质时，多特异性蛋白质能够在CD16A和表达NKp46的细胞(例如NK细胞、报告细胞)中诱导CD16A信号传导。
任选地，NK细胞活化或信号传导的特征在于活化的细胞表面标志物(例如CD107、CD69、Sca-1或Ly-6A/E、KLRG1等)的表达增加。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，当在存在表达NKp46和/或CD16的细胞(例如纯化的NK细胞)，任选地在不存在靶细胞的情况下温育蛋白质时，多特异性蛋白质能够诱导表达NKp46和/或CD16的细胞(例如NK细胞、报告细胞)的细胞表面上存在的CD137的增加。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，与缺乏细胞因子受体ABD的相同多特异性蛋白质(例如，细胞因子，CD122 ABD)相比，多特异性蛋白质能够活化或增强NK细胞的增殖至少10倍、至少50倍或至少100倍。任选地，多特异性蛋白质显示的活化或增强NK细胞增殖的EC50比其活化或增强表达CD25的T细胞的增殖的EC50低到至少1/10、1/50或1/100。
在本文所述的任何实施方案的一个方面，多特异性蛋白质能够活化或增强NK细胞相对于表达CD25的T细胞的增殖至少10倍、至少50倍或至少100倍。任选地，表达CD25的T细胞是CD4 T细胞，任选地是Treg细胞，或CD8 T细胞。
含有细胞因子受体ABD的蛋白质对细胞(例如NK细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞或Treg细胞)中经由细胞因子受体的增殖的活化或增强可通过在用多特异性蛋白质处理后测量所述细胞中pSTAT或细胞增殖标志物(例如Ki67)的表达来确定。含有CD122 ABD的蛋白质对细胞(例如NK细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞或Treg细胞)中经由IL-2R途径的增殖的活化或增强可通过在用多特异性蛋白质处理后测量所述细胞中pSTAT5或细胞增殖标志物Ki67的表达来确定。IL-2和IL-15导致参与细胞增殖、存活、分化和凋亡的STAT5蛋白质的磷酸化。磷酸化的STAT5(pSTAT5)易位到核中以调节靶基因(包括CD25)的转录。STAT5也是NK细胞存活所必需的，并且NK细胞由JAK-STAT信号传导途径紧密调节。在本文所述的任何实施方案的一个方面，当在存在表达NKp46的细胞(例如纯化的NK细胞)的情况下温育蛋白质时，多特异性蛋白质能够在表达NKp46的细胞(例如NK细胞)中诱导STAT5信号传导。在本文所述的任何实施方案的一个方面，多特异性蛋白质能够导致pSTAT5在NK细胞中的表达相对于表达CD25的T细胞增加至少10倍、至少50倍或至少100倍。任选地，多特异性蛋白质显示的诱导pSTAT5在NK细胞中表达的EC50比其诱导pSTAT5在表达CD25的T细胞中表达的EC50低到至少1/10、1/50或1/100。类似地，细胞因子受体信号转导也可评估其他细胞因子/细胞因子受体对，诸如IL-15(STAT5)、IL-21(STAT3)、IL-27(STAT1)、IL-12(STAT4)等。
活性可例如通过使表达NKp46的细胞(或表达CD25的细胞，取决于测定)与多特异性多肽接触来测量，任选地进一步在存在靶细胞(例如肿瘤细胞)的情况下。在一些实施方案中，例如通过在存在多特异性多肽的情况下使靶细胞和NK细胞(即表达NKp46的细胞)彼此接触来测量活性。表达NKp46的细胞可用作纯化的NK细胞或表达NKp46的细胞，或用作外周血单核细胞(PBMC)群体内的表达NKp46的细胞。靶细胞可以是表达感兴趣的抗原的细胞，任选地是肿瘤细胞或。
在一个示例中，可评估多特异性蛋白质导致本领域已知的分别与NK细胞活性相关的任何性质或活性的可测量的增加的能力，例如在重导向杀伤测定中，诸如细胞毒性标志物(CD107)或细胞因子产生(例如IFN-γ或TNF-α)、细胞内游离钙水平的增加、裂解靶细胞的能力等。
在存在靶细胞(表达感兴趣的抗原的靶细胞)和表达NKp46的NK细胞的情况下，多特异性蛋白质将能够体外导致与NK细胞活性相关的性质或活性的增加(例如NK细胞细胞毒性的活化、CD107表达、IFNγ的产生、靶细胞杀死伤)。例如，如通过检测NK细胞活性的测定，例如检测NK活化标志物表达的测定或检测NK细胞细胞毒性的测定，例如检测CD107或CD69表达、IFNγ产生或细胞毒性的经典体外铬释放试验的测定所测量的，与用具有相同NK细胞和未与多特异性蛋白质接触的靶细胞的相同效应子:靶细胞比例实现的相比，根据本发明的多特异性蛋白质可基于其增加NK细胞活性超过约20％、优选至少约30％、至少约40％、至少约50％或更多的能力来选择。用于检测NK细胞活化的方案和细胞毒性测定的示例在本文的实施例中以及例如在以下文献中有所描述：Pessino等人，J.Exp.Med，1998年，第188卷第5期：第953-960页；Sivori等人，Eur J Immunol，1999年，第29卷：第1656-1666页；Brando等人(2005年)，J.Leukoc.Biol.，第78卷：第359-371页；El-Sherbiny等人(2007年)，CancerResearch，第67卷第18期：第8444-9页；和Nolte-'t Hoen等人(2007年)，Blood，第109卷：第670-673页)。在细胞毒性的经典体外铬释放测试中，在添加NK细胞之前，用51Cr标记靶细胞，并且然后由于杀伤，将杀伤估计为与51Cr从细胞向培养基的释放成比例。任选地，如通过NK细胞活性测定(例如，检测表达感兴趣的抗原的NK细胞介导的靶细胞的裂解的测定)所测量的，根据本发明的多特异性蛋白质被选择或表征为其能力，即与结合相同感兴趣的抗原的常规人IgG1抗体相比具有更大的诱导针对靶细胞的NK细胞活性(即，靶细胞的裂解)的能力。
如本文所示，多特异性蛋白质、不同的ABD有助于多特异性蛋白质的总体活性，该总体或许最终以有效的体内抗肿瘤活性表现出来。本文示例的测试方法允许通过制备缺乏特定ABD的多特异性蛋白质的变体和/或使用缺乏特定ABD受体的细胞来体外评估多特异性蛋白质的不同个体ABD的活性。
例如，多特异性蛋白质的特征可在于以下中的任一项：
-与缺乏细胞因子受体ABD的相同多特异性蛋白质相比(例如，通过在用多特异性蛋白质处理后测量pSTAT或细胞增殖标志物(例如，Ki67)在所述细胞中的表达来确定)，导致NK细胞的增殖的活化或增强增加至少10倍、至少50倍或至少100倍(例如，具有低到至少1/10、至少1/50或至少1/100的EC50)的能力；
-与缺乏功能性NKp46 ABD和/或缺乏CD16A结构域(例如，具有经修饰以减少或消除CD16A结合的Fc区)的相同多特异性蛋白质相比，如例如在检测CD107或CD69表达、IFNγ产生或细胞毒性的经典体外铬释放测试的测定中所确定的，导致NK细胞针对肿瘤细胞的细胞毒性增加至少10倍、至少50倍或至少100倍(例如，具有低到至少1/10、至少1/50或至少1/100的EC50)的能力；
-与缺乏结合感兴趣的抗原(例如，肿瘤抗原)的结构域的相同多特异性蛋白质相比，如例如在检测CD107或CD69表达、IFNγ产生或细胞毒性的经典体外铬释放测试的测定中所确定的，导致NK细胞针对肿瘤细胞的细胞毒性增加至少10倍、至少50倍或至少100倍(例如，具有低到至少1/10、至少1/50或至少1/100的EC50)的能力；和/或
-与缺乏NKp46 ABD和/或缺乏CD16A结构域(例如，具有经修饰以减少或消除CD16A结合的Fc区)的相同多特异性蛋白质相比，例如，如通过在用多特异性蛋白质处理PBMC后测量pSTAT或细胞增殖标志物(例如Ki67)在所述NK细胞中的表达测定的，导致NK细胞的增强的活化或增殖增加至少10倍、至少50倍或至少100倍(例如，具有低到至少1/10、至少1/50或至少1/100的EC50)的能力；
-与增殖Treg细胞、CD4 T细胞和/或CD8 T细胞的活化或增强相比(例如，通过在用多特异性蛋白质处理PBMC后测量pSTAT或细胞增殖标志物(例如Ki67)在所述NK、TReg、CD4T细胞和/或CD8 T细胞中的表达所确定的)，导致NK细胞的增强的活化或增殖增加至少10倍、至少50倍或至少100倍(例如，具有低到至少1/10、至少1/50或至少1/100的EC50)的能力。
如在实施例中所公开的，可将比较蛋白质中的缺失结构域指定为替代结构域(例如，VH和VL对)，其维持多特异性蛋白质的结构但不与测试系统中的任何抗原结合。如本文所示，当根据本公开的多特异性蛋白质不包含细胞因子受体ABD(例如，CD122 ABD)并且当其具有不结合CD16的Fc结构域时，当该蛋白质不与靶细胞上的感兴趣的抗原结合时(例如，在不存在感兴趣的抗原和/或靶细胞的情况下)，其基本上不诱导NK细胞的NKp46信号传导(和/或由此产生的NK活化)。因此，多特异性蛋白质的单价NKp46结合组分本身不导致NKp46信号传导。因此，在具有结合CD16的Fc结构域的多特异性蛋白质的情况下，这种多特异性蛋白质可以其中细胞因子受体ABD(例如CD122 ABD)被灭活(例如经修饰、掩蔽或缺失，从而消除其结合IL-2R的能力)的构型产生，并且可通过测试该多特异性蛋白质对CD16阴性NK细胞的NKp46表达的影响来评估其引发NKp46信号传导或NKp46介导的NK细胞活化的能力。多特异性蛋白质可任选地被表征为当多特异性蛋白质与表达NKp46的CD16阴性细胞(例如，NKp46+CD16-NK细胞，报告细胞)在不存在靶细胞的情况下温育时，基本上不引起(或增加)通过表达NKp46的CD16阴性细胞的NKp46信号传导。
在本文任何实施方案的一个方面，多特异性蛋白质的特征可例如在于：
(a)当多特异性蛋白质在存在表达NKp46的细胞(例如纯化的NK细胞)的情况下温育时，能够在表达NKp46的细胞(例如NK细胞)中诱导细胞因子受体(例如CD122)信号传导(例如，如通过评估STAT信号传导，例如评估STAT磷酸化测定的)；
(b)当在存在NK细胞和靶细胞的情况下温育时，能够诱导表达NKp46(和任选的另外的CD16)的NK细胞裂解靶细胞；以及
(c)当多特异性蛋白质经修饰以缺乏细胞因子受体ABD(例如CD122ABD)或包含灭活的细胞因子受体ABD时，在不存在靶细胞的情况下，当与NK细胞(任选地CD16阴性NK细胞，不表达CD16的表达NKp46的NK细胞)一起温育时，缺乏NK细胞活化或细胞毒性和/或缺乏对NKp46的激动剂活性，任选地其中NK细胞是纯化的NK细胞。
可任选地根据本文的实施例指定测定条件和方法，包括但不限于细胞类型和效应子:靶标比例。
化合物的用途
在一个方面，提供了任何多特异性蛋白质、表达蛋白质(或其多肽链)的细胞和/或已经负载蛋白质或与蛋白质一起温育的细胞(例如NK细胞)在制备用于治疗、预防或诊断对其有需要的哺乳动物(例如人)的疾病的药物制剂中的用途。还提供了上述定义的任何化合物作为药物或药物中的活性组分或活性物质的用途。在另一个方面，本发明提供了用于制备含有如本文所定义的化合物或组合物的药物组合物的方法，以提供用于施用(例如，通过皮下或静脉内注射)的固体或液体制剂。可将这种方法或过程指定为包括将化合物与药学上可接受的载体混合的步骤。
在一个方面，提供了通过使用或施用本文所述的多特异性蛋白质或抗体或包含其的(药物)组合物来治疗、预防或更一般地影响个体的预定义病症或检测特定病症的方法。
例如，在一个方面，本发明提供了在对其有需要的患者(例如患有癌症、或病毒或细菌感染的患者)中恢复或增强表达NKp46的细胞、特别是NKp46+NK细胞(例如NKp46+CD16+NK细胞、NKp46+CD16-NK细胞)的活性和/或增殖的方法，该方法包括向所述患者施用本文所述的多特异性蛋白质的步骤。在一个方面，本发明提供了相对于表达CD25的淋巴细胞，例如CD4 T细胞、CD8 T细胞、Treg细胞，选择性恢复或增强NK细胞的活性和/或增殖的方法。在一个实施方案中，该方法涉及增加患有疾病的患者中的NKp46+淋巴细胞的活性(例如NKp46+CD16+NK细胞、NKp46+CD16-NK细胞)，在该疾病中增加的淋巴细胞(例如NK细胞)活性是有益的或其由不足的NK细胞活性引起或表征，诸如癌症、或病毒或微生物/细菌感染。
在一个方面，本发明提供了在对其有需要的患者(例如患有实体瘤的患者)中恢复或增强肿瘤浸润NK细胞或肿瘤内表达NKp46的细胞、特别是NKp46+NK细胞(例如NKp46+CD16+NK细胞、NKp46+CD16-NK细胞)的活性和/或增殖的方法，该方法包括向所述患者施用本文所述的多特异性蛋白质的步骤。
在一个方面，本发明提供了在对其有需要的患者(例如患有实体瘤的患者)中增加肿瘤浸润NK细胞或肿瘤内表达NKp46的细胞、特别是活化的表达NKp46的细胞、特别是NKp46+NK细胞(例如NKp46+CD16+NK细胞、NKp46+CD16-NK细胞)的数量的方法，该方法包括向所述患者施用本文所述的多特异性蛋白质的步骤。
在另一个方面，本发明提供了在对其有需要的患者(例如患有癌症、或病毒、寄生虫或细菌感染的患者)中恢复或增强NKp46+NK细胞(例如NKp46+CD16+NK细胞、NKp46+CD16-NK细胞)的活性和/或增殖的方法，该方法包括使源自该患者的细胞，例如免疫细胞和任选地表达感兴趣的抗原的靶细胞与根据本发明的多特异性蛋白质接触，并将该多特异性蛋白质处理的细胞再输注到该患者中的步骤。在一个实施方案中，该方法涉及增加患有疾病的患者中的NKp46+淋巴细胞的活性(例如NKp46+CD16+NK细胞)，在该疾病中增加的淋巴细胞(例如NK细胞)活性是有益的或其由不足的NK细胞活性引起或表征，诸如癌症、或病毒或微生物，例如细菌或寄生虫感染。
在另一个方面，本发明提供了在对其有需要的患者(例如患有癌症、或病毒、寄生虫或细菌感染的患者)中恢复或增强NKp46+NK细胞(例如NKp46+CD16+NK细胞、NKp46+CD16-NK细胞)的活性和/或增殖的方法，该方法包括使源自该患者的细胞，例如免疫细胞与根据本发明的多特异性蛋白质接触，并将该多特异性蛋白质处理的细胞再输注到该患者中的步骤。在一个实施方案中，该方法涉及增加患有疾病的患者中的NKp46+淋巴细胞的活性(例如NKp46+CD16+NK细胞)，在该疾病中增加的淋巴细胞(例如NK细胞)活性是有益的或其由不足的NK细胞活性引起或表征，诸如癌症、或病毒或微生物，例如细菌或寄生虫感染。
在另一个实施方案中，本发明的多特异性蛋白质可与源自待治疗的患者或源自不同供体的免疫细胞、特别是NK细胞组合使用或施用，并且将这些NK细胞施用于对其有需要的患者，诸如患有其中增加的淋巴细胞(例如NK细胞)活性是有益的或由不足的NK细胞活性引起或表征的疾病(诸如癌症、或病毒或微生物，例如细菌或寄生虫感染)的患者。由于NK细胞(不同于CAR-T细胞)不表达TCR，这些NK细胞，甚至源自不同供体的那些NK细胞也不会诱导GVHD反应(参见例如，Glienke等人，“Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells”，Front.Pharmacol.，6,Art.，第21卷：第1-6页(2015年)；Hermanson和Kaufman，Front.Immunol.，6,Art.，第195卷：第1-6页，(2015年))。
在一个实施方案中，本文所公开的经由效应细胞的多种活化受体(包括NKp46、CD16和CD122)介导NK细胞活化、增殖、肿瘤浸润和/或靶细胞裂解的多特异性蛋白质可有利地用于治疗其效应细胞或肿瘤浸润效应细胞(例如NKp46+NK细胞)的活性降低、耗竭或抑制的个体，例如具有显著的效应细胞群体的患者，这些效应细胞群体的特征在于一种或多种抑制性受体(例如TIM-3、PD1、CD96、TIGIT等)的表达和/或上调，或CD16表达的下调或低水平(例如存在升高比例的NKp46+CD16-NK细胞)。
本文所述的多特异性多肽或细胞可用于预防或治疗可用抗体治疗的障碍，诸如癌症、实体瘤和非实体瘤、血液恶性肿瘤、感染(诸如病毒感染)和炎性或自身免疫性疾病。
在一个实施方案中，感兴趣的抗原(非NKp46抗原)是在选自以下的癌症类型的恶性细胞的表面上表达的抗原：癌，包括膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌包括鳞状细胞癌；淋巴谱系的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴性白血病、急性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤；骨髓谱系的造血肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病和早幼粒细胞白血病；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；和其他肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌，淋巴谱系的造血肿瘤，例如T-细胞和B-细胞肿瘤，包括但不限于T-细胞障碍诸如T-幼淋巴细胞白血病(T-PLL)，包括小细胞和小脑细胞类型；大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)，优选为T细胞类型；Sézary综合征(SS)；成人T细胞白血病淋巴瘤(ATLL)；a/dT-NHL肝脾淋巴瘤；外周/胸腺后T细胞淋巴瘤(多形性和免疫母细胞亚型)；血管造影术免疫母细胞T-细胞淋巴瘤；血管中心(鼻)T-细胞淋巴瘤；间变性(Ki 1+)大细胞淋巴瘤；肠T细胞淋巴瘤；T-淋巴细胞；和淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质用于预防或治疗选自以下的癌症：癌，包括膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌包括鳞状细胞癌；淋巴谱系的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴性白血病、急性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤；骨髓谱系的造血肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病和早幼粒细胞白血病；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；和其他肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌。可根据本发明治疗的其他示例性障碍包括淋巴谱系的造血肿瘤，例如T-细胞和B-细胞肿瘤，包括但不限于T-细胞障碍诸如T-幼淋巴细胞白血病(T-PLL)，包括小细胞和小脑细胞类型；大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)，优选为T细胞类型；Sézary综合征(SS)；成人T细胞白血病淋巴瘤(ATLL)；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/胸腺后T细胞淋巴瘤(多形性和免疫母细胞亚型)；血管造影术免疫母细胞T-细胞淋巴瘤；血管中心(鼻)T-细胞淋巴瘤；间变性(Ki 1+)大细胞淋巴瘤；肠T细胞淋巴瘤；T-淋巴细胞；淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)。
在一个示例中，肿瘤抗原是在淋巴瘤细胞或白血病细胞的表面上表达的抗原，并且多特异性蛋白质被施用于和/或用于治疗患有淋巴瘤或白血病的个体。任选地，肿瘤抗原选自HER2、CD19、CD20、CD22、CD30或CD33。
在一个实施方案中，本文所述的本发明的多特异性多肽或细胞组合物可用于预防或治疗特征在于表达本公开的多特异性蛋白质特异性结合的感兴趣的抗原(例如肿瘤抗原)的肿瘤细胞的癌症。
在一个方面，治疗方法包括向个体施用治疗有效量的本文所述的多特异性蛋白质，例如用于治疗如本文所公开的疾病，例如上文所鉴定的任何癌症。治疗有效量可以是在患有疾病或障碍的患者中具有治疗效果的任何量(或在至少相当大比例的患有疾病或障碍和具有与该患者基本上类似的特征的患者中促进、增强和/或诱导这样的效果)。
多特异性蛋白质可在有我们没有检测感兴趣的抗原(例如肿瘤抗原)在获自个体的生物样品(例如包含癌细胞、癌组织或癌邻近组织的生物样品)中的靶细胞上的表达的先前步骤的情况下使用。在另一个实施方案中，本公开提供了一种用于治疗或预防对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括：
a)检测来自个体的样品中表达感兴趣的抗原(例如，多特异性蛋白质经由其感兴趣的抗原ABD特异性结合的感兴趣的抗原)的细胞(例如，肿瘤细胞)，以及
b)在确定表达感兴趣的抗原的细胞任选地以至少对应于参考水平(例如，对应于从多特异性蛋白质获得实质性益处的个体，或任选地以与参考水平相比增加的水平(例如，对应于健康个体或不从本文所述的蛋白质获得实质性益处的个体)的水平包含在样品中时，向个体施用与感兴趣的抗原、NKp46、细胞因子受体(例如，CD122)结合和任选地与CD16A(例如，经由其Fc结构域)结合的本公开的多特异性蛋白质。
在一些实施方案中，多特异性蛋白质用于治疗特征在于感兴趣的抗原的低水平表面表达的肿瘤。因此，肿瘤或癌症的特征可在于表达低水平肿瘤抗原的细胞。任选地，肿瘤抗原的水平小于100,000个肿瘤抗原拷贝/癌细胞。在一些方面，肿瘤抗原的水平小于90,000、小于75,000、小于50,000或小于40,000个肿瘤抗原拷贝/癌细胞。这些用途任选地进一步包括检测该受试者的一种或多种癌细胞的肿瘤抗原水平。
多特异性蛋白质可在有我们没有检测或表征来自待治疗的个体的NK细胞的先前步骤的情况下使用。任选地，在一个实施方案中，本公开提供了一种用于治疗或预防对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括：
a)检测来自个体的肿瘤样品中(或肿瘤内和/或相邻组织内)的NK细胞(例如肿瘤浸润NK细胞)，以及
b)在确定肿瘤或肿瘤样品的特征在于NK细胞的低数量或活性时，任选地以与参考水平相比降低的水平或数量(例如以对应于从常规IgG抗体疗法(诸如与相同癌抗原结合的常规IgG1抗体)不产生益处、产生低益处或产生不足益处的个体的水平)，向个体施用与癌抗原结合、与NKp46(例如单价地)结合、与细胞因子受体(例如CD122)结合和任选地与CD16A结合的多特异性蛋白质。
在一些实施方案中，个体具有特征在于CD16(例如CD16A)缺陷肿瘤微环境的肿瘤。任选地，使用多特异性蛋白质的治疗方法包括检测来自个体的样品(例如肿瘤样品)中CD16的表达水平的步骤。检测CD16任选地包括检测CD16A或CD16B的水平。在一些方面，在已历造血干细胞移植的患者中评估CD16缺陷微环境。任选地，CD16缺陷微环境包含浸润NK细胞群体，并且与对照NK细胞相比，浸润NK细胞具有小于50％的CD16表达。在一些方面，与对照NK细胞相比，浸润NK细胞具有小于30％、小于20％或小于10％的CD16表达。任选地，CD16缺陷微环境包含浸润NK细胞群体，并且与对照NK细胞相比，至少10％的浸润NK细胞具有降低的CD16表达。在一些方面，与对照NK细胞相比，至少20％、至少30％或至少40％的浸润性NK细胞具有降低的CD16表达。
任选地，在一个实施方案中，提供了一种用于治疗或预防对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括：
a)检测来自个体的肿瘤或肿瘤样品(例如肿瘤和/或邻近组织内)的细胞(例如肿瘤浸润NK细胞)中的CD16表达，以及
b)在确定肿瘤或肿瘤样品的特征在于CD16缺陷微环境后，向个体施用与癌抗原结合、与NKp46结合和与细胞因子受体(例如CD122)结合(并且任选地进一步与CD16A结合)的多特异性蛋白质。
任选地，在一个实施方案中，提供了一种用于治疗或预防对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括：
a)检测来自个体的肿瘤样品中(或肿瘤内和/或相邻组织内)NK细胞(例如肿瘤浸润NK细胞)表面处的CD16表达，以及
b)在确定肿瘤或肿瘤样品的特征在于升高比例的CD16-NK细胞时，任选地以与参考水平相比增加的水平或数量，向个体施用与癌抗原结合、与NKp46结合和与细胞因子受体(例如CD122)结合(并且任选地进一步与CD16A结合)的多特异性蛋白质。
在一个实施方案中，本公开提供了一种用于治疗或预防对其有需要的个体的疾病(例如癌症)的方法，该方法包括：
a)在来自个体的样品中(例如在循环中或在肿瘤环境中)检测免疫效应细胞(例如NK细胞、T细胞)上一种或多种抑制性受体的细胞表面表达，以及
b)在测定免疫效应细胞上的一种或多种抑制性受体的细胞表面表达后，任选地以与参考水平相比增加的水平(例如，以与健康个体、未遭受免疫耗竭或抑制的个体、或未从本文所述的蛋白质获得实质性益处的个体相比增加的水平)，向个体施用与感兴趣的抗原(例如癌抗原)结合、与NKp46(例如，单价地)结合和与细胞因子受体(例如CD122)结合(并且任选地进一步与CD16A结合)的多特异性蛋白质(例如多特异性蛋白质)。
在一些实施方案中，多特异性蛋白质用于治疗患有胃癌或前列腺癌的个体。在胃癌和前列腺癌中已经观察到NKG2D在免疫效应细胞上降低的细胞表面表达。
在一些实施方案中，个体具有特征在于降低的NKG2D表达，例如降低的细胞表面表达的NK细胞和/或T细胞。表达水平可例如与参考值相比，例如对应于在健康个体中的NK和/或T细胞上观察到的NKG2D水平的参考值。在一些实施方案中，个体具有特征在于肿瘤微环境中NK和/或T细胞上的NKG2D表达降低的NK和/或T细胞。在一些实施方案中，个体在肿瘤微环境中存在(例如以增加的水平)可溶性NKG2D配体，例如可溶性MICA、MICB或ULBP蛋白质。
在一个实施方案中，本公开提供了一种用于治疗或预防对其有需要的个体的疾病(例如癌症)的方法，该方法包括：
a)在来自个体的样品中(例如在循环中或在肿瘤环境中)检测免疫效应细胞(例如NK细胞、T细胞)上NKG2D多肽的细胞表面表达，以及
b)在测定免疫效应细胞上的一种或多种抑制性受体的降低的细胞表面表达后，任选地以与参考水平相比降低的水平(例如，以与健康个体、未遭受免疫耗竭或抑制的个体、或未从本文所述的蛋白质获得实质性益处的个体相比增加的水平)，向个体施用与感兴趣的抗原(例如癌抗原)结合、与NKp46(例如，单价地)结合和与细胞因子受体(例如CD122)结合(并且任选地进一步与CD16A结合)的多特异性蛋白质(例如多特异性蛋白质)。
在一个实施方案中，多特异性蛋白质可用作单一疗法(无其他治疗剂)，或与一种或多种单独施用的其他治疗剂组合治疗使用。在一个实施方案中，在不存在与IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽的组合治疗的情况下施用多特异性蛋白质。
多特异性蛋白质也可包括在试剂盒中。试剂盒可任选地进一步包含任何数量的多肽和/或其他化合物，例如1、2、3、4或任何其他数量的多特异性蛋白质和/或其他化合物。应当理解，对试剂盒内容物的该描述不以任何方式进行限制。例如，试剂盒可包含其他类型的治疗化合物。任选地，试剂盒还包括使用多肽的说明书，例如详述本文所述的方法，诸如在特定疾病病症的检测或治疗中。
还提供了包含本发明的多特异性蛋白质和任选的如上所定义的其他化合物的药物组合物。多特异性蛋白质和任选的另一种化合物可以纯化格式与药物载体一起作为药物组合物施用。剂型取决于预期的施用方式和治疗或诊断应用。药物载体可以是适于将化合物递送给患者的任何相容的、无毒的物质。药学上可接受的载体为本领域所熟知，并且包括例如水溶液诸如(无菌)水或生理缓冲盐水或其他溶剂或媒介物诸如二醇、甘油、油诸如橄榄油或可注射有机酯、醇、脂肪、蜡和惰性固体。药学上可接受的载体还可包含生理学上可接受的化合物，其作用是例如稳定或增加化合物的吸收此类生理学上可接受的化合物包括例如碳水化合物诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂诸如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂，低分子蛋白质或其他稳定剂或赋形剂本领域的技术人员将知道，药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于例如组合物的施用途径药学上可接受的佐剂、缓冲剂、分散剂等也可掺入到药物组合物中。此类佐剂的非限制性示例包括例如无机和有机佐剂诸如明矾、磷酸铝和氢氧化铝、角鲨烯、脂质体、脂多糖、双链(ds)RNA、单链(s-s)DNA和TLR激动剂诸如未甲基化的CpG。
根据本发明的多特异性蛋白质胃肠外施用。用于胃肠外施用的化合物制剂必须是无菌的。灭菌通过经无菌滤膜过滤而容易地完成，任选地在冻干和重构之前或之后。化合物的胃肠外施用途径与已知方法一致，例如通过静脉内、腹膜内、肌内、动脉内或病灶内途径注射或输注。化合物可通过输注或通过弹丸式注射连续施用。用于静脉内输注的典型组合物可制成包含100ml至500ml的无菌0.9％ NaCl或5％葡萄糖，任选地补充有20％白蛋白溶液和1mg至10g化合物，这取决于化合物的具体类型及其所需的给药方案。制备可胃肠外施用的组合物的方法为本领域所熟知。
实施例
多特异性蛋白质的制备
在实施例中使用的包含IL-2变体的示例性“T5”格式多特异性蛋白质的结构域结构示于图2A和图2G中，掺入了人源化NK46-1 VH和VL对作为NKp46 ABD。图2A示出了结构域接头，诸如铰链和甘氨酸-丝氨酸接头，以及链间二硫键。具有N297S突变以基本上消除CD16A结合但在其他方面等同于格式T5的示例性“T6”格式的结构域结构示于图2I中。为了构建T5链L(也称为链3)，通常与结合NKp46的ABD中的NKp46-1 VK结构域缔合的CK结构域被CH1结构域取代。T25格式与T5格式的不同之处在于结合NKp46的ABD的CH1和CK的取代，使得正常情况下与NKp46-1VK结构域结合的CK结构域和正常情况下与VH缔合的CH1保持与其缔合。为了确保链L(链3)和链H(链1)之间的正确配对以及H和L链之间的适当二硫键的形成，将人IgG1的上铰链残基添加到连接链L与IL-2变体的接头上游的链L的CH1结构域的C末端。其他蛋白质格式示于图2B至图2N中。实施例中使用的包含IL-15、IL-18(IL-18v)或IFN-α(IFNαv)变体的示例性“T5”格式多特异性蛋白质的结构域结构示于图2O、图2P、图2Q和图2R中，掺入了人源化NKp46-1或NKp46-4 VH和VK结构域。
将编码每个多特异性结合抗原的蛋白质的每条多肽链的序列插入到pTT-5载体的HindIII和BamHI限制位点之间。在存在PEI的情况下(37℃，5％CO2，150rpm)，使用三种载体(制备为无内毒素的midipreps或maxipreps)共转染EXPI-293F细胞(Life Technologies)。将细胞以1×106个细胞/ml的密度(EXPI293培养基，Gibco)接种到培养瓶中。作为参考，对于“T5”构建体，我们使用0.1μg/ml(多肽链I)、0.4μg/ml(多肽链II)或0.8μg/ml(多肽链III)的DNA比例。加入丙戊酸(最终浓度0.5mM)、葡萄糖(4g/L)和胰蛋白胨N1(0.5％)。在六天之后收获上清液，并通过具有0.22μm孔的Stericup过滤器。
使用rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare，参考号17-1279-03)从收获后的上清液纯化多特异性结合抗原的蛋白质。然后进行尺寸排阻色谱法(SEC)纯化，并且最后在0.22μm装置上过滤以预期尺寸洗脱的蛋白质。
所产生的多特异性蛋白质的多肽链的氨基酸序列示于下表6中。
表6
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实施例1：IL2v限制IL2R在Treg上的活化
评估含有突变体IL-2的一个C末端部分的异源三聚体含有Fc结构域的蛋白质IC-T6-IC-IL2v活化Treg细胞的能力。IC-T6-IC-IL2v掺入了变体IL-2多肽(IL-2v)，即包含突变T3A、C125A、F42A、Y45A和L72G的人IL-2多肽，与野生型人IL-2相比，赋予了对CD25降低的结合亲和力。
异源三聚体IC-T6-IC-IL2v蛋白质是T6格式蛋白质(参见图2I的一般结构)，其具有与同种型对照(IC)Fab的链中的一条链的C末端融合的IL2v，该IC Fab继而又与突变以基本上消除CD16A结合的Fc结构域的C末端融合，该Fc结构域继而又与另一IC Fab融合。ICFab具有不与测试系统中的任何蛋白质结合的VH/VL。将异源三聚体IC-T6-IC-IL2v与其中IL2v被野生型人IL-2多肽取代的相同异源三聚体蛋白质(IC-T6-IC-IL2pWT)和重组产生的全长野生型IL-2(rec IL-2)进行比较。
简言之，将1M/孔纯化的PBMC接种于96孔板中，并在培养箱中于37℃、5.5％ CO2下用递增剂量的重组huIL-2、IC-T6-IC-IL2或IC-T6-IC-IL2v(剂量从133nM至0,0000013nM)处理20分钟。然后通过流式细胞术分析Tregs(对在CD3+CD4+CD25+FoxP3+进行门控)上的STAT5磷酸化。
结果示于图3中。与IC-T6-IC-IL2WT(“IL2pWT免疫缀合物”)和野生型IL-2(“Rec-huIL2”)相比，IC-T6-IC-IL2v(“IL2v免疫缀合物”)导致Treg中STAT5磷酸化的EC50增加大约3-log。因此，与野生型IL-2相比，掺入突变的人IL-2的IC-T6-IC-IL2v蛋白质显示出在Treg细胞中活化细胞因子受体信号传导的能力明显降低。
实施例2：NKCE-IL2v选择性促进NK细胞中的IL2R活化
我们评估了向实施例1的含有Fc结构域和含有IL2v的异源三聚体蛋白质添加结合NKp46的功能体是否会促进NK细胞中的IL-2R信号传导。因此，我们评价了结合NKp46并包含IL2v部分(NKCE-IL2v)的不同多特异性蛋白质(也称为NK细胞衔接子(NKCE)蛋白质)。为了提供与熟知的抗肿瘤抗体的比较，通过掺入来自FDA批准的人源化抗体GA101(奥妥珠单抗，Roche)的抗CD20 VH/VL对使NKCE与CD20结合。
评估异源三聚体含有Fc结构域的蛋白质CD20-T5-NKp46-IL2v活化Treg细胞、NK细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞上的细胞因子受体信号传导的能力。图2A和图2G中所示的CD20-T5-NKp46-IL2v蛋白质格式具有结合定位在N末端的CD20的抗原结合结构域，并且掺入了包含突变T3A、C125A、F42A、Y45A和L72G的定位在C末端的IL-2v、野生型Fc结构域(即结合人CD16A)和置于Fc结构域和IL2v之间的结合NKp46的抗原结合结构域。
简言之，将1M/孔纯化的PBMC接种于96孔板中，并在培养箱中于37℃、5.5％ CO2下用递增剂量的NKCE-IL2v或IL2v免疫缀合物(剂量从133nM至0.0000013nM)处理20分钟。然后通过流式细胞术分析NK细胞(CD3-CD56+)、CD8 T细胞(CD3+CD8+)、CD4 T细胞(CD3+CD4+FoxP3-)和Tregs(对CD3+CD4+CD25+FoxP3+进行门控)上的STAT5磷酸化。
结果示于图4中，示出了y轴上的靶细胞中pSTAT5细胞的％和x轴上的测试蛋白质的浓度。CD20-T5-NKp46-IL2v和IC-T6-IC-IL2v表现出相当的Treg细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞的活化。然而，与不结合NKp46或CD16A的IC-T6-IC-IL2相比，CD20-T5-NKp46-IL2v诱导NK细胞中STAT5磷酸化的EC50降低约两个数量级。因此，CD20-T5-NKp46-IL2v蛋白质允许NK细胞中对Treg细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞进行选择性细胞因子受体信号传导。
实施例3：CD16和NKp46两者对于促进由NKCE-IL2v诱导的NK细胞上的IL2R信号传 导是重要的
我们试图研究除IL-2R之外还与CD16和/或NKp46结合的多特异性蛋白质对NK细胞中的IL-2R信号传导的影响。
构建了一系列异源三聚体含有IL2v和Fc结构域的蛋白质，其共有相同总体结构，但其中NKp46和肿瘤抗原结合结构域分别被同种型对照(IC)结构域取代，这些IC结构域维持结构域结构但缺乏与测定系统中的任何蛋白质的结合，或其中Fc结构域是结合CD16A的Fc结构域(在“T5”蛋白中)或缺乏CD16A结合的突变Fc结构域(N297S)(在“T6”蛋白中)。该实验中包括的测试蛋白质：
-IC-T6-IC-IL2v：从N末端至C末端拓扑地包含IC VH/VL、突变以消除CD16结合的Fc结构域二聚体、IC VH/VL对、IL2v。
-CD20-T6-IC-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20 VH/VL对、突变以消除CD16结合的Fc结构域二聚体、IC VH/VL对、IL2v。
-CD20-T5-IC-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20 VH/VL对、结合CD16的野生型Fc结构域二聚体、IC VH/VL对、IL2v。
-CD20-T6-NKp46-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20VH/VL对、突变以消除CD16结合的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1VH/VL对、IL2v。
-CD20-T5-NKp46-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20VH/VL对、结合CD16的野生型Fc结构域二聚体、抗NKp46-1VH/VL对、IL2v。
简言之，将1M/孔纯化的PBMC接种于96孔板中，并在培养箱中于37℃、5.5％ CO2下用递增剂量的各种NKCE-IL2v(剂量从133nM至0.0000013nM)处理20分钟。然后通过流式细胞术分析NK细胞上的STAT5磷酸化(对CD3-CD56+进行门控)。
结果示于图5中，示出了y轴上的NK细胞中pSTAT5细胞的％和x轴上的测试蛋白质的浓度。IC-T6-IC-IL2v和CD20-T6-IC-IL2v在NK细胞中表现出相当的促进IL2R信号传导的作用，示出了CD20结合结构域在不存在肿瘤靶细胞的该模型中不具有作用。CD20-T5-IC-IL2v经由其野生型Fc结构域二聚体另外具有CD16结合能力，导致NK细胞中IL2R信号传导增加。与结合CD16但不结合NKp46的CD20-T5-IC-IL2v相比，可结合NKp46但不结合CD16的CD20-T6-NKp46-IL2v在促进NK细胞中的IL2R信号传导方面更有效。然而，与CD20-T6-NKp46-IL2v相比，结合CD16和NKp46两者(除IL2v部分之外)的CD20-T5-NKp46-IL2v导致NK细胞中pSTAT5+细胞的百分比的效力的明显增加(EC50降低大约1-log)。因此，NK细胞中的IL-2R信号传导被NKp46和CD16中的每一者增强，并且当除IL-2R之外还结合NKp46和CD16时具有特别明显的增强。
实施例4：在存在和不存在靶细胞的情况下，NKCE-IL2v诱导NK细胞活化
在该实验中，评估了NK细胞衔接子蛋白质在存在或不存在肿瘤靶细胞的情况下诱导NK细胞活化的能力。
测试了一系列异源三聚体含有IL2v和Fc结构域的蛋白质，以评价单独和组合地与不同NK和靶细胞受体结合的效果。该实验中包括的测试蛋白质：
-CD20-T5-NKp46-IL2v：从N末端至C末端拓扑地包含抗CD20VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1 VH/VL对、IL-2v。
-CD20-F5-NKp46：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20 VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1 VH/VL对。除了不存在IL2v之外，F5蛋白质与T5蛋白质共有相同基本结构域排列。
-CD20-T5-IC-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20 VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、IC VH/VL对、IL2v。
-CD20-T6-NKp46-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20VH/VL对、突变以消除CD16结合的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1VH/VL对、IL2v。
-IC-T5-NKp46-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含IC VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1 VH/VL对、IL2v。
-IC-T6-IC-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含IC VH/VL对、突变以消除CD16结合的Fc结构域二聚体、IC VH/VL对、IL2v。
简言之，纯化的NK细胞在存在测试蛋白质的情况下培养5天。通过流式细胞术监测的CD69活化标志物在NK细胞上的表达的定量来评价NK细胞活化。
结果示于图6中，示出了在不存在肿瘤细胞的情况下，y轴上的表达CD69的NK细胞的％和x轴上的测试蛋白质的浓度。结合CD20、NKp46和CD16但缺乏IL2v部分的CD20-F5-NKp46在不存在肿瘤细胞的情况下不活化NK细胞，而所有含有IL2v部分的蛋白质导致明显的NK细胞活化，与缺乏CD16和NKp46结合的IC-T6-IC-IL2v蛋白质相比，对于具有结合NKp46的结构域和野生型Fc结构域的蛋白质观察到另外的益处。
实施例5：NKCE-IL2v促进NK细胞增殖
在该实验中，评估NK细胞衔接子蛋白质在温育5天后诱导NK细胞增殖的能力。
该实验中包括的测试蛋白质：
-CD20-T5-NKp46-IL2v：从N末端至C末端拓扑地包含抗CD20VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1 VH/VL对、IL-2v。
-CD20-F5-NKp46：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20 VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1 VH/VL对。
-CD20-T5-IC-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20 VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、IC VH/VL对(不与测定系统中的任何蛋白质结合的同种型对照VH/VL对)、IL2v。
-CD20-T6-NKp46-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20VH/VL对、突变以消除CD16结合的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1VH/VL对、IL2v。
-IC-T5-NKp46-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含IC VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1 VH/VL对、IL2v。
-IC-T6-IC-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含IC VH/VL对、突变以消除CD16结合的Fc结构域二聚体、IC VH/VL对、IL2v。
简言之，将CellTraceVioletTM(CTV)标记的纯化的NK细胞与133nM至0.0001nM剂量范围的NKCE-IL2v一起培养5天。通过对通过流式细胞术监测的示出稀释的CTV信号的NK细胞的百分比进行定量来评价NK细胞增殖。
结果示于图7中，示出了在不存在肿瘤细胞的情况下，y轴上的增殖的NK细胞的％和x轴上的测试蛋白质的浓度。结合CD20、NKp46和CD16但缺乏IL2v部分的CD20-F5-NKp46不诱导NK细胞的增殖，而所有含有IL2v部分的蛋白质导致明显的NK细胞增殖，尽管在效力上有差异。与缺乏CD16和NKp46结合的IC-T6-IC-IL2v蛋白质相比，具有结合NKp46的结构域和/或野生型Fc结构域(除IL2v之外)的所有NK细胞衔接子蛋白质在诱导NK细胞增殖方面更有效。
实施例6：在标准体外细胞毒性测定中，NKCE-IL2v在ET比例为10:1时促进了肿瘤 细胞杀伤
在该实验中，使用钙黄绿素释放作为读出的标准4小时细胞毒性测定中，以10:1的效应子:靶标比例评估NK细胞衔接子蛋白质诱导来自两个人供体的NK细胞对RAJI肿瘤细胞的杀伤的能力。
该实验中包括的测试蛋白质：
-CD20-T5-NKp46-IL2v3：从拓扑的N末端至C末端拓扑地包含抗CD20 VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1VH/VL对、IL-2v3。
-CD20-T5-NKp46-IL2pWT：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1 VH/VL对、作为野生型人IL-2多肽的IL-2pWT。
-CD20-F5-NKp46：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20 VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1 VH/VL对。
-CD20-T5-IC-IL2v3：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20 VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、IC VH/VL对、IL2v3。
-CD20-T6-NKp46-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20VH/VL对、突变以消除CD16结合的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1VH/VL对。
-IC-T5-NKp46-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含IC VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1 VH/VL对、IL2v。
-CD20-T5-NKp46-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1 VH/VL对、IL2v。
简言之，将纯化的NK细胞在完全培养基中静置过夜。然后将纯化的NK细胞与先前装载有钙黄绿素的Raji肿瘤细胞以10:1的比例共培养。在培养箱中于37℃、5.5％ CO2下，将细胞与上述测试蛋白质(剂量为66nM至0.0000006nM)一起温育4小时。
结果示于图8A和图8B中，每张图代表一个人NK细胞供体，示出了y轴上的由NK细胞诱导的特异性裂解％和x轴上的测试蛋白质的浓度。总体结果在两个人供体之间是一致的。缺乏与靶细胞上的CD20结合的IC-T5-NKp46-IL2v不诱导显著的细胞毒性。在诱导NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性方面，保留结合CD16和NKp46(除CD20之外)两者的能力的所有NK细胞衔接子在EC50值方面表现出相似的高效力。相反，缺乏CD16或NKp46结合的NK细胞衔接子显示出较低的效力。IL-2多肽(野生型或突变的IL2v)的性质似乎无差异地影响NK细胞的细胞毒性，并且此外，与不具有任何IL-2部分的CD20-F5-NKp46 NK细胞衔接子相比，IL2(无论是野生型还是IL2v)的存在在诱导细胞毒性方面并未导致改善的EC50值。然而，IL-2部分的存在增加了最大裂解水平。
实施例7：在标准体外细胞毒性测定中，NKCE-IL2v在ET比例为2:1时促进了肿瘤细 胞杀伤
在该实验中，使用Cr51作为读出的标准4小时细胞毒性测定中，以2:1的效应子:靶标比例评估NK细胞衔接子蛋白质诱导来自两个人供体的NK细胞对RAJI肿瘤细胞的杀伤的能力。
该实验中包括的测试蛋白质：
-CD20-T5-NKp46-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1 VH/VL对、IL-2v。
-CD20-F5-NKp46：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20 VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1 VH/VL对。
-CD20-T5-IC-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20 VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、IC VH/VL对、IL2v。
-CD20-T6-NKp46-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20VH/VL对、突变以消除CD16结合的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1VH/VL对。
-IC-T6-IC-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含IC VH/VL对、突变以消除CD16结合的Fc结构域二聚体、IC VH/VL对、IL2v。
简言之，将纯化的NK细胞在完全培养基中静置过夜。然后将静息NK细胞与先前装载51Cr的Raji肿瘤细胞以2:1的比例共培养。在培养箱中于37℃、5.5％ CO2下，将细胞与上述测试蛋白质(剂量为20μg/ml至0.0001μg/ml)一起温育4小时。
结果示于图8C和图8D中，各自代表一个人NK细胞供体，示出了y轴上的由NK细胞诱导的特异性裂解％和x轴上的测试蛋白质的浓度。总体结果在两个人供体之间是一致的。缺乏与CD20、CD16和NKp46结合的IC-T6-NKp46-IL2v不诱导显著的细胞毒性。保留结合CD16和NKp46(除CD20之外)两者的能力的所有NK细胞衔接子显示出增强NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性的强能力。缺乏CD16或NKp46结合的NK细胞衔接子在EC50值方面显示出较低的效力。不具有任何IL2v部分的CD20-F5-NKp46NK细胞衔接子具有与CD20-T5-NKp46-IL2v3 NK细胞衔接子相当的效力，尽管后者示出更高的裂解平台。
实施例8：NKCE-IL2v在与肿瘤细胞衔接时会诱导细胞因子
在该实验中，当NK细胞衔接子蛋白质与RAJI肿瘤细胞以0.5:1的效应子:靶标比例共培养时，评估它们诱导NK细胞产生细胞因子的能力。该测试是在存在Golgi Stop的情况下使用细胞内流式细胞术作为读出的标准4小时细胞因子测定的。
该实验中包括的测试蛋白质：
-CD20-T5-NKp46-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1 VH/VL对、IL-2v。
-CD20-F25-NKp46：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20 VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1 VH/VL对。
-CD20-T5-IC-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20 VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、IC VH/VL对、IL2v。
-CD20-T6-NKp46-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含抗CD20VH/VL对、突变以消除CD16结合的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1VH/VL对、IL2v。
-IC-T5-NKp46-IL2v：从拓扑的N末端至C末端包含IC VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1 VH/VL对、IL2v。
简言之，将新鲜纯化的NK细胞与Raji肿瘤细胞以0.5:1的比例共培养。在培养箱中于37℃、5.5％ CO2下，在存在Golgi Stop和上述测试蛋白质(剂量为13nM至0.00001nM)的情况下温育细胞。在4小时之后，通过对NK细胞进行门控的细胞内流式细胞术分析IFNγ和MIP1β。
结果示于图9中，示出了y轴上的IFN-γ阳性NK细胞的％(左)和NK细胞上MIP1β的Medfi(右)和x轴上的测试分子浓度。缺乏与靶细胞上的CD20结合的NK细胞衔接子不诱导IFN-γ或MIP1β产生。保留结合CD16和NKp46(除CD20之外)两者的能力的所有NK细胞衔接子在较低剂量的测试分子下诱导最高水平的IFN-γ和MIP1β。相反，缺乏CD16或NKp46结合的NK细胞衔接子在较低剂量的测试分子下显示出较低的细胞因子产生效力。可结合NKp46但不结合CD16的CD20-T6-NKp46-IL2v在诱导细胞因子方面效率较低，而经由其野生型Fc结构域二聚体结合CD16但不结合NKp46的CD20-T5-IC-IL2v在最高剂量的测试分子下导致高细胞因子产生。与不具有任何IL-2部分的CD20-F25-NKp46 NK细胞衔接子相比，IL2v在CD20-T5-NKp46-IL2v分子中的存在似乎略微增加了NK细胞产生这些细胞因子的能力。
实施例9：NKCE-IL2v在体内具有强抗肿瘤功效
在该实验中，在人类癌症的小鼠模型中评估了单次注射NK细胞衔接子蛋白CD20-T5-NKp46-IL2v(从N末端至C末端开始包含抗CD20 VH/VL对、结合CD16的野生型Fc结构域二聚体(不包含降低CD16结合的突变)、结合小家鼠(mus musculus)NKp46的抗NKp46 VH/VL对、IL2v)的体内抗肿瘤活性。
将NK细胞衔接子蛋白质与市售的金标准Fc增强的抗CD20抗体奥妥珠单抗进行比较。简言之，用基质胶中的5×106个RAJI细胞对CB17-SCID小鼠进行皮下移植。在移植之后9天，用不同剂量的CD20-T5-NKp46-IL2v(70μg、10μg、2μg和0.4μg)、不同剂量的奥妥珠单抗(1500μg、150μg、50μg和15μg)和作为媒介物的PBS的单次静脉内注射处理小鼠。随时间跟踪肿瘤生长。
结果示于图10中。与在该模型中显示出有限活性的奥妥珠单抗(左图)相比，结合CD20、NKp46、CD16A和CD122的CD20-T5-NKp46-IL2v NK细胞衔接子蛋白质(右图)在单次注射时示出强功效。10μg剂量的CD20-T5-NKp46-IL2v产生了抗肿瘤活性，其在体积超过40mm3的情况下阻止肿瘤生长约20天。70μg剂量的CD20-T5-NKp46-IL2v产生了非常强的抗肿瘤活性，其中肿瘤的体积在研究期间生长不超过40mm3。
实施例10：NKCE-IL2v在体内对大体积肿瘤具有强抗肿瘤功效
在该实验中，用NK细胞衔接子蛋白质CD20-T5-NKp46-IL2v(从N末端至C末端包含抗CD20 VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46 VH/VL对、IL2v)每周处理，评估其在人类癌症的小鼠模型中的体内抗肿瘤活性，其中在处理之前允许肿瘤生长至300m3的大体积。
简言之，用基质胶中的5×106个RAJI细胞对CB17-SCID小鼠进行皮下移植。在移植之后11天，当肿瘤达到280mm3的平均体积时，每周重复静脉内注射25μg的CD20-T5-NKp46-IL2v或作为对照媒介物的PBS来处理小鼠。随时间跟踪肿瘤生长。
结果示于图11中。结合CD20、NKp46、CD16A和CD122的CD20-T5-NKp46-IL2v NK细胞衔接子蛋白质(右图)作为在肿瘤移植之后第11天开始的每周注射示出强功效。25μg剂量的CD20-T5-NKp46-IL2v导致非常强且长时间的抗肿瘤活性，其中肿瘤首先体积减小，然后肿瘤的体积在研究期间通常保持低于300mm3。相比之下，在媒介物对照组中，肿瘤在肿瘤移植后几天体积快速生长超过300mm3。实验示出，CD20-T5-NKp46-IL2v分子在长时间内有效控制大体积肿瘤。
实施例11：体内强功效需要NKp46和IL2v两者
在该实验中，在人类癌症的小鼠模型中评估了用两次注射不同的NK细胞衔接子蛋白质的处理的体内抗肿瘤活性。所测试的蛋白质是：
-CD20-T5-NKp46-IL2v，从N末端至C末端包含抗CD20VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、结合来自小家鼠的NKp46的抗NKp46 VH/VL对、IL-2v。
-缺乏NKp46结合的CD20-T5-IC-IL2v，
-缺乏CD122结合的CD20-F5-NKp46。
-注射PBS作为载体和阴性对照。
简言之，用基质胶中的5×106个RAJI细胞对CB17-SCID小鼠进行皮下移植。在肿瘤细胞移植之后的第9天和第16天，通过2次静脉内注射25μg的CD20-T5-NKp46-IL2v、25μg的CD20-T5-IC-IL2v、25μg的CD20-F5-NKp46或作为对照媒介物的PBS来处理小鼠。随时间跟踪肿瘤生长。
结果示于图12中。结合CD20、NKp46、CD16A和CD122的CD20-T5-NKp46-IL2v NK细胞衔接子蛋白质示出强功效，因为两次注射间隔一周，在肿瘤移植后第9天开始，此时肿瘤已经生长至60mm3体积。25μg剂量的CD20-T5-NKp46-IL2v产生非常强的抗肿瘤活性，其中肿瘤的体积在研究期间通常停留在60mm3范围内。相比之下，在CD20-T5-IC-IL2v组和CD20-F5-NKp46组中，肿瘤在治疗之后的起初一周期间被稍微控制，但之后的体积迅速生长超过300mm3。实验示出，NKp46和CD122结合两者对于有效控制肿瘤生长是至关重要的，并且它们的同时靶向驱动CD20-T5-NKp46-IL2v分子的强抗肿瘤功效。
实施例12：NKCE-IL2v诱导实体瘤中的NK细胞累积和炎性微环境
在该实验中，我们在人癌症的体内小鼠模型中测试了NK细胞衔接子CD20-F5-NKp46和CD20-T5-NKp46-IL2v诱导NK细胞在肿瘤中累积的能力。所测试的分子是：
-CD20-T5-NKp46-IL2v：从N末端至C末端包含抗CD20VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗小鼠NKp46-1VH/VL对、IL-2v。
-CD20-F5-NKp46：从N末端至C末端包含抗CD20 VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗小鼠NKp46-1 VH/VL对。
-奥妥珠单抗。
简言之，用基质胶中的5×106个RAJI细胞对CB17-SCID小鼠进行皮下移植。在Raji细胞移植之后20天，通过单次静脉内注射70μg的CD20-T5-NKp46-IL2v、125μg的CD20-F5-NKp46、600μg的奥妥珠单抗和作为对照媒介物的PBS来处理小鼠。在3天之后，收获肿瘤用于RNA提取。从整个肿瘤的mRNA提取物制备cDNA并进行qPCR以定量ncr1和ifn-γ(ifng)转录物的表达，以评价NK细胞在肿瘤中的浸润和活化。结果示于图13中。从用结合CD20、NKp46、CD16A和CD122的CD20-T5-NKp46-IL2v NK细胞衔接子蛋白质处理的小鼠收获的肿瘤显示出ncr1转录物(编码NKp46蛋白质并且对NK细胞具有高度特异性)的高表达，这表明肿瘤中的NK细胞浸润增加。相比之下，在用CD20-F5-NKp46蛋白质或奥妥珠单抗处理的小鼠中收获的肿瘤仅显示出ncr1转录物的少量增加，这表明肿瘤中的NK细胞浸润低得多。此外，与其他治疗条件相比，从用CD20-T5-NKp46-IL2vNK细胞衔接子蛋白质治疗的小鼠收获的肿瘤示出更高的ifng转录物表达。与来自奥妥珠单抗或PBS注射小鼠的肿瘤相比，在用缺乏CD122结合的CD20-F5-NKp46处理的小鼠中收获的肿瘤也示出较低但显著增加的ifng转录物。结果示出，CD20-T5-NKp46-IL2v蛋白质促进靶肿瘤中NK细胞的募集和活化。
实施例13：NK细胞驱动NKCE-IL2v控制实体瘤生长的功效
在该实验中，我们评估了NK细胞的体内耗竭对NK细胞衔接子CD20-T5-NKp46-IL2v在人癌症的体内小鼠模型中控制肿瘤细胞生长的能力的影响。
简言之，用基质胶中的5×106个RAJI细胞对CB17-SCID小鼠进行皮下移植。当肿瘤达到70mm3时，在第10天给小鼠注射25μg CD20-T5-NKp46-IL2v，一周后进行第二次注射。通过注射抗唾液酸GM1抗体进行NK耗竭，每周施用一次，在第9天(治疗之前)开始，并且重复共六次施用。随时间跟踪肿瘤生长。
结果示于图14中。右上图中示出了用CD20-T5-NKp46-IL2v NK细胞衔接子处理使肿瘤生长得到控制。然而，NK细胞耗竭导致肿瘤生长在约第30天时失控(右下图)，而未耗竭NK细胞的小鼠中的肿瘤仍然得到控制。这些数据示出，NK细胞对于由CD20-T5-NKp46-IL2vNK细胞衔接子诱导的抗肿瘤活性是重要的。
实施例14：具有不同接头长度的NKCE-IL2v分子
考虑到定位在NKCE内的结构域对同时结合NK细胞上的NKp46、CD16和CD122中的每一者的潜在影响，我们试图研究NKCE-IL2v蛋白质中的不同结构修饰对它们诱导IL-2R信号传导的影响。
比较了一系列不同的异源三聚体蛋白质，即所有结合的肿瘤抗原(CD20，表示可互换，也称为“GA101”，是指抗CD20 VH/VL对)、CD16(通过包含二聚体野生型Fc结构域)、NKp46和CD122(通过包含IL2v分子)。在一个系列的蛋白质中，例如GA101-T5-NKp46-IL2v，结合NKp46的结构域(作为Fab)位于Fc结构域二聚体的C末端，并且IL2v位于结合NKp46的Fab的C末端(NKp46、Fc和IL2v部分的结构域排列，从N末端至C末端：二聚体Fc-抗NKp46 Fab-IL2v)。将IL2v与结合NKp46的结构域分开的柔性结构域接头的长度是变化的，包括5个氨基酸残基的短接头、GA101-T5-NKp46-IL2v的10个氨基酸残基接头和15个氨基酸残基的长接头。
所测试的蛋白质是：
-重组人IL-2
-CD20-T5-NKp46-IL2v
-CD20-T5-NKp46-IL2v短接头
-CD20-T5-NKp46-IL2v长接头
简言之，将1M/孔纯化的PBMC接种于96孔板中，并在培养箱中于37℃、5.5％ CO2下用递增剂量的各种NKCE-IL2v(剂量从133nM至0.0000013nM)处理20分钟。然后通过流式细胞术分析NK细胞(对CD3-CD56+进行门控)、CD4 T细胞(CD3+CD4+FoxP3-)、CD8 T细胞(CD3+CD8+)和Treg细胞(CD3+CD4+CD25hi FoxP3+)上的STAT5磷酸化。
结果示于图15中，示出了y轴上的PBMC中pSTAT5细胞的％和x轴上的测试蛋白质的浓度。无论所使用的接头的长度如何，所有GA101-T5-NKp46-IL2v NK细胞衔接子蛋白质在NK细胞中优于TReg细胞、CD8 T细胞和CD4 T细胞诱导有效的IL2R信号传导。
实施例15：NKCE-IL2v与NKp46上的远端表位的结合保留了强诱导细胞毒性能力
该实验是为了研究NKCE-IL2v蛋白质中不同结构修饰对增强NK细胞针对靶细胞的细胞毒性的能力。在该实验中，使用Cr51作为读出的标准4小时细胞毒性测定中，以10:1的效应子:靶标比例评估NK细胞衔接子蛋白质诱导静置纯化的NK细胞对RAJI肿瘤细胞的杀伤的能力。在这一系列实验中，我们测试了多特异性蛋白质内的不同结构域定位、将IL2v部分与多特异性蛋白质的其余部分分开的不同长度的结构域接头、以及与NKp46分子上的远端位点结合的不同结合NKp46的结构域。
除实施例2至14中所述的多特异性蛋白质(其全部利用掺入NKp46-1VH/VL对的NKCE蛋白质)之外，还测试了CD20-T5-NKp46-4-IL2v中的附加结合CD20的NKCE蛋白质，其替代地掺入了NKp46-4 VH/VL对。如表位作图实验和Gauthier等人，2019年(Cell，第177卷：第1701-1713页)所示，在NKp46-1抗体与NKp46上位于结构域1和2之间的过渡处的表位结合时，NKp46-4抗体与NKp46的D1结构域的N末端部分上的表位结合。
与NKp46的N末端部分的结合的三维建模表明，在这种设置中，与NKp46-1 VH/VL对相比，抗NKp46-4 VH/VL对将更靠近细胞膜定位，并且这种结合可能削弱IL2v部分与CD122相互作用的能力，其IL-2结合位点定位在离细胞表面约70埃的位置(参见图1C)。因此，产生CD20-T5-NKp46-4-IL2v，其具有将IL2v与结合NKp46的结构域分开的三种不同长度的柔性结构域接头，包括5个氨基酸残基的短接头、标准10个氨基酸残基的接头和15个氨基酸残基的长接头。
所测试的蛋白质是：
-CD20-T5-NKp46-1-IL2v
-CD20-T5-NKp46-1-IL2v短接头
-CD20-T5-NKp46-1-IL2v长接头
-CD20-T6-NKp46-1-IL2v
-IC-T6-NKp46-1-IL2v
-IC-T5-NKp46-1-IL2v
-CD20-T5-NKp46-4-IL2v
-CD20-T5-NKp46-4-IL2v短接头
-CD20-T5-NKp46-4-IL2v长接头
结果示于图16和图17中，示出了y轴上的特异性裂解％和x轴上的测试蛋白质的浓度。图16示出了由“T5”和“T6”格式的NKCE蛋白质增强的细胞毒性，其中基于NKp46-1 VH/VL对的结合NKp46的结构域被定位在野生型Fc结构域二聚体与C末端IL2v之间，具有10个氨基接头、短(5aa)接头或长(15aa)接头；这些蛋白质在增强NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性的能力方面都是相当的，而没有较短或较长的接头对NK细胞毒性的负面影响。
图17示出了由“T5”和“T6”格式的NKCE蛋白质增强的细胞毒性，其中基于NKp46-4VH/VL对的结合NKp46的结构域被定位在野生型Fc结构域二聚体与C末端IL2v之间，具有10个氨基接头、短(5aa)接头或长(15aa)接头；这些蛋白质在增强NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性的能力方面都是相当的。因此，NKCE蛋白质靶向的NKp46结合位点不影响细胞毒性能力。
图18示出了图16、图17和图18中所测试的蛋白质的结构。
实施例16：不同的细胞因子变体不负面影响由NKCE-IL2v诱导的IL2R信号传导
选择在实施例2至16的NKCE蛋白质中使用的IL2v部分以及称为IL2v3的新IL2v部分，以便赋予与NK细胞上的IL-2Rβ的结合优于与T细胞(包括Tregs)上的IL-2Rα的结合。该实验是为了研究细胞因子蛋白质中不同结构修饰对它们影响NKCE-IL2v诱导的IL2R信号传导的作用。
制备了不同的NKCE-IL2v蛋白质，其中IL2v的氨基酸序列是变化的，但是同时保持了与表达NK的受体链(IL-2Rβ)的优先结合超过Treg细胞表达链(IL-2Rα)。然后测试NKCE蛋白质在NK细胞中比在T细胞中差异诱导IL2R的能力，以评估不同的细胞因子变体是否将影响IL-2Rβ对高亲和力IL-2Rαβγ复合物的选择性靶向。
如下制备三种IL-2突变体多肽并将其C末端置于NKCE-IL2v蛋白质上：
-CD20-T5-NKp46-IL2v：从N末端至C末端包含抗CD20VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1VH/VL对、IL2v(参考成熟野生型人IL-2的突变T3A、C125A、F42A、Y45A和L72G)。
-CD20-T5-NKp46-IL2v2：从N末端至C末端包含抗CD20 VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1 VH/VL对、IL2v2(参考成熟野生型人IL-2的突变R38A/F42K)。
-CD20-T5-NKp46-IL2v3：从N末端至C末端包含抗CD20 VH/VL对、结合CD16的Fc结构域二聚体、抗NKp46-1 VH/VL对、IL2v3(参考成熟野生型人IL-2的突变R38A/T41A/F42K)。
简言之，将1M/孔纯化的PBMC接种于96孔板中，并在培养箱中于37℃、5.5％CO2下用递增剂量的各种NKCE-IL2v(剂量从133nM至0.0000013nM)处理20分钟。然后通过流式细胞术分析PBMC上的STAT5磷酸化，并对NK细胞(CD3-CD56+)、CD8 T细胞(CD3+CD8+)、CD4T细胞(CD3+CD4+FoxP3-)和Tregs(对CD3+CD4+CD25+FoxP3+进行门控)进行门控。
结果示于图19中，示出了y轴上的PBMC细胞中pSTAT5细胞的％和x轴上的测试蛋白质的浓度。与包含野生型IL-2且不结合NKp46或CD16A的IC-T6-IC-IL2(IL2pWT)相比，CD20-T5-NKp46-IL2v、CD20-T5-NKp46-IL2v2和CD20-T5-NKp46-IL2v3是相当的，并且各自都导致NK细胞中pSTAT5+细胞的百分比增加约2-log。因此，CD20-T5-NKp46-IL2v蛋白质允许对NK细胞的选择性活化优于Treg细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞。不同“非α”细胞因子变体的取代不影响NKCE-IL2v蛋白质对NK细胞的选择性活化优于Treg细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞的能力。NK细胞和Tregs的活化的EC50值如下所示。
实施例17：NKCE-IL2v在小鼠体内诱导最小的全身细胞因子释放
在该实验中，我们评估了在小鼠中用NK细胞衔接子CD20-T5-NKp46-IL2v处理对全身细胞因子释放的影响。对CB17 SCID小鼠单次注射25μg或70μg的CD20-T5-NKp46-IL2v，每个剂量水平注射四只小鼠。随时间监测小鼠IL-6和TNFα在血浆中的产生，持续14天。
结果示于图20中，其中左图示出了IL-6产生，并且右图示出了TNFα产生。对于治疗后的每个时间点(D表示天数)，左柱表示70μg剂量的细胞因子的血浆浓度，右柱表示了25μg剂量的细胞因子的血浆浓度。图10示出了用CD20-T5-NKp46-IL2v NK细胞衔接子的治疗使用超过10μg的单次剂量注射来控制肿瘤生长。这些数据示出，CD20-T5-NKp46-IL2v在治疗后的3天期间仅诱导最小的全身细胞因子产生，并且此后没有全身细胞因子产生，从而表明CD20-T5-NKp46-IL2v不涉及免疫毒性，尽管治疗是以其显示有效的抗肿瘤和NK细胞细胞毒性活性的剂量进行的。
实施例18：肿瘤抗原、NKCE蛋白质的NKp46和CD16结合组分的作用机理
示出这些实验是为了说明在不包含细胞因子部分下，NKp46和CD16A在NKCE蛋白质的作用机理中对NK细胞的作用。产生了不同的NKCE蛋白质格式，其与FcγR(包括CD16)的结合低或基本上缺乏，或者其与FcγRs(包括CD16)结合，例如对人CD16的结合亲和力在野生型人IgG1抗体的结合亲和力的1-log内，如通过SPR评估的。
使用源自对肿瘤抗原CD19特异的scFv的可变结构域DNA和氨基酸序列以及来自对NKp46特异的抗体的不同可变区，制备用于制备多特异性蛋白质的不同构建体。如PCT公开号WO2016/207273中所述克隆、生产和纯化蛋白质。在图21A和图21B中示出了不同格式的结构域结构。
格式2(F2)：CD19-F2-NKp46-3
具有单体Fc结构域并因此不结合CD16的F2多肽的结构域结构示于图21A中。单体CH2-CH3 Fc部分的DNA和氨基酸序列包含CH3结构域突变(EU编号)L351K、T366S、P395V、F405R、T407A和K409Y，以防止CH3异源二聚化。异源二聚体由以下组成：
(1)具有如下排列的结构域的第一(中心)多肽链(N末端至C末端)：
(Vκ–VH)抗CD19–CH2–CH3–VH 抗NKp46–CH1
和
(2)具有如下排列的结构域的第二多肽链(N末端至C末端)：VK抗NKp46–CK。
(VK-VH)单元由VH结构域、接头和VK单元(即scFv)组成。与双特异性多肽的其他格式一样，编码CH3/VH接头肽的DNA序列具有设计为在CH3-VH结合部处插入特定SalI限制性位点的氨基酸序列STGS。如实施例2-1所述克隆、生产和纯化蛋白质。CD19-F2-NKp46-3多肽链1的氨基酸序列示于SEQ ID NO:221中，并且CD19-F2-NKp46-3多肽链2的氨基酸序列示于SEQ ID NO:222中。
格式5(F5)：CD19-F5-NKp46-3
三聚体F5多肽的结构域结构示于图21A中，其中铰链结构域之间的链间键(在图中显示在链上的CH1/Cκ和CH2结构域之间)以及CH1和Cκ结构域之间的链间键是链间二硫键。异源三聚体由以下组成：
(1)具有如下排列的结构域的第一(中心)多肽链(N末端至C末端)：
VH 抗CD19–CH1–CH2–CH3–VH 抗NKp46–Cκ
和
(2)具有如下排列的结构域的第二多肽链(N末端至C末端)：Vκ抗CD19–CK–CH2–CH3
和
(3)具有如下排列的结构域的第三多肽链(N末端至C末端)：Vκ抗NKp46–CH1。
这三条链的氨基酸序列示于SEQ ID NO:223(链2)、224(链1)和225(链3)中。
格式6(F6)：CD19-F6-NKp46-3
F6蛋白质与F5相同，但包含N297S取代以避免N-连接糖基化。F6蛋白质的三条链的氨基酸序列示于SEQ ID NO:226(链2)、227(链1)和228(链3)中。
格式7(F7)：CD19-F7-NKp46-3
异源三聚体F7多肽的结构域结构示于图21A中。F7蛋白质与F6相同，除了在CH1和Cκ结构域中的半胱氨酸至丝氨酸的取代，这些取代在它们的C末端连接至Fc结构域，以便防止形成具有Vκ抗NKp46–CH1链的中心链的二聚体种类的少量群体。76蛋白质的三条链的氨基酸序列示于SEQ ID NO:229(链2)、230(链1)和231(链3)中。
格式13(F13)：CD19-F13-NKp46-3
二聚体F13多肽的结构域结构示于图21A中，其中铰链结构域之间的链间键(显示在链上的CH1/Cκ和CH2结构域之间)以及CH1和Cκ结构域之间的链间键是链间二硫键。异源二聚体由以下组成：
(1)具有如下排列的结构域的第一(中心)多肽链(N末端至C末端)：
VH 抗CD19–CH1–CH2–CH3–(VH-Vκ)抗NKp46
和
(2)具有如下排列的结构域的第二多肽链(N末端至C末端)：Vκ抗CD19–Cκ–CH2–CH3。
(VH-Vκ)单元由VH结构域、接头和Vκ单元(scFv)组成。
F13蛋白质的两条链的氨基酸序列如SEQ ID NO:232和233所示。
格式14(F14)：CD19-F14-NKp46-3
二聚体F14多肽的结构域结构示于图21B中。F14多肽是一种二聚体多肽，其共有F13格式的结构但野生型Fc结构域(CH2-CH3)，F14双特异性格式具有CH2结构域突变N297S以消除N-连接糖基化。F14蛋白质的两条链的氨基酸序列如SEQ ID NO:234和235所示。
通过表面等离子共振(SPR)测定NKp46的结合亲和力
Biacore T100一般程序和试剂
在25℃下在Biacore T100设备(通用电气医疗集团的Biacore)上进行SPR测量。在所有Biacore实验中，HBS-EP+(通用电气医疗集团的Biacore)和NaOH 10mM分别用作运行缓冲液和再生缓冲液。用Biacore T100评价软件对传感图进行分析。蛋白A购自(通用电气医疗集团)。在因内特制药公司(Innate Pharma)处克隆、产生和纯化人NKp46重组蛋白。
蛋白质-A的固定
将蛋白A蛋白质共价固定到传感器Chip CM5上的葡聚糖层中的羧基。用EDC/NHS(N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(通用电气医疗集团的Biacore)活化芯片表面。在偶联缓冲液(10mM乙酸盐，pH 5.6)将蛋白A稀释到10μg/ml，并且注射直至达到合适的固定水平(即，2000RU)。使用100mM乙醇胺pH 8(通用电气医疗集团的Biacore)进行剩余活化基团的失活。
结合研究
接下来将抗体作为具有来自NKp46-3抗体的抗NKp46可变区的不同格式进行测试，并与作为全长人IgG1的NKp46-3抗体进行比较。将1μg/mL的双特异性蛋白质捕获到蛋白质-A芯片上，并将重组人NKp46蛋白质以5μg/mL注射到捕获到的双特异性抗体上。对于空白扣除，再次进行循环，从而用运行缓冲液取代NKp46蛋白质。对于FACS筛选，使用用PE标记的山羊抗小鼠多克隆抗体(pAb)检测上清液中反应性抗体的存在。
亲和力研究
按照制造商推荐的常规捕获动力学方案(通用电气医疗集团的Biacore，动力学向导)进行单价亲和力研究。将范围为6.25nM至400nM的人NKp46重组蛋白质的七个连续稀释液依次注射到捕获到的双特异性抗体上，并允许其在再生前解离10分钟。使用1:1动力学结合模型，拟合整个传感器图集。
结果
当使用NKp46-3可变区时，所有测试的格式均保持与NKp46的结合。单价亲和力以及动力学缔合和解离速率常数如下表7所示。
表7
在低ET比例下耗竭抗肿瘤mAb：NKp46×CD19双特异性蛋白质的功效比较
这些研究旨在研究NKCE蛋白质是否能够以低效应子:靶标比例介导NKp46介导的NK细胞针对癌靶细胞的活化。在该实施例中使用的ET比例为1:1，据信该比例更接近于将在体内遇到的设定。具有根据F2格式(缺乏CD16A结合)的排列的NKp46×CD19双特异性蛋白质与来自NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4或NKp46-9的抗NKp46可变结构域进行比较：
(a)全长单特异性抗NKp46抗体(NKp46-3作为人IgG1)，和
(b)作为全长人IgG1的抗CD19抗体作为诱导ADCC的抗体对照比较物。
这些实验还包括以下作为对照：利妥昔单抗(一种诱导抗CD20 ADCC的抗体对照，针对具有高表达水平的靶抗原)；抗CD52抗体阿仑单抗(人IgG1，结合靶细胞和NK细胞两者上存在的CD52靶细胞)和阴性对照同种型对照治疗性抗体(不结合靶细胞上存在的靶细胞的人IgG1(HUG1-IC)。在存在CD19阳性肿瘤靶细胞(Daudi细胞)，存在CD19阴性、CD16阳性靶细胞(HUT78 T淋巴瘤细胞)并且不存在靶细胞的情况下，通过CD69或CD107表达来评估不同蛋白质对NK细胞活化的功能作用。
通过流式细胞术评估CD69和CD107在NK细胞上的表达来测试NK活化。该测定是在96U孔板中以完整RPMI，150μL终/孔完成的。效应细胞是从供体纯化的新鲜NK细胞。靶细胞是Daudi(CD19阳性)、HUT78(CD19阴性)或K562(NK活化对照细胞系)。除K562阳性对照之外，还测试了三种条件，如下：
>仅NK细胞
>NK细胞与Daudi(CD19+)
>NK细胞与HUT78(CD19-)
效应子:靶标(E:T)比例为1:1，其中抗体稀释范围从10μg/mL开始，稀释1/4(n＝8个浓度)。将抗体、靶细胞和效应细胞混合；以300g离心1分钟；在37℃下温育4小时；以500g离心3分钟；用染色缓冲液(SB)洗涤两次；添加50μL染色Ab混合物；以300g温育30分钟；用带有CellFix的SB重悬颗粒洗涤两次；在4℃下储存过夜；并用Canto II(HTS)检测荧光。
结果
上述实验的结果示于图22中(22A:CD107和22B:CD69)。在存在靶抗原表达细胞的情况下，双特异性抗NKp46×抗CD19抗体(分别包括NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4或NKp46-9可变区)在存在Daudi细胞的情况下活化NK细胞。
双特异性抗NKp46×抗CD19抗体在存在Daudi细胞的情况下诱导的活化远比全长人IgG1抗CD19抗体诱导的活化更有效。这种ADCC诱导抗体在这种情况下具有低活性。此外，在这种低E:T比例设置中，由NKCE诱导的活化与抗CD20抗体利妥昔单抗一样有效，其中仅在其中比例在2.5:1ET比例下观察到差异的浓度高10倍的最高浓度下观察到差异。
在不存在靶细胞或存在靶抗原阴性HUT78细胞的情况下，全长抗NKp46抗体和阿仑单抗示出与在存在Daudi细胞的情况下观察到的相似程度的基线活化。抗NKp46×抗CD19抗体在存在HUT78细胞的情况下不活化NK细胞。
组合NKp46和CD16触发
将结合具有根据F5格式的排列的人CD16与来自NKp46-3的抗NKp46可变结构域的NKp46×CD19 NKCE蛋白质与F6格式的相同双特异性抗体(其缺乏CD16结合)和人IgG1同种型抗CD19抗体以及人IgG1同型对照抗体进行比较，以获得指导纯化的NK细胞裂解CD19阳性Daudi肿瘤靶细胞的功能性能力。
简言之，在U-底部96孔板中，在经典4-h 51Cr-释放测定中评估来自EFS血沉棕黄层的新鲜人纯化的NK细胞的溶解细胞活性。Daudi或HUT78细胞(不表达CD19的阴性对照细胞)用51Cr标记，然后在存在稀释范围从10μg/ml开始的测试抗体的情况下，以等于10:1的效应子/靶标比例与NK细胞混合，稀释1/10(n＝8个浓度)。
在短暂离心和在37℃下温育4小时之后，除去50μL上清液并转移到LumaPlate(Perkin Elmer Life Sciences，Boston，MA)中，用TopCount NXTβ检测器(PerkinElmerLife Sciences，Boston，MA)测量51Cr的释放。所有实验条件一式三份进行分析，特异性裂解的百分比如下确定：100×(平均cpm实验释放-平均cpm自发释放)/(平均cpm总释放-平均cpm自发释放)。通过用2％ Triton X100(Sigma)裂解靶细胞获得总释放百分比，并且自发释放对应于培养基中的靶细胞(无效应子或Ab)。
这些实验的结果示于图23中。由于N297取代，因此其Fc结构域不结合CD16的CD19-F6-NKp46(F6格式的双特异性蛋白质)在介导Daudi靶细胞的NK细胞裂解中与全长IgG1抗CD19抗体一样有效。考虑到对照IgG1抗CD19抗体以二价结合CD19并且进一步由于抗CD19抗体被CD16结合，该结果是特别显著的。还将F6蛋白质与蛋白质CD19-F5-NKp46进行比较，后者与CD19-F6-NKp46蛋白质相同，不同之处在于Kabat残基297处的天冬酰胺。尽管由CD19-F5-NKp46(F5格式蛋白质)(其Fc结构域结合CD16)触发的CD16介导的明显的NK活化，F5格式在介导Daudi靶细胞裂解方面比全长IgG1抗CD19抗体或F6格式双特异性蛋白质更有效。这表明即使当CD16被触发时NKp46也可增强靶细胞裂解。事实上，在相当水平的靶细胞裂解下，CD19-F5-NKp46比全长抗CD19 IgG1的效力高至少1000倍。
不同双特异性格式与FcRn的结合
如PCT公开号WO2016/207273中所述，通过将重组FcRn蛋白质共价固定至传感器芯片CM5上的葡聚糖层中的羧基基团，通过表面等离子共振(SPR)研究不同抗体格式对人FcRn的亲和力。测试了具有完整人IgG1恒定区和NKp46×CD19 NKCE与来自NKp46-3的抗NKp46可变结构域的嵌合全长抗CD19抗体；对于每种分析物，使用稳态或1:1SCK结合模型拟合整个传感图。
这些实验的结果示于下表8中。具有Fc结构域二聚体的NKCE蛋白质(格式F5、F6、F13、F14)以类似于全长IgG1抗体的亲和力与FcRn结合。具有单体Fc结构域的其他NKCE蛋白质(F3、F4、F9、F10、F11，以下未示出)对FcRn也显示出结合亲和力，然而其亲和力低于具有Fc结构域二聚体的双特异性蛋白质。
表8
抗体/双特异性 SPR方法 KD nM
人IgG1/K抗CD19 SCK/两态反应 7.8
CD19-F5-NKp46-3 SCK/两态反应 2.6
CD19-F6-NKp46-3 SCK/两态反应 6.0
CD19-F13-NKp46-3 SCK/两态反应 15.2
CD19-F14-NKp46-3 SCK/两态反应 14.0
与FcγR的结合
评价不同的多聚体Fc蛋白质以评估此类双特异性单体Fc蛋白质是否可保持与Fcγ受体的结合。
在25℃下在Biacore T100设备(通用电气医疗集团的Biacore)上进行SPR测量。在所有Biacore实验中，HBS-EP+(通用电气医疗集团的Biacore)和10mM NaOH、500mM NaCl分别用作运行缓冲液和再生缓冲液。用Biacore T100评价软件对传感图进行分析。克隆、产生和纯化重组人FcR的(CD64、CD32a、CD32b、CD16a和CD16b)。
将F5和F6 NKCE蛋白质CD19-F5-NKp46-3或CD19-F6-NKp46-3共价固定到传感器芯片CM5上的葡聚糖层中的羧基基团上。用EDC/NHS(N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(通用电气医疗集团的Biacore)活化芯片表面。在偶联缓冲液(10mM乙酸盐，pH5.6)中将双特异性抗体稀释到10μg/ml，并且注射直至达到合适的固定水平(即，800RU至900RU)。使用100mM乙醇胺pH 8(通用电气医疗集团的Biacore)进行剩余活化基团的失活。
按照经典动力学向导(如制造商推荐的)评估单价亲和力研究。将CD64的范围为0.7到60nM和所有其他FcR的60到5000nM的可溶性分析物(FcR)的系列稀释液注射到固定的双特异性抗体上，并允许其在再生前解离10分钟。使用CD64的1:1动力学结合模型和所有其他FcR的稳态亲和力模型拟合整个传感图集。
结果示出，尽管全长野生型人IgG1与所有食蟹猴和人Fcγ受体结合，但CD19-F6-NKp46-3双特异性抗体不与任何受体结合。另一方面，CD19-F5-NKp46-3分别与人受体CD64(KD＝0.7nM)、CD32a(KD＝846nM)、CD32b(KD＝1850nM)、CD16a(KD＝1098nM)和CD16b(KD＝2426nM)结合。常规的人抗IgG1抗体具有与这些Fc受体相当的结合(下表中所示的KD)。
NK细胞衔接子蛋白质对于不同的肿瘤抗原是有效的
构建具有Fc结构域二聚体的结合NKp46的NKCE蛋白质，这些蛋白质结合具有根据F5格式的排列的人CD16，其中改变了结合肿瘤抗原的VH/VL对。
EGFR：
表皮生长因子受体(EGFR)是通过其特异性配体(包括EGFR和TGFα)的结合而活化的跨膜蛋白。导致EGFR过表达或过度活性的突变已经与许多癌症相关，包括肺癌鳞状细胞癌、肛门癌、成胶质细胞瘤和头颈癌。制备具有F5格式的NKp46×EGFR NKCE蛋白质，掺入了包含来自FDA批准的抗体西妥昔单抗(ErbituxTM)的VH和VL结构域、NKp46-1 VH/VL对和结合人CD16的Fc结构域的EGFR ABD。将该蛋白质与具有相同VH和VL结构域的全长抗EGFR IgG1抗体进行比较。
图24示出了NKp46×EGFR NKCE蛋白质，其Fc结构域结合CD16A，在介导A549靶细胞裂解方面是高度有效的，与全长IgG1抗EGFR抗体一样有效，尽管全长IgG1具有以二价结合EGFR的能力。
ROR1：
ROR1(受体酪氨酸激酶样孤儿受体1)是糖基化I型膜蛋白，其属于细胞表面受体的ROR亚家族。它是缺乏催化活性并且可能与非经典Wnt信号传导途径相互作用的假激酶。ROR1在成人组织中以非常低的水平表达，但发现最初在B细胞慢性淋巴细胞白血病中以较高的水平表达。随后发现ROR1在源自不同组织阵列的人癌症(包括例如乳腺癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌)中适度或强烈表达。制备具有F5格式的NKp46×ROR1 NKCE蛋白质，掺入了NKp46-1 ABD和结合人CD16的Fc结构域。将该蛋白质与具有相同VH和VL结构域的全长IgG1抗ROR1抗体进行比较。
图25示出了NKp46×ROR1 NKCE蛋白质，其Fc结构域结合CD16A，在介导Mino肿瘤靶细胞裂解方面是高度有效的，而且具有大于十倍的全长IgG1抗ROR1抗体的效力，尽管全长IgG1具有以二价结合ROR1的能力。
KIR3DL2
KIR3DL2(CD158k)是在健康循环NK和CD8+T淋巴细胞的亚群上表达的细胞表面受体。还在皮肤T细胞淋巴瘤和多种类型的外周T细胞淋巴瘤中的恶性肿瘤细胞的表面上发现了KIR3DL2。制备具有格式5的结构的NKp46×KIR3DL2 NKCE，掺入了NKp46-1 ABD和结合人CD16的Fc结构域。将该蛋白质与具有相同VH和VL结构域的全长IgG1抗KIR3DL2抗体进行比较。
图26示出了NKp46×KIR3DL2 NKCE蛋白质，其Fc结构域结合CD16A，在介导HUT78肿瘤靶细胞裂解方面是高度有效的，而且它比全长IgG1抗KIR3DL2抗体显著更有效，尽管全长IgG1具有以二价结合KIR3DL2的能力。
实施例19：NKCE-IL15促进NK细胞的活化
如含有IL-2v的NKCE分子那样制备图2的“T5”格式的异源三聚体结合NKp46的NKCE蛋白质，但包含野生型IL-15部分代替IL-2v部分，并评估其促进NK细胞的IL-2R活化的能力。通过掺入来自FDA批准的人源化抗体GA101的抗CD20 VH/VL对，使NKCE结合CD20。
评估异源三聚体含有Fc结构域的蛋白质CD20-T5A-NKp46-IL15活化NK细胞中细胞因子受体信号传导的能力。CD20-T5A-NKp46-IL15蛋白质具有图2G中所示的结构域结构(结构T5A)和表6中所示的氨基酸序列以及SEQ ID NO:447-479的多肽链，并且具有结合定位在N末端的CD20的抗原结合结构域，并掺入了定位在C末端的IL15、野生型Fc结构域(即结合人CD16A)以及结合源自置于Fc结构域和IL15部分之间的VH/VL对NKp46-4的NKp46的抗原结合结构域。还测试了CD20-T6AB3-IC-IL15蛋白质，其具有与CD20-T5A-NKp46-IL15相同的氨基酸序列，除了NKp46结合VH/VL对被不与实验系统中的任何抗原结合的VH/VL对取代，并且Fc结构域包含突变N297S(Kabat EU编号)以消除与CD16A的结合。
简言之，将1M/孔纯化的PBMC接种于96孔板中，并在37℃下用递增剂量的NKCE-IL15处理20分钟。然后通过流式细胞术分析NK细胞上的STAT5磷酸化(CD3-CD56+)。
结果示于图27中，示出了y轴上的NK细胞中pSTAT5细胞的％和x轴上的测试蛋白质的浓度。与不结合NKp46或CD16A的CD20-T6AB3-IC-IL15相比，CD20-T5A-NKp46-IL15在NK细胞中诱导STAT5磷酸化的EC50降低至少一个数量级。
实施例20：NKCE-IL15促进NK细胞增殖
在该实验中，评估了含有野生型IL15的NK细胞衔接子蛋白质CD20-T5A-NKp46-IL15和CD20-T6AB3-ICb-IL15在温育6天后诱导NK细胞、CD4 T细胞或CD8 T细胞增殖的能力。
简言之，将CellTraceViolet标记纯化的PBMC与一定量范围的NKCE-IL15一起培养6天。通过定量示出通过流式细胞术监测的稀释的CellTraceViolet(CTV)信号的细胞在NK细胞(CD3-CD56+)、CD4 T细胞(CD3+CD4+)和CD8 T细胞(CD3+CD8+)上的百分比来评价细胞增殖。
结果示于图28中，示出了y轴上的增殖的NK、CD4 T或CD8 T细胞的％和x轴上的测试蛋白质的浓度。CD20-T5A-NKp46-IL15导致明显的NK细胞增殖，与不结合NKp46或CD16A的CD20-T6AB3-IC-IL15蛋白质相比，NK细胞增殖的效力增加了至少1-log。效力的增加对NK细胞具有选择性，因为CD20-T5A-NKp46-IL15诱导CD4和CD8 T细胞增殖的效力没有增加。
实施例21：在标准体外细胞毒性测定中，NKCE-IL15促进了肿瘤细胞杀伤
在该实验中，评估了含有野生型IL15的NK细胞衔接子蛋白质CD20-T5A-NKp46-IL15和IC-T5A-NKp46-IL15诱导纯化的人NK细胞杀伤RAJI肿瘤细胞的能力。IC-T5A-NKp46-IL15蛋白质与CD20-T5A-NKp46-IL15相同，除了结合CD20的VH/VL对被不与实验系统中存在的任何抗原结合的VH/VL对(IC)取代。简言之，将纯化的NK细胞与先前装载有钙黄绿素的Raji肿瘤细胞以10:1的比例共培养。在培养箱中于37℃、5.5％ CO2下，将细胞与上述测试蛋白质NKCE-IL15一起温育4小时。
结果示于图29中，示出了y轴上的NK细胞诱导的特异性裂解％和x轴上的测试蛋白质的浓度。缺乏与靶细胞上的CD20结合的IC-T5A-NKp46-IL15不诱导显著的细胞毒性。另一方面，就EC50值而言，CD20-T5A-NKp46-IL15在诱导针对肿瘤细胞的NK细胞细胞毒性方面显示出高效力。
实施例22：NKCE-IL18v重定向IL18v活性以促进NK细胞的活化
如含有IL-2v的NKCE分子那样制备图2G的“T5A”格式的异源三聚体结合NKp46的NKCE蛋白质，但具有IL-18(IL-18v)部分的变体代替IL-2v部分，并评估其促进NK细胞的IL-18R活化的能力。制备具有图2I的“T6AB3”结构的对照蛋白质。通过掺入来自FDA批准的人源化抗体GA101的抗CD20 VH/VL对，使NKCE蛋白质结合CD20。
评估异源三聚体含有Fc结构域的蛋白质CD20-T5A-NKp46-IL18v活化NK细胞的能力。CD20-T5A-NKp46-IL18v蛋白质具有图2G中所示的结构域结构和表6中所示的氨基酸序列以及SEQ ID NO:486-488的多肽链，具有结合定位在N末端的CD20的抗原结合结构域，并掺入了定位在C末端的IL18v、野生型Fc结构域(即结合人CD16A)以及结合源自置于Fc结构域和IL18v部分之间的VH/VL对NKp46-4的NKp46的抗原结合结构域。不结合NKp46或CD16A的CD20-T6AB3-IC-IL18v蛋白质用作不结合NK细胞的对照分子。
简言之，将0.1M/孔的纯化的NK细胞接种于96孔板中，并在存在10ng/mL IL-12的情况下用递增剂量的每种NKCE-IL18v蛋白质处理过夜。通过流式细胞术分析细胞中表达CD69的细胞和表达CD69的medFI的百分比。
结果示于图30中，左图示出了y轴上的表达CD69的NK细胞的％和x轴上的测试蛋白质的浓度右图示出了NK细胞中CD69表达的中值荧光强度(medFI)。与不结合NK细胞上的CD16A或NKp46的CD20-T6AB3-IC-IL18v相比，CD20-T5A-NKp46-IL18v诱导活化NK细胞的EC50的两个数量级范围的降低。
实施例23：NKCE-IL18v重定向IL18v活性以促进NK细胞的IFNγ生产
在该实验中，评估含有IL18v的NK细胞衔接子蛋白质CD20-T5A-NKp46-IL18v和CD20-T6AB3-IC-IL18v促进NK细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)的能力。在96孔板中，在存在10ng/mL的IL-12的情况下，用CD20-T5A-NKp46-IL18v或CD20-T6AB3-IC-IL18v处理纯化的NK细胞过夜。IFN-γ通过流式细胞术分析。
结果示于图31中，其中y轴上的表示IFN-γ的NK细胞的％和x轴上的试验蛋白质的浓度。与不结合NK细胞上的CD16A或NKp46的CD20-T6AB3-IC-IL18v相比，CD20-T5A-NKp46-IL18v诱导活化NK细胞的EC50的两个数量级范围的降低。
实施例24：NKCE-IL18v促进NK细胞增殖
在该实验中，评估了含有IL18v的NK细胞衔接子蛋白质CD20-T5A-NKp46-IL18v和CD20-T6AB3-IC-IL18v在温育6天后诱导NK细胞、CD4 T细胞或CD8 T细胞增殖的能力。CD20-T6AB3-IC-IL18v蛋白质具有与CD20-T5A-NKp46-IL18v相同的氨基酸序列，除了NKp46结合VH/VL对被不与实验系统中的任何抗原结合的VH/VL对取代，并且Fc结构域包含突变N297S以消除与CD16A的结合。
简言之，将CellTraceViolet标记纯化的PBMC与一定量范围的NKCE-IL18v一起培养6天天。通过定量示出通过流式细胞术监测的稀释的CellTraceViolet(CTV)信号的细胞在NK细胞(CD3-CD56+)、CD4 T细胞(CD3+CD4+)和CD8 T细胞(CD3+CD8+)上的百分比来评价细胞增殖。
结果示于图32中，示出了y轴上的增殖的NK、CD4 T或CD8 T细胞的％和x轴上的测试蛋白质的浓度。CD20-T5A-NKp46-IL18v导致明显的NK细胞增殖。不结合CD16A或NKp46的CD20-T6AB3-IC-IL18v蛋白质未示出NK细胞的显著活化。CD20A-T5-NKp46-IL18v的明显的NK细胞增殖对NK细胞是选择性的，因为在CD4或CD8 T细胞中没有诱导显著的增殖。CD20-T6AB3-IC-IL18v也没有示出对CD4或CD8 T细胞增殖的显著诱导。
实施例25：在标准体外细胞毒性测定中，NKCE-IL18v促进了肿瘤细胞杀伤
在该实验中，评估了含有IL18v的NK细胞衔接子蛋白质CD20-T5A-NKp46-IL18v和IC-T5A-NKp46-IL18v诱导来自人供体的NK细胞杀伤RAJI肿瘤细胞的能力。IC-T5A-NKp46-IL18v蛋白质与CD20-T5A-NKp46-IL18v相同，除了结合CD20的VH/VL对被不与实验系统中存在的任何抗原结合的VH/VL对(IC)取代。
简言之，将人纯化的NK细胞与先前装载有钙黄绿素的Raji肿瘤细胞以10:1的比例共培养。在培养箱中于37℃、5.5％ CO2下，将细胞与测试NKCE-IL18v蛋白质一起温育4小时。
结果示于图33中，示出了y轴上的NK细胞诱导的特异性裂解％和x轴上的测试蛋白质的浓度。缺乏与靶细胞上的CD20结合的IC-T5A-NKp46-IL18v不诱导显著的细胞毒性。另一方面，就EC50值而言，CD20-T5A-NKp46-IL18v在诱导针对肿瘤细胞的NK细胞细胞毒性方面显示出高效力。
实施例26：NK细胞靶向将IFNαv活性重定向至NK细胞以促进活化
如含有IL-2v的NKCE分子那样制备图2的“T5A”格式的异源三聚体结合NKp46的NKCE蛋白质，但包含变体IFNα(IFNαv)部分代替IL-2v部分，并评估其促进IFNAR介导的NK细胞活化的能力。通过掺入来自FDA批准的人源化抗体GA101的抗CD20 VH/VL对，使NKCE结合CD20。
评价异源三聚体含有Fc结构域的蛋白质CD20-T5A-NKp46-IFNαv活化NK细胞的能力。CD20-T5A-NKp46-IFNαv蛋白质具有图2G中所示的结构域结构和表6中所示的氨基酸序列以及SEQ ID NO:495-497的多肽链，并且具有结合定位在N末端的CD20的抗原结合结构域，并掺入了定位在C末端的IFNαv、野生型Fc结构域(即结合人CD16A)以及结合源自置于Fc结构域和IFNαv部分之间的VH/VL对NKp46-4的NKp46的抗原结合结构域。作为对照，还测试了CD20-T6AB3-IC-IFNαv蛋白值，其具有与CD20-T5A-NKp46-IFNαv相同的氨基酸序列，除了NKp46结合VH/VL对被不与实验系统中的任何抗原结合的VH/VL对取代，并且Fc结构域包含突变N297S以消除与CD16A的结合。
简言之，将1M/孔纯化的PBMC接种于96孔板中，并在37℃下用递增剂量的NKCE-IFNαv处理20分钟。然后通过流式细胞术分析NK细胞(CD3-CD56+)、CD4 T细胞(CD3+CD4+)和CD8T细胞(CD3+CD8+)上的STAT3磷酸化。
结果示于图34中，示出了y轴上的NK细胞中pSTAT3细胞的％、CD4T或CD8 T细胞的％和x轴上的测试蛋白质的浓度。与不诱导任何显著的NK细胞活化的CD20-T6AB3-IC-IFNαv相比，CD20-T5A-NKp46-IFNαv在NK细胞中诱导有效的STAT3磷酸化。CD20-T5A-NKp46-IFNαv的有效NK细胞活化活性对NK细胞是选择性的，因为不存在CD4或CD8 T细胞的显著活化。
实施例27：在标准体外细胞毒性测定中，NKCE-IFNαv促进了肿瘤细胞杀伤
在该实验中，评估了含有IFNαv的NK细胞衔接子蛋白质CD20-T5A-NKp46-IFNαv和IC-T5A-NKp46-IFNαv诱导NK细胞杀伤RAJI肿瘤细胞的能力。IC-T5A-NKp46-IFNαv蛋白质与CD20-T5A-NKp46-IFNαv相同，除了结合CD20的VH/VL对被不与实验系统中存在的任何抗原结合的VH/VL对(IC)取代。
简言之，将人纯化的NK细胞与先前装载有钙黄绿素的Raji肿瘤细胞以10:1的比例共培养。在培养箱中于37℃、5.5％ CO2下，将细胞与测试NKCE-IFNαv蛋白质一起温育4小时。
结果示于图35中，示出了y轴上的NK细胞诱导的特异性裂解％和x轴上的测试蛋白质的浓度。缺乏与靶细胞上的CD20结合的IC-T5A-NKp46-IFNαv不诱导显著的细胞毒性。另一方面，就EC50值而言，CD20-T5A-NKp46-IFNαv在诱导针对肿瘤细胞的NK细胞细胞毒性方面显示出高效力。
实施例28：NKCE-IL2v在非人灵长类动物体内诱导最小的全身细胞因子释放
按照在CD20-T5-NKp46-IL2v治疗后在小鼠中观察到的有利的安全性特征(参见实施例18)，我们评估了在非人灵长类动物中用NK细胞衔接子GA101-T5-NKp46-IL2v(SEQ IDNO:175-177)治疗的效果。对食蟹猴进行单次静脉内注射0.05mg/kg体重(低剂量)或0.5mg/kg体重(高剂量)的CD20-T5-NKp46-IL2v(与CD16A结合)或0.5mg/kg的GA101-T6-NKp46-IL2v(SEQ ID NO:184-186；N297S突变导致缺乏与CD16A的结合)，每个剂量水平四只动物。
图36示出了在用NKCE蛋白质处理之前14天和之后30天(处理是第0天)的B细胞计数(个细胞/μL)自基线的差异，示出了NKCE蛋白质诱导B细胞耗竭，而对照(媒介物)不诱导B细胞耗竭。
图37示出了在施用NKCE蛋白质后24小时过程内的不同细胞因子的产生。对于治疗后的每个时间点，以ng/mL血清示出细胞因子的血浆浓度。这些数据示出，CD20-T5-NKp46-IL2v在治疗后24小时期间仅诱导最小的全身性细胞因子产生，从而表明CD20-T5-NKp46-IL2v不涉及免疫毒性，尽管其有效的细胞耗竭活性。考虑到在使用T细胞衔接子蛋白质的比较实验中观察到的细胞因子浓度值，安全特性是特别显著的，例如Engelberts等人(Ebiomedicine，2020年，第52卷：第102625页)报道了在施用1mg/kg-CD3xCD20(一种识别CD3和CD20的全长人IgG1双特异性抗体(bsAb)，通过受控的Fab-臂交换产生，通过引入突变使Fc结构域沉默)后的以下值，：IFN-γ(大于1ng/mL)、IL-6(大于8ng/mL)、TNFα(大于1.7ng/mL)、IL-10(大于10ng/mL)、IL-8(大于5ng/mL)、MCP(大于500ng/mL)。
在注射位点没有观察到反应。以1至30的等级进行行为评分，其中20至30表示增加的严重痛苦，12至20表示增加的痛苦迹象，12表示行为的强烈改变，7表示中度行为改变，并且1表示健康个体。NKCE不会导致任何痛苦，并且还远低于与甚至中等行为改变相关的程度。在临床检查时，观察到的所有参数都保持在正常值范围内。在血分析时，对于用NKCE处理的动物观察到的所有参数通常保持类似于媒介物并且在值的正常范围内，包括钠、钾、氯、碳酸氢盐、磷、铁蛋白和果糖胺、白蛋白、球蛋白、肌酸酐、脲、总蛋白、胆固醇、甘油三酯、ALAT、ASAT和碱性磷酸酯酶的血水平。图38示出了用NKCE或媒介物处理的动物在从处理前14天至处理后30天的时间段内的红细胞、血小板、血红蛋白、血细胞比容、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白和平均红细胞血红蛋白浓度的平均值。图39示出了在从处理前14天至处理后30天的时间段内，白细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱细胞的平均水平。图40示出了在从处理前14天至处理后30天的时间段内，非人灵长类动物中NK细胞、CD8+T细胞、FoxP3-CD4+T细胞和FoxP3+CD4+T细胞的平均水平。所有NKCE蛋白质在第3天和第7天诱导NK细胞的扩增。在高剂量蛋白质的CD20-T5-NKp46-IL2v和CD20-T6-NKp46-IL2v两者中观察到CD8+T细胞的增加，但在低剂量的CD20-T5-NKp46-IL2v中没有观察到。用CD20-T6-NKp46-IL2v观察到FoxP3+CD4+T细胞的增加，但用低或高剂量的CD20-T5-NKp46-IL2v没有观察到。
实施例29：NKCE-IL2v疗法增加了免疫活性小鼠的瘤床中的NK细胞
在免疫活性小鼠实体瘤模型中评估NKCE-IL2v蛋白质对NK细胞的瘤内累积的影响。
简言之，将表达huCD20(人CD20)的B16F10黑素瘤细胞移植到C57BL6小鼠。在第1天和第8天，用25μg的CD20-T5-NKp46-IL2v处理小鼠。在第13天通过流式细胞术分析肿瘤的NK细胞浸润。NK细胞被鉴定为NK1.1+CD3-。
结果示于图41中。在没有用CD20-T5-NKp46-IL2v处理的情况下，NK细胞(NK1.1+CD3-)代表肿瘤中20.4％的CD45+细胞。然而，当用CD20-T5-NKp46-IL2v处理小鼠时，NK细胞(NK1.1+CD3-)占肿瘤内总CD45+细胞的50.4％，证明了NKCE-IL2v刺激NK细胞在肿瘤部位累积的强能力。
实施例30：NKCE-IL2v处理在免疫受损小鼠的脾中诱导NK细胞扩增和活化
在其中NK细胞保持功能性的免疫受损小鼠模型中评估NKCE-IL2v蛋白质对NK数量和瘤隔室外部的活化细胞的影响。
简言之，携带RAJI sc肿瘤的CB17 SCID(免疫失能的)用70μg CD20-T5-NKp46-IL2v、125μg CD20-F5-NKp46(与CD20-T5-NKp46-IL2v共享相同的结构，但缺乏IL2v部分)或600μg奥妥珠单抗的单次i.v注射来处理。在处理之后3天，通过流式细胞术分析脾的NK细胞数量、CD69和Ki67表达。
结果示于图42中。而用CD20-F5-NKp46和奥妥珠单抗处理没有增加NK细胞的数量，用CD20-T5-NKp46-IL2v处理引起了脾细胞中NK细胞的明显增加。另外，虽然用CD20-F5-NKp46或奥妥珠单抗处理没有增加活化或增殖的NK细胞在总NK细胞中的比例，但用CD20-T5-NKp46-IL2v处理引起活化或增殖的NK细胞在总NK细胞中的明显增加。这些数据表明，NKCE-IL2v可将NK细胞群体扩增到肿瘤微环境之外，从而产生可潜在促成免疫受损小鼠中的抗肿瘤活性的NK细胞库。
实施例31：NKCE-IL2v处理在免疫活性荷瘤小鼠的血液和脾中诱导NK细胞扩增和 活化
评估了NKCE-IL2v蛋白质对携带实体瘤的免疫活性小鼠的血液和脾中的NK细胞数量和活化的影响。
简言之，用25μg的CD20-T5-NKp46-IL2v以单次i.v注射处理携带huCD20B16F10(表达人CD20的小鼠B16F10细胞)皮下肿瘤的C57BL6小鼠(免疫活性)。在处理之后第+4天，通过流式细胞术分析脾和血液中的NK细胞数量和CD69表达。
结果示于图43中。用CD20-T5-NKp46-IL2v处理导致每μl血液的NK细胞数量以及脾中的NK细胞数量的明显增加。另外，用CD20-T5-NKp46-IL2v处理导致血液和脾中的NK细胞中活化的(表达CD69的)NK细胞的明显增加。脾和血液中的大部分细胞都被活化(与对照(载体)处理的小鼠中的20％相比，80％的NK细胞是CD69阳性的)。这些数据表明，NKCE-IL2v可在血液和脾中扩增NK细胞群体，从而产生可潜在促成免疫活性小鼠中的抗肿瘤活性的NK细胞库。
实施例32：抗NKp46抗体的表位作图
A.竞争测定
根据下述方法通过表面等离子共振(SPR)进行竞争测定。
在25℃下在Biacore T100设备(通用电气医疗集团的Biacore)上进行SPR测量。在所有Biacore实验中，HBS-EP+(通用电气医疗集团的Biacore)和NaOH 10mM NaCl 500mM分别用作运行缓冲液和再生缓冲液。用Biacore T100评价软件对传感图进行分析。抗6xHis标签抗体购自QIAGEN。在Innate Pharma克隆、产生和纯化人6xHis标记的NKp46重组蛋白质(NKp46-His)。
将抗His抗体共价固定到传感器Chip CM5上的葡聚糖层中的羧基。用EDC/NHS(N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(通用电气医疗集团的Biacore)活化芯片表面。在偶联缓冲液(10mM乙酸盐，pH 5.6)中将蛋白质-A和抗His抗体稀释到10μg/ml，并且注射直至达到合适的固定水平(即，2000RU至2500RU)。使用100mM乙醇胺pH 8(通用电气医疗集团的Biacore)进行剩余活化基团的失活。
将具有对应于NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3或NKp46-4的NKp46结合区的亲本常规人IgG1嵌合抗体用于使用抗6xHis标签抗体芯片进行的竞争研究。将1μg/mL的具有基于NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3或NKp46-4的NKp46结合区的双特异性抗体捕获到蛋白质-A芯片上，并将5μg/mL的重组人NKp46蛋白质与NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3或NKp46-4组的第二测试双特异性抗体一起注射。
结果证明，NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3或NKp46-4中没有一个彼此竞争与NKp46结合。因此，这些抗体各自与不同的NKp46表位结合或相互作用。
B.与NKp46突变体的结合
为了定义这些抗NKp46抗体的表位，我们设计了NKp46突变体，这些突变体由暴露在分子表面的NKp46的2个结构域上的氨基酸的一个、两个或三个置换来定义。该方法导致产生42个突变体，这些突变体被转染到Hek-293T细胞中，如下表所示。下表9中的靶向氨基酸突变均根据SEQ ID NO:1的编号示出(也对应于以下文献中使用的编号：Jaron-Mendelson等人(2012年)，J.Immunol.，第88卷第12期：第6165-74页。
表9
C.突变体的生成
通过PCR生成NKp46突变体。扩增的序列在琼脂糖凝胶上电泳，并且使用MachereyNagel PCR Clean-Up Gel Extraction试剂盒纯化。然后用ClonTech InFusion系统将为每种突变体生成的两种或三种纯化的PCR产物连接到表达载体中。将含有突变序列的载体制备成Miniprep并且测序。测序之后，使用Promega PureYieldTM质粒Midiprep系统，将含有突变序列的载体制备成Midiprep。在测试转基因表达之前，使HEK293T细胞在DMEM培养基(英杰公司(Invitrogen))中生长，使用英杰公司的Lipofectamine2000用载体转染并且在37℃下在CO2温育箱中温育24小时。
D.流式细胞术分析抗NKp46与HEK293T转染的细胞的结合
通过流式细胞术测试所有抗NKp46抗体与每个突变体的结合。进行第一实验，以鉴定在特定浓度(10μg/ml)下丧失与一个或几个突变体的结合的抗体。为了确认结合的丧失，使用结合似乎受NKp46突变影响的抗体进行了抗体滴定(1–0,1–0,01–0,001μg/ml)。
E.结果
与野生型NK46相比，抗体NKp46-1降低了与突变体2(在残基K41、E42和E119处具有突变)(编号为NKp46野生型)的结合。类似地，NKp46-1也降低了与补充突变体Supp7(在残基Y121和Y194处具有突变)的结合。
抗体NKp46-3降低了与突变体19(在残基I135和S136处具有突变)的结合。类似地，NKp46-3也降低了与补充突变体Supp8(在残基P132和E133处具有突变)的结合。
抗体NKp46-4降低了与突变体6(在残基R101和V102处具有突变)的结合。类似地，NKp46-4也降低了与在残基E104和L105处具有突变的补充突变体Supp6的结合。
使用这些方法，我们鉴定了抗NKp46抗体NKp46-1、NKp46-3和NKp46-4的表位。我们确定NKp46-4、NKp46-3和NKp46-1的表位分别位于NKp46 D1结构域、D2结构域和D1/D2结合部处。R101、V102、E104和L105是NKp46-4结合的必需残基，并且限定NKp46-4表位的一部分。NKp46-1表位的表位包括K41、E42、E119、Y121和Y194残基。NKp46-3的表位包括P132、E133、I135和S136残基。
本文所使用的所有标题和副标题仅是为了方便起见，并且不应被解释为以任何方式限制本发明。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素在其所有可能变化形式中的任何组合。除非本文中另有说明，否则本文中数值范围的列举仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独数值的速记方法，并且每个单独数值被并入说明书中，如同其在本文中被单独列举一样。除非另外指明，否则本文提供的所有精确值都表示对应的近似值(例如，相对于特定因子或测量值提供的所有精确示例性值可被认为也提供对应的近似测量值，在适当的情况下由“约”修饰)。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以任何合适的顺序进行。
除非另外指示，否则本文所提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地描述本发明并且不对本发明的范围构成限制。除非明确说明，否则本说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何元素对于本发明的实践是必要的。
除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文参考一个或多个元素使用诸如术语对本发明的任何方面或实施方案的描述旨在为“由一个或多个特定元素组成”、“基本上由一个或多个特定元素组成”或“基本上包含一个或多个特定元素”的本发明的类似方面或实施方案提供支持(例如，除非另外指明或与上下文明显矛盾，否则本文描述为包含特定元素的组合物应当理解为也描述由该元素组成的组合物)。
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在本说明书中引用的所有出版物和专利申请以引用方式整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被明确以及各自指示以引用方式并入。
尽管为了清楚理解的目的，已通过说明和示例的方式相当详细地描述了前述发明，但是根据本发明的教导，本领域的普通技术人员将容易明白，在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下，可对其进行某些改变和修改。
序列表
<110> 先天制药公司
<120> 用于结合NKp46的NK细胞衔接子蛋白的细胞因子锚
<130> NKp46-12
<150> US 63/166,374
<151> 2021年3月26日
<160> 509
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 304
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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Tyr Thr Ser Gln Gln Gly Asn Thr Arg Pro Trp Thr
1 5 10
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 31
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 32
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 33
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala
1 5
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 34
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<213> 小家鼠
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<213> 小家鼠
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<213> 小家鼠
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Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Gly Val Phe Ala
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<213> 小家鼠
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<213> 小家鼠
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<213> 小家鼠
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<213> 小家鼠
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Gly
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<211> 8
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<213> 小家鼠
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<213> 小家鼠
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<213> 小家鼠
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Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe Thr
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<211> 17
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<213> 小家鼠
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Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
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Asp
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<213> 小家鼠
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Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr
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<211> 8
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<213> 小家鼠
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<213> 小家鼠
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<213> 小家鼠
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<213> 小家鼠
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Gly
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<213> 小家鼠
<400> 77
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<213> 小家鼠
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<213> 小家鼠
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<213> 小家鼠
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Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu His
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<213> 小家鼠
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Gly Arg Phe Asp Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 82
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<213> 小家鼠
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Gly His Ser Phe Leu Met Tyr
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<213> 小家鼠
<400> 84
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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<213> 小家鼠
<400> 86
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<213> 小家鼠
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 88
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 89
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<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 91
Ala Arg Cys Trp Asp Tyr Ala Leu Tyr Ala Met Asp Cys
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 92
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<213> 小家鼠
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Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu
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<213> 小家鼠
<400> 94
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<213> 小家鼠
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<213> 小家鼠
<400> 96
Gln His His Tyr Asp Thr Pro Leu Thr
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<213> 小家鼠
<400> 97
Asn Tyr Gly Met Asn
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 98
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1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 99
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 100
Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 101
Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 102
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1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 103
Tyr Leu Tyr Tyr Phe Asp
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 104
Ala Arg Asp Tyr Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 105
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1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 106
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<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 107
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<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 108
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<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 109
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<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 110
Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 111
Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合
<400> 112
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ala Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合
<400> 113
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Val Ile Asn Trp Gly Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ala Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
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Ala Arg Arg Gly Arg Tyr Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合
<400> 114
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合
<400> 115
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Asp
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合
<400> 116
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Asp
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Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Glu Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Gly Val Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 117
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合
<400> 117
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
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50 55 60
Glu Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Gly Val Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 118
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合
<400> 118
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 119
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合
<400> 119
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Arg Gly Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 120
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合
<400> 120
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Ser Pro Asn Ile Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 121
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合
<400> 121
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
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50 55 60
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Arg Gly Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
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Thr Val Ser Ser
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65 70 75 80
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 149
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Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Gln Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Thr Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 151
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ser Ser Gln Asp Ile Asn Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Asp Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 152
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly
100 105 110
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 153
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 154
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn His
20 25 30
Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Pro Gly Tyr His Ala Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 155
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> 智人
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
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<213> 智人
<400> 157
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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<223> 合成
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 163
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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<223> 合成
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 165
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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<220>
<223> 合成
<400> 172
Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser
1 5 10
<210> 173
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 173
Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 174
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 174
Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser
1 5 10 15
<210> 175
<211> 446
<212> PRT
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<220>
<223> 合成
<400> 175
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 176
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
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Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Ser Thr Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
450 455 460
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
465 470 475 480
Phe Ser Asp Tyr Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
485 490 495
Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Tyr
500 505 510
Asn Glu Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr
515 520 525
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
530 535 540
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Arg Tyr Gly Leu Tyr Ala Met Asp
545 550 555 560
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Arg Thr Val Ala
565 570 575
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
580 585 590
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
595 600 605
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
610 615 620
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
625 630 635 640
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
645 650 655
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
660 665 670
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
675
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<211> 358
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 177
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Arg Pro Trp
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
130 135 140
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
145 150 155 160
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
165 170 175
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
180 185 190
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
195 200 205
Ser Cys Asp Lys Thr His Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser
210 215 220
Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
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His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
245 250 255
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro
260 265 270
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
275 280 285
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
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Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
305 310 315 320
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
325 330 335
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser
340 345 350
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
355
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<211> 446
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 178
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
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Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
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Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
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Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 179
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
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Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
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165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Ser Thr Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
450 455 460
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
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Phe Ser Asp Tyr Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
485 490 495
Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Tyr
500 505 510
Asn Glu Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr
515 520 525
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
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Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Arg Tyr Gly Leu Tyr Ala Met Asp
545 550 555 560
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Arg Thr Val Ala
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Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
580 585 590
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
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Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
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Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
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Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
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Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
660 665 670
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
675
<210> 180
<211> 353
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 180
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Arg Pro Trp
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100 105 110
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Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
130 135 140
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
145 150 155 160
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
165 170 175
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
180 185 190
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
195 200 205
Ser Cys Asp Lys Thr His Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ala Pro Ala Ser
210 215 220
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
225 230 235 240
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
245 250 255
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Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
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Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
340 345 350
Thr
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 181
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
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Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
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Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
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Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<211> 679
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 182
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
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Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
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Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Ser Thr Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
450 455 460
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
465 470 475 480
Phe Ser Asp Tyr Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
485 490 495
Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Tyr
500 505 510
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515 520 525
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Arg Thr Val Ala
565 570 575
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580 585 590
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
595 600 605
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
610 615 620
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
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Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
645 650 655
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
660 665 670
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
675
<210> 183
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 183
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Arg Pro Trp
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
180 185 190
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
195 200 205
Ser Cys Asp Lys Thr His Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser
210 215 220
Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr
225 230 235 240
Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn
245 250 255
Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala
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Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys
275 280 285
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290 295 300
Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn
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Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu
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Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile
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Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
355 360
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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<220>
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<223> 合成
<400> 188
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
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Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
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435 440 445
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<211> 679
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<220>
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<400> 191
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Ser Thr Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
450 455 460
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
465 470 475 480
Phe Ser Asp Tyr Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
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Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Tyr
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Asn Glu Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr
515 520 525
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
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Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Arg Tyr Gly Leu Tyr Ala Met Asp
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Arg Thr Val Ala
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Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
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Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<211> 680
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 200
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Ser Thr Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
450 455 460
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
465 470 475 480
Phe Ser Asp Tyr Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
485 490 495
Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Tyr
500 505 510
Asn Glu Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr
515 520 525
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
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Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
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Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
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Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
660 665 670
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Ser
675 680
<210> 201
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 201
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Arg Pro Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser
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Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
275 280 285
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Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
305 310 315 320
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
325 330 335
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
340 345 350
Ile Ser Thr Leu Thr
355
<210> 202
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 202
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
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Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
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275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
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305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
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Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 203
<211> 680
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 203
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Ser Thr Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
450 455 460
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
465 470 475 480
Phe Ser Asp Tyr Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
485 490 495
Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Tyr
500 505 510
Asn Glu Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr
515 520 525
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
530 535 540
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Arg Tyr Gly Leu Tyr Ala Met Asp
545 550 555 560
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
565 570 575
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
580 585 590
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
595 600 605
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
610 615 620
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
625 630 635 640
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
645 650 655
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
660 665 670
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Ser
675 680
<210> 204
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 204
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Arg Pro Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser
210 215 220
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
245 250 255
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325 330 335
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340 345 350
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355
<210> 205
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 205
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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195 200 205
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
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Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
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<211> 839
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 206
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
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Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
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65 70 75 80
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Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
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130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
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165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
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325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Ser Thr Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
450 455 460
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
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Phe Ser Asp Tyr Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
485 490 495
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500 505 510
Asn Glu Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr
515 520 525
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
530 535 540
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Arg Tyr Gly Leu Tyr Ala Met Asp
545 550 555 560
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly
565 570 575
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile
580 585 590
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
595 600 605
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
610 615 620
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr
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Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
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Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
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Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Arg Pro Trp Thr Phe
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Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser
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Ser Ser Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
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Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala
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Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
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<220>
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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<400> 208
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
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100 105 110
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile
580 585 590
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<223> 合成
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
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<213> 人工
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Ser Thr Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
450 455 460
Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
465 470 475 480
Thr Phe Ser Asp Tyr Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
485 490 495
Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Asn Tyr
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Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser
515 520 525
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
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Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Arg Tyr Gly Leu Tyr Ala Met
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Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Ser
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<213> 人工
<220>
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<400> 214
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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65 70 75 80
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<220>
<223> 合成
<400> 215
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<223> 合成
<400> 220
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195 200 205
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
115 120 125
Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val
130 135 140
Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met
145 150 155 160
Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln
165 170 175
Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
210 215 220
Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ala
245 250 255
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
340 345 350
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
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370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Val Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Arg Leu Ala
420 425 430
Ser Tyr Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Thr Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln
465 470 475 480
Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser
485 490 495
Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His Trp Val
500 505 510
Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Ser Pro
515 520 525
Asn Ile Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr
530 535 540
Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser
545 550 555 560
Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Gly
565 570 575
Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala
580 585 590
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595 600 605
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Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
660 665 670
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675 680 685
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
690 695
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<211> 214
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 222
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
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Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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210
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 223
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
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65 70 75 80
Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr
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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
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<400> 224
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
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275 280 285
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Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 225
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
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Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
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Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
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210
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 226
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
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65 70 75 80
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100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
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His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<211> 680
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 227
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
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Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
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Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
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Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
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Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
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Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
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260 265 270
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275 280 285
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Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
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340 345 350
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385 390 395 400
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Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
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Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 228
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 228
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
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Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
165 170 175
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180 185 190
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
195 200 205
Ser Cys Asp Lys Thr His
210
<210> 229
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 229
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro
50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
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245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 230
<211> 680
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 230
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
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Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ser
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
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355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
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420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
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Ser Leu Ser Pro Gly Ser Thr Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser
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Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys
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515 520 525
Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr
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Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
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Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
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Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
660 665 670
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 214
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 231
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu
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Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
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Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
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Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
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Ser Cys Asp Lys Thr His
210
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 232
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
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Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
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Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro
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Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr
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Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
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Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 233
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
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130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
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Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
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Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
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Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
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Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
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Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
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Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Ser Thr Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser
450 455 460
Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys
465 470 475 480
Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln
485 490 495
Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Ser Pro Asn Ile
500 505 510
Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr
515 520 525
Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr
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Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Gly Ser Phe
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Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly
565 570 575
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp
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Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp
595 600 605
Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu
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His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys
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Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
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Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu
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Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu Thr
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Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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<211> 445
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 234
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
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Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
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Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr
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Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
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Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
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His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
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Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
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Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
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Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
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His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<210> 235
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 235
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
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Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
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Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
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405 410 415
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420 425 430
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Ser Leu Ser Pro Gly Ser Thr Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser
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485 490 495
Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Ser Pro Asn Ile
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515 520 525
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545 550 555 560
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly
565 570 575
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp
580 585 590
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595 600 605
Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu
610 615 620
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys
625 630 635 640
Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
645 650 655
Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu
660 665 670
Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu Thr
675 680 685
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
690 695
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<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 236
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ala Arg
<210> 237
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 237
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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Ala Arg
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<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 238
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
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50 55 60
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Ala Thr
<210> 239
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 239
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
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<213> 智人
<400> 240
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Arg
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Thr Pro Phe Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Arg Ser Met Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 241
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 241
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 242
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 242
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Ala Val Gln Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Val Val Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala
<210> 243
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 243
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 244
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 244
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr
<210> 245
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 245
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 246
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 246
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 247
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人
<400> 247
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Ala
20 25 30
Arg Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile
100
<210> 248
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人
<400> 248
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala His Arg
100
<210> 249
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人
<400> 249
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile
100
<210> 250
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人
<400> 250
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Arg Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Arg Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Phe Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile
100
<210> 251
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 251
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 252
<211> 97
<212> PRT
<213> 智人
<400> 252
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 253
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人
<400> 253
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr
100
<210> 254
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 254
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 255
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 255
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 256
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 256
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys
<210> 257
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 257
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys
<210> 258
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 258
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 259
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 259
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 260
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 260
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys
<210> 261
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 261
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 262
<211> 99
<212> PRT
<213> 智人
<400> 262
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp
<210> 263
<211> 99
<212> PRT
<213> 智人
<400> 263
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp
<210> 264
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 264
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 265
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人
<400> 265
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Thr Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg
100
<210> 266
<211> 97
<212> PRT
<213> 智人
<400> 266
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 267
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> X
<222> (46)..(46)
<223> X可以是任何氨基酸
<400> 267
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Glu Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Arg Lys Gly Leu Xaa Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Thr Ser Gly Asp Thr Val Leu Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Gly Thr Val Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys
<210> 268
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 268
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 269
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 269
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys
<210> 270
<211> 97
<212> PRT
<213> 智人
<400> 270
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 271
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 271
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 272
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人
<400> 272
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
20 25 30
Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg
100
<210> 273
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人
<400> 273
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Ser Tyr Ala Thr Ala Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg
100
<210> 274
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 274
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 275
<211> 99
<212> PRT
<213> 智人
<400> 275
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp
<210> 276
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 276
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys
<210> 277
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 277
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Trp Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 278
<211> 99
<212> PRT
<213> 智人
<400> 278
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Gly Tyr Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg
<210> 279
<211> 99
<212> PRT
<213> 智人
<400> 279
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg
<210> 280
<211> 99
<212> PRT
<213> 智人
<400> 280
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Leu Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg
<210> 281
<211> 97
<212> PRT
<213> 智人
<400> 281
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 282
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 282
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 283
<211> 99
<212> PRT
<213> 智人
<400> 283
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg
<210> 284
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 284
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Pro Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Cys Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 285
<211> 97
<212> PRT
<213> 智人
<400> 285
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 286
<211> 99
<212> PRT
<213> 智人
<400> 286
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg
<210> 287
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 287
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 288
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 288
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 289
<211> 101
<212> PRT
<213> 智人
<400> 289
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg
100
<210> 290
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 290
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 291
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 291
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Trp Ala Glu Val Arg Lys Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Ser Phe Ser Gly Phe Thr Ile Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Gln Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Gly Asn Gly Ser Pro Ser Tyr Ala Lys Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Met Thr Arg Asp Met Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Thr Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Tyr
85 90 95
Ala Arg
<210> 292
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 292
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Leu Gly Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Thr Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 293
<211> 86
<212> PRT
<213> 智人
<400> 293
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Thr Ser Tyr Cys Met His Trp Val His Gln Val His Ala Gln Gly
20 25 30
Leu Glu Trp Met Gly Leu Val Cys Pro Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr
35 40 45
Ala Gln Lys Phe Gln Ala Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Met
50 55 60
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
65 70 75 80
Met Tyr Tyr Cys Val Arg
85
<210> 294
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 294
Gln Val Gln Leu Met Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Cys Met His Trp Val Cys Gln Ala His Ala Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Cys Pro Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Met Gly Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg
<210> 295
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 295
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Ser Tyr
20 25 30
Cys Met His Trp Val His Gln Val His Ala Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Cys Pro Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Ala Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Met Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg
<210> 296
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人
<400> 296
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Phe Leu Asn Asp Lys Lys Ser Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Asn Arg Leu Ile Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Trp Arg
100
<210> 297
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 297
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Asp Met Asn Trp Ala Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Lys Asn Arg Arg Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg
<210> 298
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> X
<222> (49)..(49)
<223> X可以是任何氨基酸
<400> 298
Glu Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Lys Pro Ala Trp
1 5 10 15
Ser Pro Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gln Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Cys Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Xaa Gln Val Asn Pro Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Leu Ile Asp Ser Gly
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Asn Thr Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg
<210> 299
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 299
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Asp Met Asn Trp Val His Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Thr Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg
<210> 300
<211> 97
<212> PRT
<213> 智人
<400> 300
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Arg Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Glu Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Arg Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Gly Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Tyr
<210> 301
<211> 96
<212> PRT
<213> 智人
<400> 301
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Arg Gly Val Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Arg Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu His Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Lys
85 90 95
<210> 302
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人
<400> 302
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Met Tyr Leu Gln Met Ser Asn Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg
100
<210> 303
<211> 97
<212> PRT
<213> 智人
<400> 303
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 304
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 304
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Arg Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Tyr Leu Lys Leu Ser Gly Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Gly Ser Trp
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile His Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Cys Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 305
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 305
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Gln Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg
<210> 306
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 306
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Pro Asp Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn His
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Gly Asp Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Ser Pro Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys
<210> 307
<211> 97
<212> PRT
<213> 智人
<400> 307
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 308
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人
<400> 308
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Ala Gly Gly Leu Gly Thr Ala Trp Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Cys Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Cys Ile Lys Ser Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ile Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr
100
<210> 309
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 309
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Pro Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn His
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Gly Asp Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Ser Pro Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys
<210> 310
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 310
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn His
20 25 30
Tyr Thr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ser Ser Gly Asn Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys
<210> 311
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 311
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 312
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 312
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly His Glu Val Lys Gln Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Pro Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Phe Asn Thr Tyr Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Met Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Arg
<210> 313
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> X
<222> (14)..(14)
<223> X可以是任何氨基酸
<400> 313
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1 5 10 15
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20 25 30
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Ala Gly
<210> 314
<211> 95
<212> PRT
<213> 智人
<400> 314
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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<211> 95
<212> PRT
<213> 智人
<400> 315
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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65 70 75 80
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 316
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
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<213> 智人
<400> 317
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20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
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<212> PRT
<213> 智人
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<400> 319
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<213> 智人
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<213> 智人
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<400> 328
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<213> 智人
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<213> 智人
<400> 332
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<210> 335
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> X
<222> (93)..(93)
<223> X可以是任何氨基酸
<400> 336
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<213> 智人
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 346
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
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<213> 智人
<400> 347
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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<213> 智人
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<213> 智人
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Thr Gln Phe Pro
100
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
<400> 364
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<213> 智人
<400> 365
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<213> 智人
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<211> 98
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<213> 智人
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Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
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Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
<210> 381
<211> 94
<212> PRT
<213> 智人
<400> 381
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Leu Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Gly Glu Asn Tyr Ala
20 25 30
Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Glu Asp Ser Glu Arg Tyr Pro Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Ser Gly Asn Thr Thr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Leu Thr Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Gly Asp Glu Asp Asn
85 90
<210> 382
<211> 96
<212> PRT
<213> 智人
<400> 382
Ser Tyr Glu Leu Met Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Thr Tyr
85 90 95
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<211> 94
<212> PRT
<213> 智人
<400> 383
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Ala Lys Lys Tyr Ala
20 25 30
Arg Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Ala Ala Asp Asn Asn
85 90
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<211> 95
<212> PRT
<213> 智人
<400> 384
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Ala
85 90 95
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 385
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Ala Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Ile Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Glu His Ser Thr Tyr Thr
20 25 30
Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Arg Ser Pro Gln Tyr Ile Met
35 40 45
Lys Val Lys Ser Asp Gly Ser His Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Met Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Thr Phe Ser
65 70 75 80
Asn Leu Gln Ser Asp Asp Glu Ala Glu Tyr His Cys Gly Glu Ser His
85 90 95
Thr Ile Asp Gly Gln Val Gly
100
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<211> 99
<212> PRT
<213> 智人
<400> 386
Gln Pro Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly His Ser Ser Tyr Ile
20 25 30
Ile Ala Trp His Gln Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Arg Tyr Leu Met
35 40 45
Lys Leu Glu Gly Ser Gly Ser Tyr Asn Lys Gly Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Asn Leu Gln Leu Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Thr Trp Asp
85 90 95
Ser Asn Thr
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<211> 99
<212> PRT
<213> 智人
<400> 387
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly His Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Ile Ala Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met
35 40 45
Lys Leu Asn Ser Asp Gly Ser His Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Gly
85 90 95
Thr Gly Ile
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<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<400> 388
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ser Ser Ala Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Ala Arg Leu Thr Cys Thr Leu Pro Ser Asp Ile Asn Val Gly Ser
20 25 30
Tyr Asn Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Tyr
35 40 45
Leu Leu Tyr Tyr Tyr Ser Asp Ser Asp Lys Gly Gln Gly Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Thr Gly Ile
65 70 75 80
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Met Ile Trp Pro Ser Asn Ala Ser
100
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<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<400> 389
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Ala Arg Phe Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Val Gly Thr
20 25 30
Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Leu Pro Arg Tyr
35 40 45
Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Thr Asn Ala Gly Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
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Ala Ile Trp Tyr Ser Ser Thr Ser
100
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<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<400> 390
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Val Gly Thr
20 25 30
Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr
35 40 45
Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile
65 70 75 80
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Met Ile Trp His Ser Ser Ala Ser
100
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<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 391
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser His Ser Ala Ser Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Thr Cys Met Leu Ser Ser Gly Phe Ser Val Gly Asp
20 25 30
Phe Trp Ile Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Pro Pro Arg Tyr
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Leu Leu Tyr Tyr His Ser Asp Ser Asn Lys Gly Gln Gly Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Asn Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile
65 70 75 80
Leu Arg Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Thr Trp His Ser Asn Ser Lys Thr
100 105
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<211> 98
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<213> 智人
<400> 392
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Asn
<210> 393
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 393
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Pro Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala
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Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Lys His Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Leu Leu Tyr Tyr Gly Gly
85 90 95
Ala Gln
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<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 394
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr
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Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
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Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Leu Leu Ser Tyr Ser Gly
85 90 95
Ala Arg
<210> 395
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 395
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Tyr Tyr Pro Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Val Leu Tyr Met Gly Ser
85 90 95
Gly Ile
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<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<400> 396
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly Tyr Ser Asn Tyr Lys
20 25 30
Val Asp Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Gly Pro Arg Phe Val Met
35 40 45
Arg Val Gly Thr Gly Gly Ile Val Gly Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Val Leu Gly Ser Gly Leu Asn Arg Tyr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Lys Asn Ile Gln Glu Glu Asp Glu Ser Asp Tyr His Cys Gly Ala Asp
85 90 95
His Gly Ser Gly Ser Asn Phe Val
100
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<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 397
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Met Gly Asn Tyr
20 25 30
Ala Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
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50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Trp
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Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ala Trp Asp Thr Ser Pro
85 90 95
Arg Ala
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<211> 99
<212> PRT
<213> 智人
<400> 398
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Gln Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ala Trp Asp Asn Ser
85 90 95
Leu Asn Ala
<210> 399
<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<400> 399
Arg Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Ala Arg Leu Pro Cys Thr Leu Ser Ser Asp Leu Ser Val Gly Gly
20 25 30
Lys Asn Met Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu
35 40 45
Phe Leu Tyr His Tyr Ser Asp Ser Asp Lys Gln Leu Gly Pro Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Val Ser Gly Ser Lys Glu Thr Ser Ser Asn Thr Ala Phe
65 70 75 80
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gln Val Tyr Glu Ser Ser Ala Asn
100
<210> 400
<211> 99
<212> PRT
<213> 智人
<400> 400
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Phe Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Tyr
20 25 30
Asp His Val Phe Trp Tyr Gln Lys Arg Leu Ser Thr Thr Ser Arg Leu
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Leu Ile Tyr Asn Val Asn Thr Arg Pro Ser Gly Ile Ser Asp Leu Phe
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Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Met Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Lys Ser Glu Val Glu Ala Asn Tyr His Cys Ser Leu Tyr Ser Ser Ser
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Tyr Thr Phe
<210> 401
<211> 96
<212> PRT
<213> 智人
<400> 401
Ser Ser Gly Pro Thr Gln Val Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Met Ala Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Met Glu Gly Ser Tyr Glu
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Asp Ser Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Lys Ser Gly Asn Thr Thr Thr Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Tyr Gln Leu Ile Asp Asn His Ala Thr Gln
85 90 95
<210> 402
<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<400> 402
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Ala Arg Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Leu Gly Ser
20 25 30
Tyr Arg Ile Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Ser Pro Pro Arg Tyr
35 40 45
Leu Leu Ser Tyr Tyr Ser Asp Ser Ser Lys His Gln Gly Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ser Asn Ala Gly Ile
65 70 75 80
Leu Val Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Met Ile Trp His Ser Ser Ala Ser
100
<210> 403
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 403
Gln Ser Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Ser Gly Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Leu Ser Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
His Tyr Pro Arg Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro His Met
35 40 45
Leu Ile Cys Ser Pro Asn Thr Cys Pro Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Thr
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Gln Val Asp Asp Asp Ser Asp His Tyr Cys Val Leu Tyr Met Gly Ser
85 90 95
Gly Asn
<210> 404
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 404
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
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65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
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Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
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Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 405
<211> 130
<212> PRT
<213> 智人
<400> 405
Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu
1 5 10 15
Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys
20 25 30
Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr
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Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
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100 105 110
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115 120 125
Leu Thr
130
<210> 406
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 406
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
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100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 407
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 407
Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu
1 5 10 15
Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys
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Leu Thr Ala Met Leu Thr Lys Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr
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115 120 125
Leu Thr
130
<210> 408
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 408
Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu
1 5 10 15
Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys
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Leu Thr Ala Met Leu Ala Lys Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr
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Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
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100 105 110
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115 120 125
Leu Thr
130
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 409
Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala Leu
1 5
<210> 410
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 410
Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile
1 5
<210> 411
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 411
Ile Thr Ile Leu Gln Ser Trp Ile Phe
1 5
<210> 412
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 412
Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala
1 5 10 15
Leu Met Ile Leu Asn Ile
20
<210> 413
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 413
Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile Ala
1 5 10 15
Arg Leu Phe Glu Ser Gly
20
<210> 414
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 414
Glu Asp Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln
1 5 10 15
Ser Trp Ile Phe Ser
20
<210> 415
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 415
Pro Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala
1 5 10 15
Leu Met Ile Leu Asn Ile Val Lys Thr Asn Ser Pro Pro Ala Glu Glu
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Trp Ile Phe Ser
100
<210> 416
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 416
Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Pro
1 5 10 15
Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala Leu
20 25 30
Met Ile Leu Asn Ile Val Lys Thr Asn Ser Pro Pro Ala Glu Glu Lys
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100 105 110
Ile Phe Ser
115
<210> 417
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 417
Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn
1 5 10 15
Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu
20 25 30
Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile
35 40 45
Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Ser Ser Ser
50 55 60
Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln
65 70 75 80
Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg
85 90 95
Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys
100 105 110
His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu
115 120 125
Asn Leu Ala Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp
130 135 140
Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu
145 150 155 160
Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys
165 170 175
Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser
180 185 190
Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr
195 200 205
Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr
210 215 220
Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly
225 230 235 240
His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile
245 250 255
Tyr His Phe Trp Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr
260 265 270
Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His
275 280 285
Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly
290 295 300
<210> 418
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 418
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 419
<211> 65
<212> PRT
<213> 智人
<400> 419
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg
65
<210> 420
<211> 138
<212> PRT
<213> 智人
<400> 420
His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg
1 5 10 15
Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu
20 25 30
Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu
35 40 45
Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn
50 55 60
Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys
65 70 75 80
Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu
85 90 95
Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe
100 105 110
Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu
115 120 125
Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser
130 135
<210> 421
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X可以是任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (8)..(9)
<223> X可以是任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (11)..(16)
<223> X可以是任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (19)..(19)
<223> X可以是任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (23)..(23)
<223> X可以是任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (65)..(66)
<223> X可以是任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (68)..(73)
<223> X可以是任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (75)..(80)
<223> X可以是任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (109)..(110)
<223> X可以是任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (112)..(113)
<223> X可以是任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (116)..(117)
<223> X可以是任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (119)..(120)
<223> X可以是任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (123)..(123)
<223> X可以是任何氨基酸
<400> 421
Gln Gly Gln Asp Xaa His Met Xaa Xaa Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Val Asp Xaa Leu Lys Asn Xaa Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu
20 25 30
Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser
35 40 45
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
50 55 60
Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys
85 90 95
Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Xaa Xaa Phe Xaa
100 105 110
Xaa Leu Leu Xaa Xaa Met Xaa Xaa Gln His Xaa Ser Ser Arg Thr His
115 120 125
Gly Ser Glu Asp Ser
130
<210> 422
<211> 157
<212> PRT
<213> 智人
<400> 422
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 423
<211> 165
<212> PRT
<213> 智人
<400> 423
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
35 40 45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe
50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65 70 75 80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
85 90 95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
100 105 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
115 120 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
130 135 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Leu Arg Ser Lys Glu
165
<210> 424
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人
<400> 424
Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
35 40 45
Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp
65 70 75 80
Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145 150 155 160
Arg Leu Arg Arg Lys Glu
165
<210> 425
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人
<400> 425
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser His Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe
35 40 45
Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser
65 70 75 80
Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Arg Lys Asp
165
<210> 426
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人
<400> 426
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met
1 5 10 15
Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
35 40 45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr
65 70 75 80
Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Met Met Gln Glu Val Gly Val Glu Asp Thr Pro Leu Met
100 105 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Thr Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ala Asn Leu Gln Glu
145 150 155 160
Arg Leu Arg Arg Lys Glu
165
<210> 427
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人
<400> 427
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
35 40 45
Gln Lys Ala Glu Ala Ile Ser Val Leu His Glu Val Ile Gln Gln Thr
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Val Ala Trp Asp Glu Arg
65 70 75 80
Leu Leu Asp Lys Leu Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Trp Val Gly Gly Thr Pro Leu Met
100 105 110
Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu Gln Glu
145 150 155 160
Arg Leu Arg Arg Lys Glu
165
<210> 428
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人
<400> 428
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Arg Asn Arg Arg Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Glu Phe Arg Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe
35 40 45
Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser
65 70 75 80
Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
Asn Glu Asp Phe Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Lys Lys
145 150 155 160
Gly Leu Arg Arg Lys Asp
165
<210> 429
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人
<400> 429
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Lys Gln Phe
35 40 45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr
65 70 75 80
Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Ile Glu Leu Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ser Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Ile Glu Ser Pro Leu Met
100 105 110
Tyr Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys
145 150 155 160
Arg Leu Lys Ser Lys Glu
165
<210> 430
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人
<400> 430
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Arg Ile Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
35 40 45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser
65 70 75 80
Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Ile Glu Arg Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Arg Lys Asp
165
<210> 431
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人
<400> 431
Cys Asn Leu Ser Gln Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met
1 5 10 15
Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
35 40 45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Met Gln Gln Thr
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65 70 75 80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
85 90 95
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100 105 110
Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Arg Lys Asp
165
<210> 432
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人
<400> 432
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser His Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe
35 40 45
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145 150 155 160
Gly Leu Arg Arg Lys Asp
165
<210> 433
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人
<400> 433
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
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Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser
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Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
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Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys
145 150 155 160
Ile Leu Arg Arg Lys Asp
165
<210> 434
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人
<400> 434
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
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Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
<210> 435
<211> 152
<212> PRT
<213> 智人
<400> 435
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 436
<211> 215
<212> PRT
<213> 智人
<400> 436
Phe Pro Arg Pro Pro Gly Arg Pro Gln Leu Ser Leu Gln Glu Leu Arg
1 5 10 15
Arg Glu Phe Thr Val Ser Leu His Leu Ala Arg Lys Leu Leu Ser Glu
20 25 30
Val Arg Gly Gln Ala His Arg Phe Ala Glu Ser His Leu Pro Gly Val
35 40 45
Asn Leu Tyr Leu Leu Pro Leu Gly Glu Gln Leu Pro Asp Val Ser Leu
50 55 60
Thr Phe Gln Ala Trp Arg Arg Leu Ser Asp Pro Glu Arg Leu Cys Phe
65 70 75 80
Ile Ser Thr Thr Leu Gln Pro Phe His Ala Leu Leu Gly Gly Leu Gly
85 90 95
Thr Gln Gly Arg Trp Thr Asn Met Glu Arg Met Gln Leu Trp Ala Met
100 105 110
Arg Leu Asp Leu Arg Asp Leu Gln Arg His Leu Arg Phe Gln Val Leu
115 120 125
Ala Ala Gly Phe Asn Leu Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
130 135 140
Glu Glu Glu Glu Arg Lys Gly Leu Leu Pro Gly Ala Leu Gly Ser Ala
145 150 155 160
Leu Gln Gly Pro Ala Gln Val Ser Trp Pro Gln Leu Leu Ser Thr Tyr
165 170 175
Arg Leu Leu His Ser Leu Glu Leu Val Leu Ser Arg Ala Val Arg Glu
180 185 190
Leu Leu Leu Leu Ser Lys Ala Gly His Ser Val Trp Pro Leu Gly Phe
195 200 205
Pro Thr Leu Ser Pro Gln Pro
210 215
<210> 437
<211> 209
<212> PRT
<213> 智人
<400> 437
Arg Lys Gly Pro Pro Ala Ala Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Cys Arg
1 5 10 15
Ala Ser Arg Tyr Pro Ile Ala Val Asp Cys Ser Trp Thr Leu Pro Pro
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Thr Ser Thr Ser Cys Thr Ile Thr Asp Val Gln Leu Phe Ser Met Ala
65 70 75 80
Pro Tyr Val Leu Asn Val Thr Ala Val His Pro Trp Gly Ser Ser Ser
85 90 95
Ser Phe Val Pro Phe Ile Thr Glu His Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro
100 105 110
Glu Gly Val Arg Leu Ser Pro Leu Ala Glu Arg Gln Leu Gln Val Gln
115 120 125
Trp Glu Pro Pro Gly Ser Trp Pro Phe Pro Glu Ile Phe Ser Leu Lys
130 135 140
Tyr Trp Ile Arg Tyr Lys Arg Gln Gly Ala Ala Arg Phe His Arg Val
145 150 155 160
Gly Pro Ile Glu Ala Thr Ser Phe Ile Leu Arg Ala Val Arg Pro Arg
165 170 175
Ala Arg Tyr Tyr Val Gln Val Ala Ala Gln Asp Leu Thr Asp Tyr Gly
180 185 190
Glu Leu Ser Asp Trp Ser Leu Pro Ala Thr Ala Thr Met Ser Leu Gly
195 200 205
Lys
<210> 438
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 438
Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu
1 5 10 15
His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys
20 25 30
Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp
35 40 45
His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu
50 55 60
Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr
65 70 75 80
Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe
85 90 95
Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr
100 105 110
Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys
115 120 125
Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu
130 135 140
Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser
145 150 155 160
Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu
165 170 175
Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser
180 185 190
Tyr Leu Asn Ala Ser
195
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 439
Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu
65 70 75 80
Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
85 90 95
Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly
145 150 155 160
Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala
165 170 175
Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala
180 185 190
Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg
195 200 205
Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu
210 215 220
Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp
225 230 235 240
Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln
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Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr
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Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala
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Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro
290 295 300
Cys Ser
305
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<213> 智人
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Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Ser
1 5 10
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<211> 446
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
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Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
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Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
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Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
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Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
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Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
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Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
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Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> 人工
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<223> 合成
<400> 442
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Ser Thr Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
450 455 460
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Arg Thr Val Ala
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Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
580 585 590
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
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Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
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Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
660 665 670
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
675
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 443
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Arg Pro Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ser Thr Lys Gly
100 105 110
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
130 135 140
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
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Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
165 170 175
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
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Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
195 200 205
Ser Cys Asp Lys Thr His Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys
225 230 235 240
Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
245 250 255
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Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser
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Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu
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Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu
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Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile
325 330 335
Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
340
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<211> 446
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 444
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
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65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
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275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
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Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
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Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<211> 679
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 445
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
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Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
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Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
610 615 620
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
625 630 635 640
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
645 650 655
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
660 665 670
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
675
<210> 446
<211> 387
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 446
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Arg Pro Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ser Thr Lys Gly
100 105 110
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
130 135 140
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
145 150 155 160
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
165 170 175
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
180 185 190
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
195 200 205
Ser Cys Asp Lys Thr His Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser
225 230 235 240
Val Ile Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn
245 250 255
Arg Pro Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala
260 265 270
Pro Arg Thr Ile Phe Ile Ile Ser Lys Tyr Gly Asp Ser Gly Ala Arg
275 280 285
Gly Leu Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu
290 295 300
Ser Cys Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp
305 310 315 320
Asn Ile Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Glu Arg Asp Val
325 330 335
Pro Gly His Ser Gly Lys Val Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly
340 345 350
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355 360 365
Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln
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Asn Glu Asp
385
<210> 447
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 447
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
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Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
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Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
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Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 448
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Ser Thr Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
450 455 460
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
465 470 475 480
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485 490 495
Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Tyr
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Asn Glu Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr
515 520 525
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
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Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
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Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
675
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 449
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
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Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
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Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe
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Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu
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Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 450
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Phe
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Ser Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr Ser Pro Arg
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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<211> 676
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 451
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Gly Ile Ser Arg Ser Ser Gly Asp Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
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Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
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Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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420 425 430
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435 440 445
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser
450 455 460
Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
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Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu
485 490 495
Trp Met Gly Ile Phe Tyr Pro Gly Asp Ser Ser Thr Arg Tyr Ser Pro
500 505 510
Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Asn Thr
515 520 525
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530 535 540
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580 585 590
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
595 600 605
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
610 615 620
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
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Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
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675
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 452
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
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Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
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Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
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355
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 453
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr
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260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
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Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
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Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<210> 454
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 454
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Gly Ile Ser Arg Ser Ser Gly Asp Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Gly Val Gly Ser Phe Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
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355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
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385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
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435 440 445
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Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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Trp Met Gly Ile Phe Tyr Pro Gly Asp Ser Ser Thr Arg Tyr Ser Pro
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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
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Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 471
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 471
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Phe
35 40 45
Ser Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr Ser Pro Arg
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 472
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn Tyr
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100 105 110
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Asn Arg Gly Glu Cys
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<220>
<223> 合成
<400> 473
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
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<400> 474
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<220>
<223> 合成
<400> 475
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
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Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
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675
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 476
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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<220>
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Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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<220>
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<400> 478
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Ser Thr Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
450 455 460
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
465 470 475 480
Phe Ser Asp Tyr Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
485 490 495
Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Tyr
500 505 510
Asn Glu Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr
515 520 525
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
530 535 540
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Arg Tyr Gly Leu Tyr Ala Met Asp
545 550 555 560
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Arg Thr Val Ala
565 570 575
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
580 585 590
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
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610 615 620
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625 630 635 640
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
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Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
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Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
675
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 479
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Arg Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ser Thr Lys Gly
100 105 110
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115 120 125
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
130 135 140
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
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Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
165 170 175
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
180 185 190
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys
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325 330 335
Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
340
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 480
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
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Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 481
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
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Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
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100 105 110
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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580 585 590
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675
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<220>
<223> 合成
<400> 482
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
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<223> 合成
<400> 483
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Phe
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 484
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn Tyr
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 485
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
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165 170 175
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys
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245 250 255
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275 280 285
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<213> 人工
<220>
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<400> 486
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145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
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Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
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<400> 487
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
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Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
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305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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340 345 350
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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<223> 合成
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
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<223> 合成
<400> 490
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
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Leu Glu Trp Met Gly Ile Phe Tyr Pro Gly Asp Ser Ser Thr Arg Tyr
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Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val
515 520 525
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<220>
<223> 合成
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 492
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr
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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 493
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn Tyr
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Ser Gly Ile Ser Arg Ser Ser Gly Asp Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
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Trp Met Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Tyr Asn Glu
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Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr
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Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Arg Tyr Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
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Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro
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Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
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Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
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195 200 205
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
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165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 502
<211> 677
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 502
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Arg Ser Ser Gly Asp Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Val Gly Ser Phe Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Thr
435 440 445
Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
450 455 460
Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser
465 470 475 480
Asp Tyr Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
485 490 495
Trp Met Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Tyr Asn Glu
500 505 510
Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr
515 520 525
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
530 535 540
Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Arg Tyr Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
545 550 555 560
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro
565 570 575
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
580 585 590
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
595 600 605
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
610 615 620
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
625 630 635 640
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
645 650 655
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
660 665 670
Asn Arg Gly Glu Cys
675
<210> 503
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 503
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Arg Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ser Thr Lys Gly
100 105 110
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
130 135 140
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
145 150 155 160
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
165 170 175
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
180 185 190
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
195 200 205
Ser Cys Asp Lys Thr His Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser
225 230 235 240
Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe
245 250 255
Ser Cys Ala Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe
260 265 270
Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met
275 280 285
Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala
290 295 300
Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln
305 310 315 320
Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu
325 330 335
Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe
340 345 350
Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala
355 360 365
Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr
370 375 380
Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
385 390
<210> 504
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 504
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile Glu Pro Met Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 505
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 505
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 506
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 506
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 507
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 507
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 508
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 508
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Trp Ser Gly Arg Asp Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asn Pro Trp Pro Val Ala Ala Pro Arg Ser Gly Thr Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 509
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 509
Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ala Asp

Claims (55)

1.一种多特异性蛋白质，所述多特异性蛋白质能够与由靶细胞表达的感兴趣的抗原结合，并且所述多特异性蛋白质还能够与NK细胞的表面的NKp46、细胞因子受体和任选的CD16A结合，并且所述多特异性蛋白质能够增强NK细胞针对表达感兴趣的抗原的靶细胞的细胞毒性，所述多特异性蛋白质包含：
(a)与感兴趣的抗原结合的抗原结合结构域(ABD)；
(b)与人NKp46多肽结合的ABD；
(c)能够结合FcRn的Fc结构域或Fc结构域的一部分；和
(d)结合NK细胞上存在的人细胞因子受体的ABD，
其中：
与人NKp46多肽结合的所述ABD任选地经由Ig衍生或非Ig衍生多肽接头连接至所述Fc结构域，并且其中结合人细胞因子受体的所述ABD经由多肽接头连接至与人NKp46多肽结合或与所述Fc结构域结合的所述ABD。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述蛋白质具有结合感兴趣的抗原的仅一个ABD，使得所述蛋白质单价地与感兴趣的抗原结合，任选地进一步其中所述蛋白质具有与人NKp46多肽结合的仅一个ABD、结合细胞因子受体的仅一个ABD和仅一个Fc结构域二聚体。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其中结合所述细胞因子受体的所述ABD经由多肽接头与结合NKp46的所述ABD连接。
4.根据权利要求1、2或3所述的蛋白质，其中与人NKp46多肽结合的所述ABD和结合人细胞因子受体的所述ABD以及任选地进一步所述Fc结构域相对于所述多特异性蛋白质的N末端和C末端串联地定位在所述多特异性蛋白质内。
5.根据上述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中与人NKp46多肽结合的所述ABD和结合人细胞因子受体的ABD以及任选的所述Fc结构域被构造成能够采取膜平面结合构象，使得所述蛋白质能够与NK细胞的所述表面上的NKp46和所述细胞因子受体以及任选的进一步CD16A结合。
6.根据上述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中结合人细胞因子的所述ABD通过接头肽连接至与人NKp46多肽结合的所述ABD或所述Fc结构域，所述接头肽具有20个或少于20个氨基酸残基、任选地少于15个氨基酸残基、任选地少于10个氨基酸残基、任选地介于5个和15个残基之间、任选地介于5个和10个残基之间、任选地介于3个和5个残基之间。
7.根据上述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中与人NKp46多肽结合的所述ABD通过接头肽连接至所述Fc结构域，所述接头肽具有15个或少于15个氨基酸残基、任选地少于10个氨基酸残基、任选地介于4个和15个残基之间、任选地介于3个和10个残基之间、任选地介于4个和5个残基之间。
8.根据上述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中与人NKp46多肽结合的所述ABD通过免疫细胞蛋白衍生的接头肽连接至所述Fc结构域，所述免疫细胞蛋白衍生的接头肽具有20个或少于20个氨基酸残基、任选地少于15个氨基酸残基、任选地介于4个和15个残基之间、任选地介于4个和10个残基之间、任选地介于3个和5个残基之间，任选地其中所述接头包含氨基酸序列RTVA。
9.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中结合NKp46的所述ABD插置在所述Fc结构域和结合所述细胞因子受体的所述ABD之间。
10.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中每个ABD包含VH和/或VL结构域或其片段，任选地其中VH和/或VL包含三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR-3)。
11.一种蛋白质，所述蛋白质包含与人NKp46多肽结合的ABD，所述ABD任选地经由具有15个或少于15个氨基酸残基的结构域接头与结合在NK细胞的表面表达的受体的细胞因子融合。
12.根据上述权利要求中任一项所述的权利要求所述的蛋白质，其中与人NKp46多肽结合的所述ABD包含与所述人NKp46多肽的D1/D2结合部结合的VH和/或VL结构域，并且其中所述细胞因子是经修饰的IL-2多肽。
13.根据权利要求11或12所述的蛋白质，其中与人NKp46多肽结合的所述ABD经由结构域接头在其C末端与所述细胞因子的N末端融合，任选地其中与人NKp46多肽结合的所述ABD具有scFv或Fab结构。
14.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质是包含第一多肽链和第二多肽链的异源二聚体，或包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链的异源二聚体。
15.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质，所述蛋白质包含：
(i)第一多肽链，所述第一多肽链从N末端至C末端包含结合NKp46的可变结构域、人CH1或CL恒定结构域、任选的结构域接头和野生型或变体IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽；和
(ii)第二多肽链，所述第二多肽链从N末端至C末端包含可变结构域和人CH1或CL恒定结构域，所述可变结构域与(i)的所述可变结构域缔合以形成结合NKp46的结构域；
其中(i)和(ii)的所述恒定结构域中的一者是CH1并且另一者是CL，使得(i)和(ii)的所述恒定结构域通过CH1-CL二聚化缔合。
16.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含NKp46 ABD-细胞因子单元，所述单元具有以下结构域排列：
Va-2–(CH1或CL)a (多肽链1)
|
Vb-2–(CH1或CL)b–L–Cyt (多肽链2)
其中：
Va-2和Vb-2各自是VH结构域或VL结构域，其中Va-2和Vb-2中的一者是VH并且另一者是VL，并且其中Va-2和Vb-2形成结合NKp46的第二ABD；
CH1是人免疫球蛋白CH1结构域，并且CL是人轻链恒定结构域；
(CH1或CL)a和(CH1或CL)b中的一者是CH1并且另一者是CL，从而形成(CH1/CL)对；
L是结构域接头；并且
Cyt是与NK细胞上存在的细胞因子受体结合的细胞因子多肽或其部分，任选地其中Cyt是野生型或变体人IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽。
17.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质，所述蛋白质包含：
(a)(i)第一多肽链，所述第一多肽链从N末端至C末端包含结合NKp46的结构域或其部分，所述结合NKp46的结构域或其部分包括可变结构域、人CH1或CL恒定结构域、结构域接头和野生型或变体IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽，所述可变结构域包含与SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、112、113、115、116、117、119、120、121、123、124、125、127、128、129或236-313中任一项的氨基酸序列至少80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列，所述野生型或变体多肽包含与SEQ ID NO:404-439中任一项的氨基酸序列或其至少40个、50个、60个、80个或100个连续氨基酸的片段至少80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列；和
(ii)第二多肽链，所述第二多肽链从N末端至C末端包含可变结构域和人CH1或CL恒定结构域，所述可变结构域与(i)的所述可变结构域缔合以形成结合NKp46的结构域，其中所述可变结构域包含与SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、114、118、122、126、130或314-403中任一项的氨基酸序列至少80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列；
或
(b)(i)第一多肽链，所述第一多肽链从N末端至C末端包含结合NKp46的结构域或其部分，所述结合NKp46的结构域或其部分包括可变结构域、人CH1或CL恒定结构域、结构域接头和野生型或变体IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽，所述可变结构域包含与SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、114、118、122、126、130或314-403中任一项的氨基酸序列至少80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列，所述野生型或变体多肽包含与SEQ ID NO:404-439中任一项的氨基酸序列或其至少40、50、60、80或100个连续氨基酸的片段至少80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列；和
(ii)第二多肽链，所述第二多肽链从N末端至C末端包含可变结构域和人CH1或CL恒定结构域，所述可变结构域与(i)的所述可变结构域缔合以形成结合NKp46的结构域，其中所述可变结构域包含与SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、112、113、115、116、117、119、120、121、123、124、125、127、128、129或236-313中任一项的氨基酸序列至少80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。
18.根据权利要求1至13中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含多肽，所述多肽包含NKp46 ABD-细胞因子单元，所述单元具有以下结构域排列
–L1–Va-2–L2–Vb-2–L3–Cyt
其中：
Va-2和Vb-2各自是VH结构域或VL结构域，其中Va-2和Vb-2中的一者是VH并且另一者是VL，并且其中Va-2和Vb-2形成结合NKp46的第二ABD；
L1、L2和L3各自是结构域接头，其中L1、L2和L3能够是不同的或相同的，其中L1是将所述NKp46 ABD-细胞因子单元与所述蛋白质的其余部分连接的结构域接头；并且Cyt是与NK细胞上存在的细胞因子受体结合的细胞因子多肽或其部分，任选地其中Cyt是野生型或变体人IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽。
19.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中结合细胞因子受体的所述ABD包含与野生型人IL-2多肽相比显示降低的对CD25的结合的IL-2多肽。
20.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中与人NKp46多肽结合的所述蛋白质或所述ABD以介于1nM至100nM之间的KD结合人NKp46多肽，如通过SPR测定的，并且/或者其中所述蛋白质或所述细胞因子以介于10nM至1μM之间的KD结合所述人细胞因子受体，如通过SPR测定的。
21.根据上述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述多特异性多肽与人Fcγ受体结合，任选地与CD16A结合，如通过表面等离子共振评估的，其中对单价结合的亲和力基本上等同于全长野生型人IgG1抗体的亲和力。
22.根据上述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中固定在表面上的所述蛋白质结合可溶性人CD16A多肽，其中单价结合的KD不超过2000nM，任选地为1000nM至2000nM、任选地为1100nM或1300nM，如使用Biacore通过表面等离子共振测定的。
23.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述细胞因子受体是存在于NK细胞的所述表面并与共同γ链(γC；CD132)缔合的受体，任选地进一步其中所述细胞因子受体是中亲和力IL-2/IL-15Rβ受体(CD122)或IL-21R(CD360)，并且任选地其中所述细胞因子多肽是IL-2、IL-15或IL-21。
24.根据权利要求1至17或19至23中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质是分离的异源三聚体多肽，所述分离的异源三聚体多肽包含：
(a)第一多肽链，所述第一多肽链从N末端至C末端包含第一可变结构域(V)、CK恒定区的第一CH1、Fc结构域或其部分、第二可变结构域(V)和CK恒定区的第二CH1；
(b)第二多肽链，所述第二多肽链从N末端至C末端包含第一可变结构域(V)、CH1或CK恒定区和Fc结构域或其部分，其中选择所述V结构域和所述CH1或Cκ恒定区以与所述第一多肽链的所述第一V结构域和所述第一CH1或Cκ恒定区互补，使得所述第一多肽和所述第二多肽形成CH1-Cκ异源二聚体，其中所述第一多肽链的所述第一可变结构域和所述第二多肽的所述第一可变结构域形成结合所述感兴趣的抗原的第一抗原结合结构域；和
(c)第三多肽链，所述第三多肽链从N末端至C末端包含可变结构域(V)和CH1或CK恒定区，其中选择所述V结构域和CH1或Cκ恒定区以与所述第一多肽链的所述第二V结构域和所述第二CH1或Cκ恒定区互补，使得所述第一多肽和所述第三多肽形成CH1-Cκ异源二聚体，其中所述第一多肽链的所述第二可变结构域和所述第三多肽的所述可变结构域形成结合NKp46的第二抗原结合结构域，并且
其中所述第一多肽链或所述第三多肽链中的一者进一步包含任选地经由结构域接头共价连接至其C末端的细胞因子，任选地IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽，任选地IL-2v或IL15v。
25.根据权利要求1至17或19至24所述的多特异性蛋白质，其中所述蛋白质是具有多肽链1、2和3的异源三聚体：
其中：
Va-1、Vb-1、Va-2和Vb-2各自是VH结构域或VL结构域，其中Va-1和Vb-1中的一者是VH并且另一者是VL，并且其中Va-1和Vb-1形成结合感兴趣的抗原的第一抗原结合结构域(ABD)，其中Va-2和Vb-2中的一者是VH并且另一者是VL，并且其中Va-2和Vb-2形成结合NKp46的第二ABD；
CH1是人重链恒定结构域1，并且CL是人轻链恒定结构域；
(CH1或CL)a和(CH1或CL)c中的一者是CH1并且另一者是CL，从而形成(CH1/CL)对；
(CH1或CL)b和(CH1或CL)d中的一者是CH1并且另一者是CL，从而形成(CH1/CL)对；
铰链是免疫球蛋白铰链区或其部分；
L1和L2各自是结构域接头，其中L1和L2能够是不同的或相同的；
CH2和CH3分别是人免疫球蛋白CH2和CH3结构域；并且
Cyt是与NK细胞上存在的细胞因子受体结合的细胞因子多肽或其部分，任选地其中Cyt是野生型或变体人IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽。
26.根据权利要求1至17或19至25中任一项所述的蛋白质，所述蛋白质具有以下结构域排列：
或
或
27.根据权利要求1至17或19至24中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质是具有多肽链1、2和3的异源三聚体：
其中：
Va-1、Vb-1、Va-2和Vb-2各自是VH结构域或VL结构域，其中Va-1和Vb-1中的一者是VH并且另一者是VL，并且其中Va-1和Vb-1形成结合感兴趣的抗原的第一抗原结合结构域(ABD)，其中Va-2和Vb-2中的一者是VH并且另一者是VL，并且其中Va-2和Vb-2形成结合NKp46的第二ABD；
CH1是人重链恒定结构域1，并且CL是人轻链恒定结构域；
(CH1或CL)a和(CH1或CL)c中的一者是CH1并且另一者是CL，从而形成(CH1/CL)对；
(CH1或CL)b和(CH1或CL)d中的一者是CH1并且另一者是CL，从而形成(CH1/CL)对；
铰链是免疫球蛋白铰链区或其部分；
L1和L2各自是结构域接头，其中L1和L2能够是不同的或相同的；
CH2和CH3分别是人免疫球蛋白CH2和CH3结构域；并且
Cyt是与NK细胞上存在的细胞因子受体结合的细胞因子多肽或其部分，任选地其中Cyt是野生型或变体人IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽。
28.根据权利要求1至17、19至24或27中任一项所述的蛋白质，所述蛋白质具有以下结构域排列：
或
或
29.根据权利要求1至14或18至23中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质是分离的异源二聚体多肽，所述分离的异源二聚体多肽包含：
(a)第一多肽链，所述第一多肽链从N末端至C末端包含第一可变结构域(V)、CK恒定区的CH1、Fc结构域或其部分、第二可变结构域和第三可变结构域、以及与NK细胞上存在的细胞因子受体结合的野生型或变体细胞因子；和
(b)第二多肽链，所述第二多肽链从N末端至C末端包含第一可变结构域(V)、CH1或CK恒定区和Fc结构域或其部分，其中选择所述CH1或Cκ恒定区以与所述第一多肽链的所述CH1或Cκ恒定区互补，使得所述第一多肽和所述第二多肽形成CH1-Cκ异源二聚体，其中所述第一多肽链的所述第一可变结构域和所述第二多肽的所述第一可变结构域形成第一抗原结合结构域；并且其中所述第二可变结构域和所述第三可变结构域形成第二抗原结合结构域。
30.根据权利要求1至14、18至23或29中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质是具有多肽链1和2的异源二聚体：
其中：
Va-1、Vb-1、Va-2和Vb-2各自是VH结构域或VL结构域，其中Va-1和Vb-1中的一者是VH并且另一者是VL，并且其中Va-1和Vb-1形成结合感兴趣的抗原的第一抗原结合结构域(ABD)，其中Va-2和Vb-2中的一者是VH并且另一者是VL，并且其中Va-2和Vb-2形成结合NKp46的第二ABD；
CH1是重链恒定结构域1，并且CL是轻链恒定结构域；
(CH1或CL)a和(CH1或CL)b中的一者是CH1并且另一者是CL，从而形成(CH1/CL)对；
铰链是免疫球蛋白铰链区或其部分；
L1、L2和L3各自是结构域接头，其中L1、L2和L3能够是不同的或相同的；
CH2和CH3分别是人免疫球蛋白CH2和CH3结构域；并且
Cyt是与NK细胞上存在的细胞因子受体结合的细胞因子多肽或其部分，任选地其中Cyt是野生型或变体人IL-2、IL-15、IL-21、IL-7、IL-27、IL-12、IL-18、IFN-α或IFN-β多肽。
31.根据上述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中结合感兴趣的抗原的所述ABD包含免疫球蛋白重链可变结构域(VH)和免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)，其中所述VH区包含与SEQ ID NO:132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154或236-313中任一项的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其中所述VL包含与SEQ ID NO:133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155或314-403中任一项的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
32.根据上述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中结合NKp46的所述ABD包含免疫球蛋白重链可变结构域(VH)和免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)，其中所述VH区包含与SEQ IDNO:3、5、7、9、11、13、112、113、115、116、117、119、120、121、123、124、125、127、128、129或236-313中任一项的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其中所述VL包含与SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、114、118、122、126、130或314-403中任一项的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
33.根据上述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中Fc结构域包含与SEQ ID NO:160-165中任一项的所述Fc多肽具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
34.根据上述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中CH1结构域包含与SEQ ID NO:156中任一项的所述CH1多肽具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
35.根据上述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中CK或CL结构域包含与SEQ ID NO:156中任一项的所述CK多肽具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
36.根据上述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述多特异性蛋白质包含：
(a)与所述感兴趣的抗原结合的ABD，其中所述ABD包含scFv或Fab，
a.其中所述scFv包含VH、结构域接头和VL，所述VH包含与选自SEQ ID NO:132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154和236-313中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列，所述VL包含与选自SEQ ID NO:133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155和314-403中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列；并且
b.其中所述Fab包含一个VH、一个VL、一个人CH1结构域和一个人CL结构域，所述一个VH包含与选自SEQ ID NO:132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154和236-313中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列，所述一个VL包含与选自SEQ ID NO:133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155和314-403中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列，所述一个人CH1结构域包含与SEQ ID NO:156至少90％相同的氨基酸序列，所述一个人CL结构域包含与SEQ ID NO:159至少90％相同的氨基酸序列，其中所述VH与所述CH1结构域或所述CL结构域中的一者融合，并且所述VL与所述CH1结构域或所述CL结构域中的另一者融合，
(b)与人NKp46多肽结合的ABD，其中所述ABD包含scFv或Fab，
a.其中所述scFv包含VH、结构域接头和VL，所述VH包含与选自SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、112、113、115、116、117、119、120、121、123、124、125、127、128、129和236-313中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列，所述VL包含与选自SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、114、118、122、126、130和314-403中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列；并且
b.其中所述Fab包含一个VH、一个VL、一个人CH1结构域和一个人CL结构域，所述一个VH包含与选自SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、112、113、115、116、117、119、120、121、123、124、125、127、128、129和236-313中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列，所述一个VL包含与选自SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、114、118、122、126、130和314-403中任一项的序列至少90％相同的氨基酸序列，所述一个人CH1结构域包含与SEQ ID NO:156至少90％相同的氨基酸序列，所述一个人CL结构域包含与SEQ ID NO:159至少90％相同的氨基酸序列，其中所述VH与所述CH1结构域或所述CL结构域中的一者融合，并且所述VL与所述CH1结构域或所述CL结构域中的另一者融合，
(c)包含第一Fc单体和第二Fc单体的Fc结构域二聚体，其中每个Fc单体包含与选自SEQID NO:160-165的序列至少80％或90％相同的氨基酸序列；和
(d)细胞因子多肽，所述细胞因子多肽包含与选自SEQ ID NO:404-439的序列或其至少40个、50个、60个、70个、80个或100个氨基酸残基的连续序列至少80％或90％相同的氨基酸序列，所述细胞因子多肽经由结构域接头与所述多特异性蛋白质的所述多肽链中的一者的C末端融合。
37.根据上述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述靶细胞是肿瘤细胞。
38.根据上述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述感兴趣的抗原是癌抗原。
39.根据权利要求1至37中任一项所述的蛋白质，其中所述感兴趣的抗原由感染剂或感染细胞表达。
40.根据上述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述多特异性蛋白质与包含NKp46-1、NKp46-2、NKp46-3、NKp46-4、NKp46-6或NKp46-9 VH和VL结构域的单克隆抗体竞争与NKp46多肽结合。
41.根据上述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述多特异性蛋白质与选自以下的突变体NKp46多肽的结合降低：
(a)和与所述野生型NKp46结合相比，在残基R101、V102、E104和/或L105处具有突变的突变体NKp46多肽；
(b)和与所述野生型NKp46结合相比，具有残基K41、E42、E119、Y121和/或Y194中的任一个或多个突变的突变体NKp46多肽；和
(c)和与所述野生型NKp46结合相比，具有残基P132、E133、I135和/或S136中的任一个或多个突变的突变体NKp46多肽。
42.根据上述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中结合NKp46的所述抗原结合结构域包含：
(a)重链和轻链，所述重链包括SEQ ID NO:3的重链可变区的CDR 1、2和3，所述轻链包括SEQ ID NO:4的轻链可变区的CDR 1、2和3；
(b)重链和轻链，所述重链包括SEQ ID NO:5的重链可变区的CDR 1、2和3，所述轻链包括SEQ ID NO:6的轻链可变区的CDR 1、2和3；
(c)重链和轻链，所述重链包括SEQ ID NO:7的重链可变区的CDR 1、2和3，所述轻链包括SEQ ID NO:8的轻链可变区的CDR 1、2和3；
(d)重链和轻链，所述重链包括SEQ ID NO:9的重链可变区的CDR 1、2和3，所述轻链包括SEQ ID NO:10的轻链可变区的CDR 1、2和3；
(e)重链和轻链，所述重链包括SEQ ID NO:11的重链可变区的CDR 1、2和3，所述轻链包括SEQ ID NO:12的轻链可变区的CDR 1、2和3；或
(f)重链和轻链，所述重链包括SEQ ID NO:13的重链可变区的CDR 1、2和3，所述轻链包括SEQ ID NO:14的轻链可变区的CDR 1、2和3。
43.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据上述权利要求中任一项所述的多特异性蛋白质和药学上可接受的载体或佐剂。
44.一种重组细胞，所述重组细胞表达根据权利要求1至42中任一项所述的多特异性蛋白质的四条(或全部)多肽链中的一条、两条、三条。
45.一种制备NK细胞组合物的方法，所述方法包括在体外使NK细胞、任选地分离的NK细胞与根据权利要求1至42中任一项所述的多特异性蛋白质温育或接触。
46.一种根据权利要求45所述的方法获得的NK细胞组合物。
47.一种根据权利要求1至42、43或46中任一项所述的蛋白质或组合物作为用于治疗疾病的药物和/或在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
48.一种在患有疾病的受试者中增强NKp46+CD16+NK细胞和/或NKp46+CD16-NK细胞的NK细胞活化、细胞毒性和/或增殖的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至42中任一项所述的多特异性蛋白质。
49.一种向患有疾病的受试者的NK细胞和/或肿瘤递送或供给高效细胞因子的方法，任选地进一步降低毒性，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至42中任一项所述的多特异性蛋白质。
50.根据权利要求45至49所述的方法或用途，其中所述细胞因子是变体或野生型细胞因子或其细胞因子片段，所述细胞因子与所述野生型细胞因子对应物相比保留了对NK细胞上存在的其细胞因子受体的亲和力的至少70％、80％或90％。
51.根据权利要求45至50所述的方法或用途，其中所述多特异性蛋白质(或当包含在所述多特异性蛋白质中时的所述细胞因子)表现出的NK细胞中细胞因子途径信号传导的EC50低于用单独的所述细胞因子或在其中所述NKp46 ABD和/或CD16 ABD被对照ABD取代的蛋白质中观察到的，任选地其中NK细胞中细胞因子途径信号传导的EC50低到至少1/10或1/100，任选地其中通过使所述细胞因子与NK细胞接触并测量所述NK细胞中的STAT磷酸化来评估细胞因子途径信号传导。
52.根据权利要求47至51所述的用途，其中所述疾病是癌症或感染性疾病。
53.一种制备异源多聚体蛋白质的方法，所述方法包括：
(a)提供编码根据权利要求14至23或29至42中任一项所述的至少第一多肽链的第一核酸；
(b)提供编码根据权利要求14至23或29至42中任一项所述的至少第二多肽链的第二核酸；以及
(c)在宿主细胞中表达所述第一核酸和所述第二核酸以产生分别包含所述第一多肽和所述第二多肽链的蛋白质；将所产生的蛋白质装载到亲和纯化支持物上，任选地装载到蛋白质-A支持物上，并回收所述异源多聚体蛋白质。
54.一种制备异源多聚体蛋白质的方法，所述方法包括：
(a)提供编码根据权利要求14至28或31至42中任一项所述的第一多肽链的第一核酸；
(b)提供编码根据权利要求14至28或31至42中任一项所述的第二多肽链的第二核酸；
(c)提供包含根据权利要求14至28或31至42中任一项所述的第三多肽链的第三核酸；以及
(d)在宿主细胞中表达所述第一核酸、所述第二核酸和所述第三核酸以产生分别包含所述第一多肽链、所述第二多肽链和所述第三多肽链的蛋白质；将所产生的蛋白质装载到亲和纯化支持物上，任选地装载到蛋白质-A支持物上，并回收所述异源多聚体蛋白质。
55.一种鉴定或评价多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供编码根据权利要求1至42中任一项所述的蛋白质的多种多肽中的一种多肽的核酸；
(b)分别在宿主细胞中表达所述核酸以产生所述蛋白质；并回收所述蛋白质；以及
(c)评价所产生的蛋白质的感兴趣的生物活性。
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