JP6702893B2 - 多重特異的抗原結合タンパク質 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、全ての図面を含め、参照により全内容が本明細書に組み入れられる、２０１４年６月２７日出願の米国仮特許出願第６２／０１７，９１３号明細書の利益を主張するものである。
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表と合わせて出願されている。この配列表は、２０１５年６月１７日に作成された１９９ＫＢサイズの「ＢＩＳＰ２＿ＰＣＴ＿ＳＴ２５」という名称のファイルとして提供される。この配列表の電子形式の情報は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる。
ＮＫ細胞に結合し且つそれを特異的にリダイレクトして、目的の標的細胞を溶解する多重特異的タンパク質が提供される。このタンパク質形態は、疾患の処置に有用である。
２つの異なるエピトープに結合する二重特異的抗体は、特異性を高める機会、効力を拡張する機会、及び従来のモノクローナル抗体では達成できない作用の新規な機序を利用する機会を提供する。同時に２つの標的に結合する二重特異的抗体の様々な形態が報告されている。また、二重特異的抗体を用いて２つの異なる受容体を架橋してシグナル伝達経路を阻害することは、様々な適用例で有用性を示す（例えば、非特許文献１を参照されたい）。二重特異的抗体は、２つの異なる受容体を中和するために使用されてきた。他のアプローチでは、二重特異的抗体は、免疫エフェクター細胞を動員するために使用され、ここで、Ｔ細胞の活性化が、２つの異なる細胞型における受容体に同時に結合する二重特異的抗体によって腫瘍細胞の近傍で達成される（非特許文献２を参照されたい）。殆どのこのようなアプローチは、Ｔ細胞上のＣＤ３複合体を腫瘍結合抗原に連結する二重特異的抗体に関係する。殆どの十分に研究された二重特異的抗体形態は、Ｆｃドメインを含まない「ＢｉＴｅ」抗体及び「ＤＡＲＴ」抗体である。しかしながら、これらの抗体は、作成が困難であることが知られており、長期にわたる細胞の開発を必要とし、低い産生収率を有し、且つ／又は（既刊文献によると）均質なタンパク質組成物として産生させることができない。別の例では、１つのアームがＦｃｙＲＩＩＩに結合し、別のアームがＨＥＲ２受容体に結合する二重特異的抗体が、ＨＥＲ２抗原を過剰発現する卵巣癌及び乳癌の治療のために開発された。
Ｊａｃｋｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：２０８５０−２０８５９ Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ，（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９（１２）：４９４１−４
しかしながら、様々な形態の二重特異的抗体が存在するにもかかわらず、２つ以上の生物学的標的に結合することができ、且つ産業的発展にとって魅力的な特性を有する、作用機序が十分に明らかにされた新規なタンパク質が当技術分野でなお要望されている。
本発明は、広範囲の抗体可変領域を容易に使用することを可能にし、標準的な組換え産生技術に適用させることによって製造における利点を有し、且つ改善されたｉｎ ｖｉｖｏ薬理学を有する機能的な多重特異的抗体の発見に由来する。このような抗体は、特に、除去されるべき標的細胞上の第１の抗原及び免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞）上の第２の抗原に結合するように適合され、エフェクター細胞は、標的細胞、例えば、癌細胞に誘導される。エフェクター細胞上の抗原は、有利には、活性化受容体であり得る。多重特異的抗体は、ＦｃγＲ結合性を欠いているように設計された場合、ＣＤ１６を介してエフェクター細胞を実質的に活性化せず、多重特異的抗体は、多重特異的抗体の超可変領域に結合される抗原に応じて、目的の特定のエフェクター細胞に選択的であり、それにより、あらゆる不所望のＦｃγＲ／免疫媒介毒性（例えば、サイトカイン媒介毒性）及び／又は標的となるエフェクター細胞の抑制性ＦｃγＲ媒介阻害が回避される。多重特異的ポリペプチドは、例えば、標的抗原発現エフェクター細胞に、標的抗原、例えば、癌抗原、ウイルス抗原などを発現する標的細胞を溶解させることができる。多重特異的抗体は、エフェクター細胞表面タンパク質及び第２の抗原（標的細胞によって発現される抗原）の両方に一価で結合する場合に特に有効である。
一実施形態では、第１及び第２の抗原に一価で結合し、且つＦｃＲｎに結合するヘテロ多量体多重特異的タンパク質（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体）が提供され、このタンパク質は、目的の第１の抗原に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ１）、目的の第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ２）、及びヒトＦｃドメイン、例えば、ＦｃＲｎによって結合されるＦｃドメインの少なくとも一部を含み、任意選択により、多重特異的抗体は、低いＦｃγＲ結合性を有するか、又はＦｃγＲ結合性を実質的に欠いているように設計される。一実施形態では、Ｆｃドメインは、２つのＡＢＤ（一方のＡＢＤは、ＦｃドメインのＮ末端に配置され、他方のＡＢＤは、Ｃ末端に配置される）間に配置される。
一実施形態では、目的の抗原の一方は、エフェクター細胞上に存在する活性化受容体であり、他方は、標的細胞抗原（例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、微生物抗原）であり、多重特異的タンパク質は、ＦｃＲｎによって結合され、且つ低いＦｃγＲ結合性を有するか、又はＦｃγＲ結合性を実質的に欠いており、多重特異的タンパク質は、標的となるエフェクター細胞及び標的細胞の存在下で、エフェクター細胞ポリペプチド（このタンパク質はアゴニストとして作用する）によってエフェクター細胞でのシグナル伝達及び／又はエフェクター細胞の活性化を誘導することができ、それにより、エフェクター細胞の活性化及び／又は標的細胞の溶解が直接的に促進される。特に、多重特異的タンパク質は、ＦｃγＲ媒介毒性を活性化することも抑制性ＦｃγＲ媒介阻害も起こすことなく、目的のエフェクター細胞（エフェクター細胞受容体発現細胞）に実質的に限定される標的細胞に対する免疫エフェクター応答（細胞傷害反応）を誘導することができる。一実施形態では、エフェクター（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）によって発現される活性化受容体及び癌抗原、ウイルス抗原、又は細菌抗原に一価で結合する単離された多量体タンパク質が提供され、任意選択により、このタンパク質は、ヘテロ二量体又はヘテロ三量体タンパク質であり、任意選択により、このタンパク質は、ＣＨ１−ＣＫ二量体化によって形成された少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、このタンパク質は、（ａ）エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）によって発現される活性化受容体に結合する第１の抗原結合ドメイン、（ｂ）標的細胞上で発現される癌抗原、ウイルス抗原、又は細菌抗原に結合する第２の抗原結合ドメイン、及び（ｃ）単量体又は二量体ヒトＦｃドメインを含み、このタンパク質は、そのＦｃドメインヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）に結合することができ、且つ完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃγ受容体に対する低い結合性を有する。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、エフェクター細胞上の活性化受容体に結合する多重特異的タンパク質は、例えば、
（ａ）標的細胞の存在下で、活性化受容体を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、このようなエフェクター細胞を活性化する能力、及び／又は
（ｂ）標的細胞の非存在下で、このようなエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、このようなエフェクター細胞を活性化する能力の欠如
によって特徴付けることができる。任意選択により、エフェクター細胞は、精製されたＮＫ細胞又はＴ細胞である。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、本明細書に記載の多重特異的タンパク質は、例えば、
（ａ）標的細胞の存在下で、活性化受容体を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、このようなエフェクター細胞に標的細胞を溶解させる能力、及び／又は
（ｂ）標的細胞の非存在下で、このようなエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、このようなエフェクター細胞を活性化する能力の欠如
によって特徴付けることができる。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、本明細書に記載の多重特異的タンパク質は、例えば、
（ａ）標的細胞の存在下で、活性化受容体を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、このようなエフェクター細胞に標的細胞を溶解させる能力、及び／又は
（ｂ）標的細胞の存在下で、ＣＤ１６を発現するが活性化受容体を発現しないエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、このようなエフェクター細胞を活性化する能力の欠如
によって特徴付けることができる。
多量体ポリペプチドは、２つ又は３つの異なるポリペプチド鎖から構成され、１つ又は２つの鎖が、ＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体化（ジスルフィド結合がＣＨ１ドメインとＣＫドメインとの間に形成される）に基づいて中心鎖と二量体化している。多量体は、中心（第１）のポリペプチド鎖から構成することができ、このポリペプチド鎖は、異なる抗原特異性の別個の抗原結合ドメインの一部である２つの免疫グロブリン可変ドメイン、及びこの可変ドメインの一方又はそれぞれに隣接したこのポリペプチド鎖上に配置されたＣＨ１又はＣＫ定常ドメインを含み、Ｆｃドメインが、このポリペプチド鎖上のこの２つの免疫グロブリン可変ドメイン間に配置されている。中心ポリペプチド鎖のドメイン配置の例は、以下の通りであり、各Ｖ１、Ｖ２、又はＶ３は可変ドメインである：
Ｖ１−（ＣＨ１又はＣＫ）−Ｆｃドメイン−Ｖ２、
Ｖ２−Ｆｃドメイン−Ｖ１−（ＣＨ１又はＣＫ）、
Ｖ１−（ＣＨ１又はＣＫ）−Ｆｃドメイン−Ｖ２−Ｖ３、
Ｖ２−Ｖ３−Ｆｃドメイン−Ｖ１−（ＣＨ１又はＣＫ）、及び
Ｖ１−（ＣＨ１又はＣＫ）−Ｆｃドメイン−Ｖ２−（ＣＨ１又はＣＫ）。
Ｆｃドメインは、所望の機能（例えば、ＦｃＲｎ結合性）を付与するのに十分な完全Ｆｃドメイン又はその一部であり得る。次いで、中心ポリペプチド鎖とのＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体化が可能となるように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域及び免疫グロブリン可変ドメインを含む第２の追加のポリペプチド鎖が構成され、この免疫グロブリン可変ドメインは、ＣＨ１又はＣＫドメインに隣接した中心鎖の可変ドメインを補完するように選択され、それにより、相補的な可変ドメインが、目的の第１の抗原の抗原結合ドメインを形成する。
次いで、目的の第２の抗原の抗原結合ドメインをいくつかの構成に従って形成することができる。第１の構成では、中心ポリペプチド鎖は、３つの免疫グロブリン可変ドメインを含み、第１の可変ドメインは（第２のポリペプチドのＶドメインと共に）、目的の第１の抗原の抗原結合ドメインの一部であり、第２及び第３の可変ドメインは、目的の第２の抗原の抗原結合ドメインを形成する直列型可変ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ単位を形成する、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖（κ）可変ドメイン（ＶＫ））として構成される。
別の構成では、第２の抗体結合ドメインの第２の可変領域を提供するために第３のポリペプチド鎖が提供される。第２鎖と同様に、第３鎖は、中心ポリペプチド鎖とのＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体化が可能となるように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域及び免疫グロブリン可変ドメインを含む。この構成では、中心鎖は、間置Ｆｃドメインを有する２つのＶ−（ＣＨ１又はＣＫ）単位を含み、第１のＶ−（ＣＨ１又はＣＫ）単位は、第２鎖のＶ−（ＣＨ１又はＣＫ）単位とＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成し、第２のＶ−（ＣＨ１又はＣＫ）単位は、第３鎖のＶ−（ＣＨ１又はＣＫ）単位とヘテロ二量体を形成する。第３鎖の免疫グロブリン可変ドメインは、中心鎖の不対可変ドメインを補完するように選択され、それにより、相補的な可変ドメインが、目的の第２の抗原の抗原結合ドメインを形成する。ＣＨ１及びＣＫドメインは、これらに隣接したＶドメインが相補的である（即ち、両方がＶＨでも、両方がＶＫでもない）限り、ヘテロ二量体を形成するため、第２鎖及び第３鎖の各Ｖ−（ＣＨ１又はＣＫ）単位が、中心鎖上の好ましい結合パートナーを見出すように第２鎖及び第３鎖の可変ドメイン及び定常ドメインを構成するように、互いに自然に結合しない可変ドメイン及び定常ドメインを選択することができる。例えば、ＶＨ−ＣＫ単位は、ＶＫ−ＣＨ１とヘテロ二量体化するが、ＶＫ−ＣＫとはヘテロ二量体化しない。これにより、形成中の好ましい鎖の対形成が可能となる。
多量体ポリペプチドは、単量体Ｆｃドメイン又は二量体Ｆｃドメインを有するように設計することができる。単量体Ｆｃドメインの場合、Ｆｃドメインは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するためにＣＨ３二量体界面に１つ以上のアミノ酸変異（例えば、置換）を有するＣＨ３ドメインを含み得る。
一態様では、目的の第１及び第２の抗原に一価で結合するヘテロ三量体二重特異的抗体が提供され、この抗体は、ヒトＦｃＲｎに結合する単量体又は二量体Ｆｃドメインを含み、さらに任意選択により、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃγ受容体に結合しない。
一実施形態では、ヘテロ多量体、例えば、ヘテロ二量体二重特異的ポリペプチドが提供され、このポリペプチドは、（ａ）ＣＨ１又はＣＫドメインに融合された第１の可変領域（Ｖ）を含む第１のポリペプチド鎖であって、Ｖ−（ＣＨ１／ＣＫ）単位がヒトＦｃドメイン（完全Ｆｃドメイン又はその一部）の第１の末端（Ｎ末端又はＣ末端）に融合されている、第１のポリペプチド鎖、（ｂ）第２のポリペプチド鎖であって、ＣＨ１−ＣＫ二量体を形成するように第１鎖のＣＨ１又はＣＫに相補的であるＣＨ１又はＣＫドメインに融合された第１の可変領域（Ｖ）を含み、任意選択によりＶ−（ＣＨ１／ＣＫ）単位が少なくともヒトＦｃドメイン（完全Ｆｃドメイン又はその一部）に融合され、２つの第１の可変領域が、目的の第１の抗原に一価で結合する抗原結合ドメインを形成する、第２のポリペプチド鎖、及び（ｃ）ＦｃドメインがＶ−（ＣＨ１／ＣＫ）単位と第２の抗原に結合する抗原結合ドメインとの間に配置されるように第１のポリペプチド（又は、このようなポリペプチドがＦｃドメインを含む場合、第２のＦｃ由来ポリペプチド）のＦｃドメインの第２の末端（Ｎ末端又はＣ末端）に融合された第２の抗原に（任意選択により、相補的な抗原結合ドメインと共に）結合する抗原結合ドメインを含む。任意選択により、第１及び第２のポリペプチド鎖は、例えば、それぞれのＣＨ１とＣＫドメインとの間に形成される鎖間ジスルフィド結合によって結合される。任意選択により、Ｖ−（ＣＨ１／ＣＫ）単位は、ヒトＦｃドメインに直接融合されるか、又は介在配列、例えば、ヒンジ領域、リンカー、他のタンパク質ドメインなどを介して融合される。
上記のヘテロ多量体ポリペプチドの一実施形態では、ポリペプチドは、ヘテロ二量体であり、第２の抗原の抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ、任意選択によりエフェクター細胞上の活性化受容体に結合するｓｃＦｖである。
一態様では、目的の第１及び第２の抗原に一価で結合する単離されたヘテロ多量体ポリペプチドが提供され、このヘテロ多量体ポリペプチドは、
（ａ）ＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）、第２の可変ドメイン、及び第１の可変ドメインと第２の可変ドメインとの間に配置されたＦｃドメイン又はその一部を含む第１のポリペプチド鎖、及び
（ｂ）第２のポリペプチド鎖であって、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域にそのＣ末端で融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）を含み、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインと第２のポリペプチドの第１の可変ドメインが、目的の第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する、第２のポリペプチド鎖
を含む。
任意選択により、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖が、そのＣ末端でＣＨ１に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）を含み、及び第２のポリペプチド鎖が、そのＣ末端でＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメインを含む。別法では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとがＣＫ−ＣＨ１ヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖が、そのＣ末端でＣＫに融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）を含み、及び第２のポリペプチド鎖が、そのＣ末端でＣＨ１定常領域に融合された第１の可変ドメインを含む。任意選択により、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメイン及び第２のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインは、第１の抗原に特異的に結合する同じ第１の親抗体に由来し、及び第１のポリペプチドの第２の可変ドメインは、第２の抗原に特異的に結合する第２の親抗体に由来する。
一実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、第３の可変ドメインに融合された第２の可変ドメインをさらに含み、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成し、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインと第２のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインとが、目的の第１の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成し、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインと第３の可変ドメインとが、目的の第２の抗原に特異的なｓｃＦｖを形成する。任意選択により、第１のポリペプチド鎖は、ドメイン配置：Ｖ２−Ｖ３−Ｆｃドメイン−Ｖ１−（ＣＨ１又はＣＫ）を有し、それにより、ドメイン配置
Figure 0006702893
 を有するヘテロ多量体ポリペプチドが形成され、ここで、第１のポリペプチド鎖のＶ１及び第２のポリペプチド鎖のＶ１の一方が軽鎖可変ドメインであり、及び他方が重鎖可変ドメインである。
任意選択により、第１のポリペプチド鎖は、ドメイン配置：Ｖ１−（ＣＨ１又はＣＫ）−Ｆｃドメイン−Ｖ２−Ｖ３を有し、それにより、ドメイン配置
Figure 0006702893
 を有するヘテロ多量体ポリペプチドが形成され、ここで、第１のポリペプチド鎖のＶ１及び第２のポリペプチド鎖のＶ１の一方が軽鎖可変ドメインであり、及び他方が重鎖可変ドメインである。
一態様では、目的の第１及び第２の抗原に一価で結合する単離されたヘテロ二量体ポリペプチドが提供され、任意選択により、これらの抗原の一方が免疫エフェクター細胞で発現され、他方が目的の抗原であり、このヘテロ二量体ポリペプチドは、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、第１の可変ドメイン（Ｖ）、ＣＨ１又はＣＫ定常領域、Ｆｃドメイン又はその一部、第２の可変ドメイン、及び第３の可変ドメインを含む第１のポリペプチド鎖、及び
（ｂ）第２のポリペプチド鎖であって、Ｎ末端からＣ末端に、第１の可変ドメイン（Ｖ）、ＣＨ１又はＣＫ定常領域、及び任意選択によるＦｃドメイン又はその一部を含み、ＣＨ１又はＣＫ定常領域が、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択され、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインと第２のポリペプチドの第１の可変ドメインとが、目的の第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成し、第２の可変ドメインと第３の可変ドメインとが、目的の第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する、第２のポリペプチド鎖
を含む。第２のポリペプチド鎖がＦｃドメインを欠いている場合、第１のポリペプチド鎖は、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するための改変されたＦｃドメイン（例えば、置換又は直列型ＣＨ３ドメイン）を含む。
一態様では、目的の第１及び第２の抗原に一価で結合する単離されたヘテロ二量体ポリペプチドが提供され、任意選択により、これらの抗原の一方が免疫エフェクター細胞で発現され、他方が目的の抗原であり、このヘテロ二量体ポリペプチドは、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、第２の可変ドメイン及び第３の可変ドメイン、Ｆｃドメイン又はその一部、第１の可変ドメイン（Ｖ）、及びＣＨ１又はＣＫ定常領域を含む第１のポリペプチド鎖、及び
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、第１の可変ドメイン（Ｖ）、ＣＨ１又はＣＫ定常領域を含む第２のポリペプチド鎖であって、ＣＨ１又はＣＫ定常領域が、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択され、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインと第２のポリペプチドの第１の可変ドメインとが、目的の第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成し、第２の可変ドメインと第３の可変ドメインとが、目的の第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する、第２のポリペプチド鎖
を含む。第１のポリペプチド鎖は、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するための改変されたＦｃドメイン（例えば、置換又は直列型ＣＨ３ドメイン）を含むことができる。
一実施形態では、三量体ポリペプチドが提供され、この三量体ポリペプチドは、
（ａ）第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）、第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメイン（Ｖ）、及び第１の可変ドメインと第２の可変ドメインとの間に配置されたＦｃドメイン又はその一部（即ち、Ｆｃドメインは、第１のＶ−（ＣＨ１／ＣＫ）単位と第２のＶ−（ＣＨ１／ＣＫ）単位との間に配置される）を含む第１のポリペプチド鎖、
（ｂ）第２のポリペプチド鎖であって、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖の第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域にそのＣ末端で融合された可変ドメインを含む、第２のポリペプチド鎖、及び
（ｃ）第３のポリペプチド鎖であって、ＣＨ１又はＣＫ定常領域にそのＣ末端で融合された可変ドメインを含み、第１のポリペプチドと第３のポリペプチドとが、第３のポリペプチドのＣＨ１又はＣＫ定常領域と第１のポリペプチドの第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域との間ではなく、第３のポリペプチドのＣＨ１又はＣＫ定常領域と第１のポリペプチドの第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域との間に形成されたジスルフィド結合によって結合されたＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、可変ドメイン及びＣＨ１又はＣＫ定常領域が、第２の可変ドメイン及び第１のポリペプチド鎖のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択される、第３のポリペプチド鎖
を含み、第１のポリペプチドと、第２のポリペプチドと、第３のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＫヘテロ三量体を形成し、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインと第２のポリペプチド鎖の可変ドメインとが、目的の第１の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成し、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインと第３のポリペプチド鎖の可変ドメインとが、目的の第２の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する。任意選択により、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメイン及び第２のポリペプチド鎖の可変ドメインは、第１の抗原に特異的に結合する同じ第１の親抗体に由来し、及び第１のポリペプチドの第２の可変ドメイン及び第３のポリペプチド鎖の可変ドメインは、第２の抗原に特異的に結合する同じ第２の親抗体に由来する。
一実施形態では、目的の第１及び第２の抗原に一価で結合し、任意選択によりこれらの抗原の一方が免疫エフェクター細胞で発現され、他方が目的の抗原である、三量体ポリペプチドが提供され、この三量体ポリペプチドは、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）、Ｆｃドメイン又はその一部、及び第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメイン（Ｖ）含む第１のポリペプチド鎖、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖の（第２ではなく）第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された可変ドメイン、及び任意選択によるＦｃドメイン又はその一部を含む第２のポリペプチド鎖、及び
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に、ＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された可変ドメインを含む第３のポリペプチド鎖であって、この可変ドメイン及びＣＨ１又はＣＫ定常領域が、第１のポリペプチド鎖の（第１ではなく）第２の可変ドメイン及びＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択される、第３のポリペプチド鎖
を含む。従って、第１のポリペプチドと第３のポリペプチドとは、第３のポリペプチドのＣＨ１又はＣＫ定常領域と第１のポリペプチドの第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域との間ではなく、第３のポリペプチドのＣＨ１又はＣＫ定常領域と第１のポリペプチドの第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域との間にＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成する。第１のポリペプチドと、第２のポリペプチドと、第３のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＫヘテロ三量体を形成し、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインと第２のポリペプチド鎖の可変ドメインとが、目的の第１の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成し、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインと第３のポリペプチド鎖の可変ドメインとが、目的の第２の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する。
また、精製された又は均質な組成物も提供され、この組成物中のタンパク質の少なくとも９０％、９５％、又は９９％が本開示の多量体ポリペプチドである。
任意選択により、２つのＦｃドメインが多量体ポリペプチドに存在する任意の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化が可能であるＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
任意選択により、任意の実施形態では、可変ドメインのそれぞれは、単一免疫グロブリン重鎖又は軽鎖可変ドメインである。
任意選択により、任意の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジ領域又はリンカーペプチドを介して抗原結合ドメイン、ＣＨ１ドメイン、及び／又はＣＫドメインに融合される。
任意選択により、任意の実施形態では、ＦｃドメインはＣＨ２ドメインを含む。任意選択により、ＣＨ２ドメインは、ヒンジ領域又はリンカーペプチドを介して抗原結合ドメイン、ＣＨ１ドメイン、及び／又はＣＫドメインに融合される。任意選択により、ＣＨ２ドメインは、ヒトＦｃγ受容体に対する結合性を低下させるためのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、多重特異的ポリペプチドは、Ｎ連結グリコシル化を欠いているか、又は改変されたＮ連結グリコシル化を有する。一実施形態では、多重特異的ポリペプチドは、Ｎ２９７Ｘ変異を含み、Ｘは、アスパラギン以外の任意のアミノ酸である。
任意選択により、任意の実施形態では、多量体ポリペプチド内の２つのポリペプチド鎖は、それぞれのヒンジ領域間及び／又はそれぞれのＣＨ１／ＣＫ定常領域間に形成された鎖間ジスルフィド結合によって互いに結合される。
任意選択により、任意の実施形態では、多重特異的ポリペプチド（又はそのＦｃ部分）は、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合することができる。
任意選択により、任意の実施形態では、多重特異的ポリペプチド（又はそのＦｃ部分）は、完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃγ受容体に対して低い結合性を有する。任意選択により、多重特異的ポリペプチド（又はそのＦｃ部分）は、ヒトＦｃγ受容体に対する結合性を実質的に欠いている。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、多量体ポリペプチド（及び／又はそのＦｃドメイン）は、例えば、完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、及び／又はＣＤ６４）に対して低い結合性を有する。
一実施形態では、多量体ポリペプチドは、例えば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプの野生型Ｆｃドメインを有する同じポリペプチドと比較して、多量体ポリペプチドの可変領域によって結合された目的の抗原を発現しない免疫細胞によって媒介される（即ち、可変領域によって結合された目的の抗原を発現する細胞の非存在下で）、低下した（例えば、部分的又は完全に消失した）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、ＦｃＲ媒介細胞活性化（例えば、ＦｃＲ架橋によるサイトカインの放出）、及び／又はＦｃＲ媒介血小板活性化／減少を有する。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、ＣＨ２ドメインは、野生型ＣＨ２ドメインと比較して、ヒトＦｃγ受容体に対する結合性を低下させるアミノ酸改変を含む。一実施形態では、ＣＨ２改変多重特異的ポリペプチドは、例えば、野生型ＣＨ２ドメインを有する同じポリペプチドと比較して、多量体ポリペプチドのＡＢＤによって結合された目的の抗原を発現しない免疫エフェクター細胞によって媒介される、低下した（例えば、部分的又は完全に消失した）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、ＦｃＲ媒介細胞活性化（例えば、ＦｃＲ架橋によるサイトカインの放出）、及び／又はＦｃＲ媒介血小板活性化／減少を有する。
任意選択により、任意の実施形態では、各抗原結合ドメインは、超可変領域、任意選択により抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む。
任意選択により、単一Ｆｃドメインが多量体ポリペプチド中に存在する任意の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｌ３５１位、Ｔ３６６位、Ｌ３６８位、Ｐ３９５位、Ｆ４０５位、Ｔ４０７位、及び／又はＫ４０９位（Ｋａｂａｔと同様のＥＵ付番）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つにアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメイン、又は直列型ＣＨ３ドメインを含む。
任意選択により、任意の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン又はその一部であり、任意選択により１つ以上のアミノ酸改変を含む。
任意選択により、任意の実施形態では、目的の第１又は第２の抗原の一方は、癌抗原であり、他方は、免疫エフェクター細胞の表面で発現されるポリペプチドである。
任意選択により、任意の実施形態では、目的の第１又は第２の抗原の一方は、ウイルス抗原又は細菌抗原であり、他方は、免疫エフェクター細胞の表面で発現されるポリペプチドである。
任意選択により、任意の実施形態では、可変ドメインは、ヒトフレームワーク領域からのフレームワーク残基を含む、例えば、可変ドメインは、ヒト又は非ヒト起源の１つ、２つ、又は３つのＣＤＲ、及びヒト起源のフレームワーク残基を含む。
本明細書に記載の任意の実施形態の一態様では、二重特異的ポリペプチドは、免疫エフェクター細胞によって発現される抗原に対してよりも、癌抗原（又はウイルス抗原若しくは細菌抗原）に対して高い結合親和性（一価）を有する。このような抗体は、有利な薬理学的特性を提供する。本発明の任意の実施形態の一態様では、このポリペプチドは、免疫エフェクター細胞によって発現されるポリペプチドに対する結合について、１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満、又は好ましくは１０−９Ｍ未満の、免疫エフェクター細胞によって発現される抗原との結合（一価）のＫｄを有し、任意選択により、このポリペプチドは、免疫エフェクター細胞によって発現される抗原との結合（一価）のＫｄよりも低い、癌抗原、ウイルス抗原、又は細菌抗原との結合（一価）のＫｄを有する（即ち、より優れた結合親和性を有する）。
本明細書に記載の任意のポリペプチドの一実施形態では、多重特異的ポリペプチドは、目的の第１又は第２の抗原の一方を発現するエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）に、前記目的の第１又は第２の抗原の他方を発現する標的細胞（例えば、癌細胞）を溶解させることができる。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、本開示の任意のタンパク質の第１のポリペプチド鎖、及び／又は第２のポリペプチド鎖、及び／又は第３のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸が提供される。本明細書の任意の実施形態の一態様では、本開示の任意のタンパク質の第１のポリペプチド鎖、及び／又は第２のポリペプチド鎖、及び／又は第３のポリペプチド鎖をコードする核酸を含む組換え宿主細胞が提供され、任意選択により、この宿主細胞は、少なくとも１、２、３、又は４ｍｇ／Ｌの収量（精製後の最終生産性）で本開示のタンパク質を産生する。また、本開示の第１のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸、本開示の第２のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸、及び任意選択により、本開示の第３のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸を含む核酸のキット又はセットも提供される。また、本開示の単量体、ヘテロ二量体、及びヘテロ三量体タンパク質を産生する方法も提供される。
一実施形態では、本発明は、ヘテロ二量体タンパク質（例えば、本明細書に記載の任意のヘテロ二量体タンパク質）を産生する方法が提供され、この方法は、
ａ）本明細書に記載の第１のポリペプチド鎖（例えば、ＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）、第２の可変ドメイン（及び任意選択による第３の可変ドメイン、第２の可変ドメインと第３の可変ドメインとが抗原結合ドメインを形成する）、及び第１の可変ドメインと第２の可変ドメインとの間に配置されたＦｃドメイン又はその一部を含むポリペプチド鎖）をコードする第１の核酸を用意するステップ、
ｂ）本明細書に記載の第２のポリペプチド鎖（例えば、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成して、第１のポリペプチド鎖の第１の可変領域と第２のポリペプチドの第１の可変ドメインとが抗原結合ドメインを形成するように、第１のポリペプチド鎖のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域にそのＣ末端で融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）を含むポリペプチド鎖）をコードする第２の核酸を用意するステップであって、第１又は第２の抗原結合ドメインの一方が、免疫エフェクター細胞の表面のポリペプチドに結合し、他方が、腫瘍抗原、ウイルス抗原、又は細菌抗原に結合する、ステップ、及び
（ｃ）それぞれ前記第１及び第２の核酸を宿主細胞で発現させて、前記第１及び第２のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生し、且つヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ
を含む。任意選択により、産生されたヘテロ二量体タンパク質は、精製前に得られた総タンパク質（例えば、二重特異的タンパク質）の少なくとも２０％、２５％、又は３０％を占める。任意選択により、ステップ（ｃ）は、産生されたタンパク質を親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインＡ支持体又はカラムにローディングし、且つヘテロ二量体タンパク質を収集するステップ、及び／又は産生されたタンパク質（例えば、親和性交換若しくはプロテインＡカラムにローディングした後に収集されたタンパク質）をイオン交換カラムにローディングし、且つヘテロ二量体画分を収集するステップを含む。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインは、（任意選択により第３の可変ドメインと共に）免疫エフェクター細胞の表面のポリペプチドに結合する。
本開示のタンパク質は、ＢＩＴＥ、ＤＡＲＴ、及び他の二重特異的形態と異なり、標準的な細胞株及び高収量の標準化方法で産生することができるため、多重特異的タンパク質に組み込まれるべき最も有効な可変領域についてのスクリーニング用の従来のツールも提供する。一態様では、本開示は、ヘテロ二量体タンパク質に使用される候補可変領域を特定又は評価する方法を提供し、この方法は、
ａ）複数の核酸対を用意するステップであって、各対が、（例えば、同じ又は異なる目的の抗原に結合する異なる抗体から得られる）複数の重鎖及び軽鎖可変領域対のそれぞれについて、重鎖候補可変領域をコードする１つの核酸及び軽鎖候補可変領域をコードする１つの核酸を含む、ステップ、
ｂ）複数の核酸対のそれぞれについて、ヘテロ二量体タンパク質を、
（ｉ）ＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン（Ｖ）の一方、第２の可変ドメイン（及び任意選択による第３の可変ドメイン、ここで、第２の可変ドメインと第３の可変ドメインとは第１の抗原結合ドメインを形成する）、及び候補と第２の可変ドメインとの間に配置されたＦｃドメイン又はその一部を含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸を作製するステップ、
（ｉｉ）第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域にそのＣ末端で融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン（Ｖ）の他方を含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸を作製するステップであって、重鎖及び軽鎖候補可変ドメインが第２の抗原結合ドメインを形成する、ステップ、及び
（ｉｉｉ）それぞれ第１及び第２のポリペプチド鎖をコードする前記核酸を宿主細胞で発現させて、前記第１及び第２のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生し、且つヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ
によって作製するステップ、及び
ｃ）産生された複数のヘテロ二量体タンパク質を目的の生物学的活性、例えば、本明細書に開示される活性について評価するステップ
を含む。一実施形態では、第１の抗原結合ドメインが、免疫エフェクター細胞の表面のポリペプチドに結合し、第２の抗原結合ドメインが腫瘍抗原、ウイルス抗原、又は細菌抗原に結合し、任意選択により、第１の抗原結合ドメインはｓｃＦｖである。任意選択により、産生されたヘテロ二量体タンパク質は、精製前に得られた総タンパク質の少なくとも２０％、２５％、又は３０％を占める。任意選択により、（ｉｉｉ）の回収するステップは、産生されたタンパク質を親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインＡ支持体又はカラムにローディングし、且つヘテロ二量体タンパク質を収集するステップ、及び／又は産生されたタンパク質（例えば、親和性交換若しくはプロテインＡカラムにローディングした後に収集されたタンパク質）をイオン交換カラムにローディングし、且つヘテロ二量体画分を収集するステップを含む。
一実施形態では、ヘテロ三量体タンパク質（例えば、本明細書に記載の任意のヘテロ三量体タンパク質）を産生する方法が提供され、この方法は、
（ａ）本明細書に記載の第１のポリペプチド鎖（例えば、第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）、第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメイン、及び第１の（Ｖ−ＣＨ１／ＣＫ）単位と第２の（Ｖ−ＣＨ１／ＣＫ）単位との間に配置されたＦｃドメイン若しくはその一部を含むポリペプチド鎖）をコードする第１の核酸を用意するステップ、
（ｂ）本明細書に記載の第２のポリペプチド鎖（例えば、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成して、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインと第２のポリペプチドの可変ドメインとが抗原結合ドメインを形成するように、第１のポリペプチド鎖の第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域にそのＣ末端で融合された可変ドメイン（Ｖ）を含むポリペプチド鎖）をコードする第２の核酸を用意するステップ、
（ｃ）本明細書に記載の第３のポリペプチド鎖（例えば、そのＣ末端でＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された可変ドメインを含むポリペプチド鎖であって、このＣＨ１又はＣＫ定常領域が、第１のポリペプチドと第３のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成して、第１のポリペプチドの第２の可変ドメインと第３のポリペプチドの可変ドメインとが抗原結合ドメインを形成するように、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメイン及び第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択される、ポリペプチド鎖）を含む第３の核酸を用意するステップ、及び
（ｄ）それぞれ前記第１、第２、及び第３の核酸を宿主細胞で発現させて、前記第１、第２、及び第３のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生し、且つヘテロ三量体タンパク質を回収するステップ
を含む。任意選択により、産生されたヘテロ三量体タンパク質は、精製前の総タンパク質の少なくとも２０％、２５％、又は３０％を占める。任意選択により、ステップ（ｄ）は、産生されたタンパク質を親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインＡ支持体又はカラムにローディングし、且つヘテロ三量体タンパク質を回収するステップ、及び／又は産生されたタンパク質（例えば、親和性交換又はプロテインＡカラムにローディングした後に収集されたタンパク質）をイオン交換カラムにローディングし、且つヘテロ三量体画分を収集するステップを含む。任意選択により、抗原結合ドメインの一方は、免疫エフェクター細胞の表面のポリペプチドに結合し、他方は目的の抗原に結合する。一実施形態では、第２又は第３のポリペプチドは、（例えば、ヒンジドメイン又はリンカーを介して）ＣＨ１又はＣＫドメインのＣ末端に融合されたＦｃドメイン若しくはその断片をさらに含む。一実施形態では、第１のポリペプチドの第２の可変ドメインと第３のポリペプチドの可変ドメインとは、免疫エフェクター細胞の表面のポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成する。
一態様では、本開示は、ヘテロ三量体タンパク質に使用される候補可変領域を特定又は評価する方法を提供し、この方法は、
ａ）複数の核酸対を用意するステップであって、各対が、（例えば、同じ又は異なる目的の抗原に結合する異なる抗体から得られる）複数の重鎖及び軽鎖可変領域対のそれぞれについて、重鎖候補可変領域をコードする１つの核酸及び軽鎖候補可変領域をコードする１つの核酸を含む、ステップ、
ｂ）複数の核酸対のそれぞれについて、ヘテロ三量体タンパク質を、
（ｉ）第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン（Ｖ）の一方、第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメイン、及び第１の（Ｖ−ＣＨ１／ＣＫ）単位と第２の（Ｖ−ＣＨ１／ＣＫ）単位との間に配置されたＦｃドメイン若しくはその一部を含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸を作製するステップ、
（ｉｉ）第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖の第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域にそのＣ末端で融合された重鎖又は軽鎖候補可変ドメイン（Ｖ）の他方を含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸を作製するステップであって、重鎖及び軽鎖候補可変ドメインが抗原結合ドメインを形成する、ステップ、
（ｉｉ）第３のポリペプチド鎖であって、そのＣ末端でＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された可変ドメインを含む第３のポリペプチド鎖をコードする第３の核酸を作製するステップであって、このＣＨ１又はＣＫ定常領域が、第１のポリペプチドと第３のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成して、第１のポリペプチドの第２の可変ドメインと第３のポリペプチドの可変ドメインとが抗原結合ドメインを形成するように、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメイン及び第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択される、ステップ、及び
（ｉｉｉ）それぞれ第１及び第２のポリペプチド鎖をコードする前記核酸を宿主細胞で発現させて、前記第１及び第２のポリペプチド鎖を産生し、且つヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ
によって作製するステップ、及び
ｃ）産生された複数のヘテロ二量体タンパク質を目的の生物学的活性、例えば、本明細書に開示される活性について評価するステップ
を含む。一実施形態では、第２又は第３のポリペプチドは、（例えば、ヒンジドメイン又はリンカーを介して）ＣＨ１又はＣＫドメインのＣ末端に融合されたＦｃドメイン若しくはその断片をさらに含む。任意選択により、産生されたヘテロ三量体タンパク質は、精製前に得られた総タンパク質の少なくとも２０％、２５％、又は３０％を占める。任意選択により、（ｉｉｉ）の回収するステップは、産生されたタンパク質を親和性精製支持体、任意選択により親和性交換カラム、任意選択によりプロテインＡ支持体又はカラムにローディングし、且つヘテロ三量体タンパク質を収集するステップ、及び／又は産生されたタンパク質（例えば、親和性交換若しくはプロテインＡカラムにローディングした後に収集されたタンパク質）をイオン交換カラムにローディングし、且つヘテロ三量体画分を収集するステップを含む。
候補可変領域を特定又は評価する方法では、候補可変領域は、例えば、免疫エフェクター細胞の表面のポリペプチドに結合する抗体から、又は目的の抗原、例えば、腫瘍、細菌、又はウイルス抗原に結合する抗体からとすることができる。候補可変領域が、腫瘍、細菌、又はウイルス抗原に対する抗体からである場合、他方の可変領域は、免疫エフェクター細胞の表面のポリペプチドに結合する抗体からとすることができ、それにより、有効であると決定された抗エフェクター細胞ＡＢＤとの関連で試験されるべき腫瘍、細菌、又はウイルス抗原に対する抗体のパネルが可能となる。また、候補可変領域対及び他の可変領域対のそれぞれのＡＢＤの位置を逆にできることも理解されたい。例えば、三量体タンパク質では、この方法は、重鎖及び軽鎖候補可変ドメインが、第１のポリペプチドの第２のＶ領域及び第２のポリペプチドのＶ領域によって形成され、他方の可変領域対が、第１のポリペプチドの第１のＶ領域及び第３のポリペプチドのＶ領域によって形成されるように変更することができる。
一態様では、本開示は、ヘテロ多量体タンパク質に使用される候補タンパク質の構造を特定又は評価する方法を提供し、この方法は、
本開示の、ドメイン配置が異なる複数の多重特異的タンパク質を別個に（例えば、別の容器で）産生するステップ、及び
産生された複数のヘテロ多量体タンパク質を目的の生物学的活性、例えば、本明細書に開示の活性について評価するステップ
を含む。一実施形態では、異なるドメイン配置を有するタンパク質は、目的の第１及び／又は第２の抗原について抗原結合ドメイン（例えば、同じＣＤＲ又は可変ドメイン）を共有する。一実施形態では、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又はそれを超える異なるタンパク質が産生され、評価される。一実施形態では、タンパク質の１つ以上（又は全て）が、本明細書に開示のドメイン配置を有するタンパク質、例えば、形態Ｆ２、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２、Ｆ１３、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ１６、及びＦ１７のタンパク質の群から選択される。一実施形態では、タンパク質は、本明細書に開示の方法に従って産生される。
一態様では、本開示は、少なくとも５つ、１０、２０、３０、５０の本開示のヘテロ多量体タンパク質のライブラリーを提供し、これらのタンパク質は、ドメイン配置を共有するが、それらの抗原結合ドメインの一方又は両方の可変ドメインのアミノ酸配列が異なる。
一態様では、本開示は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は１０の本開示のヘテロ多量体タンパク質のライブラリーを提供し、これらのタンパク質は、それらの抗原結合ドメインの一方又は両方の可変ドメインのアミノ酸配列を共有するが、ドメイン配置が異なる。
一実施形態では、第１のポリペプチドの第２の可変ドメインと第３のポリペプチドの可変ドメインとは、エフェクター細胞上の活性化受容体に結合する抗原結合ドメインを形成する。一実施形態では、ヘテロ二量体又はヘテロ三量体タンパク質を目的の特徴について評価するステップは、タンパク質を目的の抗原への結合性、ＦｃＲｎ受容体に対する結合性、Ｆｃγ受容体に対する結合性、Ｆｃドメイン媒介エフェクター機能、多量体タンパク質が結合するポリペプチドでのアゴニスト又はアンタゴニスト活性、目的の抗原を発現する細胞の活性（例えば、この細胞死を引き起こす）を調節する能力、目的の抗原を発現する細胞にリンパ球を誘導する能力、目的の抗原を発現する細胞の存在下及び／又は非存在下でリンパ球を活性化する能力、標的細胞の非存在下ではなく存在下でのリンパ球（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）の活性化、目的の抗原に陰性のリンパ球の活性化の欠如、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでの安定性又は半減期、産生収率、組成物内の純度、及び溶液中での凝集のしやすさからなる群から選択される１つ以上の特性について評価する。
一態様では、本開示は、ヘテロ多量体タンパク質を特定又は評価する方法を提供し、この方法は、
（ａ）本明細書に記載のヘテロ多量体タンパク質をコードする核酸を用意するステップ、
（ｂ）それぞれ前記核酸を宿主細胞で発現させて、前記タンパク質を産生し、且つ前記タンパク質を回収するステップ、及び
（ｃ）産生されたタンパク質を目的の生物学的活性、例えば、本明細書に開示の活性について評価するステップ
を含む。一実施形態では、複数の異なるタンパク質が産生され、評価される。
一実施形態では、このタンパク質は、エフェクター細胞上の活性化受容体及び目的の抗原に結合し、及びステップ（ｃ）は、
（ｉ）（目的の抗原を発現する）標的細胞の存在下で、活性化受容体を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、タンパク質がこのようなエフェクター細胞を活性化させる能力を試験するステップ
を含む。任意選択により、ステップ（ｉ）の後に、前記エフェクター細胞を活性化するタンパク質を（例えば、さらなる開発のため、薬剤としての使用のために）選択するステップを含む。
一実施形態では、このタンパク質は、エフェクター細胞上の活性化受容体及び目的の抗原に結合し、及びステップ（ｃ）は、
（ｉ）（目的の抗原を発現する）標的細胞の非存在下で、活性化受容体を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、タンパク質がこのようなエフェクター細胞を活性化させる能力を試験するステップ
を含む。任意選択により、ステップ（ｉ）の後に、前記エフェクター細胞を実質的に活性化しないタンパク質を（例えば、さらなる開発のため、薬剤としての使用のために）選択するステップを含む。
一実施形態では、このタンパク質は、エフェクター細胞上の活性化受容体及び目的の抗原に結合し、及びステップ（ｃ）は、
（ｉ）（目的の抗原を発現する）標的細胞の存在下で、活性化受容体を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、タンパク質がこのようなエフェクター細胞を活性化させる能力を試験するステップ、及び
（ｉｉ）（目的の抗原を発現する）標的細胞の非存在下で、活性化受容体を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、タンパク質がこのようなエフェクター細胞を活性化させる能力を試験するステップ
を含む。任意選択により、この方法は、標的細胞の非存在下でインキュベートされたときに前記エフェクター細胞を実質的に活性化せず、且つ標的細胞の存在下でインキュベートされたときに前記エフェクター細胞を活性化するタンパク質を（例えば、さらなる開発のため、薬剤としての使用のために）選択するステップをさらに含む。
一実施形態では、このタンパク質は、エフェクター細胞上の活性化受容体及び目的の抗原に結合し、及びステップ（ｃ）は、
（ｉ）（目的の抗原を発現する）標的細胞の存在下で、活性化受容体を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、ポリペプチドが、このようなエフェクター細胞に（目的の抗原を発現する）標的細胞を溶解させる能力を試験するステップ
を含む。任意選択により、ステップ（ｉ）の後に、標的細胞の存在下で、活性化受容体を発現するエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、このようなエフェクター細胞に標的細胞を溶解させるタンパク質を（例えば、さらなる開発のため、薬剤としての使用のために）選択するステップを含む。
一実施形態では、このタンパク質は、エフェクター細胞上の活性化受容体及び目的の抗原に結合し、及びステップ（ｃ）は、
（ｉ）標的細胞の存在下で、ＣＤ１６を発現するが活性化受容体は発現しないエフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、このようなエフェクター細胞を活性化させるタンパク質の能力を試験するステップ
を含む。任意選択により、ステップ（ｉ）の後に、標的細胞の存在下で前記エフェクター細胞と共にインキュベートされたときに、このようなエフェクター細胞を実質的に活性化しないタンパク質を（例えば、さらなる開発のため、薬剤としての使用のために）選択するステップを含む。
一態様では、本明細書に記載の化合物又は組成物及び薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物が提供される。
一態様では、疾患の処置用の薬剤としての、上記請求項のいずれか１つのポリペプチド又は組成物の使用が提供される。
一態様では、対象の疾患を処置する方法であって、本明細書に記載の化合物又は組成物を対象に投与するステップを含む、方法が提供される。
一実施形態では、疾患は、癌又は感染疾患である。
これらのいずれの方法も、特に「発明を実施するための形態」の任意のステップを含め、本明細書に記載の任意のステップを含むとしてさらに特徴付けることができる。本発明はさらに、任意の本方法によって得ることができるタンパク質に関する。本開示はさらに、本発明の抗体の薬剤又は診断剤に関する。本開示はさらに、処置又は診断の方法における抗体の使用方法に関する。
本発明のこれら及びさらなる有利な態様及び特徴は、本明細書の他の部分にさらに記載され得る。
抗原結合ドメイン（ＡＢＤ１又はＡＢＤ２）の一方がＮＫｐ４６に特異的に結合し、且つＡＢＤの他方が目的の抗原に結合する多重特異的ポリペプチドの２つの例を示し、左側の図は、直列型ｓｃＦｖを有し、右側の図は、間にＦｃドメインが配置された２つのＡＢＤを有する。 本明細書の実施例で使用される抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＮＫｐ４６の概略図を示す。ＣＨ２ドメインの星は任意選択のＮ２９７Ｓ変異を示す。 抗ＣＤ１９−抗ＮＫｐ４６−ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏの概略図を示す。ｓｃＦｖ直列型構築物のために、抗ＮＫｐ４６ ＶＫドメイン（Ｃ末端）が、規則的なＶＫ−ＣＫ Ｌ型接合部（ｒｅｇｕｌａｒ ＶＫ−ＣＫ ｅｌｂｏｗ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を模倣したリンカーペプチド（ＲＴＶＡ）を用いてＣＨ２ドメイン（Ｎ末端）に連結されている。 抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３が、分離されているときは、Ｂ２２１（ＣＤ１９）又はＪＵＲＫＡＴ（ＣＤ３）細胞株の存在下でＴ／Ｂ細胞の凝集を引き起こさないが、Ｂ２２１及びＪＵＲＫＡＴ細胞の両方が共にインキュベートされたときに細胞の凝集を引き起こすことを示す。 抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３が、２：１の比率（各抗体に対して２つのＦｃＲｎ）でＦｃＲｎに結合するヒトＩｇＧ１定常領域（ＫＤ＝１５．４ｎＭ）を有するキメラ完全長抗体と比較して、１：１の比率（各単量体Ｆｃに対して１つのＦｃＲｎ）でＦｃＲＮとの結合（ＫＤ＝１９４ｎＭ）を維持することを示す。 作製される二重特異タンパク質の異なるドメイン配置を示す。 それぞれＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４をベースとするＮＫｐ４６結合領域を有する二重特異的Ｆ１及びＦ２抗体を示し、これらの抗体は、静止ＮＫ細胞をそれらのＣＤ１９陽性Ｄａｕｄｉ腫瘍標的細胞に誘導することができ、アイソタイプ対照抗体は、Ｄａｕｄｉ細胞の除去をもたらさなかった。リツキシマブ（ＲＴＸ）は、ＡＤＣＣの陽性対照としての役割を果たし、ＲＴＸ（このアッセイでは１０μｇ／ｍｌ）で得られた最大応答は、２１．６％の特異的溶解であった。 図８Ａ（上のパネルがＣＤ１０７、下のパネルがＣＤ６９）は、Ｆ２形態のタンパク質におけるＮＫｐ４６及びＣＤ１９結合領域を有する二重特異的抗体が標的細胞の非存在下で静止ＮＫ細胞を活性化しないが、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及び陽性対照アレムツズマブがＮＫ細胞を活性化したことを示す。図８Ｂ（上のパネルがＣＤ１０７、下のパネルがＣＤ６９）は、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４の結合ドメインのそれぞれを含む）がＤａｕｄｉ標的細胞の存在下で静止ＮＫ細胞を活性化したが、完全長抗ＣＤ１９が最良でも非常に低いＮＫ細胞の活性化を示したことを示す。完全長抗ＮＫｐ４６抗体もアレムツズマブも、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された活性化を実質的に超える活性化を示さなかった。図８Ｃ（上のパネルがＣＤ１０７、下のパネルがＣＤ６９）は、ＣＤ１９陰性ＨＵＴ７８細胞の存在下で、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４の可変領域のそれぞれを含む）のいずれもＮＫ細胞を活性化しなかったことを示す。しかしながら、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及びアレムツズマブは、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された同様のレベルで、ＮＫ細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。 １：１の低いエフェクター：標的の比率では、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体のそれぞれは、Ｄａｕｄｉ細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化させ、及び二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９が、ＡＤＣＣ誘導抗体としての完全長ヒトＩｇＧ１のような抗ＣＤ１９抗体よりも遥かに効力があったことを示す。上のパネルはＣＤ１０７であり、下のパネルはＣＤ６９を示す。 各ＮＫｐ４６×ＣＤ１９二重特異的タンパク質（一本鎖形態Ｆ３、並びに多量体形態Ｆ５及びＦ６）は、ヒトＫＨＹＧ−１ ＣＤ１６陰性ｈＮＫｐ４６陽性ＮＫ細胞株によってＤａｕｄｉ細胞（図１０Ａ）又はＢ２２１細胞（図１０Ｂ）の特異的溶解を誘導したが、リツキシマブ及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）抗体はそうではなかったことを示す。 カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）組換えＦｃｇＲ（上のグラフ；ＣｙＣＤ６４、ＣｙＣＤ３２ａ、ＣＹＣＤ３２ｂ、ＣｙＣＤ１６）及びヒト組換えＦｃｇＲ（下のグラフ；ＨｕＣＤ６４、ＨｕＣＤ３２ａ、ＨｕＣＤ３２ｂ、ＨＵＣＤ１６ａ）の固定化ヒトＩｇＧ１対照（灰色）及び単量体Ｆｃドメインを有するＣＤ１９／ＮＫｐ４６−１二重特異的抗体（黒色）に対する結合性を示す重畳センサーグラムを示す。完全長野生型ヒトＩｇＧ１は、全てのカニクイザル及びヒトＦｃγ受容体に結合したが、ＣＤ１９／ＮＫｐ４６−１単量体Ｆｃ二重特異的抗体は、いずれの受容体にも結合しなかった。 図１２Ａは、ＤＡＲＴ及びＢＩＴＥと比較した、タンパク質形態６（Ｆ６）のＳＥＣによる精製の結果を示す。ＢＩＴＥ及びＤＡＲＴは、Ｆ６と比較して非常に低い産生収率を示し、極めて複雑なＳＥＣプロフィールを有する。図１２Ｂは、予想ＳＥＣ画分でのクマーシー染色後のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し（ＢＩＴＥの３及び４並びにＤＡＲＴの４及び５）、Ｆ６形態は、主ピーク（画分３）が単量体二重特異的タンパク質を含む明確且つ単純なＳＥＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを示した。
定義
本明細書で使用される「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は１つ以上を意味し得る。請求項において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語と共に使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という語は１つ又は２つ以上を意味し得る。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、これは、任意選択により「本質的に〜からなる（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」で置き換えることができ、さらに任意選択により「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」に置き換えることができる。
本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」という語は、エピトープに免疫特異的に結合することができる３次元構造を含むドメインを指す。従って、一実施形態では、前記ドメインは、超可変領域、任意選択により抗体鎖のＶＨ及び／又はＶＬドメイン、任意選択により少なくとも１つのＶＨドメインを含み得る。別の実施形態では、結合ドメインは、抗体鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。別の実施形態では、結合ドメインは、非免疫グロブリン足場からのポリペプチドドメインを含み得る。
本明細書の「抗体」という語は、広い意味で使用され、特に、完全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、並びに抗体断片及び誘導体（但し、所望の生物学的活性を示すものに限られる）を含む。抗体の作製に適切な様々な技術が、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８８）に示されている。「抗体断片」は、完全長抗体、例えば、その抗原結合領域又は可変領域の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ（典型的には、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメイン）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片（典型的には、ＶＨ及びＣＨ１ドメイン）、及びｄＡｂ（典型的には、ＶＨドメイン）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、及びＶ−ＮＡＲドメイン；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びカッパボディ（例えば、Ｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １９９７；１０：９４９−５７を参照されたい）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；並びに抗体断片から形成された多重特異的抗体断片、及び１つ以上の単離されたＣＤＲ又は機能的パラトープが挙げられ、単離されたＣＤＲ又は抗原結合残基若しくはポリペプチドは、機能的抗体断片を形成するように１つに結合又は連結され得る。様々なタイプの抗体断片が、例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５；２３，１１２６−１１３６；国際公開第２００５０４０２１９号パンフレット、及び米国特許出願公開第２００５０２３８６４６号明細書及び同第２００２０１６１２０１号明細書に記載され、再考察されている。
本明細書で使用される「抗体誘導体」という語は、完全長抗体、又は例えばその少なくとも抗原結合領域又は可変領域を含む抗体の断片を含み、１つ以上のアミノ酸が、例えば、アルキル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成、又はアミド形成などによって化学修飾されている。これは、限定されるものではないが、ＰＥＧ化抗体、システイン−ＰＥＧ化抗体、及びこれらの変異体を含む。
「超可変領域」という語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、及び８９−９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメインの残基３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１）、及び／又は「超可変ループ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、及び９１−９６（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １９８７；１９６：９０１−９１７）を含む。典型的には、この領域のアミノ酸残基の付番は、前出のＫａｂａｔらに記載の方法によって行われる。本明細書の「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔと同様の可変ドメイン残基の付番」、及び「Ｋａｂａｔによる」などの句は、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインについてのこの付番方式を指す。Ｋａｂａｔ付番方式を用いると、ペプチドの実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮又はＦＲ又はＣＤＲへの挿入に一致するより少ない又は追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後の単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ付番は、抗体の配列の相同領域と「基準」Ｋａｂａｔ付番配列とのアラインメントによって所与の抗体について決定することができる。
本明細書で使用される「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基とは、ＣＤＲとして定義される部分を除く抗体可変ドメインの領域のことである。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲによって分離された連続した領域にさらに細分することができる（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）。
本明細書で定義される「定常領域」とは、軽鎖又は重鎖免疫グロブリン定常領域遺伝子の１つによってコードされる抗体由来定常領域のことである。本明細書で使用される「定常軽鎖」又は「軽鎖定常領域」とは、κ（Ｃκ）又はλ（Ｃλ）軽鎖によってコードされる抗体の領域のことである。定常軽鎖は、典型的には、単一ドメインを含み、且つ本明細書で定義されるように、Ｃκの１０８〜２１４位、又はＣλを指し、付番は、ＥＵインデックスによる（（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）。本明細書で使用される「定常重鎖」又は「重鎖定常領域」とは、μ、δ、γ、α、又はε遺伝子によってそれぞれコードされてＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＥとして抗体のアイソタイプを確定する抗体の領域のことである。完全長ＩｇＧ抗体では、本明細書で定義される定常重鎖は、ＣＨ１ドメインのＮ末端からＣＨ３ドメインのＣ末端までを指し、従って１１８〜４４７位を含み、付番は、ＥＵインデックスによる。
本明細書で使用される「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ領域」とは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドのことである。Ｆａｂは、分離されたこの領域、又はポリペプチド、多重特異的ポリペプチド、若しくはＡＢＤ、又は本明細書で概説されたその他の実施形態との関連でのこの領域を指し得る。
本明細書で使用される「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」とは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片のことであり、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが、抗原結合のための所望の構造を形成できるようにする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖを作製する方法は当技術分野で周知である。ｓｃＦｖを作製する方法の再考察については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
本明細書で使用される「Ｆｖ」、又は「Ｆｖ断片」、又は「Ｆｖ領域」とは、単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチドのことである。
本明細書で使用される「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く、抗体の定常領域を含むポリペプチドのことである。従って、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びに可撓性ヒンジＮ末端からこれらのドメインまでを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭでは、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧでは、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣγ２（ＣＨ２）及びＣγ３（ＣＨ３）、並びにＣγ１とＣγ２との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、残基Ｃ２２６、Ｐ２３０、又はＡ２３１からそのカルボキシ末端までを含むように定義され、この付番はＥＵインデックスによる。Ｆｃは、以下に記載される、分離されたこの領域、又はＦｃポリペプチドとの関連でのこの領域を指し得る。本明細書で使用される「Ｆｃポリペプチド」又は「Ｆｃ由来ポリペプチド」とは、Ｆｃ領域の全て又は一部を含むポリペプチドのことである。Ｆｃポリペプチドは、限定されるものではないが、抗体、Ｆｃ融合体、及びＦｃ断片を含む。
本明細書で使用される「可変領域」とは、それぞれ軽鎖（κ及びλを含む）免疫グロブリン遺伝子座及び重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成するＶＬ（Ｖκ及びＶλを含む）遺伝子及び／又はＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つ以上のＩｇドメインを含む抗体の領域のことである。軽鎖可変領域又は重鎖可変領域（ＶＬ及びＶＨ）は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域からなる。フレームワーク領域及びＣＤＲとの関連では、例えば、Ｋａｂａｔと同様に（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” Ｅ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）を参照されたい）、及びＣｈｏｔｈｉａと同様に正確に定義されている。抗体のフレームワーク領域、即ち、構成軽鎖及び構成重鎖の組み合わせフレームワーク領域は、ＣＤＲを配置して整列させる役割を果たし、ＣＤＲは抗原への結合に主に関与する。
「特異的に結合する」という語は、抗体又はポリペプチドを、タンパク質の組換え形態、その中のエピトープ、又は単離された標的細胞の表面に存在するナイーブタンパク質のいずれかを用いて評価される、好ましくは競合的結合アッセイでの結合パートナーに結合できることを意味する。競合的結合アッセイ及び特異的結合を決定する他の方法は、以下にさらに記載され、当技術分野で周知である。
本明細書で使用される「親和性」という語は、抗体又はポリペプチドのエピトープへの結合の強さを指す。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］として定義される解離定数ＫＤによって示され、［Ａｂ−Ａｇ］は抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は非結合抗体のモル濃度であり、及び［Ａｇ］は非結合抗原のモル濃度である。親和定数ＫＡは１／ＫＤによって定義される。ｍＡｂの親和性の決定に好ましい方法は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられるＨａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８），Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）、及びＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９−６０１（１９８３）に記載されている。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野で周知の１つの好ましい標準的な方法では、（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置での分析によって）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニングを使用する。
本明細書の「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失のことである。本明細書のアミノ酸改変の一例は置換である。本明細書の「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失のことである。本明細書の「アミノ酸置換」又は「置換」とは、タンパク質配列の所与の位置のアミノ酸の別のアミノ酸での置換のことである。例えば、置換Ｙ５０Ｗは、親ペプチドの変異体を指し、５０位のチロシンがトリプトファンで置換されている。ポリペプチドの「変異体」は、基準ポリペプチド、典型的にはナイーブ又は「親」ポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ポリペプチド変異体は、ナイーブアミノ酸配列内の特定の位置に１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を有し得る。
「保存的な」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の物理化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で公知であり、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
２つ以上のポリペプチドの配列間の関係で使用される「同一性」又は「同一の」という語は、２つ以上のアミノ酸残基のストリング間の一致の数によって決定される、ポリペプチド間の配列関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の計算モデル又はコンピュータープログラム（即ち、「アルゴリズム」）によって行われる、（存在する場合）ギャップアライメントを用いた同様の２つ以上の配列間の完全な一致のパーセントを示す。関連ポリペプチド間の同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。このような方法としては、限定されるものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；ａｎｄ Ｃａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載の方法が挙げられる。
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を得るように設計されている。同一性を決定する方法は、公表されているコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））を含め、ＧＣＧプログラムパッケージを含む。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）及び他の情報源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，前出）から公表されている。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性の決定に使用することができる。
「単離された」分子は、組成物中の主な種である分子であり、この組成物中では、この分子は、この分子が属する分子のクラスに対して見出される（即ち、単離された分子は、組成物中の分子のタイプの少なくとも約５０％を構成し、典型的には、組成物中の分子、例えば、ペプチドの種の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％以上を構成する）。通常、ポリペプチドの組成は、組成物中に存在する全てのペプチド種との関連でのポリペプチドに対して、又は少なくとも提案される使用との関連での実質的に活性なペプチド種に対して９８％、９８％、又は９９％の均一性を示す。
本明細書に関連して、「処置」又は「処置する」は、反対の旨の記載がない限り、疾患又は障害の１つ以上の症状又は臨床的に関連する兆候を予防すること、緩和すること、管理すること、治癒すること、又は軽減することを指す。例えば、疾患又は障害の症状又は臨床的に関連する兆候が確認されていない患者の「処置」は、防止又は予防療法であり、疾患又は障害の症状又は臨床的に関連する兆候が確認された患者の「処置」は、一般に、防止又は予防療法とはならない。
本明細書で使用される「ＮＫ細胞」は、従来にない免疫に関与するリンパ球の亜集団を指す。ＮＫ細胞は、特定の特徴及び生物学的特性、例えば、ヒトＮＫ細胞のＣＤ５６及び／又はＮＫｐ４６を含む特定の表面抗原の発現、細胞表面のα／β又はγ／δＴＣＲ複合体の非存在、特定の細胞溶解装置の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合してその細胞を殺す能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞又は他の異常細胞を殺す能力、及び免疫応答を刺激又は抑制するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力によって特定することができる。これらの特徴及び活性のいずれかを用いて、当技術分野で周知の方法でＮＫ細胞を特定することができる。ＮＫ細胞のいかなる亜集団もＮＫ細胞という語に包含される。本明細書に関連して、「活性な」ＮＫ細胞は、標的細胞を溶解する又は他の細胞の免疫機能を促進する能力を有するＮＫ細胞を含む生物学的に活性なＮＫ細胞を指す。ＮＫ細胞は、当技術分野で公知の様々な技術、例えば、血液サンプルからの単離、細胞吸着除去療法、組織又は細胞の収集などによって得ることができる。ＮＫ細胞を伴うアッセイの有用なプロトコルは、Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＫＳ ａｎｄ Ｃｏｌｏｎｎａ Ｍ）．Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ．ｐｐ．２１９−２３８（２０００）に記載されている。
本明細書で使用される「Ｔ細胞」とは、胸腺で成熟し、いくつかある分子のなかでもＴ細胞受容体をその表面に提示するリンパ球の亜集団を指す。Ｔ細胞は、特定の特徴及び生物学的特性、例えば、ＴＣＲ、ＣＤ４、又はＣＤ８を含む特定の表面抗原の発現、腫瘍又は感染細胞を殺す特定のＴ細胞の能力、免疫系の他の細胞を活性化させる特定のＴ細胞の能力、及び免疫反応を刺激若しくは抑制するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力によって特定することができる。これらの任意の特徴及び活性を使用して、当技術分野で周知の方法でＴ細胞を特定することができる。本明細書との関連では、「活性」又は「活性化」Ｔ細胞は、生物学的に活性なＴ細胞、特に、細胞溶解能力、又は、例えば分泌サイトカインにより免疫応答を刺激する能力を有するＴ細胞を指す。活性細胞は、機能的アッセイ、及び、例えば、ＴＮＦ−αなどのサイトカインの発現を用いるアッセイを含め、多数の周知の方法のいずれかで検出することができる。
ポリペプチドの産生
本明細書に記載の抗原結合ドメインは、様々な免疫グロブリン又は非免疫グロブリン足場、例えば、ブドウ球菌プロテインＡのＺドメインをベースとしたアフィボディ、エンジニアリングされたＫｕｎｉｔｚドメイン、ヒトフィブロネクチンＩＩＩの第１０細胞外ドメインをベースとしたモノボディ又はアドネクチン、リポカリンに由来するアンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ（設計アンキリン反復ドメイン、多量体化ＬＤＬＲ−Ａモジュール、アビマー、又はシステインリッチｋｎｏｔｔｉｎペプチド）から容易に得ることができる。例えば、参照により開示内容が本明細書に組み入れられる、Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：２４５−２５５を参照されたい。
可変ドメインは、通常、抗体（免疫グロブリン鎖）に由来し、例えば、２つのポリペプチド鎖に存在する結合したＶＬ及びＶＨドメイン、又は一本鎖抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｄＡｂ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、又はＶＨＨドメインの形態である。可変ドメインはまた、Ｆａｂのような抗体から容易に得ることができる。
典型的には、抗体は、最初は、抗体（例えば、ヒトポリペプチド）を得るのに望ましいポリペプチド、又は典型的には免疫原性断片であるその断片若しくは誘導体を含む免疫原を用いて、非ヒト動物、例えば、マウスの免疫によって得られる。非ヒト哺乳動物を抗原で免疫するステップは、マウスの抗体の産生を刺激するための当技術分野で周知の任意の方式で行うことができる（例えば、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられるＥ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）を参照されたい）。免疫に使用される抗原に対する抗体を発現するＢ細胞を産生するのであれば、他のプロトコルも使用することができる。非免疫非ヒト哺乳動物からのリンパ球を単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させ、これを細胞培養で免疫原に曝露することもできる。次いで、リンパ球を回収し、以下に記載される融合ステップを行う。例示的なモノクローナル抗体では、次のステップは、免疫された非ヒト哺乳動物からの脾細胞の単離であり、続いて、抗体産生ハイブリドーマを産生するためのこれらの脾細胞の不死化細胞との融合である。次いで、ハイブリドーマコロニーを、抗体が望ましいポリペプチドに特異的に結合する抗体の産生についてアッセイした。アッセイは、典型的には、比色ＥＬＩＳＡ型アッセイであるが、ハイブリドーマが増殖されるウェルに適合させることができる任意のアッセイを利用することができる。他のアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ又は蛍光活性化細胞分類が挙げられる。所望の抗体の産生に陽性なウェルを検査して、１つ以上の異なるコロニーが存在するか否かを決定する。２つ以上のコロニーが存在する場合、細胞を再びクローニングして、単一の細胞のみが、所望の抗体を産生するコロニーに生じるようになるように成長させることができる。所望のモノクローナル抗体を産生するまで十分に成長させたところで、モノクローナル抗体を含む成長培地（又は腹水）を細胞から分離し、そこに存在するモノクローナル抗体を精製する。精製は、典型的には、ゲル電気泳動法、透析、プロテインＡ若しくはプロテインＧセファロースを用いるクロマトグラフィー、又は固体支持体、例えば、アガロース若しくはセファロースビーズに連結された抗マウスＩｇによって達成される（全てが、例えば、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられるＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．１８−１０３７−４６，Ｅｄｉｔｉｏｎ ＡＣに記載されている）。
ヒト抗体は、ヒト抗体レパートリーを発現するようにエンジニアリングされたトランスジェニック動物（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ ｅｔ Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５）を免疫に用いることによって、又はファージ提示法を用いる抗体レパートリーの選択によって産生することもできる。例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を免疫に使用することができる。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、その免疫グロブリン遺伝子が機能的なヒト免疫グロブリン遺伝子によって置き換えられたマウス宿主である。従って、このマウスによって、又はこのマウスのＢ細胞から産生されたハイブリドーマで産生される抗体は既にヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、参照によりその内容が本明細書に組み入れられる米国特許第６，１６２，９６３号明細書に記載されている。
抗体はまた、例えば、（参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられるＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３４１（１９８９）ｐ．５４４）に開示されているように、免疫グロブリンの組み合わせライブラリーの選択によって産生することもできる。ファージ提示法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３）を用いて、非免疫ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから抗体を産生することができる。例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４；米国特許第５５６５３３２号明細書；同第５５７３９０５号明細書；同第５５６７６１０号明細書；同第５２２９２７５号明細書を参照されたい。組み合わせライブラリーが、ヒト起源の可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーを含む場合、組み合わせライブラリーからの選択により、ヒト抗体が得られる。
加えて、広範囲の抗体が、ＤＮＡ及び／又はアミノ酸配列を含む化学文献及び特許文献で、又は民間供給業者から入手可能である。抗体は、典型的には、所定の抗原に対するものである。抗体の例としては、除去されるべき標的細胞、例えば、増殖細胞又は病理の原因となる細胞によって発現される抗原を認識する抗体が挙げられる。例としては、腫瘍抗原、微生物（例えば、細菌）抗原、又はウイルス抗原を認識する抗体が挙げられる。
可変ドメイン及び／又は抗原結合ドメインは、所望の細胞標的に基づいて選択することができ、例えば、癌抗原、細菌抗原、又はウイルス抗原などを含み得る。本明細書で使用される「細菌抗原」という語は、限定されるものではないが、無傷細菌、弱毒細菌、若しくは死菌、あらゆる構造的若しくは機能的細菌タンパク質若しくは炭水化物、又は抗原性であるべき十分な長さ（典型的には、約８アミノ酸以上）の細菌タンパク質の任意のペプチド部分を含む。例としては、グラム陽性細菌抗原及びグラム陰性細菌抗原が挙げられる。一部の実施形態では、細菌抗原は、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）種、特にヘリコバクターピロリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ）；ボレリア（Ｂｏｒｅｌｉａ）種、特にボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）；レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）種、特にレジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）；マイコバクテリア属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓ）種、特に結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、アビウム菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、イントラセルラ菌（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）；ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）；ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、特に淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、特にリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、特にＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．ファエカリス（Ｓ．ｆａｅｃａｌｉｓ）；Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ）；嫌気性連鎖球菌（ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種；病原性カンピロバクター（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種；ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）種、特にヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚｕｅ）；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、特に炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、特にコリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；エリジペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）種、特にブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、特にウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）；エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、特にエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、特にクレブシエラ１Ｓニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ １Ｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パストレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）種、特にパストレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）種、特にパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種；フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、特にフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）；ストレプトバチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、特にストレプトバチルス・モリホルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）；トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、特にトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）；レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）；病原性エシェリキア種（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）；及びアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、特にアクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｌｉ）からなる群から選択される細菌に由来する。
本明細書で使用される「ウイルス抗原」という語は、限定されるものではないが、無傷全ウイルス、弱毒全ウイルス、若しくは死滅全ウイルス、任意の構造的若しくは機能的ウイルスタンパク質、又は抗原性であるべき十分な長さ（典型的には、約８アミノ酸以上）のウイルスタンパク質の任意のペプチド部分を含む。ウイルス抗原の供給源としては、限定されるものではないが、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、又はＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる；及び他の分離株、例えば、ＨＩＶ−ＬＰ；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス；ヒトコクサッキーウイルス；ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンヤウイルス科（例えば、ハンタウイルス、ブンヤウイルス、フレボウイルス、及びナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、及びロタウイルス）；ボルナビリダエ科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス（殆どのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（バリオラウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；及びイリダウイルス科（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；及び未分類ウイルス（例えば、デルタ肝炎の作用物質（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥サテライト（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）と考えられる）、Ｃ型肝炎；ノーウォーク及び関連ウイルス、及びアストロウイルス）の科からのウイルスが挙げられる。別法では、ウイルス抗原は、組換えにより作製することができる。
本明細書で使用される「癌抗原」及び「腫瘍抗原」という語は、同義的に使用され、癌細胞によって差次的に発現される抗原を指し、従って、癌細胞を標的にするために利用することができる。癌抗原は、明らかに腫瘍特異的免疫応答を潜在的に刺激し得る抗原である。これらの抗原の一部は、正常細胞によってコードされるが、必ずしも発現されるものではない。これらの抗原は、正常細胞では通常サイレントである（即ち、発現されない）抗原、分化の特定の段階のみで発現される抗原、及び胚抗原及び胎児抗原のように一時的に発現される抗原として特徴付けることができる。他の癌抗原は、変異細胞遺伝子、例えば、癌遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ癌遺伝子）、サプレッサー遺伝子（例えば、突然変異ｐ５３）、内部欠失又は染色体転座から生じる融合タンパク質によってコードされる。さらに他の癌抗原は、ウイルス遺伝子、例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡ腫瘍ウイルスに保持されたウイルス遺伝子によってコードすることができる。
癌抗原は、通常、過剰発現される又は異常な回数で発現される正常細胞の表面抗原である。理想的には、標的抗原は、増殖細胞（例えば、腫瘍細胞）のみで発現されるが、これは、実際には稀にのみ観察される。結果として、標的抗原は、通常、増殖組織と健康組織との間の差次的な発現に基づいて選択される。受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ４、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ４７、糖タンパク質ＮＭＢ、ＣａｎＡｇ、Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ）、ＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ２）、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ３）、ＣＤ７９、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＰＳＣＡ、Ｌ１−ＣＡＭ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＢＣＭＡ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ７０、Ｅ−セレクチン、ＥｐｈＢ２、メラノトランスフェリン、Ｍｕｄ６、及びＴＭＥＦＦ２を含む特定の腫瘍関連抗原を標的とする抗体が産生された。癌抗原の例としては、網羅するものではないが、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＰＤ−Ｌ１、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、キラーＩｇ様受容体３ＤＬ２（ＫＩＲ３ＤＬ２）、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、受容体タンパク質チロシンキナーゼ３（ＴＹＲＯ−３）、ネクチン（例えば、ネクチン−４）、主要組織適合複合体クラスＩ関連鎖Ａ及びＢポリペプチド（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）ファミリーのタンパク質、レチノイン酸初期ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ−１（ＲＡＴＥ１）ファミリーのタンパク質、癌胎児抗原（ＣＥＡ）及びその免疫原性エピトープＣＡＰ−１及びＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３ζ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥファミリー、腫瘍抗原のＧＡＧＥファミリー、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体、δ様リガンド４（ＤＬＬ４）、ＤＲ５、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、ＭＵＣファミリー、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、アンジオポイエチン−２、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ヒトＥＧＦ様受容体ファミリーのメンバー、例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、又は少なくとも１つのＨＥＲサブユニットからなるヘテロ二量体受容体、ガストリン放出ペプチド受容体抗原、Ｍｕｃ−１、ＣＡ１２５、αｖβ３インテグリン、α５β１インテグリン、αＩＩｂβ３インテグリン、ＰＤＧＦβ受容体、ＳＶＥ−カドヘリン、ＩＬ−８、ｈＣＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１５、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン及びγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸線種様ポリープタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ウイルス産物、例えば、ヒトパピローマウイルスタンパク質、ｉｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶコード核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１及びＣＴ−７、及びｃ−ｅｒｂＢ−２が挙げられる。
一実施形態では、ＡＢＤ、可変ドメイン、又は相補的な可変ドメインの対は、癌抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、又は（例えば、ウイルス感染した）感染細胞若しくは炎症性免疫細胞上に存在する抗原に結合する。一実施形態では、前記抗原は、腫瘍細胞及び感染細胞若しくは炎症性細胞で選択的に発現される又は過剰発現されるポリペプチドである。一実施形態では、前記抗原は、阻害されると、腫瘍細胞、感染細胞、若しくは炎症性細胞の増殖及び／又は生存率を低下させるポリペプチドである。例えば、第１及び／又は第２の抗体若しくは断片は、それぞれ抗Ｈｅｒ１及び抗Ｈｅｒ２に結合することができる。抗Ｈｅｒ２は、例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）又は２Ｃ４（ペルツズマブ）に由来するＣＤＲを含む抗体であり得る。抗Ｈｅｒ２及び抗Ｈｅｒ−１（抗体Ｄ１−５及びＣ３−１０１）アミノ酸配列は、国際公開第２０１１／０６９１０４号パンフレットに示されている。
一実施形態では、ＡＢＤ、可変ドメイン、又は相補的な可変ドメインの対は、特異的に結合するポリペプチドの機能を阻害（中和）する。一実施形態では、第１及び／又は第２のＡＢＤは、それぞれ特異的に結合するポリペプチドの機能を阻害する。一実施形態では、このポリペプチドは、腫瘍細胞で選択的に発現される又は過剰発現されるポリペプチドである。一実施形態では、このポリペプチドは、感染（例えば、ウイルス又は細菌感染）細胞又は炎症性細胞で選択的に発現される又は過剰発現されるポリペプチドである。一実施形態では、このポリペプチドは、阻害されると、腫瘍細胞、感染細胞、若しくは炎症性細胞の増殖及び／又は生存率を低下させるポリペプチドである。例えば、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３に結合して、リガンド誘導受容体活性化をブロックする二重特異的抗体が、ＥｒｂＢ２増幅腫瘍に有効であることが報告された（ＭａｃＤｏｎａｇｈ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１１：５８２）。
例示的な実施形態では、一方のＡＢＤ、可変ドメイン、又は相補的な可変ドメインの対は、除去されるべき標的細胞によって発現される抗原（例えば、腫瘍抗原、微生物（例えば、細菌）抗原、ウイルス抗原、又は亜炎症性疾患若しくは自己免疫疾患の一因である免疫細胞で発現される抗原）に結合し、及び他方のＡＢＤ、可変ドメイン、又は相補的な可変ドメインの対は、免疫細胞、例えば、免疫エフェクター細胞で発現される抗原、例えば、エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の細胞表面受容体に結合する。免疫細胞、任意選択により免疫エフェクター細胞で発現される抗原の例として、ヒトリンパ細胞系統のメンバー、例えば、ヒトＴ細胞、ヒトＢ細胞、若しくはヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ヒト単球、ヒト好中性顆粒球、又はヒト樹状細胞で発現される抗原が挙げられる。有利なことに、このような細胞は、（例えば、腫瘍抗原、微生物抗原、ウイルス抗原、又は炎症性疾患若しくは自己免疫疾患の一因である免疫細胞で発現される抗原を発現する）除去されるべき標的細胞に対して細胞毒又はアポトーシス効果を有する。特に有利なことに、ヒトリンパ球様細胞は、活性化されると標的細胞に細胞傷害性効果を与える細胞傷害性Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。従って、この実施形態によると、ヒトエフェクター細胞の細胞傷害活性は漸増される。別の実施形態によると、ヒトエフェクター細胞は、ヒト骨髄細胞系列のメンバーである。
多重特異的抗体を構成する抗体の断片が結合し得る免疫細胞で発現される抗原は、ＮＫ及び／又はＴ細胞受容体、例えば、それぞれＮＫ細胞又はＴ細胞を除去されるべき目的の標的細胞に誘導する役割を果たし得る、ＮＫ細胞又はＴ細胞の表面の任意の分子も含み得る。例としては、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）ファミリーのメンバー、白血球免疫グロブリン様受容体（ＬＩＬＲ）ファミリー、又はレクチンファミリー、又はＮＫ細胞レクチン様受容体ファミリーが挙げられる。活性は、例えば、多重特異的ポリペプチドの存在下で標的細胞とエフェクター細胞を接触させることによって測定することができる。任意選択により、免疫細胞受容体は、活性化受容体、例えば、活性化ＮＫ細胞又はＴ細胞受容体である。本明細書で使用される「活性化ＮＫ細胞受容体」及び「活性化Ｔ細胞受容体」という語は、それぞれ刺激されるとＮＫ細胞又はＴ細胞の活性に関連した当技術分野で公知の任意の特性又は活性の測定可能な上昇を引き超す、ＮＫ細胞又はＴ細胞の表面の任意の分子を指し、このような特性又は活性は、それぞれ、例えばサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−α）の産生、細胞内遊離カルシウムレベルの上昇、上記の、例えば、本明細書の他の部分に記載されるリダイレクト殺傷アッセイ（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙ）において標的細胞を溶解する能力、又はＮＫ細胞若しくはＴ細胞の増殖をそれぞれ刺激する能力である。「活性化ＮＫ受容体」という語は、限定されるものではないが、ＤＮＡＸアクセサリー分子−１（ＤＮＡＭ−１）、２Ｂ４、活性化型のＫＩＲタンパク質（例えば、ＫＩＲ２ＤＳ受容体、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４）、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＣＤ６９、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、及びＩＬ−２１Ｒを含む。一実施形態では、活性化ＮＫ細胞受容体は、Ｆｃγ受容体以外の受容体である。一実施形態では、活性化ＮＫ細胞受容体は、ＮＫｐ４６以外の受容体である。
細胞傷害性Ｔ細胞の活性化は、この実施形態の多重特異的（例えば、二重特異的）ポリペプチドによる細胞傷害性Ｔ細胞の表面のエフェクター抗原としてのＣＤ３抗原の結合により起こり得る。ヒトＣＤ３抗原は、ヘルパーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞の両方に存在する。ヒトＣＤ３は、多分子Ｔ細胞複合体の一部としてＴ細胞上で発現され、且つ３つの異なる鎖：ＣＤ３−ε、ＣＤ３−δ、及びＣＤ３−γを含む抗原を指す。
多重特異的ポリペプチドによって結合された他のエフェクター細胞抗原は、ヒトＣＤ１６抗原、ヒトＣＤ６４、ヒトＣＤ２抗原、ヒトＣＤ２８抗原、又はヒトＣＤ２５抗原である。一実施形態では、エフェクター細胞抗原はＣＤ１６であり、このようなポリペプチドは、抑制性ＦｃγＲに実質的に結合しないＦｃドメインを有する場合、抑制性ＦｃγＲから阻害されることなく、ＣＤ１６アゴニスト活性を有する。他の実施形態では、エフェクター細胞活性化受容体は、ＣＤ１６以外の受容体である。
このポリペプチド内に含まれるＡＢＤ又は可変ドメインは、ポリペプチドに含められる前に任意の所望の活性について試験することができる。所望の特異性及び／又は活性を有する適切な抗原結合ドメインが特定されると、それぞれの可変ドメインをコードするＤＮＡを任意の要素、例えば、酵素認識標識をコードするＤＮＡ、又は適切な宿主へのトランスフェクションのためのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン並びにその他の任意選択の要素（例えば、リンカー若しくはヒンジ領域をコードするＤＮＡ）と共に、適切な発現ベクターに適切な配置で導入することができる。次いで、宿主が、多重特異的ポリペプチドを構成するポリペプチド鎖の組換え産生に使用される。
抗体に由来するＡＢＤ又は可変領域は、一般に、多量体ポリペプチド中に存在するときに結合活性を付与するのに十分な最小の超可変領域を含む。ＡＢＤ又は可変領域は、限定されるものではないが、リンカー要素（それぞれ可変ドメインとＣＨ１、ＣＬ、ＣＨ２、又はＣＨ３ドメインとの間、又は必要に応じて他のドメイン間に配置することができる、例えば、リンカーペプチド、定常ドメイン由来配列、ヒンジ、又はこれらの断片）を含め、場合により、必要に応じて他のアミノ酸又は機能的ドメインを含み得ることを理解されたい。
任意の実施形態では、ＡＢＤ又は可変領域は、ヒト化抗体から得ることができ、このヒト化抗体では、ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、元の抗体の所望の特性、親和性、及び能力を維持したまま、元の抗体（親抗体又はドナー抗体、例えば、マウス又はラット抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されている。親抗体のＣＤＲは、その一部又は全てが非ヒト生物を起源とする核酸によってコードされ、ヒト抗体可変領域のβシートフレームワークに全て又は一部が移植されて、移植されたＣＤＲによって特性が決定される抗体を形成する。このような抗体の形成は、例えば、国際公開第９２／１１０１８号パンフレット、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５，Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６に記載されている。従って、抗原結合ドメインは、非ヒト超可変領域又はＣＤＲ及びヒトフレームワーク領域配列（任意選択により復帰変異を含む）を有し得る。
ポリペプチド鎖は、互いに機能的に連結された所望のドメインを有するポリペプチドを作製するために１つ以上の発現ベクターに配置される。多重特異的ポリペプチドの発現のために選択された宿主細胞は、限定されるものではないが、免疫グロブリンＣＨ２ドメインのタンパク質を装飾するオリゴ糖部分の組成の変化を含め、最終組成の重要な寄与因子である。従って、本発明の一態様は、多重特異的ポリペプチドが少なくとも部分的なＦｃＲｎ結合性を維持するが、例えば野生型完全長ヒトＩｇＧ１抗体と比較してＦｃγ受容体に対する結合性が低下するように、所望の治療用タンパク質を発現する産生細胞に使用するのに適した宿主細の選択及び／又はこのような産生細胞の開発に関する。宿主細胞は、哺乳動物起源であってもよく、又はＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＳＣ−１細胞、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、６５３細胞、ＳＰ２／０細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞、リンパ腫細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は植物細胞から選択してもよく、又はこれらの任意の由来細胞、不死化細胞、若しくは形質転換細胞であってもよい。別法では、宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化できない種又は生物、例えば、原核細胞又は生物、例えば、天然又はエンジニアリングされた大腸菌属菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｐｐ．）、クレブシエラ属菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）、又はシュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）から選択することができる。
次いで、このポリペプチドを適切な宿主細胞で産生するか、又は任意の適切な合成プロセスによって生産して、多量体（例えば、二量体又は三量体）ポリペプチドを形成するのに適した条件下で接触させることができる。
ポリペプチドの立体配置
目的の第１及び第２の抗原に一価で結合する単離されたヘテロ多量体ポリペプチドを異なる立体配置に従って調製することができ、いずれの場合も、少なくとも中心（第１）のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖、及び任意選択により第３のポリペプチド鎖を含む。
第１（中心）のポリペプチド鎖は、第２のポリペプチド鎖上の相補的な可変ドメインと共に、目的の１つの（例えば、第１の）抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する１つの可変ドメインを提供する。第１（中心）のポリペプチド鎖はまた、相補的な可変ドメインと対を形成して目的の別の（例えば、第２の）抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する第２の可変ドメインも提供し、第２の可変ドメインに相補的な可変ドメインを（例えば、直列型可変ドメイン構築物、例えば、ｓｃＦｖの第２の可変ドメインに隣接して）中心ポリペプチドに配置することができるか、又は第２のポリペプチド鎖上に配置することができるか、又は第３のポリペプチド鎖上に配置することができる。第２の（及び第３の（存在する場合））ポリペプチド鎖が、ＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体化によって中心ポリペプチド鎖に結合して、それぞれのヒンジドメイン間及び相補的なＣＨ１とＣＫドメインとの間に鎖間ジスルフィド結合を形成し、ＣＨ／ＣＫ及びＶＨ／ＶＫドメインが、１つのみの二量体化立体配置が生じるように選択される限り、単一多量体ポリペプチドが形成される。三量体において、又はポリペプチドが三量体の形成のために作製される場合、一般に、天然に存在しないＶＨ−ＣＫ又はＶＬ−ＣＨ１ドメイン配置を含む１つのポリペプチド鎖が存在することになる。
ＣＨ１又はＣＬ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）（例えば、Ｖドメインが、そのＣ末端でＣＨ１又はＣＫ定常領域のＮ末端に融合されている）、第２の可変ドメイン、及び第１の可変ドメインと第２の可変ドメインとの間に配置されたＦｃドメイン（例えば、完全Ｆｃドメイン又はその一部）を含む第１（中心）のポリペプチド鎖は、限定されるものではないが、以下を含む第１のポリペプチドのドメイン配置の例を有し得る。
Figure 0006702893
第２のポリペプチド鎖は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＬ（例えば、ＣＨ１−ＣＫ）ヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖のＣＨ１又はＣＬ定常領域に相補的であるように選択されたＣＨ１又はＣＬ（例えば、ＣＫ）定常領域に（例えば、そのＣ末端で）融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）を含む。第２のポリペプチド鎖は、例えば、ＣＨ１又はＣＬドメインのＣ末端に融合された、又は可変ドメインのＮ末端に融合されたＦｃドメイン（例えば、完全Ｆｃドメイン又はその一部）をさらに含み得る。第２のポリペプチドのドメイン配置の例としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる。
Figure 0006702893
第３のポリペプチド鎖は、存在する場合、ドメイン配置：（ＶＨ又はＶＫ）−（ＣＨ１又は（ＣＫ））を有し得る。
ヘテロ二量体
このようなヘテロ二量体タンパク質に使用される中心ポリペプチド鎖の（Ｎ末端からＣ末端への）ドメイン配置の例としては、
Ｖａ１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖａ２−Ｖｂ２、
Ｖａ２−Ｖｂ２−Ｆｃドメイン−Ｖａ１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ
が挙げられ、ここで、Ｖａ１は軽鎖又は重鎖可変ドメインであり、Ｖａ２及びＶｂ２の一方は軽鎖可変ドメインであり、及び他方は重鎖可変ドメインである。
さらなる例として、
Ｖａ１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖｂ、
Ｖｂ−Ｆｃドメイン−Ｖａ２−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ
も挙げられ、ここで、Ｖｂは単一可変ドメイン（例えば、ｄＡｂ、ＶｈＨ）として抗原に結合する。
中心鎖のＦｃドメインは、所望の機能（例えば、ＦｃＲｎ結合性）を付与するのに十分な完全なＦｃドメイン（ＣＨ２−ＣＨ３）又はその一部であり得る。次いで、第２のポリペプチド鎖が作製され、この第２のポリペプチド鎖は、免疫グロブリン可変ドメイン、及びＣＨ１−ＣＫの中心ポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を可能にするように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域、例えば、（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ単位を含み、この免疫グロブリン可変ドメインは、ＣＨ１又はＣＫドメインに隣接した中心鎖の可変ドメインを補完し、それにより、相補的な可変ドメインが、目的の第１の抗原の抗原結合ドメインを形成するように選択される。
例えば、第２のポリペプチド鎖は、ドメイン配置：
Ｖｂ１−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ、又は
Ｖｂ１−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ−Ｆｃドメイン
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１又はＣＫ）ｂが中心鎖の（ＣＨ１又はＣＫ）ａと二量体化し、Ｖｂ１が中心鎖のＶａ１と共に抗原結合ドメインを形成する。中心鎖のＶａ１が軽鎖可変ドメインである場合、Ｖｂ１は重鎖可変ドメインであり、中心鎖のＶａ１が重鎖可変ドメインである場合、Ｖｂ１は軽鎖可変ドメインである。
次いで、目的の第２の抗原の抗原結合ドメインを、目的の第２の抗原の抗原結合ドメインを形成する中心鎖の直列型可変ドメイン（例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖（κ）可変ドメイン（ＶＫ）であり、例えば、ｓｃＦｖ単位を形成する）として構成されたＶａ２及びＶｂ２から形成することができる。目的の第２の抗原の抗原結合ドメインは、別法では、中心鎖に存在する単一可変ドメインＶ２から形成することもできる。
得られるヘテロ二量体は、例えば、以下の構成を有することができる（図６Ａ及び図６Ｃに形態２、１１、及び１２として示されているようなタンパク質の例も参照されたい）。
Figure 0006702893
 ここで、第１のポリペプチド鎖のＶａ１及び第２のポリペプチド鎖のＶｂ１の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインであり、Ｖａ２及びＶｂ２の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインである。
得られるヘテロ二量体は、別の例では、以下の構成を有することができる（図６Ｂに形態１０として示されているこのようなタンパク質の例も参照されたい）。
Figure 0006702893
 ここで、第１のポリペプチド鎖のＶａ１及び第２のポリペプチド鎖のＶｂ１の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインであり、Ｖａ２及びＶｂ２の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインである。
得られるヘテロ二量体は、別の例では、以下の構成を有することができる（図６Ｄ及び図６Ｅに形態１３及び１４として示されているようなタンパク質の例も参照されたい）。
Figure 0006702893
 ここで、第１のポリペプチド鎖のＶａ１及び第２のポリペプチド鎖のＶｂ１の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインであり、Ｖａ２及びＶｂ２の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインである。
一実施形態では、ヘテロ二量体二重特異的Ｆｃ由来ポリペプチドは、以下の１つのドメイン配置を含み、任意選択により一方又は両方のヒンジドメインがペプチドリンカーによって置換され、任意選択によりＦｃドメインが、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞など）によって発現されるポリペプチドに結合するｓｃＦｖにペプチドリンカーを介して融合される。
Figure 0006702893
形成される二量体ポリペプチドのドメイン配置の例としては、限定されるものではないが、以下の表のドメイン配置が挙げられる。
Figure 0006702893
ヘテロ三量体
ヘテロ三量体タンパク質は、例えば、第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）、第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメイン（Ｖ）、及び第１の可変ドメインと第２の可変ドメインとの間に配置されたＦｃドメイン又はその一部（即ち、Ｆｃドメインは、第１及び第２のＶ−（ＣＨ１／ＣＫ）単位間に配置されている）を含む中心（第１）のポリペプチド鎖を使用することによって形成することができる。例えば、ヘテロ三量体タンパク質に使用される中心のポリペプチド鎖は、（Ｎ末端からＣ末端に）以下のドメイン配置を有することができる：
Ｖａ１−（ＣＨ１又はＣＫ）ａ−Ｆｃドメイン−Ｖａ２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ。
次いで、第２のポリペプチド鎖は、（Ｎ末端からＣ末端に）ドメイン配置：
Ｖｂ１−（ＣＨ１又はＣＫ）ｃ、又は
Ｖｂ１−（ＣＨ１又はＣＫ）ｃ−Ｆｃドメイン
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１又はＣＫ）ｃが中心鎖の（ＣＨ１又はＣＫ）１と二量体化し、Ｖａ１とＶｂ１とが抗原結合ドメインを形成する。
次いで、第３のポリペプチド鎖は、（Ｎ末端からＣ末端に）ドメイン配置：
Ｖｂ２−（ＣＨ１又はＣＫ）ｄ
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１又はＣＫ）ｄが中心鎖の（ＣＨ１又はＣＫ）ｂ単位と二量体化し、Ｖａ２とＶｂ２とが抗原結合ドメインを形成する。
二量体Ｆｃドメイン（図６Ｄ及び図６Ｅにも形態５、６、７、及び１６として示されている）を有する、得られるヘテロ三量体の構成の一例は、ドメイン配置：
Figure 0006702893
 を有する。
単量体Ｆｃドメイン（図６Ｂ及び図６Ｃにも形態８、９、及び１７として示されている）を有する、得られるヘテロ三量体の構成の一例は、ドメイン配置：
Figure 0006702893
 を有する。
従って、三量体ポリペプチドの構成では、第１のポリペプチドは、別個のポリペプチド鎖の可変ドメイン（即ち、第２鎖及び第３鎖の可変ドメイン）を有する抗原結合ドメインをそれぞれ形成する２つの可変ドメインを有することができ、第２のポリペプチド鎖は、１つの可変ドメインを有し、第３のポリペプチドは、１つの可変ドメインを有する。
三量体ポリペプチドは、
（ａ）第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）、第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメイン（Ｖ）、及び第１の可変ドメインと第２の可変ドメインとの間に配置されたＦｃドメイン又はその一部を含む、第１のポリペプチド鎖、
（ｂ）第１及び第２のポリペプチドがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、第１のポリペプチド鎖の第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域にそのＣ末端で融合された可変ドメイン、及び任意選択によりＦｃドメインを含む、第２のポリペプチド鎖、及び
（ｃ）ＣＨ１又はＣＫ定常領域に（例えば、そのＣ末端で）融合された可変ドメインを含む、第３のポリペプチド鎖であって、この可変ドメイン及び定常領域が、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメイン及び第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第１及び第３のポリペプチドが、第３のポリペプチドのＣＨ１又はＣＫ定常領域と第１のポリペプチドの第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域との間ではなく、第３のポリペプチドのＣＨ１又はＣＫ定常領域と第１のポリペプチドの第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域との間に形成されたジスルフィド結合によって結合されたＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成する、第３のポリペプチド鎖
を含み、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドと第３のポリペプチドとがＣＨ１−ＣＫヘテロ三量体を形成し、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインと第２のポリペプチド鎖の可変ドメインとが、目的の第１の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成し、且つ第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインと第３のポリペプチド鎖の可変ドメインとが、目的の第２の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する。
形成される三量体二重特異的ポリペプチドのドメイン配置の例としては、限定されるものではないが、以下の表のドメイン配置が挙げられる。
Figure 0006702893
ヒンジ領域は、典型的には、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間のポリペプチド鎖に存在し、且つ／又はＣＫドメインとＣＨ２ドメインとの間に存在し得る。ヒンジ領域は、任意選択により、例えば、適切なリンカーペプチドによって置き換えることができる。
本開示で記載されるタンパク質ドメインは、任意選択により、Ｎ末端からＣ末端であると指定することができる。例示のための開示のタンパク質の配置は、Ｎ末端（左側）からＣ末端へと示されている。ドメインは、互いに融合されていると言える（例えば、ドメインは、その左側のドメインのＣ末端に融合されていると言え、且つ／又はドメインは、その右側のドメインのＮ末端に融合されていると言える）。
本開示に記載されるタンパク質ドメインは、直接又は介在アミノ酸配列を介して互いに融合することができる。例えば、ＣＨ１又はＣＫドメインは、リンカーペプチド、任意選択によりヒンジ領域又はその断片を介してＦｃドメイン（又はそのＣＨ２若しくはＣＨ３ドメイン）に融合される。別の例では、ＶＨ又はＶＫドメインは、リンカーペプチドを介してＣＨ３ドメインに融合される。直列型に互いに連結されたＶＨ及びＶＬドメインは、（例えば、ｓｃＦｖのように）リンカーペプチドを介して融合される。Ｆｃドメインに連結されたＶＨ及びＶＬドメインは、リンカーペプチドを介して融合される。２つのポリペプチド鎖は、好ましくは相補的なＣＨ１及びＣＫドメイン内のシステイン残基間に形成される鎖間ジスルフィド結合によって、互いに結合される（「｜」によって示される）。
本明細書の任意の実施形態では、ＶＫドメインをＶλ可変ドメインによって置換し得ることを理解されたい。
任意のドメイン配置では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２−ＣＨ３単位（完全長ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン又はこれらの断片）を含み得る。Ｆｃドメイン（二量体Ｆｃドメイン）を有する２つの鎖を含むヘテロ二量体又はヘテロ三量体では、ＣＨ３ドメインは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化が可能である（例えば、野生型ＣＨ３ドメイン）。Ｆｃドメイン（単量体Ｆｃドメイン）を有する１つの鎖のみを含むヘテロ二量体又はヘテロ三量体では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化が不可能であり、例えば、ＣＨ３ドメインが、ＣＨ３二量体界面にアミノ酸改変を有するか、又はＦｃドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化が不可能な直列型ＣＨ３ドメインを含む。本明細書の任意の態様の一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、リンカーによって第２のＣＨ３ドメインに接続されている。直列型ＣＨ３ドメインは、以下のように、Ｎ末端からＣ末端にドメイン配置を有することができる：
−ＣＨ３−リンカー−ＣＨ３−。
直列型ＣＨ３ドメインのリンカーは、可撓性リンカー（例えば、ペプチドリンカー）であり得る。一実施形態では、リンカーは、非共有相互作用によるＣＨ３ドメインの互いの結合を可能にする。一実施形態では、リンカーは、１０〜５０のアミノ酸残基を有するペプチドリンカーである。一実施形態では、リンカーは、式（Ｇ４Ｓ）ｘを有する。任意選択により、ｘは、２、３、４、５、又は６である。任意の実施形態では、各ＣＨ３ドメインは、独立に、完全長及び／若しくはナイーブＣＨ３ドメイン、又は機能的なＣＨ３二量体化界面を維持する断片又は改変ＣＨ３ドメインである。
可撓性ペプチドリンカー（下線が引かれている）を有する例示的な直立型ＣＨ３が以下に示されている。従って、例示的な直列型ＣＨ３ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９８％同一の配列を含み得る。
Figure 0006702893
本明細書に開示される直列型ＣＨ３ドメイン、及びＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するためのアミノ酸改変を有するＣＨ３ドメインは、（例えば、野生型完全長ヒトＩｇＧ１抗体と比較して）部分的なＦｃＲｎ結合性を維持する。本明細書で提供される単量体ＣＨ２−ＣＨ３ドメインの例は、部分的なＦｃＲｎ結合性を維持するが、低いヒトＦｃγ受容体結合性を有する。任意選択により、多量体ポリペプチドは、中程度の親和性でヒトＦｃＲｎに結合することができ、例えば、ＦｃＲｎに対する結合は維持するが、完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較してヒトＦｃＲｎ受容体に対して低い結合性を有する。Ｆｃ部分は、例えば、ＣＨ２ドメインに、１つ以上のＦｃγ受容体への結合性をさらに低下させる（例えば、消失させる）１つ以上のアミノ酸改変をさらに含み得る。
単量体Ｆｃドメインを有する多量体ポリペプチドは、有利には、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むことができ、前記ＣＨ３ドメインは、別のＦｃ由来ポリペプチドとの二量体化を防止するための改変されたＣＨ３二量体界面（例えば、ＣＨ３二量体界面の変異）を含む。一実施形態では、ホモ二量体の形成を防止するための改変されたＣＨ３ドメインを含むＣＨ２−ＣＨ３部分は、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１：
Figure 0006702893
 と少なくとも９０％、９５％、又は９８％同一の配列を含み、任意選択により、配列番号１の残基１２１、１３６、１６５、１７５、１７７、又は１７９の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つに置換を含む。
本明細書の任意のポリペプチド又は方法の一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｌ３５１位、Ｔ３６６位、Ｌ３６８位、Ｐ３９５位、Ｆ４０５位、Ｔ４０７位（又はＹ４０７位）、及び／又はＫ４０９位（Ｋａｂａｔと同様のＥＵ付番）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つにアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、可変ドメインをＣＨ２又はＣＨ３に連結するために使用されるペプチドリンカーは、ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域の断片を含む。例えば、ＣＨ１のＮ末端アミノ酸配列は、抗体の天然の構造を可能な限り模倣するために、可変ドメインに融合することができる。一実施形態では、リンカーは、２〜４の残基、２〜４の残基、２〜６の残基、２〜８の残基、２〜１０の残基、２〜１２の残基、２〜１４の残基、２〜１６の残基、２〜１８の残基、２〜２０の残基、２〜２２の残基、２〜２４の残基、２〜２６の残基、２〜２８の残基、又は２〜３０の残基のＮ末端ＣＨ１アミノ酸配列を含み得る。一実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＲＴＶＡを含む、又はアミノ酸配列ＲＴＶＡからなる。
２つの可変領域がｓｃＦｖを形成する場合、これらの可変領域は、ＡＢＤが結合する予定の抗原への結合を可能にするようにＡＢＤを折り畳むことができる十分な長さのリンカーによって互いに連結される。リンカーの例としては、例えば、グリシン及びセリン残基、例えば、アミノ酸配列ＧＥＧＴＳＴＧＳ（Ｇ２Ｓ）２ＧＧＡＤを含むリンカーが挙げられる。別の特定の実施形態では、ｓｖＦｖのＶＨドメイン及びＶＬドメインは、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）３によって互いに連結される。
任意のペプチドリンカーは、少なくとも５残基、少なくとも１０残基、少なくとも１５残基、少なくとも２０基、少なくとも２５残基、少なくとも３０残基以上の長さを含み得る。他の実施形態では、リンカーは、２〜４の残基、２〜４の残基、２〜６の残基、２〜８の残基、２〜１０の残基、２〜１２の残基、２〜１４の残基、２〜１６の残基、２〜１８の残基、２〜２０の残基、２〜２２の残基、２〜２４の残基、２〜２６の残基、２〜２８の残基、又は２〜３０の残基の長さを含む。
定常領域ドメインは、任意の適切な抗体から得ることができる。特に興味深いのは、定常重（ＣＨ）ドメイン及びヒンジドメインを含む重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体との関連では、ＩｇＧアイソタイプは、それぞれ３つのＣＨ領域を有する。従って、ＩｇＧとの関連での「ＣＨ」ドメインは、次の通りである：「ＣＨ１」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスによると１１８〜２２０位を指す。「ＣＨ２」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスによると２３７〜３４０位を指す。「ＣＨ３」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスによると３４１〜４４７位を指す。「ヒンジ」、「ヒンジ領域」、又は「抗体ヒンジ領域」とは、抗体における第１及び第２の定常ドメイン間のアミノ酸を含む可撓性ポリペプチドのことである。構造的に、ＩｇＧ Ｃｈ１ドメインは、ＥＵ２２０位で終端し、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは、ＥＵ２３７位の残基で始まる。従って、ＩｇＧでは、ヒンジは、本明細書では、２２１位（ＩｇＧ１のＤ２２１）〜２３６位（ＩｇＧ１のＧ２３６）を含むように定義され、付番は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従った。ポリペプチド内に見られる定常領域ドメイン内のアミノ酸残基について言及する場合、特段の記載がない限り、又は文脈から他の旨である場合を除き、ＩｇＧ抗体との関連で、Ｋａｂａｔに準拠するものとする。
本抗体に役立ち得るＣＨ３ドメインは、任意の適切な抗体から得ることができる。このようなＣＨ３ドメインは、改変ＣＨ３ドメインの基準として役立ち得る。任意選択により、ＣＨ３ドメインはヒト起源である。
多量体ポリペプチドが単量体Ｆｃドメインを含む本明細書の特定の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ＣＨ３二量体化界面を妨害するために１つ以上のアミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換）を含む。任意選択により、ＣＨ３ドメインの改変は、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインが単量体型である場合に疎水性残基の露出によって引き起こされるタンパク質の凝集を防止する。任意選択により、ＣＨ３ドメインの改変は、Ｆｃ由来ポリペプチドの新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、例えば、ヒトＦｃＲｎに結合する能力をさらに消失させるものではない。
ＣＨ３−ＣＨ３二量体の形成を防止するために使用することができるＣＨ３ドメインは、様々な刊行物に記載されている。例えば、参照によりそれぞれの開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００６／００７４２２５号明細書、国際公開第２００６／０３１９９４号パンフレット、同第２０１１／０６３３４８号パンフレット、及びＹｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７（２３）：１９３９９−１９４０７を参照されたい。ホモ二量体の形成を抑制するために、ＣＨ３−ＣＨ３界面を構成する１つ以上の残基が、相互作用が静電気的に不利になるように荷電アミノ酸で置換される。例えば、国際公開第２０１１／０６３３４８号パンフレットには、界面における正に荷電したアミノ酸、例えば、リジン、アルギニン、又はヒスチジンが、異なるアミノ酸（例えば、負に荷電したアミノ酸、例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）で置換され、且つ／又は界面における負に荷電したアミノ酸が、異なる（例えば、正に荷電した）アミノ酸で置換されることが記載されている。一例としてヒトＩｇＧを使用すると、反対の電荷に荷電することができる界面内の荷電残基は、Ｒ３５５、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｄ３９９、Ｋ４０９、及びＫ４３９を含む。特定の実施形態では、界面内の２つ以上の荷電残基が反対の電荷に荷電される。例示的な分子としては、Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ変異を含む分子、並びにＤ３９９Ｋ及びＤ３５６Ｋ変異を含む分子が挙げられる。単量体型のＦｃドメインの安定性を維持するために、ＣＨ３−ＣＨ３界面を構成する１つ以上の大きい疎水性残基が小さい極性アミノ酸で置換される。一例としてヒトＩｇＧを使用すると、ＣＨ３−ＣＨ３界面の大きい疎水生残基は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｌ３９８、Ｖ３９７、Ｆ４０５、及びＹ４０７を含む。小さい極性アミノ酸残基は、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、及びトレオニンを含む。従って、一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｒ３５５位、Ｄ３５６位、Ｅ３５７位、Ｋ３７０位、Ｋ３９２位、Ｄ３９９位、Ｋ４０９位、及びＫ４３９位の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つでアミノ酸改変（例えば、置換）を含む。国際公開第２０１１／０６３３４８号パンフレットでは、ＣＨ３ドメイン界面に密接して位置する２つの正に荷電したＬｙｓ残基がＡｓｐに変異された。次いで、トレオニンスキャニング突然変異誘発が、これらの２つのＬｙｓからＡｓｐへの変異の背景において構造的に保存された大きい疎水性残基に対して行われた。トレオニンでの様々な置換と共にＫ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ変異を含むＦｃ分子が、単量体形成について分析された。例示的な単量体Ｆｃドメインは、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ、及びＹ３４９Ｔ置換を有する単量体Ｆｃ分子、並びにＫ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ、及びＦ４０５Ｔ置換を有する単量体Ｆｃ分子を含む。
Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７（２３）：１９３９９−１９４０７では、ＣＨ３ドメイン内の残基Ｌ３５１、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｐ３９５、Ｆ４０５、Ｔ４０７、及びＫ４０９でアミノ酸が置換された。異なる変異の組み合わせにより、タンパク質の凝集が起きることなく、ＣＨ３二量体化界面の破壊が起きた。従って、一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｌ３５１位、Ｔ３６６位、Ｌ３６８位、Ｐ３９５位、Ｆ４０５位、Ｔ４０７位、及び／又はＫ４０９位の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つでのアミノ酸改変（例えば、置換）を含む。一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｔ３６６Ｙ、Ｌ３６８Ａ、Ｐ３９５Ｒ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ｍ、及びＫ４０９Ａを含む。一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｓ、Ｔ３６６Ｒ、Ｌ３６８Ｈ、Ｐ３９５Ｋ、Ｆ４０５Ｅ、Ｔ４０７Ｋ、及びＫ４０９Ａを含む。一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙを含む。
ＣＨ２ドメインは、任意の適切な抗体から容易に得ることができる。任意選択により、ＣＨ２ドメインはヒト起源である。ＣＨ２は、ヒンジ又はリンカーアミノ酸配列に（例えば、そのＮ末端で）連結されてもよく、連結されなくてもよい。一実施形態では、ＣＨ２ドメインは、天然に存在するＩｇＧ１、２、４、又は４サブタイプのヒトＣＨ２ドメインである。一実施形態では、ＣＨ２ドメインは、ＣＨ２ドメインの断片（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、又は５０のアミノ酸）である。
一実施形態では、ＣＨ２ドメインは、本明細書に記載のポリペプチドに存在する場合、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、特にヒトＦｃＲｎに対する結合性を維持する。
一実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドに存在する場合のＣＨ２ドメイン、及び本明細書に記載のポリペプチドは、Ｆｃγ受容体、特にＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）に対して結合しにくくするか、又は全く結合しないようにする。ＣＤ１６によって結合されていないＣＨ２ドメインを含むポリペプチドは、目的のエフェクター細胞抗原（例えば、ＮＫｐ４６、ＣＤ３など）を発現しない細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞）によるＡＤＣＣを活性化又は媒介することができない。
一実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド並びにそのＦｃドメイン及び／又はそのＣＨ２ドメインは、低下した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、ＦｃＲ媒介細胞活性化（例えば、ＦｃＲ架橋によるサイトカインの放出）、及び／又は目的の抗原を発現しない免疫細胞（例えば、エフェクター細胞）によって媒介されるＦｃＲ媒介血小板活性化／減少を有するか、又はこれらを実質的に欠いている。
一実施形態では、ポリペプチド内のＣＨ２ドメインは、活性化Ｆｃγ受容体、例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、若しくはＣＤ６４に対する結合性、又は抑制性Ｆｃ受容体、例えば、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）に対する結合性が実質的に消失する。一実施形態では、ポリペプチドのＣＨ２ドメインはさらに、補体（Ｃ１ｑ）の第１の成分に対する結合性が実質的に消失する。
例えば、２３３〜２３６位でのヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ２残基の置換、並びに３２７位、３３０位、及び３３１位でのＩｇＧ４残基の置換は、Ｆｃγ受容体に対する結合性、従ってＡＤＣＣ及びＣＤＣを大幅に低下させることを示した。さらに、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（８）：４１７８−８４は、Ｋ３２２を含む異なる位置でのアラニン置換が補体の活性化を著しく低下させることを実証した。
一実施形態では、Ｆｃγ受容体に対する結合性は維持するが、Ｆｃγ受容体に対する結合性の減少を有するＣＨ２ドメインは、例えば残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵ）でのＮ連結グリコシル化を欠いているか、又は改変されたＮ連結グリコシル化を有する。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドのＦｃ領域に結合するＮアセチルグルコサミンへのフコシルの付加について高い酵素活性を自然に有するか、又はＮ２９７でグリコシル化が起きない細胞株（例えば、細菌宿主細胞）で発現される。別の実施形態では、ポリペプチドは、残基２９７〜２９９での正準Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ Ｎ連結グリコシル化モチーフの欠如を引き起こし、従ってＦｃγ受容体に対する結合性も低下させ得る１つ以上の置換を有し得る。従って、ＣＨ２ドメインは、Ｎ２９７及び／又は隣接残基（例えば、２９８、２９９）に置換を有し得る。
一実施形態では、Ｆｃドメイン又はそのＣＨ２ドメインは、ＦｃｙＲ結合能の低下を示すが、ＦｃＲｎ結合性を維持したＩｇＧ２ Ｆｃ変異に由来する。一態様では、ＩｇＧ２ Ｆｃ変異若しくは誘導多重特異的ポリペプチド、Ｆｃドメイン、又はＣＨ２ドメインは、ＥＵ付番方式による変異Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓを含む。別の態様では、ＩｇＧ２ Ｆｃ変異若しくは誘導多重特異的ポリペプチド又はＦｃドメインは、ＥＵ付番方式による変異Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｈ２６８Ｑ、又はＨ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓを含む。特定の態様では、ＩｇＧ２ Ｆｃ変異若しくは誘導多重特異的ポリペプチド又はＦｃドメインは、ＥＵ付番方式による変異Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、及び任意選択によりＰ２３３Ｓを含む。任意選択により、Ｆｃγ受容体に対する結合性が消失したＣＨ２ドメインは、ＰＡＡＡＰ、ＰＡＡＡＳ、及びＳＡＡＡＳから選択されるｎ個の配列を含む残基２３３、２３４、２３５、２３７、及び２３８（ＥＵ付番方式）を含み得、任意選択により、このような変異を有するＦｃドメインは、変異Ｈ２６８Ａ又はＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓをさらに含み得る（参照によりその開示内容が本明細書に組み入れられる国際公開第２０１１／０６６５０１号パンフレットを参照されたい）。
一実施形態では、Ｆｃγ受容体に対する結合性を消失したＣＨ２ドメインは、任意選択によりさらに他のドメイン（例えば、ヒンジドメイン又はＣＨ３ドメイン）の１つ以上のアミノ酸改変と組み合わせて、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインに少なくとも１つのアミノ酸改変を含む（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は９つ以上のアミノ酸改変を有する）。Ｆｃ改変の任意の組み合わせは、例えば、Ａｒｍｏｕｒ ＫＬ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３−２４；Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０（４）：４８７−４９０；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６；２７７（３０）：２６７３３−２６７４０ ａｎｄ Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６６０４）に開示されている異なる改変の任意の組み合わせで行うことができる。一実施形態では、ヒトＦｃγ受容体に対する低い結合性を有する本発明のポリペプチドは、アミノ酸残基２３７〜３４０（ＥＵ付番）内の野生型ＣＨ２ドメインに対して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は９つ以上のアミノ酸改変を有し）、このようなＣＨ２ドメインを含むポリペプチドは、野生型ＣＨ２ドメインを含む同等のポリペプチドと比較して、目的のヒトＦｃγ受容体に対して低い親和性を有し、任意選択により、変異型ＣＨ２ドメインは、２３３位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２６８位、２９７位、２３８位、２９９位、３０９位、３２７位、３３０位、３３１位（ＥＵ付番）のいずれか１つ以上に置換を含む。
一態様では、単離された多重特異的Ｆ２〜Ｆ１７ヘテロ二量体タンパク質が提供され、この多重特異的ヘテロ二量体タンパク質は、本明細書に開示されるＦ２〜Ｆ１７ポリペプチドの第１のポリペプチド鎖の配列に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％同一である第１のアミノ酸配列；及び本明細書に開示されるそれぞれのＦ２〜Ｆ１７ポリペプチドの第２のポリペプチド鎖の配列に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％同一である第２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖を含む。任意選択により、第１鎖及び第２鎖の可変領域又はＣＤＲのいずれか又は全ては、異なる可変領域で置換され、任意選択により、可変領域は、同一性の計算に考慮される配列から除外される。
一態様では、単離された多重特異的ヘテロ三量体タンパク質が提供され、この多重特異的ヘテロ三量体タンパク質は、本明細書に開示されるＦ１〜Ｆ１７ポリペプチドの第１のポリペプチド鎖の配列に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％同一である第１のアミノ酸配列；本明細書に開示されるそれぞれのＦ２〜Ｆ１７ポリペプチドの第２のポリペプチド鎖の配列に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％同一である第２のアミノ酸配列；及び本明細書に開示されるそれぞれのＦ２〜Ｆ１７ポリペプチドの第３のポリペプチド鎖の配列に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％同一である第３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖を含む。任意選択により、第１及び第２鎖の可変領域又はＣＤＲのいずれか又は全ては、異なる可変領域で置換され、任意選択により、可変領域は、同一性の計算に考慮される配列から除外される。
化合物の使用
一態様では、医薬製剤であって、それを必要としている哺乳動物の処置又は診断用の医薬製剤の製造における本明細書で定義される任意の化合物の使用が提供される。また、薬剤として、又は薬剤中の活性成分若しくは活性物質として上記定義された任意の化合物の使用も提供される。さらなる態様では、経口投与、局所投与、又は注射用の固体又は液体製剤を提供するために、上記定義された化合物を含む医薬組成物を調製する方法が提供される。このような方法又はプロセスは、少なくとも化合物を薬学的に許容され得る担体と混合するステップを含む。
一態様では、特定の効果を与えることによって所定の状態を処置する、予防する、若しくはより一般的には所定の状態に影響を及ぼす、又は本明細書の化合物若しくは本明細書に開示される化合物を含む（医薬）組成物を用いて特定の状態を検出する方法が提供される。
本明細書に記載のポリペプチドを使用して、抗体で処置することができる障害、例えば、癌、固形及び非固形腫瘍、血液悪性腫瘍、感染、例えば、ウイルス感染、及び免疫又は自己免疫疾患を予防又は処置することができる。
一実施形態では、目的の抗原は、以下からなる群から選択されるタイプの癌の悪性細胞の表面で発現される抗原である：膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、頸癌、甲状腺癌、及び扁平上皮癌を含む皮膚癌を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、及びバーケッツリンパ腫を含むリンパ系統の造血腫瘍；急性及び慢性の骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む骨髄系統の造血腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉系起源の腫瘍；神経芽腫及び神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む横紋筋起源の腫瘍；並びに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、濾胞性甲状腺癌、及び奇形癌を含む他の腫瘍、リンパ系統の造血腫瘍、例えば、限定されるものではないが、小細胞及び大脳細胞型を含むＴ細胞障害、例えば、Ｔ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）を含むＴ細胞及びＢ細胞腫瘍；好ましくはＴ細胞型の大顆粒性リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄ Ｔ−ＮＨＬ肝脾臓リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫（多形性及び免疫芽球性亜型）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；未分化（Ｋｉ １＋）大細胞リンパ腫；腸管Ｔ細胞リンパ腫；Ｔリンパ芽球；並びにリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）。
一実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドを使用して、以下からなる群から選択される癌を予防又は処置することができる：膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、頸癌、甲状腺癌、及び扁平上皮癌を含む皮膚癌を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、及びバーケッツリンパ腫を含むリンパ系統の造血腫瘍；急性及び慢性の骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む骨髄系統の造血腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉系起源の腫瘍；神経芽腫及び神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む横紋筋起源の腫瘍；並びに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、濾胞性甲状腺癌、及び奇形癌を含む他の腫瘍。本発明によって処置することができる他の例示的な障害としては、リンパ系統の造血腫瘍、例えば、限定されるものではないが、小細胞及び大脳細胞型を含むＴ細胞障害、例えば、Ｔ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）を含むＴ細胞及びＢ細胞腫瘍；好ましくはＴ細胞型の大顆粒性リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄ Ｔ−ＮＨＬ肝脾臓リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫（多形性及び免疫芽球性亜型）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；未分化（Ｋｉ １＋）大細胞リンパ腫；腸管Ｔ細胞リンパ腫；Ｔリンパ芽球；並びにリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）が挙げられる。
一態様では、処置の方法は、治療有効量の本明細書に記載の多重特異的タンパク質を個人に投与するステップを含む。治療有効量は、疾患又は障害を有する患者に治療効果を有する（又は疾患若しくは障害を有する患者及び患者と実質的に同様の特徴を有する患者の少なくとも相当数でこのような効果を促進する、高める、及び／又は誘導する）任意の量であり得る。
多重特異的ポリペプチドは、キットに含めることができる。このキットは、任意選択により、任意の数のポリペプチド及び／又は他の化合物、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、又はその他の数の多重特異的ポリペプチド及び／又は他の化合物をさらに含み得る。キットの内容についてのこの記載は、全く限定ではないことを理解されたい。例えば、キットは、他のタイプの治療化合物を含み得る。任意選択により、キットは、ポリペプチドの使用についての取扱説明書、例えば、本明細書に記載の方法の詳細も含む。
また、上記定義された化合物を含む医薬組成物も提供される。化合物は、医薬組成物として医薬担体と共に精製された形態で投与することができる。形態は、意図する投与方式及び治療又は診断用途によって決まる。医薬担体は、化合物を患者に送達するのに適した任意の適合性の非毒性物質とすることができる。薬学的に許容され得る担体は、当技術分野で公知であり、例えば、水溶液、例えば、（滅菌）水若しくは生理緩衝食塩水、又は他の溶媒若しくはビヒクル、例えば、グリコール、グリセロール、油、例えば、オリーブ油、又は注射可能な有機エステル、アルコール、脂肪、ワックス、及び不活性固体を含む。薬学的に許容され得る担体は、例えば化合物の吸収を安定させる又は高めるように作用する、生理的に許容され得る化合物をさらに含み得る。このような生理的に許容され得る化合物は、例えば、炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、又はデキストラン、抗酸化物、例えば、アスコルビン酸又はグルタチオン、キレート剤、低分子量タンパク質、又は他の安定剤若しくは賦形剤を含む。当業者であれば、生理的に許容され得る化合物を含む薬学的に許容され得る担体の選択が、例えば、組成物の投与経路によって決まることを理解されよう。薬学的に許容され得るアジュバント、緩衝剤、及び分散剤なども医薬組成物に含まれ得る。
化合物は、非経口投与することができる。非経口投与用の化合物の調製は、滅菌でなければならない。滅菌は、任意選択により凍結乾燥及び再生の前又は後での、滅菌濾過膜に通す濾過によって容易に達成される。化合物の投与の非経口経路は、公知の方法、例えば、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、動脈内経路、若しくは病巣内経路による注射又は注入に従う。化合物は、注入又はボーラス注射によって連続的に投与することができる。静脈注射用の典型的な組成物は、特定のタイプの化合物及びその必要な投与計画に合わせて、任意選択により２０％アルブミン溶液が添加された１００〜５００ｍｌの滅菌０．９％ＮａＣｌ又は５％グルコース及び１ｍｇ〜１０ｇの化合物を含むように構成することができる。非経口投与可能な組成物を調製する方法は、当技術分野で公知である。
実施例１
抗ｈｕＮＫｐ４６抗体の作製
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、組換えヒトＮＫｐ４６細胞外ドメイン組換えＦｃタンパク質で免疫した。マウスは、５０μｇのＮＫｐ４６タンパク質と完全フロイントアジュバントのエマルションの腹腔内投与により最初の免疫を行い、５０μｇのＮＫｐ４６タンパク質と不完全フロイントアジュバントのエマルションの腹腔内投与により２回目の免疫を行い、最後に、１０μｇのＮＫｐ４６タンパク質の静脈投与により追加免疫した。免疫脾細胞を、追加免疫の３日後にＸ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞に融合し、これを、放射線照射脾細胞の存在下で培養した。
一次スクリーニング：増殖しているクローンの上清（Ｓ／Ｎ）を、細胞表面でヒトＮＫｐ４６構築物を発現する細胞株を用いるフローサイトメトリーによって一次スクリーニングで試験した。簡単に述べると、ＦＡＣＳスクリーニングでは、上清中の反応抗体の存在を、ＰＥで標識されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）によって明らかにした。
ＮＫｐ４６に結合する抗体のセレクションを選択し、産生し、及びそれらの可変領域を二重特異的分子との関連でのそれらの活性についてさらに評価した。
実施例２：
エフェクター細胞受容体を標的とする、ＦｃＲｎに結合するがＦｃγＲに結合しない二重特異的抗体形態の同定
この実験の目的は、免疫エフェクター細胞上の受容体及び目的の第２の抗原を標的にするのに有用な新規な二重特異的タンパク質を開発することにあり、この二重特異的タンパク質では、単量体Ｆｃドメインが、２つの抗原結合ドメイン間のポリペプチド上に配置されている。このタンパク質は、２つの抗原に一価で結合し、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する少なくとも部分的な結合を維持するが、ヒトＣＤ１６及び／又は他のヒトＦｃγ受容体には実質的に結合しない。
第１のステップでは、単量体Ｆｃドメインがヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）及びヒトＦｃγ受容体に結合し得るか否かを調べるために、単量体Ｆｃドメインを有する一本鎖タンパク質を一本鎖タンパク質として作製した。
実施例２−１ 抗ＣＤ１９−ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ−ＣＤ３の作製及び結合アッセイ
腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）及びＴ細胞の活性化受容体ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ）をベースとした二重特異的Ｆｃを使用して、新規な単量体二重特異的ポリペプチド形態のＦｃＲｎ結合及びＣＤ１９結合機能を評価した。最終ポリペプチドのドメイン配置が図２に示されており、このドメイン配置は、図６Ａにおいて「Ｆ１」形態とも呼ばれる（ＣＨ２ドメインの星は、本明細書で試験されたポリペプチドには含まれていない任意選択のＮ２９７Ｓ変異を示す）。
二重特異的単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを、腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）及びＴ細胞の活性化受容体ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ）をベースに構築した。ＣＨ３ドメインは、変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙを含んでいた。このポリペプチドは、次のように配置されたドメインを有する：抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−抗ＣＤ３。アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するＣＨ３／ＶＨリンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＣＨ３−ＶＨ接合部に特定のＳａｌｌ制限部位を挿入するために設計した。
ＣＨ３ドメインは、変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙを含んでいた。ＣＨ２ドメインは、野生型ＣＨ２であった。単量体ＣＨ２−ＣＨ３Ｆｃ部分及び抗ＣＤ１９のＤＮＡ及びアミノ酸配列は以下に示されている。
抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖの軽鎖及び重鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配列は以下の通りであった。
抗ＣＤ１９−ＶＫ
Figure 0006702893
 抗ＣＤ１９−ＶＫ
Figure 0006702893
 抗ＣＤ１９−ＶＨ
Figure 0006702893
 抗ＣＤ１９−ＶＨ
Figure 0006702893
単量体ＣＨ２−ＣＨ３Ｆｃ部分及び最終的な二重特異的ポリペプチドのＤＮＡ及びアミノ酸配列は以下の通りであった。
ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ（この構築物中では最後のＫが除去されている）
Figure 0006702893
 ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ＊（＊この構築物中では最後のＫが除去されている）
Figure 0006702893
 抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３完全配列（成熟タンパク質）
Figure 0006702893
組換えタンパク質のクローニング及び産生
コード配列を、直接合成及び／又はＰＣＲによって構築した。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ，＃Ｒ０４５Ａ）を用いて行い、ＰＣＲ産物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎゲル及びＰＣＲ ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，＃７４０６０９．２５０）を用いて１％アガロースゲルから精製した。精製した後、ＰＣＲ産物を定量してから、製造者のプロトコル（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，＃ＳＴ０３４５）に記載されているようにＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ連結反応を行った。プラスミドは、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ９６プラスミドキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，＃７４０６２５．４）を用いてＥＶＯ２００（Ｔｅｃａｎ）で行われたミニプレップ調製後に得た。次いで、ＣＨＯ細胞株のトランスフェクションの前に、プラスミドを配列の確認のために配列決定した。
ＣＨＯ細胞を、フェノールレッド及び６ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘが添加されたＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖した。トランスフェクションの前日に、細胞をカウントし、１７５，０００細胞／ｍｌで播種した。トランスフェクションのために、細胞（２００，０００細胞／トランスフェクション）を、ＡＭＡＸＡ ＳＦ細胞株キット（ＡＭＡＸＡ，＃Ｖ４ＸＣ−２０３２）に記載されているように調製し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ４Ｄ装置でＤＳ１３７プロトコルを用いてヌクレオフェクトした。全てのトランスフェクションは、３００ｎｇの検証済みプラスミドを用いて行った。トランスフェクション後、細胞を、２４ウェルプレートの予熱された培養培地に播種する。２４時間後、ハイグロマイシンＢを、培養培地に添加した（２００μｇ／ｍｌ）。タンパク質の発現を、１週間後に培地で監視する。次いで、タンパク質を発現している細胞をサブクローニングして最高の産生株を得る。９６平底ウェルプレートを用いて、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢが添加された２００μｌの培養培地に１細胞／ウェルで細胞を播種して、サブクローニングを行った。クローンの生産性を試験する前に、細胞を３週間放置した。
ＩｇＧ１−Ｆｃ断片を含む組換えタンパク質を、プロテインＡビーズ（−ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ｒｅｆ．：１７−１２７９−０３）を用いて精製する。簡単に述べると、細胞培養上清を濃縮し、遠心分離によって清澄化し、プロテインＡカラムに注入し、組換えＦｃ含有タンパク質を捕捉した。タンパク質を酸性ｐＨ（クエン酸０．１Ｍ ｐＨ３）で溶出し、ＴＲＩＳ−ＨＣＬ ｐＨ８．５を用いて即座に中和し、１×ＰＢＳで透析した。「ｓｉｘ ｈｉｓ」タグを含む組換えｓｃＦｖを、コバルト樹脂を用いてアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。他の組換えｓｃＦｖを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。
実施例２−２：抗ＣＤ１９−ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ−抗ＣＤ３〜Ｂ２２１、ＪＵＲＫＡＴ、ＨＵＴ７８、及びＣＨＯ細胞株の結合分析
細胞を回収して、抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３産生細胞の細胞上清で、４℃で１時間染色した。染色緩衝液（ＰＢＳ １Ｘ／ＢＳＡ ０．２％／ＥＤＴＡ ２ｍＭ）で２回洗浄した後、細胞を、ヤギ抗ヒト（Ｆｃ）−ＰＥ抗体（ＩＭ０５５０ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ−１／２００）で、４℃で３０分間染色した。２回の洗浄後、染色物をＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで得て、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。
ＣＤ３及びＣＤ１９の発現もフローサイトメトリーによって制御した。細胞を回収して、５μｌの抗ＣＤ３−ＡＰＣ及び５μｌの抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ抗体を用いて、ＰＢＳ １Ｘ／ＢＳＡ ０．２％／ＥＤＴＡ ２ｍＭ緩衝液で、４℃で３０分間染色した。２回の洗浄後、染色物をＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで得て、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。
抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３タンパク質は、ＣＤ３細胞株（ＨＵＴ７８及びＪＵＲＫＡＴ細胞株）及びＣＤ１９細胞株（Ｂ２２１細胞株）に結合するが、陰性対照として使用されるＣＨＯ細胞株には結合しない。
実施例２−３：
精製抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３によるＴ細胞及びＢ細胞の凝集
精製抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３をＴ／Ｂ細胞凝集アッセイで試験して、抗体が、ＣＤ１９及びＣＤ３発現細胞の凝集において機能するか否かを評価した。
結果が図４に示されている。上のパネルは、抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３は、Ｂ２２１（ＣＤ１９）又はＪＵＲＫＡＴ（ＣＤ３）細胞株の存在下で凝集を引き起こさないが、Ｂ２２１及びＪＵＲＫＡＴ細胞の両方が同時にインキュベートされるときに細胞を凝集させることを示し、二重特異的抗体が機能的であることを例示する。下のパネルは、抗体を含まない対照を示す。
実施例２−４：
二重特異的単量体ＦｃポリペプチドのＦｃＲｎに対する結合性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による親和性試験
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００の一般的な手順及び試薬
ＳＰＲ測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、２５℃で行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、酢酸緩衝液（５０ｍＭ酢酸 ｐＨ５．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％界面活性剤ｐ２０）及びＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）がそれぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。組換えマウスＦｃＲｎをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
ＦｃＲｎの固定化
組換えＦｃＲｎタンパク質を、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面を、ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。ＦｃＲｎタンパク質を、結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（即ち、２５００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、１００ｍＭエタノールアミン ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
親和性試験
一価親和性試験を、Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｙｃｌｅ Ｋｉｎｅｔｉｃ（ＳＣＫ）プロトコルに従って行った。５段階希釈の４１．５〜６６０ｎＭの可溶性分析物（抗体及び二重特異的分子）を（再生なしで）ＦｃＲｎに添加し、再生の１０分前に解離させた。各分析物について、全てのセンサーグラムを、１：１ＳＣＫ結合モデルを用いてフィッティングした。
結果
そのＣＨ２−ＣＨ３ドメインが２つの抗原結合ドメイン（ここでは２つのｓｃＦｖ）間に配置された抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３を評価して、このような二重特異的単量体Ｆｃタンパク質が、ＦｃＲｎに対する結合性を維持することができ、それにより、従来の二重特異的抗体と比較して改善されたｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有するか否かを決定した。結果は、ＦｃＲＮ結合性が維持されたことを示し、このモデルは、正常なＩｇＧに対して、２：１の比率（各抗体に対して２つのＦｃＲｎ）ではなく１：１の比率（各単量体Ｆｃに対して１つのＦｃＲｎ）を示唆している。結果は図５に示されている。
親和性を、ヒトＩｇＧ１定常領域を有するキメラ完全長抗体に対してＳＰＲを用いて評価した。結果が表５に示されている。単量体Ｆｃは、ＦｃＲｎに対して著しい単量体結合性を維持した（単量体Ｆｃ：ＫＤ＝１９４ｎＭの親和性；二価結合性を有する完全長抗体：ＫＤ＝１５．４ｎＭの親和性）。
実施例３：
多量体二重特異的単量体ポリペプチドの作製
この実験の目的は、開発中の現在利用可能な二重特異的抗体、例えば、ＤＡＲＴ及びＢＩＴＥ抗体よりも生産上の利点を有する新規な二重特異的形態を開発することにあった。
最初の二重特異的タンパク質を、ＮＫ細胞上の活性化受容体ＮＫｐ４６に結合する抗ＮＫｐ４６であるように選択された、免疫エフェクター細胞の表面に存在する受容体に結合する結合ドメイン、及びリンパ腫腫瘍抗原に結合する抗ＣＤ１９であるように選択された抗標的抗原結合ドメインと共に、Ｆｃドメインをポリペプチドに配置するように設計した。この二重特異的タンパク質は、ＮＫｐ４６に一価で結合し、単量体Ｆｃドメインは、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する少なくとも部分的な結合を維持するが、ヒトＣＤ１６及び／又は他のヒトＦｃγ受容体には実質的に結合しない。結果として、この二重特異的タンパク質は、Ｆｃγ媒介（例えば、ＣＤ１６媒介）標的細胞溶解を誘導しない。
ＮＫ細上の活性化受容体が標的細胞の溶解に寄与し得るかは不明であり、抗ＮＫｐ４６抗体がＮＫｐ４６をブロックし得るため、細胞毒性がＮＫｐ４６のトリガーによって媒介することができたか否かは不明であった。本発明者らは、二重特異的タンパク質形態が、ＮＫｐ４６のトリガーを引き起こすことができたか否か、さらに標的細胞の非存在下でＮＫｐ４６アゴニズムを誘導することなく、標的から離れた不適切なＮＫ活性化及び／又は標的細胞に対する全活性の低下をもたらすことができたか否かを調べた。
２つ又は３つのポリペプチド鎖を含み、Ｆｃドメインが単量体を維持している多量体タンパク質を開発し、この多量体タンパク質は、ｓｃＦｖ形態に変換されたときにそれらの標的に対する結合を維持しない抗体可変領域と共に使用するのに適合している。この形態は、抗体のスクリーニングに便利に使用することができ、少なくとも１つの結合領域をＦ（ａｂ）構造として含めることにより、任意の抗標的（例えば、抗腫瘍）抗体可変領域を、抗体がｓｃＦｖとして結合性を維持するか否かにかかわらず、二重特異的タンパク質内のＦ（ａｂ）形態として二重特異的構築物で直接発現させて試験することができ、それにより、利用可能な抗体を単純にスクリーニングしてその数を増加させることができる。Ｆｃドメインが単量体を維持するこれらの形態は、標的抗原、例えば、エフェクター細胞受容体及び／又は標的抗原の両方に対する最適な結合を可能にし得る最大の配座柔軟性を維持するという利点を有する。
異なる構築物を、実施例２−１に記載の腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖからの可変ドメインＤＮＡ及びアミノ酸配列、及び実施例１に示されたＮＫｐ４６受容体に特異的な抗体からの異なる可変領域を用いて、二重特異的抗体の調製に使用するために作製した。
Ｆｃドメインが、一本鎖ポリペプチドで、又は１つの鎖のみがＦｃドメインを有する多量体で単量体を維持するために、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化が、２つの異なる戦略：（１）変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙを含むＣＨ３ドメインの使用によって、又は（２）直列型ＣＨ３ドメインが互いに結合された可撓性リンカーによって分離され、それにより、鎖間ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止する直列型ＣＨ３ドメインの使用によって防止された。点変異を有する単量体ＣＨ２−ＣＨ３Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、実施例２−１と同様であった。直列型ＣＨ３ドメインを有する単量体ＣＨ２−ＣＨ３−リンカーＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、図６Ａ〜図６Ｄに示されている。
抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖの軽鎖及び重鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配列は、実施例２−１と同様であった。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。以下に、抗ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖ ＮＫｐ４６４６−３の例示的な軽鎖及び重鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配列が示される。
Figure 0006702893
形態１（Ｆ１）（抗ＣＤ１９−ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ−抗ＮＫｐ４６（ｓｃＦｖ））
形態１（Ｆ１）のドメイン構造が図６Ａに示されている。二重特異的Ｆｃ含有ポリペプチドを、腫瘍抗原ＣＤ１９（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）に特異的なｓｃＦｖ及びＮＫｐ４６受容体に特異的なｓｃＦｖをベースに構築した。このポリペプチドは、以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する一本鎖ポリペプチドである。
（ＶＫ−ＶＨ）抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−（ＶＨ−ＶＫ）抗ＮＫｐ４６
アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するＣＨ３／ＶＨリンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＣＨ３−ＶＨ接合部に特定のＳａｌｌ制限部位を挿入するために設計した。図２には、最終ポリペプチドのドメイン配置が示されている（ＣＨ２ドメインの星は、任意選択のＮ２９７Ｓ変異を示す）。（ＶＫ−ＶＨ）単位は、ＶＨドメインとＶＫドメインとの間にリンカーを含む。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。
形態２（Ｆ２）：ＣＤ１９−Ｆ２−ＮＫｐ４６−３
Ｆ２ポリペプチドのドメイン構造が図６Ａに示されている。単量体ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、実施例２−１と同様であり、ＣＨ３ドメイン変異（変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙ）を含む。ヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
（ＶＫ−ＶＨ）抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ
（ＶＫ−ＶＨ）単位は、ＶＨドメイン、リンカー、及びＶＫ単位（即ち、ｓｃＦｖ）から構成されていた。二重特異的ポリペプチドの他の形態と同様に、アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するＣＨ３／ＶＨリンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＣＨ３−ＶＨ接合部に特定のＳａｌｌ制限部位を挿入するために設計した。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。ＣＤ１９−Ｆ２−ＮＫｐ４６−３のポリペプチド鎖１のアミノ酸配列は、配列番号１１に示され、ＣＤ１９−Ｆ２−ＮＫｐ４６−３のポリペプチド鎖２のアミノ酸配列は、配列番号１２に示されている。
形態８（Ｆ８）
Ｆ８ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｂに示されている。単量体ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、ＣＨ３ドメイン変異（変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙ、並びにＮ連結グリコシル化を防止してＦｃγＲ結合性を消失させるためのＮ２９７Ｓ変異）を含む形態Ｆ２と同様であった。Ｆ８タンパク質の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである（野生型、Ｆ８Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換されている（Ｆ８Ｂ）、及び（ｃ）リンカー配列ＧＧＧＳＳがヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換している（Ｆ８Ｃ）。変異型Ｆ８Ｂ及びＦ８Ｃは、中心鎖のホモ二量体の形成を防止することによって作製に利点を提供した。ヘテロ三量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＣＤ１９−ＣＫ
タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、３．７ｍｇ／Ｌ（Ｆ８Ｃ）の高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。Ｆ８「Ｃ」変異体の３つのＦ８タンパク質鎖のアミノ酸配列は、配列番号１３、１４、及び１５に示されている。
形態９（Ｆ９）：ＣＤ１９−Ｆ９−ＮＫｐ４６−３
Ｆ９ポリペプチドは、中心ポリペプチド鎖、及びそれぞれＣＨ１−ＣＫの二量体化によって中心鎖に結合された２つのポリペプチド鎖を有する三量体ポリペプチドである。三量体Ｆ９タンパク質のドメイン構造が図６Ｂに示されており、ＣＨ１とＣＫドメインとの間の結合は、鎖間ジスルフィド結合である。２つの抗原結合ドメインは、抗体がｓｃＦｖ形態で機能を支持するか否かにかかわらず、この抗体の使用を可能にするＦ（ａｂ）構造を有する。ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、同じポリペプチド鎖状の２つのＣＨ３ドメインが互いに結合した直列型ＣＨ３ドメインを含み、それにより、異なる二重特異的タンパク質間の二量体化が防止された。ＣＨ２ドメインは、Ｎ２９７Ｓ置換を含んでいた。Ｆ９タンパク質の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである（野生型、Ｆ９Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換されている（Ｆ９Ｂ）、及び（ｃ）リンカー配列ＧＧＧＳＳがヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換している（Ｆ９Ｃ）。変異型Ｆ９Ｂ及びＦ９Ｃは、中心鎖のホモ二量体の形成を防止することによって作製に利点を提供した。このヘテロ三量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＣＤ１９−ＣＫ
タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、８．７ｍｇ／Ｌ（Ｆ９Ａ）及び３．０ｍｇ／Ｌ（Ｆ９Ｂ）の高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。変異体Ｆ９Ａ、Ｆ９Ｂ、及びＦ９Ｃそれぞれの３つのＦ９タンパク質鎖のアミノ酸配列は、以下の表に列記された配列番号に示されている。
Figure 0006702893
形態１０（Ｆ１０）：ＣＤ１９−Ｆ９−ＮＫｐ４６−３
Ｆ１０ポリペプチドは、中心ポリペプチド鎖、及びＣＨ１−ＣＫの二量体化によって中心鎖に結合された第２のポリペプチド鎖を有する二量体タンパク質である。二量体Ｆ１０タンパク質のドメイン構造が図６Ｂに示され、ＣＨ１とＣＫドメインとの間の結合は、鎖間ジスルフィド結合である。２つの抗原結合ドメインの一方はＦａｂ構造を有し、且つ他方はｓｃＦｖである。ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、形態Ｆ９と同様の直列型ＣＨ３ドメイン及びＮ２９７Ｓ置換を有するＣＨ２ドメインを含んでいた。加えて、Ｆ１０タンパク質の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである（野生型、Ｆ１０Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換されている（Ｆ１０Ｂ）、及び（ｃ）リンカー配列ＧＧＧＳＳがヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換している（Ｆ１０Ｃ）。変異型Ｆ１０Ｂ及びＦ１０Ｃは、中心鎖のホモ二量体の形成を防止することによって作製に利点を提供した。（ＶＫ−ＶＨ）単位は、ＶＨドメイン、リンカー、及びＶＫ単位（ｓｃＦｖ）から構成されていた。ヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−（ＶＨ−ＶＫ）抗ＮＫｐ４６、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＣＤ１９−ＣＫ。
タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、２ｍｇ／Ｌ（Ｆ１０Ａ）の良好な産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。変異体Ｆ１０Ａ、Ｆ１０Ｂ、及びＦ１０Ｃそれぞれの３つのＦ９タンパク質鎖のアミノ酸配列は、以下の表に列記された配列番号に示されている。
Figure 0006702893
形態１１（Ｆ１１）：ＣＤ１９−Ｆ１１−ＮＫｐ４６−３
Ｆ１１ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｃに示されている。このヘテロ二量体タンパク質は、Ｆ１０に類似しているが、抗原結合ドメインの構造が逆である。２つの抗原結合ドメインの一方は、Ｆａｂ様構造を有し、他方はｓｃＦｖである。このヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
（ＶＫ−ＶＨ）抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１
タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、２ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。Ｆ１１タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号３１及び３２に示されている。
形態１２（Ｆ１２）：ＣＤ１９−Ｆ１２−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｆ１２ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｃに示されており、ＣＨ１とＣＫドメインとの間の結合は、ジスルフィド結合である。このヘテロ二量体タンパク質は、Ｆ１１に類似しているが、Ｆ（ａｂ）構造内のＣＨ１とＣＫドメインが逆である。このヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
（ＶＫ−ＶＨ）抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ
タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、２．８ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。Ｆ１２タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号３３及び３４に示されている。
形態１７（Ｆ１７）：ＣＤ１９−Ｆ１７−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ１７ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｃに示されており、ＣＨとＣＫドメインとの間の結合はジスルフィド結合である。ヘテロ二量体タンパク質は、Ｆ９と同様であるが、ＶＨ及びＶＫドメイン、並びにＣ末端Ｆ（ａｂ）構造内のＣＨ１及びＣＫドメインは、それぞれ、それらのパートナーと逆である。このヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＣＤ１９−ＣＫ
加えて、Ｆ１７タンパク質の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである（野生型、Ｆ１７Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換されえいる（Ｆ１０Ｂ）、及び（ｃ）リンカー配列ＧＧＧＳＳがヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換している（Ｆ１７Ｃ）。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。Ｆ１７Ｂタンパク質鎖の３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号３５、３６、及び３７に示されている。
実施例４：
二量体Ｆｃドメインを有する二重特異的ＮＫｐ４６抗体形態
二量体Ｆｃドメインを有する新規なタンパク質構築物を開発し、このタンパク質構築物は、実施例３の単量体Ｆｃドメインタンパク質の利点を共有するが、高い親和性でＦｃＲｎに結合し、さらにＦｃγＲに対して低い結合性を有するか、又は結合性が消失している。このポリペプチド形態を、ＶＨ−（ＣＨ１又はＣＫ）−ＣＨ２−ＣＨ３−を含む鎖及びＶＫ−（ＣＨ１又はＣＫ）−ＣＨ２−ＣＨ３−を含む鎖を含むヘテロ二量体タンパク質の機能を調べるために試験した。次いで、ＣＨ３ドメインの一方又は両方は、任意選択により介在アミノ酸配列若しくはドメインを介して、可変ドメイン（分離されたポリペプチド鎖上の可変ドメインに結合する単一可変ドメイン）、直列型可変ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）、又は単一可変ドメインとして抗原に結合することができる単一可変ドメインに融合される。次いで、２つの鎖が、ＣＨ１−ＣＫ二量体化によって結合してジスルフィド結合二量体を形成するか、又は第３鎖と結合して三量体を形成する。
様々な構築物を、二重特異的抗体の調製に使用するために、実施例２−１に記載の腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖに由来する可変ドメインＤＮＡ及びアミノ酸配列及び実施例１で明らかにされたＮＫｐ４６に特異的な抗体からの異なる可変領域を用いて作製した。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。ドメイン構造は、図６Ａ〜図６Ｄに示されている。
形態５（Ｆ５）：ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ５ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｄに示されており、ヒンジドメイン間の鎖間結合及びＣＨ１とＣＫドメインとの間の鎖間結合は鎖間ジスルフィド結合である。ヘテロ三量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ抗ＮＫｐ４６−ＣＫ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＣＤ１９−ＣＫ−ＣＨ２−ＣＨ３、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１
タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、３７ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号３８、３９、及び４０に示されている。
形態６（Ｆ６）：ＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３
ヘテロ三量体Ｆ６ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｄに示されている。Ｆ６タンパク質は、Ｆ５と同じであるが、Ｎ連結グリコシル化を防止するためのＮ２９７Ｓ置換を有する。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、１２ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。Ｆ６タンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号４１、４２、及び４３に示されている。
形態７（Ｆ７）：ＣＤ１９−Ｆ７−ＮＫｐ４６−３
ヘテロ三量体Ｆ７ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｄに示されている。Ｆ７タンパク質は、Ｆ６と同じであるが、中心鎖とＶＫ抗ＮＫｐ４６−ＣＨ１鎖との二量体種の少数集団の形成を防止するために、それらのＣ末端でＦｃドメインに連結されたＣＨ１及びＣＫドメインにシステインのセリンでの置換を有する。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、１１ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。７６タンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号４４、４５、及び４６に示されている。
形態１３（Ｆ１３）：ＣＤ１９−Ｆ１３−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｆ１３ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｄに示されており、ヒンジドメイン間の鎖間結合（鎖上のＣＨ１／ＣＫとＣＨ２ドメイン間に示されている）及びＣＨ１とＣＫドメインとの間の鎖間結合は、鎖間ジスルフィド結合である。このヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
ＶＨ抗ＣＤ１９−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−（ＶＨ−ＶＫ）抗ＮＫｐ４６、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ抗ＣＤ１９−ＣＫ−ＣＨ２−ＣＨ３
（ＶＨ−ＶＫ）単位は、ＶＨドメイン、リンカー、及びＶＫ単位（ｓｃＦｖ）から構成されていた。
タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、６．４ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。Ｆ１３タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号４７及び４８に示されている。
形態１４（Ｆ１４）：ＣＤ１９−Ｆ１４−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｆ１４ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｅに示されている。Ｆ１４ポリペプチドは、Ｆ１３形態の構造を共有する二量体ポリペプチドであるが、野生型Ｆｃドメイン（ＣＨ２−ＣＨ３）の代わりに、Ｆ１４は、Ｎ連結グリコシル化をなくすためにＣＨ２ドメイン変異Ｎ２９７Ｓを有する。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、２．４ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。Ｆ１４タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号４９及び５０に示されている。
形態１５（Ｆ１５）：ＣＤ１９−Ｆ１５−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ１５ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｅに示されている。Ｆ１５ポリペプチドは、Ｆ６形態の構造を共有するが、中心鎖と第２鎖との間のＮ末端ＶＨ−ＣＨ１単位とＶＫ−ＣＫ単位とが逆であるため、異なっている三量体ポリペプチドである。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、０．９ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。Ｆ１５タンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号５１、５２、及び５３に示されている。
形態１６（Ｆ１６）：ＣＤ１９−Ｆ１６−ＮＫｐ４６−３）
三量体Ｆ１６ポリペプチドのドメイン構造が図６Ｅに示されている。Ｆ１６ポリペプチドは、Ｆ６形態の構造を共有するが、中心鎖と第２鎖との間のＣ末端ＶＨ−ＣＫ単位とＶＫ−ＣＨ１単位とが逆であるため、異なっている三量体ポリペプチドである。タンパク質を、実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。Ｆ１６タンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号５４、５５、及び５６に示されている。
実施例５：
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、二重特異的タンパク質によるＮＫｐ４６結合親和性
Ｂａｃｏｒｅ Ｔ１００の一般的な手順及び試薬
ＳＰＲ測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、２５℃で行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、ＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＮａＯＨ １０ｍＭは、それぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。プロテインＡを（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から購入した。ヒトＮＫｐ４６組換えタンパク質を、クローニングし、産生し、且つＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａで精製した。
プロテインＡの固定化
プロテインＡタンパク質を、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面を、ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。プロテインＡを、結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（即ち、２５００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、１００ｍＭエタノールアミン ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
結合試験
抗体を、異なる形態Ｆ５、Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１３、Ｆ１４として試験し、一本鎖形態（Ｆ１）、及び完全長ヒトＩｇＧ１のような抗ＮＫｐ４６抗体と比較した。
二重特異的タンパク質を１μｇ／ｍＬで、プロテインＡチップ上で捕捉し、組換えヒトＮＫｐ４６タンパク質を、５μｇ／ｍＬで、捕捉した二重特異的抗体に注入した。ブランク差し引きのために、サイクルを再び行って、ＮＫｐ４６タンパク質を泳動用緩衝液に替えた。
親和性試験
一価親和性試験を、製造者（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｗｉｚａｒｄ）が推奨する正規のＣａｐｔｕｒｅ−Ｋｉｎｅｔｉｃプロトコルに従って行った。６．２５〜４００ｎＭの範囲のヒトＮＫｐ４６組換えタンパク質の７段階希釈物を、捕捉した二重特異的抗体に連続的に注入し、再生の１０分前に解離させた。全てのセンサーグラムのセットを、１：１動態結合モデルを用いてフィッティングした。
結果
ＳＰＲは、形態Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１３、Ｆ１４の二重特異的ポリペプチドがＮＫｐ４６に対する結合性を維持したことを示した。
一価親和性並びに動力学的結合及び解離速度定数が、以下の表３に示されている。
Figure 0006702893
実施例６：
Ｄａｕｄｉ腫瘍標的に対するＮＫ細胞とＦｃ含有ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質との結合
単量体Ｆｃドメイン及び実施例３に記載の一本鎖Ｆ１又は二量体Ｆ２形態に従って配置されたドメイン、及び様々な抗ＮＫｐ４６可変ドメイン（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４）をベースとするＮＫｐ４６結合領域を有する二重特異的抗体を、ＮＫ細胞にＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞（Ｂリンパ芽球細胞株によって十分に特徴付けられるＤａｕｄｉ）を溶解させる機能的能力について試験した。Ｆ２タンパク質は、ｓｃＦｖ形態ではＮＫｐ４６に対する結合性を失うが、Ｆ２のＦ（ａｂ）様形態では結合性を維持するＮＫｐ４６−９の可変領域をさらに含んでいた。
簡単に述べると、（ａ）静止ヒトＮＫ細胞、及び（ｂ）ヒトＮＫｐ４６でトランスフェクトされたヒトＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１のそれぞれの細胞溶解活性を、Ｕ底９６ウェルプレートで、典型的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。Ｄａｕｄｉ細胞を５１Ｃｒ（５０μＣｉ（１．８５ＭＢｑ）／１×１０６細胞）で標識し、次いで、異なる濃度の単量体二重特異的抗体の存在下で、ＫＨＹＧ−１では５０、静止ＮＫ細胞では（Ｆ１タンパク質に対して）１０又は（Ｆ２タンパク質に対して）８．８に等しいエフェクター／標的比で、ｈＮＫ４６でトランスフェクトされたＫＨＹＧ−１と混合した。短時間の遠心分離及び３７℃で４時間のインキュベーション後、上清のサンプルを取り出して、ＬｕｍａＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に移し、５１Ｃｒの放出をＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ ベータ検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。全ての実験条件を３連で分析し、特異的溶解のパーセンテージを以下のように決定した：１００×（平均ｃｐｍ実験放出−平均ｃｐｍ自然放出）／（平均ｃｐｍ総放出−平均ｃｐｍ自然放出）。総放出のパーセンテージは、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）での標的細胞の溶解によって得られ、自然放出は、培地（エフェクターもＡｂｓも含まない）中の標的細胞に一致する。
結果
ＫＨＹＧ−１ ｈＮＫｐ４６ ＮＫ実験モデルでは、各二重特異的抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９が、陰性対照（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）及びＣＤ１９／ＣＤ３二重特異的抗体）と比較して、ヒトＫＨＹＧ−１ ｈＮＫｐ４６ ＮＫ細胞株によるＤａｕｄｉ細胞の特異的溶解を誘導し、それにより、これらの抗体が、ＣＤ１９／ＮＫｐ４６架橋によってＫＨＹＧ−１ ｈＮＫｐ４６によるＤａｕｄｉ標的細胞の溶解を誘導することが示された。
静止ＮＫ細胞をエフェクターとして使用したときに、各二重特異的抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９が同様に、陰性対照（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）抗体）と比較して、ヒトＮＫ細胞によるＤａｕｄｉ細胞の特異的溶解を誘導し、それにより、これらの抗体が、ＣＤ１９／ＮＫｐ４６架橋によってヒトＮＫ細胞によるＤａｕｄｉ標的細胞の溶解を誘導することが示された。リツキシマブ（ＲＴＸ、キメラＩｇＧ１）を、静止ヒトＮＫ細胞によるＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）の陽性対照として使用した。ＲＴＸ（このアッセイでは１０μｇ／ｍｌで）で得られた最大応答は、２１．６％の特異的溶解であり、二重特異的抗体が高い標的細胞溶解活性を有することを例証した。静止ＮＫ細胞での実験の結果は、一本鎖Ｆ１タンパク質については図７Ａに示され、二量体Ｆｃタンパク質については図７Ｂに示されている。
実施例７：
完全長抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂと枯渇抗腫瘍ｍＡｂとの比較：ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質が非特異的ＮＫ活性化を防止する
これらの試験は、二重特異的抗体が、非特異的ＮＫ細胞の活性化を引き起こすことなく、癌標的細胞に対するＮＫｐ４６媒介ＮＫ活性化を媒介できるか否かを調べることを目的とした。
ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３に記載のＦ２形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質を、以下と比較した：
（ａ）完全長単一特異的抗ＮＫｐ４６抗体（ヒトＩｇＧ１のようなＮＫｐ４６−３）、及び
（ｂ）ＡＤＣＣ誘導抗体対照比較（ＡＤＣＣ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）としての完全長ヒトＩｇＧ１のような抗ＣＤ１９抗体。
実験は、対照として以下をさらに含んでいた：リツキシマブ、高い発現レベルを有する標的抗原の抗ＣＤ２０ ＡＤＣＣ誘導抗体対照；抗ＣＤ５２抗体アレムツヅマブ、標的細胞及びＮＫ細胞の両方に存在するＣＤ５２標的に結合するヒトＩｇＧ１；並びに陰性対照アイソタイプ対照治療抗体（標的細胞（ＨＵＧ１−ＩＣ）に存在する標的に結合しないヒトＩｇＧ１）。
様々なタンパク質を、ＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）の存在下、ＣＤ１９陰性ＣＤ１６陽性標的細胞（ＨＵＴ７８ Ｔリンパ腫細胞）の存在下、且つ標的細胞の非存在下でのＮＫ細胞の活性化に対する機能的な影響について試験した。
簡単に述べると、ＮＫ活性化を、フローサイトメトリーによって、ＮＫ細胞でのＣＤ６９及びＣＤ１０７の発現を評価することによって試験した。アッセイは、完全ＲＰＭＩ、１５０μＬ最終／ウェルで、９６Ｕウェルプレートで行った。エフェクター細胞は、ドナーから精製した新鮮なＮＫ細胞とした。標的細胞は、Ｄａｕｄｉ（ＣＤ１９−陽性）、ＨＵＴ７８（ＣＤ１９−陰性）、又はＫ５６２（ＮＫ活性化対照細胞株）とした。Ｋ５６２陽性対照に加えて、以下の３つの条件を試験した。
＞ＮＫ細胞のみ
＞ＮＫ細胞対Ｄａｕｄｉ（Ｃ１９＋）
＞ＮＫ細胞対ＨＵＴ７８（ＣＤ１９−）
エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比は、２．５：１（５０，０００Ｅ：２０，０００Ｔ）とし、抗体の希釈範囲は、１／４希釈で１０μｇ／ｍＬから始めた（ｎ＝８の濃度）。抗体、標的細胞、及びエフェクター細胞を混合し、３００ｇで１分間回転させ、３７℃で４時間インキュベートし、５００ｇで３分間回転させ、染色緩衝液（ＳＢ）で２回洗浄し、５０μＬの染色Ａｂミックスを加え、３００ｇで３０分間インキュベートし、ＣｅｌｌＦｉｘを含むＳＢ再懸濁ペレットで２回洗浄し、４℃で一晩保存し、Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＨＴＳ）で蛍光を明らかにした。
結果
１．ＮＫ細胞のみ
結果は図８Ａに示されている。標的抗原発現細胞の非存在下で、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の可変領域のそれぞれを含む）はいずれも、ＣＤ６９又はＣＤ１０７の発現による評価によるとＮＫ細胞を活性化しなかった。完全長抗ＣＤ１９もＮＫ細胞を活性化しなかった。しかしながら、完全長抗ＮＫｐ４６抗体は、ＮＫ細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アレムツヅマブも非常に高いレベルでＮＫ細胞の活性化を誘導した。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
２．ＮＫ細胞対Ｄａｕｄｉ（ＣＤ１９＋）
結果は図８Ｂに示されている。標的抗原発現細胞の存在下で、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の結合ドメインのそれぞれを含む）は全て、ＮＫ細胞を活性化した。完全長抗ＣＤ１９は、最良でも非常に低いＮＫ細胞の活性化のみを示した。完全長抗ＮＫｐ４６抗体もアレムツヅマブも、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された活性化を超えた活性化の実質的な増加を示さなかった。図８Ｂは、完全長抗ＮＫｐ４６抗体が、ＮＫ細胞のみの存在下で観察されたベースライン活性化と同様のレベルを示すことを示す。アレムツヅマブも、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された活性と同様のレベルのＮＫ細胞の活性化を誘導し、この設定のより高い抗体濃度（ＥＴ ２．５：１）では、活性化は、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体を用いたときよりも高かった。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
３．ＮＫ細胞対ＨＵＴ７８（ＣＤ１９−）
結果は図８Ｃに示されている。標的抗原陰性ＨＵＴ７８細胞の存在下で、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の可変領域のそれぞれを含む）は全て、ＮＫ細胞を活性化した。しかしながら、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及びアレムツヅマブは、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された同様のレベルでＮＫ細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
結論として、二重特異的抗ＮＫｐ４６タンパク質は、完全長単一特異的抗ＮＫｐ４６抗体、及び標的細胞の非存在下で同様にＮＫ細胞を活性化する枯渇ＩｇＧアイソタイプの完全長抗体とは異なり、標的細胞特異的にＮＫ細胞を活性化することができる。抗ＮＫｐ４６二重特異的タンパク質で達成されるＮＫ細胞の活性化は、完全長抗ＣＤ１９ ＩｇＧ１抗体で観察される活性化よりも高かった。
実施例８：
低いＥＴ比での枯渇抗腫瘍ｍＡｂ：ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質の効果の比較
これらの試験は、二重特異的抗体が、低いエフェクター：標的比で、癌標的細胞に対するＮＫｐ４６媒介ＮＫ細胞活性化を媒介できるか否かを調べることを目的とした。この実施例に使用されるＥＴ比は、実施例７で使用された２．５：１のＥＴ比又は実施例６の１０：１のＥＴ比よりもｉｎ ｖｉｖｏで遭遇するであろう設定に近いと考えられる１：１とした。
ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３に記載のＦ２形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質を、以下と比較した：
（ａ）完全長単一特異的抗ＮＫｐ４６抗体（ヒトＩｇＧ１のようなＮＫｐ４６−３）、及び
（ｂ）ＡＤＣＣ誘導抗体対照比較としての完全長ヒトＩｇＧ１のような抗ＣＤ１９抗体。
実験は、対象として以下をさらに含んでいた：リツキシマブ（高い発現レベルを有する標的抗原の抗ＣＤ２０ ＡＤＣＣ誘導抗体対照）；抗ＣＤ５２抗体アレムツヅマブ（標的細胞及びＮＫ細胞の両方に存在するＣＤ５２標的に結合するヒトＩｇＧ１）、並びに陰性対照アイソタイプ対照治療抗体（標的細胞（ＨＵＧ１−ＩＣ）に存在する標的に結合しないヒトＩｇＧ１）。様々なタンパク質を、ＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）の存在下、ＣＤ１９陰性ＣＤ１６陽性標的細胞（ＨＵＴ７８ Ｔリンパ腫細胞）の存在下、且つ標的細胞の非存在下でのＣＤ６９又はＣＤ１０７の発現により評価される、ＮＫ細胞活性化に対する機能的な影響について試験した。これらの実験は、ＥＴ比を１：１としたことを除いて実施例７と同様に行った。
結果
結果は図９に示されている（上のパネル：ＣＤ１０７及び下のパネル：ＣＤ６９）。標的抗原発現細胞の存在下では、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の可変領域のそれぞれを含む）は全て、Ｄａｕｄｉ細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化した。
Ｄａｕｄｉ細胞の存在下で二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体によって誘導される活性化は、この設定で低い活性を有するＡＤＣＣ誘導抗体のような完全長ヒトＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体よりも遥かに強力であった。さらに、この低いＥ：Ｔ比の設定では、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体によって誘導される活性化は、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブと同程度に強力であり、差異は、差異が２．５：１のＥＴ比で観察された濃度よりも１０倍高い最高濃度でのみ観察された。
標的細胞の非存在下又は標的抗原陰性ＨＵＴ７８細胞の存在下では、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及びアレムツヅマブは、Ｄａｕｄｉ細胞の存在下で観察されたベースライン活性化と同様のレベルを示した。抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体は、ＨＵＴ７８細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化しなかった。
結論として、二重特異的タンパク質は、標的細胞特異的にＮＫ細胞を活性化することができ、より低いエフェクター：標的比は、ＮＫ細胞の活性化の媒介において従来のヒトＩｇＧ１抗体よりも有効である。
実施例９：
動作機序の試験
ＮＫｐ４６−３からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３又は４に記載のＦ２、Ｆ３（一本鎖形態）、Ｆ５、又はＦ６形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９二重特異的抗体を、ＣＤ１６−／ＮＫｐ４６＋ＮＫ細胞株にＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞を溶解させる機能的能力について、リツキシマブ（抗ＣＤ２０ ＡＤＣＣ誘導抗体）、及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較した。
簡単に述べると、ＣＤ１６−／ＮＫｐ４６＋ヒトＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１の細胞溶解活性を、Ｕ底９６ウェルプレートで、典型的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。Ｄａｕｄｉ細胞又はＢ２２１細胞を５１Ｃｒ（５０μＣｉ（１．８５ＭＢｑ）／１×１０６細胞）で標識し、次いで、１／５希釈（ｎ＝８の濃度）で１０−７ｍｏｌ／ｍＬから始まる希釈範囲の試験抗体の存在下、５０：１に等しいエフェクター／標的比でＫＨＹＧ−１と混合した。
短時間の遠心分離及び３７℃で４時間のインキュベーション後、５０μＬの上清を取り出して、ＬｕｍａＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に移し、５１Ｃｒの放出をＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴベータ検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。全ての実験条件を３連で分析し、特異的溶解のパーセンテージを以下のように決定した：１００×（平均ｃｐｍ実験放出−平均ｃｐｍ自然放出）／（平均ｃｐｍ総放出−平均ｃｐｍ自然放出）。総放出のパーセンテージは、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）での標的細胞の溶解によって得られ、自然放出は、培地（エフェクターもＡｂｓも含まない）中の標的細胞に一致する。
結果
結果は、図１０Ａ（ＫＨＹＧ−１対Ｄａｕｄｉ）及び図１０Ｂ（ＫＨＹＧ−１対Ｂ２２１）に示されている。ＫＨＹＧ−１ ｈＮＫｐ４６ ＮＫ実験モデルでは、各ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質（形態Ｆ２、Ｆ３、Ｆ５、及びＦ６）は、ヒトＫＨＹＧ−１ ｈＮＫｐ４６ ＮＫ細胞株によるＤａｕｄｉ細胞又はＢ２２１細胞の特異的溶解を誘導したが、リツキシマブ及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）抗体は誘導しなかった。
実施例１０：
様々な二重特異的形態のＦｃＲｎに対する結合性
様々な抗体形態のヒトＦｃＲＮに対する親和性を、実施例２〜５に記載されているように、組換えＦｃＲｎタンパク質をＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定化することによって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって試験した。
ヒトＩｇＧ１定常領域を有するキメラ完全長抗ＣＤ１９抗体、及びＮＫｐ４６−３（Ｆ２ではＮＫｐ４６−２）からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３又は４に記載のＦ５、Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１３、又はＦ１４形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質をそれぞれの分析物について試験し、全てのセンサーグラムを、定常状態又は１：１のＳＣＫ結合モデルを用いてフィッティングした。
結果は以下の表に示されている。二量体Ｆｃドメイン（形態Ｆ５、Ｆ６、Ｆ１３、Ｆ１４）を有する二重特異的タンパク質は、完全長ＩｇＧ１抗体の親和性と同様の親和性でＦｃＲｎに結合した。単量体Ｆｃドメイン（Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１）を有する二重特異的タンパク質もＦｃＲｎに対する結合性を示したが、二量体Ｆｃドメインを有する二重特異的タンパク質よりも低い結合性であった。
Figure 0006702893
実施例１１：
抗ＣＤ１９ｘ抗ＮＫｐ４６のＦｃγＲに対する結合性
ここでは２つのｓｃＦｖである２つの抗原結合ドメイン間に配置されたそのＣＨ２−ＣＨ３ドメインを有する抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＮＫｐ４６を、このような二重特異的単量体Ｆｃタンパク質が、Ｆｃγ受容体に対する結合性を維持できるか否かを決定するために評価した。
ヒトＩｇＧ１抗体及びＣＤ１９／ＮＫｐ４６−１二重特異的抗体をＣＭ５チップに固定した。組換えＦｃγＲ（カニクイザル及びヒトＣＤ６４、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、及びＣＤ１６）をクローニングし、産生し、且つＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａで精製した。図１１は、固定化ヒトＩｇＧ１対照（灰色）及びＣＤ１９／ＮＫｐ４６−１二重特異的抗体（黒色）に対するカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）組換えＦｃｇＲ（上のパネル；ＣｙＣＤ６４、ＣｙＣＤ３２ａ、ＣＹＣＤ３２ｂ、ＣｙＣＤ１６）及びヒト組換えＦｃｇＲ（下のパネル；ＨｕＣＤ６４、ＨｕＣＤ３２ａ、ＨｕＣＤ３２ｂ、ＨｕＣＤ１６ａ）の結合性を示す重畳センサーグラムを示す。センサーグラムは、サンプルの注入開始時にｙ軸及びｘ軸で０に合わせた。
図１１は、完全長野生型ヒトＩｇＧ１が全てのカニクイザル及びヒトＦｃγ受容体に結合したが、ＣＤ１９／ＮＫｐ４６−１二重特異的抗体がいずれの受容体にも結合しなかったことを示す。
実施例１２：
既存の形態と比較して改善された様々な二重特異的形態の産生プロフィール及び産生収率
ブリナツモマブ、並びにＦ１〜Ｆ７形態及びＮＫｐ４６−３をベースとするＮＫｐ４６及びＣＤ１９結合領域を有する２つの二重特異的抗体、並びにブリナツモマブをそれぞれ同じプロトコルに従って、同じ発現系を用いて形態６（Ｆ６）、ＤＡＲＴ形態、及びＢＩＴＥ形態の下でクローニングし、産生した。Ｆ６、ＤＡＲＴ、及びＢＩＴＥ二重特異的タンパク質を、Ｆ６にはｐｒｏｔ−Ａビーズを用い、ＤＡＲＴ及びＢＩＴＥにはＮＩ−ＮＴＡビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。精製されたタンパク質をさらに分析し、且つＳＥＣによって精製した（図１２Ａ）。ＢＩＴＥ及びＤＡＲＴは、Ｆ６と比較して非常に低い産生収率を示し、非常に複雑なＳＥＣプロフィールを有していた。図１２Ｂ（矢印）に示されているように、ＤＡＲＴ及びＢＩＴＥは、予想ＳＥＣ画分（ＢＩＴＥでは３及び４、ＤＡＲＴでは４及び５）でのクマーシー染色後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによってわずかに検出可能であり、Ｆ６形態は、単量体二重特異的タンパク質を含む主ピーク（画分３）を有する、明確で単純なＳＥＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを示した。Ｆ６形態の主ピークは、全タンパク質の約３０％に一致する。これらの観察は、Ｆ１〜Ｆ１７タンパク質にも当てはまり（データは不図示）、これらの形態中に存在するＦｃドメイン（又はＦｃ由来ドメイン）が産生を促進し、二重特異的タンパク質の質及び溶解性を改善することを示唆している。
さらに、タンパク質Ｆ１〜Ｆ１７中に存在するＦｃドメインは、例えば、プロテインＡによって精製することができないＢｉＴｅ及びＤＡＲＴ抗体の場合、治療製品の不所望の部分として後に残存するペプチドタグの組み込みを必要とすることなく、アフィニティークロマトグラフィーに適応しているという利点を有する。Ｆ１〜Ｆ１７抗体は全て、プロテインＡに結合される。以下の表は、様々な形態の産生性を示す。
Figure 0006702893
表題及び副題は、本明細書では便宜のためにのみ使用され、本発明を限定すると決して一切解釈するべきではない。上述の要素の全ての可能なバリエーションでのあらゆる組み合わせが、本明細書に特段の記載がない限り、又は文脈から他の旨である場合を除き、本発明に包含される。本明細書で述べられた値の範囲は、本明細書に特段の記載がない限り、範囲内に含まれるそれぞれの別個の値について個々に述べられる省略方法の役割を単に果たすものであり、それぞれの別個の値は、本明細書で個々に述べられたかのように本明細書に包含される。特段の記載がない限り、本明細書に記載される全ての正確な値は、対応するおおよその値を代表する（例えば、特定の因子又は測定値に関して記載される全ての正確な例示的な値は、適切な場合は「約」によって変更される、対応するおおよその測定値を示すものと見なすことができる）。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に特段の記載がない限り、又は文脈から他の旨である場合を除き、任意の適切な順序で行うことができる。
本明細書に記載されるあらゆる例又は例示的な語（例えば、「〜など」）の使用は、単に本発明をより明確にするためのものであり、特段の記載がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。明確な記載がない限り、いずれの要素も本発明の実施に不可欠であることを示すと解釈される語は本明細書には存在しない。
語、例えば、１つ又は複数の要素を指す語を用いた、本発明の任意の態様又は実施形態の本明細書の説明は、特段の記載がない限り、又は文脈から明確に他の旨である場合を除き、その１つ又は複数の特定の要素「からなる」、「から実質的になる」、又は「を実質的に含む」本発明の同様の態様又は実施形態を支援するためである（例えば、特定の要素を含むとして本明細書に記載される組成物は、特段の記載がない限り、又は文脈から明確に他の旨である場合を除き、その要素からなる組成物の記載でもあることを理解されたい）。
本発明は、適用される法律によって許容される最大程度まで、本明細書に記載される態様又は請求項で述べられる主題の全ての変更形態及び均等物を含む。
本明細書で述べられる全ての刊行物及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物又は特許出願が、参照により含められると具体的且つ個別に示されたかのように、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられる。
前述の発明は、理解を明確にするために例示及び例によってある程度詳細に説明されたが、当業者であれば、添付の特許請求の趣旨又は範囲から逸脱することなく、特定の変形形態及び変更形態をなし得ることが本発明の教示から明白であろう。

Claims (28)

  1. 目的の第１及び第２の抗原に一価で結合する単離されたヘテロ三量体タンパク質であって、
    （ａ）第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメイン、第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域に融合された第２の可変ドメイン、及び前記第１の可変ドメインと前記第２の可変ドメインとの間に配置されたＦｃドメインを含む第１のポリペプチド鎖、及び
    （ｂ）第２のポリペプチド鎖であって、前記第１のポリペプチド鎖と前記第２のポリペプチド鎖とがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、前記第１のポリペプチド鎖の前記第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域に相補的であるように選択されたＣＨ１又はＣＫ定常領域にそのＣ末端で融合された第１の可変ドメインを含み、前記第１のポリペプチド鎖の前記第１の可変ドメインと前記第２のポリペプチド鎖の前記第１の可変ドメインとが、前記目的の第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する、第２のポリペプチド鎖；および
    （ｃ）第３のポリペプチド鎖であって、ＣＨ１又はＣＫ定常領域にそのＣ末端で融合された可変ドメインを含み、前記可変ドメイン及び前記定常領域が、前記第１のポリペプチド鎖の前記第２の可変ドメイン及び前記第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域と相補的であるように選択され、それにより、前記第１のポリペプチド鎖と前記第３のポリペプチド鎖とが、前記第３のポリペプチド鎖の前記ＣＨ１又はＣＫ定常領域と前記第１のポリペプチド鎖の前記第１のＣＨ１又はＣＫ定常領域との間ではなく、前記第３のポリペプチド鎖の前記ＣＨ１又はＣＫ定常領域と前記第１のポリペプチド鎖の前記第２のＣＨ１又はＣＫ定常領域との間に形成されたジスルフィド結合によって結合されたＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成する、第３のポリペプチド鎖
    を含み、前記第１のポリペプチド鎖と、前記第２のポリペプチド鎖と、前記第３のポリペプチド鎖とが、ＣＨ１−ＣＫヘテロ三量体を形成し、前記第１のポリペプチド鎖の前記第１の可変ドメインと前記第２のポリペプチド鎖の前記可変ドメインとが、目的の第１の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成し、及び前記第１のポリペプチド鎖の前記第２の可変ドメインと前記第３のポリペプチド鎖の前記可変ドメインとが、目的の第２の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する、単離されたヘテロ三量体タンパク質。
  2. 前記Ｆｃドメインが、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合することができ、且つ完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃγ受容体に対して低い結合性を有する、請求項１に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  3. 前記第１のポリペプチド鎖と前記第２のポリペプチド鎖とがＣＨ１−ＣＫヘテロ二量体を形成するように、前記第１のポリペプチド鎖が、そのＣ末端でＣＨ１に融合された第１の可変ドメインを含み、及び前記第２のポリペプチド鎖が、そのＣ末端でＣＫ定常領域に融合された第１の可変ドメインを含む、請求項１又は２に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  4. 前記第１のポリペプチド鎖と前記第２のポリペプチド鎖とがＣＫ−ＣＨ１ヘテロ二量体を形成するように、前記第１のポリペプチド鎖が、そのＣ末端でＣＫに融合された第１の可変ドメインを含み、及び前記第２のポリペプチド鎖が、そのＣ末端でＣＨ１定常領域に融合された第１の可変ドメインを含む、請求項１又は２に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  5. 前記第１のポリペプチド鎖の前記第１の可変ドメイン及び前記第２のポリペプチド鎖の前記第１の可変ドメインが、前記第１の抗原に特異的に結合する同じ第１の親抗体に由来し、及び前記第１のポリペプチド鎖の前記第２の可変ドメインが、前記第２の抗原に特異的に結合する第２の親抗体に由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  6. 前記目的の第１及び第２の抗原の一方が、エフェクター細胞、任意選択によりＮＫ細胞によって発現される活性化受容体であり、及び他方が癌抗原、ウイルス抗原、又は細菌抗原である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  7. 前記癌抗原、ウイルス抗原、又は細菌抗原を発現する細胞の存在下で、前記活性化受容体を発現するＮＫ細胞と共にインキュベートされたときに、前記ＮＫ細胞を活性化させる、請求項６に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  8. 前記癌抗原、ウイルス抗原、又は細菌抗原を発現する細胞の非存在下で、前記活性化受容体を発現するＮＫ細胞と共にインキュベートされたときに、前記ＮＫ細胞を活性化しない、請求項６または７に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  9. 前記癌抗原、ウイルス抗原、又は細菌抗原を発現する細胞の存在下で、前記活性化受容体を発現しないＣＤ１６陽性ＮＫ細胞と共にインキュベートされたときに、前記ＮＫ細胞を活性化しない、請求項６〜８のいずれか一項に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  10. （ａ）標的細胞の存在下で、前記活性化受容体を発現するＮＫ細胞と共にインキュベートされたときにＮＫ細胞を活性化させ、且つ（ｂ）標的細胞の非存在下で、前記ＮＫ細胞と共にインキュベートされたときに前記ＮＫ細胞を活性化しない、請求項６に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  11. Ｆｃγ発現細胞の存在下で、前記活性化受容体を発現するＮＫ細胞及び標的細胞と共にインキュベートされたときに、前記ＮＫ細胞を活性化しない、請求項６〜１０のいずれか一項に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  12. 単量体Ｆｃドメインを有する三量体であり、ドメイン配置：
    Figure 0006702893
     を有し、ここで、前記Ｆｃドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するためのアミノ酸変異を有するＣＨ３ドメインを含み、それぞれのＶ−Ｖ対形成が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間で起こり、及びそれぞれの定常領域の対形成がＣＨ１とＣＫとの間で起こる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  13. ドメイン配置：
    Figure 0006702893
     を有し、ここで、前記Ｆｃドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するためのアミノ酸変異を有するＣＨ３ドメインを含み、それぞれのＶ−Ｖ対形成が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間で起こり、及びそれぞれの定常領域の対形成がＣＨ１とＣＫとの間で起こる、請求項１２に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  14. 二量体Ｆｃドメインを有する三量体であり、ドメイン配置：
    Figure 0006702893
     を有し、ここで、それぞれのＶ−Ｖ対形成が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間で起こり、及びそれぞれの定常領域の対形成がＣＨ１とＣＫとの間で起こる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  15. ドメイン配置：
    Figure 0006702893
     を有する、請求項１４に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  16. ドメイン配置：
    Figure 0006702893
     を有する、請求項１４に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  17. Ｆｃドメインが、ヒンジ領域又はリンカーペプチドを介して抗原結合ドメイン、ＣＨ１ドメイン、及び／又はＣＫドメインに融合されている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  18. 完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒトＦｃγ受容体に対して低い結合性を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  19. ヒトＦｃγ受容体に対する結合性を実質的に欠いている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  20. 各抗原結合ドメインが、抗体の超可変領域、任意選択により重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  21. 前記Ｆｃドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化が可能であるＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  22. 前記Ｆｃドメインが、ヒトＦｃγ受容体に対する結合性を低下させるためのアミノ酸置換を含むヒトＣＨ２ドメインを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  23. 前記Ｆｃドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止するためのアミノ酸変異を有するＣＨ３ドメインを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  24. 前記Ｆｃドメインが、リンカーペプチドによって分離された第１及び第２のＣＨ３ドメインを含み、前記２つのＣＨ３ドメインが、非共有相互作用を介して互いに結合している、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  25. 可変ドメインが、ヒトフレームワーク領域からのフレームワーク残基を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のヘテロ三量体タンパク質。
  26. 請求項１〜２５のいずれか一項に記載のヘテロ三量体タンパク質及び薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
  27. 前記疾患が癌又は感染疾患である、請求項２６に記載の医薬組成物。
  28. ヘテロ三量体タンパク質を産生する方法であって、
    （ａ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載の第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸を用意するステップ、
    （ｂ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載の第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸を用意するステップ、
    （ｃ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載の第３のポリペプチド鎖を含む第３の核酸を用意するステップ、及び
    （ｄ）それぞれ前記第１、第２、及び第３の核酸を宿主細胞で発現させて、前記第１、第２、及び第３のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生し、産生された前記タンパク質を親和性精製支持体、任意選択によりプロテインＡ支持体にローディングし、且つヘテロ三量体タンパク質を回収するステップ
    を含む、方法。
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