JP2021502360A - 二重特異的融合ポリペプチド及びその使用方法 - Google Patents

二重特異的融合ポリペプチド及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

二重特異的融合タンパク質及び癌を治療するためにその二重特異的融合タンパク質を使用する方法が本明細書に提供される。

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年１１月２日に作成され、ＩＯＢＳ−１１０−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、１０５，７４５バイトのサイズである。
癌は、依然として主な世界的な健康的負担である。２０１６年、米国のみにおいて、１５０万超の新たな症例が診断され、５００，０００人を超える人々がこの疾患により死亡することが推定された（（非特許文献１）参照）。世界的には、ほぼ６人の死亡者に１人が、癌に起因し得ることが推定される（（非特許文献２）参照）。
癌及び他の疾患の撲滅のための方針の開発において過去十年にわたり顕著な進展がなされたにもかかわらず、進行性、難治性及び転移性疾患を有する患者は、限定された臨床選択を有する。化学療法、放射線療法、及び高用量化学療法は、用量制限的になる（多くの症例において、顕著に有害な副作用があるにもかかわらず、患者寿命をわずかに延ばすにすぎない）。したがって、進行性及び／又は治療抵抗性癌を有する患者のための新たな有効な抗癌療法の満たされていない医学的要求が依存として存在する。さらに、より低毒性のより標的化される抗癌療法の要求も存在する。
新たな非毒性抗癌療法の潜在的な資源は、患者自身の免疫系である。腫瘍制御における免疫系、特にＴ細胞媒介細胞傷害の役割は、十分認識されている。Ｔ細胞が、癌患者において疾患の早期及び後期の両方で腫瘍成長及び生存を制御し得るという証拠は増加している。しかしながら、腫瘍特異的Ｔ細胞応答は、癌患者において取り入れ、持続するのが困難である。
腫瘍特異的Ｔ細胞応答に影響し得るＴ細胞シグナリング経路の例は、シグナリングタンパク質、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ１又はＣＤ２７４としても公知）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０、及びＣＤ１３７（４−１ＢＢ）を含む。
ＣＤ４０Ｌは、主に活性化Ｔ細胞（例として、Ｔｈ０、Ｔｈ１、及びＴｈ２サブタイプ）上で発現される腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリー分子のメンバーであり、このファミリーの他のメンバーと同様にホモ三量体を形成する。さらに、ＣＤ４０Ｌは、肥満細胞、並びに活性化好塩基球及び好酸球上で発現されることも見出されている。ＣＤ４０Ｌは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のその受容体ＣＤ４０に結合し、標的細胞タイプに応じて多くの効果をもたらす。一般に、ＣＤ４０Ｌは共刺激分子の役割を担い、ＡＰＣ上のＭＨＣ分子によるＴ細胞受容体刺激に伴うＡＰＣ中での活性化を誘導する。
ＣＤ４０Ｌによる受容体ＣＤ４０を介するシグナリングは、ＣＤ４０担持細胞の活性化及び最適なＴ細胞プライミングをもたらすイベントのカスケードをイニシエートする。より具体的には、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０シグナリングは、抗体分泌細胞及び記憶Ｂ細胞へのＢ細胞の分化を促進する（（非特許文献３））。さらに、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０シグナリングは、ナチュラルキラー細胞を介する抗腫瘍免疫応答及び腫瘍抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の刺激を促進するマクロファージ及び樹状細胞の活性化を介して細胞媒介免疫を促進する（Ｂｕｒｋｌｙ、前掲参照）。
ＰＤ−Ｌ１も、Ｔ細胞活性化の制御に関与する受容体及びリガンドの複合体系の一部である。正常組織において、ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、間葉系幹細胞、骨髄由来肥満細胞、及び種々の非造血細胞上で発現される。その正常機能は、その２つの受容体：プログラム細胞死１（ＰＤ−１又はＣＤ２７９としても公知）及びＣＤ８０（Ｂ７−１又はＢ７．１としても公知）との相互作用を介してＴ細胞活性化と寛容との間の平衡を調節することである。ＰＤ−Ｌ１はまた広範な癌において高頻度で発現され、腫瘍が宿主免疫系による検知及び排除を回避するのに役立つように複数部位において作用する。一部の癌において、ＰＤ−Ｌ１の発現は、生存率の低減及び不都合な予後に関連している。ＰＤ−Ｌ１とその受容体（例えば、ＰＤ−１）との間の相互作用を遮断する抗体は、ＰＤ−Ｌ１依存性免疫抑制効果を緩和し、インビトロ及びインビボでの抗腫瘍Ｔ細胞の細胞傷害性活性を向上させ得る。
ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８、ＡＩＴＲ又はＣＤ３５７としても公知）は、制御性Ｔ細胞上で発現され、抗原経験ＣＤ４＋ヘルパー細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞並びに活性化ナチュラルキラー細胞上で上方調節される（（非特許文献４）；（非特許文献５））。ＧＩＴＲは、抗原曝露によるＴ細胞活性化の制御に関与する受容体及びリガンドの複合体系の一部である。ＧＩＴＲは、緩い三量体の形態で存在し、ＧＩＴＲをクラスター化し、Ｔ細胞内で強力な細胞シグナリングイベントをもたらし得る１つの公知の内因性リガンド、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）を有する（（非特許文献６））。ＧＩＴＲ及びＧＩＴＲＬ間の相互作用は、正の共刺激シグナルをＴ細胞に送達し、それは抗原曝露によるそれらの増殖及び活性化を向上させ、記憶細胞生成を促進するのに役立ち、制御性Ｔ細胞をそれらの抑制機能を低減させるように再プログラム化する（（非特許文献７）；（非特許文献８））。
ＯＸ４０（ＣＤ１３４；ＴＮＦＲＳＦ４）は、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及びナチュラルキラー細胞上で最初に見出された別のＴＮＦ受容体である（（非特許文献９））。ＯＸ４０は、三量体形態で存在し、ＯＸ４０をクラスター化し、Ｔ細胞内で強力な細胞シグナリングイベントをもたらし得る１つの公知の内因性リガンド、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ；ＣＤ１５２；ＴＮＦＳＦ４）を有する（（非特許文献９））。活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞上のＯＸ４０を介するシグナリングは、向上したサイトカイン産生、グランザイム及びパーフォリン放出、並びにエフェクター細胞及び記憶Ｔ細胞プールの拡張をもたらす（（非特許文献１０））。さらに、Ｔｒｅｇ細胞上のＯＸ４０シグナリングは、Ｔｒｅｇの拡張を阻害し、Ｔｒｅｇの誘導を停止させ、Ｔｒｅｇ抑制機能を遮断する（（非特許文献１１）；（非特許文献１２））。
免疫組織化学的研究及び早期のフローサイトメトリー分析は、ＯＸ４０が、広範なヒト癌に浸潤するＴ細胞上で発現されることを示した（（非特許文献１３）；（非特許文献１４）；（非特許文献１５）；（非特許文献１６）；（非特許文献１７）；（非特許文献１８）；（非特許文献１９））。腫瘍浸潤リンパ球上のＯＸ４０発現は、いくつかのヒト癌においてより長期の生存と相関し、ＯＸ４０シグナルが抗腫瘍免疫応答の確立において重要な役割を担い得ることを示唆する（（非特許文献１５）；（非特許文献１６））。
ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、例えば、ＧＩＴＲは、活性化Ｔ細胞及びＮＫ細胞上で発現される共刺激チェックポイント分子である。ＣＤ１３７Ｌ（ＣＤ１３７リガンド）は、抗原提示細胞により発現され、複数の癌タイプにおいて免疫系が腫瘍を排除するのを可能とすることと関連している。ＣＤ１３７は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞よりもＣＤ８＋上で高レベルにおいて発現され、それは主にＣＤ８＋ Ｔ細胞を共刺激する。ＣＤ１３７の架橋は、Ｔ細胞の増殖、ＩＦＮ−γ分泌及び細胞溶解活性を強力に向上させる。さらに、ＣＤ１３７アゴニスト、例えば、抗体は、癌ワクチン及び免疫チェックポイント阻害剤と相乗的に機能して抗癌免疫応答をブーストすることが報告されている（（非特許文献２２））。
上記Ｔ細胞シグナリング経路（及びその他）は、それぞれ、腫瘍特異的Ｔ細胞応答の制御において役割を担う。しかしながら、所望のＴ細胞媒介抗腫瘍応答の誘導及び維持に関する異なるＴ細胞シグナリング経路の相対的な重要性は、依然として解明すべきである。実際、異なるＴ細胞シグナリング経路間の相互作用は、癌の治療に関して相乗効果をもたらし得る。したがって、Ｔ細胞シグナリング経路の改善された制御を介してＴ細胞媒介細胞傷害を最大化し得る新規薬剤の当技術分野の要求が存在する。このような薬剤は、より低毒性でより標的化される抗癌療法を提供し得る。
Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｎｃｅｒ Ｆａｃｔ Ｓｈｅｅｔ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１７，Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｒｋｌｙ，Ｉｎ Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．，Ｖｏｌ．４８９．，Ｄ．Ｍ．Ｍｏｎｒｏｅ，Ｕ．Ｈｅｄｎｅｒ，Ｍ．Ｒ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｃ．Ｎｅｇｒｉｅｒ，Ｇ．Ｆ．Ｓａｖｉｄｇｅ，ａｎｄ Ｇ．Ｃ．Ｉ．Ｗｈｉｔｅ，ｅｄｓ．Ｋｌｏｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００１，ｐ．１３５ Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００４）１７３（８）：５００８−５０２０ Ｃｌｏｔｈｉｅｒ ａｎｄ Ｗａｔｔｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．（２０１４） Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０４（４９）：１９４５２−１９４５７ Ｃｌｏｔｈｉｅｒ ａｎｄ Ｗａｔｔｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．（２０１４）Ｊａｎ ４ Ｓｃｈａｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２） Ｃｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２２９：１７３−９１ Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．３７：５２４−３２ Ｖｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９１：３６４１−５０ Ｖｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｌｏｏｄ．１１０：２５０１−１０ Ｂａｒｕａｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ２１７：６６８−６７５ Ｃｕｒｔｉ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７３：７１８９−９８ Ｌａｄａｎｙｉ ｅｔ ａｌ，２００４，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５２１−３０ Ｐｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ，２００２，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１８３：５１２−８ Ｒａｍｓｔａｄ ｅｔ ａｌ，２０００，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１７９：４００−６ Ｓａｒｆｆ ｅｔ ａｌ，２００８，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１９５：６２１−５；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ６２５ Ｖｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１７４：２５８−６５ Ｄｈａｒｍａｄｈｉｋａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（４）：ｅ１１１３３６７
本明細書において、二重特異的融合タンパク質及びＴ細胞媒介細胞傷害を制御するためのその使用方法が提供される。
一態様において、本明細書の開示は、二重特異的融合タンパク質であって、第１の細胞表面標的に特異的な第１の結合領域、Ｆｃ単量体、及び第２の細胞表面標的に特異的な第２の結合領域を含む単鎖融合タンパク質を含み、第１の結合領域及び第２の結合領域は、ペプチドリンカーを介してＦｃ単量体に共有結合しており、第１の細胞表面標的及び第２の細胞表面標的に同時に結合し得る二重特異的融合タンパク質を提供する。
ある態様において、第１の結合領域及び第２の結合領域の少なくとも１つは、Ｆａｂ断片又は受容体リガンドである。
さらなる態様において、Ｆａｂ断片は、抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１ Ｆａｂ断片である。
追加の態様において、１つ以上のリガンドサブユニットの少なくとも１つは、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−α、ＣＤ１３７Ｌ又はＣＤ４０Ｌである。
別の態様において、本明細書の開示は、癌を治療する方法であって、癌の治療が必要とされる患者を、本明細書に開示の二重特異的融合タンパク質により治療することを含む方法を提供する。
本開示のこれらの及び他の特徴部及び利点は、添付の図面と一緒に本開示の以下の詳細な説明からより十分に理解される。特許請求の範囲は、その引用により定義され、本詳細な説明に記載の特徴部及び利点の具体的な考察によっては定義されないことが留意される。
第１の結合ドメイン（ＢＤ１）、第２の結合ドメイン（ＢＤ２）、及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む、企図される二重特異的融合タンパク質（ＢＦＰ）の模式的表示。ＢＤ２は、Ｆｃ領域のヒンジ領域部分を介してＦｃ領域に付着させることができる。ＢＤ１は、ペプチドリンカーを介してＦｃ領域に付着させることができる。同様に、ＢＤ１部分のサブユニット（ここでは、３つのサブユニットを用いて示すが、より少ない又は多い場合も企図される）は、ペプチドリンカーを介して接続させることができる。 単一特異的及び二重特異的タンパク質を含む、企図される融合タンパク質の様々な構造。１つの単一特異的融合タンパク質は、ＭＥＤＩ５０８３であり、それは、ＩｇＧ抗体と類似するＢＤ１＿Ｆｃ領域フォーマットを有し、二量体化単鎖融合タンパク質として産生され、ＢＤ１＝２×ＣＤ４０Ｌ三量体であり、ＣＤ４０Ｌサブユニットはペプチドリンカーにより連結しており、Ｆｃは、単一ＩｇＧ４ Ｆｃ領域（ＣＨ２及びＣＨ３））である。ＭＥＤＩ５０８３は、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、ＢＤ１＝抗ＰＤ−Ｌ１ Ｆ（ａｂ）２；Ｆｃ＝ＩｇＧ１ ＴＭ（ヒトＩｇＧ１中のＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓを有する「三重突然変異」）と構造的に同等である。対照的に、二重特異的融合タンパク質フォーマットの２つの反復型（ＢＦＰ２及びＢＦＰ３）が存在する。ＢＦＰ２は、示される反復型において２０３ｋＤａのサイズであり、ＢＤ１＿Ｆｃ＿ＢＤ２フォーマット（Ｎ→Ｃ）を有し、ＢＤ１は、２×ＣＤ４０Ｌ三量体であり、Ｆｃは、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、ＢＤ２は、２×抗ＰＤ−Ｌ１ ｓｃＦｖである。ＢＦＰ３は、示される反復型において２４２ｋＤａのサイズであり、ＢＤ２＿Ｆｃ＿ＢＤ１フォーマットを有し、ＢＤ２は、抗ＰＤ−Ｌ１ Ｆ（ａｂ）２（例えば、ＭＥＤＩ４７３６から採取）であり、Ｆｃは、単一ＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、ＢＤ１は、２×ＣＤ４０Ｌ三量体である。 企図されるＢＦＰ３の具体的な実施形態。図３Ａは、ＰＤ−１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＧＩＴＲＬサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｂは、ＰＤ−Ｌ１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＧＩＴＲＬサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｃは、ＰＤ−１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＯＸ４０Ｌサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｄは、ＰＤ−Ｌ１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＯＸ４０Ｌサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｅは、ＰＤ−１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＣＤ４０Ｌサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｆは、ＰＤ−Ｌ１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＣＤ４０Ｌサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｇは、ＰＤ−１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＴＮＦ−αサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｈは、ＰＤ−Ｌ１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＴＮＦ−αサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｉは、ＰＤ−１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＣＤ１３７Ｌサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｊは、ＰＤ−Ｌ１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＣＤ１３７Ｌサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｋは、ＰＤ−１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＧＩＴＲＬサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｌは、ＰＤ−Ｌ１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＧＩＴＲＬサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｍは、ＰＤ−１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＯＸ４０Ｌサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｎは、ＰＤ−Ｌ１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＯＸ４０Ｌサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｏは、ＰＤ−１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＣＤ４０Ｌサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｐは、ＰＤ−Ｌ１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＣＤ４０Ｌサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｑは、ＰＤ−１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＴＮＦ−αサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｒは、ＰＤ−Ｌ１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＴＮＦ−αサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｓは、ＰＤ−１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＣＤ１３７Ｌサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。図３Ｔは、ＰＤ−Ｌ１を標的化する２つのＦａｂ断片、ＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドコア、及び６つのＣＤ１３７Ｌサブユニットを含む二重特異的融合タンパク質を示す。 追加の具体的なＢＦＰ３フォーマット化二重特異的融合タンパク質：抗ＰＤ−Ｌ１＿Ｆｃ＿ＴＮＦ−α（Ａ）、抗ＰＤ１＿Ｆｃ＿ＯＸ４０Ｌ（Ｂ）；及び抗ＰＤ１＿Ｆｃ＿ＧＩＴＲＬ（Ｃ）。抗ＰＤ−Ｌ１ Ｆ（ａｂ）断片はＭＥＤＩ４７３６から誘導し、抗ＰＤ−１ Ｆ（ａｂ）断片は抗ＰＤ１抗体（ＬＯ１１５）から誘導した。ＴＮＦ−α、ＯＸ４０Ｌ、及びＧＩＴＲＬ結合ドメインは、それぞれ、ペプチドリンカーを介して一緒に結合しているそれぞれのタンパク質サブユニットの三量体リピートの２つのセットを含む。 ＢＦＰ２及び３は、ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１と結合する。図５Ａ〜５Ｄは、Ｏｃｔｅｔアッセイによる抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＣＤ４０Ｌ ＢＦＰ２及び３分子によるＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１タンパク質の同時結合を実証する。 ＢＦＰ２及びＢＦＰ３は、ＣＤ４０への結合能を保持する。抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＣＤ４０Ｌ ＢＦＰ２及び３分子は、フローサイトメトリーベースアッセイにおいて親ＣＤ４０Ｌ ＦＰ（融合タンパク質）と比較して類似の細胞表面ＣＤ４０への結合能を実証する。 ＢＦＰ２及びＢＦＰ３は、細胞表面上のＰＤＬ１へのより低い結合を有する。図７は、フローサイトメトリーベースアッセイにおいて抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ２及び３分子が細胞表面ＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合し得ることを実証する。 混合ＰＢＭＣへのＢＦＰ結合。図８は、フローサイトメトリーベースアッセイにおいて抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ２及び３分子が親抗ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ４０Ｌ ＦＰと同様にヒトＰＢＭＣサブセットに用量依存的に結合することを実証する。 ＢＦＰ２及びＢＦＰ３は、ＣＤ４０シグナリング経路の刺激能を保持する。図９は、抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ２及び３分子が、複数の細胞タイプ上のＣＤ４０活性化の下流であるＮＦ−κＢシグナリング経路を活性化させることを実証する。 ＢＦＰ３は、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ１の相互作用を遮断し、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞中でＮＦＡＴシグナリングを向上させる。図１０は、抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ２及び３分子がＰＤ−Ｌ１−ＰＤ１相互作用を遮断し、Ｊｕｒｋａｔ細胞中でＮＦＡＴ経路の活性化をもたらすことを実証する。 ＢＦＰは、ＣＤ４０を刺激し、ＰＤ１−ＰＤＬ１相互作用を遮断する。図１１Ａは、共刺激アッセイの概念的模式図を説明する。図１１Ｂは、抗ＰＤ−Ｌ１−ＣＤ４０Ｌ ＢＦＰが二重機能を有することを示し、それは、ＣＤ４０エンゲージメントを介してＴＨＰ−１細胞上のＮＦ−κＢを活性化させ、ＰＤ−Ｌ１媒介阻害を除去することによりＪｕｒｋａｔ細胞中でＮＦＡＴ活性を向上させた。 ＢＦＰ３は、ＳＥＢアッセイにおいて優れたＩＬ−２誘導活性を有する。図１２は、ブドウ球菌エンテロトキシン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ｂ（ＳＥＢ）アッセイからの結果を示し、抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ２及び３分子が、親分子ＣＤ４０Ｌ ＦＰ及び抗ＰＤ−Ｌ１の組合せよりも多いＩＬ−２産生を誘導することを実証する。 ＰＤ−１／ＧＩＴＲＬ二重特異物（ＭＥＤＩ３３８７及びＭＥＤＩ５７７１）は、ＳＥＢアッセイにおいて単一薬剤に対してＴ細胞活性化を増加させる。図１３は、ＭＥＤＩ３３８７及びＭＥＤＩ５７７１が、親分子の組合せと同等の活性を有したが、親分子単独のいずれよりも大きい活性を有したことを実証する。結果は、２つのバッチにわたり同等であり、Ｔ細胞再活性化アッセイと類似の結果を実証した。 ＢＦＰ３は、Ｍ１マクロファージ−Ｔ ＭＬＲアッセイにおいてロバストなＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２産生を誘導する。図１４は、マクロファージ−Ｔ細胞ＭＬＲアッセイからの結果を示し、抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ２及び３分子が親分子ＣＤ４０Ｌ ＦＰ及び抗ＰＤ−Ｌ１の組合せよりも多いＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２産生を誘導することを実証する。 ＢＦＰ３は、モノＴ ＭＬＲアッセイにおいてロバストなＩＦＮ−γ産生を誘導する。図１５は、単球Ｔ細胞ＭＬＲアッセイからの結果を示し、抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ２及び３分子が親分子ＣＤ４０Ｌ ＦＰ及び抗ＰＤ−Ｌ１の組合せよりも多い又はそれと同等の量のＩＦＮ−γ産生を誘導することを実証する。 ＢＦＰ３は、ＣＭＶリコールアッセイにおいて組合せと比べて優れた活性を示す。図１６は、ＣＭＶ抗原リコールアッセイからの結果を示し、抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ３分子が親分子ＣＤ４０Ｌ ＦＰ及び抗ＰＤ−Ｌ１の組合せと比較して多いＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１０産生を誘導するが、類似レベルのＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＩＬ−８を誘導することを実証する。 ＢＦＰ３は、ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１の膜局在化を潜在的に変更させ得る。図１７Ａは、ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１が抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で共発現することを説明する。図１７Ｂは、細胞表面ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１タンパク質を試験するためのフローサイトメトリーベースアッセイについての概念的模式図を示す。 ＢＦＰ３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１の下方調節を誘導する。図１８は、フローサイトメトリーベースアッセイからの結果を示し、抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ３分子のみが処理の１及び９６時間後においてＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１分子の両方の下方調節を誘導し得ることを実証する。 ＢＦＰ３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１の下方調節を誘導する。図１９は、ウエスタンブロットからの結果を示し、抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ３分子が処理の２４時間後において総ＰＤ−Ｌ１タンパク質含有率の下方調節を誘導することを実証する。ＮＳ＝刺激なし。 ＢＦＰ３刺激時のＴＨＰ１細胞中の表面ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１の損失。図２０は、連続刺激を用いる細胞表面ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１タンパク質を試験するためのアッセイについての概念的模式図を示す。 ＢＦＰ３刺激時のＴＨＰ１細胞中の表面ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１の損失。図２１は、フローサイトメトリーベースアッセイからの結果を示し、抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ３分子が処理の０．５〜３時間後において表面ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１の下方調節を誘導することを実証する。 ＢＦＰ３刺激時のＴＨＰ１細胞中の表面ＰＤ−Ｌ１の損失。図２２は、処理の１時間後に細胞表面ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１タンパク質を試験し、次いで試験材料を洗浄除去するためのアッセイについての概念的模式図を示す。 ＢＦＰ３刺激時のＴＨＰ１細胞中の表面ＰＤ−Ｌ１の損失。図２３は、ＴＨＰ１細胞に対するフローサイトメトリーベースアッセイからの結果を示し、抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ３分子による１時間の一過的な処理が細胞表面ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１タンパク質の下方調節を誘導することを実証する。２４時間において、ＣＤ４０のみを細胞表面上で検出することができた。 ＢＦＰ３処理ｍｏＤＣは、より少量のＰＤ−Ｌ１タンパク質を有する。図２４は、フローサイトメトリーベースアッセイからの結果を示し、ＣＤ４０、ＣＤ８６、及びＰＤ−Ｌ１の細胞表面発現の調節における抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ３及びＣＤ４０Ｌ ＦＰ分子間の区別される効果を実証し、ＰＤ−Ｌ１の下方調節はＢＦＰ３処理細胞中でのみ達成された。 ＢＦＰ３処理ｍｏＤＣは、より少量のＰＤ−Ｌ１タンパク質を有する。図２５は、ウエスタンブロットからの結果を示し、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の量が抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ３処理条件において、ＣＤ４０Ｌ ＦＰ単独又はＣＤ４０Ｌ ＦＰと抗ＰＤ−Ｌ１の処理よりもかなり少ないことを実証する。 血液単球上の表面ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１の損失。図２６は、フローサイトメトリーベースアッセイからの結果を示し、ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１の細胞表面発現の調節における抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ３及びＣＤ４０Ｌ ＦＰ分子間の区別される効果を実証し、ＰＤ−Ｌ１の用量依存的下方調節はＢＦＰ３処理細胞中でのみ達成された。 ｍＢＦＰ３は、Ｒｅｎｃａ細胞中でネズミＰＤ−Ｌ１の分解を誘導する。図２７は、ウエスタンブロットからの結果を示し、ネズミＰＤ−Ｌ１タンパク質の量が抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ３処理条件においてＣＤ４０Ｌ ＦＰ単独又はＣＤ４０Ｌ ＦＰと抗ＰＤ−Ｌ１の処理よりもかなり少ないことを実証する。 ＰＤ−Ｌ１架橋は、ＢＦＰ３により媒介されるＮＦ−κＢ活性を増加させる。図２８は、ＥＳ２細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１の架橋は、ＢＦＰ３により媒介されるＴＨＰ−１細胞に対するＮＦ−κＢ作用を向上させ得ることを示す。Ｙ軸は、ＮＦ−κＢレポーター活性を示す。 ＩｇＧ４ Ｆｃ及びＦｃγＲＩの相互作用は、ＢＦＰ３活性をモジュレートする。図２９は、ＦｃγＲがＢＦＰ３を介して媒介されるＴＨＰ−１細胞に対するＮＦ−κＢ作用を増大させ得ることを示す。 重量損失は、ｍＢＦＰ３処理マウス（単回投与処理）においてより少ない。図３０Ａ〜Ｆは、野生型マウス及びＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞が移植されたマウスに対する複数の試験からの結果を示す。個々のマウスからの処理後の体重の変化を示す。 重量損失は、ｍＢＦＰ３処理マウス（複数回投与処理）においてより少ない。図３１は、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞が移植されたマウスに対する複数回投与試験からの結果を示す。個々のマウスからの処理後の体重の変化パーセントを示す。 ｍＢＦＰ３処理は、腫瘍成長を有効に阻害する。図３２は、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞が移植されたマウスに対する複数回投与試験（週２回×２週間）からの結果を示す。個々のマウスからの処理後の腫瘍容積の変化を示す。 ＢＦＰ３の投与頻度の低減は副作用を予防する。図３３Ａ〜Ｃは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞が移植されたマウスに対する減量投与試験（１又は２回の投与）からの結果を示す。個々のマウスからの処理後の体重の変化を図３３Ａに提示した。図３３Ｂは、腫瘍容積の変化を示し、図３３Ｃは、血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）のレベルを示す。 ｍＢＦＰ３処理は、Ｔ細胞の活性化／分化を誘導した。図３４は、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスから回収されたＴ細胞に対するフローサイトメトリー試験からの結果を示す。Ｔ細胞サブセットの割合を決定し、グラフに示した。 ｍＢＦＰ３処理は、エフェクター／記憶ＣＤ８ Ｔ細胞分化を誘導する。図３５は、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスから回収されたＴ細胞を試験するフローサイトメトリーアッセイからの結果を示す。エフェクターＣＤ８ Ｔ細胞サブセットの割合を決定し、グラフに示した。 マウスにおけるＭＥＤＩ７５２６は、免疫関連毒性の２つのキーモジュレーターＴＮＦ−αもＩＬ−６も誘導しない。図３６は、ＭＥＤＩ７５２６の抗腫瘍機能にＴＮＦ−αもＩＬ−６も要求されないと考えられることを示す。 ＭＥＤＩ７５２６マウスサロゲートは、マウスにおいて区別されるサイトカインプロファイルを誘導する（単回ｉｖ投与試験）。 ＰＤ１−ＯＸ４０Ｌは、Ｊｕｒｋａｔ／ＯＸ４０細胞中でＮＦ−κＢ活性化を誘導する。図３８は、抗ＰＤ−Ｌ＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＯＸ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ３分子はＯＸ４０が形質移入されたＪｕｒｋａｔ細胞系中でＮＦ−κＢシグナリング経路を活性化させることを実証する。 マウス同系モデルにおけるＭＣＡ２０５及びＣＴ２６細胞系の成長に対するマウスＯＸ４０リガンド（ｍＯＸ４０Ｌ）融合タンパク質（ＦＰ）、抗マウスＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はｍＯＸ４０Ｌ ＦＰ及び抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂの組合せの効果。 ＰＤＬ１／ＯＸ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ２（ＭＥＤＩ５６１５）のＰＤ−Ｌ１依存的腫瘍局在化。 ＰＤ−Ｌ１／ＯＸ４０Ｌ二重特異的分子の様々な分子フォーマットの腫瘍担持マウス中の生体分布。 二重特異的分子の生物活性の計測に使用された細胞システム。 ＢＦＰ２は、ＯＸ４０のＰＤ−Ｌ１媒介クラスター化に最適な価数を有する。ＲＬＵ＝相対光単位；Ｍ＝モル濃度。 ＭＥＤＩ５６１５（ＰＤＬ１／ＯＸ４０Ｌ ＢＦＰ２）及びｓｃＯＸ４０Ｌは、天然ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇ細胞の存在下でＴエフェクター増殖を増加させ、ＩＬ−１０産生Ｔ制御性細胞の頻度を減少させた。エラーバーは、２つ組アッセイウェルからの平均値の標準誤差を表す。 ブドウ球菌エンテロトキシン（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ｂ（ＳＥＢ）共刺激アッセイにおけるＰＤＬ１／ＯＸ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ２（ＭＥＤＩ５６１５）及びＯＸ４０／ＰＤＬ１二重特異的ｍＡｂの活性を示す。 ヒト又はカニクイザルＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１、又はＯＸ４０及びＰＤ−Ｌ１の両方を発現するように遺伝子操作されたＣＨＯ細胞へのＰＤ−Ｌ１／ＯＸ４０Ｌ ＢＦＰ２結合を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差を表す。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。 ＰＤ１−ＯＸ４０Ｌは、ヒトＰＢＭＣ中でＰＤ１の分解を誘発する。図４７は、ウエスタンブロットからの結果を示し、ＰＤ−１タンパク質レベルが抗ＰＤ−１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＯＸ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ３処理条件において低減されるが、ＯＸ４０タンパク質レベルは変化しなかったことを実証する。 ＭＥＤＩ３３８７は、ヒトＰＢＭＣ中でＰＤ１の分解を誘発する。図４８は、ウエスタンブロットからの結果を示し、ＰＤ−１タンパク質レベルが抗ＰＤ−１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＧＩＴＲＬ ＦＰ ＢＦＰ３処理条件において低減されるが、ＧＩＴＲタンパク質の量は変化しなかったことを実証する。ＰＤ−１／ＧＩＴＲＬ ＦＰ Ｂｉｓ；ＭＥＤＩ５７７１（ＩｇＧ１フォーマット）及びＭＥＤＩ３３８７（ＩｇＧ４Ｐ）；ＧＩＴＲＬ：ＭＥＤＩ１８７３。 ＭＥＤＩ３３８７は、Ｊｕｒｋａｔ／ＧＩＴＲ細胞中でＮＦ−κＢ活性化を誘導する。４時間の刺激。図４９は、抗ＰＤ−Ｌ＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＧＩＴＲＬ ＦＰ ＢＦＰ３分子がＧＩＴＲが形質移入されたＪｕｒｋａｔ細胞系中でＮＦ−κＢシグナリング経路を活性化させることを実証する。 ＰＤ１／ＧＩＴＲ二重特異的分子は、両方の標的に同時に結合し得る。図５０は、Ｏｃｔｅｔアッセイによる抗ＰＤ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＧＩＴＲＬ ＦＰ ＢＦＰ２（ＭＥＤＩ３３８７）及び抗ＰＤ１＿ＩｇＧ１ Ｆｃ＿ＧＩＴＲＬ ＦＰ ＢＦＰ２（ＭＥＤＩ５７７１）分子によるＰＤ１及びＧＩＴＲタンパク質の同時結合を実証する。「Ａ」＝ＭＥＤＩ３３８７；「Ｂ」＝ＢＦＰ２−ＰＤ１（００７５）−ＧＩＴＲＬ（ｓｃ）−Ｇ４Ｐ；「Ｃ」＝ＢＦＰ２−ＧＩＴＲＬ（ｓｃ）−Ｇ４Ｐ。 ＢＦＰ３は、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ１の相互作用を遮断し、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞中でＮＦＡＴシグナリングを向上させる。図５１は、ＭＥＤＩ３３８７（ＢＩＯＡＥ００３）及びＭＥＤＩ５７７１（ＢＩＯＡＥ００５）分子は、ＰＤ−Ｌ１−ＰＤ１相互作用を遮断し、Ｊｕｒｋａｔ細胞中でＮＦＡＴ経路の活性化をもたらすことを実証する。ＢＩＯＡＥ００３及びＢＩＯＡＥ００５は、ＭＥＤＩ１８７３（ＧＩＴＲＬ）及び親抗ＰＤ１ ＩｇＧと同等の効能を実証する。 ＰＤ１／ＧＩＴＲ二重特異的分子は、Ｂ１６マウスモデルにおいてＧＩＴＲＬ−ＦＰ及びＰＤ−１ ｍＡｂの組合せと同等である。 ＭＥＤＩ３３８７及びＭＥＤＩ５７７１による処理時のＣＤ４＋及びＣＤ８＋総記憶Ｔ細胞（Ｋｉ６７）の用量依存的増加。図５３Ａ〜Ｂは、変動用量のＭＥＤＩ３３８７及びＭＥＤＩ５７７１により処理されたカニクイザルにおける薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）試験の結果を示す。 単一静脈内注射後の雄カニクイザルにおける平均血清ＭＥＤＩ３３８７及びＭＥＤＩ５７７１濃度−時間プロファイル。ＩＶ＝静脈内；エラーバーは、平均値の標準偏差を表す；ＬＬＯＱ（黒色点線）＝定量下限。説明の目的のみのためにＬＬＯＱ（０．０５０ｍｇ／Ｌ；黒色点線により示される）未満のデータをＬＬＯＱの半数においてプロットする。 ＰＤ１／ＧＩＴＲ二重特異的分子は、両方の標的に同時に結合し得る。図５５Ａは、Ｃｙｔｏｓｔｉｍ Ｔ細胞再活性化アッセイのアッセイ模式図を実証する。図５５Ｂは、ＰＤ１／ＧＩＴＲ ＩｇＧ４Ｐ ＢＦＰ（ＭＥＤＩ３３８７）及び親分子についての結果を実証する。図５５Ｃは、ＰＤ１／ＧＩＴＲ ＩｇＧ４Ｐ ＢＦＰ（ＭＥＤＩ５７７１）及び親分子についての結果を実証する。 インビボでのＧＩＴＲＬの蛍光生体分布を示す。 抗ＰＤＬ１−ＴＮＦαは、Ｔ２４腫瘍細胞中でネズミＰＤ−Ｌ１の下方調節を誘導する；ＡＰＣ−細胞当たりの抗原。図５７Ａは、フローサイトメトリーベースアッセイからの結果を示し、抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＴＮＦα ＦＰ ＢＦＰ３処理がＴ２４腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１を下方調節することを実証する。図５７Ｂは、抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＴＮＦα ＦＰ ＢＦＰ３処理が細胞生存に影響しなかったことを示す。 抗ＰＤＬ１−ＴＮＦ−α ＢＦＰは、ＴＨＰ１骨髄細胞を刺激し得る。図５８は、抗ＰＤ−Ｌ１＿ＩｇＧ４ Ｆｃ＿ＴＮＦ−α ＦＰ ＢＦＰ３分子がＴＮＦ−α受容体活性化の下流であるＮＦ−κＢシグナリング経路を活性化させることを実証する。 ＢＦＰ３は、親試薬の組合せについて生じないＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１の両方の同時内在化をドライブする。図５９は、抗ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ４０Ｌ結合ドメインを含むＢＦＰ分子を示し、ＢＦＰ分子が細胞表面上の２つの標的（ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１）を内在化させ、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の分解をもたらし得ることを示す概念的模式図である。ＣＤ４０は分解に耐性であり、続いて発現が細胞表面において回復される。 レポーターアッセイスキーム。パネルＡは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体形成による阻害に起因して抗原提示細胞からの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８活性化の結果としてシグナルが生じない（アッセイ応答なし）モデル疾患状態を示す。対照的に、パネルＢは、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８活性化時にレポーター分子（ルシフェラーゼ）発現をもたらす抗ＰＤ−１抗体を介するＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体形成の良好な遮断を示す。 ＩｇＧ１ ＴＭ及びＩｇＧ４フォーマットの抗ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ３を比較するＳＥＢアッセイの結果を示す。 ＩｇＧ１ ＴＭ及びＩｇＧ４フォーマットの抗ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ３を比較するＣＭＶリコールアッセイの結果を示す。 抗ＰＤ−１−抗ＯＸ４０ Ｂｉｓ２は、Ｊｕｒｋａｔ細胞中でＮｆｋＢ活性化を誘導しない一方、抗ＰＤ−１−ＯＸ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ３は誘導することを示す。 Ｂｉｓ２構築物は、ＰＤ１分解を誘発することを示し、ＰＤ１の分解がＯＸ４０アゴニスト機能と無関係であることを示す。 ５ＦＵ及びＭＥＤＩ７５２６（抗ＰＤＬ１−ＣＤ４０Ｌ ＢＦＰ３）の組合せ処理は、腫瘍成長を有効に阻害する。図６５は、複数回投与における５ＦＵ（１１日目）及びＭＥＤＩ７５２６（１４、２１及び２８日目）の連続処理をＣＴ２６腫瘍細胞を担持するマウスに施与した動物試験からの結果を示す。個々のマウスからの処理後の腫瘍容積の変化を示す。５ＦＵとＭＥＤＩ７５２６の処理は、ＭＥＤＩ７５２６処理単独により媒介される抗腫瘍応答を向上させる。 肝臓及び脾臓は、ＭＥＤＩ７５２６のネズミサロゲートの標的器官である。図６６Ａは、ＭＥＤＩ５０８３及びＭＥＤＩ７５２６のネズミサロゲートが肝臓及び脾臓中に蓄積したことを示す。図６６Ｂは、ヒトクッパー細胞（肝臓中に存在するマクロファージ）がＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１の両方を発現することを示し、ＭＥＤＩ７５２６が肝臓中でクッパー細胞を標的化し得ることを示す。 ＭＥＤＩ７５２６は、肝腫瘍成長を有効に阻害する。図６７Ａは、ＣＴ２６ルシフェラーゼ腫瘍細胞を肝臓中に直接移植する肝腫瘍モデルの設計を示す。２１日目、肝臓を解剖後に回収し、肝臓中の腫瘍負荷をルシフェラーゼ活性のイメージングにより定量した。図６７Ｂは、ＭＥＤＩ７５２６処理マウスからの肝臓中の腫瘍負荷（発光単位として示される）が、アイソタイプ対照処理動物のものと比較して有意に低かったことを示す。 ＭＥＤＩ７５２６処理は、ＣＴ２６肝腫瘍モデル試験からの肝臓中のＴ細胞拡張及び活性化を誘導する。図６８Ａは、ＭＥＤＩ７５２６を受容したマウスが対照マウスと比較して肝臓中で増加した数のＣＤ８ Ｔ細胞を有したことを示す。図６８Ｂは、ＭＥＤＩ７５２６処理動物から単離された腫瘍抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞がより高い割合の活性化サブタイプを有したことを示す。 ＣＴ２６肝腫瘍モデルにおいてＭＥＤＩ７５２６の処理は、ＭＥＤＩ５０８３及び抗ＰＤＬ１の組合せ処理よりも寛容である。図６９Ａは、重量損失がＭＥＤＩ７５２６処理マウスにおいてＭＥＤＩ５０８３又はＭＥＤＩ５０８３と抗ＰＤＬ１処理と比較して小さかったことを示す。個々のマウスからの単回投与処理後の体重の変化を示す。図６９Ｂは、死亡率がｍＭＥＤＩ５０８３と抗ネズミＰＤＬ１群において相対的に高かったことを示す。 追加の具体的なＢＦＰ３フォーマット化二重特異的融合タンパク質：抗ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ野生型（Ａ）、抗ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ ２ＷＴ（Ｂ）；及び抗ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ １ＷＴ（Ｃ）。抗ＰＤ−１ Ｆ（ａｂ）断片は、抗ＰＤ１抗体（ＬＯ１１５）から誘導した。ＯＸ４０Ｌ部分は、保存野生型配列（Ａ）を有し、又は残基Ｆ１８０上の突然変異（Ｂ及びＣ）を有する。 抗ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ ２ＷＴ及び１ＷＴは、ヒトＴ細胞系上で縮小したＯＸ４０アゴニスト機能を有する。図７１Ａ及びＢは、抗ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ ２ＷＴが抗ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌと比較してわずかに低減した結合及び内在化を有することを示す。図７１Ｃは、抗ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ ２ＷＴ及び１ＷＴが低減したＮＦκＢ経路の活性化能を有したことを示す。 抗ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ ２ＷＴ及び１ＷＴは、プライマリーヒトＴ細胞上で抗ＰＤ１−ＯＸ４０Ｌと比較して類似の結合及び内在化を有する。データを、２人の健常ドナーからの精製ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞に対して作成した。 抗ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ ２ＷＴは、ヒトプライマリーＴ細胞上で縮小したＯＸ４０アゴニスト機能を有する。ヒトＴ細胞刺激及びＣＭＶリコールアッセイを使用してＰＤ１−ＯＸ４０Ｌ及びＰＤ１−ＯＸ４０Ｌ ２ＷＴを比較した。ＰＤ１−ＯＸ４０Ｌ ２ＷＴは、ＯＸ４０Ｌ上のいかなる突然変異も担持しないＰＤ１−ＯＸ４０Ｌと比較してかなり少ない炎症性サイトカインを誘導した。 抗ＰＤ１−Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ ２ＷＴ及び１ＷＴは、ヒトＴ細胞上のＰＤ１分解を誘導した。活性化ヒトＴ細胞はＰＤ１タンパク質を発現し、総ＰＤ１タンパク質の量は抗ＰＤ１−ＯＸ４０Ｌ、抗ＰＤ１−ＯＸ４０Ｌ １ＷＴ又は抗ＰＤ１−ＯＸ４０Ｌ ２ＷＴの処理後に有意に低減された。図７４Ａは、代表的なウエスタンブロット写真を示し、図７４Ｂは、３人のドナーからプールされた結果を示す。
定義
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者により一般に理解される意味を有する。以下の参照文献は、当業者に本開示において使用される用語の多くの一般的定義を提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及びＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書において使用される以下の用語は、特に規定のない限り、以下においてそれらに属する意味を有する。
用語「Ｔ細胞媒介細胞傷害」は、細胞傷害性Ｔリンパ球による細胞、例えば、感染細胞又は癌性細胞の標的化殺傷を指す。
用語「抗腫瘍活性」は、腫瘍細胞の増殖の増加又は生存を低減させ、又は予防する任意の生物学的活性を指すことを意味する。一実施形態において、抗腫瘍活性は、抗腫瘍免疫応答である。
用語「免疫調節剤」は、免疫応答（例えば、抗腫瘍免疫応答）を向上させる薬剤を指す。本開示の例示的な免疫調節剤としては、抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、及びその断片、並びにタンパク質、例えば、融合タンパク質、二重特異的融合タンパク質、及び／又はそれらの断片が挙げられる。
用語「ＣＤ４０Ｌポリペプチド」は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００００６５と少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有し、ＣＤ４０結合活性を有するポリペプチド又はその断片を示すことを意味する。用語「ＣＤ４０Ｌ」は、全長ＣＤ４０Ｌ及び可溶性断片、例えば、タンパク質分解から生じるＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン形態、並びにＣＤ４０Ｌの単量体形態及びオリゴマー形態、例えば、三量体ＣＤ４０Ｌの両方を指す。ヒトＣＤ４０Ｌの膜結合及び可溶性形態のアミノ酸配列は、以下に示す。
「ＣＤ４０ポリペプチド」は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２４１と少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有し、ＣＤ４０Ｌ結合活性を有するポリペプチド又はその断片を意味する。例示的なＣＤ４０アミノ酸配列は、以下に提供する（配列番号２２）。
「ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド」は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２５４６３５と少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有し、ＰＤ−１及びＣＤ８０結合活性を有するポリペプチド又その断片を意味する。例示的なＰＤ−Ｌ１アミノ酸配列は、以下に提供する（配列番号２３）。
「抗ＰＤ−Ｌ１抗体」は、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドを選択的に結合する抗体を意味する。例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８７７９１０８号明細書及び米国特許出願公開第２０１４０３５６３５３号明細書において記載されている。デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）は、例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）及びＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。
「ＰＤ−１ポリペプチド」は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００５００９と少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有し、ＰＤ−Ｌ１結合活性を有するポリペプチド又はその断片を意味する。例示的なＰＤ−１アミノ酸配列は、以下に提供する（配列番号３２）。
「ＰＤ−１核酸分子」は、ＰＤ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なＰＤ−１核酸分子配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５０１８において提供される。
用語「ＧＩＴＲＬポリペプチド」は、配列番号３３と少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有し、ＧＩＴＲ結合活性を有するポリペプチド又はその断片を示すことを意味する。用語「ＧＩＴＲＬ」は、全長ＧＩＴＲＬ及び可溶性断片、例えば、タンパク質分解から生じるＧＩＴＲＬの細胞外ドメイン形態、並びにＧＩＴＲＬの単量体形態及びオリゴマー形態、例えば、三量体ＧＩＴＲＬの両方を指す。ヒトＧＩＴＲＬの膜結合及び可溶性形態のアミノ酸配列は、以下に示す。
用語「ＴＮＦ−αポリペプチド」は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００５８５．２と少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド又はその断片を示すことを意味する。用語「ＴＮＦ−α」は、全長ＴＮＦ−α及び可溶性断片、例えば、タンパク質分解から生じるＴＮＦ−αの細胞外ドメイン形態、並びにＴＮＦ−αの単量体形態及びオリゴマー形態、例えば、三量体ＴＮＦ−αの両方を指す。ヒトＴＮＦ−αの膜結合及び可溶性形態のアミノ酸配列は、以下に示す。
本明細書において使用される「ＯＸ４０ポリペプチド」は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００３３１８と少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド又はその断片を意味する。ＯＸ４０は、抗原活性化哺乳動物ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔリンパ球の表面上で発現される受容体のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーである。ＯＸ４０受容体配列は当技術分野において公知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ３３９４４又はＣＡＥ１１７５７において提供される。
用語「ＯＸ４０Ｌポリペプチド」は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００３３１７と少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有し、ＯＸ４０結合活性を有するポリペプチド又はその断片を示すことを意味する。用語「ＯＸ４０Ｌ」は、全長ＯＸ４０Ｌ及び可溶性断片、例えば、タンパク質分解から生じるＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン形態、並びにＯＸ４０Ｌの単量体形態及びオリゴマー形態、例えば、三量体ＯＸ４０Ｌの両方を指す。ヒトＯＸ４０Ｌの膜結合及び可溶性形態のアミノ酸配列は、以下に示す。
用語「ＣＤ１３７Ｌ」は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１５５２．２と少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有し、ＣＤ１３７結合活性を有するポリペプチド又はその断片を示すことを意味する。用語「ＣＤ１３７Ｌ」は、全長ＣＤ１３７Ｌ及び可溶性断片、例えば、タンパク質分解から生じるＣＤ１３７Ｌの細胞外ドメイン形態、並びにＣＤ１３７Ｌの単量体形態及びオリゴマー形態、例えば、三量体ＣＤ１３７Ｌの両方を指す。ヒトＣＤ１３７Ｌの膜結合及び可溶性形態のアミノ酸配列は、以下に示す。
本開示において使用される用語「抗体」は、インビトロで産生されるかインビボで産生されるかにかかわらず、免疫グロブリン又はその断片若しくは誘導体を指し、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。この用語は、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異的、多特異的、非特異的、ヒト化、単鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、突然変異、融合タンパク質及びグラフト抗体を含む。「インタクト抗体」におけるように用語「インタクト」により特に修飾されない限り、本開示の目的のため、用語「抗体」は、抗原結合機能、すなわち、例えば、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する能力を保持する抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、他の抗体断片及びその組合せも含む。典型的には、このような断片は、抗原結合ドメインを含む。さらに、このような断片は、他のものと組み合わせて多抗原結合融合タンパク質を形成することができる。
用語「抗原結合ドメイン」、「抗原結合断片」、及び「結合断片」は、抗体及び抗原間の特異的結合を担うアミノ酸を含む抗体分子の一部を指す。抗原が大型である例において、抗原結合ドメインは、抗原の一部にのみ結合し得る。抗原結合ドメインとの特異的相互作用を担う抗原分子の一部は、「エピトープ」又は「抗原決定基」と称される。抗原結合ドメインは、典型的には抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むが、必ずしも、その両方を含むわけでない。例えば、いわゆる「Ｆｄ」抗体断片は、ＶＨドメインからのみなるが、依然として、インタクト抗体のいくらかの抗原結合機能を保持する。
抗体の結合断片は、組換えＤＮＡ技術により、又はインタクト抗体の酵素的若しくは化学的開裂により産生される。結合断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及び単鎖抗体が挙げられる。「二重特異的」又は「二機能性」抗体以外の抗体は、同一の結合部位を有すると理解される。酵素パパインによる抗体の消化は、「Ｆａｂ」断片としても公知の２つの同一の抗原結合断片、及び抗原結合活性を有さないが、結晶化能を有する「Ｆｃ」断片をもたらす。酵素ペプシンによる抗体の消化は、抗体分子の２つのアームが依然として結合したままであり、２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗原の架橋能を有する。本明細書において使用される「Ｆｖ」は、抗原認識部位及び抗原結合部位の両方を保持する抗体の最小断片を指す。本明細書において使用される「Ｆａｂ」は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖のＣＨ１ドメインを含む抗体の断片を指す。
用語「ｍＡｂ」は、モノクローナル抗体を指す。本開示の抗体は、限定されるものではないが、全天然抗体、二重特異的抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆａｂ’、単鎖Ｖ領域断片（ｓｃＦｖ）、融合ポリペプチド、非慣用抗体及びその組合せを含む。
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する」及び「有する」などは、米国特許法においてそれらに帰属する意味を有し得、「挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得；「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、同様に、米国特許法において帰属する意味を有し、その用語は、無制約であり、記述される基礎的又は新規特徴が記述されるそれを超える存在により変化しない限り、記述されるそれを超える存在を許容するが、先行技術の実施形態を除外する。
本明細書において使用される用語「測定する」、「評価する」、「アッセイする」、「計測する」及び「検出する」は、定量及び定性的測定の両方を指し、したがって、用語「測定する」は、「アッセイする」、「計測する」などと本明細書において互換的に使用され得る。定量的測定が意図される場合、分析物の「量を測定する」という語句などが使用される。定性的及び／又は定量的測定が意図される場合、分析物の「レベルを測定する」又は分析物を「検出する」という語句が使用される。
本明細書において使用される用語「Ｆｃドメイン」ドメインは、抗体定常領域の一部を指す。慣習的に、用語Ｆｃドメインは、抗体のペアになったＣＨ２、ＣＨ３及びヒンジ領域を包含するプロテアーゼ（例えば、パパイン）開裂産物を指す。本開示に関して、用語Ｆｃドメイン又はＦｃは、産生の手段にかかわらず、免疫グロブリンポリペプチドのＣＨ２、ＣＨ３及びヒンジ領域の全部又は一部を含む任意のポリペプチド（又はそのようなポリペプチドをコードする核酸）を指す。
用語「融合ポリペプチド」又は「融合タンパク質」は、同一のポリペプチド中に天然には存在しない２つ以上の異なるポリペプチド又はその活性断片を含むポリペプチドを指す。種々の実施形態において、２つ以上の異なるポリペプチドは、一緒に作動可能に共有結合しており、例えば、化学結合又はペプチド結合若しくはペプチドリンカーによりインフレームで融合している。例えば、二重特異的融合タンパク質は、１つ以上のＦａｂ及び／若しくはＦａｂ’断片、Ｆｃ断片若しくは領域（例えば、ヒンジ領域を有さない又は有さないＣＨ２及びＣＨ３）、並びに／又は１つ以上のＦａｂ及び／若しくはＦａｂ’断片若しくはＦｃ断片に付着している融合タンパク質を含み得る。
２つ以上の核酸又はポリペプチドに関する用語「同一」又は「同一性」パーセントは、配列同一性の一部としていかなる保存アミノ酸置換も考慮せずに最大対応について比較及びアライン（必要に応じてギャップを導入）して同一であり、又は同一である規定の割合のヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する２つ以上の配列又は下位配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズムを使用して、又は目視調査により計測することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用することができる種々のアルゴリズム及びソフトウェアは、当分野において公知である（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：５８７３−５８７７において修正され、ＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２）に組み込まれるＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：２２６４−２２６８参照。ある実施形態において、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載のとおり使用することができる。ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０）、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用することができる。
用語「単離」は、その天然環境中に存在する他の要素を実質的に有さない分子を指す。例えば、単離タンパク質は、それが由来する細胞又は組織資源からの細胞材料も他のタンパク質も実質的に有さない。用語「単離」は、単離タンパク質が医薬組成物として投与することができるほど十分に純粋であり、又は少なくとも７０〜８０％（ｗ／ｗ）純粋、より好ましくは、少なくとも８０〜９０％（ｗ／ｗ）純粋、いっそうより好ましくは、９０〜９５％純粋；最も好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（ｗ／ｗ）純粋である調製物も指す。
用語「参照」は、比較標準を指す。
用語「特異的に結合する」は、分子（例えば、ＣＤ４０ポリペプチド、ＧＩＴＲポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、又はＣＤ１３７ポリペプチド、それぞれ）を認識し、それに結合するが、試料、例えば、生物試料中の他の分子を実質的に認識せず、それに結合しない薬剤（例えば、ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ、又はＣＤ１３７Ｌ）を指す。例えば、特異的に結合する２つの分子は、生理学的条件下で比較的安定である複合体を形成する。特異的結合は、高い親和性及び低から中程度のキャパシティを特徴とし、それは通常、中程度から高いキャパシティで低い親和性を有する非特異的結合と区別される。
用語「対象」は、哺乳動物、例として、限定されるものではないが、ヒト又は非ヒト哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、又はネコを指す。
本明細書において提供される範囲は、その範囲内の値の全てについての短縮形であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０からなる群からの任意の数、数の組合せ、又は下位範囲を含むと理解される。
本明細書において使用される用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療」などは、障害及び／又はそれに伴う症状の低減及び／又は改善を指す。除外されるものではないが、障害又は病態の治療は、その障害、病態又はそれに伴う症状が完全に消散することを要求しないことが認識される。例えば、本明細書において企図される障害の治療は、障害の症状の悪化の予防を含む。
本明細書において使用される用語「又は」は、具体的に記述のない限り、又は文脈からそうでないことが明らかでない限り、包括的なものであると理解される。本明細書において使用される用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、具体的に記述のない限り、又は文脈からそうでないことが明らかでない限り、単数形又は複数形であると理解される。
さらに、本明細書において使用される「及び／又は」は、他方を含め、又は含めない、２つ以上の規定の特徴部又は構成要素のそれぞれの具体的開示と解釈すべきである。したがって、本明細書の語句、例えば、「Ａ及び／又はＢ」において使用される「及び／又は」という用語は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、語句、例えば、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」において使用される用語「及び／又は」は、以下の実施形態のそれぞれを包含することが意図される：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；並びにＡ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）。
特に記述のない限り、又は文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される用語「約」は、当分野における通常の許容範囲内、例えば、平均値の２標準偏差内として理解される。「約」は、記述値の±１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％，又は０．０１％内として理解することができる。特に別途示されない限り、本明細書において提供される全ての数値は、約という用語により修飾されるものと黙示的に解釈される。
本明細書における可変部の任意の定義中の化学基の列記の記述は、列記される基の任意の単一基又は任意の組合せとしてのその可変部の定義を含む。本明細書における可変部又は態様についての実施形態の記述は、任意の単一実施形態としての、又は任意の他の実施形態若しくはその一部との任意の組合せのその実施形態を含む。
本明細書において提供される任意の組成物又は方法は、本明細書において提供される他の組成物及び方法のいずれかの１つ以上と組み合わせることができる。
概要
本開示は、いくつかの融合タンパク質（ＦＰ）、特に、多価であり、Ｔ細胞媒介抗癌免疫応答を制御するように設計される二重特異的融合タンパク質（ＢＦＰ）を提供する。１つの非排他的な実施形態において、企図されるＢＦＰは、第１の結合ドメイン（ＢＤ１）、第２の結合ドメイン（ＢＤ２）、及び免疫グロブリンＦｃ領域、例として、例えば、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む（図１参照）。ＢＤ１及びＢＤ２は、抗原結合ドメイン、抗原結合断片、結合断片、受容体アゴニスト、アンタゴニスト、又はリガンドなどの１つ以上を別個に含み得る。１つの特定の例において、ＢＤ１及びＢＤ２の少なくとも１つは、Ｆａｂドメイン、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、及び抗体可変ドメインである。
一部の実施形態において、一部のＢＦＰのＢＤ１、ＢＤ２、及びＦｃ領域は、１つ以上のリンカー、例えば、ペプチドリンカーにより一緒に結合させることができる。このように、一部の実施形態において、企図されるＢＦＰは、宿主細胞中で発現され、アセンブルされ得る、遺伝子によりコードされ、発現される単鎖融合タンパク質（ｓｃｆｐ）であり得る。
一部の実施形態において、ＢＤ１及びＢＤ２結合ドメインは、それぞれ、それらの親（天然、非結合）構成成分と類似する、それらのそれぞれの標的（例えば、エピトープ、タンパク質、及び／又は受容体）に対する結合能及び機能を保持する。一実施形態において、企図されるＢＦＰの二重特異的結合能は、単一ＢＦＰが単一細胞表面上（すなわち、シス相互作用）又は隣接細胞の細胞表面上（すなわち、トランス相互作用）の２つの分子標的に同時にエンゲージし、及び／又は結合するのを可能とする。一部の実施形態において、シス及びトランス相互作用を別個又は同時のいずれかで引き起こし得るＢＦＰが企図される。
本明細書において企図されるとおり、様々なＢＦＰ構成、例えば、図２及び以下の表１に見られるものが可能である。
Figure 2021502360
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１つの特定の実施形態において、任意の他の細胞表面タンパク質を標的化する別の結合ドメインとペアになる任意のＴＮＦスーパーファミリーメンバーを標的化する少なくとも１つの結合ドメインとして取り込む本明細書に開示の任意のフォーマットのＢＦＰが企図される。本明細書において企図されるＢＦＰ結合ドメインＴＮＦスーパーファミリーメンバーの追加の例としては、ＢＦＰ２又はＢＦＰ３フォーマットに取り込むことができるＬＩＧＨＴ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、及びＴＬ１ａが挙げられる。
作用機序
一部の好ましい実施形態において、本開示は、１つ以上のＮ末端抗原結合サブユニット、中央Ｆｃポリペプチドコア、及び１つ以上のＣ末端リガンドタンパク質を含むＢＦＰ３フォーマット二重特異的融合タンパク質を特徴とする。一実施形態において、１つ以上のＮ末端抗原結合サブユニット（ＢＤ２）は、抗ＰＤ−１及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗原結合サブユニットであり得、中央Ｆｃポリペプチドコアは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチド（ＣＨ２及びＣＨ３）であり得、１つ以上のＣ末端リガンドタンパク質（ＢＤ１）としては、例えば、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦ−α、及び／又はＣＤ１３７を挙げることができる。
一実施形態において、図１〜４に示されるＢＦＰ３フォーマットは、異なる細胞上に存在するＢＤ１及びＢＤ２標的の同時選択を可能とし（トランス相互作用）、骨髄細胞上のＦｃγ受容体と結びつく下流シグナリング経路の活性化をもたらす。一例としてＭＥＤＩ７５２６（表１参照）を使用する場合、ＣＤ４０刺激の状況におけるＦｃγＲＩエンゲージメントは、相加的ＮＦ−κＢ活性化を上回ってドライブし得る。
一部の実施形態において、ＢＤ１のその標的（例えば、細胞受容体）への結合は、結合複合体の内在化を誘発し、シグナリングカスケードをイニシエートし（例えば、Ｔ細胞活性化及び／又は複製を促進する）、又はシグナリングカスケードを阻害し得る（例えば、阻害遮断を除去する）。例えば、ＢＤ１結合及び内在化は、ＢＤ２及びその標的、例えば、ＰＤ１又はＰＤ−Ｌ１のいずれかが細胞内に内在化するのを引き起こす。ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１の強制的内在化はそれらの分解を誘発し、細胞表面上のＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１の長期間の不存在をもたらす。これは、細胞表面からＰＤ１／ＰＤＬ１を除去することによりＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１阻害機能を減衰させてＴ細胞媒介免疫応答を促進する新規アプローチである。
一実施形態において、企図されるＢＦＰは、二量体化単鎖融合タンパク質骨格サブユニットであり、例えば、ジスルフィド結合を介して結合している２つの同一の単鎖融合タンパク質を含む。それぞれの単鎖融合タンパク質の個々の構成成分は、ペプチドリンカーを介して結合させることができる。企図されるペプチドリンカーは、所望の二重特異的融合タンパク質の機能的形成を可能とする任意の長さ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０アミノ酸以上であり得る。１つの特定の実施形態において、企図される融合タンパク質の個々の構成成分間の９アミノ酸以上の長さを有するペプチドリンカーが企図される。企図される二重特異的融合タンパク質中の９アミノ酸以上のペプチドリンカーが、安定性を保持し、及び／又はそのような融合タンパク質の凝集を引き起こさなかったことが見出された。実際、広範なリンカー長さは、本開示の二重特異的融合タンパク質において、他箇所で示唆されるものよりも十分寛容であることが証明された。
本開示の単鎖二重特異的融合タンパク質は、安定的であり、生物活性を示すことが示された。本明細書に記載されるとおり、二重特異的融合タンパク質サブユニット安定性及び活性は、少なくとも部分的に、本開示の二重特異的融合タンパク質において使用されるリンカーの長さに起因した。９アミノ酸の長さよりも長いリンカーは、凝集及び／又は安定性についてのいかなる顕著な問題も呈さなかった。本開示の二重特異的融合タンパク質は、単鎖Ｆｃタンパク質の他の特徴部及び利点も提供する。
ＢＤ１抗原結合ドメイン
Ｔ細胞媒介免疫応答を制御するために使用することができる任意のＴＮＦ−αファミリーメンバーが本明細書における使用に企図される。企図されるＴＮＦ−αファミリーメンバーの具体例としては、ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−α、及びＣＤ１３７Ｌが挙げられる。ＴＮＦリガンドファミリーの天然存在可溶性サイトカインメンバーが、ホモ三量体としてその生物活性を示すことは公知である。しかしながら、ＴＮＦリガンドの三量体複合体は、それらの単量体の解離を介して変性する傾向があり、組換え単量体単位から調製することが困難である。単量体へのホモ三量体の解離を防止するため、ＴＮＦリガンドの少なくとも３つの単量体を、ペプチドリンカーによりそれらのＣ末端及びＮ末端を介して互いに共有結合させて「単鎖（ｓｃ）」分子を形成させる。したがって、分子全体（２つのペプチドリンカーを有するＴＮＦリガンドファミリーのメンバーの少なくとも３つの単量体）は、単量体への解離がもはや生じ得ないように単一タンパク質ストランドからなる。
さらに、本開示の単鎖融合タンパク質中におけるように、ＦｃドメインへのＴＮＦリガンドの融合を使用して二量体化三量体を得ることができる。可溶性ドメインの二量体化は、ジスルフィド架橋を介する２つのＦｃドメインの集合により達成される。細胞又は隣接細胞上での単鎖ＴＮＦリガンドの局所濃縮は、それらの融合タンパク質生物活性を増加させる潜在性を有する。
ＢＤ２抗原結合ドメイン
ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１に選択的に結合し、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の結合又は活性化を阻害する抗原結合領域、例えば、Ｆａｂ断片が、本開示のＢＦＰにおいて有用である。Ｆａｂ（抗原結合断片）断片は、定常領域間のジスルフィド結合により共有結合しているＶＨ−ＣＨ１及びＶＬ−ＣＬドメインからなる。宿主細胞中で共発現された場合に解離するＦｖ中の非共有結合ＶＨ及びＶＬドメインの傾向を克服するため、いわゆる単鎖（ｓｃ）Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を構築することができる。ｓｃＦｖにおいて、フレキシブルで適切に長いポリペプチドは、ＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に、又はＶＬのＣ末端をＶＨのＮ末端に結合させる。一部の実施形態において、本明細書において企図されるリンカーペプチドとしては、ＧＧＧＧＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ペプチド（配列番号４３）の多量体が挙げられるが、他のリンカーも当技術分野において公知であり、本明細書において使用することができる。例えば、考えられるリンカーは、１５残基（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチド（配列番号３４）である。
本開示のＢＤ２抗原結合ドメイン（例えば、抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１に特異的）は、場合により、抗体定常領域又はその一部を含み得る。例えば、ＶＬドメインは、そのＣ末端においてヒトＣκ又はＣλ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインに付着している場合がある。同様に、ＶＨドメインをベースとする特異的抗原結合ドメインは任意の抗体アイソトープ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＭ、並びにアイソトープサブクラス、例として、限定されるものではないが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４のいずれかに由来する免疫グロブリン重鎖の全部又は一部に付着している場合がある。
当業者は、本開示のＢＦＰのＢＤ２抗原結合ドメインは、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１と若干異なるタンパク質を検出、計測及び阻害するために使用することができることを認識する。ＢＤ２抗原結合ドメインは、標的タンパク質が本明細書に記載の連続アミノ酸の少なくとも１００、８０、６０、４０又は２０の任意の配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上同一である配列を含む限り、結合の特異性を保持すると予測される。同一性パーセントは、標準的なアラインメントアルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０に記載のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３のアルゴリズム、又はＭｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７のアルゴリズムなどにより決定される。
配列相同性分析に加えて、エピトープマッピング（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９６参照）並びに二次及び三次構造分析を実施して、開示されたＢＤ２抗原結合ドメイン及び抗原とのそれらの複合体により推定される特異的３Ｄ構造を同定することができる。このような方法としては、限定されるものではないが、Ｘ線結晶構造解析（Ｅｎｇｓｔｏｍ（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，１１：７−１３）及び本出願に開示の抗体の仮想表現のコンピュータモデリング（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）が挙げられる。
企図される抗ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインは、ＰＤ−Ｌ１に選択的であり、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１及びＣＤ８０受容体への結合を遮断する例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）から採取し、又は誘導することができる。デュルバルマブは、インビトロでヒトＴ細胞活性化のＰＤ−Ｌ１媒介抑制を緩和し得、Ｔ細胞依存的機序を介してゼノグラフトモデルにおいて腫瘍成長を阻害する。本明細書に提供される方法における使用のためのデュルバルマブ（又はその断片）に関する情報は、開示が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７９，１０８号明細書及び同第９，４９３，５６５号明細書に見出すことができる。
具体的な態様において、本明細書における使用のためのデュルバルマブの抗原結合断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、本明細書に上記で示されるＫａｂａｔ定義ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域は、本明細書に上記で示されるＫａｂａｔ定義ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む。当業者は、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、Ａｂｍ定義、又は当業者に公知の他のＣＤＲ定義を容易に識別することができる。具体的な態様において、使用のためのデュルバルマブの抗原結合断片は、米国特許第８，７７９，１０８号明細書に開示の２．１４Ｈ９ＯＰＴ抗体の可変重鎖及び可変軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
企図される抗ＰＤ−１抗原結合ドメインは、ＰＤ−１に選択的であり、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２受容体への結合を遮断する例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＬＯ１１５から採取し、又は誘導することができる。
Ｆｃ領域
一部の実施形態において、本開示は、少なくとも１つのアミノ酸改変を有し得るＩｇＧ１又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドを有する二重特異的融合タンパク質を提供する。例えば、アミノ酸は、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスによりナンバリングされる２２８〜２３５から選択される１つ以上の位置において置換されていてよい。例えば、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり得、バリアントアミノ酸は、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスによりナンバリングされる２２８Ｐ（「ＩｇＧ４Ｐ」を生じさせる）、２３５Ｅ、及び２３５Ｙの１つ以上である。別の例として、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（本明細書の他箇所で「ＩｇＧ ＴＭ」と称される）の１つ以上を含み得るバリアントアミノ酸を有するＩｇＧ１ Ｆｃ領域が企図される。本明細書に開示の全てのＩｇＧ４分子は、標識ＩｇＧ４であるかＩｇＧ４Ｐであるかにかかわらず、２２８Ｐ突然変異を含有する。
一実施形態において、本明細書において使用される断片結晶化可能（Ｆｃ）ドメインは、デュルバルマブのものであり、それは抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）の媒介を担う補体成分Ｃ１ｑ及びＦｃγ受容体の結合を低減させるＩｇＧ１重鎖の定常ドメイン中の三重突然変異を含有する。
リンカー
本開示の二重特異的融合タンパク質のサブユニットは、ポリペプチドリンカーにより連結させることができ、それぞれのリンカーは、少なくとも２つのポリペプチド又はサブユニットに融合しており、及び／又はそうでなければ（例えば、ペプチド結合を介して）連結している。二重特異的融合タンパク質中のリンカーの組合せは、ホモ型でもヘテロ型でもよい。一部の実施形態において、本開示の二重特異的融合タンパク質中に存在する全てのペプチドリンカーのアミノ酸配列は、同一である。他の実施形態において、本開示の二重特異的融合タンパク質中に存在するペプチドリンカーの少なくとも２つのアミノ酸配列は、異なる。リンカーポリペプチドは、２つ以上の単量体サブユニットを、それらが所望の活性を保持するようにそれらが互いに対して正確な立体構造を取るように結合させるために適切な長さを有するべきである。ポリペプチドを新規結合融合ポリペプチド中に連結するための天然存在及び人工ペプチドリンカーの使用は、文献において周知である。したがって、２つ以上の単量体サブユニットを融合するリンカーは、天然リンカー、人工リンカー、又はそれらの組合せであり得る。
本明細書に記載のとおり、融合タンパク質サブユニット間の９アミノ酸以上の長さを有するペプチドリンカーが、そのような融合タンパク質の安定性を保持し、及び／又はその過剰な凝集を引き起こさなかったことが見出された。したがって、一部の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、約９〜約２０アミノ酸残基、約９〜約１５アミノ酸残基、又は約９アミノ酸残基を含み得ることが想定される。ポリペプチドリンカー中の包含のために選択されるアミノ酸残基は、本開示の融合タンパク質サブユニットの活性も機能も顕著に干渉しない特性を示すべきである。したがって、ポリペプチドリンカーは、全体的に見ると、本開示の特定の融合タンパク質サブユニットの活性又は機能と不一致の電荷を示すべきでなく、内部フォールディングを干渉すべきでなく、結合を深刻に妨害する単量体サブユニットの１つ以上の中のアミノ酸残基との結合も他の相互作用も形成すべきでもない。
種々の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、立体構造フレキシビリティを有する。好適なフレキシブルリンカーとしては、例えば、Ｇｌｙ及びＳｅｒ残基の組合せ（ＧｌｙとＳｅｒとの比は、≧１である）を有するものが挙げられる。一部の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、本質的に非構造化の天然又は人工ポリペプチドである（例えば、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：１１８６−１１９０，２００９参照；Ｓｉｃｋｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：Ｄ７８６−９３，２００７も参照）。
ある具体的な実施形態において、二重特異的融合タンパク質サブユニット間のリンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号４３）の多量体、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４０）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）であり得る。他の実施形態において、企図されるリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４２）であり得る。
具体的な実施形態
具体的な実施形態において、本明細書に開示の二重特異的融合タンパク質は、単鎖融合タンパク質のペアを含有し、それらはそれぞれＮ末端からＣ末端にかけて、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１ Ｆａｂ断片を含み、それは（ｂ）ＩｇＧ１又はＩｇＧ４Ｐ Ｆｃポリペプチドに共有結合しており、それは（ｃ）第１のペプチドリンカーに共有結合しており、それは第１のＴＮＦスーパーファミリーリガンドサブユニットに共有結合しており、それは第２のペプチドリンカーに共有結合しており、それは第２のＴＮＦスーパーファミリーリガンドサブユニットに共有結合しており、それは第３のペプチドリンカーに共有結合しており、それは第３のＴＮＦスーパーファミリーリガンドサブユニットに共有結合している。
誘導体
本開示のポリペプチド（例えば、抗ＰＤ−１ Ｆａｂ、抗ＰＤ−Ｌ１ Ｆａｂ、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦ−α、又はＣＤ１３７Ｌ）は、それらの標的に特異的に結合する能力を保持することを条件として配列のバリアントを含み得る。このようなバリアントは、当業者により当技術分野において周知の技術を使用してそれらのポリペプチドの配列から誘導することができる。例えば、アミノ酸置換、欠失、又は付加を、抗ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１ Ｆａｂ断片のＦＲ中で及び／又はＣＤＲ中で作製することができる。ＦＲ中の変化は通常、抗原結合ドメインの安定性及び免疫原性を改善するために設計される一方、ＣＤＲ中の変化は典型的には抗原結合ドメインのその標的についての親和性を増加させるために設計される。ＦＲのバリアントとしては、天然存在免疫グロブリンアロタイプも挙げられる。このような親和性を増加させる変化は、ＣＤＲを変更し、抗原結合ドメインのその標的についての親和性を試験することを含む定型的技術によって実験的に測定することができる。例えば、保存的アミノ酸置換は、開示のＣＤＲのいずれか１つの中に作製することができる。種々の変更は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，１９９５に記載の方法に従って作製することができる。これらの変更としては、限定されるものではないが、配列内で機能的に同等のアミノ酸残基をコードし、したがって「サイレント」変化を産生する様々なコドンの置換により変更されるヌクレオチド配列が挙げられる。例えば、非極性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが挙げられる。極性天然アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられる。正荷電（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられる。負荷電（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。
本開示のポリペプチド及び／又は抗体の誘導体及びアナログは、当分野において周知の種々の技術、例として、組換え法及び合成法（Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、及びＢｏｄａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により産生することができる。
一実施形態において、本開示のＶＨドメインのアミノ酸配列バリアントであるＶＨドメインを作製する方法は、本明細書に開示のＶＨドメインのアミノ酸配列中で１つ以上のアミノ酸を付加し、欠失させ、置換し、又は挿入するステップ、場合により、このように提供されたＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと組み合わせるステップ、及びＶＨドメイン又はＶＨ／ＶＬの１つ若しくは複数の組合せを抗原への特異的結合について試験するステップを含む。本明細書に開示のＶＬドメインの１つ以上の配列バリアントを１つ以上のＶＨドメインと組み合わせる類似の方法を用いることができる。
類似のシャッフリング又はコンビナトリアル技術もＳｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７０：３８９−３９１）により開示されており、その著者はβ−ラクタマーゼ遺伝子に関連する技術について記載しているが、そのアプローチは抗体の生成に使用することができることを観察している。
さらなる実施形態において、１つ以上の選択されたＶＨ及び／又はＶＬ遺伝子のランダム突然変異誘発を使用して本明細書に開示の配列に由来する１つ以上の配列を担持する新規なＶＨ又はＶＬ領域を生成することができる。１つのそのような技術であるエラープローンＰＣＲは、Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９２）８９：３５７６−３５８０）により記載されている。
使用することができる別の方法は、ＶＨ又はＶＬ遺伝子のＣＤＲに突然変異誘発を指向することである。このような技術は、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９４）９１：３８０９−３８１３）及びＳｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）２６３：５５１−５６７）により開示されている。
同様に、１つ、２つ又は３つ全てのＣＤＲの抗体結合ドメインは、ＶＨ又はＶＬドメインのレパートリーにグラフトすることができ、これらは次いでＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１について特異的な抗原結合断片についてスクリーニングされる。
本明細書で有用な免疫グロブリン可変ドメインの一部は、本明細書に実質的に記載のＣＤＲの少なくとも１つ、及び場合により、本明細書に記載のｓｃＦｖ断片からの介在フレームワーク領域を含み得る。この一部はＦＲ１及びＦＲ４のいずれか又は両方の少なくとも約５０％を含み得、その５０％はＦＲ１のＣ末端５０％及びＦＲ４のＮ末端５０％である。可変ドメインの実質的部分のＮ末端又はＣ末端における追加の残基は、通常、天然存在可変ドメイン領域に関連しない残基であり得る。例えば、組換えＤＮＡ技術による抗体の構築は、クローニング又は他の操作ステップを容易にするために導入されたリンカーによりコードされるＮ末端又はＣ末端残基の導入をもたらし得る。他の操作ステップとしては、免疫グロブリン重鎖定常領域、他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディの産生における）又は下記でより詳細に考察されるタンパク性標識を含むさらなるタンパク質配列に可変ドメインを結合させるためのリンカーの導入が挙げられる。
本明細書に記載の本開示の抗体結合ドメイン（例えば、抗ＰＤ−１及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１）は、別の機能的分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質（アルブミン、別の抗体など）に結合させることができる。例えば、抗体結合ドメインは、化学的架橋結合により、又は組換え法により結合させることができる。抗体結合ドメインは、種々の非タンパク性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの１つに、米国特許第４，６４０，８３５号明細書；同第４，４９６，６８９号明細書；同第４，３０１，１４４号明細書；同第４，６７０，４１７号明細書；同第４，７９１，１９２号明細書；又は同第４，１７９，３３７号明細書に記載の様式で結合させることもできる。抗体結合ドメインは、例えば、それらの循環半減期を増加させるためにポリマーへの共有結合コンジュゲーションにより化学的に修飾することができる。例示的なポリマー及びそれらに付着させる方法は、米国特許第４，７６６，１０６号明細書；同第４，１７９，３３７号明細書；同第４，４９５，２８５号明細書及び同第４，６０９，５４６号明細書にも示されている。
本明細書に開示の抗体断片は、天然パターンと異なるグリコシル化パターンを有するように変更することもできる。例えば、１つ以上の炭水化物部分を欠失させることができ、及び／又は１つ以上のグリコシル化部位を付加することができる。本明細書に開示の抗体断片へのグリコシル化部位の付加は、当分野において公知のグリコシル化部位コンセンサス配列を含有するようにアミノ酸配列を変更することにより達成することができる。抗体断片上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、抗体のアミノ酸残基へのグリコシドの化学的又は酵素的カップリングによるものである。このような方法は、国際公開第８７／０５３３０号パンフレット、及びＡｐｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：２５９−３０６に記載されている。抗体からの任意の炭水化物部分の除去は、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２；及びＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１並びにＴｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０により記載されているとおり化学的又は酵素的に達成することができる。抗体断片は、検出可能、又は機能的標識によりタグ付けすることもできる。検出可能標識としては、慣用の化学反応を使用してさらに抗体断片に付着させることもできる放射性標識、例えば、１３１Ｉ又は９９Ｔｃが挙げられる。検出可能標識としては、酵素標識、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼも挙げられる。検出可能な標識としては、化学的部分、例えば、特異的コグネート検出可能部分、例えば、標識アビジンへの結合を介して検出することができるビオチンがさらに挙げられる。
ＣＤＲ配列が本明細書に記載のＣＤＲ配列とごくわずかにのみ異なる抗体結合ドメインは、本開示の範囲内に包含される。典型的には、アミノ酸は、類似の電荷、疎水性、又は立体化学的特徴を有する関連アミノ酸により置換される。このような置換は、当業者の通常の技能の範囲内である。ＣＤＲとは異なり、ＦＲには抗体の結合特性に有害な影響を及ぼすことなくより実質的な変化を作製することができる。ＦＲへの変化としては、限定されるものではないが、非ヒト由来物のヒト化又は抗原接触若しくは結合部位の安定化に重要なあるフレームワーク残基の遺伝子操作、例えば、定常領域のクラス又はサブクラスの変化、例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書及び同第５，６４８，２６０号明細書並びにＬｕｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４７：２６５７−２６６２及びＭｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６：３１９−３２４に記載のとおり、エフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体結合を変更させ得る規定のアミノ酸残基の変化、又は定常領域が由来する種の変化が挙げられる。
当業者は、上記の改変が全く排他的ではなく、本明細書に記載のタンパク質サブユニットに適用することができること、及び多くの他の改変が本開示の教示に照らして当業者に想起されることを認識する。
二重特異的融合タンパク質産生
本開示の実施は、特に示されない限り、当業者の知識範囲内に明確に含まれる分子生物学（例として、組換え技術）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の技術を用いる。このような技術は、文献、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ，１９９６）；“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）に十分に説明されている。これらの技術は、本開示のポリペプチドの産生に適用可能であり、したがって、本開示の作製及び実施において考慮することができる。特定の実施形態に特に有用な技術を実施例において考察する。
二重特異的融合タンパク質特性及び活性のアッセイ
単離された、又は多量体の一部としての本開示の二重特異的融合タンパク質サブユニットの安定性は、当技術分野において周知の技術、例えば、熱（Ｔｍ）及びカオトロピック変性（例えば、尿素、又はグアニジン塩による処理）、プロテアーゼ処理（例えば、サーモリシンによる処理）又はタンパク質安定性を決定する別の当技術分野において承認された方法により容易に計測することができる。タンパク質安定性を計測するために使用される技術の包括的概説は、例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”及び“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ”ｂｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ．２００７に見出すことができる。
本開示による二重特異的融合タンパク質の結合親和性及び他の結合特性は、当技術分野において公知の種々のインビトロアッセイ法、例として、例えば、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又はカイネティクス（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析）、並びに他の方法、例えば、間接的結合アッセイ、競合結合アッセイ、ゲル電気泳動、及びクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）により決定することができる。これらの及び他の方法は、試験されている構成成分の１つ以上の上の標識を利用し、及び／又は種々の検出法、例として、限定されるものではないが、発色、蛍光、発光、若しくは同位体標識を用い得る。結合親和性及びカイネティクスの詳細な説明は、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，ｅｄ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９）に見出すことができる。
二重特異的融合タンパク質の機能又は活性を決定する追加のインビトロ及びインビボ法は、本明細書に記載される。これらのアッセイを使用して免疫応答の１つ以上（例えば、Ｔ細胞機能及び記憶、Ｂ細胞活性化又は増殖、樹状細胞成熟又は活性化、Ｔｈ１サイトカイン又はケモカイン応答、単球由来マクロファージＭ１／Ｍ２極性化、抗原提示及び／又は腫瘍微小環境の免疫抑制の１つ以上）を決定することができる。インビボでは、抗癌又は抗腫瘍活性をアッセイするための種々の動物モデル、例として、例えば、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍マウスモデルが当技術分野において公知である。薬力学及び薬物動態特性を評価する追加の方法も周知である。
抗腫瘍療法
本開示はまた、二重特異的融合タンパク質、例えば、上記のものを含む癌の治療に有用な組成物及び方法を特徴とする。種々の実施形態において、二重特異的融合タンパク質は、癌に対する免疫細胞応答を増大させる１つ又は複数の他の抗癌薬との組合せで投与することができる。
本明細書において、１つ以上の二重特異的融合タンパク質、例えば、図１〜４に示されるものの投与を含む、癌を治療する方法がさらに提供される。本明細書に示されるとおり、二重特異的融合タンパク質の投与は、例えば、マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍容積の低減をもたらし得る。ある態様において、固形腫瘍を呈する患者に二重特異的融合タンパク質を投与する。
二重特異的融合タンパク質を含む癌療法による治療は、例えば、癌の進行速度の低減、腫瘍成長の遅滞若しくは安定化、腫瘍の縮小、及び／又は腫瘍退縮を引き起こす。一部の態様において、腫瘍成長の低減又は遅滞は、統計的に有意であり得る。腫瘍成長の低減は、ベースラインにおける患者の腫瘍の成長との比較、予測腫瘍成長に対する比較、大患者集団に基づく予測腫瘍成長に対する比較、又は対照集団の腫瘍成長に対する比較により計測することができる。
他の実施形態において、本開示の方法は、癌生存率を増加させ、寿命を延長させる。例えば、本明細書に開示のデータは、癌治療のためのＢＦＰ分子の有効性だけでなく、ＢＦＰ（ＭＥＤＩ７５２６）の使用がその親試薬の組合せ（デュルバルマブ＋ＭＥＤＩ５０８３）による処理よりも低い毒性をもたらすことを実証する。したがって、癌治療のためのＢＦＰ分子の使用は、より低い毒性で有効な抗癌応答を達成し、患者の健康全般を改善し得る。換言すると、本明細書に開示の二重特異的融合タンパク質の使用は、単剤療法単独について達成不可能な治療結果を提供し得る。
癌療法の施与に対する臨床応答は、臨床医に公知の診断技術、例として、限定されるものではないが、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャン、ｘ線イメージング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、フローサイトメトリー、又は蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析、組織診、肉眼所見、並びに血液化学検査、例として、限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及びクロマトグラフィーにより検出可能な変化を使用して評価することができる。
以下の実施例は、本開示のアッセイ、スクリーニング、及び治療方法の作製方法及び使用方法についての完全な開示及び説明を当業者に提供するように提示するものであり、本発明者らが本開示とみなすものの範囲を限定するものではない。
本開示を目下、以下の実施例を参照して記載する。これらの実施例は、説明的なものにすぎず、本開示は決してそれらの実施例に限定されるものと解釈すべきでなく、本明細書において提供される教示の結果として明らかになる任意の及び全ての変法を包含するものと解釈すべきである。
実施例１
二重特異的融合タンパク質の生成
以下の実施例において試験される二重特異的融合タンパク質は、ペプチドリンカーを介してＦａｂ断片に結合しているＦｃ単量体に結合している３つのリガンドサブユニット（主にＴＮＦホモロジードメインに対応する）の単鎖融合タンパク質（ｓｃｆｐ）構築物を使用して構築した（図１〜４参照）。ｓｃｆｐは、二量体化してＢＦＰを形成した。ＢＦＰに使用された配列を以下に記載する。
実施例２
Ｏｃｔｅｔ結合アッセイ
本明細書に開示の二重特異的結合分子の結合を評価するため、Ｎｉ−ＮＴＡバイオセンサーチップを備えるＯｃｔｅｔ ＱＫ及び１０×カイネティクス緩衝液を使用した（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）。この系列の二重特異的結合タンパク質のため、Ｈｉｓタグ化ＰＤ−Ｌ１−ｈｉｓをインハウスで作製し、ＣＤ４０−Ｆｃタンパク質をＳｉｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）から購入し、実験室中でビオチン化した。全ての結合アッセイを２５℃において実施した。
試料プレートを１０００ｒｐｍにおいて分析前に撹拌した。１×カイネティック緩衝液を使用前にストレプトアビジン及びＮｉ−ＮＴＡバイオセンサーチップに１０分間アプライした。１×カイネティック緩衝液は、ベースライン決定のためのランニング緩衝液として、並びに抗原及び二重特異的抗体のための希釈緩衝液としても機能した。ストレプトアビジン又はＮｉ−ＮＴＡバイオセンサーチップを２０ｎＭのＣＤ４０−ビオチン（図５Ａ及び５Ｂ）又はｈｉｓタグ化ＰＤ−Ｌ１（図５Ｃ及び５Ｄ）中に抗原捕捉のために５分間浸漬させ、カイネティック緩衝液中で３０秒間リンスした。抗原コートバイオセンサーチップをそれぞれ１０μｇ／ｍｌの二重特異的抗体中に５分間浸漬させ、リンスし、次いで１００ｎＭのＰＤ−Ｌ１ Ｆｃ抗原（図５Ａ及び５Ｂ）又は１００ｎＭのＣＤ４０−Ｆｃ（図５Ｃ及び５Ｄ）を含有するウェルのカラム中に５分間移した。このアッセイにおいて、ＢＦＰ分子が第１の抗原（ＣＤ４０又はＰＤ−Ｌ１）を飽和させた場合、第２の抗原（ＰＤ−Ｌ１又はＣＤ４０）をインジェクトし、予測のとおり、第２の結合シグナルが観察された。この観察は、抗原インジェクションの順序を逆にした場合に再現可能であり、ＢＦＰ分子が２つの標的に同時に結合し得ることを示した。
実施例３
細胞表面抗原結合の評価
フローサイトメトリーを使用してＢＦＰによる細胞表面抗原結合を評価した。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７モノクローナル抗体標識キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して抗ＰＤ−Ｌ１＋ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ２及びＢＦＰ３（ＭＥＤＩ７５２６；表１参照）、ＣＤ４０Ｌ ＦＰ６（ＭＥＤＩ５０８３）、及び抗ＰＤＬ１（ＭＥＤＩ４７３６）（全てヒトＩｇＧ４アイソタイプ中）を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートさせた。ＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体も同一のプロトコルに従ってコンジュゲートさせた。全ての得られたコンジュゲート抗体は、類似の色素と抗体との比を有した。結合アッセイにおいて、Ａｌｅｘａ ６４７コンジュゲート抗体をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳと３％のウシ胎児血清）中で段階希釈し、４０ｎＭ〜１９．５３２ｐＭの最終濃度をもたらし、１０，０００個のＣＤ４０形質移入ＨＥＫ２９３細胞（図６Ａ）又はＲａｍｏｓヒトＢ細胞（図６Ｂ）と混合した。ＣＤ４０形質移入２９３及びＲａｍｏｓ細胞は両方ともＣＤ４０を発現するが、ＰＤ−Ｌ１を発現しない。４℃における１時間のインキュベーション後、細胞をスピンダウンし、上清中の遊離抗体を除去した。結合抗体を有する細胞を洗浄し、フローサイトメトリーに流した。蛍光シグナルをサイトメトリー装置により検出及び記録し、Ｆｌｏｗｊｏ（登録商標）ソフトウェアを使用して標的細胞上のＡｌｅｘａ ６４７の平均蛍光強度を決定した。図６Ａ及び図６Ｂのグラフは、ＢＦＰ２及びＢＦＰ３が親ＭＥＤＩ５０８３と類似のＣＤ４０への結合を有する一方、抗ＰＤ−Ｌ１（ＭＥＤ４７３６）及びアイソタイプ対照抗体が結合しなかったことを示す。
次に、ＰＤ−Ｌ１形質移入ＨＥＫ２９３細胞及びＥＳ２ヒト卵巣癌細胞系上のヒトＰＤ−Ｌ１への結合を評価した。細胞系は両方ともＰＤ−Ｌ１を発現したが、ＣＤ４０を発現しなかった。Ａｌｅｘａ ６４７コンジュゲート抗体をＦＡＣＳ緩衝液中で希釈し、１０，０００個のＰＤ−Ｌ１形質移入ＨＥＫ２９３細胞と混合した。４℃における１時間のインキュベーション後、細胞をスピンダウンし、上清中の遊離抗体を除去した。結合抗体を有する細胞を洗浄し、フローサイトメトリーに流した。蛍光シグナルをサイトメトリー装置により検出及び記録し、Ｆｌｏｗｊｏ（登録商標）ソフトウェアを使用して標的細胞上のＡｌｅｘａ ６４７の平均蛍光強度を決定した。図７Ａ及び図７Ｂのグラフは、ＢＦＰ２及びＢＦＰ３の両方が細胞表面ＰＤ−Ｌ１に結合するが、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１ ＴＭアイソタイプを有するＭＥＤＩ４７３６よりも最大結合が低く、ＥＣ５０が高いことを示す。ＣＤ４０Ｌ ＦＰ及びアイソタイプ対照抗体は、予測のとおり、このアッセイにおいてＰＤ−Ｌ１に結合しなかった。
抗ＰＤ−Ｌ１＋ＣＤ４０Ｌ ＦＰ、ＢＦＰ２及び３を、ヒトＰＢＭＣへの結合について評価した。ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１の発現は炎症条件下でＰＢＭＣ上で増加するため、本発明者らは、プールされたナイーブ及びＩＦＮ−γ刺激ＰＢＭＣ上の結合を評価した。この試験において、ＰＢＭＣを健常ドナーから単離し、多（１００ｎＭ）又は少（１０ｎＭ）量のいずれかのカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）により標識した。１００ｎＭのＣＦＳＥを有するＰＢＭＣを２４時間処理なしで培養し、１０ｎＭのＣＦＳＥにより標識されたＰＢＭＣを同一条件下で培養したが、１ｎＭのヒトＩＦＮ−γにより一晩刺激してＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１発現を上方調節した。したがって、ＩＦＮ−γ処理あり又はなしの細胞を、異なるレベルのＣＦＳＥシグナルに基づき区別することができる。多量及び少量のＣＦＳＥ標識を有する全てのＰＢＭＣを翌日混合し、Ｂ細胞についての抗ＣＤ１９、Ｔ細胞についてのＣＤ３、及び単球についてのＣＤ１４により染色した。抗ＰＤ−Ｌ１−ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ分子のＰＢＭＣサブセットへの結合は、ＣＤ４０Ｌ ＦＰ（ＭＥＤＩ５０８３）及び抗ＰＤＬ１（ＭＥＤＩ４７３６ ＩｇＧ１ ＴＭ）と比較したフローサイトメトリーにより明らかにした。図８に示されるとおり、ＢＦＰタンパク質の両方のフォーマットは、類似の結合活性及び効能を示した。ＩＦＮ−γ処理単球はほとんどのＢＦＰ分子に結合し、次いでナイーブ単球並びにＴ及びＢ細胞に結合した。これらの結果も、ＰＢＭＣ上でＢＦＰ分子が抗ＰＤＬ１及びＣＤ４０Ｌ ＦＰ（ＭＥＤＩ５０８３）と類似の結合プロファイルを有することを示す。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７モノクローナル抗体標識キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してＰＤ１−ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ１−ＯＸ４０Ｌ ２ＷＴ及びＰＤ１−ＯＸ４０Ｌ １ＷＴ（全てヒトＩｇＧ４アイソタイプ）を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートさせた。上記のプロトコルを使用してＪｕｒｋａｔ／ＯＸ４０−ＧＩＴＲ−ＦＰ２細胞（図７１Ａ）及び活性化ヒトプライマリーＴ細胞（図７２）への結合を試験した。
実施例４
抗ＰＤＬ１−ＣＤ４０Ｌ ＦＰ、ＢＦＰ２及び３は、ＣＤ４０経路を刺激し、ＰＤ１−ＰＤＬ１相互作用を遮断する能力を有する。
ＮＦ−κＢ活性化経路は、ＣＤ４０活性化を介して誘発される。
ＨｕＣＤ４０／ＨＥＫ２９３／ＮＦ−κＢ細胞（クローン３）を、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）＋１０％の熱不活化ＦＢＳ（ＨＩ−ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ）及び１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ＧＩＢＣＯ）中で維持した。１日目、細胞を回収し、２％のＨＩ ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中で５×１０５個／ｍＬにおいて再懸濁させた。ウェル当たり１００マイクロリットルの細胞をＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔポリ−Ｄ−リジン９６ウェル黒色／透明マイクロタイタープレート（カタログ番号３５６６４０）中で播種した。細胞を３７℃のインキュベーター中に２４時間配置した。インキュベーション後、培地をプレートから吸引した。１００マイクロリットルの１×試験材料を慎重にそれぞれのウェルに添加し、細胞の剥離を最小化するように留意した。細胞を３７℃のインキュベーターに２４時間戻した。ルシフェラーゼ試薬（Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質；Ｐｒｏｍｅｇａ）を調製し、室温に平衡化させておき、それぞれのウェルに添加した（１００μＬ）。細胞及び試薬を十分に混合して完全な細胞溶解を確保し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダー上で直ちに読み取った。図９は、ＢＦＰ分子が複数の細胞タイプ、例として、ＣＤ４０形質移入２９３細胞（Ａ）、Ｒａｍｏｓ細胞（ｂ）及びＴＨＰ−１細胞（Ｃ）上のＮＦ−κＢシグナルを活性化させたことを実証する。
Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ生物活性アッセイプロトコル
Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ ＮＦ−κＢ／ＡＰ−１レポーター細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）をＩＭＤＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ）＋１０％のＨＩ−ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ＧＩＢＣＯ）及びＺｅｏｃｉｎ（１００μｇ／ｍＬ；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）培地中で維持した。細胞は非接着性であり、培養を５×１０５個の細胞／ｍＬにおいて開始し、３×１０６個の細胞／ｍＬ未満で保持した。実験前日、細胞をＩＭＤＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１０％のＨＩ−ＦＢＳ及びｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（Ｚｅｏｃｉｎ不含）培地中に分けた。細胞を回収し、１×１０６個の細胞／ｍＬに調整し、平底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに添加した（１８０μＬ）。Ｚｅｏｃｉｎ不含培地中の２０マイクロリットルの１０×試験材料をそれぞれのウェルに添加し、細胞を３７℃のインキュベーター中に２４時間配置した。ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ試薬（１００ｍＬの滅菌水中で溶解させた１パウチ；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を調製し、平底９６ウェルプレートに１６０μＬ／ウェルにおいて添加した。Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞からの上清（４０μＬ）を、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅを含有するウェルに添加した。プレートを３７℃のインキュベーター中に１時間まで配置し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５分光光度計上で６５５ｎｍにおいて読み取った。
ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ生物活性アッセイプロトコル
ＴＨＰ１−ｂｌｕｅ ＮＦ−κＢレポーター細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を、ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）＋１０％のＨＩ−ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、１％のＰｅｎ Ｓｔｒｅｐ（ＧＩＢＣＯ）及びブラスチシジン（１０μｇ／ｍＬ；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）培地中で維持した。細胞は非接着性であり、培養を７×１０５個の細胞／ｍＬにおいて開始し、２×１０６個の細胞／ｍＬ未満で保持した。実験前日、細胞をＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＨＩ−ＦＢＳ及びｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（ブラスチシジン不含）培地中に分けた。細胞を回収し、１×１０６個の細胞／ｍＬに調整し、平底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに添加した（１８０μＬ）。ブラスチシジン不含培地中の２０マイクロリットルの１０倍試験材料（段階希釈済）をそれぞれのウェルに添加し、細胞を３７℃のインキュベーター中に２４時間配置した。ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ試薬（１００ｍＬの滅菌水中に溶解させた１パウチ；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を調製し、平底９６ウェルプレートに１６０μＬ／ウェルにおいて添加した。ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ細胞からの上清（４０μＬ）を、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅを含有するウェルに添加した。プレートを３７℃のインキュベーター中に６時間配置し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５分光光度計上で６５５ｎｍにおいて読み取った。結果を図９に示す。
実施例５
ＰＤ−Ｌ１媒介阻害の減衰
この実施例において、抗ＰＤ−Ｌ１−ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰ分子を試験してそれらがＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断生物アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）において抗ＰＤ−Ｌ１と生物学的に等価であるか否かを決定した。最初に、ＣＨＯ ＰＤ−Ｌ１細胞の１つのバイアルを解凍し、１０％のＦＢＳを有する１４．５ｍｌのハムＦ１２培地中で再懸濁させた。細胞を９６ウェル白色底アッセイプレートにウェル当たり１００μＬにおいて添加した。プレートを３７℃のインキュベーターにおいて一晩（１６〜２０時間）インキュベートした。翌日、プレートをインキュベーターから取り出し、培地を慎重に除去した。アッセイ緩衝液（１％のＦＢＳを有するＲＰＭＩ１６４０）中の４０μＬの試験材料（２×）をプレートのそれぞれのウェルに添加した。次に、Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ１エフェクター細胞の１つのバイアルを解凍し、５．９ｍＬのアッセイ緩衝液中で再懸濁させた。次いで、４０μＬのＪｕｒｋａｔ ＰＤ１細胞をプレートのそれぞれのウェルに添加した。プレートを３７℃のインキュベーターにおいて６時間配置した。ルシフェラーゼ試薬（Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質；Ｐｒｏｍｅｇａ）を調製し、室温に平衡化させておき、それぞれのウェルに添加した（８０μＬ）。プレートを室温において５分間配置し、次いで直ちにＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５プレートリーダー上で読み取った。ＭＥＤＩ７５２６はＰＤ−Ｌ１機能を阻害し、このアッセイにおいてＮＦＡＴ活性の用量依存的増加をもたらした。ＭＥＤＩ７５２６のＥＣ５０は、ＭＥＤＩ４７３６ ＩｇＧ４分子と同等である。図１０は、抗ＰＤ−Ｌ１−ＣＤ４０Ｌ ＦＰ ＢＦＰがＰＤ−Ｌ１媒介阻害機能を減衰させたことを実証する。
実施例６
ＢＦＰ共活性化アッセイ
ロバストなレポーターベースＴＨＰ−１単球及びＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞共活性化アッセイにおいてＢＦＰ分子機能をさらに評価した。このアッセイにおいて、ＮＦ−κＢ−ＳＥＡＰレポーター遺伝子（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）が形質移入されたＴＨＰ−１細胞をウェル当たり４００，０００個において播種し、ＩＦＮ−γにより一晩刺激してそれらの細胞上のＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１発現を上方調節した。ＩＦＮ−γ刺激は、ＴＨＰ−１細胞上のＮＦ−κＢ活性化を誘導しない。アッセイの概念的模式図を図１１Ａに示す。
アッセイ前日の夜、白色９６ウェルプレートを抗ヒトＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によりコーティングした。アッセイ当日、ＴＨＰ−１細胞を洗浄し、ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）が形質移入されたウェル当たり１００，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞と混合し、段階希釈された試験試薬を添加した。アッセイプレートを３７℃において６時間インキュベートした。次いで、細胞をスピンダウンし、４０μＬの培養培地をそれぞれのウェルから新たな９６ウェルプレートの対応するウェルに移し、−８０℃において貯蔵した。
培養培地中に存在するＳＥＡＰ活性を決定するため、冷凍細胞培養培地を有するプレートを室温において解凍し、３７℃においてＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ溶液と混合した。１５分間のインキュベーション後、アッセイＳＥＡＰ活性をマイクロプレートリーダーにより計測した。ＮＦ−κＢ活性を計測するため、細胞を１×溶解試薬と混合し、細胞溶解物を８０μＬのＢｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。プレートを周囲温度において５分間インキュベートし、発光強度をプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５中で計測した。図１１Ｂに示されるとおり、抗ＰＤＬ１−ＣＤ４０Ｌ ＢＦＰ分子はＴＨＰ１細胞中でＮＦ−κＢを活性化させ、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞中でＮＦＡＴ活性を増加させ、ＢＦＰ分子が混合免疫細胞上で複数の機能を実行し得ることを実証した。
実施例７
ＭＥＤＩ７５２６はプライマリーヒト細胞を活性化させ、サイトカインの産生を誘導する。
この試験において、プライマリー細胞中でサイトカイン産生を誘導するＭＥＤＩ７５２６の能力を試験した。
ブドウ球菌エンテロトキシン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ｂ（ＳＥＢ）アッセイプロトコル
ＩＬ−２免疫応答に対するＢＦＰ分子の効果を決定するためのＳＥＢアッセイプロトコルにおいて使用される試薬は、白血球コーン（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｃｏｎｅ）（ＮＨＳＢＴコードＮＣ２４；Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ製）；５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ（ＢＤ３５２０７０）；Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７−１４４０−０２）；抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３；１ｍｇ／ｍｌ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；カタログ番号１６−００３７−８５）；塩化アンモニウム溶液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ０７８５０）；ブドウ球菌エンテロトキシン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ｂ（ＳＥＢ；Ｓｉｇｍａ，Ｓ−４８８１）原液、１ｍｇ／ｍＬ、−２０℃において貯蔵；培養培地（全てＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）：１０％ｖ／ｖの熱不活化ＦＣＳ（９０００５Ｍ）及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン＋１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（１５１４０−１２２）が補給されたＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（６１８７０）を有するＲＰＭＩ１６４０；Ｖ字底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯｎｅ ６５１２０１）；９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ７１０７）を含む。
ＩＬ−２ ＤＥＬＦＩＡ ＥＬＩＳＡのための試薬は、ＦＬＵＯＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ ４３７９５８）；ユーロピウム標識ストレプトアビジン、ＳＡ−Ｅｕ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ １２４４−３６０）；ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）アッセイ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，＃４００２−００１０）；ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）向上溶液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ４００１−００１０）；ＲＴ、使用前；アッセイ希釈剤：０．１％のＢＳＡが補給されたＤＥＬＦＩＡ洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ７．２〜７．４）、滅菌濾過；ミルク粉末（Ｍａｒｖｅｌ；Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｆｏｏｄｓ）；試料希釈剤（上記のＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＣＳ＋１％のペニシリン／ストレプトマイシン）；ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １４１９０２３５）；ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ中０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０）；ヒトＩＬ−２ ＥＬＩＳＡキット（Ｄｕｏｓｅｔ ＤＹ２０２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；自動化プレートローダーを有するＢｉｏｔｅｋプレートワッシャー（ＥＬ４０６）（Ｂｉｏｓｔａｃｋ）を含む。
一般アッセイプロトコル
密度勾配遠心（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＰＢＭＣをヒト血液白血球コーン（ＮＨＳ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ＳｅｒｖｉｃｅコードＮＣ２４）から単離し、次いで赤血球を塩化アンモニウム溶液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で溶解させた。抗ヒトＣＤ３（ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬのクローンＯＫＴ３；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を平底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ７１０７）中で３７℃において２時間コーティングした。次いで、ウェル当たり２×１０５個の細胞のＰＢＭＣを、培養培地（１０％ｖ／ｖの熱不活化ウシ血清及び１ｍＬ当たり１００Ｕ／１００μｇのストレプトマイシン／ペニシリン（それぞれ）が補給されたＲＰＭＩ１６４０−ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で添加した。ＰＢＭＣをＳＥＢ最終濃度１μｇ／ｍＬの添加によりさらに刺激し、候補ＢＦＰ分子を段階希釈し、最終試験濃度まで添加した。３７℃及び５％のＣＯ２における３日間の培養後、上清を細胞から取り出し、市販のＥＬＩＳＡを製造業者の説明書（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って使用してＩＬ−２分泌を決定した。
図１２に示される結果は、ＭＥＤＩ７５２６（ＢＦＰ３）がＳＥＢアッセイにおいて最大レベルのＩＬ−２産生を誘導し、ＥＣ５０が５９．８ｐＭであることを実証する。
実施例８
ＭＥＤＩ７５２６はプライマリーヒト細胞を活性化させ、サイトカインの産生を誘導する。
この試験において、プライマリー細胞中でサイトカイン産生を誘導するＭＥＤＩ３３８７及びＭＥＤＩ５７７１の能力を試験した。
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７−１４４０−０２）を製造業者の推奨プロトコルに従って使用してＰＢＭＣを白血球コーン（ＮＨＳＢＴ，Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌにより供給）から調製した。ＰＢＭＣを培養培地（１０％の熱不活化ＦＣＳ［Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ９０００５Ｍ］及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンが補給されたｇｌｕｔａｍａｘ［Ｇｉｂｃｏ］を有するＲＰＭＩ１６４０）中で再懸濁させ、抗ヒトＣＤ３抗体により事前にコーティング（コーティングは、０．５μｇ／ｍＬのＯＫＴ３［Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ１６−００３７−８５］を含有する２２５μＬのＰＢＳをそれぞれのウェルに添加し、使用前に３７℃において２時間インキュベートすることにより実施した）された９６ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ７１０７）に移した。反応物はウェル当たり２２５μＬの最終容量を有し、２Ｅ５個の細胞を含有し、それに試験薬物又は対照ｍＡｂと一緒にブドウ球菌エンテロトキシン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ｂ（０．１μｇ／ｍＬの濃度）を補給した。反応物を３７℃、５％のＣＯ２において７２時間インキュベートし、その後に上清を取り出し、続いてＩＬ−２放出についてＥＬＩＳＡにより試験した。結果を図１３に示す。
実施例９
ＭＥＤＩ７５２６ ＭＬＲアッセイ
ＭＥＤＩ７５２６によるマクロファージ中のＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２産生の誘導を、ＭＬＲアッセイを使用して評価した。
一般アッセイプロトコル：
単球由来Ｍ１マクロファージの培養：ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ１４陽性選択キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）を使用して単球を１人のドナーから単離し、ＣｅｌｌＸＶｉｖｏヒトＭ１マクロファージ分化キット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＭ１マクロファージを生成した。このアッセイにおいて、４０００万個の単球を２つのＴ７５フラスコ中に分けた。３及び６日目に培地の半量をそれぞれのフラスコから除去し、ＧＭ−ＣＳＦが補給された新鮮培地と交換した。６日目、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）細胞解離試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して分化したマクロファージを回収し、細胞を１５００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離した。次に、上清を除去し、細胞を完全ＲＰＭＩ １６４０培地中に１２万５千個／ｍｌにおいて入れた。次に、８０μＬ／ウェルのマクロファージを９６ウェルＵ字底プレートに添加し、ウェル当たり２０μＬの試験抗体（最終濃度の１０倍）を添加した。次に、１００μＬ／ウェルの別のドナーから単離された総Ｔ細胞（１００万個／ｍＬ）を９６ウェルＵ字底プレートに添加した。プレートを３７℃においてＣＯ２インキュベーター中で５日間インキュベートした。上清を回収し、上清中のサイトカインのレベルをヒトＴｈ１／Ｔｈ２ １０プレックスキット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）により計測した。
図１４は、ＭＥＤＩ７５２６（ＢＦＰ３）が３つのマクロファージ−Ｔ細胞ＭＬＲ反応でＩＦＮ−γの産生を誘導したことを示す。
実施例１０
混合白血球反応（ＭＬＲ）アッセイプロトコル（新鮮血液）
実施例９に記載のＭＬＲ細胞ベースアッセイを同様に使用して本明細書に開示のＢＦＰ分子に応答するＴ細胞機能のインビトロ相関を提供した。
一般アッセイプロトコル
あるドナーのＰＢＭＣから単球を、及び別のドナーからＴ細胞を単離した。単球及びＴ細胞の両方を完全ＲＰＭＩ培地中で１：１の比において懸濁させ、試験試薬とインキュベートした。プレートを３７℃において５日間インキュベートした。最終日、プレートを３００ｇにおいて５分間遠心分離し、上清を回収した。上清中のサイトカインをヒトＴｈ１／Ｔｈ２ １０プレックスキット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）により計測した。
図１５は、ＭＥＤＩ７５２６（ＢＦＰ３）が単球−Ｔ細胞ＭＬＲ反応の４つのペアでＩＦＮ−γの産生を誘導したことを示し、ＭＥＤＩ７５２６がＴ細胞媒介免疫応答をブーストし得ることを示唆する。
実施例１１
ＣＭＶリコールアッセイ
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原リコールアッセイを使用して本明細書に記載のある免疫治療分子により誘導される潜在的な免疫応答を評価した。ＣＭＶ陽性ドナーにおけるＣＤ８＋ Ｔ細胞による組換えヒトＣＭＶ ｐｐ６５タンパク質（ＣＭＶ ｐｐ６５）に応答するＩＦＮ−γ分泌の誘導は、免疫記憶リコール応答と称される。ある癌は、それらの受容体の発現を介してこの抑制を向上させ、それらの免疫チェックポイントの治療的妨害における利益をもたらし得る。抗体組合せ、二重特異的試薬の使用及びＦｃ構成成分タイプの変更の潜在的な利益が存在する。
この実験において、既知ＣＭＶ陽性ドナーからのＨＬＡ−Ａ０２型ＰＢＭＣをＢＦＰ分子の存在下でＨＬＡ−Ａ０２制限ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチド（４９５〜５０３）に曝露させた。４日後、ＩＦＮ−γ分泌をＭＳＤにより決定した。使用された一般試薬を表２に示す。
Figure 2021502360
ＣＭＶリコールアッセイプロトコル（Ａｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅハイブリッド）：
ＣＭＶ陽性ヒトＰＢＭＣを解凍し、ＸＶＩＶＯ−１５により洗浄し、カウントし、ＸＶＩＶＯ−１５中で４×１０ｅ６個の細胞／ｍＬに調整した。細胞懸濁液１ｍＬ当たり２マイクロリットルのＣＭＶ ｐｐ６５ ＨＬＡ−Ａ０２ペプチドを添加し、十分に混合した。次に、１００μＬのＰＢＭＣとペプチドをウェルに入れた（４×１０ｅ５個の細胞／ウェル）。それぞれのウェルに、１００μＬの抗体（２×）を添加し、プレートを３７℃のインキュベーター中に配置した。４日目、上清（１００μＬ）をそれぞれのウェルから回収し、後続のサイトカインアッセイ（ＭＳＤ）のために−３０℃において冷凍した。
図１６は、ＭＥＤＩ７５２６がＣＭＶリコールアッセイにおいて他の試験試料よりも高いレベルのＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２産生を誘導したことを実証する。ＩＦＮ−γについて：ＢＦＰ３は、約１０４．３のＥＣ５０を有し、ＣＤ４０Ｌ ＦＰ６（ＭＥＤＩ５０８３）は、３５９．４のＥＣ５０を有し、ＣＤ４０Ｌ＋抗ＰＤ−Ｌ１は、３６７．１のＥＣ５０を有した。
図７３Ｂは、ＰＤ１−ＯＸ４０Ｌ ＢＦＰがＣＭＶリコールアッセイにおいてＰＤ１−ＯＸ４０Ｌ ２ＷＴ ＢＦＰよりも高いレベルのＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＬ−１β及びＩＬ−６産生を誘導したことを示し、このアッセイにおいて残基Ｆ１８０がＯＸ４０アゴニスト機能に重要であることを示す。
実施例１２
ＢＦＰ分子は、ＰＤ１又はＰＤＬ１の内在化及び分解を誘発する。
この実施例において、ＢＦＰ３がＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１内在化を誘導し、膜ＰＤ−Ｌ１を不安定化させるという仮説を試験した。
ＭＥＤＩ７５２６ ＢＦＰ３は、ヒトＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１に結合する。ＢＦＰ３がＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１内在化を誘導し、続いてＰＤ−Ｌ１タンパク質分解を誘発し得ることが仮定された。ＭＥＤＩ７５２６処理時のＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１内在化の定量的計測を可能とするため、抗ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１抗体のパネルをスクリーニングし、抗ＣＤ４０クローン５Ｃ３及び抗ＰＤ−Ｌ１クローン２９Ｅ．２Ａ３を非競合抗体として同定した。すなわち、抗ＣＤ４０クローン５Ｃ３はＭＥＤＩ７５２６と競合せずにＣＤ４０に結合し、抗ＰＤ−Ｌ１クローン２９Ｅ．２Ａ３はＭＥＤＩ７５２６と競合せずにＰＤ−Ｌ１に結合する。非競合抗体を利用してＭＥＤＩ７５２６処理後のＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１の表面発現を評価した。図１７は、細胞表面からのＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１の内在化を検出するフローサイトメトリーベース法を示す。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１はヒト乳腺癌細胞であり、ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１の両方を構成的に発現する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をタイトレートされた量の試験材料と混合し、３７℃において１時間又は９６時間インキュベートした。インキュベーション後、遊離抗体を洗浄により除去し、細胞を蛍光色素コンジュゲート抗ＣＤ４０（クローン５Ｃ３）及び抗ＰＤ−Ｌ１（クローン番号２９Ｅ．２Ａ３）（両方ともＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製）により染色した。次いで、結合抗体を有する細胞をフローサイトメトリー分析に供した。Ｆｌｏｗｊｏ（登録商標）を使用して幾何平均蛍光強度を計算し、グラフ中にプロットした。結果は、図１８に見られる。
次に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を６ウェルプレート中にウェル当たり５０万個でＲＰＭＩ１６４０培地を用いてプレーティングし、示される条件により処理した。２４時間後、プロテアーゼ阻害剤を有する３００μＬ／ウェルのＲＩＰＡ緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で細胞を溶解させ、次いで回転させながら４℃において１時間インキュベートした。溶解物中のタンパク質の量をＢＣＡ分析（Ｐｉｅｒｃｅ）により決定し、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製の抗ＰＤ−Ｌ１クローン（Ｅ１Ｌ３Ｎ）を使用してウエスタンブロットによりＰＤ−Ｌ１タンパク質の存在を検出した（図１９参照）。
図１８及び１９に見られる結果は、ＭＥＤＩ７５２６（ＢＦＰ３）処理がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１表面発現を下方調節しただけでなく、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中の総ＰＤ−Ｌ１タンパク質含有量を減少させたことを実証する。
ＴＨＰ−１細胞
ＴＨＰ−１細胞は、ヒト白血病単球細胞系である。ＴＨＰ−１細胞は、極少量のＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１を発現するが、ＩＦＮ−γ処理後にＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１の発現を上方調節する。図２０に示されるアッセイ模式図において、ＴＨＰ−１細胞をＩＦＮ−γにより２４時間刺激し、タイトレートされた量の試験材料と混合し、３７℃において０．５〜３時間インキュベートした。インキュベーション後、遊離抗体を洗浄により除去し、細胞を蛍光色素コンジュゲート抗ＣＤ４０（クローン５Ｃ３）及び抗ＰＤ−Ｌ１（クローン番号２９Ｅ．２Ａ３）により染色した。次いで、結合抗体を有する細胞をフローサイトメトリー分析に供した。幾何平均蛍光強度をＦｌｏｗｊｏ（登録商標）により計算し、図２１にプロットし、それは、ＭＥＤＩ７５２６が０．５〜３時間のＴＨＰ−１細胞の細胞表面からのＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１の急速な下方調節を誘導したことを実証する。
ＩＦＮ−γ処理ＴＨＰ−１細胞
図２２の試験模式図に従って、ＴＨＰ−１細胞をＩＦＮ−γにより２４時間刺激し、タイトレートされた量の試験材料と混合し、３７℃において１時間インキュベートした。インキュベーション後、遊離抗体を洗浄により除去し、細胞を蛍光色素コンジュゲート抗ＣＤ４０（クローン５Ｃ３）及び抗ＰＤ−Ｌ１（クローン番号２９Ｅ．２Ａ３）により染色した。次いで、結合抗体を有する細胞をフローサイトメトリー分析に供した。幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）をＦｌｏｗｊｏ（登録商標）により計算し、図２３に示されるグラフ中にプロットし、それは、処理２４時間後にＣＤ４０発現が急速に回復されるが、ＰＤ−Ｌ１細胞表面発現は低いままであることを実証し、内在化ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１についての別個の回復経路を示す。
実施例１３
ヒトプライマリー細胞アッセイ
この試験において、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ１４陽性選択キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）を使用して健常ドナーＰＢＭＣから単球を単離し、ＣｅｌｌＸＶｉｖｏヒト単球由来ＤＣ分化キット（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＣＤＫ００４）を製造業者のプロトコルに従って使用して樹状細胞に分化させた。細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含むヒトＤＣ分化培地中で１００万個の細胞／ｍＬにおいて再懸濁させ、合計２０００万個の細胞をＴ７５フラスコ中に播種した。３及び５日目に、培地の半量を新鮮ヒトＤＣ分化培地と交換した。７日目、未成熟ＤＣを回収し、漸増用量の試験材料により刺激した。ＣＤ４０、ＣＤ８６及びＰＤ−Ｌ１の表面発現を２４時間の刺激後にフローサイトメトリーにより決定した（図２４参照）。図２５において、１０ｎＭの試験材料により２４時間刺激されたＤＣ中のＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１のタンパク質レベルを、イムノブロッティングにより計測した。これらの結果は、ＭＥＤＩ７５２６（ＢＦＰ３）がヒトプライマリー細胞上のＰＤ−Ｌ１の下方調節を引き起こしたことを示す。
図２４は、ＭＥＤＩ７５２６が、その親ＣＤ４０Ｌ ＦＰと同様に、低用量においてＣＤ４０の上方調節を誘導したが、高用量においてＣＤ４０を下方調節したことを実証する。これは、単球由来樹状細胞上のＣＤ８６発現も上方調節した。しかし、ＰＤ−Ｌ１タンパク質レベルは、ＭＥＤＩ７５２６処理細胞上で低いままであった。
ＰＢＭＣアッセイ
この試験において、健常ドナーからのＰＢＭＣをＩＦＮ−γにより刺激し、試験試薬と１時間反応させた。ＣＤ４０、ＣＤ８６、及びＰＤ−Ｌ１の表面発現レベルをフローサイトメトリーにより試験した。図２６は、ＭＥＤＩ７５２６が単球の細胞表面からのＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１の下方調節を誘導することを実証する。これらの結果は、ＭＥＤＩ７５２６（ＢＦＰ３）が新鮮単離ヒトプライマリー細胞上のＰＤ−Ｌ１の下方調節を引き起こしたことを示す。
実施例１４
Ｒｅｎｃａ細胞中のＰＤ−Ｌ１に対するネズミサロゲートＭＥＤＩ７５２６の効力
Ｒｅｎｃａは、ＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１の両方を構成的に発現するネズミ腎腺癌細胞系である。この試験において、初日にＲｅｎｃａ細胞を６ウェルプレート中で５０万個／ウェルにおいて培養した。培養２日目、Ｒｅｎｃａ細胞を１０ｎＭの濃度の示される試薬により２４時間処理した。培養３日目、プロテアーゼ阻害剤を有するＲＩＰＡ緩衝液中で処理Ｒｅｎｃａ細胞を溶解させ、細胞溶解物をウエスタンブロットにより分析した。ウエスタンブロットに使用された抗体を以下の表３に列記する。
Figure 2021502360
図２７は、ＭＥＤＩ７５２６のネズミサロゲート（ｍＢＦＰ３）がＲｅｎｃａ細胞中でＰＤ−Ｌ１の分解を誘導したことを実証する。この結果は、ＭＥＤＩ７５２６のネズミサロゲートがネズミ細胞上のＰＤ−Ｌ１及びＣＤ４０発現の下方調節において類似の機能を有することを実証する。
実施例１５
ＢＦＰ分子及びＦｃ受容体のエンゲージメントは、骨髄細胞活性化を向上させ得る。
この実施例において、ＢＦＰ分子による骨髄細胞活性化を試験した。
ＰＤ−Ｌ１を発現するＥＳ２細胞を平底９６ウェルプレート中で３０，０００個／ウェルにおいて播種し、ＴＨＰ１細胞をＩＦＮ−γにより２４時間刺激した。２日目、等量のＥＳ２細胞及びＴＨＰ−１細胞を混合し、タイトレートされた試験材料（ＢＰＦ１、ＢＰＦ２、ＭＥＤＩ７５２６、ＦＰ６（ＭＥＤＩ５０８３）、及びＭＥＤＩ４７３６；表１参照）を添加した。プレートを３７℃において２４時間インキュベートした。ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）を説明書に従ってパウチ上で調製した。次に、平底９６ウェルプレートのウェル当たり１６０μＬのＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ溶液を４０μＬの上清と混合した。プレートを３７℃において３時間インキュベートし、分光光度計を６５５ｎｍにおいて使用してＳＥＡＰレベルを決定した。
図２８は、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１を介する架橋がＭＥＤＩ７５２６ ＢＦＰ３活性を向上させ得ることを示す。ＢＦＰフォーマットの配向は、機能に影響すると考えられる。それというのも、ＢＦＰ２フォーマットが向上した活性を有さないことが観察されたためである。２細胞システムに基づくこの結果は、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１を介する架橋がＴＨＰ−１細胞中のＮＦ−κＢ活性の刺激におけるＭＥＤＩ７５２６機能を増大させ得ることを実証する。
実施例１６
ＰＤ−Ｌ１架橋におけるＦｃγＲＩの役割
この実施例において、ＰＤ−Ｌ１架橋における高親和性Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩ）の役割を試験した。Ｂｉｏｃｏａｔ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、５０μＬ／ウェルのＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ（２μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）により４℃において一晩コーティングした。２日目、ＴＨＰ１細胞（２０万個／ウェル）をプレートに添加した。Ｆｃγ受容体への結合においてＩｇＧ４と競合する可溶性ＩｇＧ１（インハウスで作製）を添加した。他の阻害剤、例として、ＦｃγＲＩ／ＦｃγＲＩＩに対する遮断抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）並びにＳｙｋ及びＢｔｋについての阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｈｅｍ）を１時間添加し、次いで試験材料（３ｎＭ）により２４時間刺激した。３日目、プレートを１５００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離した。４０μＬの細胞培養物上清を１６０μＬの新鮮調製ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合し、次いで３７℃において１時間インキュベートした。ＳＥＡＰレベルをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５分光光度計により６５５ｎｍにおいて決定した。図２９は、ＰＤ−Ｌ１架橋により媒介される向上したシグナルがＦｃｒＲＩを介するものであり、可溶性ＩｇＧ並びにＳｙｋ及びＢｔｋについての阻害剤により阻害され得ることを実証する。しかしながら、Ｆｃエンゲージメントは、ＢＦＰ３機能に要求されない（図６１及び６２参照）。これらの結果は、ＢＦＰ３により媒介される増大した活性がＦｃγＲＩエンゲージメントを介するものであることを示唆する。
実施例１７
ＭＥＤＩ７５２６のネズミサロゲートは、インビボでロバストな抗腫瘍活性を実証し、それはマウス腫瘍モデルにおいて寛容であることを実証する
マウスにおけるインビボでのＭＥＤＩ７５２６の効果を試験するため、ＭＥＤＩ７５２６のマウスサロゲートｍＭＥＤＩ７５２６を構築した。ＭＥＤＩ７６２５と並行して、ｍＭＥＤＩ７５２６は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、Ｆ（ａｂ）２抗ネズミＰＤ−Ｌ１、Ｄ２６５Ａ突然変異を有するネズミＩｇＧ１ Ｆｃ、及びペプチドリンカーを介して連結している３つのネズミＣＤ４０Ｌサブユニットの２つの単鎖融合タンパク質を含む。
最初にＭＥＤＩ７５２６のネズミサロゲート（ｍＭＥＤＩ７５２６）を、Ｃ５７Ｂｌ／６雌マウスにおいて試験してその安全性プロファイルを試験した（図３０Ａ及び３０Ｂ）。ナイーブマウスは、１０ｍｇ／ｋｇのｍＣＤ４０Ｌ又は１６ｍｇ／ｋｇの等モル濃度のｍＭＥＤＩ７５２６のいずれかによる単一静脈内（ｉｖ；図３０Ａ）又は皮下（ｓｃ；図３０Ｂ）処理を受容した。マウスの非処理群を対照として使用した。体重を処理前日及び処理後毎日モニタリングし、個々のマウスについてベースライン体重の割合に変換した（図３１参照）。対照と比較して、ｍＣＤ４０Ｌ処理は、ｉｖ又はｓｃのいずれでも体重の損失をもたらした。比較において、１６ｍｇ／ｋｇにおけるｍＭＥＤＩ７５２６処理は、有意な体重の損失を引き起こさなかった。
別個の実験において、Ｃ５７Ｂｌ／６雌マウスにＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を移植し、後続の試験のために＞１００ｍｍ３の腫瘍サイズを有するマウスを選択した。選択されたマウスは、図３０Ｃ及び３０Ｄに示されるｍＣＤ４０Ｌ（１０ｍｇ／ｋｇ）及びｍＭＥＤＩ７５２６（１６ｍｇ／ｋｇ）の、又は高用量のｍＭＥＤＩ７５２６（２５又は３５ｍｇ／ｋｇ、図３０Ｅ及び３０Ｆ、それぞれ）による単回ｉｖ又はｓｃ処理を受容した。体重を処理前日及び処理後毎日モニタリングし、ベースライン体重の割合を計算し、処理群と非処理群とを比較した。結果は、ｍＣＤ４０Ｌの処理が処理後により重度の体重の損失をもたらしたことを実証し、ナイーブ又は腫瘍担持マウスにおいてｍＭＥＤＩ７５２６がｍＭＥＤＩ５０８３よりも寛容であることを示す。
次に、ｍＭＥＤＩ７５２６の安全性プロファイルをＢ１６Ｆ１０ネズミ腫瘍モデルに対する複数回投与試験において評価した。１日目にマウスにＢ１６Ｆ１０腫瘍を移植し、１１日目に＞１００ｍｍ３の腫瘍サイズを有するマウスを無作為化し、次いで、図３１に示されるとおり１１、１３、１９及び２１日目に処理した。２０％超の体重の損失を示すマウスを重度ストレス下にあるとみなし、試験から除去した。１３日目の２回目の投与直後、ｍＣＤ４０Ｌ群の２匹のマウス及びＣＤ４０Ｌ＋抗ＰＤＬ１群の４匹のマウスは、＞２０％の体重の損失を示した。比較において、ｍＭＥＤＩ７５２６投与マウスは、２回目の投与後に＞２０％の体重の損失を示さなかった。これらのデータは、ｍＭＥＤＩ７５２６がｍＣＤ４０Ｌ単独又はそれと抗ＰＤＬ１との組合せよりも寛容であることをさらに示す。
次に、 ｍＭＥＤＩ７５２６をＢ１６Ｆ１０同系マウスモデルにおいて試験した。モデルを図３１に記載のとおり設定した。２０〜３５ｍｇ／ｋｇの用量範囲のｍＭＥＤＩ７５２６は、Ｂ１６−Ｆ１０マウスモデルにおいてＰＢＳ対照と比較して腫瘍容積を減少させ、及び／又は腫瘍成長を遅延させた（図３２）。２５ｍｇ／ｋｇ用量のｍＭＥＤＩ７５２６は、最も強力な腫瘍成長阻害を有し、試験終了時、２５ｍｇ／ｋｇの処理を受容した７０％のマウスは、５００ｍｍ３未満の腫瘍サイズを有した。したがって、ｍＭＥＤＩ７５２６は、低応答腫瘍モデルにおいて有意な抗腫瘍活性を示した。
投与最適化。ｍＭＥＤＩ７５２６の投与レジメンを図３３に示されるとおりＢ１６Ｆ１０モデルにおいて最適化した。ｍＭＥＤＩ７５２６を２５ｍｇ／ｋｇにおいて、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞の移植１０日後に１回、又は１０及び１４日目、若しくは１０及び１７日目に２回投与した。ｍＭＥＤＩ７５２６ ＣＤ４０Ｌ−ＦＰの単回投与の処理は、腫瘍容積を有意に減少させ、及び／又は腫瘍成長を遅延させた。しかしながら、２回の投与は、単回投与よりも良好な抗腫瘍活性を有した（１０及び１４日目又は１０及び１７日目のいずれでも）。さらに、ｍＭＥＤＩ７５２６により処理されたマウスは、有意な重量損失も、他の観察可能な効果も有さなかった。したがって、ｍＭＥＤＩ７５２６の低減した投与頻度は、有意な抗腫瘍活性を維持し、主な毒性を低減させ得る。
インビボでのＴ細胞活性化。Ｔ細胞活性化に対するｍＭＥＤＩ７５２６の効果を、Ｂ１６Ｆ１０マウスモデルにおいて評価した。ｍＭＥＤＩ７５２６を、２５ｍｇ／ｋｇにおいてＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞の移植１０日後に投与し、脾臓Ｔ細胞をｍＭＥＤＩ７５２６処理の２及び４日後に回収した。図３４に示されるとおり、ｍＭＥＤＩ７５２６の処理は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の両方の上の早期活性化マーカーＣＤ６９の上方調節をもたらした。さらに、４日目、エフェクター記憶ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２Ｌｌｏｗ）及びエフェクターＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＫＬＲＧ１＋）の割合は、有意に増加された。さらに、エフェクターＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＫＬＲＧ１＋）の割合は脾臓中だけでなく、肝臓及び腫瘍中でも増加された（図３５）。まとめると、これらのデータは、ｍＭＥＤＩ７５２６が腫瘍担持マウスにおいてＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞のロバストな活性化を誘導したことを示す。
血清サイトカインプロファイル分析。血清サイトカインプロファイルの変化を、ｍＭＥＤＩ７５２６及びｍＣＤ４０Ｌ処理後にモニタリングした。ナイーブマウスに、１０ｍｇ／ｋｇのｍＣＤ４０Ｌ（ｍＭＥＤＩ５０８３、ネズミ化ＭＥＤＩ５０８３である）又は１６ｍｇ／ｋｇのｍＭＥＤＩ７５２６のいずれかを投与し、血液を図３６に示される処理後の複数の時点において回収した。血清を全血から分離し、サイトカイン、例として、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＫＣ／ＧＲＯ、及びＴＮＦ−αの検出のためのＭＳＤマルチプレックス分析（Ｕ−ＰＬＥＸ ＴＨ１／ＴＨ２ Ｃｏｍｂｏ）に供した。ｍＣＤ４０Ｌと比較すると、ｍＭＥＤＩ７５２６は、類似のレベルのＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２を誘導したが、有意に低いＴＮＦ−α及びＩＬ−６を誘導した（図３７）。Ｂ１６Ｆ１０マウスに対する別個の試験において、１６〜３５ｍｇ／ｋｇの用量のｍＭＥＤＩ７５２６は、かなり少ないＩＬ−６及びＴＮＦ−αを誘導したが、同等のレベルのＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２を誘導した。したがって、ｍＭＥＤＩ７５２６処理は、抗腫瘍サイトカインを誘導するが、全身毒性に寄与するサイトカインの産生を制限する。
ＭＥＤＩ７５２６処理は、化学療法薬と有効に組み合わさる。別個の試験において、ＣＴ２６ネズミ腫瘍の治療のためのＭＥＤＩ７５２６単独又はそれと化学療法薬フルオロウラシル（５ＦＵ）との組合せの効果を評価した。合計５０万個のＣＴ２６腫瘍細胞をマウス中にｓ．ｃ．移植し、腫瘍をそれらが約１００ｍｍ３と計測されるまで約１０日間モニタリングし、その時点でマウスをそれらの腫瘍の容積に基づき処理群に無作為化した。翌日、処理を２５若しくは５０ｍｇ／ｋｇの用量の５ＦＵ又はＰＢＳ対照によりｉ．ｐ．でイニシエートし、次いでその後３週間、週１回、２５又は３５ｍｇ／ｋｇのいずれかのｍＭＥＤＩ７５２６をｉ．ｐ．処理した。腫瘍容積及び体重を試験終了まで週２回計測し、結果を図６５に示す。２５及び５０ｍｇ／ｋｇの５ＦＵによる処理は、ＣＴ２６腫瘍成長を十分には阻害せず、ＭＥＤＩ７５２６単独は、全てのマウスではなくマウスのサブセットにおいてのみ腫瘍成長を阻害し得た。５ＦＵ及びＭＥＤＩ７５２６の組合せは、単回処理よりも多くのマウスにおいて腫瘍成長阻害をもたらした。５ＦＵ ５０ｍｇ／ｋｇとＭＥＤＩ７５２６ ３５ｍｇ／ｋｇ処理は、より良好な効果を有し、群の全てのマウスにおいて腫瘍成長の阻害をもたらした。この結果は、化学療法薬との組合せがＭＥＤＩ７５２６により媒介される抗腫瘍活性をさらに向上させ得ることを示唆する。
ＭＥＤＩ７５２６は、肝腫瘍を治療する潜在性を有する。ＭＥＤＩ７５２６の標的器官をさらに評価した。生体分布試験において、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞をマウス中に移植し、次いで図６６Ａに示されるとおりＺｒ−８９標識抗体（アイソタイプ対照並びにＭＥＤＩ５０８３及び７５２６のネズミサロゲート）を注射した。標識抗体の分布をＰＥＴＣＴにより検出した。アイソタイプ対照抗体と比較して、ＭＥＤＩ５０８３及びＭＥＤＩ７５２６の両方は、肝臓及び脾臓中で蓄積した。肝マクロファージのタイプであるクッパー細胞がＣＤ４０及びＰＤ−Ｌ１を発現することがさらに裏付けられた（図６６Ｂ）。これらの結果は、肝臓中のクッパー細胞がＭＥＤＩ５０８３及びＭＥＤＩ７５２６の標的細胞であることを示す。
上記結果は、ＭＥＤＩ７５２６及びＭＥＤＩ５０８３がマウスにおいて肝腫瘍を治療し得るか否かに関するさらなる調査をもたらした。この実験において、ＣＴ２６腫瘍細胞にルシフェラーゼ遺伝子を形質移入し、５０万個の形質移入ＣＴ２６−Ｌｕｃ細胞をマウス肝中に直接移植した。マウスはＣＴ２６細胞を受容し、外科的処置から回復させ、それにアイソタイプ対照抗体、ＭＥＤＩ５０８３、抗ＰＤＬ１、ＭＥＤＩ５０８３と抗ＰＤＬ１又はＭＥＤＩ７５２６を腫瘍移植の３、１０及び１７日後に投与した。全ての試験試薬を２１．９ｍｇ／ｋｇにおいて投与し、但し、ＭＥＤＩ７６２５は３５ｍｇ／ｋｇの等モルで投与した。２１日目、マウスを犠死させ、肝臓中の腫瘍負荷の指標であるルシフェラーゼ活性の計測のために肝臓を回収した。ＭＥＤＩ７５２６処理のみが腫瘍負荷を無腫瘍マウスのレベルに有効に低減させ（図６７）、ＭＥＤＩ７５２６が肝臓癌を治療する潜在性を有することを示した。
さらに、ＭＥＤＩ７５２６処理は、フローサイトメトリー分析により決定されたとおり、１４日目のＣＤ８ Ｔ細胞の数の増加、及び２１日目の抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のうちのより活性化された表現型と関連した（図６８）。
試験試薬の安全性プロファイルを、ＣＴ２６肝腫瘍モデルにおいて評価した（図６９）。重度ストレスを示す有意な体重の損失及びマウスの死亡が報告された。１回目の投与の２日後、ｍＭＥＤＩ５０８３群及びｍＭＥＤＩ５０８３と抗ＰＤＬ１群の全てのマウスは、約１０％の体重の損失を示した。比較において、ｍＭＥＤＩ７５２６投与マウスは、同一時点において＞５％の体重の損失を示さなかった（図６９Ａ）。さらに、ｍＭＥＤＩ５０８３＋抗ＰＤＬ１の処理を受容したマウスは、３回の投与後に死亡が見出された（図６９Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ｍＭＥＤＩ７５２６がｍＭＥＤＩ５０８３単独又はそれと抗ＰＤＬ１との組合せよりも寛容であることをさらに示す。
実施例１８
ＮＦ−κＢのＯＸ４０Ｌ活性化
ＯＸ４０タンパク質が形質移入されたＪｕｒｋａｔ ＮＦ−κＢ−ＬｕｃレポーターＴリンパ球を、ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）＋１０％のＨＩ−ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、及び１％のＰｅｎ Ｓｔｒｅｐ（ＧＩＢＣＯ）中で維持した。実験日、細胞を回収し、２×１０６個の細胞／ｍＬに調整し、Ｕ字底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にウェル当たり９０μＬの容量で添加した。完全ＲＰＭＩ１６４０中で調製された１０μＬの試験試薬（１０×）をそれぞれのウェルに添加し、細胞を３７℃のインキュベーター中に４時間配置した。ルシフェラーゼ試薬（Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質；Ｐｒｏｍｅｇａ）を調製し、室温に平衡化させておき、それぞれのウェルに添加した（１００μＬ）。プレートを室温において５分間配置し、次いで直ちにＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５プレートリーダー上で読み取った。図３８は、抗ＰＤ１−ＯＸ４０Ｌ ＢＦＰがＯＸ４０が形質移入されたＪｕｒｋａｔ細胞中でＮＦ−κＢ経路を活性化させたことを実証する。
別個の試験において、ＯＸ４０エクトドメイン及びＧＩＴＲ細胞内ドメインを有するヒトＯＸ４０−ＧＩＴＲ融合タンパク質を発現するように遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ ＮＦ−κＢ−Ｌｕｃレポーター細胞系（Ｊｕｒｋａｔ／ＯＸ４０−ＧＩＴＲ−ＦＰ２）を、上記段落に示されるとおりＮＦ−κＢ活性についてアッセイした。図７１Ｃは、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞中でＰＤ１／ＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０Ｌの全てのサブユニットは、野生型タンパク質配列を有する）がロバストなＮＦ−κＢ活性化を誘導したが、ＰＤ１／ＯＸ４０Ｌ １ＷＴ及びＰＤ１／ＯＸ４０Ｌ ２ＷＴの両方がＮＦ−κＢを活性化させ得なかったことを実証する。これらのデータは、ＯＸ４０上のＦ１８０の６つの残基の全てがＯＸ４０下流シグナリングの活性化に重要であることを裏付け、ＰＤ１／ＯＸ４０Ｌ １ＷＴ及び２ＷＴが最小のＯＸ４０媒介Ｔ細胞活性化機能を有することを示す。
実施例１９
抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０Ｌ ＢＦＰのマウス試験
マウスＯＸ４０に結合し、ＯＸ４０シグナリングを誘発するネズミＯＸ４０リガンドＩｇＧ１融合タンパク質（ｍＯＸ４０Ｌ ＦＰ）を生成し、ＭＥＤＩ６３８３、ヒトＯＸ４０リガンドＩｇＧ４Ｐ融合タンパク質についてのマウスＯＸ４０アゴニストサロゲートとして使用した。米国特許第９，７１８，８７０号明細書参照。クローン８０は、マウスＰＤ−Ｌ１に対するラットキメラマウスＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａ抗体である。ｍＯＸ４０Ｌ ＦＰ及びクローン８０の抗腫瘍活性を単剤療法として、又は組合せ療法として、マウス同系肉腫細胞系ＭＣＡ２０５、及びマウス結腸腺癌細胞系ＣＴ２６から生じた腫瘍を担持するマウスにおいて評価した。
それぞれの群の１０匹のＣ５７ＢＬ／６又はＢａｌｂ／ｃマウスに、１日目にＭＣＡ２０５（左パネル）細胞又はＣＴ２６（右パネル）細胞をそれぞれＳＣ接種した。対照物質（生理食塩水）及び試験物質抗ＰＤ−Ｌ１クローン８０ ｍＡｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ｍＯＸ４０Ｌ ＦＰ（９．８ｍｇ／ｋｇ）、又は１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂ及び９．８ｍｇ／ｋｇのｍＯＸ４０Ｌ ＦＰの組合せを、ＭＣＡ２０５については１２、１５、１８、及び２２日目に、ＣＴ２６については４、７、１１、及び１４日目にＩＰ投与した。経時的な個々の腫瘍容積を図３９のグラフ中に示す。ＩＰ＝腹腔内；ＳＣ＝皮下。
クローン８０との組合せにおけるｍＯＸ４０Ｌ ＦＰの投与は、対照物質又は薬剤単独の投与よりも大きい抗腫瘍活性をもたらした（図３９）。したがって、ＯＸ４０アゴニスト及びＰＤＬ１アンタゴニスト療法は、前臨床モデルにおいて補完的な抗腫瘍利益を提供する。
ＰＤＬ１結合部分からなる二重特異的分子は、ＰＤ−Ｌ１に結合しない二重特異的分子と比較してＰＤ−Ｌ１＋腫瘍中の滞留時間を増加させ得る。この仮説を試験するため、インビボ生体分布試験をマウスにおいて実施した。
二重特異的分子をキレート剤（ＩＴＣ−ＤＴＰＡ，Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｓ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）とコンジュゲートさせて約６００ＭＢｑ／ｍｇの比活性を目的とする１１１インジウム放射性標識（Ｂｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，２０１２）を可能とした。脱塩カラム（ＰＤ−１０ ＥｃｏｎｏＰａｃ，ＢｉｏＲａｄ）を介する精製後、放射性標識分子の放射化学的純度（ＲＣＰ）をインスタント薄層クロマトグラフィーにより確認してＲＣＰ＞９５％及び室温における４時間までの安定性で標識効力を確保した。
生体分布試験のため、雌ヌードマウス（Ｅｎｖｉｇｏ）にＵ８７−ＭＧ癌細胞（０．１ｍＬ中の１×１０７個の細胞）を皮下接種し、０．２ｃｍ３の平均腫瘍容積でそれらを異なる処理群に無作為化した。全ての無作為化マウスに、単回用量の放射性標識分子（２０μｇ／０．２Ｍｂｑ／ｋｇ体重）を静脈内注射した。次いで、動物の下位群を放射性標識投与の１時間、１日、及び４日後に安楽死させた。生体分布プロファイルを作成するため、器官／組織（すなわち、血液、筋肉、肺、肝臓、脾臓、腎臓、腫瘍、尾部）を回収し、秤量し、ガンマカウンター（Ｗｉｚａｒｄ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して放射活性のレベルを計測して注射用量の割合（％ＩＤ）及び組織１グラム当たりの％ＩＤを計算した。生体分布プロファイルは、組織１グラム当たりについて補正された注射用量の平均割合（±ＳＥＭ）を説明し、注射の１時間、１日、及び４日後の示される組織における放射性標識ＭＥＤＩ５６１５及び対照の取り込みを比較する。１群当たりｎ＝５であり、但し、「４日目 ＢＦＰ３」について１群当たりｎ＝６である。アスタリスクは、両側ｔ検定を使用する有意差（ｐ＜０．０５）を説明する。
Ｕ８７ＭＧ腫瘍は、抗ＰＤ−Ｌ１特異的免疫組織化学的検査により決定されたとおり、高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現し（図４０Ａ）、それを生体分布試験において使用した（図４０Ｂ）。治療量未満の放射性標識二重特異的分子を、Ｕ８７ＭＧ腫瘍を担持するマウス中に注射し；１つはＩｇＧ４Ｐ ＢＦＰ２分子（ＭＥＤＩ５６１５；１×Ｆｃドメイン）としてＰＤ−Ｌ１及びＯＸ４０を標的化し、１つはＩｇＧ１ ＢＦＰ３分子（１×Ｆｃドメイン）としてＰＤ−Ｌ１及びＯＸ４０を標的化し、１つはＰＤ−Ｌ１にもＯＸ４０にも結合しない対照物質（Ｒ３４７−ＯＸ４０Ｌ Ｆ１８０ ＢＦＰ２）であった。二重特異的分子は最初に１時間後に血液中で検出され、急速にクリアランスされ、その結果、１日後に血液中で検出することができた放射性標識は皆無かそれに近かった。ＭＥＤＩ５６１５及び対照物質も、標的結合とは無関係に肝臓及び脾臓に急速に分布し、４日目までそれらの組織中で留まった（図４０Ｃ）。対照的に、ＭＥＤＩ５６１５は透過し、対照物質と比較して腫瘍中で保持された一方、両方の分子は血液からクリアランスされた。
ＰＤ−Ｌ１／ＯＸ４０Ｌ ＢＦＰ３分子は、ＭＥＤＩ５６１５と同様に腫瘍中に留まる能力を実証し（図４１）、腫瘍滞留がＦｃドメイン及び分子フォーマットとは無関係であったことを示唆した。対照物質と比較したＭＥＤＩ５６１５及びＰＤＬ１／ＯＸ４０Ｌ ＢＦＰ３分子間の１及び４日目において観察された腫瘍アップデートの差は、腫瘍滞留がＰＤ−Ｌ１への分子結合により媒介されることを示唆する。
実施例２０
抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０Ｌ ＢＦＰの活性
ヒトＯＸ４０を介してシグナリングを活性化させるＭＥＤＩ５６１５（ＰＤ−Ｌ１／ＯＸ４０Ｌ ＢＦＰ２二重特異的分子）の能力を、ヒトＯＸ４０を発現するように遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼＴ細胞レポーター系を使用する２細胞レポーター生物活性アッセイのセットにおいて評価した（図４２）。ＰＤ−Ｌ１媒介薬物架橋は、細胞表面ＰＤ−Ｌ１を発現するＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を介して生じた。Ｆｃγ受容体媒介薬物架橋は、Ｆｃγ受容体ＩＩａ（ＣＤ３２Ａ）を発現するように遺伝子操作されたＨＥＫ２９３細胞を介して生じた。Ｔ細胞活性化を、プライマリーヒトＴ細胞活性化の下流のＮＦ−κＢシグナリング経路の刺激に応答するルシフェラーゼ活性の増加として計測した。ＮＦ−κＢシグナリングは、ＯＸ４０シグナリングの下流で生じ、Ｔ細胞活性化の他の尺度、例えば、増殖及びサイトカイン放出と相関することが報告された。生物活性を可溶性ＭＥＤＩ５６１５、及び細胞表面ＰＤ−Ｌ１を発現するＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞又は個々のＦｃγ受容体を発現するように遺伝子操作されたＨＥＫ２９３細胞とインキュベートしたＭＥＤＩ５６１５について計測した。
使用前、ＯＸ４０ Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞を組織培養インキュベーター中で完全ＲＰＭＩ培地中で１ｍＬ当たり０．５〜１．５×１０６個の密度において培養した。細胞を、生物アッセイ前日に１ｍＬ当たり１０６個の細胞の密度において継代した。ＯＸ４０ Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞、及びＣＤ３２Ａ ＨＥＫ細胞を回収し、ペレット化した。二重特異的分子を、完全ＲＰＭＩ中で３倍段階希釈した。ＯＸ４０レポーター細胞と提示細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり１００，０００個の細胞において添加した。二重特異的分子を完全ＲＰＭＩ培地中で細胞に１μｇ／ｍＬにおいて開始して最終濃度まで添加し、上記のとおり希釈した。インキュベーション時間の１６〜２４時間後、１００μＬの再構成Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をそれぞれのウェルに添加し、混合して細胞を溶解させ、次いでインキュベートしてルシフェラーゼシグナルを平衡化させた。検出のためにＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）／試料溶解物（１５０μＬ）をそれぞれのウェルから９６ウェル白色壁アッセイプレートに移し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）発光リーダーを使用して発光を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して二重特異的分子の濃度（ｘ軸は、タンパク質濃度のｌｏｇ１０である）を発光ＲＬＵ（ｙ軸）に対してプロットした。
図４３に見られるとおり、ＭＥＤＩ５６１５は、ヒトＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞中で、Ｆｃγ受容体（ＣＤ３２Ａ発現ＨＥＫ２９３細胞）及びＰＤ−Ｌ１（ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞）を発現する細胞の存在下でＮＦ−κＢシグナリングにより計測されたとおりＯＸ４０シグナリング経路を活性させ、ＥＣ５０値はそれぞれ５２ｐＭ及び１８ｐＭであった。ＭＥＤＩ５６１５を架橋し得るＰＤ−Ｌ１又はＦｃγ受容体を発現する細胞の不存在下で、最小プロモーター細胞系活性を計測した。
次に、エフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞増殖に対する天然ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）細胞の抑制機能を克服し、ｎＴｒｅｇからのＩＬ−１０の放出を低減させるＭＥＤＩ５６１５の能力を、ヒトＴ細胞共培養アッセイにおいて試験した。
ヒトＴｒｅｇ細胞単離キットを製造業者の説明書（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）に従って使用してヒトＣＤ４＋エフェクター及びＴｒｅｇ細胞をＰＢＭＣから単離した。この方法は、非ＣＤ４＋細胞の抗体標識による総ＣＤ４＋細胞の陰性選択、次いで磁気ビーズベース枯渇の使用を介する抗体陽性細胞の除去を含んだ。Ｔｒｅｇ細胞を抗ＣＤ２５による標識によりエフェクターＣＤ４＋細胞から分離し、次いで磁気ビーズにより陽性選択を行い、続いて単離細胞から取り出した。
ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を使用してエフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞をＣＦＳＥにより標識した。エフェクターＴ細胞及びＴｒｅｇ細胞を３７℃において１：１又は１：２の比において、抗マウスＣＤ３ｍＡｂによりコーティングされた９６ウェルプレートのウェル中で、対照及び試験物質と混合した可溶性抗マウスＣＤ２８抗体の存在下で４日間同時培養した。細胞をブレフェルジンＡの存在下でＰＭＡとイオノマイシンによりさらに４時間再刺激し、固定し、細胞内サイトカイン染色法を使用するフローサイトメトリーによりＩＬ−１０産生について試験した。アッセイ終了時における分裂エフェクターＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合及びＩＬ−１０を産生するＴｒｅｇ細胞の割合を、フローサイトメトリーにより評価した。
分裂エフェクターＴ細胞（ＣＦＳＥ低）の割合を決定し；非生存（ｅＦｌｕｏｒ陽性）細胞及び制御性Ｔ細胞（ＣＦＳＥ陰性）を区別し、分析から排除した。ＩＬ１０を産生するＴｒｅｇ細胞の割合を非生存及びエフェクターＴ細胞（ＣＤ２５陰性）の排除後に評価した。
Ｔｒｅｇ細胞の不存在下のエフェクターＴ細胞は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８との培養後に分裂した（図４４上段）。細胞周期に入るエフェクターＴ細胞の割合は、試験物質の添加時に増加しなかった。ＯＸ４０アゴニストからなる試験物質（すなわち、ｓｃＯＸ４０Ｌ ２×Ｇ４Ｓ（配列番号３５）ＩｇＧ４Ｐ、ＭＥＤＩ５６１５、及び抗ＰＤ−Ｌ１ ＩｇＧ４Ｐ＋ｓｃＯＸ４０Ｌ ２×Ｇ４Ｓ（配列番号３５）ＩｇＧ４Ｐ）は、Ｔｒｅｇの存在下で、１：２のエフェクターとＴｒｅｇとの比において、対照物質（すなわち、非処理、ＮＩＰ２２８ ＩｇＧ４Ｐ、及び抗ＰＤ−Ｌ１ ＩｇＧ４Ｐ）と比較して分裂エフェクターＴ細胞の割合を統計的に増加させた。分裂するエフェクターＴ細胞の割合の増加は、１：１のエフェクターとＴｒｅｇとの比では培養物中で観察されなかった。
ＯＸ４０アゴニストからなる試験物質は、対照物質と比較してエフェクターＴ細胞との共培養物中でＩＬ−１０を産生するＴｒｅｇの割合を有意に低減させた（図４４下段）。これらの結果は、ＭＥＤＩ５６１５がＯＸ４０アゴニストと同様に機能してＴｒｅｇ細胞の抑制活性及びＩＬ−１０産生を克服することを示唆する。
次に、超抗原ブドウ球菌エンテロトキシン（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ｂ（ＳＥＢ）の存在下でヒトＰＢＭＣを共刺激するＰＤ−Ｌ１及びＯＸ４０ベース二重特異的分子の能力を評価した。抗ヒトＣＤ３（クローンＳＫ７）抗体を、９６ウェルプレートのウェルにプレコーティングした。ヒトＰＢＭＣを健常ドナーから単離し、抗ＣＤ３、ＳＥＢ（２５ｎｇ／ｍＬ）、及び示される試験物質と７２時間培養し、培養物上清をＩＬ−２について試験した（図４５Ａ〜Ｂ）。ＢｉＳ２及びＢｉＳ３ ＯＸ４０／ＰＤ−Ｌ１二重特異的抗体（図４５Ａ；米国特許出願第１５／５８８，２７１号明細書も参照）及びＭＥＤＩ５６１５（図４５Ｂ）は、電気化学発光ＥＬＩＳＡにより決定されたとおり、ヒトＰＢＭＣがＩＬ−２を濃度依存的に産生するように誘導した。二重特異的分子により産生されたＩＬ−２の量は、ＯＸ４０抗体（抗ＯＸ４０ ＩｇＧ４Ｐ）、ＰＤ−Ｌ１抗体（抗ＰＤ−Ｌ１ ＩｇＧ４Ｐ）、ＯＸ４０及びＰＤＬ１抗体の組合せ、対照二重特異的融合タンパク質（ＰＤＬ１−ＯＸ４０ Ｆ１８０Ａ ＢＦＰ２、Ｒ３４７−ＯＸ４０Ｌ ＢＦＰ２）単独又はその組合せ、並びに陰性対照物質（ＮＩＰ２２８ ＩｇＧ４Ｐ；Ｒ３４７−ＯＸ４０Ｌ Ｆ１８０Ａ ＢＦＰ２）を含有するヒトＰＢＭＣ培養物により産生されたＩＬ−２の量よりも多かった。
次に、細胞ベース平衡結合アッセイを実施して遺伝子操作ＣＨＯ細胞の細胞表面上で発現されたヒト及びカニクイザルＯＸ４０及びＰＤ−Ｌ１へのＭＥＤＩ５６１５（ＰＤ−Ｌ１／ＯＸ４０Ｌ ＢＦＰ２）結合の見かけの親和性を計測した。
試験物質を、ヒト又はカニクイザルＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１又はＯＸ４０及びＰＤ−Ｌ１の両方を発現するように遺伝子操作されたＣＨＯ細胞に順次１９回の３倍希釈にわたり希釈した。細胞及び試験物質（ｎ＝３）を４℃において１時間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％の熱不活化新生児ウシ血清）により３回洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液により洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。蛍光補正後、生存（ＰＩ陰性）単一細胞をゲーティングし、二次抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定してそれぞれの試験物質の結合のレベルを報告し、試験物質結合のＭＦＩを融合タンパク質濃度（Ｍ）に対してプロットして結合曲線を作出し、それから見かけのＫＤ及び受容体占有率値を決定した。図４６Ａ〜Ｆ参照。
ＭＥＤＩ５６１５と種々のＣＨＯ細胞との相互作用についての平均平衡解離定数（ＫＤ）を、以下の表４に報告する。
Figure 2021502360
細胞への試験物質結合についての見かけのＫＤを決定するため、図４６Ａ〜Ｆのデータを使用して１つの部位（特異的結合）について非線形回帰（曲線当てはめ）式を用いた。結果は、ＭＥＤＩ５６１５と、細胞表面ヒトＯＸ４０を発現するＣＨＯ細胞との相互作用についての平均平衡解離定数（ＫＤ）が１８０ｐＭであり、細胞表面ヒトＰＤ−Ｌ１を発現する細胞の場合は８８ｐＭであり、ヒトＯＸ４０及びヒトＰＤ−Ｌ１の両方を発現する細胞の場合は２７０ｐＭであることを明らかにした。ＭＥＤＩ５６１５と、細胞表面カニクイザルＯＸ４０を発現するＣＨＯ細胞との相互作用についてのＫＤは５６ｐＭであり、細胞表面カニクイザルＰＤ−Ｌ１を発現する細胞の場合は１１０ｐＭであり、カニクイザルＯＸ４０及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１の両方を発現する細胞の場合は９９ｐＭである。一方の抗原ＯＸ４０又はＰＤＬ１にのみ結合し得る対照ＢＦＰ２分子を使用して類似の結果が得られた。
ＭＥＤＩ５６１５と種々のＣＨＯ細胞との相互作用についての平衡における２０％、５０％、及び９０％のヒトＯＸ４０受容体占有率を表５に報告する。
Figure 2021502360
ＥＣｘ値は、図４６Ａ〜Ｆに提示されるデータの４パラメータフィットシグモイド用量応答曲線を使用する非線形回帰分析からＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。
受容体の２０％、５０％、及び９０％が試験物質により占有された濃度の決定のため、式Ｘ＝ｌｏｇ［Ｘ］を使用して濃度値（Ｍ）を最初に変換し、続いてＥＣＡｎｙｔｈｉｎｇ（ＥＣｆ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してシグモイド用量応答（変動勾配（ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ））結合曲線からｆ＝２０、ｆ＝５０、及びｆ＝９０について決定した。ＥＣｆは、下及び上の漸近線間の経路の応答ｆパーセントを与える試験物質の濃度であり、２０％（ｆ＝２０）、５０％（ｆ＝５０）、及び９０％（ｆ＝９０）の受容体占有率を表し、計算された曲線の上は１００％の受容体占有率を表す。
遺伝子操作ＣＨＯ細胞上の平衡における２０％、５０％、又は９０％のヒトＯＸ４０受容体占有率を達成するために要求されるＭＥＤＩ５６１５の濃度は、それぞれ４５ｐＭ、１８０ｐＭ及び１６００ｐＭであると計算された。さらに、遺伝子操作ＣＨＯ細胞上の平衡における２０％、５０％、又は９０％のカニクイザルＯＸ４０受容体占有率を達成するために要求されるＭＥＤＩ５６１５の濃度は、それぞれ１４ｐＭ、５６ｐＭ及び５００ｐＭであると計算された。
遺伝子操作ＣＨＯ細胞上の平衡における２０％、５０％、又は９０％のヒトＰＤ−Ｌ１占有率を達成するために要求されるＭＥＤＩ５６１５の濃度は、それぞれ２２ｐＭ、８８ｐＭ及び７９０ｐＭであると計算された。さらに、遺伝子操作ＣＨＯ細胞上の平衡における２０％、５０％、又は９０％のカニクイザルＰＤ−Ｌ１占有率を達成するために要求されるＭＥＤＩ５６１５の濃度は、それぞれ２７ｐＭ、１１０ｐＭ、及び９５０ｐＭであると計算された。
遺伝子操作ＣＨＯ細胞上の平衡における２０％、５０％、又は９０％のヒトＯＸ４０及びＰＤ−Ｌ１占有率を達成するために要求されるＭＥＤＩ５６１５の濃度は、それぞれ６７ｐＭ、２７０ｐＭ及び２，４００ｐＭであると計算された。さらに、遺伝子操作ＣＨＯ細胞上の平衡における２０％、５０％、又は９０％のカニクイザルＯＸ４０及びＰＤ−Ｌ１占有率を達成するために要求されるＭＥＤＩ５６１５の濃度は、それぞれ２５ｐＭ、９９ｐＭ及び８９０ｐＭであると計算された。
したがって、ＭＥＤＩ５６１５は、細胞表面ヒト及びカニクイザルＯＸ４０及びＰＤＬ１を個々に又は一緒に発現する細胞に結合し得る。
実施例２１
活性化ヒトＰＢＭＣ中のＰＤ−１タンパク質の下方調節
この試験において、活性化ヒトＰＢＭＣ中でＰＤ−１タンパク質を下方調節するＢＦＰの能力を評価した。
刺激及びウエスタンプロトコル：新鮮単離ヒトＰＢＭＣを、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（クローンＨＩＴ３ａ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及び抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含有する完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で１００万個の細胞／ｍＬにおいて再懸濁させた（図４７参照）。３日間の刺激後、細胞を回収し、洗浄し、新鮮完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で１００万個／ｍＬにおいて再懸濁させた。合計２ｍＬの細胞を６ウェルプレートのそれぞれのウェルに添加した。細胞を１０ｎＭの試験材料により２４時間刺激した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤を有するＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させ、全細胞溶解物をイムノブロッティングにより分析した。ウエスタンブロットに使用された抗体を表６に列記する。
Figure 2021502360
結果を図４７、４８及び７４に示す。抗ＰＤ１−ＯＸ４０Ｌ ＢＦＰは、活性化ヒトＰＢＭＣ中でＰＤ１タンパク質の分解を誘発することが示され（図４７）、抗ＰＤ１−ＧＩＴＲＬ ＢＦＰ（ＭＥＤＩ３３８７）は、活性化ヒトＰＢＭＣ中でＰＤ１タンパク質の分解を誘発することが示される（図４８）。本発明者らは、ＰＤ１／ＯＸ４０Ｌ ２ＷＴ及び１ＷＴもアイソタイプ対照抗体と比較して有意なＰＤ１分解を誘導したことを見出した（図７４）。したがって、ＰＤ１タンパク質内在化及び分解の誘導は、ＯＸ４０内在化によりドライブされるが、ＯＸ４０活性化とは無関係であり得る。
実施例２２
ＮＦ−κＢのＧＩＴＲＬ活性化
このアッセイは、ＧＩＴＲリガンドによるＧＩＴＲ受容体のエンゲージメントがＮＦＡＴプロモーターによりドライブされるルシフェラーゼ活性を誘導するＪｕｒｋａｔ ＮＦ−κＢ Ｌｕｃ ＦＬ ｈＧＩＴＲクローン２９細胞系を利用する。
ＧＩＴＲタンパク質が形質移入されたＪｕｒｋａｔ−Ｂｌｕｅ ＮＦ−κＢ／Ｌｕｃ ＦＬ ｈＧＩＴＲクローン２９レポーターＴリンパ球を、ＲＰＭＩ−１６４０＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０％のＨＩ−ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地中で維持した。細胞を回収し、１×１０６個の細胞／ｍＬに調整し、平底９６ウェルプレート（５×１０４個の細胞／ウェル；Ｆａｌｃｏｎ）のウェルに添加した（５０μＬ中）。５０マイクロリットルの２×試験試薬をそれぞれのウェルに添加した。Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）緩衝液を室温において計測日に使用前に暗所で解凍した。４時間及び４０分間のインキュベーション後、プレートを室温に２０分間平衡化させておき、次いで１００μＬの室温再構成Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を９６ウェルプレート中のそれぞれのウェルに添加し、計測前にプレートシェーカー中で＞１０分間インキュベートした。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で最適化超高感度ＬＵＭ ９６（ｏｐｔｉ）０．１秒リードを使用して発光読取値を計測した。
図４９は、抗ＰＤ１−ＧＩＴＲＬ ＢＦＰ（ＭＥＤＩ３３８７及びＭＥＤＩ５７７１）がＧＩＴＲが形質移入されたＪｕｒｋａｔ細胞中でＮＦ−κＢ経路を活性化させたことを実証する。
実施例２３
Ｂｉｏ−ｈＧＩＴＲ及びＨＰＤ−１へのＰＤ−１／ＧＩＴＲＬ二重特異的同時結合のＯｃｔｅｔ試験
この実験の目的は、ＯＣＴＥＴバイオレイヤー干渉法を使用してｈｕＰＤ−１及びｈｕＧＩＴＲＬ（ＧＩＴＲリガンド）に同時に結合するＰＤ１／ＧＩＴＲＬ二重特異的融合タンパク質の能力を試験して相互作用を決定することであった。
このプロトコルに使用された材料を以下の表７に概説する。
Figure 2021502360
ビオチン化ｒｈＧＩＴＲ／Ｆｃは、ストレプトアビジンセンサーに結合し、次いでＩＯ二重特異的構築物が会合した。短時間の解離相の後、構築物をｒｈＰＤ−１／Ｆｃに同時に結合するそれらの能力について試験した。
二重特異的融合タンパク質の同時結合は、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４システム及びＯｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアバージョン９（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用してバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により評価した。高精度ストレプトアビジン（ＳＡＸ）ｄｉｐ ａｎｄ ｒｅａｄバイオセンサーを最初にアッセイ緩衝液（ダルベッコＰＢＳ中１％のＢＳＡ、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０）中で１０分間平衡化させた。ベースラインをアッセイ緩衝液中で１分間確立してからビオチン化組換えヒトＧＩＴＲ／Ｆｃ（６８９−ＧＲ−１００，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を３分間捕捉した。第２のベースラインをアッセイ緩衝液中で３０秒間確立してからＧＩＴＲＬドメインを介して二重特異的融合タンパク質を５分間捕捉した。解離／ベースラインをアッセイ緩衝液中で１分間実施してから二重特異的融合タンパク質の抗体構成成分により組換えヒトＰＤ−１／Ｆｃ（１０８６−ＰＤ−０５０，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を５分間捕捉した。結果を図５０に示す。
実施例２４
ＮＦＡＴの活性化におけるＰＤ−１活性
このアッセイは、抗原提示細胞としてＣＨＯ Ｋ１ ＯＫＴ３−ＣＤ１４（ｌｏｗ）ｈＢ７Ｈ１（ｈｉｇｈ）ｃｌ２細胞を、及び抗ＣＤ３活性化レポーター細胞系としてＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｌｕｃ２ ＰＤ１クローン３Ｌ−Ｂ９細胞を利用する。ＰＤ−１遮断抗体によるＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用の阻害は、ＮＦＡＴプロモーターによりドライブされるルシフェラーゼ発現の活性化をもたらす。
ＰＤ−１が形質移入されたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｌｕｃ２ ＰＤ１クローン３Ｌ−Ｂ９レポーターＴリンパ球及びＣＨＯ Ｋ１ ＯＫＴ３−ＣＤ１４（ｌｏｗ）ｈＢ７Ｈ１（ｈｉｇｈ）ｃｌ ２細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０％のＨＩ−ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地中で維持した。細胞を回収し、１×１０６個の細胞／ｍＬに調整し、平底９６ウェルプレート（５×１０４個の細胞／ウェル；Ｆａｌｃｏｎ）のウェルに添加した（５０μＬ中）。５０マイクロリットルの２×試験試薬をそれぞれのウェルに添加した。Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）緩衝液を室温において計測日に使用前に暗所で解凍した。４時間及び４０分間のインキュベーション後、プレートを室温に２０分間平衡化させておき、次いで１００μＬの室温再構成Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を９６ウェルプレート中のそれぞれのウェルに添加し、計測前にプレートシェーカー中で＞１０分間インキュベートした。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で最適化超高感度ＬＵＭ ９６（ｏｐｔｉ）０．１秒リードを使用して発光読取値を計測した。
図５１は、抗ＰＤ１−ＧＩＴＲＬ ＢＦＰ（ＭＥＤＩ３３８７及びＭＥＤＩ５７７１）がＰＤ−１が形質移入されたＪｕｒｋａｔ細胞中でＮＦＡＴ経路を活性化させたことを実証する。上記の実施例８からのものと一致するこれらのデータは、ＭＥＤＩ３３８７及びＭＥＤＩ５７７１ ＢＦＰがヒトＰＤ−１及びＧＩＴＲへの同時結合を実証することを実証する。
実施例２５
抗ＰＤ−１＿ＩＧＧ＿ＧＩＴＲＬインビボアッセイ
マウス及び腫瘍モデル：８〜１０週齢ＢＡＬＢ／ｃ又はＣ５７ＢＬ／６雌マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＵＫ Ｌｔｄ．又はＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．から入手した。１００ｍＬの５×１０６個の細胞／ｍＬ又は５×１０４個の細胞／ｍＬの細胞密度のＣＴ２６（ＡＴＣＣ）又はＢ１６Ｆ１０細胞のＰＢＳ中懸濁液を、それぞれの動物の右脇腹中に皮下注射した。Ｂ１６Ｆ１０細胞系を５０％のＰＢＳ及び５０％の低成長因子及びフェノールレッド不含Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で移植した。細胞系を制限継代まで培養してから移植し、定期的にスクリーニングしてマイコプラズマの不存在を確認した。ＳＴＲプロファイリング（ＩＤＥＸＸ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を介して細胞をさらに確認し、マウスウイルスのパネルについてスクリーニングした（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）。
計測可能な腫瘍を腫瘍容積に基づきそれぞれの群に無作為化した。それぞれの腫瘍の長さ（ｍｍ）及び幅（ｍｍ）を電子ノギスにより週３回計測した。腫瘍の容積（ｍｍ３）を、式［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２］／２に基づき計算した。腫瘍成長応答を、試験終了時に計測可能な腫瘍が存在せず、又は容積が２００ｍｍ３未満であるような持続腫瘍成長阻害が存在する場合に応答として分類した。
検出力計算を実施してインビボ試験のための群サイズを決定した。マウスにｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ、抗プログラム細胞死タンパク質タンパク質−１ ｒＩｇＧ２ａ（ＰＤ−１、クローンＲＭＰ１−１４，ＢｉｏＸＣｅｌｌ）、又は抗マウス−ＰＤ１／ＧＩＴＲＬ二重特異的ｍＡｂのいずれかを腹腔内投与した。試験に応じて、腫瘍細胞接種の６日後から開始し、又は腫瘍が２００ｍｍ３の容積に達した時にマウスに異なる濃度を投与した。結果を図５２に示す。
実施例２６
抗ＰＤ−１＿ＩＧＧ＿ＧＩＴＲＬインビボアッセイ
薬物動態及び薬力学（ＰＫ／ＰＤ）試験
カニクイザルを薬理学的に関連する非臨床種とみなしてＰＤ−１／ＧＩＴＲＬ二重特異的融合タンパク質の機能的活性を試験した。薬物動態（ＰＫ）及び薬力学ＰＤ−１／ＧＩＴＲＬ二重特異的融合タンパク質をカニクイザルにおける非ＧＬＰ（Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）試験において評価した。ＰＫ及びＰＤ（Ｋｉ６７陽性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋総記憶Ｔ細胞パーセント）をカニクイザル（ｎ＝５；雄）において、５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたる単回静脈内（ＩＶ）投与後に評価した。血液試料を投与前並びに投与の１、３、８、１１、１５、１８、２２及び２９日後に回収し、試料回収日にフローサイトメトリーにより分析した。Ｋｉ６７結果は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋総記憶Ｔ細胞（Ｋｉ６７）の用量依存的増加を示した（図５３Ａ〜Ｂ）。
ＰＫ評価のため、血液試料を８、１５、２２及び２９日目の投与の０．５、６、２４、４８及び９６時間後にも回収した。まとめると、ＰＤ−１／ＧＩＴＲＬ二重特異的融合タンパク質は、Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０−ｉｎｆのほぼ比例的な増加をもたらし、この用量範囲内で線形薬物動態を示唆し（図５４）、１．１２〜２．１９日間の短い半減期であった（表８参照）。
Figure 2021502360
ＭＥＤＩ３３８７について、５及び５０ｍｇ／ｋｇの用量についてそれぞれ平均Ｃｍａｘ値は１１１及び１２００ｍｇ／Ｌであり、平均ＡＵＣ０−ｉｎｆ値は１２５及び１０５０ｍｇ・日／Ｌであった。用量正規化ＡＵＣ値は、２つの用量群についてほぼ同様であった。平均ＡＵＣ０−ｉｎｆ／用量は、５、及び５０ｍｇ／ｋｇの用量レベルについてそれぞれ２４．９、及び２０．９であった。ＭＥＤＩ５７７１について、５、及び５０ｍｇ／ｋｇの用量についてそれぞれ平均Ｃｍａｘ値は７７．１及び７３０ｍｇ／Ｌであり、平均ＡＵＣ０−ｉｎｆ値は１０８及び８００ｍｇ・日／Ｌであった。用量正規化ＡＵＣ値は、２つの用量群についてほぼ同様であった。平均ＡＵＣ０−ｉｎｆ／用量は、５、及び５０ｍｇ／ｋｇの用量レベルについてそれぞれ２１．５、及び１６．０であった。
実施例２７
抗ＰＤ−１＿ＩＧＧ＿ＧＩＴＲＬ ＢＦＰは、プライマリーヒトＴ細胞再活性化アッセイにおいてＴ細胞エフェクター機能を向上させる
Ｃｙｔｏｓｔｉｍ Ｔ細胞再活性化アッセイの模式図を図５５Ａに示す。
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７−１４４０−０２）を製造業者の推奨プロトコルに従って使用してＰＢＭＣを白血球コーン（ＮＨＳＢＴ，Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌにより供給）から調製した。Ｔ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ カタログ：１９０５１）を製造業者の推奨プロトコルに従って使用してドナーＰＢＭＣからＴ細胞を陰性選択により単離した。次いで、Ｔ細胞をＴ細胞培地（５％のヒトＡＢ血清［Ｓｉｇｍａ］及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンが補給されたＧｌｕｔａｍａｘ（商標）［Ｇｉｂｃｏ］を有するＲＰＭＩ１６４０）中で１Ｅ６個の細胞／ｍＬの濃度において再懸濁させ、３７℃、５％のＣＯ２において、抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３，Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ カタログ：１６−００３７−８５）により事前にコーティングされた６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ：３５０６）中で９６時間刺激した。６ウェルプレートをコーティングするため、０．２μｇのＯＫＴ３を含有する１ｍＬのＰＢＳをそれぞれのウェルに添加し、４℃において一晩インキュベートした。プレートを使用前にＰＢＳにより２回洗浄した。
次いで、Ｔ細胞を洗浄し、新鮮Ｔ細胞培地中で、３７℃、５％のＣＯ２において刺激なしでさらに２４時間インキュベートした。続いて、これらの「休止」Ｔ細胞をＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ３陽性選択キットＩＩ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ，１７８５１）を製造業者の推奨プロトコルに従って使用してＴ細胞を事前に枯渇させた自己ＰＢＭＣと１：４の比において混合した。得られた細胞混合物を９６ウェルＵ字底組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ ８７９７ＢＣ）中に、試験薬物又は対照ｍＡｂと一緒にヒトＣｙｔｏｓｔｉｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０−０９２−１７３）が４００分の１の濃度において補給されたＴ細胞培地中でアリコート化した。それぞれの反応物は、２００μＬの総容量を有し、５Ｅ５個の細胞を含有した。反応物を３７℃、５％のＣＯ２において７２時間インキュベートし、その後に上清を取り出し、続いてＥＬＩＳＡによりＩＮＦ−ｙ放出について試験した。
結果を図５５Ｂ〜Ｃに示す。ＭＥＤＩ３３８７及びＭＥＤＩ５７７１は、単一特異的（ＰＤ−１及びＧＩＴＲＬ）分子の組合せよりも＞４倍強力であり、したがって、ＢＦＰフォーマットに起因する予想外の相乗効果を説明する。上記のインビトロデータ（図５５Ｄ〜Ｅ）は、ＧＩＴＲＬ（ＭＥＤＩ１８７３）／デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）又はＭＥＤＩ１８７３／ａＰＤ−１ ｍＡｂ（ＬＯ１１５）のいずれの組合せともＭＥＤＩ３３８７及びＭＥＤＩ５７７１についての生物学的同等性を実証する。インビボデータは、ＭＥＤＩ１８７３／ａＰＤ−１ ｍＡｂの組合せとの生物学的同等性を実証する。
実施例２８
インビボでのＧＩＴＲの蛍光生体分布
０日目、６／８週齢の雌ＳＣＩＤマウスにヒト肺腫瘍細胞系ＮＣＩ−Ｈ３５８（５ｅ５個の細胞／マウス）を皮下注射した。蛍光（ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ）標識抗体（１００μＬ／２５ｇの投与容量の１０ｍｇ／ｋｇ）の単回静脈内投与は、腫瘍サイズが約２００〜３００ｍｍ３であった２５日目に行った。３つ全ての抗体をＩＲＤｙｅ ８００ＣＷにより製造業者のプロトコルに従ってインビボ注射の２週間前に標識した。処理群当たり５匹のマウスを麻酔し、ＩＶＩＳスペクトルを使用して投与の１時間、２４時間、及び９６時間後にイメージングした。蛍光色素について最適な波長設定を選択し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ画像分析ソフトウェアを使用して腫瘍及び肝臓領域について放射効率値を決定した。結果は、ＭＥＤＩ３３８７、ＭＥＤＩ５７７１及びＭＥＤＩ１８７３についての肝臓生体分布プロファイル間に有意差が存在しないことを実証する（図５６）。
実施例２９
抗ＰＤ−Ｌ１−ＴＮＦ−α ＢＦＰは、Ｔ２４腫瘍細胞の細胞表面上のＰＤ−Ｌ１タンパク質の下方調節を誘発する。
Ｔ２４は、ＴＮＦ−α受容体及びＰＤ−Ｌ１の両方を構成的に発現するヒト膀胱移行上皮癌細胞系である。この試験において、Ｔ２４細胞を１０ｎＭの濃度の試験材料と混合し、３７℃において２４時間インキュベートした。インキュベーション後、遊離抗体を洗浄により除去し、細胞表面上のＰＤ−Ｌ１タンパク質の量をＱｉｆｉｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）により定量した。簡潔に述べると、処理後のＴ２４細胞を非コンジュゲート抗ＰＤ−Ｌ１（クローン２９Ｅ．２Ａ３）と氷上で３０分間反応させ、次いでＦＩＴＣコンジュゲートＦ（ａｂ）２ヤギ抗マウスＩｇＧとさらに３０分間反応させた。ＦＩＴＣシグナルの平均蛍光強度を記録し、Ｔ２４細胞上の細胞当たりのＰＤ−Ｌ１抗原の量を製造業者の説明書に従って計算した。
細胞生存に対する効果を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）細胞生存キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）により評価した。この試験において、１０，０００個／ウェルのＴ２４細胞を上記のとおり処理された不透明壁マルチウェルプレート中で培養し、インキュベーション後、Ｔ２４細胞を希釈ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬と混合した。内容物をオービタルシェーカー上で２分間混合して細胞溶解を誘導し、プレートを室温において１０分間インキュベートして発光シグナルを安定化させた。発光をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダー上で記録した。図５７は、抗ＰＤ−Ｌ１−ＴＮＦ−α ＢＦＰがＴ２４腫瘍細胞中でＰＤ−Ｌ１タンパク質の下方調節を誘発することを実証する。この結果は、ＣＤ４０を別のＴＮＦ−αファミリータンパク質と置き換える別のＢＦＰ分子が細胞表面ＰＤ−Ｌ１の下方調節を誘発し得ることを実証する。
実施例２９
抗ＰＤ−Ｌ１−ＴＮＦ−α ＢＦＰは、Ｔ２４腫瘍細胞の細胞表面上のＰＤ−Ｌ１タンパク質の下方調節を誘発する。
ＴＨＰ１−ｂｌｕｅ細胞に対する別のアッセイを実施例４に上記のとおり設定し、但し、試験試薬を抗ＰＤＬ１−ＴＮＦ−α ＢＦＰ３及びＴＮＦ−α ＦＰ及びアイソタイプ対照と置き換えた。図５８は、抗ＰＤＬ１−ＴＮＦ−α ＢＦＰがＴＨＰ１骨髄細胞上のＮＦ−κＢ経路を活性化させることを実証する。
実施例３０
抗ＰＤ−１−ＯＸ４０ ＢＦＰは内在化をドライブする。
下記の試験は、抗ＰＤ−１−ＯＸ４０ ＢＦＰが内在化をドライブし得ることを示す。これは、ＯＸ４０アームがアゴニスト抗体であるか非アゴニスト抗体であるかを問わない。この知見は、自己免疫空間に直接適用可能である。結果は、非アゴニストであるが内在化する抗体を用いて構築された二重特異物を使用して活性化受容体の内在化をドライブすることができることを示す。図６３〜６４及び７０〜７４参照。これらの結果は、ＰＤ−１の分解がこの二重特異的状況においてＯＸ４０アゴニスト機能と無関係であることも示す。
結論
ＣＤ４０Ｌ ＦＰと類似するＭＥＤＩ７５２６は、ＣＤ４０の急速な下方調節を誘導した。興味深いことに、ＭＥＤＩ７５２６が、複数の細胞のタイプ、例として、ＴＨＰ１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、及びヒト単球上で細胞表面上のＰＤ−Ｌ１の急速でロバストな下方調節も誘発することが見出された。これらの細胞の全ては、ＣＤ４０を発現する。さらに、ＭＥＤＩ７５２６は、細胞表面上のＰＤ−Ｌ１を下方調節しただけでなく、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の総細胞量も有意に低減させ、ＰＤ−Ｌ１の強制的内在化がその分解を誘発し得ることを示唆した。さらに、抗ＰＤ−Ｌ１−ＴＮＦ−α ＢＦＰは、同様にＴ２４腫瘍細胞中でＰＤ−Ｌ１タンパク質の下方調節を誘発した。この結果は、ＣＤ４０を別のＴＮＦ−αファミリータンパク質と置き換える別のＢＦＰ分子が細胞表面ＰＤ−Ｌ１の下方調節を誘発し得ることを実証する。追加のＢＦＰ分子も同様にＰＤ−Ｌ１の下方調節を調節し得ることが考えられる。
これらの新規二重特異的分子からの本明細書に記載のデータは、それら２つの１つの「足場」への組合せが、組合せ療法単独について達成不可能な結果を生成することを実証する。ＭＥＤＩ７５２６（ＢＦＰ３）は、ＣＤ４０経路を刺激し、ＰＤ−Ｌ１発現を下方調節するそのユニークな機能を介して、癌に対する有望な治療アプローチをなす。
同様に、抗ＰＤ１−ＧＩＴＲＬ ＢＦＰ（ＭＥＤＩ３３８７）及び抗ＰＤ１−ＯＸ４０Ｌ ＢＦＰは、活性化ヒトＰＢＭＣ中でＰＤ１タンパク質の分解を誘発することが示され、このことは癌を撲滅するための別の治療選択を提供し得る。
図５９は、ＭＥＤＩ７５２６（ＢＦＰ３）について提案されるＭＯＡを説明する。具体的には、ＣＤ４０ライゲーションを介して抗原提示細胞を活性化させる一方、細胞表面からＰＤ−Ｌ１を同時に除去することにより、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１０の誘導をもたらすが、ＴＮＦ−αの誘導もＩＬ−６の誘導ももたらさない。ＴＮＦ−α及びＩＬ−６誘導の不存在は、向上した抗腫瘍機能及び低減した重量損失と相関し、ＭＥＤＩ７５２６が向上した抗腫瘍応答を低減した毒性で誘導し得るという結論を支持する。
ネズミ試験は、ＭＥＤＩ７５２６が肝腫瘍を治療する潜在性を有することをさらに裏付ける。
他の実施形態
上記の記載から、本明細書に記載の本開示に対して変形及び改変を行ってそれを種々の使用法及び条件に適合させることができることが明らかである。このような実施形態も、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本明細書における可変部の任意の定義中の要素の列記の記述は、列記要素の任意の単一要素又は組合せ（又は下位組合せ）としてのその可変部の定義を含む。本明細書における実施形態の記述は、任意の単一の実施形態としての、又は任意の他の実施形態若しくはその一部との組合せのその実施形態を含む。
本明細書において挙げられる全ての特許及び刊行物は、それぞれの独立特許及び刊行物が参照により組み込まれることが具体的及び個別的に示されるのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
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Claims (38)

  1. 二重特異的融合タンパク質であって、
    第１の細胞表面標的に特異的な第１の結合領域、Ｆｃ単量体、及び第２の細胞表面標的に特異的な第２の結合領域を含む単鎖融合タンパク質
    を含み、
    前記第１の結合領域及び前記第２の結合領域は、ペプチドリンカーを介して前記Ｆｃ単量体に共有結合しており、
    前記第１の細胞表面標的及び前記第２の細胞表面標的に同時に結合し得る二重特異的融合タンパク質。
  2. 前記第１の結合領域及び前記第２の結合領域の少なくとも１つが、Ｆａｂ断片又は受容体リガンドである、請求項１に記載の二重特異的融合タンパク質。
  3. 前記Ｆａｂ断片が、抗ＰＤ−１ Ｆａｂ断片である、請求項２に記載の二重特異的タンパク質。
  4. 前記Ｆａｂ断片が、抗ＰＤ−Ｌ１ Ｆａｂ断片である、請求項２に記載の二重特異的融合タンパク質。
  5. 前記Ｆｃ単量体が、ＩｇＧ１ Ｆｃ単量体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の二重特異的融合タンパク質。
  6. 前記ＩｇＧ１ Ｆｃ単量体が、配列番号６と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の二重特異的融合タンパク質。
  7. 前記Ｆｃ単量体が、ＩｇＧ４ Ｆｃ単量体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の二重特異的融合タンパク質。
  8. 前記ＩｇＧ４ Ｆｃ単量体が、配列番号９と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の二重特異的融合タンパク質。
  9. 前記Ｆｃ単量体が、ヒンジ領域を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の二重特異的融合タンパク質。
  10. 前記Ｆｃ単量体が、ヒトＦｃアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の二重特異的融合タンパク質。
  11. 前記１つ以上のリガンドサブユニットの少なくとも１つが、ＧＩＴＲＬである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異的融合タンパク質。
  12. 前記１つ以上のリガンドサブユニットの少なくとも１つが、ＯＸ４０Ｌである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異的融合タンパク質。
  13. 前記１つ以上のリガンドサブユニットの少なくとも１つが、ＣＤ４０Ｌである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異的融合タンパク質。
  14. 前記ＣＤ４０Ｌリガンドサブユニットが、１９４位におけるＴｒｐ残基を含む、請求項１３に記載の二重特異的融合タンパク質。
  15. １９４位における前記Ｔｒｐ残基が、Ｃ→Ｗ置換である、請求項１４に記載の二重特異的融合タンパク質。
  16. 前記１つ以上のリガンドサブユニットの少なくとも１つが、ＴＮＦ−αである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異的融合タンパク質。
  17. 前記１つ以上のリガンドサブユニットの少なくとも１つが、ＣＤ１３７Ｌである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異的融合タンパク質。
  18. 前記Ｆａｂ断片が、前記Ｆｃ単量体のＮ末端に結合している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異的融合タンパク質。
  19. 前記１つ以上のリガンドサブユニットが、前記Ｆｃ単量体のＣ末端に結合している、請求項１８に記載の二重特異的融合タンパク質。
  20. 前記Ｆａｂ断片が、前記Ｆｃ単量体のＣ末端に結合している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異的融合タンパク質。
  21. 前記１つ以上のリガンドサブユニットが、前記Ｆｃ単量体のＮ末端に結合している、請求項２０に記載の二重特異的融合タンパク質。
  22. 前記単鎖融合タンパク質が、複数のリガンドサブユニットを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の二重特異的融合タンパク質。
  23. 前記複数のリガンドサブユニットが、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のリガンドサブユニットを含む、請求項２２に記載の二重特異的融合タンパク質。
  24. 前記単鎖融合タンパク質が、３つのリガンドサブユニットを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の二重特異的融合タンパク質。
  25. 前記リガンドサブユニットが、Ｎ末端からＣ末端まで連続的に結合している３つのリガンドサブユニットとのホモ三量体を形成する、請求項２４に記載の二重特異的融合タンパク質。
  26. 前記ペプチドリンカーが、約９〜約２０アミノ酸を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の二重特異的融合タンパク質。
  27. 前記ペプチドリンカーが、約９〜約１５アミノ酸を含む、請求項２６に記載の二重特異的融合タンパク質。
  28. 前記ペプチドリンカーが、約９アミノ酸を含む、請求項２７に記載の二重特異的融合タンパク質。
  29. 前記ペプチドリンカーが、１つ以上のグリシン（Ｇｌｙ）又はセリン（Ｓｅｒ）残基を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の二重特異的融合タンパク質。
  30. 前記ペプチドリンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３５）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３６）である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の二重特異的融合タンパク質。
  31. 請求項１〜３０のいずれか一項に記載の二重特異的融合タンパク質から選択される２つの二重特異的融合タンパク質を含む二量体であって、前記Ｆｃ単量体の相互作用を介して形成される二量体。
  32. 対象における抗腫瘍免疫応答を向上させる方法であって、前記対象に請求項１〜３１のいずれか一項に記載の単離融合タンパク質又は二量体を投与することを含む方法。
  33. 前記対象が、癌を有する、請求項３２に記載の方法。
  34. 免疫応答及び／又は抗癌応答の１つ以上を向上させる、請求項３３又は３４に記載の方法。
  35. 前記単離融合タンパク質又は二量体の親試薬による治療と比較して低減した毒性をもたらす、請求項３３又は３４に記載の方法。
  36. 癌を治療する方法であって、癌の治療が必要とされる患者を請求項１３に記載の二重特異的融合タンパク質により治療することを含む方法。
  37. 化学療法薬による治療をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記癌が、肝臓癌である、請求項３６に記載の方法。
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