BR112020008978A2 - polipeptídeos de fusão biespecíficos e seus métodos de uso - Google Patents

Abstract

São aqui fornecidos proteínas de fusão biespecíficas e métodos de utilização das proteínas de fusão biespecíficas para o tratamento de câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLI-

PEPTÍDEOS DE FUSÃO BIESPECÍFICOS E SEUS MÉTODOS DE USO". LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[001] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente em formato de ASCII e está aqui incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia de AS- CII, criada em 2 de novembro de 2018, é nomeada IOBS-110-WO- PCT_SL.txt e está em 105,745 bytes em tamanho.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O câncer continua a ser um grande problema da saúde glo- bal. Em 2016, apenas nos Estados Unidos, estima-se que mais de 1,5 milhões de novos casos sejam diagnosticados e mais de 500,000 pes- soas que morrem da doença (ver Cancer Statistics de National Cancer Institute, National Institutes of Health). Globalmente, estima-se que quase 1 em cada 6 mortes possa ser atribuída ao câncer (ver Cancer Fact Sheet, fevereiro de 2017, Organização Mundial da Saúde).

[003] Apesar dos progressos significativos realizados ao longo da última década no desenvolvimento de estratégias para combater o câncer e outras doenças, os pacientes com doença avançada, refratá- ria e metastática têm opções clínicas limitadas. A quimioterapia, a irra- diação e a quimioterapia com elevadas doses tornaram-se limitantes da dose (e em muitos casos meramente prolongam a vida do paciente, embora com efeitos colaterais significativamente debilitantes). Portan- to, continua a haver uma necessidade médica não atendida de terapi- as anticâncer novas e eficazes para aqueles pacientes com câncer avançado e/ou resistente ao tratamento. Além disso, há também a ne- cessidade de terapias anticâncer menos tóxicas e mais direcionadas.

[004] Uma fonte potencial de novas terapias anticâncer, não- tóxicas é um sistema imunológico do próprio paciente. O papel do sis-

tema imune, em particular a citotoxicidade mediada por células T, no controle do tumor é bem reconhecido. Existem evidências crescentes de que as células T podem controlar o crescimento do tumor e sobre- vivência em pacientes com câncer, em ambas as fases inicial e avan- çada da doença. No entanto, as respostas de células T específicas do tumor são difíceis de desenvolver e manter em pacientes com câncer.

[005] Os exemplos de vias de sinalização de células T que po- dem influenciar as respostas das células T específicas do tumor envol- vem as proteínas de sinalização, tais como o antígeno 4 de linfócitos T citotóxicos (CTLA-4, CD152), ligando de morte programada 1 (PD-L1, também conhecido como B7-H1 ou CD274), ligando de CD40 (CD40L), proteína relacionada ao receptor de TNF (TNFR) induzida por glicocorticoide (GITR), OX40, e CD137 (4-1BB).

[006] CD40L é um membro da família de moléculas do fator de necrose tumoral (TNF), que é expresso principalmente em células T ativadas (incluindo os subtipos Th0, Th1 e Th2) e formas homotríme- ras semelhantes a outros membros desta família. Além disso, CD40L também foi encontrado expresso em mastócitos e basófilos e eosinófi- los ativados. CD40L se liga ao seu receptor de CD40 nas células que apresentam o antígeno (APC), que conduz a muitos efeitos dependen- do do tipo de célula alvo. Em geral, o CD40L desempenha o papel de uma molécula coestimulatória e induz a ativação da APC em associa- ção com a estimulação do receptor das células T por moléculas de MHC em APC.

[007] A sinalização através de CD40 por CD40L inicia uma cas- cata de eventos que resultam na ativação das células portadoras de CD40 e ótimo pré-condicionamento das células T. Mais especificamen- te, a sinalização CD40L/CD40 promove a diferenciação das células B em células secretoras de anticorpos e células B de memória (Burkly, In Adv. Exp. Med. Bio., Vol. 489., D. M. Monroe, U. Hedner, M. R. Ho-

ffman, C. Negrier, G. F. Savidge e G. C. I. White, eds. Klower Acade- mic/Plenum Publishers, 2001, p. 135). Além disso, a sinalização CD40L/CD40 promove imunidade mediada por células através da ati- vação de macrófagos e células dendríticas, que promovem respostas imunes antitumorais através de células assassinas naturais e a estimu- lação de linfócitos T citotóxicos específicos para antígenos tumorais (ver Burkly, supra).

[008] O PD-L1 é também parte de um sistema complexo de re- ceptores e ligantes envolvidos no controle da ativação das células T. Em tecido normal, PD-L1 é expresso em células T, células B, células dendríticas, macrófagos, células tronco mesenquimais, mastócitos de- rivados da medula óssea, e várias células não hematopoiéticas. A sua função normal é regular o equilíbrio entre ativação e tolerância das cé- lulas T através da interação com os seus dois receptores: morte pro- gramada 1 (também conhecido como PD-1 ou CD279) e CD80 (tam- bém conhecido como B7-1 ou B7,1). O PD-L1 também é expresso em uma ampla gama de cânceres com elevada frequência e atua em vá- rios sítios para ajudar os tumores a evitar a detecção e eliminação pelo sistema imunológico do hospedeiro. Em alguns cânceres, a expressão de PD-L1 tem sido associada a sobrevivência reduzida e prognóstico desfavorável. Os anticorpos que bloqueiam a interação entre PD-L1 e seus receptores (por exemplo PD-1) são capazes de aliviar os efeitos imunossupressores dependentes de PD-L1 e aumentar a atividade ci- totóxica de células T antitumorais in vitro e in vivo.

[009] GITR (também conhecida como TNFRSF18, AITR ou CD357) é expressa em células T reguladoras e é sobrerregulada em células auxiliares CD4+ experientes em antígeno e células T citotóxi- cas CD8+ também como células assassinas naturais ativadas (Stephens et al. J Immunol. (2004) 173(8): 5008-5020; Clothier e Watts, Cytokine Growth Factor Rev. (2014)). GITR é parte de um sis-

tema complexo de receptores e ligantes que estão envolvidos no con- trole da ativação das células T por exposição ao antígeno. GITR tem um ligando endógeno conhecido, o ligando GITR (GITRL), que existe de forma vagamente trimérica e pode agrupar GITR resultando em po- tentes eventos de sinalização celular dentro de células T (Chattopad- hyay et al. (2007) Proc. Natl. Acad Sci. EUA 104(49): 19452-19457). A interação entre GITR e GITRL fornece um sinal coestimulatório positi- vo para as células T, o que aumenta a proliferação e ativação por ex- posição a antígenos, ajuda a promover a geração de células de memó- ria e reprograma as células T reguladoras para reduzir suas funções supressoras (Clothier e Watts, Cytokine Growth Factor Rev. (2014) 4 de jan.; Schaer et al. Curr Opin Immunol. (2012)).

[0010] OX40 (CD134; TNFRSF4) é outro receptor de TNF encon- trado principalmente em células T CD4+ e CD8+ ativadas, células T reguladoras (Treg) e células assassinas naturais (Croft et al., 2009, Immunol Rev. 229:173-91). OX40 tem um ligando endógeno conheci- do, o ligando OX40 (OX40L; CD152; TNFSF4), que existe em uma forma trimérica e que pode agrupar o OX40 resultante em potentes eventos de sinalização da célula dentro das células T (Croft et al., 2009, Immunol Rev. 229:173-91). A sinalização através do OX40 em células T CD4+ e CD8+ ativadas conduz à produção melhorada de ci- tocina, liberação de granzima e perforina e expansão de agrupamen- tos de células efetoras e T de memória (Jensen et al., 2010, Semin Oncol. 37:524-32). Além disso, a sinalização OX40 nas células Treg inibe a expansão de Tregs, desliga a indução de Tregs e bloqueia a função supressora de Treg (Voo et al., 2013, J Immunol. 191:3641-50; Vu et al., 2007, Blood. 110: 2501-10).

[0011] Estudos de imuno-histoquímica e análises iniciais de cito- metria de fluxo mostraram que OX40 é expresso em células T que se infiltram numa ampla gama de cânceres humanos (Baruah et al., 2011,

Immunobiology 217:668-675; Curti et al, 2013, Cancer Res. 73:7189- 98; Ladanyi et al, 2004, Clin Cancer Res. 10:521-30; Petty et al, 2002, Am J Surg. 183:512-8; Ramstad et al, 2000, Am J Surg. 179:400-6; Sarff et al, 2008, Am J Surg. 195:621-5; discussão 625; Vetto et al, 1997, Am J Surg. 174: 258-65). A expressão de OX40 em linfócitos infiltrantes de tumor se correlaciona com maior sobrevivência em vá- rios cânceres humanos, sugerindo que os sinais de OX40 podem de- sempenhar um papel crítico no estabelecimento de uma resposta imu- ne antitumoral (Ladanyi et al., 2004, Clin Cancer Res. 10:521-30; Petty et al., 2002, Am J Surg. 183: 512-8).

[0012] CD137 (4-1BB), como GITR, é uma molécula do ponto de checagem coestimulatória que é expressa em células T ativadas e cé- lulas NK. CD137L (ligando CD137) é expresso por células apresenta- doras de antígenos e tem sido associado à ativação do sistema imuno- lógico para eliminar tumores em vários tipos de câncer. CD137 é ex- presso em níveis mais elevados nas células T CD8+ doque nas células T CD4+ e coestimula principalmente as células T CD8+. A reticulação de CD137 aumenta fortemente a proliferação, a secreção de IFN-γ e a atividade citolítica das células T. Além disso, foi relatado que agonistas de CD137, tais como anticorpos, funcionam sinergicamente com vaci- nas contra o câncer e inibidores do ponto de checagem imunológico para aumentar as respostas imunes ao câncer. (Dharmadhikari et al., 2016, Oncoimmunology 5(4): e1113367).

[0013] As vias de sinalização de células T acima mencionadas (e outras) desempenham um papel no controle de respostas de células T específicas de tumores. No entanto, a importância relativa de diferen- tes vias de sinalização de células T no contexto de indução e manu- tenção de uma resposta antitumoral desejada mediada por células T ainda precisa ser elucidada. De fato, a interação entre diferentes vias de sinalização de células T pode levar a efeitos sinérgicos no contexto do tratamento do câncer. Portanto, existe uma necessidade na técnica de novos agentes capazes de maximizar a citotoxicidade mediada por células T via controle melhorado das vias de sinalização de células T. Tais agentes poderiam fornecer terapias anticâncer menos tóxicas e mais direcionadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0014] São aqui fornecidas proteínas de fusão biespecíficas e métodos da sua utilização para controlar a citotoxicidade mediada por células T.

[0014] Em um aspecto, a divulgação aqui fornece uma proteína de fusão biespecífica, compreendendo uma proteína de fusão de cadeia única compreendendo uma primeira região de ligação específica para um primeiro alvo de superfície celular, um monômero Fc e uma se- gunda região de ligação específica para uma segundo alvo de superfí- cie celular, em que a primeira região de ligação e a segunda região de ligação estão ligadas covalentemente ao monômero Fc através de um ligante peptídico e em que a proteína de fusão biespecífica é capaz de ligar o primeiro alvo de superfície celular e o segundo alvo de superfí- cie celular ao mesmo tempo.

[0015] Em certos aspectos, a pelo menos uma da primeira região de ligação e da segunda região de ligação é um fragmento Fab ou um ligando receptor.

[0016] Em outros aspectos, o fragmento Fab é um fragmento Fab anti-PD-1 ou anti-PD-L1.

[0017] Em aspectos adicionais, a pelo menos uma das uma ou mais subunidades de ligantes é GITRL, OX40L, TNF-α. CD137L ou CD40L.

[0018] Em outro aspecto, a divulgação aqui fornecida fornece um método de tratamento de câncer, compreendendo o tratamento de um paciente em necessidade do mesmo com a proteína de fusão biespe- cífica, como aqui divulgado.

[0019] Essas e outras características e vantagens da presente di-

vulgação serão mais bem compreendidas a partir da seguinte descri- ção detalhada da divulgação, tomada em conjunto com as reivindica- ções anexas. Note-se que o escopo das reivindicações é definido pe- las recitações aqui contidas e não pela discussão específica sobre ca- racterísticas e vantagens estabelecidas na presente descrição.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0020] FIG. 1 Representação esquemática de uma proteína de fu- são biespecífica contemplada (BFP), incluindo um primeiro domínio de ligação (BD1), um segundo domínio de ligação (BD2), e uma região Fc de imunoglobulina. O BD2 pode ser ligado à região Fc através de uma porção da região de charneira da região Fc. O BD1 pode ser ligado à região Fc através de ligantes peptídicos. Da mesma forma, as subuni- dades da porção BD1 (aqui mostradas com 3 subunidades, embora menos ou mais sejam contempladas) podem ser interconectadas por meio de ligantes peptídicos.

[0021] FIG. 2 Estruturas diferentes de proteínas de fusão biespecí- ficas contempladas incluindo proteínas de fusão monoespecíficas e biespecíficas. Uma proteína de fusão monoespecífica é MEDI5083, que tem um formato de região BD1_Fc semelhante a um anticorpo de IgG e que é produzida como uma proteína de fusão de cadeia única dimerizada, onde BD1 = 2x trímero CD40L, com as subunidades de CD40L ligadas por ligantes peptidicos, e Fc é uma região Fc de IgG4 única (CH2 e CH3)). MEDI5083 é estruturalmente comparável a ME- DI4736 (Durvalumab, um anticorpo anti-PD-L1, onde BD1 = anti- P D- L1 F(ab)2; Fc = IgG1 TM ("mutação tripla", com L234F/L235E/P331S em IgG1 humana). Em contraste são duas iterações (BFP2 e BFP3) dos formatos de proteína de fusão biespecífica. BFP2, que é de 203 kDa em tamanho na iteração mostrada, tem um formato BD1_Fc_BD2 (de N para C), em que BD1 é 2x trímeros CD40L, Fc é uma região Fc de IgG4 e BD2 é 2x anti-PD-L1 scFv. BFP3, com tamanho de 242 kDa na iteração mostrada, tem um formato BD2_Fc_BD1, em que BD2 é um anti-PD-L1 F(ab)2 (por exemplo, retirado de MEDI4736), Fc é uma região Fc de IgG4 única e BD1 é 2x trímero CD40L.

[0022] FIG. 3 Modalidades específicas de BFP3s contempla- dos. FIG. 3A representa uma proteína de fusão biespecífica incluindo 2 fragmentos Fab direcionados a PD-1, um núcleo de polipeptídeo IgG1 Fc e 6 subunidades GITRL. FIG. 3B representa uma proteína de fusão biespecífica incluindo 2 fragmentos Fab direcionados a PD-L1, um núcleo de polipeptídeo IgG1 Fc e 6 subunidades GITRL. FIG. 3C representa uma proteína de fusão biespecífica incluindo 2 fragmentos Fab direcionados a PD-1, um núcleo de polipeptídeo IgG1 Fc e 6 su- bunidades OX40L. FIG. 3D representa uma proteína de fusão biespe- cífica incluindo 2 fragmentos Fab direcionados a PD-L1, um núcleo de polipeptídeo IgG1 Fc e 6 subunidades OX40L. FIG. 3E representa uma proteína de fusão biespecífica incluindo 2 fragmentos Fab direciona- dos a PD-1, um núcleo de polipeptídeo IgG1 Fc e 6 subunidades CD40L. FIG. 3F representa uma proteína de fusão biespecífica inclu- indo 2 fragmentos Fab direcionados a PD-L1, um núcleo de polipeptí- deo IgG1 Fc e 6 subunidades CD40L. FIG. 3G representa uma proteí- na de fusão biespecífica incluindo 2 fragmentos Fab direcionados a PD-1, um núcleo de polipeptídeo IgG1 Fc e 6 subunidades TNF-α. FIG. 3H representa uma proteína de fusão biespecífica incluindo 2 fra- gmentos Fab direcionados a PD-L1, um núcleo de polipeptídeo IgG1 Fc e 6 subunidades TNF-α. FIG. 3I representa uma proteína de fusão biespecífica incluindo 2 fragmentos Fab direcionados a PD-1, um nú- cleo de polipeptídeo IgG1 Fc e 6 subunidades CD137L. FIG. 3J repre- senta uma proteína de fusão biespecífica incluindo 2 fragmentos Fab direcionados a PD-L1, um núcleo de polipeptídeo IgG1 Fc e 6 subuni- dades CD137L. FIG. 3K representa uma proteína de fusão biespecífi- ca incluindo 2 fragmentos Fab direcionados a PD-1, um núcleo de po-

lipeptídeo IgG4 Fc e 6 subunidades GITRL. FIG. 3L representa uma proteína de fusão biespecífica incluindo 2 fragmentos Fab direciona- dos a PD-L1, um núcleo de polipeptídeo IgG4 Fc e 6 subunidades GI- TRL. FIG. 3M representa uma proteína de fusão biespecífica incluindo 2 fragmentos Fab direcionados a PD-1, um núcleo de polipeptídeo IgG4 Fc e 6 subunidades OX40L. FIG. 3N representa uma proteína de fusão biespecífica incluindo 2 fragmentos Fab direcionados a PD-L1, um núcleo de polipeptídeo IgG4 Fc e 6 subunidades OX40L. FIG. 3O representa uma proteína de fusão biespecífica incluindo 2 fragmentos Fab direcionados a PD-1, um núcleo de polipeptídeo IgG4 Fc e 6 su- bunidades CD40L. FIG. 3P representa uma proteína de fusão biespe- cífica incluindo 2 fragmentos Fab direcionados a PD-L1, um núcleo de polipeptídeo IgG4 Fc e 6 subunidades CD40L. FIG. 3Q representa uma proteína de fusão biespecífica incluindo 2 fragmentos Fab direci- onados a PD-1, um núcleo de polipeptídeo IgG4 Fc e 6 subunidades TNF-α. FIG. 3R representa uma proteína de fusão biespecífica incluin- do 2 fragmentos Fab direcionados a PD-L1, um núcleo de polipeptídeo IgG4 Fc e 6 subunidades TNF-α. FIG. 3S representa uma proteína de fusão biespecífica incluindo 2 fragmentos Fab direcionados a PD-1, um núcleo de polipeptídeo IgG4 Fc e 6 subunidades CD137L. FIG. 3T representa uma proteína de fusão biespecífica incluindo 2 fragmentos Fab direcionados a PD-L1, um núcleo de polipeptídeo IgG4 Fc e 6 su- bunidades CD137L.

[0023] FIG. 4 Adicionais proteínas de fusão biespecíficas formata- das para BFP3 específicas: anti-PD-L1_Fc_TNF- (A), anti- PD1_Fc_OX40L (B); e anti-PD1_Fc_GITRL (C). O fragmento anti-PD- L1 F(ab) foi derivado de MEDI4736 e os fragmentos anti-PD-1 F(ab) foram derivados de um anticorpo anti-PD1 (LO115). Os domínios de ligação a TNF-α, OX40L, e GITRL incluem, cada um, 2 conjuntos de repetições de trímero de cada subunidade de proteína ligadas entre si através de ligantes peptídicos.

[0024] FIGS. 5A-5D. BFP 2 e 3 ligam-se com CD40 e PD-L1. FIGS. 5A-5D mostram a ligação simultânea de proteínas CD40 e PD- L1 por moléculas anti-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L BFP 2 e 3 por um en- saio de Octeto.

[0025] FIGS. 6A e 6B. BFP2 & BFP3 retêm a capacidade para ligar a CD40. As moléculas anti-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L BFP 2 e 3 demonstram semelhantes capacidades de ligar a CD40 na superfície celular em comparação com CD40L FP parental (proteína de fusão) em um ensaio baseado em citometria de fluxo.

[0026] FIGS. 7A e 7B. BFP2 & BFP3 Tem Baixa Ligação a PDL1 na Superfície Celular. A FIG. 7 demonstra que as moléculas anti-PD- L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2 e 3 podem se ligar à proteína PD-L1 da superfície celular em um ensaio baseado em citometria de fluxo.

[0027] FIG. 8 Ligação de BFP a Mistura de PBMCs. A FIG. 8 demonstra que as moléculas anti-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2 e 3 ligam-se a subconjuntos de PBMC humanas em uma forme depen- dente da dose, semelhante a anti-PD-L1 parental e CD40L FP em um ensaio baseado em citometria de fluxo.

[0028] FIG. 9 BFP2 & BFP3 Retêm a Capacidade para Estimu- lar a Via de Sinalização de CD40. A FIG. 9 demonstra que as molé- culas anti-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2 e 3 ativam a via de sinali- zação NF-B, que está a jusante da ativação de CD40 em vários tipos de células.

[0029] FIG. 10 BFP3 bloqueia a interação de PD-L1 e PD1 e me- lhora a sinalização de NFAT nas células T Jurkat T. FIG . 10 de- monstra que as moléculas anti-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2 e 3 bloqueiam a interação PD-L1-PD1, resultando na ativação da via NFAT nas células Jurkat.

[0030] FIG. 11 BFPs Estimula CD40 e Bloqueia a Interação

PD1-PDL1. FIG. 11A ilustra um esquema conceitual de ensaio coesti- mulatório. FIG. 11B mostra que anti-PD-L1-CD40L BFP tem funções duplas: é ativado NF-B em células THP-1 através do engajamento de CD40 e aumenta a actividade NFAT em células Jurkat através da re- moção de da inibição mediada por PD-L1.

[0031] FIG. 12 BFP3 tem atividade indutora IL-2 superior no Ensaio SEB. FIG. 12 mostra resultados de um ensaio de enterotoxina B Estafilocócica (SEB), demonstrando que as moléculas anti-PD- L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2 e 3 induzem mais produção de IL-2 do que a combinação das moléculas parentais CD40L FP e anti-PD-L1.

[0032] FIG. 13 PD-1/GITRL Biespecíficos (MEDI3387 e ME- DI5771) Aumentam a Ativação de Célula T Versus Agentes Únicos no Ensaio SEB. FIG. 13 demonstra que MEDI3387 e MEDI5771 ti- nham atividade equivalente à combinação de moléculas parentais, mas maior que a molécula parental sozinha. Os resultados foram comparáveis em 2 lotes e demonstraram resultados semelhantes ao ensaio de reativação de células T.

[0033] FIG. 14 BFP3 Induz Produção Robusta de IFN- e IL-12 no Ensaio MLR de T-Macrófagos M1. FIG. 14 mostra resultados de um ensaio MLR de célula T macrófago, demonstrando que as molécu- las anti-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2 e 3 induzem mais produção de IFN-γ e IL-12 do que a combinação das moléculas parentais CD40L FP e anti-PD-L1.

[0034] FIG. 15 BFP3 Induz Produção Robusta de IFN- no En- saio MLR de T-Mono. FIG. 15 mostra resultados de um ensaio MLR de célula T monócito, demonstrando que as moléculas anti-PD- L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2 e 3 induzem quantidades mais ou equi- valentes de produção de IFN-γ do que a combinação das moléculas parentais CD40L FP e anti-PD-L1.

[0035] FIG. 16 BFP3 mostra atividade superior em relação à combinação no ensaio de recordação de CMV. FIG. 16 mostra os resultados de um ensaio de recordação de antígeno CMV, que de- monstram que as moléculas anti-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3 in- duzem mais produção de IFN-γ, IL-12, e IL-10, mas níveis semelhan- tes de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 em comparação com a combinação de moléculas parentais CD40L FP e anti-PD-L1.

[0036] FIGS. 17A-B. BFP3 pode alterar potencialmente a locali- zação na membrana de CD40 e PD-L1. FIG. 17A ilustra que CD40 e PD-L1 coexpressam em células apresentadoras de antígeno (APC). FIG. 17B mostra um esquema conceptual para um ensaio baseado em citometria de fluxo para o estudo de proteínas da superfície celular CD40 e PD-L1.

[0037] FIG. 18 BFP3 induz subrregulação de CD40 e PD-L1 em células MDA-MB-231. FIG. 18 mostra os resultados de um ensaio ba- seado em citometria de fluxo, demonstrando que apenas as moléculas anti-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3 podem subrregular ambas as moléculas CD40 e PD-L1 às 1 e 96 horas após o tratamento.

[0038] FIG. 19 BFP3 induz subrregulação de CD40 e PD-L1 em células MDA-MB-231. FIG. 19 mostra os resultados de um Western blot, demonstrando que apenas as moléculas anti-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3 induzem a subrregulação do conteúdo de proteí- na total PD-L1 em 24 horas após o tratamento. NS = sem estimulação.

[0039] FIG. 20 Perda de CD40 & PD-L1 de superfície em células THP1 após estimulação com BFP3. FIG. 20 mostra um esquema conceitual para um ensaio para o estudo das proteínas CD40 e PD-L1 da superfície celular, onde é aplicada estimulação contínua.

[0040] FIG. 21 Perda de CD40 & PD-L1 de superfície em células THP1 após estimulação com BFP3. FIG. 21 mostra os resultados de um ensaio baseado em citometria de fluxo, demonstrando que as mo- léculas anti-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3 induzem subrregulação de CD40 e PD-L1 de superfície às 0,5 e 3 horas após o tratamento.

[0041] FIG. 22 Perda de PD-L1 de superfície em células THP1 após estimulação com BFP3. FIG. 22 mostra um esquema conceitu- al para um ensaio para o estudo das proteínas CD40 e PD-L1 da su- perfície celular após 1 hora de tratamento, seguido por remoção por lavagem dos materiais de teste.

[0042] FIG. 23 Perda de PD-L1 de superfície em células THP1 após estimulação com BFP3. FIG. 23 mostra os resultados de um ensaio baseado em citometria de fluxo em células THP-1, demons- trando que o tratamento transiente com moléculas anti-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3 durante uma hora induz a subrregulação das pro- teínas de superfície celular CD40 e PD-L1. Às 24 horas, apenas CD40 pode ser detectado na superfície da célula.

[0043] FIG. 24 moDC tratado com BFP3 tem quantidade menor de proteína PD-L1. FIG. 24 mostra os resultados de um ensaio base- ado em citometria de fluxo, demonstrando efeitos diferenciados entre moléculas anti-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3 e CD40L FP na regu- lação da expressão na superfície celular de CD40, CD86 e PD-L1: a subrregulação de PD-L1 foi alcançada apenas em células tratadas com BFP3.

[0044] FIG. 25 moDC tratado com BFP3 tem quantidade menor de proteína PD-L1. FIG. 25 mostra os resultados de um Western blot, demonstrando que as quantidades de proteína PD-L1 são muito meno- res em condições de tratamento com anti-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3 do que com o tratamento de apenas CD40L FP ou CD40L FP mais anti-PD-L1.

[0045] FIG. 26 Perda de CD40 e PD-L1 de superfície em Monó- citos do Sangue. FIG. 26 mostra os resultados de um ensaio baseado em citometria de fluxo, demonstrando efeitos diferenciados entre mo- léculas anti-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3 e CD40L FP na regula-

ção da expressão na superfície celular de CD40 e PD-L1: a subrregu- lação dependente da dose de PD-L1 foi alcançada apenas em células tratadas com BFP3.

[0046] FIG. 27. mBFP3 induz degradação de PD-L1 de murino em células Renca. FIG. 27 mostra os resultados de um Western blot, demonstrando que a quantidade de proteína PD-L1 é muito menor em condições de tratamento com anti-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3 do que com o tratamento com apenas CD40L FP ou CD40L FP junta- mente com anti-PD-L1.

[0047] FIG. 28 Reticulação de PD-L1 Aumenta a Atividade de NF-B mediada por BFP3. FIG. 28 mostra que a reticulação de PD-L1 na superfície das células ES2 pode aumentar a ação de NF-B nas células THP-1 mediada por BFP3. Os eixos Y mostram a atividade do repórter NF-B.

[0048] FIG. 29 Interação IgG4 Fc e FcγRI Modula as Atividades de BFP3. FIG. 29 mostra que FcγR pode aumentar a ação de NF-B em células THP-1 mediada por BFP3.

[0049] FIGS. 30A-F. Perda de peso é menor em camundongos tratados com mBFP3 (tratamento com dose única). FIGS. 30A-F mostram resultados de múltiplos estudos em camundongos do tipo selvagem e camundongos implantados com células tumorais B16F10. São mostradas alterações no peso corporal após o tratamento de ca- mundongos individuais.

[0050] FIG. 31 Perda de peso é menor em camundongos trata- dos com mBFP3 (tratamento com múltiplas doses). FIG. 31 mostra resultados de estudos de múltiplas doses em camundongos implanta- dos com células tumorais B16F10. São mostradas percentagens de alterações no peso corporal após o tratamento de camundongos indi- viduais.

[0051] FIG. 32. Tratamento com mBFP3 inibe efetivamente o crescimento do tumor. FIG. 32 mostra resultados de estudos de múl- tiplas doses (duas vezes por semana x 2 semanas) em camundongos implantados com células tumorais B16F10. São mostradas alterações no volume do tumor após o tratamento de camundongos individuais.

[0052] FIGS. 33A-C. Redução da frequência de dosagem de BFP3 evita efeitos secundários. FIGS. 33A-C mostram resultados de estudos de dose reduzida (uma ou duas doses) em camundongos im- plantados com células tumorais B16F10. Alterações do peso corporal após tratamento de camundongos individuais foram apresentadas na FIG. 33A. FIG. 33B mostra alterações do volume do tumor, e a FIG. 33C mostra níveis de Alanina transaminase sérica (ALT).

[0053] FIG. 34. Tratamento com mBFP3 induziu a ativa- ção/diferenciação de células T. FIG. 34 mostra resultados de um es- tudo de citometria de fluxo em células T recuperadas de camundongos portadores de tumor B16F10. As percentagens de subconjuntos de células T foram determinadas e mostradas em gráficos.

[0054] FIG. 35. Tratamento com mBFP3 induz a diferenciação de células T CD8 efetoras/memória. FIG. 35 mostra os resultados do ensaio de citometria de fluxo estudando células T recuperadas de ca- mundongos portadores de tumor B16F10. As percentagens do sub- conjunto de células T CD8 efetoras foram determinadas e mostradas em gráficos.

[0055] FIG. 36 MEDI7526 em camundongos não induz TNF- ou IL-6, dois mediadores-chave de toxicidades relacionadas a imunidade. FIG. 36 mostra que nem o TNF-α nem a IL-6 parecem ser necessários para função anti-tumor de MEDI7526‘.

[0056] FIG. 37 O substituto de MEDI7526 de camundongo induz um perfil distinto de citocinas em camundongos (estudo de dosagem única iv).

[0057] FIG. 38 PD1-OX40L induz a ativação de NF-B em célu-

las Jurkat/OX40. FIG. 38 demonstra que a molécula anti-PD-L_IgG4 Fc_OX40L FP BFP3 ativa a via de sinalização de NF-B em uma linha de células Jurkat transfectadas com OX40.

[0058] FIG. 39 Efeito da proteína de fusão (FP) do ligando OX40 de camundongo (mOX40L), dos anticorpos monoclonais (mAb) anti- comundongo PD-L1 ou da combinação de mOX40L FP e do mAb anti- PD-L1 no crescimento das linhas celulares MCA205 e CT26 nos mo- delos singênicos de camundongo.

[0059] FIGS. 40A-C. Localização de tumor dependente de PD-L1 de PDL1/OX40L FP BFP2 (MEDI5615).

[0060] FIG. 41 Biodistribuição em camundongos portadores de tumor de diferentes formatos moleculares de moléculas biespecíficas PD-L1/OX40L.

[0061] FIG. 42 Sistemas celulares utilizados para medir a bioativi- dade de moléculas biespecíficas.

[0062] FIG. 43 BFP2 tem ótima valência para o agrupamento me- diado por PD-L1 de OX40. RLU = unidades relativas de luz; M = Mola- ridade.

[0063] FIGS. 44A-B. MEDI5615 (PDL1/OX40L BFP2) e scOX40L aumentaram a proliferação de T efetoras na presença de células Treg CD4+CD25+ naturais e diminuíram a frequência de células regulado- ras T produtoras de IL-10. As barras de erro representam o erro pa- drão da média a partir de poços de ensaio em duplicado.

[0064] FIGS. 45A-B. Mostra a atividade de PDL1/OX40L FP BFP2 (MEDI5615) e dos mAbs biespecíficos OX40/PDL1 em um ensaio de coestimulação estafilocócica com enterotoxina B (SEB).

[0065] FIGS. 46A-F. Mostra a ligação de PD-L1/OX40L BFP2 a células CHO manipuladas para expressar OX40, PD-L1 humano ou de macaco cinomolgo, ou ambos OX40 e PD-L1. As barras de erro repre- sentam o desvio padrão da média. MFI= intensidade média de fluores-

cência.

[0066] FIG. 47 PD1-OX40L desencadeia a degradação de PD1 em PBMC humanas. FIG. 47 mostra resultados de um de Western blot, demonstrando que os níveis de proteína PD-1 são reduzidos nas condições de tratamento com anti-PD-1_IgG4 Fc_OX40L FP BFP3, mas os níveis de proteína OX40 não foram alterados.

[0067] FIG. 48 MEDI3387 desencadeia a degradação de PD1 em PBMC humanas. FIG. 48 mostra resultados de um de Western blot, demonstrando que os níveis de proteína PD-1 são reduzidos nas condições de tratamento com anti-PD-1_IgG4 Fc_GITRL FP BFP3, mas a quantidade de proteína GITR não foi alterada. PD-1/GITRL FP Bis; MEDI5771 (formato IgG1) & MEDI3387 (IgG4P); GITRL: ME- DI1873.

[0068] FIG. 49 MEDI3387 induz a ativação de NF-B em células Jurkat/GITR. Estimulação de quatro horas. FIG. 49 demonstra que a molécula anti-PD-L_IgG4 Fc_GITRL FP BFP3 ativa a via de sinaliza- ção de NF-B em uma linha de células Jurkat transfectadas com GITR.

[0069] FIG. 50 Moléculas Biespecíficas PD1/GITR Podem se Ligar Simultaneamente a Ambos os Alvos. FIG. 50 demonstra a li- gação simultânea de proteínas PD1 e GITR pelas moléculas anti- PD1_IgG4 Fc_GITRL FP BFP2 (MEDI3387) e anti-PD1_IgG1 Fc_GITRL FP BFP2 (MEDI5771) pelo ensaio Octeto. "A" = MEDI3387; "B" = BFP2-PD1(0075)-GITRL(sc)-G4P; "C" = BFP2-GITRL(sc)-G4P.

[0070] FIG. 51 BFP3 bloqueia a interação de PD-L1 e PD1 e me- lhora a sinalização de NFAT nas células T Jurkat T. FIG. 51 de- monstra que as moléculas MEDI3387 (BIOAE003) e MEDI5771 (BIO- AE005) bloqueiam a interação PD-L1-PD1, resultando na ativação da via NFAT nas células Jurkat. BIOAE003 & BIOAE005 demonstram po- tência comparável a MEDI1873 (GITRL) e anti-PD1 IgG parental.

[0071] FIG. 52 Moléculas Biespecíficas PD1/GITR são Equiva-

lentes à Combinação de GITRL-FP e PD-1 mAb no modelo de ca- mundongo B16.

[0072] FIGS. 53A-B. Aumento dependente da dose nas células T de memória totais CD4+ e CD8+ (Ki67) após tratamento com MEDI3387 e MEDI5771. FIGS. 53A-B mostram resultados de estudos de farmacocinética (PK) e farmacodinâmica (DP) em macacos cinomo- lgos tratados com doses variadas de MEDI3387 e MEDI5771.

[0073] FIG. 54 Perfis de Concentração-Tempo Médio de ME- DI3387 e MEDI5771 no Soro em Macacos Cinomolgos Machos após Injeção Intravenosa Única. IV = intravenoso; Barras de erro representam desvio padrão da média; LLOQ (linha tracejada preta) = limite inferior de quantificação. Os dados abaixo de LLOQ (0,050 mg/L; como mostrado pela linha tracejada preta) são plotados na metade de LLOQ apenas para fins ilustrativos.

[0074] FIGS. 55A-C. Moléculas biespecíficas PD1/GITR podem se ligar simultaneamente a ambos os alvos. FIG. 55A demonstra um ensaio esquemático para o Ensaio de Reativação de células T por Cytostim. FIG. 55B demonstra resultados com PD1/GITR IgG4P BFPs (MEDI3387) e moléculas parentais. FIG. 55C demonstra resultados com PD1/GITR IgG4P BFPs (MEDI5771) e moléculas parentais.

[0075] FIG. 56 Mostra a Biodistribuição de fluorescência de GITRL in vivo.

[0076] FIGS. 57A-B. Anti-PDL1-TNF induz a regulação negati- va de PD-L1 de murino em células tumorais T24; APC - antígeno por célula. FIG. 57A mostra resultados de um ensaio baseado em ci- tometria de fluxo, demonstrando que o tratamento com anti-PD- L1_IgG4 Fc_TNFα FP BFP3 regula negativamente PD-L1 nas células tumorais T24. FIG. 57B mostra que o tratamento anti-PD-L1_IgG4 Fc_TNFα FP BFP3 não afetou a viabilidade celular.

[0077] FIG. 58 Anti-PDL1-TNF- BFP pode estimular as células mieloides THP1. FIG. 58 demonstra que a molécula anti-PD-L1_IgG4 Fc_TNF-α FP BFP3 ativa a via de sinalização de NF-B, que está a jusante da ativação do receptor de TNF-α.

[0078] FIG. 59 BFP3 conduz a internalização concomitante de CD40 e PD-L1 que não ocorre com a combinação de reagentes parentais. FIG. 59 é um esquema conceitual que descreve uma molé- cula de BFP incluindo domínios de ligação anti-PD-L1 e CD40L e mos- tra que a molécula de BFP pode internalizar dois alvos (CD40 e PD- L1) na superfície celular, resultando na degradação da proteína PD-L1. CD40 é resistente à degradação e a expressão é subsequentemente recuperada na superfície celular.

[0079] FIG. 60 Esquema de ensaio de repórter. O painel A mos- tra um estado de modelo de doença em que nenhum sinal (sem res- posta do ensaio) ocorre como resultado da ativação anti-CD3/anti- CD28 de uma célula apresentadora de antígeno devido à inibição pela formação do complexo PD-1/PD-L1. Em contraste, o Painel B repre- senta o bloqueio bem-sucedido da formação do complexo PD-1/PD-L1 através de um anticorpo anti-PD-1, o que leva à expressão da molécu- la repórter (luciferase) após a ativação anti-CD3/anti-CD28.

[0080] FIG. 61. Mostra os resultados de um ensaio SEB compa- rando anti-PD-L1/CD40 L FP BFP3 nos formatos IgG1 TM e IgG4.

[0081] FIG. 62. Mostra os resultados de um ensaio de recordação CMV comparando anti-PD-L1/CD40 L FP BFP3 nos formatos IgG1 TM and IgG4.

[0082] FIG. 63 Mostra que Anti-PD-1-anti-OX40 Bis2 não induz a ativação de NfkB em células Jurkat, enquanto que anti-PD-1-OX40L FP BFP3 induz.

[0083] FIG. 64 Mostra que o construto Bis2 desencadeia a degra- dação de PD1, indicando que a degradação de PD1 é independente da função agonista de OX40.

[0084] FIG. 65 Tratamento combinado de 5FU e MEDI7526 (An- ti-PDL1-CD40L BFP3) inibe eficazmente o crescimento do tumor. FIG. 65 mostra os resultados de um estudo animal, no qual tratamen- tos sequenciais de 5-FU (Dia 11) e MEDI7526 (Dia 14, 21 e 28) em doses múltiplas foram administrados a camundongos tendo células tumorais CT26. São mostradas alterações no volume do tumor após o tratamento de camundongos individuais. O tratamento de 5FU mais MEDI7526 melhora as respostas antitumorais mediadas apenas pelo tratamento MEDI7526.

[0085] FIG. 66 O fígado e o baço são os órgãos alvo do substi- tuto de MEDI7526 de murino. FIG. 66A mostra que o substituto de MEDI5083 e MEDI7526 de murino acumula-se no fígado e baço. FIG . 66B mostra que as células Kupffer humanas (macrófagos residenciais no fígado) expressam CD40 e PD-L1, indicando que MEDI7526 pode atingir células Kupffer no fígado.

[0086] FIG. 67 MEDI7526 inibe efetivamente o crescimento de tumores hepáticos. FIG. 67A mostra o desenho de um modelo de tumor no fígado, no qual as células tumorais da CT26-luciferase são implantadas diretamente no fígado. No dia 21, os fígados foram recu- perados após necropsia e a carga tumoral no fígado foi quantificada por imagiologia de atividade de luciferase. FIG. 67B mostra que as cargas tumorais (indicadas como unidades de luminância) no fígado de camundongos tratados com MEDI7526, foram significativamente mais baixas em comparação com aquelas no animal tratado com con- trole de isotipo.

[0087] FIG. 68 Tratamento MEDI7526 induz a expansão e ativa- ção de células T no fígado a partir do estudo do modelo de tumor hepático CT26. FIG. 68A mostra que os camundongos que receberam MEDI7526 tiveram um número aumentado de células T CD8 no fígado em comparação com os camundongos de controle. FIG. 68B mostra que as células T CD8 específicas do antígeno tumoral isoladas do animal tratado com MEDI7526 tinham percentagens mais altas do sub- tipo ativado.

[0088] FIG. 69 Tratamento com MEDI7526 é mais tolerável do que o tratamento combinado de MEDI5083 e anti-PDL1 no modelo de tumor hepático CT26. FIG. 69A mostra que as perdas de peso foram menores em camundongos tratados com MEDI7526 em compa- ração com MEDI5083 ou MEDI5083 mais o tratamento com anti-PDL1. São mostradas alterações no peso corporal após o tratamento com dose única de camundongos individuais. FIG. 69B mostra que a morta- lidade foi relativamente elevada em MEDI5083 mais grupo PDL1 anti- murino.

[0089] FIG. 70 Proteínas de fusão biespecíficas formatadas espe- cíficas de BFP3 adicionais: anti-PD1-Fc-OX40L de tipo selvagem(A), anti-PD1-Fc-OX40L 2TS (B); e anti-PD1-Fc-OX40L 1TS (C). O frag- mento anti-PD-1F(ab) foi derivado de um anticorpo anti-PD1 (LO115). A parte OX40L conservou a sequência do tipo selvagem (A) ou possui mutações em F180 residual (B e C).

[0090] FIG. 71 Anti-PD1-Fc-OX40L 2TS e 1TS diminuíram a função agonista de OX40 na linha de células T humanas. FIG. 71A e B mostram que o anti-PD1-Fc-OX40L 2TS reduziu ligeiramente a ligação e a internalização em comparação com o anti-PD1-Fc-OX40L. FIG. 71C mostra que anti-PD1-Fc-OX40L 2TS e 1TS tinham capacida- de reduzida de ativar a via NFκB.

[0091] FIG. 72 Anti-PD1-Fc-OX40L 2TS e 1TS têm semelhante ligação e internalização em comparação com anti-PD1-OX40L nas células T primárias humanas. Os dados foram gerados em células T CD4 e CD8 purificadas de dois doadores saudáveis.

[0092] FIG. 73 Anti-PD1-Fc-OX40L 2TS diminuiu as funções agonistas OX40 em células T primárias humanas. PD1-OX40L e

PD1-OX40L 2TS foram comparados usando estimulação de células T humanas e ensaios de recordação CMV. PD1-OX40L 2TS induziu mui- to menos citocinas inflamatórias comparando a PD1-OX40L, que não tem quaisquer mutações em OX40L.

[0093] FIG. 74 Anti-PD1-Fc-OX40L 2TS e 1TS induziram degra- dação de PD1 em células T humanas. As células T humanas ativa- das expressam a proteína PD1 e a quantidade de proteína PD1 total foi significativamente reduzida após o tratamento de anti-PD1-OX40L, anti-PD1-OX40L 1TS ou anti-PD1-OX40L 2TS. FIG. 74A. mostra uma imagem representativa de Western Blot e a FIG. 74B mostra resulta- dos agrupados de três doadores.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[0094] A menos que definido de outro modo, todos os termos téc- nicos e científicos aqui usados têm o significado normalmente entendi- do por um perito na técnica à qual esta divulgação pertence. As se- guintes referências fornecem a um perito uma definição geral de mui- tos dos termos utilizados na presente divulgação: Singleton et al., Dic- tionary of Microbiology and Molecular Biology (2ª ed. 1994); The Cam- bridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5ª Ed., R. Rieger et al. (editores), Springer Ver- lag (1991); e Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Tal como utilizado na presente invenção, os termos seguintes têm os significados a eles atribuídos abaixo, a menos que especificado de outra forma.

[0095] O termo "citotoxicidade mediada por células T" se refere a matar células alvo pelos linfócitos T citotóxicos, tais como as células infetadas ou células cancerígenas.

[0096] O termo "atividade antitumoral" se entende referir a qual- quer atividade biológica que reduza ou previna o aumento da prolifera- ção ou sobrevivência de uma célula tumoral. Em uma modalidade, a atividade antitumoral é uma resposta imune antitumoral.

[0097] O termo "agente imunomodulador" refere-se a um agente que aumenta uma resposta imune (por exemplo, resposta imune anti- tumoral). Agentes imunomoduladores exemplificativos da divulgação incluem anticorpos, um anticorpo anti-PD-L1 e seus fragmentos, bem como proteínas, como proteínas de fusão, proteínas de fusão biespe- cíficas e/ou seus fragmentos.

[0098] O termo "polipeptídeo CD40L" se pretende indicar um poli- peptídeo ou seu fragmento tendo, pelo menos, cerca de 85% de iden- tidade de aminoácidos com o Nº de Acesso do NCBI NP_000065 e com atividade de ligação a CD40. O termo "CD40L" se refere ao CD40L de comprimento total e a fragmentos solúveis, por exemplo, formas de domínio extracelular de CD40L que resultam de proteólise, e a formas monoméricas de CD40L bem como formas oligoméricas, por exemplo, CD40L trimérico. As sequências de aminoácidos das formas ligadas a membrana e solúveis de CD40L humano são mostra- das abaixo.

[0099] Por "polipeptídeo CD40" se pretende designar um polipep- tídeo ou seu fragmento tendo, pelo menos, cerca de 85% de identida- de de aminoácidos com o Nº de Acesso do NCBI NP_001241 e com atividade de ligação a CD40L. Uma sequência de aminoácidos de CD40 exemplificativa é proporcionada abaixo (SEQ ID NO: 22).

[00100] Por "polipeptídeo PD-L1" se pretende designar um polipep- tídeo ou seu fragmento tendo, pelo menos, cerca de 85% de identida- de de aminoácidos com o Nº de Acesso do NCBI NP_001254635 e tendo atividade de ligação a PD-1 e CD80. Uma sequência de amino- ácidos de PD-L1 exemplificativa é proporcionada abaixo (SEQ ID NO: 23).

[00101] Por "anticorpo anti-PD-L1" se pretende designar um anti- corpo que se liga seletivamente a um polipeptídeo PD-L1. Anticorpos anti-PD-L1 exemplificativos são descritos por exemplo na Patente dos E.U.A. No. 8,779,108, e na Publicação do Pedido de Patente dos E.U.A. No. 2014/0356353, que são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Durvalumab (MEDI4736) é um anticorpo anti-PD-L1 exemplificativo. Outros anticorpos anti-PD-L1 incluem BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb) e MPDL3280A (Roche).

[00102] Por "polipeptídeo PD-1" se pretende designar um polipeptí- deo ou seu fragmento tendo, pelo menos, cerca de 85% de identidade de aminoácidos com o Nº de Acesso do NCBI NP_005009 e com ativi- dade de ligação a PD-L1. Uma sequência de aminoácidos de PD-1 exemplificativa é proporcionada abaixo (SEQ ID NO: 32).

[00103] Por "molécula de ácido nucleico de PD-1" se pretende de- signar um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo PD-1. Uma se- quência de molécula de ácido nucleico de PD-1 exemplificativa é pro- porcionada no Nº de Acesso do NCBI NM_005018.

[00104] O termo "polipeptídeo GITRL" se pretende indicar um poli- peptídeo ou seu fragmento tendo, pelo menos, cerca de 85% de iden- tidade de aminoácidos a SEQ ID NO: 33 e tendo atividade de ligação a GITR. O termo "GITRL" se refere ao GITRL de comprimento total e a fragmentos solúveis, por exemplo, formas de domínio extracelular de GITRL que resultam de proteólise, e a formas monoméricas de GITRL bem como formas oligoméricas, por exemplo, GITRL trimérico. As se- quências de aminoácidos das formas ligadas a membrana e solúveis de GITRL humano são mostradas abaixo.

[00105] O termo "polipeptídeo TNF-α" pretende indicar um polipep- tídeo ou fragmento do mesmo tendo pelo menos cerca de 85% de identidade de aminoácidos com o Nº de Acesso NCBI NP_000585.2. O termo "TNF-α" se refere a TNF-α de comprimento total e fragmentos solúveis, por exemplo, formas de domínio extracelular de TNF-α resul- tantes de proteólise e formas monoméricas de TNF-α bem como for-

mas oligoméricas, por exemplo, TNF-α trimérico. As sequências de aminoácidos das formas ligadas a membrana e solúveis de TNF-α humano são mostradas abaixo.

[00106] Tal como aqui usado, "polipeptídeo OX40" significa um po- lipeptídeo ou seu fragmento tendo pelo menos cerca de 85% de iden- tidade de aminoácidos com o Nº de Acesso do NCBI NP_003318. OX40 é um membro da superfamília de receptores de TNFR que é ex- presso na superfície de linfócitos T CD4+ e CD8+ de mamífero ativa- dos por antígeno. As sequências do receptor OX40 são conhecidas na técnica e são fornecidas, por exemplo, nos Números de Acesso de GenBank: AAB33944 ou CAE11757.

[00107] O termo "polipeptídeo OX40L" se pretende indicar um poli- peptídeo ou seu fragmento tendo, pelo menos, cerca de 85% de iden- tidade de aminoácidos com o Nº de Acesso do NCBI NP_003317 e com atividade de ligação a OX40. O termo "OX40L" se refere ao OX40L de comprimento total e a fragmentos solúveis, por exemplo, formas de domínio extracelular de OX40L que resultam de proteólise, e a formas monoméricas de OX40L bem como formas oligoméricas, por exemplo, OX40L trimérico. As sequências de aminoácidos das formas ligadas a membrana e solúveis de OX40L humano são mostra- das abaixo.

[00108] O termo "CD137L" se pretende indicar um polipeptídeo ou seu fragmento tendo, pelo menos, cerca de 85% de identidade de aminoácidos com o Nº de Acesso do NCBI NP_001552.2 e com ativi- dade de ligação a CD137. O termo "CD137L" se refere ao CD137L de comprimento total e a fragmentos solúveis, por exemplo, formas de domínio extracelular de CD137L que resultam de proteólise, e a for- mas monoméricas de CD137L bem como formas oligoméricas, por exemplo, CD137L trimérico. As sequências de aminoácidos das for- mas ligadas a membrana e solúveis de CD137L humano são mostra-

das abaixo.

[00109] O termo "anticorpo", como usado nesta divulgação, se refe- re a uma imunoglobulina ou um seu fragmento ou derivado, e engloba qualquer polipeptídeo compreendendo um sítio de ligação ao antígeno, independentemente de ser produzido in vitro ou in vivo. O termo inclui, mas não está limitado a, anticorpos policlonais, monoclonais, monoes- pecíficos, poliespecíficos, não específicos, humanizados, humanos, de cadeia única, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, muta- dos, proteínas de fusão e enxertados. A não ser que de outro modo modificado pelo termo "intacto", como em "anticorpos intactos", para os propósitos desta divulgação, o termo "anticorpo" inclui também fra- gmentos de anticorpo tais como Fab, F(ab′)2, Fv, scFv, Fd, dAb, e ou- tros fragmentos de anticorpo e suas combinações que retêm a função de ligação ao antígeno, isto é, a capacidade de se ligar, por exemplo, a PD-1 ou PD-L1, especificamente. Tipicamente, tais fragmentos com- preenderiam um domínio de ligação ao antígeno. Além disso, esses fragmentos podem ser combinados com outros para formar proteínas de fusão de ligação a antígenos múltiplos.

[00110] Os termos "domínio de ligação ao antígeno", "fragmento de ligação ao antígeno" e "fragmento de ligação" se referem a uma parte de uma molécula de anticorpo que compreende aminoácidos respon- sáveis pela ligação específica entre o anticorpo e o antígeno. Em ca- sos, onde um antígeno é grande, o domínio de ligação ao antígeno pode somente se ligar a uma parte do antígeno. Uma porção da molé- cula de antígeno que é responsável por interações específicas com o domínio de ligação ao antígeno é referida como "epitopo" ou um "de- terminante antigênico". Um domínio de ligação ao antígeno tipicamen- te compreende uma região variável de cadeia leve (VL) de anticorpo e uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo, no entanto, não tem necessariamente de incluir ambas. Por exemplo, um assim chamado fragmento de anticorpo "Fd" consiste somente em um domí- nio VH, mas ainda retém alguma função de ligação ao antígeno do an- ticorpo intacto.

[00111] Fragmentos de ligação de um anticorpo são produzidos por técnicas de DNA recombinante, ou por clivagem enzimática ou quími- ca de anticorpos intactos. Os fragmentos de ligação incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fv, e anticorpos de cadeia única. Um anticorpo sem ser um anticorpo "biespecífico" ou "bifuncional" é entendido como tendo sítios de ligação idênticos. A digestão de anticorpos com a enzima, papaína, resulta em dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, conheci- dos também como fragmentos "Fab", e um "fragmento Fc", não tendo nenhuma atividade de ligação ao antígeno mas tendo a capacidade de cristalizar. A digestão de anticorpos com a enzima, pepsina, resulta no fragmento F(ab')2 no qual os dois braços da molécula de anticorpo permanecem ligados e compreendem dois sítios de ligação ao antíge- no. O fragmento F(ab')2 tem a capacidade de reticular o antígeno. "Fv" quando usado aqui se refere ao fragmento mínimo de um anticorpo que retém sítios de reconhecimento do antígeno e ligação ao antígeno. "Fab" quando usado aqui se refere a um fragmento de um anticorpo que compreende o domínio constante da cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada.

[00112] O termo "mAc" refere-se a anticorpo monoclonal. Os anti- corpos da divulgação compreendem, sem limitação, anticorpos nativos inteiros, anticorpos biespecíficos, anticorpos quiméricos, Fab, Fab', fragmentos da região V de cadeia única (scFv), polipeptídeos de fu- são, anticorpos não convencionais e suas combinações.

[00113] Na presente descrição, os termos "compreende", "compre- endendo", "contendo", "tendo" e semelhantes, podem ter o significado que lhes foi atribuído na lei de Patentes dos E.U.A. e podem significar "inclui", "incluindo", e semelhantes; "consistindo essencialmente em"

ou "consiste essencialmente" também tem o significado atribuído na lei de Patentes dos E.U.A. e o termo é aberto, permitindo a presença de mais do que aquilo que é recitado, desde que as características bási- cas ou novas daquilo que é recitado não sejam alteradas pela presen- ça de mais do que aquilo que é recitado, mas excluindo modalidades anteriores da técnica.

[00114] Tal como aqui utilizados, os termos "determinação", "avali- ação", "análise", "medição" e "detecção" se referem a ambas as de- terminações quantitativas e qualitativas, e como tal, o termo "determi- nação" pode ser aqui usado indistintamente com "análise", "medição" e semelhantes. Caso uma determinação quantitativa seja pretendida é usada a frase "determinação de uma quantidade" de um analito e se- melhantes. Caso uma determinação qualitativa e/ou quantitativa seja pretendida é usada a frase "determinação de um nível" de um analito ou "detecção" de um analito.

[00115] Tal como aqui utilizado, o termo domínio "domínio Fc" se refere a uma porção de uma região constante de anticorpo. Tradicio- nalmente, o termo domínio Fc se refere a um produto de clivagem de protease (por exemplo, papaína) que engloba as regiões emparelha- das CH2, CH3 e de dobra de um anticorpo. No contexto da presente divulgação, o termo domínio de Fc ou Fc se refere a qualquer polipep- tídeo (ou ácido nucleico que codifica um tal polipeptídeo), independen- temente dos meios de produção, que inclui a totalidade ou uma parte do CH2, CH3 e regiões de charneira de um polipeptídeo de imunoglo- bulina.

[00116] O termo "polipeptídeo de fusão" ou "proteína de fusão", se refere a um polipeptídeo compreendendo dois ou mais polipeptídeos diferentes ou seus fragmentos ativos que não estão naturalmente pre- sentes no mesmo polipeptídeo. Em várias modalidades, os dois ou mais polipeptídeos diferentes estão operacionalmente ligados em con-

junto covalentemente, por exemplo, quimicamente ligados ou fundidos em quadro por uma ligação peptídica ou um ligante peptídico. Por exemplo, uma proteína de fusão biespecífica pode incluir um ou mais fragmentos Fab e/ou Fab', um fragmento ou região Fc (tal como, CH2 e CH3 sem ou sem uma região de charneira) e/ou uma proteína de fusão ligada àquela ou mais fragmentos Fab e/ou Fab’ ou fragmento Fc.

[00117] Os termos "idênticos" ou percentagem de "identidade", no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou polipeptídeos, se refe- rem a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma percentagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácido que são os mesmos, quando comparadas e alinhadas (in- troduzindo lacunas, se necessário) para correspondência máxima, não considerando quaisquer substituições conservativas de aminoácidos como parte da identidade de sequências. A percentagem de identida- de pode ser medida usando software ou algoritmos de comparação de sequências ou algoritmos ou por inspeção visual. São conhecidos na técnica vários algoritmos e software que podem ser usados para se obterem alinhamentos de sequências de aminoácidos ou nucleotídeos (ver, por exemplo, Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264- 2268, como modificado em Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877, e incorporado nos programas NBLAST e XBLAST (Al- tschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). Em certas mo- dalidades, Gapped BLAST pode ser usado como descrito em Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, São Francisco, Califórnia) ou Megalign (DNAS- TAR).

[00118] O termo "isolado" refere-se a uma molécula que está subs- tancialmente isenta de outros elementos presentes no seu ambiente natural. Por exemplo, uma proteína isolada está substancialmente isenta de material celular ou outras proteínas da fonte de células ou tecidos da qual é derivada. O termo "isolado" se refere também a pre- parações onde a proteína isolada é suficientemente pura para ser ad- ministrada como uma composição farmacêutica, ou pelo menos 70- 80% (p/p) pura, mais preferencialmente, pelo menos 80-90% (p/p) pu- ra, ainda mais preferencialmente, 90-95% pura; e, o mais preferenci- almente, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% (p/p) pura.

[00119] O termo "referência" refere-se a um padrão de comparação.

[00120] O termo "liga-se especificamente" refere-se a um agente (por exemplo, CD40L, GITRL, OX40L ou CD137L) que reconhece e liga uma molécula (por exemplo, polipeptídeo CD40, polipeptídeo GITR, polipeptídeo OX40 ou polipeptídeo CD137, respetivamente), mas que não reconhece e liga substancialmente outras moléculas em uma amostra, tal como uma amostra biológica. Por exemplo, duas mo- léculas que se ligam especificamente formam um complexo que é rela- tivamente estável sob condições fisiológicas. A ligação específica é caracterizada por uma elevada afinidade e uma capacidade baixa a moderada como distinta de ligação não específica que tem usualmente uma baixa afinidade com uma capacidade moderada a elevada.

[00121] O termo "sujeito" refere-se a um mamífero, incluindo, mas não se limitando a, um ser humano ou mamífero não humano, tal co- mo um bovino, equino, canino, ovino ou felino.

[00122] Os intervalos aqui fornecidos são entendidos como sendo uma abreviação para todos os valores dentro do intervalo. Por exem- plo, entende-se que uma gama de 1 a 50 inclui qualquer número, combinação de números, ou sub-gama a partir do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50.

[00123] Tal como aqui usados, os termos "tratar," tratando"," trata- mento" e semelhantes referem-se à redução e/ou melhoria de um dis- túrbio e/ou sintomas a ele associados. Será apreciado que, embora não seja excluído, o tratamento de um distúrbio ou condição não re- quer que o distúrbio, condição ou sintomas a ele associado seja com- pletamente eliminado. Por exemplo, tal como aqui contemplado, o tra- tamento de um distúrbio inclui a prevenção da exacerbação de sinto- mas no distúrbio.

[00124] Como aqui utilizado, o termo "ou" é entendido como inclusi- vo, a menos que seja especificamente declarado ou óbvio do contexto, o contrário. Como usado aqui, os termos "um", "uma" e "o", "a" são entendidos como singulares ou plurais, a menos que especificamente indicado ou óbvio do contexto ao contrário.

[00125] Além disso, "e/ou" onde usado aqui é para ser tomado co- mo divulgação específica de cada uma das duas ou mais característi- cas ou componentes especificados com ou sem o outro. Assim, o ter- mo "e/ou" como usado numa frase tal como "A e/ou B" no presente documento se destina a incluir "A e B", "A ou B", "A" (sozinho) e "B" (sozinho). Do mesmo modo, se pretende que o termo "e/ou" tal como usado em uma frase tal como "A, B e/ou C" englobe cada uma das se- guintes modalidades: A, B e C; A, B, ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; e A (apenas); B (apenas); e C (apenas).

[00126] A menos que especificamente indicado ou evidente a partir do contexto, como aqui utilizado, o termo "cerca de" é entendido como dentro de um intervalo de tolerância normal na técnica, por exemplo dentro de 2 desvios padrão da média. "Cerca" pode ser entendido co- mo superior ou inferior a 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05%, ou 0,01% de um valor indicado. Salvo indicação em contrário, todos os valores numéricos aqui fornecidos são conside- rados implicitamente modificados pelo termo "cerca".

[00127] A recitação de uma listagem de grupos químicos em qual- quer definição de uma variável aqui inclui definições dessa variável como qualquer grupo único ou qualquer combinação de grupos lista- dos. A recitação de uma modalidade para uma variável ou aspecto aqui inclui essa modalidade como qualquer modalidade única ou em qualquer combinação com quaisquer outras modalidades ou suas por- ções.

[00128] Quaisquer composições ou métodos proporcionados aqui podem ser combinados com um ou mais de qualquer uma das outras composições e métodos proporcionados aqui.

VISÃO GERAL

[00129] A presente divulgação fornece várias proteínas de fusão (FP) e, em particular, proteínas de fusão biespecíficas (BFPs) que são multivalentes e projetadas para controlar as respostas imunológicas anticâncer mediadas por células T. Em uma modalidade não exclusiva, as BFPs contempladas incluem um primeiro domínio de ligação (BD1), um segundo domínio de ligação (BD2) e uma região Fc de imunoglo- bulina incluindo, por exemplo, domínios CH2 e CH3 (ver FIG. 1). BD1 e BD2 podem cada um separadamente incluir um ou mais de um do- mínio de ligação ao antígeno, um fragmento de ligação ao antígeno, um fragmento de ligação, um agonista do receptor, antagonista ou li- gando e similares. Em um exemplo particular, pelo menos um dos BD1 e BD2 é um domínio Fab, um scFv, um anticorpo de domínio único e um domínio variável de anticorpo.

[00130] Em algumas modalidades, BD1, BD2 e a região Fc de al- gumas BFPs podem ser ligados entre si por um ou mais ligantes, tal como um ligante peptídico. Dessa maneira, em algumas modalidades, as BFPs contempladas podem ser codificados geneticamente, expres- sos uma proteína de fusão de cadeia única (scfp) que pode ser ex- pressa e montada dentro de uma célula hospedeira.

[00131] Em algumas modalidades, cada domínio de ligação BD1 e BD2 retém semelhantes capacidades e funções para os seus respeti- vos alvos (por exemplo, epítopos, proteínas e/ou receptores) como seus componentes constituintes parentais (nativos, não ligados). Em uma modalidade, a capacidade de ligação biespecífica de BFPs con- templadas permitem que a uma única BFP para simultaneamente en- gatar e/ou ligar a dois alvos moleculares na superfície de uma célula única (isto é, uma interação cis) ou em superfícies celulares de células adjacentes (isto é, uma interação trans). Em algumas modalidades, são contempladas BFPs que podem causar interações cis e trans, se- paradamente ou ao mesmo tempo.

[00132] Como aqui contemplado, diferentes configurações de BFP são possíveis, como são vistas na FIG. 2 e Tabela 1 abaixo. Tabela 1. Proteínas de fusão biespecíficas exemplificativas. Nome(s) Formato BD1 alvo BD1 BD2 alvo BD2 Fc CD40L FP- BFP2 6 unidades CD40 1 unidade de PD-L1 IgG4P anti-PD-L1 de CD40L F(ab)2 anti- FP PD-L1 (de MEDI4736) Anti-PD-L1- BFP3 6 unidades CD40 1 unidade de PD-L1 IgG4P CD40L FP de CD40L F(ab)2 anti- (MEDI7526) FP PD-L1 (de MEDI4736) Anti-PD-L1- BFP3 6 unidades CD40 1 unidade de PD-L1 IgG1D265 CD40L FP de CD40L murina F(ab)2 anti- murina A murina (substituto de FP de murino murino PD-L1 murino para MEDI7526) Anti-PD-L1- BFP3 6 unidades recepto- 1 unidade de PD-L1 IgG4P TNF-α FP de TNF- FP res TNF- F(ab)2 anti-  PD-L1 (de MEDI4736) Anti-PD1- BFP3 6 unidades OX40 1 unidade de PD1 IgG4P OX40L FP de OX40L F(ab)2 anti- FP PD1

Nome(s) Formato BD1 alvo BD1 BD2 alvo BD2 Fc Anti-PD1- BFP3 4 unidades OX40 1 unidade de PD1 IgG4P OX40L FP de OX40L de F(ab)2 anti- 2xTS tipo selva- PD1 gem, 2 uni- dades de OX40L F180A FP Anti-PD1- BFP3 2 unidades OX40 1 unidade de PD1 IgG4P OX40L FP de OX40L de F(ab)2 anti- 1xWT tipo selva- PD1 gem, 4 uni- dades de OX40L F180A FP Anti-PD-L1- BFP3 6 unidades OX40 1 unidade de PD1 IgG4P OX40L FP de OX40L F(ab)2 anti- (MEDI5615) FP PD1 Anti-PD1- BFP3 6 unidades CD137 1 unidade de PD1 IgG4P CD137L FP de CD137L F(ab)2 anti- FP PD1 Anti-PD1- BFP3 6 unidades GITR 1 unidade de PD1 IgG4P GITRL FP* de GITRL FP F(ab)2 anti- (MEDI3387, PD1 BIOAE003, BFP@- PD1(0115)- GITRL(sc)- G4P, PD- 1/GITRL BFP IgG4P) Anti-PD1- BFP3 6 unidades GITR 1 unidade de PD1 IgG1 GITRL FP* de GITRL FP F(ab)2 anti- (MEDI5771, PD1 BIOAE005, PD-1/GITRL BFP IgG1)

[00133] Em uma modalidade específica, contemplam-se BFPs de qualquer formato aqui divulgado que incorporem como pelo menos um domínio de ligação que atinja qualquer membro da superfamília de TNF emparelhado com outro domínio de ligação que atinja qualquer outra proteína da superfície celular. Exemplos adicionais de domínios de ligação do BFP de membros da superfamília de TNF aqui contem- plados incluem LIGHT, CD30L, CD27L, e TL1a, que podem ser incor- porados num formato BFP2 ou BFP3. Mecanismos de Ação

[00134] Em algumas modalidades preferidas, a divulgação apresen- ta proteínas de fusão biespecíficas no formato BFP3, incluindo uma ou mais subunidades de ligação ao antígeno do terminal N, um núcleo central de polipeptídeo Fc e uma ou mais proteínas ligantes do termi- nal C. Em uma modalidade, as uma ou mais subunidades de ligação ao antígeno do terminal N (BD2) podem ser subunidades de ligação ao antígeno anti-PD-1 e/ou anti-PD-1L, o núcleo central de polipeptídeo Fc pode ser um polipeptídeo da região Fc IgG1 ou IgG4 (CH2 e CH3) e as uma ou mais proteínas do ligando do terminal C (BD1) podem in- cluir, por exemplo, GITRL, OX40L, CD40L, TNF-α e/ou CD137.

[00135] Em uma modalidade, o formato BFP3 mostrado nas FIGS. 1-4 permite a cooptação de alvos BD1 e BD2 quando presentes em células diferentes (interação trans), resultando na ativação de vias de sinalização a jusante ligadas a receptores Fcγ nas células mieloides. Usando MEDI7526 (ver a Tabela 1) como um exemplo, o engajamento de FcγRI, no contexto da estimulação de CD40, pode direcionar mais do que a ativação aditiva de NF-κB.

[00136] Em algumas modalidades, a ligação de BD1 ao seu alvo (por exemplo, um receptor celular) pode desencadear a internalização do complexo de ligação e iniciar uma cascata de sinalização (por exemplo, promover a ativação e/ou replicação de células T) ou inibir uma cascata de sinalização (por exemplo, removendo um bloqueio ini- bitório). Por exemplo, a ligação e internalização de BD1 faz com que BD2 e seu alvo, por exemplo, PD1 ou PD-L1 sejam internalizados den- tro de uma célula. Internalização forçada de PD1/PD-L1 provoca a sua degradação, levando a um longo período de ausência de PD1/PD-L1 na superfície celular. Esta é uma nova abordagem para atenuar fun- ções inibidoras de PD1/PDL1 removendo PD1/PDL1 da superfície ce- lular para promover uma resposta imunológica mediada por células T.

[00137] Em uma modalidade, as BFPs contempladas são subuni- dades da estrutura principal da proteína de fusão de cadeia única di- merizada e, por exemplo, incluem duas proteínas de fusão de cadeia única idênticas unidas por meio de ligações dissulfeto. Os componen- tes individuais de cada proteína de fusão de cadeia única podem ser ligados através de ligantes peptídicos. Os ligantes peptídicos contem- plados podem ter qualquer comprimento que permita a formação fun- cional da proteína de fusão biespecífica desejada, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ou mais ami- noácidos. Em uma modalidade particular, são contemplados ligantes peptídicos com um comprimento de 9 aminoácidos ou mais entre os componentes individuais das proteínas de fusão contempladas. Verifi- cou-se que os ligantes peptídicos de 9 ou mais aminoácidos nas prote- ínas de fusão biespecíficas contempladas mantiveram a estabilidade e/ou não causaram agregação dessas proteínas de fusão. De fato, uma ampla gama de comprimentos de ligantes provou ser bem tolera- da nas proteínas de fusão biespecíficas da presente divulgação, facto que nunca foi sugerido em qualquer outro lugar.

[00138] Tem sido mostrado que as proteínas de fusão biespecíficas de cadeia única da divulgação são estáveis e exibem bioatividade. Como aqui descrito, a estabilidade e a atividade da subunidade da pro- teína de fusão biespecífica foram devidas, pelo menos em parte, ao comprimento dos ligantes utilizados nas proteínas de fusão biespecífi- cas da divulgação. Os ligantes com mais de 9 aminoácidos de com- primento não apresentaram problemas significativos com agregação e/ou estabilidade. As proteínas de fusão biespecíficas da divulgação também fornecem outras características e vantagens das proteínas Fc de cadeia única. Domínio de ligação ao antígeno BD1

[00139] Qualquer membro da família de TNF-α que pode ser utiliza- do para controlar uma resposta imunológica mediada por células T é contemplado para utilização na presente divulgação. Exemplos especí- ficos de membros da família de TNF-α contemplados incluem CD40L, GITRL, OX40L, TNF-α, e CD137L. É conhecido que membros de cito- cina solúveis de ocorrência natural da família de ligantes de TNF exi- bem a sua bioatividade como homotrímeros. No entanto, complexos triméricos de ligantes de TNF tendem a desnaturar através de dissoci- ação dos seus monômeros e são difíceis de preparar de unidades mo- noméricas recombinantes. Para impedir a dissociação dos homotríme- ros em monômeros pelo menos três monômeros de um ligando de TNF estão ligados covalentemente entre si através dos seus terminais C e terminais N por meio de ligantes peptídicos para formar uma mo- lécula de "cadeia única (sc)". Portanto, a molécula completa (pelo me- nos três monômeros de um membro da família do ligando de TNF com os dois ligantes peptídicos) consiste em uma cadeia de proteína única, de modo que a dissociação em monômeros não possa mais ocorrer.

[00140] Além disso, a fusão do ligando de TNF a um domínio de Fc, tal como nas proteínas de fusão de cadeia única da divulgação, pode ser usada para obter trímeros de dimerização. A dimerização de domí- nios solúveis é conseguida através da montagem de dois domínios de Fc através de pontes dissulfeto. O enriquecimento local de ligantes TNF de cadeia única nas células ou nas células vizinhas tem o poten- cial de aumentar a bioatividade destas proteínas de fusão. Domínio de ligação ao antígeno BD2

[00141] As regiões de ligação ao antígeno, tal como fragmentos Fab, que se ligam seletivamente a PD-1 e PD-L1 e inibem a ligação ou ativação de PD-1 e PD-L1 são úteis nas BFPs da divulgação. Os fra-

gmentos Fab (Fragmento de ligação ao antígeno) consistem nos do- mínios VH-CH1 e VL-CL covalentemente ligados por uma ligação dis- sulfeto entre as regiões constantes. Para ultrapassar a tendência de domínios VH e VL não covalentemente ligados no Fv de se dissocia- rem quando coexpressos em uma célula hospedeira, um assim cha- mado fragmento Fv de cadeia única (sc) (scFv) pode ser construído. Em um scFv, um polipeptídeo flexível e adequadamente longo liga ou o terminal C do VH ao terminal N do VL ou o terminal C do VL ao ter- minal N do VH. Em algumas modalidades, os peptídeos ligantes aqui contemplados incluem um multímero de um peptídeo GGGGS (Gly4Ser), mas outros ligantes também são conhecidos na técnica e podem ser usados aqui. Por exemplo, um possível ligante é um peptí- deo de 15 resíduos (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 34).

[00142] Os domínios de ligação ao antígeno BD2 da divulgação (por exemplo, específicos para anti-PD-1 ou anti-PD-L1) podem opcio- nalmente compreender regiões constantes do anticorpo ou partes de- las. Por exemplo, um domínio VL pode ter ligado, no seu terminal C, domínios constantes de cadeia leve de anticorpo incluindo cadeias Cκ ou Cλ humanas. Do mesmo modo, um domínio de ligação ao antígeno específico baseado em um domínio VH pode ter anexado toda ou par- te de uma cadeia pesada de imunoglobulina derivada de qualquer isó- topo de anticorpo, por exemplo, IgG, IgA, IgE, e IgM e qualquer uma das subclasses de isótopo, que incluem, mas não estão limitadas a, IgG1 e IgG4.

[00143] Um perito na técnica reconhecerá que o domínio de ligação ao antígeno BD2 das BFPs desta divulgação pode ser usado para de- tectar, medir e inibir proteínas que diferem um pouco de PD-1 e PD- L1. Espera-se que o domínio de ligação ao antígeno BD2 retenha a especificidade de ligação desde que a proteína alvo compreenda uma sequência que seja pelo menos cerca de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%,

ou mais idêntica com qualquer sequência de pelo menos 100, 80, 60, 40, ou 20 dos aminoácidos contíguos aqui descritos. A percentagem de identidade é determinada por algoritmos de alinhamento padrão tais como, por exemplo, Ferramenta de Alinhamento Local Básico (BLAST) descrito em Altshul et al. (1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410, o algoritmo de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol., 48: 444-453, ou o algoritmo de Meyers et al. (1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17.

[00144] Adicionalmente às análises de homologia de sequências, o mapeamento de epítopos (ver, por exemplo, "Epitope Mapping Proto- cols", ed. Morris, Humana Press, 1996) e análises da estrutura secun- dária e terciária podem ser levados a cabo para se identificarem estru- turas 3D específicas assumidas pelos domínios de ligação ao antígeno BD2 divulgados e seus complexos com antígenos. Tais métodos inclu- em, mas não estão limitados a, cristalografia de raios X (Engstom (1974) Biochem. Exp. Biol., 11:7-13) e modelação em computador de representações virtuais dos anticorpos presentemente divulgados (Fle- tterick et al. (1986) "Computer Graphics and Molecular Modeling", em Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor La- boratory, Cold Spring Harbor, N.I.).

[00145] Os domínios de ligação ao antígeno anti-PD-L1 contempla- dos podem ser obtidos ou derivados de durvalumab (MEDI4736), um exemplo de anticorpo anti-PD-L1 que é seletivo para PD-L1 e bloqueia a ligação de PD-L1 a PD-1 e receptores CD80. Durvalumab pode ate- nuar a supressão mediada por PD-L1 da ativação de células T huma- nas in vitro e inibe o crescimento tumoral em um modelo de xenoen- xerto via um mecanismo dependente de células T. As informações re- lativas a durvalumab (ou seus fragmentos) para uso nos métodos aqui proporcionados podem ser encontradas nas Patentes U.S Nos.

8.779.108 e 9.493.565, a divulgação das quais é incorporada aqui por referência na sua totalidade.

[00146] Em um aspecto específico, um seu fragmento de ligação ao antígeno de durvalumab para uso aqui inclui uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 aqui mostradas acima, e em que a região variável da cadeia leve compreende as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 defi- nidas por Kabat aqui mostradas acima. Aqueles com conhecimentos comuns na técnica seriam facilmente capazes de identificar CDR defi- nidas por Chothia, definidas por Abm, ou outras conhecidas daqueles com conhecimentos comuns na técnica. Em um aspecto específico, um fragmento de ligação ao antígeno de durvalumab para uso inclui as sequências CDR de cadeia pesada variável e de cadeia leve variável do anticorpo 2.14H9OPT, conforme divulgado na Patente U.S No. 8,.779.108.

[00147] Os domínios de ligação ao antígeno anti-PD-1 contempla- dos podem ser obtidos ou derivados de LO115, um exemplo de anti- corpo anti-PD-1 que é seletivo para PD-1 e bloqueia a ligação de PD-1 a PD-L1 e receptores PD-L2. Região Fc

[00148] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece proteínas de fusão biespecíficas com um polipeptídeo da região Fc IgG1 ou IgG4 que pode ter pelo menos uma modificação de aminoáci- dos. Por exemplo, um aminoácido pode ser substituído em uma ou mais posições selecionadas entre 228 e 235, conforme numeradas pelo índice EU, conforme estabelecido em Kabat. Por exemplo, a regi- ão Fc pode ser uma região Fc de IgG4 e os aminoácidos variantes são um ou mais de 228P (dando origem a "IgG4P"), 235E e 235Y como numerados pelo índice EU como apresentado em Kabat. Como outro exemplo, uma região Fc IgG1 é contemplada com a variante de ami- noácidos que podem incluir um ou mais de L234F/L235E/P331S (refe-

rido aqui em qualquer outra parte como "IgG TM"). Todas as moléculas de IgG4 aqui divulgadas, sejam IgG4 ou IgG4P marcadas, contêm a mutação 228P.

[00149] Em uma modalidade, o domínio de fragmento cristalizável (Fc) aqui usado é de durvalumab, que contém a mutação tripla no do- mínio constante da cadeia pesada de IgG1 que reduz a ligação ao componente do complemento C1q e aos receptores Fcγ responsáveis pela mediação da citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC). Ligantes

[00150] As subunidades nas proteínas de fusão biespecíficas da divulgação podem ser conectadas por ligantes polipeptídicos, em que cada ligante é fundido e/ou conectado de outra forma (por exemplo, através de uma ligação peptídica) a pelo menos dois polipeptídeos ou subunidades. As combinações de ligantes nas proteínas de fusão bi- específicas podem ser homoméricas ou heteroméricas. Em algumas modalidades, as sequências de aminoácidos de todos os ligantes pep- tídicos presentes em uma proteína de fusão biespecífica da divulgação são idênticas. Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos de, pelo menos, dois ligantes peptídicos presentes em uma proteína de fusão biespecífica da divulgação são diferentes. Um ligante polipep- tídico deve ter um comprimento, o qual é adequado para ligar duas ou mais subunidades monoméricas, de tal maneira que eles assumem a conformação correta em relação um ao outro, de modo que eles rete- nham a sua atividade desejada. O uso de ligantes de ocorrência natu- ral, bem como de ligantes peptídicos artificiais para a conexão de poli- peptídeos a novos polipeptídeos de fusão ligados é bem conhecido na literatura. Por conseguinte, os ligantes fundindo duas ou mais subuni- dades monoméricas podem ser ligantes naturais, ligantes artificiais, ou combinações dos mesmos.

[00151] Como aqui descrito, se verificou que ligantes peptídicos com um comprimento de 9 aminoácidos ou mais entre as subunidades de da proteína de fusão retiveram a estabilidade e/ou não causaram a agregação excessiva de tais proteínas de fusão. Assim, prevê-se que, em algumas modalidades, o ligante polipeptídico possa incluir cerca de 9 a cerca de 20 resíduos de aminoácidos, cerca de 9 a cerca de 15 resíduos de aminoácidos ou cerca de 9 resíduos de aminoácidos. Os resíduos de aminoácidos selecionados para serem incluídos no ligante polipeptídico devem apresentar propriedades que não interferem signi- ficativamente com a atividade ou a função das subunidades de proteí- nas de fusão da divulgação. Assim, um ligante polipeptídico não deve, em geral, exibir uma carga que seria incompatível com a atividade ou a função da subunidade da proteína de fusão particular da divulgação, ou interferir com a dobragem interna, ou formar ligações ou outras in- terações com os resíduos de aminoácidos em uma ou mais das subu- nidades monoméricas, que iria seriamente impedir a ligação

[00152] Em várias modalidades, um ligante polipeptídico possui fle- xibilidade conformacional. Os ligantes flexíveis adequados incluem, por exemplo, aqueles que têm uma combinação de resíduos Gly e Ser, onde a razão de Gly para SER é ≥ 1. Em algumas modalidades, um ligante polipeptídico é um polipeptídeo natural ou artificial inerente- mente não estruturado (ver, por exemplo Schellenberger et al., Nature Biotechnol. 27:1186-1190, 2009; ver também, Sickmeier et al., Nucleic Acids Res. 35:D786-93, 2007).

[00153] Em certas modalidades específicas, um ligante entre as su- bunidades da proteína de fusão biespecífica pode ser um multímero de GGGGS, tais como GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 39), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 40), ou GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 41). Em outras modalidades, um ligante contemplado pode ser GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 42).

Modalidades Específicas

[00154] Em modalidades específicas, as proteínas de fusão biespe- cíficas aqui divulgadas contêm um par de proteínas de fusão de cadeia única, cada uma compreendendo, do terminal N ao terminal C, um fra- gmento Fab anti-PD-1 ou anti-PD-L1 compreendendo uma região vari- ável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, covalen- temente ligada a um (b) polipeptídeo IgG1 ou IgG4P Fc covalentemen- te ligada a (c) um primeiro ligante peptídico covalentemente ligado a uma primeira subunidade de ligando da superfamília TNF, covalente- mente ligada a um segundo ligante peptídico, covalentemente ligado a uma segunda subunidade de ligando da superfamília TNF, covalente- mente ligado a um terceiro ligante peptídico, covalentemente ligado a uma terceira subunidade de ligando da superfamília TNF. Derivados

[00155] Os polipeptídeos (por exemplo, anti-PD-1 Fab, anti-PD-L1 Fab, GITRL, OX40L, CD40L, TNF-α, ou CD137L) da divulgação po- dem incluir variantes das sequências, desde que mantenham a capa- cidade de ligar-se especificamente aos seus alvos. Tais variantes po- dem ser derivadas das sequências desses polipeptídeos por um perito na técnica usando técnicas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, substituições, deleções, ou adições de aminoácidos podem ser feitas nas FRs e/ou nas CDRs de anti-PD-1 ou fragmentos PD-L1 Fab. Em- bora mudanças nas FRs sejam usualmente desenhadas para melhora- rem a estabilidade e imunogenicidade do domínio de ligação ao antí- geno, mudanças nas CDRs são tipicamente desenhadas para aumen- tarem a afinidade do domínio de ligação ao antígeno pelo seu alvo. As variantes de FRs incluem também alotipos de imunoglobulina ocorren- do naturalmente. Tais mudanças de aumento da afinidade podem ser determinadas empiricamente por técnicas de rotina que envolvem alte- ração da CDR e teste da afinidade do domínio de ligação ao antígeno pelo seu alvo. Por exemplo, substituições de aminoácidos conservati- vas podem ser feitas dentro de qualquer uma das CDRs divulgadas. Várias alterações podem ser feitas de acordo com os métodos descri- tos em "Antibody Engineering", 2ª ed., Oxford University Press, ed. Borrebaeck, 1995. Estas alterações incluem, mas não estão limitados a sequências de nucleotídeos que são alteradas pela substituição de diferentes códons que codificam um resíduo de aminoácido funcional- mente equivalente dentro da sequência, produzindo assim uma mu- dança "silenciosa". Por exemplo, os aminoácidos não polares incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina. Os aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido as- pártico e ácido glutâmico.

[00156] Os derivados e análogos de polipeptídeos e/ou anticorpos da divulgação podem ser produzidos por várias técnicas bem conheci- das na técnica, incluindo métodos recombinantes e sintéticos (Maniatis (1990) "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.I., e Bodansky et al. (1995) "The Practice of Peptide Synthesis", 2ª ed., Spring Verlag, Berlim, Alemanha).

[00157] Em uma modalidade, um método para construir um domínio VH que é uma variante de sequência de aminoácidos de um domínio VH da divulgação compreende um passo de adição, deleção, substi- tuição, ou inserção de um ou mais aminoácidos na sequência de ami- noácidos do domínio VH presentemente divulgado, combinando opci- onalmente o domínio VH assim proporcionado com um ou mais domí- nios VL, e teste do domínio VH ou combinação ou combinações VH/V para uma ligação específica ao antígeno. Um método análogo pode ser empregue em que uma ou mais variantes de sequência de um domínio VL aqui divulgadas são combinadas com um ou mais domí- nios VH.

[00158] Técnicas de embaralhamento ou combinatoriais análogas são também divulgadas por Stemmer (Nature (1994) 370: 389-391), que descreve a técnica em relação a um gene da β-lactamase, mas observa que a abordagem pode ser usada para a geração de anticor- pos.

[00159] Em modalidades adicionais, se podem gerar novas regiões VH ou VL transportando uma ou mais sequências derivadas das se- quências aqui divulgadas usando mutagênese aleatória de um ou mais genes de VH e/ou VL selecionados. Uma tal técnica, PCR propensa a erros, é descrita por Gram et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. E.U.A. (1992) 89: 3576-3580).

[00160] Outro método que pode ser usado é direcionar mutagênese para CDRs de genes VH ou VL. Tais técnicas são divulgadas por Bar- bas et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1994) 91: 3809-3813) e Schier et al. (J. Mol. Biol. (1996) 263: 551-567).

[00161] Do mesmo modo, uma, duas ou todas as três CDRs de um domínio de ligação ao antígeno podem ser enxertadas em um repertó- rio de domínios VH ou VL, que são depois analisados quanto a um fragmento de ligação ao antígeno específico para PD-1 ou PD-L1.

[00162] Uma porção de um domínio variável de imunoglobulina útil pode compreender, pelo menos, uma das CDRs substancialmente como apresentado aqui e, opcionalmente, regiões estruturais interve- nientes dos fragmentos scFv como apresentado aqui. A porção pode incluir pelo menos cerca de 50% de qualquer uma das ou ambas as FR1 e FR4, os 50% sendo os 50% de terminal C de FR1 e os 50% de terminal N de FR4. Os resíduos adicionais na extremidade de N- terminal ou C-terminal da parte substancial do domínio variável podem ser aqueles não normalmente associados às regiões de domínio variá- vel de ocorrência natural. Por exemplo, a construção de anticorpos por técnicas de DNA recombinante pode resultar na introdução de resí- duos no terminal N ou C codificados por ligantes introduzidos para fa- cilitar a clonagem ou outros passos de manipulação. Outros passos de manipulação incluem a introdução de ligantes para unir domínios vari- áveis a sequências de proteína adicionais incluindo regiões constantes de cadeia pesada de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos), ou marcações proteináceas co- mo discutido em detalhe adicional em baixo.

[00163] Os domínios de ligação a antígeno da divulgação (por exemplo, anti-PD-1 e/ou anti-PD-L1) aqui descritos podem ser ligados a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (albumina, outro anticorpo, etc.). Por exemplo, os domínios de ligação a antígeno podem ser ligados por reticulação química ou por métodos recombinantes. Os domínios de ligação a antígeno podem também ser ligados a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, ou polioxialquilenos, do modo estabelecido nas Pat. U.S Nos. 4.640.835; 4.,496.689;

4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; ou 4.179.337. Os domínios de liga- ção a antígeno podem ser quimicamente modificados por conjugação covalente a um polímero, por exemplo, para aumentar a sua semivida em circulação. Polímeros exemplificativos e métodos para os ligar são também mostrados na Pat. U.S. Nos. 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285 e 4.609.546.

[00164] Os domínios de ligação a antígeno divulgados podem ser também alterados para terem um padrão de glicosilação que difere do padrão nativo. Por exemplo, uma ou mais frações de carboidrato po- dem ser eliminadas e/ou um ou mais sítios de glicosilação adiciona- dos. A adição de sítios de glicosilação aos domínios de ligação a antí-

geno presentemente divulgados pode ser alcançada por alteração da sequência de aminoácidos para conter sequências de consenso de sítios de glicosilação conhecidas na técnica. Outro meio de aumentar o número de frações de carboidrato nos domínios de ligação a antígeno é por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos aos resíduos de aminoácidos do anticorpo. Tais métodos são descritos em WO 87/05330 e em Aplin et al. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-

306. A remoção de quaisquer frações de carboidrato dos anticorpos pode ser alcançada quimicamente ou enzimaticamente, por exemplo, como descrito por Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259: 52; e Edge et al. (1981) Anal. Biochem., 118: 131 e por Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol., 138: 350. Os domínios de ligação a antí- geno podem ser também marcados com um marcador detectável, ou funcional. Os marcadores detectáveis incluem radiomarcadores tais como 131I ou 99Tc, que podem estar também anexados a domínios de ligação a antígeno usando química convencional. Marcadores de- tectáveis incluem também marcadores de enzima tais como peroxida- se de rábano-silvestre ou fosfatase alcalina. Os marcadores detectá- veis incluem adicionalmente frações químicas tais como biotina, que podem ser detectados através de ligação a uma fração química detec- tável cognata específica, por exemplo, avidina marcada.

[00165] Os domínios de ligação a antígeno, nos quais as sequên- cias de CDR diferem apenas insubstancialmente daquelas aqui apre- sentadas, estão abrangidos no âmbito desta divulgação. Tipicamente, um aminoácido é substituído por um aminoácido relacionado tendo características de carga, hidrofóbicas, ou estereoquímicas similares. Tais substituições estariam dentro das perícias ordinárias de um espe- cialista. Ao contrário de CDRs podem ser feitas mudanças substanci- ais em FRs sem afetar adversamente as propriedades de ligação de um anticorpo. Mudanças a FRs incluem, mas não estão limitadas a,

humanização de um resíduo estrutural derivado não humano ou mani- pulação de certos resíduos estruturais que são importantes para con- tato do antígeno ou para estabilização do sítio de ligação, por exem- plo, mudança da classe ou subclasse da região constante, mudança de resíduos de aminoácidos específicos que poderiam alterar a função efetora tal como ligação ao receptor Fc, por exemplo, como descrito na Pat. U.S. Nos. 5.624.821 e 5.648.260 e Lund et al. (1991) J. Immun. 147: 2657-2662 e Morgan et al. (1995) Immunology 86: 319-324, ou mudança da espécie da qual a região constante é derivada.

[00166] Um com perícia na técnica apreciará que as modificações descritas acima não são exaustivas, podem ser aplicadas às subuni- dades de proteínas aqui descritas e que muitas outras modificações serão possíveis para um perito na técnica experiente à luz dos ensi- namentos da presente divulgação. Produção de Proteínas de Fusão Biespecíficas

[00167] A prática da presente divulgação aplica, a menos que indi- cado de outro modo, técnicas de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunolo- gia, que estão bem dentro da competência de um perito na técnica. Tais técnicas são inteiramente explicadas na literatura, tal como, "Mo- lecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimen- tal Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Bio- logy" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991). Estas técni- cas são aplicáveis à produção dos polipeptídeos da divulgação, e, co- mo tal, podem ser consideradas para realizar e praticar a divulgação. Técnicas particularmente úteis para modalidades particulares serão discutidas nos Exemplos. Análise das propriedades e atividades da proteína de fusão bies- pecífica

[00168] A estabilidade das subunidades da proteína de fusão bies- pecífica da divulgação, isoladas ou como parte de um multímero, pode ser facilmente medida através de técnicas bem conhecidas na técnica, tais como desnaturação térmica (Tm) e com agentes caotrópicos (tal como tratamento com ureia ou sais de guanidina), tratamento de pro- tease (tal como, tratamento com termolisina) ou outra técnica aceite na metodologia para determinar a estabilidade da proteína. Uma ampla revisão de técnicas utilizadas para medir a estabilidade da proteína pode ser encontrada, por exemplo, em "Current Protocols in Molecular Biology" e "Current Protocols in Protein Science" por John Wiley and Sons. 2007.

[00169] A afinidade de ligação e outras propriedades de ligação de uma proteína de fusão biespecífica de acordo com a presente divulga- ção pode ser determinada por uma variedade de métodos de ensaio in vitro conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, métodos de equi- líbrio (por exemplo, ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) ou cinética (por exemplo, análise BIACORE®), e outros métodos, tais co- mo os ensaios de ligação indireta, ensaios de ligação competitiva, ele- troforese em gel e cromatografia (por exemplo, filtração em gel). Estes e outros métodos, podem utilizar uma etiqueta sobre um ou mais dos componentes a serem examinados e/ou empregar uma variedade de métodos de detecção incluindo, mas não limitado a, cromogênico, fluo- rescente, luminescente ou marcadores isotópicos. Uma descrição de- talhada de afinidade e cinética de ligação pode ser encontrada em Pa- ul, WE, ed., Fundamental Immunology, 4a edição., Lippincott -Raven, Filadélfia (1999).

[00170] Métodos adicionais in vitro e in vivo para determinar a fun-

ção ou atividade da proteína de fusão biespecífica são aqui descritos. Estes ensaios podem ser usados para determinar uma ou mais de uma resposta imune (por exemplo, uma ou mais funções e memória das células T, ativação ou proliferação de células B, maturação ou ati- vação de células dendríticas, resposta de citocina ou quimiocinas Th1, polarização M1/M2 de macrófagos derivados de monócitos humanos, apresentação de antígenos e/ou imunossupressão de um microambi- ente tumoral). São conhecidos na técnica vários modelos animais para análise anticancerígena ou atividade antitumoral in vivo, incluindo, por exemplo, o modelo de camundongo de tumor B16-F10. Além disso, métodos de avaliação das propriedades farmacodinâmicas e farmaco- cinéticas também são bem conhecidos. Terapia Antitumoral

[00171] A presente divulgação também apresenta composições e métodos que são úteis para o tratamento do câncer compreendendo uma proteína de fusão biespecífica, tal como descrito acima. Em vá- rias modalidades, as proteínas de fusão biespecíficas podem ser ad- ministradas em combinação com outros fármacos anticâncer ou fár- macos que aumentam as respostas das células imunológicas ao cân- cer.

[00172] São ainda aqui fornecidos métodos para o tratamento de câncer, incluindo a administração de uma ou mais proteínas de fusão biespecíficas, tal como as mostradas nas FIGS. 1-4. Como mostrado aqui, a administração de proteínas de fusão biespecíficas pode resul- tar em uma redução no volume do tumor em, por exemplo, um modelo de tumor de camundongo. Em certos aspectos, um paciente que apre- senta um tumor sólido é administrado com uma proteína de fusão bi- específica.

[00173] O tratamento com uma terapia de câncer incluindo uma proteína de fusão biespecífica causa, por exemplo, uma redução na taxa de progressão do câncer, um atraso ou estabilização do cresci- mento do tumor, encolhimento do tumor e/ou regressão do tumor. Em alguns aspectos, a redução ou atraso do crescimento do tumor pode ser estatisticamente significativo. Uma redução no crescimento do tu- mor pode ser medida por comparação com o crescimento do tumor do paciente na linha de base, contra o crescimento de um tumor espera- do, contra o crescimento de um tumor esperado baseado em uma grande população de pacientes, ou contra o crescimento do tumor de uma população de controle.

[00174] Em outras modalidades, os métodos da divulgação aumen- tam as taxas de sobrevivência ao câncer e prolongam a vida. Por exemplo, os dados aqui divulgados demonstram não apenas a eficácia das moléculas de BFP no tratamento do câncer, mas que o uso de uma BFP (MEDI7526) resulta em menor toxicidade do que o tratamen- to com uma combinação de seus reagentes parentais (Durva + ME- DI5083). Portanto, o uso de moléculas de BFP no tratamento do cân- cer pode alcançar uma resposta anticâncer eficaz com menos toxici- dade e melhorar a saúde geral do paciente. Por outras palavras, a uti- lização das proteínas de fusão biespecíficas aqui divulgadas pode proporcionar resultados de tratamento que não são alcançáveis ape- nas com as monoterapias.

[00175] A resposta clínica à administração de uma terapia de cân- cer pode ser avaliada usando técnicas de diagnóstico conhecidas pe- los clínicos, incluindo, mas não limitadas a, varredura de imagiologia de ressonância magnética (MRI), imagiologia de raios X, varredura tomográfica computorizada (CT), citometria de fluxo ou análise de tria- gem de células ativadas por fluorescência (FACS), histologia, patolo- gia macroscópica, e química do sangue, incluindo mas não se limitan- do a alterações detectáveis por ELISA, RIA e cromatografia.

[00176] Os exemplos seguintes são apresentados de modo a forne-

cer aos peritos na técnica com uma divulgação e descrição completas de como preparar e utilizar o ensaio, rastreio, e métodos terapêuticos da divulgação, e não se destinam a limitar o âmbito de que os invento- res consideram como a sua divulgação.

EXEMPLOS

[00177] A divulgação é agora descrita com referência aos exemplos seguintes. Estes exemplos são apenas ilustrativos e a divulgação não deve, de forma alguma ser interpretada como estando limitada a estes exemplos, mas sim deve ser interpretada de modo a incluir quaisquer e todas as variações que se tornam evidentes como resultado dos en- sinamentos aqui proporcionados. EXEMPLO NO. 1. GERAÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO BIESPE-

CÍFICAS

[00178] As proteínas de fusão biespecíficas testadas nos exemplos abaixo foram construídas usando um construto de proteína de fusão de cadeia única (scfp) de três subunidades de ligandos (correspon- dendo principalmente ao domínio de homologia do TNF) ligadas a um monômero Fc ligado a um fragmento Fab via ligantes peptídicos (ver FIGS. 1-4). As scfps dimerizaram para formar as BFPs. As sequência usadas para as BFPs são descritas abaixo. EXEMPLO NO. 2. ENSAIO DE LIGAÇÃO AO OCTETO

[00179] Para avaliar a ligação das moléculas de ligação biespecífi- cas aqui divulgadas, foi utilizado um Octet QK equipado com pontas de biossensores Ni-NTA e tampão cinético 10X (ForteBio, Menlo Park, CA). Para esta série de proteínas de ligação biespecíficas, PD-L1-his marcada com His foi fabricada internamente, a proteína CD40-Fc foi adquirida na Sino-Biological (Pequim, China) e biotinilada no laborató- rio. Todos os ensaios de ligação foram realizados a 25 °C.

[00180] As placas de amostra foram agitadas a 1000 rpm antes da análise. O tampão cinético 1X foi aplicado a estreptavidina e nas pon-

tas dos biossensores Ni-NTA por 10 minutos antes de usar. O tampão cinético 1X também serviu como tampão de corrida para determinação da linha de base e como tampão de diluição para antígenos e anticor- pos biespecíficos. A estreptavidina e as pontas de biossensores Ni- NTA foram mergulhados em CD40-biotina 20 nM (FIGS. 5A e 5B) ou PD-L1 marcado com his (FIGS. 5C e 5D) para captura de antígeno por 5 min e enxaguamento em tampão cinético por 30 segundos. As pon- tas de biossensores revestidas com antígeno foram mergulhadas em anticorpos biespecíficos a 10 μg/mL por 5 minutos e enxaguou-se, de- pois foram movidos para uma coluna de poços contendo antígeno PD- L1 Fc 100 nM (FIGS. 5A e 5B) ou CD40-Fc 100 nM (FIGS. 5C e 5D) por 5 minutos. Neste ensaio, quando as moléculas de BFP foram satu- radas, o primeiro antígeno (CD40 ou PD-L1), o segundo antígeno (PD- L1 ou CD40) foram injetados e, como esperado, foi observado um se- gundo sinal de ligação. Esta observação foi reproduzível quando a or- dem de injeção de antígeno foi revertida, indicando que as moléculas de BFP podem se ligar a dois alvos simultaneamente. EXEMPLO NO. 3. AVALIAÇÃO DA LIGAÇÃO DE ANTÍGENOS DE

SUPERFÍCIE CELULAR

[00181] A citometria de fluxo foi usada para avaliar a ligação ao an- tígeno da superfície celular por BFPs.

[00182] Anti-PD-L1+CD40L FPs BFP2 e BFP3 (MEDI7526; ver Ta- bela 1), CD40L FP6 (MEDI5083), e anti-PDL1 (MEDI4736), todos em isotipo IgG4 humano, foram conjugados com Alexa Fluor 647 usando o Kit de Marcação de Anticorpos Monoclonais Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher). Um anticorpo de controle de isotipo IgG4 também foi conjuga- do seguindo o mesmo protocolo. Todos os anticorpos conjugados re- sultantes apresentaram proporções similares de corante para anticor- po. No ensaio de ligação, anticorpos conjugados Alexa 647 foram dilu- ídos serialmente em tampão FACS (PBS mais 3% de soro fetal de bo-

vino), resultando em concentração final de entre 40 nM para 19,532 pM e misturado com 10,000 células HEK293 transfectadas com CD40 (FIG. 6A) ou células B humanas Ramos (FIG. 6 B). As células 293 e Ramos transfectadas com CD40 expressam CD40, mas não PD-L1. Após incubação a 4C durante uma hora, as células foram centrifuga- das e anticorpos livres presentes no sobrenadante foram removidos. As células com anticorpos ligados foram lavadas e executadas através de citometria de fluxo. Os sinais de fluorescência foram detectados e registrados pela máquina de citometria e a intensidade média de fluo- rescência de Alexa 647 nas células alvo foi determinada usando o sof- tware Flowjo®. Os gráficos das FIGS. 6A e 6B mostram que BFP2 e BFP3 têm ligação semelhante a CD40 tal como o MEDI5083 parental; enquanto que, anti-PD-L1 (MED4736) e controle de isotipo de anticor- po não se ligam.

[00183] A seguir, avaliou-se a ligação a PD-L1 humana em células HEK293 transfectadas com PD-L1 e uma linha celular de câncer de ovário humano ES2. Ambas as linhas celulares expressam PD-L1, mas não CD40. Os anticorpos conjugados com Alexa 647 foram diluí- dos em tampão FACS e misturados com 10,000 células HEK293 trans- fectadas com PD-L1. Após incubação a 4C durante uma hora, as cé- lulas foram centrifugadas e anticorpos livres presentes no sobrenadan- te foram removidos. As células com anticorpos ligados foram lavadas e executadas através de citometria de fluxo. Os sinais de fluorescência foram detectados e registrados pela máquina de citometria e a intensi- dade média de fluorescência de Alexa 647 nas células alvo foi deter- minada usando o software Flowjo®. Os gráficos das FIGS. 7A e 7B mostram que BFP2 e BFP3 se ligam à superfície celular PD-L1, embo- ra com menor ligação máxima e EC50 maior que MEDI4736 com isoti- pos TM IgG1 ou IgG4. CD40L FP e o anticorpo de controle do isotipo não se ligaram a PD-L1 neste ensaio, como esperado.

[00184] Anti-PD-L1+CD40L FP, BFP2 e 3 foram avaliadas quanto à ligação a PBMCs humanas. Uma vez que a expressão de CD40 e PD- L1 é aumentada em PBMCs em condições inflamatórias, foi avaliada a ligação em agrupamentos de PBMCs puros ("naive") e estimuladas com IFN-γ. Neste estudo, as PBMCs foram isoladas a partir de um do- ador saudável e marcadas com quantidades elevadas (100 nM) ou baixas (10 nM) de éster succinimidilo de diacetato de carboxifluoresce- ína (CFSE). PBMCs com 100 nM CFSE foram colocadas em cultura sem tratamento durante 24 horas e as PBMCs marcadas com 10 nM CFSE foram colocadas em cultura sob as mesmas condições, mas foram estimuladas com 1 nM IFN-γ humano durante a noite para regu- lar positivamente a expressão de CD40 e PD-L1. Assim, as células com ou sem tratamento com IFN-γ podem ser diferenciadas com base em diferentes níveis de sinais CFSE. Todas as PBMCs com marcação de elevada e baixa CFSE foram misturadas no dia seguinte e coradas com anti-CD19 para células B, CD3 para células T, e CD14 para mo- nócitos. A ligação de moléculas de anti-PD-L1-CD40L FP BFP a sub- conjuntos de PBMC foi revelada por citometria de fluxo em compara- ção com CD40L FP (MEDI5083) e anti-PDL1 (MEDI4736 IgG1 TM). Como mostrado na FIG. 8, ambos os formatos de proteínas BFP exibi- ram atividade e potência de ligação semelhantes. Monócitos tratados com IFN-γ se ligam à maioria das moléculas de BFP, seguido por mo- nócitos puros ("naive") e células T e B. Estes resultados também indi- cam que em PBMCs, as moléculas de BFP têm perfil de ligação seme- lhante a anti-PDL1 e CD40L FP (MEDI5083).

[00185] PD1-OX40L, PD1-OX40L 2TS e PD1-OX40L 1TS, todos no isotipo IgG4 humano, foram conjugados com Alexa Fluor 647 usando Kit de Marcação de Anticorpo Monoclonal Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher). A ligação às células Jurkat/OX40-GITR-FP2 (FIG. 71A) e às células T primárias humanas ativadas (FIG. 72) foram testadas usando o protocolo como mencionado acima. EXEMPLO NO. 4. ANTI-PDL1-CD40L FP, BFP2 E 3 TÊM A CAPA- CIDADE DE ESTIMULAR A VIA CD40 E BLOQUEAR A INTERAÇÃO PD1-PDL1. Via de ativação de NF-κB é acionada via ativação de CD40.

[00186] Células HuCD40/HEK293/ NF-κB (clone 3) foram mantidas em DMEM (Gibco) mais 10% de FBS inativado pelo calor (HI-FBS; Gibco) e 1% de Pen/Strep (GIBCO). No dia 1, as células foram colhi- das e ressuspensas em DMEM com 2% de HI FBS a 5 × 105/mL. Cem microlitros de células por poço foram semeados em uma placa de mi- crotitulação BD Biocoat Poly-D-lisina de 96 poços preto/claro (Cat#356640). As células foram colocadas em uma incubadora a 37 °C por 24 horas. Após a incubação, o meio foi aspirado da placa. Cem microlitros de 1X material de teste foi cuidadosamente adicionado a cada poço e foi tomado cuidado para minimizar o descolamento das células. As células foram devolvidas à incubadora a 37 °C durante 24 horas. Foi preparado o reagente de luciferase (Substrato do Ensaio de Luciferase Bright-Glo®; Promega), deixado a equilibrar à temperatura ambiente e adicionado (100 µL) a cada poço. As células e o reagente foram bem misturados para garantir a lise celular completa e imedia- tamente lidos em um leitor de placas SpectraMax M5. FIG. 9 demons- tra que as moléculas BFP ativam sinais de NF-κB em vários tipos de células, incluindo células 293 transfectadas com CD40 (A), células Ramos (b) e células THP-1 (C). Protocolo do ensaio de bioatividade de Ramos-Blue

[00187] Células repórter Ramos-Blue NF-B/AP-1 (Invivogen) foram mantidas em meio IMDM GlutaMAX® (GIBCO) mais HI-FBS a 10% (GIBCO), 1% Pen Strep (GIBCO) e Zeocin (100 µg/mL; InvivoGen). As células não são aderentes e as culturas foram iniciadas a 5 × 105 célu- las/mL e mantidas abaixo de 3 × 106 células/mL. No dia antes da expe-

riência, as células foram divididas em meio IMDM GlutaMAX mais HI- FBS a 10% e pen/estrep (livre de Zeocina). As células foram colhidas, ajustadas para 1 × 106 células/mL e adicionadas (180 µL) aos poços de uma placa de 96 poços de fundo plano (Corning). Foram adiciona- dos vinte microlitros de material de teste 10 X em meio isento de Zeo- cina a cada poço, e as células foram colocadas em uma incubadora a 37 °C por 24 horas. O reagente QUANTI-Blue (uma bolsa dissolvida em 100 mL de água estéril; Invivogen) foi preparado e adicionado a uma placa de 96 poços de fundo plano a 160 µL/poço. O sobrenadante das células Ramos-Blue (40 µL) foi adicionado aos poços contendo QUANTI-Blue. As placas foram colocadas em uma incubadora a 37 °C por até 1 hora e lidas em um espectrofotômetro SpectraMax M5 a 655 nm. Protocolo do ensaio de bioatividade de THP1-Blue

[00188] As células repórter THP1-blue NF-κB (Invivogen) foram mantidas em RPMI1640 (GIBCO) mais 10% de HI-FBS (GIBCO), 1% de Pen Strep (GIBCO) e blasticidina (10 µg/mL; InvivoGen). As células não são aderentes e as culturas foram iniciadas a 7 × 105 células/mL e mantidas abaixo de 2 × 106 células/mL. No dia antes da experiência, as células foram divididas em meio IMDM RPMI1640 mais HI-FBS a 10% e pen/estrep (livre de blasticidina). As células foram colhidas, ajustadas para 1×106 células/mL e adicionadas (180 µL) aos poços de uma placa de 96 poços de fundo plano (Corning). Vinte microlitros de material de ensaio a 10 vezes (já diluído serialmente) em meio livre de blasticidina, foram adicionados a cada poço, e as células foram colo- cadas numa incubadora a 37 °C durante 24 horas. O reagente QUAN- TI-Blue (uma bolsa dissolvida em 100 mL de água estéril; Invivogen) foi preparado e adicionado a uma placa de 96 poços de fundo plano a 160 µL/poço. O sobrenadante das células THP1-Blue (40 µL) foi adici- onado aos poços contendo QUANTI-Blue. As placas foram colocadas em uma incubadora a 37 °C até 6 horas e lidas em um espectrofotô- metro SpectraMax M5 a 655 nm. Os resultados são mostrados na FIG.

9. EXEMPLO NO. 5. ATENUAÇÃO DA INIBIÇÃO MEDIADA POR PD- L1

[00189] Neste exemplo, as moléculas de anti-PD-L1-CD40L FP BFP foram examinadas para determinar se eram biologicamente equi- valentes a anti-PD-L1 no bioensaio de bloqueio de PD-1/PD-L1 (Pro- mega). Em primeiro lugar, um frasco de células CHO PD-L1 foi des- congelado e ressuspenso em 14,5 mL de meio Ham's F12 com 10% de FBS. As células foram adicionadas a 100 µL por poço às placas de ensaio de fundo branco de 96 poços. As placas foram incubadas a 37 °C durante a noite (16-20 horas). As placas foram retiradas da incuba- dora no dia seguinte e os meios foram cuidadosamente removidos. Quarenta (40) µL de material de teste (2x) em tampão de ensaio (RPMI1640 com 1% de FBS) foram adicionados a cada poço das pla- cas. Em seguida, um frasco de células efetoras Jurkat PD1 foi des- congelado e ressuspenso em 5,9 mL de tampão de ensaio. Quarenta (40) µL de células Jurkat PD1 foram então adicionadas a cada poço das placas. As placas foram colocadas na incubadora a 37 °C por 6 horas. Foi preparado o reagente de luciferase (Substrato do Ensaio de Luciferase Bio-Glo®; Promega), deixado a equilibrar à temperatura ambiente e adicionado (80 µL) a cada poço. As placas foram coloca- das à temperatura ambiente por 5 minutos, seguidas de leitura imedia- ta em um leitor de placas SpectraMax® M5. MEDI7526 inibiu a função PD-L1, resultando em um aumento dependente da dose da atividade de NFAT neste ensaio. EC50 de MEDI7526 é comparável à molécula MEDI4736 IgG4. FIG. 10 demonstra a função inibidora mediada por PD-L1 atenuada por anti-PD-L1-CD40L FP BFP. EXEMPLO NO. 6. ENSAIO DE COATIVAÇÃO DE BFP

[00190] A função da molécula de BFP foi avaliada em um robusto monócito THP-1 baseado em repórter e ensaio de coativação de célu- las T Jurkat. Neste ensaio, as células THP-1 transfectadas com genes repórter de NF-ĸB-SEAP (Invivogen) foram semeadas a 400,000 por poço e estimuladas com IFN-γ durante a noite para regular positiva- mente a expressão de CD40 e PD-L1 nessas células. A estimulação por IFN-γ não induz a ativação de NF-ĸB em células THP-1. Um es- quema conceitual do ensaio é mostrado na FIG. 11A.

[00191] Na noite anterior ao dia do ensaio, uma placa branca de 96 poços foi revestida com anticorpo anti-CD3 humano (Biolegend). No dia do ensaio, as células THP-1 foram lavadas e misturadas com 100,000 células Jurkat por poço transfectadas com o repórter NFAT- luciferase (Promega) e foram adicionados reagentes de teste diluídos em série. A placa de ensaio foi incubada a 37 °C por 6 horas. As célu- las foram então centrifugadas e 40 µL de meio de cultura foram trans- feridos de cada poço para o poço correspondente de uma nova placa de 96 poços e foram armazenadas a -80 °C.

[00192] Para determinar a atividade SEAP, que está presente no meio de cultura, as placas com meio de cultura de células congeladas foram descongeladas à temperatura ambiente e misturadas com solu- ção QUANTI-Blue a 37 °C. Após 15 minutos de incubação, a atividade SEAP foi medida com um leitor de microplacas. Para medir a atividade de NF-ĸB, as células foram misturadas com o reagente de lise 1X e os lisados celulares foram misturados com 80 µL de reagente de ensaio Bio-Glo luciferase (Promega). As placas foram incubadas por 5 minu- tos à temperatura ambiente e as intensidades de luminescência foram medidas em um leitor de placas SpectraMax® M5. Como mostrado na FIG. 11 B, moléculas anti-PDL1-CD40L BFP ativaram NF-ĸB em célu- las THP1 e aumentaram a atividade NFAT em células T Jurkat, de- monstrando que as moléculas BFP podem desempenhar múltiplas funções em células imunológicas mistas. EXEMPLO NO. 7. MEDI7526 ATIVA CÉLULAS PRIMÁRIAS HUMA- NAS E INDUZ A PRODUÇÃO DE CITOCINAS.

[00193] Neste estudo, foi examinada a capacidade de MEDI7526 de induzir a produção de citocinas em células primárias. Protocolo do ensaio de enterotoxina B estafilocócica (SEB)

[00194] Os reagentes usados no protocolo de ensaio SEB para de- terminar o efeito das moléculas BFP na resposta imunológica de IL-2 incluem: Cones de leucócitos (código NHSBT NC24; de Addenbrookes Hospital); Tubos Falcon de 50 mL (BD 352070); Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare 17-1440-02); Anti-CD3 (clone OKT3; 1 mg/mL; eBios- cience; cat no: 16-0037-85); Solução de cloreto de amônio (Stemcell Technologies 07850); Soluções de estoque de enterotoxina B estafilo- cócica (SEB; Sigma, S-4881) a 1 mg/mL armazenadas a -20 °C; Meios de cultura (todos da Life Technologies): RPMI1640 com GlutaMax™ (61870) suplementado com 10% v/v de FCS inativado pelo calor (90005M) e 100 U/mL de penicilina + 100 µg/mL de estreptomicina (15140-122); Placa com fundo em V (Greiner BioOne 651201); Placas de fundo plano de 96 poços (Corning Costar 7107).

[00195] Os reagentes para IL-2 DELFIA ELISA incluem: Placas FLUONUNC Maxisorp ELISA (Nunc 437958); Estreptavidina marcada com európio, SA-Eu (Perkin-Elmer 1244-360); Tampão de ensaio DELFIA® (Perkin-Elmer, #4002-0010); Solução de melhoramento DELFIA® (Perkin-Elmer 4001-0010); à TA antes do uso; Diluente do ensaio: tampão de lavagem DELFIA (Tween-20 a 0,05%, Tris 20 mM, NaCl 150 mM; pH 7,2-7,4) suplementado com BSA a 0,1%, filtrado es- terilizado; Leite em pó (Marvel; Premier Foods); Diluente de amostra (RPMI1640 + 10% de FCS + 1% de penicilina/estreptomicina como acima); PBS (ThermoFisher 14190235); PBS-Tween (0,01% de Tween-20 em PBS); Kit ELISA IL-2 humana (Duoset DY202, R&D Sys-

tems); Lavadora de placas Biotek (EL406) com carregador automático de placas (Biostack). Protocolo Geral de Ensaio

[00196] PBMCs foram isoladas a partir de cones de leucócitos do sangue humano (código NC24 de Serviços de Sangue e Transplantes NHS) usando centrifugação em gradiente de densidade (Ficoll-Paque PLUS; GE Healthcare); depois, os glóbulos vermelhos foram lisados em solução de cloreto de amônio (Stemcell Technologies). CD3 anti- humano (clone OKT3 a 0,5 µg/mL em PBS; eBioscience) foi revestido em placas de 96 poços de fundo plano (Corning Costar 7107) por 2 horas a 37 °C. Em seguida, 2 x 105 células foram adicionadas por poço de PBMC em meio de cultura (RPMI1640-GlutaMax suplementado com 10% v/v de soro bovino inativado pelo calor e 100 U/100 µg por mL de estreptomicina/penicilina (respetivamente) (Life Technologies). PBMCs foram ainda estimuladas por adição de SEB de concentração final 1 µg/mL, e moléculas de BFP candidatas foram diluídas em série adicionadas às concentrações finais testadas. Após 3 dias de cultura a 37 °C e 5% de CO2, os sobrenadantes foram removidos das células, e a secreção de IL-2 foi determinada usando um ELISA comercial de acordo com as instruções do fabricante (R&D Systems).

[00197] Os resultados mostrados na FIG. 12 demonstram que ME- DI7526 (BFP3) induz o nível mais alto de produção de IL-2 no ensaio SEB com um EC50 de 59,8 pM. EXEMPLO NO. 8. MEDI7526 ATIVA CÉLULAS PRIMÁRIAS HUMA- NAS E INDUZ A PRODUÇÃO DE CITOCINAS.

[00198] Neste estudo, foram examinadas as capacidades de ME- DI3387 e MEDI5771 para induzirem a produção de citocinas em célu- las primárias.

[00199] As PBMCs foram preparadas a partir de cones de Leucóci- tos (fornecidos por NHSBT, Addenbrooke's Hospital) usando Ficoll-

Paque PLUS (GE Healthcare 17-1440-02), seguindo o protocolo reco- mendado pelo fabricante. As PBMCs foram ressuspensas em meio de cultura (RPMI1640 com glutamax [Gibco] suplementado com FCS 10% inativado por calor [Life Technologies 90005M] e penicili- na/estreptomicina a 1%) e transferidas para placas de cultura de teci- dos de 96 poços de fundo plano (Corning Costar 7107) previamente revestidas com anticorpo anti-CD3 humano (o revestimento foi realiza- do adicionando 225 µL de PBS contendo 0,5 µg/mL de OKT3 [Ebiosci- ence cat: 16-0037-85] a cada poço e incubando por 2 horas a 37 °C antes do uso). Reações tinham um volume final de 225 µL por cavida- de, continham 2E5 células, e foram suplementadas com enterotoxina B de estafilococos (a uma concentração de 0,1 µg/mL) em conjunto com o fármaco de teste ou mAbs de controle. As reações foram incu- badas durante 72 horas a 37 °C, 5% de CO2, depois os sobrenadantes foram removidos e testados posteriormente para a liberação de IL-2 por ELISA. Os resultados são mostrados na FIG. 13. EXEMPLO NO. 9. ENSAIO MLR MEDI7526

[00200] A indução da produção de IFN-γ e IL-12 em macrófagos por MEDI7526 foi avaliada usando um ensaio MLR. Protocolo Geral de Ensaio:

[00201] Cultura de monócitos derivados de macrófagos M1: monó- citos foram isolados a partir de um doador utilizando um Kit de Seleção Positivo para CD14 Humano EasySep™ (STEMCELL) e macrófagos M1 foram gerados utilizando o Kit de Diferenciação de Macrófago M1 Humano CellXVivo (R&D Systems). Neste ensaio, 40 milhões de mo- nócitos foram divididos em 2 balões T75. Metade do meio foi removido de cada balão e substituído nos dias 3 e 6 por meio fresco suplemen- tado com GM-CSF. No dia 6, os macrófagos diferenciados foram co- lhidos usando o reagente de dissociação de células StemPro™ Accu- tase™ (Invitrogen), centrifugando as células a 1500 rpm por 5 minutos.

Em seguida, o sobrenadante foi removido e as células estavam em meio RPMI 1640 completo a 0,125 milhões/mL. Em seguida, 80 µL/poço de macrófagos foram adicionados às placas de 96 poços de fundo em U e 20 µL de anticorpos de teste (10 vezes a concentração final) foram adicionados por poço. Em seguida, 100 μL/poço de células T totais isoladas de outro doador (1 milhão/mL) foram adicionados às placas de 96 poços de fundo em U. As placas foram incubadas a 37 °C em uma incubadora de CO2 por 5 dias. O sobrenadante foi recolhi- do e os níveis de citocinas no sobrenadante foram medidos com o kit Th1/Th2 10-plex humano (Meso Scale Discovery).

[00202] A FIG. 14 mostra que MEDI7526 (BFP3) induziu a produ- ção de IFN-γ em 3 reações MLR de células T-macrófagos. EXEMPLO NO. 10. PROTOCOLO DE ENSAIO DE REAÇÃO MISTA DE LEUCÓCITOS (MLR) (SANGUE FRESCO)

[00203] O ensaio baseado em células MLR descrito no Exemplo No. 9 também foi usado para fornecer correlação in vitro da função das células T em resposta às moléculas BFP aqui divulgadas. Protocolo Geral de Ensaio

[00204] Os monócitos foram isolados de PBMCs de um doador e as células T de outro doador. As células T e monócitos foram suspensos em meio RPMI completo na proporção de 1:1 e incubados com rea- gentes de teste. As placas foram incubadas a 37 °C por 5 dias. No úl- timo dia, as placas foram centrifugadas a 300 g por 5 minutos e o so- brenadante foi colhido. As citocinas no sobrenadante foram medidas com o kit Th1/Th2 10-plex humano (Meso Scale Discovery).

[00205] A FIG. 15 mostra que MEDI7526 (BFP3) induziu a produ- ção de IFN-γ em 4 pares de reação MLR de células T-monócitos, su- gerindo que MEDI7526 pode aumentar as respostas imunológicas me- diadas por células T. EXEMPLO NO. 11. ENSAIO DE RECORDAÇÃO CMV

[00206] Um ensaio de recordação de antígeno de citomegalovírus (CMV) foi usado para avaliar a potencial resposta imunológica induzida por algumas das moléculas imunoterapêuticas descritas aqui. A indu- ção da secreção de IFN-γ em resposta à proteína recombinante hu- mana CMV pp65 (CMV pp65) por células T CD8+ em um doador posi- tivo para CMV é denominada resposta de recordação da memória imunológica. Certos cânceres podem aumentar essa supressão atra- vés da expressão desses receptores, levando ao interesse em interfe- rir terapeuticamente com esses pontos de checagem imunológicos. Existe um potencial benefício na combinação de anticorpos, no uso de reagentes biespecíficos e na alteração do tipo de componente Fc.

[00207] Nesta experiência, PBMC do tipo HLA-A02 de doadores conhecidos positivos para CMV foram expostas ao peptídeo CM pp65 restrito a HLA-A02 (495-503) na presença de moléculas de BFP. Após 4 dias, a secreção de IFN-γ foi determinada por MSD. Os reagentes gerais utilizados são mostrados na Tabela 2. Tabela 2. Reagentes gerais para o ensaio de Recordação CMV Descrição Fabricante Cat# Observações meio XVIVO-15 LONZA 04-418Q peptídeo pp65 – HLA- AnaSpec AS-28328 Dissolver 1mg em A02 CMV 1 mL DMSO placas de 96-poços – Falcon 353077 poços com fundo T/C-tratadas em U kit IFN-γ Humano MSD Protocolo de ensaio de recordação CMV (Astarte Biolo- gics/hibrido MedImmune):

[00208] As PBMCs humanas positivas para CMV foram desconge- ladas, lavadas com XVIVO-15, contadas e ajustadas para 4x10e6 cé- lulas/mL em XVIVO-15. Dois microlitros de peptídeo HLA-A02 pp65 CMV foram adicionados por mL de suspensão de células e bem mistu- rados. Em seguida, 100 μL de PBMC mais peptídeo foram para os po-

ços (4x10e5 células/poço). A cada poço, 100 μL de anticorpo (2X) fo- ram adicionados e as placas foram colocadas em uma incubadora a 37 °C. No dia 4, o sobrenadante (100 mL) foi colhido de cada poço e congelado a -30 °C para o ensaio de citocina subsequente (MSD).

[00209] A FIG. 16 demonstra que MEDI7526 induziu níveis mais altos de produção de IFN- e IL-12 no ensaio de recordação CMV do que outras amostras de teste. Para IFN-γ: BFP3 tinha uma EC50 de ~ 104,3, CD40L FP6 (MEDI5083) tinha uma EC50 de 359,4, CD40L + anti-PD-L1 tinha uma EC50 de 367,1.

[00210] A FIG. 73B mostra que PD1-OX40L BFP induziu níveis mais altos de produção de IFN-, IL-12, TNFα, IL-1β e IL-6 no ensaio de recordação CMV do que PD1-OX40L 2TS BFP, indicando que F180 residual é crítico para a função de agonista de OX40 neste ensaio. EXEMPLO NO. 12. MOLÉCULAS BFP DESENCADEIAM INTERNA- LIZAÇÃO E DEGRADAÇÃO DE PD1 OU PDL1

[00211] Neste exemplo, foi testada a hipótese de que BFP3 induz a internalização de CD40 e PD-L1 e desestabiliza a membrana PD-L1.

[00212] MEDI7526 BFP3 se liga a CD40 e PD-L1 humano. Foi Co- locada a hipótese de que BFP3 poderia induzir a internalização de CD40 e PD-L1 e posteriormente desencadear a degradação da proteí- na PD-L1. Para permitir medições quantitativas da internalização de CD40 e PD-L1 após o tratamento MEDI7526, um painel de anticorpos anti-CD40 e PD-L1 foi rastreado e o clone 5C3 anti-CD40 e o clone 29E.2A3 anti-PD-L1 foram identificados como anticorpos não- competitivos. Nomeadamente, o clone 5C3 anti-CD40 não compete com MEDI7526 para ligar CD40, e o clone 29E.2A3 anti-PD-L1 não compete com MEDI7526 para ligar PD-L1. Os anticorpos não competi- tivos foram tomados para avaliar a expressão à superfície de CD40 e PD-L1 após o tratamento com MEDI7526. FIG. 17 representa um mé- todo baseado em citometria de fluxo para detectar a internalização de

CD40 e PD-L1 da superfície celular. Células MDA-MB-231

[00213] MDA-MB-231 é uma célula de adenocarcinoma da mama humana e expressa constitutivamente CD40 e PD-L1. As células MDA- MB-231 foram misturadas com uma quantidade titulada de material de teste e incubadas a 37 °C por 1 hora ou 96 horas. Após a incubação, os anticorpos livres foram removidos por lavagem e as células foram coradas com anti-CD40 conjugado com fluorocromo (clone 5C3) e an- ti-PD-L1 (número do clone 29E.2A3), ambos da BioLegend. Em segui- da, as células com anticorpos ligados foram submetidas à análise por citometria de fluxo. A intensidade da fluorescência média geométrica foi calculada usando Flowjo® e plotada no gráfico. Os resultados são vistos na FIG. 18.

[00214] Em seguida, as células MDA-MB-231 foram colocadas em placas de 0,5 milhão por poço em uma placa de 6 poços com meio RPMI1640 e tratadas nas condições indicadas. Após 24 horas, as cé- lulas foram lisadas em 300 µL/poço de tampão RIPA (Millipore) com inibidores de protease, seguido de incubação a 4 °C por 1 hora com rotação. A quantidade de proteína no lisado foi determinada por análi- se BCA (Pierce) e a presença da proteína PD-L1 foi detectada por Western blot usando o clone anti-PD-L1 (E1L3N) de Sinalização Celu- lar (ver FIG. 19).

[00215] Os resultados vistos nas FIGS. 18 e 19 demonstram que o tratamento MEDI7526 (BFP3) não apenas reduz a expressão da su- perfície de CD40 e PD-L1 nas células MDA-MB-231, mas também di- minui o conteúdo total de proteína PD-L1 nas células MDA-MB-231. Células THP-1

[00216] As células THP-1 são uma linha celular de monócitos leu- cêmicos humanos. As células THP-1 expressam uma quantidade mui- to baixa de CD40 e PD-L1, mas aumentam a expressão de CD40 e

PD-L1 após o tratamento com IFN-γ. No ensaio esquemático mostrado na FIG. 20, as células THP-1 foram estimuladas com IFN-γ por 24 ho- ras e misturadas com quantidades tituladas de material de teste e in- cubadas a 37 °C por 0,5 a 3 horas. Após a incubação, os anticorpos livres foram removidos por lavagem e as células foram coradas com anti-CD40 conjugado com fluorocromo (clone 5C3) e anti-PD-L1 (nú- mero do clone 29E.2A3). Em seguida, as células com anticorpos liga- dos foram submetidas à análise por citometria de fluxo. A intensidade da fluorescência média geométrica foi calculada por Flowjo® e plotada na FIG. 21, que demonstra que MEDI7526 induziu a rápida regulação negativa de CD40 e PD-L1 da superfície celular das células THP1 en- tre 0,5 e 3 horas. Células THP-1 tratadas com IFN-γ

[00217] Seguindo o estudo esquemático na FIG. 22, as células THP-1 foram estimuladas com IFN-γ por 24 horas e misturadas com quantidades tituladas de material de teste e incubadas a 37 °C por 1 hora. Após a incubação, os anticorpos livres foram removidos por la- vagem e as células foram coradas com anti-CD40 conjugado com fluo- rocromo (clone 5C3) e anti-PD-L1 (número do clone 29E.2A3). Em se- guida, as células com anticorpos ligados foram submetidas à análise por citometria de fluxo. A intensidade da fluorescência média geomé- trica (gMFI) foi calculada por Flowjo® e plotada nos gráficos mostrados na FIG. 23, que demonstram que a expressão de CD40 é rapidamente recuperada 24 horas após o tratamento, mas a expressão da superfí- cie celular de PD-L1 permanece baixa, indicando vias de recuperação separadas para CD40 e PD-L1 internalizados. EXEMPLO NO. 13. ENSAIO DE CÉLULAS PRIMÁRIAS HUMANAS

[00218] Neste estudo, os monócitos foram isolados de PBMCs de doadores saudáveis usando o Kit de Seleção Positiva CD14 Humana EasySep™ (STEMCELL) e diferenciados em células dendríticas usan-

do um Kit de Diferenciação DC derivada de Monócitos Humanos CellXVivo (R&D, Cat # CDK004) de acordo com protocolo do fabrican- te. As células foram ressuspensas no meio de diferenciação de DC humanas, incluindo GM-CSF e IL-4 a 1 milhão de células/mL, e um total de 20 milhões de células foram semeadas em um balão T75. Me- tade do meio foi substituído nos dias 3 e 5 por meio de diferenciação de DC humano fresco. No dia 7, as DC imaturas foram colhidas e es- timuladas com doses crescentes de material de teste. A expressão de superfície de CD40, CD86 e PD-L1 foi determinada por citometria de fluxo após estimulação por 24 horas (ver FIG. 24). Na FIG. 25, os ní- veis de proteína de CD40 e PD-L1 em DCs estimulados com 10 nM de material de teste por 24 horas foram medidos por imunotransferência. Estes resultados mostram que MEDI7526 (BFP3) causou uma regula- ção negativa de PD-L1 em células primárias humanas.

[00219] A FIG. 24 demonstra que MEDI7526, tal como o seu CD40L FP parental, induziu a regulação positiva de CD40 em doses baixas, mas regulou negativamente CD40 em altas doses. Também aumentou a expressão de CD86 em células dendríticas derivadas de monócitos. Mas os níveis de proteína PD-L1 permaneceram baixos nas células tratadas com MEDI7526. Ensaio PBMC

[00220] Neste estudo, PBMCs de doadores saudáveis foram esti- muladas com IFN-γ e reagiram com reagentes de teste por uma hora. Os níveis de expressão superficial de CD40, CD86 e PD-L1 foram es- tudados com citometria de fluxo. A FIG. 26 demonstra que MEDI7526 induz a regulação negativa de CD40 e PD-L1 da superfície celular de monócitos. Estes resultados mostram que MEDI7526 (BFP3) causou uma regulação negativa de PD-L1 em células primárias humanas iso- ladas recentemente. EXEMPLO NO. 14. EFICÁCIA DO SUBSTITUTO DE MEDI7526 DE

MURINO CONTRA PD-L1 EM CÉLULAS RENCA.

[00221] Renca é uma linha celular de adenocarcinoma renal de rim murino que expressa constitutivamente CD40 e PD-L1. Neste estudo, as células Renca foram cultivadas a 0,5 milhão/poço em uma placa de 6 poços no primeiro dia. No segundo dia de cultura, as células Renca foram tratadas com os reagentes indicados na concentração de 10 nM por 24 horas. No terceiro dia de cultura, as células Renca tratadas fo- ram lisadas em tampão RIPA com inibidores de protease, e os lisados celulares foram analisados por Western blot. Os anticorpos utilizados para Western blot estão listados na Tabela 3 abaixo. Tabela 3. Anticorpos Anticorpo Vendedor Cat# Diluição Hospedeiro anti-mPD-L1 R&D systems AF1019 1 : 500 cabra anti-CD40 Abcam ab13545 1 : 500 coelho anti-actina Sigma A2066-.2ML 1 : 2000 coelho IgG Anti-Coelho de Jackson 711-035- 1 : 4000 Burro Burro de Peroxida- Immunorese- 152 se AffiniPure (H+L) arch

[00222] A FIG. 27 demonstra que um substituto de MEDI7526 de murino (mBFP3) induziu a degradação de PD-L1 nas células Renca. Este resultado demonstra que um substituto de MEDI7526 de murino tem função semelhante na regulação negativa da expressão de PD-L1 e CD40 em células de murino. EXEMPLO NO. 15. ENGAJAMENTO DAS MOLÉCULAS BFP E RE-

CEPTOR DE FC PODE MELHORAR A ATIVAÇÃO DE CELULAS MIELOIDES.

[00223] Neste exemplo, a ativação de células mieloides por molécu- las BFP foi examinada.

[00224] As células ES2, que expressam PD-L1, foram semeadas a 30,000 células/poço em uma placa de 96 poços de fundo plano, e as células THP1 foram estimuladas com IFN-γ por 24 horas. No 2º dia,

quantidades iguais de células ES2 e as células THP-1 foram mistura- das e foram adicionados materiais de teste titulados (BPF1, BPF2, MEDI7526, FP6 (MEDI5083), e MEDI4736; ver Tabela 1). As placas foram incubadas a 37 °C por 24 horas. Foi preparado QUANTI-Blue™ seguindo as instruções na bolsa. Em seguida, 160 μL da solução QUANTI-Blue foram misturados com 40 μL de sobrenadante por poço de uma placa de 96 poços de fundo plano. A placa foi incubada a 37 °C por 3 horas, e os níveis de SEAP foram determinados usando um espectrofotômetro a 655 nm.

[00225] A FIG. 28 mostra que a reticulação através de PD-L1 em células tumorais pode melhorar as atividades de MEDI7526 BFP3. A orientação do formato BFP parece afetar a função, pois foi observado que o formato BFP2 não apresentou atividade melhorada. Este resul- tado baseado em um sistema de 2 células demonstra que a reticula- ção através de PD-L1 em células tumorais pode aumentar a função MEDI7526 ao estimular a atividade de NF-ĸB em células THP-1. EXEMPLO NO. 16. PAPEL DE FCγRI NA RETICULAÇÃO DE PD-L1.

[00226] Neste exemplo, foi examinado o papel do receptor Fc de alta afinidade (FcγRI) na reticulação de PD-L1. Placas de 96 poços Biocoat (Corning) foram revestidas com 50 µL/poço de PD-L1-His (2 µg/mL, R&D Systems) durante a noite a 4 ºC. No segundo dia, as célu- las THP1 (0,2 milhões/poço) foram adicionadas às placas. Foi adicio- nado IgG1 solúvel (fabricado em casa), que compete com IgG4 na li- gação a receptores Fcγ. Outros inibidores, incluindo anticorpos blo- queadores contra FcγRI/FcγRII (Biolegend) e inibidores para Syk e Btk (Sellechem) durante 1 hora seguido de estimulação com materiais de teste (3 nM) durante 24 horas. No terceiro dia, as placas foram centri- fugadas a 1500 rpm por 5 min. Quarenta (40) µL de sobrenadante de cultura de células foram misturados com 160 µL de reagentes QUAN- TI-Blue™ preparados recentemente (Invivogen), seguidos de incuba-

ção a 37 °C por 1 hora. Os níveis de SEAP foram determinados por um espectrofotômetro SpectraMax® M5 a 655 nm. FIG. 29 demonstra que os sinais melhorados mediados pela reticulação de PD-L1 são através de FcrRI e podem ser inibidos por IgG solúvel e inibidores para Syk e Btk. No entanto, o engajamento de Fc não é necessário para a função BFP3 (ver FIGs. 61 e 62). Estes resultados sugerem que a ati- vidade aumentada mediada por BFP3 é através do engajamento de FcγRI. EXEMPLO NO. 17. SUBSTITUTO DE MEDI7526 DE MURINO DE- MONSTRA ROBUSTA ATIVIDADE ANTI-TUMOR IN VIVO E QUE É

TOLERÁVEL EM MODELO DE TUMOR DE CAMUNDONGO

[00227] Para estudar o efeito de MEDI7526 in vivo em camundon- gos, um substituto de murino de MEDI7526, mMEDI7526, foi construí- do. Paralelamente a MEDI7625, mMEDI7526 compreende, do terminal N ao C, um PD-L1 anti-murino F(ab)2, um Fc IgG1 de murino com mu- tação D265A e duas proteínas de fusão de cadeia única de 3x subuni- dades CD40L de murino conectadas via ligantes peptídicos.

[00228] O substituto de MEDI7526 de murino (mMEDI7526) foi tes- tado primeiro nos camundongos C57Bl/6 fêmeas para estudar seu per- fil de segurança (FIGS. 30A e 30B). Camundongos puros ("naïve") re- ceberam tratamentos intravenosos únicos (iv; FIG. 30A) ou subcutâ- neos (sc; FIG. 30B) com mCD40L a 10 mg/kg ou mMEDI7526 a uma concentração molar equivalente a 16 mg/kg. Um grupo de camundon- gos não tratados foi usado como controle. Os pesos corporais foram monitorados antes e todos os dias após o tratamento e foram converti- dos em percentagem do peso corporal da linha de base para camun- dongos individuais (ver FIG. 31). Comparado ao controle, o tratamento com mCD40L, iv ou sc, levou à perda de peso corporal. Em compara- ção, o tratamento com mMEDI7526 a 16 mg/kg não causou perda sig- nificativa de peso corporal.

[00229] Em uma experiência separada, os camundongos fêmeas C57Bl/6 foram implantados com células tumorais B16F10 e camun- dongos com tamanhos de tumor >100mm3 foram selecionados para os seguintes estudos. Os camundongos selecionados receberam um úni- co tratamento iv ou sc de mCD40L (10 mg/kg) e mMEDI7526 (16 mg/kg), como mostrado nas FIGS. 30C e 30D, ou com doses elevadas de mMEDI7526 (25 ou 35 mg/kg, FIGS. 30E e 30F, respectivamente). Os pesos corporais foram monitorados todos os dias antes e após o tratamento e as percentagens do peso corporal basal foram calculadas e comparadas entre os grupos de tratamento e o grupo sem tratamen- to. Os resultados demonstram que o tratamento de mCD40L levou a uma perda mais severa de peso corporal após o tratamento e indica que mMEDI7526 é mais tolerável que mMEDI5083 em camundongos puros ("naive") ou portadores de tumor.

[00230] Em seguida, o perfil de segurança de mMEDI7526 foi avali- ado em um estudo de doses múltiplas no modelo de tumor de murino B16F10. Os camundongos foram implantados com tumores B16F10 no dia 1 e os camundongos com tamanhos de tumor > 100 mm3 foram randomizados no dia 11, seguidos pelo tratamento nos dias 11, 13, 19 e 21, como indicado na FIG. 31. Os camundongos com mais de 20% de perda de peso corporal foram considerados sob estresse severo e removidos do estudo. Imediatamente após a 2ª dose no dia 13, 2 ca- mundongos no grupo mCD40L e 4 no grupo CD40L+anti-PDL1 tiveram > 20% de perda de peso corporal. Em comparação, nenhum dos ca- mundongos doseados com mMEDI7526 mostrou > perda de 20% do peso corporal após 2ª dosagem. Esses dados indicam ainda que mMEDI7526 é mais tolerável que mCD40L sozinho ou em combinação com o anti-PDL1.

[00231] mMEDI7526 foi testado em seguida no modelo de camun- dongo singênico B16F10. O modelo foi configurado como descrito na

FIG. 31. mMEDI7526, em uma gama de doses de 20 a 35 mg/kg, di- minuiu o volume do tumor e/ou retardou o crescimento do tumor no modelo de camundongo B16-F10, em comparação com os controles de PBS (FIG. 32) mMEDI7526 a 25 mg/kg de dose teve a mais forte inibição do crescimento tumoral: no final do estudo, 70% camundon- gos que receberam 25 mg/kg de tratamento tinham um tamanho do tumor menor que 500 mm3. Assim, mMEDI7526 exibiu atividade anti- tumoral significativa em um modelo de tumor com baixa responsivida- de.

[00232] Otimização de dosagem. O regime de dosagem de mME- DI7526 foi otimizado como mostrado na FIG. 33 no modelo B16F10. mMEDI7526 foi dosado a 25 mg/kg, uma vez no dia 10 após a implan- tação das células tumorais B16F10, ou duas vezes nos dias 10 e 14 ou nos dias 10 e 17. O tratamento de uma dose única de mMEDI7526 CD40L-FP diminuiu significativamente o volume do tumor e/ou atraso no crescimento do tumor. No entanto, duas doses apresentaram me- lhor atividade antitumoral do que uma dose única (dia 10 e 14 ou dia 10 e 17). Além disso, os camundongos tratados com mMEDI7526 não tiveram perda de peso significativa ou outros efeitos observáveis. As- sim, a frequência de dosagem reduzida de mMEDI7526 pode manter uma atividade antitumoral significativa e reduzir as principais toxicida- des.

[00233] Ativação de células T in vivo. O efeito de mMEDI7526 na ativação de células T foi avaliado no modelo de camundongo B16F10. mMEDI7526 foi administrado a 25 mg/kg no dia 10 após a implantação das células tumorais B16F10 e as células T do baço foram recupera- das nos dias 2 e 4 após o tratamento com mMEDI7526. Como mostra- do na FIG. 34, o tratamento de mMEDI7526 levou à regulação positiva do marcador de ativação precoce CD69 em células T CD4+ e CD8+. Além disso, no dia 4, as percentagens de células T CD8+ de memória efetoras (CD44elevadaCD62Lbaixa) e células T CD8+ efetoras (KLRG1+) aumentaram significativamente. Além disso, a percentagem de células T CD8+ efetoras (KLRG1+) aumentou não apenas no baço, mas tam- bém no fígado e no tumor (FIG. 35). Juntos, esses dados indicam que mMEDI7526 induziu ativação robusta de células CD4+ e CD8+ em camundongos portadores de tumor.

[00234] Análise de Perfil de Citocinas no Soro. Alterações no perfil sérico de citocinas foram monitoradas após o tratamento com mMEDI7526 e mCD40L. Camundongos puros ("naive") foram dosea- dos com mCD40L (mMEDI5083, que é um MEDI5083 murinizado) a 10 mg/kg ou mMEDI7526 a 16 mg/kg e o sangue foi coletado em vá- rios momentos após o tratamento, conforme indicado na FIG. 36. O soro foi separado do sangue total e submetido à análise multiplex MSD (U-PLEX TH1/TH2 Combo) para detecção de citocinas, incluindo IFN- γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-13, KC/GRO, e TNF- α. Comparando com mCD40L, mMEDI7526 induziu níveis semelhan- tes de IFN-γ e IL-12, mas significativamente menos TNF- e IL-6 (FIG. 37). Em um estudo separado em camundongos B16F10, mMEDI7526 em doses entre 16 a 35 mg/kg, induziu muito menos IL-6 e TNF- mas níveis comparáveis de IFN-γ e IL-12. Assim, o tratamento com mME- DI7526 induz citocinas antitumorais, mas limita a produção de citoci- nas que contribuem para a toxicidade sistêmica.

[00235] Tratamento com MEDI7526 combina-se efetivamente com a quimioterapia. Num estudo separado, foi avaliado o efeito de MEDI7526 sozinho ou em combinação com a quimioterapia de Fluo- rouracil (5FU) no tratamento de tumores de murinos CT26. Um total de 0,5 milhões de células tumorais CT26 foram implantadas s.c. em ca- mundongos e os tumores foram monitorizados durante ~10 dias, até que foram medidos ~100 mm3, altura em que os camundongos foram então randomizados em grupos de tratamento com base no seu volu-

me de tumor. No dia seguinte, o tratamento foi iniciado com 5FU na dose de 25 ou 50 mg/kg ou controle PBS i.p., seguido por 25 ou 35 mg/kg mMEDI7526 i.p. posteriormente uma vez por semana durante 3 semanas. Os volumes tumorais e os pesos corporais foram medidos duas vezes por semana até o final do estudo e os resultados são mos- trados na FIG 65. O tratamento com 5 FU a 25 e 50 mg/kg não inibiu suficientemente o crescimento do tumor CT26 e MEDI7526 sozinho poderia inibir o crescimento do tumor apenas em um subconjunto de camundongos, mas não em todos os camundongos. A combinação de 5FU e MEDI7526 levou à inibição do crescimento tumoral em mais camundongos do que o tratamento único. O tratamento com 5 FU 50 mg/kg e MEDI7526 35 mg/kg teve o melhor efeito e resultou em uma inibição do crescimento do tumor em todos os camundongos do grupo. Este resultado sugere que a combinação com quimioterapia pode me- lhorar ainda mais as atividades antitumorais mediadas por MEDI7526.

[00236] MEDI7526 tem o potencial para tratar tumores hepáti- cos. Os órgãos alvo de MEDI7526 foram ainda avaliados. No estudo de biodistribuição, as células tumorais B16F10 foram implantadas em camundongos, seguidas pela injeção de anticorpos marcados com Zr- 89 (controle de isotipo e substitutos murinos de MEDI5083 e 7526), como indicado na FIG. 66A. A distribuição dos anticorpos marcados foi detectada por PETCT. Comparando com o anticorpo de controle do isótipo, MEDI5083 e MEDI7526 se acumularam no fígado e no baço. Foi ainda confirmado que as células Kupffer, um tipo de macrófago hepático, expressam CD40 e PD-L1 (FIG. 66B). Estes resultados indi- cam que as células Kupffer no fígado são as células alvo de ME- DI5083 e MEDI7526.

[00237] Os resultados acima levaram a uma investigação mais aprofundada sobre se MEDI7526 e MEDI5083 poderiam ou não tratar tumor hepático em camundongos. Nesta experiência, as células tumo-

rais CT26 foram transfectadas com o gene da luciferase e metade de milhão de células CT26-Luc transfectadas foram implantadas direta- mente no fígado de camundongo. Os camundongos receberam células CT26 e foram deixados a recuperar da cirurgia e foram doseados com anticorpo de controle de isotipo, MEDI5083, anti-PDL1, MEDI5083 mais anti-PDL1 ou MEDI7526 nos dias 3, 10 e 17 após implantes de tumores. Todos os reagentes de teste foram doseados a 21,9 mg/kg, exceto MEDI7625 foi dosado com equivalente molar 35 mg/kg. No dia 21, os camundongos foram sacrificados e o fígado foi recuperado para a medição da atividade da luciferase, que é um indicador da carga tu- moral no fígado. Apenas o tratamento com MEDI7526 reduziu efetiva- mente a carga tumoral ao nível de camundongos livres de tumor (FIG. 67), indicando que MEDI7526 tem potencial para tratar câncer de fíga- do.

[00238] Além disso, o tratamento MEDI7526 foi associado ao au- mento do número de células T CD8 no dia 14 e a um fenótipo mais ativado entre as células T CD8 específicas do antígeno no dia 21, con- forme determinado pela análise por citometria de fluxo (FIG. 68).

[00239] Os perfis de segurança dos reagentes de teste foram avali- ados no modelo de tumor hepático CT26 (FIG. 69). Foi documentada a perda significativa de peso corporal, indicação de estresse severo e morte de camundongos. No dia 2 após a 1ª dosagem, todos os ca- mundongos no grupo mMEDI5083 e mMEDI5083 e grupos anti-PDL1 tiveram perda de cerca de 10% do peso corporal. Em comparação, nenhum dos camundongos doseados com mMEDI7526 mostrou perda de peso corporal > 5% no mesmo momento (FIG. 69A). Além disso, todos os camundongos que receberam o tratamento com mMEDI5083 e anti-PDL1 foram encontrados mortos após 3 doses (FIG. 69B). Jun- tos, estes dados indicam ainda que mMEDI7526 é mais tolerável que mMEDI5083 sozinho ou em combinação com o anti-PDL1.

EXEMPLO NO. 18. ATIVAÇÃO DE OX40L EM NF-ΚB

[00240] Linfócitos T repórter Jurkat NF-κB-Luc transfectados com proteína OX40 foram mantidos em RPMI1640 (GIBCO) mais 10% de HI-FBS (GIBCO), e 1% de Pen Strep (GIBCO). No dia da experiência, as células foram colhidas, ajustadas a 2 × 106 células/mL e adiciona- das num volume de 90 µL por poço a uma placa de 96 poços de fundo em U (Corning). Dez (10) µL de reagentes de teste (10 x), preparados em meio RPMI1640 completo foram adicionados a cada poço, e as células foram colocadas numa incubadora a 37 °C durante 4 horas. Foi preparado o reagente de luciferase (Substrato do Ensaio de Luciferase Steady-Glo®; Promega), deixado a equilibrar à temperatura ambiente e adicionado (100 µL) a cada poço. As placas foram colocadas à tempe- ratura ambiente por 5 minutos, seguidas de leitura imediata em um lei- tor de placas SpectraMax® M5. FIG. 38 demonstra que anti-PD1- OX40L BFP ativa d a via NF-ĸB em células Jurkat transfectadas com OX40.

[00241] Em um estudo separado, a linha celular repórter Jurkat NF- κB-Luc manipulada para expressar a proteína de fusão OX40-GITR humana com ectodomínio OX40 e domínio intracelular GITR (Jur- kat/OX40-GITR-FP2) foi testada quanto à atividade de NF-κB como mostrado no parágrafo anterior. FIG. 71C demonstra que PD1/OX40L (todas as subunidades de OX40L têm sequências de proteína de tipo selvagem) induzia ativação robusta de NF-B, no entanto, tanto PD1/OX40L 1TS e PD1/OX40L 2TS não conseguiram ativar NF-B, nas células repórter Jurkat. Estes dados confirmam que todos de seis resíduos de F180 em OX40 são críticos para a ativação de sinalização a jusante OX40 e indicam que PD1/OX40L 1TS e 2TS tem mínima função de ativação das células T mediada por OX40. EXEMPLO NO. 19. ESTUDOS EM CAMUNDONGO DE ANTI-PD-L1- OX40L BFP

[00242] Foi gerada uma proteína de fusão IgG1 do ligando OX40 de murino (mOX40L FP) que se liga a OX40 de camundongo e aciona a sinalização de OX40, e foi usada como substituto agonista de OX40 de camundongo para MEDI6383, uma proteína de fusão IgG4P de ligan- do de OX40 humano. Ver a Patente U.S. No. 9.718.870. O clone 80 é um anticorpo quimérico IgG1 D265A de camundongo contra PD-L1 de camundongo. A atividade antitumoral de mOX40L FP e do clone 80 foi avaliada como uma monoterapia ou como uma terapia de combinação em camundongos com tumores que se originou a partir de MCA205, uma linha celular de sarcoma singênico de camundongo, e em CT26, uma linha celular de adenocarcinoma de cólon de camundongo.

[00243] Dez camundongos C57BL/6 ou Balb/c em cada grupo fo- ram inoculados SC no Dia 1 com células MCA205 (painéis da esquer- da) ou células CT26 (painéis da direita), respectivamente. Artigo de controle (salmoura) e os artigos de teste anti-PD-L1 clone 80 mAb (10 mg/kg), mOX40L FP (9,8 mg/kg), ou a combinação de 10 mg/kg de anti-PD-L1 mAb e 9,8 mg/kg de mOX40L FP foram administrados IP nos Dias 12, 15, 18 e 22 para MCA205 e nos Dias 4, 7, 11 e 14 para CT26. Os volumes individuais do tumor ao longo do tempo são mos- trados nos gráficos em FIG. 39. IP = intraperitoneal; SC = subcutâneo.

[00244] A administração de mOX40L FP em combinação com o clone 80 resultou em maior atividade antitumoral do que a administra- ção de artigos de controle ou apenas dos agentes (FIG. 39). Assim, a terapia com agonista de OX40 e antagonista de PDL1 fornece benefí- cio antitumoral complementar em modelos pré-clínicos.

[00245] Moléculas biespecíficas que consistem em porções de liga- ção a PDL1 podem aumentar o tempo de retenção em tumores PD- L1+ em comparação com moléculas biespecíficas que não se ligam a PD-L1. Para testar esta hipótese, um estudo de biodistribuição in vivo foi realizado em camundongos.

[00246] Moléculas biespecíficas foram conjugadas com um quelan- te (ITC-DTPA, Macrocyclis, Dallas, TX) para permitir a radiomarcação 111 de índio (Brom et al., 2012), visando uma atividade específica de cerca de 600 MBq/mg. Após purificação através de uma coluna de dessalinização (PD-10 EconoPac, BioRad), a pureza radioquímica (RCP) das moléculas radiomarcadas foi verificada por cromatografia instantânea em camada fina para garantir uma eficácia de marcação com uma RCP> 95% e estabilidade até 4 h à temperatura ambiente.

[00247] Para os estudos de biodistribuição, camundongos nus fê- mea (Envigo) foram inoculados subcutaneamente com células de cân- cer U87-MG (1 x 107 células em 0,1 mL), e foram divididos aleatoria- mente em diferentes grupos de tratamento com um volume tumoral médio de 0,2 cm3. Todos os camundongos randomizados foram inje- tados por via intravenosa com uma dose única de molécula radiomar- cada (20 µg/0,2 Mbq/kg de peso corporal). Os subgrupos de animais foram em seguida humanamente sacrificados a 1 hora, 1 dia, e 4 dias após a dosagem radiomarcador. Para gerar perfis de biodistribuição, os órgãos/tecidos (isto é, sangue, músculos, pulmões, fígado, baço, rins, tumores, cauda) foram recolhidos, pesados, e medidos para os níveis de radioatividade usando um contador gama (Assistente, Perkin Elmer) para calcular dose injetada percentual (% ID) e % ID por grama de tecido. Os perfis de biodistribuição ilustram a percentagem média da dose injetada corrigida por grama de tecido (±SEM), e comparar a absorção de MEDI5615 radiomarcado e controles nos tecidos indica- dos a 1 hora, 1 dia, e 4 dias após a injeção. n = 5 por grupo, exceto n = 6 por grupo para o "Dia 4 BFP3". Os asteriscos ilustram uma dife- rença significativa (p <0,05) usando um teste t bicaudal.

[00248] Os tumores U87MG expressaram elevados níveis de PD- L1, conforme determinado por imuno-histoquímica específica para an- ti-PD-L1 (FIG. 40A), e foram utilizados nos estudos de biodistribuição

(FIG. 40B). Quantidades subterapêuticas de moléculas biespecíficas radiomarcadas foram injetadas em camundongos portadores de tumo- res U87MG; um alvo PD-L1 e OX40 como uma molécula IgG4P BFP2 (MEDI5615; domínio 1X Fc), um alvo PD-L1 e OX40 como uma molé- cula IgG1 BFP3 (domínio 1X Fc) e um artigo de controle que não se ligava a nenhum PD-L1 ou OX40 (R347-OX40L F180 BFP2). As molé- culas biespecíficas foram primeiro detectadas no sangue após 1 hora e foram rapidamente eliminadas para que 1 dia depois, pouco ou ne- nhum radiomarcador pudesse ser detectado no sangue. MEDI5615 e o artigo de controle também se distribuíram rapidamente no fígado e no baço, independentemente da ligação ao alvo, e permaneceram nesses tecidos até o dia 4 (FIG. 40C). Em contraste, MEDI5615 penetrou e foi retido no tumor em comparação com o artigo de controle, enquanto as duas moléculas foram removidas do sangue.

[00249] As moléculas PD-L1/OX40L BFP3 demonstraram uma ca- pacidade para permanecer no tumor semelhante a MEDI5615 (FIG. 41) o que sugere que a retenção no tumor era independente do domí- nio de Fc e formato da molécula. As diferenças observadas na atuali- zação do tumor nos dias 1 e 4, entre MEDI5615 e moléculas PDL1/OX40L BFP3 em comparação com o artigo de controle sugere que a retenção de tumores é mediada por moléculas de ligação a PDL1. EXEMPLO NO. 20. ATIVIDADE DE ANTI-PD-L1-OX40L BFP

[00250] A capacidade de MEDI5615 (molécula biespecífica PD- L1/OX40L BFP2) para ativar a sinalização através de OX40 humano foi avaliada em um conjunto de ensaios de repórter de bioatividade de duas células, utilizando linhas repórter de células T de NF-kB- luciferase Jurkat geneticamente modificadas para expressar OX40 humano (FIG. 42). Ocorreu reticulação de fármaco mediada por PD-L1 através de células MDA-MB231 que expressavam PD-L1 da superfície celular. Ocorreu reticulação de fármaco mediada pelo receptor Fcγ através de células HEK293 manipuladas para expressar o receptor Fcγ IIa (CD32A). A ativação de células T foi medida como atividade aumentada de luciferase em resposta à estimulação da via de sinali- zação NF-κB a jusante da ativação de células T primárias humanas. A sinalização NF-κB ocorre a jusante da sinalização OX40 e foi relatada correlação com outras medidas de ativação de células T, tal como pro- liferação e liberação de citocinas. A bioatividade foi medida para ME- DI5615 solúvel, bem como MEDI5615 incubado com células MDA- MB231 que expressavam PD-L1 da superfície celular ou células HEK293 manipuladas para expressar um receptor Fcγ individual.

[00251] Antes da utilização, as células repórter Jurkat OX40 foram cultivadas em meio RPMI completo num incubador de cultura de teci- dos a uma densidade de 0,5-1,5 x 106 por mL. As células foram pas- sadas no dia anterior ao bioensaio a uma densidade de 106 células por mL. As células repórter Jurkat OX40, células MDA-MB231, e células HEK CD32A foram recolhidas e sedimentadas. Moléculas biespecífi- cas foram diluídas em série 3 vezes em RPMI completo. As células repórter OX40 mais as células apresentadoras foram adicionadas a uma placa de 96 poços a 100,000 células por poço. A molécula bies- pecífica foi adicionada às células em meio RPMI completo, até uma concentração final iniciando em 1 µg/mL e diluída, como descrito aci- ma. Após 16-24 horas de tempo de incubação, adicionou-se 100 μL de solução de ensaio de luciferase Steady-Glo® reconstituída (Promega, Madison, WI) a cada poço e misturou-se para lisar as células e depois incubou-se para equilibrar o sinal de luciferase. Transferiu-se lisado Steady-Glo®/amostra (150 μL) de cada poço para uma placa de ensaio com paredes brancas de 96 poços para detecção e leitura da lumines- cência, utilizando um leitor de luminescência Perkin Elmer Envision™. Utilizou-se GraphPad Prism para Windows (GraphPad Software, San

Diego, CA) para traçar a concentração da molécula biespecífica (eixo x é log10 da concentração de proteína) versus luminescência RLU (eixo y).

[00252] Como visto na FIG. 43, MEDI5615 ativou a via de sinaliza- ção OX40, medido pela sinalização NF-κB, em células T Jurkat huma- nas que expressam OX40, na presença de células que expressam o receptor Fcγ (células HEK293 que expressam CD32A) e PD-L1 (célu- las MDA-MB231), com valores de EC50 de 52 pM e 18 pM, respetiva- mente. Na ausência de células que expressam receptores PD-L1 ou Fcγ capazes de reticulação de MEDI5615, foi medida a atividade mí- nima da linha celular repórter.

[00253] Em seguida, a capacidade de MEDI5615 para superar a função supressora das células Treg CD4+CD25+ naturais (nTreg) na proliferação efetiva de células T CD4+CD25- e reduzir a liberação de IL-10 de nTregs foi testada em um de cocultura de células T humanas.

[00254] As células Treg e efetoras CD4+ humanas foram isoladas a partir de PBMCs usando um kit de isolamento de células Treg huma- nas conforme as instruções do fabricante (Life Technologies, Paisley, Reino Unido). Este processo envolveu a seleção negativa do total de células CD4+ por marcação com anticorpos de células não-CD4+ e depois a remoção de células positivas para anticorpo através do uso de depleção à base de esferas magnéticas. As células Treg foram se- paradas a partir de células CD4+ efetoras através de marcação com anti-CD25 seguido por seleção positiva com esferas magnéticas, as quais foram subsequentemente removidas a partir de células isoladas.

[00255] As células efetoras CD4+CD25- foram marcadas com CFSE usando o kit de proliferação de células CFSE CellTrace™ (Life Technologies, Paisley, Reino Unido). As células T efetoras e as células Treg foram cocultivadas por 4 dias a 37 °C na proporção de 1:1 ou 1:2 em poços de placas de 96 poços revestidas com mAb CD3 anti-

camundongo e na presença de anticorpo CD28 anti-camundongo so- lúvel misturado com artigos de controle e teste. As células foram re- estimuladas com PMA e ionomicina na presença de brefeldina A para um período adicional de 4 horas, fixadas, e testadas quanto a produ- ção de IL-10 por citometria de fluxo utilizando métodos de coloração de citocinas intracelulares. A percentagem de células T CD4+ efetoras divididas e a percentagem de células Treg que produzem IL-10 no final do ensaio foram avaliadas por citometria de fluxo.

[00256] A percentagem de células T efetoras divididas (CFSE bai- xo) foi determinada; células não viáveis (eFluor positivo) e células T reguladoras (CFSE negativo) foram discriminadas e excluídas da aná- lise. A percentagem de células Treg produtoras de IL-10 foi avaliada a seguir à exclusão de células T não viáveis e efetoras (CD25 negati- vas).

[00257] Células T efetoras na ausência de células Treg dividiram após cultura com anti-CD3 e anti-CD28 (FIG. 44, parte superior). A percentagem de células T efetoras que entram no ciclo celular não aumentou com a adição dos artigos de teste. Artigos de teste consis- tindo em agonistas OX40 (ou seja, scOX40L 2xG4S IgG4P, ME- DI5615, e anti-PD-L1 IgG4P + scOX40L 2xG4S IgG4P) estatisticamen- te aumentou a percentagem de células T efetoras divididas na presen- ça de Tregs na proporção de 1:2 efetora para Treg, em comparação com os artigos de controle (ou seja, não tratadas, NIP228 IgG4P, e anti-PD-L1 IgG4P). Não foi observado aumento na percentagem de células T efetoras dividindo-se em culturas com uma proporção de 1:1 de efetoras para Treg.

[00258] Os artigos de teste consistindo em agonistas OX40 reduzi- ram significativamente a percentagem de Tregs que produzem IL-10 em coculturas com células T efetoras em comparação com os artigos de controle (FIG. 44, parte inferior). Esses resultados sugerem que

MEDI5615 funciona de maneira semelhante aos agonistas OX40 para superar a atividade supressora e a produção de IL-10 das células Treg.

[00259] A seguir, foi avaliada a capacidade das moléculas biespecí- ficas baseadas em PD-L1 e OX40 de coestimularem PBMC humanas na presença do superantígeno, enterotoxina estafilocócica B (SEB). O anticorpo anti-CD3 humano (clone SK7) foi pré-revestido nos poços de uma placa de 96 poços. As PBMCs humanas foram isoladas a partir de doadores saudáveis, cultivadas durante 72 horas com anti-CD3, SEB (25 ng/mL), e os artigos de teste indicados, e os sobrenadantes de cultura foram testados quanto a IL-2 (FIGS. 45A-B). Anticorpos bi- específicos BiS2 e BiS3 OX40/PD-L1 (FIG. 45A; ver também Pedido de Patente U.S. No. 15/588,271) e MEDI5615 (FIG. 45 B) induziram PBMC humanas a produzir IL-2 de uma maneira dependente da con- centração, como determinado por um ELISA eletroquimiluminescente. A quantidade de IL-2 produzida pelas moléculas biespecíficas foi maior que a quantidade de IL-2 produzida por culturas de PBMC humanas contendo anticorpos OX40 (anti-OX40 IgG4P), anticorpos PD-L1 (anti- PD-L1 IgG4P), combinações de anticorpos OX40 e PDL1, proteínas de fusão biespecíficas de controle (PDL1-OX40 F180A BFP2, R347- OX40L BFP2) isoladamente ou em combinação e artigos de controle negativo (NIP228 IgG4P; R347-OX40L F180A BFP2).

[00260] Em seguida, foram realizados ensaios de ligação de equilí- brio com base em células para medir a afinidade aparente da ligação de MEDI 5615 (PD-L1/OX40L BFP2) a OX40 e PD-L1 humano e de macaco cinomolgo, expresso na superfície celular de células CHO manipuladas.

[00261] Os artigos de teste foram diluídos cerca de 19 3-vezes di- luições em série para células CHO manipuladas para expressar OX40, PD-L1 humanos ou de macaco cinomolgo ou ambos OX40 e PD-L1.

As células e os artigos de teste (n=3) foram incubados por 1 hora a 4 °C, lavados três vezes com tampão FACS (PBS + soro de bovino re- cém-nascido inativado pelo calor a 2%), incubados com anticorpo se- cundário IgG anti-humano de cabra 647-marcado AlexaFluor® e iodeto de propídio (PI), lavou-se com tampão FACS, e analisou-se em cito- metria de fluxo. Após a compensação da fluorescência, células vivas (PI negativas), foram isoladas e a intensidade média de fluorescência (MFI) do anticorpo secundário foi determinada para relatar o nível de ligação de cada artigo de teste MFI da ligação do artigo de teste ver- sus a concentração da proteína de fusão (M) foi traçada para criar cur- vas de ligação a partir do qual KDaparentes foram determinadas e os valores de ocupação de receptores. Ver FIGS. 46A-F.

[00262] As constantes de dissociação de equilíbrio médias (KD) pa- ra a interação de MEDI5615 com várias células CHO são apresenta- das na Tabela 4 abaixo. Tabela 4. Afinidade aparente (KD) para a ligação de PDL1/OX40L BFP2 e moléculas de controle para células CHO manipuladas para superexpressar OX40, PDL1 humano e de macaco cinomolgo, e ambos OX40 e PDL1 KD = constante de dissociação de ligação de equilíbrio; CI = intervalo de confiança; ND = não determinado

[00263] Para determinar a KD aparente para o artigo de teste da li- gação a células, uma equação de regressão não-linear (ajuste de cur- va) para um sítio (de ligação específica) foi aplicada utilizando os da- dos da FIGS. 46A-F. Os resultados revelaram que as constantes de dissociação de equilíbrio médias (KD) para a interacção de MEDI5615 com células CHO que expressam OX40 de superfície celular humana é 180 pM, que expressam PD-L1 de superfície celular humana é de 88 pM, e que expressam tanto humana OX40 e PD-L1 humana é 270 pM. KD para a interação de MEDI5615 com células CHO que expressam OX40 de superfície celular de macaco cinomolgo é de 56 pM, que ex- pressam PD-L1 de superfície celular de macaco cinomolgo é 110 pM, e que expressam ambos OX40 de macaco cinomolgo e PD-L1 de ma- caco cinomolgo é 99 pM. Resultados semelhantes foram obtidos usando moléculas de controle BFP2 capazes de ligar apenas um antí- geno, OX40 ou PDL1.

[00264] A ocupação do receptor OX40 humano de 20%, 50%, e 90% em equilíbrio para a interação de MEDI5615 com várias células CHO é apresentada na Tabela 5. Tabela 5. Valores de ocupação do receptor (EC20, EC50, EC90) para a ligação de PD-L1/OX40L BFP2 e moléculas de controle pa- ra células CHO manipuladas para superexpressar OX40, PDL1 humano e de macaco cinomolgo, e ambos OX40 e PDL1 EC = concentração efetiva; ND = não determinado

[00265] Os valores de ECx foram calculados usando o software GraphPad Prism a partir de análise de regressão não linear usando curvas sigmoidais de resposta à dose e ajuste de quatro parâmetros dos dados apresentados nas FIGS. 46A-F.

[00266] Para a determinação da concentração para a qual 20%, 50%, e 90% dos receptores foram ocupados pelo artigo de teste, os valores de concentração (M) foram primeiro transformados usando a equação X = log [X], e subsequentemente, o ECAnything (ECf) foi de- terminado para f = 20, f = 50 e f = 90 a partir de curvas de ligação de resposta de dose sigmoidal (declive variável) usando o software Gra- phPad Prism. ECf é a concentração do artigo de teste que dá uma resposta f porcento do caminho entre as assíntotas inferior e superior, e representa 20% (f=20), 50% (f=50), e 90% (f=90) de ocupação do receptor, em que o topo da curva calculada representa 100% de ocu- pação do receptor.

[00267] As concentrações de MEDI5615 necessárias para atingir 20%, 50% ou 90% de ocupação do receptor OX40 humano em equilí- brio nas células CHO manipuladas foram calculadas em 45 pM, 180 pM e 1600 pM, respectivamente. Adicionalmente, as concentrações de MEDI5615 necessárias para atingir 20%, 50% ou 90% de ocupação do receptor OX40 de macaco cinomolgo em equilíbrio nas células CHO manipuladas foram calculadas em 14 pM, 56 pM e 500 pM, res- pectivamente.

[00268] As concentrações de MEDI5615 necessárias para atingir 20%, 50% ou 90% de ocupação de PD-L1 humano em equilíbrio nas células CHO manipuladas foram calculadas em 22 pM, 88 pM e 790 pM, respectivamente. Adicionalmente, as concentrações de MEDI5615 necessárias para atingir 20%, 50% ou 90% de ocupação de PD-L1 de macaco cinomolgo em equilíbrio nas células CHO manipuladas foram calculadas em 27 pM, 110 pM e 950 pM, respectivamente.

[00269] As concentrações de MEDI5615 necessárias para atingir 20%, 50% ou 90% de ocupação de OX40 e PD-L1 humano em equilí- brio nas células CHO manipuladas foram calculadas em 67 pM, 270 pM e 2400 pM, respectivamente. Adicionalmente, as concentrações de MEDI5615 necessárias para atingir 20%, 50% ou 90% de ocupação de OX40 e PD-L1 de macaco cinomolgo em equilíbrio nas células CHO manipuladas foram calculadas em 25 pM, 99 pM e 890 pM, respecti-

vamente.

[00270] Assim, MEDI5615 pode se ligar a células que expressam OX40 e PDL1de superfície celular humano e de macaco cinomolgo, individualmente ou em conjunto. EXEMPLO NO. 21. REGULAÇÃO NEGATIVA DA PROTEÍNA PD-1 EM PBMCS HUMANAS ATIVADAS.

[00271] Neste estudo, foi avaliada a capacidade de BFPs para re- gular a proteína PD-1 em PBMCs humanas ativadas.

[00272] Estimulação e protocolo Western: PBMCs humanas re- centemente isoladas foram ressuspensas em meio RPMI1640 comple- to contendo 1 µg/mL de anti-CD3 (Clone HIT3a, Biolegend) e anti- CD28 (Clone CD28,2, Biolegend) a 1 milhão de células/mL (ver FIG. 47). Após estimulação por 3 dias, as células foram coletadas, lavadas e ressuspensas em 1 milhão/mL em meio RPMI1640 fresco e comple- to. Foram adicionados 2 mL totais de células a cada poço de uma pla- ca de 6 poços. As células foram estimuladas com 10 nM de material de teste por 24 h. As células foram lisadas em tampão RIPA com inibi- dores de protease e os lisados de células inteiras foram analisados por imunotransferência. Os anticorpos utilizados para Western blot estão listados na Tabela 6. Tabela 6. Análise de Western blot para detectar os níveis de prote- ína PD1, OX40 e GITR anticorpo Vendedor Cat# Diluição mAb de Coelho PD-1 sinalização 86163S 1 : 500 (D4W2J) XP® #86163 celular mAb de Coelho OX40 sinalização 15123S 1 : 500 (D1S6L) #15123 celular Anticorpo R&D systems AB689-100 1 : 500 GITR/TNFRSF18 Humano anti-actina Sigma A2066-.2ML 1 : 2000 anticorpo Vendedor Cat# Diluição IgG Anti-Coelho de Burro Jackson 711-035-152 1 : 4000 de Peroxidase AffiniPure Immunorese- (H+L) arch IgG Anti-Camundongo de Jackson 715-035-150 1 : 4000 Burro de Peroxidase Affi- Immunorese- niPure (H+L) arch

[00273] Os resultados são mostrados nas FIGS. 47, 48 e 74. É mostrado que anti-PD1-OX40L BFP desencadeia a degradação da proteína PD1 em PBMCs humanas ativadas (FIG. 47) e é mostrado que anti-PD1-GITRL BFP (MEDI3387) desencadeia a degradação da proteína PD1 em PBMCs humanas ativadas (FIG. 48). Descobriu-se que PD1/OX40L 2TS and 1TS também induziram degradação signifi- cativa de PD1 em comparação com o anticorpo de controle de isotipo (Fig. 74). Portanto, a indução da internalização e degradação da pro- teína PD1 é impulsionada pela internalização de OX40, mas pode ser independente da ativação de OX40. EXEMPLO NO. 22. ATIVAÇÃO DE GITRL EM NF-ΚB

[00274] O presente ensaio utiliza a linha celular clone 29 Jurkat NF- κB Luc FL hGITR, onde o engajamento do receptor GITR pelo ligando GITR induz o promotor NFAT conduzido a atividade da luciferase.

[00275] Os linfócitos T repórter clone 29 Jurkat-Blue NF-ĸB/Luc FL hGITR transfectados com proteína GITR foram mantidos em meio RPMI-1640 mais Glutamax™ (Invitrogen) mais 10% de HI-FBS (Invi- trogen), 1% Pen/Strep (Invitrogen). As células foram colhidas, ajusta- das para 1x106 células/mL e adicionadas (50 µL) aos poços de uma placa de 96 poços de fundo plano (5x104 células/poço; Falcon). Cin- quenta microlitros de reagentes de teste 2X foram adicionados a cada poço. Tampão Steady-Glo® (Promega) foi descongelado à temperatu- ra ambiente antes de ser utilizado no dia da medição no escuro. Após 4 horas e 40 minutos de incubação, as placas foram deixadas equili-

brar à temperatura ambiente por 20 minutos, em seguida, 100 µL de reagente Steady-Glo® reconstituído à temperatura ambiente foram adicionados a cada poço na placa de 96 poços e incubados por >10 minutos em um agitador de placas antes da medição. As leituras de luminescência foram medidas usando a leitura ultrassensível otimizada de LUM 96 (opti) de 0,1 segundo em um leitor de placas Envision (Perkin Elmer).

[00276] A FIG. 49 demonstra que anti-PD1-GITRL BFPs (ME- DI3387 e MEDI5771) ativam a via NF-ĸB em células Jurkat transfecta- das com GITR. EXEMPLO NO. 23. TESTE OCTETO DA LIGAÇÃO CONCORRENTE DE PD-1/GITRL BIESPECÍFICA A BIO-HGITR & HPD-1.

[00277] O objetivo desta experiência foi testar a capacidade das proteínas de fusão biespecíficas PD1/GITRL de se ligarem simultane- amente a huPD-1 e huGITRL (ligando GITR) usando a Interferometria de Bio-Camada OCTETO para determinar a interação.

[00278] Os materiais usados neste protocolo estão descritos na Ta- bela 7 abaixo. Tabela 7. Materiais de teste do ensaio octeto. Reagente Fornecedor Catálogo Lote/Lot No. Tamanho do Arma- No. tubo zena- mento Bio- Sistemas de R & 689-GR- CRS0615071 0,1 mg/mL em -80°C rhGITR/Fc D Biotinilados 100 PBS + 0,1% internamente 10 BSA de maio de 2016 R & D Systems rhPD-1/Fc R & D Systems 1086-PD- FVQ0915111 50 µg -20°C 050 rhB7-H1 R & D Systems 156-B7- FVQ0915111 0,5 mg/mL em -20°C (PD-L1)/Fc 100 PBS rhGITRL R & D Systems 6987-GL- TSU0815071 0,5 mg/mL em -20°C 025/CF BSA

Reagente Fornecedor Catálogo Lote/Lot No. Tamanho do Arma- No. tubo zena- mento Hu IL-7 Produzido & bio- PS1062 NA 144,8 (2,98 -80°C FL_A_H_Biot tinilado interna- mg/mL) ina mente (CPL) IgG1 4P Internamente NA SP09-410 71,0 -20°C NIP228 Hu- (10,65mg/mL) mana DPBS GIBCO 14190-169 1734676 NA TA 30% BSA SIGMA A9576- SLBJ8273 NA TA 50ML Tween-20 SIGMA P9416- SLBH9666V NA TA 50ML Biossenso- Fortébio 18-5117 1511211 NA TA res de leitura & imersão de Estreptavidi- na de Alta Precisão (SAX) Microplacas Fortébio 18-5076 18-0019 NA TA de fundo inclinado (TW384) Microplaca Greiner 655209 EI5033KF NA TA de 96 poços PP Preto rhGITR/Fc biotinilado foi ligado aos sensores de Estreptavidina, segui- do pela associação dos construtos biespecíficos IO. Após uma breve fase de dissociação, os construtos foram então testados quanto à sua capacidade de se ligarem simultaneamente a rhPD-1/Fc.

[00279] A ligação simultânea de proteínas de fusão biespecíficas foi avaliada por Interferometria de Bio-Camada (BLI) usando o sistema Octet RED384 e o software Octet Data Analysis versão 9 (Pall Forte- Bio). A imersão em Estreptavidina de alta precisão (SAX) e biossenso- res de leitura foram primeiramente equilibrados em tampão de ensaio (BSA a 1%, 0,02% de Tween 20 em Dulbecco's PBS) durante 10 minu- tos. Uma linha de base foi estabelecida em tampão de ensaio por um minuto antes da captura de GITR/Fc humano recombinante biotinilado (689-GR-100, R&D Systems) por 3 minutos. Uma segunda linha de base foi estabelecida em tampão de ensaio por 30 segundos antes da captura da proteína de fusão biespecífica através do domínio GITRL por 5 minutos. Uma dissociação/linha de base foi realizada em tampão de ensaio por um minuto antes da captura de PD-1/Fc humano recom- binante (1086-PD-050, R&D Systems) por 5 minutos pelo componente de anticorpo da proteína de fusão biespecífica. Os resultados são mostrados na FIG. 50. EXEMPLO NO. 24. ATIVIDADE DE PD-1 NA ATIVAÇÃO DE NFAT

[00280] Este ensaio utiliza células CHO K1 OKT3-CD14 (baixa) hB7H1 (alta) cl 2 como célula apresentadora de antígeno e células 3L- B9 do clone Jurkat NFAT Luc2 PD1 como linha celular repórter ativada anti-CD3. A inibição da interação PD-1 a PD-L1 por um anticorpo blo- queador de PD-1 resulta na ativação da expressão de luciferase dirigi- da pelo promotor NFAT.

[00281] Linfócitos T do repórter 3L-B9 do clone Jurkat NFAT Luc2 PD1 transfectados com PD-1 e células CHO K1 OKT3-CD14 (baixa) hB7H1 (alta) cl 2 foram mantidas em meio RPMI-1640 mais Glutamax (Invitrogen) mais 10% HI-FBS (Invitrogen), meio de aminoácidos não essenciais (Invitrogen). As células foram colhidas, ajustadas para 1x106 células/mL e adicionadas (50 µL) aos poços de uma placa de 96 poços de fundo plano (5x104 células/poço; Falcon). Cinquenta microli- tros de reagentes de teste 2X foram adicionados a cada poço. Tampão Steady-Glo® (Promega) foi descongelado à temperatura ambiente an- tes de ser utilizado no dia da medição no escuro. Após 4 horas e 40 minutos de incubação, as placas foram deixadas equilibrar à tempera- tura ambiente por 20 minutos, em seguida, 100 µL de reagente Ste- ady-Glo® reconstituído à temperatura ambiente foram adicionados a cada poço na placa de 96 poços e incubados por >10 minutos em um agitador de placas antes da medição. As leituras de luminescência fo- ram medidas usando a leitura ultrassensível otimizada de LUM 96 (op- ti) de 0,1 segundo em um leitor de placas Envision (Perkin Elmer).

[00282] A FIG. 51 demonstra que anti-PD1-GITRL BFPs (ME- DI3387 e MEDI5771) ativam a via NF em células Jurkat transfectadas com PD-1. Estes dados em conjunto com os do Exemplo 8 acima de- monstram que as BFPs MEDI3387 e MEDI5771 demonstram ligação simultânea à PD-1 e GITR humana. EXEMPLO NO. 25. ENSAIOS ANTI-PD-1_IGG_GITRL IN VIVO

[00283] Modelos de camundongos e tumores: Camundongas fêmeas BALB/c ou C57BL/6 de oito a 10 semanas de idade foram ob- tidas da Charles River UK Ltd. ou da Harlan Laboratories Inc. Uma suspensão de 100 mL de células CT26 (ATCC) ou B16F10 em PBS a uma densidade celular de 5 x 106 células/mL ou 5 x104 células/mL foi injetada subcutaneamente no flanco direito de cada animal. A linha de células B16F10 foi implantada em 50% de PBS e 50% de fator de crescimento reduzido e livre de vermelho de fenol Matrigel® (Corning). As linhas celulares foram cultivadas para passagem limitada antes da implantação e foram rastreadas periodicamente para confirmar a au- sência de micoplasma. As células foram ainda autenticadas através de perfil STR (IDEXX Bioresearch) e rastreadas quanto a um painel de vírus de camundongo (Charles River).

[00284] Os tumores mensuráveis foram randomizados com base no volume do tumor nos respetivos grupos. O comprimento (mm) e a lar- gura (mm) de cada tumor foram medidos com uma caliper eletrônica 3 vezes por semana. Os volumes de tumores (mm3) foram calculados com base na fórmula [(comprimento (mm) × largura (mm)2)/2. As res- postas ao crescimento tumoral foram categorizadas como uma respos- ta se não houvesse tumor mensurável ou uma inibição do crescimento tumoral sustentado, de modo que o volume fosse inferior a 200 mm3 no final do estudo.

[00285] O cálculo de potência foi realizado para determinar os ta- manhos dos grupos para estudos in vivo. Os camundongos foram do- seados por via intraperitoneal com mGITRL-FP, proteína de morte ce- lular anti-programada-1 rIgG2a (PD-1, clone RMP1- 14, BioXCell) ou mAb bi-específico para anti-PD1/GITRL. Os camundongos foram do- seados com diferentes concentrações, dependendo do estudo, come- çando no dia 6 após inoculação das células tumorais ou quando os tumors atingiram um volume de 200 mm3. Os resultados são mostra- dos na FIG. 52. EXEMPLO NO. 26. ENSAIOS ANTI-PD-1_IGG_GITRL IN VIVO Estudos Farmacocinéticos e Farmacodinâmicos (PK/PD)

[00286] O macaco cinomolgo foi considerado uma espécie não clí- nica farmacologicamente relevante para testar a atividade funcional das proteínas de fusão biespecíficas PD-1/GITRL. A farmacocinética (PK) e farmacodinâmica das proteínas de fusão biespecíficas PD- 1/GITRL foram avaliadas em um estudo não-GLP (Boas Práticas de Laboratório) em macacos cinomolgos. A PK e a PD (percentagem de células T CD4+ e CD8+ de memória totais positivas para Ki67) foram avaliadas em macacos cinomolgos (n=5; machos) após uma única do- se intravenosa (IV) no intervalo de doses de 5 mg/kg a 50 mg/kg. As amostras de sangue foram coletadas antes da dosagem e nos dias 1, 3, 8, 11, 15, 18 22 e 29 após a dosagem, sendo analisadas no dia da coleta das amostras por citometria de fluxo. Os resultados de Ki67 mostraram um aumento dependente da dose nas células T CD4+ e CD8+ de memória totais (Ki67) (FIGS. 53A-B).

[00287] Também foram coletadas amostras de sangue 0,5, 6, 24, 48 e 96 horas após a dosagem nos dias 8, 15, 22 e 29 para avaliação da farmacocinética. Em resumo, as proteínas de fusão biespecíficas PD-1/GITRL resultaram em aumentos aproximadamente proporcionais em Cmax e AUC0-inf, sugerindo farmacocinética linear dentro desse in- tervalo de doses (FIG. 54) com uma meia-vida curta de 1,12 a 2,19 dias (ver Tabela 8). Tabela 8. Parâmetros farmacocinéticos médios das proteínas de fusão biespecíficas PD-1/GITRL Dose t1/2 Tmax Cmax AUC0-inf Vss (mg/Kg) (dia) (h) (mg/L) (dia·mg/L) (mL/kg) MEDI3387 5 1,12 0,50 111 125 61,1 (0,278) (0,00) (11,7) (20,1) (8,33) MEDI3387 50 1,91 0,50 1200 1050 83,2 (0,129) (0,00) (82,7) (183) (8,13) MEDI3387 5 1,48 0,50 77,1 108 88,9 (0,481) (0,00) (11) (26,7) (6,36) MEDI3387 50 2,19 0,50 730 800 135 (0,13) (0,00) (26,7) (51,4) (5,86) Os valores são apresentados como Média (Desvio Padrão). AUClast = área sob a curva do tempo concentração até a última concentração mensurável; AUCINF = área sob a curva do tempo concentração até o tempo infinito; Cmax = concentração máxima observada; CL: depuração sistêmica; T1/2 = meia-vida; Vss: distribuição de volume da fase termi- nal.

[00288] MEDI3387, os valores médios de Cmax foram 111 e 1200 mg/L, e os valores médios de AUC0-inf foram 125 e 1050 mg·dia/L para doses de 5 e 50 mg/kg, respetivamente. Os valores de AUC normali- zados para a dose foram aproximadamente semelhantes para dois grupos de doses. Média AUC0-inf/dose foi de 24,9 e 20,9 para os níveis de dose de 5 e 50 mg/kg, respetivamente. MEDI5771, os valores mé- dios de Cmax foram 77,1 e 730 mg/L, e os valores médios de AUC0-inf foram 108 e 800 mg·dia/L para doses de 5 e 50 mg/kg, respetivamen- te. Os valores de AUC normalizados para a dose foram aproximada- mente semelhantes para dois grupos de doses. Média AUC0-inf/dose foi de 21,5 e 16,0 para os níveis de dose de 5 e 50 mg/kg, respetivamen- te.

EXEMPLO NO. 27. ANTI-PD-1_IGG_GITRL BFPS MELHORA A FUNÇÃO DAS CÉLULAS T EFETORAS EM UM ENSAIO DE REATI-

VAÇÃO DE CÉLULAS T HUMANAS PRIMÁRIAS

[00289] Um esquema do ensaio de reativação de células T Cytostim é mostrado na FIG. 55A.

[00290] As PBMCS foram preparadas a partir de cones de Leucóci- tos (fornecidos por NHSBT, Addenbrooke's Hospital) usando Ficoll- Paque PLUS (GE Healthcare 17-1440-02), seguindo o protocolo reco- mendado pelo fabricante. As células T foram isoladas por seleção ne- gativa de PBMCs doadoras usando um kit de enriquecimento de célu- las T (Stemcell cat: 19051) seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. As células T foram então ressuspensas a uma concentra- ção de 1E6 células/mL em meio de célula T (RPMI1640 com Gluta- max™ [Gibco] suplementado com soro AB humano a 5% [Sigma] e 1% de penicilina/estreptomicina) e estimuladas por 96 horas a 37 °C, 5% de CO2, em 6 placas de cultura de tecidos (Costar, cat: 3506), revesti- da previamente com um anticorpo anti-CD3 humano (clone OKT3, eBioscience cat: 16-0037-85). Para revestir as placas de 6 poços, 1 mL de PBS contendo 0,2 µg de OKT3 foi adicionado a cada poço e incubado durante a noite a 4 °C. As placas foram lavadas duas vezes com PBS antes do uso.

[00291] As células T foram, em seguida, alavdas e incubadas em meio de células T fresco durante mais 24 horas a 37 °C, 5% de CO2, sem estimulação. Essas células T 'descansadas' foram subsequente- mente misturadas na proporção de 1:4 com PBMCs autólogas que fo- ram esgotadas anteriormente de células T usando um Kit II de Seleção Positiva para CD3 Humano EasySep™ (Stemcell, 17851), seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. A mistura de células resultan- te foi dividida em alíquotas em placas de cultura de tecidos de 96 po- ços com fundo em U (Costar 8797BC) em meio de células T, suple-

mentado com Cytostim humano (Miltenyi Biotec, 130-092-173) a uma concentração de 1 em 400, juntamente com fármacos de teste ou mAbs de controle. Cada reação teve um volume total de 200 µL e con- tinha 5E5 células. As reações foram incubadas durante 72 horas a 37 °C, 5% de CO2, depois os sobrenadantes foram removidos e testados posteriormente para a liberação de IFN-y por ELISA.

[00292] Os resultados são mostrados nas FIGS. 55B-C. MEDI3387 e MEDI5771 são >4x mais potentes que uma combinação de molécu- las monoespecíficas (PD-1 e GITRL) e, portanto, ilustram um efeito sinérgico inesperado devido ao formato BFP. Os dados in vitro descri- tos acima (FIGS 55D-E) demonstram bioequivalência para MEDI3387 e MEDI5771 a uma combinação de GITRL (MEDI1873) / Durva (ME- DI4736) ou MEDI1873 / aPD-1 mAb (LO115). Os dados in vivo de- monstram bioequivalência a uma combinação de MEDI1873 / aPD-1 mAb. EXEMPLO NO. 28. BIODISTRIBUIÇÃO DE FLUORESCÊNCIA DE

GITR IN VIVO

[00293] Camundongos SCID fêmeas, com 6/8 semanas de idade, foram injetados por via subcutânea com a linha celular de tumor de pulmão humano, NCI-H358 (células 5e5 / mouse), no dia 0. Uma única administração intravenosa de anticorpo marcado com fluorescência (IRDye 800CW) (10 mg/kg em um volume de dose de 100 µL/25 g) ocorreu no dia 25, quando o tamanho do tumor foi aproximado de 200 – 300 mm3. Todos os três anticorpos foram marcados com IRDye 800CW, de acordo com o protocolo do fabricante, duas semanas antes da injeção in vivo. Cinco camundongos por grupo de tratamento foram anestesiados e fotografados 1 hora, 24 horas e 96 horas após a dose, utilizando um espectro IVIS. As configurações ótimas de comprimento de onda foram selecionadas para o corante fluorescente e os valores de eficiência radiante foram determinados para as regiões tumorais e hepáticas, usando o software de análise de imagem PerkinElmer. Os resultados demonstram que não há diferença significativa entre os per- fis de biodistribuição do teliver para MEDI3387, MEDI5771 e ME- DI1873 (FIG. 56). EXEMPLO NO. 29. ANTI-PD-L1-TNF- α BFP DESENCADEIA REGU- LAÇÃO NEGATIVA DA PROTEÍNA PD-L1 NA SUPERFÍCIE CELU- LAR DE CÉLULAS TUMORAIS T24.

[00294] T24 é uma linha celular de carcinoma de transição da bexi- ga urinária humana que expressa constitutivamente os receptores TNF-α e PD-L1. No presente estudo, as células T24 foram misturadas com materiais de teste a uma concentração de 10 nM e incubou-se a 37 °C durante 24 horas. Após a incubação, os anticorpos livres foram removidos por lavagem, e a quantidade de proteína PD-L1 na superfí- cie das células foi quantificada com Qifikit (Agilent). Resumidamente, as células T24 após tratamento reagiram com anti-PD-L1 não conju- gado (clone 29E.2A3) em gelo por 30 minutos, seguido por IgG anti- camundongo de cabra F(ab)2 conjugado com FITC, por mais 30 minu- tos. A intensidade de fluorescência média de sinais de FITC foi grava- da, e a quantidade de antígeno PD-L1 por célula em células T24 foi calculada de acordo com a instruções do fabricante.

[00295] O efeito na viabilidade celular foi avaliado com o kit de via- bilidade celular CellTiter-Glo® (Promega). Neste estudo, 10,000 células T24/poço foram cultivadas em placas de múltiplos poços de paredes opacas tratadas como descrito acima e após a incubação, as células T24 foram misturadas com o reagente CellTiter-Glo® diluído. Os con- teúdos foram misturados durante 2 minutos num agitador orbital, para induzir lise de células, e o prato foi incubado à temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar o sinal luminescente. A lumines- cência foi registada num leitor de placas SpectraMax M5. A FIG. 57 demonstra que anti-PD-L1-TNF-α BFP desencadeia a regulação nega-

tiva de proteína PD-L1 em células tumorais T24. Este resultado de- monstra que outra molécula de BFP que substitui CD40 por outra pro- teína da família TNF-α pode desencadear uma regulação negativa de PD-L1 da superfície celular. EXEMPLO NO. 29. ANTI-PD-L1-TNF- α BFP DESENCADEIA REGU- LAÇÃO NEGATIVA DA PROTEÍNA PD-L1 NA SUPERFÍCIE CELU- LAR DE CÉLULAS TUMORAIS T24.

[00296] Outro ensaio em células THP1-blue foi configurado como descrito acima no Exemplo No. 4, exceto que os reagentes de teste foram substituídos por anti-PDL1-TNF-α BFP3 e TNF- FP e controle de isotipo. FIG. 58 demonstra que anti-PDL1-TNF- BFP ativa a via NF-κB em células mieloides THP1. EXEMPLO NO. 30. ANTI-PD-1-OX40 BFP CONDUZ A INTERNALI- ZAÇÃO.

[00297] Os estudos descritos abaixo mostram que uma anti-PD-1- OX40 BFP pode conduzir à internalização Independentemente de o braço OX40 ser um anticorpo agonista ou não-agonista. Esta desco- berta é diretamente aplicável ao espaço autoimune. Os resultados mostram que a internalização de receptores ativadores pode ser con- duzida usando construtos de anticorpos biespecíficos com não agonis- tas, mas internacionalizadores. Ver as FIGs 63-64 e 70-74. Estes re- sultados também mostram que a degradação de PD-1 é independente da função agonista de OX40 neste cenário biespecífico.

CONCLUSÕES

[00298] MEDI7526 semelhante ao CD40L FP, induziu a rápida re- gulação negativa de CD40. Curiosamente, descobriu-se que ME- DI7526 também desencadeou regulação negativa rápida e robusta de PD-L1 na superfície celular em vários tipos de células, incluindo THP1, MDA-MB-231, e monócitos humanos. Todas essas células expressam CD40. Além disso, MEDI7526 não apenas regulou negativamente PD-

L1 na superfície celular, mas também reduziu significativamente a quantidade celular total de proteína PD-L1, sugerindo que a internali- zação forçada de PD-L1 pode desencadear sua degradação. Além disso, anti-PD-L1-TNF-α BFP desencadeou de forma semelhante a regulação negativa da proteína PD-L1 em células tumorais T24. Este resultado demonstra que outra molécula de BFP que substitui CD40 por outra proteína da família TNF-α pode desencadear uma regulação negativa de PD-L1 da superfície celular. Acredita-se que as moléculas de BFP adicionais também podem regular negativamente PD-L1.

[00299] Os dados aqui descritos a partir destas novas moléculas biespecíficas, demonstram que a combinação dos dois em um "molde" gera resultados que seriam inatingíveis apenas com a terapia combi- nada. MEDI7526 (BFP3), através de sua função exclusiva de estimular a via CD40 e regular a expressão de PD-L1, representa uma aborda- gem terapêutica promissora contra o câncer.

[00300] Da mesma forma, é mostrado que anti-PD1-GITRL BFP (MEDI3387) e anti-PD1-OX40L BFP desencadeiam a degradação da proteína PD1 em PBMCs humanas ativadas, o que pode fornecer ou- tra opção terapêutica para combater o câncer.

[00301] A FIG. 59 ilustra MOA proposto para MEDI7526 (BFP3). Especificamente, ao ativar as células apresentadoras de antígeno por meio da ligação a CD40 e remover simultaneamente PD-L1 da super- fície celular, leva à indução de IFN-γ, IL-12 e IL-10, mas não TNF-α ou IL-6. A ausência de TNF-α e IL-6 induzidos correlaciona-se com a fun- ção antitumoral melhorada e a perda de peso reduzida, apoiando a conclusão de que MEDI7526 pode induzir respostas antitumorais me- lhoradas com toxicidade reduzida.

[00302] Os estudos em murinos confirmam ainda que MEDI7526 tem o potencial de tratar tumores hepáticos. Outras Modalidades

[00303] A partir da descrição anterior, será evidente que variações e modificações podem ser feitas à divulgação aqui descrita para a ado- tar a várias utilizações e condições. Estas modalidades estão também dentro do âmbito das seguintes reivindicações.

[00304] A recitação de uma lista de elementos em qualquer defini- ção de uma variável aqui inclui definições desta variável como um úni- co elemento ou combinação (ou subcombinação) dos elementos lista- dos. A recitação de uma modalidade aqui inclui essa modalidade como uma modalidade única, ou em combinação com quaisquer outras mo- dalidades ou partes das mesmas.

[00305] Todas as patentes e publicações mencionadas neste relató- rio descritivo de patente são aqui incorporadas a título de referência na mesma extensão como se cada patente e publicação independente estivesse específica e individualmente indicada como incorporada a título de referência.

SEQUÊNCIAS ID NOS Sequência No.

Nome SEQ ID NO: 1 Polipeptídeo α-PD-1 VH (região variável da cadeia pesada) SEQ ID NO: 2 Polipeptídeo α-PD-1 CH1 (região constante da cadeia pesada 1) SEQ ID NO: 3 Polipeptídeo α-PD-1 VL (região variável da cadeia leve) SEQ ID NO: 4 Polipeptídeo α-PD-1 LC (região constante da cadeia leve) SEQ ID NO: 5 Cadeia leve α-PD-1 kappa SEQ ID NO: 6 Polipeptídeo IgG1 Fc (charneira-CH2-CH3) SEQ ID NO: 7 Polipeptídeo GITRL SEQ ID NO: 8 Polipeptídeo BIOAE005/MEDI3387_ HC (cadeia pesada) SEQ ID NO: 9 Polipeptídeo IgG4 Fc (charneira_CH2_CH3) SEQ ID NO: 10 Polipeptídeo BIOAE003 / MEDI5771_HC (cadeia pesada) SEQ ID NO: 11 Proteína de fusão BFP2-CD40L (MEDI5083)- anti-PDL1 (MEDI4736 scFv)-G4P HC (sem cadeia leve b/c sem braços Fab) SEQ ID NO: 12 Proteína de fusão BFP3-anti-PDL1 (MEDI4736)- CD40L (MEDI5083)-G4P HC SEQ ID NO: 13 Proteína de fusão BFP3-anti-PDL1 (MEDI4736)- CD40L (MEDI5083)-G4P LC (Igual que LC de MEDI4736) / cadeia leve α-PD-L1 kappa SEQ ID NO: 14 Proteína de fusão BFP3-anti-muPDL1 de murino (Substituto MEDI4736)-muCD40L (Substituto MEDI5083)-muIgG1 D265A HC SEQ ID NO: 15 Proteína de fusão BFP3-anti-muPDL1 de murino (Substituto MEDI4736)-muCD40L (Substituto MEDI5083)-muIgG1 D265A LC SEQ ID NO: 16 Proteína de fusão BFP3-anti-PDL1 (MEDI 4736)- TNF- -G4P HC

Sequência No.

Nome SEQ ID NO: 17 Proteína de fusão BFP3-anti-PDL1 (MEDI 4736)- TNF- -G4P LC (igual a LC de 4736) / cadeia leve α-PD-L1 kappa SEQ ID NO: 18 Proteína de fusão BFP3-anti-PD1-OX40 ligando- G4P HC SEQ ID NO: 19 Proteína de fusão BFP3-anti-PD1-OX40 ligando- G4P LC (igual a LC de LO115) SEQ ID NO: 20 CD40L sp|P29965|CD40L_HUMANO – Forma do Domínio citoplasmático ligado à Membrana = 1-20; Sinal da região da proteína de membrana tipo II âncora = 21-46; forma solúvel = 113-261 SEQ ID NO: 21 Polipeptídeo CD40L – Forma solúvel SEQ ID NO: 22 Polipeptídeo CD40 SEQ ID NO: 23 Polipeptídeo PD-L1 SEQ ID NO: 24 Polipeptídeo Durvalumab VL SEQ ID NO: 25 Polipeptídeo Durvalumab VH SEQ ID NO: 26 Durvalumab CDR1 de VH SEQ ID NO: 27 Durvalumab CDR2 de VH SEQ ID NO: 28 Durvalumab CDR3 de VH SEQ ID NO: 29 Durvalumab CDR1 de VL SEQ ID NO: 30 Durvalumab CDR2 de VL SEQ ID NO: 31 Durvalumab CDR3 de VL SEQ ID NO: 32 Polipeptídeo PD-1 SEQ ID NO: 33 Ligante 4x repetição GGGGS SEQ ID NO: 34 Ligante 3x repetição GGGGS SEQ ID NO: 35 Ligante 2x repetição GGGGS SEQ ID NO: 36 Variante ligante SEQ ID NO: 37 Proteína de fusão BFP3-anti-PD1-OX40 1TS ligando-G4P HC SEQ ID NO: 38 Proteína de fusão BFP3-anti-PD1-OX40 2TS ligando-G4P HC

SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSD

YGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSYTIYSAD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY

YCARRAPNSFYEYYFDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 2 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY

FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK

RV SEQ ID NO: 3 QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSKHTNLY

WSRHMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNRATGIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWS

SNPFTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 4 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS

PVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 5 QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSKHTNLY

WSRHMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNRATGIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWS SNPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 6 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP

KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPGK SEQ ID NO: 7 EPCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSDW

KLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEVRLY KNKDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTIDLIF NSEHQVLKDNTYWGIILLANPQFIS

SEQ ID NO: 8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSD

YGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSYTIYSAD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY YCARRAPNSFYEYYFDYWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQLETAKE PCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSDWKL EILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEVRLYKN KDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTIDLIFNS EHQVLKDNTYWGIILLANPQFISGGGGSGGGG SEPCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSD WKLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEVRL YKNKDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTIDLI FNSEHQVLKDNTYWGIILLANPQFISGGGGSG GGGSEPCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNK VSDWKLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPF EVRLYKNKDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVG

DTIDLIFNSEHQVLKDNTYWGIILLANPQFIS SEQ ID NO: 9 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDT

LMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSLGK

SEQ ID NO: 10 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSD

YGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSYTIYSAD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY YCARRAPNSFYEYYFDYWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE SKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRL TVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSQLETAKEPC MAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSDWKLEI LQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEVRLYKNK DMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTIDLIFNSE HQVLKDNTYWGIILLANPQFISGGGGSGGGGS EPCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSDW KLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEVRLY KNKDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTIDLIF NSEHQVLKDNTYWGIILLANPQFISGGGGSGG GGSEPCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVS DWKLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEV RLYKNKDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTI DLIFNSEHQVLKDNTYWGIILLANPQFIS

SEQ ID NO: 11 NPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSN

NLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNRE ASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSA KPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQV SHGTGFTSFGLLKLGGGGSGGGSQIAAHVISE ASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQL TVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLW LKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGG VFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLL KLGGGGSGGGSQIAAHVISEASSKTTSVLQWA EKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYA QVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILL RAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVF VNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGGGGSGGG GSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSEIVLTQSP GTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTD FTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGCGT KVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLV ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMS WVRQAPGKCLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR EGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSR

YWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYV DSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAV YYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE SKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRL TVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGKGGGGSGGGGSNPQIAAHVISEASSKT TSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKR QGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSP GRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFEL QPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGG GGSGGGSQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGY YTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTF CSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAAN THSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVT DPSQVSHGTGFTSFGLLKLGGGGSGGGSQIA AHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTL ENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQA PFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQ QSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTG

FTSFGLLKL SEQ ID NO: 13 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSY

LAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSG SGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPW TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 14 QVKLLQSGAALVKPGDSLKMSCKASGYTFTDY

LIHWVKQSHGKSLEWIGYINPYSGNTNYDEKF RSMATLTVDKSSSTAYMEFSRLTSEDSAIYYCA RKDSSYIGGIWFAYWGQGTLVTVSSASTTPPS VYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTV TWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVP SSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCG CKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVT CVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPR EEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVN SAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQ MAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAE NYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAG NTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKGGGG SGGGGSDPQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKK GYYTMKSNLVMLENGKQLTVKREGLYYVYTQ VTFCSNREPSSQRPFIVGLWLKPSSGSERILLK AANTHSSSQLCEQQSVHLGGVFELQAGASVF VNVTEASQVIHRVGFSSFGLLKLGGGSGGSQI AAHVVSEANSNAASVLQWAKKGYYTMKSNLV MLENGKQLTVKREGLYYVYTQVTFCSNREPSS QRPFIVGLWLKPSSGSERILLKAANTHSSSQLC EQQSVHLGGVFELQAGASVFVNVTEASQVIHR VGFSSFGLLKLGGGSGGSQIAAHVVSEANSNA ASVLQWAKKGYYTMKSNLVMLENGKQLTVKR EGLYYVYTQVTFCSNREPSSQRPFIVGLWLKP SSGSERILLKAANTHSSSQLCEQQSVHLGGVF

ELQAGASVFVNVTEASQVIHRVGFSSFGLLKL SEQ ID NO: 15 GDTVLTQSPALAVSPGERVTISCWASESVSTL

THWYQQKPGQQPKLLIYLASHLESGVPARFSG SGSGTDFTLTIDPVEADDTATYYCHQTWNNPP TFGAGTKLELTRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGG ASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLN SWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYT CEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

SEQ ID NO: 16 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSR

YWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYV DSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAV YYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE SKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRL TVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGKGGGGSGGGGSSDKPVAHVVANPQAE GQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEG LYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQ TKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLG GVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGI IALGGGGSGGGGSGGGGSSDKPVAHVVANP QAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVP SEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAV SYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPI YLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQV YFGIIALGGGGSGGGGSGGGGSSDKPVAHVV ANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQL VVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTIS RIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPW YEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAES

GQVYFGIIAL SEQ ID NO: 17 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSY

LAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSG SGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPW TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 18 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSD

YGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSYTIYSAD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY YCARRAPNSFYEYYFDYWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE SKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRL TVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSQVSHRYPRI QSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNS VIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPL FQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNT SLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVLGGGGSGG GGSQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQ KEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEV NISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYK DKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGE FCVLGGGGSGGGGSQVSHRYPRIQSIKVQFTE YKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYL ISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSV NSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNG

GELILIHQNPGEFCVL SEQ ID NO: 19 QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSKHTNLY

WSRHMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNRATGIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWS SNPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 20 MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLIT

QMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMK TIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIML NKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASS KTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVK RQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKS PGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVF

ELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL SEQ ID NO: 21 MQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKG

YYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVT FCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAA NTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNV

TDPSQVSHGTGFTSFGLLKL SEQ ID NO: 22 MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYL

INSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGE SEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKG TSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSP GFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEK CHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDR LRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPH PKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQP

VTQEDGKESRISVQERQ SEQ ID NO: 23 MRIFAVFIFMTYWHLLNAPYNKINQRILVVDPVT

SEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTT TTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRL DPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAIL LCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSK

KQSDTHLEET SEQ ID NO: 24 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSY

LAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSG SGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPW

TFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 25 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSR

YWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYV DSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAV

YYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 26 GFTFSRYWMS

SEQ ID NO: 27 NIKQDGSEKYYVDSVKG SEQ ID NO: 28 EGGWFGELAFDY SEQ ID NO: 29 RASQRVSSSYLA SEQ ID NO: 30 DASSRAT SEQ ID NO: 31 QQYGSLPWT SEQ ID NO: 32 MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDR

PWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSES FVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDC RFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCG AISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPS PSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLA VICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSV DYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVF PSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGH

CSWPL SEQ ID NO: 33 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 34 GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 35 GGGGSGGGGS SEQ ID NO: 36 GGGGSGGGS

SEQ ID NO: 37 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSD

YGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSYTIYSAD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY YCARRAPNSFYEYYFDYWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE SKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRL TVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSQVSHRYPRI QSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNS VIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPL FQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNT SLDDFHVNGGELILIHQNPGEACVLGGGGSGG GGSQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQ KEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEV NISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYK DKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGE ACVLGGGGSGGGGSQVSHRYPRIQSIKVQFT EYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGF YLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVR SVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHV NGGELILIHQNPGEFCVL

SEQ ID NO: 38 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSD

YGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSYTIYSAD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY YCARRAPNSFYEYYFDYWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE SKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRL TVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSQVSHRYPRI QSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNS VIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPL FQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNT SLDDFHVNGGELILIHQNPGEACVLGGGGSGG GGSQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQ KEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEV NISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYK DKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGE FCVLGGGGSGGGGSQVSHRYPRIQSIKVQFTE YKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYL ISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSV NSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNG GELILIHQNPGEFCVL

Claims (38)

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína de fusão biespecífica, caracterizada pelo fato de que compreende: uma proteína de fusão de cadeia única compreendendo uma primeira região de ligação específica para um primeiro alvo da superfície celular, um monômero Fc e uma segunda região de ligação específica para um segundo alvo da superfície celular, em que a primeira região de ligação e a segunda região de ligação estão ligadas covalentemente ao monômero Fc através de um ligante peptídico, e em que a proteína de fusão biespecífica é capaz de se ligar ao primeiro alvo da superfície celular e ao segundo alvo da superfície celular ao mesmo tempo.

2. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma da primeira região de ligação e da segunda região de ligação é um fragmento Fab ou um ligando receptor.

3. Proteína biespecífica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o fragmento Fab é um fragmento Fab anti-PD-1.

4. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com a reivindi- cação 2, caracterizada pelo fato de que o fragmento Fab é um frag- mento Fab anti-PD-L1.

5. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o monô- mero Fc é um monômero IgG1 Fc.

6. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com a reivindi- cação 5, caracterizada pelo fato de que o monômero IgG1 Fc compre- ende uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 85% de iden- tidade de sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 6.

7. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o monô- mero Fc é um monômero IgG4 Fc.

8. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com a reivindi- cação 7, caracterizada pelo fato de que o monômero IgG4 Fc compre- ende uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 85% de iden- tidade de sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 9.

9. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o monômero Fc compreende uma região de charneira.

10. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o monômero Fc compreende uma sequência de aminoácidos Fc huma- na.

11. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma da uma ou mais subunidades de ligando é GITRL.

12. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma da uma ou mais subunidades de ligando é OX40L.

13. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma da uma ou mais subunidades de ligando é CD40L.

14. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com a reivin- dicação 13, caracterizada pelo fato de que a subunidade do ligando CD40L compreende um resíduo Trp na posição 194.

15. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com a reivin- dicação 14, caracterizada pelo fato de que o resíduo de Trp na posição 194 é uma substituição C→W.

16. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma da uma ou mais subunidades de ligando é TNF-α.

17. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma da uma ou mais subunidades de ligando é CD137L.

18. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o fragmento Fab está ligado ao terminal N do monômero Fc.

19. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com a reivin- dicação 18, caracterizada pelo fato de que uma ou mais subunidades de ligandos estão ligadas ao terminal C do monômero Fc.

20. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que o frag- mento Fab está ligado ao terminal C do monômero Fc.

21. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com a reivin- dicação 20, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais subunida- des de ligandos estão ligadas ao terminal N do monômero Fc.

22. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão de cadeia única compreende uma pluralidade de su- bunidades de ligandos.

23. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com a reivin- dicação 22, caracterizada pelo fato de que a pluralidade de subunida- des de ligandos compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 subunidades de ligandos.

24. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão de cadeia única compreende 3 subunidades de li- gandos.

25. A proteína de fusão biespecífica, de acordo com a rei-

vindicação 24, caracterizada pelo fato de que as subunidades de li- gando formam um homotrímero com 3 subunidades de ligando ligadas em série a partir do N-terminal para C-terminal.

26. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o ligante peptídico compreende cerca de 9 a cerca de 20 aminoácidos.

27. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com a reivin- dicação 26, caracterizada pelo fato de que o ligante peptídico compre- ende cerca de 9 a cerca de 15 aminoácidos.

28. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com a reivin- dicação 27, caracterizada pelo fato de que o ligante peptídico compre- ende cerca de 9 aminoácidos.

29. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o ligante peptídico compreende um ou mais resíduos de glicina (Gly) ou serina (Ser).

30. Proteína de fusão biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o ligante peptídico é GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 34), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 35), ou GGGGSGGGS (SEQ IN NO: 36).

31. Dímero, caracterizado pelo fato de que compreende duas proteínas de fusão biespecíficas selecionadas das proteínas de fusão biespecíficas, como definidas em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 30, em que o dímero é formado através da interação dos mo- nômeros de Fc.

32. Método de aumentar uma resposta imune antitumoral em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito a proteína de fusão ou dímero isolado, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 31.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracteriza- do pelo fato de que o sujeito tem câncer.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 33 a 34, caracterizado pelo fato de que o método aumenta uma ou mais de uma resposta imune e/ou uma resposta anticâncer.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 33 a 34, caracterizado pelo fato de que o método resulta em uma toxicidade reduzida em comparação com o tratamento com reagentes parentais da proteína de fusão ou dímero isolado.

36. Método de tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende o tratamento de um paciente em necessidade do mesmo com a proteína de fusão biespecífica, como definida na rei- vindicação 13.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda o tratamento com quimiotera- pia.

38. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é câncer do fígado.