CN111315405A - 双特异性融合多肽及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了双特异性融合蛋白和使用该双特异性融合蛋白用于治疗癌症的方法。

Description

双特异性融合多肽及其使用方法
序列表
本申请含有已以ASCII格式以电子方式提交且特此以引用的方式整体并入的序列表。所述ASCII副本创建于2018年11月2日，名称为IOBS-110-WO-PCT_SL.txt并且大小为105,745字节。
背景技术
癌症仍然是主要的全球健康负担。2016年，仅在美国，估计将诊断出超过150万新病例，并且超过500,000人将死于该疾病(参见来自国立卫生研究院，国家癌症研究所的癌症统计)。在全球范围内，估计有近六分之一的死亡可归因于癌症(参见Cancer Fact Sheet[癌症情况说明书]，2017年2月，世界卫生组织)。
尽管在过去十年在开发用于对抗癌症和其他疾病的策略中做出了显著的进步，但是患有晚期、难治性和转移性疾病的患者具有有限的临床选择。化学疗法、辐射和高剂量化学疗法已经成为剂量限制(并且在许多情况下仅延长患者的寿命，尽管具有显著使人衰弱的副作用)。因此，对于患有晚期和/或治疗抗性癌症的患者，仍然存在对于新的有效抗癌疗法的未满足的医疗需要。此外，还需要毒性较小，更具靶向性的抗癌疗法。
新的无毒抗癌疗法的潜在来源是患者自身的免疫系统。免疫系统，特别是T细胞介导的细胞毒性在肿瘤控制中的作用是公认的。有越来越多的证据表明T细胞在癌症患者中可以控制肿瘤生长和存活，无论是在该疾病的早期和晚期阶段。然而，肿瘤特异性T细胞应答很难在癌症患者中上升和维持。
可以影响肿瘤特异性T细胞应答的T细胞信号传导途径的实例涉及信号蛋白，例如细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4，CD1 52)、程序性死亡配体1(PD-L1，也称为B7-H1或CD274)、CD40配体(CD40L)、糖皮质激素诱导的TNF受体(TNFR)相关蛋白(GITR)、OX40和CD137(4-1BB)。
CD40L是肿瘤坏死因子(TNF)分子家族的成员，其主要在活化的T细胞(包括Th0、Th1和Th2亚型)上表达，并形成与该家族的其他成员类似的同源三聚体。此外，还发现CD40L在肥大细胞和活化的嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。CD40L与抗原呈递细胞(APC)上的其受体CD40结合，这导致取决于靶细胞类型的许多作用。通常，CD40L起到共刺激分子的作用并通过APC上的MHC分子诱导与T细胞受体刺激相关的APC中的活化。
通过CD40L穿过CD40发信号引发一系列事件，这些事件导致携带CD40的细胞的活化和最佳T细胞初免。更具体地，CD40L/CD40信号传导促进B细胞分化成抗体分泌细胞和记忆B细胞(Burkly，于以下中：Adv.Exp.Med.Bio.[实验医学和生物学进展]，第489卷，D.M.Monroe，U.Hedner，M.R.Hoffnan，C.Negrier，G.F.Savidge，以及G.C.I.White，编辑.Klower Academic/Plenum Publishers[克鲁维尔学术/普雷纳姆出版社]，2001，第135页)。另外，CD40L/CD40信号传导通过活化巨噬细胞和树突状细胞促进细胞介导的免疫，其通过自然杀伤细胞和肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的刺激促进抗肿瘤免疫应答(参见Burkly，同上)。
PD-L1也是涉及控制T细胞活化的受体和配体的复杂系统的一部分。在正常组织中，PD-L1在T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、骨髓源性肥大细胞和不同非造血细胞上表达。它的正常功能是通过与它的两个受体程序性死亡1(又称为PD-1或CD279)和CD80(又称为B7-1或B7.1)的相互作用来调节T细胞活化与耐受之间的平衡。PD-L1还以高频率在广泛的癌症中表达，并且在多个部位上起作用以帮助肿瘤避开由宿主免疫系统进行的检测和消除。在一些癌症中，PD-L1的表达与存活降低和不利预后相关联。阻断PD-L1与其受体(例如PD-1)之间的相互作用的抗体能够在体外和在体内解除PD-L1依赖性免疫抑制作用并且增强抗肿瘤T细胞的细胞毒性活性。
GITR(也称为TNFRSF18、AITR或CD357)，是在调节性T细胞上表达，并在抗原处理的CD4+辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞以及活化的自然杀伤细胞上上调(Stephens等人JImmunol.[免疫学杂志](2004)173(8)：5008-5020；Clothier和Watts，Cytokine GrowthFactor Rev.[细胞因子生长因子评论](2014))。GITR是涉及通过抗原暴露控制T细胞活化的受体和配体的复杂系统的一部分。GITR具有一个已知的内源性配体，GITR配体(GITRL)，该GITR配体以松散三聚体的形式存在，并且可以使GITR聚集，在T细胞内导致有效的细胞信号传导事件(Chattopadhyay等人(2007)Proc.Natl.Acad Sci.USA[美国国家科学院院刊]104(49)：19452-19457)。GITR和GITRL之间的相互作用向T细胞递送正共刺激信号，这通过抗原暴露增强其增殖和活化，帮助促进记忆细胞产生并重编程调节性T细胞以降低其抑制功能(Clothier和Watts，Cytokine Growth Factor Rev.[细胞因子生长因子评论](2014)1月4日；Schaer等人Curr Opin Immunol.[当前免疫学观点](2012))。
OX40(CD134；TNFRSF4)是发现的主要存在于活化的CD4+和CD8+T细胞、调控性T细胞(Treg)和自然杀伤细胞上的另一种TNF受体(Croft等人，2009，Immunol Rev.[免疫学评论]229：173-91)。OX40具有一个已知的内源性配体，OX40配体(OX40L；CD152；TNFSF4)，该OX40配体以三聚体的形式存在，并且可以使OX40聚集，在T细胞内导致有效的细胞信号传导事件(Croft等人，2009，Immunol Rev.[免疫学评论]229：173-91)。在活化的CD4+和CD8+T细胞上通过OX40信号传导导致增强的细胞因子产生、颗粒酶和穿孔素释放、以及效应和记忆T细胞池的扩增(Jensen等人，2010，Semin Oncol.[肿瘤学研讨会]37：524-32)。此外，Treg细胞上的OX40信号传导抑制Treg的扩增，停止Treg的诱导并且阻断Treg抑制功能(Voo等人，2013，J Immunol.[免疫学杂志]191：3641-50；Vu等人，2007，Blood.[血液]110：2501-10)。
免疫组织化学研究和早期流式细胞术分析显示，OX40在浸润广泛人癌症的T细胞上表达(Baruah等人，2011，Immunobiology[免疫生物学]217：668-675；Curti等人，2013，Cancer Res.[癌症研究]73：7189-98；Ladanyi等人，2004，临床癌症研究Clin Cancer Res.[临床癌症研究]10：521-30；Petty等人，2002，Am J Surg.[美国外科学杂志]183：512-8；Ramstad等人，2000，Am J Surg.[美国外科学杂志]179：400-6；Sarff等人，2008，Am JSurg.[美国外科学杂志]195：621-5；讨论625；Vetto等人，1997，Am J Surg.[美国外科学杂志]174：258-65)。在肿瘤浸润淋巴细胞上的OX40表达与若干种人类癌症中的较长生存期相关，表明OX40信号可在建立抗肿瘤免疫应答中发挥关键的作用(Ladanyi等人，2004，ClinCancer Res.[临床癌症研究]10：521-30；Petty等人，2002，Am J Surg.[美国外科学杂志]183：512-8)。
与GITR一样，CD137(4-1BB)是在活化的T细胞和NK细胞上表达的共刺激检查点分子。CD137L(CD137配体)由抗原呈递细胞表达，并且与使免疫系统消除多种癌症类型的肿瘤有关。CD137在CD8+T细胞上以比在CD4+T细胞上更高的水平表达，并且它主要共刺激CD8+T细胞。CD137的交联强烈增强T细胞的增殖、IFN-γ分泌和细胞溶解活性。此外，已报道CD137激动剂(例如抗体)与癌症疫苗和免疫检查点抑制剂协同作用以增强抗癌免疫应答。(Dharmadhikari等人，2016，Oncoimmunology[肿瘤免疫学]5(4)：e1113367)。
上述T细胞信号传导途径(和其他)各自在控制肿瘤特异性T细胞应答中起作用。然而，在诱导和维持希望的T细胞介导的抗肿瘤应答的背景下，不同T细胞信号传导途径的相对重要性仍有待阐明。实际上，不同T细胞信号传导途径之间的相互作用可以在导致治疗癌症的背景下产生协同效应。因此，本领域需要能够经由改进的T细胞信号传导途径的控制使T细胞介导的细胞毒性最大化的新颖试剂。这些试剂可以提供毒性更小，更具靶向性的抗癌疗法。
发明内容
本文提供了双特异性融合蛋白及其用于控制T细胞介导的细胞毒性的方法。
在一个方面中，本文的披露内容提供包含单链融合蛋白的双特异性融合蛋白，该单链融合蛋白包含对第一细胞表面靶标具有特异性的第一结合区、Fc单体、和对第二细胞表面靶标具有特异性的第二结合区，其中该第一结合区和该第二结合区经由肽接头与该Fc单体共价连接，并且其中该双特异性融合蛋白能够同时结合该第一细胞表面靶标和该第二细胞表面靶标。
在某些方面中，该第一结合区和该第二结合区中的至少一个是Fab片段或受体配体。
在其他方面中，Fab片段是抗PD-1或抗PD-L1 Fab片段。
在另外的方面中，一种或多种配体亚单元中的至少一种是GITRL、OX40L、TNF-α、CD137L或CD40L。
在另一个方面中，本文的披露内容提供了治疗癌症的方法，该方法包括用本文披露的双特异性融合蛋白治疗对其有需要的患者。
从以下对本披露的详细描述以及与所附权利要求一起将更全面地理解本披露的这些和其他特征和优点。应注意权利要求的范围由其中的叙述定义，而不是由本说明书中阐述的特征和优点的具体讨论定义。
附图说明
图1.考虑的双特异性融合蛋白(BFP)的示意图，包括第一结合结构域(BD1)、第二结合结构域(BD2)、和免疫球蛋白Fc区。BD2可以经由Fc区的铰链区部分附接至Fc区。BD1可以经由肽接头附接至Fc区。类似地，BD1部分的亚单元(在此示出具有3个亚单元，尽管可以考虑更少或更多)可以经由肽接头互连。
图2.考虑的融合蛋白的不同结构包括单特异性和双特异性融合蛋白。一种单特异性融合蛋白是MEDI5083，该蛋白具有相似于IgG抗体的BD1_Fc区形式，并且作为二聚化的单链融合蛋白产生，其中BD1＝2x CD40L三聚体，其中CD40L亚单元通过肽接头连接，并且Fc是单个IgG4Fc区(CH2和CH3)。MEDI5083在结构上与MEDI4736可比较(杜伐鲁单抗(Durvalumab)，一种抗PD-L1抗体，其中BD1＝抗PD-L1 F(ab)2；Fc＝IgG1 TM(“三重突变”，其中L234F/L235E/P331S在人IgG1中)。相反的是双特异性融合蛋白形式的两个迭代(BFP2和BFP3)。在示出的迭代中大小为203kDa的BFP2具有BD1_Fc_BD2形式(N至C)，其中BD1是2xCD40L三聚体，Fc是IgG4 Fc区，且BD2是2x抗PD-L1 scFv。在示出的迭代中大小为242 kDa的BFP3具有BD2_Fc_BD1格式，其中BD2是抗PD-L1 F(ab)2(例如，取自MEDI4736)，Fc是单个IgG4Fc区，且BD1是2x CD40L三聚体。
图3.考虑的BFP3的具体实施例。图3A描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2个Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6个GITRL亚单元。图3B描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2个Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6个GITRL亚单元。图3C描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2个Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6个OX40L亚单元。图3D描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2个Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6个OX40L亚单元。图3E描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2个Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6个CD40L亚单元。图3F描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2个Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6个CD40L亚单元。图3G描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2个Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6个TNF-α亚单元。图3H描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2个Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6个TNF-α亚单元。图3I描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2个Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6个CD137L亚单元。图3J描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2个Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6个CD137L亚单元。图3K描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2个Fab片段、IgG4 Fc多肽核心、和6个GITRL亚单元。图3L描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2个Fab片段、IgG4Fc多肽核心、和6个GITRL亚单元。图3M描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2个Fab片段、IgG4 Fc多肽核心、和6个OX40L亚单元。图3N描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2个Fab片段、IgG4 Fc多肽核心、和6个OX40L亚单元。图3O描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2个Fab片段、IgG4 Fc多肽核心、和6个CD40L亚单元。图3P描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2个Fab片段、IgG4 Fc多肽核心、和6个CD40L亚单元。图3Q描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2个Fab片段、IgG4Fc多肽核心、和6个TNF-α亚单元。图3R描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2个Fab片段、IgG4 Fc多肽核心、和6个TNF-α亚单元。图3S描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2个Fab片段、IgG4 Fc多肽核心、和6个CD137L亚单元。图3T描绘了双特异性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2个Fab片段、IgG4Fc多肽核心、和6个CD137L亚单元。
图4.另外的特异性BFP3形式化的双特异性融合蛋白：抗PD-L1_Fc_TNF-α(A)，抗PD1_Fc_OX40L(B)；和抗PD1_Fc_GITRL(C)。抗PD-L1 F(ab)片段衍生自MEDI4736，且抗PD-1F(ab)片段衍生自抗PD1抗体(LO115)。TNF-α、OX40L、和GITRL结合结构域各自包括2组经由肽接头连接在一起的每个蛋白质亚单元的三聚体重复。
图5A-5D.BFP 2和3与CD40和PD-L1结合。图5A-5D证明了通过Octet测定经由抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L BFP 2和3分子的CD40和PD-L1蛋白的并行结合。
图6A和6B.BFP2和BFP3保留结合CD40的能力。在基于流式细胞术的测定中，与亲本CD40L FP(融合蛋白)相比，抗-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L BFP 2和3分子证明了与细胞表面CD40结合的类似的能力。
图7A和7B.BFP2和BFP3与细胞表面上的PDL1具有较低的结合。图7证明抗PD-L1_IgG4Fc_CD40L FP BFP 2和3分子可以在基于流式细胞术的测定中结合细胞表面PD-L1蛋白。
图8A和8B.BFP与混合的PBMC结合。图8证明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2和3分子以剂量依赖性方式结合人PBMC亚组，类似于基于流式细胞术的测定中的亲本抗PD-L1和CD40L FP。
图9.BFP2和BFP3保留了刺激CD40信号传导通路的能力。图9证明抗PD-L1_IgG4Fc_CD40L FP BFP 2和3分子活化NF-κB信号传导途径，该途径是关于多种细胞类型的CD40活化的下游。
图10.BFP3阻断PD-L1和PD1相互作用并增强Jurkat T细胞中的NFAT信号传导。图10证明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2和3分子阻断PD-L1-PD1相互作用，导致Jurkat细胞中NFAT途径的活化。
图11.BFP刺激CD40并阻断PD1-PDL1相互作用。图11A阐明了共刺激测定概念示意图。图11B示出了抗PD-L1-CD40L BFP具有双重功能：其通过CD40接合活化THP-1细胞上的NF-κB，并通过去除PD-L1介导的抑制来增强Jurkat细胞中的NFAT活性。
图12.BFP3在SEB测定中具有优异的IL-2诱导活性。图12示出了来自葡萄球菌肠毒素B(SEB)测定的结果，证明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2和3分子比亲本分子CD40LFP和抗PD-L1的组合诱导更多的IL-2产生。
图13.PD-1/GITRL双特异性抗体(MEDI3387和MEDI5771)在SEB测定中增加T细胞活化相对于单一试剂。图13证明MEDI3387和MEDI5771具有与亲本分子的组合等效，但是比单独的任一亲本分子更大的活性。结果在两个批次中是可比较的，并且证明了与T细胞再活化测定类似的结果。
图14.BFP3在M1巨噬细胞-T MLR测定中诱导稳健的IFN-γ和IL-12产生。图14示出了来自巨噬细胞-T细胞MLR测定的结果，证明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2和3分子比亲本分子CD40L FP和抗PD-L1的组合诱导更多的IFN-γ和IL-12产生。
图15.BFP3在单-T MLR测定中诱导稳健的IFN-γ产生。图15示出了来自单核细胞-T细胞MLR测定的结果，证明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2和3分子比亲本分子CD40LFP和抗PD-L1的组合诱导更多或相等量的IFN-γ产生。
图16.在CMV回忆测定中，BFP3示出了优于组合的活性。图16示出了来自CMV抗原回忆测定的结果，证明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3分子比亲本分子CD40L FP和抗PD-L1的组合诱导更多的IFN-γ、IL-12、和IL-10产生但类似水平的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8。
图17A-B.BFP3可能潜在地改变CD40和PD-L1的膜定位。图17A阐明了CD40和PD-L1在抗原呈递细胞(APC)上共表达。图17B示出了用于研究细胞表面CD40和PD-L1蛋白的基于流式细胞术的测定的概念示意图。
图18.BFP3诱导MDA-MB-231细胞上CD40和PD-L1的下调。图18示出了来自基于流式细胞术的测定的结果，证明在治疗后1小时和96小时仅抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3分子可以诱导CD40和PD-L1分子的下调。
图19.BFP3诱导MDA-MB-231细胞上CD40和PD-L1的下调。图19示出了来自蛋白质印迹的结果，证明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3分子在治疗后24小时诱导总PD-L1蛋白含量的下调。NS＝无刺激。
图20.BFP3刺激后THP1细胞中表面CD40和PD-L1的损失。图20示出了用于研究细胞表面CD40和PD-L1蛋白的测定的概念示意图，其中采用连续性刺激。
图21.BFP3刺激后THP1细胞中表面CD40和PD-L1的损失。图21示出了来自基于流式细胞术的测定的结果，证明在治疗后0.5小时至3小时抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3分子诱导表面CD40和PD-L1的下调。
图22.BFP3刺激后THP1细胞中表面PD-L1的损失。图22示出了测定的概念示意图，该测定用于在1小时处理后，随后洗掉测试材料，研究细胞表面CD40和PD-L1蛋白。
图23.BFP3刺激后THP1细胞中表面PD-L1的损失。图23示出了来自关于THP-1细胞的基于流式细胞术的测定的结果，证明用抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3分子瞬时处理1小时诱导细胞表面CD40和PD-L1蛋白的下调。在24小时，仅在细胞表面检测到CD40。
图24.BFP3处理的moDC具有较低量的PD-L1蛋白。图24示出了来自基于流式细胞术的测定的结果，证明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3和CD40L FP分子在调节CD40、CD86、和PD-L1的细胞表面表达之间的分化作用：PD-L1的下调仅在BFP3处理的细胞中实现。
图25.BFP3处理的moDC具有较低量的PD-L1蛋白。图25示出了来自蛋白质印迹的结果，证明PD-L1蛋白质的量在抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3处理的条件下比仅CD40L FP或CD40L FP加抗PD-L1的处理的情况下少得多。
图26.血液单核细胞上的表面CD40和PD-L1的损失。图26示出了来自基于流式细胞术的测定的结果，证明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3和CD40L FP分子在调节CD40和PD-L1的细胞表面表达之间的分化作用：PD-L1的剂量依赖性下调仅在BFP3处理的细胞中实现。
图27.mBFP3诱导Renca细胞中鼠PD-L1的降解。图27示出了来自蛋白质印迹的结果，证明鼠PD-L1蛋白质的量在抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3处理的条件下比仅CD40LFP或CD40L FP加抗PD-L1的处理的少得多。
图28.PD-L1交联增加BFP3介导的NF-κB活性。图28示出了ES2细胞表面上的交联PD-L1可以增强由BFP3介导的THP-1细胞上的NF-κB作用。Y轴示出了NF-κB报告基因活性。
图29.IgG4Fc和FcγRI相互作用调节BFP3活性。图29示出了FcγR可以加强通过BFP3介导的THP-1细胞上的NF-κB作用。
图30A-F.mBFP3处理的小鼠的体重减轻较少(单次剂量治疗)。图30A-F示出了来自关于野生型小鼠和植入B16F10肿瘤细胞的小鼠的多项研究的结果。示出了来自个体小鼠的治疗后体重的变化。
图31.mBFP3处理的小鼠的体重减轻较少(多剂量治疗)。图31示出了来自关于植入B16F10肿瘤细胞的小鼠的多剂量研究的结果。示出了来自个体小鼠的治疗后体重的百分比变化。
图32.mBFP3治疗有效地抑制肿瘤生长。图32示出了来自关于植入B16F10肿瘤细胞的小鼠的多剂量研究(每周两次x 2周)的结果。示出了来自个体小鼠的治疗后肿瘤体积的变化。
图33A-C.降低BFP3的给药频率可预防副作用。图33A-C示出了来自关于植入B16F10肿瘤细胞的小鼠的减少的剂量研究(一次或两次给药)的结果。来自个体小鼠的治疗后体重的变化示于图33A中。图33B示出了肿瘤体积的变化，且图33C示出了血清丙氨酸转氨酶(ALT)的水平。
图34.mBFP3治疗诱导了T细胞的活化/分化。图34示出了来自关于从携带B16F10肿瘤的小鼠中回收的T细胞的流式细胞术研究的结果。确定T细胞亚组的百分比并以图示出。
图35.mBFP3治疗诱导效应/记忆CD8T细胞分化。图35示出了来自研究从携带B16F10肿瘤的小鼠中回收的T细胞的流式细胞术测定的结果。确定效应CD8T细胞亚组的百分比并以图示出。
图36.小鼠中的MEDI7526不诱导TNF-α或IL-6，这两种免疫相关毒性的关键介体。图36示出了MEDI7526的抗肿瘤功能似乎不需要TNF-α和IL-6。
图37.MEDI7526小鼠替代物在小鼠中诱导不同的细胞因子谱(单次经静脉内给药研究)。
图38.PD1-OX40L在Jurkat/OX40细胞中诱导NF-κB活化。图38证明抗PD-L_IgG4Fc_OX40L FP BFP3分子在用OX40转染的Jurkat细胞系中活化NF-κB信号传导途径。
图39.小鼠OX40配体(mOX40L)融合蛋白(FP)、抗小鼠PD-L1单克隆抗体(mAb)或mOX40L FP和抗PD-L1mAb的组合对小鼠同系模型MCA205和CT26细胞系生长的影响。
图40A-C.PDL1/OX40L FP BFP2(MEDI5615)的PD-L1依赖性肿瘤定位。
图41.不同分子形式的PD-L1/OX40L双特异性分子的荷瘤小鼠的生物分布。
图42.用于测量双特异性分子的生物活性的细胞系统。
图43.BFP2具有PD-L1介导的OX40聚集的最佳效价。RLU＝相对光单位；M＝摩尔浓度。
图44.MEDI5615(PDL1/OX40L BFP2)和scOX40L在天然CD4+CD25+Treg细胞存在下增加T效应物增殖并降低产生IL-10的T调节细胞的频率。误差条表示来自一式两份测定孔的平均值的标准误差。
图45A-B.示出了葡萄球菌肠毒素B(SEB)共刺激测定中PDL1/OX40L FP BFP2(MEDI5615)和OX40/PDL1双特异性mAb的活性。
图46A-F.示出了PD-L1/OX40L BFP2与工程化以表达人或食蟹猴OX40、PD-L1、或OX40和PD-L1两者的CHO细胞的结合。误差条代表平均值的标准偏差。MFI＝平均荧光强度。
图47.PD1-OX40L触发人PBMC中PD1的降解。图47示出了来自蛋白质印迹的结果，证明PD-1蛋白水平在抗PD-1_IgG4 Fc_OX40L FP BFP3处理的条件下降低，但OX40蛋白水平未变化。
图48.MEDI3387触发人PBMC中PD1的降解。图48示出了来自蛋白质印迹的结果，证明PD-1蛋白水平在抗PD-1_IgG4 Fc_GITRL FP BFP3处理的条件下降低，但GITR蛋白量未变化。PD-1/GITRL FP Bis；MEDI5771(IgG1形式)和MEDI3387(IgG4P)；GITRL：MEDI1873。
图49.MEDI3387在Jurkat/GITR细胞中诱导NF-κB活化。四小时刺激。图49证明抗PD-L_IgG4 Fc_GITRL FP BFP3分子在用GITR转染的Jurkat细胞系中活化NF-κB信号传导途径。
图50.PD1/GITR双特异性分子可以同时与两个靶标结合。图50证明了通过Octet测定通过抗PD1_IgG4 Fc_GITRL FP BFP2(MEDI3387)和抗PD1_IgG1 Fc_GITRL FP BFP2(MEDI5771)分子并行结合PD1和GITR蛋白。“A”＝MEDI3387；“B”＝BFP2-PD1(0075)-GITRL(sc)-G4P；“C”＝BFP2-GITRL(sc)-G4P。
图51.BFP3阻断PD-L1和PD1相互作用并增强Jurkat T细胞中的NFAT信号传导。图51证明MEDI3387(BIOAE003)和MEDI5771(BIOAE005)分子阻断PD-L1-PD1相互作用，导致Jurkat细胞中NFAT途径的活化。BIOAE003和BIOAE005证明与MEDI1873(GITRL)和亲本抗PD1IgG可比较的效力。
图52.PD1/GITR双特异性分子相当于B16小鼠模型中GITRL-FP和PD-1mAb的组合。
图53A-B.用MEDI3387和MEDI5771治疗后CD4+和CD8+总记忆T细胞(Ki67)的剂量依赖性增加。图53A-B示出了在用改变的剂量的MEDI3387和MEDI5771处理的食蟹猴中的药代动力学(PK)和药效学(PD)研究的结果。
图54.单次静脉内注射后雄性食蟹猴的平均血清MEDI3387和MEDI5771浓度-时间曲线。IV＝静脉内；误差条代表平均值的标准偏差；LLOQ(黑色虚线)＝定量下限。低于LLOQ的数据(0.050mg/L；如黑色虚线示出的)绘制在LLOQ的一半，仅用于说明性目的。
图55A-E.PD1/GITR双特异性分子可以同时与两个靶标结合。图55A证明CytostimT细胞再活化测定的测定示意图。图55B证明在PD1/GITR IgG4P BFP(MEDI3387)和亲本分子情况下的结果。图55C证明在PD1/GITR IgG4P BFP(MEDI5771)和亲本分子情况下的结果。
图56.示出了GITRL在体内的荧光生物分布。
图57A-B.抗PDL1-TNFα诱导T24肿瘤细胞中鼠PD-L1的下调；APC-每个细胞的抗原。图57A示出了来自基于流式细胞术的测定的结果，证明抗PD-L1_IgG4 Fc_TNFαFP BFP3治疗下调T24肿瘤细胞上的PD-L1。图57B示出了抗PD-L1_IgG4 Fc_TNFαFP BFP3治疗不影响细胞活力。
图58.抗PDL1-TNF-αBFP可刺激THP1骨髓细胞。图58证明抗PD-L1_IgG4 Fc_TNF-αFP BFP3分子活化NF-κB信号传导途径，该信号传导途径是TNF-α受体活化的下游。
图59.BFP3驱动CD40和PD-L1的同时内化，其不会与亲本试剂的组合一起发生。图59是一个概念示意图，该概念示意图描绘了包括抗PD-L1和CD40L结合结构域的BFP分子且示出了BFP分子可内化细胞表面上的两个靶标(CD40和PD-L1)，导致PD-L1蛋白质的降解。CD40对降解具有抗性，且随后在细胞表面回收表达。
图60.报告基因测定方案。图A示出了模型疾病状态，其中由于通过PD-1/PD-L1复合物形成的抑制，从抗原呈递细胞的没有因抗CD3/抗CD28活化发生信号(无测定应答)。相反，图B描绘了经由抗PD-1抗体成功阻断PD-1/PD-L1复合物形成，其导致在抗CD3/抗CD28活化后报告基因分子(荧光素酶)表达。
图61.显示了比较IgG1 TM和IgG4形式的抗PD-L1/CD40L FP BFP3的SEB测定结果。
图62.显示了比较IgG1 TM和IgG4形式的抗PD-L1/CD40L FP BFP3的CMV回忆测定结果。
图63.显示了抗PD-1-抗OX40Bis2在Jurkat细胞中不诱导NfkB活化，而抗PD-1-OX40L FP BFP3却诱导。
图64.显示了Bis2构建体触发PD1降解，表明PD1的降解独立于OX40激动剂功能。
图65. 5FU和MEDI7526(抗PDL1-CD40L BFP3)的组合治疗有效抑制肿瘤生长。图65示出了来自动物研究的结果，其中将多剂量的5FU(第11天)和MEDI7526(第14、21、和28天)的顺序治疗给予携带CT26肿瘤细胞的小鼠。示出了来自个体小鼠的治疗后肿瘤体积的变化。5FU加MEDI7526的治疗增强了由单独MEDI7526治疗介导的抗肿瘤应答。
图66.肝和脾是MEDI7526的鼠替代物的靶器官。图66A示出了MEDI5083和MEDI7526的鼠替代物在肝和脾中累积。图66B示出了人Kupffer细胞(肝中的居住巨噬细胞)表达CD40和PD-L1，表明MEDI7526可靶向肝中的Kupffer细胞。
图67.MEDI7526可有效抑制肝肿瘤的生长。图67A示出了肝肿瘤模型的设计，其中将CT26-荧光素酶肿瘤细胞直接植入肝脏中。在第21天，在尸体剖检后回收肝，并通过成像荧光素酶活性定量肝中的肿瘤负荷。图67B示出了来自MEDI7526处理的小鼠的肝中的肿瘤负荷(表示为亮度单位)与同种型对照处理的动物中的那些相比显著降低。
图68.MEDI7526治疗从CT26肝肿瘤模型研究中诱导肝中的T细胞扩增和活化。图68A示出了与对照小鼠相比，接受MEDI7526的小鼠肝中CD8T细胞的数量增加。图68B示出了从MEDI7526处理的动物分离的肿瘤抗原特异性CD8T细胞具有更高百分比的活化的亚型。
图69.在CT26肝肿瘤模型中，MEDI7526的治疗比MEDI5083和抗PDL1的组合治疗更可耐受。图69A示出了与MEDI5083或MEDI5083加抗PDL1治疗相比，MEDI7526治疗的小鼠体重减轻较少。示出了来自个体小鼠的单次剂量治疗后体重的变化。图69B示出了mMEDI5083加抗鼠PDL1组的死亡率相对较高。
图70.另外的特异性BFP3形式化的双特异性融合蛋白：抗PD1-Fc-OX40L野生型(A)、抗PD1-Fc-OX40L 2WT(B)、和抗PD1-Fc-OX40L 1WT(C)。抗PD-1F(ab)片段衍生自抗PD1抗体(LO115)。OX40L部分具有保守的野生型序列(A)或在残余的F180(B和C)上具有突变。
图71.抗PD1-Fc-OX40L 2WT和1WT降低了对人T细胞系的OX40激动剂功能。图71A和B示出了与抗PD1-Fc-OX40L相比，抗PD1-Fc-OX40L 2WT轻微降低了结合和内化。图71C示出了抗PD1-Fc-OX40L 2WT和1WT降低了活化NFκB途径的能力。
图72A和72B.与初级人T细胞上的抗PD1-OX40L相比，抗PD1-Fc-OX40L 2WT和1WT具有类似的结合和内化。在来自两个健康供体的纯化的CD4和CD8T细胞上产生数据。
图73A和73B.抗PD1-Fc-OX40L 2WT降低了对人初级T细胞的OX40激动剂功能。使用人T细胞刺激和CMV回忆测定比较PD1-OX40L和PD1-OX40L 2WT。与PD1-OX40L相比，PD1-OX40L 2WT诱导了少得多的炎症细胞因子，其在OX40L上不携带任何突变。
图74.抗PD1-Fc-OX40L 2WT和1WT诱导了人T细胞上的PD1降解。活化的人T细胞表达PD1蛋白，并且在抗PD1-OX40L、抗PD1-OX40L 1WT或抗PD1-OX40L 2WT治疗后，总PD1蛋白的量显著减少。图74A示出了代表性的蛋白质印迹图片，且图74B示出了来自三个供体的合并的结果。
具体实施方式
定义
除非另外说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本披露所属领域的技术人员通常理解的含义。以下的参考文献为技术人员提供了本披露所用的多个术语的通用定义：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology[微生物学和分子生物学词典](第2版1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology[剑桥科技词典](Walker编著，1988)；The Glossary of Genetics[遗传学词汇]，第5版，R.Rieger等人(编著)，斯普林格出版社(Springer Verlag)(1991)；以及Hale和Marham，TheHarper Collins Dictionary of Biology[哈珀科林斯生物学词典](1991)。除非另外指明，否则如本文所使用的以下术语具有以下赋予它们的含意。
术语“T细胞介导的细胞毒性”是指由细胞毒性T淋巴细胞(例如感染的细胞或癌性细胞)靶向杀死细胞。
术语“抗肿瘤活性”意指任何减少或预防肿瘤细胞的增殖或存活增加的生物活性。在一个实施例中，该抗肿瘤活性是抗肿瘤免疫应答。
术语“免疫调节剂”是指增强免疫应答(例如抗肿瘤免疫应答)的试剂。本披露的示例性免疫调节剂包括抗体，抗PD-L1抗体，及其片段，连同蛋白质，例如融合蛋白、双特异性融合蛋白、和/或其片段。
术语“CD40L多肽”意指表明与NCBI登录号NP_000065具有至少约85％氨基酸同一性、并且具有CD40结合活性的多肽或其片段。术语“CD40L”是指全长CD40L和可溶性片段两者(例如由蛋白水解生成的CD40L的细胞外结构域形式)，和CD40L的单体形式以及寡聚形式(例如三聚CD40L)。人CD40L的膜结合和可溶形式的氨基酸序列如下所示。
“CD40多肽”意指与NCBI登录号NP_001241具有至少约85％氨基酸同一性、并且具有CD40L结合活性的多肽或其片段。以下提供了示例性CD40氨基酸序列(SEQ ID NO：22)。
“PD-L1多肽”意指与NCBI登录号NP_001254635具有至少约85％氨基酸同一性、并且具有PD-1和CD80结合活性的多肽或其片段。以下提供了示例性PD-L1氨基酸序列(SEQ IDNO：23)。
“抗PD-L1抗体”意指选择性结合PD-L1多肽的抗体。示例性抗PD-L1抗体描述于，例如美国专利号8，779，108和美国专利申请公开号2014/0356353，其通过引用并入本文。度伐鲁单抗(MEDI4736)是示例性抗PD-L1抗体。其他抗PD-L1抗体包括BMS-936559(美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))和MPDL3280A(罗氏公司(Roche))。
“PD-1多肽”意指与NCBI登录号NP_005009具有至少约85％氨基酸同一性、并且具有PD-L1结合活性的多肽或其片段。以下提供了示例性PD-1氨基酸序列(SEQ ID NO：32)。
“PD-1核酸分子”意指编码PD-1多肽的多核苷酸。示例性PD-1核酸分子序列以NCBI登录号NM_005018提供。
术语“GITRL多肽”意指表明与SEQ ID NO：33具有至少约85％氨基酸同一性、并且具有GITR结合活性的多肽或其片段。术语“GITRL”是指全长GITRL和可溶性片段两者(例如由蛋白水解生成的GITRL的细胞外结构域形式)，和GITRL的单体形式以及寡聚形式(例如三聚GITRL)。人GITRL的膜结合和可溶形式的氨基酸序列如下所示。
术语“TNF-α多肽”意指表明与NCBI登录号NP_000585.2具有至少约85％氨基酸同一性的多肽或其片段。术语“TNF-α”是指全长TNF-α和可溶性片段两者(例如由蛋白水解生成的TNF-α的细胞外结构域形式)，和TNF-α的单体形式以及寡聚形式(例如三聚TNF-α)。人TNF-α的膜结合和可溶形式的氨基酸序列如下所示。
如本文所使用的“OX40多肽”意指与NCBI登录号NP_003318具有至少约85％氨基酸一致性的多肽或其片段。OX40是受体TNFR超家族中的在抗原活化的哺乳动物CD4+和CD8+T淋巴细胞的表面上表达的成员。OX40受体序列是本领域中已知的并且例如以GenBank登录号：AAB33944或CAE11757提供。
术语“OX40L多肽”意指表明与NCBI登录号NP_003317具有至少约85％氨基酸同一性、并且具有OX40结合活性的多肽或其片段。术语“OX40L”是指全长OX40L和可溶性片段两者(例如由蛋白水解生成的OX40L的细胞外结构域形式)，和OX40L的单体形式以及寡聚形式(例如三聚OX40L)。人OX40L的膜结合和可溶形式的氨基酸序列如下所示。
术语“CD137L”意指表明与NCBI登录号NP_001552.2具有至少约85％氨基酸同一性、并且具有CD137结合活性的多肽或其片段。术语“CD137L”是指全长CD137L和可溶性片段两者(例如由蛋白水解生成的CD137L的细胞外结构域形式)，和CD137L的单体形式以及寡聚形式(例如三聚CD137L)。人CD137L的膜结合和可溶形式的氨基酸序列如下所示。
如在本披露中所使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段或衍生物，并且涵盖包含抗原结合位点的任何多肽，无论它是在体外或在体内生产的。该术语包括但不限于：多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、非特异性、人源化、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、融合蛋白以及接合的抗体。除非用术语“完整”另外修饰，如在“完整抗体”中，出于本披露的目的，术语“抗体”还包括抗体片段如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb和保留抗原结合功能(即特异性结合例如PD-1或PD-L1的能力)的其他抗体片段及其组合。典型地，此类片段将包含抗原结合结构域。此外，此类片段可以与其他组合以形成多抗原结合融合蛋白。
术语“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”和“结合片段”是指包含负责抗体和抗原之间特异性结合的氨基酸的抗体分子的一部分。在抗原很大的情况下，抗原结合结构域可以仅结合到该抗原的一部分。负责与抗原结合结构域特异性相互作用的抗原分子的一部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。抗原结合结构域典型地包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)，然而，它不一定包括两者。例如，所谓的Fd抗体片段仅由VH结构域组成，但是仍然保留完整抗体的一定抗原结合功能。
抗体的结合片段通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解来产生。结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv以及单链抗体。除了“双特异性”或“双功能”抗体以外，抗体应理解为具有同一的结合位点。使用酶(木瓜蛋白酶)来消化抗体的结果是两个同一的抗原结合片段，又称为“Fab”片段和“Fc”片段，它们不具有抗原结合活性但具有结晶的能力。用酶(胃蛋白酶)来消化抗体的结果是F(ab′)2片段，其中该抗体分子的两个臂保持连接并且包含两个抗原结合位点。F(ab′)2片段具有交联抗原的能力。当本文使用时，“Fv”是指保留了抗原识别和抗原结合位点两者的抗体的最小片段。当本文使用时，“Fab”是指包含轻链的恒定结构域和重链的CH1结构域的抗体的片段。
术语“mAb”是指单克隆抗体。本披露的抗体包含但不限于：全天然抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、Fab、Fab′、单链V区片段(scFv)、融合多肽、非常规抗体及其组合。
在本披露中，“包含(comprises、comprising)”、“含有(containing)”和“具有(having)”等可以具有美国专利法赋予它们的意义并且可以意指“包括(includes、including)”等；“基本上由……组成(consisting essentially of或consistsessentially of)”同样具有美国专利法赋予的意义并且该术语是开放性的，允许超出所叙述的存在，只要所叙述的基本或新颖特征不被超过叙述的存在改变，但是排除现有技术实施例。
如本文所使用的术语“确定”、“评估”、“测定”、“测量”和“检测”是指定量和定性确定两者，并且正因如此，术语“确定”本文可与“测定”、“测量”、等等互换使用。其中定量确定为目的时，使用短语“确定分析物以及类似物的量”。其中定性和/或定量确定为目的时，使用短语“确定分析物的水平”或“检测”分析物。
如本文所使用的术语“Fc结构域”结构域是指抗体恒定区的一部分。传统上，术语Fc结构域是指涵盖抗体的配对CH2、CH3和铰链区的蛋白酶(例如，木瓜蛋白酶)裂解产物。在本披露的上下文中，术语Fc结构域或Fc是指不管产生手段的任何多肽(或编码这样一种多肽的核酸)，其包括免疫球蛋白多肽的CH2、CH3和铰链区的全部或一部分。
术语“融合多肽”或“融合蛋白”是指包含两种或更多种不同多肽的多肽或非天然存在于相同多肽中的其活性片段。在不同的实施例中，两种或更多种不同多肽通过肽键或肽接头共价地可操作地连接(例如化学地连接或框内融合)在一起。例如，双特异性融合蛋白可包括一个或多个Fab和/或Fab′片段、Fc片段或区(例如，不具有或不具有铰链区的CH2和CH3)、和/或附接至一个或多个Fab和/或Fab′片段或Fc片段的融合蛋白。
在两个或更多个核酸或多肽的上下文中，术语“同一”或百分比“同一性”是指当比较和比对(如有必要，引入缺口)以获得最大对应性(不考虑任何保守氨基酸取代作为序列同一性的一部分)时相同或具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列。百分比同一性可以使用序列比较软件或算法或者通过目测测量。本领域中已知有可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的不同算法和软件(参见例如Karlin等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]，87：2264-2268，如在Karlin等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]，90：5873-5877中的改进，并且并入NBLAST和XBLAST程序(Altschul等人，1991，Nucleic Acids Res.[核酸研究]，25：3389-3402)。在某些实施例中，有缺口的BLAST可以如Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res.[核酸研究]25：3389-3402中所述的使用。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等人，1996，Methods in Enzymology[酶学方法]，266：460-480)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech[基因泰克公司]，南旧金山，加利福尼亚)或Megalign(DNASTAR)。
术语“分离的”是指基本上不含存在于其天然环境中的其他元素的分子。例如，分离的蛋白质基本上不含来自于细胞或其衍生的组织源的细胞材料或其他蛋白质。术语“分离的”也指制剂，其中分离的蛋白质是足够纯的而作为药物组合物给予，或是至少70％-80％(w/w)纯的，更优选地是至少80％-90％(w/w)纯的，甚至更优选地是90％-95％纯的；并且最优选地是至少95％、96％、97％、98％、99％、或100％(w/w)纯的。
术语“参考”指的是比较的标准。
术语“特异性结合”是指一种试剂(例如，CD40L、GITRL、OX40L、或CD137L)识别并结合一种分子(例如分别地，CD40多肽、GITR多肽、OX40多肽、或CD137多肽)，但是其基本上不识别并结合样品(例如生物样品)中的其他分子。例如，特异性结合的两个分子形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合的特征在于高亲和力和区别于非特异性结合的低等至中等容量，非特异性结合通常具有中等至高等容量的低亲和力。
术语“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，如牛、马、犬、羊或猫。
本文提供的范围被理解为对该范围内的所有值的简写。例如，1到50的范围应当理解为包括来自下组的任何数字、数字组合或子范围，该组由以下各项组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
如本文所使用的术语“治疗(treat、treating、treatment等)”是指减少和/或改善障碍和/或与其相关的症状。将被理解的是，尽管不能排除，但是治疗障碍或病症并不要求完全地消除该障碍、病症或与其相关的症状。例如，如本文所考虑的，障碍的治疗包括预防障碍症状的恶化。
如本文所使用的术语“或”应理解为包括在内，除非明确说明或从上下文显而易见与之相反。如本文所使用的术语“一种(a)”、“一个(an)”和“该(the)”被理解为单数的或复数的，除非明确说明或从上下文显而易见与之相反。
此外，当在本文使用时，“和/或”应被理解为这两个或更多个指定的特征或组分每一者与或不与另一者的特定披露。因此，术语“和/或”如本文在词组例如“A和/或B”中使用时，旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、以及“B”(单独)。同样，术语“和/或”如在词组例如“A、B和/或C”中使用时，旨在涵盖以下的实施例中的每一者：A、B、和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；和A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
除非明确声明或从上下文显而易见，否则如本文所使用的术语“约(about)”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均数的2个标准偏差之内。“约”可以被理解为在声明值的多于或少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％之内。除非另有说明，否则本文提供的所有数值均被考虑为由术语“约”隐含地修饰。
本文变量的任何定义中对化学基团清单的叙述包括将所述变量定义为任何单个基团或所列基团的任何组合。对本文变量或方面的实施例的叙述包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分任何组合的实施例。
可以将本文提供的任何组合物或方法与本文提供的任何其他组合物和方法中的一种或多种进行组合。
综述
本披露提供了若干种融合蛋白(FP)，并且特别是双特异性融合蛋白(BFP)，其是多价的并且被设计用于控制T细胞介导的抗癌免疫应答。在一个非排他性实施例中，考虑的BFP包括第一结合结构域(BD1)、第二结合结构域(BD2)、和免疫球蛋白Fc区，包括例如CH2和CH3结构域(参见图1)。BD1和BD2可以各自分别包括抗原结合结构域、抗原结合片段、结合片段、受体激动剂、拮抗剂或配体等中的一种或多种。在一个具体的实例中，BD1和BD2中的至少一个是Fab结构域、scFv、单结构域抗体、和抗体可变结构域。
在一些实施例中，一些BFP的BD1、BD2、和Fc区可以通过一个或多个接头(例如肽接头)连接在一起。以这种方式，在一些实施例中，考虑的BFP可以是遗传编码的，表达可以在宿主细胞内表达和组装的单链融合蛋白(scfp)。
在一些实施例中，BD1和BD2结合结构域各自保留与其各自靶标(例如，表位、蛋白质、和/或受体)类似的结合能力和功能，作为其亲本(天然的，未结合的)成分组分。在一个实施例中，考虑的BFP的双特异性结合能力允许单个BFP同时接合和/或结合单个细胞表面上(即，顺式相互作用)或相邻细胞的细胞表面上(即，反式相互作用)的两个分子靶标。在一些实施例中，考虑了可以分别或同时引起顺式和反式相互作用的BFP。
如本文考虑的，不同的BFP构型是可能的，例如见于以下图2和表1中。
表1.示例性双特异性融合蛋白.
Figure BDA0002478719010000251
Figure BDA0002478719010000261
在一个特定的实施例中，考虑本文披露的任何形式的BFP，这些BFP掺入至少一个结合结构域，所述至少一个结合结构域靶向任何TNF超家族成员，与靶向任何其他细胞表面蛋白的另一结合结构域配对。本文考虑的BFP结合结构域TNF超家族成员的另外的实例包括LIGHT、CD30L、CD27L、和TL1a，它们可以掺入BFP2或BFP3形式。
作用机制
在一些优选的实施例中，本披露的特征在于BFP3形式的双特异性融合蛋白，包括一个或多个N末端抗原结合亚单元、中央Fc多肽核心、和一个或多个C末端配体蛋白。在一个实施例中，一个或多个N末端抗原结合亚单元(BD2)可以是抗PD-1和/或抗PD-1L抗原结合亚单元，中央Fc多肽核心可以是IgG1或IgG4Fc区多肽(CH2和CH3)，并且一个或多个C末端配体蛋白(BD1)可包括，例如，GITRL、OX40L、CD40L、TNF-α、和/或CD137。
在一个实施例中，图1-4中示出的BFP3形式当存在于不同细胞上时(反式相互作用)允许共选择BD1和BD2靶标，导致与骨髓细胞上的Fcγ受体连接的下游信号传导途径的活化。使用MEDI7526(参见表1)作为实例，在CD40刺激的背景下，FcγRI接合可以比加成的NF-κB活化有更大的驱动。
在一些实施例中，BD1与其靶标(例如，细胞受体)的结合可以触发结合复合物的内化并开始信号级联(例如，促进T细胞活化和/或复制)或抑制信号级联(例如，去除抑制性阻断)。例如，BD1结合和内化导致BD2及其靶标，例如PD1或PD-L1在细胞内内化。PD1/PD-L1的强制内化触发其降解，导致细胞表面上长时间PDl/PD-L1的不存在。这是通过从细胞表面去除PD1/PDL1以促进T细胞介导的免疫应答来减弱PD1/PD-L1抑制功能的新颖方法。
在一个实施例中，考虑的BFP是二聚化的单链融合蛋白骨架亚单元，并且例如包括经由二硫键连接的两个同一的单链融合蛋白。每个单链融合蛋白的单独组分可以经由肽接头连接。考虑的肽接头可以是允许所希望的双特异性融合蛋白的功能形成的任何长度，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20或更多个氨基酸。在一个具体的实施例中，考虑了在所考虑的融合蛋白的单独组分之间具有9个氨基酸或更长的肽接头。已经发现，考虑的双特异性融合蛋白中9个或更多个氨基酸的肽接头保持稳定性和/或不引起这种融合蛋白的聚集。事实上，已证明宽范围的接头长度在本披露的双特异性融合蛋白中比其他地方所表明的具有良好耐受性。
已示出本披露的单链双特异性融合蛋白是稳定的并且展现出生物活性。如本文所述的，双特异性融合蛋白稳定性和活性至少部分是由于本披露的双特异性融合蛋白中使用的接头的长度。长度大于9个氨基酸的接头不会出现任何聚集和/或稳定性的显著问题。本披露的双特异性融合蛋白还提供单链Fc蛋白的其他特征和优点。
BD1抗原结合结构域
考虑可用于控制T细胞介导的免疫应答的任何TNF-α家族成员用于本文。考虑的TNF-α家族成员的具体实例包括CD40L、GITRL、OX40L、TNF-α、和CD137L。已知TNF配体家族的天然存在的可溶性细胞因子成员展示出它们作为同源三聚体的生物活性。然而，TNF配体的三聚体复合物倾向于经由它们的单体的解离而变性，并且难以从重组单体单元制备。为了防止同源三聚体解离成单体，TNF配体的至少三个单体经由它们的C-末端和N-末端通过肽接头彼此共价连接，以形成“单链(sc)”分子。因此，整个分子(具有两个肽接头的TNF配体家族成员的至少三个单体)由单个蛋白链组成，这样使得不再能够发生解离成单体。
此外，如在本披露的单链融合蛋白中，将TNF配体与Fc结构域融合可用于获得二聚化三聚体。可溶性结构域的二聚化是经由二硫桥键组装两个Fc结构域完成的。细胞或邻近细胞上单链TNF配体的局部富集具有增加这些融合蛋白的生物活性的潜力。
BD2抗原结合结构域
选择性结合PD-1和PD-L1并且抑制PD-1和PD-L1的结合或活化的抗原结合区，例如Fab片段可用于本披露的BFP。Fab(抗原结合片段)片段由通过恒定区之间的二硫键共价连接的VH-CH1和VL-CL结构域组成。为了克服Fv中非共价连接的VH和VL结构域在宿主细胞中共表达时解离的倾向，可构建一个所谓的单链(sc)Fv片段(scFv)。在scFv中，柔性和足够长的多肽将VH的C-末端链接至VL的N-末端或将VL的C-末端链接至VH的N-末端。在一些实施例中，本文考虑的接头肽包括GGGGS(Gly4Ser)肽(SEQ ID NO：43)的多聚体，但是其他接头也是本领域已知的并且可以在本文中使用。例如，可能的接头是15-残基(Gly4Ser)3肽(SEQID NO：34)。
本披露的BD2抗原结合结构域(例如，对抗PD-1或抗PD-L1具有特异性)可任选地包含抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可以具有在其C-末端附接的抗体轻链恒定结构域，包括人Cκ或Cλ链。类似地，基于VH结构域的特定的抗原结合结构域可以具有附接一个免疫球蛋白重链的全部或一部分，该免疫球蛋白重链衍生自任何抗体同位素，例如IgG、IgA、IgE和IgM，和任何该同位素子类，其包括但不限于IgG1和IgG4。
本领域的普通技术人员将认识到，本披露的BFP的BD2抗原结合结构域可用于检测、测量和抑制与PD-1和PD-L1有些不同的蛋白质。预期BD2抗原结合结构域可以保持结合的特异性，只要靶蛋白质包含与至少100个、80个、60个、40个、或20个连续氨基酸的任何序列(如本文所述)具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、或更高同一性的序列。百分比同一性是通过标准比对算法来确定，这些标准比对算法例如像Altshul等人((1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，215：403-410)描述的基本局部比对工具(BLAST)，Needleman等人((1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，48：444-453)的算法，或Meyers等人((1988)Comput.Appl.Biosci.[计算机应用生物科学]，4：11-17)的算法。
除了序列同源性分析，可以进行表位作图(参见例如，Epitope MappingProtocols[表位作图实验方案]，Morris编辑，Humana Press[胡玛纳出版社]，1996)和二级和三级结构分析，以鉴定由所披露的BD2抗原结合结构域假定的具体3D结构和它们与抗原的复合物。此类方法包括但不限于：X射线晶体学(Engstom(1974)Biochem.Exp.Biol.[生物化学实验生物学]，11：7-13)和本披露抗体的虚拟表现形式的计算机建模(Fletterick等人(1986)Computer Graphics and Molecular Modeling[计算机图形学和分子建模]，在Current Communications in Molecular Biology[分子生物学现代通讯]中，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约州(N.Y.))。
考虑的抗PD-L1抗原结合结构域可以来自或衍生自杜伐鲁单抗(durvalumab)(MEDI4736)，一种示例性的抗PD-L1抗体，其对PD-L1具有选择性并阻断PD-L1与PD-1和CD80受体的结合。杜伐鲁单抗可以在体外解除PD-L1介导的对人T细胞活化的抑制，并且经由T细胞依赖性机制在异种移植物模型中抑制肿瘤生长。关于用于本文提供的方法中的度伐鲁单抗(或其片段)的信息可以发现于美国专利号8,779,108和9,493,565，该专利的披露通过引用以其全文并入本文。
在一个特定方面中，用于本文的杜伐鲁单抗的抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含上文所示的卡巴特(Kabat)定义的CDR1、CDR2和CDR3序列，并且其中该轻链可变区包含上文所示的卡巴特定义的CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域的普通技术人员将能够容易地鉴定本领域技术人员已知的Chothia定义的、Abm定义的或其他的CDR定义。在一个特定方面中，所使用的杜伐鲁单抗的抗原结合片段包括如在美国专利号8,779,108中所披露的2.14H9OPT抗体的可变重链和可变轻链CDR序列。
考虑的抗PD-1抗原结合结构域可以来自或衍生自LO115，一种示例性的抗PD-1抗体，其对PD-1具有选择性并阻断PD-1与PD-L1和PD-L2受体的结合。
Fc区
在一些实施例中，本披露提供了具有IgG1或IgG4 Fc区多肽的双特异性融合蛋白，其可具有至少一个氨基酸修饰。例如，氨基酸可以在选自228和235的一个或多个位置被取代，例如通过卡巴特(Kabat)中阐述的EU索引编号的。例如，该Fc区可以是一个IgG4 Fc区，并且变体氨基酸是228P(引起“IgG4P”)、235E、以及235Y中的一个或多个，如通过卡巴特中阐述的EU索引编号的。作为另一个实例，考虑具有变体氨基酸的IgG1 Fc区，该变体氨基酸可包括L234F/L235E/P331S中的一种或多种(在本文别处称为“IgG TM”)。本文披露的所有IgG4分子，是否是标记的IgG4或IgG4P，都含有228P突变
在一个实施例中，本文所用的片段可结晶(Fc)结构域是杜伐鲁单抗的，其在IgG1重链的恒定结构域中含有三重突变，该三重突变减少与负责介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的补体组分C1q和Fcγ受体的结合。
接头
本披露的双特异性融合蛋白中的亚单元可以通过多肽接头连接，其中每个接头与至少两个多肽或亚单元融合和/或以其他方式连接(例如，经由肽键)。双特异性融合蛋白中的接头的组合可以是同源的或异聚(heteromeric)的。在一些实施例中，存在于本披露的双特异性融合蛋白中的所有肽接头的氨基酸序列都是同一的。在其他实施例中，存在于本披露的双特异性融合蛋白中的至少两个肽接头的氨基酸序列是不同的。接头多肽应该具有适合以这样一种方式连接两个或更多个单体亚单元的长度，在该方式中它们相对于彼此采取正确的构象，这样使得它们保留所希望的活性。将天然存在的以及人工的肽接头用于将多肽连接进新颖的连接的融合多肽中在文献中是熟知的。因此，融合两个或更多个单体亚单元的接头可以是天然接头、人工接头或其组合。
如本文所述的，已经发现，融合蛋白亚单元之间长度为9个氨基酸或更长的肽接头保持稳定性和/或不引起此类融合蛋白的过度的聚集。因此，设想在一些实施例中多肽接头可以包括约9个至约20个氨基酸残基、约9个至约15个氨基酸残基、或约9个氨基酸残基。选择被包含在该多肽接头中的氨基酸残基应该展示出不显著干扰本披露的融合蛋白亚单元的活性或功能的特性。因此，多肽接头应该大体上不展示出将与本披露的特定融合蛋白亚单元的活性或功能不一致的职责(charge)，或干扰内部折叠，或与一个或多个单体亚单元中的氨基酸残基形成键或其他相互作用，这将严重地妨碍结合。
在不同的实施例中，多肽接头具有构象柔性。合适的柔性接头包括，例如具有Gly和Ser残基的组合的那些，其中Gly与Ser的比率≥1。在一些实施例中，多肽接头是固有非结构化的天然的或人工的多肽(参见例如，Schellenberger等人，Nature Biotechnol.[自然生物技术]27：1186-1190，2009；还参见Sickmeier等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]35：D786-93，2007)。
在某些具体的实施例中，双特异性融合蛋白亚单元之间的接头可以是
Figure BDA0002478719010000321
的多聚体(SEQ ID NO：43)，例如
Figure BDA0002478719010000322
(SEQ ID NO：39)、
Figure BDA0002478719010000323
(SEQ ID NO：40)、或
Figure BDA0002478719010000324
(SEQ ID NO：41)。在其他的实施例中，考虑的接头可以是
Figure BDA0002478719010000325
(SEQ ID NO：42)。
具体的实施例
在具体的实施例中，本文披露的双特异性融合蛋白含有一对单链融合蛋白，每个单链融合蛋白从N末端到C末端包含抗PD-1或抗PD-L1Fab片段，该抗PD-1或抗PD-L1Fab片段含有轻链可变区和重链可变区，与(b)IgG1或IgG4P Fc多肽共价连接，与(c)第一肽接头共价连接，与第一TNF超家族配体亚单元共价连接，与第二个肽接头共价连接，与第二TNF超家族配体亚单元共价连接，与第三肽接头共价连接，与第三TNF超家族配体亚单元共价连接。
衍生物
本披露的多肽(例如，抗PD-1 Fab、抗PD-L1 Fab、GITRL、OX40L、CD40L、TNF-α、或CD137L)可包括提供的保留特异性结合其靶标的能力的序列的变体。这些变体可以由熟练的技术人员通过使用本领域中公知的技术从这些多肽的序列中衍生而来。例如，可以在FR和/或在抗PD-1或PD-L1Fab片段的CDR中进行氨基酸取代、缺失、或添加。虽然FR的改变一般被设计来改进抗原结合结构域的稳定性及免疫原性，而CDR的改变典型地被设计来增加抗原结合结构域对它的靶标的亲和力。FR的变体还包括天然存在的免疫球蛋白同种异型。这种亲和力增加的变化可凭经验通过涉及改变CDR和测试抗原结合结构域对其靶标的亲和力的常规技术来确定。例如，可以在所披露的CDR中的任一个中制造保守的氨基酸取代。可以根据Antibody Engineering[抗体工程]，第2版，牛津大学出版社(Oxford UniversityPress)，Borrebaeck编辑，1995中所述的方法进行不同改变。这些改变包括但不限于由在序列内编码功能上等效的氨基酸残基的不同密码子的取代改变的核苷酸序列，从而产生“沉默”的改变。例如，非极性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸以及组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
本披露的多肽和/或抗体的衍生物和类似物可以通过本领域中熟知的不同技术来生产，这些技术包括重组的和合成的方法(Maniatis(1990)Molecular Cloning，ALaboratory Manual[分子克隆，实验室手册]，第2版，冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约州(N.Y.)，和Bodansky等人(1995)ThePractice of Peptide Synthesis[肽合成的实践]，第2版，施普林格出版社(SpringVerlag)，柏林，德国)。
在一个实施例中，用于制造为本披露VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域的方法包含如下步骤：在当前披露的VH结构域的氨基酸序列中添加、缺失、取代、或插入一个或多个氨基酸，任选地将这样提供的VH结构域与一个或多个VL结构域组合，并测试该VH结构域或VH/VL组合或特异性结合抗原的组合。可采用类似方法，其中将本文披露的VL结构域的一个或多个序列变体与一个或多个VH结构域组合。
Stemmer(Nature[自然](1994)370：389-391)也披露了类似改组或组合技术，描述了与β-内酰胺酶基因相关的技术但观察到该方法可用于产生抗体。
在进一步的实施例中，人们可以使用一个或多个选择的VH和/或VL基因的随机诱变产生携带衍生自本文所披露的序列的一个或多个序列的新颖的VH或VL区。Gram等人(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊](1992)89：3576-3580)描述了一个这种技术，易错PCR。
可使用的另一个方法是将诱变引导至VH或VL基因的CDR。Barbas等人(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊](1994)91：3809-3813)和Schier等人(J.Mol.Biol.[分子生物学杂志](1996)263：551-567)披露了此类技术。
类似地，抗原结合结构域的一个、两个、或所有三个CDR可以接合至VH或VL结构域的谱系中，然后针对对PD-1或PD-L1具有特异性的抗原结合片段来对这些结构域进行筛选。
本文有用的免疫球蛋白可变结构域的一部分可以包含大致上如本文阐述的CDR中的至少一个，以及任选地，来自如本文阐述的scFv片段的干预框架区。该部分可以包括FR1和FR4中的一个或两个的至少约50％，该50％是FR1的C末端50％和FR4的N末端50％。可变结构域的实质性部分的N末端或C末端的另外的残基可以是通常不与天然存在的可变结构域区相关的那些残基。例如，通过重组DNA技术构建抗体可以导致由所引入的接头编码的N-或C末端残基的引入，以便促进克隆或其他操纵步骤。其他操纵步骤包括引入接头以将可变结构域连接至另外的蛋白质序列，这些蛋白质序列包括免疫球蛋白重链恒定区、其他可变结构域(例如在双抗体产生中)、或蛋白质的标签，如在下文更详细地讨论。
本文描述的本披露的抗原结合结构域(例如，抗PD-1和/或抗PD-L1)可连接至另一功能性分子，例如另一种肽或蛋白质(白蛋白、另一种抗体等)。例如，这些抗原结合结构域可以通过化学交联或通过重组方法连接。这些抗原结合结构域还可以按以下专利中所列出的方式连接至多种非蛋白质聚合物例如，聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯中的一种：美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；或4,179,337。抗原结合结构域可以通过共价轭合至聚合物来进行化学修饰，例如增加其循环半衰期。示例性聚合物和附接这些抗体的方法还在美国专利号4,766,106；4,179,337；4,495,285以及4,609,546中示出。
所披露的抗体片段还可以改变以具有与天然模式不同的糖基化模式。例如，一个或多个碳水化合物部分可以被删除和/或一个或多个糖基化位点可以被添加。将糖基化位点添加至当前披露的抗体片段可以通过改变氨基酸序列以含有本领域中已知的糖基化位点共有序列来实现。在抗体片段上增加碳水化合物部分的数目的另一种手段是通过使糖苷与抗体的氨基酸残基进行化学或酶促偶联。此类方法描述在WO 87/05330中以及在Aplin等人(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.[CRC生物化学关键评论]，22：259-306中。将任何碳水化合物部分从抗体去除可以通过化学或酶促方法来实现，例如，如Hakimuddin等人(1987)Arch.Biochem.Biophys.[生物化学与生物物理学集刊]，259：52；和Edge等人(1981)Anal.Biochem.[分析生物化学]，118：131，以及通过Thotakura等人(1987)Meth.Enzymol.[酶学方法]，138：350中所述的。抗体片段也可以用可检测或功能性标记来加标记。可检测标记包括放射性标记，例如131I或99Tc，可使用常规化学来将它们附接至抗体片段。可检测标记还包括酶标记，例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。可检测标记进一步包括化学部分，诸如生物素，该化学部分可以经由结合到特异性同源可检测部分(例如标记的抗生物素蛋白)来检测。
在本披露的范围内涵盖CDR序列仅在非本质上与本文所阐述的抗原结合结构域不同的抗原结合结构域。典型地，一个氨基酸被具有类似电荷、疏水性或立体化学特征的相关氨基酸取代。此类取代将在技术人员的普通技能之内。不像在CDR中，可以在FR中进行更多实质性的改变，而不对抗体的结合特性造成不利影响。对FR的改变包括但不限于人源化非人衍生的或工程化某些框架残基，这些框架残基对于抗原接触或将结合位点稳定化是重要的，例如，改变恒定区的类或亚类，改变可能改变效应子功能(如Fc受体结合)的特定氨基酸残基(例如，如在美国专利号5,624,821和5,648,260和Lund等人(1991)J.Immun.[免疫学杂志]147：2657-2662以及Morgan等人(1995)Immunology[免疫学]86：319-324中所述的)，或改变衍生恒定区的物种。
本领域的技术人员将理解，以上所述的修饰不是全部详尽的，可以应用于本文描述的蛋白亚单元，并且由于本披露的传授，许多其他的修改将对熟练的技术人员是可能的。
双特异性融合蛋白的产生
除非另外指明，本披露的实施采用很好地处在熟练的技术人员的见识范围之内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的技术。此类技术在文献中已被充分解释，例如“Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]”，第二版(Sambrook，1989)；“Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成]”(Gait，1984)；“Animal Cell Culture[动物细胞培养]”(Freshney，1987)；“Methods inEnzymology[酶学方法]”“Handbook of Experimental Immunology[实验免疫学手册]”(Weir，1996)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells[用于哺乳动物细胞的基因转移载体]”(Miller和Calos，1987)；“Current Protocols in Molecular Biology[当前分子生物学方法]”(Ausubel，1987)；“PCR：The Polymerase Chain Reaction[PCR：聚合酶链式反应]”，(Mullis，1994)；“Current Protocols in Immunology[免疫学现代实验方案]”(Coligan，1991)。这些技术适用于本披露的多肽的生产，并且按照这样，可以被考虑用于制作和实施本披露。对具体实施例特别有用的技术将在实例中进行讨论。
测定双特异性融合蛋白的特性和活性
本披露的双特异性融合蛋白亚单元(分离的或作为多聚体的一部分)的稳定性可以通过本领域熟知的技术(例如热(Tm)和离液变性(例如用尿素或胍盐处理)、蛋白酶处理(例如用嗜热菌蛋白酶处理)或另一种本领域接受的方法来确定蛋白质稳定性)容易地测量。用于测量蛋白质稳定性的技术的全面综述可以发现于例如“Current Protocols inMolecular Biology[分子生物学现代方案]”和“Current Protocols in Protein Science[蛋白质科学现代方案]”，通过John Wiley and Sons.[约翰·威利父子出版公司]2007。
根据本披露双特异性融合蛋白的结合亲和力和其他结合特性可以通过本领域已知的多种体外测定方法(包括例如平衡方法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA))或动力学(例如，
Figure BDA0002478719010000371
分析)和其他方法，例如间接结合测定、竞争性结合测定、凝胶电泳和色谱法(例如，凝胶过滤))确定。这些方法和其他方法可以利用所检查的一种或多种组分上的标记，和/或采用多种检测方法包括但不限于发色标记、荧光标记、发光标记或同位素标记。结合亲和力和动力学的详细描述可以发现于Paul，W.E.编辑，Fundamental Immunology[基础免疫学]，第4版，利平科特-雷文出版社(Lippincott-Raven，Philadelphia)(1999)。
本文描述了用于确定双特异性融合蛋白的功能或活性的另外的体外和体内方法。这些测定可用于确定一种或多种免疫应答(例如，T细胞功能和记忆、B细胞活化或增殖、树突细胞成熟或活化、Th1细胞因子或趋化因子应答、单核细胞衍生的巨噬细胞M1/M2极化、抗原呈递和/或肿瘤微环境的免疫抑制中的一种或多种)。在体内，用于测定抗癌或抗肿瘤活性的不同动物模型是本领域已知的，包括例如B16-F10肿瘤小鼠模型。另外，评估药效学和药代动力学特性的方法也是熟知的。
抗肿瘤疗法
本披露的特征还在于包含双特异性融合蛋白(例如上述)的用于治疗癌症的组合物和方法。在各种实施例中，双特异性融合蛋白可以与其他抗癌药物或加强免疫细胞对癌症应答的药物组合给予。
本文进一步提供了用于治疗癌症的方法，这些方法包括给予一种或多种双特异性融合蛋白，例如图1-4中示出的那些。如本文示出的，双特异性融合蛋白的给予可导致例如小鼠肿瘤模型中肿瘤体积的减少。在某些方面中，给予患有实体瘤的患者双特异性融合蛋白。
用包括双特异性融合蛋白的癌症疗法治疗导致例如癌症的进展速率降低，肿瘤生长的阻滞或稳定，肿瘤缩小和/或肿瘤消退。在一些方面中，肿瘤生长的减少或阻滞可以是统计学上显著的。可以通过与基线处的患者肿瘤的生长、针对预期的肿瘤生长、针对基于大的患者群体的预期肿瘤生长或针对对照群体的肿瘤生长进行比较来测量肿瘤生长的减少。
在其他实施例中，本披露的方法提高了癌症存活率并延长了寿命。例如，本文披露的数据不仅证明了BFP分子用于治疗癌症的有效性，而且使用BFP(MEDI7526)导致比用其亲本试剂(Durva+MEDI5083)的组合治疗更低的毒性。因此，使用BFP分子进行癌症治疗可以实现有效的具有较低的毒性的抗癌应答，并改进患者的整体健康。换言之，使用本文披露的双特异性融合蛋白可以提供单独使用单一疗法无法实现的治疗结果。
对给予癌症疗法的临床应答可以使用临床医生已知的诊断技术来评估，这些诊断技术包括但不限于磁共振成像(MRI)扫描、x-射线照相成像、计算机断层照相(CT)扫描、流式细胞术或荧光激活的细胞分选器(FACS)分析、组织学、宏观病理学、以及血液化学，包括但不限于可通过ELISA、RIA和色谱法可检测到的改变。
给出以下的实例是为了给本领域的普通技术人员提供如何准备和使用测定、筛选和本披露的治疗方法的一个完整的披露和说明，而不是旨在限定诸位发明人认为是自己的披露的范围。
实例
现在，参见下面的实例对本披露进行描述。这些实例仅是说明性的，并且本披露决不应被解释为局限于这些实例，而是应当被解释为涵盖作为本文提供的教导的结果变得明显的任何以及所有变体。
实例号1.特异性融合蛋白的产生
使用与经由肽接头与Fab片段连接的Fc单体连接的三个配体亚单元(主要对应于TNF同源结构域)的单链融合蛋白(scfp)构建体构建在以下实例中测试的双特异性融合蛋白(参见图1-4)。scfp二聚化形成BFP。以下描述了用于BFP的序列。
实例号2.OCTET结合测定
为了评价本文披露的双特异性结合分子的结合，使用配备有Ni-NTA生物传感器尖端和10X动力学缓冲液的Octet QK(ForteBio公司，门洛帕克(Menlo Park)，加利福尼亚州)。对于该系列双特异性结合蛋白，His标记的PD-L1-his是内部制备的，CD40-Fc蛋白购自翘神州生物技术有限公司(Sino-Biological)(北京，中国)并在实验室中进行生物素化。所有结合测定均在25℃进行。
在分析之前，以1000rpm搅拌样品板。在我们之前将1X动力学缓冲液应用于链霉亲和素和Ni-NTA生物传感器尖端10min。该1X动力学缓冲液也用作基线确定的运行缓冲液以及抗原和双特异性抗体的稀释缓冲液。链霉亲和素或Ni-NTA生物传感器尖端浸入20nMCD40-生物素(图5A和5B)或his标记的PD-L1(图5C和5D)中用于抗原捕获5min并在动力学缓冲液中漂洗30秒。将抗原涂覆的生物传感器尖端各自浸入10μg/ml双特异性抗体中5分钟并漂洗，然后移入含有100nM PD-L1Fc抗原(图5A和5B)或100nM CD40-Fc(图5C和5D)的孔的柱中持续5分钟。在该测定中，当BFP分子已经使第一抗原(CD40或PD-L1)饱和时，注射第二抗原(PD-L1或CD40)，并且如所希望的，观察到第二结合信号。当抗原注射顺序逆转时，该观察结果是可再现的，表明BFP分子可以同时结合两个靶标。
实例号3.细胞表面抗原结合的评估
流式细胞术用于评估通过BFP的细胞表面抗原的结合。
抗PD-L1+CD40L FP BFP2和BFP3(MEDI7526；参见表1)、CD40L FP6(MEDI5083)、和抗PDL1(MEDI4736)均处于人IgG4同种型，使用Alexa Fluor 647单克隆抗体标记试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher))与Alexa Fluor 647轭合。还按照相同的方案轭合IgG4同种型对照抗体。所有得到的轭合抗体具有类似的染料与抗体比率。在结合测定中，将Alexa 647轭合的抗体在FACS缓冲液(PBS加3％胎牛血清)中连续稀释，得到40nM至19.532pM之间的终浓度，并与10,000CD40转染的HEK293细胞(图6A)或Ramos人B细胞(图6B)混合。CD40转染的293和Ramos细胞均表达CD40但不表达PD-L1。在4℃孵育1小时后，将细胞离心并去除上清液中的游离抗体。洗涤具有结合抗体的细胞并通过流式细胞术进行。通过细胞计数仪器检测并记录荧光信号，并使用
Figure BDA0002478719010000401
软件确定靶细胞上Alexa 647的平均荧光强度。图6A和6B的图示出了BFP2和BFP3与亲本MEDI5083具有对CD40类似的结合；然而抗PD-L1(MED4736)和同种型对照抗体不结合。
接下来，评估在PD-L1转染的HEK293细胞和ES2人卵巢癌细胞系上与人PD-L1的结合。两种细胞系均表达PD-L1但不表达CD40。将Alexa 647轭合的抗体在FACS缓冲液中稀释，并与10，000个PD-L1转染的HEK293细胞混合。在4℃孵育1小时后，将细胞离心并去除上清液中的游离抗体。洗涤具有结合抗体的细胞并通过流式细胞术进行。通过细胞计数仪器检测并记录荧光信号，并使用
Figure BDA0002478719010000402
软件确定靶细胞上Alexa 647的平均荧光强度。图7A和7B的图示出了BFP2和BFP3都与细胞表面PD-L1结合，尽管具有比具有IgG4或IgG1 TM同种型的MEDI4736更低的最大结合和更高的EC50。如所希望的，CD40L FP和同种型对照抗体在该测定中不与PD-L1结合。
评估抗PD-L1+CD40L FP、BFP2和3与人PBMC的结合。由于在炎性条件下PBMC上CD40和PD-L1的表达增加，我们评估了关于合并的初试和IFN-γ刺激的PBMC的结合。在该研究中，将PBMC从健康供体分离并用高(100nM)或低(10nM)量的羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记。将具有100nM CFSE的PBMC无处理培养24小时，并在相同条件下培养用10nMCFSE标记的PBMC，但用1nM人IFN-γ刺激过夜以上调CD40和PD-L1表达。因此，可以基于不同水平的CFSE信号区分有或无IFN-γ处理的细胞。所有具有高和低CFSE标记的PBMC在第二天混合，并用针对B细胞的抗CD19、针对T细胞的CD3、和针对单核细胞的CD14染色。与CD40LFP(MEDI5083)和抗PDL1(MEDI4736IgG1 TM)相比，通过流式细胞术揭示抗PD-L1-CD40L FPBFP分子与PBMC亚组的结合。如图8示出的，两种形式的BFP蛋白都展现出类似的结合活性和效力。IFN-γ处理的单核细胞与大多数BFP分子结合，随后是初试单核细胞和T和B细胞。这些结果还表明，在PBMC上，BFP分子具有与抗PDL1和CD40L FP(MEDI5083)类似的结合特征曲线。
PD1-OX40L、PD1-OX40L 2WT和PD1-OX40L 1WT均处于人IgG4同种型，使用AlexaFluor 647单克隆抗体标记试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher))与Alexa Fluor647轭合。使用以上提到的方案测试与Jurkat/OX40-GITR-FP2细胞(图71A)和活化的人初级T细胞(图72)的结合。
实例号4.抗PDL1-CD40L FP、BFP2和3具有刺激CD40途径和阻断PD1-PDL1相互作用的能力。
经由CD40活化触发NF-κB活化途径。
将HuCD40/HEK293/NF-κB细胞(克隆3)维持在DMEM(吉毕科公司(GIBCO))加10％热灭活的FBS(HI-FBS；吉毕科公司(GIBCO))和1％Pen Strep(吉毕科公司(GIBCO))中。在第1天，收获细胞并以5×105/mL重悬于具有2％的HI FBS的DMEM中。将每孔一百微升的细胞接种在BD Biocoat聚-D-赖氨酸96孔黑/透明微量滴定板(Cat#356640)中。将细胞置于37℃培养箱中24小时。孵育后，从板中吸出培养基。将一百微升1X测试材料小心地添加至每个孔中，并注意使细胞的分离最小化。将细胞放回37℃培养箱中24小时。制备荧光素酶试剂(
Figure BDA0002478719010000421
荧光素酶测定底物；普洛麦格公司(Promega))，使其平衡至室温，并添加(100μL)至每个孔中。将细胞和试剂充分混合以确保完全细胞裂解，并立即在SpectraMax M5读板仪上读取。图9证明BFP分子在多种细胞类型上活化NF-κB信号，这些多种细胞类型包括CD40转染的293细胞(A)、Ramos细胞(b)、和THP-1细胞(C)。
Ramos-Blue生物活性测定方案
将Ramos-Blue NF-κB/AP-1报告基因细胞(英杰公司(Invivogen))维持在IMDM
Figure BDA0002478719010000422
(吉毕科公司(GIBCO))加10％HI-FBS(吉毕科公司(GIBCO))、1％Pen Strep(吉毕科公司(GIBCO))和Zeocin(100μg/mL；英杰公司(InvivoGen))培养基中。细胞是非粘附的，并且培养物以5×105个细胞/mL开始并保持低于3×106个细胞/mL。在实验前一天，将细胞分裂成IMDM GlutaMAX加10％HI-FBS和pen/strep(无Zeocin)培养基。收获细胞，调节至1×106个细胞/mL，并添加(180μL)至平底96孔板(康宁公司(Corning))的孔中。将无Zeocin培养基中的二十微升的10X测试材料添加至每个孔中，并将细胞置于37℃培养箱中24小时。制备QUANTI-Blue试剂(溶解于100mL无菌水中的一个小袋；英杰公司(Invivogen))并以160μL/孔添加至平底96孔板中。将来自Ramos-Blue细胞(40μL)的上清液添加至含有QUANTI-Blue的孔中。将平板置于37℃培养箱中最多1小时，并在SpectraMax M5分光光度计上在655nm处读数。
THP1-Blue生物活性测定方案
将THP1-blue NF-κB报告基因细胞(英杰公司(Invivogen))维持在RPMI1640(吉毕科公司(GIBCO))加10％HI-FBS(吉毕科公司(GIBCO))、1％Pen Strep(吉毕科公司(GIBCO))和杀稻瘟素(10μg/mL；英杰公司(Invivogen))培养基中。细胞是非粘附的，并且培养物以7×105个细胞/mL开始并保持低于2×106个细胞/mL。在实验前一天，将细胞分裂成RPMI1640加10％HI-FBS和pen/strep(无杀稻瘟素)培养基。收获细胞，调节至1×106个细胞/mL，并添加(180μL)至平底96孔板(康宁公司(Corning))的孔中。将无杀稻瘟素培养基中的二十微升的10倍测试材料(已连续稀释)添加至每个孔中，并将细胞置于37℃培养箱中24小时。制备QUANTI-Blue试剂(溶解于100mL无菌水中的一个小袋；英杰公司(Invivogen))并以160μL/孔添加至平底96孔板中。将来自THP1-Blue细胞(40μL)的上清液添加至含有QUANTI-Blue的孔中。将平板置于37℃培养箱中6小时，并在SpectraMax M5分光光度计上在655nm处读数。结果示出于图9中。
实例号5.PD-L1介导的抑制的减弱
在该实例中，检查抗PD-L1-CD40L FP BFP分子以确定它们在PD-1/PD-L1阻断生物测定(普洛麦格公司(Promega))中是否在生物学上等效于抗PD-L1。首先，将一小瓶CHO PD-L1细胞解冻并重悬于14.5ml的具有10％FBS的Ham′s F12培养基中。将细胞以100μL/孔添加至96孔白底测定板中。将板在37℃培养箱中孵育过夜(16-20小时)。第二天将培养板从培养箱中取出，并小心地去除培养基。将四十(40)μL在测定缓冲液(含有1％FBS的RPMI1640)中的测试材料(2×)添加至板的每个孔中。接下来，将一小瓶Jurkat PD1效应细胞解冻并重悬于5.9mL的测定缓冲液中。然后将四十(40)μL的Jurkat PD1细胞添加至板的每个孔中。将板置于37℃培养箱中6小时。制备荧光素酶试剂(
Figure BDA0002478719010000431
荧光素酶测定底物；普洛麦格公司(Promega))，使其平衡至室温，并添加(80μL)至每个孔中。将板置于室温下5min，随后立即在
Figure BDA0002478719010000432
M5读板仪上读取。MEDI7526抑制的PD-L1功能，导致该测定中NFAT活性的剂量依赖性增加。MEDI7526的EC50与MEDI4736 IgG4分子是可比较的。图10证明了抗PD-L1-CD40L FP BFP减弱了PD-L1介导的抑制功能。
实例号6.BFP共活化测定
在基于稳健的基于报告基因的THP-1单核细胞和Jurkat T细胞共活化测定中进一步评估BFP分子功能。在该测定中，用NF-κB-SEAP报告基因(英杰公司(Invivogen))转染的THP-1细胞以每孔400,000接种并用IFN-γ刺激过夜以上调这些细胞上的CD40和PD-L1表达。IFN-γ刺激不会诱导THP-1细胞上的NF-κB活化。测定概念示意图示出于图11A中。
在测定前一天晚上，用抗人CD3抗体(生物传奇公司(Biolegend))涂覆白色96孔板。在测定当天，洗涤THP-1细胞并与每孔100,000个用NFAT-荧光素酶报告基因(普洛麦格公司(Promega))转染的Jurkat细胞混合，并添加连续稀释的测试试剂。将测定板在37℃搅拌6小时。然后将细胞离心并将40μL的培养基从每个孔转移至新96孔板的相应孔中并储存在-80℃。
为了确定培养基中存在的SEAP活性，将具有冷冻细胞培养基的板在室温解冻并在37℃与QUANTI-Blue溶液混合。孵育15分钟后，用酶标仪测量SEAP活性。为了测量NF-κB活性，将细胞与1X裂解试剂混合，并将细胞裂解物与80μL的Bio-Glo荧光素酶测定试剂(普洛麦格公司(Promega))混合。将板在环境温度孵育5分钟，并在板读数器
Figure BDA0002478719010000441
M5中测量荧光强度。如图11B示出的，抗PDL1-CD40L BFP分子在THP1细胞中活化NF-κB并增加Jurkat T细胞中的NFAT活性，证明BFP分子可以在混合的免疫细胞上进行多种功能。
实例号7.MEDI7526活化初级人类细胞并诱导细胞因子的产生。
在该研究中，检查了MEDI7526在初级细胞中诱导细胞因子产生的能力。
葡萄球菌肠毒素B(SEB)测定方案
用于SEB测定方案以确定BFP分子对IL-2免疫应答的影响的试剂包括：白细胞锥(NHSBT代码NC24；来自阿登布鲁克斯医院(Addenbrookes Hospital))；50ml Falcon试管(BD 352070)；菲可帕克加(Ficoll-Paque PLUS)(GE医疗集团(GE Healthcare)17-1440-02)；抗CD3(克隆OKT3；1mg/ml；e生物科学公司(eBioscience)；目录号：16-0037-85)；氯化铵溶液(干细胞技术公司(Stemcell Technologies)07850)；葡萄球菌肠毒素B(SEB；Sigma(西格玛公司)，S-4881)储备溶液，1mg/mL，储存于-20℃；培养基(均来自生命科技公司(Life Technologies))：具有GlutaMaxTM的RPMI1640(61870)，补充有10％v/v热灭活的FCS(90005M)和100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素(15140-122)；V型底板(格雷纳生物公司(Greiner BioOne)651201)；96孔平底板(康宁科斯塔公司(Corning Costar)7107)。
用于IL-2 DELFIA ELISA的试剂包括：FLUONUNC Maxisorp ELISA板(能肯公司(Nunc)437958)；铕标记的链霉亲和素，SA-Eu(珀金埃尔默(Perkin-Elmer)1244-360)；
Figure BDA0002478719010000451
测定缓冲液(珀金埃尔默(Perkin-Elmer)，#4002-0010)；
Figure BDA0002478719010000452
增强溶液(珀金埃尔默(Perkin-Elmer)4001-0010)；在使用前在RT下；测定稀释剂：DELFIA洗涤缓冲液(0.05％Tween-20，20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.2-7.4)，补充有0.1％BSA，经无菌过滤；奶粉(Marvel；第一食品公司(Premier Foods))；样品稀释剂(如上所述的RPMI1640+10％FCS+1％青霉素/链霉素)；PBS(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)14190235)；PBS-吐温(PBS中0.01％Tween-20)；人类IL-2ELISA试剂盒(Duoset DY202，R&D系统公司(R&D Systems))；具有自动板加载器(Biostack)的Biotek洗板器(EL406)。
一般测定方案
使用密度梯度离心(菲可帕克加(Ficoll-Paque PLUS)；GE医疗集团(GEHealthcare))从人类血液白细胞锥(NHS血液与移植服务代码NC24)分离PBMC，然后在氯化铵溶液(干细胞技术公司(Stemcell Technologies))中裂解红细胞。将抗人类CD3(PBS中0.5μg/mL的克隆OKT3；e生物科学公司(eBioscience))在平底96孔板(康宁科斯塔公司(Corning Costar)7107)中于37℃涂覆2小时。然后，每孔添加在培养基(补充有10％v/v热灭活的牛血清和100U/100μg/ml链霉素/青霉素(分别地)的RPMI1640-GlutaMax，生命科技公司(Life Technologies))中的PBMC的2x 105个细胞。通过添加SEB终浓度1μg/mL进一步刺激PBMC，并将候选BFP分子连续稀释添加至最终测试浓度。在37℃和5％CO2培养3天后，从细胞和根据制造商的说明书(R&D系统公司(R&D Systems))使用商业ELISA确定的IL-2分泌中去除上清液。
示出于图12中的结果证明MEDI7526(BFP3)在SEB测定中诱导最高水平的IL-2产生，其中EC50为59.8pM。
实例号8.MEDI7526活化初级人类细胞并诱导细胞因子的产生。
在该研究中，检查了MEDI3387和MEDI5771在初级细胞中诱导细胞因子产生的能力。
按照制造商推荐的方案，使用菲可帕克加(Ficoll-Paque PLUS)(GE医疗集团(GEHealthcare)17-1440-02)从白细胞锥(由NHSBT，阿登布鲁克斯医院(Addenbrooke′sHospital)提供)制备PBMC。将PBMC重悬于培养基(具有glutamax[吉毕科公司(Gibco)]的RPMI1640，补充有10％热灭活的FCS[生命科技公司(Life Technologies)90005M]和1％青霉素/链霉素)并转移至之前涂覆抗人CD3抗体(通过向每个孔中添加225μL的含有0.5μg/mL的OKT3[e生物科学公司(eBioscience)目录号：16-0037-85]的PBS，并在使用前在37℃孵育2小时来进行涂覆)的96孔平底组织培养板(康宁科斯塔公司(Corning Costar)7107)中。反应的最终体积为每孔225μL，含有2E5个细胞，并且补充有葡萄球菌肠毒素B(浓度为0.1μg/mL)以及测试药物或对照mAb。将反应在37℃，5％CO2孵育72小时，然后去除上清液，并随后通过ELISA测试IL-2的释放。结果示出于图13中。
实例号9.MEDI7526 MLR测定
使用MLR测定评估通过MEDI7526对巨噬细胞中IFN-γ和IL-12产生的诱导。
一般测定方案：
培养单核细胞衍生的M1巨噬细胞：使用EasySepTM人CD14阳性选择试剂盒(STEMCELL)从一个供体分离单核细胞，并使用CellXVivo人M1巨噬细胞分化试剂盒(R&D系统公司(R&D Systems))产生M1巨噬细胞。在该测定中，将4，000万个单核细胞分成2个T75烧瓶。从每个烧瓶中去除一半培养基，并在第3天和第6天用补充有GM-CSF的新鲜培养基替代。在第6天，使用StemProTMAccutaseTM细胞解离试剂(英杰公司(Invitrogen))收获分化的巨噬细胞，以1500rpm离心细胞5分钟。接下来，去除上清液，且细胞以0.125百万/ml在完全RPMI 1640培养基中。接下来，将80μL/孔的巨噬细胞添加至96孔U型底板中，且每孔添加20μL的测试抗体(终浓度的10倍)。接下来，将来自另一供体(1百万/mL)的100μL/孔的分离的总T细胞添加至96孔U型底板中。将板于37℃，在CO2培养箱中孵育5天。收获上清液，并用人Th1/Th2 10-plex试剂盒(Meso Scale Discovery)测量上清液中细胞因子的水平。
图14示出了MEDI7526(BFP3)在3种巨噬细胞-T细胞MLR反应时诱导产生IFN-γ。
实例号10.混合的白细胞反应(MLR)测定方案(新鲜血液)
描述于实例号9中的基于MLR细胞的测定还用于提供应答于本文披露的BFP分子的T细胞功能的体外相关性。
一般测定方案
从一个供体的PBMC和另一个供体的T细胞中分离单核细胞。将单核细胞和T细胞以1∶1的比例悬浮在完全RPMI培养基中，并与测试试剂一起孵育。将板在37℃孵育5天。在最后一天，将板以300g离心5分钟，并且收获上清液。用人Th1/Th210-plex试剂盒(Meso ScaleDiscovery)测量上清液中的细胞因子。
图15示出了MEDI7526(BFP3)在4对单核细胞-T细胞MLR反应时诱导产生IFN-γ，表明MEDI7526可以增强T细胞介导的免疫应答。
实例号11.CMV回忆测定
巨细胞病毒(CMV)抗原回忆测定用于评价由本文所述的某些免疫治疗分子诱导的潜在免疫应答。在CMV阳性供体中通过CD8+T细胞响应于重组人CMV pp65蛋白(CMV pp65)的IFN-γ分泌的诱导被称作免疫记忆回忆应答。某些癌症可以通过这些受体的表达来增强这种抑制，导致对在治疗上干扰这些免疫检查点的兴趣。对抗体组合，双特异性试剂的使用和改变Fc组分类型具有潜在的益处。
在该实验中，来自已知CMV阳性供体的HLA-A02型PBMC在BFP分子存在下暴露于HLA-A02限制的CMV pp65肽(495-503)。4天后，通过MSD确定IFN-γ分泌。使用的通用试剂示出于表2中。
表2.用于CMV回忆测定的通用试剂
Figure BDA0002478719010000481
CMV回忆测定方案(阿斯塔特生物制品/医学免疫公司(Astarte Biologics/MedImmune)杂合)：
解冻CMV阳性人PBMC，用XVIVO-15洗涤，计数，并在XVIVO-15中调节至4x10e6个细胞/mL。每mL细胞悬浮液添加两微升的CMV pp65HLA-A02肽并充分混合。接下来，将100μL的PBMC加肽添加到孔中(4x10e5个细胞/孔)。向每个孔中添加100μL抗体(2X)，并将板置于37℃培养箱中。在第4天，从每个孔收获上清液(100uL)并在-30℃冷冻用于随后的细胞因子测定(MSD)。
图16证明与其他测试样品相比，MEDI7526在CMV回忆测定中诱导更高水平的IFN-γ和IL-12产生。对于IFN-γ：BFP3的EC50为约104.3，CD40L FP6(MED15083)的EC50为359.4，CD40L+抗PD-L1的EC50为367.1。
图73B示出了PD1-OX40L BFP在CMV回忆测定中诱导比PD1-OX40L 2WT BFP更高水平的IFN-γ、IL-12、TNFα、IL-1β和IL-6产生，表明在这个测定中残余的F180对OX40激动剂功能是关键的。
实例号12.BFP分子触发PD1或PDL1的内化和降解
在该实例中，测试了BFP3诱导CD40和PD-L1内化并使膜PD-L1去稳定化的假设。
MEDI7526BFP3与人CD40和PD-L1结合。假设BFP3可诱导CD40和PD-L1内化并随后触发PD-L1蛋白降解。为了能够在MEDI7526治疗后定量测量CD40和PD-L1的内化，筛选一组抗CD40和PD-L1抗体，并将抗CD40克隆5C3和抗PD-L1克隆29E.2A3鉴定为非竞争抗体。即，抗CD40克隆5C3不与MEDI7526竞争结合CD40，并且抗PD-L1克隆29E.2A3不与MEDI7526竞争结合PD-L1。在MEDI7526治疗后，利用非竞争抗体评估CD40和PD-L1的表面表达。图17描绘了用于检测来自细胞表面的CD40和PD-L1内化的基于流式细胞术的方法。
MDA-MB-231细胞
MDA-MB-231是人乳腺癌细胞，并组成型表达CD40和PD-L1。将MDA-MB-231细胞与滴定量的测试材料混合，并在37℃孵育1小时或96小时。孵育后，通过洗涤去除游离抗体，并用来自BioLegend的荧光染料缀合的抗CD40(克隆5C3)和抗PD-L1(克隆号29E.2A3)染色细胞。然后，对具有结合抗体的细胞进行流式细胞术分析。使用
Figure BDA0002478719010000491
计算几何平均荧光强度并绘制在图中。结果见于图18中。
接下来，将MDA-MB-231细胞以0.5百万孔/孔接种在具有RPMI1640培养基的6孔板中，并用指定条件处理。24小时后，将细胞在300μL/孔的具有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液(密理博公司(Millipore))中裂解，随后在4℃旋转孵育1hr。通过BCA分析(皮尔斯公司(Pierce))确定裂解物中蛋白质的量，并使用来自细胞信号传导公司(Cell Signaling)的抗PD-L1克隆(E1L3N)通过蛋白质印迹检测PD-L1蛋白的存在(参见图19)。
见于图18和19中的结果证明MEDI7526(BFP3)治疗不仅下调MDA-MB-231细胞上的CD40和PD-L1表面表达，而且还降低MDA-MB-231细胞中的总PD-L1蛋白含量。
THP-1细胞
THP-1细胞是人白血病单核细胞系。THP-1细胞表达非常低量的CD40和PD-L1，但在IFN-γ治疗后上调CD40和PD-L1的表达。在示出于图20的测定示意图中，用IFN-γ刺激THP-1细胞24小时，并与滴定量的测试材料混合，并在37℃孵育0.5至3小时。孵育后，通过洗涤去除游离抗体，并用荧光染料缀合的抗CD40(克隆5C3)和抗PD-L1(克隆号29E.2A3)染色细胞。然后，对具有结合抗体的细胞进行流式细胞术分析。通过
Figure BDA0002478719010000502
计算几何平均荧光强度并绘制在图21中，证明MEDI7526在0.5-3小时之间诱导来自THP1细胞的细胞表面的CD40和PD-L1的快速下调。
IFN-γ-处理的THP-1细胞
根据在图22中的研究示意图，用IFN-γ刺激THP-1细胞24小时，并与滴定量的测试材料混合，并在37℃孵育1小时。孵育后，通过洗涤去除游离抗体，并用荧光染料缀合的抗CD40(克隆5C3)和抗PD-L1(克隆号29E.2A3)染色细胞。然后，对具有结合抗体的细胞进行流式细胞术分析。通过
Figure BDA0002478719010000501
计算几何平均荧光强度(gMFI)并绘制在示出于图23中的图中，证明CD40表达在处理后24小时快速恢复，但PD-L1细胞表面表达保持低，表明内化的CD40和PD-L1的单独恢复途径。
实例号13.人初级细胞测定
在该研究中，使用EasySepTM人CD14阳性选择试剂盒(干细胞公司(STEMCELL))从健康供体PBMC分离单核细胞，并根据制造商的方案使用CellXVivo人单核细胞衍生的DC分化试剂盒(R&D，Cat#CDK004)分化成树突细胞。将细胞重悬于包括1百万个细胞/mL的GM-CSF和IL-4的人DC分化培养基中，并将总共2，000万个细胞接种于T75烧瓶中。在第3天和第5天用新鲜的人DC分化培养基替代一半培养基。在第7天，收获未成熟的DC并用增加剂量的测试材料刺激。在刺激24小时后通过流式细胞术确定CD40、CD86和PD-L1的表面表达(参见图24)。在图25中，通过免疫印迹测量用10nM的测试材料刺激24小时的DC中CD40和PD-L1的蛋白质水平。这些结果显示MEDI7526(BFP3)导致人初级细胞上PD-L1的下调。
图24证明MEDI7526与其亲本CD40L FP一样，在低剂量下诱导CD40上调，但在高剂量下下调CD40。它还上调单核细胞衍生的树突状细胞上的CD86表达。但是在MEDI7526处理的细胞上PD-L1蛋白保持低水平。
PBMC测定
在该研究中，来自健康供体的PBMC用IFN-γ刺激并与测试试剂反应1小时。用流式细胞术研究CD40、CD86、和PD-L1的表面表达水平。图26证明MEDI7526诱导来自单核细胞的细胞表面的CD40和PD-L1的下调。这些结果显示MEDI7526(BFP3)导致新鲜分离的人初级细胞上PD-L1的下调。
实例号14.鼠替代物MEDI7526对RENCA细胞中PD-L1的功效。
Renca是一种鼠肾肾腺癌细胞系，其组成型表达CD40和PD-L1。在该研究中，Renca细胞在第一天在6孔板中以0.5百万/孔培养。在培养的第二天，将Renca细胞用指定试剂以10nM的浓度处理24hr。在培养的第三天，用蛋白酶抑制剂在RIPA缓冲液中裂解处理的Renca细胞，并通过蛋白质印迹分析细胞裂解物。用于蛋白质印迹的抗体列于下表3中。
表3.抗体
Figure BDA0002478719010000521
图27证明MEDI7526的鼠替代物(mBFP3)诱导了Renca细胞中PD-L1的降解。该结果证明，MEDI7526的鼠替代物在鼠细胞上PD-L1和CD40表达的下调中具有类似的功能。
实例号15.BFP分子和FC受体的接合可以增强骨髓细胞的活化。
在该实例中，检查了通过BFP分子的骨髓细胞的活化。
将表达PD-L1的ES2细胞以30，000个细胞/孔接种在平底96孔板中，并用IFN-γ刺激THP1细胞24小时。在第2天，混合等量的ES2细胞和THP-1细胞，并添加滴定的测试材料(BPF1、BPF2、MEDI7526、FP6(MEDI5083)和MEDI4736；参见表1)。将板在37℃孵育24hr。根据小袋上的说明制备QUANTI-BlueTM。接下来，将160μL的QUANTI-Blue溶液与平底96孔板的每孔40μL上清液混合。将板在37℃孵育3小时，并使用分光光度计在655nm确定SEAP水平。
图28显示通过肿瘤细胞上的PD-L1的交联可以增强MEDI7526BFP3活性。BFP形式的取向似乎影响功能，因为观察到BFP2形式没有增强活性。基于2-细胞系统的该结果证明，通过PD-L1在肿瘤细胞上的交联可以加强MEDI7526在THP-1细胞中刺激NF-κB活性的功能。
实例号16.FCγRI在PD-L1交联中的作用。
在该实例中，检查了高亲和力Fc受体(FcγRI)在PD-L1交联中的作用。将Biocoat96孔板(康宁公司(Corning))用50μL/孔的PD-L1-His(2μg/ml，R&D系统公司(R&Dsystems))在4℃涂覆过夜。在第2天，将THP1细胞(0.2百万/孔)添加至板中。添加可溶的IgG1(内部制备)，其与IgG4竞争结合Fcγ受体。其他抑制剂包括针对FcγRI/FcγRII的阻断抗体(生物传奇公司(Biolegend))和针对Syk和Btk(Sellechem公司)的抑制剂1小时，随后用测试材料(3nM)刺激24小时。在第3天，将板以1500rpm离心5min。将四十(40)μL细胞培养上清液与160μL新鲜制备的QUANTI-BlueTM试剂(英杰公司(Invivogen))混合，随后在37℃孵育1小时。通过
Figure BDA0002478719010000531
M5分光光度计在655nm确定SEAP水平。图29证明由PD-L1交联介导的增强信号是通过FcrRI并且可被可溶的IgG以及Syk和Btk抑制剂抑制。然而，BFP3功能不需要Fc接合(参见图61和62)。这些结果表明BFP3介导的增加活性是通过FcγRI接合。
实例号17.MEDI7526的鼠替代物在体内证明了稳健的抗肿瘤活性，并且其在小鼠肿瘤模型中可耐受
为了研究MEDI7526在小鼠体内的作用，构建了MEDI7526的鼠替代物mMEDI7526。与MEDI7625平行，mMEDI7526从N-到C末端包含F(ab)2抗鼠PD-L1、具有D265A突变的鼠IgG1Fc、和经由肽接头连接的3x鼠CD40L亚单元的两个单链融合蛋白。
首先在C57Bl/6雌性小鼠中测试MEDI7526的鼠替代物(mMEDI7526)以研究其安全性曲线(图30A和30B)。初试小鼠接受单次静脉内(iv；图30A)或皮下(sc；图30B)治疗，其中mCD40L为10mg/kg或mMEDI7526为16mg/kg的等效摩尔浓度。未处理组的小鼠用作对照。在治疗前和治疗后每天监测体重，并将其转换为个体小鼠的基线体重百分比(参见图31)。与对照相比，mCD40L治疗(经静脉内或sc)导致体重减轻。相比之下，16mg/kg的mMEDI7526治疗没有引起体重的显著损失。
在单独的实验中，向C57Bl/6雌性小鼠植入B16F10肿瘤细胞，并选择肿瘤大小＞100mm3的小鼠用于以下研究。选择的小鼠接受mCD40L(10mg/kg)和mMEDI7526(16mg/kg)(如图30C和30D示出的)，或高剂量mMEDI7526(25或35mg/kg，分别为图30E和30F)的单次经静脉内或经皮下治疗。在治疗前后每天监测体重，并计算基线体重的百分比，并在治疗组与未治疗组之间进行比较。结果证明，mCD40L的治疗导致治疗后更严重的体重减轻，并且表明在初试或荷瘤小鼠中mMEDI7526比mMEDI5083更可耐受。
接下来，在针对B16F10鼠肿瘤模型的多剂量研究中评估mMEDI7526的安全性曲线。在第1天给小鼠植入B16F10肿瘤，并且在第11天将肿瘤大小＞100mm3的小鼠随机化，随后在第11、13、19和21天进行治疗，如图31所示。在严重压力下考虑体重减轻超过20％的小鼠并从研究中去除。在第13天第2次给药后即刻，mCD40L组中的2只小鼠和CD40L+抗PDL1组中的4只小鼠具有＞20％的体重减轻。相比之下，在第二次给药后，给药mMEDI7526的小鼠均未显示＞20％的体重减轻。这些数据进一步表明mMEDI7526比单独的mCD40L或与抗PDL1组合更可耐受。
接下来在B16F10同系小鼠模型中测试mMEDI7526。如图31中所述设置模型。与PBS对照相比，剂量范围为从20至35mg/kg的mMEDI7526降低了B16-F10小鼠模型中的肿瘤体积和/或延缓的肿瘤生长(图32)。25mg/kg剂量的mMEDI7526具有最强的肿瘤生长抑制：在研究结束时，接受25mg/kg治疗的70％小鼠肿瘤大小小于500mm3。因此，mMEDI7526在低应答性肿瘤模型中展示出显著的抗肿瘤活性。
剂量优化。在B16F10模型中，如图33示出的，优化mMEDI7526的给药方案。将mMEDI7526以25mg/kg在植入B16F10肿瘤细胞后第10天给药一次，或在第10天和第14天，或第10天和第17天给药两次。单个剂量mMEDI7526 CD40L-FP的治疗显著降低肿瘤体积和/或延迟肿瘤生长。然而，两种剂量比单个剂量具有更好的抗肿瘤活性(第10天和第14天或第10天和第17天)。另外地，用mMEDI7526处理的小鼠没有显著的体重减轻或其他可观察到的作用。因此，mMEDI7526的降低的给药频率可以保持显著的抗肿瘤活性并减少主要毒性。
体内T细胞活化在B16F10小鼠模型中评估mMEDI7526对T细胞活化的影响。在植入B16F10肿瘤细胞后第10天以25mg/kg给药mMEDI7526，并在mMEDI7526治疗后第2天和第4天回收脾T细胞。如图34示出的，mMEDI7526的治疗导致CD4+和CD8+T细胞上的早期活化标志物CD69的上调。此外，在第4天，效应记忆CD8+T细胞(CD44高CD62L低)和效应CD8+T细胞(KLRG1+)的百分比显著增加。此外，效应CD8+T细胞(KLRG1+)的百分比不仅在脾中增加，而且在肝和肿瘤中也增加(图35)。总之，这些数据表明mMEDI7526诱导荷瘤小鼠中CD4+和CD8+细胞的稳健的活化。
血清细胞因子曲线分析。在mMEDI7526和mCD40L治疗后监测血清细胞因子曲线的变化。将初试小鼠给药10mg/kg的mCD40L(mMEDI5083，其为鼠源化MEDI5083)或16mg/kg的mMEDI7526，并如图36所示在治疗后的多个时间点收集血液。从全血中分离血清，并进行MSD多重plex分析(U-PLEX TH1/TH2组合)用于检测细胞因子，包括IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-13、KC/GRO、和TNF-α。与mCD40L相比，mMEDI7526诱导类似水平的IFN-γ和IL-12，但显著更低的TNF-α和IL-6(图37)。在对B16F10小鼠的单独研究中，剂量在16至35mg/kg之间的mMEDI7526诱导了较少的IL-6和TNF-α，但相当水平的IFN-γ和IL-12。因此，mMEDI7526治疗诱导抗肿瘤细胞因子，但限制了导致全身毒性的细胞因子的产生。
MEDI7526治疗与化学疗法有效结合。在单独研究中，评估了MEDI7526单独或与化学疗法氟尿嘧啶(5FU)组合治疗CT26鼠肿瘤的效果。在小鼠中皮下植入总共50万个CT26肿瘤细胞，并监测肿瘤约10天，直至测量它们约100mm3，此时基于它们肿瘤的体积将小鼠随机化为治疗组。第二天，用25或50mg/kg剂量的5FU或经腹膜PBS对照，随后用25或35mg/kgmMEDI7526经腹膜开始治疗，此后每周一次，持续3周。每周两次测量肿瘤体积和体重直至研究结束，并且结果示出于图65中。用25和50mg/kg的5FU治疗不能充分抑制CT26肿瘤生长，且单独的MEDI7526只能抑制小鼠的亚组而不是所有小鼠的肿瘤生长。5FU和MEDI7526的组合比单个治疗在更多小鼠中导致肿瘤生长抑制。5FU 50mg/kg加MEDI752635mg/kg治疗具有最佳效果，并且导致该组中所有小鼠中肿瘤生长的抑制。该结果表明，与化学疗法的组合可以进一步增强通过MEDI7526介导的抗肿瘤活性。
MEDI7526具有治疗肝肿瘤的潜力。进一步评估MEDI7526的靶器官。在生物分布研究中，将B16F10肿瘤细胞植入小鼠中，随后注射Zr-89标记的抗体(同种型对照以及MEDI5083和7526的鼠替代物)，如图66A所示。通过PETCT检测标记的抗体的分布。与同种型对照抗体相比，MEDI5083和MEDI7526均在肝和脾中累积。进一步证实Kupffer细胞，一种表达CD40和PD-L1的肝巨噬细胞(图66B)。这些结果表明肝中的Kupffer细胞是MEDI5083和MEDI7526的靶细胞。
以上结果导致了关于MEDI7526和MEDI5083是否可以治疗小鼠肝肿瘤的进一步调查。在该实验中，用荧光素酶基因转染CT26肿瘤细胞，并将五十万转染的CT26-Luc细胞直接植入小鼠肝中。小鼠接受CT26细胞并允许从手术中恢复，并在肿瘤植入后第3、10和17天给药同种型对照抗体、MEDI5083、抗PDL1、MEDI5083加抗PDL1或MEDI7526。所有测试试剂均以21.9mg/kg进行给药，除了MEDI7625以35mg/kg的摩尔当量给药。在第21天，处死小鼠，并回收肝脏以测量荧光素酶活性，这是肝中肿瘤负荷的指示物。仅MEDI7526治疗有效地将肿瘤负荷降低至无肿瘤小鼠的水平(图67)，表明MEDI7526具有治疗肝癌的潜力。
此外，如通过流式细胞术分析所确定的，MEDI7526治疗与第14天CD8T细胞数量增加和第21天抗原特异性CD8T细胞中更多活化表型相关(图68)。
在CT26肝肿瘤模型中评估测试试剂的安全性曲线(图69)。记录了小鼠的体重显著减轻、严重压力的指征和死亡。在第1次给药后第2天，mMEDI5083组和mMEDI5083加抗PDL1组的所有小鼠体重减轻约10％。相比之下，给药mMEDI7526的小鼠均未在相同时间点显示＞5％的体重减轻(图69A)。此外，在3次给药后发现所有接受mMEDI5083加抗PDL1治疗的小鼠死亡(图69B)。总之，这些数据进一步表明mMEDI7526比单独的mMEDI5083或与抗PDL1组合更可耐受。
实例号18.NF-KB的OX40L活化
将用OX40蛋白转染的Jurkat NF-κB-Luc报告基因T淋巴细胞维持在RPMI1640(吉毕科公司(GIBCO))加10％HI-FBS(吉毕科公司(GIBCO))和1％Pen Strep(吉毕科公司(GIBCO))中。在实验当天，收获细胞，调节至2×106个细胞/mL，并以每孔90μL的体积添加至U型底96孔板(康宁公司(Corning))中。将在完全RPMI1640中制备的十(10)μL的测试试剂(10×)添加每个孔中，并将细胞置于37℃培养箱中4小时。制备荧光素酶试剂(
Figure BDA0002478719010000572
荧光素酶测定底物；普洛麦格公司(Promega))，使其平衡至室温，并添加(100μL)至每个孔中。将板置于室温下5min，随后立即在
Figure BDA0002478719010000571
M5读板仪上读取。图38症明抗PD1-OX40L BFP在用OX40转染的Jurkat细胞中活化NF-KB途径。
在单独研究中，针对NF-κB活性，测定工程化以表达具有OX40胞外域和GITR胞内结构域的人OX40-GITR融合蛋白(Jurkat/OX40-GITR-FP2)的Jurkat NF-κB-Luc报告基因细胞系，如之前段落中示出的。图71C证明PD1/OX40L(OX40L的所有亚单元具有野生型蛋白质序列)诱导稳健的NF-κB活化，然而，PD1/OX40L 1WT和PD1/OX40L 2WT均未能活化Jurkat报告基因细胞中的NF-κB。这些数据证实，OX40上的所有六个F180残基对于OX40下游信号传导的活化是关键的，并且表明PD1/OX40L 1WT和2WT具有最小的OX40介导的T细胞活化功能。
实例号19.抗PD-L1-OX40L BFP的小鼠研究
产生鼠OX40配体IgG1融合蛋白(mOX40L FP)，该蛋白结合小鼠OX40并触发OX40信号传导，并用作MEDI6383人OX40配体IgG4P融合蛋白的小鼠OX40激动剂替代物。参见美国专利号9,718,870。克隆80是针对小鼠PD-L1的大鼠嵌合小鼠IgG1 D265A抗体。mOX40L FP和克隆80的抗肿瘤活性作为单一疗法或作为组合疗法在源自MCA205的荷瘤小鼠(小鼠同系肉瘤细胞系)中和在CT26(小鼠结肠腺癌细胞系)中进行评估。
在第1天，每组十只C57BL/6或Balb/c小鼠分别用MCA205(左图)细胞或CT26(右图)细胞经皮下接种。将对照物品(盐水)和测试物品抗PD-L1克隆80mAb(10mg/kg)、mOX40L FP(9.8mg/kg)、或10mg/kg抗PD-L1mAb和9.8mg/kg mOX40L FP的组合针对MCA205，在第12、15、18、和22天经腹膜给予，并针对CT26在第4、7、11、和14天经腹膜给予。随时间的个体肿瘤体积示出于在图39中的图中。IP＝经腹膜；SC＝皮下。
与克隆80组合给予mOX40L FP比给予对照物品或单独的试剂导致更大的抗肿瘤活性(图39)。因此，OX40激动剂和PDL1拮抗剂疗法在临床前模型中提供补充的抗肿瘤益处。
如与不结合PD-L1的双特异性分子相比，由PDL1结合部分组成的双特异性分子可增加PD-L1+肿瘤中的保留时间。为了测试这个假设，在小鼠中进行了体内生物分布研究。
将双特异性分子与螯合剂(ITC-DTPA，Macrocyclis，达拉斯，得克萨斯州)轭合以实现111铟放射性标记(Brom等人，2012)，目标是约600MBq/mg的特异性活性。通过脱盐柱(PD-10EconoPac，伯乐公司(BioRad))纯化后，放射性标记分子的放射化学纯度(RCP)通过瞬时薄层色谱验证，以确保标签功效，其中RCP＞95％，且在室温稳定性可达4小时。
对于生物分布研究，将雌性裸鼠(Envigo)经皮下接种U87-MG癌细胞(在0.1mL中1x107个细胞)，并随机化成平均肿瘤体积为0.2cm3的不同的治疗组。所有随机化小鼠静脉内注射单个剂量的放射性标记分子(20μg/0.2Mbq/kg体重)。然后在放射性标记给药后1小时、1天、和4天人道地处死亚组的动物。为了产生生物分布图，收集器官/组织(即血液、肌肉、肺、肝、脾、肾、肿瘤、尾巴)，称重，并使用γ计数器(Wizard，珀金埃尔默公司(PerkinElmer))测量放射活性水平以计算注射剂量百分比(％ID)和每克组织的％ID。生物分布图阐明了每克组织校正的注射剂量的平均百分比(±SEM)，并比较了注射后1小时、1天、和4天所示组织中放射性标记的MEDI5615和对照的摄取。每组n＝5，除了对于“第4天BFP3”每组n＝6。星号阐明使用双尾t检验的显著差异(p＜0.05)。
如通过抗PD-L1特异性免疫组织化学确定的，U87MG肿瘤表达高水平的PD-L1(图40A)，并且用于生物分布研究(图40B)。将亚治疗量的放射性标记的双特异性分子注射到携带U87MG肿瘤的小鼠中；一个靶向PD-L1和OX40作为IgG4P BFP2分子(MEDI5615；1X Fc结构域)，一个靶向PD-L1和OX40作为IgG1 BFP3分子(1X Fc结构域)，并且一个是不与PD-L1或OX40(R347-OX40L F180BFP2)结合的对照物品。1小时后首先在血液中检测到双特异性分子并迅速清除，这样使得1天后血液中很少至没有检测到放射性标记。MEDI5615和对照物品也快速分布到肝和脾而独立于靶标结合，并且在第4天保持在这些组织中(图40C)。相反，如与对照物品相比，MEDI5615渗透并保留在肿瘤中，同时两种分子都从血液中清除。
PD-L1/OX40L BFP3分子证明与MEDI5615类似的保持在肿瘤中的能力(图41)，表明肿瘤保留独立于Fc结构域和分子形式。如与对照物品相比，在MEDI5615和PDL1/OX40L BFP3分子之间在第1天和第4天观察到的肿瘤更新差异表明肿瘤保留是由与PD-L1结合的分子介导的。
实例号20.抗PD-L1-OX40L BFP的活性
MEDI5615(PD-L1/OX40L BFP2双特异性分子)通过人OX40活化信号传导的能力在一组2-细胞报告基因生物活性测定中，使用遗传工程化以表达人OX40的NF-κB-荧光素酶T-细胞报告基因系进行评估(图42)。PD-L1介导的药物交联通过表达细胞表面PD-L1的MDA-MB231细胞发生。通过工程化以表达Fcγ受体IIa(CD32A)的HEK293细胞发生Fcγ受体介导的药物交联。T-细胞活化被测量为响应于初级人T-细胞活化下游的NF-κB信号传导途径的刺激的增加的荧光素酶活性。NF-κB信号传导发生在OX40信号传导的下游，并且据报道与T细胞活化的其他测量例如增殖和细胞因子释放相关。测量可溶的MEDI5615连同与MDA-MB231细胞或HEK293细胞孵育的MEDI5615的生物活性，这些MDA-MB231细胞表达细胞表面PD-L1，这些HEK293细胞工程化以表达个体Fcγ受体。
在使用前，将OX40Jurkat报告细胞在组织培养孵育箱中以0.5-1.5x 106/mL的密度在完全RPMI培养基中培养。将细胞在生物测定前一天以106个细胞/mL的密度传代。收集OX40Jurkat报告基因细胞、MDA-MB231细胞、和CD32A HEK细胞并沉淀。将双特异性分子在完全RPMI中连续稀释3倍。将OX40报告基因细胞加呈递细胞以每孔100，000个细胞添加至96孔板中。如上所述，将双特异性分子添加至完全RPMI培养基中的细胞中，至以1μg/mL开始并稀释的终浓度。在16-24小时孵育时间后，将100μL重构的
Figure BDA0002478719010000601
荧光素酶测定溶液(普洛麦格公司，麦迪逊，威斯康辛州)添加至每个孔并混合以裂解细胞，且然后孵育以平衡荧光素酶信号。将
Figure BDA0002478719010000611
/样品裂解物(150μL)从各孔转移至96孔白壁测定板，以使用珀金埃尔默EnvisionTM发光读取器进行检测和发光读取。用于Windows的GraphPad Prism(GraphPad软件公司(GraphPad Software)，圣地亚哥，加利福尼亚州)用于绘制双特异性分子的浓度(x轴是蛋白质浓度的log10)相对于发光RLU(y轴)。
如见于图43，如通过NF-κB信号传导所测量的，MEDI5615在表达Fcγ受体(表达CD32A的HEK293细胞)和PD-L1(MDA-MB231细胞)的细胞存在下，在表达人OX40的Jurkat T细胞中活化OX40信号传导途径，其中EC50值分别为52pM和18pM。在表达能够交联MEDI5615的PD-L1或Fcγ受体的细胞的不存在下，测量了最小的报告基因细胞系活性。
接下来，在人T细胞共培养测定中测试MEDI5615克服天然CD4+CD25+Treg(nTreg)细胞对效应CD4+CD25-T细胞增殖的抑制功能和减少IL-10从nTreg释放的能力。
人CD4+效应和Treg细胞使用人Treg细胞分离试剂盒按照制造商的说明(生命技术公司(Life Technologies)，佩斯利，英国)从PBMC中分离。该过程涉及通过抗体标记非CD4+细胞阴性选择总CD4+细胞，并然后通过使用基于磁珠的耗竭去除抗体阳性细胞。Treg细胞通过标记抗CD25从效应CD4+细胞中分离，接着是使用磁珠的阳性选择，这些磁珠随后从分离的细胞中去除。
使用CellTraceTM CFSE细胞增殖试剂盒(生命科技公司(Life Technologies)，佩斯利，英国)用CFSE标记效应CD4+CD25-T细胞。将效应T细胞和Treg细胞在涂覆有抗小鼠CD3mAb的96孔板的孔中和在可溶性抗小鼠CD28抗体存在下在37℃以1∶1或1∶2的比例共培养4天，这些可溶的抗小鼠CD28抗体与对照和测试物品混合。在布雷菲德菌素A存在下用PMA加伊屋诺霉素再刺激细胞另外的4小时，固定，并使用胞内细胞因子染色方法通过流式细胞术针对IL-10产生进行测试。通过流式细胞术评估分裂的效应CD4+T细胞的百分比和在测定结束时产生IL-10的Treg细胞百分比。
测定分裂的效应T细胞(CFSE低)的百分比；非活的(eFluor阳性)细胞和调节性T细胞(CFSE阴性)被区分，并从分析中排除。在排除非活的细胞和效应T细胞(CD25阴性)后评估产生IL10的Treg细胞的百分比。
在用抗CD3和抗CD28培养后，在Treg细胞的不存在下的效应T细胞分裂(图44，顶部)。添加测试物品后，进入细胞周期的效应T细胞的百分比没有增加。在1∶2效应物与Treg比例的Treg存在下，如与对照物品(即未处理的，NIP228 IgG4P和抗PD-L1IgG4P)相比，由OX40激动剂(即scOX40L 2xG4S(SEQ ID NO：35)IgG4P、MEDI5615、和抗PD-L1 IgG4P+scOX40L 2xG4S(SEQ ID NO：35)IgG4P)组成的测试物品统计上增加了分裂的效应T细胞的百分比。在具有1∶1效应物与Treg比例的培养物中未观察到效应T细胞分裂百分比的增加。
如与对照物品相比，由OX40激动剂组成的测试物品显著降低了与效应T细胞共培养物中产生IL-10的Treg的百分比(图44，底部)。这些结果表明MEDI5615与OX40激动剂的功能类似，以克服Treg细胞的抑制活性和IL-10产生。
接下来，评估了在超抗原，葡萄球菌肠毒素B(SEB)存在下基于PD-L1和OX40的双特异性分子共刺激人PBMC的能力。将抗人CD3(克隆SK7)抗体预涂覆于96孔板的孔中。从健康供体分离人PBMC，用抗CD3，SEB(25ng/mL)培养72小时，并测试所示的测试物品和培养物上清液的IL-2(图45A-B)。如通过电化学发光ELISA确定的，BiS2和BiS3 OX40/PD-L1双特异性抗体(图45A；还参见美国专利申请号15/588,271)和MEDI5615(图45B)诱导人PBMC以浓度依赖性方式产生IL-2。双特异性分子产生的IL-2的量大于人PBMC培养物产生的IL-2量，这些人PBMC培养物含有OX40抗体(抗OX40 IgG4P)、PD-L1抗体(抗PD-L1 IgG4P)、OX40和PDL1抗体组合、单独或组合的对照双特异性融合蛋白(PDL1-OX40 F180A BFP2，R347-OX40LBFP2)、和阴性对照物品(NIP228 IgG4P；R347-OX40L F180A BFP2)。
接下来，进行基于细胞的平衡结合测定以测量MEDI5615(PD-L1/OX40L BFP2)与工程化CHO细胞的细胞表面上表达的人和食蟹猴OX40和PD-L1结合的表观亲和力。
将测试物品在19个3倍稀释液中系列稀释至CHO细胞，该CHO细胞工程化以表达人或食蟹猴OX40、PD-L1或OX40和PD-L1两者。将细胞和测试物品(n＝3)在4℃孵育1小时，用FACS缓冲液(PBS+2％热灭活的新生小牛血清)洗涤三次，与
Figure BDA0002478719010000632
647标记的山羊抗人IgG二级抗体和碘化丙啶(PI)孵育，用FACS缓冲液洗涤，并在流式细胞术上分析。在荧光补偿后，活(PI阴性)单细胞被门控并且确定二级抗体的平均荧光强度(MFI)以报告每个测试物品的结合水平。绘制测试物品结合的MFI相对于融合蛋白浓度(M)以产生结合曲线，从中确定表观KD和受体占有值。参见图46A-F。
MEDI5615与各种CHO细胞相互作用的平均平衡解离常数(KD)报告于下表4中。
表4.PDL1/OX40L BFP2和对照分子与CHO细胞结合的表观亲和力(KD)，这些CHO细胞经工程化以过表达人和食蟹猴OX40、PD-L1以及OX40和PD-L1两者
Figure BDA0002478719010000631
KD＝平衡结合解离常数；CI＝置信区间；ND＝未测定
为了确定与细胞结合的测试物品的表观KD，使用图46A-F中的数据采用一个位点的非线性回归(曲线拟合)方程(特异性结合)。结果揭示，MEDI5615与表达细胞表面人OX40的CHO细胞相互作用的平均平衡解离常数(KD)为180pM，与表达细胞表面人PD-L1的CHO细胞相互作用的KD为88pM，且与表达人OX40和人PD-L1的CHO细胞相互作用的KD为270pM。MEDI5615与表达细胞表面食蟹猴OX40的CHO细胞相互作用的KD为56pM，与表达细胞表面食蟹猴PD-L1的CHO细胞相互作用的KD为110pM，与表达食蟹猴OX40和食蟹猴PD-L1的CHO细胞相互作用的KD为99pM。使用能够仅结合一种抗原OX40或PDL1的对照BFP2分子获得了类似的结果。
表5中报道了MEDI5615与各种CHO细胞相互作用在平衡时20％、50％、和90％的人OX40受体占有率。
表5.PD-L1/OX40L BFP2和对照分子与CHO细胞结合的受体占有值(EC20、EC50、EC90)，这些CHO细胞经工程化以过表达人和食蟹猴OX40、PD-L1以及OX40和PD-L1两者
Figure BDA0002478719010000641
EC＝有效浓度；ND＝未测定
使用GraphPad Prism软件从非线性回归分析使用图46A-F中表示的数据的4-参数拟合S形剂量-应答曲线计算ECx值。
为了确定20％、50％、和90％的受体被测试物品占有的浓度，首先使用方程X＝对数[X]转化浓度值(M)，随后使用图板棱柱(GraphPad Prism)软件从S形剂量应答(可变斜率)结合曲线对f＝20、f＝50、和f＝90确定EC任何值(ECf)。ECf是给出了底部和顶部渐近线之间方式的应答百分比的测试物品的浓度，并表示20％(f＝20)、50％(f＝50)、和90％(f＝90)受体占有率，其中计算曲线的顶部表示100％的受体占有率。
在工程化的CHO细胞上达到平衡时达到20％、50％、或90％人OX40受体占有率所需的MEDI5615浓度分别计算为45pM、180pM和1600pM。另外，在工程化的CHO细胞上达到平衡时达到20％、50％、或90％食蟹猴OX40受体占有率所需的MEDI5615浓度分别计算为14pM、56pM和500pM。
在工程化的CHO细胞上达到平衡时达到20％、50％、或90％人PD-L1占有率所需的MEDI5615浓度分别计算为22pM、88pM和790pM。另外，在工程化的CHO细胞上达到平衡时达到20％、50％、或90％食蟹猴PD-L1占有率所需的MEDI5615浓度分别计算为27pM、110pM和950pM。
在工程化的CHO细胞上达到平衡时达到20％、50％、或90％人OX40和PD-L1占有率所需的MEDI5615浓度分别计算为67pM、270pM和2，400pM。另外，在工程化的CHO细胞上达到平衡时达到20％、50％、或90％食蟹猴OX40和PD-L1占有率所需的MEDI5615浓度分别计算为25pM、99pM和890pM。
因此，MEDI5615可以结合单独或一起表达细胞表面人和食蟹猴OX40和PDL1的细胞。
实例号21.PD-1蛋白在活化的人PBMC中的下调。
在该研究中，评估了BFP在活化的人PBMC中下调PD-1蛋白的能力。
刺激和蛋白质印迹方案：将新鲜分离的人PBMC以1百万个细胞/mL重悬于含有1μg/mL抗CD3(克隆HIT3a，生物传奇公司(Biolegend))和抗CD28(克隆CD28.2，生物传奇公司(Biolegend))的完全RPMI1640培养基中(参见图47)。刺激3天后，收集细胞，洗涤，并以1百万/mL重悬于新鲜的完全RPMI1640培养基中。将总共2mL细胞添加至6孔板的每个孔中。用10nM的测试材料刺激细胞24小时。在具有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解细胞，并通过免疫印迹分析全细胞裂解物。用于蛋白质印迹的抗体列于表6中。
表6.蛋白质印迹分析以检测PD1、OX40、和GITR的蛋白质水平
Figure BDA0002478719010000661
结果示出于图47、48和74中。示出了抗PD1-OX40L BFP触发活化的人PBMC中PD1蛋白的降解(图47)，并且示出了抗PD1-GITRL BFP(MEDI3387)触发活化的人PBMC中PD1蛋白的降解(图48)。我们发现与同种型对照抗体相比，PDI/OX40L 2WT和1WT也诱导显著的PD1降解(图74)。因此，诱导PD1蛋白内化和降解是由OX40内化驱动的，但可以独立于OX40活化。
实例号22.NF-KB的GITRL活化
该测定利用Jurkat NF-κB Luc FL hGITR克隆29细胞系，其中通过GITR配体的GITR受体的接合诱导NFAT启动子驱动的荧光素酶活性。
将用GITR蛋白转染的Jurkat-Blue NF-κB/Luc FL hGITR克隆29报告基因T淋巴细胞维持在RPMI-1640加GlutamaxTM(英杰公司(Invitrogen))加10％HI-FBS(英杰公司(Invitrogen))，1％Pen/Strep(英杰公司(Invitrogen))培养基中。收获细胞，调节至1x106个细胞/mL，并添加(在50μL中)至平底96孔板的孔中(5x104个细胞/孔；Falcon)。向每个孔中添加五十微升的2X测试试剂。
Figure BDA0002478719010000671
(普洛麦格公司(Promega))缓冲液在室温解冻，然后在黑暗中在测量当天使用。孵育4小时40分钟后，允许板平衡至室温20分钟，然后将100μL室温重构的
Figure BDA0002478719010000672
试剂添加至96孔板中的每个孔中，并在测量之前在板振荡器中孵育＞10分钟。使用在Envision读板器(珀金埃尔默)上的优化的超灵敏LUM 96(opti)0.1秒读数测量发光读数。
图49证明抗PD1-GITRL BFP(MEDI3387和MEDI5771)在用GITR转染的Jurkat细胞中活化NF-κB途径。
实例号23.PD-1/GITRL双特异性并行结合BIO-HGITR和HPD-1的OCTET测试。
该实验的目的是测试PD1/GITRL双特异性融合蛋白使用OCTET生物层干涉法同时结合huPD-1和huGITRL(GITR配体)以确定相互作用的能力。
在此方案中使用的材料在下表7中概述。
表7.Octet测定测试材料。
Figure BDA0002478719010000673
Figure BDA0002478719010000681
生物素化的rhGITR/Fc与链霉亲和素传感器结合，随后关联IO双特异性构建体。在短暂的解离阶段后，然后测试构建体同时结合rhPD-1/Fc的能力。
使用Octet RED384系统和Octet数据分析软件版本9(颇尔生命科学公司(Pall)ForteBio)通过生物层干涉法(BLI)评估双特异性融合蛋白的并行结合。首先在测定缓冲液(达尔伯克PBS中的1％BSA，0.02％Tween 20)中平衡高精确度链霉亲和素(SAX)浸入和读数生物传感器10分钟。在捕获生物素化的重组人GITR/Fc(689-GR-100，R&D系统公司(R&DSystems))3分钟之前，在测定缓冲液中建立基线1分钟。在经由GITRL结构域捕获双特异性融合蛋白5分钟之前，在测定缓冲液中建立第二基线30秒。在测定缓冲液中进行解离/基线1分钟，然后通过双特异性融合蛋白的抗体组分捕获重组人PD-1/Fc(1086-PD-050，R&D系统公司(R&D Systems))5分钟。结果示出于图50中。
实例号24.NFAT的活化中PD-1活性
该测定利用CHO K1OKT3-CD14(低)hB7H1(高)cl 2细胞作为抗原呈递细胞，并利用Jurkat NFAT Luc2PD1克隆3L-B9细胞作为抗CD3活化的报告基因细胞系。通过PD-1阻断抗体的PD-1对PD-L1相互作用的抑制导致NFAT启动子驱动的荧光素酶表达的活化。
将用PD-1和CHO K1OKT3-CD14(低)hB7H1(高)cl 2细胞转染的Jurkat NFATLuc2PD1克隆3L-B9报告基因T淋巴细胞维持在RPMI-1640加Glutamax(英杰公司(Invitrogen))加10％HI-FBS中(英杰公司(Invitrogen))，非必需氨基酸(英杰公司(Invitrogen))培养基中。收获细胞，调节至1x106个细胞/mL，并添加(在50μL中)至平底96孔板的孔中(5x104个细胞/孔；Falcon)。向每个孔中添加五十微升的2X测试试剂。
Figure BDA0002478719010000691
(普洛麦格公司(Promega))缓冲液在室温解冻，然后在黑暗中在测量当天使用。孵育4小时40分钟后，允许板平衡至室温20分钟，然后将100μL室温重构的
Figure BDA0002478719010000692
试剂添加至96孔板中的每个孔中，并在测量之前在板振荡器中孵育＞10分钟。使用在Envision读板器(珀金埃尔默)上的优化的超灵敏LUM 96(opti)0.1秒读数测量发光读数。
图51证明抗PD1-GITRL BFP(MEDI3387和MEDI5771)在用PD-1转染的Jurkat细胞中活化NF-κB途径。这些数据与来自上述实例8的数据一致证明MEDI3387和MEDI5771BFP证明与人PD-1和GITR并行结合。
实例号25.抗PD-1_IGG_GITRL体内测定
小鼠和肿瘤模型：8周至10周龄的BALB/c或C57BL/6雌性小鼠获自查尔斯河实验室(英国)(Charles River UK Ltd.)或哈兰实验室公司(Harlan Laboratories Inc)。将CT26(ATCC)或B16F10细胞在PBS中的100mL悬浮液以5x 106个细胞/mL或5x104个细胞/mL的细胞密度经皮下注射到每只动物的右侧腹。将B16F10细胞系植入50％PBS和50％生长因子减少的和不含酚红的
Figure BDA0002478719010000693
(康宁公司(Corning))中。在植入前将细胞系培养至有限的传代，并周期性地筛选以确认支原体的不存在。经由STR图谱分析(IDEXX生物研究(IDEXXBioresearch))进一步验证细胞，并筛选一组小鼠病毒(查尔斯河实验室(CharlesRiver))。
基于肿瘤体积将可测量的肿瘤随机化成各自的组。每个肿瘤的长度(mm)和宽度(mm)用电子卡尺每周测量3次。基于公式[长度(mm)x宽度(mm)2]/2计算肿瘤体积(mm3)。如果不存在可测量的肿瘤或持续的肿瘤生长抑制，使得在研究结束时体积小于200mm3，则将肿瘤生长应答分类为应答。
进行粉末计算以确定体内研究的组大小。小鼠经腹膜给药mGITRL-FP、抗程序性细胞死亡蛋白-1rIgG2a(PD-1，克隆RMP1-14，BioXCell公司)、或抗小鼠-PD1/GITRL双特异性mAb。在肿瘤细胞接种后第6天开始或当肿瘤达到200mm3的体积时，取决于研究，给药小鼠不同的浓度。结果示出于图52中。
实例号26.抗PD-1_IGG_GITRL体内测定
药代动力学和药效学(PK/PD)研究
食蟹猴被考虑是药理学相关的非临床物种，用于测试PD-1/GITRL双特异性融合蛋白的功能活性。在食蟹猴的非GLP(良好实验室实践)研究中评估PD-1/GITRL双特异性融合蛋白的药代动力学(PK)和药效学。在剂量范围为5mg/kg至50mg/kg的单次静脉内(IV)给药后，在食蟹猴(n＝5；雄性)中评价PK和PD(Ki67阳性CD4+和CD8+总记忆T细胞百分比)。在给药前和给药后第1、3、8、11、15、18、22和29天收集血液样品，通过流式细胞术样品采集当天进行分析。Ki67结果显示CD4+和CD8+总记忆T细胞(Ki67)的剂量依赖性增加(图53A-B)。
在第8、15、22和29天，在给药后0.5、6、24、48和96小时也收集血液样品用于PK评估。总之，PD-1/GITRL双特异性融合蛋白导致C最大和AUC0-inf的大约成比例增加，表明在该剂量范围内的线性药代动力学(图54)，具有1.12至2.19天的短半衰期(参见表8)。
表8.PD-1/GITRL双特异性融合蛋白的平均药代动力学参数
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这些值表示为平均值(标准偏差)。AUClast＝浓度时间曲线(一直到最后一次可测量的浓度)下的面积；AUCINF＝浓度时间曲线(一直到无穷时间)下的面积；C最大＝最大观察浓度；CL：系统清除率；T1/2＝半衰期；Vss：分布的末期体积。
MEDI3387，平均C最大值为111和1200mg/L，并且5和50mg/kg剂量的平均AUC0-inf值分别为125和1050mg天/L。剂量归一化的AUC值对于两个剂量组大约类似。对于5和50mg/kg剂量水平，平均AUC0-inf/剂量分别为24.9和20.9。MEDI5771，平均C最大值为77.1和730mg/L，并且5和50mg/kg剂量的平均AUC0-inf值分别为108和800mg天/L。剂量归一化的AUC值对于两个剂量组大约类似。对于5和50mg/kg剂量水平，平均AUC0-inf/剂量分别为21.5和16.0。
实例号27.抗PD-1_IGG_GITRL BFPS在初级人T细胞再活化测定中增强T细胞效应功能
Cytostim T细胞再活化测定的示意图示出于图55A中。
按照制造商推荐的方案，使用菲可帕克加(Ficoll-Paque PLUS)(GE医疗集团(GEHealthcare)17-1440-02)从白细胞锥(由NHSBT，阿登布鲁克斯医院(Addenbrooke′sHospital)提供)制备PBMC。根据制造商推荐的方案，使用T细胞富集试剂盒(干细胞技术公司(Stemcell)目录号：19051)通过来自供体PBMC的阴性选择分离T细胞。然后将T细胞以1E6个细胞/mL的浓度重悬于T细胞培养基(含有补充有5％人AB血清[西格玛公司(Sigma)]和1％青霉素/链霉素的GlutamaxTM[吉毕科公司(Gibco)]的RPMI1640)中，并在之前涂覆有抗人CD3抗体(克隆OKT3，e生物科学公司(Ebioscience)目录号：16-0037-85)的6孔组织培养板(康宁科斯塔公司(Costar)，目录号：3506)中在37℃，5％CO2刺激96小时。为了涂覆6孔板，向每个孔中添加1mL含有0.2μg的OKT3的PBS，并在4℃孵育过夜。在使用之前用PBS洗涤板两次。
然后洗涤T细胞并在新鲜T细胞培养基中在37℃，5％CO2不刺激孵育另外24小时。随后使用EasySepTM人CD3阳性选择试剂盒II(Stemcell，17851)根据制造商推荐的方案，将这些“休息的”T细胞以1∶4的比例与之前已经耗竭T细胞的自体PBMC混合。将得到的细胞混合物以四百分之一的浓度等分到补充有人Cytostim(美天旎生物技术公司(MiltenyiBiotec)，130-092-173)的T细胞培养基中的96孔U型底组织培养板(康宁科斯塔公司(Costar)8797BC)上，与测试药物或对照mAb一起。每个反应的总体积为200μL并含有5E5细胞。将反应在37℃，5％CO2孵育72小时，然后去除上清液，并随后通过ELISA测试INF-y的释放。
结果示出于图55B-C中。MEDI3387和MEDI5771比单特异性(PD-1和GITRL)分子组合的效力高＞4x，并因此阐明了由于BFP形式而产生的意想不到的协同效应。上述体外数据(图55D-E)证明MEDI3387和MEDI5771与GITRL(MEDI1873)/Durva(MEDI4736)或MEDI1873/aPD-1 mAb(LO115)的组合的生物等效性。体内数据证明了MEDI1873/aPD-1 mAb组合的生物等效性。
实例号28.体内GITR的荧光生物分布
在第0天，将年龄为6/8wk的雌性SCID小鼠经皮下注射人肺肿瘤细胞系NCI-H358(5e5细胞/小鼠)。在第25天发生单次静脉内给予荧光(IRDye 800CW)标记的抗体(10mg/kg，剂量体积为100μL/25g)，此时肿瘤大小大约200-300mm3。在体内注射前两周，根据制造商的方案，用IRDye 800CW标记所有三种抗体。将每个治疗组的五只小鼠麻醉并在给药后1小时、24小时、和96小时使用IVIS光谱成像。为荧光染料选择最佳波长设置，并使用PerkinElmer图像分析软件确定肿瘤和肝区的辐射效率。结果证明MEDI3387、MEDI5771和MEDI1873的递送生物分布图之间没有显着差异(图56)。
实例号29.抗PD-L1-TNF-αBFP触发在T24肿瘤细胞表面上的PD-L1蛋白的下调。
T24是人膀胱移行癌细胞系，该细胞系组成型表达TNF-α受体和PD-L1二者。在该研究中，将T24细胞与10nM浓度的测试材料混合，并在37℃孵育24hr。孵育后，通过洗涤去除游离抗体，用Qifikit(安捷伦公司(Agilent))定量细胞表面上PD-L1蛋白的量。简言之，将处理后的T24细胞与未轭合的抗PD-L1(克隆29E.2A3)在冰上反应30分钟，随后与FITC轭合的F(ab)2山羊抗小鼠IgG另外反应30分钟。记录FITC信号的平均荧光强度，并根据制造商的说明计算T24细胞上每个细胞的PD-L1抗原的量。
用
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细胞活力试剂盒(普洛麦格公司(Promega))评估对细胞活力的影响。在该研究中，10,000/孔T24细胞在如上所述处理的不透明壁多孔板中培养，并且在孵育后，将T24细胞与稀释的
Figure BDA0002478719010000732
试剂混合。将内容物在定轨振荡器上混合2分钟以诱导细胞裂解，并将板在室温孵育10分钟以稳定发光信号。在SpectraMax M5读板器上记录发光。图57证明抗PD-L1-TNF-αBFP触发T24肿瘤细胞中PD-L1蛋白的下调。该结果证明，用另一种TNF-α家族蛋白替代CD40的另一种BFP分子可以引发细胞表面PD-L1下调。
实例号29.抗PD-L1-TNF-αBFP触发在T24肿瘤细胞表面上的PD-L1蛋白的下调。
如上文实例号4中所述设定对THP1-blue细胞的另一种测定，除了用抗PDL1-TNF-αBFP3和TNF-αFP和同种型对照替代测试试剂。图58证明抗PDL1-TNF-αBFP活化THPl骨髓细胞上的NF-κB途径。
实例号30.抗PD-1-OX40BFP驱动内化。
以下描述的研究显示，抗PD-1-OX40BFP可以驱动内化。这与OX40臂是否是激动剂还是非激动剂抗体无关。该发现直接适用于自身免疫空间。结果显示，使用用非激动剂但内化抗体构建的双特异性可以驱动活化受体的内化。参见图63-64和70-74。这些结果还显示PD-1的降解独立于该双特异性环境中的OX40激动剂功能。
结论
MEDI7526与CD40L FP类似，诱导CD40的快速下调。有趣的是，发现MEDI7526还在多种类型的细胞(包括THP1、MDA-MB-231、和人单核细胞)的细胞表面上触发PD-L1的快速和稳健的下调。所有这些细胞都表达CD40。此外，MEDI7526不仅下调细胞表面的PD-L1，而且还显著降低PD-L1蛋白的总细胞量，表明PD-L1的强制内化可能触发其降解。此外，抗PD-L1-TNF-αBFP类似地触发T24肿瘤细胞中PD-L1蛋白的下调。该结果证明，用另一种TNF-α家族蛋白替代CD40的另一种BFP分子可以引发细胞表面PD-L1下调。据信另外的BFP分子也可以类似地调节PD-L1下调。
本文描述的来自这些新颖双特异性分子的数据证明，将两者组合成一个“支架”产生单独使用组合疗法无法实现的结果。MEDI7526(BFP3)通过其刺激CD40途径和下调PD-L1表达的独特功能，代表了一种有前途的抗癌治疗方法。
类似地，抗PD1-GITRL BFP(MEDI3387)和抗PD1-OX40L BFP示出了触发活化的人PBMC中PD1蛋白的降解，这可能为抗癌提供另一种治疗选择。
图59阐明了针对MEDI7526(BFP3)的所提出的MOA。具体地，通过经由CD40连接活化抗原呈递细胞同时从细胞表面去除PD-L1导致IFN-γ、IL-12、和IL-10的诱导，但不导致TNF-α或IL-6的诱导。诱导的TNF-α和IL-6的不存在与增强的抗肿瘤功能和减轻的体重减轻相关，支持MEDI7526可以诱导增强的抗肿瘤应答且毒性降低的结论。
鼠研究进一步证实MEDI7526具有治疗肝肿瘤的潜力。
其他实施例
从前述说明中，将显而易见的是，可以对本披露所述的发明作出变更和修改以使其适应于不同用途和状况。此类实施例也在以下权利要求的范围内。
本文变量的任何定义中对要素清单的叙述包括将所述变量定义为任何单个要素或所列要素的组合(或次组合)。本文实施例的叙述包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分结合的实施例。
本说明书中提及的全部专利和出版物通过引用方式以相同的程度并入本文，如同每份单独的专利和出版物具体地且个别地指出通过引用的方式结合。
序列ID号
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序列
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Claims (38)

1.一种双特异性融合蛋白，其包含：
单链融合蛋白，该单链融合蛋白包含对第一细胞表面靶标具有特异性的第一结合区、Fc单体、和对第二细胞表面靶标具有特异性的第二结合区，
其中该第一结合区和该第二结合区经由肽接头与该Fc单体共价连接，并且
其中该双特异性融合蛋白能够同时结合该第一细胞表面靶标和该第二细胞表面靶标。
2.如权利要求1所述的双特异性融合蛋白，其中该第一结合区和该第二结合区中的至少一个是Fab片段或受体配体。
3.如权利要求2所述的双特异性蛋白，其中该Fab片段是抗PD-1 Fab片段。
4.如权利要求2所述的双特异性融合蛋白，其中该Fab片段是抗PD-L1 Fab片段。
5.如权利要求1-4中任一项所述的双特异性融合蛋白，其中该Fc单体是IgG1 Fc单体。
6.如权利要求5所述的双特异性融合蛋白，其中该IgG1 Fc单体包含与SEQ ID NO：6具有至少约85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
7.如权利要求1-4中任一项所述的双特异性融合蛋白，其中该Fc单体是IgG4 Fc单体。
8.如权利要求7所述的双特异性融合蛋白，其中该IgG4 Fc单体包含与SEQ ID NO：9具有至少约85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
9.如前述权利要求中任一项所述的双特异性融合蛋白，其中该Fc单体包含铰链区。
10.如前述权利要求中任一项所述的双特异性融合蛋白，其中该Fc单体包含人Fc氨基酸序列。
11.如前述权利要求中任一项所述的双特异性融合蛋白，其中该一种或多种配体亚单元中的至少一种是GITRL。
12.如权利要求1-10中任一项所述的双特异性融合蛋白，其中该一种或多种配体亚单元中的至少一种是OX40L。
13.如权利要求1-10中任一项所述的双特异性融合蛋白，其中该一种或多种配体亚单元中的至少一种是CD40L。
14.如权利要求13所述的双特异性融合蛋白，其中该CD40L配体亚单元包含在位置194处的Trp残基。
15.如权利要求14所述的双特异性融合蛋白，其中该在位置194处的Trp残基是C→W取代。
16.如权利要求1-10中任一项所述的双特异性融合蛋白，其中该一种或多种配体亚单元中的至少一种是TNF-α。
17.如权利要求1-10中任一项所述的双特异性融合蛋白，其中该一种或多种配体亚单元中的至少一种是CD137L。
18.如前述权利要求中任一项所述的双特异性融合蛋白，其中该Fab片段与Fc单体的N末端连接。
19.如权利要求18所述的双特异性融合蛋白，其中该一种或多种配体亚单元与Fc单体的C末端连接。
20.如权利要求1-17中任一项所述的双特异性融合蛋白，其中该Fab片段与Fc单体的C末端连接。
21.如权利要求20所述的双特异性融合蛋白，其中该一种或多种配体亚单元与Fc单体的N末端连接。
22.如前述权利要求中任一项所述的双特异性融合蛋白，其中该单链融合蛋白包含多个配体亚单元。
23.如权利要求22所述的双特异性融合蛋白，其中该多个配体亚单元包含2、3、4、5、6、7、8、9、或10个配体亚单元。
24.如前述权利要求中任一项所述的双特异性融合蛋白，其中该单链融合蛋白包含3个配体亚单元。
25.如权利要求24所述的双特异性融合蛋白，其中该配体亚单元与从N末端至C末端连续地连接的3个配体亚单元形成同源三聚体。
26.如前述权利要求中任一项所述的双特异性融合蛋白，其中该肽接头包含约9个至约20个氨基酸。
27.如权利要求26所述的双特异性融合蛋白，其中该肽接头包含约9个至约15个氨基酸。
28.如权利要求27所述的双特异性融合蛋白，其中该肽接头包含约9个氨基酸。
29.如前述权利要求中任一项所述的双特异性融合蛋白，其中该肽接头包含一个或多个甘氨酸(Gly)或丝氨酸(Ser)残基。
30.如前述权利要求中任一项所述的双特异性融合蛋白，其中该肽接头是GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：33)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：34)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：35)、或GGGGSGGGS(SEQ IN NO：36)。
31.一种二聚体，其包含选自如权利要求1-30所述的双特异性融合蛋白的两种双特异性融合蛋白，其中该二聚体经由Fc单体的相互作用而形成。
32.一种增强受试者中的抗肿瘤免疫应答的方法，该方法包括向该受试者给予如权利要求1-31中任一项所述的分离的融合蛋白或二聚体。
33.如权利要求32所述的方法，其中该受试者患有癌症。
34.如权利要求33或34中任一项所述的方法，其中该方法增强了免疫应答和/或抗癌应答中的一种或多种。
35.如权利要求33或34中任一项所述的方法，其中与用该分离的融合蛋白或二聚体的亲本试剂治疗相比，该方法导致降低的毒性。
36.一种治疗癌症的方法，该方法包括用如权利要求13所述的双特异性融合蛋白治疗有需要的患者。
37.如权利要求36所述的方法，该方法进一步包括用化学疗法进行治疗。
38.如权利要求36所述的方法，其中该癌症是肝癌。
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