KR20200079536A - 이중 특이성 융합 폴리펩티드 및 이의 사용 방법 - Google Patents

이중 특이성 융합 폴리펩티드 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본원에서는 이중 특이성 융합 단백질, 및 암을 치료하기 위한 이중 특이성 융합 단백질을 사용하는 방법이 제공된다.

Description

이중 특이성 융합 폴리펩티드 및 이의 사용 방법
서열 목록
본원은 ASCII 양식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하고 있으며, 이의 전체는 본원에서 참고로 포함된다. 2018년 11월 2일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 IOBS-110-WO-PCT_SL.txt로 명명되며, 이의 크기는 105,745바이트이다.
암은 계속해서 세계적으로 건강상 주요 부담으로 남아 있다. 2016년, 미국에서만 150만 명이 넘는 새로운 사례가 진단되었고, 50만 명이 넘는 사람들이 이 질병으로 사망한 것으로 추정되었다(국립보건원 국립암연구소의 암 통계 참조). 세계적으로, 사망의 대략 6분의 1이 암에 기인한 것으로 추정된다(세계보건기구의 2017년 2월 암 발생 현황(Cancer Fact Sheet) 참조).
암 및 기타 질병을 퇴치하기 위한 전략의 개발에 있어서 과거 10년간 이루어낸 유의한 진전에도 불구하고, 진행되고 다루기 힘들며 전이성인 질병에 걸린 환자는 제한된 임상 옵션을 갖는다. 화학 요법, 방사선 조사 및 고선량 화학 요법은 투여량 제한적인 방법이었다(그리고, 많은 경우 환자를 상당히 쇠약하게 하는 심각한 부작용을 초래하며 환자의 삶을 단지 연장할 뿐임). 따라서 진행성 암 및/또는 치료에 내성을 갖는 암에 걸린 이들 환자를 위한 새롭고 효과적인 항암 요법에 대한 의료적인 요구가 충족되지 않은 채 남아 있다. 또한, 독성이 덜하고 보다 표적화된 항암 요법에 대한 요구가 존재한다.
새로운 무독성 항암 요법에 대한 잠재적인 원천은 환자 자신의 면역 시스템이다. 종양 제어에서 면역 시스템의 역할, 특히 T 세포 매개 세포 독성은 잘 알려져 있다. T 세포가 질병의 초기 단계 및 말기 단계 모두에서 종양 성장 및 암 환자의 생존을 제어할 수 있다는 증거가 많다. 그러나 암 환자에서 종양-특이적 T-세포 반응을 증가시키고 유지하는 것은 어렵다.
종양-특이적 T 세포 반응에 영향을 미칠 수 있는 T 세포 신호전달 경로의 예는 세포독성 T 림프구 항원-4(CTLA-4, CD152), 예정된 사멸 리간드 1(PD-L1; B7-H1 또는 CD274로도 알려져 있음), CD40 리간드(CD40L), 글루코코르티코이드-유도 TNF 수용체(TNFR)-관련 단백질(GITR), OX40 및 CD137(4-1BB)과 같은 신호전달 단백질을 수반한다.
CD40L은 주로 활성화된 T 세포(Th0, Th1, 및 Th2 아형을 포함함) 상에서 발현되는 분자의 종양 괴사 인자(TNF) 패밀리의 멤버이고, 이러한 패밀리의 기타 멤버와 유사한 동종 삼량체를 형성한다. 또한, CD40L은 또한 비만 세포 및 활성화된 호염기성 백혈구 및 호산성 백혈구 상에서 발현되는 것으로 밝혀져 있다. CD40L은 항원 제시 세포(APC) 상의 이의 수용체 CD40에 결합하며, 그 결과 표적 세포 유형에 따라 많은 효과가 나타난다. 일반적으로, CD40L은 공동 자극 분자의 역할을 하며, APC 상의 MHC 분자에 의한 T 세포 수용체 자극과 관련하여 APC에서의 활성화를 유도한다.
CD40L에 의한 CD40을 통한 신호전달은 CD40 함유 세포의 활성화 및 최적의 T 세포 프라이밍(T cell priming)을 초래하는 일련의 이벤트를 개시한다. 보다 구체적으로, CD40L/CD40 신호전달은 B 세포를 항체 분비 세포 및 기억 B 세포로 분화하는 것을 조장한다(문헌{Burkly, In Adv. Exp. Med. Bio., Vol. 489., D. M. Monroe, U. Hedner, M. R. Hoffman, C. Negrier, G. F. Savidge, 및 G. C. I. White, eds. Klower Academic/Plenum Publishers, 2001, p. 135}). 게다가, CD40L/CD40 신호전달은 대식세포 및 수지상 세포의 활성화를 통해 세포 매개 면역력을 증진시키며, 이는 자연 살해 세포를 통한 항종양 면역 반응 및 종양 항원-특이적 세포독성 T 림프구의 자극을 증진시킨다(앞서 언급된 버클리(Burkly)의 문헌 참조).
PD-L1은 또한 T 세포 활성화의 제어와 연관된 수용체와 리간드의 복합 시스템의 일부이다. 정상 조직에서, PD-L1은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 대식세포, 중간엽 줄기 세포, 골수 유래 비만 세포 및 다양한 비-조혈성 세포 상에서 발현된다. 이의 정상 기능은 이들 2개의 수용체, 즉 예정된 사멸 1(PD-1 또는 CD279로도 알려져 있음) 및 CD80(B7-1 또는 B7.1로도 알려져 있음)과의 상호작용을 통해 T 세포 활성화와 내성 사이의 균형을 조절하는 것이다. 또한 PD-L1은 매우 다양한 범위의 암에서 높은 빈도로 발현되고, 다수의 부위에서 작용하여 종양이 숙주 면역 시스템에 의한 검출 및 제거를 회피하는 것을 도와준다. 일부 암에서, PD-L1의 발현은 생존율의 감소 및 좋지 않은 예후와 연관되어 있었다. PD-L1과 이의 수용체(예를 들어, PD-1) 사이의 상호작용을 차단하는 항체는 PD-L1 의존성 면역 억제 효과를 완화시키고 시험관 내 및 생체 내에서 항종양 T 세포의 세포 독성 활성을 향상시킬 수 있다.
GITR(TNFRSF18, AITR 또는 CD357로도 알려져 있음)은 조절 T 세포 상에서 발현되고, 항원에 노출된 바 있는 CD4+ 헬퍼 세포 및 CD8+ 세포독성 T 세포뿐만 아니라 활성화된 자연 살해 세포 상에서 상향 조절된다(문헌{Stephens et al. J Immunol. (2004) 173(8): 5008~5020}; 문헌{Clothier and Watts, Cytokine Growth Factor Rev. (2014)}). GITR은 항원 노출에 의한 T 세포 활성화의 제어와 연관이 있는 수용체와 리간드의 복합 시스템의 일부이다. 또한 GITR은 느슨한 삼량체 형태로 존재하고 GITR 클러스터를 형성하여 T 세포 내에서의 강력한 세포 신호전달 이벤트를 야기할 수 있는 것으로 알려진 하나의 내생성 리간드인 GITR 리간드(GITRL)를 갖는다(문헌{Chattopadhyay et al. (2007) Proc. Natl. Acad Sci. USA 104(49): 19452~19457}). GITR과 GITRL 사이의 상호작용에 의해 양의 공동 자극 신호가 T 세포에 전달되어, 항원 노출에 의한 이들의 증식 및 활성화가 향상되고, 기억 세포의 생성을 조장하는데 도움이 되며, 조절 T 세포가 다시 프로그래밍되어 이들의 억제 기능을 감소시킨다(문헌{Clothier and Watts, Cytokine Growth Factor Rev. (2014) Jan 4; Schaer et al. Curr Opin Immunol. (2012)).
OX40(CD134; TNFRSF4)은 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포, 조절 T 세포(Treg) 및 자연 살해 세포 상에서 주로 발견되는 또 다른 TNF 수용체이다(문헌{Croft et al., 2009, Immunol Rev. 229: 173~91}). OX40은 삼량체 형태로 존재하고 OX40 클러스터를 형성하여 T 세포 내에서의 강력한 세포 신호전달 이벤트를 야기할 수 있는 것으로 알려진 하나의 내생성 리간드인 OX40 리간드(OX40L; CD152; TNFSF4)를 갖는다(문헌{Croft et al., 2009, Immunol Rev. 229: 173~91}). 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상의 OX40을 통한 신호전달로 인해 사이토카인 생산, 그랜자임(granzyme) 및 퍼포린(perforin) 방출 및 효과기 및 기억 T 세포 풀(pool)의 확장이 향상된다(문헌{Jensen et al., 2010, Semin Oncol. 37: 524~32}). 게다가, Treg 세포 상의 OX40 신호전달에 의해 Treg의 확장이 억제되고, Treg의 유도가 중단되며, Treg 억제 기능이 차단된다(문헌{Voo et al., 2013, J Immunol. 191: 3641~50}; 문헌{Vu et al., 2007, Blood. 110: 2501~10}).
면역 조직 화학 연구 및 조기 유세포 분석에 따르면 OX40는 다양한 범위의 인간 암을 침윤시키는 T 세포 상에서 발현되는 것으로 나타났다(문헌{Baruah et al., 2011, Immunobiology 217: 668~675}; 문헌{Curti et al, 2013, Cancer Res. 73: 7189~98}; 문헌{Ladanyi et al, 2004, Clin Cancer Res. 10: 521~30}; 문헌{Petty et al, 2002, Am J Surg. 183: 512~8}; 문헌{Ramstad et al, 2000, Am J Surg. 179: 400~6}; 문헌{Sarff et al, 2008, Am J Surg. 195: 621~5; discussion 625}; 문헌{Vetto et al, 1997, Am J Surg. 174: 258~65}). 종양 침윤 림프구 상의 OX40 발현은 몇몇 인간 암에서의 보다 긴 생존과 상호 관련이 있으며, 이는 OX40 신호가 항종양 면역 반응을 확립하는데 결정적인 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다(문헌{Ladanyi et al., 2004, Clin Cancer Res. 10: 521~30}; 문헌{Petty et al., 2002, Am J Surg. 183: 512~8}).
GITR과 같이 CD137(4-1BB)은 활성화된 T 세포 및 NK 세포 상에서 발현되는 공동 자극 관문 분자이다. CD137L(CD137 리간드)은 항원 제시 세포에 의해 발현되며, 면역 시스템이 다양한 암 유형에서 종양을 제거하도록 하는 것과 연관되어 있다. CD137은 CD8+ T 세포 상에서 CD4+ T 세포보다 높은 수준으로 발현되며, 이는 주로 CD8+ T 세포를 공동 자극한다. CD137의 가교 결합에 의해 T 세포의 증식, IFN-γ 분비 및 세포 용해 활성이 강하게 향상된다. 더욱이, 항체와 같은 CD137 작용제는 암 백신 및 면역 관문 억제제와 협주적으로 작용하여 항암 면역 반응을 증대시키는 것으로 보고된 바 있다(문헌{Dharmadhikari et al., 2016, Oncoimmunology 5(4): e1113367}).
상술한 T 세포 신호전달 경로(및 기타 경로)는 각각 종양-특이적 T 세포 반응의 제어에 역할을 한다. 그러나, 목적하는 T 세포 매개 항종양 반응을 유도 및 유지한다는 맥락에서 상이한 T 세포 신호전달 경로의 상대적인 중요도는 여전히 규명되지 않은 채 남아있다. 실제로, 상이한 T 세포 신호전달 경로들 사이의 상호작용으로 인해 암을 치료한다는 맥락에서 상승효과가 야기될 수 있다. 따라서, 당해 기술분야에서는 T 세포 신호전달 경로의 개선된 제어를 통해 T 세포 매개 세포 독성을 극대화할 수 있는 신규한 약제가 요구되고 있다. 이 같은 약제는 독성이 낮고 표적성이 높은 항암 요법을 제공할 수 있다.
본원에서는 이중 특이성 융합 단백질 및 T 세포 매개 세포 독성을 제어하는데 있어서 이들의 사용 방법이 제공된다.
하나의 양태에서, 본원의 개시내용은 제1 세포 표면 표적에 특이적인 제1 결합 영역, Fc 단량체 및 제2 세포 표면 표적에 특이적인 제2 결합 영역을 포함하는 단일쇄 융합 단백질을 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 제공하며, 이때 제1 결합 영역 및 제2 결합 영역은 펩티드 링커를 통해 Fc 단량체에 공유 결합되고, 이중 특이성 융합 단백질은 제1 세포 표면 표적 및 제2 세포 표면 표적과 동시에 결합할 수 있다.
특정 양태에서, 제1 결합 영역 및 제2 결합 영역 중 적어도 하나는 Fab 절편 또는 수용체 리간드이다
추가의 양태에서, Fab 절편은 항-PD-1 또는 항-PD-L1 Fab 절편이다.
추가적인 양태에서, 하나 이상의 리간드 소단위들 중 적어도 하나는 GITRL, OX40L, TNF-α, CD137L 또는 CD40L이다.
다른 양태에서, 본원의 개시내용은 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 본원에 개시된 바와 같은 이중 특이성 융합 단백질로 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 이들 및 기타 특징 및 이점은 첨부된 청구항과 함께 결합하여 개시내용의 하기 상세한 설명으로부터 보다 잘 이해될 것이다. 특허청구범위는 본원의 설명에 의해 한정되는 것으로, 본 설명에 개시되어 있는 특징 및 이점의 구체적인 논의에 의해 한정되지 않는 것으로 주지된다.
도 1은 제1 결합 도메인(BD1), 제2 결합 도메인(BD2) 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 고려되는 이중 특이성 융합 단백질(BFP)의 개략적인 도면이다. BD2는 Fc 영역의 힌지 영역 부분을 통해 Fc 영역에 부착될 수 있다. BD1은 펩티드 링커를 통해 Fc 영역에 부착될 수 있다. 유사하게, BD1 부분의 소단위(보다 적거나 보다 많은 소단위가 고려될지라도 본원에는 3개의 소단위가 나타나 있음)가 펩티드 링커를 통해 서로 연결될 수 있다.
도 2는 단일 특이성 및 이중 특이성 융합 단백질을 포함하는 고려되는 융합 단백질의 상이한 구조를 나타낸다. 하나의 단일 특이성 융합 단백질은 IgG 항체와 유사한 BD1_Fc 영역 형식을 갖고 이량화된 단일쇄 융합 단백질로서 생산되는 MEDI5083이며, 여기서 BD1은 2x CD40L 삼량체로서, 이의 CD40L 소단위들은 펩티드 링커에 의해 연결되고, Fc는 단일 IgG4 Fc 영역(CH2 및 CH3)이다. MEDI5083은 MEDI4736(더발루맙(durvalumab); BD1이 항-PD-L1 F(ab)2이고; Fc가 IgG1 TM(인간 IgG1 내에 L234F/L235E/P331S를 갖는 "3중 돌연변이")인 항-PD-L1 항체임)과 구조적으로 유시하다. 이중 특이성 융합 단백질 형식의 2개의 반복(iteration)(BFP2 및 BFP3)이 대조적이다. 도시된 반복 내의 203 kDa 크기의 BFP2는 BD1_Fc_BD2 형식(N부터 C까지)을 가지며, 여기서 BD1은 2x CD40L 삼량체이고, Fc는 IgG4 Fc 영역이고, BD2는 2x 항-PD-L1 scFv이다. 도시된 반복 내의 242 kDa 크기의 BFP3은 BD2_Fc_BD1 형식을 가지며, 여기서 BD2는 항-PD-L1 F(ab)2(예를 들어, MEDI4736으로부터 채취한 것임)이고, Fc는 단일 IgG4 Fc 영역이고, BD1은 2x CD40L 삼량체이다.
도 3은 고려되는 BFP3의 특정 실시형태를 나타낸다. 도 3a는 PD-1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG1 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 GITRL 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3b는 PD-L1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG1 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 GITRL 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3c는 PD-1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG1 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 OX40L 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3d는 PD-L1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG1 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 OX40L 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3e는 PD-1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG1 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 CD40L 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3f는 PD-L1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG1 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 CD40L 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3g는 PD-1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG1 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 TNF-α 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3h는 PD-L1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG1 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 TNF-α 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3i는 PD-1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG1 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 CD137L 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3j는 PD-L1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG1 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 CD137L 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3k는 PD-1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG4 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 GITRL 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3l은 PD-L1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG4 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 GITRL 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3m은 PD-1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG4 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 OX40L 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3n은 PD-L1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG4 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 OX40L 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3o는 PD-1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG4 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 CD40L 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3p는 PD-L1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG4 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 CD40L 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3q는 PD-1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG4 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 TNF-α 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3r은 PD-L1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG4 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 TNF-α 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3s는 PD-1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG4 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 CD137L 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다. 도 3t는 PD-L1을 표적화하는 2개의 Fab 절편, IgG4 Fc 폴리펩티드 코어 및 6개의 CD137L 소단위를 포함하는 이중 특이성 융합 단백질을 나타낸다.
도 4는 추가적인 특정 BFP3 형식의 이중 특이성 융합 단백질, 즉 (A) 항-PD-L1_Fc_TNF-α; (B) 항-PD1_Fc_OX40L; 및 (C) 항-PD1_Fc_GITRL을 나타낸다. 항-PD-L1 F(ab) 절편은 MEDI4736에서 유래하고, 항-PD-1 F(ab) 절편은 항-PD1 항체(LO115)에서 유래하였다. TNF-α, OX40L 및 GITRL 결합 도메인은 각각 펩티드 링커를 통해 함께 연결된 각각의 단백질 소단위의 삼량체 반복서열(trimer repeat) 2 세트를 포함한다.
도 5a 내지 도 5d는 BFP 2 및 3이 CD40 및 PD-L1와 결합한다는 것을 나타낸다. 도 5a 내지 도 5d는 옥테트 검정(Octet assay)을 이용하여 항-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L BFP 2 및 3 분자에 의해 CD40 및 PD-L1 단백질의 동시 결합을 보여준다.
도 6a 내지 도 6b는 BFP2 및 BFP3이 CD40와 결합하는 능력을 보유한다는 것을 나타낸다. 항-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L BFP 2 및 3 분자는 유세포 분석법 기반 검정에서 모 CD40L 융합 단백질(FP)(parental CD40L FP)와 비교하여 세포 표면 CD40에 결합하는 능력이 유사하다는 것을 보여준다.
도 7a 내지 도 7b는 BFP2 및 BFP3이 세포 표면 상의 PDL1에 대해 보다 낮은 결합을 갖는다는 것을 나타낸다. 도 7은 항-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2 및 3 분자가 유세포 분석법 기반 검정에서 세포 표면 PD-L1 단백질과 결합할 수 있다는 것을 보여준다.
도 8은 혼합 PBMC에 대한 BFP 결합을 나타낸다. 도 8은 항-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2 및 3 분자가 유세포 분석법 기반 검정에서 모 항-PD-L1 및 CD40L FP와 유사하게 투여량 의존 방식으로 인간 PBMC 하위 세트에 결합한다는 것을 보여준다.
도 9는 BFP2 및 BFP3이 CD40 신호전달 경로를 자극하는 능력을 보유한다는 것을 나타낸다. 도 9는 항-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2 및 3 분자가 다양한 세포 유형에 대한 CD40 활성화의 하류에 있는 NF-κB 신호전달 경로를 활성화한다는 것을 보여준다.
도 10은 BFP3이 저캇 T 세포(Jurkat T cell)에서 PD-L1 및 PD1 상호작용을 차단하고, NFAT 신호전달을 향상시킨다는 것을 나타낸다. 도 10은 항-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2 및 3 분자가 PD-L1-PD1 상호작용을 차단하며, 그 결과 저캇 세포에서 NFAT 경로가 활성화된다는 것을 보여준다.
도 11은 BFP가 CD40을 자극하고 PD1-PDL1 상호작용을 차단한다는 것을 나타낸다. 도 11a는 공동 자극 검정의 개념 개략도를 나타낸다. 도 11b는 항-PD-L1-CD40L BFP가 이중 기능을 갖는다는 것을 나타낸다: 이는 CD40 연합(engagement)을 통해 THP-1 세포 상의 NF-κB를 활성화하였고, PD-L1 매개 억제를 해소함으로써 저캇 세포에서의 NFAT 활성을 향상시켰다.
도 12는 BFP3이 SEB 검정에서 우수한 IL-2 유도 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. 도 12는 포도상구균 엔테로톡신 B(SEB) 검정 결과를 나타내며, 이는 항-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2 및 3 분자가 모 분자인 CD40L FP와 항-PD-L1의 조합보다 IL-2 생산을 더 많이 유도한다는 것을 보여준다.
도 13은 PD-1/GITRL 이중 특이성 단백질(MEDI3387 및 MEDI5771)이 SEB 검정에서 단일 약제 대비 T-세포 활성화를 증가시킨다는 것을 나타낸다. 도 13은 MEDI3387 및 MEDI5771이 모 분자들의 조합과 유사한 활성을 갖지만 모 분자 단독보다는 높은 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 2회의 배치(batch)에서 유사한 결과가 얻어졌으며, T 세포 재활성화 검정과 유사한 결과가 입증되었다.
도 14는 BFP3이 M1 대식세포-T MLR 검정에서 강력한 IFN-γ 및 IL-12 생산을 유도한다는 것을 나타낸다. 도 14는 대식세포-T 세포 MLR 검정 결과를 나타내며, 이는 항-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2 및 3 분자가 모 분자인 CD40L FP 및 항-PD-L1의 조합보다 IFN-γ 및 IL-12 생산을 더 많이 유도한다는 것을 보여준다.
도 15는 BFP3이 모노-T MLR 검정에서 강력한 IFN-γ 생산을 유도한다는 것을 나타낸다. 도 15는 단핵구-T 세포 MLR 검정 결과를 나타내며, 이는 항-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2 및 3 분자가 모 분자인 CD40L FP 및 항-PD-L1의 조합보다 많거나 상응하는 양의 IFN-γ 생산을 유도한다는 것을 보여준다.
도 16은 BFP3이 CMV 회상 검정(CMV recall assay)에서 복합(combo)보다 우수한 활성을 보인다는 것을 나타낸다. 도 16은 CMV 항원 회상 검정 결과를 나타내며, 이는 항-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3 분자가 모 분자인 CD40L FP 및 항-PD-L1의 조합과 비교하여 IFN-γ, IL-12, 및 IL-10 생산을 더 많이 유도하지만, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-8을 유사한 수준으로 유도한다는 것을 보여준다.
도 17a 및 도 17b는 BFP3이 잠재적으로 CD40 및 PD-L1의 막 국소화(membrane localization)를 변경시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 도 17a는 CD40 및 PD-L1이 항원 제시 세포(APC) 상에서 동시 발현(co-expression)한다는 것을 보여준다. 도 17b는 세포 표면 CD40 및 PD-L1 단백질을 연구하기 위한 유세포 분석법 기반 검정에 대한 개념 개략도를 나타낸다.
도 18은 BFP3이 MDA-MB-231 세포 상의 CD40 및 PD-L1의 하향 조절을 유도한다는 것을 나타낸다. 도 18은 유세포 분석법 기반 검정 결과를 나타내며, 이는 항-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3 분자만이 처리 1시간 및 96시간 후에 CD40 및 PD-L1 분자 둘 모두의 하향 조절을 유도한다는 것을 보여준다.
도 19는 BFP3이 MDA-MB-231 세포 상의 CD40 및 PD-L1의 하향 조절을 유도한다는 것을 나타낸다. 도 19는 웨스턴 블롯 결과를 나타내며, 이는 항-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3 분자가 처리 24시간 후에 총 PD-L1 단백질 함량의 하향 조절을 유도한다는 것을 보여준다. NS = 자극 없음.
도 20은 BFP3 자극 시에 THP1 세포 내에서의 표면 CD40 및 PD-L1의 손실을 나타낸다. 도 20은 연속적인 자극을 이용하는 세포 표면 CD40 및 PD-L1 단백질을 연구하기 위한 검정에 대한 개념 개략도를 나타낸다.
도 21은 BFP3 자극 시에 THP1 세포 내에서의 표면 CD40 및 PD-L1의 손실을 나타낸다. 도 21은 유세포 분석법 기반 검정 결과를 나타내며, 이는 항-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3 분자가 처리 0.5시간 내지 3시간 후에 표면 CD40 및 PD-L1의 하향 조절을 유도한다는 것을 보여준다.
도 22는 BFP3 자극 시에 THP1 세포 내에서의 표면 PD-L1의 손실을 나타낸다. 도 22는 1시간의 처리와 그에 뒤따른 시험 물질의 세척 제거 이후에 세포 표면 CD40 및 PD-L1 단백질을 연구하기 위한 검정에 대한 개념 개략도를 나타낸다.
도 23은 BFP3 자극 시에 THP1 세포 내에서의 표면 PD-L1의 손실을 나타낸다. 도 23은 THP-1 세포에 대한 유세포 분석법 기반 검정 결과를 나타내고, 이는 항-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3 분자에 의한 1시간 동안의 일시적인 처리에 의해 세포 표면 CD40 및 PD-L1 단백질의 하향 조절이 유도된다는 것을 보여준다. 24시간 시점에 CD40만이 세포 표면 상에서 검출될 수 있다.
도 24는 BFP3-처리 moDC가 보다 적은 양의 PD-L1 단백질을 갖는다는 것을 나타낸다. 도 24는 유세포 분석법 기반 검정 결과를 나타내며, 이때 CD40, CD86, 및 PD-L1의 세포 표면 발현의 조절에 있어서 항-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3 분자와 CD40L FP 분자 사이의 차별화된 효과를 보여준다: BFP3-처리 세포에서만 PD-L1의 하향 조절이 구현되었다.
도 25는 BFP3-처리 moDC가 보다 적은 양의 PD-L1 단백질을 갖는다는 것을 나타낸다. 도 25는 웨스턴 블롯 결과를 나타내며, 이는 항-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3-처리 조건에서는 PD-L1 단백질의 양이 CD40L FP 단독 처리 또는 CD40L FP 및 항-PD-L1의 처리에서보다 훨씬 낮다는 것을 보여준다.
도 26은 혈액 단핵구 상에서의 표면 CD40 및 PD-L1의 손실을 나타낸다. 도 26은 유세포 분석법 기반 검정 결과를 나타내며, 이는 CD40 및 PD-L1의 세포 표면 발현의 조절에 있어서 항-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3 분자와 CD40L FP 분자 사이의 차별화된 효과를 보여준다: BFP3-처리 세포에서만 PD-L1의 투여량 의존성 하향 조절이 구현되었다.
도 27은 mBFP3이 Renca 세포에서의 쥐 PD-L1의 분해를 유도한다는 것을 나타낸다. 도 27은 웨스턴 블롯 결과를 나타내며, 이는 항-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3-처리 조건에서는 쥐 PD-L1 단백질의 양이 CD40L FP 단독 처리 또는 CD40L FP 및 항-PD-L1의 처리에서보다 훨씬 낮다는 것을 보여준다.
도 28은 PD-L1 가교 결합에 의해 BFP3에 의해 매개되는 NF-κB 활성이 증가된다는 것을 보여준다. 도 28은 ES2 세포 표면 상의 PD-L1이 가교 결합되면 BFP3에 의해 매개되는 THP-1 세포에 대한 NF-κB 작용이 향상된다는 것을 보여준다. Y-축은 NF-κB 리포터 활성을 나타낸다.
도 29는 IgG4 Fc 및 FcγRI 상호작용이 BFP3 활성을 조정한다는 것을 나타낸다. 도 29는 FcγR이 BFP3을 통해 매개되는 THP-1 세포에 대한 NF-κB 작용을 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
도 30a 내지 도 30f는 체중 감량이 mBFP3-처리 마우스(단일 용량 처리)에서 보다 낮다는 것을 나타낸다. 도 30a 내지 도 30f는 야생형 마우스 및 B16F10 종양 세포가 이식된 마우스에 대한 다양한 연구 결과를 나타낸다. 개개의 마우스에 대해 처리 후 체중의 변화가 나타나 있다.
도 31은 체중 감량이 mBFP3-처리 마우스(다중 용량 처리)에서 보다 낮다는 것을 나타낸다. 도 31은 B16F10 종양 세포가 이식된 마우스에 대한 다중 투여 연구 결과를 나타낸다. 개개의 마우스에 대한 처리 후 체중 변화율(%)이 나타나 있다.
도 32는 mBFP3 처리가 종양 성장을 효과적으로 억제한다는 것을 나타낸다. 도 32는 B16F10 종양 세포가 이식된 마우스에 대한 다중 투여 연구(2주 동안 매주 2회) 결과를 나타낸다. 개개의 마우스에 대한 처리 후 종양 부피의 변화가 나타나 있다.
도 33a 내지 도 33c는 BFP3의 투약 빈도가 감소하면 부작용이 예방된다는 것을 나타낸다. 도 33a 내지 도 33c는 B16F10 종양 세포가 이식된 마우스에 대한 감소 용량 연구(1회 또는 2회 투약) 결과를 나타낸다. 개개의 마우스에 대한 처리 후 체중의 변화가 도 33a에 나타나 있다. 도 33b는 종양 부피의 변화를 나타내고, 도 33c는 혈청 알라닌 트랜스아미나아제(ALT)의 수준을 나타낸다.
도 34는 mBFP3 처리가 T 세포의 활성화/분화를 유도하였다는 것을 나타낸다. 도 34는 B16F10 종양 보유 마우스로부터 회수된 T 세포에 대한 유세포 분석 연구 결과를 나타낸다. 그래프에는 T 세포 하위 세트의 비율(%)이 결정되어 나타나 있다.
도 35는 mBFP3 처리가 효과기/기억 CD8 T 세포의 분화를 유도하였다는 것을 나타낸다. 도 35는 B16F10 종양 보유 마우스로부터 회수된 T 세포에 대해 연구한 유세포 분석법 검정 결과를 나타낸다. 그래프에는 효과기 CD8 T 세포 하위 세트의 비율(%)이 결정되어 나타나 있다.
도 36은 마우스 내에서의 MEDI7526이 면역-관련 독성의 2개의 주요 매개인자인 TNF-α 또는 IL-6을 유도하지 않는다는 것을 나타낸다. 도 36은 TNF-α 또는 IL-6 중 어떠한 것도 MEDI7526의 항종양 기능을 위해 요구되는 것처럼 보이지 않는다는 것을 나타낸다.
도 37은 MEDI7526 마우스 대리가 마우스에서 명확한 사이토카인 프로파일을 유도한다는 것을 나타낸다(단일 정맥 내 투약 연구).
도 38은 PD1-OX40L이 저캇/OX40 세포에서의 NF-κB 활성화를 유도한다는 것을 나타낸다. 도 38은 항-PD-L_IgG4 Fc_OX40L FP BFP3 분자가 OX40로 형질 감염된 저캇 세포주에서의 NF-κB 신호전달 경로를 활성화한다는 것을 보여준다.
도 39는 마우스 공통 유전자 모델에서 마우스 OX40 리간드(mOX40L) 융합 단백질(FP), 항-마우스 PD-L1 단클론성 항체(mAb) 또는 mOX40L FP와 항-PD-L1 mAb의 조합이 MCA205 및 CT26 세포주의 성장에 미치는 효과를 나타낸다.
도 40a 내지 도 40c는 PDL1/OX40L FP BFP2(MEDI5615)의 PD-L1 의존성 종양 국소화를 나타낸다.
도 41은 PD-L1/OX40L 이중 특이성 분자의 상이한 분자 형식의 종양 함유 마우스에서의 생체 분포를 나타낸다.
도 42는 이중 특이성 분자의 생물 활성을 측정하기 위해 사용되는 세포 시스템을 나타낸다.
도 43은 BFP2가 OX40의 PD-L1 매개 클러스터링에 최적인 원자가를 갖는다는 것을 나타낸다. RLU = 상대 발광 단위; M = 몰 농도.
도 44a 및 도 44b는 MEDI5615(PDL1/OX40L BFP2) 및 scOX40L이 천연 CD4+CD25+ Treg 세포의 존재 하에 T-효과기 증식을 증가시켰고, 조절 T 세포를 생산하는 IL-10의 빈도를 감소시켰다는 것을 나타낸다. 에러 바(error bar)는 2회 실시된 검정 웰(assay well)에서 얻어진 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 45a 및 도 45b는 포도상구균 엔테로톡신 B(SEB) 공동 자극 검정에서의 PDL1/OX40L FP BFP2(MEDI5615) 및 OX40/PDL1 이중 특이성 mAb의 활성을 나타낸다.
도 46a 내지 도 46f는 인간 또는 시노몰구스 원숭이 OX40, PD-L1 또는 OX40 및 PD-L1 둘 모두를 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 PD-L1/OX40L BFP2의 결합을 나타낸다. 에러 바는 평균의 표준 편차를 나타낸다. MFI = 평균 형광 세기.
도 47은 PD1-OX40L이 인간 PBMC에서의 PD1의 분해를 촉발한다는 것을 나타낸다. 도 47은 웨스턴 블롯 결과를 나타내며, 이는 항-PD-1_IgG4 Fc_OX40L FP BFP3-처리 조건에서 PD-1 단백질 수준이 감소하지만, OX40 단백질 수준은 변하지 않는다는 것을 보여준다.
도 48은 MEDI3387이 인간 PBMC에서의 PD1의 분해를 촉발한다는 것을 나타낸다. 도 48은 웨스턴 블롯 결과를 나타내며, 이는 항-PD-1_IgG4 Fc_GITRL FP BFP3-처리 조건에서 PD-1 단백질 수준이 감소하지만, GITR 단백질의 양은 변하지 않는다는 것을 보여준다. PD-1/GITRL FP Bis; MEDI5771(IgG1 형식) 및 MEDI3387(IgG4P); GITRL: MEDI1873.
도 49는 MEDI3387이 저캇/GITR 세포 내에서의 NF-κB 활성화를 유도한다는 것을 나타낸다. 4시간의 자극. 도 49는 항-PD-L_IgG4 Fc_GITRL FP BFP3 분자가 GITR로 형질 감염된 저캇 세포주에서의 NF-κB 신호전달 경로를 활성화한다는 것을 보여준다.
도 50은 PD1/GITR 이중 특이성 분자가 표적 둘 모두와 동시에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 50은 옥테트 검정을 이용하여 항-PD1_IgG4 Fc_GITRL FP BFP2(MEDI3387) 및 항-PD1_IgG1 Fc_GITRL FP BFP2(MEDI5771) 분자에 의한 PD1 및 GITR 단백질의 동시 결합을 보여준다. "A" = MEDI3387; "B" = BFP2-PD1(0075)-GITRL(sc)-G4P; "C" = BFP2-GITRL(sc)-G4P.
도 51은 BFP3이 저캇 T 세포에서 PD-L1 및 PD1 상호작용을 차단하고 NFAT 신호전달을 향상시킨다는 것을 나타낸다. 도 51은 MEDI3387(BIOAE003) 및 MEDI5771(BIOAE005) 분자가 PD-L1-PD1 상호작용을 차단하며, 그 결과 저캇 세포에서의 NFAT 경로가 활성화된다는 것을 보여준다. BIOAE003 및 BIOAE005는 MEDI1873(GITRL) 및 모 항-PD1 IgG에 필적하는 효능을 나타낸다.
도 52는 PD1/GITR 이중 특이성 분자가 B16 마우스 모델에서 GITRL-FP와 PD-1 mAb의 조합과 동등하다는 것을 나타낸다.
도 53a 및 도 53b는 MEDI3387 및 MEDI5771에 의한 처리 시에 CD4+ 및 CD8+ 총 기억 T 세포(Ki67)가 투여량 의존적으로 증가한다는 것을 나타낸다. 도 53a 및 도 53b는 다양한 용량의 MEDI3387 및 MEDI5771로 처리된 시노몰구스 원숭이에서의 약동학(PK) 및 약역학(PD) 연구 결과를 나타낸다.
도 54는 단일 정맥 내 주사 이후에 수컷 시노몰구스 원숭이에서의 평균 혈청 MEDI3387 및 MEDI5771 농도-시간 프로파일을 나타낸다. IV= 정맥 내; 에러 바는 평균의 표준 편차를 나타낸다; LLOQ(흑색 파선) = 정량 하한. LLOQ(0.050 ㎎/ℓ; 흑색 파선으로 나타낸 바와 같음) 미만의 데이터는 단지 설명을 목적으로 LLOQ의 1/2로 작도된다.
도 55a 내지 도 55c는 PD1/GITR 이중 특이성 분자가 표적 둘 모두와 동시에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 55a는 사이토스팀(Cytostim) T 세포 재활성화 검정에 대한 검정 개략도를 보여준다. 도 55b는 PD1/GITR IgG4P BFP(MEDI3387) 및 모 분자를 이용한 결과를 보여준다. 도 55c는 PD1/GITR IgG4P BFP(MEDI5771) 및 모 분자를 이용한 결과를 보여준다.
도 56은 생체 내에서의 GITRL의 형광 생체 분포를 나타낸다.
도 57a 및 도 57b는 항-PDL1-TNFα가 T24 종양 세포에서의 쥐 PD-L1(APC: 세포 당 항원)의 하향 조절을 유도한다는 것을 나타낸다. 도 57a는 유세포 분석법 기반 검정 결과를 나타내며, 이는 항-PD-L1_IgG4 Fc_TNFα FP BFP3 처리로 인해 T24 종양 세포 상의 PD-L1이 하향 조절된다는 것을 보여준다. 도 57b는 항-PD-L1_IgG4 Fc_TNFα FP BFP3 처리에 의해 세포 생존력이 영향을 받지 않는다는 것을 나타낸다.
도 58은 항-PDL1-TNF-α BFP가 THP1 골수 세포를 자극할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 58은 항-PD-L1_IgG4 Fc_TNF-α FP BFP3 분자가 TNF-α 수용체 활성화의 하류에 있는 NF-κB 신호전달 경로를 활성화한다는 것을 보여준다.
도 59는 BFP3이 모 시약들의 조합에 의해서는 나타나지 않는 CD40 및 PD-L1 둘 모두의 동시 내재화를 조장한다는 것을 나타낸다. 도 59는 항-PD-L1 및 CD40L 결합 도메인을 포함하는 BFP 분자를 나타낸 개념 개략도이며, 이는 BFP 분자가 세포 표면 상의 2개의 표적(CD40 및 PD-L1)을 내재화할 수 있으며, 그 결과 PD-L1 단백질의 분해가 야기될 수 있다는 것을 나타낸다. CD40은 분해에 대한 내성이 있으며, 후속적으로 세포 표면에서 발현이 회복된다.
도 60은 리포터 검정 계획을 나타낸다. 패널 A는 PD-1/PD-L1 복합체의 형성에 의한 억제로 인해 항원 제시 세포로부터의 항-CD3/항-CD28 활성화의 결과로서 어떠한 신호(어떠한 검정 반응)도 발생하지 않는 모델 질병 상태를 나타낸다. 이에 반해, 패널 B는 항-PD-1 항체를 통한 PD-1/PD-L1 복합체의 형성의 성공적인 차단(이로 인해 항-CD3/항-CD28 활성화 시에 리포터 분자(루시페라아제)가 발현하게 됨)을 보여준다.
도 61은 IgG1 TM 및 IgG4 형식에서 항-PD-L1/CD40L FP BFP3을 비교한 SEB 검정 결과를 나타낸다.
도 62는 IgG1 TM 및 IgG4 형식에서 항-PD-L1/CD40L FP BFP3을 비교한 CMV 회상 검정 결과를 나타낸다.
도 63은 저캇 세포에서 항-PD-1-항-OX40 Bis2가 NF-κB 활성화를 유도하지 못하는 반면 항-PD-1-OX40L FP BFP3은 NF-κB 활성화를 유도한다는 것을 나타낸다.
도 64는 Bis2 구조체가 PD1 분해를 촉발한다는 것을 나타내며, 이는 PD1의 분해가 OX40 작용제 기능과는 무관하다는 것을 보여준다.
도 65는 5FU 및 MEDI7526(항-PDL1-CD40L BFP3)의 병용 처리로 인해 종양 성장이 효과적으로 억제된다는 것을 나타낸다. 도 65는 다중 용량의 5FU(11일째) 및 MEDI7526(14일, 21일 및 28일)의 순차적인 처리가 CT26 종양 세포를 보유하고 있는 마우스에 투여되는 동물 연구 결과를 나타낸다. 개개의 마우스에 대한 처리 후의 종양 부피의 변화가 나타나 있다. 5FU 및 MEDI7526의 처리로 인해 MEDI7526 단독 처리에 의해 매개되는 항종양 반응이 향상된다.
도 66은 간 및 비장이 MEDI7526 쥐 대리의 표적 기관임을 나타낸다. 도 66a는 MEDI5083 및 MEDI7526 쥐 대리가 간 및 비장에 축적되었다는 것을 나타낸다. 도 66b는 인간 쿠퍼 세포(human Kupffer cell; 간에 상주하는 대식세포)가 CD40 및 PD-L1 둘 모두를 발현한다는 것을 나타내며, 이는 MEDI7526이 간에서 쿠퍼 세포를 표적화할 수 있다는 것을 보여준다.
도 67은 MEDI7526이 간 종양 성장을 효과적으로 억제한다는 것을 나타낸다. 도 67a는 CT26-루시페라아제 종양 세포가 간에 직접 이식되어 있는 간 종양 모델의 설계를 나타낸다. 21일째 날, 부검 후에 간을 회수하고, 루시페라아제 활성을 이미지화함으로써 간에서의 종양 부하(tumor burden)를 정량화하였다. 도 67b는 MEDI7526-처리 마우스에서 적출한 간에서의 종양 부하(휘도 단위로 나타냄)가 아이소타입 대조군-처리 동물에서의 종양 부하와 비교하여 유의하게 낮았다는 것을 나타낸다.
도 68은 MEDI7526 처리로 인해 CT26 간 종양 모델 연구에서 간 내에서의 T 세포의 확장 및 활성화가 유도된다는 것을 나타낸다. 도 68a는 MEDI7526을 투여 받은 마우스가 대조군 마우스와 비교하여 간에서의 CD8 T 세포 개수가 증가하였다는 것을 나타낸다. 도 68b는 MEDI7526-처리 동물로부터 단리된 종양 항원-특이적 CD8 T 세포가 보다 높은 활성화된 아형 비율(%)을 가졌다는 것을 나타낸다.
도 69는 CT26 간 종양 모델에서 MEDI7526의 처리는 MEDI5083 및 항-PDL1의 병용 처리보다 내약성이 높다는 것을 나타낸다. 도 69a는 MEDI7526-처리 마우스에서 체중 감량이 MEDI5083 또는 MEDI5083 및 항-PDL1 처리와 비교하여 낮다는 것을 나타낸다. 개개의 마우스에 대한 단일 용량 처리 이후의 체중의 변화가 나타나 있다. 도 69b는 mMEDI5083 및 항-쥐 PDL1 그룹에서 사망률이 상대적으로 더 높았다는 것을 나타낸다.
도 70은 추가적인 특정 BFP3 형식의 이중 특이성 융합 단백질, 즉 (A) 항-PD1-Fc-OX40L 야생형, (B) 항-PD1-Fc-OX40L 2WT; 및 (C) 항-PD1-Fc-OX40L 1WT를 나타낸다. 항-PD-1 F(ab) 절편은 항-PD1 항체(LO115)에서 유래하였다. OX40L 부분은 보존된 야생형 서열을 갖거나(A), 잔류 F180 상에 돌연변이를 갖는다(B 및 C).
도 71은 항-PD1-Fc-OX40L 2WT 및 1WT가 인간 T 세포주에 대해 감소한 OX40 작용제 기능을 갖는다는 것을 나타낸다. 도 71a 및 도 71b는 항-PD1-Fc-OX40L 2WT가 항-PD1-Fc-OX40L과 비교하여 결합 및 내재화가 약간 감소하였다는 것을 나타낸다. 도 71c는 항-PD1-Fc-OX40L 2WT 및 1WT가 NFκB 경로를 활성화하는 능력이 감소하였다는 것을 나타낸다.
도 72는 항-PD1-Fc-OX40L 2WT 및 1WT가 일차 인간 T 세포 상의 항-PD1-OX40L과 비교하여 유사한 결합 및 내재화를 갖는다는 것을 나타낸다. 2개의 건강한 공여자에서 유래한 정제된 CD4 및 CD8 T 세포에 대한 데이터를 생성하였다.
도 73은 항-PD1-Fc-OX40L 2WT가 인간 일차 T 세포에 대해 감소한 OX40 작용제 기능을 갖는다는 것을 나타낸다. PD1-OX40L 및 PD1-OX40L 2WT는 인간 T 세포 자극 및 CMV 회상 검정을 이용하여 비교하였다. PD1-OX40L 2WT는 OX40L 상에 어떠한 돌연변이도 갖지 않는 PD1-OX40L과 비교하여 훨씬 적은 염증성 사이토카인을 유도하였다.
도 74는 항-PD1-Fc-OX40L 2WT 및 1WT가 인간 T 세포 상에서 PD1 분해를 유도하였다는 것을 나타낸다. 활성화된 인간 T 세포는 PD1 단백질을 발현하고, 총 PD1 단백질의 양은 항-PD1-OX40L, 항-PD1-OX40L 1WT 또는 항-PD1-OX40L 2WT의 처리 이후에 유의하게 감소하였다. 도 74a는 대표적인 웨스턴 블롯 사진을 나타내고, 도 74b는 3명의 공여자에서 유래한 병합 결과를 나타낸다.
정의
달리 언급하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속한 당해 기술분야의 숙련자에 의해 흔히 이해되는 의미를 갖는다. 하기 참고문헌에서는 당업자에게 본 개시내용에서 사용된 다수의 용어에 대한 일반적이 정의가 제공된다: 문헌{Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)]; 문헌{The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)}; 문헌{The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991}); 및 문헌{Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)}. 본원에서 사용된 바와 같이, 하기 용어는, 달리 언급하지 않는 한, 하기에서 이들에 대해 주어진 의미를 갖는다.
"T 세포 매개 세포 독성"이란 용어는 감염 세포 또는 암 세포와 같은 세포독성 T 림프구에 의한 세포의 표적 살해를 지칭한다.
"항종양 활성"이란 용어는 종양 세포의 증식 또는 생존의 증가를 감소 또는 방지하는 임의의 생물학적 활성을 의미한다. 하나의 실시형태에서, 항종양 활성은 항종양 면역 반응이다.
"면역 조절제"란 용어는 면역 반응(예를 들어, 항종양 면역 반응)을 향상시키는 약제를 의미한다. 본 개시내용의 예시적인 면역 조절제는 항체, 항-PD-L1 항체 및 이의 절편뿐만 아니라 융합 단백질, 이중 특이성 융합 단백질 및/또는 이의 절편과 같은 단백질을 포함한다.
"CD40L 폴리펩티드"란 용어는 NCBI 등록 번호 NP_000065에 대해 적어도 약 85% 아미노산 동일성을 갖고 CD40 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 절편을 나타낸다는 것을 의미한다. "CD40L"이란 용어는 전장 CD40L 및 가용성 절편, 예를 들어 단백질 분해(proteolysis)로부터 얻어진 CD40L의 세포 외 도메인 형태, 및 CD40L의 단량체 형태뿐만 아니라 올리고머 형태(예를 들어, 삼량체성 CD40L) 둘 모두를 지칭한다. 막 결합 및 가용성 형태인 인간 CD40L의 아미노산 서열은 하기에 나타나 있다.
"CD40 폴리펩티드"는 NCBI 등록 번호 NP_001241에 대해 적어도 약 85% 아미노산 동일성을 갖고 CD40L 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 절편을 의미한다. 하기에는 예시적인 CD40 아미노산 서열이 제공된다(서열 번호 22).
"PD-L1 폴리펩티드"는 NCBI 등록 번호 NP_001254635에 대해 적어도 약 85% 아미노산 동일성을 갖고 PD-1 및 CD80 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 절편을 의미한다. 하기에는 예시적인 PD-L1 아미노산 서열이 제공된다(서열 번호 23).
"항-PD-L1 항체"는 PD-L1 폴리펩티드와 선택적으로 결합하는 항체를 의미한다. 예시적인 항-PD-L1 항체는, 예를 들어 미국 특허 제8,779,108호 및 미국 특허 출원 공개공보 제2014/0356353에 기술되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다. 더발루맙(MEDI4736)은 예시적인 항-PD-L1 항체이다. 기타 항-PD-L1 항체로는 BMS-936559(브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb)) 및 MPDL3280A(로슈(Roche))를 들 수 있다.
"PD-1 폴리펩티드"는 NCBI 등록 번호 NP_005009에 대해 적어도 약 85% 아미노산 동일성을 갖고 PD-L1 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 절편을 의미한다. 하기에는 예시적인 PD-1 아미노산 서열이 제공된다(서열 번호 32).
"PD-1 핵산 분자"는 PD-1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. NCBI 등록 번호 NM_005018에는 예시적인 PD-1 핵산 분자 서열이 제공된다.
"GITRL 폴리펩티드"란 용어는 서열 번호 33에 대해 적어도 약 85% 아미노산 동일성을 갖고 GITR 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 절편을 나타내도록 의도된다. "GITRL"이란 용어는 전장 GITRL 및 가용성 절편, 예를 들어 단백질 분해로부터 얻어진 GITRL의 세포 외 도메인 형태, 및 GITRL의 단량체 형태뿐만 아니라 올리고머 형태(예를 들어, 삼량체성 GITRL) 둘 모두를 지칭한다. 막 결합 및 가용성 형태인 인간 GITRL의 아미노산 서열은 하기에 나타나 있다.
"TNF-α 폴리펩티드"란 용어는 NCBI 등록 번호 NP_000585.2에 대해 적어도 약 85% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 절편을 나타낸다는 것을 의미한다. "TNF-α"란 용어는 전장 TNF-α 및 가용성 절편, 예를 들어 단백질 분해로부터 얻어진 TNF-α의 세포 외 도메인 형태, 및 TNF-α의 단량체 형태뿐만 아니라 올리고머 형태(예를 들어, 삼량체성 TNF-α) 둘 모두를 지칭한다. 막 결합 및 가용성 형태인 인간 TNF-α의 아미노산 서열은 하기에 나타나 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "OX40 폴리펩티드"는 NCBI 등록 번호 NP_003318에 대해 적어도 약 85% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 절편을 의미한다. OX40는 항원-활성화된 포유동물 CD4+ 및 CD8+ T 림프구의 표면 상에서 발현되는 수용체의 TNFR-수퍼패밀리의 멤버이다. OX40 수용체 서열은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어 유전자은행(GenBank) 등록 번호 AAB33944 또는 CAE11757로 제공된다.
"OX40L 폴리펩티드"란 용어는 NCBI 등록 번호 NP_003317에 대해 적어도 약 85% 아미노산 동일성을 갖고 OX40 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 절편을 나타낸다는 것을 의미한다. "OX40L"이란 용어는 전장 OX40L 및 가용성 절편, 예를 들어 단백질 분해로부터 얻어진 OX40L의 세포 외 도메인 형태, 및 OX40L의 단량체 형태뿐만 아니라 올리고머 형태(예를 들어, 삼량체성 OX40L) 둘 모두를 지칭한다. 막 결합 및 가용성 형태인 인간 OX40L의 아미노산 서열은 하기에 나타나 있다.
"CD137L"이란 용어는 NCBI 등록 번호 NP_001552.2에 대해 적어도 약 85% 아미노산 동일성을 갖고 CD137 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 절편을 나타낸다는 것을 의미한다. "CD137L"이란 용어는 전장 CD137L 및 가용성 절편, 예를 들어 단백질 분해로부터 얻어진 CD137L의 세포 외 도메인 형태, 및 CD137L의 단량체 형태뿐만 아니라 올리고머 형태(예를 들어, 삼량체성 CD137L) 둘 모두를 지칭한다. 막 결합 및 가용성 형태인 인간 CD137L의 아미노산 서열은 하기에 나타나 있다.
본 개시내용에 사용된 바와 같이, "항체"란 용어는 면역글로불린 또는 이의 절편 또는 유도체를 지칭하고, 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서의 이의 생성 여부와는 무관하게 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 상기 용어는 다클론성, 단클론성, 단일 특이성, 다중 특이성, 비특이성, 인간화, 단일쇄, 키메라, 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이된 융합 단백질 및 그래프팅(grafting)된 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 개시내용을 위해 "온전한 항체"에서와 같이 "온전한"이란 용어로 달리 수식되지 않는 한, "항체"란 용어는 또한 항체 절편, 예를 들어 Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, 및 항원 결합 기능, 즉 예를 들어 PD-1 또는 PD-L1과 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 기타 항체 절편 및 이들의 조합을 포함한다. 전형적으로, 이 같은 절편은 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 게다가, 이 같은 절편은 기타 절편과 조합하여 다중 항원 결합 융합 단백질을 형성할 수 있다.
"항원 결합 도메인", "항원 결합 절편" 및 "결합 절편"이란 용어는 항체와 항원 사이의 특이적 결합에 관여하는 아미노산을 포함하는 항체 분자의 일부를 지칭한다. 일부 경우, 항원이 크면 항원 결합 도메인은 항원의 일부에만 결합할 수 있다. 항원 결합 도메인과의 특이적 상호작용에 관여하는 항원 분자의 일부분은 "에피토프(epitope)" 또는 "항원 결정인자"로서 지칭된다. 항원 결합 도메인은 전형적으로 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하지만, 이는 필수적으로 둘 모두를 포함할 필요는 없다. 예를 들어, 소위 "Fd" 항체 절편은 VH 도메인으로만 이루어져 있지만, 여전히 온전한 항체의 항원 결합 기능을 일부 보유한다.
항체의 결합 절편은 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 개열(cleavage)에 의해 생성된다. 결합 절편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 및 단일쇄 항체를 포함한다. "이중 특이성" 또는 "이작용성" 항체 이외의 항체는 동일한 결합 부위를 갖는 것으로 이해된다. 효소인 파파인(papain)에 의한 항체의 소화로 인해, "Fab" 절편으로도 알려져 있는 2개의 동일한 항원 결합 절편 및 항원 결합 활성을 갖지 않지만 결정화하는 능력을 갖는 "Fc" 절편이 생성된다. 효소인 펩신에 의한 항체의 소화로 인해 항체 분자의 2개 암(arm)이 연결된 채로 남아 있고 2개의 항원 결합 부위를 포함하는 F(ab')2 절편이 생성된다. F(ab')2 절편은 항원을 가교 결합시키는 능력을 갖는다. 본원에서 사용되는 경우 "Fv"는 항원 인식 및 항원 결합 부위를 둘 모두 보유하는 항체의 최소 절편을 지칭한다. 본원에서 이용되는 경우 "Fab"는 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 CH1 도메인을 포함하는 항체의 절편을 지칭한다.
"mAb"란 용어는 단클론성 항체를 지칭한다. 본 개시내용의 항체는 전체 천연 항체, 이중 특이성 항체; 키메라 항체; Fab, Fab', 단일쇄 V 영역 절편(scFv), 융합 폴리펩티드, 비통상적인 항체 및 이들의 조합을 제한 없이 포함한다.
본 개시내용에서, "포함하는", "포함하기", "함유하기" 및 "갖기" 등은 미국 특허법에서 이들에 부여된 의미를 가질 수 있고, "포함하는", "포함하기" 등을 의미할 수 있으며; "본질적으로 ~로 구성되기" 또는 "본질적으로 ~로 구성되는" 등은 마찬가지로 미국 특허법에서 부여된 의미를 가지며, 상기 용어는 개방형으로, 인용되는 기본적이거나 신규한 특징이 인용되는 것 이외의 존재에 의해 변경되지 않는 한 인용되는 것 이외의 존재를 허용하지만, 선행 기술의 실시형태를 배제한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "결정하기", "평가하기", "검정하기", "측정하기" 및 "검출하기"란 용어는 정성적 및 정량적 결정 둘 모두를 지칭하며, 이와 같이 "결정하기"란 용어는 본원에서 "검정하기", "측정하기" 등과 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 정량적 결정이 의도되는 경우, 피분석물 등의 "양을 결정하기"란 어구가 사용된다. 정성적 및/또는 정량적 결정이 의도되는 경우, 피분석물의 "수준을 결정하기" 또는 피분석물을 "검출하기"란 어구가 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "Fc 도메인"이란 용어는 항체 불변 영역의 일부분을 지칭한다. 전통적으로, Fc 도메인이란 용어는 항체의 쌍을 이룬 CH2, CH3 및 힌지 영역을 포함하는 프로테아제(예를 들어, 파파인) 개열 생성물을 지칭한다. 본 개시내용의 문맥에서, Fc 도메인 또는 Fc란 용어는, 생산 수단과는 무관하게 면역글로불린 폴리펩티드의 CH2, CH3 및 힌지 영역 전체 또는 일부분을 포함하는 임의의 폴리펩티드(또는 이 같은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산)를 지칭한다.
"융합 폴리펩티드" 또는 "융합 단백질"이란 용어는 2개 이상의 상이한 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드, 또는 동일한 폴리펩티드에 자연적으로 존재하지 않는 이의 활성 절편을 지칭한다. 다양한 실시형태에서, 2개 이상의 상이한 폴리펩티드는 펩티드 결합 또는 펩티드 링커에 의해 작동 가능하게 함께 공유 결합되며, 예를 들어 프레임 내에서 화학적으로 결합 또는 융합된다. 예를 들어, 이중 특이성 융합 단백질은 하나 이상의 Fab 및/또는 Fab' 절편, Fc 절편 또는 영역(예를 들어, 힌지 영역이 존재하거나 존재하지 않는 CH2 및 CH3) 및/또는 하나 이상의 Fab 및/또는 Fab' 절편 또는 Fc 절편에 부착되어 있는 융합 단백질을 포함할 수 있다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드와 관련하여 "동일한" 또는 "동일성" 비율(%)이란 용어는, 어떠한 보존적 아미노산 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않으면서 최대 상응성(maximum correspondence)을 위해 (필요하면, 갭을 도입하면서) 비교되고 정렬되는 경우, 동일한 2개 이상의 서열 또는 부분서열(subsequence), 또는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 소정의 비율(%)로 갖는 2개 이상의 서열 또는 부분서열을 지칭한다. 동일성 비율(%)은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 이용하여 측정될 수 있거나, 시각 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 구현하기 위해 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어는 당해 기술분야에 알려져 있다(예를 들어, 문헌{Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 5873~5877}에서 변형되고 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(문헌{Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25: 3389~3402}) 내로 통합된 바와 같은 문헌{Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 2264~2268} 참조). 특정 실시형태에서, 문헌{Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389~3402}에 기술된 바와 같은 Gapped BLAST가 사용될 수 있다. BLAST-2, WU-BLAST-2(문헌{Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266: 460~480}), ALIGN, ALIGN-2(캘리포니아주 사우스샌프란시스코 소재의 제넨테크(Genentech)) 또는 Megalign(DNASTAR)가 또한 사용될 수 있다.
"단리된"이란 용어는 자연 환경에서 존재하는 기타 성분들이 실질적으로 없는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 단리된 단백질에는 실질적으로 상기 단백질이 유래하는 세포 또는 조직 공급원에서 유래한 세포 물질 또는 기타 단백질이 없다. 또한 "단리된"이란 용어는 단리된 단백질이 약학 조성물로서 투여되기에 충분히 순수하거나, 적어도 70% 내지 80%(w/w) 순수하고, 보다 바람직하게는 적어도 80% 내지 90%(w/w) 순수하고, 더욱 더 바람직하게는 90% 내지 95% 순수하고, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(w/w) 순수한 제제를 지칭한다.
"참고"란 용어는 비교 기준(standard of comparison)을 지칭한다.
"특이적으로 결합하는"이란 용어는 약제(예를 들어, CD40L, GITRL, OX40L 또는 CD137L)가 분자(예를 들어, CD40 폴리펩티드, GITR 폴리펩티드, OX40 폴리펩티드 또는 CD137 폴리펩티드 각각)를 인식하여 이와 결합하지만, 시료, 예를 들어 생물학적 시료 내의 기타 분자를 실질적으로 인식하여 이와 결합하지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 특이적으로 결합하는 2개의 분자는 생리적 조건 하에 비교적 안정한 복합체를 형성한다. 특이적 결합은, 통상 중간 내지 높은 용량과 함께 낮은 친화도를 갖는 비특이적 결합과 구별되는 바와 같이, 높은 친화도 및 중간 내지 낮은 용량을 특징으로 한다.
"개체"란 용어는 인간 또는 비인간 포유동물, 예를 들어 소, 말, 개, 양 또는 고양이를 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물을 지칭한다.
본원에서 제공되는 범위는 이 범위 내의 모든 값에 대한 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50으로 이루어진 군으로부터의 임의의 숫자, 숫자의 조합, 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료하는", "치료하기", "치료" 등의 용어는 질환 및/또는 이와 연관된 증상을 감소 및/또는 완화시키는 것을 지칭한다. 배제되지는 않지만, 질환 또는 병태를 치료한다는 것은 질환, 병태 또는 이와 연관된 증상의 완전 제거를 요구하지는 않는 것으로 인지될 것이다. 예를 들어, 본원에서 고려되는 바와 같이, 질환의 치료는 질환의 증상 악화의 예방을 포함한다.
문맥 상 구체적으로 언급되거나 자명하지 않은 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "또는"이란 용어는 포괄적인 것으로 이해된다. 문맥 상 구체적으로 언급되거나 자명하지 않은 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "일" 및 "하나"와 같은 단수 용어는 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.
더욱이, 본원에서 사용되는 경우에 "및/또는"은 2개 이상의 명시된 특징 또는 성분 각각에 대해 단독 또는 기타 특징 및 성분과 함께 구체적으로 개시한 것으로서 간주되어야 한다. 따라서, "A 및/또는 B"란 어구에서 사용된 바와 같이, "및/또는"이란 용어는 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)을 포함하도록 하기 위한 것이다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용된 바와 같이 "및/또는"이란 용어는 하기 실시형태 각각, 즉 A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독)을 포함하도록 하기 위한 것이다.
문맥 상 구체적으로 언급되거나 자명하지 않은 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "약"이란 용어는 당해 기술분야에서 정상적인 허용 범위 이내, 예를 들어 평균에 대해 2의 표준 편차 이내인 것으로 이해된다. "약"은 언급되는 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 이내인 것으로 이해될 수 있다. 달리 언급하지 않는 한, 본원에 제공되는 모든 수치는 "약"이란 용어로 암시적으로 수식된 것으로 간주된다.
본원에서 변수에 대한 임의의 정의에서 화학적 그룹의 목록에 대한 설명에는 임의의 단일 그룹 또는 나열된 그룹의 임의의 조합으로서의 해당 변수에 대한 정의가 포함된다. 본원에서 변수 또는 양태에 대한 실시형태의 설명에는 임의의 단일 실시형태로서 또는 임의의 기타 실시형태 또는 이들의 일부의 임의의 조합으로 해당 실시형태가 포함된다.
본원에서 제공되는 임의의 조성물 또는 방법은 본원에서 제공되는 하나 이상의 임의의 기타 조성물 및 방법과 조합될 수 있다.
개요
본 개시내용은 몇몇 융합 단백질(FP)을 제공하며, 특히 다가이면서 T 세포 매개 항암 면역 반응을 제어하도록 설계된 이중 특이성 융합 단백질(BFP)을 제공한다. 하나의 비배타성 실시형태에서, 고려되는 BFP는 제1 결합 도메인(BD1), 제2 결합 도메인(BD2), 및 예를 들어 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역을 포함한다(도 1 참조). BD1 및 BD2는 각각 개별적으로 항원 결합 도메인, 항원 결합 절편, 결합 절편, 수용체 작용제, 길항제 또는 리간드 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 하나의 특정 실시예에서, BD1 및 BD2 중 적어도 하나는 Fab 도메인, scFv, 단일 도메인 항체 및 항체 가변 도메인이다.
일부 실시형태에서, 일부 BFP의 BD1, BD2 및 Fc 영역은 펩티드 링커와 같은 하나 이상의 링커에 의해 함께 연결될 수 있다. 이러한 방식으로, 일부 실시형태에서는 고려되는 BFP는 유전적으로 암호화될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 발현되고 조립될 수 있는 단일쇄 융합 단백질(scfp)을 발현할 수 있다.
일부 실시형태에서, BD1 및 BD2 결합 도메인은 각각 이들의 모(천연의 미결합) 구성 성분으로서 이들 개개의 표적(예를 들어, 에피토프, 단백질 및/또는 수용체)에 대한 유사한 결합 능력 및 기능을 보유하고 있다. 하나의 실시형태에서, 고려되는 BFP의 이중 특이성 결합 능력으로 인해 단일 BFP가 단일 세포 표면(즉, 시스-상호작용) 또는 인접한 세포의 세포 표면(즉, 트랜스-상호작용) 상의 2개의 분자 표적에 동시에 연합 및/또는 결합하도록 한다. 일부 실시형태에서, 시스- 및 트랜스-상호작용을 별도로 또는 동시에 야기할 수 있는 BFP가 고려되고 있다.
본원에서 고려되는 바와 같이, 하기 도 2 및 표 1에 나타나 있는 바와 같은 상이한 BFP 구성이 가능하다.
예시적인 이중 특이성 융합 단백질
명칭(들) 형식 BD1 BD1 표적 BD2 BD2 표적 Fc
CD40L FP-항-PD-L1 BFP2 6 단위의 CD40L FP CD40 1 단위의 F(ab)2 항-PD-L1(MEDI4736에서 유래) PD-L1 IgG4P
항-PD-L1-CD40L FP(MEDI7526) BFP3 6 단위의 CD40L FP CD40 1 단위의 F(ab)2 항-PD-L1(MEDI4736에서 유래) PD-L1 IgG4P
항-PD-L1-CD40L FP (MEDI7526에 대한 쥐 대리) BFP3 6 단위의 쥐 CD40L FP 쥐 CD40 1 단위의 F(ab)2 항-쥐 PD-L1 쥐 PD-L1 쥐 IgG1D265A
항-PD-L1-TNF-α FP BFP3 6 단위의 TNF-α FP TNF-α 수용체 1 단위의 F(ab)2 항-PD-L1(MEDI4736에서 유래) PD-L1 IgG4P
항-PD1-OX40L FP BFP3 6 단위의 OX40L FP OX40 1 단위의 F(ab)2 항-PD1 PD1 IgG4P
항-PD1-OX40L FP(2 x WT) BFP3 4 단위의 OX40L 야생형, 2 단위의 OX40L F180A FP OX40 1 단위의 F(ab)2 항-PD1 PD1 IgG4P
항-PD1-OX40L FP(1 x WT) BFP3 2 단위의 OX40L 야생형, 4 단위의 OX40L F180A FP OX40 1 단위의 F(ab)2 항-PD1 PD1 IgG4P
항-PD-L1-OX40L FP(MEDI5615) BFP3 6 단위의 OX40L FP OX40 1 단위의 F(ab)2 항-PD1 PD1 IgG4P
항-PD1-CD137L FP BFP3 6 단위의 CD137L FP CD137 1 단위의 F(ab)2 항-PD1 PD1 IgG4P
항-PD1-GITRL FP*(MEDI3387, BIOAE003, BFP@-PD1(0115)-GITRL(sc)-G4P, PD-1/GITRL BFP IgG4P) BFP3 6 단위의 GITRL FP GITR 1 단위의 F(ab)2 항-PD1 PD1 IgG4P
항-PD1-GITRL FP*(MEDI5771, BIOAE005,
PD-1/GITRL BFP IgG1)		 BFP3 6 단위의 GITRL FP GITR 1 단위의 F(ab)2 항-PD1 PD1 IgG1
하나의 특정 실시형태에서, 임의의 기타 세포 표면 단백질을 표적화하는 다른 결합 도메인과 쌍을 형성하는 임의의 TNF 수퍼패밀리 멤버를 표적화하는 적어도 하나의 결합 도메인으로서 포함되는 본원에 개시된 임의의 형식의 BFP가 고려된다. 본원에서 고려되는 TNF 수퍼패밀리 멤버를 표적화하는 BFP 결합 도메인의 추가적인 예로는 LIGHT, CD30L, CD27L 및 TL1a를 들 수 있으며, 이들은 BFP2 또는 BFP3 형식에 포함될 수 있다.
작용 기작
일부 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 N-말단 항원 결합 소단위, 중앙 Fc 폴리펩티드 코어 및 하나 이상의 C-말단 리간드 단백질을 포함하는 BFP3 형식의 이중 특이성 융합 단백질을 특징으로 한다. 하나의 실시형태에서, 하나 이상의 N-말단 항원 결합 소단위(BD2)는 항-PD-1 및/또는 항-PD-1L 항원 결합 소단위일 수 있고, 중앙 Fc 폴리펩티드 코어는 IgG1 또는 IgG4 Fc 영역 폴리펩티드(CH2 및 CH3)일 수 있으며, 하나 이상의 C-말단 리간드 단백질(BD1)은, 예를 들어 GITRL, OX40L, CD40L, TNF-α 및/또는 CD137을 포함할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 도 1 내지 도 4에 도시된 BFP3 형식은 상이한 세포 상에 존재하는 경우(트랜스-상호작용) BD1 및 BD2 표적의 선별(co-opting)을 가능케 하며, 그 결과 골수 세포 상의 Fcγ 수용체에 연결되어 있는 하류의 신호전달 경로가 활성화된다. MEDI7526(표 1 참조)을 일례로서 사용하여 CD40 자극과 관련하여 FcγRI 연합은 부가적인 NF-κB 활성화 그 이상을 조장할 수 있다.
일부 실시형태에서, 이의 표적(예를 들어, 세포 수용체)에 대한 BD1의 결합으로 인해 결합 복합체의 내재화가 촉발될 수 있으며, 신호전달 캐스케이드(signaling cascade; 예를 들어 T-세포 활성화 및/또는 복제를 조장함)가 개시되거나, 신호전달 캐스케이드(예를 들어, 억제적 차단을 제거함)가 억제된다. 예를 들어, BD1 결합 및 내재화로 인해 BD2 및 이의 표적, 예를 들어 PD1 또는 PD-L1 중 하나가 세포 내로 내재화되게 된다. PD1/PD-L1의 강제 내재화로 인해 이들의 분해가 촉발되며, 따라서 세포 표면 상에는 PD1/PD-L1이 장기간 동안 존재하지 않게 된다. 이는 T 세포 매개 면역 반응을 조장하기 위해 세포 표면으로부터 PD1/PDL1을 제거함으로써 PD1/PD-L1 억제 기능을 감쇠시키기 위한 신규한 접근법이다.
하나의 실시형태에서, 고려되는 BFP는 이량화된 단일쇄 융합 단백질 골격 소단위이며, 예를 들어 이황화 결합을 통해 결합되는 2개의 동일한 단일쇄 융합 단백질을 포함한다. 각각의 단일쇄 융합 단백질의 개개의 성분은 펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다. 고려되는 펩티드 링커는 목적하는 이중 특이성 융합 단백질의 기능적 형성을 가능케 하는 임의의 길이, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 또는 그 이상의 아미노산 길이를 가질 수 있다. 하나의 특정 실시형태에서, 고려되는 융합 단백질의 개개의 성분들 사이에 9개 이상의 아미노산 길이를 갖는 펩티드 링커가 고려된다. 고려되는 이중 특이성 융합 단백질에서 9개 이상의 아미노산을 갖는 펩티드 링커는 안정성을 보유하고/하거나 이 같은 융합 단백질의 응집을 야기하지 않는 것으로 밝혀져 있다. 사실상, 다양한 범위의 링커 길이는 다른 곳에서 제안된 것보다 본 개시내용의 이중 특이성 융합 단백질에서 내성이 좋은 것으로 증명되었다.
본 개시내용의 단일쇄 이중 특이성 융합 단백질은 안정하고 생물 활성을 나타내는 것으로 나타나 있다. 본원에서 기술된 바와 같이, 이중 특이성 융합 단백질 소단위의 안정성 및 활성은 적어도 부분적으로는 본 개시내용의 이중 특이성 융합 단백질에서 사용되는 링커의 길이에 기인하였다. 9개 초과의 아미노산 길이를 갖는 링커는 응집 및/또는 안정성에 대한 어떠한 중요한 문제도 나타내지 않았다. 본 개시내용의 이중 특이성 융합 단백질은 또한 단일쇄 Fc 단백질의 기타 특징 및 이점을 제공한다.
BD1 항원 결합 도메인
T 세포 매개 면역 반응을 제어하기 위해 사용될 수 있는 임의의 TNF-α 패밀리 멤버가 본원에서의 사용에 고려된다. 고려되는 TNF-α 패밀리 멤버의 특정 예로는 CD40L, GITRL, OX40L, TNF-α 및 CD137L을 들 수 있다. TNF 리간드 패밀리의 자연적으로 발생하는 가용성 사이토카인 멤버는 동종 삼량체로서의 이들의 생물 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 TNF 리간드의 삼량체성 복합체는 이들의 단량체의 해리를 통해 변성되는 경향이 있으며, 재조합 단량체 단위로부터 제조하기는 어렵다. 동종 삼량체를 단량체로 해리하는 것을 방지하기 위해, TNF 리간드의 적어도 3개의 단량체는 "단일쇄(sc)" 분자를 형성하기 위해 펩티드 링커에 의해 이들의 C 말단 및 N 말단을 통해 서로 공유 결합된다. 따라서 전체 분자(2개의 펩티드 링커를 갖는 TNF 리간드 패밀리의 멤버의 적어도 3개의 단량체)는 단량체로의 해리가 더 이상 일어날 수 없도록 단일 단백질 가닥으로 이루어져 있다.
또한, 본 개시내용의 단일쇄 융합 단백질에서와 같이, 삼량체의 이량화를 구현하기 위해 Fc 도메인에 대한 TNF 리간드의 융합이 사용될 수 있다. 가용성 도메인의 이량화는 이황화 결합을 통해 2개의 Fc-도메인의 조립에 의해 달성된다. 세포 또는 이웃하는 세포 상의 단일쇄 TNF 리간드의 국소 부유화(local enrichment)는 이들 융합 단백질의 생물 활성을 증가시키려는 잠재성을 갖는다.
BD2 항원 결합 도메인
PD-1 및 PD-L1와 선택적으로 결합하고 PD-1 및 PD-L1의 결합 또는 활성화를 억제하는 항원 결합 영역, 예를 들어 Fab 절편은 본 개시내용의 BFP에서 유용하다. Fab(절편 항원 결합) 절편은 불변 영역들 사이의 이황화 결합에 의해 공유 결합된 VH-CH1 및 VL-CL 도메인으로 이루어져 있다. Fv 내의 비공유 결합된 VH 및 VL 도메인이 숙주 세포에 동시 발현되는 경우에 해리되려는 경향을 극복하기 위해, 소위 단일쇄(sc) Fv 절편(scFv)이 제조될 수 있다. scFv에서, 유연하면서 적절한 길이를 갖는 폴리펩티드는 VH의 C-말단을 VL의 N-말단에 결합시키거나 VL의 C-말단을 VH의 N-말단에 결합시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에서 고려되는 링커 펩티드는 GGGGS(Gly4Ser) 펩티드(서열 번호 43)의 다량체를 포함하지만, 당해 기술분야에는 기타 링커가 또한 알려져 있고, 본원에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 가능한 링커는 15개의 잔기로 이루어진 (Gly4Ser)3 펩티드이다.
본 개시내용의 BD2 항원 결합 도메인(예를 들어, 항-PD-1 또는 항-PD-L1에 특이적임)은 임의적으로는 항체 불변 영역 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 이의 C 말단에 인간 Cκ 또는 Cλ 사슬을 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인이 부착될 수 있다. 유사하게, VH 도메인에 기반을 둔 특정 항원 결합 도메인은 임의의 항체 동위원소, 예를 들어 IgG, IgA, IgE 및 IgM 및 임의의 동위원소의 하위 부류(IgG1 및 IgG4를 포함하지만 이에 제한되지 않음)에서 유래하는 면역글로불린 중쇄 모두 또는 일부가 부착될 수 있다.
당업자라면 PD-1 및 PD-L1과는 다소 다른 단백질을 검출, 측정 및 억제하기 위해 본 개시내용의 BFP의 BD2 항원 결합 도메인이 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. BD2 항원 결합 도메인은 표적 단백질이 본원에 기술된 적어도 100개, 80개, 60개, 40개 또는 20개의 인접 아미노산의 임의의 서열에 대해 적어도 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 한 결합 특이성을 보유하는 것으로 예상된다. 동일성 비율(%)은, 예를 들어 문헌{Altshul et al. (1990) J. Mol. Biol., 215: 403~410}에 개시된 베이직 로컬 얼라인먼트 툴(Basic Local Alignment Tool; BLAST), 문헌{Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol., 48: 444~453}의 알고리즘 또는 문헌{Meyers et al. (1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11~17}의 알고리즘과 같은 표준 정렬 알고리즘에 의해 결정된다.
서열 상동성 분석 이외에, 개시된 BD2 항원 결합 도메인 및 이들의 항원과의 복합체에 의해 추정되는 특정 3D 구조를 확인하기 위해 에피토프 매핑(epitope mapping; 예를 들어 문헌{Epitope Mapping Protocols, ed. Morris, Humana Press, 1996} 참고) 및 2차 및 3차 구조 분석이 실시될 수 있다. 이 같은 방법으로는 X선 결정학(문헌{Engstom (1974) Biochem. Exp. Biol., 11:7~13}) 및 본원에 개시된 항체에 대한 가상 재현(virtual representation)의 컴퓨터 모델링(문헌{Fletterick et al. (1986) Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.})을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
고려되는 항-PD-L1 항원 결합 도메인은 PD-L1에 대해 선택적이며 PD-1 및 CD80 수용체에 대한 PD-L1의 결합을 차단하는 예시적인 항-PD-L1 항체인 더발루맙(MEDI4736)으로부터 채취하거나 이로부터 유래할 수 있다. 더발루맙은 시험관 내에서 인간 T-세포 활성화의 PD-L1 매개 억제를 완화시킬 수 있으며, T-세포 의존 기작을 통해 이종 이식 모델에서 종양 성장을 억제한다. 본원에서 제공되는 방법에 사용하기 위한 더발루맙(또는 이의 절편)에 관한 정보는 미국 특허 제8,779,108호 및 제9,493,565호에서 찾아볼 수 있으며, 이들의 전문은 본원에서 그 전체가 참고로 포함된다.
특정 양태에서, 본원에 사용하기 위한 더발루맙의 항원 결합 절편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 이때 중쇄 가변 영역은 상기 본원에 나타나 있는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열(카바트에 의해 정의됨)을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상기 본원에 나타나 있는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열(카바트에 의해 정의됨)을 포함한다. 당업자들이라면 당업자들에게 알려져 있는 초티아(Chothia) 정의, Abm 정의 또는 기타 CDR 정의를 용이하게 확인할 수 있을 것이다. 특정한 양태에서, 본원에서 사용하기 위한 더발루맙의 항원 결합 절편은 미국 특허 제8,779,108호에 개시된 바와 같은 2.14H90PT 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
고려되는 항-PD-1 항원 결합 도메인은 PD-1에 대해 선택적이며 PD-L1 및 PD-L2 수용체에 대한 PD-1의 결합을 차단하는 예시적인 항-PD-1 항체인 LO115로부터 채취하거나 이로부터 유래할 수 있다.
Fc 영역
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 아미노산 변형을 가질 수 있는 IgG1 또는 IgG4 Fc 영역 폴리펩티드를 갖는 이중 특이성 융합 단백질을 제공한다. 예를 들어, 아미노산은 카바트로 개시된 바와 같이 EU 인덱스(EU index)로 넘버링할 때 228번 및 235번으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서 치환될 수 있다. 예를 들어, Fc 영역은 IgG4 Fc 영역일 수 있고, 변이체 아미노산은 카바트로 개시된 바와 같이 EU 인덱스로 넘버링할 때 228P("IgG4P"를 생성함), 235E 및 235Y 중 하나 이상이다. 다른 예로서, L234F/L235E/P331S(본원의 다른 곳에서는 "IgG TM"으로 지칭됨) 중 하나 이상을 포함할 수 있는 변이체 아미노산을 갖는 IgG1 Fc 영역이 고려된다. 본원에 개시된 모든 IgG4 분자는 표지된 IgG4이든 IgG4P이든 무관하게 228P 돌연변이를 함유한다.
하나의 실시형태에서, 본원에서 사용되는 절편 결정화(Fc) 도메인은 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC)을 매개하는데 관여하는 보체 성분 C1q 및 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키는 IgG1 중쇄의 불변 도메인에서 3중 돌연변이를 함유하는 더발루맙의 Fc 도메인이다.
링커
본 개시내용의 이중 특이성 융합 단백질 내의 소단위들은 폴리펩티드 링커에 의해 연결될 수 있으며, 이때 각각의 링커는 (예를 들어, 펩티드 결합을 통해) 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 소단위에 융합되고/되거나, 그렇지 않는 경우에 이에 연결된다. 이중 특이성 융합 단백질 내의 링커들의 조합은 등가 동의성(homomericity) 또는 이가 동의성(heteromericity)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 이중 특이성 융합 단백질 내에 존재하는 모든 펩티드 링커의 아미노산 서열은 동일하다. 기타 실시형태에서, 본 개시내용의 이중 특이성 융합 단백질 내에 존재하는 펩티드 링커들 중 적어도 2개의 아미노산 서열은 서로 상이하다. 링커 폴리펩티드는 이들이 목적하는 활성을 보유하도록 서로에 대해 정확한 구성을 취하는 방식으로 2개 이상의 단량체 소단위를 연결시키기에 적합한 길이를 가져야 한다. 폴리펩티드를 신규한 연결된 융합 폴리펩티드 내에 연결시키기 위한 자연적으로 발생하는 펩티드 링커뿐만 아니라 인공 펩티드 링커의 용도는 문헌에 잘 알려져 있다. 따라서, 2개 이상의 단량체 소단위를 융합시키는 링커는 천연 링커, 인공 링커 또는 이들의 조합일 수 있다.
본원에서 기술된 바와 같이, 융합 단백질 소단위들 사이에 9개의 이상의 아미노산 길이를 갖는 펩티드 링커는 안정성을 보유하고/하거나 이 같은 융합 단백질의 과도한 응집을 야기하지 않는 것으로 밝혀져 있다. 따라서 일부 실시형태에서 폴리펩티드 링커는 약 9개 내지 약 20개의 아미노산 잔기, 약 9개 내지 약 15개의 아미노산 잔기 또는 약 9개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 폴리펩티드 링커 내에 포함하도록 선택된 아미노산 잔기는 본 개시내용의 융합 단백질 소단위의 활성 또는 기능을 유의하게 방해하지 않는 특성을 나타내야 한다. 따라서 폴리펩티드 링커는 대체로 본 개시내용의 특정 융합 단백질 소단위의 활성 또는 기능과는 모순될 수 있는 전하를 나타내지 않아야 하거나, 내부 접힘을 방해하지 않아야 하거나, 결합을 심각하게 방해할 수 있는 하나 이상의 단량체 소단위 내의 아미노산 잔기와 결합 또는 기타 상호작용을 형성하지 않아야 한다.
다양한 실시형태에서, 폴리펩티드 링커는 구성적 유연성을 갖는다. 적합한 유연한 링커로는, 예를 들어 Gly와 Ser의 비율이 1 이상인 Gly 및 Ser 잔기의 조합을 갖는 링커를 들 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 링커는 본질적으로 구조화되지 않은 천연 또는 인공 폴리펩티드이다(예를 들어, 문헌{Schellenberger et al., Nature Biotechnol. 27: 1186~1190, 2009} 참조, 및 또한 문헌{Sickmeier et al., Nucleic Acids Res. 35: D786~93, 2007} 참조).
특정한 구체적인 실시형태에서, 이중 특이성 융합 단백질 소단위들 사이의 링커는 GGGGS의 다량체, 예를 들어 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 39), GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 40) 또는 GGGGSGGGGS(서열 번호 41)일 수 있다. 기타 실시형태에서, 고려되는 링커는 GGGGSGGGS(서열 번호 42)일 수 있다.
특정 실시형태
특정 실시형태에서, 본원에 개시된 이중 특이성 융합 단백질은 한 쌍의 단일쇄 융합 단백질을 함유하며, 이때 단일쇄 융합 단백질 각각은, N-말단에서 C-말단 방향으로, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-PD-1 또는 항-PD-L1 Fab 절편을 포함하며, 이때 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 (b) IgG1 또는 IgG4P Fc 폴리펩티드에 공유 결합되고, IgG1 또는 IgG4P Fc 폴리펩티드는 (c) 제1 펩티드 링커에 공유 결합되고, 제1 펩티드 링커는 제1 TNF 수퍼패밀리 리간드 소단위에 공유 결합되고, 제1 TNF 수퍼패밀리 리간드 소단위는 제2 펩티드 링커에 공유 결합되고, 제2 펩티드 링커는 제2 TNF 수퍼패밀리 리간드 소단위에 공유 결합되고, 제2 TNF 수퍼패밀리 리간드 소단위는 제3 펩티드 링커에 공유 결합되고, 제3 펩티드 링커는 제3 TNF 수퍼패밀리 리간드 소단위에 공유 결합된다.
유도체
본 개시내용의 폴리펩티드(예를 들어, 항-PD-1 Fab, 항-PD-L1 Fab, GITRL, OX40L, CD40L, TNF-α 또는 CD137L)는 이들의 표적과 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다면 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 이 같은 변이체는 당해 기술분야에 널리 알려져 있는 기법을 이용하여 당업자에 의해 이들 폴리펩티드의 서열로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가는 항-PD-1 또는 PD-L1 Fab 절편의 FR 및/또는 CDR 내에서 이루어질 수 있다. 보통 FR에서의 변경이 항원 결합 도메인의 안정성 및 면역원성을 개선하기 위해 설계될지라도 CDR에서의 변경은 전형적으로 이의 표적에 대한 항원 결합 도메인의 친화도를 증가시키기 위해 설계된다. 또한 FR의 변이체는 자연적으로 발생하는 면역글로불린 알로타입(immunoglobulin allotype)을 포함한다. 이 같은 친화도 증가 변화는 통상의 기법에 의해 경험적으로 결정되며, 여기서 상기 기법은 CDR를 변경하는 단계 및 이의 표적에 대한 항원 결합 도메인의 친화도를 시험하는 단계를 수반한다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 개시된 CDR 중 임의의 하나 내에서 이루어질 수 있다. 문헌{Antibody Engineering, 2nd ed., Oxford University Press, ed. Borrebaeck, 1995}에 개시된 방법에 따라 다양한 변경이 이루어질 수 있다. 이들 변경은 서열 내에서 기능적으로 동일한 아미노산 잔기를 암호화하는 상이한 코돈(codon)의 치환에 의해 변경되어 "침묵(silent)" 변경을 야기하는 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 비극성 아미노산으로는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 들 수 있다. 극성의 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 들 수 있다. 양으로 하전된 (염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 들 수 있다. 음으로 하전된 (산성) 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산을 들 수 있다.
본 개시내용의 폴리펩티드 및/또는 항체의 유도체 및 유사체는 재조합 및 합성 방법을 포함하여 당해 기술분야에 널리 알려져 있는 다양한 기법에 의해 생산될 수 있다(문헌{Maniatis (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.} 및 문헌{Bodansky et al. (1995) The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed., Spring Verlag, Berlin, Germany}).
하나의 실시형태에서, 본 개시내용의 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제조하기 위한 방법은 본원에 개시된 VH 도메인의 아미노산 서열 내에 하나 이상의 아미노산을 부가, 결실, 치환 또는 삽입하는 단계, 이렇게 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 임의적으로 조합하는 단계, 및 항원에 대한 특이적 결합에 대해 VH 도메인 또는 VH/VL 조합(들)을 시험하는 단계를 포함한다. 본원에 개시된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체가 하나 이상의 VH 도메인과 조합되는 유사한 방법이 이용될 수 있다.
유사한 셔플링(shuffling) 또는 조합 기법이 또한 β-락타마아제 유전자와 관련한 기법을 기술하지만 상기 접근법이 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다는 것을 관찰한 스테머(Stemmer)(문헌{Nature (1994) 370: 389~391})에 의해 개시된다.
추가의 실시형태에서, 당업자라면 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자의 무작위 돌연변이 유발을 이용하여 본원에 개시된 서열에서 유래하는 하나 이상의 서열을 갖는 신규한 VH 또는 VL 영역을 생성할 수 있다. 이 같은 하나의 기법인 오류 유발 PCR(error-prone PCR)은 그램(Gram) 등(문헌{Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89: 3576~3580})에 의해 개시된다.
사용 가능한 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR에 대한 돌연변이 유발을 유도하는 것이다. 이 같은 기법은 바바스(Barbas) 등(문헌{Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1994) 91: 3809~3813}) 및 쉬어(Schier) 등(문헌{J. Mol. Biol. (1996) 263: 551~567})에 의해 개시된다.
유사하게, 항원 결합 도메인의 1개, 2개 또는 3개의 CDR이 모두 다양한 VH 또는 VL 도메인 내로 이식될 수 있으며, 이어 상기 VH 또는 VL 도메인은 PD-1 또는 PD-L1에 특이적인 항원 결합 절편에 대해 선별된다.
본원에서 유용한 면역글로불린 가변 도메인의 일부분은 실질적으로 본원에서 개시된 바와 같은 CDR 중 적어도 하나, 및 임의적으로는 본원에서 개시된 바와 같은 scFv 절편에서 유래한 간섭 골격 영역을 포함할 수 있다. 상기 일부분은 FR1 및 FR4 중 하나 또는 둘 모두를 적어도 약 50%씩 포함할 수 있으며, 이때 50%는 FR1의 C 말단 50%이고, FR4의 N 말단 50%이다. 가변 도메인의 실질적인 부분의 N 말단부 또는 C 말단부에 있는 추가적인 잔기는 정상적으로는 자연적으로 발생하는 가변 도메인 영역과는 무관한 잔기일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기법에 의한 항체의 제조는 클로닝 또는 기타 조작 단계를 용이하게 하기 위해 도입되는 링커에 의해 암호화되는 N 또는 C 말단 잔기의 도입을 초래할 수 있다. 기타 조작 단계는 면역글로불린 중쇄 불변 영역, 기타 가변 도메인(예를 들어, 이중체(diabody)의 생산에서), 또는 하기에서 더욱 상세하게 토의된 바와 같은 단백질성 표지를 포함하는 추가의 단백질 서열에 가변 도메인을 연결하기 위해 링커를 도입하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 본 개시내용의 항원 결합 도메인(예를 들어, 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1)은 다른 기능성 분자, 예를 들어 다른 펩티드 또는 단백질(알부민, 다른 항체 등)에 연결될 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 화학적 가교 결합 또는 재조합 방법에 의해 연결될 수 있다. 또한 항원 결합 도메인은 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호; 또는 제4,179,337호에 개시된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체들 중 하나, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 연결될 수 있다. 항원 결합 도메인은, 예를 들어 이들의 순환 반감기를 증가시키기 위해 중합체에 대한 공유 접합에 의해 화학적으로 개질될 수 있다. 또한 예시적인 중합체 및 이들을 부착시키기 위한 방법은 미국 특허 제4,766,106호; 제4,179,337호; 제4,495,285호; 및 제4,609,546호에 나타나 있다.
개시된 항체 절편은 또한 고유의 패턴과는 상이한 글리코실화 패턴을 갖도록 변경될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 탄수화물 모이어티(moiety)가 결실되고/되거나 하나 이상의 글리코실화 부위가 부가될 수 있다. 본원에 개시된 항체 절편에 대한 글리코실화 부위의 부가는 당해 기술분야에 알려져 있는 글리코실화 부위 공통 서열(consensus sequence)을 함유하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 달성될 수 있다. 항체 절편 상의 탄수화물 모이어티의 개수를 증가시키는 다른 수단은 항체의 아미노산 잔기에 대한 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링에 의한 것이다. 이 같은 방법은 WO 87/05330 및 문헌{Aplin et al. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259~306}에 개시되어 있다. 항체로부터 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는, 예를 들어 문헌{Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259: 52}; 및 문헌{Edge et al. (1981) Anal. Biochem., 118: 131} 및 문헌{Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol., 138: 350}에 개시된 바와 같이 화학적 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 또한 항체 절편은 검출 가능한 표지 또는 기능성 표지로 태깅(tagging)될 수 있다. 검출 가능한 표지로는 통상적인 화학을 이용하여 항체 절편에 또한 부착될 수 있는 131I 또는 99Tc와 같은 방사성 표지를 들 수 있다. 또한 검출 가능한 표지로는 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase) 또는 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 같은 효소 표지를 들 수 있다. 검출 가능한 표지는 비오틴과 같은 화학적 모이어티를 추가로 포함하며, 이는 특정 동족성 검출 가능한 모이어티, 예를 들어, 표지된 아비딘(avidin)에 대한 결합을 통해 검출될 수 있다.
CDR 서열이 본원에 개시된 CDR 서열과는 단지 비실질적으로 상이한 항원 결합 도메인은 본 개시내용의 범주 내에 포함된다. 전형적으로, 아미노산은 유사한 전하, 소수성 또는 입체 화학적 특성을 갖는 관련된 아미노산에 의해 치환된다. 이 같은 치환은 당업자의 통상적인 기술 범위 내에서 있을 수 있다. CDR에서와는 달리, 항체의 결합 특징에 악영향을 미치지 않으면서 FR에서 보다 많은 실질적인 변경이 이루어질 수 있다. FR에 대한 변경으로는 비인간 유래 골격 잔기의 인간화 또는 항원 접촉에 중요하거나 결합 부위를 안정화시키는데 중요한 특정 골격 잔기의 조작(engineering), 예를 들어 불변 영역의 부류 또는 하위부류의 변경, 예를 들어 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호 및 문헌{Lund et al. (1991) J. Immun. 147: 2657~2662} 및 문헌{Morgan et al. (1995) 면역학 86: 319~324}에 개시된 바와 같은 Fc 수용체 결합과 같이 효과기 기능을 변경할 수 있는 특정 아미노산 잔기의 변경, 또는 불변 영역이 유래하는 종의 변경을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
당업자라면 상술한 변경이 전적으로 완전한 것은 아니고, 본원에 기술된 단백질 소단위에 적용될 수 있으며, 다수의 기타 변경은 본 개시내용의 교시 측면에서 당업자에게 가능할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
이중 특이성 융합 단백질 생산
달리 언급하지 않는 한, 본 개시내용의 실시는 분자생물학(재조합 기법을 포함함), 미생물학, 세포생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법을 이용하며, 이들 기법은 충분히 당업자의 범위 내에 있다. 이 같은 기법은 문헌{"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989)}; 문헌{"Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984)}; 문헌{"Animal Cell Culture" (Freshney, 1987)}; 문헌{"Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996)}; 문헌{"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987)}; 문헌{"Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987)}; 문헌{"PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994)}; 문헌{"Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)}과 같은 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 이들 기법은 본 개시내용의 폴리펩티드의 생산에 적용 가능하며, 이와 같이 본 개시내용을 수행하고 실시할 때 고려될 수 있다. 특정한 실시형태를 위한 특히 유용한 기법은 실시예에서 토의될 것이다.
이중 특이성 융합 단백질 특징 및 활성을 검정하기
단리되거나 다량체 일부로서의 본 개시내용의 이중 특이성 융합 단백질 소단위의 안정성은 당해 기술분야에 널리 알려져 있는 기법, 예를 들어 열적(Tm)및 무질서 변성(chaotropic denaturation; 예를 들어 우레아 또는 구아니딘 염에 의한 처리), 프로테아제 처리(예를 들어, 써몰리신(thermolysin)에 의한 처리) 또는 단백질 안정성을 결정하기 위한 당업계에서 허용되는 다른 방법에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 단백질 안정성을 측정하기 위해 사용되는 기법에 대한 포괄적 검토는, 예를 들어 문헌{"Current Protocols in Molecular Biology" and "Current Protocols in Protein Science" by John Wiley and Sons. 2007}에서 찾아볼 수 있다.
본 개시내용에 따른 이중 특이성 융합 단백질의 결합 친화도 및 기타 결합 특징은 당해 기술분야에 알려져 있는 다양한 시험관 내 검정 방법, 예를 들어 평형 방법(예를 들어, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 또는 동력학(예를 들어, BIACORE® 분석)), 및 간접 결합 검정, 경쟁적 결합 검정, 겔 전기영동 및 크로마토그래피(예를 들어, 겔 여과)와 같은 기타 방법에 의해 결정될 수 있다. 이들 및 기타 방법은 검사될 하나 이상의 성분에 대한 표지를 이용하고/하거나, 발색성, 형광성, 발광성 또는 동위원소 표지를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 검출 방법을 이용할 수 있다. 결합 친화도 및 동력학에 대한 상세한 설명은 문헌{Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)}에서 찾아볼 수 있다.
이중 특이성 융합 단백질의 기능 또는 활성을 결정하기 위한 추가적인 시험관 내 및 생체 내 방법이 본원에 개시되어 있다. 면역 반응들 중 하나 이상(예를 들어, T 세포 기능 및 기억, B 세포 활성화 또는 증식, 수지상 세포 성숙 또는 활성화, Th1 사이토카인 또는 케모카인 반응, 단핵구 유래 대식세포 M1/M2 분극, 항원 제시 및/또는 종양 미세환경의 면역 억제 중 하나 이상)을 결정하기 위해 이들 검정이 사용될 수 있다. 예를 들어, B16-F10 종양 마우스 모델을 비롯한 항암 또는 항종양 활성을 검정하기 위한 다양한 생체 내 동물 모델이 당해 기술분야에 알려져 있다. 추가적으로, 약역학 및 약동학 특징을 평가하기 위한 방법이 또한 널리 알려져 있다.
항종양 요법
또한 본 개시내용은 암을 치료하는데 유용한 조성물 및 방법을 특징으로 하며, 이때 상기 조성물은 상술한 바와 같은 이중 특이성 융합 단백질을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 이중 특이성 융합 단백질은 기타 항암 약물 또는 암에 대한 면역 세포 반응을 증가시키는 약물과 함께 투여될 수 있다.
또한 본원에서는 암을 치료하기 위한 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 도 1 내지 도 4에 나타나 있는 것과 같은 하나 이상의 이중 특이성 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. 본원에 나타낸 바와 같이, 이중 특이성 융합 단백질의 투여는, 예를 들어 마우스 종양 모델에서 종양 부피의 감소를 초래할 수 있다. 특정 양태에서, 고형 종양이 발현된 환자에는 이중 특이성 융합 단백질이 투여된다.
이중 특이성 융합 단백질을 포함하는 암 요법에 의한 치료로 인해, 예를 들어 암의 진행 속도의 감소, 종양 성장의 지연 또는 안정화, 종양 수축 및/또는 종양 퇴화가 야기된다. 일부 양태에서, 종양 성장의 감소 또는 지연이 통계적으로 유의할 수 있다. 종양 성장의 감소는 예상되는 종양 성장에 대해, 대규모 환자 개체군에 기반을 둔 예상되는 종양 성장에 대해, 또는 대조 개체군의 종양 성장에 대해 기준선에서의 환자의 종양 성장과의 비교를 통해 측정될 수 있다.
기타 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 암 생존율을 증가시키고 생명을 연장시킨다. 예를 들어, 본원에 개시된 데이터는 암 치료를 위한 BFP 분자의 효과를 보여줄 뿐만 아니라, BFP(MEDI7526)의 사용이 이의 모 시약의 조합(Durva + MEDI5083)에 의한 처리보다 낮은 독성을 야기한다는 것을 보여준다. 따라서 암 치료용으로 BFP 분자를 사용하면 효과적인 항암 반응이 보다 낮은 독성으로 구현될 수 있으며, 환자의 전반적인 건강이 개선될 수 있다. 다시 말해, 본원에 개시된 이중 특이성 융합 단백질을 사용하면 단일 요법 단독으로는 구현할 수 없는 치료 결과가 제공될 수 있다.
암 치료제의 투여에 대한 임상 반응은 자기 공명 영상(MRI) 스캔, x-방사선 영상, 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캔, 유세포 분석법 또는 형광 활성화 세포 분류기(FACS) 분석, 조직학, 육안 병리학, 및 혈액 화학분석(ELISA, RIA 및 크로마토그래피에 의해 검출 가능한 변화를 포함하지만 이에 제한되지 않음)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임상의에게 알려져 있는 진단 기법을 이용하여 평가될 수 있다.
하기 실시예는 본 개시내용의 평가, 선별 및 치료 방법을 어떻게 수행하고 이용하는지에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 개시되며, 본 발명자들이 자신의 개시내용으로 간주하는 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예
이하 본 개시내용은 하기 실시예를 참고하여 설명된다. 이들 실시예는 단순히 예시적이며, 본 개시내용은 결코 이들 실시예에 제한되는 것으로 이해되어서는 안 되지만, 오히려 본원에서 제공된 교시의 결과로서 자명하게 되는 모든 변형예를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예 번호 1: 이중 특이성 융합 단백질의 생성
하기 실시예에서 시험되는 이중 특이성 융합 단백질은 펩티드 링커를 통해 Fab 절편에 연결된 Fc 단량체에 연결된 3개의 리간드 소단위(주로 TNF 상동성 도메인에 상응함)로 이루어진 단일쇄 융합 단백질(scfp) 구조체를 이용하여 제조되었다(도 1 내지 도 4 참조). scfp는 이량화되어 BFP를 형성하였다. BFP용으로 사용되는 서열이 하기에 기술되어 있다.
실시예 번호 2: 옥테트 결합 검정
본원에 개시된 이중 특이성 결합 분자의 결합을 평가하기 위해, Ni-NTA 바이오센서 팁이 구비된 옥테트 QK 및 10X 동적 완충액이 사용되었다(캘리포니아주 멘로파크 소재의 포르테바이오(ForteBio)). 이러한 일련의 이중 특이성 결합 단백질에 있어서, His-태깅(tagging)된 PD-L1-his는 내부에서 제조하였으며, CD40-Fc 단백질은 시노 바이오로지컬(Sino-Biological; 중국 베이징)로부터 구입하여 실험실에서 비오티닐화하였다. 모든 결합 검정은 25℃에서 수행되었다.
분석 이전에 시료 플레이트를 1,000 rpm으로 교반하였다. 사용 이전에 스트렙타아비딘 및 Ni-NTA 바이오센서 팁에 1X 동적 완충액을 10분 동안 적용하였다. 1X 동적 완충액은 또한 기준선 결정을 위한 러닝 완충액으로서 작용하였으며, 항원 및 이중 특이성 항체에 대한 희석 완충액으로서 작용하였다. 스트렙타아비딘 또는 Ni-NTA 바이오센서 팁을 항원 포획용 20 nM CD40-비오틴(도 5a 및 도 5b) 또는 his-태깅된 PD-L1(도 5c 및 도 5d)에 5분 동안 담그고, 동적 완충액에서 30초 동안 세정하였다. 항원-코팅된 바이오센서 팁을 각각 10 ㎍/㎖의 이중 특이성 항체에 5분 동안 담그고, 세척한 후, 100 nM PD-L1 Fc 항원(도 5a 및 도 5b) 또는 100 nM CD40-Fc(도 5c 및 도 5d)이 담겨 있는 한 줄의 웰 내로 5분 동안 이동시켰다. 이러한 검정에서, BFP 분자가 포화되어 있을 때, 제1 항원(CD40 또는 PD-L1), 제2 항원(PD-L1 또는 CD40)을 주사하였으며, 예상되는 바와 같이, 제2 결합 신호가 관찰되었다. 이러한 관찰은 항원의 주사 순서를 반대로 하였을 때 재현 가능하였으며, 이는 BFP 분자가 2개의 표적에 동시에 결합할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 번호 3: 세포 표면 항원 결합의 평가
BFP에 의한 세포 표면 항원 결합을 평가하기 위해 유세포 분석법을 이용하였다.
알렉사 플루오르 647(Alexa Fluor 647) 단클론성 항체 표지 키트(써모 피셔(Thermo Fisher))를 이용하여 항-PD-L1+CD40L FP인 BFP2 및 BFP3(MEDI7526; 표 1 참조), CD40L FP6(MEDI5083) 및 항-PDL1(MEDI4736)(모두가 인간 IgG4 아이소타입 내에 포함됨)을 알렉사 플루오르 647에 접합하였다. IgG4 아이소타입 대조군 항체를 동일한 프로토콜에 따라 또한 접합하였다. 얻어진 접합된 항체 모두는 유사한 염료-대-항체 비율을 가졌다. 결합 검정에서, 알렉사 647-접합 항체를 FACS 완충액(PBS 및 3% 소 태아 혈청)에서 연속으로 희석하여 40 nM과 19.532 pM 사이의 최종 농도를 얻었으며, 이를 CD40로 형질 감염된 10,000개의 HEK293 세포(도 6a) 또는 라모스 인간 B 세포(도 6b)와 혼합하였다. CD40로 형질 감염된 HEK293 및 라모스 세포 둘 모두에서는 CD40이 발현되었지만 PD-L1은 발현하지 않는다. 4℃에서 1시간 동안 배양한 후, 세포를 스핀 다운시키고, 상층액 중의 유리 항체를 제거하였다. 항체가 결합된 세포를 세척하고, 유세포 분석하였다. 세포 분석기기를 이용하여 형광 신호를 검출하고 기록하였으며, Flowjo® 소프트웨어를 이용하여 표적 세포 상의 알렉사 647의 평균 형광 세기를 측정하였다. 도 6a 내지 도 6b의 그래프에는 BFP2 및 BFP3가 CD40에 대해 모 MEDI5083와 유사한 결합을 갖는 반면 항-PD-L1 (MED4736) 및 아이소타입 대조군 항체는 결합하지 않았다는 것이 나타나 있다.
이어, PD-L1-형질 감염된 HEK293 세포주 및 ES2 인간 난소 암 세포주 상에서의 인간 PD-L1에 대한 결합을 평가하였다. 세포주 둘 모두에서는 PD-L1이 발현되었지만, CD40은 발현되지 않았다. 알렉사 647-접합 항체를 FACS 완충액에서 희석하고, 10,000개의 PD-L1-형질 감염된 HEK293 세포와 혼합하였다. 4℃에서 1시간 동안 배양한 후, 세포를 스핀 다운시키고, 상층액 중의 유리 항체를 제거하였다. 항체가 결합된 세포를 세척하고, 유세포 분석하였다. 세포 분석기기를 이용하여 형광 신호를 검출하고 기록하였으며, Flowjo® 소프트웨어를 이용하여 표적 세포 상의 알렉사 647의 평균 형광 세기를 측정하였다. 도 7a 내지 도 7b의 그래프에는 BFP2 및 BFP3 둘 모두가 IgG4 또는 IgG1 TM 아이소타입이 결합된 MEDI4736보다 최대 결합은 낮고 EC50은 높을지라도 세포 표면 PD-L1에 결합한다는 것이 나타나 있다. 예상되는 바와 같이, CD40L FP 및 아이소타입 대조군 항체는 이러한 검정에서 PD-L1에 결합하지 않았다.
인간 PBMC에 대한 항-PD-L1+CD40L FP인 BFP2 및 BFP3의 결합을 평가하였다. 염증 조건 하에 CD40 및 PD-L1의 발현이 PBMC 상에서 증가하므로 본 발명자들은 병합된 순수 PBMC 및 IFN-γ-자극 PBMC에 대한 결합을 평가하였다. 본 연구에서, 건강한 공여자로부터 PBMC을 단리하고, 다량(100 nM) 또는 소량(10 nM)의 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지하였다. 100 nM CFSE로 표지된 PBMC를 처리 없이 24시간 동안 배양하였으며, 10 nM CFSE로 표지된 PBMC를 동일한 조건 하에 배양하였지만, 1 nM 인간 IFN-γ로 하룻밤 동안 자극하여 CD40 및 PD-L1 발현을 상향 조절하였다. 따라서 상이한 수준의 CFSE 신호에 기초하여 IFN-γ로 처리되거나 처리되지 않은 세포를 분화시킬 수 있다. 높은 수준 및 낮은 수준의 CFSE로 표지된 모든 PBMC를 다음 날 함께 혼합하고, B 세포의 경우 항-CD19, T 세포의 경우 CD3 및 단핵구의 경우 CD14로 염색하였다. 유세포 분석법을 이용하여 PBMC 하위 세트에 대한 항-PD-L1-CD40L FP BFP 분자의 결합은 CD40L FP(MEDI5083) 및 항-PDL1(MEDI4736 IgG1 TM)과 비교하여 나타냈다. 도 8에 도시된 바와 같이, BFP 단백질 형식 둘 모두는 유사한 결합 활성 및 효능을 나타냈다. IFN-γ-처리 단핵구는 대부분의 BFP 분자와 결합한 후, 순수 단핵구 및 T 및 B 세포와 결합한다. 또한, 이들 결과에 따르면 PBMC 상의 BFP 분자가 항-PDL1 및 CD40L FP(MEDI5083)와 유사한 결합 프로파일을 갖는 것으로 나타난다.
알렉사 플루오르 647 단클론성 항체 표지 키트(써모 피셔)를 이용하여 PD1-OX40L, PD1-OX40L 2WT 및 PD1-OX40L 1WT(모두가 인간 IgG4 아이소타입 내에 포함됨)을 알렉사 플루오르 647에 접합하였다. 상술한 바와 같은 프로토콜을 이용하여 저캇/OX40-GITR-FP2 세포에 대한 결합(도 71a) 및 활성화된 인간 일차 T 세포에 대한 결합(도 72)을 시험하였다.
실시예 번호 4: 항-PDL1-CD40L FP인 BFP2 및 BFP3은 CD40 경로를 자극하고 PD1-PDL1 상호작용을 차단하는 능력을 갖는다.
NF-κB 활성화 경로는 CD40 활성화를 통해 촉발된다.
HuCD40/HEK293/NF-κB 세포(클론 3)는 10% 열-불활성화된 FBS(HI-FBS; 집코(GIBCO)) 및 1% 펜/스트렙(Pen/Strep; 집코)이 보충된 DMEM(집코)에서 유지되었다. 1일째 날, 세포를 수확하고, 2% HI FBS가 첨부된 DMEM에서 5 x 105개의 세포/㎖로 재현탁하였다. BD 바이오코트(Biocoat) 폴리-D-리신 96-웰 흑색/투명 마이크로티터 플레이트(microtiter plate: 카탈로그 번호 356640)에 웰 당 100 마이크로리터(㎕)의 세포를 분주하였다. 세포를 37℃의 배양기에 24시간 동안 넣어 두었다. 배양 후, 플레이트로부터 배지를 흡입하였다. 각각의 웰에 100 마이크로리터(㎕)의 1X 시험 물질을 조심스럽게 첨가하고, 세포의 분리를 최소화하도록 조심하였다. 세포를 24시간 동안 37℃의 배양기로 되돌려 보냈다. 루시페라아제 시약(브라이트-글로(Bright-Glo) 루시페라아제 검정 기질; 프로메가(Promega))을 준비하고, 실온까지 평형화하도록 하였으며, 각각의 웰에 첨가하였다(100 ㎕). 세포 및 시약을 충분히 혼합하여 완전한 세포 용균을 확인하였으며, 스펙트라맥스 M5(SpectraMax M5) 플레이트 판독기 상에서 즉시 판독하였다. 도 9는 BFP 분자가 CD40-형질 감염된 293 세포(A), 라모스 세포(B) 및 THP-1 세포(C)를 포함하는 다양한 세포 유형에 대한 NF-κB 신호를 활성화하였다는 것을 보여준다.
라모스-블루 생물 활성 검정 프로토콜
라모스-블루 NFκB/AP-1 리포터 세포(인비보젠(InvivoGen))를 10% HI-FBS(집코(GIBCO)), 1% 펜/스트렙(집코) 및 제오신(Zeocin; 100 ㎍/㎖; 인비보젠) 배지가 보충된 IMDM 글루타맥스®(GlutaMAX®; 집코)에서 유지하였다. 세포는 비부착성이며, 배양은 5 x 105개의 세포/㎖에서 개시되고, 3 x 106개의 세포/㎖ 미만으로 유지되었다. 실험 전 날, 세포를 10% HI-FBS 및 펜/스트렙(제오신 부재) 배지가 첨부된 IMDM 글루타맥스로 분할하였다. 세포를 수확하고, 1 x 106개의 세포/㎖로 조절하였으며, 편평 바닥의 96웰 플레이트(코닝(Corning))의 웰에 첨가하였다(180 ㎕). 제오신 부재 배지 중의 20 마이크로리터(㎕)의 10X 시험 물질을 각각의 웰에 첨가하고, 세포를 24시간 동안 37℃의 배양기 내에 넣어 두었다. 퀀티-블루(QUANTI-Blue) 시약(lOO ㎖의 멸균수에 용해된 하나의 파우치(pouch); 인비보젠)을 준비하고, 편평 바닥의 96-웰 플레이트에 웰 당 160 ㎕의 양으로 첨가하였다. 라모스-블루 세포의 상층액(40 ㎕)을 퀀티-블루가 담겨 있는 웰에 첨가하였다. 플레이트를 최대 1시간 동안 37℃의 배양기에 넣어 두고, 655 ㎚에서 스펙트라맥스 M5 분광 광도계 상에서 판독하였다.
THP1-블루(THP1-Blue) 생물 활성 검정 프로토콜
THP1-블루 NF-κB 리포터 세포(인비보젠)를 10% HI-FBS(집코), 1% 펜-스트렙 (집코) 및 블라스티시딘(blasticidin; 10 ㎍/㎖; 인비보젠) 배지가 보충된 RPMI1640(집코)에서 유지하였다. 세포는 비부착성이며, 배양은 7 x 105개의 세포/㎖에서 개시되고, 2 x 106개의 세포/㎖ 미만으로 유지되었다. 실험 전 날, 세포를 10% HI-FBS 및 펜/스트렙(블라스티시딘 부재) 배지가 첨부된 RPMI1640으로 분할하였다. 세포를 수확하고, 1 x 106개의 세포/㎖로 조절하였으며, 편평 바닥의 96웰 플레이트(코닝)의 웰에 첨가하였다(180 ㎕). 블라스티시딘 부재 배지 중의 20 마이크로리터(㎕)의 10X 시험 물질(이미 연속 희석됨)을 각각의 웰에 첨가하고, 세포를 24시간 동안 37℃의 배양기 내에 넣어 두었다. 퀀티-블루 시약(lOO ㎖의 멸균수에 용해된 하나의 파우치; 인비보젠)을 준비하고, 편평 바닥의 96-웰 플레이트에 웰 당 160 ㎕의 양으로 첨가하였다. THP1-블루 세포의 상층액(40 ㎕)을 퀀티-블루가 담겨 있는 웰에 첨가하였다. 플레이트를 6시간 동안 37℃의 배양기에 넣어 두고, 655 ㎚에서 스펙트라맥스 M5 분광 광도계 상에서 판독하였다. 결과는 도 9에 나타나 있다.
실시예 번호 5: PD-L1 매개 억제의 감쇠
본 실시예에서, 항-PD-L1-CD40L FP BFP 분자가 PD-1/PD-L1 차단 생물 검정(프로메가)에서 항-PD-L1과 생물학적으로 동일한 지를 결정하기 위해 항-PD-L1-CD40L FP BFP 분자를 조사하였다. 먼저, 한 병의 CHO PD-L1 세포를 해동하여 10% FBS가 보충된 14.5 ㎖의 햄 F12 배지(Ham's F12 medium)에 재현탁하였다. 96-웰 백색 바닥 검정 플레이트에 세포를 웰 당 100 ㎕의 양으로 첨가하였다. 플레이트를 37℃의 배양기에서 하룻밤 동안(16시간 내지 20시간) 배양하였다. 다음 날 배양기에서 플레이트를 꺼냈으며, 배지를 조심스럽게 제거하였다. 검정 완충액(1% FBS가 보충된 RPMI1640) 중의 사십(40) ㎕의 시험 물질(2x)을 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 그 후, 한 병의 저캇 PD1 효과기 세포를 해동하여 5.9 ㎖의 검정 완충액에 재현탁하였다. 이어서, 사십(40) ㎕의 저캇 PD1 세포를 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃의 배양기에 6시간 동안 넣어 두었다. 루시페라아제 시약(바이오-글로®(Bio-Glo®) 루시페라아제 검정 기질; 프로메가)을 준비하고, 실온까지 평형화하도록 하였으며, 각각의 웰에 첨가하였다(80 ㎕). 플레이트를 실온에서 5분 동안 방치한 후, 스펙트라맥스® M5 플레이트 판독기 상에서 즉시 판독하였다. MEDI7526이 PD-L1의 기능을 억제하였으며, 그 결과 본 검정에서 NFAT 활성이 투여량 의존적으로 증가하였다. MEDI7526의 EC50은 MEDI4736 IgG4 분자에 필적한다. 도 10은 항-PD-L1-CD40L FP BFP가 PD-L1 매개 억제 기능을 감쇠시켰다는 것을 보여준다.
실시예 번호 6: BFP 공동 활성화 검정
강력한 리포터 기반 THP-1 단핵구 및 저캇 T 세포 공동 활성화 검정에서 BFP 분자의 기능을 추가로 평가하였다. 본 검정에서, NF-κB-SEAP 리포터 유전자로 형질 감염된 THP-1 세포(인비보젠)를 웰 당 400,000개로 분주하고, IFN-γ로 하룻밤 동안 자극하여 이들 세포 상에서의 CD40 및 PD-L1 발현을 상향 조절하였다. IFN-γ 자극에 의해 THP-1 세포 상의 NF-κB 활성화가 유도되지 않았다. 검정 개념 개략도는 도 11a에 나타나 있다.
검정 일 전날 밤에, 백색 96-웰 플레이트를 항-인간 CD3 항체(바이오레전드(BioLegend))로 코팅하였다. 검정 일에, THP-1 세포를 세척하고, NFAT-루시페라아제 리포터(프로메가)로 형질 감염된 저캇 세포 웰 당 100,000개와 혼합하고, 연속 희석된 시험 시약을 첨가하였다. 검정 플레이트를 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 스핀 다운시키고, 40 ㎕의 배양 배지를 각각의 웰에서 새로운 96-웰 플레이트의 상응하는 웰로 전달하고, -80℃에 저장하였다.
배양 배지에 존재하는 SEAP 활성을 측정하기 위해, 냉동된 세포 배양 배지가 담겨 있는 플레이트를 실온에서 해동하고, 37℃에서 퀀티-블루 용액과 혼합하였다 15분 동안 배양 후, 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 검정 SEAP 활성을 측정하였다. NF-κB 활성을 측정하기 위해, 세포를 1X 용균 시약과 혼합하고, 세포 용균물을 80 ㎕의 바이오-글로 루시페라아제 검정 시약(프로메가)과 혼합하였다. 플레이트를 주위 온도에서 5분 동안 배양하고, 플레이트 판독기 스펙트라맥스® M5에서 발광 세기를 측정하였다. 도 11b에 나타나 있는 바와 같이, 항-PDL1-CD40L BFP 분자는 THP1 세포에서 NF-κB를 활성화하고, 저캇 T 세포에서 NFAT 활성을 증가시켰는데, 이는 BFP 분자가 혼합 면역 세포에 대해 다양한 기능을 수행할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 번호 7: MEDI7526은 일차 인간 세포를 활성화하고 사이토카인의 생산을 유도한다.
본 연구에서, MEDI7526이 일차 세포에서 사이토카인 생산을 유도하는 능력을 조사하였다.
포도상구균 엔테로톡신 B(SEB) 검정 프로토콜
BFP 분자가 IL-2 면역 반응에 미치는 효과를 측정하기 위해 SEB 검정 프로토콜에서 사용되는 시약으로는 백혈구 콘(Leukocyte cone; NHSBT 코드 NC24; 출처: 애든브룩스 병원); 50 ㎖ 팔콘 튜브(BD 352070); 피콜-파크 플러스(Ficoll-Paque PLUS; 지이 헬쓰케어(GE Healthcare) 17-1440-02); 항-CD3(클론 OKT3; 1 ㎎/㎖; 이바이오사이언스(eBioscience); 카탈로그 번호 16-0037-85); 염화암모늄 용액(스템셀 테크놀로지스(Stemcell Technologies) 07850); -20℃에 1 ㎎/㎖로 저장된 포도상구균 엔테로톡신 B(SEB; 시그마(Sigma), S-4881) 저장 용액; 배양 배지(모두의 출처: 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)): 10%(v/v) 열-불활성화된 FCS(90005M) 및 100 U/㎖의 페니실린 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(15140-122)이 보충된 글루타맥스TM(61870) 함유 RPMI1640; V자형 바닥 플레이트(그라이너 바이오원(Greiner BioOne) 651201); 96-웰 편평 바닥 플레이트(코닝 코스타(Corning Costar) 7107)를 들 수 있다.
IL-2 DELFIA ELISA용 시약으로는 플루오로눈크 맥시소프(FLUONUNC Maxisorp) ELISA 플레이트(Nunc 437958); 유로퓸-표지 스트렙타아비딘, SA-Eu(퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) 1244-360); DELFIA® 검정 완충액(퍼킨-엘머, #4002-0010); DELFIA® 증강 용액(퍼킨-엘머 4001-0010), 사용 전에 실온에 유지; 검정 희석액: 0.1% BSA가 보충된 DELFIA 세척 완충액(0.05% 트윈-20, 20 mM 트리스, 150 mM NaCl; pH 7.2 내지 pH 7.4), 멸균 여과됨; 분유(마블(Marvel); 프리미어 푸드(Premier Foods)); 시료 희석액(상기와 같은 RPMI1640 + 10% FCS + 1% 페니실린/스트렙토마이신); PBS(써모 피셔 14190235); PBS-트윈(PBS 중의 0.01% 트윈-20); 인간 IL-2 ELISA 키트(듀오세트 DY202(DuoSet DY202), R&D 시스템즈); 자동화 플레이트 로더(plate loader; 바이오스택(Biostack))가 구비된 바이오테크(Biotek) 플레이트 세척기(EL406)를 들 수 있다.
일반적인 검정 프로토콜
밀도 구배 원심분리(피콜-파크 플러스; 지이 헬쓰케어)를 이용하여 인간 혈액 백혈구 콘(NHS 혈액 및 이식 서비스 코드(NHS Blood and Transplant Service code) NC24)으로부터 PBMC를 단리한 후, 염화암모늄 용액(스템셀 테크놀로지스)에서 적혈구를 용균하였다. 항-인간 CD3(PBS 중의 0.5 ㎍/㎖ 농도의 클론 OKT3; 이바이오사이언스)을 편평 바닥의 96-웰 플레이트(코닝 코스타 7107) 내에서 37℃에서 2시간 동안 코팅하였다. 이어서, 배양 배지(10%(v/v) 열-불활성화된 소 혈청 및 1 ㎖ 당 100 U/100 ㎍의 스트렙토마이신/페니실린(각각)이 보충된 RPMI1640-글루타맥스(라이프 테크놀로지스))에 PBMC의 웰 당 2 x 105개의 세포를 첨가하였다. SEB를 1 ㎍/㎖의 최종 농도로 첨가하여 PBMC를 추가로 자극하였으며, 후보 BFP 분자를 연속 희석하여 최종 시험 농도가 되도록 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 3일 동안 배양한 후, 세포로부터 상층액을 제거하고, 제조사의 설명서(R&D 시스템즈)에 따라 상업용 ELISA를 이용하여 IL-2 분비량을 측정하였다.
도 12에 나타나 있는 결과에 따르면 MEDI7526(BFP3)이 SEB 검정에서 가장 높은 수준으로 IL-2 생산을 유도하였으며, 이때 EC50은 59.8 pM인 것으로 증명되었다.
실시예 번호 8: MEDI7526은 일차 인간 세포를 활성화하고 사이토카인의 생산을 유도한다.
본 연구에서, MEDI3387 및 MEDI5771이 일차 세포에서 사이토카인의 생산을 유도하는 능력을 조사하였다.
제조사의 추천 프로토콜에 따라 피콜-파크 플러스(지이 헬쓰케어 17-1440-02)를 이용하여 백혈구 콘(애든브룩스 병원의 NHSBT이 제공함)으로부터 PBMC를 준비하였다. PBMC를 배양 배지(10% 열-불활성화된 FCS[라이프 테크놀로지스 90005M] 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 글루타맥스(집코) 함유 RPMI1640)에 재현탁하고, 항-인간 CD3 항체로 사전에 코팅된 96-웰 편평 바닥의 조직 배양 플레이트(코닝 코스타 7107)에 전달하였다(코팅은 0.5 ㎍/㎖의 OKT3[이바이오사이언스 카탈로그 번호 16-0037-85]를 함유하는 225 ㎕의 PBS를 각각의 웰에 첨가하고 사용 전에 37℃에서 2시간 동안 배양함으로써 실시함). 반응물은 웰 당 225 ㎕의 최종 부피를 가졌고, 2E5 세포를 함유하고 있었으며, 시험 약물 또는 대조군 mAb와 함께 포도상구균 엔테로톡신 B(농도: 0.1 ㎍/㎖)이 보충되어 있었다. 반응물을 37℃ 및 5% CO2에서 72시간 동안 배양하였으며, 그 이후에 상층액을 제거한 후, ELISA를 이용하여 IL-2 방출에 대해 시험하였다. 그 결과는 도 13에 나타나 있다.
실시예 번호 9: MEDI7526 MLR 검정
MLR 검정을 이용하여 MEDI7526에 의한 대식세포에서의 IFN-γ 및 IL-12 생산의 유도를 평가하였다.
일반적인 검정 프로토콜:
단핵구 유래 M1 대식세포를 배양하기: EasySepTM 인간 CD14 양성 선택 키트(스템셀)를 이용하여 한 명의 공여자로부터 단핵구를 단리하고, CellXVivo 인간 M1 대식세포 분화 키트(R&D 시스템즈)를 이용하여 M1 대식세포를 생성하였다. 본 검정에서, 4,000만 개의 단핵구를 2개의 T75 플라스크로 나누었다. 각각의 플라스크로부터 절반의 배지를 제거하고, GM-CSF가 보충된 신선한 배지로 3일 및 6일째 날에 교체하였다. 6일째 날, StemProTM AccutaseTM 세포 해리 시약(인비트로젠(Invitrogen))을 이용하여 분화된 대식세포를 수확하고, 세포를 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리 하였다. 그 이후, 상층액을 제거하고, 세포를 125,000개의 세포/㎖로 완전 RPMI 1640 배지에 넣었다. 그 이후, 웰 당 80 ㎕의 대식세포를 96-웰 U자형 바닥 플레이트에 첨가하고, 각각의 웰 당 20 ㎕의 시험 항체(최종 농도의 10배)를 첨가하였다. 그 이후, 다른 공여자에서 유래한 웰 당 100 ㎕의 단리된 총 T 세포(1,000,000개의 세포/㎖)를 96-웰 U자형 바닥 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 CO2 배양기에서 37℃에서 5일 동안 배양하였다. 상층액을 수확하고, 인간 Th1/Th2 10-플렉스 키트(메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery))를 이용하여 상층액 중의 사이토카인의 수준을 측정하였다.
도 14는 MEDI7526(BFP3)이 3회의 대식세포-T 세포 MLR 반응에서 IFN-γ의 생산을 유도하였다는 것을 나타낸다.
실시예 번호 10: 혼합 백혈구 반응(MLR) 검정 프로토콜(신선한 혈액)
본원에 개시된 BFP 분자에 대한 반응에서의 T 세포 기능의 시험관 내 연관성을 제공하기 위해 실시예 번호 9에서 기술된 MLR 세포 기반 검정을 또한 사용하였다.
일반적인 검정 프로토콜
한 명의 공여자에서 유래한 PBMC 및 다른 공여자에서 유래한 T 세포로부터 단핵구를 단리하였다. 단핵구 및 T 세포 둘 모두를 완전 RPMI 배지에 1:1의 비율로 현탁하고, 시험 시약과 함께 배양하였다. 플레이트를 37℃에서 5일 동안 배양하였다. 마지막 날, 플레이트를 300 g로 5분 동안 원심분리 하고, 상층액을 수확하였다. 인간 Th1/Th2 10-플렉스 키트(메조 스케일 디스커버리)를 이용하여 상층액 중의 사이토카인을 측정하였다.
도 15는 MEDI7526(BFP3)이 4쌍의 단핵구-T 세포 MLR 반응에서 IFN-γ의 생산을 유도하였다는 것을 나타내며, 이는 MEDI7526이 T-세포 매개 면역 반응을 증대시킬 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 번호 11: CMV 회상 검정
본원에 개시된 면역 치료용 분자들 중 일부에 의해 유도되는 잠재적인 면역 반응을 평가하기 위해 사이토메갈로바이러스(CMV) 항원 회상 검정을 이용하였다. CMV 양성 공여자에서 CD8+ T-세포에 의한 재조합 인간 CMV pp65 단백질(CMV pp65)에 대한 반응에서의 IFN-γ 분비의 유도는 면역 기억 회상 반응으로 지칭된다. 특정 암은 이들 수용체의 발현을 통해 이러한 억제를 증가시킬 수 있으며, 그 결과 이들 면역 관문을 치료학적으로 간섭하는데 연관될 수 있다. 항체 조합, 이중 특이성 시약의 사용 및 Fc-성분 유형의 변경에 대한 잠재적인 이점이 존재한다.
본 실험에서, 알려져 있는 CMV-양성 공여자에서 유래한 HLA-A02형 PBMC를 BFP 분자의 존재 하에 HLA-A02-제한 CMV pp65 펩티드(495~503)에 노출시켰다. 4일 후, MSD를 이용하여 IFN-γ 분비를 측정하였다. 사용된 일반적인 시약은 표 2에 나타나 있다.
CMV 회상 검정용 일반적인 시약
설명 제조사 카탈로그 번호 주석
XVIVO-15 배지 론자(LONZA) 04-418Q
CMV pp65 - HLA-A02 펩티드 아나스펙(AnaSpec) AS-28328 1 ㎖의 DMSO에서 1 ㎎ 용해
96-웰 플레이트 - T/C-처리 팔콘 353077 U자형 바닥 웰
인간 IFN-γ 키트 MSD
CMV 회상-검정 프로토콜(아스타르트 바이올로직스(Astarte Biologics)/메드이뮨(MedImmune) 하이브리드):
CMV 양성 인간 PBMC를 해동하고, XVIVO-15로 세척하고, 계수하고, XVIVO-15에서 4 x 106개의 세포/㎖로 조절하였다. 세포 현탁액 1 ㎖ 당 2 마이크로리터의 CMV pp65 HLA-A02 펩티드를 첨가하고, 충분히 혼합하였다. 그 이후, 펩티드가 보충된 100 ㎕의 PBMC를 웰에 첨가하였다(웰 당 4 x 105개의 세포). 각각의 웰에 100 ㎕의 항체(2X)를 첨가하고, 플레이트를 37℃의 배양기에 넣어 두었다. 4일째 날, 각각의 웰로부터 상층액(100 ㎕)을 수확하고, 후속적인 사이토카인 검정(MSD)을 위해 -30℃에서 냉동시켰다.
도 16은 MEDI7526이 CMV 회상 검정에서 기타 시험 시료보다 IFN-γ 및 IL-12 생산을 높은 수준으로 유도하였다는 것을 보여준다. IFN-γ의 경우, BFP3은 대략 104.3의 EC50을 가졌고, CD40L FP6(MEDI5083)은 359.4의 EC50을 가졌으며, CD40L과 항-PD-L1의 조합은 367.1의 EC50을 가졌다.
도 73b는 PD1-OX40L BFP가 CMV 회상 검정에서 PD1-OX40L 2WT BFP보다 IFN-γ, IL-12, TNFα, IL-1β 및 IL-6 생산을 높은 수준으로 유도하였다는 것을 나타내며, 이는 잔류 F180이 본 검정에서 OX40 작용제 기능에 중요하다는 것을 보여준다.
실시예 번호 12: BFP 분자는 PD1 또는 PDL1의 내재화 및 분해를 촉발한다.
본 실시예에서, BFP3가 CD40 및 PD-L1 내재화를 유도하고 막 PD-L1을 불안정하게 만든다는 가설을 시험하였다.
MEDI7526 BFP3은 인간 CD40 및 PD-L1에 결합한다. BFP3가 CD40 및 PD-L1 내재화를 유도할 수 있고, 후속적으로 PD-L1 단백질 분해를 촉발하는 것으로 가정되었다. MEDI7526 처리 시에 CD40 및 PD-L1의 내재화에 대한 정량적 측정을 가능케 하기 위해, 항-CD40 및 PD-L1 항체의 집단을 스크리닝하고, 항-CD40 클론 5C3 및 항-PD-L1 클론 29E.2A3을 비경쟁적 항체로서 확인하였다. 즉, 항-CD40 클론 5C3은 CD40와 결합하기 위해 MEDI7526과 경쟁하지 않으며, 항-PD-L1 클론 29E.2A3은 PD-L1과 결합하기 위해 MEDI7526과 경쟁하지 않는다. 비경쟁적 항체는 MEDI7526 처리 이후에 CD40 및 PD-L1의 표면 발현을 평가하는데 유리하였다. 도 17은 세포 표면으로부터 CD40 및 PD-L1의 내재화를 검출하기 위한 유세포 분석법 기반 방법을 나타낸다.
MDA-MB-231 세포
MDA-MB-231은 인간 유방 선암 세포이며, CD40 및 PD-L1 둘 모두를 구성적으로 발현한다. MDA-MB-231 세포를 적정된 양의 시험 물질과 혼합하고, 37℃에서 1시간 또는 96시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세척에 의해 유리 항체를 제거하고, 세포를 형광 색소(fluorochrome)-접합 항-CD40(클론 5C3) 및 항-PD-L1(클론 번호 29E.2A3)(둘 모두의 출처: 바이오레전드)로 염색하였다. 이어서, 항체가 결합된 세포에 유세포 분석이 적용되었다. Flowjo®를 이용하여 기하 평균 형광 세기를 계산하고, 그래프에 작도하였다. 그 결과는 도 18에 나타나 있다.
그 이후, RPMI1640 배지가 담겨 있는 6-웰 플레이트에 MDA-MB-231 세포를 웰 당 500,000개의 세포로 도말하고, 표시된 조건으로 처리하였다. 24시간 후, 웰 당 300 ㎕의 프로테아제 억제제 함유 RIPA 완충액(밀리포어(Millipore))에서 세포를 용균한 후, 회전하면서 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. BCA 분석(피어스(Pierce))에 의해 용균물 내의 단백질의 양을 측정하고, 세포 신호전달로부터 항-PD-L1 클론(E1L3N)을 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 PD-L1 단백질의 존재를 검출하였다(도 19 참조).
도 18 및 도 19에서 확인된 결과에 따르면 MEDI7526(BFP3) 처리가 MDA-MB-231 세포 상의 CD40 및 PD-L1 표면 발현을 하향 조절했을 뿐만 아니라, MDA-MB-231 세포 내의 총 PD-L1 단백질 함량을 감소시켰다는 것을 보여준다.
THP-1 세포
THP-1 세포는 인간 백혈병 단핵구 세포주이다. THP-1 세포는 CD40 및 PD-L1을 매주 낮은 양으로 발현하지만, IFN-γ 처리 이후에는 CD40 및 PD-L1의 발현을 상향 조절한다. 도 20에 나타나 있는 검정 개략도에서, THP-1 세포를 IFN-γ로 24시간 동안 자극하고, 적정된 양의 시험 물질과 혼합하였으며, 37℃에서 0.5시간 내지 3시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세척에 의해 유리 항체를 제거하고, 세포를 형광 색소-접합 항-CD40(클론 5C3) 및 항-PD-L1(클론 번호 29E.2A3)로 염색하였다. 이어서, 항체가 결합된 세포에 유세포 분석이 적용되었다. Flowjo®를 이용하여 기하 평균 형광 세기를 계산하고, 도 21에 작도하였으며, 이는 MEDI7526이 0.5시간과 3시간 사이에 THP1 세포의 세포 표면으로부터 CD40 및 PD-L1의 신속한 하향 조절을 유도하였다는 것을 보여준다.
IFN-γ-처리 THP-1 세포
도 22에 개략적으로 나타낸 연구 이후, THP-1 세포를 IFN-γ로 24시간 동안 자극하고, 적정된 양의 시험 물질과 혼합하였으며, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세척에 의해 유리 항체를 제거하고, 세포를 형광 색소-접합 항-CD40(클론 5C3) 및 항-PD-L1(클론 번호 29E.2A3)로 염색하였다. 이어서, 항체가 결합된 세포에 유세포 분석이 적용되었다. Flowjo®를 이용하여 기하 평균 형광 세기(gMFI)를 계산하고, 도 23에 나타나 있는 그래프에 작도하였으며, 이는 CD40 발현이 처리 24시간 후에 빠르게 회복하지만, PD-L1 세포의 표면 발현은 낮게 유지된다는 것을 보여주는데, 이는 내재화된 CD40 및 PD-L1에 대해 별도의 회복 경로가 존재함을 나타낸다.
실시예 번호 13: 인간 일차 세포 검정
본 연구에서, EasySepTM 인간 CD14 양성 선택 키트(스템셀)를 이용하여 건강한 공여자 PBMC로부터 단핵구를 단리하고, 제조사의 프로토콜에 따라 CellXVivo 인간 단핵구 유래 DC 분화 키트(R&D, 카탈로그 번호 CDK004)를 이용하여 수지상 세포로 분화시켰다. GM-CSF 및 IL-4를 1,000,000개의 세포/㎖로 포함하는 인간 DC 분화 배지에 세포를 재현탁하고, 총 20,000,000개의 세포를 T75 플라스크에 분주하였다. 3일 및 5일째 날에 절반의 배지를 신선한 인간 DC 분화 배지로 교체하였다. 7일째 날, 미성숙 DC를 수확하고, 증가하는 용량의 시험 물질로 자극하였다. 24시간 동안 자극한 후 유세포 분석법을 이용하여 CD40, CD86 및 PD-L1의 표면 발현을 측정하였다(도 24 참조). 도 25에서, 10 nM의 시험 물질로 24시간 동안 자극한 DC 내의 CD40 및 PD-L1의 단백질 수준은 면역 블로팅에 의해 측정하였다. 이들 결과에 따르면 MEDI7526(BFP3)이 인간 일차 세포 상의 PD-L1의 하향 조절을 유발하는 것으로 나타나 있다.
도 24는 MEDI7526이 이의 모 CD40L FP와 같이 저용량에서 CD40의 상향 조절을 유도하였지만 고용량에서는 CD40을 하향 조절하였다는 것을 보여준다. 이는 또한 단핵구 유래 수지상 세포 상에서의 CD86 발현을 상향 조절하였다. 그러나 MEDI7526-처리 세포 상의 PD-L1 단백질 수준은 낮게 유지되었다.
PBMC 검정
본 연구에서, 건강한 공여자에서 유래한 PBMC를 IFN-γ로 자극하고, 시험 시약과 1시간 동안 반응시켰다. 유세포 분석법을 이용하여 CD40, CD86 및 PD-L1의 표면 발현 수준을 연구하였다. 도 26은 MEDI7526이 단핵구의 세포 표면으로부터 CD40 및 PD-L1의 하향 조절을 유도한다는 것을 보여준다. 이들 결과에 따르면 MEDI7526(BFP3)이 새로 단리된 인간 일차 세포 상에서의 PD-L1의 하향 조절을 유발한 것으로 나타나 있다.
실시예 번호 14: RENCA 세포 내 PD-L1에 대한 쥐 대리 MEDI7526의 효능
Renca는 CD40 및 PD-L1 둘 모두를 구성적으로 발현하는 쥐 신장 선암 세포주이다. 본 연구에서, 첫째 날에 Renca 세포를 6-웰 플레이트에서 웰 당 500,000개의 세포로 배양하였다. 배양 2일째 날, Renca 세포를 10 nM의 농도의 표시된 시약으로 24시간 동안 처리하였다. 배양 3일째 날, 처리된 Renca 세포를 프로테아제 억제제가 보충된 RIPA 완충액에서 용균하고, 세포 용균물을 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 웨스턴 블롯용으로 사용되는 항체는 하기 표 3에 나열되어 있다.
항체
항체 판매사 카탈로그 번호 희석 숙주
항-mPD-L1 R&D 시스템즈 AF1019 1:500 염소
항-CD40 아브캠(Abcam) ab13545 1:500 토끼
항-액틴 시그마 A2066-.2ML 1:2000 토끼
페록시다아제 어피니퓨어(AffiniPure) 당나귀 항-토끼 IgG(H+L) 잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch) 711-035-152 1:4000 당나귀
도 27은 MEDI7526(mBFP3)의 쥐 대리가 Renca 세포에서의 PD-L1의 분해를 유도하였다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 MEDI7526의 쥐 대리가 쥐 세포 상의 PD-L1 및 CD40 발현의 하향 조절에 있어서 유사한 기능을 갖는 것을 보여준다.
실시예 번호 15: BFP 분자와 FC 수용체의 연합에 의해 골수 세포 활성화가 향상될 수 있다.
본 실시예에서, BFP 분자에 의한 골수 세포 활성화를 조사하였다.
PD-L1을 발현하는 ES2 세포를 편평 바닥 96-웰 플레이트에서 웰 당 30,000개의 세포로 분주하고, THP1 세포를 IFN-γ로 24시간 동안 자극하였다. 2일째 날, 동일한 양의 ES2 세포와 THP-1 세포를 혼합하고, 적정된 시험 물질(BPF1, BPF2, MEDI7526, FP6(MEDI5083) 및 MEDI4736; 표 1 참조)을 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 파우치에 적힌 설명서에 따라 퀀티-블루TM을 준비하였다. 그 이후, 160 ㎕의 퀀티-블루 용액을 편평 바닥 96-웰 플레이트의 웰 당 40 ㎕의 상층액과 혼합하였다. 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 배양하고, 분광 광도계를 이용하여 655 ㎚에서 SEAP 수준을 측정하였다.
도 28은 종양 세포 상의 PD-L1을 통한 가교 결합으로 인해 MEDI7526 BFP3 활성이 향상될 수 있다는 것을 나타낸다. BFP2 형식이 향상된 활성을 갖지 않는 것으로 관찰된다는 점에서 BFP 형식의 배향이 기능에 영향을 미치는 것으로 보인다. 2-세포 시스템에 기반을 둔 이러한 결과에 따르면 종양 세포 상의 PD-L1을 통한 가교 결합으로 인해 THP-1 세포 내의 NF-κB 활성을 자극할 때 MEDI7526 기능이 증가할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 번호 16: PD-L1 가교 결합에서의 FCγRI의 역할
본 실시예에서, PD-L1 가교 결합에서의 고친화도 Fc 수용체(FcγRI)의 역할을 조사하였다. 바이오코트 96-웰 플레이트(코닝)를 웰 당 50 ㎕의 PD-L1-His(2 ㎍/㎖, R&D 시스템즈)로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 2일째 날, 플레이트에 THP1 세포(웰 당 200,000개의 세포)를 첨가하였다. Fcγ 수용체와의 결합 시에 IgG4와 경쟁하는 가용성 IgG1(내부에서 제조됨)을 첨가하였다. FcγRI/FcγRII에 대한 차단 항체(바이오레전드) 및 Syk 및 Btk에 대한 억제제(셀렉켐(Sellechem))을 포함하는 기타 억제제를 1시간 동안 첨가한 후, 시험 물질(3 nM)로 24시간 동안 자극하였다. 3일째 날, 플레이트를 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리 하였다. 사십(40) ㎕의 세포 배양 상층액을 160 ㎕의 새로 제조된 퀀티-블루TM 시약(인비보젠)과 혼합한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 655 ㎚에서 스펙트라맥스® M5 분광 광도계에 의해 SEAP 수준을 측정하였다. 도 29는 PD-L1 가교 결합에 의해 매개되는 향상된 신호는 FcrRI를 통해 이루어지고, 가용성 IgG 및 Syk 및 Btk에 대한 억제제에 의해 억제될 수 있다는 것을 보여준다. 그러나, Fc 연합은 BFP3 기능을 위해 요구되지 않는다(도 61 및 도 62 참조). 이들 결과는 BFP3에 의해 매개되는 증가된 활성이 FcγRI 연합을 통해 이루어진다는 것을 시사한다.
실시예 번호 17: MEDI7526의 쥐 대리는 생체 내에서 강력한 항종양 활성을 나타내고, 이는 마우스 종양 모델에서 내약성을 나타낸다.
마우스에서 MEDI7526의 생체 내 효과를 연구하기 위해, MEDI7526의 쥐 대리인 mMEDI7526을 제조하였다. MEDI7625와 함께, mMEDI7526은, N-말단에서 C-말단 방향으로, F(ab)2 항-쥐 PD-L1, D265A 돌연변이를 갖는 쥐 IgG1 Fc, 및 펩티드 링커를 통해 연결된 3x 쥐 CD40L 소단위의 2개의 단일쇄 융합 단백질을 포함한다.
먼저, C57Bl/6 암컷 마우스에서 MEDI7526의 쥐 대리(mMEDI7526)를 시험하여 이의 안전성 프로파일을 연구하였다(도 30a 및 도 30b). 10 ㎎/㎏의 mCD40L 또는 등가 몰 농도인 16 ㎎/㎏의 mMEDI7526을 순수 마우스에 1회 정맥 내(iv; 도 30a) 또는 피하(sc; 도 30b) 처리하였다. 마우스의 미처리 그룹을 대조군으로 사용하였다. 처리 전 및 처리 후 매일 체중을 모니터링하였으며, 개개의 마우스에 대한 기준선 체중의 비율(%)로 변환하였다(도 31 참조). 대조군과 비교하여, mCD40L 처리는 정맥 내이건 또는 피하이건 무관하게 체중 감량을 야기하였다. 비교해 보면, mMEDI7526을 16 ㎎/㎏로 처리하면 유의한 체중 감량이 야기되지 않았다.
별도의 실험에서, C57Bl/6 암컷 마우스에 B16F10 종양 세포를 이식하고, 종양 크기가 100 ㎣를 넘는 마우스를 하기 연구용으로 선택하였다. 선택된 마우스에 도 30c 및 도 30d에 나타나 있는 바와 같이 mCD40L(10 ㎎/㎏) 및 mMEDI7526(16 ㎎/㎏)을 1회 정맥 내 또는 피하 처리하거나, 고용량의 mMEDI7526(25 ㎎/㎏ 또는 35 ㎎/㎏; 각각 도 30e 및 도 30f)을 1회 정맥 내 또는 피하 처리하였다. 처리 전 및 처리 후 매일 체중을 모니터링하였으며, 기준선 체중의 비율(%)을 계산하고, 처리 그룹과 미처리 그룹 사이를 비교하였다. 그 결과에 따르면 mCD40L의 처리로 인해 처리 후 체중 감량이 보다 심한 것으로 증명되었으며, mMEDI7526이 순수 마우스 또는 종양 보유 마우스에서 mMEDI5083보다 내약성이 높은 것으로 나타나 있다.
그 이후, B16F10 쥐 종양 모델에 대한 다중 용량 연구에서 mMEDI7526의 안전성 프로파일을 평가하였다. 1일째 날에 마우스에 B16F10 종양을 이식하고, 11일째 날에 종양 크기가 100 ㎣를 넘는 마우스를 무작위 분류(randomization)한 후, 도 31에 표시된 바와 같이 11일, 13일, 19일 및 21일째 날에 처리하였다. 체중 감량이 20%를 넘는 마우스를 심각한 스트레스를 받은 것으로 간주하고, 연구에서 제외하였다. 13일째 날 두 번째 투여 직후, mCD40L 그룹 내의 2마리의 마우스 및 CD40L+항-PDL1 그룹 내의 4마리의 마우스는 20% 초과의 체중 감량을 나타냈다. 비교해 보면, mMEDI7526가 투여된 어떠한 마우스도 두 번째 투여 이후에 20% 초과의 체중 감량을 나타내지 않았다. 이들 데이터에 따르면 mMEDI7526이 mCD40L 단독 또는 항-PDL1과의 병용보다 내약성이 높다는 것이 추가로 나타났다.
그 이후, B16F10 공통 유전자 마우스 모델에서 mMEDI7526을 시험하였다. 모델은 도 31에 기술된 바와 같이 설정되었다. 20 ㎎/㎏ 내지 35 ㎎/㎏의 용량 범위에서 mMEDI7526은 B16-F10 마우스 모델에서 PBS 대조군과 비교하여 종양 부피를 감소시키고/시키거나 종양 성장을 지연시켰다(도 32). 25 ㎎/㎏의 용량에서 mMEDI7526은 가장 강력하게 종양 성장을 억제하였으며, 연구가 끝날 무렵에는 25 ㎎/㎏으로 처리된 70%의 마우스가 500 ㎣ 미만의 종양 크기를 가졌다. 따라서, mMEDI7526은 저반응성 종양 모델에서 유의한 항종양 활성을 지연시켰다.
투약 최적화. B16F10 모델에서 도 33에 나타나 있는 바와 같이 mMEDI7526의 투약 처방(dosing regimen)을 최적화하였다. 25 ㎎/㎏의 mMEDI7526을 B16F10 종양 세포를 이식한 후 10일째 날에 1회 투약하거나, 10일 및 14일째 날 또는 10일 및 17일째 날에 2회 투약하였다. 단일 용량의 mMEDI7526 CD40L-FP의 처리는 종양 부피를 유의하게 감소시키고/시키거나 종양 성장을 지연시켰다. 그러나 2회 용량은 단일 용량보다 양호한 항종양 활성을 나타낸다(10일 및 14일째 날 또는 10일 및 17일째 날). 게다가, mMEDI7526으로 처리된 마우스는 유의한 체중 감량 또는 기타 관찰 가능한 효과가 없었다. 따라서, mMEDI7526의 투약 빈도가 감소하면 유의한 항종양 활성이 유지될 수 있으며, 주요 독성이 감소할 수 있다.
생체 내 T-세포 활성화. B16F10 마우스 모델에서 mMEDI7526이 T 세포 활성화에 미치는 효과를 평가하였다. B16F10 종양 세포를 이식한 후 10일째 날에 mMEDI7526을 25 ㎎/㎏으로 투약하고, mMEDI7526 처리 후 2일 및 4일째 날에 비장 T 세포를 회수하였다. 도 34에 나타나 있는 바와 같이, mMEDI7526의 처리로 인해 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 모두에 대한 조기 활성화 마커인 CD69이 상향 조절되었다. 또한, 4일째 날에 효과기 기억 CD8+ T 세포(CD44highCD62Llow) 및 효과기 CD8+ T 세포(KLRG1+)의 비율(%)이 유의하게 증가하였다. 게다가, 효과기 CD8+ T 세포(KLRG1+)의 비율(%)은 비장에서 뿐만 아니라 간 및 종양에서도 증가하였다(도 35). 종합하면, 이들 데이터에 따르면 mMEDI7526이 종양 보유 마우스에서 CD4+ 및 CD8+ 세포의 강력한 활성화를 유도하였다는 것을 보여준다.
혈청 사이토카인 프로파일 분석. mMEDI7526 및 mCD40L 처리 후 혈청 사이토카인 프로파일에서의 변화를 모니터링하였다. 순수 마우스에 10 ㎎/㎏의 mCD40L(mMEDI5083; 이는 쥐화(murinization)된 MEDI5083임) 또는 16 ㎎/㎏의 mMEDI7526을 투약하고, 도 36에 표시된 바와 같이 처리 후 다양한 시점에 혈액을 수집하였다. 전혈로부터 혈청을 분리하고, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-13, KC/GRO 및 TNF-α를 포함하는 사이토카인을 검출하기 위해 혈청에 MSD 다중 플렉스 분석(U-PLEX TH1/TH2 복합)을 적용하였다. mCD40L과 비교하여, mMEDI7526은 IFN-γ 및 IL-12를 유사한 수준으로 유도하였지만, TNF-α 및 IL-6을 유의하게 덜 유도하였다(도 37). B16F10 마우스에 대한 별도의 연구에서, 16 ㎎/㎏과 35 ㎎/㎏ 사이의 용량에서 mMEDI7526은 IL-6 및 TNF-α를 훨씬 낮게 유도하였지만, IFN-γ 및 IL-12를 비교할만한 수준으로 유도하였다. 따라서, mMEDI7526 처리로 인해 항종양 사이토카인이 유도되지만, 전신 독성에 기여하는 사이토카인의 생산이 제한된다.
MEDI7526 처리는 화학 요법과 효과적으로 조합된다. 별도의 연구에서, CT26 쥐 종양의 치료를 위한 MEDI7526 단독의 효과 또는 화학 요법제인 플루오로우라실(5FU)과의 병용 효과를 평가하였다. 총 500,000개의 CT26 종양 세포를 마우스에 피하 이식하고, 종양이 약 100 ㎣로 측정될 때까지 약 10일 동안 종양을 모니터링하였으며, 이어서, 이때 마우스를 이들의 종양 부피에 기초하여 처리 그룹으로 무작위 분류하였다. 다음 날, 5FU를 이용하여 25 ㎎/㎏ 또는 50 ㎎/㎏로 처리를 시작하거나, PBS 대조군을 복강 내 처리하였으며, 그 이후에는 매주 1회 3주 동안 mMEDI7526을 25 ㎎/㎏ 또는 35 ㎎/㎏으로 복강 내 처리하였다. 연구가 끝날 때까지 종양 부피 및 체중을 매주 2회 측정하였으며, 그 결과는 도 65에 나타나 있다. 5FU를 25 ㎎/㎏ 및 50 ㎎/㎏로 처리하여도 CT26 종양 성장이 유의하게 억제되지 않았으며, MEDI7526 단독은 하위 세트의 마우스에서만 종양 성장을 억제할 수 있었지만, 모든 마우스에서 종양 성장을 억제하는 것은 아니었다. 5FU과 MEDI7526의 조합에 의해 단일 처리에서보다 많은 마우스에서 종양 성장이 억제되었다. 50 ㎎/㎏의 5FU 및 35 ㎎/㎏의 MEDI7526 처리에서 가장 좋은 효과가 나타났으며, 그룹 내 모든 마우스에서 종양 성장이 억제되었다. 이러한 결과에 따르면 화학 요법과의 조합에 의해 MEDI7526에 의해 매개되는 항종양 활성이 추가로 향상될 수 있다는 것을 시사한다.
MEDI7526은 간 종양을 치료할 잠재성을 갖는다. MEDI7526의 표적 기관을 추가로 평가하였다. 생체 분포 연구에서, B16F10 종양 세포를 마우스에 이식한 후, 도 66a에 표시된 바와 같이 Zr-89-표지 항체(아이소타입 대조군 및 MEDI5083 및 MEDI7526의 쥐 대리)를 주사하였다. PETCT에 의해 표지된 항체의 분포를 검출하였다. 아이소타입 대조군 항체와 비교하여, MEDI5083 및 MEDI7526 둘 모두가 간 및 비장에 축적되었다. 간 대식세포의 한 유형인 쿠퍼 세포가 CD40 및 PD-L1을 발현하는 것으로 추가로 확인되었다(도 66b). 이들 결과에 따르면 간 내의 쿠퍼 세포가 MEDI5083 및 MEDI7526의 표적 세포임을 보여준다.
상술한 결과로 인해 MEDI7526 및 MEDI5083이 마우스에서 간 종양을 치료할 수 있는 지에 대한 추가의 연구가 이루어졌다. 본 실험에서, CT26 종양 세포를 루시페라아제 유전자로 형질 감염시키고, 1,000,000개의 형질 감염된 CT26-Luc 세포 중 절반을 마우스의 간에 직접 이식하였다. 마우스는 CT26 세포를 투여받고, 수술에서 회복하도록 하였으며, 종양 이식 후 3일, 10일 및 17일째 날에 아이소타입 대조군 항체, MEDI5083, 항-PDL1, MEDI5083 및 항-PDL1의 병용, 또는 MEDI7526을 투약하였다. MEDI7625을 35 ㎎/㎏의 몰 당량으로 투약한다는 것을 제외하고, 모든 시험 시약을 21.9 ㎎/㎏으로 투약하였다. 21일째 날, 마우스를 희생시키고, 간에서의 종양 부하의 지표인 루시페라아제 활성을 측정하기 위해 간을 회수하였다. MEDI7526 처리에 의해서만 종양 부하가 종양 부재 마우스의 수준까지 효과적으로 감소하였으며(도 67), 이는 MEDI7526이 간암을 치료할 잠재성을 갖는다는 것을 보여준다.
또한, MEDI7526 처리는, 유세포 분석에 의해 측정할 때, 14일째 날에 CD8 T 세포수의 증가 및 21일째 날에 항원 특이적 CD8 T 세포들 중 활성화된 표현형의 증가와 연관이 있었다(도 68).
CT26 간 종양 모델에서 시험 시약의 안전성 프로파일을 평가하였다(도 69). 마우스의 유의한 체중 감량(심각한 스트레스를 나타냄) 및 사망을 기록하였다. 첫 번째 투약 후 2일째 날, mMEDI5083 그룹 및 mMEDI5083 및 항-PDL1 그룹 내의 모든 마우스는 약 10%의 체중 감량을 나타냈다. 그에 비해, mMEDI7526가 투약된 어떠한 마우스도 동일한 시점에 5% 초과의 체중 감량을 나타내지 않았다(도 69a). 더욱이, mMEDI5083 및 항-PDL1로 처리된 모든 마우스는 3회 투약 이후에 사망한 채로 발견되었다(도 69b). 종합하면, 이들 데이터에 따르면 mMEDI7526이 mMEDI5083 단독 또는 항-PDL1와의 병용보다 내약성이 높다는 것이 추가로 나타났다.
실시예 번호 18: NF-ΚB의 OX40L 활성화
OX40 단백질로 형질 감염된 저캇 NF-κB-Luc 리포터 T-림프구를 10% HI-FBS(집코) 및 1% 펜/스트렙(집코)가 보충된 RPMI1640(집코)에서 유지하였다. 실험 당일, 세포를 수확하고, 2 x 106개의 세포/㎖로 조절하고, 웰 당 90 ㎕의 부피로 U자형 바닥 96-웰 플레이트(코닝)에 첨가하였다. 완전 RPMI1640에서 제조된 십(10) ㎕의 시험 시약(10X)을 각각의 웰에 첨가하고, 세포를 37℃의 배양기에 4시간 동안 넣어 두었다. 루시페라아제 시약(스테디-글로®(Steady-Glo®) 루시페라아제 검정 기질; 프로메가)을 준비하고, 실온까지 평형화하도록 하였으며, 각각의 웰에 첨가하였다(100 ㎕). 플레이트를 실온에 5분 동안 방치한 후, 스펙트라맥스® M5 플레이트 판독기 상에서 즉시 판독하였다. 도 38은 항-PD1-OX40L BFP가 OX40로 형질 감염된 저캇 세포에서 NF-κB 경로를 활성화하였다는 것을 보여준다.
별도의 연구에서, OX40 엑토도메인 및 GITR 세포 내 도메인을 갖는 인간 OX40-GITR 융합 단백질(저캇/OX40-GITR-FP2)을 발현하도록 조작된 저캇 NF-κB-Luc 리포터 세포주는 이전 단락에 나타나 있는 바와 같이 NF-κB- 활성에 대해 검정하였다. 도 71c는 PD1/OX40L(OX40L의 모든 소단위는 야생형 단백질 서열을 가짐)이 강력한 NF-κB 활성화를 유도하였지만, PD1/OX40L 1WT 및 PD1/OX40L 2WT 둘 모두는 저캇 리포터 세포에서 NF-κB를 활성화하지 못하였다는 것을 보여준다. 이들 데이터에 따르면 OX40 상의 F180의 6개의 잔기 모두는 OX40 하류 신호전달의 활성화에 중요한 것으로 확인되었으며, PD1/OX40L 1WT 및 2WT가 최소의 OX40 매개 T 세포 활성화 기능을 갖는 것으로 나타나 있다.
실시예 번호 19: 항-PD-L1-OX40L BFP의 마우스 연구
마우스 OX40에 결합하고 OX40 신호전달을 촉발하는 쥐 OX40 리간드 IgG1 융합 단백질(mOX40L FP)을 생성하고, 인간 OX40 리간드 IgG4P 융합 단백질인 MEDI6383용 마우스 OX40 작용제 대리로서 사용하였다. 미국 특허 제9,718,870호를 참고한다. 클론 80은 마우스 PD-L1에 대한 래트 키메라 마우스 IgG1 D265A 항체이다. 마우스 공통 유전자 육종 세포주인 MCA205 및 마우스 대장 선암 세포주인 CT26에서 유래한 종양을 갖는 마우스에서 mOX40L FP 및 클론 80의 항종양 활성을 단일 요법 또는 병용 요법으로서 평가하였다.
1일째 날, 각각의 그룹 내 10마리의 C57BL/6 또는 Balb/c 마우스에 MCA205(좌측 패널) 세포 또는 CT26(우측 패널) 세포를 각각 접종하였다. 대조군 검체(식염수) 및 시험 검체(즉, 항-PD-L1 클론 80 mAb(10 ㎎/㎏), mOX40L FP(9.8 ㎎/㎏) 또는 10 ㎎/㎏의 항-PD-L1 mAb와 9.8 ㎎/㎏의 mOX40L FP의 조합)는 MCA205의 경우에 12일, 15일, 18일 및 22일째 날에 복강 내 투여하고, CT26의 경우에 4일, 7일, 11일 및 14일째 날에 복강 내 투여하였다. 시간의 경과에 따른 개개의 종양 부피가 도 39의 그래프에 나타나 있다. IP = 복강 내; SC = 피하.
클론 80과 mOX40L FP의 병용 투여로 인해 대조군 검체 또는 약제 단독의 투여보다 항종양 활성이 높게 나타났다(도 39). 따라서, OX40 작용제 및 PDL1 길항제 요법은 임상전 모델에서 상보적인 항종양 이점을 제공한다.
PDL1-결합 모이어티로 이루어져 있는 이중 특이성 분자는 PD-L1에 결합하지 않는 이중 특이성 분자와 비교할 때 PD-L1+ 종양에서의 체류 시간을 증가시킬 수 있다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 마우스에서 생체 내 생체 분포 연구를 수행하였다.
이중 특이성 분자는 킬레이트제(ITC-DTPA; 텍사스주 댈러스 소재의 매크로사이클리스(Macrocyclis))와 접합하여 111인듐 방사성 표지를 가능케 하였으며(문헌{Brom et al., 2012}), 이는 약 600 MBq/㎎의 고유 활성을 목표로 하였다. 탈염 칼럼(PD-10 EconoPac, 바이오라드(BioRad))을 통한 정제 이후, 즉석 박층 크로마토그래피에 의해 방사성 표지 분자의 방사 화학적 순도(RCP)를 확인하여 95% 초과의 RCP 및 실온에서 최대 4시간 동안의 안정성으로 표지 효능을 확인하였다.
생체 분포 연구를 위해, 암컷 누드 마우스(엔비고(Envigo))에 U87-MG 암 세포(0.1 ㎖ 중의 1 x 107개의 세포)를 피하 접종하고, 이를 평균 종양 부피가 0.2 ㎤인 상이한 처리 그룹으로 무작위 분류하였다. 무작위 분류된 모든 마우스에 단일 용량의 방사성 표지 분자(20 ㎍/0.2 Mbq/㎏ 체중)를 정맥 내 주사하였다. 이어서, 소집단의 동물을 방사성 표지 투여 1시간, 1일 및 4일 후에 인도적으로 희생시켰다. 생체 분포 프로파일을 생성하기 위해, 기관/조직(즉, 혈액, 근육, 폐, 간, 비장, 신장, 종양, 꼬리)을 수집하고, 중량을 달고, 감마 계수기(위저드(Wizard), 퍼킨-엘머)를 이용하여 방사능 수준을 측정하여 주사 용량 비율(%ID) 및 조직 1 g 당 %ID를 계산하였다. 생체 분포 프로파일에는 조직 1 g 당 보정된 주사 용량의 평균 비율(%)(±SEM)이 예시되어 있으며, 주사 1시간, 1일 및 4일 후에 표시된 조직에서의 방사성 표지된 MEDI5615 및 대조군의 흡수량을 비교하였다. n = 그룹 당 6마리인 "4일째 날 BFP3"의 경우를 제외하고, n = 그룹 당 5마리이다. 별표는 양쪽-꼬리 t-검정을 이용하여 유의한 차이(p < 0.05)를 나타낸다.
U87MG 종양은 항-PD-L1 특이적 면역 조직 화학에 의해 결정된 바와 같이 PD-L1을 높은 수준으로 발현하였으며(도 40a), 생체 분포 연구에서 사용되었다(도 40b). U87MG 종양을 갖는 마우스에 방사성 표지된 이중 특이성 분자를 치료 이하의 양으로 주사하였으며; 하나는 IgG4P BFP2 분자(MEDI5615; 1X Fc 도메인)로서 PD-L1 및 OX40을 표적화하고, 하나는 IgG1 BFP3 분자(1X Fc 도메인)로서 PD-L1 및 OX40을 표적화하고, 하나는 PD-L1 또는 OX40에 결합하지 않는 대조군 검체(R347-OX40L F180 BFP2)였다. 이중 특이성 분자는 일단 1시간 후에 혈액 내에서 검출되었고, 빠르게 제거되어 1일 후에 혈액 내에서 어떠한 방사성 표지도 검출될 수 없었거나 미량의 방사성 표지만이 검출되었다. 또한 MEDI5615 및 대조군 검체가 표적 결합과는 무관하게 간 및 비장에 빠르게 분포하였으며, 4일까지 이들 조직 내에 남아 있었다(도 40c). 이에 반해, MEDI5615은 대조군 검체와 비교하여 종양을 침투하여 그 내부에 남아 있는 반면, 두 분자 모두 혈액에서 제거되었다.
PD-L1/OX40L BFP3 분자는 MEDI5615과 유사하게 종양 내에 남아 있는 능력을 보였으며(도 41), 이는 종양 체류가 Fc 도메인 및 분자 형식과 무관하다는 것을 시사한다. 대조군 검체와 비교하여 MEDI5615와 PDL1/OX40L BFP3 분자 사이에서 1일 및 4일째 날에 관찰된 종양 업데이트의 차이는, 종양 체류가 PD-L1에 대한 분자의 결합에 의해 매개된다는 것을 시사한다.
실시예 번호 20: 항-PD-L1-OX40L BFP의 활성
인간 OX40을 발현하기 위해 유전적으로 조작된 저캇 NF-κB-루시페라아제 T 세포 리포터 세포주를 이용하여 한 세트의 2-세포 리포터 생물 활성 검정에서 MEDI5615(PD-L1/OX40L BFP2 이중 특이성 분자)가 인간 OX40을 통한 신호전달을 활성화하는 능력을 평가하였다(도 42). PD-L1 매개 약물의 가교 결합은 세포 표면 PD-L1을 발현하는 MDA-MB231 세포를 통해 일어났다. Fcγ 수용체 매개 약물의 가교 결합은 Fcγ 수용체 IIa(CD32A)를 발현하도록 조작된 HEK293 세포를 통해 일어났다. 일차 인간 T 세포 활성화의 하류에 있는 NF-κB 신호전달 경로의 자극에 대한 반응에서 루시페라아제 활성의 증가로서 T 세포 활성화를 측정하였다. NF-κB 신호전달은 OX40 신호전달 하류에서 발생하고, 증식 및 사이토카인 방출과 같은 기타 T-세포 활성화 척도와 연관성이 있는 것으로 보고된 바 있다. 세포 표면 PD-L1을 발현하는 MDA-MB231 세포 또는 개개의 Fcγ 수용체를 발현하도록 조작된 HEK293 세포와 함께 배양된 MEDI5615뿐만 아니라 가용성 MEDI5615에 대해 생물 활성을 측정하였다.
사용 전, OX40 저캇 리포터 세포를 조직 배양 배양기 내의 완전 RPMI 배지에서 1 ㎖ 당 0.5 내지 1.5 x 106개의 세포 밀도로 배양하였다. 생물 검정 하루 전날에 세포를 1 ㎖ 당 106개의 세포 밀도로 계대 배양하였다. OX40 저캇 리포터 세포, MDA-MB231 세포 및 CD32A HEK 세포를 수집하고, 펠릿화하였다. 이중 특이성 분자를 완전 RPMI에서 연속으로 3배 희석하였다. OX40 리포터 세포 및 제시 세포를 웰 당 100,000개의 세포로 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 상술한 바와 같이, 완전 RPMI 배지 내의 세포에 1 ㎍/㎖에서 시작하여 최종 농도까지 이중 특이성 분자를 첨가하고, 희석하였다. 16시간 내지 24시간의 배양 시간 후, 각각의 웰에 100 ㎕의 재구성된 스테디-글로® 루시페라아제 검정 용액(위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가)을 첨가하고, 혼합하여 세포를 용균한 후, 배양하여 루시페라아제 신호를 평형화하였다. 스테디-글로®/시료 용균물(150 ㎕)을 각각의 웰로부터 백색 벽을 가진 검출용 96-웰 검정 플레이트로 전달하고, 퍼킨-엘머 앤비젼TM(EnvisionTM) 발광 판독기를 이용하여 발광을 판독하였다. 윈도우용 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)(캘리포니아주 샌디에고 소재의 그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software))을 이용하여 이중 특이성 분자(x-축은 단백질 농도의 log10임)의 농도 대 발광(RLU; y-축)을 작도하였다.
도 43에서 나타나 있는 바와 같이, MEDI5615는 NF-κB 신호전달에 의해 측정할 때 Fcγ 수용체(CD32A-발현 HEK293 세포) 및 PD-L1(MDA-MB231 세포)을 발현하는 세포의 존재 하에 인간 OX40-발현 저캇 T 세포에서 OX40 신호전달 경로를 활성화하였으며, 이때 EC50 값은 각각 52 pM 및 18 pM이었다. MEDI5615를 가교 결합할 수 있는 PD-L1 또는 Fcγ 수용체를 발현하는 세포의 부재 시에, 최소 리포터 세포주 활성을 측정하였다.
그 이후, MEDI5615가 효과기 CD4+CD25- T 세포 증식에 대한 천연 CD4+CD25+ Treg(nTreg) 세포의 억제 기능을 극복하고 nTreg로부터 IL-10의 방출을 감소시키는 능력을 인간 T 세포 공동 배양 검정에서 시험하였다.
제조사의 설명서(영국 페이즐리 소재의 라이프 테크놀로지스)에 따라 인간 Treg 세포 단리 키트를 이용하여 인간 CD4+ 효과기 및 Treg 세포를 PBMC로부터 단리하였다. 이러한 과정은 비-CD4+ 세포에 대한 항체 표지에 의해 총 CD4+ 세포를 음성적으로 선택하는 단계, 및 이어서 자성 비드 기반 고갈을 이용하여 항체 양성 세포를 제거하는 단계를 수반한다. 항-CD25로 표지한 후, 자성 비드로 양성적으로 선택함으로써 효과기 CD4+ 세포로부터 Treg 세포를 분리하였으며, 그 이후에 단리된 세포로부터 자성 비드를 제거하였다.
CellTraceTM CFSE 세포 증식 키트(영국 페이즐리 소재의 라이프 테크놀로지스)를 이용하여 효과기 CD4+CD25- T 세포를 CFSE로 표지하였다. 효과기 T 세포 및 Treg 세포를 항-마우스 CD3 mAb가 코팅된 96-웰 플레이트의 웰에서 37℃에서 4일 동안 1:1 또는 1:2의 비율로 공동 배양하였으며, 가용성 항-마우스 CD28 항체의 존재 하에 대조군 및 시험 검체와 혼합하였다. 브레펠딘 A(brefeldin A)의 존재 하에 세포를 PMA 및 이오노마이신으로 추가의 4시간 동안 다시 자극하고, 고정하고, 세포 내 사이토카인 염색 방법을 이용하는 유세포 분석법에 의해 IL-10 생산에 대해 시험하였다. 분열된 효과기 CD4+ T 세포의 비율(%) 및 검정 말기에 IL-10을 생산하는 Treg 세포의 비율(%)을 유세포 분석법에 의해 평가하였다.
분열된 효과기 CD4+ T 세포(CFSElow)의 비율(%)을 결정하고; 생존 불능 (eFluor 양성) 세포 및 조절 T 세포(CFSE 음성)를 구별하고, 분석에서 제외하였다. IL10을 생산하는 Treg 세포의 비율(%)은 생존 불능 및 효과기 T 세포(CD25 음성)를 배제한 후 평가하였다.
Treg 세포의 부재 시의 효과기 T 세포는 항-CD3 및 항-CD28과 함께 배양한 후에 분열하였다(도 44 상부). 세포 주기에 들어가는 효과기 T 세포의 비율(%)은 시험 검체를 첨가할 때 증가하지 않았다. OX40 작용제(즉, scOX40L 2x G4S IgG4P, MEDI5615 및 항-PD-L1 IgG4P와 scOX40L 2x G4S IgG4P의 조합)로 이루어져 있는 시험 검체는 대조군 검체(즉, 미처리, NIP228 IgG4P 및 항-PD-L1 IgG4P)와 비교하여 Treg의 존재 하에 분열된 효과기 T 세포의 비율(%)을 1:2의 효과기-대-Treg 비율에서 통계적으로 증가시켰다. 1:1의 효과기-대-Treg 비율로 배양했을 때 효과기 T 세포의 분화 비율(%)에서의 어떠한 증가도 관찰되지 않았다.
OX40 작용제로 이루어져 있는 시험 검체는 대조군 검체와 비교하여 효과기 T 세포와 공동 배양할 때 IL-10을 생산하는 Treg의 비율(%)을 유의하게 감소시켰다(도 44 하부). 이들 결과는 MEDI5615가 Treg 세포의 억제 활성 및 IL-10 생산을 극복하기 위해 OX40 작용제와 유사하게 작용한다는 것을 시사한다.
그 이후, PD-L1 및 OX40 기반 이중 특이성 분자가 초항원인 포도상구균 엔테로톡신 B(SEB)의 존재 하에 인간 PBMC를 공동 자극하는 능력을 평가하였다. 항-인간 CD3(클론 SK7) 항체를 96-웰 플레이트의 벽에 예비 코팅하였다. 건강한 공여자로부터 인간 PBMC를 단리하고, 항-CD3, SEB(25 ng/㎖) 및 표시된 시험 검체와 함께 72시간 동안 배양하였으며, 배양 상층액을 IL-2에 대해 시험하였다(도 45a 및 도 45b). BiS2 및 BiS3 OX40/PD-L1 이중 특이성 항체(도 45a; 또한 미국 특허 출원 제15/588,271호 참조) 및 MEDI5615(도 45b)는 전기 화학 발광 ELISA에 의해 측정할 때 인간 PBMC를 유도하여 IL-2를 농도 의존 방식으로 생산하였다. 이중 특이성 분자에 의해 생산되는 IL-2의 양은 OX40 항체(항-OX40 IgG4P), PD-L1 항체(항-PD-L1 IgG4P), OX40과 PDL1 항체의 조합, 대조군 이중 특이성 융합 단백질(PDL1-OX40 F180A BFP2, R347-OX40L BFP2) 단독 또는 조합, 및 음성 대조군 검체(NIP228 IgG4P; R347-OX40L F180A BFP2)를 함유하는 인간 PBMC 배양에 의해 생산되는 IL-2의 양보다 많았다.
그 이후, 조작된 CHO 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 인간 및 시노몰구스 원숭이 OX40 및 PD-L1에 결합하는 MEDI5615(PD-L1/OX40L BFP2)의 겉보기 친화도를 측정하기 위해 세포 기반 평형 결합 검정을 실시하였다.
3배 희석을 연속적으로 19회 실시하여 시험 검체를 희석하여 인간 또는 시노몰구스 원숭이 OX40, PD-L1 또는 OX40 및 PD-L1 둘 모두를 발현하도록 조작된 CHO 세포를 얻었다. 세포 및 시험 검체(n = 3)를 4℃에서 1시간 동안 배양하고, FACS 완충액(PBS 및 2% 열-불활성화된 신생우아혈청(newborn calf serum))으로 3회 세척하고, 알렉사플루오르® 647-표지 염소 항-인간 IgG 2차 항체 및 프로피디움 요오다이드(PI)와 함께 배양하고, FACS 완충액으로 세척하고, 유세포 분석법으로 분석하였다. 형광 보상 이후, 살아있는 (PI 음성) 단일 세포를 게이팅(gating)하고, 2차 항체의 평균 형광 세기(MFI)를 측정하여 각각의 시험 검체의 결합 수준을 기록하였다. 융합 단백질 농도(M)에 대한 시험 검체 결합의 MFI를 작도하여 겉보기 KD 및 수용체 점유 값을 결정하는 결합 곡선을 생성하였다. 도 46a 내지 도 46f를 참고한다.
다양한 CHO 세포와 MEDI5615의 상호작용을 위한 평균 평형 해리 상수(KD)는 하기 표 4에 나타나 있다.
Figure pct00001
세포에 결합하는 시험 검체에 대한 겉보기 KD를 측정하기 위해, 도 46a 내지 도 46f의 데이터를 이용하는 하나의 부위(특이적 결합)에 대한 비선형 회귀(곡선 맞춤(curve fit)) 방정식을 이용하였다. 그 결과에 따르면 세포 표면 인간 OX40을 발현하는 CHO 세포와 MEDI5615의 상호작용에 대한 평균 평형 해리 상수(KD)는 180 pM이고, 세포 표면 인간 PD-L1을 발현하는 CHO 세포와 MEDI5615의 상호작용에 대한 평균 평형 해리 상수(KD)는 88 pM이고, 인간 OX40 및 인간 PD-L1 둘 모두를 발현하는 CHO 세포와 MEDI5615의 상호작용에 대한 평균 평형 해리 상수(KD)는 270 pM인 것으로 나타났다. 세포 표면 시노몰구스 원숭이 OX40을 발현하는 CHO 세포와 MEDI5615의 상호작용에 대한 KD는 56 pM이고, 세포 표면 시노몰구스 원숭이 PD-L1을 발현하는 CHO 세포와 MEDI5615의 상호작용에 대한 KD는 110 pM이고, 시노몰구스 원숭이 OX40 및 시노몰구스 원숭이 PD-L1 둘 모두를 발현하는 CHO 세포와 MEDI5615의 상호작용에 대한 KD는 99 pM이다. 하나의 항원(OX40 또는 PDL1)에만 결합할 수 있는 대조군 BFP2 분자를 이용하여 유사한 결과를 얻었다.
다양한 CHO 세포와 MEDI5615의 상호작용을 위한 평형에서 20%, 50% 및 90%의 인간 OX40 수용체 점유도가 표 5에 나타나 있다.
Figure pct00002
도 46a 내지 도 46f에 나타나 있는 데이터에 대한 4-파라미터 맞춤 S자형 용량-반응 곡선을 이용하는 비선형 회귀 분석으로부터 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 ECx 값을 계산하였다.
수용체의 20%, 50% 및 90%가 시험 검체에 의해 차지하게 되는 농도를 측정하기 위해, 먼저 방정식 X = log[X]를 이용하여 농도 값(M)을 변환하고, 이어서 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 S자형 용량-반응(가변 기울기) 결합 곡선으로부터 f = 20, f = 50 및 f = 90에 대한 ECAnything(ECf)을 측정하였다. ECf는 하부 점근선과 상부 점근선 사이의 선의 반응 f의 비율(%)을 제공하는 시험 검체의 농도이며, 20%(f = 20), 50%(f = 50) 및 90%(f = 90) 수용체 점유도를 나타내며, 여기서 계산된 곡선의 최상단은 100% 수용체 점유도를 나타낸다.
조작된 CHO 세포 상의 평형 상태에서 20%, 50% 또는 90% 인간 OX40 수용체 점유도를 구현하기 위해 요구되는 MEDI5615의 농도는 각각 45 pM, 180 pM 및 1,600 pM인 것으로 계산되었다. 또한, 조작된 CHO 세포 상의 평형 상태에서 20%, 50% 또는 90% 시노몰구스 원숭이 OX40 수용체 점유도를 구현하기 위해 요구되는 MEDI5615의 농도는 각각 14 pM, 56 pM 및 500 pM인 것으로 계산되었다.
조작된 CHO 세포 상의 평형 상태에서 20%, 50% 또는 90% 인간 PD-L1 점유도를 구현하기 위해 요구되는 MEDI5615의 농도는 각각 22 pM, 88 pM 및 790 pM인 것으로 계산되었다. 또한, 조작된 CHO 세포 상의 평형 상태에서 20%, 50% 또는 90% 시노몰구스 원숭이 PD-L1 점유도를 구현하기 위해 요구되는 MEDI5615의 농도는 각각 27 pM, 110 pM 및 950 pM인 것으로 계산되었다.
조작된 CHO 세포 상의 평형 상태에서 20%, 50% 또는 90% 인간 OX40 및 PD-L1 점유도를 구현하기 위해 요구되는 MEDI5615의 농도는 각각 67 pM, 270 pM 및 2,400 pM인 것으로 계산되었다. 또한, 조작된 CHO 세포 상의 평형 상태에서 20%, 50% 또는 90% 시노몰구스 원숭이 OX40 및 PD-L1 점유도를 구현하기 위해 요구되는 MEDI5615의 농도는 각각 25 pM, 99 pM 및 890 pM인 것으로 계산되었다.
따라서, MEDI5615는 세포 표면 인간 및 시노몰구스 원숭이 OX40 및 PDL1을 개별적으로 또는 함께 발현하는 세포에 결합할 수 있다.
실시예 번호 21: 활성화된 인간 PBMC에서 PD-1 단백질의 하향 조절
본 연구에서, BFP가 활성화된 인간 PBMC에서 PD-1 단백질을 하향 조절하는 능력을 평가하였다.
자극 및 웨스턴 프로토콜: 1 ㎍/㎖의 항-CD3(클론 HIT3a, 바이오레전드) 및 항-CD28(클론 CD28.2, 바이오레전드)을 함유하는 완전 RPMI1640 배지에 새롭게 단리된 인간 PBMC를 1,000,000개의 세포/㎖로 재현탁하였다(도 47 참조). 3일 동안의 자극 후, 세포를 수집하고, 세척하고, 신선한 완전 RPMI1640 배지에 1,000,000개의 세포/㎖로 재현탁하였다. 총 2 ㎖의 세포를 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 10 nM 시험 물질로 24시간 자극하였다. 프로테아제 억제제가 보충된 RIPA 완충액에서 세포를 용균하고, 전세포 용균물을 면역 블로팅에 의해 분석하였다. 웨스턴 블롯용으로 사용된 항체는 표 6에 나열되어 있다.
PD1, OX40 및 GITR의 단백질 수준을 검출하기 위한 웨스턴 블롯 분석
항체 판매사 카탈로그 번호 희석
PD-1(D4W2J) XP® 토끼 mAb #86163 세포 신호전달 86163S 1:500
OX40 (D1S6L) 토끼 mAb #15123 세포 신호전달 15123S 1:500
인간 GITR/TNFRSF18 항체 R&D 시스템즈 AB689-100 1:500
항-액틴 시그마 A2066-.2ML 1:2,000
페록시다아제 어피니퓨어 당나귀 항-토끼 IgG(H+L) 잭슨 이뮤노리서치 711-035-152 1:4,000
페록시다아제 어피니퓨어 당나귀 항-마우스 IgG(H+L) 잭슨 이뮤노리서치 715-035-150 1:4,000
결과는 도 47, 도 48 및 도 74에 나타나 있다. 항-PD1-OX40L BFP는 활성화된 인간 PBMC에서 PD1 단백질의 분해를 촉발하는 것으로 나타나 있고(도 47), 항-PD1-GITRL BFP(MEDI3387)는 활성화된 인간 PBMC에서 PD1 단백질의 분해를 촉발하는 것으로 나타나 있다(도 48). 본 발명자들은 PD1/OX40L 2WT 및 1WT가 또한 아이소타입 대조군 항체와 비교하여 유의한 PD1 분해를 유도한다는 것을 발견하였다(도 74). 따라서, PD1 단백질의 내재화 및 분해의 유도가 OX40 내재화에 의해 조장되지만, 이는 OX40 활성화와는 무관할 수 있다.
실시예 번호 22: NF-ΚB의 GITRL 활성화
본 검정에서는 GITR 리간드에 의한 GITR 수용체의 연합으로 인해 NFAT 프로모터-조장 루시페라아제 활성이 유도되는 저캇 NF-κB Luc FL hGITR 클론 29 세포주가 이용된다.
GITR 단백질로 형질 감염된 저캇-블루 NF-κB/Luc FL hGITR 클론 29 리포터 T-림프구를 글루타맥스TM(인비트로젠), 10% HI-FBS(인비트로젠) 및 1% 펜/스트렙(인비트로젠)가 보충된 RPMI-1640 배지에서 유지하였다. 세포를 수확하고, 1 x 106개의 세포/㎖로 조절하였으며, 편평 바닥의 96웰 플레이트(웰 당 5 x 104개의 세포; 팔콘)의 웰에 첨가하였다(50 ㎕). 50 마이크로리터(㎕)의 2X 시험 시약을 각각의 웰에 첨가하였다. 스테디-글로®(프로메가) 완충액을 측정일에 암실에서 사용하기 전에 실온에서 해동시켰다. 4시간 40분 동안의 배양 후, 플레이트를 20분 동안 실온까지 평형화하도록 한 후, 실온에서 재구성된 100 ㎕ 의 스테디-글로® 시약을 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 측정 이전에 플레이트 진탕기에서 10분 초과의 시간 동안 배양하였다. 최적화된 초민감 LUM 96(옵티(Opti))을 이용하여 발광 판독을 측정하였으며, 이때 판독은 앤비젼 플레이트 판독기(퍼킨-엘머) 상에서 0.1초 동안 이루어 졌다.
도 49는 항-PD1-GITRL BFP(MEDI3387 및 MEDI5771)가 GITR로 형질 감염된 저캇 세포에서 NF-κB 경로를 활성화시켰다는 것을 보여준다.
실시예 번호 23: 생물-HGITR 및 HPD-1에 대한 PD-1/GITRL 이중 특이성 동시 결합의 옥테트 시험
본 실험의 목적은 상호작용을 알아보기 위해 옥테트 생물층 간섭법(OCTET Bio-Layer Interferometry)을 이용하여 PD1/GITRL 이중 특이성 융합 단백질이 huPD-1 및 huGITRL(GITR 리간드)에 동시에 결합하는 능력을 시험하는 것이다.
이러한 프로토콜에 사용된 재료는 하기 표 7에 서술되어 있다.
옥테트 검정 시험 물질
시약 공급자 카탈로그 번호 배치/로트 번호 튜브 크기 저장
Bio-rhGITR/Fc 2016년 5월 10일에 내부에서 비오티닐화됨(R&D 시스템즈) 689-GR-100 CRS0615071 PBS 및 0.1% BSA 중의 0.1 ㎎/㎖ -80℃
rhPD-1/Fc R&D 시스템즈 1086-PD-050 FVQ0915111 50 ㎍ -20℃
rhB7-H1 (PD-L1)/Fc R&D 시스템즈 156-B7-100 FVQ0915111 PBS 중의 0.5 ㎎/㎖ -20℃
rhGITRL R&D 시스템즈 6987-GL-025/CF TSU0815071 BSA 중의 0.5 ㎎/㎖ -20℃
Hu IL-7 FL_A_H_비오틴 내부에서 생산 및 비오티닐화됨(CPL) PS1062 해당 없음 144.8(2.98 ㎎/㎖) -80℃
NIP228 인간 IgG1 4P 내부 제조 해당 없음 SP09-410 71.0(10.65 ㎎/㎖) -20℃
DPBS 집코 14190-169 1734676 해당 없음 실온
30% BSA 시그마 A9576-50ML SLBJ8273 해당 없음 실온
트윈-20 시그마 P9416-50ML SLBH9666V 해당 없음 실온
고정밀 스트렙타아비딘(SAX) 딥 앤 리드 바이오센서 포르테바이오 18-5117 1511211 해당 없음 실온
경사 바닥(TW384) 마이크로플레이트 포르테바이오 18-5076 18-0019 해당 없음 실온
마이크로플레이트 96-웰 PP 흑색 그라이너 655209 EI5033KF 해당 없음 실온
비오티닐화된 rhGITR/Fc가 스트렙타아비딘 센서에 결합한 후, IO 이중 특이성 구조체가 연합하였다. 이어서, 짧은 해리 단계 이후에 구조체를 rhPD-1/Fc에 동시에 결합하는 능력에 대해 시험하였다.
옥테트 RED384 시스템 및 옥테트 데이터 분석 소프트웨어 버전 9(폴 포르테바이오)를 이용하여 생물층 간섭법(BLI)에 의해 이중 특이성 융합 단백질의 동시 결합을 평가하였다. 먼저, 고정밀 스트렙타아비딘(SAX) 딥 앤 리드 바이오센서(Dip-and-Read biosensor)를 검정 완충액(1% BSA, 둘베코(Dulbecco) PBS 중의 0.02% 트윈 20)에서 10분 동안 평형화시켰다. 비오티닐화된 재조합 인간 GITR/Fc(689-GR-100, R&D 시스템즈)를 3분 동안 포획하기 전에 1분 동안 검정 완충액에서 기준선을 확립하였다. GITRL 도메인을 통해 이중 특이성 융합 단백질을 5분 동안 포획하기 전에 30초 동안 검정 완충액에서 제2 기준선을 확립하였다. 이중 특이성 융합 단백질의 항체 성분에 의해 5분 동안 재조합 인간 PD-1/Fc(1086-PD-050, R&D 시스템즈)를 포획하기 전에 1분 동안 검정 완충액에서 해리/기준선을 실시하였다. 결과는 도 50에 나타나 있다.
실시예 번호 24: NFAT의 활성화에서의 PD-1 활성
본 검정에서는 CHO K1 OKT3-CD14(low) hB7H1(high) cl 2 세포가 항원 제시 세포로 사용되고 저캇 NFAT Luc2 PD1 클론 3L-B9 세포가 항-CD3 활성화된 리포터 세포주로서 사용된다. PD-1 차단 항체가 PD-L1 상호작용에 대해 PD-1을 억제하면 NFAT 프로모터-조장 루시페라아제 발현이 활성화된다.
PD-1로 형질 감염된 저캇 NFAT Luc2 PD1 클론 3L-B9 리포터 T-림프구 및 CHO K1 OKT3-CD14(low) hB7H1(high) cl 2 세포를 글루타맥스(인비트로젠), 10% HI-FBS(인비트로젠) 및 비필수 아미노산(인비트로젠)가 보충된 RPMI-1640 배지에서 유지하였다. 세포를 수확하고, 1 x 106개의 세포/㎖로 조절하였으며, 편평 바닥의 96웰 플레이트(웰 당 5 x 104개의 세포; 팔콘)의 웰에 첨가하였다(50 ㎕). 50 마이크로리터(㎕)의 2X 시험 시약을 각각의 웰에 첨가하였다. 스테디-글로®(프로메가) 완충액을 측정일에 암실에서 사용하기 전에 실온에서 해동시켰다. 4시간 40분 동안의 배양 후, 플레이트를 20분 동안 실온까지 평형화하도록 한 후, 실온에서 재구성된 100 ㎕의 스테디-글로® 시약을 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 측정 이전에 플레이트 진탕기에서 10분 초과의 시간 동안 배양하였다. 최적화된 초민감 LUM 96(옵티)을 이용하여 발광 판독을 측정하였으며, 이때 판독은 앤비젼 플레이트 판독기(퍼킨-엘머) 상에서 0.1초 동안 이루어졌다.
도 51은 항-PD1-GITRL BFP(MEDI3387 및 MEDI5771)가 PD-1로 형질 감염된 저캇 세포에서 NFAT 경로를 활성화하였다는 것을 보여준다. 상기 실시예 8의 데이터와 연합하여 이들 데이터에 따르면 MEDI3387 및 MEDI5771 BFP는 인간 PD-1 및 GITR에 대한 동시 결합을 보여준다는 것이 증명된다.
실시예 번호 25: 항-PD-1_IGG_GITRL 생체 내 검정
마우스 및 종양 모델: 8주 내지 10주령의 BALB/c 또는 C57BL/6 암컷 마우스를 찰스 리버 유케이 리미티드(Charles River UK Ltd.) 또는 할란 연구소(Harlan Laboratories, Inc.)로부터 수득하였다. PBS 중의 CT26 (ATCC) 또는 B16F10 세포의 100 ㎖ 현탁액을 각각의 동물의 우측 옆구리에 5 x 106개의 세포/㎖ 또는 5 x 104개의 세포/㎖의 세포 밀도로 피하 주사하였다. B16F10 세포주를 50% PBS 및 50% 성장 인자 감소 및 페놀 레드 부재 마트리겔®(Matrigel®; 코닝)에 이식하였다. 이식 이전에 세포주를 제한된 계대배양으로 배양하고, 마이코플라스마가 존재하지 않는다는 것을 확인하기 위해 주기적으로 스크리닝하였다. STR 프로파일링(아이덱스 바이오리서치(IDEXX Bioresearch))을 통해 세포를 추가로 확인하고, 마우스 바이러스의 집단(찰스 리버)에 대해 스크리닝하였다.
종양의 부피에 기초하여 측정 가능한 종양을 개개의 그룹으로 무작위 분류하였다. 전자 캘리퍼스를 이용하여 각각의 종양의 길이(㎜) 및 너비(㎜)를 매주 3회 측정하였다. 종양의 부피(㎣)를 식[길이(㎜) x 너비(㎜)2]/2에 기초하여 계산하였다. 종양 성장 반응은, 측정 가능한 종양이 존재하지 않거나 연구가 끝날 무렵에 부피가 200 ㎣이 미만이 되도록 종양 성장 억제가 유지된 경우의 반응으로서 분류하였다.
생체 내 연구를 위한 그룹 크기를 결정하기 위해 전력 계산을 실시하였다. 마우스에 mGITRL-FP, 항-세포 예정사 단백질-1 rIgG2a(PD-1, 클론 RMP1-14, 바이오엑스셀(BioXCell)) 또는 항-마우스-PD1/GITRL 이중 특이성 mAb 중 하나를 복강 내 투약하였다. 종양 세포 접종 이후 6일째 날에 시작하거나 종양의 부피가 200 ㎣에 도달했을 때 마우스에는 연구에 따라 상이한 농도로 투약하였다. 결과는 도 52에 나타나 있다.
실시예 번호 26: 항-PD-1_IGG_GITRL 생체 내 검정
약동학 및 약역학(PK/PD) 연구
시노몰구스 원숭이는 PD-1/GITRL 이중 특이성 융합 단백질의 기능 활성을 시험하기 위한 약물학적으로 관련이 있는 비임상 종으로 간주되었다. 시노몰구스 원숭이에서의 비-GLP(우수 실험실 기준(Good Laboratory Practices)) 연구에서 PD-1/GITRL 이중 특이성 융합 단백질의 약동학(PK) 및 약역학을 평가하였다. 5 ㎎/㎏ 내지 50 ㎎/㎏의 용량 범위에 걸쳐 1회의 정맥 내(IV) 투약 이후에 시노몰구스 원숭이(n = 5; 수컷)에서 PK 및 PD(Ki67 양성 CD4+ 및 CD8+ 총 기억 T 세포의 비율(%))을 평가하였다. 혈액 시료는 투약 이전에 수집하고, 투약 후 1일, 3일, 8일, 11일, 15일, 18일, 22일 및 29일째 날에 수집하였으며, 시료 수집 일에 유세포 분석법에 의해 분석하였다. Ki67 결과에 따르면 CD4+ 및 CD8+ 총 기억 T 세포(Ki67)가 투여량 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다(도 53a 및 도 53b).
또한 혈액 시료를 PK 평가를 위해 8일, 15일, 22일 및 29일째 날에 투약 후 0.5시간, 6시간, 24시간, 48시간 및 96시간에 수집하였다. 요약하면, PD-1/GITRL 이중 특이성 융합 단백질은 Cmax 및 AUC0-inf에 있어서 대략 비례적으로 증가하였으며, 이는 이러한 용량 범위 내에서의 선형 약동학(도 54)에서는 1.12일 내지 2.19일로 반감기가 짧다는 것을 시사한다(표 8 참조).
PD-1/GITRL 이중 특이성 융합 단백질의 평균 약동학 파라미터
투여량
(㎎/㎏) 		t 1/2
(일) 		T max
(시간) 		C max
(㎎/ℓ) 		AUC 0-inf
(일ㆍ㎎/ℓ) 		Vss
(㎖/㎏)
MEDI3387 5 1.12
(0.278)		 0.50
(0.00)		 111
(11.7)		 125
(20.1)		 61.1
(8.33)
MEDI3387 50 1.91
(0.129)		 0.50
(0.00)		 1,200
(82.7)		 1,050
(183)		 83.2
(8.13)
MEDI3387 5 1.48
(0.481)		 0.50
(0.00)		 77.1
(11)		 108
(26.7)		 88.9
(6.36)
MEDI3387 50 2.19
(0.13)		 0.50
(0.00)		 730
(26.7)		 800
(51.4)		 135
(5.86)
값은 평균(표준 편차)으로서 나타나 있다. AUClast = 마지막 측정 가능한 농도까지의 농도-시간 곡선 하의 면적; AUCINF = 무한 시간까지의 농도-시간 곡선 하의 면적; Cmax = 최대 관찰 농도; CL: 전신 소거율; T1/2 = 반감기; Vss: 종료 단계의 분포 부피.
MEDI3387의 경우, 5 ㎎/㎏ 및 50 ㎎/㎏의 용량에 대해 평균 Cmax 값은 각각 111 ㎎/ℓ 및 1,200 ㎎/ℓ이고, 평균 AUC0-inf 값은 각각 125 ㎎ㆍ일/ℓ 및 1,050 ㎎ㆍ일/ℓ이다. 용량-정규화된 AUC 값은 2개의 투여 그룹에서 대략 유사하였다. 평균 AUC0-inf/용량은 5 ㎎/㎏ 및 50 ㎎/㎏의 용량 수준에 대해 각각 24.9 및 20.9이었다. MEDI5771의 경우, 5 ㎎/㎏ 및 50 ㎎/㎏의 용량에 대해 평균 Cmax 값은 각각 77.1 ㎎/ℓ 및 730 ㎎/ℓ이고, 평균 AUC0-inf 값은 각각 108 ㎎ㆍ일/ℓ 및 800 ㎎ㆍ일/ℓ이다. 용량-정규화된 AUC 값은 2개의 투여 그룹에서 대략 유사하였다. 평균 AUC0-inf/용량은 5 ㎎/㎏ 및 50 ㎎/㎏의 용량 수준에 대해 각각 21.5 및 16.0이었다.
실시예 번호 27: 항-PD-1_IGG_GITRL BFP는 일차 인간 T 세포 재활성화 검정에서 T 세포 효과기 기능을 향상시킨다.
사이토스팀 T 세포 재활성화 검정에 대한 개략도가 도 55a에 나타나 있다.
제조사의 추천 프로토콜에 따라 피콜-파크 플러스(지이 헬쓰케어 17-1440-02)를 이용하여 백혈구 콘(애든브룩스 병원의 NHSBT이 제공함)으로부터 PBMC를 준비하였다. 제조사의 추천 프로토콜에 따라 T 세포 부유화 키트(스템셀 카탈로그 번호 19051)를 이용하여 T 세포를 공여자 PBMC로부터 음성 선택에 의해 단리하였다. 이어서, T 세포를 T 세포 배지(5% 인간 AB 혈청[시그마] 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 글루타맥스TM[집코] 함유 RPMI1640)에 1 x 106개의 세포/㎖의 농도로 재현탁하고, 항-인간 CD3 항체(클론 OKT3, 이바이오사이언스 카탈로그 번호 16-0037-85)로 사전에 코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트(코스타, 카탈로그 번호 3506) 내에서 37℃ 및 5% CO2에서 96시간 동안 자극하였다. 6-웰 플레이트를 코팅하기 위해, 0.2 ㎍의 OKT3을 함유하는 1 ㎖의 PBS를 각각의 웰에 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 사용하기 전에 플레이트를 PBS로 2회 세척하였다.
이어서, T 세포를 세척하고, 신선한 T 세포 배지에서 자극 없이 37℃ 및 5% CO2에서 추가의 24시간 동안 배양하였다. 이어, 이들 '휴면' T 세포를, 제조사의 추천 프로토콜을 따라 EasySepTM 인간 CD3 양성 선택 키트 II(스템셀, 17851)를 사용하여 사전에 T 세포가 고갈된 자가 PBMC와 1:4의 비율로 혼합하였다. 얻어진 세포 혼합물을 시험 약물 또는 대조군 mAb와 함께 인간 사이토스팀(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), 130-092-173)이 1/400의 농도로 보충된 T 세포 배지에서 96-웰 U자형 바닥 조직 배양 플레이트(코스타 8797BC) 상에 분주하였다. 각각의 반응물은 200 ㎕의 총 부피를 가졌고, 5E5 세포를 함유하고 있었다. 반응물을 37℃ 및 5% CO2에서 72시간 동안 배양하였으며, 그 이후에 상층액을 제거한 후, ELISA에 의해 INF-γ 방출에 대해 시험하였다.
결과는 도 55b 및 도 55c에 나타나 있다. MEDI3387 및 MEDI5771은 단일 특이성 (PD-1 및 GITRL) 분자들의 조합에 비해 4배 초과 더 강력하며, 따라서 BFP 형식으로 인해 예상치 못한 상승 효과를 나타낸다. 상술한 시험관 내 데이터(도 55d 및 도 55e)에는 GITRL (MEDI1873)/Durva(MEDI4736) 또는 MEDI1873/aPD-1 mAb(LO115) 조합에 대한 MEDI3387 및 MEDI5771의 생물 등가성(bioequivalence)이 나타나 있다. 생체 내 데이터에는 MEDI1873/aPD-1 mAb 조합에 대한 생물 등가성이 나타나 있다.
실시예 번호 28: GITR의 생체 내 형광 생체 분포
0일째 날에 6주/8주령의 암컷 SCID 마우스에 인간 폐종양 세포주인 NCI-H358(5 x 105개의 세포/마우스)을 피하 주사하였다. 종양 크기가 대략 200 ㎣ 내지 300 ㎣가 되었을 때 25일째 날에 형광(IRDye 800CW) 표지 항체(100 ㎕/25 g의 용량 부피 중 10 ㎎/㎏)의 정맥 내 단일 투여가 이루어졌다. 생체 내 주사 2주 전에 제조사의 프로토콜에 따라 3개의 항체 모두를 IRDye 800CW로 표지하였다. 처리 그룹 당 5마리의 마우스를 마취시키고, IVIS 스펙트럼을 이용하여 투약 후 1시간, 24시간 및 96시간에 이미지화하였다. 형광 염료에 대한 최적의 파장 세팅을 선택하였으며, 퍼킨-엘머 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 종양 및 간 영역에 대한 방사 효율 값을 측정하였다. 결과에 따르면 MEDI3387, MEDI5771 및 MEDI1873에 대한 간 생체 분포 프로파일 사이에는 유의한 차이가 없다는 것을 보여준다(도 56).
실시예 번호 29: 항-PD-L1-TNF-α BFP는 T24 종양 세포의 세포 표면 상의 PD-L1 단백질의 하향 조절을 촉발한다.
T24는 NF-α 수용체 및 PD-L1 둘 모두를 구성적으로 발현하는 인간 방광 이행성 암종 세포주이다. 본 연구에서, T24 세포를 시험 물질과 10 nM의 농도로 혼합하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세척에 의해 유리 항체를 제거하고, Qifikit(애질런트(Agilent))를 이용하여 세포 표면 상의 PD-L1 단백질의 양을 정량화하였다. 간단히 말하자면, 처리 후 T24 세포를 미접합 항-PD-L1(클론 29E.2A3)과 얼음 상에서 30분 동안 반응시킨 후, FITC-접합 F(ab)2 염소 항-마우스 IgG와 추가의 30분 동안 반응시켰다. FITC 신호의 평균 형광 세기를 기록하고, T24 세포 상의 세포 당 PD-L1 항원의 양을 제조사의 설명서에 따라 계산하였다.
셀티터-글로®(CellTiter-Glo®) 세포 생존력 키트(프로메가)를 이용하여 세포 생존력에 미치는 효과를 평가하였다. 본 연구에서, 웰 당 10,000개의 T24 세포를 상술한 바와 같이 처리된 투명 벽의 멀티웰 플레이트에서 배양하고, 배양 후에는 T24 세포를 희석된 셀티터-글로® 시약과 혼합하였다. 내용물을 회전식 진탕기 상에서 2분 동안 혼합하여 세포 용균을 유도하였으며, 플레이트를 실온에서 10분 동안 배양하여 발광 신호를 안정화시켰다. 스펙트라맥스 M5 플레이트 판독기 상에서 발광을 기록하였다. 도 57은 항-PD-L1-TNF-α BFP가 T24 종양 세포 내의 PD-L1 단백질의 하향 조절을 촉발한다는 것을 보여준다. 이러한 결과에 따르면 CD40을 다른 TNF-α 패밀리 단백질로 교체하는 다른 BFP 분자도 세포 표면 PD-L1의 하향 조절을 촉발할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 번호 29: 항-PD-L1-TNF-α BFP는 T24 종양 세포의 세포 표면 상의 PD-L1 단백질의 하향 조절을 촉발한다.
시험 시약이 항-PDL1-TNF-α BFP3 및 TNF-α FP 및 아이소타입 대조군으로 교체된다는 것을 제외하고, THP1-블루 세포에 대한 다른 검정을 상기 실시예 번호 4에서 기술한 바와 같이 설정하였다. 도 58은 항-PDL1-TNF-α BFP가 THP1 골수 세포 상에서 NF-κB 경로를 활성화한다는 것을 보여준다.
실시예 번호 30: 항-PD-1-OX40 BFP는 내재화를 조장한다.
하기에 기술된 연구에 따르면 항-PD-1-OX40 BFP가 내재화를 조장할 수 있는 것으로 나타나 있다. 이는 OX40 암이 작용제이거나 비-작용제 항체인지와는 무관하다. 이러한 결과는 자가 면역 공간에 직접 응용 가능하다. 그 결과에 따르면 활성화용 수용체의 내재화는 비-작용제지만 내재화용 항체를 이용하여 구축된 이중 특이성을 이용하여 조장될 수 있는 것으로 나타나 있다(도 63 내지 도 64 및 도 70 내지 도 74 참조). 또한 이들 결과에 따르면 PD-1의 분해가 이러한 이중 특이성 환경에서 OX40 작용제 기능과는 무관하다.
결론
CD40L FP와 유사한 MEDI7526은 CD40의 신속한 하향 조절을 유도하였다. 흥미롭게도, MEDI7526은 또한 다양한 유형의 세포(THP1, MDA-MB-231 및 인간 단핵구를 포함함)의 세포 표면 상의 PD-L1의 신속하고 강력한 하향 조절을 촉발하는 것으로 밝혀졌다. 이들 모든 세포는 CD40을 발현한다. 또한, MEDI7526은 세포 표면 상의 PD-L1을 하향 조절할 뿐만 아니라, PD-L1 단백질의 총 세포량을 유의하게 감소시켰으며, 이는 PD-L1의 강제적인 내재화가 이의 분해를 촉발할 수 있다는 것을 시사한다. 더욱이, 항-PD-L1-TNF-α BFP는 T24 종양 세포에서 PD-L1 단백질의 하향 조절을 유사하게 촉발하였다. 이러한 결과에 따르면 CD40을 다른 TNF-α 패밀리 단백질로 교체하는 다른 BFP 분자가 세포 표면 PD-L1의 하향 조절을 촉발할 수 있다는 것을 보여준다. 추가적인 BFP 분자가 또한 PD-L1의 하향 조절을 유사하게 조절할 수 있는 것으로 여겨진다.
이들 신규한 이중 특이성 분자에 대한 본원에 기술된 데이터에 따르면 2개의 분자가 하나의 "스캐폴드(scaffold)"로 조합되면 병용 요법 단독으로는 구현할 수 없는 결과가 발생한다는 것을 보여준다. CD40 경로를 자극하고 PD-L1 발현을 하향 조절하는 독특한 기능을 통해 MEDI7526(BFP3)은 암에 대한 유망한 치료 접근법을 제시한다.
유사하게는, 항-PD1-GITRL BFP(MEDI3387) 및 항-PD1-OX40L BFP는 활성화된 인간 PBMC에서의 PD1 단백질의 분해를 촉발하는 것으로 나타나 있으며, 이는 암 투병에 대한 다른 치료 옵션을 제공할 수 있다.
도 59는 MEDI7526(BFP3)에 대해 제안된 MOA를 설명한다. 상세하게는, CD40 연결을 통해 항원 제시 세포를 활성화하는 동시에 세포 표면으로부터 PD-L1을 제거함으로써 IFN-γ, IL-12 및 IL-10이 유도되지만, TNF-α 또는 IL-6은 유도되지 않는다. 유도된 TNF-α 및 IL-6의 부재는 항종양 기능 향상 및 체중 감량의 감소와 연관성이 있으며, 이는 MEDI7526이 독성 감소와 더불어 향상된 항종양 반응을 유도할 수 있다는 것을 뒷받침 해준다.
쥐 연구에 따르면 MEDI7526이 간 종양을 치료할 수 있는 잠재성을 갖는다는 것이 추가로 확인되었다.
기타 실시형태
본원에 기술된 개시내용을 다양한 용도 및 조건에 맞추기 위해 본 개시내용에 대해 다양한 변형 및 변경이 이루어질 수 있다는 것이 상술한 설명으로부터 자명하게 될 것이다. 이 같은 실시형태도 또한 하기 특허청구범위의 범위 내에 있다.
본원에서 변수에 대한 임의의 정의에서 성분 목록에 대한 설명에는 임의의 단일 성분 또는 나열된 성분의 조합(또는 하위조합)으로서 이러한 변수에 대한 정의가 포함되어 있다. 본원에서의 실시형태에 대한 설명에는 임의의 단일 실시형태로서, 또는 임의의 기타 실시형태 또는 이의 일부와의 조합으로 이러한 실시형태가 포함되어 있다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은, 각각의 개별적인 특허 및 간행물이 참고로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 나타나 있는 것과 동일한 정도로 본원에서 참고로 포함된다.
서열 번호
Figure pct00003
서열
Figure pct00004
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Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
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Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Thr Ile Tyr Ser Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ala Pro Asn Ser Phe Tyr Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 450 455 460 Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe 465 470 475 480 Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu 485 490 495 Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp 500 505 510 Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn 515 520 525 Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys 530 535 540 Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys 545 550 555 560 Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp 565 570 575 Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly 580 585 590 Glu Ala Cys Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 595 600 605 Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr 610 615 620 Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp 625 630 635 640 Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly 645 650 655 Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile 660 665 670 Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys 675 680 685 Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp 690 695 700 Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe 705 710 715 720 His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu 725 730 735 Phe Cys Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val 740 745 750 Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu 755 760 765 Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu 770 775 780 Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe 785 790 795 800 Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser 805 810 815 Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val 820 825 830 Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys 835 840 845 Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His 850 855 860 Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe 865 870 875 880 Cys Val Leu <210> 39 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 43 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (38)

  1. 제1 세포 표면 표적에 특이성인 제1 결합 영역, Fc 단량체 및 제2 세포 표면 표적에 특이성인 제2 결합 영역을 포함하는 단일쇄 융합 단백질을 포함하는 이중 특이성 융합 단백질로서,
    상기 제1 결합 영역 및 상기 제2 결합 영역은 펩티드 링커를 통해 상기 Fc 단량체에 공유 결합되고,
    상기 이중 특이성 융합 단백질은 상기 제1 세포 표면 표적 및 상기 제2 세포 표면 표적과 동시에 결합할 수 있는 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 결합 영역 및 상기 제2 결합 영역 중 적어도 하나는 Fab 절편 또는 수용체 리간드인 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 Fab 절편은 항-PD-1 Fab 절편인 이중 특이성 단백질.
  4. 제2항에 있어서, 상기 Fab 절편은 항-PD-L1 Fab 절편인 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 단량체는 IgG1 Fc 단량체인 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 IgG1 Fc 단량체는 서열 번호 6에 대해 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 단량체는 IgG4 Fc 단량체인 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 IgG4 Fc 단량체는 서열 번호 9와 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 단량체는 힌지 영역을 포함하는 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 단량체는 인간 Fc 아미노산 서열을 포함하는 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 리간드 소단위들 중 적어도 하나는 GITRL인 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 리간드 소단위들 중 적어도 하나는 OX40L인 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 리간드 소단위들 중 적어도 하나는 CD40L인 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 상기 CD40L 리간드 소단위는 194번 위치에 Trp 잔기를 포함하는 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 상기 194번 위치의 Trp 잔기는 C→W 치환된 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 리간드 소단위들 중 적어도 하나는 TNF-α인 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  17. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 리간드 소단위들 중 적어도 하나는 CD137L인 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fab 절편은 상기 Fc 단량체의 N-말단에 연결되어 있는 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  19. 제18항에 있어서, 상기 하나 이상의 리간드 소단위는 상기 Fc 단량체의 C-말단에 연결되어 있는 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fab 절편은 상기 Fc 단량체의 C-말단에 연결되어 있는 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  21. 제20항에 있어서, 상기 하나 이상의 리간드 소단위는 상기 Fc 단량체의 N-말단에 연결되어 있는 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일쇄 융합 단백질은 복수의 리간드 소단위를 포함하는 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  23. 제22항에 있어서, 상기 복수의 리간드 소단위는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 리간드 소단위를 포함하는 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일쇄 융합 단백질은 3개의 리간드 소단위를 포함하는 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  25. 제24항에 있어서, 상기 리간드 소단위는 3개의 리간드 소단위가 N-말단에서 C-말단까지 연속으로 연결되어 있는 동종 삼량체(homotrimer)를 형성하는 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드 링커는 약 9개 내지 약 20개의 아미노산을 포함하는 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  27. 제26항에 있어서, 상기 펩티드 링커는 약 9개 내지 약 15개의 아미노산을 포함하는 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  28. 제27항에 있어서, 상기 펩티드 링커는 약 9개의 아미노산을 포함하는 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드 링커는 하나 이상의 글리신(Gly) 또는 세린(Ser) 잔기를 포함하는 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드 링커는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 33), GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 34), GGGGSGGGGS(서열 번호 35) 또는 GGGGSGGGS(서열 번호 36)인 것인 이중 특이성 융합 단백질.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이성 융합 단백질로부터 선택되는 2개의 이중 특이성 융합 단백질을 포함하는 이량체로서,
    상기 이량체는 상기 Fc 단량체의 상호작용을 통해 형성되는 것인 이량체.
  32. 개체에서 항종양 면역 반응을 향상시키는 방법으로서,
    제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 단리된 융합 단백질 또는 이량체를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 개체에서 항종양 면역 반응을 향상시키는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 개체는 암에 걸려 있는 것인 방법.
  34. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 방법은 면역 반응 및/또는 항암 반응 중 하나 이상을 향상시키는 것인 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 단리된 융합 단백질 또는 이량체의 모 시약(parental reagent)을 이용한 처리와 비교하여, 상기 방법에 의해 독성이 감소되는 것인 방법.
  36. 암을 치료하는 방법으로서,
    제13항에 따른 상기 이중 특이성 융합 단백질을 이용하여 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 단계를 포함하는 것인, 암을 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 화학 요법을 이용한 치료를 추가로 포함하는 것인 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 암은 간암인 것인 방법.
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