TW201934583A - 雙特異性融合多肽及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了雙特異性融合蛋白和使用該雙特異性融合蛋白用於治療癌症之方法。

Description

雙特異性融合多肽及其使用方法 序列表
本申請案含有已以ASCII格式以電子方式提交且特此以引用的方式整體併入之序列表。所述ASCII副本創建於2018年11月2日，名稱為IOBS-110-WO-PCT_SL.txt並且大小為105,745位元組。
背景技術
癌症仍然是主要的全球健康負擔。2016年，僅在美國，估計將診斷出超過150萬新病例，並且超過500,000人將死於該疾病(參見來自國立衛生研究院，國家癌症研究所的癌症統計)。在全球範圍內，估計有近六分之一的死亡可歸因於癌症(參見Cancer Fact Sheet[癌症情況說明書]，2017年2月，世界衛生組織)。
儘管在過去十年在開發用於對抗癌症和其他疾病的策略中做出了顯著的進步，但是患有晚期、難治性和轉移性疾病的患者具有有限的臨床選擇。化學療法、輻射和高劑量化學療法已經成為劑量限制(並且在許多情況下僅延長患者的壽命，儘管具有顯著使人衰弱的副作用)。因此，對於患有晚期和/或治療抗性癌症的患者，仍然存在對於新的有效抗癌療法的未滿足的醫療需要。此外，還需要毒性較小，更具靶向性的抗癌療法。
新的無毒抗癌療法的潛在來源係患者自身的免疫系統。免疫系統，特別是T細胞介導的細胞毒性在腫瘤控制中的作用係公認的。有越來越多的證據表明T細胞在癌症患者中可以控制腫瘤生長和存活，無論係在該疾病的早期和晚期階段。然而，腫瘤特異性T細胞應答很難在癌症患者中上升和維持。
可以影響腫瘤特異性T細胞應答的T細胞訊號傳導途徑的實例涉及訊號蛋白，例如細胞毒性T淋巴細胞抗原-4(CTLA-4，CD152)、程式性死亡配位基1(PD-L1，也稱為B7-H1或CD274)、CD40配位基(CD40L)、糖皮質激素誘導的TNF受體(TNFR)相關蛋白(GITR)、OX40和CD137(4-1BB)。
CD40L係腫瘤壞死因子(TNF)分子家族的成員，其主要在活化的T細胞(包括Th0、Th1和Th2亞型)上表現，並形成與該家族的其他成員類似的同源三聚體。此外，還發現CD40L在肥大細胞和活化的嗜鹼性球和嗜酸性球上表現。CD40L與抗原呈遞細胞(APC)上的其受體CD40結合，這導致取決於靶細胞類型的許多作用。通常，CD40L起到共刺激分子的作用並藉由APC上的MHC分子誘導與T細胞受體刺激相關的APC中的活化。
藉由CD40L穿過CD40發訊號引發一系列事件，這些事件導致攜帶CD40的細胞的活化和最佳T細胞初免。更具體地，CD40L/CD40訊號傳導促進B細胞分化成抗體分泌細胞和記憶B細胞(Burkly，於以下中：Adv.Exp.Med.Bio.[實驗醫學和生物學進展]，第489卷，D.M.Monroe,U.Hedner,M.R.Hoffman,C.Negrier,G.F.Savidge，以及G.C.I.White，編輯.Klower Academic/Plenum Publishers[克魯維爾學術/普雷納姆出版社]，2001，第135 頁)。另外，CD40L/CD40訊號傳導藉由活化巨噬細胞和樹突狀細胞促進細胞介導的免疫，其藉由自然殺傷細胞和腫瘤抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的刺激促進抗腫瘤免疫應答(參見Burkly，同上)。
PD-L1也是涉及控制T細胞活化的受體和配位基的複雜系統的一部分。在正常組織中，PD-L1在T細胞、B細胞、樹突細胞、巨噬細胞、間葉系幹細胞、骨髓源性肥大細胞和不同非造血細胞上表現。它的正常功能係藉由與它的兩個受體程式性死亡1(又稱為PD-1或CD279)和CD80(又稱為B7-1或B7.1)的相互作用來調節T細胞活化與耐受之間的平衡。PD-L1還以高頻率在廣泛的癌症中表現，並且在多個部位上起作用以幫助腫瘤避開由宿主免疫系統進行的檢測和消除。在一些癌症中，PD-L1的表現與存活降低和不利預後相關聯。阻斷PD-L1與其受體(例如PD-1)之間的相互作用的抗體能夠在體外和在體內解除PD-L1依賴性免疫抑制作用並且增強抗腫瘤T細胞的細胞毒性活性。
GITR(也稱為TNFRSF18、AITR或CD357)，係在調節性T細胞上表現，並在抗原處理的CD4+輔助細胞和CD8+細胞毒性T細胞以及活化的自然殺傷細胞上上調(Stephens等人J Immunol.[免疫學雜誌](2004)173(8)：5008-5020；Clothier和Watts,Cytokine Growth Factor Rev.[細胞介素生長因子評論](2014))。GITR係涉及藉由抗原暴露控制T細胞活化的受體和配位基的複雜系統的一部分。GITR具有一個已知的內源性配位基，GITR配位基(GITRL)，該GITR配位基以鬆散三聚體的形式存在，並且可以使GITR聚集，在T細胞內導致有效的細胞訊號傳導事件(Chattopadhyay等人(2007)Proc.Natl.Acad Sci.USA[美國國家科學院院刊]104(49)：19452-19457)。GITR和GITRL之間的相互作用向T細胞遞送正共刺激訊號，這藉由抗原暴露增強其增殖和活化，幫助促進記憶細胞產生並重程式設計調節性T細胞以 降低其抑制功能(Clothier和Watts,Cytokine Growth Factor Rev.[細胞介素生長因子評論](2014)1月4日；Schaer等人Curr Opin Immunol.[當前免疫學觀點](2012))。
OX40(CD134；TNFRSF4)係發現的主要存在於活化的CD4+和CD8+ T細胞、調控性T細胞(Treg)和自然殺傷細胞上的另一種TNF受體(Croft等人，2009，Immunol Rev.[免疫學評論]229：173-91)。OX40具有一個已知的內源性配位基，OX40配位基(OX40L；CD152；TNFSF4)，該OX40配位基以三聚體的形式存在，並且可以使OX40聚集，在T細胞內導致有效的細胞訊號傳導事件(Croft等人，2009，Immunol Rev.[免疫學評論]229：173-91)。在活化的CD4+和CD8+ T細胞上藉由OX40訊號傳導導致增強的細胞介素產生、顆粒酶和穿孔素釋放、以及效應和記憶T細胞池的擴增(Jensen等人，2010，Semin Oncol.[腫瘤學研討會]37：524-32)。此外，Treg細胞上的OX40訊號傳導抑制Treg的擴增，停止Treg的誘導並且阻斷Treg抑制功能(Voo等人，2013，J Immunol.[免疫學雜誌]191：3641-50；Vu等人，2007，Blood.[血液]110：2501-10)。
免疫組織化學研究和早期流動式細胞測量術分析顯示，OX40在浸潤廣泛人癌症的T細胞上表現(Baruah等人，2011，Immunobiology[免疫生物學]217：668-675；Curti等人，2013，Cancer Res.[癌症研究]73：7189-98；Ladanyi等人，2004，臨床癌症研究Clin Cancer Res.[臨床癌症研究]10：521-30；Petty等人，2002，Am J Surg.[美國外科學雜誌]183：512-8；Ramstad等人，2000，Am J Surg.[美國外科學雜誌]179：400-6；Sarff等人，2008，Am J Surg.[美國外科學雜誌]195：621-5；討論625；Vetto等人，1997，Am J Surg.[美國外科學雜誌]174：258-65)。在腫瘤浸潤淋巴細胞上的OX40表現與若干種人類癌症中的較長生存期相關，表明OX40訊號可在建立抗腫瘤免 疫應答中發揮關鍵的作用(Ladanyi等人，2004，Clin Cancer Res.[臨床癌症研究]10：521-30；Petty等人，2002，Am J Surg.[美國外科學雜誌]183：512-8)。
與GITR一樣，CD137(4-1BB)係在活化的T細胞和NK細胞上表現的共刺激檢查點分子。CD137L(CD137配位基)由抗原呈遞細胞表現，並且與使免疫系統消除多種癌症類型的腫瘤有關。CD137在CD8+ T細胞上以比在CD4+ T細胞上更高的水平表現，並且它主要共刺激CD8+ T細胞。CD137的交聯強烈增強T細胞的增殖、IFN-γ分泌和細胞溶解活性。此外，已報導CD137激動劑(例如抗體)與癌症疫苗和免疫檢查點抑制劑協同作用以增強抗癌免疫應答。(Dharmadhikari等人，2016,Oncoimmunology[腫瘤免疫學]5(4)：e1113367)。
上述T細胞訊號傳導途徑(和其他)各自在控制腫瘤特異性T細胞應答中起作用。然而，在誘導和維持希望的T細胞介導的抗腫瘤應答的背景下，不同T細胞訊號傳導途徑的相對重要性仍有待闡明。實際上，不同T細胞訊號傳導途徑之間的相互作用可以在導致治療癌症的背景下產生協同效應。因此，本領域需要能夠經由改進的T細胞訊號傳導途徑的控制使T細胞介導的細胞毒性最大化的新穎試劑。這些試劑可以提供毒性更小，更具靶向性的抗癌療法。
本文提供了雙特異性融合蛋白及其用於控制T細胞介導的細胞毒性之方法。
在一個方面中，本文的揭露內容提供包含單鏈融合蛋白的雙特異性融合蛋白，該單鏈融合蛋白包含對第一細胞表面靶標特異的第一結合 區、Fc單體、和對第二細胞表面靶標特異的第二結合區，其中該第一結合區和該第二結合區經由肽接頭與該Fc單體共價連接，並且其中該雙特異性融合蛋白能夠同時結合該第一細胞表面靶標和該第二細胞表面靶標。
在某些方面中，該第一結合區和該第二結合區中的至少一個係Fab片段或受體配位基。
在其他方面中，Fab片段係抗PD-1或抗PD-L1 Fab片段。
在另外的方面中，一種或多種配位基亞單元中的至少一種係GITRL、OX40L、TNF-α、CD137L或CD40L。
在另一個方面中，本文的揭露內容提供了治療癌症之方法，該方法包括用本文揭露的雙特異性融合蛋白治療對其有需要的患者。
從以下對本揭露的詳細描述以及與所附申請專利範圍一起將更全面地理解本揭露的這些和其他特徵和優點。應注意申請專利範圍的範圍由其中的敘述定義，而不是由本說明書中闡述的特徵和優點的具體討論定義。
[圖1].考慮的雙特異性融合蛋白(BFP)的示意圖，包括第一結合結構域(BD1)、第二結合結構域(BD2)、和免疫球蛋白Fc區。BD2可以經由Fc區的鉸鏈區部分附接至Fc區。BD1可以經由肽接頭附接至Fc區。類似地，BD1部分的亞單元(在此示出具有3個亞單元，儘管可以考慮更少或更多)可以經由肽接頭互連。
[圖2].考慮的融合蛋白的不同結構包括單特異性和雙特異性融合蛋白。一種單特異性融合蛋白係MEDI5083，該蛋白具有相似於IgG抗體的BD1_Fc區形式，並且作為二聚化的單鏈融合蛋白產生，其中BD1=2x CD40L三聚體，其中CD40L亞單元藉由肽接頭連接，並且Fc係單個IgG4 Fc 區(CH2和CH3)。MEDI5083在結構上與MEDI4736可比較(杜伐魯單抗(Durvalumab)，一種抗PD-L1抗體，其中BD1=抗PD-L1 F(ab)2；Fc=IgG1 TM(“三重突變”，其中L234F/L235E/P331S在人IgG1中)。相反的是雙特異性融合蛋白形式的兩個反覆運算(BFP2和BFP3)。在示出的反覆運算中大小為203kDa的BFP2具有BD1_Fc_BD2形式(N至C)，其中BD1係2x CD40L三聚體，Fc係IgG4 Fc區，且BD2係2x抗PD-L1 scFv。在示出的反覆運算中大小為242kDa的BFP3具有BD2_Fc_BD1格式，其中BD2係抗PD-L1 F(ab)2(例如，取自MEDI4736)，Fc係單個IgG4Fc區，且BD1係2x CD40L三聚體。
[圖3].考慮的BFP3的具體實施方式。圖3A描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2個Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6個GITRL亞單元。圖3B描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2個Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6個GITRL亞單元。圖3C描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2個Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6個OX40L亞單元。圖3D描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2個Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6個OX40L亞單元。圖3E描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2個Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6個CD40L亞單元。圖3F描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2個Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6個CD40L亞單元。圖3G描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2個Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6個TNF-α亞單元。圖3H描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2個Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6個TNF-α亞單元。圖3I描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2個Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6個CD137L亞單元。圖3J描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2個Fab片段、IgG1 Fc多肽核心、和6個CD137L亞單元。 圖3K描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2個Fab片段、IgG4 Fc多肽核心、和6個GITRL亞單元。圖3L描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2個Fab片段、IgG4 Fc多肽核心、和6個GITRL亞單元。圖3M描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2個Fab片段、IgG4 Fc多肽核心、和6個OX40L亞單元。圖3N描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2個Fab片段、IgG4 Fc多肽核心、和6個OX40L亞單元。圖3O描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2個Fab片段、IgG4 Fc多肽核心、和6個CD40L亞單元。圖3P描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2個Fab片段、IgG4 Fc多肽核心、和6個CD40L亞單元。圖3Q描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2個Fab片段、IgG4 Fc多肽核心、和6個TNF-α亞單元。圖3R描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2個Fab片段、IgG4 Fc多狀核心、和6個TNF-α亞單元。圖3S描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-1的2個Fab片段、IgG4 Fc多肽核心、和6個CD137L亞單元。圖3T描繪了雙特異性融合蛋白，其包括靶向PD-L1的2個Fab片段、IgG4 Fc多肽核心、和6個CD137L亞單元。
[圖4].另外的特異性BFP3形式化的雙特異性融合蛋白：抗PD-L1_Fc_TNF-α(A)，抗PD1_Fc_OX40L(B)；和抗PD1_Fc_GITRL(C)。抗PD-L1 F(ab)片段衍生自MEDI4736，且抗PD-1 F(ab)片段衍生自抗PD1抗體(LO115)。TNF-α、OX40L、和GITRL結合結構域各自包括2組經由肽接頭連接在一起的每個蛋白質亞單元的三聚體重複。
[圖5A-5D].BFP 2和3與CD40和PD-L1結合。圖5A-5D證明了藉由Octet測定經由抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L BFP 2和3分子的CD40和PD-L1蛋白的並行結合。
[圖6A和6B].BFP2和BFP3保留結合CD40的能力。在基於流動式細胞測量術的測定中，與親本CD40L FP(融合蛋白)相比，抗-PD-L1_IgG4 Fc_CD40L BFP 2和3分子證明了與細胞表面CD40結合的類似的能力。
[圖7A和7B].BFP2和BFP3與細胞表面上的PDL1具有較低的結合。圖7證明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2和3分子可以在基於流動式細胞測量術的測定中結合細胞表面PD-L1蛋白。
[圖8A和8B].BFP與混合的PBMC結合。圖8證明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2和3分子以劑量依賴性方式結合人PBMC亞組，類似於基於流動式細胞測量術的測定中的親本抗PD-L1和CD40L FP。
[圖9].BFP2和BFP3保留了刺激CD40訊號傳導通路的能力。圖9證明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2和3分子活化NF-κB訊號傳導途徑，該途徑係關於多種細胞類型的CD40活化的下游。
[圖10].BFP3阻斷PD-L1和PD1相互作用並增強Jurkat T細胞中的NFAT訊號傳導。圖10證明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2和3分子阻斷PD-L1-PD1相互作用，導致Jurkat細胞中NFAT途徑的活化。
[圖11].BFP刺激CD40並阻斷PD1-PDL1相互作用。圖11A闡明了共刺激測定概念示意圖。圖11B示出了抗PD-L1-CD40L BFP具有雙重功能：其藉由CD40接合活化THP-1細胞上的NF-κB，並藉由去除PD-L1介導的抑制來增強Jurkat細胞中的NFAT活性。
[圖12].BFP3在SEB測定中具有優異的IL-2誘導活性。圖12示出了來自葡萄球菌腸毒素B(SEB)測定的結果，證明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2和3分子比親本分子CD40L FP和抗PD-L1的組合誘導更多的IL-2產生。
[圖13].PD-1/GITRL雙特異性抗體(MEDI3387和MEDI5771)在SEB測定中增加T細胞活化相對於單一試劑。圖13證明MEDI3387和MEDI5771具有與親本分子的組合等效，但是比單獨的任一親本分子更大的活性。結果在兩個批次中是可比較的，並且證明了與T細胞再活化測定類似的結果。
[圖14].BFP3在M1巨噬細胞-T MLR測定中誘導穩健的IFN-γ和IL-12產生。圖14示出了來自巨噬細胞-T細胞MLR測定的結果，證明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2和3分子比親本分子CD40L FP和抗PD-L1的組合誘導更多的IFN-γ和IL-12產生。
[圖15].BFP3在單-T MLR測定中誘導穩健的IFN-γ產生。圖15示出了來自單核細胞-T細胞MLR測定的結果，證明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP 2和3分子比親本分子CD40L FP和抗PD-L1的組合誘導更多或相等量的IFN-γ產生。
[圖16].在CMV回憶測定中，BFP3示出了優於組合的活性。圖16示出了來自CMV抗原回憶測定的結果，證明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3分子比親本分子CD40L FP和抗PD-L1的組合誘導更多的IFN-γ、IL-12、和IL-10產生但類似水平的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8。
[圖17A-B].BFP3可能潛在地改變CD40和PD-L1的膜定位。圖17A闡明了CD40和PD-L1在抗原呈遞細胞(APC)上共表現。圖17B示出了用於研究細胞表面CD40和PD-L1蛋白的基於流動式細胞測量術的測定的概念示意圖。
[圖18].BFP3誘導MDA-MB-231細胞上CD40和PD-L1的下調。圖18示出了來自基於流動式細胞測量術的測定的結果，證明在治療後1小時和 96小時僅抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3分子可以誘導CD40和PD-L1分子的下調。
[圖19].BFP3誘導MDA-MB-231細胞上CD40和PD-L1的下調。圖19示出了來自西方墨點法的結果，證明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3分子在治療後24小時誘導總PD-L1蛋白含量的下調。NS=無刺激。
[圖20].BFP3刺激後THP1細胞中表面CD40和PD-L1的損失。圖20示出了用於研究細胞表面CD40和PD-L1蛋白的測定的概念示意圖，其中採用連續性刺激。
[圖21].BFP3刺激後THP1細胞中表面CD40和PD-L1的損失。圖21示出了來自基於流動式細胞測量術的測定的結果，證明在治療後0.5小時至3小時抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3分子誘導表面CD40和PD-L1的下調。
[圖22].BFP3刺激後THP1細胞中表面PD-L1的損失。圖22示出了測定的概念示意圖，該測定用於在1小時處理後，隨後洗掉測試材料，研究細胞表面CD40和PD-L1蛋白。
[圖23].BFP3刺激後THP1細胞中表面PD-L1的損失。圖23示出了來自關於THP-1細胞的基於流動式細胞測量術的測定的結果，證明用抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3分子暫態處理1小時誘導細胞表面CD40和PD-L1蛋白的下調。在24小時，僅在細胞表面檢測到CD40。
[圖24].BFP3處理的moDC具有較低量的PD-L1蛋白。圖24示出了來自基於流動式細胞測量術的測定的結果，證明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3和CD40L FP分子在調節CD40、CD86、和PD-L1的細胞表面表現之間的分化作用：PD-L1的下調僅在BFP3處理的細胞中實現。
[圖25].BFP3處理的moDC具有較低量的PD-L1蛋白。圖25示出了來自西方墨點法的結果，證明PD-L1蛋白質的量在抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3處理的條件下比僅CD40L FP或CD40L FP加抗PD-L1的處理的情況下少得多。
[圖26].血液單核細胞上的表面CD40和PD-L1的損失。圖26示出了來自基於流動式細胞測量術的測定的結果，證明抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3和CD40L FP分子在調節CD40和PD-L1的細胞表面表現之間的分化作用：PD-L1的劑量依賴性下調僅在BFP3處理的細胞中實現。
[圖27].mBFP3誘導Renca細胞中鼠PD-L1的降解。圖27示出了來自西方墨點法的結果，證明鼠PD-L1蛋白質的量在抗PD-L1_IgG4 Fc_CD40L FP BFP3處理的條件下比僅CD40L FP或CD40L FP加抗PD-L1的處理的少得多。
[圖28].PD-L1交聯增加BFP3介導的NF-κB活性。圖28示出了ES2細胞表面上的交聯PD-L1可以增強由BFP3介導的THP-1細胞上的NF-κB作用。Y軸示出了NF-κB報道基因活性。
[圖29].IgG4 Fc和FcγRI相互作用調節BFP3活性。圖29示出了FcγR可以加強藉由BFP3介導的THP-1細胞上的NF-κB作用。
[圖30A-F].mBFP3處理的小鼠的體重減輕較少(單次劑量治療)。圖30A-F示出了來自關於野生型小鼠和植入B16F10腫瘤細胞的小鼠的多項研究的結果。示出了來自個體小鼠的治療後體重的變化。
[圖31].mBFP3處理的小鼠的體重減輕較少(多劑量治療)。圖31示出了來自關於植入B16F10腫瘤細胞的小鼠的多劑量研究的結果。示出了來自個體小鼠的治療後體重的百分比變化。
[圖32].mBFP3治療有效地抑制腫瘤生長。圖32示出了來自關於植入B16F10腫瘤細胞的小鼠的多劑量研究(每週兩次x 2周)的結果。示出了來自個體小鼠的治療後腫瘤體積的變化。
[圖33A-C].降低BFP3的給藥頻率可預防副作用。圖33A-C示出了來自關於植入B16F10腫瘤細胞的小鼠的減少的劑量研究(一次或兩次給藥)的結果。來自個體小鼠的治療後體重的變化示於圖33A中。圖33B示出了腫瘤體積的變化，且圖33C示出了血清丙胺酸轉胺酶(ALT)的水平。
[圖34].mBFP3治療誘導了T細胞的活化/分化。圖34示出了來自關於從攜帶B16F10腫瘤的小鼠中回收的T細胞的流動式細胞測量術研究的結果。確定T細胞亞組的百分比並以圖示出。
[圖35].mBFP3治療誘導效應/記憶CD8 T細胞分化。圖35示出了來自研究從攜帶B16F10腫瘤的小鼠中回收的T細胞的流動式細胞測量術測定的結果。確定效應CD8 T細胞亞組的百分比並以圖示出。
[圖36].小鼠中的MEDI7526不誘導TNF-α或IL-6，這兩種免疫相關毒性的關鍵介體。圖36示出了MEDI7526的抗腫瘤功能似乎不需要TNF-α和IL-6。
[圖37].MEDI7526小鼠替代物在小鼠中誘導不同的細胞介素譜(單次經靜脈內給藥研究)。
[圖38].PD1-OX40L在Jurkat/OX40細胞中誘導NF-κB活化。圖38證明抗PD-L_IgG4 Fc_OX40L FP BFP3分子在用OX40轉染的Jurkat細胞系中活化NF-κB訊號傳導途徑。
[圖39].小鼠OX40配位基(mOX40L)融合蛋白(FP)、抗小鼠PD-L1單株抗體(mAb)或mOX40L FP和抗PD-L1 mAb的組合對小鼠同系模型MCA205和CT26細胞系生長的影響。
[圖40A-C].PDL1/OX40L FP BFP2(MEDI5615)的PD-L1依賴性腫瘤定位。
[圖41].不同分子形式的PD-L1/OX40L雙特異性分子的荷瘤小鼠的生物分佈。
[圖42].用於測量雙特異性分子的生物活性的細胞系統。
[圖43].BFP2具有PD-L1介導的OX40聚集的最佳效價。RLU=相對光單位；M=莫耳濃度。
[圖44A-B].MEDI5615(PDL1/OX40L BFP2)和scOX40L在天然CD4+CD25+ Treg細胞存在下增加T效應物增殖並降低產生IL-10的T調節細胞的頻率。誤差條表示來自一式兩份測定孔的平均值的標準誤差。
[圖45A-B].示出了葡萄球菌腸毒素B(SEB)共刺激測定中PDL1/OX40L FP BFP2(MEDI5615)和OX40/PDL1雙特異性mAb的活性。
[圖46A-F].示出了PD-L1/OX40L BFP2與工程化以表現人或食蟹猴OX40、PD-L1、或OX40和PD-L1兩者的CHO細胞的結合。誤差條代表平均值的標準差。MFI=平均螢光強度。
[圖47].PD1-OX40L觸發人PBMC中PD1的降解。圖47示出了來自西方墨點法的結果，證明PD-1蛋白水平在抗PD-1_IgG4 Fc_OX40L FP BFP3處理的條件下降低，但OX40蛋白水平未變化。
[圖48].MEDI3387觸發人PBMC中PD1的降解。圖48示出了來自西方墨點法的結果，證明PD-1蛋白水平在抗PD-1_IgG4 Fc_GITRL FP BFP3處理的條件下降低，但GITR蛋白量未變化。PD-1/GITRL FP Bis；MEDI5771(IgG1形式)和MEDI3387(IgG4P)；GITRL：MEDI1873。
[圖49].MEDI3387在Jurkat/GITR細胞中誘導NF-κB活化。四小時刺激。圖49證明抗PD-L_IgG4 Fc_GITRL FP BFP3分子在用GITR轉染的Jurkat細胞系中活化NF-κB訊號傳導途徑。
[圖50].PD1/GITR雙特異性分子可以同時與兩個靶標結合。圖50證明了藉由Octet測定藉由抗PD1_IgG4 Fc_GITRL FP BFP2(MEDI3387)和抗PD1_IgG1 Fc_GITRL FP BFP2(MEDI5771)分子並行結合PD1和GITR蛋白。“A”=MEDI3387；“B”=BFP2-PD1(0075)-GITRL(sc)-G4P；“C”=BFP2-GITRL(sc)-G4P。
[圖51].BFP3阻斷PD-L1和PD1相互作用並增強Jurkat T細胞中的NFAT訊號傳導。圖51證明MEDI3387(BIOAE003)和MEDI5771(BIOAE005)分子阻斷PD-L1-PD1相互作用，導致Jurkat細胞中NFAT途徑的活化。BIOAE003和BIOAE005證明與MEDI1873(GITRL)和親本抗PD1 IgG可比較的效力。
[圖52].PD1/GITR雙特異性分子相當於B16小鼠模型中GITRL-FP和PD-1 mAb的組合。
[圖53A-B].用MEDI3387和MEDI5771治療後CD4+和CD8+總記憶T細胞(Ki67)的劑量依賴性增加。圖53A-B示出了在用改變的劑量的MEDI3387和MEDI5771處理的食蟹猴中的藥物動力學(PK)和藥效學(PD)研究的結果。
[圖54].單次靜脈內注射後雄性食蟹猴的平均血清MEDI3387和MEDI5771濃度-時間曲線。IV=靜脈內；誤差條代表平均值的標準差；LLOQ(黑色虛線)=定量下限。低於LLOQ的數據(0.050mg/L；如黑色虛線示出的)繪製在LLOQ的一半，僅用於說明性目的。
[圖55A-E].PD1/GITR雙特異性分子可以同時與兩個靶標結合。圖55A證明Cytostim T細胞再活化測定的測定示意圖。圖55B證明在PD1/GITR IgG4P BFP(MEDI3387)和親本分子情況下的結果。圖55C證明在PD1/GITR IgG4P BFP(MEDI5771)和親本分子情況下的結果。
[圖56].示出了GITRL在體內的螢光生物分佈。
[圖57A-B].抗PDL1-TNFα誘導T24腫瘤細胞中鼠PD-L1的下調；APC-每個細胞的抗原。圖57A示出了來自基於流動式細胞測量術的測定的結果，證明抗PD-L1_IgG4 Fc_TNFα FP BFP3治療下調T24腫瘤細胞上的PD-L1。圖57B示出了抗PD-L1_IgG4 Fc_TNFα FP BFP3治療不影響細胞活力。
[圖58].抗PDL1-TNF-α BFP可刺激THP1骨髓細胞。圖58證明抗PD-L1_IgG4 Fc_TNF-α FP BFP3分子活化NF-κB訊號傳導途徑，該訊號傳導途徑係TNF-α受體活化的下游。
[圖59].BFP3驅動CD40和PD-L1的同時內化，其不會與親本試劑的組合一起發生。圖59係一個概念示意圖，該概念示意圖描繪了包括抗PD-L1和CD40L結合結構域的BFP分子且示出了BFP分子可內化細胞表面上的兩個靶標(CD40和PD-L1)，導致PD-L1蛋白質的降解。CD40對降解具有抗性，且隨後在細胞表面回收表現。
[圖60].報道基因測定方案。圖A示出了模型疾病狀態，其中由於藉由PD-1/PD-L1複合物形成的抑制，從抗原呈遞細胞的沒有因抗CD3/抗CD28活化發生訊號(無測定應答)。相反，圖B描繪了經由抗PD-1抗體成功阻斷PD-1/PD-L1複合物形成，其導致在抗CD3/抗CD28活化後報道基因分子(螢光素酶)表現。
[圖61].顯示了比較IgG1 TM和IgG4形式的抗PD-L1/CD40L FP BFP3的SEB測定結果。
[圖62].顯示了比較IgG1 TM和IgG4形式的抗PD-L1/CD40L FP BFP3的CMV回憶測定結果。
[圖63].顯示了抗PD-1-抗OX40 Bis2在Jurkat細胞中不誘導NfkB活化，而抗PD-1-OX40L FP BFP3卻誘導。
[圖64].顯示了Bis2構建體觸發PD1降解，表明PD1的降解獨立於OX40激動劑功能。
[圖65].5FU和MEDI7526(抗PDL1-CD40L BFP3)的組合治療有效抑制腫瘤生長。圖65示出了來自動物研究的結果，其中將多劑量的5FU(第11天)和MEDI7526(第14、21、和28天)的順序治療給予攜帶CT26腫瘤細胞的小鼠。示出了來自個體小鼠的治療後腫瘤體積的變化。5FU加MEDI7526的治療增強了由單獨MEDI7526治療介導的抗腫瘤應答。
[圖66].肝和脾係MEDI7526的鼠替代物的靶器官。圖66A示出了MEDI5083和MEDI7526的鼠替代物在肝和脾中累積。圖66B示出了人Kupffer細胞(肝中的居住巨噬細胞)表現CD40和PD-L1，表明MEDI7526可靶向肝中的Kupffer細胞。
[圖67].MEDI7526可有效抑制肝腫瘤的生長。圖67A示出了肝腫瘤模型的設計，其中將CT26-螢光素酶腫瘤細胞直接植入肝臟中。在第21天，在屍體剖檢後回收肝，並藉由成像螢光素酶活性定量肝中的腫瘤負荷。圖67B示出了來自MEDI7526處理的小鼠的肝中的腫瘤負荷(表示為亮度單位)與同種型(isotype)對照處理的動物中的那些相比顯著降低。
[圖68].MEDI7526治療從CT26肝腫瘤模型研究中誘導肝中的T細胞擴增和活化。圖68A示出了與對照小鼠相比，接受MEDI7526的小鼠肝中 CD8 T細胞的數量增加。圖68B示出了從MEDI7526處理的動物分離的腫瘤抗原特異性CD8 T細胞具有更高百分比的活化的亞型。
[圖69A-B].在CT26肝腫瘤模型中，MEDI7526的治療比MEDI5083和抗PDL1的組合治療更可耐受。圖69A示出了與MEDI5083或MEDI5083加抗PDL1治療相比，MEDI7526治療的小鼠體重減輕較少。示出了來自個體小鼠的單次劑量治療後體重的變化。圖69B示出了mMEDI5083加抗鼠PDL1組的死亡率相對較高。
[圖70].另外的特異性BFP3形式化的雙特異性融合蛋白：抗PD1-Fc-OX40L野生型(A)、抗PD1-Fc-OX40L 2WT(B)和抗PD1-Fc-OX40L 1WT(C)。抗PD-1 F(ab)片段衍生自抗PD1抗體(LO115)。OX40L部分具有保守的野生型序列(A)或在殘餘的F180(B和C)上具有突變。
[圖71].抗PD1-Fc-OX40L 2WT和1WT降低了對人T細胞系的OX40激動劑功能。圖71A和B示出了與抗PD1-Fc-OX40L相比，抗PD1-Fc-OX40L 2WT輕微降低了結合和內化。圖71C示出了抗PD1-Fc-OX40L 2WT和1WT降低了活化NFκB途徑的能力。
[圖72A和72B].與初級人T細胞上的抗PD1-OX40L相比，抗PD1-Fc-OX40L 2WT和1WT具有類似的結合和內化。在來自兩個健康供體的純化的CD4和CD8 T細胞上產生數據。
[圖73A和73B].抗PD1-Fc-OX40L 2WT降低了對人初級T細胞的OX40激動劑功能。使用人T細胞刺激和CMV回憶測定比較PD1-OX40L和PD1-OX40L 2WT。與PD1-OX40L相比，PD1-OX40L 2WT誘導了少得多的炎症細胞介素，其在OX40L上不攜帶任何突變。
[圖74].抗PD1-Fc-OX40L 2WT和1WT誘導了人T細胞上的PD1降解。活化的人T細胞表現PD1蛋白，並且在抗PD1-OX40L、抗PD1-OX40L 1WT或抗PD1-OX40L 2WT治療後，總PD1蛋白的量顯著減少。圖74A示出了代表性的西方墨點法圖片，且圖74B示出了來自三個供體的合併的結果。
定義
除非另外說明，本文使用的所有技術和科學術語具有本揭露所屬領域的技術人員通常理解的含義。以下的參考文獻為技術人員提供了本揭露所用的多個術語的通用定義：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology[微生物學和分子生物學詞典](第2版1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology[劍橋科技詞典](Walker編著，1988)；The Glossary of Genetics[遺傳學詞彙]，第5版，R.Rieger等人(編著)，斯普林格出版社(Springer Verlag)(1991)；以及Hale和Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology[哈珀科林斯生物學詞典](1991)。除非另外指明，否則如本文所使用的以下術語具有以下賦予它們的含意。
術語“T細胞介導的細胞毒性”係指由細胞毒性T淋巴細胞(例如感染的細胞或癌性細胞)靶向殺死細胞。
術語“抗腫瘤活性”意指任何減少或預防腫瘤細胞的增殖或存活增加的生物活性。在一個實施方式中，該抗腫瘤活性係抗腫瘤免疫應答。
術語“免疫調節劑”係指增強免疫應答(例如抗腫瘤免疫應答)的試劑。本揭露的示例性免疫調節劑包括抗體，抗PD-L1抗體，及其片段，連同蛋白質，例如融合蛋白、雙特異性融合蛋白、和/或其片段。
術語“CD40L多肽”意指表明與NCBI登錄號NP_000065具有至少約85%胺基酸同一性、並且具有CD40結合活性的多肽或其片段。術語“CD40L”係指全長CD40L和可溶性片段兩者(例如由蛋白水解生成的 CD40L的細胞外結構域形式)，和CD40L的單體形式以及寡聚形式(例如三聚CD40L)。人CD40L的膜結合和可溶形式的胺基酸序列如下所示。
“CD40多肽”意指與NCBI登錄號NP_001241具有至少約85%胺基酸同一性、並且具有CD40L結合活性的多肽或其片段。以下提供了示例性CD40胺基酸序列(SEQ ID NO：22)。
“PD-L1多肽”意指與NCBI登錄號NP_001254635具有至少約85%胺基酸同一性、並且具有PD-1和CD80結合活性的多肽或其片段。以下提供了示例性PD-L1胺基酸序列(SEQ ID NO：23)。
“抗PD-L1抗體”意指選擇性結合PD-L1多肽的抗體。示例性抗PD-L1抗體描述於，例如美國專利案號8,779,108和美國專利申請公開號2014/0356353，其藉由引用併入本文。度伐魯單抗(Durvalumab)(MEDI4736)係示例性抗PD-L1抗體。其他抗PD-L1抗體包括BMS-936559(美施貴寶公司(Bristol-Myers Squibb))和MPDL3280A(羅氏公司(Roche))。
“PD-1多肽”意指與NCBI登錄號NP_005009具有至少約85%胺基酸同一性、並且具有PD-L1結合活性的多肽或其片段。以下提供了示例性PD-1胺基酸序列(SEQ ID NO：32)。
“PD-1核酸分子”意指編碼PD-1多肽的多核苷酸。示例性PD-1核酸分子序列以NCBI登錄號NM_005018提供。
術語“GITRL多肽”意指表明與SEQ ID NO：33具有至少約85%胺基酸同一性、並且具有GITR結合活性的多肽或其片段。術語“GITRL”係指全長GITRL和可溶性片段兩者(例如由蛋白水解生成的GITRL的細胞外結構域形式)，和GITRL的單體形式以及寡聚形式(例如三聚GITRL)。人GITRL的膜結合和可溶形式的胺基酸序列如下所示。
術語“TNF-α多肽”意指表明與NCBI登錄號NP_000585.2具有至少約85%胺基酸同一性的多肽或其片段。術語“TNF-α”係指全長TNF-α和可溶性片段兩者(例如由蛋白水解生成的TNF-α的細胞外結構域形式)，和TNF-α的單體形式以及寡聚形式(例如三聚TNF-α)。人TNF-α的膜結合和可溶形式的胺基酸序列如下所示。
如本文所使用的“OX40多肽”意指與NCBI登錄號NP_003318具有至少約85%胺基酸一致性的多肽或其片段。OX40係受體TNFR超家族中的在抗原活化的哺乳動物CD4+和CD8+T淋巴細胞的表面上表現的成員。OX40受體序列係本領域中已知的並且例如以GenBank登錄號：AAB33944或CAE11757提供。
術語“OX40L多肽”意指表明與NCBI登錄號NP_003317具有至少約85%胺基酸同一性、並且具有OX40結合活性的多肽或其片段。術語“OX40L”係指全長OX40L和可溶性片段兩者(例如由蛋白水解生成的OX40L的細胞外結構域形式)，和OX40L的單體形式以及寡聚形式(例如三聚OX40L)。人OX40L的膜結合和可溶形式的胺基酸序列如下所示。
術語“CD137L”意指表明與NCBI登錄號NP_001552.2具有至少約85%胺基酸同一性、並且具有CD137結合活性的多肽或其片段。術語“CD137L”係指全長CD137L和可溶性片段兩者(例如由蛋白水解生成的CD137L的細胞外結構域形式)，和CD137L的單體形式以及寡聚形式(例如三聚CD137L)。人CD137L的膜結合和可溶形式的胺基酸序列如下所示。
如在本揭露中所使用的術語“抗體”係指免疫球蛋白或其片段或衍生物，並且涵蓋包含抗原結合位點的任何多肽，無論它係在體外或在體內生產的。該術語包括但不限於：多株、單株、單特異性、多特異性、非特異性、人源化、單鏈、嵌合、合成、重組、雜合、突變、融合蛋白以及 接合的抗體。除非用術語“完整”另外修飾，如在“完整抗體”中，出於本揭露之目的，術語“抗體”還包括抗體片段如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和保留抗原結合功能(即特異性結合例如PD-1或PD-L1的能力)的其他抗體片段及其組合。典型地，此類片段將包含抗原結合結構域。此外，此類片段可以與其他組合以形成多抗原結合融合蛋白。
術語“抗原結合結構域”、“抗原結合片段”和“結合片段”係指包含負責抗體和抗原之間特異性結合的胺基酸的抗體分子的一部分。在抗原很大的情況下，抗原結合結構域可以僅結合到該抗原的一部分。負責與抗原結合結構域特異性相互作用的抗原分子的一部分被稱為“表位”或“抗原決定簇”。抗原結合結構域典型地包括抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)，然而，它不一定包括兩者。例如，所謂的Fd抗體片段僅由VH結構域組成，但是仍然保留完整抗體的一定抗原結合功能。
抗體的結合片段藉由重組DNA技術或藉由完整抗體的酶促或化學裂解來產生。結合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv以及單鏈抗體。除了“雙特異性”或“雙功能”抗體以外，抗體應理解為具有同一的結合位點。使用酶(木瓜酵素)來消化抗體的結果係兩個同一的抗原結合片段，又稱為“Fab”片段和“Fc”片段，它們不具有抗原結合活性但具有結晶的能力。用酶(胃蛋白酶)來消化抗體的結果係F(ab')2片段，其中該抗體分子的兩個臂保持連接並且包含兩個抗原結合位點。F(ab')2片段具有交聯抗原的能力。當本文使用時，“Fv”係指保留了抗原識別和抗原結合位點兩者的抗體的最小片段。當本文使用時，“Fab”係指包含輕鏈的恒定結構域和重鏈的CH1結構域的抗體的片段。
術語“mAb”係指單株抗體。本揭露的抗體包含但不限於：全天然抗體、雙特異性抗體、嵌合抗體、Fab、Fab'、單鏈V區片段(scFv)、融合多肽、非常規抗體及其組合。
在本揭露中，“包含(comprises、comprising)”、“含有(containing)”和“具有(having)”等可以具有美國專利法賦予它們的意義並且可以意指“包括(includes、including)”等；“基本上由......組成(consisting essentially of或consists essentially of)”同樣具有美國專利法賦予的意義並且該術語係開放性的，允許超出所敘述的存在，只要所敘述的基本或新穎特徵不被超過敘述的存在改變，但是排除先前技術實施方式。
如本文所使用的術語“確定”、“評估”、“測定”、“測量”和“檢測”係指定量和定性確定兩者，並且正因如此，術語“確定”本文可與“測定”、“測量”、等等互換使用。其中定量確定為目的時，使用短語“確定分析物以及類似物的量”。其中定性和/或定量確定為目的時，使用短語“確定分析物的水平”或“檢測”分析物。
如本文所使用的術語“Fc結構域”結構域係指抗體恒定區的一部分。傳統上，術語Fc結構域係指涵蓋抗體的配對CH2、CH3和鉸鏈區的蛋白酶(例如，木瓜酵素)裂解產物。在本揭露的上下文中，術語Fc結構域或Fc係指不管產生手段的任何多肽(或編碼這樣一種多肽的核酸)，其包括免疫球蛋白多肽的CH2、CH3和鉸鏈區的全部或一部分。
術語“融合多肽”或“融合蛋白”係指包含兩種或更多種不同多肽的多肽或非天然存在於相同多肽中的其活性片段。在不同的實施方式中，兩種或更多種不同多肽藉由肽鍵或肽接頭共價地可操作地連接(例如化學地連接或框內融合)在一起。例如，雙特異性融合蛋白可包括一個或 多個Fab和/或Fab'片段、Fc片段或區(例如，含或不含鉸鏈區的CH2和CH3)、和/或附接至一個或多個Fab和/或Fab'片段或Fc片段的融合蛋白。
在兩個或更多個核酸或多肽的上下文中，術語“同一”或百分比“同一性”係指當比較和比對(如有必要，引入缺口)以獲得最大對應性(不考慮任何保守胺基酸取代作為序列同一性的一部分)時相同或具有指定百分比的相同的核苷酸或胺基酸殘基的兩個或更多個序列或子序列。百分比同一性可以使用序列比較軟體或演算法或者藉由目測測量。本領域中已知有可用於獲得胺基酸或核苷酸序列的比對的不同演算法和軟體(參見例如Karlin等人，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.[美國國家科學院院刊]，87：2264-2268，如在Karlin等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.[美國國家科學院院刊]，90：5873-5877中的改進，並且併入NBLAST和XBLAST程式(Altschul等人，1991,Nucleic Acids Res.[核酸研究]，25：3389-3402)。在某些實施方式中，有缺口的BLAST可以如Altschul等人，1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25：3389-3402中所述的使用。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等人，1996,Methods in Enzymology[酶學方法]，266：460-480)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech[基因泰克公司]，南三藩市，加利福尼亞)或Megalign(DNASTAR)。
術語“分離的”係指基本上不含存在於其天然環境中的其他元素的分子。例如，分離的蛋白質基本上不含來自於細胞或其衍生的組織源的細胞材料或其他蛋白質。術語“分離的”也指製劑，其中分離的蛋白質係足夠純的而作為藥物組成物給予，或係至少70%-80%(w/w)純的，更較佳的是至少80%-90%(w/w)純的，甚至更較佳的是90%-95%純的；並且最較佳的是至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%(w/w)純的。
術語“參考”指的是比較的標準。
術語“特異性結合”係指一種試劑(例如，CD40L、GITRL、OX40L、或CD137L)識別並結合一種分子(例如分別地，CD40多肽、GITR多肽、OX40多肽、或CD137多肽)，但是其基本上不識別並結合樣品(例如生物樣品)中的其他分子。例如，特異性結合的兩個分子形成在生理條件下相對穩定的複合物。特異性結合的特徵在於高親和力和區別於非特異性結合的低等至中等容量，非特異性結合通常具有中等至高等容量的低親和力。
術語“受試者”係指哺乳動物，包括但不限於人或非人哺乳動物，如牛、馬、犬、羊或貓。
本文提供的範圍被理解為對該範圍內的所有值的簡寫。例如，1到50的範圍應當理解為包括來自下組的任何數字、數字組合或子範圍，該組由以下各項組成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
如本文所使用的術語“治療(treat、treating、treatment等)”係指減少和/或改善障礙和/或與其相關的症狀。將被理解的是，儘管不能排除，但是治療障礙或病症並不要求完全地消除該障礙、病症或與其相關的症狀。例如，如本文所考慮的，障礙的治療包括預防障礙症狀的惡化。
如本文所使用的術語“或”應理解為包括在內，除非明確說明或從上下文顯而易見與之相反。如本文所使用的術語“一種(a)”、“一個(an)”和“該(the)”被理解為單數的或複數的，除非明確說明或從上下文顯而易見與之相反。
此外，當在本文使用時，“和/或”應被理解為這兩個或更多個指定的特徵或組分每一者與或不與另一者的特定揭露。因此，術語“和/或”如本文在片語例如“A和/或B”中使用時，旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(單獨)、以及“B”(單獨)。同樣，術語“和/或”如在片語例如“A、B和/或C”中使用時，旨在涵蓋以下的實施方式中的每一者：A、B、和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；和A(單獨)；B(單獨)；和C(單獨)。
除非明確聲明或從上下文顯而易見，否則如本文所使用的術語“約(about)”被理解為在本領域的正常公差範圍內，例如，在平均數的2個標準差之內。“約”可以被理解為在聲明值的多於或少於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、或0.01%之內。除非另有說明，否則本文提供的所有數值均被考慮為由術語“約”隱含地修飾。
本文變量的任何定義中對化學基團清單的敘述包括將所述變量定義為任何單個基團或所列基團的任何組合。對本文變量或方面的實施方式的敘述包括作為任何單個實施方式或與任何其他實施方式或其部分任何組合的實施方式。
可以將本文提供的任何組成物或方法與本文提供的任何其他組成物和方法中的一種或多種進行組合。
綜述
本揭露提供了若干種融合蛋白(FP)，並且特別是雙特異性融合蛋白(BFP)，其係多價的並且被設計用於控制T細胞介導的抗癌免疫應答。在一個非排他性實施方式中，考慮的BFP包括第一結合結構域(BD1)、第二結合結構域(BD2)、和免疫球蛋白Fc區，包括例如CH2和CH3結構域(參 見圖1)。BD1和BD2可以各自分別包括抗原結合結構域、抗原結合片段、結合片段、受體激動劑、拮抗劑或配位基等中的一種或多種。在一個具體的實例中，BD1和BD2中的至少一個係Fab結構域、scFv、單結構域抗體、和抗體可變結構域。
在一些實施方式中，一些BFP的BD1、BD2、和Fc區可以藉由一個或多個接頭(例如肽接頭)連接在一起。以這種方式，在一些實施方式中，考慮的BFP可以是遺傳編碼的，表現可以在宿主細胞內表現和組裝的單鏈融合蛋白(scfp)。
在一些實施方式中，BD1和BD2結合結構域各自保留與其各自靶標(例如，表位、蛋白質、和/或受體)類似的結合能力和功能，作為其親本(天然的，未結合的)成分組分。在一個實施方式中，考慮的BFP的雙特異性結合能力允許單個BFP同時接合和/或結合單個細胞表面上(即，順式相互作用)或相鄰細胞的細胞表面上(即，反式相互作用)的兩個分子靶標。在一些實施方式中，考慮了可以分別或同時引起順式和反式相互作用的BFP。
如本文考慮的，不同的RFP構型係可能的，例如見於以下圖2和表1中。
在一個特定的實施方式中，考慮本文揭露的任何形式的BFP，這些BFP摻入至少一個結合結構域，所述至少一個結合結構域靶向任何TNF超家族成員，與靶向任何其他細胞表面蛋白的另一結合結構域配對。本文考慮的BFP結合結構域TNF超家族成員的另外的實例包括LIGHT、CD30L、CD27L、和TL1a，它們可以摻入BFP2或BFP3形式。
作用機制
在一些較佳的的實施方式中，本揭露的特徵在於BFP3形式的雙特異性融合蛋白，包括一個或多個N末端抗原結合亞單元、中央Fc多肽核心、和一個或多個C末端配位基蛋白。在一個實施方式中，一個或多個N末端抗原結合亞單元(BD2)可以是抗PD-1和/或抗PD-1L抗原結合亞單元，中央Fc多肽核心可以是IgG1或IgG4 Fc區多肽(CH2和CH3)，並且一個或多個C末端配位基蛋白(BD1)可包括，例如，GITRL、OX40L、CD40L、TNF-α、和/或CD137。
在一個實施方式中，圖1-4中示出的BFP3形式當存在於不同細胞上時(反式相互作用)允許共選擇BD1和BD2靶標，導致與骨髓細胞上的Fcγ受體連接的下游訊號傳導途徑的活化。使用MEDI7526(參見表1)作為實例，在CD40刺激的背景下，FcγRI接合可以比加成的NF-κB活化有更大的驅動。
在一些實施方式中，BD1與其靶標(例如，細胞受體)的結合可以觸發結合複合物的內化並開始訊號級聯(例如，促進T細胞活化和/或複製)或抑制訊號級聯(例如，去除抑制性阻斷)。例如，BD1結合和內化導致BD2及其靶標，例如PD1或PD-L1在細胞內內化。PD1/PD-L1的強制內 化觸發其降解，導致細胞表面上長時間PD1/PD-L1的不存在。這係藉由從細胞表面去除PD1/PDL1以促進T細胞介導的免疫應答來減弱PD1/PD-L1抑制功能的新穎方法。
在一個實施方式中，考慮的BFP係二聚化的單鏈融合蛋白骨架亞單元，並且例如包括經由二硫鍵連接的兩個同一的單鏈融合蛋白。每個單鏈融合蛋白的單獨組分可以經由肽接頭連接。考慮的肽接頭可以是允許所希望的雙特異性融合蛋白的功能形成的任何長度，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20或更多個胺基酸。在一個具體的實施方式中，考慮了在所考慮的融合蛋白的單獨組分之間具有9個胺基酸或更長的肽接頭。已經發現，考慮的雙特異性融合蛋白中9個或更多個胺基酸的肽接頭保持穩定性和/或不引起這種融合蛋白的聚集。事實上，已證明大範圍的接頭長度在本揭露的雙特異性融合蛋白中比其他地方所表明的具有良好耐受性。
已示出本揭露的單鏈雙特異性融合蛋白係穩定的並且展現出生物活性。如本文所述的，雙特異性融合蛋白穩定性和活性至少部分是由於本揭露的雙特異性融合蛋白中使用的接頭的長度。長度大於9個胺基酸的接頭不會出現任何聚集和/或穩定性的顯著問題。本揭露的雙特異性融合蛋白還提供單鏈Fc蛋白的其他特徵和優點。
BD1抗原結合結構域
考慮可用於控制T細胞介導的免疫應答的任何TNF-α家族成員用於本文。考慮的TNF-α家族成員的具體實例包括CD40L、GITRL、OX40L、TNF-α、和CD137L。已知TNF配位基家族的天然存在的可溶性細胞介素成員展示出它們作為同源三聚體的生物活性。然而，TNF配位基的三聚體複合物傾向於經由它們的單體的解離而變性，並且難以從重組單體單元製 備。為了防止同源三聚體解離成單體，TNF配位基的至少三個單體經由它們的C-末端和N-末端藉由肽接頭彼此共價連接，以形成“單鏈(sc)”分子。因此，整個分子(具有兩個肽接頭的TNF配位基家族成員的至少三個單體)由單個蛋白鏈組成，這樣使得不再能夠發生解離成單體。
此外，如在本揭露的單鏈融合蛋白中，將TNF配位基與Fc結構域融合可用於獲得二聚化三聚體。可溶性結構域的二聚化係經由二硫橋鍵組裝兩個Fc結構域完成的。細胞或鄰近細胞上單鏈TNF配位基的局部富集具有增加這些融合蛋白的生物活性的潛力。
BD2抗原結合結構域
選擇性結合PD-1和PD-L1並且抑制PD-1和PD-L1的結合或活化的抗原結合區，例如Fab片段可用於本揭露的BFP。Fab(抗原結合片段)片段由藉由恒定區之間的二硫鍵共價連接的VH-CH1和VL-CL結構域組成。為了克服Fv中非共價連接的VH和VL結構域在宿主細胞中共表現時解離的傾向，可構建一個所謂的單鏈(sc)Fv片段(scFv)。在scFv中，柔性和足夠長的多肽將VH的C-末端連結至VL的N-末端或將VL的C-末端連結至VH的N-末端。在一些實施方式中，本文考慮的接頭肽包括GGGGS(Gly4Ser)肽(SEQ ID NO：43)的多聚體，但是其他接頭也是本領域已知的並且可以在本文中使用。例如，可能的接頭係15-殘基(Gly4Ser)3肽(SEQ ID NO：34)。
本揭露的BD2抗原結合結構域(例如，對抗PD-1或抗PD-L1特異)可視需要包含抗體恒定區或其部分。例如，VL結構域可以具有在其C-末端附接的抗體輕鏈恒定結構域，包括人Cκ或Cλ鏈。類似地，基於VH結構域的特定的抗原結合結構域可以具有附接一個免疫球蛋白重鏈的全部或一部 分，該免疫球蛋白重鏈衍生自任何抗體同位素，例如IgG、IgA、IgE和IgM，和任何該同位素子類，其包括但不限於IgG1和IgG4。
熟悉該項技術者將認識到，本揭露的BFP的BD2抗原結合結構域可用於檢測、測量和抑制與PD-1和PD-L1有些不同的蛋白質。預期BD2抗原結合結構域可以保持結合的特異性，只要靶蛋白質包含與至少100個、80個、60個、40個、或20個連續胺基酸的任何序列(如本文所述)具有至少約60%、70%、80%、90%、95%、或更高同一性的序列。百分比同一性係藉由標準比對演算法來確定，這些標準比對演算法例如像Altshul等人((1990)J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]，215：403-410)描述的基本局部比對工具(BLAST)，Needleman等人((1970)J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]，48：444-453)的演算法，或Meyers等人((1988)Comput.Appl.Biosci.[電腦應用生物科學]，4：11-17)的演算法。
除了序列同源性分析，可以進行表位作圖(參見例如，Epitope Mapping Protocols[表位作圖實驗方案]，Morris編輯，Humana Press[胡瑪納出版社]，1996)和二級和三級結構分析，以鑒定由所揭露的BD2抗原結合結構域假定的具體3D結構和它們與抗原的複合物。此類方法包括但不限於：X射線晶體學(Engstom(1974)Biochem.Exp.Biol.[生物化學實驗生物學]，11：7-13)和本揭露抗體的虛擬表現形式的電腦建模(Fletterick等人(1986)Computer Graphics and Molecular Modeling[電腦圖形學和分子建模]，在Current Communications in Molecular Biology[分子生物學現代通訊]中，冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，紐約州(N.Y.))。
考慮的抗PD-L1抗原結合結構域可以來自或衍生自杜伐魯單抗(durvalumab)(MEDI4736)，一種示例性的抗PD-L1抗體，其對PD-L1 具有選擇性並阻斷PD-L1與PD-1和CD80受體的結合。杜伐魯單抗可以在體外解除PD-L1介導的對人T細胞活化的抑制，並且經由T細胞依賴性機制在異種移植物模型中抑制腫瘤生長。關於用於本文提供的方法中的度伐魯單抗(或其片段)的資訊可以發現於美國專利案號8,779,108和9,493,565，該專利的揭露藉由引用以其全文併入本文。
在一個特定方面中，用於本文的杜伐魯單抗的抗原結合片段包括重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含上文所示的卡巴特(Kabat)定義的CDR1、CDR2和CDR3序列，並且其中該輕鏈可變區包含上文所示的卡巴特定義的CDR1、CDR2和CDR3序列。熟悉該項技術者將能夠容易地鑒定熟悉該項技術者已知的Chothia定義的、Abm定義的或其他的CDR定義。在一個特定方面中，所使用的杜伐魯單抗的抗原結合片段包括如在美國專利案號8,779,108中所揭露的2.14H9OPT抗體的可變重鏈和可變輕鏈CDR序列。
考慮的抗PD-1抗原結合結構域可以來自或衍生自LO115，一種示例性的抗PD-1抗體，其對PD-1具有選擇性並阻斷PD-1與PD-L1和PD-L2受體的結合。
Fc區
在一些實施方式中，本揭露提供了具有IgG1或IgG4 Fc區多肽的雙特異性融合蛋白，其可具有至少一個胺基酸修飾。例如，胺基酸可以在選自228和235的一個或多個位置被取代，例如藉由卡巴特(Kabat)中闡述的EU索引編號的。例如，該Fc區可以是一個IgG4 Fc區，並且變體胺基酸係228P(引起“IgG4P”)、235E、以及235Y中的一個或多個，如藉由卡巴特中闡述的EU索引編號的。作為另一個實例，考慮具有變體胺基酸的IgG1 Fc區，該變體胺基酸可包括L234F/L235E/P331S中的一種或多種(在本文別處 稱為“IgG TM”)。本文揭露的所有IgG4分子，是否是標記的IgG4或IgG4P，都含有228P突變
在一個實施方式中，本文所用的片段可結晶(Fc)結構域係杜伐魯單抗的，其在IgG1重鏈的恒定結構域中含有三重突變，該三重突變減少與負責介導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)的補體組分C1q和Fcγ受體的結合。
接頭
本揭露的雙特異性融合蛋白中的亞單元可以藉由多肽接頭連接，其中每個接頭與至少兩個多肽或亞單元融合和/或以其他方式連接(例如，經由肽鍵)。雙特異性融合蛋白中的接頭的組合可以是同源的或異聚的(heteromeric)。在一些實施方式中，存在於本揭露的雙特異性融合蛋白中的所有肽接頭的胺基酸序列都是同一的。在其他實施方式中，存在於本揭露的雙特異性融合蛋白中的至少兩個肽接頭的胺基酸序列係不同的。接頭多肽應該具有適合以這樣一種方式連接兩個或更多個單體亞單元的長度，在該方式中它們相對於彼此採取正確的構象，這樣使得它們保留所希望的活性。將天然存在的以及人工的肽接頭用於將多肽連接進新穎的連接的融合多肽中在文獻中是熟知的。因此，融合兩個或更多個單體亞單元的接頭可以是天然接頭、人工接頭或其組合。
如本文所述的，已經發現，融合蛋白亞單元之間長度為9個胺基酸或更長的肽接頭保持穩定性和/或不引起此類融合蛋白的過度的聚集。因此，設想在一些實施方式中多肽接頭可以包括約9個至約20個胺基酸殘基、約9個至約15個胺基酸殘基、或約9個胺基酸殘基。選擇被包含在該多肽接頭中的胺基酸殘基應該展示出不顯著干擾本揭露的融合蛋白亞單元的活性或功能的特性。因此，多肽接頭應該大體上不展示出將與本揭露的特定融 合蛋白亞單元的活性或功能不一致的職責(charge)，或干擾內部折疊，或與一個或多個單體亞單元中的胺基酸殘基形成鍵或其他相互作用，這將嚴重地妨礙結合。
在不同的實施方式中，多肽接頭具有構象柔性。合適的柔性接頭包括，例如具有Gly和Ser殘基的組合的那些，其中Gly與Ser的比率1。在一些實施方式中，多肽接頭係固有非結構化的天然的或人工的多肽(參見例如，Schellenberger等人，Nature Biotechnol.[自然生物技術]27：1186-1190,2009；還參見Sickmeier等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]35：D786-93,2007)。
在某些具體的實施方式中，雙特異性融合蛋白亞單元之間的接頭可以是GGGGS的多聚體(SEQ ID NO：43)，例如GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：39)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：40)、或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：41)。在其他的實施方式中，考慮的接頭可以是GGGGSGGGS(SEQ ID NO：42)。
[具體實施方式]
在具體的實施方式中，本文揭露的雙特異性融合蛋白含有一對單鏈融合蛋白，每個單鏈融合蛋白從N末端到C末端包含抗PD-1或抗PD-L1Fab片段，該抗PD-1或抗PD-L1 Fab片段含有輕鏈可變區和重鏈可變區，與(b)IgG1或IgG4P Fc多肽共價連接，與(c)第一肽接頭共價連接，與第一TNF超家族配位基亞單元共價連接，與第二個肽接頭共價連接，與第二TNF超家族配位基亞單元共價連接，與第三肽接頭共價連接，與第三TNF超家族配位基亞單元共價連接。
衍生物
本揭露的多肽(例如，抗PD-1Fab、抗PD-L1 Fab、GITRL、OX40L、CD40L、TNF-α、或CD137L)可包括提供的保留特異性結合其靶標的能力的序列的變體。這些變體可以由熟練的技術人員藉由使用本領域中公知的技術從這些多肽的序列中衍生而來。例如，可以在FR和/或在抗PD-1或PD-L1 Fab片段的CDR中進行胺基酸取代、缺失、或添加。雖然FR的改變一般被設計來改進抗原結合結構域的穩定性及免疫原性，而CDR的改變典型地被設計來增加抗原結合結構域對它的靶標的親和力。FR的變體還包括天然存在的免疫球蛋白同種異型。這種親和力增加的變化可憑經驗藉由涉及改變CDR和測試抗原結合結構域對其靶標的親和力的常規技術來確定。例如，可以在所揭露的CDR中的任一個中製造保守的胺基酸取代。可以根據Antibody Engineering[抗體工程]，第2版，牛津大學出版社(Oxford University Press),Borrebaeck編輯，1995中所述的方法進行不同改變。這些改變包括但不限於由在序列內編碼功能上等效的胺基酸殘基的不同密碼子的取代改變的核苷酸序列，從而產生“緘默”的改變。例如，非極性胺基酸包括丙胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸以及蛋胺酸。極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺以及穀胺醯胺。帶正電荷的(鹼性)胺基酸包括精胺酸、賴胺酸以及組胺酸。帶負電荷的(酸性)胺基酸包括天冬胺酸和谷胺酸。
本揭露的多肽和/或抗體的衍生物和類似物可以藉由本領域中熟知的不同技術來生產，這些技術包括重組的和合成的方法(Maniatis(1990)Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子選殖，實驗室手冊]，第2版，冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，紐約州(N.Y.)，和Bodansky等人(1995)The Practice of Peptide Synthesis[肽合成的實踐]，第2版，施普林格出版社(Spring Verlag)，柏林，德國)。
在一個實施方式中，用於製造為本揭露VH結構域的胺基酸序列變體的VH結構域之方法包含如下步驟：在當前揭露的VH結構域的胺基酸序列中添加、缺失、取代、或插入一個或多個胺基酸，視需要將這樣提供的VH結構域與一個或多個VL結構域組合，並測試該VH結構域或VH/VL組合或特異性結合抗原的組合。可採用類似方法，其中將本文揭露的VL結構域的一個或多個序列變體與一個或多個VH結構域組合。
Stemmer(Nature[自然](1994)370：389-391)也揭露了類似改組或組合技術，描述了與β-內醯胺酶基因相關的技術但觀察到該方法可用於產生抗體。
在進一步的實施方式中，人們可以使用一個或多個選擇的VH和/或VL基因的隨機誘變產生攜帶衍生自本文所揭露的序列的一個或多個序列的新穎的VH或VL區。Gram等人(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.[美國國家科學院院刊](1992)89：3576-3580)描述了一個這種技術，易錯PCR。
可使用的另一個方法係將誘變引導至VH或VL基因的CDR。Barbas等人(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.[美國國家科學院院刊](1994)91：3809-3813)和Schier等人(J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌](1996)263：551-567)揭露了此類技術。
類似地，抗原結合結構域的一個、兩個、或所有三個CDR可以接合至VH或VL結構域的譜系中，然後針對對PD-1或PD-L1具有特異性的抗原結合片段來對這些結構域進行篩選。
本文有用的免疫球蛋白可變結構域的一部分可以包含大致上如本文闡述的CDR中的至少一個，以及視需要，來自如本文闡述的scFv片段的干預框架區。該部分可以包括FR1和FR4中的一個或兩個的至少約50%，該50%係FR1的C末端50%和FR4的N末端50%。可變結構域的實質性部分的N 末端或C末端的另外的殘基可以是通常不與天然存在的可變結構域區相關的那些殘基。例如，藉由重組DNA技術構建抗體可以導致由所引入的接頭編碼的N-或C末端殘基的引入，以便促進選殖或其他操縱步驟。其他操縱步驟包括引入接頭以將可變結構域連接至另外的蛋白質序列，這些蛋白質序列包括免疫球蛋白重鏈恒定區、其他可變結構域(例如在雙抗體產生中)、或蛋白質的標籤，如在下文更詳細地討論。
本文描述的本揭露的抗原結合結構域(例如，抗PD-1和/或抗PD-L1)可連接至另一功能性分子，例如另一種肽或蛋白質(白蛋白、另一種抗體等)。例如，這些抗原結合結構域可以藉由化學交聯或藉由重組方法連接。這些抗原結合結構域還可以按以下專利案中所列出的方式連接至多種非蛋白質聚合物例如，聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯中的一種：美國專利案號4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；或4,179,337。抗原結合結構域可以藉由共價軛合(conjugation)至聚合物來進行化學修飾，例如增加其循環半衰期。示例性聚合物和附接這些抗體的方法還在美國專利案號4,766,106；4,179,337；4,495,285以及4,609,546中示出。
所揭露的抗體片段還可以改變以具有與天然模式不同的糖基化模式。例如，一個或多個碳水化合物部分可以被刪除和/或一個或多個糖基化位點可以被添加。將糖基化位點添加至當前揭露的抗體片段可以藉由改變胺基酸序列以含有本領域中已知的糖基化位點共有序列來實現。在抗體片段上增加碳水化合物部分的數目的另一種手段係藉由使糖苷與抗體的胺基酸殘基進行化學或酶促偶聯。此類方法描述在WO 87/05330中以及在Aplin等人(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.[CRC生物化學關鍵評論]，22：259-306中。將任何碳水化合物部分從抗體去除可以藉由化學或酶促方法來實現，例如，如Hakimuddin等人(1987)Arch.Biochem.Biophys.[生物化學與生物 物理學集刊]，259：52；和Edge等人(1981)Anal.Biochem.[分析生物化學]，118：131，以及藉由Thotakura等人(1987)Meth.Enzymol.[酶學方法]，138：350中所述的。抗體片段也可以用可檢測或功能性標記來加標記。可檢測標記包括放射性標記，例如131I或99Tc，可使用常規化學來將它們附接至抗體片段。可檢測標記還包括酶標記，例如辣根(horseradish)過氧化物酶或鹼性磷酸酶。可檢測標記進一步包括化學部分，諸如生物素，該化學部分可以經由結合到特異性同源可檢測部分(例如標記的抗生物素蛋白)來檢測。
在本揭露的範圍內涵蓋CDR序列僅在非本質上與本文所闡述的抗原結合結構域不同的抗原結合結構域。典型地，一個胺基酸被具有類似電荷、疏水性或立體化學特徵的相關胺基酸取代。此類取代將在技術人員的普通技能之內。不像在CDR中，可以在FR中進行更多實質性的改變，而不對抗體的結合特性造成不利影響。對FR的改變包括但不限於人源化非人衍生的或工程化某些框架殘基，這些框架殘基對於抗原接觸或將結合位點穩定化是重要的，例如，改變恒定區的類或亞類，改變可能改變效應子功能(如Fc受體結合)的特定胺基酸殘基(例如，如在美國專利案號5,624,821和5,648,260和Lund等人(1991)J.Immun.[免疫學雜誌]147：2657-2662以及Morgan等人(1995)Immunology[免疫學]86：319-324中所述的)，或改變衍生恒定區的物種。
熟悉該項技術者將理解，以上所述的修飾不是全部詳盡的，可以應用於本文描述的蛋白亞單元，並且由於本揭露的傳授內容，許多其他的修改將對熟練的技術人員是可能的。
雙特異性融合蛋白的產生
除非另外指明，本揭露的實施採用很好地處在熟練的技術人員的見識範圍之內的分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的技術。此類技術在文獻中已被充分解釋，例如“Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子選殖：實驗室手冊]”，第二版(Sambrook,1989)；“Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成]”(Gait,1984)；“Animal Cell Culture[動物細胞培養]”(Freshney,1987)；“Methods in Enzymology[酶學方法]”“Handbook of Experimental Immunology[實驗免疫學手冊]”(Weir,1996)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells[用於哺乳動物細胞的基因轉移載體]”(Miller和Calos,1987)；“Current Protocols in Molecular Biology[當前分子生物學方法]”(Ausubel,1987)；“PCR：The Polymerase Chain Reaction[PCR：聚合酶鏈式反應]”，(Mullis,1994)；“Current Protocols in Immunology[免疫學現代實驗方案]”(Coligan,1991)。這些技術適用於本揭露的多肽的生產，並且按照這樣，可以被考慮用於製作和實施本揭露。對具體實施方式特別有用的技術將在實例中進行討論。
測定雙特異性融合蛋白的特性和活性
本揭露的雙特異性融合蛋白亞單元(分離的或作為多聚體的一部分)的穩定性可以藉由本領域熟知的技術(例如熱(Tm)和離液變性(例如用尿素或胍鹽處理)、蛋白酶處理(例如用嗜熱菌蛋白酶處理)或另一種本領域接受的方法來確定蛋白質穩定性)容易地測量。用於測量蛋白質穩定性的技術的全面綜述可以發現於例如“Current Protocols in Molecular Biology[分子生物學現代方案]”和“Current Protocols in Protein Science[蛋白質科學現代方案]”，藉由John Wiley and Sons.[約翰．威利父子出版公司]2007。
根據本揭露雙特異性融合蛋白的結合親和力和其他結合特性可以藉由本領域已知的多種體外測定方法(包括例如平衡方法(例如，酶聯免疫吸附測定(ELISA))或動力學(例如，BIACORE®分析)和其他方法，例如間接結合測定、競爭性結合測定、凝膠電泳和層析法(例如，凝膠過濾))確定。這些方法和其他方法可以利用所檢查的一種或多種組分上的標記，和/或採用多種檢測方法包括但不限於發色標記、螢光標記、發光標記或同位素標記。結合親和力和動力學的詳細描述可以發現於Paul,W.E.編輯，Fundamental Immunology[基礎免疫學]，第4版，利平科特-雷文出版社(Lippincott-Raven,Philadelphia)(1999)。
本文描述了用於確定雙特異性融合蛋白的功能或活性的另外的體外和體內方法。這些測定可用於確定一種或多種免疫應答(例如，T細胞功能和記憶、B細胞活化或增殖、樹突細胞成熟或活化、Th1細胞介素或趨化介素應答、單核細胞衍生的巨噬細胞M1/M2極化、抗原呈遞和/或腫瘤微環境的免疫抑制中的一種或多種)。在體內，用於測定抗癌或抗腫瘤活性的不同動物模型係本領域已知的，包括例如B16-F10腫瘤小鼠模型。另外，評估藥效學和藥物動力學特性的方法也是熟知的。
抗腫瘤療法
本揭露的特徵還在於包含雙特異性融合蛋白(例如上述)的用於治療癌症之組成物和方法。在各種實施方式中，雙特異性融合蛋白可以與其他抗癌藥物或加強免疫細胞對癌症應答的藥物組合給予。
本文進一步提供了用於治療癌症之方法，這些方法包括給予一種或多種雙特異性融合蛋白，例如圖1-4中示出的那些。如本文示出的，雙特異性融合蛋白的給予可導致例如小鼠腫瘤模型中腫瘤體積的減少。在某些方面中，給予患有實體瘤的患者雙特異性融合蛋白。
用包括雙特異性融合蛋白的癌症療法治療導致例如癌症的進展速率降低，腫瘤生長的阻滯或穩定，腫瘤縮小和/或腫瘤消退。在一些方面中，腫瘤生長的減少或阻滯可以是統計學上顯著的。可以藉由與基線處的患者腫瘤的生長、針對預期的腫瘤生長、針對基於大的患者群體的預期腫瘤生長或針對對照群體的腫瘤生長進行比較來測量腫瘤生長的減少。
在其他實施方式中，本揭露的方法提高了癌症存活率並延長了壽命。例如，本文揭露的數據不僅證明了BFP分子用於治療癌症的有效性，而且使用BFP(MEDI7526)導致比用其親本試劑(Durva+MEDI5083)的組合治療更低的毒性。因此，使用BFP分子進行癌症治療可以實現有效的具有較低的毒性的抗癌應答，並改進患者的整體健康。換言之，使用本文揭露的雙特異性融合蛋白可以提供單獨使用單一療法無法實現的治療結果。
對給予癌症療法的臨床應答可以使用臨床醫生已知的診斷技術來評估，這些診斷技術包括但不限於磁共振成像(MRI)掃描、x-射線照相成像、電腦斷層照相(CT)掃描、流動式細胞測量術或螢光流式細胞分選儀(FACS)分析、組織學、宏觀病理學、以及血液化學，包括但不限於可藉由ELISA、RIA和層析法可檢測到的改變。
給出以下的實例係為了給熟悉該項技術者提供如何準備和使用測定、篩選和本揭露的治療方法的一個完整揭露內容和說明，而不是旨在限定諸位發明人認為係自己的揭露內容之範圍。
實例
現在，參見下面的實例對本揭露進行描述。這些實例僅是說明性的，並且本揭露決不應被解釋為局限於這些實例，而是應當被解釋為涵蓋作為本文提供的教導的結果變得明顯的任何以及所有變體。
實例號1.特異性融合蛋白的產生
使用與經由肽接頭與Fab片段連接的Fc單體連接的三個配位基亞單元(主要對應於TNF同源結構域)的單鏈融合蛋白(scfp)構建體構建在以下實例中測試的雙特異性融合蛋白(參見圖1-4)。scfp二聚化形成BFP。以下描述了用於BFP的序列。
實例號2.OCTET結合測定
為了評價本文揭露的雙特異性結合分子的結合，使用配備有Ni-NTA生物感測器尖端和10X動力學緩衝液的Octet QK(ForteBio公司，門洛派克(Menlo Park)，加利福尼亞州)。對於該系列雙特異性結合蛋白，His標記的PD-L1-his係內部製備的，CD40-Fc蛋白購自翹神州生物技術有限公司(Sino-Biological)(北京，中國)並在實驗室中進行生物素化。所有結合測定均在25℃進行。
在分析之前，以1000rpm攪拌樣品板。在我們之前將1X動力學緩衝液應用於鏈黴親和素(Streptavidin)和Ni-NTA生物感測器尖端10min。該1X動力學緩衝液也用作基線確定的運行緩衝液以及抗原和雙特異性抗體的稀釋緩衝液。鏈黴親和素或Ni-NTA生物感測器尖端浸入20nM CD40-生物素(圖5A和5B)或his標記的PD-L1(圖5C和5D)中用於抗原捕獲5min並在動力學緩衝液中漂洗30秒。將抗原塗覆的生物感測器尖端各自浸入10μg/ml雙特異性抗體中5分鐘並漂洗，然後移入含有100nM PD-L1 Fc抗原(圖5A和5B)或100nM CD40-Fc(圖5C和5D)的孔的柱中持續5分鐘。在該測定中，當BFP分子已經使第一抗原(CD40或PD-L1)飽和時，注射第二抗原(PD-L1或CD40)，並且如所希望的，觀察到第二結合訊號。當抗原注射順序逆轉時，該觀察結果係可再現的，表明BFP分子可以同時結合兩個靶標。
實例號3.細胞表面抗原結合的評估
流動式細胞測量術用於評估藉由BFP的細胞表面抗原的結合。
抗PD-L1+CD40L FP BFP2和BFP3(MEDI7526；參見表1)、CD40L FP6(MEDI5083)、和抗PDL1(MEDI4736)均處於人IgG4同種型，使用Alexa Fluor 647單株抗體標記套組(kit)(賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher))與Alexa Fluor 647軛合。還按照相同的方案軛合IgG4同種型對照抗體。所有得到的軛合抗體具有類似的染料與抗體比率。在結合測定中，將Alexa 647軛合的抗體在FACS緩衝液(PBS加3%胎牛血清)中連續稀釋，得到40nM至19.532pM之間的終濃度，並與10,000 CD40轉染的HEK293細胞(圖6A)或Ramos人B細胞(圖6B)混合。CD40轉染的293和Ramos細胞均表現CD40但不表現PD-L1。在4℃孵育1小時後，將細胞離心並去除上清液中的游離抗體。洗滌具有結合抗體的細胞並藉由流動式細胞測量術進行。藉由細胞計數儀器檢測並記錄螢光訊號，並使用Flowjo®軟體確定靶細胞上Alexa 647的平均螢光強度。圖6A和6B的圖示出了BFP2和BFP3與親本MEDI5083具有對CD40類似的結合；然而抗PD-L1(MED4736)和同種型對照抗體不結合。
接下來，評估在PD-L1轉染的HEK293細胞和ES2人卵巢癌細胞系上與人PD-L1的結合。兩種細胞系均表現PD-L1但不表現CD40。將Alexa 647軛合的抗體在FACS緩衝液中稀釋，並與10,000個PD-L1轉染的HEK293細胞混合。在4℃孵育1小時後，將細胞離心並去除上清液中的游離抗體。洗滌具有結合抗體的細胞並藉由流動式細胞測量術進行。藉由細胞計數儀器檢測並記錄螢光訊號，並使用Flowjo®軟體確定靶細胞上Alexa 647的平均螢光強度。圖7A和7B的圖示出了BFP2和BFP3都與細胞表面PD-L1結合，儘管具有比具有IgG4或IgG1 TM同種型的MEDI4736更低的最大結合和更高的 EC50。如所希望的，CD40L FP和同種型對照抗體在該測定中不與PD-L1結合。
評估抗PD-L1+CD40L FP、BFP2和3與人PBMC的結合。由於在炎性條件下PBMC上CD40和PD-L1的表現增加，我們評估了關於合併的初試和IFN-γ刺激的PBMC的結合。在該研究中，將PBMC從健康供體分離並用高(100nM)或低(10nM)量的羧基螢光素二乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)標記。將具有100nM CFSE的PBMC無處理培養24小時，並在相同條件下培養用10nM CFSE標記的PBMC，但用1nM人IFN-γ刺激過夜以上調CD40和PD-L1表現。因此，可以基於不同水平的CFSE訊號區分有或無IFN-γ處理的細胞。所有具有高和低CFSE標記的PBMC在第二天混合，並用針對B細胞的抗CD19、針對T細胞的CD3、和針對單核細胞的CD14染色。與CD40L FP(MEDI5083)和抗PDL1(MEDI4736 IgG1 TM)相比，藉由流動式細胞測量術揭示抗PD-L1-CD40L FP BFP分子與PBMC亞組的結合。如圖8示出的，兩種形式的BFP蛋白都展現出類似的結合活性和效力。IFN-γ處理的單核細胞與大多數BFP分子結合，隨後是初試單核細胞和T和B細胞。這些結果還表明，在PBMC上，BFP分子具有與抗PDL1和CD40L FP(MEDI5083)類似的結合特徵曲線。
PD1-OX40L、PD1-OX40L 2WT和PD1-OX40L 1WT均處於人IgG4同種型，使用Alexa Fluor 647單株抗體標記套組(賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher))與Alexa Fluor 647軛合。使用以上提到的方案測試與Jurkat/OX40-GITR-FP2細胞(圖71A)和活化的人初級T細胞(圖72)的結合。
實例號4.抗PDL1-CD40L FP、BFP2和3具有刺激CD40途徑和阻斷PD1-PDL1相互作用的能力。
經由CD40活化觸發NF-κB活化途徑。
將HuCD40/HEK293/NF-κB細胞(殖株3)維持在DMEM(吉畢科公司(GIBCO))加10%熱滅活的FBS(HI-FBS；吉畢科公司(GIBCO))和1% Pen Strep(吉畢科公司(GIBCO))中。在第1天，收穫細胞並以5×105/mL重懸於具有2%的HIFBS的DMEM中。將每孔一百微升的細胞接種在BD Biocoat聚-D-賴胺酸96孔黑/透明微量滴定板(Cat # 356640)中。將細胞置於37℃培養箱中24小時。孵育後，從板中吸出培養基。將一百微升1X測試材料小心地添加至每個孔中，並注意使細胞的分離最小化。將細胞放回37℃培養箱中24小時。製備螢光素酶試劑(Bright-Glo®螢光素酶測定底物；普洛麥格公司(Promega))，使其平衡至室溫，並添加(100μL)至每個孔中。將細胞和試劑充分混合以確保完全細胞裂解，並立即在SpectraMax M5讀板儀上讀取。圖9證明BFP分子在多種細胞類型上活化NF-κB訊號，這些多種細胞類型包括CD40轉染的293細胞(A)、Ramos細胞(b)、和THP-1細胞(C)。
Ramos-Blue生物活性測定方案
將Ramos-Blue NF-κB/AP-1報道基因細胞(英傑公司(Invivogen))維持在IMDM GlutaMAX®(吉畢科公司(GIBCO))加10% HI-FBS(吉畢科公司(GIBCO))、1% Pen Strep(吉畢科公司(GIBCO))和Zeocin(100μg/mL；英傑公司(InvivoGen))培養基中。細胞係非粘附的，並且培養物以5×105個細胞/mL開始並保持低於3×106個細胞/mL。在實驗前一天，將細胞分裂成IMDM GlutaMAX加10% HI-FBS和pen/strep(無Zeocin)培養基。收穫細胞，調節至1×106個細胞/mL，並添加(180μL)至平底96孔板(康寧公司(Corning))的孔中。將無Zeocin培養基中的二十微升的10X測試材料添加至每個孔中，並將細胞置於37℃培養箱中24小時。製備 QUANTI-Blue試劑(溶解於100mL無菌水中的一個小袋；英傑公司(Invivogen))並以160μL/孔添加至平底96孔板中。將來自Ramos-Blue細胞(40μL)的上清液添加至含有QUANTI-Blue的孔中。將平板置於37℃培養箱中最多1小時，並在SpectraMax M5分光光度計上在655nm處讀數。
THP1-Blue生物活性測定方案
將THP1-blue NF-κB報道基因細胞(英傑公司(Invivogen))維持在RPMI1640(吉畢科公司(GIBCO))加10%HI-FBS(吉畢科公司(GIBCO))、1% Pen Strep(吉畢科公司(GIBCO))和殺稻瘟菌素(10μg/mL；英傑公司(Invivogen))培養基中。細胞係非粘附的，並且培養物以7×105個細胞/mL開始並保持低於2×106個細胞/mL。在實驗前一天，將細胞分裂成RPMI1640加10% HI-FBS和pen/strep(無殺稻瘟菌素)培養基。收穫細胞，調節至1×106個細胞/mL，並添加(180μL)至平底96孔板(康寧公司(Corning))的孔中。將無殺稻瘟菌素培養基中的二十微升的10倍測試材料(已連續稀釋)添加至每個孔中，並將細胞置於37℃培養箱中24小時。製備QUANTI-Blue試劑(溶解於100mL無菌水中的一個小袋；英傑公司(Invivogen))並以160μL/孔添加至平底96孔板中。將來自THP1-Blue細胞(40μL)的上清液添加至含有QUANTI-Blue的孔中。將平板置於37℃培養箱中6小時，並在SpectraMax M5分光光度計上在655nm處讀數。結果示出於圖9中。
實例號5. PD-L1介導的抑制的減弱
在該實例中，檢查抗PD-L1-CD40L FP BFP分子以確定它們在PD-1/PD-L1阻斷生物測定(普洛麥格公司(Promega))中是否在生物學上等效於抗PD-L1。首先，將一小瓶CHO PD-L1細胞解凍並重懸於14.5ml的具有10% FBS的Ham's F12培養基中。將細胞以100μL/孔添加至96孔白底測 定板中。將板在37℃培養箱中孵育過夜(16-20小時)。第二天將培養板從培養箱中取出，並小心地去除培養基。將四十(40)μL在測定緩衝液(含有1% FBS的RPMI1640)中的測試材料(2×)添加至板的每個孔中。接下來，將一小瓶Jurkat PD1效應細胞解凍並重懸於5.9mL的測定緩衝液中。然後將四十(40)μL的Jurkat PD1細胞添加至板的每個孔中。將板置於37℃培養箱中6小時。製備螢光素酶試劑(Bio-Glo®螢光素酶測定底物；普洛麥格公司(Promega))，使其平衡至室溫，並添加(80μL)至每個孔中。將板置於室溫下5min，隨後立即在SpectraMax® M5讀板儀上讀取。MEDI7526抑制的PD-L1功能，導致該測定中NFAT活性的劑量依賴性增加。MEDI7526的EC50與MEDI4736 IgG4分子係可比較的。圖10證明了抗PD-L1-CD40L FP BFP減弱了PD-L1介導的抑制功能。
實例號6. BFP共活化測定
在基於穩健的基於報道基因的THP-1單核細胞和Jurkat T細胞共活化測定中進一步評估BFP分子功能。在該測定中，用NF-κB-SEAP報道基因(英傑公司(Invivogen))轉染的THP-1細胞以每孔400,000接種並用IFN-γ刺激過夜以上調這些細胞上的CD40和PD-L1表現。IFN-γ刺激不會誘導THP-1細胞上的NF-κB活化。測定概念示意圖示出於圖11A中。
在測定前一天晚上，用抗人CD3抗體(生物傳奇公司(Biolegend))塗覆白色96孔板。在測定當天，洗滌THP-1細胞並與每孔100,000個用NFAT-螢光素酶報道基因(普洛麥格公司(Promega))轉染的Jurkat細胞混合，並添加連續稀釋的測試試劑。將測定板在37℃攪拌6小時。然後將細胞離心並將40μL的培養基從每個孔轉移至新96孔板的相應孔中並儲存在-80℃。
為了確定培養基中存在的SEAP活性，將具有冷凍細胞培養基的板在室溫解凍並在37℃與QUANTI-Blue溶液混合。孵育15分鐘後，用酶標儀 測量SEAP活性。為了測量NF-κB活性，將細胞與1X裂解試劑混合，並將細胞裂解物與80μL的Bio-Glo螢光素酶測定試劑(普洛麥格公司(Promega))混合。將板在環境溫度孵育5分鐘，並在板讀數器SpectraMax® M5中測量螢光強度。如圖11B示出的，抗PDL1-CD40L BFP分子在THP1細胞中活化NF-κB並增加Jurkat T細胞中的NFAT活性，證明BFP分子可以在混合的免疫細胞上進行多種功能。
實例號7. MEDI7526活化初級人類細胞並誘導細胞介素的產生。
在該研究中，檢查了MEDI7526在初級細胞中誘導細胞介素產生的能力。
葡萄球菌腸毒素B(SEB)測定方案
用於SEB測定方案以確定BFP分子對IL-2免疫應答的影響的試劑包括：白細胞錐(NHSBT代碼NC24；來自阿登布魯克斯醫院(Addenbrookes Hospital))；50ml Falcon試管(BD 352070)；菲可派克加(Ficoll-Paque PLUS)(GE醫療集團(GE Healthcare)17-1440-02)；抗CD3(殖株OKT3；1mg/ml；e生物科學公司(eBioscience)；目錄號：16-0037-85)；氯化銨溶液(幹細胞技術公司(Stemcell Technologies)07850)；葡萄球菌腸毒素B(SEB；Sigma(西格瑪公司)，S-4881)儲備溶液，1mg/mL，儲存於-20℃；培養基(均來自生命科技公司(Life Technologies))：具有GlutaMaxTM的RPMI1640(61870)，補充有10% v/v熱滅活的FCS(90005M)和100U/mL青黴素+100μg/mL鏈黴素(15140-122)；V型底板(格雷納生物公司(Greiner BioOne)651201)；96孔平底板(康寧科斯塔公司(Corning Costar)7107)。
用於IL-2 DELFIA ELISA的試劑包括：FLUONUNC Maxisorp ELISA板(能肯公司(Nunc)437958)；銪標記的鏈黴親和素，SA-Eu(珀金埃爾默(Perkin-Elmer)1244-360)；DELFIA®測定緩衝液(珀金埃爾默 (Perkin-Elmer)，#4002-0010)；DELFIA®增強溶液(珀金埃爾默(Perkin-Elmer)4001-0010)；在使用前在RT下；測定稀釋劑：DELFIA洗滌緩衝液(0.05% Tween-20，20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.2-7.4)，補充有0.1% BSA，經無菌過濾；奶粉(Marvel；第一食品公司(Premier Foods))；樣品稀釋劑(如上所述的RPMI1640+10% FCS+1%青黴素/鏈黴素)；PBS(賽默飛世爾公司(ThermoFisher)14190235)；PBS-吐溫(PBS中0.01% Tween-20)；人類IL-2 ELISA套組(Duoset DY202，R&D系統公司(R&D Systems))；具有自動板加載器(Biostack)的Biotek洗板器(EL406)。
一般測定方案
使用密度梯度離心(菲可派克加(Ficoll-Paque PLUS)；GE醫療集團(GE Healthcare))從人類血液白細胞錐(NHS血液與移植服務代碼NC24)分離PBMC，然後在氯化銨溶液(幹細胞技術公司(Stemcell Technologies))中裂解紅細胞。將抗人類CD3(PBS中0.5μg/mL的殖株OKT3；e生物科學公司(eBioscience))在平底96孔板(康寧科斯塔公司(Coming Costar)7107)中於37℃塗覆2小時。然後，每孔添加在培養基(補充有10% v/v熱滅活的牛血清和100U/100μg/ml鏈黴素/青黴素(分別地)的RPMI1640-GlutaMax，生命科技公司(Life Technologies))中的PBMC的2 x 105個細胞。藉由添加SEB終濃度1μg/mL進一步刺激PBMC，並將候選BFP分子連續稀釋添加至最終測試濃度。在37℃和5% CO2培養3天後，從細胞和根據製造商的說明書(R&D系統公司(R & D Systems))使用商業ELISA確定的IL-2分泌中去除上清液。
示出於圖12中的結果證明MEDI7526(BFP3)在SEB測定中誘導最高水平的IL-2產生，其中EC50為59.8pM。
實例號8. MEDI7526活化初級人類細胞並誘導細胞介素的產生。
在該研究中，檢查了MEDI3387和MEDI5771在初級細胞中誘導細胞介素產生的能力。
按照製造商推薦的方案，使用菲可派克加(Ficoll-Paque PLUS)(GE醫療集團(GE Healthcare)17-1440-02)從白細胞錐(由NHSBT，阿登布魯克斯醫院(Addenbrooke's Hospital)提供)製備PBMC。將PBMC重懸於培養基(具有glutamax[吉畢科公司(Gibco)]的RPMI1640，補充有10%熱滅活的FCS[生命科技公司(Life Technologies)90005M]和1%青黴素/鏈黴素)並轉移至之前塗覆抗人CD3抗體(藉由向每個孔中添加225μL的含有0.5μg/mL的OKT3[e生物科學公司(eBioscience)目錄號：16-0037-85]的PBS，並在使用前在37℃孵育2小時來進行塗覆)的96孔平底組織培養板(康寧科斯塔公司(Corning Costar)7107)中。反應的最終體積為每孔225μL，含有2E5個細胞，並且補充有葡萄球菌腸毒素B(濃度為0.1μg/mL)以及測試藥物或對照mAb。將反應在37℃，5% CO2孵育72小時，然後去除上清液，並隨後藉由ELISA測試IL-2的釋放。結果示出於圖13中。
實例號9. MEDI7526 MLR測定
使用MLR測定評估藉由MEDI7526對巨噬細胞中IFN-γ和IL-12產生的誘導。
一般測定方案：
培養單核細胞衍生的M1巨噬細胞：使用EasySepTM人CD14陽性選擇套組(STEMCELL)從一個供體分離單核細胞，並使用CellXVivo人M1巨噬細胞分化套組(R&D系統公司(R&D Systems))產生M1巨噬細胞。在該測定中，將4,000萬個單核細胞分成2個T75燒瓶。從每個燒瓶中去除一半培養基，並在第3天和第6天用補充有GM-CSF的新鮮培養基替代。在第6 天，使用StemProTM AccutaseTM細胞解離試劑(英傑公司(Invitrogen))收穫分化的巨噬細胞，以1500rpm離心細胞5分鐘。接下來，去除上清液，且細胞以0.125百萬/ml在完全RPMI 1640培養基中。接下來，將80μL/孔的巨噬細胞添加至96孔U型底板中，且每孔添加20μL的測試抗體(終濃度的10倍)。接下來，將來自另一供體(1百萬/mL)的100μL/孔的分離的總T細胞添加至96孔U型底板中。將板於37℃，在CO2培養箱中孵育5天。收穫上清液，並用人Th1/Th2 10-plex套組(Meso Scale Discovery)測量上清液中細胞介素的水平。
圖14示出了MEDI7526(BFP3)在3種巨噬細胞-T細胞MLR反應時誘導產生IFN-γ。
實例號10.混合的白細胞反應(MLR)測定方案(新鮮血液)
描述於實例號9中的基於MLR細胞的測定還用於提供應答於本文揭露的BFP分子的T細胞功能的體外相關性。
一般測定方案
從一個供體的PBMC和另一個供體的T細胞中分離單核細胞。將單核細胞和T細胞以1：1的比例懸浮在完全RPMI培養基中，並與測試試劑一起孵育。將板在37℃孵育5天。在最後一天，將板以300g離心5分鐘，並且收穫上清液。用人Th1/Th2 10-plex套組(Meso Scale Discovery)測量上清液中的細胞介素。
圖15示出了MEDI7526(BFP3)在4對單核細胞-T細胞MLR反應時誘導產生IFN-γ，表明MEDI7526可以增強T細胞介導的免疫應答。
實例號11.CMV回憶測定
巨細胞病毒(CMV)抗原回憶測定用於評價由本文所述的某些免疫治療分子誘導的潛在免疫應答。在CMV陽性供體中藉由CD8+ T細胞響應 於重組人CMV pp65蛋白(CMV pp65)的IFN-γ分泌的誘導被稱作免疫記憶回憶應答。某些癌症可以藉由這些受體的表現來增強這種抑制，導致對在治療上干擾這些免疫檢查點的興趣。對抗體組合，雙特異性試劑的使用和改變Fc組分類型具有潛在的益處。
在該實驗中，來自已知CMV陽性供體的HLA-A02型PBMC在BFP分子存在下暴露於HLA-A02限制的CMV pp65肽(495-503)。4天後，藉由MSD確定IFN-γ分泌。使用的通用試劑示出於表2中。
CMV回憶測定方案(阿斯塔特生物製品/醫學免疫公司(Astarte Biologics/MedImmune)雜合)：
解凍CMV陽性人PBMC，用XVIVO-15洗滌，計數，並在XVIVO-15中調節至4 x 10e6個細胞/mL。每mL細胞懸浮液添加兩微升的CMV pp65 HLA-A02肽並充分混合。接下來，將100μL的PBMC加肽添加到孔中(4 x 10e5個細胞/孔)。向每個孔中添加100μL抗體(2X)，並將板置於37℃培養箱中。在第4天，從每個孔收穫上清液(100μL)並在-30℃冷凍用於隨後的細胞介素測定(MSD)。
圖16證明與其他測試樣品相比，MEDI7526在CMV回憶測定中誘導更高水平的IFN-γ和IL-12產生。對於IFN-γ：BFP3的EC50為約104.3，CD40L FP6(MEDI5083)的EC50為359.4，CD40L+抗PD-L1的EC50為367.1。
圖73B示出了PD1-OX40L BFP在CMV回憶測定中誘導比PD1-OX40L 2WT BFP更高水平的IFN-γ、IL-12、TNFα、IL-1β和IL-6產生，表明在這個測定中殘餘的F180對OX40激動劑功能係關鍵的。
實例號12. BFP分子觸發PD1或PDL1的內化和降解
在該實例中，測試了BFP3誘導CD40和PD-L1內化並使膜PD-L1去穩定化的假設。
MEDI7526 BFP3與人CD40和PD-L1結合。假設BFP3可誘導CD40和PD-L1內化並隨後觸發PD-L1蛋白降解。為了能夠在MEDI7526治療後定量測量CD40和PD-L1的內化，篩選一組抗CD40和PD-L1抗體，並將抗CD40殖株5C3和抗PD-L1殖株29E.2A3鑒定為非競爭抗體。即，抗CD40殖株5C3不與MEDI7526競爭結合CD40，並且抗PD-L1殖株29E.2A3不與MEDI7526競爭結合PD-L1。在MEDI7526治療後，利用非競爭抗體評估CD40和PD-L1的表面表現。圖17描繪了用於檢測來自細胞表面的CD40和PD-L1內化的基於流動式細胞測量術的方法。
MDA-MB-231細胞
MDA-MB-231係人乳腺癌細胞，並組成型表現CD40和PD-L1。將MDA-MB-231細胞與滴定量的測試材料混合，並在37℃孵育1小時或96小時。孵育後，藉由洗滌去除游離抗體，並用來自BioLegend的螢光染料軛合的抗CD40(殖株5C3)和抗PD-L1(殖株號29E.2A3)染色細胞。然後，對具有結合抗體的細胞進行流動式細胞測量術分析。使用Flowjo®計算幾何平均螢光強度並繪製在圖中。結果見於圖18中。
接下來，將MDA-MB-231細胞以0.5百萬孔/孔接種在具有RPMI1640培養基的6孔板中，並用指定條件處理。24小時後，將細胞在300μL/孔的具有蛋白酶抑制劑的RIPA緩衝液(密理博公司(Millipore))中裂解，隨 後在4℃旋轉孵育1hr。藉由BCA分析(皮爾斯公司(Pierce))確定裂解物中蛋白質的量，並使用來自細胞訊號傳導公司(Cell Signaling)的抗PD-L1殖株(E1L3N)藉由西方墨點法檢測PD-L1蛋白的存在(參見圖19)。
見於圖18和19中的結果證明MEDI7526(BFP3)治療不僅下調MDA-MB-231細胞上的CD40和PD-L1表面表現，而且還降低MDA-MB-231細胞中的總PD-L1蛋白含量。
THP-1細胞
THP-1細胞係人白血病單核細胞系。THP-1細胞表現非常低量的CD40和PD-L1，但在IFN-γ治療後上調CD40和PD-L1的表現。在示出於圖20的測定示意圖中，用IFN-γ刺激THP-1細胞24小時，並與滴定量的測試材料混合，並在37℃孵育0.5至3小時。孵育後，藉由洗滌去除游離抗體，並用螢光染料軛合的抗CD40(殖株5C3)和抗PD-L1(殖株號29E.2A3)染色細胞。然後，對具有結合抗體的細胞進行流動式細胞測量術分析。藉由Flowjo®計算幾何平均螢光強度並繪製在圖21中，證明MEDI7526在0.5-3小時之間誘導來自THP1細胞的細胞表面的CD40和PD-L1的快速下調。
IFN-γ-處理的THP-1細胞
根據在圖22中的研究示意圖，用IFN-γ刺激THP-1細胞24小時，並與滴定量的測試材料混合，並在37℃孵育1小時。孵育後，藉由洗滌去除游離抗體，並用螢光染料軛合的抗CD40(殖株5C3)和抗PD-L1(殖株號29E.2A3)染色細胞。然後，對具有結合抗體的細胞進行流動式細胞測量術分析。藉由Flowjo®計算幾何平均螢光強度(gMFI)並繪製在示出於圖23中的圖中，證明CD40表現在處理後24小時快速恢復，但PD-L1細胞表面表現保持低，表明內化的CD40和PD-L1的單獨恢復途徑。
實例號13.人初級細胞測定
在該研究中，使用EasySepTM人CD14陽性選擇套組(幹細胞公司(STEMCELL))從健康供體PBMC分離單核細胞，並根據製造商的方案使用CellXVivo人單核細胞衍生的DC分化套組(R & D，Cat # CDK004)分化成樹突細胞。將細胞重懸於包括1百萬個細胞/mL的GM-CSF和IL-4的人DC分化培養基中，並將總共2,000萬個細胞接種於T75燒瓶中。在第3天和第5天用新鮮的人DC分化培養基替代一半培養基。在第7天，收穫未成熟的DC並用增加劑量的測試材料刺激。在刺激24小時後藉由流動式細胞測量術確定CD40、CD86和PD-L1的表面表現(參見圖24)。在圖25中，藉由免疫墨點測量用10nM的測試材料刺激24小時的DC中CD40和PD-L1的蛋白質水平。這些結果顯示MEDI7526(BFP3)導致人初級細胞上PD-L1的下調。
圖24證明MEDI7526與其親本CD40L FP一樣，在低劑量下誘導CD40上調，但在高劑量下下調CD40。它還上調單核細胞衍生的樹突狀細胞上的CD86表現。但是在MEDI7526處理的細胞上PD-L1蛋白保持低水平。
PBMC測定
在該研究中，來自健康供體的PBMC用IFN-γ刺激並與測試試劑反應1小時。用流動式細胞測量術研究CD40、CD86、和PD-L1的表面表現水平。圖26證明MEDI7526誘導來自單核細胞的細胞表面的CD40和PD-L1的下調。這些結果顯示MEDI7526(BFP3)導致新鮮分離的人初級細胞上PD-L1的下調。
實例號14.鼠替代物MEDI7526對RENCA細胞中PD-L1的功效。
Renca係一種鼠腎腎腺癌細胞系，其組成型表現CD40和PD-L1。在該研究中，Renca細胞在第一天在6孔板中以0.5百萬/孔培養。在培養的第二天，將Renca細胞用指定試劑以10nM的濃度處理24hr。在培養的第三天， 用蛋白酶抑制劑在RIPA緩衝液中裂解處理的Renca細胞，並藉由西方墨點法分析細胞裂解物。用於西方墨點法的抗體列於下表3中。
圖27證明MEDI7526的鼠替代物(mBFP3)誘導了Renca細胞中PD-L1的降解。該結果證明，MEDI7526的鼠替代物在鼠細胞上PD-L1和CD40表現的下調中具有類似的功能。
實例號15. BFP分子和FC受體的接合可以增強骨髓細胞的活化。
在該實例中，檢查了藉由BFP分子的骨髓細胞的活化。
將表現PD-L1的ES2細胞以30,000個細胞/孔接種在平底96孔板中，並用IFN-γ刺激THP1細胞24小時。在第2天，混合等量的ES2細胞和THP-1細胞，並添加滴定的測試材料(BPF1、BPF2、MEDI7526、FP6(MEDI5083)和MEDI4736；參見表1)。將板在37℃孵育24hr。根據小袋上的說明製備QUANTI-BlueTM。接下來，將160μL的QUANTI-Blue溶液與平底96孔板的每孔40μL上清液混合。將板在37℃孵育3小時，並使用分光光度計在655nm確定SEAP水平。
圖28顯示藉由腫瘤細胞上的PD-L1的交聯可以增強MEDI7526 BFP3活性。BFP形式的取向似乎影響功能，因為觀察到BFP2形式沒有增強 活性。基於2-細胞系統的該結果證明，藉由PD-L1在腫瘤細胞上的交聯可以加強MEDI7526在THP-1細胞中刺激NF-κB活性的功能。
實例號16. FCγRI在PD-L1交聯中的作用。
在該實例中，檢查了高親和力Fc受體(FcγRI)在PD-L1交聯中的作用。將Biocoat 96孔板(康寧公司(Corning))用50μL/孔的PD-L1-His(2μg/ml，R&D系統公司(R&D systems))在4℃塗覆過夜。在第2天，將THP1細胞(0.2百萬/孔)添加至板中。添加可溶的IgG1(內部製備)，其與IgG4競爭結合Fcγ受體。其他抑制劑包括針對FcγRI/FcγRII的阻斷抗體(生物傳奇公司(Biolegend))和針對Syk和Btk(Sellechem公司)的抑制劑1小時，隨後用測試材料(3nM)刺激24小時。在第3天，將板以1500rpm離心5min。將四十(40)μL細胞培養上清液與160μL新鮮製備的QUANTI-BlueTM試劑(英傑公司(Invivogen))混合，隨後在37℃孵育1小時。藉由SpectraMax® M5分光光度計在655nm確定SEAP水平。圖29證明由PD-L1交聯介導的增強訊號係藉由FcrRI並且可被可溶的IgG以及Syk和Btk抑制劑抑制。然而，BFP3功能不需要Fc接合(參見圖61和62)。這些結果表明BFP3介導的增加活性係藉由FcγRI接合。
實例號17. MEDI7526的鼠替代物在體內證明了穩健的抗腫瘤活性，並且其在小鼠腫瘤模型中可耐受
為了研究MEDI7526在小鼠體內的作用，構建了MEDI7526的鼠替代物mMEDI7526。與MEDI7625平行，mMEDI7526從N-到C末端包含F(ab)2抗鼠PD-L1、具有D265A突變的鼠IgG1 Fc、和經由肽接頭連接的3x鼠CD40L亞單元的兩個單鏈融合蛋白。
首先在C57Bl/6雌性小鼠中測試MEDI7526的鼠替代物(mMEDI7526)以研究其安全性曲線(圖30A和30B)。初試小鼠接受單 次靜脈內(iv；圖30A)或皮下(sc；圖30B)治療，其中mCD40L為10mg/kg或mMEDI7526為16mg/kg的等效莫耳濃度。未處理組的小鼠用作對照。在治療前和治療後每天監測體重，並將其轉換為個體小鼠的基線體重百分比(參見圖31)。與對照相比，mCD40L治療(經靜脈內或sc)導致體重減輕。相比之下，16mg/kg的mMEDI7526治療沒有引起體重的顯著損失。
在單獨的實驗中，向C57Bl/6雌性小鼠植入B16F10腫瘤細胞，並選擇腫瘤大小>100mm3的小鼠用於以下研究。選擇的小鼠接受mCD40L(10mg/kg)和mMEDI7526(16mg/kg)(如圖30C和30D示出的)，或高劑量mMEDI7526(25或35mg/kg，分別為圖30E和30F)的單次經靜脈內或經皮下治療。在治療前後每天監測體重，並計算基線體重的百分比，並在治療組與未治療組之間進行比較。結果證明，mCD40L的治療導致治療後更嚴重的體重減輕，並且表明在初試或荷瘤小鼠中mMEDI7526比mMEDI5083更可耐受。
接下來，在針對B16F10鼠腫瘤模型的多劑量研究中評估mMEDI7526的安全性曲線。在第1天給小鼠植入B16F10腫瘤，並且在第11天將腫瘤大小>100mm3的小鼠隨機化，隨後在第11、13、19和21天進行治療，如圖31所示。在嚴重壓力下考慮體重減輕超過20%的小鼠並從研究中去除。在第13天第2次給藥後即刻，mCD40L組中的2只小鼠和CD40L+抗PDL1組中的4只小鼠具有>20%的體重減輕。相比之下，在第二次給藥後，給藥mMEDI7526的小鼠均未顯示>20%的體重減輕。這些數據進一步表明mMEDI7526比單獨的mCD40L或與抗PDL1組合更可耐受。
接下來在B16F10同系小鼠模型中測試mMEDI7526。如圖31中所述設置模型。與PBS對照相比，劑量範圍為從20至35mg/kg的mMEDI7526降低了B16-F10小鼠模型中的腫瘤體積和/或延緩的腫瘤生長(圖32)。25mg/kg 劑量的mMEDI7526具有最強的腫瘤生長抑制：在研究結束時，接受25mg/kg治療的70%小鼠腫瘤大小小於500mm3。因此，mMEDI7526在低應答性腫瘤模型中展示出顯著的抗腫瘤活性。
劑量優化。在B16F10模型中，如圖33示出的，優化mMEDI7526的給藥方案。將mMEDI7526以25mg/kg在植入B16F10腫瘤細胞後第10天給藥一次，或在第10天和第14天，或第10天和第17天給藥兩次。單個劑量mMEDI7526 CD40L-FP的治療顯著降低腫瘤體積和/或延遲腫瘤生長。然而，兩種劑量比單個劑量具有更好的抗腫瘤活性(第10天和第14天或第10天和第17天)。另外地，用mMEDI7526處理的小鼠沒有顯著的體重減輕或其他可觀察到的作用。因此，mMEDI7526的降低的給藥頻率可以保持顯著的抗腫瘤活性並減少主要毒性。
體內T細胞活化。在B16F10小鼠模型中評估mMEDI7526對T細胞活化的影響。在植入B16F10腫瘤細胞後第10天以25mg/kg給藥mMEDI7526，並在mMEDI7526治療後第2天和第4天回收脾T細胞。如圖34示出的，mMEDI7526的治療導致CD4+和CD8+T細胞上的早期活化標誌物CD69的上調。此外，在第4天，效應記憶CD8+ T細胞(CD44高CD62L低)和效應CD8+ T細胞(KLRG1+)的百分比顯著增加。此外，效應CD8+ T細胞(KLRG1+)的百分比不僅在脾中增加，而且在肝和腫瘤中也增加(圖35)。總之，這些數據表明mMEDI7526誘導荷瘤小鼠中CD4+和CD8+細胞的穩健的活化。
血清細胞介素曲線分析。在mMEDI7526和mCD40L治療後監測血清細胞介素曲線的變化。將初試小鼠給藥10mg/kg的mCD40L(mMEDI5083，其為鼠源化MEDI5083)或16mg/kg的mMEDI7526，並如圖36所示在治療後的多個時間點收集血液。從全血中分離血清，並進行MSD 多重plex分析(U-PLEX TH1/TH2組合)用於檢測細胞介素，包括IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-13、KC/GRO、和TNF-α。與mCD40L相比，mMEDI7526誘導類似水平的IFN-γ和IL-12，但顯著更低的TNF-α和IL-6(圖37)。在對B16F10小鼠的單獨研究中，劑量在16至35mg/kg之間的mMEDI7526誘導了較少的IL-6和TNF-α，但相當水平的IFN-γ和IL-12。因此，mMEDI7526治療誘導抗腫瘤細胞介素，但限制了導致全身毒性的細胞介素的產生。
MEDI7526治療與化學療法有效結合。在單獨研究中，評估了MEDI7526單獨或與化學療法氟尿嘧啶(5FU)組合治療CT26鼠腫瘤的效果。在小鼠中皮下植入總共50萬個CT26腫瘤細胞，並監測腫瘤約10天，直至測量它們約100mm3，此時基於它們腫瘤的體積將小鼠隨機化為治療組。第二天，用25或50mg/kg劑量的5FU或經腹膜PBS對照，隨後用25或35mg/kg mMEDI7526經腹膜開始治療，此後每週一次，持續3周。每週兩次測量腫瘤體積和體重直至研究結束，並且結果示出於圖65中。用25和50mg/kg的5FU治療不能充分抑制CT26腫瘤生長，且單獨的MEDI7526只能抑制小鼠的亞組而不是所有小鼠的腫瘤生長。5FU和MEDI7526的組合比單個治療在更多小鼠中導致腫瘤生長抑制。5FU 50mg/kg加MEDI7526 35mg/kg治療具有最佳效果，並且導致該組中所有小鼠中腫瘤生長的抑制。該結果表明，與化學療法的組合可以進一步增強藉由MEDI7526介導的抗腫瘤活性。
MEDI7526具有治療肝腫瘤的潛力。進一步評估MEDI7526的靶器官。在生物分佈研究中，將B16F10腫瘤細胞植入小鼠中，隨後注射Zr-89標記的抗體(同種型對照以及MEDI5083和7526的鼠替代物)，如圖66A所示。藉由PETCT檢測標記的抗體的分佈。與同種型對照抗體相比，MEDI5083和MEDI7526均在肝和脾中累積。進一步證實Kupffer細胞，一種表現CD40 和PD-L1的肝巨噬細胞(圖66B)。這些結果表明肝中的Kupffer細胞係MEDI5083和MEDI7526的靶細胞。
以上結果導致了關於MEDI7526和MEDI5083是否可以治療小鼠肝腫瘤的進一步調查。在該實驗中，用螢光素酶基因轉染CT26腫瘤細胞，並將五十萬轉染的CT26-Luc細胞直接植入小鼠肝中。小鼠接受CT26細胞並允許從手術中恢復，並在腫瘤植入後第3、10和17天給藥同種型對照抗體、MEDI5083、抗PDL1、MEDI5083加抗PDL1或MEDI7526。所有測試試劑均以21.9mg/kg進行給藥，除了MEDI7625以35mg/kg的莫耳當量給藥。在第21天，處死小鼠，並回收肝臟以測量螢光素酶活性，這係肝中腫瘤負荷的指示物。僅MEDI7526治療有效地將腫瘤負荷降低至無腫瘤小鼠的水平(圖67)，表明MEDI7526具有治療肝癌的潛力。
此外，如藉由流動式細胞測量術分析所確定的，MEDI7526治療與第14天CD8 T細胞數量增加和第21天抗原特異性CD8 T細胞中更多活化表型相關(圖68)。
在CT26肝腫瘤模型中評估測試試劑的安全性曲線(圖69)。記錄了小鼠的體重顯著減輕、嚴重壓力的指征和死亡。在第1次給藥後第2天，mMEDI5083組和mMEDI5083加抗PDL1組的所有小鼠體重減輕約10%。相比之下，給藥mMEDI7526的小鼠均未在相同時間點顯示>5%的體重減輕(圖69A)。此外，在3次給藥後發現所有接受mMEDI5083加抗PDL1治療的小鼠死亡(圖69B)。總之，這些數據進一步表明mMEDI7526比單獨的mMEDI5083或與抗PDL1組合更可耐受。
實例號18.NF-KB的OX40L活化
將用OX40蛋白轉染的Jurkat NF-κB-Luc報道基因T淋巴細胞維持在RPMI1640(吉畢科公司(GIBCO))加10% HI-FBS(吉畢科公司(GIBCO)) 和1% Pen Strep(吉畢科公司(GIBCO))中。在實驗當天，收穫細胞，調節至2×106個細胞/mL，並以每孔90μL的體積添加至U型底96孔板(康寧公司(Corning))中。將在完全RPMI1640中製備的十(10)μL的測試試劑(10×)添加每個孔中，並將細胞置於37℃培養箱中4小時。製備螢光素酶試劑(Steady-Glo®螢光素酶測定底物；普洛麥格公司(Promega))，使其平衡至室溫，並添加(100μL)至每個孔中。將板置於室溫下5min，隨後立即在SpectraMax® M5讀板儀上讀取。圖38症明抗PD1-OX40L BFP在用OX40轉染的Jurkat細胞中活化NF-κB途徑。
在單獨研究中，針對NF-κB活性，測定工程化以表現具有OX40胞外域和GITR胞內結構域的人OX40-GITR融合蛋白(Jurkat/OX40-GITR-FP2)的Jurkat NF-κB-Luc報道基因細胞系，如之前段落中示出的。圖71C證明PD1/OX40L(OX40L的所有亞單元具有野生型蛋白質序列)誘導穩健的NF-κB活化，然而，PD1/OX40L 1WT和PD1/OX40L 2WT均未能活化Jurkat報道基因細胞中的NF-κB。這些數據證實，OX40上的所有六個F180殘基對於OX40下游訊號傳導的活化係關鍵的，並且表明PD1/OX40L 1WT和2WT具有最小的OX40介導的T細胞活化功能。
實例號19.抗PD-L1-OX40L BFP的小鼠研究
產生鼠OX40配位基IgG1融合蛋白(mOX40L FP)，該蛋白結合小鼠OX40並觸發OX40訊號傳導，並用作MEDI6383人OX40配位基IgG4P融合蛋白的小鼠OX40激動劑替代物。參見美國專利案號9,718,870。殖株80係針對小鼠PD-L1的大鼠嵌合小鼠IgG1 D265A抗體。mOX40L FP和殖株80的抗腫瘤活性作為單一療法或作為組合療法在源自MCA205的荷瘤小鼠(小鼠同系肉瘤細胞系)中和在CT26(小鼠結腸腺癌細胞系)中進行評估。
在第1天，每組十隻C57BL/6或Balb/c小鼠分別用MCA205(左圖)細胞或CT26(右圖)細胞經皮下接種。將對照物品(鹽水)和測試物品抗PD-L1殖株80 mAb(10mg/kg)、mOX40L FP(9.8mg/kg)、或10mg/kg抗PD-L1 mAb和9.8mg/kg mOX40L FP的組合針對MCA205，在第12、15、18、和22天經腹膜給予，並針對CT26在第4、7、11、和14天經腹膜給予。隨時間的個體腫瘤體積示出於在圖39中的圖中。IP=經腹膜；SC=皮下。
與殖株80組合給予mOX40L FP比給予對照物品或單獨的試劑導致更大的抗腫瘤活性(圖39)。因此，OX40激動劑和PDL1拮抗劑療法在臨床前模型中提供補充的抗腫瘤益處。
如與不結合PD-L1的雙特異性分子相比，由PDL1結合部分組成的雙特異性分子可增加PD-L1+腫瘤中的保留時間。為了測試這個假設，在小鼠中進行了體內生物分佈研究。
將雙特異性分子與螯合劑(ITC-DTPA，Macrocyclis，達拉斯，德克薩斯州)軛合以實現111銦放射性標記(Brom等人，2012)，目標係約600MBq/mg的特異性活性。藉由脫鹽柱(PD-10 EconoPac，伯樂公司(BioRad))純化後，放射性標記分子的放射化學純度(RCP)藉由暫態薄層層析驗證，以確保標籤功效，其中RCP>95%，且在室溫穩定性可達4小時。
對於生物分佈研究，將雌性裸鼠(Envigo)經皮下接種U87-MG癌細胞(在0.1mL中1 x 107個細胞)，並隨機化成平均腫瘤體積為0.2cm3的不同的治療組。所有隨機化小鼠靜脈內注射單個劑量的放射性標記分子(20μg/0.2Mbq/kg體重)。然後在放射性標記給藥後1小時、1天、和4天人道地處死亞組的動物。為了產生生物分佈圖，收集器官/組織(即血液、肌肉、肺、肝、脾、腎、腫瘤、尾巴)，稱重，並使用γ計數器(Wizard，珀金埃爾默公司(PerkinElmer))測量放射活性水平以計算注射劑量百分 比(%ID)和每克組織的%ID。生物分佈圖闡明了每克組織校正的注射劑量的平均百分比(±SEM)，並比較了注射後1小時、1天、和4天所示組織中放射性標記的MEDI5615和對照的攝取。每組n=5，除了對於“第4天BFP3”每組n=6。星號闡明使用雙尾t檢驗的顯著差異(p<0.05)。
如藉由抗PD-L1特異性免疫組織化學確定的，U87MG腫瘤表現高水平的PD-L1(圖40A)，並且用於生物分佈研究(圖40B)。將亞治療量的放射性標記的雙特異性分子注射到攜帶U87MG腫瘤的小鼠中；一個靶向PD-L1和OX40作為IgG4P BFP2分子(MEDI5615；1X Fc結構域)，一個靶向PD-L1和OX40作為IgG1 BFP3分子(1X Fc結構域)，並且一個係不與PD-L1或OX40(R347-OX40L F180 BFP2)結合的對照物品。1小時後首先在血液中檢測到雙特異性分子並迅速清除，這樣使得1天後血液中很少至沒有檢測到放射性標記。MEDI5615和對照物品也快速分佈到肝和脾而獨立於靶標結合，並且在第4天保持在這些組織中(圖40C)。相反，如與對照物品相比，MEDI5615滲透並保留在腫瘤中，同時兩種分子都從血液中清除。
PD-L1/OX40L BFP3分子證明與MEDI5615類似的保持在腫瘤中的能力(圖41)，表明腫瘤保留獨立於Fc結構域和分子形式。如與對照物品相比，在MEDI5615和PDL1/OX40L BFP3分子之間在第1天和第4天觀察到的腫瘤更新差異表明腫瘤保留係由與PD-L1結合的分子介導的。
實例號20.抗PD-L1-OX40L BFP的活性
MEDI5615(PD-L1/OX40L BFP2雙特異性分子)藉由人OX40活化訊號傳導的能力在一組2-細胞報道基因生物活性測定中，使用遺傳工程化以表現人OX40的NF-κB-螢光素酶T-細胞報道基因系進行評估(圖42)。PD-L1介導的藥物交聯藉由表現細胞表面PD-L1的MDA-MB231細胞發生。藉由工程化以表現Fcγ受體IIa(CD32A)的HEK293細胞發生Fcγ受體介導的 藥物交聯。T-細胞活化被測量為響應於初級人T-細胞活化下游的NF-κB訊號傳導途徑的刺激的增加的螢光素酶活性。NF-κB訊號傳導發生在OX40訊號傳導的下游，並且據報導與T細胞活化的其他測量例如增殖和細胞介素釋放相關。測量可溶的MEDI5615連同與MDA-MB231細胞或HEK293細胞孵育的MEDI5615的生物活性，這些MDA-MB231細胞表現細胞表面PD-L1，這些HEK293細胞工程化以表現個體Fcγ受體。
在使用前，將OX40 Jurkat報告細胞在組織培養孵育箱中以0.5-1.5 x 106/mL的密度在完全RPMI培養基中培養。將細胞在生物測定前一天以106個細胞/mL的密度傳代。收集OX40 Jurkat報道基因細胞、MDA-MB231細胞、和CD32A HEK細胞並沈澱。將雙特異性分子在完全RPMI中連續稀釋3倍。將OX40報道基因細胞加呈遞細胞以每孔100,000個細胞添加至96孔板中。如上所述，將雙特異性分子添加至完全RPMI培養基中的細胞中，至以1μg/mL開始並稀釋的終濃度。在16-24小時孵育時間後，將100μL重構的Steady-Glo®螢光素酶測定溶液(普洛麥格公司，麥迪森，威斯康辛州)添加至每個孔並混合以裂解細胞，且然後孵育以平衡螢光素酶訊號。將Steady-Glo/樣品裂解物(150μL)從各孔轉移至96孔白壁測定板，以使用珀金埃爾默EnvisionTM發光讀取器進行檢測和發光讀取。用於Windows的GraphPad Prism(GraphPad軟體公司(GraphPad Software)，聖地牙哥，加利福尼亞州)用於繪製雙特異性分子的濃度(x軸係蛋白質濃度的log10)相對於發光RLU(y軸)。
如見於圖43，如藉由NF-κB訊號傳導所測量的，MEDI5615在表現Fcγ受體(表現CD32A的HEK293細胞)和PD-L1(MDA-MB231細胞)的細胞存在下，在表現人OX40的Jurkat T細胞中活化OX40訊號傳導途徑，其中 EC50值分別為52pM和18pM。在表現能夠交聯MEDI5615的PD-L1或Fcγ受體的細胞的不存在下，測量了最小的報道基因細胞系活性。
接下來，在人T細胞共培養測定中測試MEDI5615克服天然CD4+CD25+ Treg(nTreg)細胞對效應CD4+CD25- T細胞增殖的抑制功能和減少IL-10從nTreg釋放的能力。
人CD4+效應和Treg細胞使用人Treg細胞分離套組按照製造商的說明(生命技術公司(Life Technologies)，佩斯利，英國)從PBMC中分離。該過程涉及藉由抗體標記非CD4+細胞陰性選擇總CD4+細胞，並然後藉由使用基於磁珠的耗竭去除抗體陽性細胞。Treg細胞藉由標記抗CD25從效應CD4+細胞中分離，接著係使用磁珠的陽性選擇，這些磁珠隨後從分離的細胞中去除。
使用CellTraceTM CFSE細胞增殖套組(生命科技公司(Life Technologies)，佩斯利，英國)用CFSE標記效應CD4+CD25- T細胞。將效應T細胞和Treg細胞在塗覆有抗小鼠CD3 mAb的96孔板的孔中和在可溶性抗小鼠CD28抗體存在下在37℃以1：1或1：2的比例共培養4天，這些可溶的抗小鼠CD28抗體與對照和測試物品混合。在佈雷菲德菌素A存在下用PMA加伊屋諾黴素再刺激細胞另外的4小時，固定，並使用胞內細胞介素染色方法藉由流動式細胞測量術針對IL-10產生進行測試。藉由流動式細胞測量術評估分裂的效應CD4+ T細胞的百分比和在測定結束時產生IL-10的Treg細胞百分比。
測定分裂的效應T細胞(CFSE低)的百分比；非活的(eFluor陽性)細胞和調節性T細胞(CFSE陰性)被區分，並從分析中排除。在排除非活的細胞和效應T細胞(CD25陰性)後評估產生IL10的Treg細胞的百分比。
在用抗CD3和抗CD28培養後，在Treg細胞的不存在下的效應T細胞分裂(圖44，頂部)。添加測試物品後，進入細胞週期的效應T細胞的百分比沒有增加。在1：2效應物與Treg比例的Treg存在下，如與對照物品(即未處理的，NIP228 IgG4P和抗PD-L1 IgG4P)相比，由OX40激動劑(即scOX40L 2xG4S(SEQ ID NO：35)IgG4P、MEDI5615、和抗PD-L1 IgG4P+scOX40L 2xG4S(SEQ ID NO：35)IgG4P)組成的測試物品統計上增加了分裂的效應T細胞的百分比。在具有1：1效應物與Treg比例的培養物中未觀察到效應T細胞分裂百分比的增加。
如與對照物品相比，由OX40激動劑組成的測試物品顯著降低了與效應T細胞共培養物中產生IL-10的Treg的百分比(圖44，底部)。這些結果表明MEDI5615與OX40激動劑的功能類似，以克服Treg細胞的抑制活性和IL-10產生。
接下來，評估了在超抗原，葡萄球菌腸毒素B(SEB)存在下基於PD-L1和OX40的雙特異性分子共刺激人PBMC的能力。將抗人CD3(殖株SK7)抗體預塗覆於96孔板的孔中。從健康供體分離人PBMC，用抗CD3，SEB(25ng/mL)培養72小時，並測試所示的測試物品和培養物上清液的IL-2(圖45A-B)。如藉由電化學發光ELISA確定的，BiS2和BiS3 OX40/PD-L1雙特異性抗體(圖45A；還參見美國專利申請案號15/588,271)和MEDI5615(圖45B)誘導人PBMC以濃度依賴性方式產生IL-2。雙特異性分子產生的IL-2的量大於人PBMC培養物產生的IL-2量，這些人PBMC培養物含有OX40抗體(抗OX40 IgG4P)、PD-L1抗體(抗PD-L1 IgG4P)、OX40和PDL1抗體組合、單獨或組合的對照雙特異性融合蛋白(PDL1-OX40 F180A BFP2，R347-OX40L BFP2)、和陰性對照物品(NIP228 IgG4P；R347-OX40L F180A BFP2)。
接下來，進行基於細胞的平衡結合測定以測量MEDI5615(PD-L1/OX40L BFP2)與工程化CHO細胞的細胞表面上表現的人和食蟹猴OX40和PD-L1結合的表觀親和力。
將測試物品在19個3倍稀釋液中系列稀釋至CHO細胞，該CHO細胞工程化以表現人或食蟹猴OX40、PD-L1或OX40和PD-L1兩者。將細胞和測試物品(n=3)在4℃孵育1小時，用FACS緩衝液(PBS+2%熱滅活的新生小牛血清)洗滌三次，與AlexaFluor®647標記的山羊抗人IgG二級抗體和碘化丙啶(PI)孵育，用FACS緩衝液洗滌，並在流動式細胞測量術上分析。在螢光補償後，活(PI陰性)，單細胞被門控並且確定二級抗體的平均螢光強度(MFI)以報告每個測試物品的結合水平。繪製測試物品結合的MFI相對於融合蛋白濃度(M)以產生結合曲線，從中確定表觀KD和受體佔有值。參見圖46A-F。
MEDI5615與各種CHO細胞相互作用的平均平衡解離常數(KD)報告於下表4中。
KD=平衡結合解離常數；CI=置信區間；ND=未測定
為了確定與細胞結合的測試物品的表觀KD，使用圖46A-F中的數據採用一個位點的非線性回歸(曲線擬合)方程(特異性結合)。結果揭示，MEDI5615與表現細胞表面人OX40的CHO細胞相互作用的平均平衡解離常數(KD)為180pM，與表現細胞表面人PD-L1的CHO細胞相互作用的KD為88pM，且與表現人OX40和人PD-L1的CHO細胞相互作用的KD為270pM。MEDI5615與表現細胞表面食蟹猴OX40的CHO細胞相互作用的KD為56pM，與表現細胞表面食蟹猴PD-L1的CHO細胞相互作用的KD為110pM，與表現食蟹猴OX40和食蟹猴PD-L1的CHO細胞相互作用的KD為99pM。使用能夠僅結合一種抗原OX40或PDL1的對照BFP2分子獲得了類似的結果。
表5中報導了MEDI5615與各種CHO細胞相互作用在平衡時20%、50%、和90%的人OX40受體佔有率。
EC=有效濃度；ND=未測定
使用GraphPad Prism軟體從非線性回歸分析使用圖46A-F中表示的數據的4-參數擬合S形劑量-應答曲線計算ECx值。
為了確定20%、50%、和90%的受體被測試物品佔有的濃度，首先使用方程X=對數[X]轉化濃度值(M)，隨後使用圖板棱柱(GraphPad Prism) 軟體從S形劑量應答(可變斜率)結合曲線對f=20、f=50、和f=90確定EC任何值(ECf)。ECf係給出了底部和頂部漸近線之間方式的應答百分比的測試物品的濃度，並表示20%(f=20)、50%(f=50)、和90%(f=90)受體佔有率，其中計算曲線的頂部表示100%的受體佔有率。
在工程化的CHO細胞上達到平衡時達到20%、50%、或90%人OX40受體佔有率所需的MEDI5615濃度分別計算為45pM、180pM和1600pM。另外，在工程化的CHO細胞上達到平衡時達到20%、50%、或90%食蟹猴OX40受體佔有率所需的MEDI5615濃度分別計算為14pM、56pM和500pM。
在工程化的CHO細胞上達到平衡時達到20%、50%、或90%人PD-L1佔有率所需的MEDI5615濃度分別計算為22pM、88pM和790pM。另外，在工程化的CHO細胞上達到平衡時達到20%、50%、或90%食蟹猴PD-L1佔有率所需的MEDI5615濃度分別計算為27pM、110pM和950pM。
在工程化的CHO細胞上達到平衡時達到20%、50%、或90%人OX40和PD-L1佔有率所需的MEDI5615濃度分別計算為67pM、270pM和2,400pM。另外，在工程化的CHO細胞上達到平衡時達到20%、50%、或90%食蟹猴OX40和PD-L1佔有率所需的MEDI5615濃度分別計算為25pM、99pM和890pM。
因此，MEDI5615可以結合單獨或一起表現細胞表面人和食蟹猴OX40和PDL1的細胞。
實例號21. PD-1蛋白在活化的人PBMC中的下調。
在該研究中，評估了BFP在活化的人PBMC中下調PD-1蛋白的能力。
刺激和西方墨點法方案：將新鮮分離的人PBMC以1百萬個細胞/mL重懸於含有1μg/mL抗CD3(殖株HIT3a，生物傳奇公司(Biolegend))和 抗CD28(殖株CD28.2，生物傳奇公司(Biolegend))的完全RPMI1640培養基中(參見圖47)。刺激3天後，收集細胞，洗滌，並以1百萬/mL重懸於新鮮的完全RPMI1640培養基中。將總共2mL細胞添加至6孔板的每個孔中。用10nM的測試材料刺激細胞24小時。在具有蛋白酶抑制劑的RIPA緩衝液中裂解細胞，並藉由免疫墨點分析全細胞裂解物。用於西方墨點法的抗體列於表6中。
結果示出於圖47、48和74中。示出了抗PD1-OX40L BFP觸發活化的人PBMC中PD1蛋白的降解(圖47)，並且示出了抗PD1-GITRL BFP(MEDI3387)觸發活化的人PBMC中PD1蛋白的降解(圖48)。我們發現與同種型對照抗體相比，PD1/OX40L 2WT和1WT也誘導顯著的PD1降解(圖74)。因此，誘導PD1蛋白內化和降解係由OX40內化驅動的，但可以獨立於OX40活化。
實例號22. NF-KB的GITRL活化
該測定利用Jurkat NF-κB Luc FL hGITR殖株29細胞系，其中藉由GITR配位基的GITR受體的接合誘導NFAT啟動子驅動的螢光素酶活性。
將用GITR蛋白轉染的Jurkat-Blue NF-κB/Luc FL hGITR殖株29報道基因T淋巴細胞維持在RPMI-1640加GlutamaxTM(英傑公司(Invitrogen))加10% HI-FBS(英傑公司(Invitrogen))，1% Pen/Strep(英傑公司(Invitrogen))培養基中。收穫細胞，調節至1 x 106個細胞/mL，並添加(在50μL中)至平底96孔板的孔中(5 x 104個細胞/孔；Falcon)。向每個孔中添加五十微升的2X測試試劑。Steady-Glo®(普洛麥格公司(Promega))緩衝液在室溫解凍，然後在黑暗中在測量當天使用。孵育4小時40分鐘後，允許板平衡至室溫20分鐘，然後將100μL室溫重構的Steady-Glo®試劑添加至96孔板中的每個孔中，並在測量之前在板振盪器中孵育>10分鐘。使用在Envision讀板器(珀金埃爾默)上的優化的超靈敏LUM 96(opti)0.1秒讀數測量發光讀數。
圖49證明抗PD1-GITRL BFP(MEDI3387和MEDI5771)在用GITR轉染的Jurkat細胞中活化NF-κB途徑。
實例號23. PD-1/GITRL雙特異性並行結合BIO-HGITR和HPD-1的OCTET測試。
該實驗的目的是測試PD1/GITRL雙特異性融合蛋白使用OCTET生物層干涉法同時結合huPD-1和huGITRL(GITR配位基)以確定相互作用的能力。
在此方案中使用的材料在下表7中概述。
生物素化的rhGITR/Fc與鏈黴親和素感測器結合，隨後關聯IO雙特異性構建體。在短暫的解離階段後，然後測試構建體同時結合rhPD-1/Fc的能力。
使用Octet RED384系統和Octet數據分析軟體版本9(頗爾生命科學公司(Pall)ForteBio)藉由生物層干涉法(BLI)評估雙特異性融合蛋白的並行結合。首先在測定緩衝液(達爾伯克PBS中的1% BSA，0.02% Tween 20)中平衡高精確度鏈黴親和素(SAX)浸入和讀數生物感測器10分鐘。在捕獲生物素化的重組人GITR/Fc(689-GR-100，R&D系統公司(R&D Systems))3分鐘之前，在測定緩衝液中建立基線1分鐘。在經由GITRL結構域捕獲雙特異性融合蛋白5分鐘之前，在測定緩衝液中建立第二基線30秒。在測定緩衝液中進行解離/基線1分鐘，然後藉由雙特異性融合蛋白的抗體組分捕獲重組人PD-1/Fc(1086-PD-050，R&D系統公司(R&D Systems))5分鐘。結果示出於圖50中。
實例號24. NFAT的活化中PD-1活性
該測定利用CHO K1 OKT3-CD14(低)hB7H1(高)cl 2細胞作為抗原呈遞細胞，並利用Jurkat NFAT Luc2 PD1殖株3L-B9細胞作為抗CD3活化的報道基因細胞系。藉由PD-1阻斷抗體的PD-1對PD-L1相互作用的抑制導致NFAT啟動子驅動的螢光素酶表現的活化。
將用PD-1和CHO K1 OKT3-CD14(低)hB7H1(高)cl 2細胞轉染的Jurkat NFAT Luc2 PD1殖株3L-B9報道基因T淋巴細胞維持在RPMI-1640加Glutamax(英傑公司(Invitrogen))加10% HI-FBS中(英傑公司(Invitrogen))，非必需胺基酸(英傑公司(Invitrogen))培養基中。收穫細胞，調節至1 x 106個細胞/mL，並添加(在50μL中)至平底96孔板的孔中(5 x 104個細胞/孔；Falcon)。向每個孔中添加五十微升的2X測試試 劑。Steady-Glo®(普洛麥格公司(Promega))緩衝液在室溫解凍，然後在黑暗中在測量當天使用。孵育4小時40分鐘後，允許板平衡至室溫20分鐘，然後將100μL室溫重構的Steady-Glo®試劑添加至96孔板中的每個孔中，並在測量之前在板振盪器中孵育>10分鐘。使用在Envision讀板器(珀金埃爾默)上的優化的超靈敏LUM 96(opti)0.1秒讀數測量發光讀數。
圖51證明抗PD1-GITRL BFP(MEDI3387和MEDI5771)在用PD-1轉染的Jurkat細胞中活化NF-κB途徑。這些數據與來自上述實例8的數據一致證明MEDI3387和MEDI5771 BFP證明與人PD-1和GITR並行結合。
實例號25.抗PD-1_IGG_GITRL體內測定
小鼠和腫瘤模型：8周至10周齡的BALB/c或C57BL/6雌性小鼠獲自查理斯河實驗室(英國)(Charles River UKLtd.)或哈蘭實驗室公司(Harlan Laboratories Inc)。將CT26(ATCC)或B16F10細胞在PBS中的100mL懸浮液以5 x 106個細胞/mL或5 x 104個細胞/mL的細胞密度經皮下注射到每只動物的右側腹。將B16F10細胞系植入50% PBS和50%生長因子減少的和不含酚紅的Matrigel®(康寧公司(Corning))中。在植入前將細胞系培養至有限的傳代，並週期性地篩選以確認支原體的不存在。經由STR圖譜分析(IDEXX生物研究(IDEXX Bioresearch))進一步驗證細胞，並篩選一組小鼠病毒(查理斯河實驗室(Charles River))。
基於腫瘤體積將可測量的腫瘤隨機化成各自的組。每個腫瘤的長度(mm)和寬度(mm)用電子卡尺每週測量3次。基於公式[長度(mm)x寬度(mm)2]/2計算腫瘤體積(mm3)。如果不存在可測量的腫瘤或持續的腫瘤生長抑制，使得在研究結束時體積小於200mm3，則將腫瘤生長應答分類為應答。
進行粉末計算以確定體內研究的組大小。小鼠經腹膜給藥mGITRL-FP、抗程式性細胞死亡蛋白-1 rIgG2a(PD-1，殖株RMP1-14，BioXCell公司)、或抗小鼠-PD1/GITRL雙特異性mAb。在腫瘤細胞接種後第6天開始或當腫瘤達到200mm3的體積時，取決於研究，給藥小鼠不同的濃度。結果示出於圖52中。
實例號26.抗PD-1_IGG_GITRL體內測定
藥物動力學和藥效學(PK/PD)研究
食蟹猴被考慮係藥理學相關的非臨床物種，用於測試PD-1/GITRL雙特異性融合蛋白的功能活性。在食蟹猴的非GLP(良好實驗室實踐)研究中評估PD-1/GITRL雙特異性融合蛋白的藥物動力學(PK)和藥效學。在劑量範圍為5mg/kg至50mg/kg的單次靜脈內(IV)給藥後，在食蟹猴(n=5；雄性)中評價PK和PD(Ki67陽性CD4+和CD8+總記憶T細胞百分比)。在給藥前和給藥後第1、3、8、11、15、18、22和29天收集血液樣品，藉由流動式細胞測量術樣品採集當天進行分析。Ki67結果顯示CD4+和CD8+總記憶T細胞(Ki67)的劑量依賴性增加(圖53A-B)。
在第8、15、22和29天，在給藥後0.5、6、24、48和96小時也收集血液樣品用於PK評估。總之，PD-1/GITRL雙特異性融合蛋白導致C最大和AUC0-inf的大約成比例增加，表明在該劑量範圍內的線性藥物動力學(圖54)，具有1.12至2.19天的短半衰期(參見表8)。
這些值表示為平均值(標準差)。AUClast=濃度時間曲線(一直到最後一次可測量的濃度)下的面積；AUCINF=濃度時間曲線(一直到無窮時間)下的面積；C最大=最大觀察濃度；CL：系統清除率；T1/2=半衰期；Vss：分佈的末期體積。
MEDI3387，平均C最大值為111和1200mg/L，並且5和50mg/kg劑量的平均AUC0-inf值分別為125和1050mg天/L。劑量歸一化的AUC值對於兩個劑量組大約類似。對於5和50mg/kg劑量水平，平均AUC0-inf/劑量分別為24.9和20.9。MEDI5771，平均C最大值為77.1和730mg/L，並且5和50mg/kg劑量的平均AUC0-inf值分別為108和800mg天/L。劑量歸一化的AUC值對於兩個劑量組大約類似。對於5和50mg/kg劑量水平，平均AUC0-inf/劑量分別為21.5和16.0。
實例號27.抗PD-1_IGG_GITRL BFPS在初級人T細胞再活化測定中增強T細胞效應功能
Cytostim T細胞再活化測定的示意圖示出於圖55A中。
按照製造商推薦的方案，使用菲可派克加(Ficoll-Paque PLUS)(GE醫療集團(GE Healthcare)17-1440-02)從白細胞錐(由NHSBT，阿登布魯克斯醫院(Addenbrooke's Hospital)提供)製備PBMC。根據製造商推薦的方案，使用T細胞富集套組(幹細胞技術公司(Stemcell)目錄號：19051)藉由來自供體PBMC的陰性選擇分離T細胞。然後將T細胞以1E6個細胞/mL的濃度重懸於T細胞培養基(含有補充有5%人AB血清[西格瑪公司 (Sigma)]和1%青黴素/鏈黴素的GlutamaxTM[吉畢科公司(Gibco)]的RPMI1640)中，並在之前塗覆有抗人CD3抗體(殖株OKT3，e生物科學公司(Ebioscience)目錄號：16-0037-85)的6孔組織培養板(康寧科斯塔公司(Costar)，目錄號：3506)中在37℃，5% CO2刺激96小時。為了塗覆6孔板，向每個孔中添加1mL含有0.2μg的OKT3的PBS，並在4℃孵育過夜。在使用之前用PBS洗滌板兩次。
然後洗滌T細胞並在新鮮T細胞培養基中在37℃，5% CO2不刺激孵育另外24小時。隨後使用EasySepTM人CD3陽性選擇套組II(Stemcell，17851)根據製造商推薦的方案，將這些“休息的”T細胞以1：4的比例與之前已經耗竭T細胞的自體PBMC混合。將得到的細胞混合物以四百分之一的濃度等分到補充有人Cytostim(美天旎生物技術公司(Miltenyi Biotec)，130-092-173)的T細胞培養基中的96孔U型底組織培養板(康寧科斯塔公司(Costar)8797BC)上，與測試藥物或對照mAb一起。每個反應的總體積為200μL並含有5E5細胞。將反應在37℃，5% CO2孵育72小時，然後去除上清液，並隨後藉由ELISA測試INF-y的釋放。
結果示出於圖55B-C中。MEDI3387和MEDI5771比單特異性(PD-1和GITRL)分子組合的效力高>4x，並因此闡明了由於BFP形式而產生的意想不到的協同效應。上述體外數據(圖55D-E)證明MEDI3387和MEDI5771與GITRL(MEDI1873)/Durva(MEDI4736)或MEDI1873/aPD-1 mAb(LO115)的組合的生物等效性。體內數據證明了MEDI1873/aPD-1 mAb組合的生物等效性。
實例號28.體內GITR的螢光生物分佈
在第0天，將年齡為6/8 wk的雌性SCID小鼠經皮下注射人肺腫瘤細胞系NCI-H358(5e5細胞/小鼠)。在第25天發生單次靜脈內給予螢光(IRDye 800CW)標記的抗體(10mg/kg，劑量體積為100μL/25g)，此時腫瘤大小大約200-300mm3。在體內注射前兩周，根據製造商的方案，用IRDye 800CW標記所有三種抗體。將每個治療組的五隻小鼠麻醉並在給藥後1小時、24小時、和96小時使用IVIS光譜成像。為螢光染料選擇最佳波長設置，並使用PerkinElmer圖像分析軟體確定腫瘤和肝區的輻射效率值。結果證明MEDI3387、MEDI5771和MEDI1873的遞送生物分佈圖之間沒有顯著差異(圖56)。
實例號29.抗PD-L1-TNF-αBFP觸發在T24腫瘤細胞表面上的PD-L1蛋白的下調。
T24係人膀胱移行癌細胞系，該細胞系組成型表現TNF-α受體和PD-L1二者。在該研究中，將T24細胞與10nM濃度的測試材料混合，並在37℃孵育24hr。孵育後，藉由洗滌去除游離抗體，用Qifikit(安捷倫公司(Agilent))定量細胞表面上PD-L1蛋白的量。簡言之，將處理後的T24細胞與未軛合的抗PD-L1(殖株29E.2A3)在冰上反應30分鐘，隨後與FITC軛合的F(ab)2山羊抗小鼠IgG另外反應30分鐘。記錄FITC訊號的平均螢光強度，並根據製造商的說明計算T24細胞上每個細胞的PD-L1抗原的量。
用CellTiter-Glo®細胞活力套組(普洛麥格公司(Promega))評估對細胞活力的影響。在該研究中，10,000/孔T24細胞在如上所述處理的不透明壁多孔板中培養，並且在孵育後，將T24細胞與稀釋的CellTiter-Glo®試劑混合。將內容物在定軌振盪器上混合2分鐘以誘導細胞裂解，並將板在室溫孵育10分鐘以穩定發光訊號。在SpectraMax M5讀板器上記錄發光。圖57證明抗PD-L1-TNF-α BFP觸發T24腫瘤細胞中PD-L1蛋白的下調。該結果證明，用另一種TNF-α家族蛋白替代CD40的另一種BFP分子可以引發細胞表面PD-L1下調。
實例號29.抗PD-L1-TNF-αBFP觸發在T24腫瘤細胞表面上的PD-L1蛋白的下調。
如上文實例號4中所述設定對THP1-blue細胞的另一種測定，除了用抗PDL1-TNF-α BFP3和TNF-α FP和同種型對照替代測試試劑。圖58證明抗PDL1-TNF-α BFP活化THP1骨髓細胞上的NF-κB途徑。
實例號30.抗PD-1-OX40 BFP驅動內化。
以下描述的研究顯示，抗PD-1-OX40 BFP可以驅動內化。這與OX40臂是否是激動劑還是非激動劑抗體無關。該發現直接適用於自身免疫空間。結果顯示，使用用非激動劑但內化抗體構建的雙特異性可以驅動活化受體的內化。參見圖63-64和70-74。這些結果還顯示PD-1的降解獨立於該雙特異性環境中的OX40激動劑功能。
結論
MEDI7526與CD40L FP類似，誘導CD40的快速下調。有趣的是，發現MEDI7526還在多種類型的細胞(包括THP1、MDA-MB-231、和人單核細胞)的細胞表面上觸發PD-L1的快速和穩健的下調。所有這些細胞都表現CD40。此外，MEDI7526不僅下調細胞表面的PD-L1，而且還顯著降低PD-L1蛋白的總細胞量，表明PD-L1的強制內化可能觸發其降解。此外，抗PD-L1-TNF-α BFP類似地觸發T24腫瘤細胞中PD-L1蛋白的下調。該結果證明，用另一種TNF-α家族蛋白替代CD40的另一種BFP分子可以引發細胞表面PD-L1下調。據信另外的BFP分子也可以類似地調節PD-L1下調。
本文描述的來自這些新穎雙特異性分子的數據證明，將兩者組合成一個“支架”產生單獨使用組合療法無法實現的結果。MEDI7526(BFP3)藉由其刺激CD40途徑和下調PD-L1表現的獨特功能，代表了一種有前途的抗癌治療方法。
類似地，抗PD1-GITRL BFP(MEDI3387)和抗PD1-OX40L BFP示出了觸發活化的人PBMC中PD1蛋白的降解，這可能為抗癌提供另一種治療選擇。
圖59闡明了針對MEDI7526(BFP3)的所提出的MOA。具體地，藉由經由CD40連接活化抗原呈遞細胞同時從細胞表面去除PD-L1導致IFN-γ、IL-12、和IL-10的誘導，但不導致TNF-α或IL-6的誘導。誘導的TNF-α和IL-6的不存在與增強的抗腫瘤功能和減輕的體重減輕相關，支持MEDI7526可以誘導增強的抗腫瘤應答且毒性降低的結論。
鼠研究進一步證實MEDI7526具有治療肝腫瘤的潛力。
其他實施方式
從前述說明中，將顯而易見的是，可以對本揭露所述的發明作出變更和修改以使其適應於不同用途和狀況。此類實施方式也在以下申請專利範圍的範圍內。
本文變量的任何定義中對要素清單的敘述包括將所述變量定義為任何單個要素或所列要素的組合(或次組合)。本文實施方式的敘述包括作為任何單個實施方式或與任何其他實施方式或其部分結合的實施方式。
本說明書中提及的全部專利案和出版物藉由引用方式以相同的程度併入本文，如同每份單獨的專利案和出版物具體地且個別地指出藉由引用的方式結合。
序列ID號
序列
<110> 美商麥迪紐有限責任公司(MEDIMMUNE,LLC)
<120> 雙特異性融合多肽及其使用方法
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Claims (38)

  1. 一種雙特異性融合蛋白，其包含：一種單鏈融合蛋白，該單鏈融合蛋白包含對第一細胞表面靶標特異的第一結合區、Fc單體、和對第二細胞表面靶標特異的第二結合區，其中該第一結合區和該第二結合區經由肽接頭與該Fc單體共價連接，並且其中該雙特異性融合蛋白能夠同時結合該第一細胞表面靶標和該第二細胞表面靶標。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之雙特異性融合蛋白，其中該第一結合區和該第二結合區中的至少一個係Fab片段或受體配位基。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之雙特異性融合蛋白，其中該Fab片段係抗PD-1 Fab片段。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之雙特異性融合蛋白，其中該Fab片段係抗PD-L1 Fab片段。
  5. 如申請專利範圍第1-4項中任一項所述之雙特異性融合蛋白，其中該Fc單體係IgG1 Fc單體。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之雙特異性融合蛋白，其中該IgG1 Fc單體包含與SEQ ID NO：6具有至少約85%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
  7. 如申請專利範圍第1-4項中任一項所述之雙特異性融合蛋白，其中該Fc單體係IgG4 Fc單體。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之雙特異性融合蛋白，其中該IgG4 Fc單體包含與SEQ ID NO：9具有至少約85%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之雙特異性融合蛋白，其中該Fc單體包含鉸鏈區。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之雙特異性融合蛋白，其中該Fc單體包含人Fc胺基酸序列。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之雙特異性融合蛋白，其中該一種或多種配位基亞單元中的至少一種係GITRL。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之雙特異性融合蛋白，其中該一種或多種 配位基亞單元中的至少一種係OX40L。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之雙特異性融合蛋白，其中該一種或多種配位基亞單元中的至少一種係CD40L。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之雙特異性融合蛋白，其中該CD40L配位基亞單元包含在位置194處的Trp殘基。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之雙特異性融合蛋白，其中該在位置194處的Trp殘基係C→W取代。
  16. 如申請專利範圍第1項所述之雙特異性融合蛋白，其中該一種或多種配位基亞單元中的至少一種係TNF-α。
  17. 如申請專利範圍第1項所述之雙特異性融合蛋白，其中該一種或多種配位基亞單元中的至少一種係CD137L。
  18. 如申請專利範圍第1項所述之雙特異性融合蛋白，其中該Fab片段與Fc單體的N末端連接。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之雙特異性融合蛋白，其中該一種或多種配位基亞單元與Fc單體的C末端連接。
  20. 如申請專利範圍第1項所述之雙特異性融合蛋白，其中該Fab片段與Fc單體的C末端連接。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之雙特異性融合蛋白，其中該一種或多種配位基亞單元與Fc單體的N末端連接。
  22. 如申請專利範圍第1項所述之雙特異性融合蛋白，其中該單鏈融合蛋白包含多個配位基亞單元。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之雙特異性融合蛋白，其中該多個配位基亞單元包含2、3、4、5、6、7、8、9、或10個配位基亞單元。
  24. 如申請專利範圍第1項所述之雙特異性融合蛋白，其中該單鏈融合蛋白包含3個配位基亞單元。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之雙特異性融合蛋白，其中該配位基亞單元與從N末端至C末端連續地連接的3個配位基亞單元形成同源三聚體。
  26. 如申請專利範圍第1項所述之雙特異性融合蛋白，其中該肽接頭包含 約9個至約20個胺基酸。
  27. 如申請專利範圍第26項所述之雙特異性融合蛋白，其中該肽接頭包含約9個至約15個胺基酸。
  28. 如申請專利範圍第27項所述之雙特異性融合蛋白，其中該肽接頭包含約9個胺基酸。
  29. 如申請專利範圍第1項所述之雙特異性融合蛋白，其中該肽接頭包含一個或多個甘胺酸(Gly)或絲胺酸(Ser)殘基。
  30. 如申請專利範圍第1項所述之雙特異性融合蛋白，其中該肽接頭係GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：33)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：34)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：35)、或GGGGSGGGS(SEQ IN NO：36)。
  31. 一種二聚體，其包含選自如申請專利範圍第1-30項所述之雙特異性融合蛋白的兩種雙特異性融合蛋白，其中該二聚體經由Fc單體的相互作用而形成。
  32. 如申請專利範圍第1-30項中任一項所述之分離的融合蛋白或如申請專利範圍第31所述的二聚體在生產用於增強受試者中的抗腫瘤免疫應答的藥物中的用途。
  33. 如申請專利範圍第32項所述之用途，其中該受試者患有癌症。
  34. 如申請專利範圍第32或33項中任一項所述之用途，其中該藥物增強了免疫應答和/或抗癌應答中的一種或多種。
  35. 如申請專利範圍第32或33項中任一項所述之用途，其中與用分離的融合蛋白或二聚體的親本試劑治療相比，該藥物導致降低的毒性。
  36. 如申請專利範圍第13項所述之雙特異性融合蛋白在生產用於治療癌症，包括治療對其有需要的患者的藥物中之用途。
  37. 如申請專利範圍第36項所述之用途，其中該藥物用化學療法給予。
  38. 如申請專利範圍第36項所述之用途，其中該癌症係肝癌。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114206940B (zh) * 2019-07-23 2023-09-22 南京金斯瑞生物科技有限公司 抗cd47/抗lag-3双特异抗体及其制备方法和应用
WO2022072697A2 (en) * 2020-09-30 2022-04-07 Immetas Therapeutics, Inc. Bispecific binding molecules 2
GB202104104D0 (en) * 2021-03-24 2021-05-05 Liliumx Ltd Platform and method
TW202315893A (zh) * 2021-06-09 2023-04-16 香港商岸邁生物科技（香港）有限公司 Ｏｘ４０和／或ｐｄ—ｌ１的抗體和雙特異性結合蛋白
CN117813320A (zh) * 2021-07-30 2024-04-02 Inserm(法国国家健康医学研究院) 嵌合蛋白和免疫治疗方法
WO2023088876A1 (en) * 2021-11-16 2023-05-25 Apogenix Ag Multi-specific immune modulators
TW202330588A (zh) * 2021-12-17 2023-08-01 美商莫德斯醫療公司 含有tnfsf配體之細胞外域的抗原結合多肽複合物
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf
CN116789834B (zh) * 2023-08-29 2023-10-27 苏州为度生物技术有限公司天津分公司 一种抗人cd56工程抗体及应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2310509T3 (en) * 2008-07-21 2015-04-27 Apogenix Gmbh Single chain molecules TNFSF
PT2542590T (pt) * 2010-03-05 2017-08-31 Univ Johns Hopkins Composições e métodos para anticorpos e proteínas de fusão imunomoduladores direcionados
RU2019126655A (ru) * 2012-08-20 2019-11-12 Фред Хатчинсон Кансэр Рисёч Сентер Нуклеиновые кислоты, кодирующие химерные рецепторы, полипептидные химерные рецепторы, кодируемые ими, векторы экспрессии, содержащие их, выделенные клетки-хозяева, содержащие их, композиции, содержащие выделенные клетки-хозяева, а также способы получения выделенных клеток-хозяев in vitro, способы выбора нуклеиновых кислот, кодирующих химерные рецепторы, in vitro и способы проведения клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего опухоль
US9683044B2 (en) * 2012-08-20 2017-06-20 Gliknik Inc. Molecules with antigen binding and polyvalent FC gamma receptor binding activity
CA2906927C (en) * 2013-03-15 2021-07-13 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
JP6702893B2 (ja) * 2014-06-27 2020-06-03 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニムＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ Ｐｈａｒｍａ Ｓ．Ａ． 多重特異的抗原結合タンパク質
RU2018139811A (ru) * 2016-04-15 2020-05-15 Займворкс Инк. Мультиспецифические антигенсвязывающие конструкции, нацеливающие иммунотерапевтические средства
WO2018144514A2 (en) * 2017-02-01 2018-08-09 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Tnf superfamily fusion polypeptides
WO2018213747A1 (en) * 2017-05-19 2018-11-22 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. 4-1bb agonist and cd40 agonist bispecific molecules

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