CN116789834B - 一种抗人cd56工程抗体及应用 - Google Patents

一种抗人cd56工程抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗人CD56工程抗体及应用，重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明所述的抗人CD56单克隆抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因及其表达产物，两者重组后表达产生的抗CD56抗体，能够特异性结合人CD56分子。

Description

一种抗人CD56工程抗体及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种抗人CD56工程抗体及应用。
背景技术
甲状腺乳头状癌是最常见的甲状腺上皮恶性肿瘤，大多数乳头状癌具有典型的细胞核改变，其中核增大和核外形不规则的相对特异性高；但乳头状癌特征性核改变在其他甲状腺病变中也可见。因此，寻找相关特异性标志物，建立可靠、可行的检测手段，对甲状腺乳头状癌的诊断具有重要的临床价值。
甲状腺乳头状癌是最常见的甲状腺上皮恶性肿瘤，如果肿瘤具有特异性核改变时，可直接做出诊断，然而有时肿瘤仅在局灶出现某些不确定的核改变，行常规形态学检查难以做出诊断；在一些良性病变中常见的乳头状增生病变，虽然无典型特征性细胞核改变，但出现核增大、淡染等不典型形态或乳头状结构不明显，细胞呈空泡状、偶见核沟时，与乳头状癌难以鉴别；当出现甲状腺微小乳头状癌，尤其是镜下发现的甲状腺微小乳头状癌位于硬化性间质内，其细胞形态不典型，也会带来诊断困难。
CD56是神经细胞黏附分子，主要用于视网膜母细胞瘤、髓母细胞瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤等肿瘤和NK细胞的分析。有文献报道认为CD56是诊断甲状腺乳头状癌有意义的抗体，特别是在鉴别滤泡型甲状腺乳头状癌和其他滤泡性肿瘤中具有重要意义。在61例甲状腺乳头状癌中有18例CD56呈阴性，43例甲状腺乳头状癌中CD56阳性，但肿瘤细胞阳性率＜5％，且CD56阳性肿瘤细胞位于肿瘤浸润的边缘，提示CD56失表达可能与肿瘤侵袭能力强有关。61例甲状腺乳头状癌中仅1例CD56散在表达。本组CD56在甲状腺乳头状癌中敏感度较低，仅为56.80％，部分病例阳性细胞约100％，与良性病变相似，但是其特异度高，在良性病变中均呈强阳性，CD56失表达有助于提高甲状腺乳头状癌诊断的准确性。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种抗人CD56工程抗体及应用。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供了一种抗人CD56工程抗体，该工程抗体包括重链可变区与轻链可变区；
所述的重链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2与CDR3；所述的重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述的重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的轻链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2与CDR3；所述的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步，所述的重链可变区的骨架区包括FR1、FR2、FR3和FR4；所述的重链可变区的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述的重链可变区的FR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示；所述的重链可变区的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述的重链可变区的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述的轻链可变区的骨架区包括FR1、FR2、FR3和FR4；所述的轻链可变区的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述的轻链可变区的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述的轻链可变区的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述的轻链可变区的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
进一步，所述的工程抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明还提供了一种核酸分子，该核酸分子编码所述的抗人CD56工程抗体。
进一步，所述的核酸分子编码所述的抗人CD56工程抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
本发明还提供了一种表达载体，该表达载体包含所述的核酸分子。
本发明还提供了一种抗人CD56工程抗体的应用，所述的抗人CD56工程抗体在制备诊断甲状腺微小乳头状癌的试剂中的应用。
本发明还提供了一种抗人CD56工程抗体的应用，所述的抗人CD56工程抗体在制备治疗甲状腺微小乳头状癌的药物中的应用。
本发明还提供了一种免疫检测试剂盒，该试剂盒含有所述的抗人CD56工程抗体和/或所述的表达载体。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的抗人CD56工程抗体可用于诊断上皮内瘤，尤其可用于诊断甲状腺微小乳头状癌。
本发明所述的抗人CD56单克隆抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因及其表达产物，两者重组后表达产生的抗CD56抗体，能够特异性结合人CD56分子。
附图说明
图1为本发明实施例3所述的抗人CD56工程抗体的纯化电泳图；
图2为本发明实施例4所述的抗人CD56工程抗体的活性检测图；
图3为本发明实施例6所述的抗人CD56-PE工程抗体的活性检测图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1 小鼠抗人CD56抗体的轻重链可变区基因克隆
1、RNA提取：采用Trizol一步法，1)取杂交瘤细胞约1×106个，加入1ml Trizol，吹打混匀，室温静置 10 分钟；2) 加入 0.2ml 氯仿，剧烈振荡 15 秒，室温静置 2-3 分钟；3)12000rpm，4℃，离心 15 分钟；4) 取上清，加入 0.5ml 异丙醇室温静置 15 分钟；5)12000rpm，4℃，离心15 分钟；6) 弃上清，加入 1ml 75％的乙醇洗，7500rpm，4℃，离心 5分钟；7) 弃上清，沉淀晾干，加入 30μLDEPC 水溶解；
2、逆转录为 cDNA(40μl)：使用TransScript All-in-one First-Strand cDNASynthesis SuperMix for qPCR试剂盒进行逆转录反应，取总RNA 1.0 μg，TransScriptAll-in-one SuperMix for qPCR 4μl，gDNA remover 4μl，DEPC水补充至20μl，反应42℃，15min后，85℃孵育5min，于20℃保存；
3、PCR 扩增CD56抗体的轻重链可变区基因
轻链可变区基因PCR扩增反应体系(50μl) ：设计通用简并引物：上游引物5’-GACATT GTG CTC ACC CAG WCT SMH-3’（SEQ ID NO:19），下游引物5’-CCG TTAGAT CTC CARBTT KGT SCS-3’（SEQ ID NO:20）；以cDNA 为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为 94℃ 5 分钟 ；94℃ 30 秒，55℃ 30秒，72℃ 30 秒，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 分钟；
重链可变区基因 PCR 扩增反应体系 (50μl) ：上游引物 5’-CAG GTS MARCTGCAGSAG TCW GG-3’（SEQ ID NO:21）；下游引物 5’-TGA GGA GAC KGT GAC HGT GGT SCC-3’（SEQ ID NO:22）；以 cDNA 为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为 94℃ 5分钟 ；94℃，30 秒，55℃，30 秒，72℃，30 秒，共 35 个循环 ；最后 72℃延伸 10 分钟；
4、测序载体的构建：pClone007 Blunt Simple Vector Kit购自擎科生物；将轻重链可变区基因PCR 产物回收，与 pClone007 Blunt Simple Vector载体连接后，按常规方法氯化钙转化，以 100μg/ml 氨苄浓度筛选阳性克隆，送测序，该基因完全符合蛋白数据库中抗体所具有的若干保守的框架氨基酸的特点，该序列为抗体基因序列。分别命名为pClone007-VH及pClone007-VL。
实施例2 工程抗体表达载体pcDNA3.4-H和pcDNA3.4-L的构建
根据轻、重链可变区序列及构建载体pcDNA3.4的序列，设计并合成了用于扩增重链可变区的引物（PDH-F和PDH-R）、用于扩增轻链可变区的引物（PDL-F和PDL-R）、用于扩增重链载体的引物（ZTH-F和ZTH-R）和用于扩增轻链载体的引物（ZTL-F和ZTL-R）。
PDH-F：
5’-TTCCAGGTTCCACTGGTGACTGATGTGCAGCTGGTGGAGTC-3’（SEQ ID NO:23）
PDH-R：
5’-GATGGGGGTGTCGTTTTGGCGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-3’ （SEQ ID NO:24）
PDL-F：
5’-TTCCAGGTTCCACTGGTGACGACATTGTGATGACACAGTCTCCAT-3’ （SEQ ID NO:25）
PDL-R：
5’-ACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTC-3’（SEQ ID NO:26）
ZTH-F：
5’-GCCAAAACGACACCCCCA-3’（SEQ ID NO:27）
ZTH-R：
5’-GTCACCAGTGGAACCTGGAACC-3’（SEQ ID NO:28）
ZTL-F：
5’-GCTGATGCTGCACCAACTGTAT-3’（SEQ ID NO:28）
ZTL-R：
5’-GTCACCAGTGGAACCTGGAACC-3’（SEQ ID NO:30）
轻链可变区基因PCR扩增反应体系(50μl) ：上游引物PDL-F；下游引物PDL-R；以pClone007-VL为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为 94℃ 5 分钟 ；94℃30 秒，58℃ 60秒，72℃ 30 秒，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 分钟。
重链可变区基因PCR扩增反应体系(50μl) ：上游引物PDH-F；下游引物PDH-R；以pClone007-VH为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为 94℃ 5 分钟 ；94℃30 秒，58℃ 60秒，72℃ 30 秒，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 分钟。
轻链线性化载体的扩增：上游引物ZTL-F；下游引物ZTL-R；以pcDNA-CD15-L(合成序列，含鼠IgG1恒定区核苷酸序列)为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为94℃ 5 分钟 ；94℃ 30 秒，58℃ 60秒，72℃ 4 min，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10分钟；
将PCR产物分别回收，将回收轻链可变区PCR产物和重链可变区PCR产物分别与回收线性化载体产物使用重组酶进行重组，重组后转化DH5α克隆菌株，并挑取单菌落扩大培养，送样测序，测序正确的克隆用于转染CHO细胞。
重链线性化载体的扩增：上游引物ZTH-F；下游引物ZTH-R；以pcDNA-CD15-H(合成序列，含鼠IgG1恒定区核苷酸序列)为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为94℃ 5 分钟 ；94℃ 30 秒，58℃ 60秒，72℃ 4 min，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10分钟；
将PCR产物分别回收，将回收轻链可变区PCR产物和重链可变区PCR产物分别与回收线性化载体产物使用重组酶进行重组，重组后转化DH5α克隆菌株，并挑取单菌落扩大培养，送样测序，测序正确的克隆用于转染CHO细胞。
实施例3 抗人CD56工程抗体的表达、纯化
1、工程抗体 CD56抗体的表达：将准备好的CHO细胞从培养箱中取出，准备两支15ml 无菌离心管，在其中一支中加入 5ml SPM培养基 和 100μg 无菌质粒 DNA(含轻链表达载体和重链表达载体)，轻轻吹打混匀；取另一支离心管，加入 5ml SPM 和 320μl转染试剂，轻轻吹打混匀；将含有转染试剂的离心管中所有液体转移至含质粒的离心管中，轻轻吹打混匀；室温下静置5分钟制备出质粒-载体复合物；从恒温摇床中取出细胞，边摇边加入制备好的质粒-载体复合物，放回 CO2恒温摇床中震荡培养；第1天和第5天补加辅料，第12天收获细胞上清；
2、抗人CD56工程抗体的纯化：将上步收集的细胞上清使用Protein A亲和柱进行纯化，PBS平衡柱子后，上样，使用pH值为3.0的甘氨酸进行洗脱，洗脱纯抗使用G25柱置换溶液，将溶液置换为PBS，取样进行电泳测试，结果如图1所示，框内的是CD56工程抗体纯品的还原和非还原的结果（左侧为还原电泳，右侧为非还原电泳），然后分装后于-20℃冻存。
实施例 4 抗人CD56工程抗体的活性测定
正常人外周血检测：每管加入正常人抗凝外周血 100μl，加入不同量的工程抗体CD56，室温避光孵育 30分钟；加入 2ml 溶血素室温避光反应 10 分钟后 1000 转/分钟离心 5 分钟，弃上清；加入 2ml 冷 PBS 缓冲液，重悬，1000 转/分钟离心 5 分钟，弃上清；再加入 0.5μg APC 标记的鼠二抗，室温避光孵育 30 分钟；加入 2ml 冷 PBS 缓冲液，重悬，1000 转/分钟离心 5 分钟，弃上清；加入配套抗体CD45-PerCP和CD3-FITC，反应20分钟，加入 2ml 冷 PBS 缓冲液，重悬，1000 转/分钟离心 5 分钟，弃上清；加入 250μl PBS缓冲液，流式细胞仪检测，结果如图2所示，CD56与淋巴细胞结合后，加入荧光二抗，可检测到荧光信号，说明CD56工程抗体可与淋巴细胞表面的CD56结合，活性正常；并且随着抗体量加入的减少，平均荧光强度先增加后降低，最适的工程抗体加入量为0.13μg。
实施例 5 抗人CD56工程抗体的PE标记
将抗人CD56工程抗体使用还原剂进行还原，将其与经过活化的PE混合均匀，25℃搅拌，反应1小时；再使用S200 increase纯化柱纯化，得到PE标记CD56工程抗体。
实施例 6 抗人CD56-PE工程抗体的活性测定
正常人外周血检测：每管加入正常人抗凝外周血 100μl，加入不同量的工程抗体CD56-PE（1.0μg、0.5μg、0.25、0.13μg、0.06μg、0.03μg），再加入抗体CD45-PerCP，CD3-FITC，室温避光孵育 30 分钟；加入 2ml 溶血素室温避光反应 10 分钟后 1000 转/分钟离心 5分钟，弃上清；加入 2ml 冷 PBS 缓冲液，1000 转/分钟离心 5 分钟，弃上清；加入 300μlPBS 缓冲液，流式细胞仪检测，结果如图3所示；CD56-PE与淋巴细胞结合后，可检测到荧光信号，说明CD56-PE工程抗体可与淋巴细胞表面的CD56结合，活性正常；并且随着抗体量加入的减少，平均荧光强度减弱。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种抗人CD56工程抗体，其特征在于：该工程抗体包括重链可变区与轻链可变区；
所述的重链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2与CDR3；所述的重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的轻链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2与CDR3；所述的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的抗人CD56工程抗体，其特征在于：所述的重链可变区的骨架区包括FR1、FR2、FR3和FR4；所述的重链可变区的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述的重链可变区的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述的重链可变区的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述的重链可变区的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述的轻链可变区的骨架区包括FR1、FR2、FR3和FR4；所述的轻链可变区的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述的轻链可变区的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述的轻链可变区的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述的轻链可变区的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
3.根据权利要求1所述的抗人CD56工程抗体，其特征在于：所述的工程抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
4.一种核酸分子，其特征在于：该核酸分子编码权利要求1-3中任一项所述的抗人CD56工程抗体。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于：所述的核酸分子编码所述的抗人CD56工程抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
6.一种表达载体，其特征在于：该表达载体包含权利要求4或5所述的核酸分子。
7.权利要求1-3中任一项所述的抗人CD56工程抗体的应用，其特征在于：所述的抗人CD56工程抗体在制备诊断甲状腺微小乳头状癌的试剂中的应用。
8.权利要求1-3中任一项所述的抗人CD56工程抗体的应用，其特征在于：所述的抗人CD56工程抗体在制备治疗甲状腺微小乳头状癌的药物中的应用。
9.一种免疫检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1-3中任一项所述的抗人CD56工程抗体和/或权利要求6所述的表达载体。
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