CN101001879A - 与胎儿而非成体cd34+/cd36+细胞结合的抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及优先特异性与胎儿CD36⁺细胞而非母体CD36⁺细胞结合的抗体，和利用这些抗体从成体生物液体包括母体外周血中检测和分离胎儿细胞的方法。

Description

与胎儿而非成体CD34+/CD36+细胞结合的抗体

本申请要求2004年6月14日提交的美国专利申请No.60/579,693和2004年10月15日提交的美国专利申请No.60/618,963的优先权，上述专利申请的内容明确地以引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及与胎儿CD36⁺细胞而不是与母体CD36⁺细胞结合的抗体，以及利用这些抗体检测和分离母体外周血的胎儿细胞。

背景技术

在分娩后的母体血液中发现胎儿红血球是由Zipursky等于1959年报道的(“Foetal erythrocytes in the maternal circulation，”Lancet 1：45 1-52)。之后又发现胎儿的红细胞、淋巴细胞和滋养层细胞在怀孕期就存在于母体血液中(Herzenberg等，1979，Proc Natl Acad Sci USA，76：1453-1455；Bianchi等，1990，Natl Acad Sci USA，87：3279-83)。母血中存在胎儿细胞得到广泛的确认，在对胎儿的风险降到最低的条件下为获得用于医疗诊断测试和研究的胎儿细胞样品，提供了一个机会。与之对应的是近来广泛采用的胎儿细胞样品的采集方法，如绒毛膜绒毛采样(CVS)、羊水诊断，或脐周血采样(PUBS)。当这些方法有效而广泛被采纳的同时，这些方法也会直接侵害到胎儿，增加胎儿发病率或死亡的风险，包括流产的风险。从母体血获取胎儿细胞的方法受限于存在于母体外周血的胎儿细胞数目很少。所报道的胎儿与母体红细胞的比例一般在1∶4,000到1∶80,000范围内。所报道的相应的淋巴细胞的比例变化很大，从1∶100到1∶300,000，其根据特定的分析方法和胎儿的胎龄等诸多因素而定。

大量的有关从母血中获取胎儿细胞的方法被提出来。有一组方法在美国专利5,641,628中被提出并在此作为参考：使用胎儿细胞特异性单克隆抗体，尤其是抗-CD71(转铁蛋白受体)结合到胎儿红细胞上。其他用于相似目的方法包括使用对细胞表面抗原特异的抗体，如CD34和血型糖蛋白A。这种方法的一些常用实施例使用联结到可检测的成分如荧光团的抗体。联结的抗体与胎儿细胞结合使得这些细胞在其他不表现非同源抗原细胞的存在下，能够被检测到。该检测有时与荧光激活细胞分选(FACS)法结合使用，使标记的胎儿细胞与未标记的混合的母体细胞分开。在该方法的其它实施例中，胎儿细胞特异性抗体连接到固体表面或磁性微粒上，利用固定住的抗体捕获胎儿细胞。结合到靶胎儿细胞的抗体将它们连接到一个支撑表面、微粒、微孔滤膜、多孔非溶性基质或其它诸如此类的物体上，而母体细胞不被结合因而留在液相中。联结有胎儿细胞的支撑物体很容易与液相的母体细胞区分开来。两种胎儿细胞分离的方法基于和使用现有技术已经建立起来的用于这种目的和相关用途的可接受的方法和材料。这些方法都受到前述的母体血液中胎儿细胞数目太少，以及造血和胎儿干细胞发育生物学的限制。

运用以上所述的方法检测母体血液中的胎儿细胞是一种检测“稀有事件”的实践。从大多数发表的数据来评估这些直接免疫法的性能是很难的，尤其因为典型的度量都是有关“纯产物的产量”或“敏感性”和“特异性”；或计算这些参数的数据全然没有报道。更为普遍的是，报道对被标记的或如果可能的话回收的细胞计数不作进一步确定或所报道的内容为错误的否定或错误的肯定。然而，对该性能的粗略的估算可以依据标本中细胞的总数和标本中估计的所要的细胞类型出现的频率来获得。举个例子，假设报道说一个标本的细胞总数为1×10⁷，标本中靶细胞出现频率为1∶25,000(这两个数值都是可用于实验的真实的数值，在该实验中，胎儿红血球被标记或从母体血液回收)，那么可以合理地推断，标本中大约有40个胎儿细胞。如果用所提供的方法报道的标记了的或回收的细胞数低于这个期望值，那么该方法的敏感性，即用该法检测的实际存在于在标本中的胎儿细胞的比例和所占百分比，可以认为是低的。相反，如果用所提供的方法报道的标记了的或回收的细胞数高于这个期望值，那么该方法的特异性，即用该法检测的实际存在于在标本中的胎儿细胞的比例和所占百分比，是低的。将这种Meta分析应用于发表的标记或回收母体血液的胎儿细胞的实验结果，经常获得一个低于25％，有时低于10％的敏感性或特异性(若适用)的估算值。

这些对直接免疫标记或回收的胎儿细胞的估算的敏感性和特异性，可以结合考虑那些很相似的用免疫化学筛选子宫颈细胞标本中异常的和癌细胞的报道结果。与胎儿细胞一样，癌细胞筛选就是一种稀有事件检测的操作，其中，有关细胞出现的频率通常在1∶10,000到1∶50,000的范围。类似地，某些相同的抗体，最典型的为对CD71特异的抗体，用于这两种用途的某些实施步骤上。用于标记标本来获取数据的方法和说明这些结果的方法也同样是非常相似的。但是，常规报道的子宫颈细胞敏感性和特异性的结果在85％到95％的范围内。这个对比很清楚地说明在/从母体血液标本中直接免疫标记或获取胎儿细胞方法，敏感性和特异性都不充分。

已经有大量的尝试用于改进从母体血液中标记和/或获取胎儿细胞的敏感性和特异性。这些改进采取在标记和获取步骤之前，先增加胎儿细胞标本的方式。例如，本领域所有的技术人员事实上在对胎儿细胞进行特异性操作之前将母体血液内样品通过Ficoll或相似的密度梯度法进行沉降。该沉降方法将母体血液样品分成了三个主要部分：红血球，单核细胞和血小板。红血球和血小板占原有样品细胞的绝大部分，而单核细胞部分含有有关的胎儿细胞。非针对性地将大部分潜在的干扰细胞从样品中移除，富集胎儿靶细胞，增进这些细胞被标记和获取的可能性。但是，大多数现有的分离方法包括前一段落所讨论到的方法，使用这种富集法表明，该富集不足以弥补这些现有技术使用的方法的特异性和敏感性的缺陷。

因而，有些人即对单核细胞部分进一步富集。一个通常使用的方法(参见美国专利5,641,628)是，有选择性地将展示与胎儿细胞关联的细胞表面抗原的细胞与单细胞部分分离。相反，不展示与胎儿细胞关联的抗原的细胞从混合物中移除(减除)(美国专利5,877,299)。选择性分离胎儿细胞采用了抗体对早期胎儿细胞标志物如CD34和/或CD133的特异性，二者可以单独使用也可以结合使用。减除法利用含有多种抗体的“鸡尾酒”法，每一种抗体特异于一类特定的要从混合物移除的细胞。这种分离机制如上述并且基于已建立的方法，如FACS，磁性分离，亲和层析法或细胞淘选法。

这种方法的效率的主要限制是细胞发育过程的结果。所有细胞都来自多能性的干细胞，干细胞具有分化形成一个有机体的任何一个细胞的潜能。多能性干细胞是胚胎发育最初期的主要的细胞类型，但随着胚胎的发育，数目很快地下降到不可检测的水平。在发育期间，由于这些多能性干细胞负责形成特定的器官和组织，这些多能性细胞的分化能力逐渐减弱。对分化的最初限制导致几种类别的多能性干细胞的形成，每一种类别能够在特定的范围内产生所有的细胞种类。例如，造血干细胞能致使产生任何一种血细胞类型。这些干细胞具有极大的增殖潜能并表现出自我更新、移植并给于适当刺激时能分化为“祖”干细胞的特性。祖细胞虽然保留了上一代多能性干细胞的增殖和移植的能力，但是限于分化成为特定的造血细胞系细胞。例如，造血干细胞致使产生红细胞、骨髓细胞、巨核细胞、淋巴样细胞，也可能产生血细胞的veto谱系，而来自一个造血干细胞的祖细胞仅致力于产生这些细胞之中的一种(即红细胞、骨髓细胞、巨核细胞等)。同多能性和产生多种结果的干细胞一样，祖细胞在形态上无法辨别，但是可以从它们的后代辨认。当给予适当刺激时，这些祖细胞进行几次的分化，导致在特定演进中的倒数第二个分化细胞。以红细胞系为例，在演进到形态上可以区分出来的成红血细胞“前体”细胞之前，分化的初期代表“爆式红系集落形成细胞”(BFU-E)，之后代表“红系集落形成细胞”(CFU-E)。这些前体细胞在去核成为网织红血球前经过原成红细胞性成红血细胞、嗜碱性成红血细胞、多染色性成红血细胞、正色性成红血细胞后，，最终形成红细胞。

这个来自分化的变化进程也由细胞表面抗原的变化反映了出来。在红细胞发育进程中，造血干细胞和BFU-E细胞表达CD34和17F11(c-kit)，而CD33在BFU-E期被表达，但是这些抗原中没有一个在CFU-E期或之后的时期被表达。CD71(转铁蛋白受体，TFR)在BFU-E的后期或CFU-E的早期出现，一直存在到网织红血球期，而CD36(血栓反应素受体，TSPR)在CFU-E的后期出现，并存在到甚至一些成熟的红血球期。血型糖蛋白A和血型A抗原在成红血细胞期出现并存在到成熟红细胞期。其它的抗原在作为表达分化时期的一种功能也表现出类似的变化。

这种表达变化对运用这些抗体将胎儿细胞和非胎儿细胞分离是一种限制。比如，用CD34来识别造血干细胞和BFU-E时期的细胞，但是不能识别之后的任何一个时期。相反，CD71不能识别造血干细胞和BFU-E细胞时期，却能识别后期的细胞。因而需要将CD34和CD71二者抗体结合起来使用，保证所有有关细胞被标记和/或捕获以防敏感性极大地降低。类似的情况也适用于样品富集的“减除”方法，因为它们需要可以结合到所有不相关的细胞发育时期的各种细胞类型上，而不与胎儿细胞结合的抗体。

现有胎儿细胞分离方法的又一个限制是，很多这些抗原出现在多种并且经常是不相关的细胞类型上。比如，CD71紧密地参与铁代谢，因此可以被所有的哺乳类进行活跃呼吸的细胞所表达。相似地，CD36参与细胞的附着和某些调节功能，可以被多种血细胞和其它的细胞类型所表达。这种涵盖广泛的细胞种类的抗原表达，削弱了依赖于这些抗原的方法的敏感性。同时，某些这类细胞表面标志物的表达不仅仅依赖于细胞类型和发育阶段，还依赖于其它多种能够减少这些抗原作为分化标记有效性的环境因素。例如，CD71受严格的转录、翻译和翻译后调控。CD71的表达不仅受细胞发育时期的控制，而且还受各种环境因素的控制。该环境因素会降低该方法的敏感性、特异性或二者之和。最终，同一类型和相同发育阶段的胎儿和母体细胞表达基本上相同的抗原，因而很难辨认任一特定细胞的来源。在某些情况下，这类限制可以被克服：例如，胎儿成红血细胞表达胎儿血红蛋白，而母体成红血细胞表达成体的形式，并且父本Y染色体可以在雄性胎儿细胞中检测到。

考虑到这些限制，又发展出其它用于在母体血液样品中选择性富集胎儿细胞组分的方法。其中一个方法在美国专利5,580,724中公开。它利用具有较高增殖能力的胎儿细胞与同细胞类型的母体细胞作比较。其中，CD34⁺细胞使用以上所述方法之中的一种从母体血液样品中收集，在适当的细胞因子和其它因子存在下进行细胞培养扩增。由于胎儿CD34细胞比母体CD34细胞具有更高的增殖能力，所以经过多个细胞分裂周期之后的扩增，增加了培养基中的早期胎儿细胞的比例。由于促进这种选择扩增的细胞激素和其它因子主要对增强增殖能力是特异性的，对CD34细胞的分化不具特异性，所以，后期胎儿细胞的数目不会增加到一个相似高的程度。

美国专利5,843,633公开了另一种方法，其中，完整的胎儿细胞或干细胞作为免疫原制备单克隆抗体。这种方法产生了一种复杂的杂交瘤细胞混合体，每一种表达直接抗整套抗原表位中的一种的抗体，而这些抗原表位由胎儿细胞或干细胞表达。杂交瘤细胞被纯化克隆，每一种表达一个抗体，然后抗体针对胎儿和其它细胞类型的板筛选，以确定这些抗体中的哪一个表达出对胎儿细胞敏感性有用的水平，如果有的话。为了充分地评价抗体的特异性，筛选板一定要包括靶胎儿细胞或干细胞类型的纯样品，以及可能存在于临床用样品的所有污染细胞类型。具有充分敏感性的杂交瘤细胞扩增产生大量的所选择的抗体。虽然这种方法具有足够敏感性的潜力，但是它们对用来识别表达胎儿或干细胞充分敏感性的抗体彻底的筛选有限的。

通过比较胎儿细胞表达的蛋白质或基因和母体细胞表达的蛋白质或基因，来识别那些在胎儿细胞而不是在母体细胞强烈表达的蛋白质或基因，已经发现了其它一些胎儿细胞特异性的抗原。用这种方法获得的对比的特性，对作为样品的母体和胎儿细胞的纯度是敏感的，并且对获得可重复结果的严格程序控制也是敏感的。这些实验通过具有很低的信噪比的各种各样的微阵列来进行，以至于为获得有用的结果必须进行大量的重复实验。根据在阵列中实际出现的可能的总靶数目的百分比，每一个样品的遗传多样性和阵列的“覆盖”值得考虑。一个特别的限制是，用于该目的的有关的母体和胎儿细胞主要是干细胞和处于BFU和CFU分化期的细胞。这些细胞无法通过形态学标准得到确认，只有通过它们的后期才可得到确认。用该法识别细胞有极大的不定性。在任何情况下，一旦被胎儿细胞独一无二地表达的任何抗原被识别，用标准方法就能获得相应的蛋白质，并且产生抗这些蛋白质的抗体。

所以本领域仍然需要更加特异的和敏感的方法，来识别能将胎儿细胞和母体细胞区分开来的标记物，还需要用于该方法的标记物以及试剂，尤其是测定这种标记物的抗体。

发明内容

本发明提供特异结合到胎儿细胞而不是母体细胞的抗体、制备该抗体的方法，以及利用该抗体进行测定和将胎儿细胞与其它类型细胞分离的方法。对本发明的方法和抗体的特殊的具有优势的应用，是对胎儿细胞进行特异性标记和将胎儿细胞与其它类型细胞尤其是母体细胞区分开来。用本发明的抗体和方法分离的胎儿细胞，对胎儿进行遗传分析来测定或诊断疾病状况或确定胎儿的性别很有用，并且发现能进一步应用于细胞治疗。

本发明优于现有方法之处在于标记胎儿细胞和从母体血液获取胎儿细胞，尤其因为，在对胎儿细胞标记和捕获之前，使样品中的胎儿细胞成为预定状态，从而用本发明的抗体对胎儿细胞的整个细胞群被标记或捕获。例如，抗细胞表面特异性抗原CD34和CD133的抗体被广泛地分别或结合起来用于标记或捕获CFU-E或分化的早期的胎儿红细胞，但是不标记或捕获分化后期的胎儿红细胞。该方法减少了从母体外周血获得的胎儿细胞的数量。同时，该数量有赖于样品中胎儿细胞分化的程度。将所有胎儿细胞处于预定状态和使用针对该状态下胎儿细胞表达的抗原的特异性抗体，以恒定的方式，使样品中被标记和捕获的胎儿细胞的比例增高。

本发明的方法还有一个优点是，在获取胎儿细胞标本时，可以使用最低限度的入侵法而不影响到胎儿。

根据以下提供的更详细的对某些优选实施例的说明以及权利要求，有助于更好地理解本发明。

附图说明

图1为制备胎儿细胞特异性抗体的流程图。

图2为利用胎儿细胞抗体将胎儿细胞从母体外周血分离的流程图。

具体实施方式

本发明提供的抗体是抗肽抗原，该肽抗原是根据系统调查胎儿细胞和母体细胞基因表达的不同进行选择的，此时所述细胞处于预定状态。用于这些调查的样品由分离的来自胎儿和母体的CD34⁺细胞(造血干细胞和红系造血祖细胞)库构成。在适当的细胞因子和其它因子存在下，将细胞库分别进行扩增，增加库中的CD34⁺细胞数目。然后这些被扩大的CD34⁺细胞库，在特定的细胞因子和其它促进CD34⁺细胞分化形成表达CD36而不表达CD34细胞的因子存在下，被分别扩增。

分别提取来自所述胎儿和动员的成体CD36⁺细胞库的总RNA并转录成相应的cDNA制备物，之后该制备物被杂交至“表达”或“EST”微阵列，从中，来自胎儿的CD36⁺细胞特异表达的基因或ESTs被确定。由被特异表达的胎儿基因编码的蛋白质氨基酸序列随即被确定和评估，以识别较短的氨基酸残基(一般为10-30个残基)序列，该序列对胎儿蛋白质是特异性的，并且在同样条件下，不存在于由来自母体的CD36⁺细胞表达的基因产物(蛋白质)中。这些特异性的胎儿肽被合成、连接(如果需要或有益于抗原性)到载体如钥孔虫戚血蓝素，并作为免疫原来制备特异性结合到这些特异性胎儿肽上的单克隆或多克隆抗体。根据抗体是否用于从母体外周血样品标记或捕获胎儿细胞，所述胎儿特异性抗体之后被结合到可测定的标记物，如荧光素或固定在非溶性支撑物如磁微粒。

本发明的抗体可用于从母体外周血回收来自胎儿的红细胞，因而本发明也提供该回收方法。在本发明所述的方法中，按照传统的血细胞分离法将CD34⁺细胞部分从母体外周血分离出来，并且在合适的细胞因子和其它因子存在下进行扩增，使CD34⁺细胞分化成表达CD36(而不是CD34)的细胞。如果所获得的CD36⁺细胞要在样品中被识别，例如被荧光显微镜识别，或与样品分离如用荧光激活细胞分类法进行分离，那么，样品用本发明的一个或多个结合到可测定的标记物如荧光素的抗体进行处理。如果所得CD36⁺细胞是用例如磁性分离、细胞淘选或亲和层析法直接从样品中捕获，那么样品即用本发明的一个或多个抗体进行处理，所述抗体被固定到非溶性和适用于分离方法的支撑物上。

如前段落所述的已被标记的细胞可用显微镜来评估或进一步用原位法如荧光原位杂交(FISH)或与其它抗体或探针的反应来做胎儿性别、遗传异常和疾病情况分析之用，以及用流式细胞术进行分析。用前段落提到的方法所捕获的细胞还可用FISH、多聚酶链式反应(PCR)、核型分析或类似的方法，用于分析胎儿性别、遗传异常和疾病情况，或者这些细胞可用于研究或用于可能的治疗目的。

如在此所公开，本发明提供从各种生物液体包括但不限于外周血、血浆或其血清以及唾液中分离胎儿细胞的方法。

本发明提供最低限度入侵方法，用于从母体外周血测定和捕获胎儿细胞。因为成体生物液体如母体血液中的胎儿细胞数目很少，本发明的方法包括将大量的母体细胞从生物液体中清除，如从母体血液样品中清除母体红细胞和血小板，可使用众所周知的技术沉降标本，即使用Ficoll或等同物作为高密度介质，利用阶梯形式的密度梯度法来沉降标本。这种方法使红细胞在离心管底部成团块状，而血小板留在上清液中。单核细胞包括所需的胎儿细胞在较高和较低的高密度介质交汇处汇集，形成梯度，以较纯的形式回收。

利用母体血液样品，通过密度梯度沉降法获得的单核细胞部分构成一个混合物，由一小部分胎儿细胞和来自母体的造血干细胞、祖细胞和前体细胞与大量的成熟成体细胞混合而成。胎儿细胞和来自母体的未成熟细胞，根据细胞表面被细胞表达的抗原(标记物)，可以与成熟的成体细胞区分开来。具体地说，现有技术依赖于特异结合到CD34、CD133和/或相似的抗原上的抗体，所述抗原由不成熟细胞表达，使来自胎儿和母体的不成熟细胞与母体的成熟细胞区分开来。虽然CD34、CD133和类似的抗原不是严格地特异于未成熟的血细胞，但是其它表达这些抗原细胞类型，包括小血管内皮细胞、胚胎纤维原细胞、发育中的上皮细胞和特定的神经细胞，在适合的母体血液样品里的数目不可能很大。

两种常用的方法被常规用于胎儿和母体来源的未成熟血细胞(在此之后称CD34⁺细胞)与成熟血细胞的最初的分离。其中的一种方法，荧光激活细胞分选(FACS)法，有赖于对有关未成熟细胞选择性的测定，通过结合到荧光报道结构上并且特异性地结合到如未成熟细胞表达的CD34的抗原的抗体标记这些细胞来完成。在该方法中，通过密度梯度沉降法获得的单核细胞部分用一个或多个适当的荧光共轭抗体处理并经FACS加工，基于荧光密度、前向散射和侧向散射，可以逐个检测和对每一个细胞进行分类。FACS法将每一个符合预定荧光密度、前向角散射和侧向角散射标准(特别针对未成熟细胞)的细胞转移到一个汇集管。在该管中汇集的细胞可认定为所需的胎儿和母体来源的未成熟细胞。

其它的方法也可用于最初的胎儿和母体来源的未成熟细胞与成熟血细胞的分离。这些方法包括运用抗原特异性的抗体来特异性地对有关细胞固定到不溶性支撑物上，该支撑物易于区别于可溶性混合物。有各种方法可用来从母体收集胎儿细胞。例如，将特异于CD34、CD133或类似的未成熟细胞标记的抗体固定到磁微粒的表面。当与通过密度沉降法获得的单核细胞部分结合的时候，这些抗体就结合到与之相应的抗原上，从而在磁微粒表面捕获表达这些抗原的细胞。应用强磁场使这些带有捕获的细胞的磁微粒留在进行该处理的柱或容器的两侧，因而洗脱掉不表达这些抗原所以不会结合到磁微粒上的细胞。之后，磁微粒结合的细胞从磁微粒释放并收集起来作为富含所需细胞的一个部分。这些方法中的另一个实施例是在最初的分离过程中，选择性地排除样品中的成熟细胞，然后捕获所述的未成熟细胞。这种最初排除成熟细胞，有时被称为“否定选择”，一般认为它可以在第二个步骤中促进捕获效率。用于排除成熟细胞的抗体对成熟细胞特异性表达的抗原是特异性的，并且常以含有多种抗体的“鸡尾酒”的方式应用，其中每一种对不同的成熟细胞标记是特异的。

用对CD34和/或其它被未成熟细胞表达的抗原特异的抗体而获得的细胞部分，由主要包含来自胎儿和母体的未成熟细胞的混合物构成。这类混合物为许多方法的终产物，而所述有关收集母体血液中胎儿细胞的方法已经发表和/或获得专利。然而这些混合物在诊断应用方面只能有限度的使用，比如在有些例子中，胎儿是雄性并且混合物中的胎儿细胞可以通过检测Y染色体而得以识别，以及在治疗应用中，对CD34⁺细胞的基本的嫁接和增殖能力是有益的。但是在其它的应用中，需要样品中的胎儿细胞相对于那些母体来源的细胞更进一步的富集。

已经发现来自胎儿的CD34⁺细胞的增殖能力大于那些来自母体的CD34⁺细胞。这种增殖能力上的差别可用来区别性地富集样品中的胎儿成分，通过在促进CD34⁺细胞增殖的细胞激素和其它因子存在的情况下，扩增样品中的细胞来进行。在此条件下，样品中来自胎儿CD34⁺细胞的百分比在每一个细胞分裂周期中得以增加，从而富集样品中的胎儿CD34⁺细胞。

这些胎儿富集细胞的细胞群还不足以用于很多的诊断程序，其最好用几乎全部都是胎儿来源的细胞构成的样品来进行。为达到这个目的的尝试主要集中在识别能够区分胎儿和母体胎儿CD34⁺细胞的抗原，制备特异性结合到这些抗原的抗体；利用这些抗体来实施以上所述的分离程序。这些抗原已经被识别，和/或者抗未被识别的胎儿细胞特异性抗原的抗体用实验方法已经制备。例如，用对已知细胞抗原特异性的抗体来针对标称为纯的胎儿和母体细胞板筛选，通常是用以上所述的方法来进行，以识别那些明显地特异地优选结合到胎儿细胞上的抗体。或者，用标称为纯的胎儿细胞作为免疫原对宿主动物如鼠进行免疫，然后由所获得的免疫细胞产生杂交瘤细胞。这些杂交瘤细胞被亚克隆成均一性，例如，有限度地稀释和将这些杂交瘤产生的抗体对用如前述方法制备的标称为纯的胎儿和母体细胞板进行筛选。这些方法理论上产生用作特异测定和/或从母体血液捕获胎儿细胞的抗体。但是，这些抗体功能上的特性严格地依赖于用于产生它们的免疫原的纯度和均一性、用作抗体筛选的胎儿和母体细胞板的广泛度，以及这些盘的成员的均一性，任何一项的错误都会限制这些抗体的使用。这是一个用胎儿和母体细胞产生抗体的一个典型的问题，其富集了胎儿细胞，但不是纯制品。同时，即使所使用的细胞是纯胎儿或母体来源，这些制品由含不同分化阶段细胞的混合物构成，而不同分化阶段展示不同群的抗原。所以，用这些方法制备出来的抗体，最多只能识别样品中一小部分的胎儿细胞。

现有技术中制备胎儿特异性抗体的这些限制也是本发明的一个焦点。不使用对细胞表面标记物交叉特异的抗体，而是利用用以上所述方法制备的汇集的胎儿CD34⁺细胞来识别抗原。制备两个独立的细胞库，一个来自非怀孕供者外周血，另一个来自胎儿肝脏。因而第一个库仅由来自母体的CD34⁺细胞组成，而第二个库仅由来自胎儿的胎儿CD34⁺细胞组成。每一个细胞库在细胞激素及其它促进CD34⁺细胞增殖(但不促进分化)的因子存在下被分别扩增。在扩增的细胞库再选择纯化后，在细胞激素及其它促进CD34⁺细胞分化到表达CD36抗原但不表达CD34抗原、并且促进CD36⁺细胞增殖阶段的因子存在下，它们被第二次被扩增。在增加可利用细胞的数目之余，这种细胞表型的胁迫改变减少了库中不能分化至CD36-表达阶段细胞的百分比，使多个CD34⁺表型衰减，该表型可分化成少量的表达CD36恒定水平的表型。如果需要的话，肯定和否定的选择可用来进一步纯化这些CD36⁺库。这个方法获得了限定的纯母体和胎儿来源的细胞制品。

由这些具有活性和纯化的成体和胎儿细胞制品表达的蛋白质通过以下方式来确定，从每一种细胞制品提取RNA，从该RNA合成相应的标记cDNA混合物，将该cDNA混合物杂交至单独且相同的“基因微阵列”芯片，按照本领域技术人员熟知的标准方法确定结合到基因微阵列每一个探针的cDNA的量。然后评估这些数据，识别被胎儿细胞强烈表达但不被CD36⁺母体细胞明显表达的那些基因。判定阈值(Wilcoxon Signed Rank Test p＞0.99，优选的＞0.999，更加优选的＞0.9999)用于做出这些决定(如“Genechip Expression Analysis TechnicalManual”，PN701024 Rev 3，2004，Affymetrix Santa Clara CA中所公开)。

胎儿CD36⁺细胞特异表达的基因的蛋白质产物的氨基酸序列，以及所有被母体CD36⁺细胞表达的所有蛋白质氨基酸序列被确定，该信息一般参考标准数据库如Gene Bank和SwissProt而获得。然后查找这些氨基酸序列以识别氨基酸子序列，特别是出现在胎儿而不是母体蛋白质的10到30个长度的氨基酸残基。用该方法识别的肽之后用于CD36⁺胎儿细胞特异标记物。按照现有技术，这些特异的肽经化学合成并且应用常规技术产生针对这些肽的抗体。在某些情况下，需要在N端加入半胱氨酸残基或在C端加入半光氨酰一丙氨酸缩二肽来修饰肽，以利于相应免疫原的制备。所得的抗体用抗胎儿和母体纯化的CD36⁺细胞筛选以确认与结合胎儿细胞的特异性。这些抗体结合到荧光素上用来FACS分析和/或分离，或结合到磁微粒上用来磁性回收所需胎儿细胞。这个步骤识别胞外和胞内对胎儿CD36⁺细胞特异的蛋白质抗原。抗胞外抗原的抗体可用于捕获胎儿CD36⁺细胞；在FACS方法中，需要测定和/或收集活胎儿CD36⁺细胞；在显微镜方法中，需要测定和/或收集CD36⁺胎儿细胞(无论是否存活)。另一方面，胞内抗原对用FACS方法测定和/或收集胎儿CD3⁺细胞很有用，其中不用考虑细胞的存活，而用显微镜方法，需要检测胎儿CD36⁺细胞。

如本文所述，本发明的抗体特异性地结合到表位，该表位包括胎儿细胞表达的细胞表面蛋白质的肽片段，优选地，包含这些肽的表位在细胞表面通过本发明的抗体用于免疫结合，最优选地是胎儿细胞外表面。优选地，与母体细胞表面抗原相比，抗体能够免疫性地优先结合到胎儿细胞的表面抗原，这是由于：胎儿细胞表面有更多的抗原表达；在胎儿细胞表面的抗原蛋白质有更好的构象排列；或者在胎儿细胞表面存在而在母体细胞表面缺省。

在此，术语“优先结合”或“优先的结合”应当理解为本发明的抗体及其片段以及这种抗体的混合物或抗体片段的混合物，以高于结合到母体细胞大约5到大约200倍，优选是10到100倍，更优选是20-50倍的亲和力或亲和性与胎儿细胞结合。

本领域技术人员应当更进一步明白本发明抗体及其片段包括抗血清、纯化的多克隆抗体及其片段，以及其混合物，以单独或组合物的形式提供，并且还包括利用纯化的胎儿细胞用现有方法制备的抗体或抗血清，更优选的是，从所述细胞获得的抗原肽，甚至更优选地是，经体外化学或其他合成途径生产的肽抗原，并作为现有方法的免疫原。尤其是，本发明还包括单克隆抗体及其片段，更尤其是多个所述单克隆抗体的组合物。所述抗体可用本发明的方法来生产，或是用任何一种方法产生可免疫性地与优先在胎儿细胞上表达的抗原反应的抗体。

这些抗体可以很方便地从母体外周血来回收胎儿造血细胞。本发明的方法的实施方式可以通过如下所述进行操作：从怀孕母亲的外周血获得样品；将单核细胞部分从该血液样品中分离；收集单核细胞的再次分离的CD34⁺；任选地，扩增这些CD34⁺；在促进这些细胞分化到CD34-/CD36⁺表型的细胞激素的存在下，扩增这些细胞；以及通过使用本发明的一或多个抗体，捕获或标记样品中胎儿CD36⁺细胞。

本发明因而提供对人胎儿CD36⁺细胞特异的抗体，优选是单克隆抗体。本发明还包括抗体片段，包括但不限于所述抗体的F(ab)和F(ab)’₂片段。抗体片段由任何一种方法产生，所述方法包括但不局限于蛋白水解或化学分裂、化学合成或通过基因工程技术制备所述片段。本发明还包括与对胎儿细胞特异的表位起免疫反应的单链抗体，制作方法是本领域技术人员已知的。

以下的实验用于说明本发明的优选的实施例。本领域技术人员应当明白，在此公开的技术代表在操作本发明时运作完好的技术，因而可以作为操作的优选模式。但是，本领域技术人员应该明白，可以对公开的实施例做很多的变化而仍然取得类似的或相似的结果，这些都不背离本发明的精神和范围。

实例1：胎儿肝细胞的制备

胎儿肝细胞可以从Cambrex Bio Science，Walkersville，M.D。或者，可以从5个不同的供者的胎儿肝脏(FL，妊娠期15-22个星期)分离获得，如下所述。

从五个供者而来的胎儿肝脏在DPBS/0.2％BSA溶液中被匀浆并通过金属筛，其中，DPBS为不含Ca⁺⁺/Mg⁺⁺的Dulbecco的磷酸缓冲盐溶液(Biowhittaker，Walkersville，MD)；BSA为牛血清白蛋白(Sigma St.Louis，  MO)，同时含有50μg/ml硫酸庆大霉素(Life Technologies，Grand Island NY)。CD34⁺细胞可用如实例3描述的MACS或FACS法从该匀浆中分选。或者，在按照实例3描述的MACS或FACS法分选CD34⁺细胞之前，先将匀浆按以下所述方法进一步纯化。

用免疫磁性微球排除的方式将成熟红细胞和其它谱系阳性细胞从匀浆中排除。简要地说如下：匀浆与饱和量的血型糖蛋白A(GPA)mAb(AmericanType Culture Collection，Rockvill，MD)共同孵育；细胞在DPBS/BSA中用悬浮/沉降法洗涤两次，与BioMag山羊-鼠IgG磁微粒(Perseptive Biosystems，Framingham，MA)一起孵育15分钟；结合磁微粒的GPA⁺FL细胞以过柱或批量模式的磁梯度分选，从而被捕获。而没有与磁微粒结合的GPA^-FL细胞从被捕获的细胞中用DPBS/BSA(过柱)洗脱或用倾析(批量)，并通过800g离心25分钟(室温下)用1.077g/ml Nycoprep(LifeTechnologies，Grand Island，NY)作为浓相，用梯级密度梯度分离。所得的轻质肝细胞(LDFL)从梯度界面收集，用DPBS/BSA洗涤，在10μg鼠IgG1和IgG 2a(Sigma)的2ml的DPBS/BSA中重悬浮，以阻止用于进一步捕获细胞的单克隆抗体的非特异性结合。所得GPA-LDFL细胞悬浮液在4℃与如下结合FITC的抗体共同孵育30分钟：抗-CD3，抗-CD4，抗-CDB，抗-CD11b，抗-CD14，抗-CD16抗-CD19，抗-CD20，抗-CD36，抗-CD54(包括谱系板)。洗涤后，按照以上所述方式，用涂覆有羊抗鼠IgG(Dynal，Oslo Norway)的磁珠对标记细胞进行否定选择，以获取GPA-Lin-LDFL细胞。按照实例3描述的MACS或FACS法，将CD34⁺细胞从所得GPA-Lin-LDFL细胞分选。

实例2：动员的外周血细胞的制备

动员的外周血细胞从Cambrex获得，也可从以下方式获得。

按照本领域技术人员已知的方法，粒细胞集落刺激因子G-CSF动员的外周血(MPB)单核细胞通过白细胞分离法(leukapherisis)从十个不同的正常成体供者获取并分选。CD34⁺细胞可以按照实例3描述的MACS或FACS法从该MPB血液部分分选。或者，在按照实例3描述的MACS或FACS法分选CD34⁺细胞之前，先将该MPB血液部分按以下所述方法进一步纯化。

如实例1所述，通过免疫磁性微球排除的方式将成熟红细胞和其它谱系阳性细胞中从单核细胞中排除。简要地说，成熟红细胞和其它谱系阳性细胞通过如下步骤从MPB血液部分移除：与饱和量的血型糖蛋白A(GPA)mAb共同孵育；在DPBS/BSA中用悬浮/沉降法洗涤两次；与BioMag山羊-鼠IgG磁微粒(Perseptive Biosystems)共同孵育15分钟；将结合磁微粒的GPA⁺MPB细胞通过磁梯度方式以过柱或批量模式与未结合GPA-MPB细胞分离。而GPA-MPB细胞通过800g离心25分钟(室温下)用1.077g/ml Nycoprep(LifeTechnologies，Grand Island，NY)作为浓相，被梯级密度梯度分离。所得的轻质MPB细胞从梯度界面收集；用DPBS/BSA洗涤，在10μg鼠IgG1和IgG 2a(Sigma)的2ml的DPBS/BSA中重悬浮，以阻止用于进一步捕获细胞的单克隆抗体的非特异性结合。所得GPA-MPB细胞细胞悬浮液在4℃与如下结合FITC的抗体一同孵育30分钟：抗-CD3，抗-CD4，抗-CDB，抗-CD11b，抗-CD14，抗-CD16抗-CD19，抗-CD20，抗-CD36，抗-CD54(包括Lineage盘)。洗涤后，按照实例1所述方式，用涂覆有羊抗鼠IgG(Dynal，OsloNorway)的磁珠对标记细胞进行否定选择，以获取GPA-Lin-MPB细胞。按照实例3描述的MACS或FACS法，将CD34⁺细胞从所得GPA-Lin-MPB细胞分选。

实例3：成体与胎儿CD34⁺祖细胞的纯化

实例1、实例2的胎儿肝细胞和MPB单核细胞部分，按照以下任何一种方法被分别在CD34⁺细胞富集。

MACS法

胎儿肝细胞和MPB单核细胞部分按实例1和2的方法分别制备，并运用MACS CD34⁺分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)按照使用说明，在CD34⁺细胞免疫磁珠富集。简要地说，单核细胞与hapen标记的抗-CD34抗体(QBEND-10，BD Pharmingen，San Diego，CA)在作为封闭剂的0.1％人IgG(Bayer Elkhart，IN)中共同孵育，然后与连接到MACS微珠的抗hapen共同培养。标记细胞通过30μm的尼龙筛过滤移除细胞团块和凝集体。然后标记的CD34⁺细胞经过高梯度磁选柱(Miltenyi Biotec)从混合物中捕获。在洗脱非标记CD34^-细胞之后，移走磁场，磁性吸附的CD34⁺细胞用染色缓冲液SB(DPBS加入0.2％BSA和2mM EDTA，pH7.2)在4-8℃从过柱上洗脱。利用CEllQuestAnalysis软件(Becton Dickinson)的FACS(FACSCalibur；BectonDickinson San Jose CA)分析确定，大于90％的回收细胞为CD34⁺细胞。

FACS法

实例1和2所述的方法分别制备的胎儿肝细胞和单核细胞部分通过荧光激活细胞分类(FACS)法在CD34⁺细胞富集。胎儿肝细胞和单核细胞用20μl/1×10⁶细胞的荧光标记抗-CD34单克隆抗体(catalog#34374X；BD Pharmingen)在SB，4-8℃下染色1小时。非特异结合对照细胞以同样的方法用荧光标记的同型匹配的鼠IgG₁(catalog#554679；BD Pharmingen)染色。紧接着在分类之前，在每个样品中加入1μg/mL荧光DNA染色碘化丙啶(PI)，以识别和排除死细胞。按照使用说明书，细胞在FACSVatage细胞分选机上(Becton Dickinson)被分类。用488nm的氩离子射线激发荧光团，之后在525nm(荧光素)和620nm(PI)处检测荧光。收集活的CD34⁺细胞(CD34⁺/PI^-)并在冰上进行分类备用。样品细胞出现CD34荧光强度比那些同型匹配的不相关的鼠IgG₁对照多出第99个百分点的，被选择为CD34⁺。前和侧向角散射排除细胞凝集体或残片。利用CEllQuestAnalysis软件(Becton Dickinson)的FACSCalibur(BectonDickinson)分析确定，大于90％的回收细胞为CD34⁺细胞。

实例4：刺激胎儿CD34⁺细胞表达CD36

胎儿和成体CD34⁺细胞如实例3所述被分选和纯化，并按照两种方法中的一种进行扩增。在一项实验中CD34⁺细胞用Hematopoietic Progenitor GrowthMedia(HPGM；Biowhittaker)加上50ng/ml的Flt-3配体(FLT-3)，100ng/mlTPO(血小板生成素)和100ng/ml SCF(干细胞因子)，在5％CO₂液体培养基中37℃扩增4-6天。然后这些细胞通过在HPGM加入3U/ml EPO(红细胞生成素)、25ng/ml SCF、10ng/ml白细胞介素-3(IL-3)和10ng/ml白细胞介素-6(IL-6)在5％CO₂液体培养基中37℃进一步扩增4-6天，从而被刺激表达CD36。或者，CD34⁺细胞被扩增，通过在HPGM中加入(在此之后称“增补HPGM”)2％去离子牛血清白蛋白、150μg/ml铁饱和的人运铁蛋白、900μg/ml硫酸亚铁、90μg/ml硝酸亚铁、100μg/ml胰岛素、30μg/ml大豆卵磷脂和7.5μg/ml胆固醇和1×10^-6M氢化可的松(Sigma)进行，其中细胞在含有50ng/ml Flt-3配体(FLT-3)，100ng/ml TPO(血小板生成素)，和100ng/ml SCF(干细胞因子)的增补HPGM中，在5％CO₂液体培养基中37℃培养4-6天。然后这些细胞在含有3U/ml EPO(红细胞生成素)，50ng/ml IGF-1(胰岛素样生长素-1)，和50ng/ml SCF的增补HPGM中，在5％CO₂液体培养基中37℃进一步扩增4-6天，被刺激表达CD36。利用CEllQuestAnalysis软件(BectonDickinson)的FACSCalibur(Becton Dickinson)分析确定，CD36表达细胞通过MACS被回收和纯化到大于85％的纯度。

实例5：分离总RNA

按照使用说明，通过使用Trizol(Life Technologies，Gaithersburg，MD)，分别从CD36⁺成体MPB和胎儿肝细胞分离总RNA。细胞被颗粒化后，经重复吸放，以1mL Trizol/5×10⁶细胞的比例悬浮，从而被溶解。细胞溶解物在室温下培养5分钟，然后加入0.2倍体积的氯仿进行1分钟旋转抽提。样品随即在微量离心机中以13,000rpm(12,000g)4℃下离心30分钟。在加入2倍体积的异丙醇后在室温下混合10分钟，沉淀RNA。将RNA以12000xg离心45分钟。用75％的乙醇洗涤RNA，简单地干燥；按照使用说明，在不含RNase的水或焦碳酸二乙酯处理(DEPC；Sigma)的水(0.1％)中悬浮并用不含RNase的DNase I酶(Life Technologies)处理。RNA浓度用Beckman DU650分光光度计(Beckman Instruments，Palo Alto，CA)来测定。或者遵循使用说明，用RNeasy RNA分离试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)分离总RNA。

实例6：用于微阵列分析的cDNA的制备

按照生产商在GeneChip Expression Analysis Technical手册(Affymetrix，Santa Clara，CA)中的说明制备用于在Affymetrix GeneChip^TM微阵列上分析的cDNA。简要地说，总RNA从如实例4所述的成体MPB和胎儿肝细胞中分离，并第一链cDNA合成反应中，使用T7-Oligo(dT)Promoter Primer进行反转录。第二链cDNA在以Rnase-H为媒介的反应中合成，然后纯化所得的双链cDNA。纯化的双链cDNA在T7 RNA聚合酶和生物素化的核苷酸类似物和核苷酸混合物存在下制备互补RNA(cRNA)。将cRNA片段化并如实例7所述杂交到Affymetrix U133阵列。

实例7：cDNA微阵列分析

按照制造商说明书指导，将所得胎儿和成体cDNA制品分别用AffymetrixU133微阵列芯片分析。根据标准方法(参见Statistical Algorithims ReferenceGuide，Affymetrix Inc.Santa Clara，CA)，测量对应胎儿和成体微阵列芯片上的基因的校正的荧光强度，并换算成p值。在胎儿cDNA样品(其中，Wilcoxon的Signed Ranked Test p-值(参见Genechip Expression Analysis TechnicalManual得到完整的说明)大于或等于0.99，优选地＞0.999，更优选地为0.9999)表达更强烈的基因和表达序列标签(EST)，被认为属于CD36⁺胎儿细胞独特表达(相对于CD36⁺成体细胞)。优先被本发明制备的胎儿CD36⁺细胞表达的基因列于表1。优先被本发明制备的胎儿CD36⁺细胞表达的ESTs列于表2。

表1：优先被CD36⁺胎儿肝细胞表达的基因

基因名称                       FL/MPB    Wilcoxon Ranked

(Genbank/Unigene Accession No.)信号比    P值

AD037(Al890191)	1976/9.1	0.99998
			CSPG2(NM_004385)	1959.5/29.4	0.99998
DCNP1(Hs.152477)	968.6/86.7	0.99998
			人(Homo sapiens)cDNAFLJ30298 fis，cloneBRACE2003172(AK025198.1)	700.5/2.8	0.99998
人(Homo sapiens)cDNAFLJ33028 fis，cloneTHYMU2000140(AL048542)	2228.3/7.4	0.99998
			人(Homo sapiens)cDNA：FLJ21545 fis，clone  COL06195(AK025198.1)	4129.6/21	0.99998
KCNJ2(AF153820)	244.6/18.2	0.99998
			MRC1(NM_002438)	2036.7/23.1	0.99998
MS4A4A(NM_024021)	126.9/7.9	0.99998
			MS4A6A(NM_022349)	5229.9/44.5	0.99998
MS4A7(Hs.530735)	2661.9/60.7	0.99998
			NMES1(AF228422.1)	116.9/10.1	0.99998
PAG(NM_018440.1)	981/96.2	0.99998
			PARVG(AF237772.1)	701/17.2	0.99998
S100A8(AW238654)	7132.9/31	0.99998
			S100A9(NM_002965)	2518/15	0.99998
ASGR2(NM_001181)	1274.2/4.8	0.99998

C1QG(AI184968)	1399.7/6.1	0.99998
			TIM3(AW025572)	415.17/18.8	0.99998
HRB2(Hs.205558)	1064.6/59.9	0.99997
			PKIB(Hs.486354)	339.8/5.4	0.99997
MAFB(Hs.169487)	797.4/81.3	0.99996
			MGC21854(A1659418)	911.1/148.9	0.99996
PRAM-1(Hs.465812)	276.6/15.8	0.99996
			AKNA(Hs.494895)	661.1/37.7	0.99992
AD026(AF226731.1)	198.3/10.3	0.99990
			GPR84(AF237762.1)	411/21.3	0.99985
JDP2(Hs.196482)	875/12.5	0.99985
			RCP(BE544375)	145.9/13.4	0.99969
RASGRP4(Hs.130434)	493.9/20.9	0.99956
			PTGFRN(Hs.418093)	137.8/20	0.99817
CXCL16(Hs.82407)	327.4/76.6	0.99775
			CREM(Hs.200250)	241.4/21.4	0.99751
MS4A5(Hs.178066)	没有数据
			MS4A10(Hs.450640)	没有数据

表2：优先被CD36⁺胎儿肝细胞表达的ESTs

GENBANK       EST序号FL/MPB信号比      P值

AL039884	740.5/35.5	0.99998
			AV646597	1612.5/63.5	0.99998
AW135176	1820/77.8	0.99998
			AW872374	699.2/37.9	0.99998
BF892532	322.6/8.6	0.99998
			AI536637	288.8/9.9	0.99998
BE549540	766.7/34.4	0.99998
			AW303397	695.4/14.4	0.99997

AI741439	221.6/7.9	0.99994
			AV660825	102.2/3.8	0.99992
AI681260	183.9/3.6	0.99990
			AW006441	611/13.4	0.99990
AW575863	374.4/10.4	0.99990
			AI915629	113/4.4	0.99951
AA988769	94/2.6	0.99914
			AV688087	279.5/9.4	0.99914

实例8：生产抗体

与实例7识别的基因和ESTs对应的蛋白质氨基酸序列的确定参考GenBank、SwissProt和其它公共数据库。每一条氨基酸序列被用来识别每一种具有独特氨基酸序列的蛋白质内的肽区域。如果可能，每一种蛋白质可被识别出两个或多个这种肽区域。作为例子，具有两个独特肽区域氨基酸序列、被MS4A10、MS4A7、MS4A6A、MSGR2、MS4A5编码的蛋白质，列于表3中。

表3：与选择基因对应的独特肽氨基酸序列

基因	肽A	肽B
			MS4A10	NTTQPKLLAPHQHEKSQKKS(序列号1)	CINALSSNLKSPRLSQPAEE(序列号2)
MS4A7	FTPKGITIPQREKPGHMYQN(序列号3)	YSNNPGSSFSSTQSQDHIQQ(序列号4)
			MS4A6A	FSQAEKPEPTNQGQDSLKKH(序列号5)	PASLQCELDKNNIPTRSYVS(序列号6)
ASGR2	HELGGSEDCVEVQPDGRWND(序列号7)	LQVYRWVCEKRRNATGEVA(序列号8)
			MS4A5	MDSSTAHSPVFLVFPPEITA(序列号9)	TFGFILDQNYICGYSHQNSQ(序列号10)

将N端半胱氨酸残基加到MS4A10(序列号11/12)、MS4A7(序列号13/14)和MS4A6A(序列号15/16)的肽上，并将双肽CYS-ALA加到MS4A5(序列号17/18)肽的C端，以促进这些肽在制备免疫原期间结合到Keyhole LimpetHemocyanin。

这些肽用现有技术合成，多克隆抗血清和纯化的兔多克隆抗体从BethelLabs，Montgomery，Texas获得；所述抗血清和纯化的抗体使用本领域技术人员说熟知的方法从所述多克隆抗血清生成(参见Harlow&Lane，1988，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press：NewYork)。所得抗体被亲合纯化并结合到hapen生物素或荧光团荧光素或藻红蛋白(PE)，由如此产生的抗体结合物的用途来定。

实例9：从母体外周血分选CD34⁺细胞

外周血(PB)样品通过静脉穿刺孕妇供者在肝素化的收集管获得，所述孕妇供者被用其它手段如羊水诊断检测得知怀有男性胎儿。胎儿的Y染色体提供了一个确切区分相同的母体细胞和胎儿细胞的途径。收集的外周血用DPBS稀释、加样于Ficoll-Paque(Pharmacia AB)上方，在800g和20℃下离心30分钟。单核细胞部分从血沉棕黄层收集，并在SB中于4-8℃下被20μl/10⁶荧光标记的抗CD34单克隆抗体(catalog#34374X；BD Pharmingen)染色一个小时。随即在分类之前，在每一个样品中加入1μg/mL的荧光DNA染剂PI，以识别和排除死细胞。细胞在FACSVatage细胞分选机上(Becton Dickinson)按照使用说明被分类和分析。488nm氩离子射线用于激活荧光团，之后在525nm处(荧光素)和620nm处(PI)检测荧光。或者，细胞如实例3所述的MACS法进行处理。收集活的CD34⁺亚群(活的CD34⁺细胞)并在冰上进行分类备用。通过这些方法，可以从来自母体供者的30ml的全血样品中一般获得500到3000个活的CD34⁺细胞，相当于一份样品中所预期获得细胞数目的70-85％。

实例10：用母体外周血的CD34⁺细胞刺激CD36的表达

CD34⁺细胞如实例9中所述被分选，并通过在Hematopoietic ProgenitorGrowth Media(HPGM；Biowhittaker)加入3U/ml EPO(红细胞生成素)、25ng/mlSCF、10ng/ml白细胞介素-3(IL-3)和10ng/ml白细胞介素-6(IL-6)在5％CO₂中37℃下扩增3-6天，或者通过在增补HPGM中加入2％去离子牛血清白蛋白、150μg/ml铁饱和人运铁蛋白、900μg/ml硫酸亚铁、90μg/ml硝酸亚铁、100μg/ml胰岛素、30μg/ml大豆卵磷脂和7.5μg/ml胆固醇和1×10^-6M氢化可的松(Sigma)，还含有50ng/ml Flt-3配体(FLT-3)，100ng/ml TPO(血小板生成素)，和100ng/ml SCF(干细胞因子)，在5％CO₂液体培养基中37℃培养4-6天进行扩增。然后这些细胞在含有3U/ml EPO(红细胞生成素)和50ng/mlIGF-1(胰岛素样生长素-1)的增补HPGM中，在5％CO₂液体培养基中37℃进一步扩增4-6天，被刺激表达CD36。

实例11：用FACS法从母体血液分选胎儿细胞

如实例10所述的方法制备表型改变的CD36⁺细胞，并用结合藻红蛋白(PE)的抗CD36(BD Pharmingen)和从那些如实例7所制备的抗体中选择的纯化的多克隆抗体(Bethel Labs，Montgomery，TX)进行免疫染色，所述抗体结合到荧光素或生物素上。如果使用结合生物素的抗体，就用抗生物素蛋白链菌素-APC(别藻蓝蛋白)(BD Pharmingen)结合物作检测试剂。所有免疫染色都按照标准方法在含有0.2％BSA的磷酸缓冲盐溶液(pH7.4)中4-8℃下进行。在抗体染色之前，细胞在1％Gamimune(Bayer HealthCare Research Triangle park，North Carolina)中在4-8℃孵育30分钟，以阻止非特异性抗体结合。按照使用说明书，免疫染色细胞在FACSVatage细胞分选机上(Becton Dickinson)被分类和进行分析。用488nm的氩离子激光激发荧光团，在525nm(荧光素)和575nm(PE和APC)处检测。对CD36和靶肽呈阳性染色的细胞被收集并在冰上贮存备用。对照细胞与结合荧光染料的同型匹配IgM-荧光素(BD Pharmingen)、IgM-PE(BD Pharmingen)或抗兔同型对照共同孵育。用前和侧向角散射排除细胞凝集体或残片。

实例12：从母体血液磁性分离胎儿细胞

表型改变的CD36⁺细胞如实例10所述进行制备，并用结合藻红蛋白的(PE)抗CD36(BD Pharmingen)和从那些如实例7所制备的抗体中选择的生物素共轭抗体(Bethel Labs，Montgomery，TX)进行免疫染色。双重标记的细胞与结合抗生物素蛋白链菌素的MACS微珠(Miltenyi Biotec)共同孵育并通过30μm尼龙网过滤，去除细胞团块和凝集体。按照使用说明书的指导，表达所选择的胎儿细胞标记物的细胞通过高梯度磁选柱可以从混合物中捕获。在洗脱未吸附的细胞之后，移走磁场，磁性吸附的胎儿细胞用SB从过柱上洗脱。洗脱物中的CD36⁺胎儿细胞也标记有PE。所有免疫染色按照标准方法，在含有0.2％BSA的DPBS缓冲液(pH7.2)在4-8℃下进行。

实例13：用RNA探针检测基因表达

实例7中识别的基因的胎儿细胞表达用RNA探针来表示。简要地说，按照说明书的提示使用体外转录体系中的Promega T-7核探针(Promega T-7Riboprobe In-vitro Transcriptiong System(Promega，Madison，WI.)，制备相应于一个或多个实例7所识别的基因的RNA模板，或者还可以从GeneDetect.com(Auckland，NZ)购得。5’-(α’³⁵S)rUTP可以从AmershamPharmacia Biotech(Piscataway，NJ)或NEN/Perkin Elmer(Boston，MA)获得。其它试剂可以从Promega获得，除非特别说明。缓冲液按照GeneDetectOne-Step RNA Probe Synthesis Templates说明书进行配制，除非另作说明。

制备RNA探针

RNA探针按如下方法制备。2μl 5X Transcription Buffer，1μl 100mM二硫苏糖醇(DTT)，1μl Rnasin Rnase抑制剂；lμg所需RNA模板在3μl水中；将2μlTranscription Buffer中混有分别为5μM的GTP、CTP和ATP的混合物，加到冷冻干燥在1.5mL微量离心管底部的25μl的³⁵S-UTP。经过混合，将1μl的T7 RNA Polymerase加到混合物中，并在30℃下混合和培养一个小时。为保证完全转录，在加入1μl RQ1 Dnase和在37℃下培养15分钟停止反应之前，加入第二个1μl量的T7 RNA Polymerase到混合物中，混合并在30℃下又培养一个小时。通过加入20μl 10mM的Tris-HCl/1mM EDTA(pH 8.0)缓冲液(TE)和50μg的tRNA，从反应混合物中回收RNA探针；旋转；并在G-50Sephadex柱(Amersham Pharmacia Biotech)脱盐。探针的完整性在Tris-Borate-EDTA(TBE)-Urea缓冲液的15％聚丙烯酰胺胶经电泳确定。

用RNA探针对胎儿细胞染色

如实例11所述的FACS法收集或如实例12所述经磁性分离收集的CD36⁺/肽⁺细胞，通过沉淀、CytoSpin(Thermo-Shandon，Pittsburgh，PA)、ThinPrep(Cytyc，Boxborough，MA)或相似的标准方法，在玻璃载玻片上制备成单层细胞制品。细胞被覆100μl的杂交缓冲液(HB)并在42℃培养1-3小时，使渗透到细胞。对每一个要处理的载玻片，2μl所需RNA探针和1μl 50mg/ml的tRNA相结合，并加热到95℃保持3分钟，然后加入17μl的HB冷却。将20μl的所得混合物在载玻片上加到100μl的HB小滴，45-55℃下培养过夜。标记的样品两次冲洗10分钟，每一次都用2×SSC-BME-EDTA在室温下冲洗；在室温下浸入到20mg/ml的Rnase A溶液30分钟；两次冲洗10分钟，每一次都在室温下用2×SSC-BME-EDTA冲洗；用4L 0.1×SSC-MBE-EDTA冲洗2个小时；用0.5×SSC在室温下冲洗2×10分钟；脱水2分钟，每一次都经过50％、70％和90％含有0.3M醋酸铵的乙醇进行脱水，并在真空干燥器中干燥。标记的细胞以标准的放射自显影法进行检测。

实例14：诊断测试胎儿细胞：显微镜测试和评估从母体血液分离的胎儿细胞

如实例11所述的FACS法收集或如实例12所述经磁性分离收集的CD36⁺/肽⁺细胞，通过未扰动沉淀、CytoSpin(Thermo-Shandon，Pittsburgh，PA)、ThinPrep(Cytyc，Boxborough，MA)或相似的方法以及如前所述的免疫染色，在玻璃载玻片上制备成单层细胞制品；并用本领域技术人员所熟知的荧光显微镜进行评估。对CD36和靶肽阳性染色的细胞的存在作为制剂中胎儿细胞存在的标志。然后用彩色染料如苏木精在原位复染制品，其中的细胞可形态学评估或使用原位杂交染色法如荧光原位杂交(FISH)检测制品中细胞内特定基因或突变基因的存在。所述复染的操作是本领域技术人员所熟知的。如果制品内CD36⁺/肽⁺细胞的物理位置被确定，这个位置信息可与形态学分析的结果相关联，或与制品中特定胎儿细胞原位杂交相关联。这种CD36⁺/肽⁺细胞与随后用其它试剂染色的相同细胞之间的关联很容易操作，使用市场可购得的自动显微镜系统如AcCell或TracCell计算机协助的显微镜系统(Molecular Diagnostics，Chicago，IL)进行操作。

实例15：诊断测试胎儿细胞：PCR检测从母体血液分离出的男性胎儿细胞中的Y染色体

如实例11所述的FACS法收集的CD36⁺/肽⁺细胞，用PCR确定它们是否含有一个Y染色体。简要地说，用修正了的盐沉淀法(Puregene DNA Isolation试剂盒，Gentra Systems，Minneapolis，MN)，将整个基因组DNA从分离的细胞中提取出来。针对GAPDH和SRY基因座，用传统的多聚酶链反应(PCR)来分析大约50-200ng的DNA，利用GeneAmp PCR系统9700Thermocycler(Perkin Elmer，Foster City，CA)、Platinum Taq DNA Polymerase(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)作为酶以及以下的步骤来操作。将薄壁PCR微量试管先于94℃培养2分钟使样品变性和激活酶。样品随即被扩增10个循环(前5个循环包括在94℃变性15秒和59℃下退火30秒的步骤，接下来的5个循环包括在94℃变性15秒和57℃下退火30秒的步骤)，之后的30个循环包括在94℃变性15秒和55℃下退火30秒的步骤。最后的扩增步骤为72℃下10分钟。SRY序列用于测定胎儿DNA，而甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用于确定每一个样品中DNA的完整性和质量。所使用的寡核苷酸为：SRY正向5′-TCC TCA AAA GAA ACC GTG CAT-3′序列号19)，SRY反向5′-AGA TTAATG GTT GCT AAG GAC TGG AT-3′(序列号20)，GAPDH正向5′-CCC CACACA CAT GCA CTT ACC-3′(序列号21)和GAPDH反向5′-CCT AGT CCCAGG GCT TTG ATT-3′(序列号22)。PCR产物用2％的琼胶电泳分离，并且从这些细胞而来的Y染色体特异DNA片段的存在，表明它们来自(男性)胎儿而不是来自母体。通过替换适当的Y染色体引物，可以相同的方式用PCR分析测定所收集细胞包括与特定疾病情况相关的细胞中特异基因和突变基因的存在。同样地，收集的细胞可通过FISH等方法作分析之用，如果使用适当探针的话。

实例16：诊断测试胎儿细胞：RT-PCR确定从母体血液分离的男性胎儿细胞中Y染色体

使用ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(Applied Biosystem，Foster City，CA)，针对如实例11所述分离的胎儿细胞进行实时定量PCR分析。可用β-球蛋白TaqMan系统作为内部对照，其由两个引物β-球蛋白-354(正向)5′-GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAG A-3′(序列号23)；β-球蛋白-455(反向)，5′-CCT TGA TAC CAA CCT GCC CAG-3′(序列号24)和一个双重标记的荧光TaqMan探针β-globin-402T，5′(FAM)AAG GTG AAC GTG GAT GAAGTT GGT GG(TAMRA)-3′(序列号25)构成。为测试如前述分离的胎儿样品中Y染色体的存在，可以使用SRY TaqMan系统，其由SRY-109(正向)引物，5′-TGG CGA TTA AGT CAA ATT CGC-3′(序列号26)；SRY-245(反向)引物，5′-CCC CCT AGT ACC CTG ACA ATG TAT T-3′(序列号27)和一个探针SRY-142T，5′(FAM)AGC AGT AGA GCA GTC AGG GAG GCA GA(TAMRA)-3′(序列号28)构成。使用TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)，以25μl的反应体积建立TaqMan扩增反应。DNA扩增在8孔光管/条(Applied Biosystems)中进行。TaqMan PCR条件如TaqMan使用指南所述，在95℃下为15秒，60℃下为1分钟，进行40个循环，在50℃下2分钟预孵育用于理想的AmpErase UNG活性和在95℃下10分钟预孵育用于激活AmpliTaq Gold DNA聚合酶。对每一个样品进行三次分析，并且为每一次分析做出一个校准曲线。

实例17：诊断测试胎儿细胞：利用从母体分离的胎儿细胞，用FISH确定胎儿的性别。

载玻片制备

如实例11和12分别所述分离的胎儿细胞，利用台式离心机在15mL带螺帽的试管中成颗粒状，并用含有10U/mL的肝素(ICN Biomedicals Inc，Aurora，OH)的HPGM洗涤一次。将细胞重悬浮在100到200μl的HPGM/肝素中。用PAP笔(Research Products International，Mt.Prospect，IL)在甲硅烷处理过的载玻片上标记一个长方形，并且100到200μl的细胞悬浮液散布于该长方形上。在室温(RM)下，载玻片培养30到45分钟使细胞沉降和附着在载玻片上。从载玻片边缘倾倒出多余的液体并风干载玻片。将载玻片在乙醇∶醋酸(3∶1)中固定15分钟并风干。在-80℃下储存载玻片备用。

荧光原位杂交(FISH)

在准备杂交的当天，样品在室温下(RT)解冻融化，在甲醇∶乙酸(3∶1)中再固定、风干，并用2X SSC(3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH7.0)在37℃培养30分钟进行预处理。接着在室温下经过一系列的不同乙醇浓度70、90和100％进行脱水。样品随即用胃蛋白酶(20mg/ml，Sigma)进行处理以提高探针的透过率，在70％甲酰胺/2×SSC中、72℃下变形2分钟，并如上所述在冰上系列脱水。600μl针对X和Y染色体α-卫星着丝点特异的每一个探针，16.8μl的CEP缓冲液(Vysis，Downers Grove，IL)和2μl的水混合。然后探针混合液在70℃变形5分钟并加到预热(37℃)的靶样品。杂交区域用玻璃盖玻片封住，置入80℃烘箱90秒。经过一夜的在37℃下潮湿小室内的杂交，移走盖玻片和胶。将载玻片用0.25×SSC在67℃下冲洗12秒，后在1×PBD(2-苯基-5-(4-联苯)-1，3，4，-噁二唑；ONCOR Gaithersburg，MD)中洗涤1分钟。在显微镜分析之前用DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚II；Vysis)复染样品10分钟。然后用Zeiss Axioskop显微镜(Carl Zeiss，Thornwood，NY)通过荧光显微分析确定X和Y染色体。

以上所述的特定的抗体和方法只是作为本发明的代表而不是限制。虽然优选实施例对本发明的一些抗体和方法进行了描述，但对本领域技术人员来说是明显的，即不同于在此所述的处理、组合物和/或方法都可以进行，并且不脱离本发明的原理、精神和范围。特别是，在此所描述的抗体可用不同的手段而制得，并且在此所描述的组合物和条件可以根据特定的细胞和样品类型而改变，但仍然可以获得相同或相似的在此所描述的结果。对本领域技术人员来说，所有类似的替换物和修正被认为都没有超出如所附加的权利要求所限定的本发明的精神范围。

序列表

<110>伊利诺伊大学董事会(Sharma，ArunElias，Sherman)

<120>与胎儿而非成体CD34+/CD36+细胞结合的抗体

<130>04-488-B

<150>60/579,693

<151>2004-06-14

<150>60/618,963

<151>2004-10-15

<160>28

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>1

Asn Thr Thr Gln Pro Lys Leu Leu Ala Pro His Gln His Glu Lys Ser

1               5                   10                  15

Gln Lys Lys Ser

            20

<210>2

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>2

Cys Ile Asn Ala Leu Ser Ser Asn Leu Lys Ser Pro Arg Leu Ser Gln

1               5                   10                  15

Pro Ala Glu Glu

            20

<210>3

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>3

Phe Thr Pro Lys Gly Ile Thr Ile Pro Gln Arg Glu Lys Pro Gly His

1               5                   10                  15

Met Tyr Gln Asn

            20

<210>4

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>4

Tyr Ser Asn Asn Pro Gly Ser Ser Phe Ser Ser Thr Gln Ser Gln Asp

1               5                   10                  15

His Ile Gln Gln

            20

<210>5

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>5

Phe Ser Gln Ala Glu Lys Pro Glu Pro Thr Asn Gln Gly Gln Asp Ser

1               5                   10                  15

Leu Lys Lys His

            20

<210>6

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>6

Pro Ala Ser Leu Gln Cys Glu Leu Asp Lys Asn Asn Ile Pro Thr Arg

1               5                   10                  15

Ser Tyr Val Ser

            20

<210>7

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>7

His Glu Leu Gly Gly Ser Glu Asp Cys Val Glu Val Gln Pro Asp Gly

1               5                   10                  15

Arg Trp Asn Asp

            20

<210>8

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>8

Leu Gln Val Tyr Arg Trp Val Cys Glu Lys Arg Arg Asn Ala Thr Gly

1               5                   10                  15

Glu Val Ala

<210>9

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>9

Met Asp Ser Ser Thr Ala His Ser Pro Val Phe Leu Val Phe Pro Pro

1               5                   10                  15

Glu Ile Thr Ala

            20

<210>10

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>10

Thr Phe Gly Phe Ile Leu Asp Gln Asn Tyr Ile Cys Gly Tyr Ser His

1               5                   10                  15

Gln Asn Ser Gln

            20

<210>11

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>11

Cys Asn Thr Thr Gln Pro Lys Leu Leu Ala Pro His Gln His Glu Lys

1               5                   10                  15

 Ser Gln Lys Lys Ser

             20

<210>12

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>12

Cys Cys Ile Asn Ala Leu Ser Ser Asn Leu Lys Ser Pro Arg Leu Ser

1               5                   10                  15

Gln Pro Ala Glu Glu

            20

<210>13

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>13

Cys Phe Thr Pro Lys Gly Ile Thr Ile Pro Gln Arg Glu Lys Pro Gly

1               5                   10                  15

His Met Tyr Gln Asn

            20

<210>14

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>14

Cys Tyr Ser Asn Asn Pro Gly Ser Ser Phe Ser Ser Thr Gln Ser Gln

1               5                   10                  15

Asp His Ile Gln Gln

            20

<210>15

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>15

Cys Phe Ser Gln Ala Glu Lys Pro Glu Pro Thr Asn Gln Gly Gln Asp

1               5                   10                  15

Ser Leu Lys Lys His

            20

<210>16

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>16

Cys Pro Ala Ser Leu Gln Cys Glu Leu Asp Lys Asn Asn Ile Pro Thr

1               5                   10                  15

Arg Ser Tyr Val Ser

            20

<210>17

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>17

Cys Ala Met Asp Ser Ser Thr Ala His Ser Pro Val Phe Leu Val Phe

1               5                   10                  15

Pro Pro Glu Ile Thr Ala

            20

<210>18

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>18

Cys Ala Thr Phe Gly Phe Ile Leu Asp Gln Asn Tyr Ile Cys Gly Tyr

1               5                   10                  15

Ser His Gln Asn Ser Gln

            20

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>19

tcctcaaaag aaaccgtgca t                                                  21

<210>20

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>20

agattaatgg ttgctaagga ctggat                                            26

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>21

ccccacacac atgcacttac c                                                 21

<210> 22

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>22

cctagtccca gggctttgat t                                                 21

<210>23

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>23

gtgcacctga ctcctgagga g                                                    21

<210>24

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>24

ccttgatacc aacctgccca g                                                    21

<210>25

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>5’-FAM

<220>

<221>misc_feature

<222>(26)..(26)

<223>3’-TAMRA

<400>25

aaggtgaacg tggatgaagt tggtgg                                            26

<210>26

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>26

tggcgattaa gtcaaattcg c                                                 21

<210>27

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>27

ccccctagta ccctgacaat gtatt                                               25

<210>28

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>5’-FAM

<220>

<221>misc_feature

<222>(26)..(26)

<223>3’-TAMRA

<400>28

agcagtagag cagtcaggga ggcaga                                            26

Claims (26)

1.特异性地与细胞抗原结合的抗体，该抗原可被CD36⁺胎儿肝细胞可检测地表达而不能被CD36⁺成体外周血细胞可检测地表达。

2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体特异性地与细胞抗原MS4A10、MS4A7、MS4A6A、ASGR2或MS4A5结合。

3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体特异性地与细胞抗原结合，所述细胞抗原由以下基因所编码：AD026，AD037，AKNA，ASGR2，C1 QG，CREM，CSPG2，CXCL16，DCNP1，GPR84，HRB2，JDP2，KCNJ2，MAFB，MGC21854，MRC1，MS4A4A，MS4A6A，MS4A7，MS4A10，MS4A5，MS4A6A，NMES1，PAG，PARVG，PKIB，PRAM-1，PTGFRN，RASGRP4，RCP，S100A8，S100A9，或TIM3。

4.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体特异性地与包括EST的基因所编码的细胞抗原结合，所述EST为AA988769，AI915629，AI681260，AW006441，AV660825，AW135176，AI741439，AV688087，AV646597，AW575863，BF892532，AI536637，AL039884，BE549540，AW303397或AW872374。

5.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体连接着一种结构，该结构为荧光团、放射性同位素、发色团、酶、生物素、抗生物素蛋白、外源凝集素或微粒。

6.多种权利要求1所述的抗体，包括纯化了的抗血清。

7.根据权利要求1所述的抗体，该抗体为单克隆抗体。

8.一种从生物液体中分离胎儿细胞的方法，包括步骤：

a).从生物液体中分离CD34⁺细胞；

b).刺激分离的CD34⁺细胞表达CD36；和

c).用一种或多种权利要求1的抗体，将步骤b)的受刺激的细胞群中的胎儿细胞与非胎儿细胞分离。

9.根据权利要求8所述的方法，其中CD34⁺细胞最初在细胞因子Flt-3配体、TPO(血小板生成素)和SCF(干细胞因子)的存在下受刺激增殖，之后在EPO(红细胞生成素)、SCF、白细胞介素-3(IL-3)和白细胞介素-6(IL-6)或IGF-1的存在下受刺激表达CD36抗原。

10.根据权利要求8所述的方法，其中胎儿细胞通过荧光激活细胞分类(FACS)法与非胎儿细胞分离。

11.根据权利要求8所述的方法，其中胎儿细胞通过亲和层析法与非胎儿细胞分离。

12.根据权利要求8所述的方法，其中胎儿细胞通过磁性分离法与非胎儿细胞分离。

13.根据权利要求8所述的方法，其中所述生物液体为成体外周血、其血浆或其血清或唾液。

14.一种检测生物液体中胎儿细胞的方法，包括步骤：

a).从生物液体分离CD34⁺细胞；

b).刺激分离的CD34⁺细胞表达CD36；

c).利用一种或多种权利要求1的抗体，结合或标记一种或多种被胎儿细胞明显表达而不被非胎儿细胞明显表达的基因产物；和

d).通过流式细胞术、显微镜或放射线照相检测标记的胎儿细胞。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述生物液体是成体外周血、其血浆或其血清或唾液。

16.一种检测生物液体中胎儿细胞的方法，包括：

a).从生物液体中分离CD34⁺细胞；

b).刺激分离的CD34⁺细胞表达CD36；

c).用一种或多种可检测的标记探针标记一种或多种基因或基因产物，所述基因或基因产物为AD026，AD037，AKNA，ASGR2，C1 QG，CREM，CSPG2，CXCL16，DCNP1，GPR84，HRB2，JDP2，KCNJ2，MAFB，MGC21854，MRC1，MS4A4A，MS4A6A，MS4A7，MS4A10，MS4A5，MS4A6A，NMES1，PAG，PARVG，PKIB，PRAM-1，PTGFRN，RASGRP4，RCP，S100A8，S100A9，或TIM3；和

d).用流式细胞术、显微镜或放射线照相检测标记的胎儿细胞。

17.根据权利要求16所述的方法，其中可检测的标记探针是mRNA探针或核探针。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述生物液体是成体外周血、其血浆或其血清或唾液。

19.一种诊断方法，其中根据权利要求8所获得的胎儿细胞用FISH、PCR或实时PCR进行遗传学分析。

20.根据权利要求11所述的方法，其中所述亲和层析法是利用结合有或连接有不溶性支撑物的权利要求1的抗体进行的。

21.根据权利要求12所述的方法，其中磁性分离是利用结合有或连接有磁微粒支撑物的权利要求1的抗体进行的。

22.一种产生特异性地与细胞表面抗原结合的抗体的方法，该抗原可被CD36⁺胎儿肝细胞可检测地表达而不能被CD36⁺成体外周血细胞可检测地表达，该方法包括步骤：

a).从生物液体中分离CD34⁺细胞；

b).刺激分离的CD34⁺细胞表达CD36；

c).分离在步骤(c)受刺激的CD36⁺细胞；

d).从胎儿肝组织分离CD34⁺细胞；

e).刺激分离的胎儿肝脏的CD34⁺细胞表达CD36；

f).从在步骤(e)受到刺激的胎儿肝细胞中分离CD36⁺细胞；

g).从步骤(c)的CD36⁺细胞和步骤(f)的CD36⁺胎儿肝细胞分离总RNA；

h).从步骤(g)的CD36⁺细胞而来的总RNA和从CD36⁺胎儿肝细胞而来的总RNA杂交到cDNA微阵列；

i).识别编码细胞蛋白质的基因，所述蛋白质被CD36⁺胎儿肝细胞明显地表达而不能被CD36⁺成体外周血细胞明显地表达；

j).获得如此识别的细胞表面蛋白质或来源其的肽；和

k).用所述细胞表面蛋白质或其肽作为抗原，制备抗识别的细胞表面蛋白质的抗体。

20.根据权利要求22所述的方法，其中CD34⁺细胞在细胞因子Flt-3配体、TPO(血小板生成素)和SCF(干细胞因子)存在下被刺激增殖，或在Flt-3配体、TPO(血小板生成素)和SCF(干细胞因子)存在下，通过在HPGM中加入2％去离子牛血清白蛋白、150μg/ml铁饱和的人运铁蛋白、900μg/ml硫酸亚铁、90μg/ml硝酸铁、100μg/ml胰岛素、30μg/ml大豆卵磷脂和7.5μg/ml胆固醇和1×10^-6M氢化可的松的条件下被刺激增殖。

21.根据权利要求22所述的方法，其中CD36⁺细胞是在EPO(红细胞生成素)、SCF、白细胞介素-3(IL-3)和白细胞介素-6(IL-6)的存在下或含有3U/mlEPO(红细胞生成素)、50ng/ml IGF-1(胰岛素样生长素-1)和50ng/ml SCF的HPGM中产生的。

22.根据权利要求22所述的方法，其中微阵列是由cDNA制备的，所述cDNA为人cDNA FLJ30298 fis，克隆BRACE2003172，人cDNA FLJ33028 fis，克隆THYMU2000140，或人cDNA FLJ21545 fis，克隆COL06195。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述的生物液体是成体外周血、其血浆或其血清或唾液。

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