CN102203609B

CN102203609B - 用于输血相关急性肺损伤(trali)的筛选方法

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Publication number: CN102203609B
Application number: CN200980144058.0A
Authority: CN
Inventors: A·格雷纳赫尔; J·韦谢; J·布克斯; A·雷尔
Original assignee: Ernst Moritz Arndt Universitaet Greifswald; DRK Blutspendedienst West gGmbH
Current assignee: Universitaet Greifswald; DRK Blutspendedienst West gGmbH
Priority date: 2008-09-04
Filing date: 2009-09-03
Publication date: 2017-07-11
Anticipated expiration: 2029-09-03
Also published as: AU2009289809A8; AU2009289809B2; US8084216B2; US20130189696A1; US20150203915A1; US20120070834A1; WO2010025915A1; US8999651B2; EP2321644B1; JP2012501631A; BRPI0918233A2; US20100055706A1; EP2321644A1; BRPI0918233B8; AU2016204135A1; AU2009289809A1; CA2735138C; CA2735138A1; US9963741B2; US8435733B2

Abstract

本发明发现了HNA‑3a和HNA‑3b为具有高度类似于CTL2氨基酸序列的多肽序列的抗原。本发明也提供了用于筛选意欲移植的生物组织的样品中的HNA‑3a和HNA‑3b特异性抗体、HNA‑3a和HNA‑3b多肽以及HNA‑3a和HNA‑3b核酸的方法和试剂盒。

Description

用于输血相关急性肺损伤(TRALI)的筛选方法

相关申请

本申请要求2008年9月4日申请的德国申请No.10 2008 045 696.9的优先权，该申请通过引用整体合并于此。

技术领域

本发明涉及HNA-3a和HNA-3b多肽抗原序列的鉴定，该抗原与输血相关急性肺损伤(TRALI)综合症的发生有关。本发明提供筛选用于移植或输血的生物组织样品中HNA-3a和HNA-3b特异抗原、HNA-3a和HNA-3b多肽和HNA-3a和HNA-3b核苷酸的方法和试剂盒。本发明还涉及测定用于移植或输血的捐献组织是否会导致TRALI的方法和试剂盒。本发明还进一步提供了测定人类的移植或输血受体发生TRALI易感性的方法和试剂盒。

背景技术

研究表明人类嗜中性白细胞特异抗原(HNA)的抗体可导致临床并发症如肺部输血反应和某些情况下的输血相关急性肺损伤TRALI(Popovsky等.Am.Rev.Resp.Dis.128(1)：185-9，1983)或导致同种免疫性新生儿中性粒细胞减少症(NAIN)(Bux，等.Transfus.Med.2(2)：143-9，1992)。因此，检测HNA特异抗体具有重要的临床应用。

在美国，TRALI是危及生命的输血并发症，也是输血相关性死亡的最频繁原因之一。在欧洲，提供ABO血型不合贮藏血后TRALI是输血相关性死亡的第二最频繁的原因(Holness等.Transfus Med Rev.18：184-188，2004)。作为输血并发症发生TRALI的风险至少比感染HIV或C型肝炎高2000倍。

TRALI被定义为包括输血后6小时内突发急性呼吸短促的临床症状，与无心功能不全或心脏超负荷的双侧肺浸润症(肺水肿)有关(欧洲血液预警系统网络EHN。输血不良事件的定义。www.ehn-org.net)

TRALI综合症不易被诊断，因为起初其通常与脱离输血的肺功能不足或其最大变体ARDS(“获得性呼吸窘迫综合症”)(Popovsky& Moore，Transfusion 25：573-577，1985)没有区别。TRALI的症状包括血氧过少、心跳过速、低血压、发绀和发烧。由于其症状通常被归因于其他原因如体液超负荷，临床上TRALI常常被忽略或误诊。TRALI已与所有含有血液成分的血浆输血相关，包括全血，红细胞浓缩液，新鲜冷冻血浆、血小板、混合血小板、静脉丙种球蛋白、冷沉淀、干细胞和粒性白细胞衍生的全血。TRALI是肺毛细血管损伤；因此其治疗集中在呼吸支持和盐的输入。

TRALI是一种免疫相关性疾病，其主要与HNA、粒细胞及人白细胞抗原(HLA)I型的特异抗体相关。在输血接收者体内导致TRALI的其他因素包括生物活性脂肪和人白细胞抗原(HLA)II型抗体。大多数情况，供体(供体血浆中)的抗体随贮藏血一起输送，然后与受体的白细胞(粒细胞)反应。抗体与粒细胞的结合导致其活化和部分聚集。通过从粒细胞中不断释放杀菌武器，毛细血管内皮受到损伤而导致肺水肿。该免疫反应诱导补体活化粒细胞释放氧自由基和蛋白酶而损伤毛细血管内皮，导致富含蛋白质的液体流入肺泡和间质组织。此外，贮藏血中的抗体会结合并活化受体的粒细胞而导致粘附分子的表达(Uchiyama等.Transfu.s Med.Rev.8：84-95，1994)，粒细胞进入到肺泡和肺部血管内皮之间的间隙中，并释放细胞因子、蛋白酶和氧自由基(Snyder，.Immol Invest.24：333-9，1994)。这些细胞的作用导致毛细血管壁损伤和随后的渗透性过高。肺水肿就发生了，而且10％的患者死于这种并发症。

TRALI中受体的抗体很少与供体的粒细胞反应(Bux等.，Br.J.Heamatol.93：707-713，1996)。然而，TRALI也有过由输血受体的抗体而引起的情况。在极少数情况，抗-IgA-抗体也会引起TRALI(Saigo等.，J.Int.Med.Res.27：96-100，1999)。

多胞胎妇女献血带有特别的风险，因为在怀孕期间会发生抗粒细胞或HLA抗原的抗体形成。同样，病人可能由于先前的输血而得到免疫(Voss等.，Anaesthesist 50：930-932，2001)。会导致TRALI的供体血浆在临床上无法检测出来。目前生产的红细胞浓缩液含很少的血浆和少数粒细胞，因此在提供新鲜血浆和血小板浓缩液后极有可能发生TRALI。

除HLA抗体以外，抗3种不同粒细胞抗原系统的抗体被认为是导致TRALI的原因(Leger等.Anesthesiology 91：1529-1532，1999；Davoren等，Transfusion 43：641-645，2003；Kopko等.JAMA 287：1968-1971，2000；Reil等.Vox Sanguinis(printing，alreadyaccessible online)，2008年。其中两种抗原系统(HNA-1和HNA-2)已知与其结构和定位有关。抗原HNA-2的特征由Dr.Bux教授描述并申请了专利(DE 100 28 725 A1)。第三种抗原系统HNA-3(包括对立的抗原HNA-3a和HNA-3b)未被描述。抗原HNA-3a在大约95％的人口中存在(Davoren等，Transfusion 43：641-645，2003)，并且尤其频繁地与TRALI的发病过程相关(Reil等.，Vox Sanguinis(印刷版，网上也有)，2008)。

根据英国输血副作用通告和评估中心、SHOT(输血的严重危害)当前的报道，TRALI是输血引起的严重副作用的最频繁原因。该报告表明1996～2003年(SHOT)死亡率为9％，增加的1996～2003年积累资料。www.shotuk.org)。自2001年以来，美国食品和药物管理局同样报道TRALI为输血相关性并发症的主因(Goldman等.，Transfus.Med.Rev.19：2-31，2005；Boshkov，Vox Sang.83：299-303，2002)。

目前，大多数血液和组织捐献者还未进行HNA分型。嗜中性白细胞免疫生物学的特殊特性，HNA分型血清的缺乏和检测新鲜的嗜中性白细胞位置的需要限制了HNA相容血液成分的分型。高百分比的TRALI发生率是由于女性捐献的血液，尤其是多胞胎女性，并由于输送新鲜冷冻血液。当前减少TRALI发生的建议方案包括排除所有女性捐献者，排除多胞胎(3胎或更多胎)女性捐献者，并减少输送新鲜、冷冻血液。

目前，粒细胞特性抗体的检测很费力；并且供体血清中HLA抗体的检测也不充分。目前最可靠的TRALI风险测定在于供体血清和患者白细胞之间的交叉匹配。该检测只能在特别的实验室实施，其不适合用作供体筛选(Voss，Anaesthesist 50：930-932，2001)。目前其他策略倾向于更严格的供体管理(Mair等.，Crit.Care Med.34：137-143，2006)(如上述)。由于将怀孕后的女性排除在供体之外使得贮藏血量严重减少，这令人无法接受。

对于排除女性供体加拿大做了系统的调查。通过排除多胞胎女性供体，12％的总献血量将会从加拿大捐血服务中心减除(Goldman等Transfus.Med.Rev.19：2-31，2005)。根据一些研究，实施该策略会排除三分之一潜在的女性供体(Densmore等.，Transfusion 39：103-106，1999)。一个可供选择的策略是对所有的贮藏血进行粒细胞特性抗体检测。目前这在技术上无法实施。也有其他策略建议处理血液成分，但这些策略会涉及新的风险如细菌感染，并且由于其需要时间而只适合于计划好的输血。而不适合紧急情况(Mair等.，CritCare Med.34：137-143，2006)。另外，对于这些策略是否确实能减少TRALI发生的风险还缺乏证据。

已知人嗜中性白细胞抗原也被称为嗜中性白细胞特异抗原或HNA。目前有5种HNA抗原系统：HNA-1，HNA-2，HNA-3，HNA-4和HNA-5。HNA-1，2，4和5的等位基因已被鉴定出来，并且对应的糖蛋白也被描述；然而，HNA-3的等位基因还处于未知状态(reviewed byStroncek，ASHI Quarterly 2004)。有3种HNA-1抗原(HNA-1a，HNA-1b and HNA-1c)仅在嗜中性白细胞中表达并位于低亲合力Fc-γ受体IIIb。HNA-2系统已建立一个很好的抗原(HNA-2a)。HNA-2只在嗜中性白细胞和嗜中性白细胞的前体中表达，并且位于糖蛋白CD177(NB 1 gp)上。HNA-4和HNA-5位于β2整合素上。HNA-4表达于粒细胞、单核白细胞和淋巴细胞(参见Stroncek，ASHI Quarterly 2004)。

HNA-3系统有个已知的抗原HNA-3a，也已知为5b。HNA-3表达于嗜中性白细胞、淋巴细胞、血小板、内皮细胞、肾脏、脾脏和胎盘细胞，并且已知位于70～95kDa嗜中性白细胞的糖蛋白上(See Stroncek，ASHI Quarterly 2004)。HNA-3a基因还未被克隆，且糖蛋白的特性和功能之前也是未知的。因此，目前HNA-3抗体的检测仅仅基于非特异性的检测，如凝集检测(Lalezari & Bernard，Transfusion 5：135-42，1965)或GIFT-FC检测(Davoren等.，Transfusion 43(5)：641-5，2003)。

推定的HNA-3等位基因，也已知为5b，有约0.82基因频率(Van Leeuwen等.VoxSang 9：431-46，1964)。也有报道其有0.66基因频率(Lalezari & Bernard，Transfusion5：135-42，1965)。据报道该5b蛋白的分子量为70～95kD(De Haas等，Transfusion 40(2)：222-7，2000)，同样该5b基因也未被克隆，且该蛋白的特性和功能还处于未知状态。

本发明关注的CTL2是706个氨基酸的跨膜蛋白(约80.152kD)，其包含10个螺旋跨膜结构域。该蛋白也被称为SLC44A2，DKFZp666A071 2，FLJ44586 2和PP1292，也已知与内耳中的胆碱转运系统有关，且表达于内耳支持细胞上。编码CTL2的基因位于染色体19p13上。此外，该抗原，即内耳支持细胞抗原(IESCA)已知为CTL2蛋白，其易与自身免疫性感音神经性聋相关的自身抗体反应。

目前，移植组织或导致TRALI的HNA抗体输血的筛选和分型方法还不够恰当且存在问题。此外，将一大部分的人口排除在捐献血液和组织之外是个极端的方案。因此，强烈需要研究出筛选HNA抗原的方法。

因此，本发明的一个目的就是弄清与TRALI相关的人嗜中性白细胞抗原-3a或-3b(HNA-3a，HNA-3b)的蛋白质或DNA序列，并提供相应的序列。

发明概述

本发明涉及如下发现：HNA-3a在氨基酸序列SEQ ID NO：1的区域之内且HNA-3b在氨基酸序列SEQ ID NO：3b范围之内，且这些氨基酸序列与胆碱转运类蛋白2(CTL2)的氨基酸序列高度类似于。

胞外环上密码子154内的单核苷酸多态性(SNP)现象是至关重要的(SNPrs2288904)，这是由于该SNP为HNA-3a和HNA-3b之间的不同。。编码HNA-3a的多核苷酸在461位置有一个″G″(鸟嘌呤)且因此在HNA-3a氨基酸序列的154位置编码″R″(精氨酸，Arg)，因此表现为HNA-3a等位基因。编码HNA-3b的多核苷酸在461位置有一个″A″(腺嘌呤)且因此在氨基酸序列的154位置编码“Q”(谷氨酰胺，Gln)，因此表现为HNA-3b等位基因。

有人提出HNA-3基因的密码子154内SNP的存在导致一部分种群如果暴露于抗HNA-3抗原，可产生HNA-3a或HNA-3b的异体抗体。这种差异允许部分的种群具有两种抗HNA-3特异性抗体之一，且当暴露于包含外源HNA-3抗原的血液或组织时，将诱导受体的输血相关急性肺损伤。

本发明提供了检测生物样品中HNA-3a特异性抗体的方法，该方法包括a)获得生物样品，b)接触生物样品与转化或转染用以表达SEQ ID NO：1的HNA-3a多肽或其片段的细胞，来在样品中与HNA-3a形成复合物，和c)检测复合物，其中存在复合物则表明生物样品中包含HNA-3a特异性抗体。

前述的方法可采用包括选自下组的氨基酸序列的抗原片段进行：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42。

本发明也提供了检测生物样品中HNA-3b特异性抗体的方法，该方法包括a)获得生物样品，b)接触生物样品与转化或转染以表达SEQ ID NO：2的HNA-3b多肽或其片段的细胞，来在样品中与HNA-3b形成复合物，以及检测复合物，其中复合物存在则表明生物样品包含HNA-3b的特异性抗体。

优选的方法可采用包括选自下组的氨基酸序列的抗原片段来进行：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、和SEQ IDNO：26。

本发明意欲利用任意的包括那些不内源表达HNA-3a或HNA-3b的细胞类型，诸如B细胞、CHO细胞或昆虫细胞，以使得细胞表达异源的HNA-3a或HNA-3多肽。术语“异源的”是指细胞学元件，例如DNA或蛋白来自不同种或不同的细胞类型。

本发明也意欲利用表达低水平的HNA-3a或HNA-3b的细胞和通过插入异源的启动子或增强子增加内源蛋白的表达，或增加HNA-3a或HNA-3b基因的拷贝数。可适用的示例性细胞包括EB-3细胞和K-562细胞。

本发明也提供了检测生物样品中HNA-3a特异性抗体的方法，该方法包括a)获得生物样品，b)接触生物样品与类似SEQ ID NO：1的HNA-3a多肽的抗原片段的适配子，来在样品中与HNA-3a特异性抗体形成复合物，和c)检测复合物，其中复合物存在则表明生物样品包含HNA-3a特异性抗体。这些方法可采用模仿包括选自下组的氨基酸序列的抗原片段的适配子进行：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQID NO：18、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42。

本发明也提供了检测生物样品中HNA-3a特异性抗体的方法，该方法包括a)获得生物样品，b)接触生物样品与模仿SEQ ID NO：2的HNA-3b多肽的抗原片段的适配子，来在样品中与HNA-3b特异性抗体形成复合物，和c)检测复合物，其中复合物存在则表明生物样品包含HNA-3b特异性抗体。这些方法可采用模仿包括选自下组的氨基酸序列的抗原片段的适配子来进行：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQID NO：24、和SEQ ID NO：26。

本发明提供了筛选意欲用于移植或输血的供体组织中HNA-3a和/或HNA-3b特异性抗体的方法，根据HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的存在，来确定是否供体组织在表达HNA-3a或HNA-3b的人受体中将诱导TRALI或移植物抗宿主病(GVHD)。

在一个实施方案中，本发明提供测定是否意欲用于移植或输血的供体组织将在人受体中诱导TRALI或GVHD的方法，其中人受体表达HNA-3a抗原，该方法包括a)获得意欲人受体中用于移植或输血的组织样品，b)接触样品与包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的多肽或其抗原片段，由此在样品中与HNA-3a特异性抗体形成复合物，和c检测复合物，其中复合物存在则表明供体组织很可能在表达HNA-3a抗原的人受体中诱导TRALI或GVDH。这些方法可采用选自下组的HNA-3a氨基酸序列(SEQ ID NO：SEQ ID NO：1)的抗原片段进行：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42。

在另一个实施方案中，本发明提供了测定是否意欲用于移植或输血的供体组织将在人受体中诱导TRALI或GVHD的方法，其中人受体表达HNA-3b抗原，该方法包括a)获得意欲人受体中用于移植或输血的组织样品，b)接触样品与包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的多肽或其抗原片段，由此在样品中与HNA-3b特异性抗体形成复合物，和c检测复合物，其中存在复合物则表明供体组织很可能在表达HNA-3b抗原的人受体中诱导TRALI或GVDH。这些方法可采用选自下组的HNA-3b氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的抗原片段来进行：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、和SEQ ID NO：26。

在进一步的实施方案中，本发明提供了测定意欲用于移植或输血的供体组织是否将在人受体中诱导TRALI或GVHD的方法，所述的人受体表达HNA-3a或HNA-3b抗原，其中除检测HNA-3a或HNA-3b特异性抗体外，该方法进一步包含一个或多个下述步骤：接触样品与Fc-γ受体IIIb多肽或抗原片段由此来在样品中与HNA-1特异性抗体形成复合物，接触样品与CD177多肽或其抗原片段来在样品中与HNA-2特异性抗体形成复合物，接触样品与CD11b多肽或其抗原片段来在样品中与HNA-4特异性抗体形成复合物，接触样品与CD11a多肽或其抗原片段来在样品中与HNA-5特异性抗体形成复合物，或接触样品与HLA抗原来在样品中与HLA特异性抗体形成复合物，以及检测复合物，其中存在任何复合物时则表明样品很可能在人受体中诱导TRALI或GVHD。

本发明也提供了筛选用于HNA-3a和/或HNA-3b特异性抗体的移植或输血受体的方法。该方法是有意义的，因为如果用于移植或输血的供体组织包括HNA-3a或HNA-抗原，则受体如果包括相应抗原的抗体则移植或输血组织很可能将被排斥。在排斥中，受体的抗体将结合和靶向外源组织，从而通过其免疫系统破坏该组织。

在一个实施方案中，本发明提供测定人移植或输血受体排斥移植或输血组织的敏感性的方法，其中供体组织包含HNA-3a多肽或其抗原片段，该方法包括a)在移植或输血前，由人移植或输血受体获得生物样品，b)接触生物样品与包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的多肽或其抗原片段，由此在生物样品中与HNA-3a特异性抗体形成复合物，和c)检测复合物，其中生物样品中存在复合物则表明人移植或输血受体对于排斥移植或输血组织易感。这些方法可采用选自下组的HNA-3a氨基酸序列(SEQ ID NO：SEQ ID NO：1)的抗原片段进行：SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42。

在另一个实施方案中，本发明提供了测定人移植或输血受体排斥移植或输血组织的敏感性的方法，其中供体组织包含HNA-3b多肽或其抗原片段，该方法包括a)在移植或输血前，由人移植或输血受体获得生物样品，b)接触生物样品与包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的多肽或其抗原片段，由此在生物样品中与HNA-3b特异性抗体形成复合物，和c)检测复合物，其中生物样品中存在复合物则表明人移植或输血受体对于排斥移植或输血组织易感。这些方法可采用选自下组的HNA-3b氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的抗原片段来进行：SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、和SEQID NO：26。

在进一步的实施方案中，本发明提供了测定排斥移植或输血组织的敏感性的方法，所述的供体组织包含HNA-3a或HNA-3b多肽或其抗原片段，其中除检测HNA-3a或HNA-3b特异性抗体外，本发明提供方法进一步包含一个或多个下述步骤：接触生物样品与Fc-γ受体IIIb多肽或抗原片段由此来在生物样品中与HNA-1特异性抗体形成复合物，接触生物样品与CD177多肽或其抗原片段来在生物生物样品中与HNA-2特异性抗体形成复合物，接触生物样品与CD11b多肽或其抗原片段来在生物生物样品中与HNA-4特异性抗体形成复合物，接触生物样品与CD11a多肽或其抗原片段来在生物样品中与HNA-5特异性抗体形成复合物，或接触生物样品与HLA抗原来在生物样品中与HLA特异性抗体形成复合物，和检测该复合物，其中生物样品中存在任意复合物则表明人移植或输血受体对于排斥移植或输血组织是易感的，其中供体组织包含任一项的HNA-1，HNA-2，HNA-3a，HNA-3b，HNA-4，HNA-5和HLA。

任一项前述的方法可采用模仿HNA-3a或HNA-3b抗原表位且因此结合HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的适配子来进行。

本发明提供筛选供体组织中HNA-3a和/或HNA-3b抗原的方法。当移植或输血受体已知表达HNA-3a或HNA-3b抗体时，筛选HNA-3a或HNA-3b抗原是重要的。受体的抗体可结合供体组织内的细胞导致或增加移植或输血组织的排斥的危险。

在一个实施方案中，本发明提供测定是否意欲用于移植或输血的供体组织将在人受体中可能被排斥的方法，其中人受体表达HNA-3a特异性抗体，该方法包括a)获得意欲人受体中用于移植或输血的组织样品，b)接触样品与特异性结合包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的HNA-3a多肽的抗体，由此在样品中与HNA-3a特异性抗体形成复合物，和c)检测复合物，其中存在复合物则表明供体组织很可能在表达HNA-3a特异性抗体的人受体中被排斥。

在另一个实施方案中，本发明提供测定是否意欲用于移植或输血的供体组织将在人受体中可能被排斥的方法，其中人受体表达HNA-3b特异性抗体，该方法包括a)获得意欲在人受体中用于移植或输血的组织样品，接触样品与特异性结合包括氨基酸序列SEQ IDNO：2的HNA-3b多肽的抗体，由此在样品中与HNA-3b特异性抗体形成复合物，及检测复合物，其中存在复合物则表明供体组织很可能在表达HNA-3b特异性抗体的人受体中被排斥。

在进一步的实施方案中，本发明提供了测定意欲用于移植和/或输血的供体组织是否将在人受体中诱导TRALI和/或GVHD的方法，所述的人受体具有HNA-3a和/或HNA-3b特异性抗体，其中除检测HNA-3a和/或HNA-3b抗原外，本发明提供方法进一步包含一个和/或多个下述步骤：接触样品与特异性结合HNA-1的抗体来在样品中与HNA-1形成复合物，接触样品与特异性结合HNA-2的抗体来在样品中与HNA-2形成复合物，接触样品与特异性结合HNA-4的抗体来在样品中与HNA-4形成复合物，接触样品与特异性结合HNA-5的抗体来在样品中与HNA-5形成复合物，或接触样品与特异性结合HLA抗原的抗体来在样品中与HLA形成复合物，以及检测复合物，其中存在任何复合物则表明样品很可能在人受体中诱导TRALI或GVHD。

在上述任一项方法中，抗体可包含选自下组的标记：放射性标记、荧光标记、酶标记、亲和素标记或生物素标记。另外，在任一项上述的方法中，抗原-抗体复合物可用第二抗体检测。第二抗体可包含选自下组的标记：放射性标记、荧光标记、酶标记、亲和素标记或生物素标记。

本发明进一步提供了移植或输血供体的HNA-3a或HNA-3b等位基因的基因分型的方法。术语“基因分型”是指检测特定等位基因的存在，也即，人受体的HNA-3a或HNA-3b。当意欲移植或输血受体已知表达HNA-3a或HNA-3b抗体时，这些方法是有意义的，因此HNA-3a或HNA-3b抗原在输血或转染组织中分别存在时很可能被受体排斥。基因分型的方法可使用检测HNA-3a或HNA-3b等位基因的寡核苷酸探针，或PCR来扩增包括HNA-3a或HNA-3b等位基因的核苷酸片段或利用本领域标准的测序方法来检测HNA-3a或HNA-3b等位基因。

在一个实施方案中，本发明提供了测定用于移植或输血的供体组织在表达HNA-3a特异性抗体的人受体中是否会受到排斥的方法，该方法包括下述步骤：a)获得用于移植或输血的组织样品，b)从样品中提取核酸，c)使核酸和与SEQ ID NO：3的片段杂交的寡核苷酸探针接触，以及d)对探针与核酸的杂交进行检测，其中，探针杂交表明存在HNA-3a核酸，样品中存在HNA-3a核酸表明样品在表达HNA-3a特异性抗体的人受体中可能会受到排斥。这些方法可使用寡核苷酸探针进行，所述寡核苷酸探针包含编码选自下组氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ IDNO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42。

本发明还提供测定用于移植或输血的供体组织在表达HNA-3b特异性抗体的人受体中是否会受到排斥的方法，该方法包括下述步骤：a)获得用于移植或输血的组织样品，b)从样品中提取核酸，c)使核酸和与SEQ ID NO：4的片段杂交的寡核苷酸探针接触，以及d)对探针与核酸的杂交进行检测，其中，探针杂交表明存在HNA-3b核酸，样品中存在HNA-3b核酸表明样品在表达HNA-3a特异性抗体的人受体中可能会受到排斥。这些方法可使用寡核苷酸探针进行，所述寡核苷酸探针包含编码选自下组氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26。

在另一个实施方案中，本发明提供了测定用于移植或输血的供体组织在表达HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的人受体中是否会受到排斥的方法，除了检测HNA-3a或HNA-3b等位基因的存在，该方法可包括一个或多个下述步骤：使样品和与SEQ ID NO：5的片段杂交的寡核苷酸探针接触，使样品和与SEQ ID NO：7的片段杂交的寡核苷酸探针接触，使样品和与SEQ ID NO：9的片段杂交的寡核苷酸探针接触，使样品和与SEQ ID NO：11的片段杂交的寡核苷酸探针接触，或使样品和与编码HLA抗原的核苷酸序列的片段杂交的寡核苷酸探针接触，以及对探针与核酸的杂交进行检测，其中，任一种探针杂交表明样品中存在HNA-1，HNA-2，HNA-3a，HNA-3b，HNA-4，HNA-5或HLA核酸中的任一种，样品中HNA-1，HNA-2，HNA-3a，HNA-3b，HNA-4，HNA-5或HLA的存在表明样品在人受体中可能会受到排斥。例如，本发明包括含有SEQ ID NO：5的核苷酸141，核苷酸147，核苷酸226，核苷酸227，核苷酸277或核苷酸349的HNA-1(SEQ ID NO：5)的片段。

在另一个实施方案中，本发明提供了测定人移植或输血受体发生TRALI或GVHD的易感性的方法，其中，供体组织含有HNA-3a特异性抗体，该方法包括下述步骤：a)从移植或输血前的人移植或输血受体中获得生物样品，b)从生物样品中提取核酸，c)使核酸和与SEQID NO：1的核苷酸序列片段杂交的寡核苷酸探针接触，以及d)对探针与核酸的杂交进行检测，其中，探针与核酸杂交表明生物样品中存在HNA-3a核酸，生物样品中存在HNA-3a核酸表明人移植或输血受体易发生TRALI或GVHD。这些方法可使用寡核苷酸探针进行，所述寡核苷酸探针包含编码选自下组氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ IDNO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ IDNO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ IDNO：40，SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42。

本发明还提供测定人移植或输血受体发生TRALI或GVHD的易感性的方法，其中，供体组织含有HNA-3b特异性抗体，该方法包括下述步骤：a)从移植或输血前的人移植或输血受体中获得生物样品，b)从生物样品中提取核酸，c)使核酸和与SEQ ID NO：2的核苷酸序列片段杂交的寡核苷酸探针接触，以及d)对探针与核酸的杂交进行检测，其中，探针与核酸杂交表明生物样品中存在HNA-3b核酸，生物样品中存在HNA-3b核酸表明人移植或输血受体易发生TRALI或GVHD。这些方法可使用寡核苷酸探针进行，所述寡核苷酸探针包含编码选自下组氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26。

本发明进一步提供了测定人移植或输血受体发生TRALI或GVHD的易感性的方法，供体组织含有HNA-3a或HNA-3b特异性抗体，其中，除了分别检测HNA-3a或HNA-3b同位基因的存在外，该方法包括一个或多个下述步骤：使样品和与SEQ ID NO：5的片段杂交的寡核苷酸探针接触，使样品和与SEQ ID NO：7的片段杂交的寡核苷酸探针接触，使样品和与SEQ IDNO：9的片段杂交的寡核苷酸探针接触，使样品和与SEQ ID NO：11的片段杂交的寡核苷酸探针接触，或使样品和与编码HLA抗原的核苷酸序列的片段杂交的寡核苷酸探针接触，以及对探针与核酸的杂交进行检测，其中，任一种探针杂交表明样品中存在HNA-1，HNA-2，HNA-3a，HNA-3b，HNA-4，HNA-5或HLA核酸中的任一种，样品中HNA-1，HNA-2，HNA-3a，HNA-3b，HNA-4，HNA-5或HLA的存在表明样品可能会诱导TRALI或GVHD。例如，本发明包括含有SEQ ID NO：5的核苷酸141，核苷酸147，核苷酸226，核苷酸227，核苷酸277或核苷酸349的HNA-1(SEQ IDNO：5)的片段。

在任一种前述方法中，寡核苷酸探针可附着在选自膜、滤光片、磁珠和芯片的底物上。此外，本发明提供了其中寡核苷酸探针为阵列形式的方法。该方法包括的寡核苷酸探针包括选自放射性标记，荧光标记，酶标记，亲和素标记或生物素标记的标记物。

可替代地，本发明提供了测定用于移植或输血的供体组织在具有HNA-3a特异性抗体的人受体中是否会受到排斥的方法，该方法包括下述步骤：a)获得用于移植或输血的组织样品，b)从样品中提取核酸，c)使用至少一种对HNA-3a核酸具有特异性的寡核苷酸引物从提取的核酸中扩增出SEQ ID NO：3的HNA-3a核酸的片段。以及d)检测样品中的HNA-3a核酸片段，其中，样品中存在HNA-3a核酸表明样品在具有HNA-3a特异性抗体的人受体中可能会受到排斥。这些方法可使用引物进行，所述引物扩增编码选自下组氨基酸序列的HNA-3a核酸片段：SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQID NO：18，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42。

本发明还提供测定用于移植或输血的供体组织在具有HNA-3b特异性抗体的人受体中是否会受到排斥的方法，该方法包括下述步骤：a)获得用于移植或输血的组织样品，b)从样品中提取核酸，c)使用至少一种对HNA-3b核酸具有特异性的寡核苷酸引物从提取的核酸中扩增出SEQ ID NO：4的HNA-3b核酸的片段。以及d)检测样品中的HNA-3b核酸片段，其中，样品中存在HNA-3b核酸表明样品在具有HNA-3b特异性抗体的人受体中可能会受到排斥。这些方法可使用引物进行，所述引物扩增编码选自下组氨基酸序列的HNA-3b核酸片段：SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26。

本发明还提供测定用于移植或输血的供体组织在具有HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的人受体中是否会受到排斥的方法，除了检测HNA-3a或HNA-3b等位基因外，该方法包括一个或多个下述步骤：使用至少一种对HNA-1核酸具有特异性的寡核苷酸引物扩增出HNA-1核酸(SEQ ID NO：5)的片段，使用至少一种对HNA-2核酸具有特异性的寡核苷酸引物扩增出HNA-2核酸(SEQ ID NO：7)的片段，使用至少一种对HNA-4核酸具有特异性的寡核苷酸引物扩增出HNA-4核酸(SEQ ID NO：9)的片段，使用至少一种对HNA-5核酸具有特异性的寡核苷酸引物扩增出HNA-5核酸(SEQ ID NO：11)的片段，或使用至少一种对HLA核酸具有特异性的寡核苷酸引物扩增出HLA核酸的片段，以及检测样品中的任何HNA或HLA核酸片段，其中，样品中存在HNA或HLA核酸表明样品在人受体中可能会受到排斥。

在另一个实施方案中，本发明提供了测定人移植或输血受体发生TRALI或GVHD的易感性的方法，其中，供体组织含有HNA-3a特异性抗体，该方法包括下述步骤：a)从移植或输血前的人移植或输血受体中获得生物样品，b)从生物样品中提取核酸，c)使用至少一种对HNA-3a核酸具有特异性的寡核苷酸引物从提取的核酸中扩增出HNA-3a核酸(SEQ ID NO：3)的片段，以及d)检测生物样品中HNA-3a核酸片段的存在，其中，生物样品中存在HNA-3a核酸表明人移植或输血受体易发生TRALI或GVHD。这些方法可使用引物进行，所述引物扩增编码选自下组氨基酸序列的HNA-3a核酸序列：SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ IDNO：40，SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42。

在另一个实施方案中，本发明提供了测定人移植或输血受体发生TRALI或GVHD的易感性的方法，其中，供体组织含有抗HNA-3b抗体，该方法包括下述步骤：a)从移植或输血前的人移植或输血受体中获得生物样品，b)从生物样品中提取核酸，c)使用至少一种对HNA-3b核酸具有特异性的寡核苷酸引物从提取的核酸中扩增出HNA-3b核酸(SEQ ID NO：4)的片段，以及d)检测生物样品中HNA-3b核酸片段的存在，其中，生物样品中存在HNA-3b核酸表明人移植或输血受体易发生TRALI或GVHD。这些方法可使用引物进行，所述引物扩增编码选自下组氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ IDNO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26。

本发明进一步提供了测定人移植或输血受体发生TRALI或GVHD的易感性的方法，其中，供体组织含有HNA-3a或HNA-3b特异性抗体，其中，除了检测HNA-3a或HNA-3b同位基因外，该方法还包括一个或多个下述步骤：使用至少一种对HNA-1核酸具有特异性的寡核苷酸引物扩增HNA-1核酸(SEQ ID NO：5)的片段，使用至少一种对HNA-2核酸具有特异性的寡核苷酸引物扩增HNA-2核酸(SEQ ID NO：7)的片段，使用至少一种对HNA-4核酸具有特异性的寡核苷酸引物扩增HNA-4核酸(SEQ ID NO：9)的片段，使用至少一种对HNA-5核酸具有特异性的寡核苷酸引物扩增HNA-5核酸(SEQ ID NO：11)的片段，或使用至少一种对HLA核酸具有特异性的寡核苷酸引物扩增HLA核酸的片段，以及检测样品中任何的HNA-1，HNA-2，HNA-3a，HNA-3b，HNA-4，HNA-5或HLA核酸，其中样品中任一种HNA-1，HNA-2，HNA-3a，HNA-3b，HNA-4，HNA-5或HLA的存在表明样品可能会诱导TRALI或GVHD。

本发明所述的任何前述方法中，组织样品或生物样品选自血液、血液衍生物、血浆、血清、细胞和组织。尤其是组织样品或生物样品可为嗜中性白细胞。

本发明还提供用于实施任何前述方法的试剂盒。特别是，本发明提供了用于检测HNA-3a和/或HNA-3b抗体以及检测对HNA-1，HNA-2，HNA-4，HNA-5和HLA中的一种或多种具有特异性的抗体的试剂盒。本发明还提供用于检测HNA-3a和/或HNA-3b抗原以及检测对HNA-1，HNA-2，HNA-4，HNA-5和HLA的试剂盒。本发明进一步提供了检测HNA-3a或HNA-3b等位基因以及检测HNA-1，HNA-2，HNA-4，HNA-5和HLA中的一种或多种的等位基因的试剂盒。

在一个实施方案中，本发明提供了测定用于移植或输血的供体组织在表达HNA-3a抗原的人受体中是否会诱导TRALI或GVHD的试剂盒，其中，该试剂盒包括：含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其抗原片段的多肽，和选自Fc-γ受体IIIb多肽、CD177多肽、CD11b多肽、CD11a多肽和HLA抗原的一种或多种多肽或其抗原片段。该试剂盒还包括含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其抗原片段的多肽，用于检测HNA-3b特异性抗体和HNA-3a特异性抗体。

所述试剂盒任选地还包括HNA-3a的特异性抗体和与含有选自HNA-1，HNA-2，HNA-4，HNA-5和HLA的抗原特异性结合的一种或多种抗体。这些试剂盒中的HNA-3a多肽片段可包括选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ IDNO：41和SEQ ID NO：42。

本发明还提供测定用于移植或输血的供体组织在具有HNA-3a特异性抗体的人受体中是否会受到排斥的试剂盒，其中，该试剂盒包括HNA-3a的特异性抗体和与含有选自HNA-1，HNA-2，HNA-3b，HNA-4，HNA-5或HLA的肽特异性结合的一种或多种抗体。

此外，本发明提供了测定人移植或输血受体发生TRALI或GVHD的易感性的试剂盒，其中，供体组织含有抗HNA-3a抗体，其中，该试剂盒包括HNA-3a特异性抗体和与含有选自HNA-1，HNA-2，HNA-3b，HNA-4，HNA-5或HLA的肽特异性结合的一种或多种抗体。

任何前述试剂盒可进一步包括含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其抗原片段的多肽和/或选自Fc-γ受体IIIb多肽，CD177多肽，CD11b多肽，CD11a多肽和HLA抗原的一种或多种多肽或其抗原片段。该试剂盒还可以包括HNA-3b特异性抗体和与含有选自HNA-1，HNA-2，HNA-3b，HNA-4，HNA-5或HLA的肽特异性结合的一种或多种抗体。特别地，本发明提供了一种试剂盒，其中包括的SEQ ID NO：2的氨基酸的抗原片段选自SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26。

本发明还提供测定用于移植或输血的供体组织在具有HNA-3b特异性抗体的人受体中是否会受到排斥的试剂盒，其中，该试剂盒包括HNA-3b的特异性抗体和与含有选自HNA-1，HNA-2，HNA-3b，HNA-4，HNA-5或HLA的肽特异性结合的一种或多种抗体。

在另一个实施方案中，本发明提供了测定人移植或输血受体发生TRALI或GVHD的易感性的试剂盒，其中，供体组织含有抗HNA-3b抗体，其中，该试剂盒包括HNA-3b特异性抗体和与含有选自HNA-1，HNA-2，HNA-3b，HNA-4，HNA-5或HLA的肽特异性结合的一种或多种抗体。

所述试剂盒可进一步包括含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其抗原片段的多肽和/或选自Fc-γ受体IIIb多肽，CD177多肽，CD11b多肽，CD11a多肽和HLA抗原的一种或多种多肽或其抗原片段。

此外，该试剂盒可包括含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其抗原片段的多肽，用于检测HNA-3a特异性抗体和HNA-3b特异性抗体。

任何前述试剂盒还可包括二级抗体。一级抗体和二级抗体可含有选自放射性标记、荧光标记、酶标记、亲和素标记或生物素标记的标记物。

在另一实施方案中，本发明提供了测定用于移植或输血的供体组织在表达HNA-3a特异性抗体的人受体中是否会受到排斥的试剂盒，其中该试剂盒包括与SEQ ID NO：3的核酸序列的片段杂交的寡核苷酸探针，和与选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，和HLA核苷酸序列的核酸序列的片段杂交的一种或多种寡核苷酸探针。

此外，本发明提供了测定人移植或输血受体发生TRALI或GVHD的易感性的试剂盒，其中，供体组织含有抗HNA-3a抗体，其中，该试剂盒包括与SEQ ID NO：3的核酸序列的片段杂交的寡核苷酸探针，和与选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，和HLA核苷酸序列的核酸序列的片段杂交的一种或多种寡核苷酸探针。这些试剂盒的寡核苷酸探针可包括编码下组的氨基酸序列的核苷酸序列的片段：SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：25，SEQ IDNO：27，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42。

本发明还提供了测定用于移植或输血的供体组织在表达HNA-3b特异性抗体的人受体中是否会受到排斥的试剂盒，其中，该试剂盒包括与SEQ ID NO：4的核酸序列的片段杂交的寡核苷酸探针，和与选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，和HLA核苷酸序列的核酸序列的片段杂交的一种或多种寡核苷酸探针。

本发明提供了测定人移植或输血受体发生TRALI或GVHD的易感性的试剂盒，所述供体组织含有抗HNA-3b抗体，其中该试剂盒包括与SEQ ID NO：4的核酸序列的片段杂交的寡核苷酸探针，和与选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，和HLA核苷酸序列的核酸序列的片段杂交的一种或多种寡核苷酸探针。这些试剂盒的寡核苷酸探针可包括编码下组的氨基酸序列的核苷酸序列的片段：SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ IDNO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26。

任何前述试剂盒中，寡核苷酸探针可包括选自放射性标记、荧光标记、酶标记、亲和素标记或生物素标记的标记物。此外，所述试剂盒还可包括凝胶加样缓冲液。

在另一实施方案中，本发明提供了测定用于移植或输血的供体组织在表达HNA-3a特异性抗体的人受体中是否会受到排斥的试剂盒，其中，该试剂盒包括至少一种用于扩增SEQ ID NO：3的核酸序列的片段的寡核苷酸引物，和用于扩增选自SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，和HLA核苷酸序列的核酸序列的片段的一种或多种寡核苷酸引物。

本发明提供了测定人移植或输血受体发生TRALI或GVHD的易感性的试剂盒，其中，供体组织含有抗HNA-3a抗体，其中，该试剂盒包括至少一种用于扩增SEQ ID NO：3的核酸序列的片段的寡核苷酸引物，和用于扩增选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQID NO：11，和HLA核苷酸序列的核酸序列的片段的一种或多种寡核苷酸引物。这些试剂盒的寡核苷酸引物可扩增编码下组氨基酸序列的核苷酸序列的片段：SEQ ID NO：13，SEQ IDNO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：25，SEQ IDNO：27，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42。

前述试剂盒还可包括由所述核苷酸引物扩增的HNA-3a核酸序列的片段和/或选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，以及由核苷酸引物扩增的HLA核苷酸序列的核酸序列的一种或多种片段。此外，所述试剂盒还可包括用于扩增SEQ ID NO：4的HNA-3b核酸片段和HNA-3b核酸片段的寡核苷酸引物。

在另一实施方案中，本发明提供了测定用于移植或输血的供体组织在表达HNA-3b特异性抗体的人受体中是否会受到排斥的试剂盒，其中，该试剂盒包括至少一种用于扩增SEQ ID NO：4的核酸序列的片段的寡核苷酸引物，和用于扩增选自SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，和HLA核苷酸序列的核酸序列的片段的一种或多种寡核苷酸引物。

本发明提供了测定人移植或输血受体发生TRALI或GVHD的易感性的试剂盒，其中，供体组织含有抗HNA-3b抗体，其中，该试剂盒包括至少一种用于扩增SEQ ID NO：4的HNA-3b核酸序列的片段的寡核苷酸引物，和至少一种用于扩增选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，和HLA核苷酸序列的核酸序列片段的寡核苷酸引物。这些试剂盒的寡核苷酸引物可扩增编码下组氨基酸序列的核苷酸序列的片段：SEQ ID NO：19，SEQID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26。

任意前述试剂盒还可包括PCR扩增用的缓冲液，dNTP’s和凝胶加样缓冲液。

在另一个实施方案中，本发明提供了分离的HNA-3b多肽例如含有氨基酸序列SEQID NO：2的分离多肽，含有SEQ ID NO：2的多肽片段的分离多肽，其中所述片段的长度至少为7个氨基酸，至少为10个氨基酸，至少为20个氨基酸，至少为50个氨基酸。HNA-3b的片段包括含有SEQ ID NO：2的氨基酸残基154的片段，其中残基154为谷氨酸(Gln)。HNA-3b多肽的片段包括含有SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26的氨基酸序列的片段，并能与HNA-3b特异性异体抗体反应或特异性结合。本发明还提供编码HNA-3b多肽的多核苷酸。

本发明提供了SEQ ID NO：1的HNA-3a多肽片段，例如含有SEQ ID NO：13，SEQ IDNO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：25，SEQ IDNO：27，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42的氨基酸序列的分离多肽，其中所述多肽与HNA-3a特异性异体抗体反应或特异性结合。本发明还提供编码HNA-3a多肽片段的多核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了HNA-3a多肽或其片段在鉴定HNA-3a特异性异体抗体中的应用。还提供了HNA-3b多肽或其片段在鉴定HNA-3b特异性异体抗体中的应用。

本发明还提供了编码HNA-3a多肽或其片段的多核苷酸在鉴定HNA-3a基因型中的应用，所述多核苷酸编码与HNA-3a特异性异体抗体反应或特异性结合的蛋白。此外，本发明提供HNA-3b多核苷酸或其片段在鉴定HNA-3b基因型中的应用。例如，本发明提供含有密码子154的SEQ ID NO：4的片段在鉴定HNA-3b基因型中的应用。

在另一实施方案中，本发明提供了包含与HNA-3a特异性异体抗体反应或特异性结合的SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其片段的蛋白，或HNA-3a蛋白片段在血样或血浆分析中用于鉴定抗HNA-3a抗原的抗体的应用。

本发明还提供了HNA-3b多肽在血样或血浆分析中用于鉴定抗HNA-3b抗原的抗体的应用。

在含有SEQ ID NO：1(HNA-3a)的氨基酸序列或其片段或SEQ ID NO：2(HNA-3b)的氨基酸序列或其片段的应用过程中，应用蛋白或蛋白片段从血样或血浆中分离抗体。

在含有SEQ ID NO：1(HNA-3a)的氨基酸序列或其片段或SEQ ID NO：2(HNA-3b)的氨基酸序列或其片段的应用过程中，应用蛋白或蛋白片段制备抗体，优选单克隆抗体。在另一个实施方案中，本发明提供了筛选受试人体中HNA-3b基因型的方法，该方法包括下述步骤：a)从受试人体中获得生物样品，b)从生物样品中提取核酸，和c)检测生物样品中的SEQID NO：4核酸序列的片段，其中，所述片段包含SEQ ID NO：4的密码子154，其中检测到密码子154表明受试人体中具有HNA-3b基因型。检测步骤可包括使核酸和与SEQ ID NO：4的核酸序列片段杂交的寡核苷酸探针接触或使用至少一个对SEQ ID NO：4的片段具有特异性的寡核苷酸引物从提取的核酸中扩增出SEQ ID NO：4的片段。在筛选HNA-3b基因型的方法中，所用的生物样品可选自血液、血液衍生物、血浆、血清、细胞和组织。

本发明的序列

SEQ ID NO：1-人HNA-3a蛋白

SEQ ID NO：2-人HNA-3b蛋白

SEQ ID NO：3-人HNA-3a DNA

SEQ ID NO：4-人HNA-3b DNA

SEQ ID NO：5-人FCγ受体IIIb DNA(HNA-1)

SEQ ID NO：6-人FCγ受体IIIb蛋白(HNA-1)

SEQ ID NO：7-人CD177DNA(HNA-2)

SEQ ID NO：8-人CD177蛋白(HNA-2)

SEQ ID NO：9-人CD11b DNA(HNA-4)

SEQ ID NO：10-人CD11b蛋白(HNA-4)

SEQ ID NO：11-人CD11a DNA(HNA-5)

SEQ ID NO：12-人CD11a蛋白(HNA-5)

SEQ ID NO：13-HNA-3a(SEQ ID NO：1)的氨基酸1-231

SEQ ID NO：14-HNA-3a(SEQ ID NO：55)的氨基酸55-183

SEQ ID NO：15-HNA-3a(SEQ ID NO：1)的氨基酸55-164

SEQ ID NO：16-HNA-3a(SEQ ID NO：1)的氨基酸114-164

SEQ ID NO：17-HNA-3a(SEQ ID NO：1)的氨基酸55-706

SEQ ID NO：18-HNA-3a(SEQ ID NO：1)的氨基酸114-706

SEQ ID NO：19-HNA-3b(SEQ ID NO：2)的氨基酸1-231

SEQ ID NO：20-HNA-3b(SEQ ID NO：2)的氨基酸55-183

SEQ ID NO：21-HNA-3b(SEQ ID NO：2)的氨基酸55-164

SEQ ID NO：22-HNA-3b(SEQ ID NO：2)的氨基酸114-164

SEQ ID NO：23-HNA-3b(SEQ ID NO：2)的氨基酸55-706

SEQ ID NO：24-HNA-3b(SEQ ID NO：2)的氨基酸114-706

SEQ ID NO：25-HNA-3a(SEQ ID NO：1)的氨基酸154-164

SEQ ID NO：26-HNA-3b(SEQ ID NO：2)的氨基酸154-164

SEQ ID NOS：27-47-表1中的HNA-3a的片段

SEQ UD NO：48-HNA-3a(SEQ ID NO：1)的氨基酸145-167

SEQ ID NOS：49-55-引物序列

发明详述

本发明是基于发现HNA-3位于CTL2跨膜蛋白上。已知在受体中诱导TRALI，但对HNA-1和HNA-2抗体呈阴性的血清样品被用于鉴定抗原HNA-3a的来源。鉴定HNA-3a，首先比较被HNA-3a血清免疫沉淀的HNA-3a阳性和阴性细胞表面蛋白。通过流式细胞术用HNA-3a阳性和阴性血清鉴定细胞。然后将HNA阳性和阴性粒细胞与HNA-3a阳性血清温育，且与血清反应的细胞表面蛋白与实施例6中详细描述的G蛋白包被的磁珠进行免疫沉淀。首先用SDS-PAGE对蛋白进行分析，鉴定出两种分子量为约80-100kD的蛋白，它们仅存在于阳性细胞中，而阴性细胞中不存在。将这些蛋白从SDS凝胶中切下进一步进行质谱(MS)分析，并通过氨基酸测序确定。

本发明提供筛选生物样品的方法以检测抗原HNA-3a或HNA-3b的特异性抗体。所述生物样品包括全血、血液衍生物、浓缩红细胞、血浆、血清、新鲜冰冻血浆、全血源性浓缩血小板、单采血小板、汇集血小板、静脉注射γ-球蛋白、冷沉淀、脑脊液、组织和细胞如干细胞、中性粒细胞和粒细胞。生物样品可从意欲用于移植的人供体的组织或细胞或意欲用于输血的人供体的血液或衍生物中获得。生物样品可从意欲用于在人受体中移植的组织或细胞中获得。产物，生物样品可从意欲用于在人受体中输血的血液或衍生物中获得。生物样品还可从意欲接受移植或输血的人体中获得。

本发明还涉及易感性筛选或确定受体是否患有移植物抗宿主病(GVHD)。GVHD是指当组织中含有攻击受体的免疫成分细胞或抗体时的疾病。GVHD的主要原因是造血干细胞移植，既包括同种的(2个体间)又包括自体的(来自相同个体)。也有报道实体器官移植、输血和母婴输血引起GVHD。GVHD的急性症状包括腹部疼痛或损伤、腹泻、发烧、黄疸、皮疹、呕吐和体重减轻。GVHD的慢性症状包括眼睛干涩、口干、肝炎、肺和消化道疾病以及皮疹。

本发明还涉及检测移植的或输血的组织是否可能受到受体排斥的方法和产品。排斥的症状包括移植的器官无法正常工作、全身不适、不安，或生病的感觉、疼痛或器官处肿胀和发烧。

HNA-3a和HNA-3b的鉴定

因此，本发明的目的是鉴定并提供与TRALI相关的含有人类嗜中性白细胞抗原-3a或-3b(HNA-3a，HNA-3b)的蛋白和DNA序列。

换言之，问题的解决是通过提供由SEQ ID NO：1氨基酸序列组成的蛋白(抗原HNA-3a)，其与HNA-3a的特异性异体抗体反应，并通过提供由SEQ ID NO：2氨基酸序列组成的蛋白(抗原HNA-3b)，其与HNA-3b的特异性异体抗体反应。

调查有问题的受体以鉴定HNA-3a阳性和HNA-3a阴性的受体，他们的细胞可用于进一步研究。使用来自血液制品已激发TRALI的供体的抗体以及细胞表面表达有相应抗原的白血细胞。用高效价的HNA-3a抗体鉴定受体后，抗原可被沉淀下来，供体受到血浆置换，以获得用于抗原-抗体反应的充足的材料。用抗体沉淀抗原，鉴定仍未知的HNA-3a的蛋白/基因结构。

详细地，首先对粒细胞制备进行优化。然后，通过筛选程序，测定HNA-3a阳性和HNA-3a阴性受体，它们的细胞可用于进一步研究。然后用高效价HNA-3a抗体挑选出受体，抗原可被沉淀下来。对挑选出的受体进行血浆置换，以获得用于抗原-抗体反应的充足的材料。用于定量凝胶电泳的粒细胞膜蛋白的制备方法首先采用血小板进行，这是由于它们不含细胞核，制备简便。然后将方法转化并调整为针对含有细胞核的白细胞/粒细胞。这使优化粒细胞膜蛋白的制备成为可能。用分析的方法对相应蛋白进行分析。通过免疫沉淀对来自于制备的膜蛋白的HNA-3a进行富集/分离，并通过蛋白质印迹法进行确定。通过质谱鉴定出带有HNA-3a的蛋白；然后，通过序列分析鉴定HNA-3a的一级序列(SEQ ID NO：1)。

因此，本发明涉及由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白(抗原HNA-3a)，其与HNA-3a的特异性异体抗体反应。本发明还包括由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的其中一个或多个氨基酸被缺失、添加或取代的蛋白(抗原HNA-3a)，其与HNA-3a的特异性异体抗体反应。鉴定得到的抗原HNA-3a证明是跨膜受体CTL2的变化形式。通过蛋白质印迹得到的分子量为80～100kDa，去糖基化后条带移至64kDa。

抗原HNA-3a表达于粒细胞和淋巴细胞CTL2蛋白上。胞外环上的单核苷酸多态性(SNP)现象是至关重要的(SNP rs2288904)，这是由于该SNP为HNA-3a和HNA-3b之间的不同。该SNP允许可对与HNA-3a/HNA-3b型有关的血液供体进行基因分型。编码HNA-3a的多核苷酸的第461位为“G”(鸟嘌呤)，因此编码HNA-3a氨基酸序列第154位的“R”(精氨酸，Arg)，因此表现为等位基因HNA-3a。编码HNA-3b的多核苷酸的第461位为“A”(腺嘌呤)，因此编码HNA-3b氨基酸序列第154位的“Q”(谷氨酰胺，Gln)，因此表现为等位基因HNA-3b。

通过氨基酸第154位的精氨酸(Arg，R)交换为谷氨酰胺(Gln，Q)(见SEQ ID NO：2)，从而确定抗原HNA-3b的一级序列。因此，本发明涉及由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的蛋白(抗原HNA-3b)，其与HNA-3b的特异性异体抗体反应。

同样地，本发明提供HNA-3a和HNA-3b的蛋白，它们是链长为至少7个氨基酸，至少10个氨基酸，至少20个氨基酸或至少50个氨基酸的蛋白片段。

然后，分离基因HNA-3a并进行异源表达。HNA-3a相应的DNA序列如SEQ ID NO：3的核苷酸序列所示，以及与其杂交的全部序列，它们编码上述的抗原HNA-3a，与HNA-3a特异性异体抗体反应或结合。本发明还包括与SEQ ID NO：3的核苷酸序列具有相同的核苷水平为至少90％，优选至少95％，更优选至少98％的核苷酸序列，以及与它们杂交的全部序列，它们编码上述的抗原HNA-3a，与HNA-3a特异性异体抗体反应或结合。

此外，本发明提供核苷酸序列SEQ ID NO：3的剪接形式，其与核苷酸序列SEQ IDNO：3的同一性为至少70％。优选地，序列同一性为至少80％，更优选为90％，更优选为95％。

本发明进一步提供核苷酸序列SEQ ID NO：4以及区别与其杂交的全部序列，它们编码上述的抗原HNA-3b，与HNA-3b特异性异体抗体反应。本发明还包括具有相同的核苷水平为至少90％，优选至少95％，更优选至少98％的核苷酸序列，以及与它们杂交的全部序列，它们编码上述的抗原HNA-3b，与HNA-3b特异性异体抗体反应。典型的严格杂交条件包括在65℃下杂交，用0.25x SSC，0.1％SDS在65℃洗三次，每次15分钟。另外，典型的严格杂交条件包括在约50℃～70℃下，在0.02M～0.15M NaCl中或在65℃下，在0.5x SSC 0.25％SDS中杂交15分钟，然后在65℃下洗半小时，或在65℃下杂交14小时，然后在65℃下用0.5XSSC，1％SDS洗3次。

此外，本发明提供核苷酸序列SEQ ID NO：4的剪接形式，其与核苷酸序列SEQ IDNO：4的同一性为至少70^％。优选地，序列同一性为至少80％，更优选为90％，更优选为95％。

序列相同或核苷水平的相同通常是指100％相同。

基于测定的一级结构，抗原的重组生产方法基于已知的蛋白/抗原HNA-1a、-1b、-1c、-2a进行优化。结果将获得的抗原HNA-1和HNA-2转化为HNA-3a或HNA-3b，使这些抗原能在适合的表达系统如大肠杆菌中、真核细胞中、昆虫细胞中生产。

因此，本发明包括由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白(抗原HNA-3a)在鉴定HNA-3a特异性异体抗体中的应用。同样地，本发明中包括由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的蛋白(抗原HNA-3b)在鉴定HNA-3b特异性异体抗体中的应用。

此外，本发明包括SEQ ID NO：3的核苷酸序列在检测HNA-3a基因型中的应用以及SEQ ID NO：4的核苷酸序列在检测HNA-3b基因型中的应用。

本发明的方法可采用ELISA检测、流式细胞术、免疫荧光法、电芯片检测(electro-chip assays)、PCR反应和凝集试验进行。

同样地，本发明提供了用于检测能够与由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白(抗原HNA-3a)结合的HNA-3a特异性异体抗体的测试系统。本发明还提供用于检测能够与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的蛋白(抗原HNA-3b)结合的HNA-3b特异性异体抗体的测试系统。

本发明还提供用于检测含有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的基因型HNA-3a的测试系统以及用于检测含有SEQ ID NO：4的核苷酸序列的基因型HNA-3b的测试系统。

根据本发明，由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白(抗原HNA-3a)用于分析血液样品或血浆，以鉴定与抗原HNA-3a特异性结合的抗体。同样地，由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的蛋白(抗原HNA-3b)用于分析血液样品或血浆，以鉴定作用于抗原HNA-3b的抗体。

本发明进一步包括由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白(抗原HNA-3a)在从血液样品或血浆中分离抗体的方法中的应用。同样地，本发明包括由上述SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的蛋白(抗原HNA-3b)在从血液样品或血浆中分离抗体的方法中的应用。特别优选所述蛋白在吸附(adsorption)法如血浆置换中的应用。

本发明进一步提供由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白(抗原HNA-3a)在生产抗体，优选单克隆抗体的方法中的应用。同样地，本发明提供由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的蛋白(抗原HNA-3b)在生产抗体，优选单克隆抗体的方法中的应用。

HNA-3a的抗原片段

可用本领域的标准方法，如位点特异性突变、基因工程、CTL2肽库分析、预测算法、功能试验，如酶联免疫斑点(ELISpot)或胞内细胞因子染色和细胞结合试验来鉴定生成HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的HNA-3a或HNA-3b的抗原片段的表位图谱。用于分析肽库的高通量系统可市售获得，如REVEAL & ProVE^TM系统(Proimmune，Springfield.VA)。

能与HNA-3a特异性抗体，如异体抗体反应或与之结合的优选的HNA-3a(SEQ IDNO：1)的蛋白质片段，包括至少SEQ ID NO：13的氨基酸序列(SEQ ID NO：1的1～231位氨基酸)、至少SEQ ID NO：14的氨基酸序列(SEQ ID NO：1的55～183位氨基酸)、至少SEQ ID NO：15的氨基酸序列(SEQ ID NO：1的55～164位氨基酸)、至少SEQ ID NO：16的氨基酸序列(SEQID NO：1的114～164位氨基酸)、至少SEQ ID NO：25的氨基酸序列(SEQ ID NO：1的154～164位氨基酸)、至少SEQ ID NO：17的氨基酸序列(SEQ ID NO：1的55～706位氨基酸)和至少SEQID NO：18的氨基酸序列(SEQ ID NO：1的114～706位氨基酸)。

此外，本发明涉及本申请所描述的包括SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的任意蛋白质片段，其中一个或多个氨基酸已经被缺失、增加或取代，并与HNA-3a特异性抗体或异体抗体反应。

本发明涉及SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质片段。能与HNA-3b特异性抗体，如异体抗体反应或与之结合的优选的HNA-3b(SEQ ID NO：2)的蛋白质片段，包括至少SEQ ID NO：19的所示氨基酸序列(SEQ ID NO：2的1～231位氨基酸)、至少SEQ ID NO：20的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的55～183位氨基酸)、至少SEQ ID NO：21的氨基酸序列(SEQ IDNO：2的55～164位氨基酸)、至少SEQ ID NO：22的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的114～164位氨基酸)、至少SEQ ID NO：26的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的154～164位氨基酸)、至少SEQ IDNO：23的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的55～706位氨基酸)和至少SEQ ID NO：24的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的114～706位氨基酸)。

同样，本发明涉及本申请如上所述的包括SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的任意蛋白质片段，其中，一个或多个氨基酸已经被缺失、增加或取代，并与HNA-3b特异性抗体或异体抗体反应。

HNA-3a特异性抗体的检测方法

本发明提供在生物样品中检测HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的方法。本发明还预期在检测HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的同时，检测其他特异性抗体，如HNA-1、HNA-2或HLA。检测抗体的方法包括非特异性或特异性试验，如粒细胞免疫荧光试验、粒细胞免疫荧光流式细胞术试验(GIFT-FC)、粒细胞抗原的单克隆抗体固定(MAIGA)试验、单球免疫扩散试验(SRID)、酶联免疫和血细胞凝集抑制试验(HAI)。

典型的非特异性试验以完整的粒细胞为目标，如GIFT-FC，使用具有不同HNAs的嗜中性白细胞的平板(panel)(Davoren，等.Transfusion 43(5)：641-5，2003，Kobayashi等，Ped.Res.26：246-249)。嗜中性白细胞首先与待测的血清温育，接下来，再与荧光标记的第二抗体温育，如抗人多价免疫球蛋白、IgG、IgM和IgA。漂洗后，通过流式细胞术测定结合到细胞悬浮液的抗体。

典型的特异性试验以固定的HNA糖蛋白为目标，如MAIGA试验。MAIGA是一种基于酶联免疫的试验，使用HNA-3特异性单克隆抗体在待测血清中捕获嗜中性抗原。接下来，细胞混合物同酶标第二抗体温育，如抗鼠IgG，用比色法测定结合(Bux，等，Transfusion Med.3(2)：157-62，1993，Metcalfe & Waters，Transfusion Med.2：283-287，1992.)。

酶联免疫试验用于测定样品中的总抗体。免疫原，如SEQ ID NO：1所示的HNA-3a多肽、SEQ ID NO：2所示的HNA-3b多肽或其抗原片段，吸附到微量滴定板的表面。将待测血清添加到微量滴定板上，然后，添加酶联免疫球蛋白，如IgG。吸附到微量滴定板上的酶的活性通过任何适合的方法进行定量，如分光光度计法，并且酶的活性与抗待测样品中的免疫原的抗体浓度成正比。此外，HNA-3a或HNA-3b多肽或其抗原片段可吸附到固体基质上，如膜、磁珠、滤纸、玻璃、硅、金属合金、无机膜、聚合物、尼龙或用于检测HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的塑料。

SRID试验使用一种含有待测抗原的凝胶层，如琼脂糖。将上样孔(well)插入到凝胶中，并将血清置于上样孔中。抗体扩散到凝胶中，导致形成沉淀环，其面积与待测血清的抗体浓度成正比。

HNA试验利用免疫原凝集鸡红细胞(等)的能力。该试验检测中和抗体，即那些能抑制血细胞凝集的抗体。待测血清的稀释液与标准浓度的免疫原温育，然后，加入红细胞。存在的中和抗体将通过免疫原抑制红细胞的凝集。

可使用其他用于在器官移植或输血的病人的血清中的检测HNA-3a或HNA-3b的抗体的传播的方法。在这样的试验中，通过测定补体介导的溶菌活性筛选血清中抗HNA-3a或HNA-3b抗体的存在。从代表最常遇到的HNA-3a或HNA-3b抗原个体的平板中筛选血清中抗T和B淋巴细胞的补体介导的溶菌活性。有或无二硫赤藓糖醇下均可开展该试验。

可用嗜中性细胞或任何转化的或转染的用于表达HNA-3a或HNA-3b的细胞实施本发明HNA-3a或HNA-3b抗体检测的方法。可用不能内源表达HNA-3a或HNA-3b的细胞开展该方法，如B-细胞、CHO细胞或昆虫细胞。本发明还预期使用低水平表达的HNA-3a或HNA-3b的细胞，并通过插入异源的启动子或增强子，或增加HNA-3a或HNA-3b基因的拷贝数提高内源HNA-3a或HNA-3b蛋白质的表达。

可在本发明方法中使用的B细胞的实例包括EB-3细胞(ATCC CCL85)、K-562细胞(ATCC CCL243)、RAJI细胞(ATCC CCL86)、Jiyoye细胞(CCL87)、IM-9(ATCC159)、Daudi细胞(ATCC CCL213)，NC-37细胞(ATCC 214)、Mo-B细胞(ATCC 245)、KG-1细胞(ATCC CCL246)、H2126细胞(ATCC 256)、BL2126细胞(ATCC 256)和MCL-5细胞(ATCC CCL10575)。其他可在本发明方法中使用的细胞的实例包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(ATCC No.CCL61)、CHO DHFR-细胞(Urlaub等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：4216-4220(1980))、人胚肾(HEK)293或293T细胞(ATCC No.CRL 1573)、或3T3细胞(ATCC No.CCL92)、猴COS-1(ATCC No.CRL1650)和COS-7细胞(ATCC No.CRL1651)、和CV-1细胞(ATCC No.CCL70)。此外，可在本发明的方法中使用昆虫细胞，如SF-9和HI5细胞。

此外，可修饰低至中水平内源表达HNA-3a或HNA-3b的细胞来提高或过表达内源的HNA-3a或HNA-3b。例如，在指定的细胞的基因组中插入启动子、增强子元件或外源转录调控元件，在接近度或方向性上足以影响编码HNA-3a或HNA-3b多肽的DNA的转录。控制元件控制宿主细胞中的部分DNA。这样，不用通过转染编码HNA-3a或HNA-3b基因自身，而是通过使用目标DNA(含有与目标内源基因同源的域)和同时提供内源基因序列转录识别信号的DNA调控片段，来实现HNA-3a或HNA-3b多肽的表达。

本发明还通过将生物样品与模拟HNA-3a或HNA-3b抗原片段或表位的适配子接触，提供一种在生物样品中检测HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的方法。适配子是包含单链寡核苷酸的大分子，具有依赖于序列的可高亲和力和高特异性地与靶蛋白结合的三维形状。本发明预期开发和使用具有模拟HNA-3a或HNA-3b抗原片段或表位的序列，并能因此结合到HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的适配子。这些适配子可在本发明的任何方法中使用，用于检测HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的存在。

本发明的适配子可包括融合到支架(scaffold)，如硫氧还蛋白上的单链RNA或DNA寡核苷酸，大小介于15～50个碱基之间。适配子可模拟本发明HNA-3a或HNA-3b肽的物理或结构特性。适配子通常源自通过被称为指数富集配体的系统进化(SELEX)的离体选择加工的组合库。用于鉴定和合成抗HNA-3a或HNA-3b抗体的适配子的典型方法描述于Lo，Antibody Engineering：methods and protocols Vol 248 of Methods in MolecularBiology，Humana Press 2004，Klussmann、The Aptamer Handbook：functionaloligonucleotides and their applications Wily-VCH，2006，and JayasenaClin.Chem.45：168-1650，1999。本申请中描述的试验可用于证实预期的适配子结合到HNA-3a或HNA-3b特异性抗体。

此外，本发明通过使用模拟HNA-3a或HNA-3b二级和三级结构的抗原片段，而一级氨基酸结构不同的肽，提供用于检测HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的方法。这些肽的结构特性引起HNA-3a或HNA-3b抗体与这些肽相互反应。这些肽可使用本领域的标准方法进行鉴定，如噬菌体展示肽库和组合库。

鉴别HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的方法

本申请中描述的任意检测HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的方法还可用于鉴别特定抗体是否可以特异性结合HNA-3a或HNA-3b。可用包含氨基酸154的全长多肽或肽来进行该试验。特别地，用于这些试验的肽可保持任何用于鉴别HNA-3a或HNA-3b抗原表位的二级或三级结构。此外，试验中使用的已知表达HNA-3a或HNA-3b细胞或组织可用于鉴定和鉴别HNA-3a或HNA-3b特异性抗体。这些试验可包括转染的或转化的用于表达HNA-3a或HNA-3b的细胞。这些HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的分离可有助于开展本发明的方法。此外，本发明的试剂盒可包括分离的HNA-3a或HNA-3b特异性抗体。

检测HNA-3蛋白质的方法

本发明提供了在生物样品中检测HNA-3a或HNA-3b的方法。术语“HNA-3a”指SEQ IDNO：1的全长序列或至少SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的片段。术语“HNA-3b”指SEQ ID NO：2的全长氨基酸序列或至少SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的片段。包括产生特异性抗体的特殊抗原表位的HNA-3a或HNA-3b的抗原片段是感兴趣的。例如，暴露于细胞表面的SEQ IDNO：1或2所示的氨基酸序列的域可能包含抗原表位。

可用于产生HNA-3a特异性抗体的典型的抗原片段包括SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列。可用于产生HNA-3b特异性抗体的典型的抗原片段包括SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列。

CTL2的一级结构表明在CTL2基因的编码区和启动子区均存在多个多态域。CTL2基因的多态性可提供HNA-3a或HNA-3b的多态信息。启动子区内的差异可引起不同的转录效率，并因此影响CTL2多态的表达。编码区的多态性可改变CTL2的蛋白质构象，并因此不同的多态性的CTL2蛋白质变成彼此的免疫原。例如，HNA-3a/HNA-3b的核苷酸461具有多态性，其中，HNA-3a等位基因为“G”，在154的位置编码精氨酸，HNA-3b等位基因为“A”，编码谷氨酰胺。

人嗜中性抗原HNA-1具有多态表位。HNA-1有三个等位基因，HNA-1a、HNA-1b和HNA-1c，是FcγRIIIb基因内的多态性的结果。HNA-1a和HNA-1b相差四个氨基酸。HNA-1c和HNA-1b在核苷酸266位点由于单核苷酸替换(C-A)而不同，导致78位的氨基酸由丙氨酸变成了天冬氨酸。如上所述，CTL2基因的多态性可导致类似于那些HNA-1观察到的HNA-3的多态抗原表位。

然而，人嗜中性抗原HNA-2具有单态抗原表位，其中群体的部分没有表达HNA-2。HNA-2具有唯一一个如上所述的等位基因，HNA-2a。在5～10％个体之间存在的转录缺陷引起HNA-2a的不足。当这些个体暴露于HNA-2a抗原时，可产生HNA-2a抗体。因此，预期HNA-3a或HNA-3b可具有类似于HNA-2的单态性抗原表位。

本发明预期在生物样品中检测HNA-3a或HNA-3b的同时，还检测其他的抗原，如HNA-1、HNA-2、HNA-4、HNA-5和/或HLA。

结合到人CTL2的市售抗体可在本发明的方法中使用。典型的市售抗体包括人抗SLC44A2单克隆抗体(3D11克隆)和人抗SLC44A2多克隆抗体，两者均可从Sigma Aldrich(St.Louis，MO)获得。其他的典型抗体包括从Abcam(Cambridge，MA)获得的SLC44A2抗体、从Abnova(Walnut，CA)获得的CTL2单克隆抗体(M01)、克隆3D11、从Novus Biologicals(Littleton，CO)获得的鼠抗SLC44A2溶质运载蛋白家族44多克隆抗体、第2号、MaxPab抗体和鼠抗CTL2多克隆抗体。

本发明的抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体、保留它们结合特定抗原表位能力的抗体片段(Fv、Fab和F(ab)2片段)、单链抗体和人或人化抗体。可通过本领域的标准方法用CTL2或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的抗原表位HNA-3a或HNA-3b制备抗体。本发明的抗体分子包括IgG(以及IgG、IgG2a和IgG2b亚类)、IgM、IgA、IgD和IgE类。

为了在生物样品内的检测抗体的结合，可将本发明的抗体进行标记。抗体可包含放射性标记，如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹²⁵I。此外，标记可以是荧光的或化学放光的化合物，如异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、若丹明(rhodamine)或荧光素。标记可以是酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、生物素和抗生物素蛋白或辣根过氧化物酶(Bayer等.，Meth.Enz.，184：138-163(1990))。

为了在生物样品中检测HNA-3a或HNA-3b，HNA-3a和HNA-3b特异性抗体可吸附到固体基质上，如膜、磁珠、滤纸、玻璃、硅、金属合金、无机膜、聚合物、尼龙或用于检测HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的塑料。

本发明的抗原可为整个蛋白质、截短的蛋白质、蛋白质的片段或肽。抗原可为蛋白质的自然发生的、基因工程产生的突变体，或为了在特殊的哺乳动物或宿主中表达的密码子优化的。通常，B细胞抗原表位可包括至少约5个氨基酸，但可以小至3～4个氨基酸。

通常，抗原表位可包括7～15个氨基酸，如9、10、12或15个氨基酸。术语“抗原”表示抗原的亚单位，(即与与抗原本质上相关联的整个的生物体上分离和离散的抗原)。抗体，如抗个体基因型抗体或其片段和合成肽模拟位，也即为可模拟抗原或抗原表位的合成肽，也可被本发明中抗原的定义下捕获。

此外，为了本发明的目的，“抗原”是指包括修饰，如缺失、增加或取代的蛋白质，通常本质上是同自然存在的序列保守的，只要该蛋白质维持引起本申请所定义的免疫学响应的能力。这些修饰可以特意的，如通过定点诱变，或可以是偶然的，如通过制备抗原的宿主的突变。

本发明的抗原可通过本领域公知的方法优化密码子，来提高在宿主中的表达或免疫原性。

可使用免疫印迹的蛋白质印迹分析、免疫细胞化学、免疫组织化学、斑点印迹分析、流式细胞术、ELISA试验或RIA试验，在生物样品内开展抗体和HNA-3a或HNA-3b抗原的特异性地结合。这些方法和其他方法是本领域常用的(见See Sambrook等.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratories(New York，1989))。

此外，可使用微量细胞毒性试验在生物样品中检测HNA-3a或HNA-3b。微量细胞毒性测定包括混合源自具有很好特征类型的抗体，也即HNA-3a或HNA-3b的免疫活性的受体或供体的纯嗜中性白细胞。将混合物温育足够的时间，使抗体结合到HNA抗原的嗜中性表面。然后，添加补体，其可源自如兔血清。补体的添加可引起补体结合，并且抗体结合在它们的细胞表面的细胞会由于补体结合反应而裂解。裂解的细胞数量可使用各种不同的方法测定。例如，可将活体染料添加到样品中，这种活体染料不进入活的细胞，但会使死细胞染色，如锥虫蓝，可测定死细胞对活细胞的数目。

HNA-3核酸的检测方法

本发明提供用于检测生物样品中HNA-3a核酸的方法，利用寡核苷酸探针与SEQ IDNO：3所示的核酸序列片段杂交。本发明提供用于检测生物样品中HNA-3b核酸的方法，利用寡核苷酸探针与SEQ ID NO：4所示的核酸序列片段杂交。HNA-3a或HNA-3b特异性地与寡核苷酸探针杂交的检测方法有Northern印迹杂交分析、Southern印迹杂交分析、slot-印迹杂交分析或原位杂交分析或本领域任何其它的方法，如Sambrook等(Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratories New York，1989)描述的那些技术。

优选的寡核苷酸探针为能与含有编码HNA-3a抗原表位的HNA-3a基因的序列杂交的那些寡核苷酸探针。例如，优选的探针可以与编码SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42所示核酸序列的核苷酸杂交。此外，本发明的探针包括能与内含子或编码HNA-3a的基因的5′和3′未转录区域杂交的那些探针。

优选的寡核苷酸探针为能与含有编码HNA-3b抗原表位的HNA-3b基因的序列杂交的那些寡核苷酸探针。例如，优选的探针可以与编码SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26所示核酸序列的核苷酸杂交。此外，本发明的探针包括能与内含子或编码HNA-3b的基因的5′和3′未转录区域杂交的那些探针。

标记该寡核苷酸探针可用于检测与生物样品中提取的DNA的杂交。探针可包括放射性标记，如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹²⁵I。此外，标记物可以是荧光的或化学发光的化合物，如异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、罗丹明或荧光素。标记物可以是酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、生物素和抗生物素蛋白或辣根过氧化物酶(Bayer等.，Meth.Enz.，184：138-163(1990))。

阵列或微阵列是指附着在固体表面，如玻璃、塑料或硅芯片的DNA探针或DNA片段的集合，形成一个用于同时表达谱或监测多基因表达水平的阵列。寡核苷酸探针阵列可用于检测生物样品中的HNA-3a或HNA-3bDNA。优选包括与HNA-1和/或HNA-2杂交的探针的阵列。此外，优选包括与HNA-1、HNA-2和HLA杂交的探针的阵列。市售阵列可用于检测包括与CTL2杂交的探针的HNA-3a或HNA-3b，如在阵列nos.U95-C和U95-B上检测SLC44A2的Affymetrix探针系列nos.58800、48798和56340，在阵列no.U133-B上检测SLC44A2的探针系列nos.225175和224609，和在阵列no.U133Plus 2上检测SLC44A2的探针系列nos.225175和224609。本发明的阵列包括微阵列、DNA芯片、微球阵列、基因芯片和生物芯片。

寡核苷酸探针可附着在如膜、珠片、过滤器、玻璃、硅、金属、金属合金、anopore无机膜、聚合物、尼龙或塑料的固体基质上。基质在附着探针前可用化学物质进行化学处理，以在使用过程中提高结合力或抑制非特异性的结合。示例性的处理包括用氨烷基硅烷或者丙烯酰胺或蛋白质的聚合物材料涂层给玻片镀膜。探针可以通过共价键和非共价键连接到基质上。

本发明还提供采用扩增法检测生物样品中HNA-3a或HNA-3b的方法，其采用例如聚合酶链反应和对编码HNA-3a(SEQ ID NO：1)或HNA-3b(SEQ ID NO：2)的核酸序列片段特异的至少一个寡核苷酸引物。

本文中，“聚合酶链反应”或“PCR”是指如在美国专利No.4,683,195和美国专利No.4,683,202中描述的方法，采用至少两个引物和一个DNA聚合酶，用于扩增DNA片段。其它核酸扩增方法有链替代扩增3(SDA，BD ProbeTec(TM)、等温扩增法如赖解旋酶扩增(HDA)和等温逆转录-嗜热赖解旋酶扩增(RT-tHDA)，滚环扩增(RCA)和环介导等温扩增(LAMP)。这些方法可以按照本领域的技术标准来实施。本发明还预期利用测序分析来证实用PCR扩增的DNA片段的同一性。

在本发明的方法中，可以使用适于实施PCR的“PCR反应混合物”进行PCR。PCR反应混合物将含有一种适量的热稳定的DNA聚合酶、线性或圆形模板DNA，优选双链DNA，来扩增一对寡核苷酸引物，配置的引物之一用于退火模板的一个链，配置的另一个引物用于退火模板的另一个链或互补的链，可能还需要ATP、适量的四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)和缓冲液、盐类，如氯化镁、防腐剂、还原剂和水。

本发明的寡核苷酸引物将设计为特异性扩增编码HNA-3a抗原表位或HNA-3b抗原表位的核酸。在设计寡核苷酸引物时，引物的长度取决于其(A+T)的含量，及其配体的Tm。此外，引物应足以复杂以减少引物退火序列而不是其它靶的可能性。本发明的方法可以利用10-30个核苷酸长度的引物，优选引物的长度为17个核苷酸。一般地，建议引物的G+C含量为40％-60％，避免任何一个碱基的内部二级结构和长向伸展。此外，引物不应退火到熔点高于引物的二级结构区域(在靶内)。

本发明用于基因分型HNA-3a表型优选包括用于扩增下组氨基酸序列的寡核苷酸引物：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42。此外，本发明的引物包括能扩增SEQ ID NO：3所示片段的那些引物，所述片段含有内含子或编码HNA-3a的基因的5′和3′未转录区域。引物的示例包括正义引物5′AGT GGC TGA GCT TCG 3’(SEQ ID NO：48)和反义引物5′GTG CGC CAA TAT CCT CAC TTG 3’(SEQ ID NO：50)。

本发明用于基因分型HNA-3b表型优选包括用于扩增下组氨基酸序列的寡核苷酸引物：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24或SEQ ID NO：26。本发明还设想扩增包括SEQ ID NO：4的密码子154的SEQ ID NO：4片段的引物。此外，本发明的引物包括能扩增SEQ ID NO：4片段的那些引物，所述片段含有内含子或编码HNA-3b的基因的5′和3′未转录区域。引物的示例包括正义引物5’GAG TGG CTGTGC TTC A 3’(SEQ ID NO：49)和反义引物5’GTG CGC CAATAT CCT CAC TTG 3’(SEQ IDNO：50)。

本发明还包括在生物样品中检测HNA-1核酸以及检测HNA-3核酸的方法。HNA-1核酸可采用寡核苷酸探针或寡核苷酸引物进行检测，在141位核苷酸、147位核苷酸、227位核苷酸、277位核苷酸或349位(HNA-1avs.HNA-1b)以及266位(HNA-1c vs.HNA-1b)核苷酸检测唯一的HNA-1抗原表位(多态性)。本发明进一步包括在生物样品中检测HNA-2核酸的方法。由于HNA-2只有一个等位基因，对HNA-2的表达可用寡核苷酸探针或与任何编码区的引物同源性来检测。

脱氧核苷三磷酸(dNTPs)包括2′-脱氧腺苷5′-三磷酸(dATP)、2′-脱氧胞苷5′-三磷酸(dCTP)、2′-脱氧鸟苷5′-三磷酸(dGTP)和2′-脱氧胸苷5′-三磷酸(dTTP)。一般地，在PCR反应中dNTP的浓度约为200μM。重要的是要保持上述四个dNTP的浓度，每个dNTP的估计Km(10μM-15μM)和最佳碱基结合的平衡。通过等摩尔浓度来降低dNTP和镁离子的浓度可以提高保真度。也可使用改良的dNTPs(dig-11-dUTP、5-溴-dUTP、肌苷、生物素-11-dUTP、生物素-16-dUTP和7-脱氮dGTP)和2′-脱氧尿苷5′-三磷酸(dUTP)。

试剂盒

本发明提供了用以实施本发明任意方法的试剂盒。本发明的试剂盒包括用于检测生物样品中HNA-3a或HNA-3b的特异性抗体的成分。该试剂盒可以包含一个分离的或重组的HNA-3a或HNA-3b多肽或其抗原片段，在生物样品中与含HNA-3a或HNA-3b特异性抗体形成复合物和已知用于阳性对照的HNA-3a或HNA-3b特异性抗体。本发明还提供用于检测HNA-1和HNA-2特异性抗体以及HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的试剂盒，其包含用于HNA-1检测的Fc-γ受体IIIb或其抗原片段，及用于检测HNA-2的CD177或其抗原片段，以及已知的HNA-1和HNA-2特异性抗体。本发明还提供用于检测HNA-4和/或HNA-5特异性抗体以及HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的试剂盒，其包含用于检测HNA-4的CD11b(CR3)或其抗原片段，及用于检测HNA-5的CD11a(LFA-1)或其抗原片段，以及已知的HNA-4和HNA-5的特异性抗体。此外，本发明提供在生物样品中检测HLA特异性抗体的试剂盒，其包括含有HLA的多肽和已知的HLA特异性抗体。

用于检测HNA-3a或HNA-3b特异性抗体的试剂盒以及检测可选地其它HNA和/或HLA抗原的特异性抗体的试剂盒，可以进一步包括本领域常规的实施检测分析的任何必要组分。例如，该试剂盒可以包括实施SRID、ELISA、HAI、MAIGA分析、GIIFT、MLAT和GAT的必要组分。

本发明的试剂盒包括用于检测生物样品中HNA-3a或HNA-3b的组分。该试剂盒可以包括与HNA-3a或HNA-3b特异性结合的抗体，以及包括用作阳性对照的用于抗体的HNA-3a或HNA-3b抗原表位分离的或重组的蛋白或多肽。本发明还提供用于检测HNA-1和HNA-2以及HNA-3a或HNA-3b的试剂盒，其包含HNA-1和/或HNA-2的特异性抗体以及与HNA-1和HNA-2抗原表位相应的重组蛋白或多肽。此外，本发明提供用于在生物样品中检测HLA以及HNA的试剂盒，其包含HLA特异性抗体和与HLA抗原表位相应的重组蛋白或多肽。

用于检测HNA-3a或HNA-3b和可选地其它HNA和/或HLA抗原的试剂盒可以进一步包括实施本领域常规的检测分析的任何必要的组分。例如，该试剂盒可以包括缓冲液、加载染料、凝胶，如用于制备SDS-PAGE凝胶进行免疫印迹分析的聚丙烯酰胺凝胶和分子量标记物。该试剂盒还包括过滤器、阻止缓冲液的膜、对照缓冲液、同型对照抗体、冲洗缓冲液或用于进行免疫印迹或点印迹分析如标记的二级抗体检测的试剂或缓冲液。该试剂盒还可以包括固定剂、阻断缓冲液、对照缓冲液、冲洗缓冲液、染色染料和检测试剂，所述检测试剂包括进行免疫化学和免疫组化的抗-特定特异性抗体。此外，该试剂盒可以包括必要的试剂和工具，以实施流式细胞仪、ELISA分析、RIA分析或微毒性分析。

本发明的试剂盒包括用于检测生物样品中HNA-3a或HNA-3b核酸的组分。该试剂盒包括与SEQ ID NO：3所示的HNA-3a核酸片段杂交的寡核苷酸探针，以及与寡核苷酸探针杂交的SEQ ID NO：3所示的核酸片段作为阳性对照。另外，该试剂盒包括与SEQ ID NO：4所示的HNA-3b核酸片段杂交的寡核苷酸探针，以及作为阳性对照的与寡核苷酸探针杂交的SEQID NO：4所示的核酸片段。本发明还提供在生物样品中检测HNA-1和HNA-2核酸、以及HNA-3a或HNA-3b核酸的试剂盒，其包含HNA-1和HNA特异性的寡核苷酸探针，以及作为阳性对照的相应的HNA-1和HNA-2核酸片段。此外，本发明提供用于在生物样品中检测HLA核酸以及HNA核酸的试剂盒，其包含用作阳性对照的HLA核酸特异性的寡核苷酸探针及相应的HLA核酸片段。

另外，用于检测HNA-3a核酸的试剂盒包括用于扩增SEQ ID NO：3所示HNA-3a核酸片段的寡核苷酸引物，以及用作阳性对照的已知用寡核苷酸引物扩增的HNA-3a核酸片段。用于检测HNA-3b核酸的试剂盒包括用于扩增SEQ ID NO：4所示HNA-3b核酸片段的寡核苷酸引物，以及用作阳性对照的已知用寡核苷酸引物扩增的HNA-3b核酸片段。本发明进一步提供的试剂盒包括HNA-1和HNA-2核酸特异性的寡核苷酸引物，及已知通过寡核苷酸引物扩增的HNA-1和HNA-2核酸片段。此外，本发明提供的试剂盒包括HLA核酸特异性的寡核苷酸引物，以及HNA核酸特异性的寡核苷酸引物和通过寡核苷酸引物扩增的HLA核酸片段。

本发明的试剂盒还可以包括进行PCR或其它扩增方法的必要的组分。例如，该试剂盒可以包含以下物质的一种或多种：Taq聚合酶或其它热稳定的聚合酶、ATP、适量的四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)和缓冲液、盐类如氯化镁、防腐剂、还原剂或水。

用于检测HNA-3a或HNA-3b核酸及可选地其它HNA和/或HLA核酸的试剂盒可以进一步包括实施本领域常规检测方法的任何必要的组分。例如，该试剂盒可以包括从生物样品提取核酸的必要的试剂。该试剂盒可包括缓冲液、加载染料、凝胶、分子量标记物、膜、过滤器、阻止缓冲液和检测试剂，用于Northern印迹杂交分析、Southern印迹杂交分析，slot-印迹杂交分析或原位杂交分析以及本领域常规的任何其它方法，如所述技术。

通过下面非限制性的实施例来说明本发明。实施例1描述了从供体的血液中分离粒细胞。实施例2描述了用于获得HNA-3a的阳性和阴性血浆的方法。实施例3描述了粒细胞表面蛋白的生物素化。实施例4描述了用血浆培养粒细胞的方法。实施例5描述了采用流式细胞仪进行荧光激活细胞分选。实施例6描述了使用磁珠进行免疫沉淀反应。实施例7描述了实施SDS-PAGE和免疫印迹的方法。实施例8描述了利用傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)的方法。实施例1-8中所描述的实验用于鉴别HNA-3a和HNA-3b的氨基酸序列，这些方法可用于实施本发明的方法。实施例9描述了HNA-3a和HNA-3b的异源表达，而这些多肽可以用于本发明的方法中。实施例10描述了HNA-3a多肽片段的异源表达，这些肽片段用于映射HNA-3a的抗原表位，这些多肽可以用于本发明的方法中。实施例11描述了从人血浆中亲和纯化HNA-3a抗体。实施例12描述了HNA-3a抗原片段的鉴定，这些片段可以用来实施本发明的方法。实施例13描述了HNA-3a和HNA-3b基因分型的方法，其可用于实施本发明的方法。最后，实施例14描述了进行制备抗-HNA-3抗体的方法，这些抗体可以用于实施本发明的方法。

实施例

实施例1

粒细胞的分离

将选取的供体血液与1.25％EDTA和0.5％右旋糖酐混合。沉淀后，上清液进一步用于Ficoll密度离心。冲洗所获得的颗粒，发生红细胞溶血。冲洗剩余的粒细胞并配制成不同的细胞浓度作为起始原料。

实施例2

获得HNA-3a的阳性与阴性血浆

将选取的供体血液与1.25％EDTA混合，然后将细胞离心分离。上清液作为相应的血浆。

实施例3

粒细胞表面蛋白的生物素化

在免疫印迹分析中，采用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-biotin(PIERCE；Rockford，IL)将纯化的粒细胞生物素化。

实施例4

用血浆培养粒细胞

用HNA-3a-阳性或-阴性血浆在37℃培养粒细胞(生物素化或非生物素化的)至少30分钟。分批冲洗后，将全部细胞进行FACS分析，或者用含有Triton-X100的缓冲液进行细胞裂解。将细胞碎片离心后，分析含有蛋白的上清液。

实施例5

荧光激活细胞分选(FACS分析)流式细胞仪

将分离的HNA-3a-阳性和-阴性供体的粒细胞用血浆(用或不用抗-HNA-3a抗体)培养并冲洗。随后，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔F(ab′)2-抗人IgG培养细胞。冲洗后，用FACS检测细胞悬液，以确定粒细胞的荧光强度。高强度指示HNA-3a-阳性结果。

实施例6

采用磁珠方式进行免疫沉淀反应

将蛋白质-G包衣的磁珠与抗人IgG(Fc特异性的)偶合。冲洗后，用含有蛋白的上清液培养磁珠，如实施例4所述。对磁珠进行重新冲洗和消磁后，用含有SDS的样品缓冲液洗脱蛋白，(用于通过SDS-PAGE和免疫印迹分析)或直接在含有胰蛋白酶的缓冲液中消化，用于通过傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICR质谱)分析。

实施例7

SDS-PAGE/免疫印迹

用SDS-PAGE(7.5％的分离胶)和在硝酸纤维素膜上印迹来分离免疫沉淀反应(生物素化的批次)中的洗脱液。在偶合到生物素化的蛋白过程中，膜经过阻塞和冲洗步骤后，用碱性磷酸酶(AP)培养并结合链霉亲和素。加入NBT(硝基氯化四氮唑蓝)/BCIP(5-溴-4-氯-3′-吲哚基磷酸酯对甲苯胺盐)检测1-15分钟。

实施例8

傅立叶变换离子回旋共振(FTICR-MS)

用C18材料(ZipTip)预清洗胰蛋白酶消化的免疫沉淀蛋白(非生物素化的批次)，进行质谱分析。用SEQUEST Sorcerer-和Scaffold2软件(数据库：uniprot-sprot-human_re154)数据库对比评价多肽谱。

实施例9

HNA-3a和HNA-3b的异源表达

在大肠杆菌和CHO细胞中表达具有编码HNA-3a蛋白(SEQ ID NO：1)的DNA序列的cDNA克隆。用SDS-PAGE凝胶电泳(如实施例7中所述)分离合成的蛋白，通过结合人抗-HNA-3a抗体在免疫印迹中显示特异性。用DNA序列对cDNA克隆进行相同的程序来表达蛋白HNA-3b(SEQ ID NO：2)。

用His-tag表达HNA-3a蛋白以便进行纯化。此外，用固相ELISA证实重组人抗-HNA-3a或HNA-3b蛋白与其各自抗体的结合。

实施例10

多肽片段的异源表达

用pGEX-2TK载体(GE Healthcare，Chalfont St Giles，UK)和限制性内切酶BamHI和HindII(Roche，Basel，Switzerland)克隆HNA-3a DNA片段。将cDNA克隆NM_020428.2(OriGene，Rockville，MD)作为模板DNA来生成谷胱甘肽-S-转移酶基因区域(GST)融合体。编码SEQ ID NO：1所示氨基酸22-231(表示为“HNA-3a(22-231)”)和SEQ ID NO：1所示氨基酸145-167(表示为“HNA-3a(145-167)”)的DNA片段被插入到载体JHC27中以编码GST-HNA-3a融合肽。将编码SEQ ID NO：1所示氨基酸114-164(表示为“HNA-3a(114-164)”)的DNA片段插入到pTB25载体中以编码GST融合肽GST-HNA-3a(114-164)。

用上述载体转化大肠杆菌BL21-Gold(DE3)细胞(Stratagene，La Jolla，CA)，在含有100μg/ml氨苄青霉素的YTG 100培养基中于37℃培养至OD600＝0.7。随后，用异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)培养细胞(1mM；1h)，然后离心(7,000g；10分钟)，并在冰冷的PBS中冲洗。然后在变性缓冲液(8M尿素)中超声处理细胞，离心(12,000g)，上清液用变性缓冲液(TRIS-甘油)透析。将融合蛋白上清加载到谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱上，用PBS冲洗。用含有10mM还原的谷胱甘肽的50mM Tris-HCl(pH8)溶液洗脱GST-HNA-3a融合肽。

实施例11

由人血浆亲和纯化HNA-3a抗体

为由人血浆亲和纯化HNA-3a抗体，如实施例10所述制备GST-HNA-3a(114-164)，浓缩和渗析抗耦合(0.2M NaHCO3，0.5M NaCl，pH 8.3)。用6ml冰冷的1mM HCl平衡HiTrapNHS-激活HP柱(GE Healthcare，Uppsala，瑞典)；以及随后将1ml浓缩的GST-HNA-3a(114-164)肽注入在柱上。25℃温育30分钟后，根据使用说明书冲洗该柱。

用冲洗缓冲液(1∶25)(20mM NaH2PO4，150mM NaCl，pH 7.4)稀释已知对HNA-3a抗体阳性的人血浆并将50ml以0.8ml/min的流速装载在柱上。用冲洗缓冲液冲洗后，利用10ml0.1M的甘氨酸缓冲液(pH 2.7)由柱洗脱抗体。用250μl中和缓冲液(1MTris-HCl，pH 9)混合等分的收集的级分(750μl)。收集含有蛋白浓度大于50μg/ml的级分并用反向冲洗缓冲液渗析。

使用粒细胞活化试验检测是否HNA-3a诱导粒细胞聚集。用已知包含抗HNA-3a抗体的人血浆(30min，37℃)温育由HNA-3a阳性供体分离的粒细胞，且随后进行冲洗(140g，5min)。根据厂商的使用说明书(BAG，Lich，德国)利用酸洗脱系统获得结合抗体。

HNA-3a特异性抗体，通过在粒细胞活化试验中与GST-HNA-3a(114-164)肽结合来亲和纯化获得的洗脱抗体。用于此试验的阴性对照为单独的GST-融合蛋白，包含HNA-3b抗体的对照血清和阴性对照抗体(无HNA-3抗体)。HNA-3a抗体仅仅以内源形式激活粒细胞聚集且失活的形式具有很小的影响。固定的粒细胞凝集物为非阳性的。

实施例12

HNA-3a的抗原片段的鉴定

为绘制HNA-3a氨基酸序列(SEQ ID NO：SEQ ID NO：1)的抗原表位，根据实施例10的描述制备包括HNA-3a氨基酸序列的胞外片段的重组肽如GST-融合肽。通过Western印迹测定的这些肽与HNA-3a血清的活性见下表1

将来自代表性HNA-3a阳性(HNA-3a+)供体和代表性HNA-3a阴性供体(HNA-3a-)的分离的粒细胞与已知含有HNA-3a抗体(+)和已知不含有HNA-3a抗体(-)的血浆一起温育。然后用结合有结合磁珠的蛋白G的抗-人类IgG免疫沉淀HNA-3a蛋白。对于每种供体/血浆组合，样品用肽-N-糖苷酶F(PNGase F)去糖基化。

经SDS-PAGE分离免疫沉淀的蛋白，然后使用本领域公知的方法转化到消化纤维素膜上，并经与HNA-3a+和HNA-3a-血浆免疫印迹进行分析。蛋白首先用与链亲和素(a)或抗-人类IgG(b)偶联的碱性磷酸酶观察，然后与NBT/BCIP一起温育用于检测。

对含有SEQ ID NO：1的氨基酸145-167(HNA-3a(145-167)；SEQ ID NO：48)和SEQID NO：1的氨基酸55-231(HNA-3a(55-231)；SEQ ID NO：27)的GST-融合肽使用免疫印迹进行分析。50kDa条带代表与存在于HNA-3a阳性血清中的抗体结合的GST-HNA-3a(55-231)肽。较小的36kDa的条带代表与存在于HNA-3a阳性血清中的抗体结合的GST-HNA-3a(145-167)肽。只有来自HNA-3+血浆的抗体与HNA-3a融合肽反应。来自HNA-3a-血浆的抗体不与HNA-3a融合蛋白反应。两种HNA-3a阳性血浆没有显示与较长的HNA-3a的氨基酸55-231肽的结合，HNA-3a阳性血浆显示出与HNA-3a较小片段氨基酸145-167的结合。

GST-融合肽HNA-3a氨基酸145-167也诱导在HNA-3a阳性粒细胞中的聚集。

这种分析证实了HNA-3a多肽序列的关键的最小抗原性片段是SEQ ID NO：1的氨基酸154-164(SEQ ID NO：25)。

这样的方法可用于鉴定HNA-3a的抗原性片段或者诸如HNA-1，HNA-2，HNA-5或HLA的任何其他抗原。

实施例13

HNA-3a和HNA-3b的基因分型

HNA-3多态性的PCR如下进行。50-100ng DNA的等份样品，使用0.5pmol等位基因-特异性正义引物(5’-AGT GGC TGA GGT GCT TCG-3；SEQ ID NO：49；HNA-3a)或5’-GAG TGGCTG AGG TGC TTC A-3’；SEQ ID NO：50；HNA-3b))和部分内含子反义引物(5’-GTG CGC CAATAT CCT CAC TTG-3’(SEQ ID NO：51))。聚合酶链反应(PCR)用0.2mmol脱氧核糖核苷三磷酸和2.0单位的Hot Start Taq DNA聚合酶(GeneCraft，Germany)在热循环仪上(GeneAmpPCR System 2700，Applied Biosystems，Germany)在总体积20μL中进行。在95℃加热10分钟，2-步PCR在以下条件下进行：变性(30秒，95℃)，退火(40秒，64℃)，延伸(30秒，72℃)用于10个循环，变性(30秒，95℃)，退火(30秒，61℃)，延伸(30秒，72℃)用于20个循环，终延伸(5分钟，72℃)。最为内部阳性对照，使用将扩增hGH基因439-bp片段的0.0625pmol人生长激素(hGH)引物(5’-CAG TGC CTT CCC AAC CAT TCC CTT A-3’(SEQ ID NO：52)，5’-ATC CACTCA CGG ATT TCT GTT GTG TTT C-3’(SEQ ID NO：53))。使用Tris硼酸盐EDTA缓冲液(TBE-缓冲液；5Prime，Germany)在1.5％琼脂糖凝胶上分析PCR产物(291bp)。

该方法可用于任何抗原等位基因，诸如HNA-1，HNA-2，HNA-4，HNA-5或HLA的基因分型。

实施例14

抗-HNA-3抗体的制备方法

特异性针对HNA-3a或HNA-3b蛋白的抗体可以通过用包含特定HNA-3表位的肽免疫获得。用于产生抗体的合适的方法包括那些描述在Hudson和Hay，Practical Immunology，2nd Edition，Blackwell Scientific Publications(1980)中的方法。可用于产生特异性针对HNA-3a的抗体的示例的抗原性片段包括SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ IDNO：40，SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42。可用于产生特异性针对HNA-3b的抗体的示例的抗原性片段包括SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26。

在用于产生抗体的一个方法中，动物(典型地为小鼠或兔子)注射含有HNA-3a或HNA-3b表位的肽，并分离血清中产生的多克隆抗体。此外，选择经ELISA确定的具有充分血清滴度水平的动物产生的杂交瘤。收集免疫的动物的脾，并且制备单细胞悬液，从所述单细胞悬液回收脾细胞。将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(诸如Sp2/0-Ag14细胞；ATCC编号：CRL-1581)融合，在DMEM中与200U/ml青霉素，200g/ml链霉素硫酸化物和4mM谷氨酸一起温育，然后在HAT选择培养基中温育(次黄嘌呤；氨蝶呤；胸苷)。选择后，从每个含有杂交瘤的每个孔获得组织培养物上清液，并经ELISA检验抗-HNA-3a或HNA-3b的抗体产生。

或者，也可以使用用于获得抗-HNA-3a或抗-HNA-3b抗体的方法，诸如带有人Ig位点的转基因小鼠的免疫用于产生人抗体，并筛选合成的抗体文库，诸如由抗体可变结构域的突变产生的。

此外，可以从噬菌体-显示文库产生人抗体(Hoogenboom等.，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks等.，J.Mol.Biol.222：581(1991)。这些过程通过在丝状噬菌体表面上显示抗体结合模拟免疫选择，以及随后的通过他们与所选择的抗原的结合选择噬菌体。一种这样的技术描述在PCT申请PCT/US98/17364中，其中描述了使用这样的方法分离针对MPL-和msk-受体的高亲和性和功能性的激动性抗体。

这些方法用于产生特异性针对任何抗原性蛋白，诸如HNA-1，HNA-2，HNA-4，HNA-5或HLA的抗体。

在考虑到本发明的优选实施方案后，对于本领域技术人员而言能够预料到在本发明的实施中的多种修改和改变。因此，对于本发明的范围应该进行的唯一限定是随附的权利要求书。

Claims

1.SEQ ID NO : 1的氨基酸序列所示的多肽或其抗原片段在制备用于测定移植或输血用供体组织是否在人受体中诱导输血相关急性肺损伤(TRALI)或移植物抗宿主症(GVHD)的试剂盒中的用途，其中人受体表达HNA-3a抗原。

2.根据权利要求1所述的用途，其中抗原片段如选自下组的氨基酸序列所示：SEQ IDNO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO:36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41和SEQ ID NO: 42。

3.SEQ ID NO : 2的氨基酸序列所示的多肽或其抗原片段在制备用于测定移植或输血用供体组织是否在人受体中诱导输血相关急性肺损伤(TRALI)或移植物抗宿主症(GVHD)的试剂盒中的用途，其中人受体表达HNA-3b抗原。

4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其中所述试剂盒进一步包括选自Fc-γ受体IIIb多肽、CD177多肽、CD11b多肽、CD11a多肽和HLA抗原的一种或多种多肽。

5.SEQ ID NO : 1的氨基酸序列所示的多肽或其抗原片段在制备用于测定人移植或输血受体对排斥移植或输血组织的易感性的试剂盒中的用途，其中供体组织包含HNA-3a多肽或其抗原片段。

6.根据权利要求5所述的用途，其中抗原片段如选自下组的氨基酸序列所示：SEQ IDNO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO:36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41和SEQ ID NO: 42。

7.SEQ ID NO : 2的氨基酸序列所示的多肽或其抗原片段在制备用于测定人移植或输血受体对排斥移植或输血组织的易感性的试剂盒中的用途，其中供体组织包含HNA-3b多肽或其抗原片段。

8.根据权利要求5-7任一项所述的用途，其中所述试剂盒进一步包括选自Fc-γ受体IIIb多肽、CD177多肽、CD11b多肽、CD11a多肽和HLA抗原的一种或多种多肽。

9.特异性结合SEQ ID NO : 1的氨基酸序列所示的HNA-3a多肽的抗体在制备用于检测人移植或输血受体对发展输血相关急性肺损伤(TRALI)或移植物抗宿主症(GVHD)的易感性的试剂盒中的用途，其中供体组织包含抗- HNA-3a抗体。

10.特异性结合SEQ ID NO : 2的氨基酸序列所示的HNA-3b多肽的抗体在制备用于检测人移植或输血受体对输血相关急性肺损伤(TRALI)或移植物抗宿主症(GVHD)易感性的试剂盒中的用途，其中供体组织包含抗- HNA-3b抗体。

11.根据权利要求9或10所述的用途，其中所述试剂盒进一步包括特异性结合Fc-γ受体IIIb多肽、CD177多肽、CD11b多肽、CD11a多肽和HLA抗原的一种或多种抗体。

12.根据权利要求9或10任一项所述的用途，其中抗体包括选自下组的标记：放射性标记、荧光标记、酶标记、亲和素标记或生物素标记。

13.与SEQ ID NO: 3的片段杂交的寡核苷酸探针在制备用于检测用于移植或输血的供体组织是否有可能在人受体中被排斥的试剂盒中的用途，其中人受体表达HNA-3a特异性抗体。

14.根据权利要求13的用途，其中寡核苷酸探针如编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列所示：SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 34、 SEQ IDNO: 35、 SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO:40、 SEQ ID NO: 41和SEQ ID NO: 42。

15.与SEQ ID NO: 4的片段杂交的寡核苷酸探针在制备用于检测用于移植或输血的供体组织是否有可能在人受体中被排斥的试剂盒中的用途，其中人受体表达HNA-3b特异性抗体。

16.根据权利要求13-15任一项所述的用途，其中所述试剂盒进一步包括特异性结合Fc-γ受体IIIb多肽、CD177多肽、CD11b多肽、CD11a多肽和HLA抗原的一种或多种抗体。

17.根据权利要求16的用途，其中SEQ ID NO:4的片段包括SEQ ID NO: 4的141位的核苷酸、SEQ ID NO: 4的147位的核苷酸、SEQ ID NO: 4的226位的核苷酸、SEQ ID NO: 4的227位的核苷酸、SEQ ID NO: 4的277位的核苷酸或SEQ ID NO: 4的349位的核苷酸中的至少任一种。

18.与SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的片段杂交的寡核苷酸探针在制备用于检测人移植或输血受体对发展输血相关急性肺损伤(TRALI)或移植物抗宿主症(GVHD)的易感性的试剂盒中的用途，其中供体组织包含HNA-3a特异性抗体。

19.根据权利要求18所述的用途，其中寡核苷酸探针如编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列所示：SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 34、 SEQID NO: 35、 SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO:40、 SEQ ID NO: 41和SEQ ID NO: 42。

20.与SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的片段杂交的寡核苷酸探针在制备用于检测人移植或输血受体对发展输血相关急性肺损伤(TRALI)或移植物抗宿主症(GVHD)的易感性的试剂盒中的用途，其中供体组织包含HNA-3b特异性抗体。

21.根据权利要求20所述的用途，其中所述片段如SEQ ID NO: 5的141位的核苷酸、SEQID NO: 5的147位的核苷酸、SEQ ID NO: 5的226位的核苷酸、SEQ ID NO: 5的227位的核苷酸、SEQ ID NO: 5的277位的核苷酸或SEQ ID NO: 5的349位的核苷酸中的至少任一种所示。

22.根据权利要求13-15任一项所述的用途，其中寡核苷酸探针被固定于选自膜、滤纸、珠子及芯片的基质。

23.根据权利要求13-15任一项所述的用途，其中寡核苷酸探针在阵列中。

24.根据权利要求13-15任一项所述的用途，其中寡核苷酸探针包括选自下组的标记：放射性标记、荧光标记、酶标记、亲和素标记或生物素标记。

25.特异于HNA-3a核酸且扩增SEQ ID NO : 3的核酸的片段的至少一个寡核苷酸引物在制备用于检测用于移植或输血的供体组织是否有可能在人受体中被排斥的试剂盒中的用途，其中人受体具有HNA-3a特异性抗体。

26.根据权利要求25所述的用途，其中HNA-3a核酸的片段编码选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO:41和SEQ ID NO: 42。

27.根据权利要求25-26任一项所述的用途，其中所述试剂盒进一步包括选自特异于SEQ ID NO : 5所示的HNA-1核酸的寡核苷酸引物、特异于SEQ ID NO : 7所示的HNA-2核酸的寡核苷酸引物、特异于SEQ ID NO : 9所示的HNA-4核酸的寡核苷酸引物、特异于SEQ IDNO : 11所示的HNA-5核酸的寡核苷酸引物或特异于HLA核酸的寡核苷酸引物的至少一种寡核苷酸引物。

28.特异于HNA-3a核酸且扩增SEQ ID NO : 3的核酸的片段的至少一个寡核苷酸引物在制备用于检测人移植或输血受体对发展输血相关急性肺损伤(TRALI)或移植物抗宿主症(GVHD)的易感性的试剂盒中的用途，其中供体组织包含HNA-3a特异性抗体。

29.根据权利要求28所述的用途，其中HNA-3a核酸序列的片段编码选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、 SEQ IDNO: 41和SEQ ID NO: 42。

30.特异于HNA-3b核酸且扩增SEQ ID NO : 4的核酸的片段的至少一个寡核苷酸引物在制备用于检测人移植或输血受体对发展输血相关急性肺损伤(TRALI)或移植物抗宿主症(GVHD)的易感性的试剂盒中用途，其中供体组织包含抗- HNA-3b抗体。

31.根据权利要求28-30任一项所述的用途，其中所述试剂盒进一步包括选自特异于SEQ ID NO : 5所示的HNA-1核酸的寡核苷酸引物、特异于SEQ ID NO : 7所示的HNA-2核酸的寡核苷酸引物、特异于SEQ ID NO : 9所示的HNA-4核酸的寡核苷酸引物、特异于SEQ IDNO : 11所示的HNA-5核酸的寡核苷酸引物或特异于HLA核酸的寡核苷酸引物的至少一种寡核苷酸引物。

32.一种试剂盒，其包括：

a)SEQ ID NO: 1的氨基酸序列所示的多肽或其抗原片段，和

b)选自下组的一种或多种多肽或其抗原片段：Fc -γ受体IIIb多肽、CD177多肽、CD11b多肽、CD11a多肽和HLA抗原。

33.根据权利要求32所述的试剂盒，其进一步包括特异于HNA-3a的抗体。

34.根据权利要求32或33所述的试剂盒，进一步包括特异性结合包含选自下组的抗原的肽的一或多种抗体：HNA-1、HNA-2、HNA-4、HNA-5和HLA。

35.根据权利要求32或33所述的试剂盒，其中HNA-3a多肽片段如选自下组的氨基酸序列所示：SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO:35、 SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41和SEQ ID NO: 42。

36.根据权利要求32或33所述的试剂盒，其进一步包括SEQ ID NO: 2的氨基酸序列所示的多肽或其抗原片段。

37.一种试剂盒，其包括：

a) 特异于SEQ ID NO: 1或其抗原片段的抗体，和

b) 特异性结合包括选自下组的抗原的肽的一种或多种抗体：HNA-1、HNA-2、HNA-4、HNA- 5或HLA。

38.根据权利要求37所述的试剂盒，其进一步包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列所示的多肽或其抗原片段。

39.根据权利要求37或38任一项所述的试剂盒，其进一步包括选自下组的一或多种多肽：Fc-γ受体IIIb多肽、CD177多肽、CD11b多肽、CD11a多肽和HLA抗原。

40.根据权利要求37或38所述的试剂盒，其进一步包括特异于HNA-3b的多肽或抗体。

41.一种试剂盒，其包括：

a)SEQ ID NO: 2的氨基酸序列所示的多肽或其抗原片段，和

c)选自下组的一或多种多肽：Fc –γ受体IIIb多肽、CD177多肽、CD11b多肽、CD11a多肽和HLA抗原。

42.根据权利要求41所述的试剂盒，其进一步包括特异于HNA-3b的抗体。

43.根据权利要求41或42所述的试剂盒，进一步包括特异性结合包含选自下组的抗原的肽的一或多种抗体：HNA-1、HNA-2、HNA-4、HNA-5和HLA。

44.一种试剂盒，其包括：

a) 特异于SEQ ID NO: 2或其抗原片段的抗体，和

c) 特异性结合包括选自下组的抗原的肽的一或多种抗体：HNA-1、HNA- 2、HNA- 4、HNA- 5和HLA。

45.根据权利要求44所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括SEQ ID NO: 2氨基酸序列所示的多肽或其抗原片段。

46.根据权利要求44或45任一项所述的试剂盒，进一步包括选自下组的一或多种多肽或其抗原片段：Fc –γ受体IIIb多肽、CD177多肽、CD11b多肽、CD11a多肽和HLA抗原。

47.根据权利要求44或45所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列所示的多肽或其抗原片段。

48.根据权利要求44或45所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括第二抗体。

49.根据权利要求48所述的试剂盒，其中第二抗体包括选择下组的标记：放射性标记、荧光标记、酶标记、亲和素标记或生物素标记。

50.根据权利要求44或45所述的试剂盒，其中抗体包括选择下组的标记：放射性标记、荧光标记、酶标记、亲和素标记或生物素标记。

51.一种试剂盒，其包括：

a) 与SEQ ID NO：3的核酸序列的片段杂交的寡核苷酸探针，和

b) 一或多种杂交于选自下组的核酸序列的片段的寡核苷酸探针：SEQ ID NO : 5、SEQID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11和HLA核苷酸序列。

52.根据权利要求51所述的试剂盒，其中寡核苷酸探针如编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列的片段所示：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42。

53.根据权利要求51或52所述的试剂盒，进一步包括杂交于SEQ ID NO : 4的核酸序列的片段的寡核苷酸探针。

54.一种试剂盒，其包括：

a) 杂交于SEQ ID NO：4的核酸序列的片段的寡核苷酸探针，和

c) 一或多种杂交于选自下组的核酸序列的片段的寡核苷酸探针：SEQ ID NO : 5、SEQID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11和HLA核苷酸序列。

55.根据权利要求54所述的试剂盒，其中寡核苷酸探针包括编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列的片段：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQID NO：23、SEQ ID NO：24、和SEQ ID NO：26。

56.根据权利要求54或55所述的试剂盒，进一步包括杂交于SEQ ID NO : 2的核酸序列的片段的寡核苷酸探针。

57.根据权利要求54或55所述的试剂盒，其中寡核苷酸探针包括选择下组的标记：放射性标记、荧光标记、酶标记、亲和素标记和生物素标记。

58.根据权利要求57所述的试剂盒，进一步包括用于凝胶装载的缓冲液。

59.一种试剂盒，其包括：

a) 一或多种用于扩增SEQ ID NO : 3的HNA-3a核酸的片段的寡核苷酸引物，和

b) 一或多种用于扩增选自下组的核酸序列的片段的寡核苷酸引物：SEQ ID NO : 5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11和HLA核苷酸序列。

60.根据权利要求59所述的试剂盒，进一步包括用于扩增SEQ ID NO：4的HNA-3b核酸的片段的寡核苷酸引物。

61.一种试剂盒，其包括：

a) 一或多种用于扩增SEQ ID NO : 4的HNA-3b核酸的片段的寡核苷酸引物，和

62.根据权利要求61所述的试剂盒，进一步包括用于扩增SEQ ID NO：2的HNA-3a核酸的片段的寡核苷酸引物。

63.根据权利要求61或62所述的试剂盒，进一步包括用于 PCR扩增的缓冲液、dNTP’s和用于凝胶装载的缓冲液。

64.SEQ ID NO：2的氨基酸序列所示的分离多肽。

65.一种分离多肽，其如选自下组的氨基酸序列所示：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42，其中多肽与HNA- 3a -特异性异体抗体反应。

66.一种分离的多核苷酸，其如编码权利要求64-65任一项所述的多肽序列的核苷酸序列所示。

67.权利要求65所述的多肽或其片段用于鉴定HNA-3a -特异性异体抗体的应用。

68.权利要求64所述的多肽或其片段用于鉴定HNA-3b -特异性异体抗体的应用。

69.SEQ ID NO：3的多核苷酸或其编码与HNA-3a -特异性异体抗体反应的蛋白的片段在制备用于HNA-3a基因型鉴定的试剂盒中的应用。

70.权利要求66所述的多核苷酸或其片段用于HNA-3b基因型鉴定的应用。

71.根据权利要求70所述的应用，其中片段包括SEQ ID NO:3的密码子154。

72.氨基酸序列SEQ ID NO：1所示的蛋白或其与HNA- 3a -特异性异体抗体反应的片段，或权利要求65所述的蛋白片段在制备用于鉴定抗HNA-3a抗原的抗体的血样或血浆分析的试剂盒中的应用。

73.权利要求64所述的多肽在用于鉴定抗HNA- 3b抗原的抗体的血样或血浆分析中的应用。

74.氨基酸序列SEQ ID NO：1所示的多肽或其片段或权利要求65所述的多肽在制备用于由血样或血浆分离抗体的试剂盒中的应用。

75.权利要求64-66任一项所述的多肽在制备用于由血样或血浆分离抗体的试剂盒中的应用。

76.权利要求64所述的多肽在方法中的应用，该方法利用蛋白或蛋白片段制备抗体，优选单克隆抗体。

77.一种被转化或转染以表达SEQ ID NO : 1的HNA-3a多肽或其片段的细胞在制备用于检测生物样品中HNA-3a特异性抗体的试剂盒中的应用。

78.根据权利要求77所述的应用，其中所述细胞为B细胞。

79.根据权利要求77或78所述的应用，其中所述片段如选自下组的氨基酸序列所示：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ IDNO：42。

80.一种被转化或转染以表达SEQ ID NO : 2的HNA-3b多肽或其片段的细胞在制备用于检测生物样品中HNA-3b特异性抗体的试剂盒中的应用。

81.根据权利要求80所述的应用，其中所述细胞为B细胞。