CN102827921B

CN102827921B - C9orf135基因、其编码的蛋白及其抗体的应用

Info

Publication number: CN102827921B
Application number: CN201110159475.1A
Authority: CN
Inventors: 李凌松; 周士新; 文锦华
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-06-14
Filing date: 2011-06-14
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2031-06-14
Also published as: CN102827921A

Abstract

本发明涉及基因C9ORF135的应用，具体讲涉及基因C9ORF135、其编码的蛋白以及该蛋白的抗体的应用及其试剂盒。本发明提出基因C9ORF135、其编码的蛋白以及该蛋白的抗体在诊断、检测或治疗精子畸形中的应用，在作为男性避孕药的潜在靶点中的应用、在诊断、检测或治疗衰老引起的精子活力下降及精子畸形中的应用，以及在检测胚胎干细胞分化中的应用，本发明还提出用于检测精子畸形的试剂盒、用于筛选男性避孕药物的试剂盒、用于检测胚胎干细胞分化的试剂盒及其使用方法。

Description

C9ORF135基因、其编码的蛋白及其抗体的应用

技术领域

本发明涉及基因C9ORF135的应用，具体讲，涉及基因C9ORF135、其编码的蛋白以及该蛋白的抗体的应用及其试剂盒。

背景技术

新基因C9ORF135位于人类第9号染色体，编码蛋白区（CDS）长度690个核苷核，编码229个氨基酸，经过SWISSPORT工具分析氨基酸残基的序列，发现有一个单跨膜结构域，将该蛋白分为胞外区、跨膜区和胞内区，并且有1个潜在的N-糖基化位点（表1），其中文献Liu T,Qian W.-J.,Gritsenko M.A.,et al.Human plasma N-glycoproteome analysis by immunoaffinity subtraction,hydrazide chemistry,and mass spectrometry.J.Proteome Res.4:2070-2080(2005)提示该蛋白为糖基化蛋白。该蛋白的结构域的预测如下表所示。

表1C9orf135编码蛋白质（NP_001010940）的可能结构域

而在现有技术的报道中，还没有该基因及其编码的蛋白质的功能的报道，为了进一步研究该基因及其编码的蛋白质的功能，发明人进行了深入的研究。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提供基因C9ORF135、其编码的蛋白以及该蛋白的抗体在诊断或检测精子畸形中的应用。

本发明的第二发明目的在于提供一种用于在诊断或检测精子畸形的试剂盒。

本发明的第三发明目的在诊断、检测或治疗衰老引起的精子活力下降及精子畸形的试剂盒。

本发明的第四发明目的在于提供基因C9ORF135、其编码的蛋白以及该蛋白的抗体在作为男性避孕药的潜在靶点中的应用。

本发明的第五发明目的在于提供基因C9ORF135、其编码的蛋白以及该蛋白的抗体在检测胚胎干细胞分化中的应用。

本发明的第六发明目的在于提供一种用于检测胚胎干细胞分化的试剂盒。

为了完成本发明的第一发明目的，采用的技术方案为：本发明涉及基因C9ORF135、其编码的蛋白以及该蛋白的抗体在诊断或检测精子畸形中的应用。

本发明该方案的第一优选技术方案为：所述的检测方法包括定量PCR检测法、ELISA免疫检测法、免疫印迹法；优选ELISA免疫检测法。

本发明该方案的第二优选技术方案为：采用定量PCR法检测基因C9ORF135的表达，用定量PCR仪检测，当待测组的基因C9ORF135水平低于正常参比组基因C9ORF13水平1/3时，判定为精子畸形；

采用ELISA免疫检测法检测C9ORF135编码的蛋白时，当待测组的基因C9ORF135编码的蛋白质水平低于正常参比组基因C9ORF135水平一半时，判定为精子畸形。

为了完成本发明的第二发明目的，采用的技术方案为：一种用于检测精子畸形的试剂盒，所述试剂盒为定量PCR的试剂盒，包括：提取精子RNA的试剂盒、正常参比组的RNA、逆转录试剂、C9ORF135基因的引物、内参的引物，SYBR荧光试剂盒，所述内参采用鱼精蛋白1。

所述的C9ORF135基因的引物：前引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，后引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；鱼精蛋白1的前引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，后引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

SEQ ID NO:1：5’-TATCAGCCACATGCTTATCC-3’；

SEQ ID NO:2：5’-TGCCAAATCTTTTAGAACCA-3’；

SEQ ID NO:3：5’-GCCAGGTACAGATGCTGTCGCAG-3’；

SEQ ID NO:4：5’-TTAGTGTCTTCTACATCGCGGTCTG-3’。

本发明还涉及一种用于检测精子畸形的试剂盒，所述试剂盒采用免疫检测法，包括：提取精子蛋白质的试剂盒、C9ORF135抗体包被的96孔板、C9ORF135的单克隆或多克隆抗体、作为浓度参比标准的C9ORF135纯化蛋白、第二抗体、ELISA显色试剂，用于检测的酶标仪，其中，C9ORF135抗体为单抗或多抗。

本发明该方案的第一优选技术方案为：所述的试剂盒中的C9ORF135的单克隆或多克隆抗体为兔源，所述的第二抗体选自辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。其中，所述的显色剂为邻苯二胺溶液(底物)，临用前配制0.1M柠檬酸(2.1g/100ml),6.1ml0.2M Na₂HPO₄.12H₂O(7.163g/100ml)6.4ml，蒸馏水12.5ml，邻苯二胺10mg，溶解。

所述试剂盒的使用方法为：将C9ORF135抗体包被的96孔板，加入提取的精子蛋白质，再加入C9ORF135抗体混合，温育，洗去非特异性吸附的蛋白，加入二抗和显色剂；用原核表达的C9ORF135蛋白作为参考的标准品，按浓度从高到低倍比稀释，绘制标准曲线；通过测定待测精子蛋白质的吸光度，计算其含量；

其中，C9ORF135抗体为单抗或多抗，试剂盒中的C9ORF135的单克隆或多克隆抗体为兔源，所述的第二抗体选自辣根过氧化物酶羊抗兔IgG；所述的显色剂为邻苯二胺溶液(底物)，临用前配制0.1M柠檬酸(2.1g/100ml)，6.1ml0.2M Na₂HPO₄.12H₂O(7.163g/100ml)6.4ml，蒸馏水12.5ml，邻苯二胺10mg，溶解。

其中，包被抗原条件为：37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时；抗原和抗体作用的时间为37℃2小时；洗液为含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液（0.01mol/L pH7.4PBS），常温洗涤3次，每次5分钟。

为了完成本发明的第三发明目的，采用的技术方案为：一种用于诊断或检测衰老引起的精子活力下降及精子畸形的试剂盒，其试剂盒组成与用于检测精子畸形的试剂盒相同。

为了完成本发明的第四发明目的，采用的技术方案为：基因C9ORF135、其编码的蛋白以及该蛋白的抗体在作为男性避孕药的潜在靶点中的应用。

本发明该方案的第一优选技术方案为：通过比较待测化合物对正常精子的C9ORF135表达水平有无抑制作用，从而判定待测化合物是否有药效。

本发明该方案的第二优选技术方案为：在筛选男性避孕药的化合物时，当待测化合物作用下的正常精子的C9ORF135表达水平低于正常对照组C9ORF135表达水平的一半时，判定该待测化合物有效。

为了完成本发明的第五发明目的，采用的技术方案为：基因C9ORF135、其编码的蛋白以及该蛋白的抗体在检测胚胎干细胞分化中的应用。

本发明该方案的第一优选技术方案为：所述的检测方法包括定量PCR检测法、ELISA免疫检测法。

本发明该方案的第二优选技术方案为：当采用定量PCR检测法时，当待测组的基因C9ORF135的水平不低于胚胎干细胞组50%时，判定为未分化；当采用免疫检测法时，当待测组的基因C9ORF135编码的蛋白质的水平不低于胚胎干细胞组50%时，判定为未分化。

为了完成本发明的第六发明目的，采用的技术方案为：一种用于检测胚胎干细胞分化的试剂盒，所述试剂盒包括：RNA提取试剂盒、正常参比组的RNA、逆转录试剂、C9ORF135基因的引物、内参的引物，SYBR荧光试剂盒，所述内参采用GAPDH。

本发明该方案的第一优选技术方案为：所述的C9ORF135基因的前引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，后引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。内参GAPDH的前引物如SEQID NO:5所示，后引物如SEQ ID NO:6所示；

SEQ ID NO:5： 5’-GCGACAGGAAGCAACACTGG-3’；

SEQ ID NO:6： 5’-ACACCAACACCGGCTTCG-3’。

本发明还提出一种用于检测胚胎干细胞分化的试剂盒，所述试剂盒包括：蛋白质提取试剂盒、C9ORF135抗体包被的96孔板、C9ORF135的单克隆或多克隆抗体、作为浓度参比标准的C9ORF135纯化蛋白、第二抗体、ELISA显色试剂，用于检测的酶标仪，其中，C9ORF135抗体为单抗或多抗。试剂盒中的C9ORF135的单克隆或多克隆抗体为兔源，所述的第二抗体选自辣根过氧化物酶羊抗兔IgG；显色剂为邻苯二胺溶液(底物)，临用前配制0.1M柠檬酸(2.1g/100ml),6.1ml0.2M Na₂HPO₄.12H₂O(7.163g/100ml)6.4ml，蒸馏水12.5ml，邻苯二胺10mg，溶解。

附图说明

图1为图1C9ORF135编码蛋白在人ES细胞的定位，图上为自制抗体染色，图下部为阴性对照；

图2为C9ORF135基因连上Flag标签后在HEK293T细胞中过表达，后用Flag抗体检测过表达的蛋白的共聚焦显微镜结果；

图3多肽抗体检测人ES细胞各组分蛋白质的Western Blot结果；

图4为胚胎发育中C9ORF135的表达，柱状图表示C9ORF135基因的相对表达量，点表示基因表达芯片所有的基因中所占的百分比位次；

图5精子发育的基因表达芯片结果分析，柱状图表示C9ORF135基因的相对表达量，点表示要基因表达芯片所有的基因中所占的百分比位次；

图6正常精子和畸形精子的基因表达芯片结果分析，柱状图表示C9ORF135基因的相对表达量，点表示要基因表达芯片所有的基因中所占的百分比位次；

图7正常精子和畸形精子的定量PCR结果比较；方点表示正常精子（normal）组，圆点为畸形精子（TZ，teratozoospermia）组。

下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明，但并不限定本发明的范围，本发明所用的试剂均为市售。

具体实施方式

实施例1制备基因C9ORF135的多克隆抗体

用该基因编码的具有保守性的氨基酸序列，制备多克隆抗体（兔源）。

1.抗体制备

1.1合成短肽，氨基酸序列：VERKGSLTLRSHHKKY，作为抗原。

1.2抗原注射以前需要收集一些兔的正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血，取血量约5ml。

1.3纯化免疫用的抗原，抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。

弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant，FCA）Sigma F-5881

弗氏不完全佐剂（Freund’s incomplete adjuvant，FIA）Sigma F-5506

1.4免疫方法采用背部多点注射法。即于家兔脊柱两旁选4～6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射。每次免疫的抗原量约100μg，免疫次数在四五次即可。

1.5免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。在三次免疫后，可以获得较高效价的抗体，每次取血量可以在40ml，最后一次取血可以采用颈动脉放血，一般一只家兔可放血100～120ml。

2.抗体的纯化

2.1准备蛋白A sepharose CL-4B亲和柱

通常准备5ml或10ml蛋白A sepharose CL-4B填料，在真空瓶中将等体积的填料和TBS缓冲溶液混合，搅拌。抽真空约15分钟以除去填料中的气泡，否侧在柱中形成的气泡影响柱子的容量和分离效果。将蛋白A sepharose CL-4B填料缓慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度为1ml/分-2ml/分，避免柱干，利用10倍于床体积并经过预冷的TBS缓冲溶液平衡柱子。2.2制备抗血清

将抗血清放入冰水或4℃冰箱中缓慢解冻以避免蛋白质的聚集。在蛋白质解冻过程中出现的聚集可通过37℃预热而溶解。加入固体叠氮化钠至浓度为0.05%，4℃，15,000xg离心5分钟，移出澄清的抗血清再经过滤器过滤除去多余的脂肪。

2.3亲和层析

将抗体用TBS缓冲溶液以1：5的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。以每分钟0.5ml的速度将抗血清上到柱上，为保证抗血清与填料的结合，需连续上柱2次并保留上样流出液。用TBS缓冲溶液清洗柱子至A_λ280nm<0.008后加pH2.7洗脱缓冲溶液，以0.5ml/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来。用已经加入100ul中和缓冲溶液的1.5ml EP管分管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查洗脱液的pH，如果pH低于7可利用中和缓冲液调至约pH7.4以防止抗体的变性。

在柱中加入10ml，pH1.9洗脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液至A_λ280nm<0.008。

利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。若蛋白浓度低于0.5mg/ml可加入10%的甘油以便保存，将纯化的抗体分装后在2℃～8℃保存。用含0.05%叠氮化钠的TBS缓冲溶液清洗柱子后将柱子储存在2℃～8℃环境。

实施例2制备基因C9ORF135的单克隆抗体

1.动物的选择与免疫

1.1动物的选择

纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。

1.2免疫方案

初次免疫：抗原1～50μg加福氏完全佐剂小鼠皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml，0.2ml/点）；

第二次免疫：剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或腹腔内注射（腹腔内剂量不宜超过0.5ml）。

2.细胞融合

2.1细胞融合前准备

2.1.1骨髓瘤细胞系的选择：

选用小鼠的骨髓瘤细胞，采用DMEM培养基。

2.1.2饲养细胞：

在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。采用的饲养细胞为小鼠腹腔巨噬细胞。饲养细胞的细胞数为一般为2×10⁴或10⁵细胞/孔。

2.2细胞融合的步骤

2.2.1制备免疫脾细胞

最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死，取10⁸脾淋巴细胞悬液备用；

2.2.2制备骨髓瘤细胞；

2.2.3融合

①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min；弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。

②90s内加入37℃预温的1ml45%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。

③加37。C预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

④离心，800rpm，6min。

⑤充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。

⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。

⑦将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。

3选择杂交瘤细胞及抗体检测

3.1HAT选择杂交瘤细胞

脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。杂交瘤细胞在HAT选择培养液可以生长繁殖。

在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

3.2抗体的检测

采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对McAb进行检测。

4.单克隆抗体的大量生产

腹水的制备：常规是先腹腔注射0.5ml Pristane降植烷或液体石蜡于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到5～10mg/ml。

（六）单克隆抗体的鉴定

对制备的单克隆抗体（McAb）的鉴定：

1.抗体特异性的鉴定：除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应该用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如我们制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应该用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。另外用酶标或荧光素标记的第二抗体确定抗体的Ig类型，用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定。

2.McAb中和活性的鉴定：用动物或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。

3.McAb亲合力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲合力。

实施例3亚细胞定位

采用实施例1制备的基因C9ORF135的克隆抗体（兔源），检测人胚胎干细胞（ES）中内源蛋白的表达，通过细胞免疫荧光和Western Blot试验检测人胚胎干细胞（ES）结果，证实C9ORF135新基因编码的是人ES细胞的膜蛋白。其中图1为C9ORF135编码蛋白在人ES细胞的定位，上图为自制抗体染色，下图为阴性对照，从左向右依次为DAPI染色的细胞核、C9ORF135编码蛋白荧光染色、前两者的合成图。

将新基因C9ORF135连上Flag标签，通过HEK293T细胞中过表达，然后用Flag抗体检测过表达的蛋白，图2为共聚焦显微镜结果。其中，从左向右依次为DAPI染的细胞核、带Flag标签的C9ORF135、前两者合成图；提示新基因编码的蛋白在细胞膜和细胞质里表达。

应用细胞各组分蛋白提取试剂盒（Perkin Elmer,Cellular protein fraction kit），分别提取人ES细胞的细胞膜、细胞质、细胞核和细胞骨架各组分蛋白质。提示人ES细胞中该蛋白质主要定位于细胞膜和细胞质中。用beta actin作为对照，用多肽抗体给测人ES细胞总蛋白和各组分蛋白质，结果显示多肽抗体可以特异性地检测内源性新基因的表达，该新蛋白主要在细胞膜和细胞质中表达，图3多肽抗体检测人ES细胞各组分蛋白质的Western Blot结果。

实施例4：胚胎发育

在人胚胎发育过程中，C9ORF135基因表达芯片分析，结果提示，人ES细胞C9ORF135表达相对较高，形成类胚体（embryoid body）后，其表达水平迅速下降，至形成心肌细胞，表达水平非常低或不表达。表达谱分析的方法：在www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/下载人ES细胞及各发育阶段的基因芯片数据，用内参对各芯片的信号值进行标准化，方法为MAS5.0（Affymetrix公司提供）。

分析中采用了人ES细胞向心肌细胞发育的基因芯片数据，如图4所示，结果从两方面显示，一是C9ORF135基因在心肌各发育阶段的相对表达量，取log10的对数值（图4中的柱状图），二是该基因表达值在所有的信号值中所占的位次，100%为最高，0为最低（图4中的方点）。作图的方法以GEO自带的工具实现。

实施例5：精子发育的基因表达芯片分析

C9ORF135除了在人ES细胞表达水平较高外，在人睾丸组织、精子发育表达水平也很高，从精子发育的基因表达芯片分析结果显示，在精子发育的多个阶段，该基因均有较高的表达。与其他组织相比，在睾丸生精小管、精子细胞、睾丸间质细胞、leydig细胞的表达均较高，如图5所示。

通过正常精子和畸形精子的基因表达芯片结果分析（如图6所示）可知，比较形态正常的精子（normal）与畸形精子（teratozoospermia）C9ORF135的基因表达，正常组C9ORF135的表达水平显著地高于畸形精子组。

实施例6

从北医三院收集正常人和畸形精子病人的精子标本，按试剂盒操作提取精子，提取精子的RNA的试剂盒为Qiagen RNeasy Mini Kit(货号：74104)，完全按照试剂盒的方法操作（http://www.qiagen.com/products/rnastabilizationpurification/rneasysystem/rneasymini.aspx）。

1.用Qiagen试剂盒提取精子的RNA，逆转录为cDNA，逆转录的步骤为：

逆转录酶：Invitrogen superscripⅡ

cDNA第一链的合成（反转录）

反应总体积为20μl。

2.用SYBR定量PCR检测正常精子和畸形精子组的C9ORF135的表达情况：

其中，C9ORF135基因前引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，后引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；以鱼精蛋白1作为内参，鱼精蛋白1的前引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，后引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

SYBR定量PCR：反应体系15μl，缓冲液和SYBR为大连宝生物工程公司生产。退火温度57℃，40个循环。

结果见图7，正常精子组(normal)C9ORF135的相对表达量显著高于畸形精子组(TZ)。

实施例7C9ORF135与畸形精子分子诊断

C9ORF135的亚细胞定位于细胞膜，是一种膜蛋白，该蛋白可能与精子发育和成熟精子的完整性相关，可以作为潜在的畸形精子分子诊断和治疗的靶标；从分子诊断方面来看，显示正常精子组的C9ORF135表达水平均高于畸形精子组，但相差幅度不一，从3倍～47倍不等，均数为21倍，从检测的18例中，如图7所示，有16例C9ORF135的表达相差5倍以上，占88.9%，两者相差比较大，可以作为潜在的分子诊断的指标。

通过对正常和病例各100例的C9ORF135的基因水平和蛋白水平进行检测后，用统计学95%可信区间的方法初步设定一个正常值范围，从而在分子水平上实现精子畸形的初步诊断。

用定量PCR仪检测，当待测组的基因C9ORF135水平低于正常参比组基因C9ORF135水平1/3时，判定为精子畸形；

采用ELISA免疫检测法检测C9ORF135编码的蛋白时，当待测组的基因C9ORF135编码的蛋白质水平低于正常参比组基因C9ORF135水平的一半时，判定为精子畸形。

Claims

1.一种用于诊断或检测精子畸形的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为定量PCR的试剂盒，含有：提取精子RNA的试剂盒、正常参比组的RNA、逆转录试剂、C9ORF135基因的引物、内参的引物，SYBR荧光试剂盒，所述内参采用鱼精蛋白1。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的C9ORF135基因前引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，C9ORF135基因后引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；鱼精蛋白1前引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，鱼精蛋白1后引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

3.一种用于诊断或检测精子畸形的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用免疫检测法，含有：提取精子蛋白质的试剂盒、C9ORF135抗体包被的孔板、C9ORF135的单克隆或多克隆抗体、作为浓度参比标准的C9ORF135纯化蛋白、第二抗体、ELISA显色试剂，用于检测的酶标仪，其中，C9ORF135抗体为单抗或多抗。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中的C9ORF135的单克隆或多克隆抗体为兔源，所述的第二抗体选自辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法为：将C9ORF135抗体包被的96孔板，加入提取的精子蛋白质，再加入C9ORF135抗体混合，温育，洗去非特异性吸附的蛋白，加入二抗和显色剂；用原核表达的C9ORF135蛋白作为参考的标准品，按浓度从高到低倍比稀释，绘制标准曲线；通过测定待测精子蛋白质的吸光度，计算其含量；其中，C9ORF135抗体为单抗或多抗。

6.基因C9ORF135所编码蛋白的抗体在检测胚胎干细胞分化中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的检测方法包括定量PCR检测法、ELISA免疫检测法。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，当采用定量PCR检测法时，当待测组的基因C9ORF135的水平不低于胚胎干细胞组50%时，判定为未分化；当采用免疫检测法时，当待测组的基因C9ORF135编码的蛋白质的水平不低于胚胎干细胞组50%时，判定为未分化。

9.一种用于检测胚胎干细胞分化的试剂盒，所述试剂盒含有：RNA提取试剂盒、正常参比组的RNA、逆转录试剂、C9ORF135基因的引物、内参的引物、SYBR荧光试剂盒，所述内参采用GAPDH。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的C9ORF135基因前引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，C9ORF135基因后引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；内参GAPDH前引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，后引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示。

11.一种用于检测胚胎干细胞分化的试剂盒，所述试剂盒含有：蛋白质提取试剂盒、C9ORF135抗体包被的96孔板、C9ORF135的单克隆或多克隆抗体、作为浓度参比标准的C9ORF135纯化蛋白、第二抗体、ELISA显色试剂，用于检测的酶标仪，其中，C9ORF135抗体为单抗或多抗。