用于获得抗原特异性B细胞的克隆群体的培养方法
本申请要求于2006年5月19日提交的美国临时专利申请系列号60/801,412的权益。
发明领域
本发明涉及获得抗原特异性细胞的克隆群体的培养方法。
发明背景
培养和鉴定产生对所需抗原有特异性的抗体的B细胞的方法在本领域是众所周知的。这种B细胞用于回收抗原特异性抗体以及回收编码这种抗体的核酸序列。这种B细胞还可用于抗原特异性功能测定。
抗体通过免疫系统用于鉴定外源性抗原如毒素、细菌和病毒。每种抗体结合于抗原的特异性表位。抗体识别特异性表位且与之结合的能力使抗体成为有用的治疗和诊断工具。除它们的免疫作用之外,实际上抗体可被产生以识别任何物质,包括其他蛋白质,如生长因子、激素和酶。
产生单克隆抗体的方法包括体细胞杂交(somatic cellhybridization)-借此动物用抗原进行免疫以诱导免疫反应,该动物的B细胞被收获且与无限增殖细胞系融合以形成杂交瘤,并且所述杂交瘤经筛选以鉴定具有抗原特异性的克隆。但是抗原特异性B细胞的低频率使分离抗原特异性克隆变得困难。当寻找还显示具体的表位特异性或功能活性的抗原特异性B细胞时,希望的候选物的频率进一步减少。
此外,可通过从产生对所需抗原有特异性的单克隆抗体的B细胞克隆编码抗体的核酸序列以及在适合的重组表达系统如哺乳动物细胞或细菌表达系统中表达由此得到的这些核酸序列或修饰的序列,产生单克隆抗体。这种方法优于杂交瘤技术,因为它们允许产生无限供应的具有所需抗原特异性的单克隆抗体,同时也允许这种抗体序列例如通过人源化或嵌合来进行修饰。
本发明提供了用于分离抗原特异性细胞的克隆群体的培养方法。B细胞的克隆群体潜在地可用于B细胞功能测定以及用于回收抗原特异性单克隆抗体和回收编码这种抗体的核酸序列。
附图简述
图1显示了通过收集由抗体选择方案制备的抗IL-6抗体来识别多种独特表位。表位变异性(Epitope variability)通过抗体-IL-6结合竞争性研究(ForteBio octet)来证实。
图2显示了通过收集由抗体选择方案制备的抗TNF-α抗体来识别多种独特表位。表位变异性通过抗体-TNF-α结合竞争性研究(ForteBio octet)来证实。
图3描述了抗TNF-α抗体的结合亲和力。
图4描述了抗TNF-α抗体的细胞毒性比较。
图5描述了抗Aβ抗体的表位选择性。
图6证实了产生的IgG和示例性IL-6方案的抗原特异性之间的高度相关性。11孔中的9孔显示了与抗原识别相关的特异性IgG。
图7证实了产生的IgG和示例性huTNF-α方案的抗原特异性之间的高度相关性。20孔中的18孔显示了与抗原识别相关的特异性IgG。
发明详述
在一个实施方案中,本发明提供了分离抗原特异性B细胞的克隆群体的方法,所述B细胞可用于分离至少一种抗原特异性细胞。如下文所述和示例,这些方法包括能分开、组合、连续、重复或周期地使用的一系列培养和选择步骤。优选地,这些方法用于分离至少一种抗原特异性细胞,所述抗原特异性细胞能用于产生对所需抗原有特异性的单克隆抗体或相应于这种抗体的核酸序列。
在一个实施方案中,本发明提供了包括以下步骤的方法:
a.制备包含至少一种抗原特异性B细胞的细胞群体;
b.例如通过色谱法富集细胞群体以形成包含至少一种抗原特异性B细胞的富集细胞群体;
c.从富集B细胞群体中分离单个B细胞;且
d.测定单个B细胞是否产生对抗原有特异性的抗体。
在另一个实施方案中,本发明提供了分离单个产生抗体的B细胞的方法的改良,所述改良包括富集从已被免疫或与抗原天然接触的宿主中获得的B细胞群体,其中所述富集步骤在任何选择步骤之前,包括至少一个培养步骤,且形成产生对所述抗原有特异性的单个单克隆抗体的B细胞克隆群体。
遍及本申请,″B细胞克隆群体″是指仅分泌对所需抗原有特异性的单个抗体的B细胞群体。这就是说,这些细胞仅产生一种类型的对所需抗原有特异性的单克隆抗体。
在本申请中,″富集″细胞群体的细胞是指增加包含在混合的细胞群体(例如从免疫对抗所需抗原的宿主中得到的包含B细胞的分离物)中的所需细胞、通常是抗原特异性细胞的频率。因此,富集细胞群体包括因富集步骤而具有更高频率的抗原特异性细胞的细胞群体,但是这种细胞的群体可包含且产生不同的抗体。
一般术语″细胞群体″包括富集前和富集后细胞群体,应牢记当进行多个富集步骤时,细胞群体可以是富集前和富集后的。例如,在一个实施方案中,本申请提供了以下方法:
a.从免疫的宿主中收获细胞群体以获得收获的细胞群体;
b.从所述收获的细胞群体中生成至少一种单细胞悬浮液;
c.富集至少一种单细胞悬浮液以形成第一富集细胞群体;
d.富集第一富集细胞群体以形成第二富集细胞群体;
e.富集第二富集细胞群体以形成第三富集细胞群体;和
f.选择由第三富集细胞群体的抗原特异性细胞产生的抗体。
每种细胞群体可直接用于下一步骤,或它可部分或全部冷冻用于长期或短期贮藏或用于随后的步骤。同时,细胞群体的细胞可单独进行悬浮以得到单细胞悬浮液。所述单细胞悬浮液可被富集以使单细胞悬浮液用作富集前细胞群体。然后,一种或多种抗原特异性单细胞悬浮液一起形成富集细胞群体;抗原特异性单细胞悬浮液可一起集合,例如再铺板(re-plated)用于进一步分析和/或抗体产生。
在一个实施方案中,本发明提供了富集细胞群体以得到富集细胞群体的方法,所述富集细胞群体具有约50%至约100%或在其中间增量的抗原特异性细胞频率。优选地,富集细胞群体具有大于或等于约50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、99%或100%的抗原特异性细胞频率。
在另一个实施方案中,本发明提供了富集细胞群体的方法,由此所述抗原特异性细胞的频率增加至至少约2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或在其中间的增量。
遍及本申请,术语″增量(increment)″用于使不同精确度的数值限定至例如最接近的10、1、0.1、0.01等。所述增量可四舍五入(round)至任何可测量的精确度,且所述增量不需要四舍五入至范围两端的相同的精确度。例如,1至100的范围或在其中间的增量包括如20至80、5至50和0.4至98的范围。当范围为末端开放式(open-ended)、例如少于100的范围时,在其中间的增量是指在100与可测量的极限值之间的增量。例如,少于100或在其中间的增量是指0至100或在其中间的增量,除非该特征如温度不受0的限制。
可以测量关于任何抗原的抗原特异性。所述抗原可以是抗体可结合的任何物质,包括但不限于肽、蛋白质或其片段;碳水化合物;有机和无机分子;由动物细胞、细菌细胞和病毒产生的受体;酶;生物途径的激动剂和拮抗剂;激素;和细胞因子。示例性抗原包括但不限于IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、IFN-α、IFN-γ、BAFF、CXCL13、IP-10、VEGF、EPO、EGF、HRG和Aβ。优选的抗原包括IL-6、IL-13、TNF-α和VEGF-α。在利用多于一个富集步骤的方法中,在每个富集步骤中使用的抗原可以是彼此相同或不同的。具有相同抗原的多个富集步骤可产生大的和/或不同的抗原特异性细胞群体;具有不同抗原的多个富集步骤可产生对不同抗原有交叉特异性的富集细胞群体。
富集细胞群体可通过本领域已知的用于分离抗原特异性细胞的任何细胞选择方法来进行。例如,细胞群体可通过色谱技术,例如Miltenyi珠或磁珠技术来富集。所述珠可以直接或间接连接至目的抗原。在一个优选的实施方案中,富集细胞群体的方法包括至少一个色谱富集步骤。
细胞群体也可通过进行本领域已知的任何抗原特异性测定技术,例如ELISA测定法或光晕测定法(hlao assay)来富集。ELISA测定法包括但不限于选择性抗原固定(例如通过链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、或中性抗生物素蛋白(neutravidin)包被的板进行的生物素化抗原捕获)、非特异性抗原板包被和通过抗原构建(build-up)策略(例如选择性抗原捕获,随后添加结合伴侣以产生异聚的蛋白-抗原复合物)。光晕测定法包括使细胞与装载抗原的珠和对用于收获B细胞的宿主有特异性的标记的抗宿主抗体接触。所述标记可以是例如荧光团。在一个实施方案中,在至少一种单细胞悬浮液上进行至少一个测定富集步骤。在另一个实施方案中,富集细胞群体的方法包括至少一个色谱富集步骤和至少一个测定富集步骤。
通过大小或密度″富集″细胞群体的方法在本领域是已知的。参见,例如U.S.专利5,627,052。除通过抗原特异性富集细胞群体之外,这些步骤可用于本方法。
本发明的细胞群体包含至少一种能识别抗原的细胞。识别抗原的细胞包括但不限于B细胞、浆细胞和其后代(progeny)。在一个实施方案中,本发明提供了包含单个类型的抗原特异性B细胞的克隆细胞群体,即所述细胞群体产生对所需抗原有特异性的单个单克隆抗体。
在这种实施方案中,认为B细胞的克隆抗原特异性群体主要由抗原特异性、抗体分泌细胞组成,所述抗体分泌细胞通过本文提供的新型培养和选择方案获得。因此,本发明也提供了获得包含至少一种抗原特异性、抗体分泌细胞的富集细胞群体的方法。在一个实施方案中,本发明提供了包含约50%至约100%或在其中间的增量、或大于或等于约60%、70%、80%、90%或100%的抗原特异性、抗体分泌细胞的富集细胞群体。
在一个实施方案中,本发明提供了在任何选择步骤(例如从细胞群体选择特定的B细胞和/或选择由特定细胞产生的抗体)之前通过富集从宿主获得的细胞群体来分离单个B细胞的方法。所述富集步骤可以以一个、两个、三个或更多个步骤来进行。在一个实施方案中,在证实单个B细胞是否分泌具有抗原特异性和/或所需特性的抗体之前,从富集细胞群体分离单个B细胞。
在一个实施方案中,富集细胞群体的方法在用于抗体产生和/或选择的方法中使用。因此,本发明提供了包括在选择抗体之前富集细胞群体的方法。所述方法可包括以下步骤:制备包含至少一种抗原特异性细胞的细胞群体;通过分离至少一种抗原特异性细胞来富集细胞群体以形成富集细胞群体;和诱导至少一种抗原特异性细胞产生抗体。在优选的实施方案中,所述富集细胞群体包含一种以上的抗原特异性细胞。在一个实施方案中,富集群体的每种抗原特异性细胞在由此分离抗体产生细胞和/或使用所述B细胞产生抗体或相应于这种抗体的核酸序列之前,在产生克隆抗原特异性B细胞群体的条件下进行培养。与其中抗体从具有低频率的抗原特异性细胞的细胞群体中产生的现有技术相比,本发明允许在高频率的抗原特异性细胞中选择抗体。因为在抗体选择之前使用富集步骤,所以用于抗体产生的大多数细胞,优选实质上所有的细胞是抗原特异性的。通过从具有增加的抗原特异性频率的细胞群体中产生抗体,来增加抗体的数量和种类。
在本发明的抗体选择方法中,优选在形成抗原特异性B细胞的克隆群体的富集步骤和培养步骤之后选择抗体。本方法可进一步包括对从一个或多个分离的抗原特异性细胞选择的抗体或其部分进行测序的步骤。可使用本领域已知的用于测序的任何方法,且可包括对重链、轻链、可变区和/或互补决定区(CDR)进行测序。
除富集步骤之外,用于抗体选择的方法还可包括一个或多个就抗体功能性筛选细胞群体的步骤。例如,所需抗体可具有特异的结构特征,如与特定的表位结合或模拟特定的结构;拮抗剂或激动剂活性;或中和活性,例如抑制抗原和配体之间的结合。在一个实施方案中,所述抗体功能性筛选是配体依赖性的。针对抗体功能性的筛选包括但不限于恢复(recreate)抗原配体与重组受体蛋白质的天然相互作用的体外蛋白-蛋白相互作用测定;和配体依赖性且易于监控的基于细胞的反应(例如增殖反应)。在一个实施方案中,用于抗体选择的方法包括通过测量抑制浓度(IC50)就抗体功能性筛选细胞群体的步骤。在一个实施方案中,至少一种分离的抗原特异性细胞产生IC50小于约100、50、30、25、10μg/mL或在其中间的增量的抗体。
除富集步骤之外,用于抗体选择的方法还可包括一个或多个就抗体结合强度筛选细胞群体的步骤。抗体结合强度可通过本领域已知的任何方法(例如Biacore)来测量。在一个实施方案中,至少一种分离的抗原特异性细胞产生具有高抗原亲和力,例如解离常数(K
d)小于约5×10
-10M
-1、优选约1×10
-13至5×10
-10、1×10
-12至1×10
-10、1×10
-12至7.5×10
-11、1×10
-11至2×10
-11、约1.5×10
-11或更小或在其中间的增量的抗体。在这个实施方案中,所述抗体被称为是亲和力成熟(affinity mature)的。在一个优选的实施方案中,所述抗体的亲和力相当于或高于Panorex
(依决洛单抗(edrecolomab))、Rituxan
(利妥昔单抗(rituximab))、Herceptin
(traztuzumab)、Mylotarg
(gentuzumab)、Campath
(阿仑珠单抗(alemtuzumab))、Zevalin
TM(ibritumomab)、Erbitux
TM(西妥昔单抗(cetuximab))、Avastin
TM(贝伐单抗(bevicizumab))、Raptiva
TM(依法珠单抗(efalizumab))、Remicade
(英夫利昔单抗(infliximab))、Humira
TM(阿达木单抗(adalimumab))和Xolair
TM(奥马珠单抗(omalizumab))中任何一个的亲和力。优选地,抗体的亲和力相当于或高于Humira
TM的亲和力。抗体的亲和力还可通过已知的亲和力成熟技术来增加。在一个优选的实施方案中,就抗体功能性和抗体结合强度筛选至少一种细胞群体。
除富集步骤之外,用于抗体选择的方法还可包括一个或多个就抗体序列同源性、特别是人同源性筛选细胞群体的步骤。在另一个实施方案中,至少一种分离的抗原特异性细胞产生与人抗体具有约50%至约100%、或在其中间的增量的同源性、或大于约60%、70%、80%、85%、90%或95%同源性的抗体。所述抗体可通过本领域已知技术(如CDR移植或选择性决定残基移植(SDR))进行人源化以增加与人序列的同源性。
在另一个实施方案中,本发明还提供了在IC50、Kd和/或同源性方面根据上述任何实施方案的抗体本身。
与其他用于获得抗体分泌B细胞和对所需靶抗原有特异性的单克隆抗体的方法比较,本文公开的发明性B细胞选择方案有很多内在的优势。这些优势包括但不限于下列:
首先,已发现当用所需抗原如IL-6或TNF-α利用这些选择程序时,所述方法可重现地形成抗原特异性B细胞,所述抗原特异性B细胞能产生似乎是非常广泛的抗体的补体,即结合于抗原的各种不同表位的抗体。不受理论束缚,假设广泛的补体可归因于在初始的B细胞回收之前进行的抗原富集步骤。而且,由于这些性质可随具体抗体的表位特异性而变化,这种优势允许分离和选择具有不同性质的抗体。
第二,已发现本发明B细胞选择方案可重现地产生包含单个B细胞或其子代的克隆B细胞培养物,其分泌通常以相对高结合亲和力,即皮摩尔或更好的结合亲和力结合所需抗原的单个单克隆抗体。相比之下,现有的抗体选择方法倾向于产生相对很少高亲和力抗体,且由此需要大量的筛选程序以分离具有治疗潜力的抗体。不受理论束缚,假设本发明方案导致宿主的体内B细胞免疫(初次免疫)、随后第二体外B细胞免疫(二次抗原提呈步骤),这可增强回收的克隆B细胞分泌对抗原靶有特异性的单个高亲和力单克隆抗体的能力和倾向。
第三,已观察到(如本文IL-6特异性B细胞所示)本发明B细胞选择方案可重现地得到产生对所需靶平均具有高选择性(抗原特异性)的IgG的富集B细胞。部分基于此,认为通过本发明方法回收的抗原富集的B细胞包含能产生如上所述的表位特异性的所需全部补体的B细胞。
第四,已观察到甚至当与小型抗原,即100个氨基酸或更少、例如10-50个氨基酸长的肽一起使用时,本发明B细胞选择方案可重现地引起分泌小型抗原如肽的单个高亲和力抗体的克隆B细胞培养物。这是很令人惊奇的,因为这通常是很难的、劳动密集的并且有时甚至不能产生小型肽的高亲和力抗体。因此,本发明可用于产生所需肽靶如病毒、细菌或自身抗原肽的治疗性抗体,从而允许产生具有非常不同的结合特性的单克隆抗体或甚至产生不同肽靶如不同病毒株的单克隆抗体的混合物。这种优势可特别用于产生具有所需效价的治疗性或预防性疫苗,如诱导对不同HPV菌株的保护性免疫的HPV疫苗的情况。
第五,特别当与来源于兔的B细胞一起使用时,本发明B细胞选择方案倾向于可重现地产生抗原特异性抗体序列,所述抗体序列与内源性人免疫球蛋白非常类似(在氨基酸水平上大约90%类似)并且包含具有非常类似于人免疫球蛋白的长度的CDR,因而几乎不需要或不需要序列修饰(通常最多仅少量CDR残基可在母抗体序列中进行修饰且没有引入框架外源性残基)以消除潜在的免疫原性顾虑。因此,根据本发明B细胞和抗体选择方案产生的回收抗体序列的高抗原结合亲和力甚至经人源化保持完整或基本上完整。
总之,本发明方法可通过使用比先前已知的更有效率的方案用于产生对更多不同表位显示更高结合亲和力的抗体。
在特定的实施方案中,本发明提供了通过包括下列步骤的方法鉴定分泌对所需抗原有特异性的抗体且任选具有至少一种所需功能特性如亲和力、亲和性(avidity)、细胞溶解活性等的单个B细胞的方法:
a.用抗原免疫宿主;
b.从宿主收获B细胞;
c.富集收获的B细胞以增加抗原特异性细胞的频率;
d.生成至少一种单细胞悬浮液;
e.在有利于每培养孔单个抗原特异性B细胞的存活的条件下从所述单细胞悬浮液培养亚群体;
f.从所述亚群体中分离少于12个B细胞;和
g.测定单个B细胞是否产生对所述抗原有特异性的抗体。
通常地,本发明方法进一步包括额外的步骤:全部或部分分离和测序多肽和编码所需抗体的核酸序列。这些序列或其修饰形式或部分可在所需宿主细胞中表达以产生所需抗原的重组抗体。
如先前描述,认为B细胞的克隆群体主要包含产生对抗所需抗原的抗体的抗体分泌B细胞。也认为基于用数种抗原和用不同B细胞群体获得的试验结果,根据本发明产生的克隆产生的B细胞和由此得到的分离的抗原特异性B细胞分泌通常有相对高亲和力并且还能有效地、可重现地产生更大表位变异性的单克隆抗体的选择(与从培养的抗原特异性B细胞得到单克隆抗体的其他方法相比较)的单克隆抗体。在示例性的实施方案中,用于这种B细胞选择方法的免疫细胞群体来源于兔。然而,产生抗体的其他宿主(包括非人和人宿主)可选择地可用作免疫B细胞的来源。认为,兔作为B细胞来源的用途可增强通过本发明方法得到的单克隆抗体的多样性。同样,根据本发明从兔得到的抗体序列通常拥有与人抗体序列具有高度序列同一性的序列,因其具有很小的抗原性而使得它们有利于在人中使用。在人源化的过程中,最终人源化抗体包含低得多的外源性/宿主残基含量,通常限于宿主CDR残基的亚群,所述亚群与用于移植的人靶序列相比由于它们的性质而显著不同。这增强了人源化抗体蛋白中完全活性恢复的可能性。
使用本文公开的富集步骤的抗体选择的方法包括从免疫的宿主中获得包含免疫细胞的细胞群体的步骤。从免疫的宿主中获得包含免疫细胞的细胞群体的方法在本领域是已知的,并且通常包括诱导宿主中的免疫反应和从宿主中收获细胞以获得一个或多个细胞群体。所述反应可通过使宿主免疫对抗所需抗原而诱发。可选择地,用作这种免疫细胞来源的宿主可与所需抗原,如已被特定病原体如细菌或病毒感染的个体天然接触,或可选择地已建立(mount)对个体患有的癌症的特异性抗体反应。
宿主动物在本领域是众所周知的,且包括但不限于人、兔、小鼠、大鼠、鸡、奶牛、猪、豚鼠、山羊和绵羊。当与抗原接触时,作为对所述抗原的天然免疫反应的部分,所述宿主产生抗体。如所述,所述免疫反应可由于疾病自然发生,或它可通过用所述抗原免疫来诱导。免疫可通过本领域任何已知的方法例如在有或没有增强免疫反应的试剂,如完全或不完全弗式佐剂(Freund’s adjuvant)的情况下通过抗原的一次或多次注射来进行。作为体内免疫宿主动物的另一选择,所述方法可包括体外免疫宿主细胞培养物。
在允许用于免疫反应(例如通过血清抗体检测来测量)的时间之后,收获宿主动物细胞以获得一个或多个细胞群体。在一个优选的实施方案中,就抗体结合强度和/或抗体功能性来筛选收获的细胞群体。收获的细胞群体优选来自脾、淋巴结、骨髓和/或外周血单核细胞(PBMC)中至少一种。所述细胞可从一种以上的来源收获且进行混合。某些来源可优选用于某些抗原。例如,脾、淋巴结和PBMC优选用于IL-6;淋巴结优选用于TNF;且脾和淋巴结优选用于Aβ。在免疫后约20至约90天或在其中间的增量、优选约50至约60天,收获细胞群体。收获的细胞群体和/或由此形成的单细胞悬浮液可进行富集、筛选和/或培养用于抗体选择。在收获的细胞群体之内抗原特异性细胞的频率通常为约1%至约5%或在其中间的增量。
在一个实施方案中,优选通过使用Miltenyi珠从收获的细胞群体富集单细胞悬浮液。由此,从抗原特异性细胞频率为约1%至约5%的收获的细胞群体得到了抗原特异性细胞频率接近100%的富集细胞群体。
使用富集步骤的抗体选择的方法包括从富集细胞群体的至少一种抗原特异性细胞中产生抗体的步骤。体外产生抗体的方法在本领域是公知的,且可使用任何合适的方法。在一个实施方案中,富集细胞群体如来自收获的细胞群体的抗原特异性单细胞悬浮液以不同的细胞密度,如每孔50、100、250、500个或在1至1000个细胞之间的其他增量铺板。优选地,亚群体包含不超过约10,000个抗原特异性、抗体分泌细胞,更优选约50-10,000、约50-5,000、约50-1,000、约50-500、约50-250个抗原特异性、抗体分泌细胞或在其中间的增量。然后,优选在有利于每培养孔单个增殖的抗体分泌细胞存活的条件下,用适合的培养基在饲养层上培养这些亚群体。通常由受辐射的细胞物质组成的饲养层不构成细胞群体的部分。这些细胞在适合的培养基中培养足以用于抗体产生的时间,例如约1天至约2周、约1天至约10天、至少约3天、约3至约5天、约5天至约7天或在其中间的其他增量。优选地,单个抗体产生细胞和其子代在每孔中存活,因而在每孔中提供抗原特异性B细胞的克隆群体。在该阶段,由克隆群体产生的免疫球蛋白G(IgG)与抗原特异性高度相关。在一个优选的实施方案中,所述IgG显示与抗原特异性的相关性大于约50%、更优选大于70%、85%、90%、95%、99%或在其中的增量。参见图6与图7,其分别证实针对IL-6和huTNF-α的示例相关性。所述相关性通过在限制条件下形成B细胞培养物以建立每孔单抗原特异性抗体产物来进行证实。比较了抗原特异性和普通IgG合成。观察到三个群体:识别抗原单甲酸盐(生物素化和直接包被)的IgG、可检测的IgG和与固定化无关的抗原识别、和仅IgG产生。IgG产生与抗原特异性高度相关。
任选收集包含抗体的上清液,所述上清液可根据上述的步骤进行富集、筛选和/或培养用于抗体选择。在一个实施方案中,富集(优选通过抗原特异性测定,尤其是ELISA测定)和/或就抗体功能性筛选所述上清液。
在另一个实施方案中,富集的、优选克隆的抗原特异性B细胞群体(从所述细胞群体中任选筛选上述的上清液以检测所需分泌的单克隆抗体的存在)用于分离少量B细胞,优选单个B细胞,所述B细胞然后在适当的测定中进行检测以证实克隆B细胞群体的单个抗体产生B细胞的存在。在一个实施方案中,从克隆B细胞群体中分离约1至约20个细胞,优选少于约15、12、10、5或3个细胞或在其中间的增量,最优选单个细胞。筛选优选通过抗原特异性测定,尤其是光晕测定来实现。所述光晕测定可用全长蛋白或其片段来进行。包含抗体的上清液还可就以下至少一种进行筛选:抗原结合亲和力;抗原-配体结合的激动或拮抗作用、诱导或抑制特定靶细胞类型的增殖;诱导或抑制靶细胞的溶解以及诱导或抑制包含所述抗原的生物途径。
该经鉴定的抗原特异性细胞可用于得到编码所需单克隆抗体的相应核酸序列。(AluI消化可证实每孔仅产生单个单克隆抗体类型)。如上所述,这些序列可例如通过人源化进行突变以使它们适于在人药物中使用。
如所述,根据可以以不同次序重复或进行的上述步骤,用于本发明过程的富集B细胞群体也可进一步进行富集、筛选和/或培养用于抗体选择。在一个优选的实施方案中,富集的、优选克隆的抗原特异性细胞群体的至少一种细胞分离、培养并且用于抗体选择。
因此,在一个实施方案中,本发明提供了包括以下步骤的方法:
a.从免疫的宿主中收获细胞群体以获得收获的细胞群体;
b.从收获的细胞群体中生成至少一种单细胞悬浮液;
c.优选通过色谱法富集至少一种单细胞悬浮液以形成第一富集细胞群体;
d.优选通过ELISA测定富集第一富集细胞群体以形成第二富集细胞群体,所述第二富集细胞群体优选是克隆的,即它仅包含单类型的抗原特异性B细胞;
e.优选通过光晕测定富集第二富集细胞群体以形成包含单个或少量产生对所需抗原有特异性的抗体的B细胞的第三富集细胞群体;和
f.选择由从第三富集细胞群体分离的抗原特异性细胞产生的抗体。
本方法可进一步包括一个或多个就抗体结合强度(亲和力、亲和性)和/或抗体功能性筛选收获的细胞群体的步骤。适合的筛选步骤包括但不限于检测下列的测定方法:是否由经鉴定的抗原特异性B细胞产生的抗体产生具有最小抗原结合亲和力的抗体;是否所述抗体激动或拮抗所需抗原与配体的结合;是否所述抗体诱导或抑制了特定细胞类型的增殖;是否所述抗体诱导或诱发了对抗靶细胞的细胞溶解反应;是否所述抗体与特异性表位结合;以及是否所述抗体调节(抑制或激动)特异性生物途径或包括该抗原的途径。
类似地,本方法可包括一个或多个就抗体结合强度和/或抗体功能性筛选第二富集细胞群体的步骤。
本方法可进一步包括对多肽序列或所选抗体的相应核酸序列测序的步骤。本方法还可包括使用所选抗体的序列、其片段或基因修饰形式产生重组抗体的步骤。使抗体序列突变以保留所需性质的方法对本领域技术人员是众所周知的,其包括人源化、嵌合、产生单链抗体;这些突变方法可产生具有所需效应子功能、免疫原性、稳定性、糖基化的去除或添加等的重组抗体。所述重组抗体可通过任何适合的重组细胞产生,所述细胞包括但不限于哺乳动物细胞如CHO、COS、BHK、HEK-293、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和两栖动物细胞。在一个实施方案中,所述抗体在多倍体酵母细胞,即二倍体酵母细胞,特别是毕赤酵母属(Pichia)中表达。
在一个实施方案中,本方法包括:
a.用抗原免疫宿主以产生宿主抗体;
b.就抗原特异性和中和作用筛选宿主抗体;
c.从宿主收获B细胞;
d.富集收获的B细胞以生成具有增加的抗原特异性细胞频率的富集细胞群体;
e.在有利于单个B细胞存活的条件下从所述富集细胞群体培养一个或多个亚群体以在至少一个培养孔中产生克隆群体;
f.确定所述克隆群体是否产生对所述抗原有特异性的抗体;
g.分离单个B细胞;和
h.对由单个B细胞产生的抗体的核酸序列测序。
为进一步明确说明上述的本发明,我们提供了下列非限制性实施例。
实施例
实施例1:产生富集的抗原特异性B细胞抗体培养物
通过免疫常规的抗体宿主动物以产生对目的靶抗原的天然免疫反应而得到多组抗体。通常地,用于免疫的宿主是兔或其他宿主,所述宿主使用类似的成熟过程产生抗体且提供产生相当的多样性(如表位多样性)的抗体的抗原特异性B细胞群体。初次抗原免疫可使用完全弗式佐剂(CFA)来进行,且用不完全佐剂实现后续加强。在免疫后约50-60天、优选在第55天,测试抗体滴度,并且如果建立了适当的滴度,那么开始抗体选择(ABS)过程。开始ABS的两个关键标准是有效抗原识别和多克隆血清中的功能修饰活性。
在建立阳性抗体滴度的时候,处死动物且分离B细胞来源。这些来源包括:脾、淋巴结、骨髓和外周血单核细胞(PBMC)。产生单细胞悬浮液,且洗涤所述细胞悬浮液以使它们适于低温长期贮存。然后通常将细胞冷冻。
为开始抗体鉴定过程,将小部分的冷冻细胞悬浮液解冻、洗涤、且放置于组织培养基中。然后将这些悬浮液与用于产生动物免疫反应的抗原的生物素化形式混合,且使用Miltenyi磁珠细胞选择方法学回收抗原特异性细胞。使用链霉抗生物素蛋白珠进行特异性富集。回收富集的群体且进入下一阶段的特异性B细胞分离。
实施例2:产生包含克隆的、抗原特异性B细胞的培养物
然后将根据实施例1产生的富集的B细胞以每孔不同的细胞密度铺板在96孔微量滴定板中。通常,每孔有50、100、250或500个细胞,每组10个板。所述培养基补充有4%活化的兔T细胞条件培养基和50K冷冻的经辐射的EL4B饲养细胞。这些培养物静置5-7天,在此时间收集包含分泌的抗体的上清液且就靶特性在分离测定装置中对其进行评价。剩余上清液保持不变,并且将所述板在-70℃下冷冻。在这些条件下,培养过程通常形成包含含有抗原特异性B细胞克隆群体的混合细胞群体的孔,即单个孔仅包含单个对所需抗原有特异性的单克隆抗体。
实施例3:就单克隆抗体的所需特异性和/或功能特性筛选抗体上
清液
从根据实施例2产生的含有克隆的抗原特异性B细胞群体的孔中得到的包含抗体的上清液最初通过使用ELISA方法就抗原识别来进行筛选。这包括选择性抗原固定化(例如通过链霉抗生物素蛋白包被的板的生物素化抗原捕获)、非特异性抗原板包被,或可选择地,通过抗原构建策略(例如选择性抗原捕获,随后添加结合伴侣以产生异聚的蛋白-抗原复合物)。然后抗原阳性孔上清液任选在严格依赖于配体的功能修饰测定中进行测试。一个这样例子是使抗原配体与重组受体蛋白质的天然相互作用得到恢复的体外蛋白-蛋白相互作用测定。可选择地,利用配体依赖性和易于监控的基于细胞的反应(例如增殖反应)。认为显示显著的抗原识别和效价的上清液是阳性孔。然后将由原始阳性孔得到的细胞转变成抗体恢复期。
实施例4:回收具有所需抗原特异性的单个抗体产生B细胞
从包含分泌单个抗体序列的抗原特异性B细胞的克隆群体(根据实施例2或3产生)的孔中分离少量细胞。然后测定分离的细胞以分离单个抗体分泌细胞。Dynal链霉抗生物素蛋白珠在缓冲的培养基下用生物素化靶抗原进行包被以制备与细胞生存力相容的包含抗原的微珠。接下来将装载抗原的珠、来自阳性孔中的抗体产生细胞以及异硫氰酸荧光素(FITC)-标记的抗宿主H&L IgG抗体(如所示,宿主可以是任何哺乳动物宿主,例如兔、小鼠、大鼠等)在37℃下一起温育。然后此混合物以等份试样再移液至载玻片以使每小份平均具有单个抗体产生B细胞。然后抗原特异性、抗体分泌细胞通过荧光显微镜进行检测。分泌的抗体由于结合抗原局部浓缩至邻近的珠上并且基于强荧光信号提供了定位信息。抗体分泌细胞通过与所述分泌细胞邻近形成的抗体-抗原复合物的FITC检测来进行鉴定。然后使用微操作器来回收在该复合物中心发现的单细胞。所述细胞在eppendorf PCR管中快速冷冻以在-80℃下贮存直至开始抗体序列回收。
实施例5:从抗原特异性B细胞中分离抗体序列
使用基于联合RT-PCR的方法从根据实施例4产生的单个分离的B细胞或从分离自根据实施例2获得的克隆B细胞群体的抗原特异性B细胞回收抗体序列。将引物设计成在靶免疫球蛋白基因(重和轻)(如兔免疫球蛋白序列)的保守和恒定区中退火(anneal),并且两步骤巢式PCR回收步骤用于获得抗体序列。分析每孔的扩增子的回收和大小完整性。然后用AluI消化所得到的片段以对序列克隆性做指纹图谱。相同序列在它们的电泳分析中显示共同的片段化模式。重要的是,证明细胞克隆性的此共同的片段化模式通常甚至在最初涂布高达1000个细胞/孔的孔中观察到。接着原始重链和轻链扩增子片段用HindIII和XhoI或HindIII和BsiwI进行限制酶消化以制备各自用于克隆的DNA碎片。然后将所得到的消化产物连接至表达载体且转化入细菌用于质粒繁殖和产生。就序列特征选择克隆。
实施例6:重组产生具有所需抗原特异性和/或功能特性的单克隆
抗体
建立包含单个单克隆抗体的每孔的正确的全长抗体序列,并且小量制备的DNA使用Qiagen固相方法学来制备。然后该DNA用于转染哺乳动物细胞以产生重组全长抗体。就抗原识别和功能特性测试粗抗体产物以证实原始特征存在于重组抗体蛋白中。在适当情况下,完成大规模瞬时哺乳动物转染,并且抗体通过蛋白质A亲和色谱法来纯化。使用标准方法(例如Biacore)评价Kd,以及在效价测定中评价IC50。
实施例7:制备结合人IL-6的抗体
通过使用本文所述的抗体选择方案,本领域技术人员能产生一组大范围的抗体。所述抗体对IL-6具有高亲和力(个位数至两位数pM的Kd)且证实了IL-6在多种基于细胞的筛选系统(T1165和HepG2)中的有效拮抗作用。此外,抗体的集合显示对IL-6驱使的过程的不同方式的拮抗作用。
免疫策略
用huIL-6(R&R)免疫兔。免疫由以下组成:100μg在完全弗式佐剂(CFA)(Sigma)中的第一次皮下(sc)注射,随后两次加强,相隔两周,每次50μg在不完全弗式佐剂(IFA)(Sigma)中。在第55天对动物放血,且血清滴度通过ELISA(抗原识别)和通过非放射性增殖测定(Promega)使用T1165细胞系来确定。
抗体选择滴度评价
通过在4℃下用1μg/ml在磷酸盐缓冲盐水(PBS,Hyclone)中的huIL-6包被Immulon 4板(Thermo)(50ul/孔)过夜来确定抗原识别。在测定的当天,板用PBS/吐温20(PBST片剂,Calbiochem)洗涤3次。然后在37℃下用200ul/孔的0.5%在PBS中的鱼皮明胶(FSG,Sigma)封闭板30分钟。移除封闭溶液,且将板吸干。以1∶100的起始稀释度(所有稀释液以FSG 50ul/孔制备)、随后1∶10的稀释度横越板(留下第12列空白用于背景对照)制备血清样品(出血和预出血)。板在37℃下温育30分钟。板用PBS/吐温20洗涤3次。将以1∶5000稀释的山羊抗兔FC-HRP(Pierce)加至所有孔(50ul/孔),并且板在37℃下温育30分钟。板如上所述进行洗涤。将50ul/孔TMB-Stablestop(Fitzgerald Industries)加至板,且使颜色显现通常3至5分钟。显影反应用50ul/孔的0.5M HCl终止。在450nm处读板。使用Graph Pad Prizm软件对光密度(OD)对稀释度绘图,并且确定滴度。
功能滴度评价
样品的功能活性通过T1165增殖测定来确定。T1165细胞通常保持在改良的RPMI培养基(Hyclone)中,该培养基补充有Hepes、丙酮酸钠、碳酸氢钠、L-谷氨酰胺、高葡萄糖、青霉素/链霉素、10%热灭活的FBS(所有补充物来自Hyclone)、2-巯基乙醇(Sigma)和10ng/mlhuIL-6(R&D)补充。在测定的当天,细胞生存力通过台盼蓝(Invitrogen)来确定,并且细胞以20,000细胞/孔的固定密度进行接种。在接种之前,细胞在不含人-IL-6的上述培养基中洗涤两次(通过以13000rpm/5分钟离心且弃去上清液)。最后一次洗涤后,将细胞以与50μl/孔等价的体积重悬于用于洗涤的相同培养基中。在室温下静置(seta side)细胞。
在圆底96孔板(Costar)中,血清样品起初以1∶100的稀释度,随后以1∶10的稀释度横越板(第2至10列),以30μl/孔添加,一式5份(B至F行:在不含huIL-6的上述培养基中制备的稀释液)。第11列是用于IL-6对照的仅培养基。30μl/孔huIL-6以最终EC50的4倍浓度(之前确定的浓度)加至所有孔(huIL-6在上述的培养基中稀释)中。孔在37℃下温育1小时以允许抗体结合发生。1小时后,将板图规格(plate map forma t)在圆底板中陈列,随后将50μl/孔抗体-抗原(Ab-Ag)复合物转移至平底96孔板(Costar)中。在G行,将50μl/孔的培养基加至所有孔(第2至11列)用于背景对照。将静置的50μl/孔的细胞悬浮液加至所有孔(第2至11列,B至G行)。在第1和12列以及A和H行上,添加200μl/孔的培养基以防止测试孔的蒸发并且使边缘效应最小化。板在37℃、4%CO2下温育72小时。在72小时时,根据制造商方案将20μl/孔的CellTiter96(Promega)试剂加入至所有测试孔,并且板在37℃下温育2小时。在2小时时,板在定轨振荡器上轻轻混合以分散细胞,且允许在测试孔中的同质性。在490nm波长处读板。使用Graph Pad Prizm软件对光密度(OD)对稀释度作图,并且确定功能滴度。阳性测定对照板以1μg/ml的起始浓度(最终浓度)随后以1∶3的稀释度横越板使用MAB2061(R&D Systems)如上所述进行。
组织收获:
一旦建立可接受的滴度,处死兔。收获脾、淋巴结和全血(R&R),并且如下进行处理:
通过解离组织并且用20cc注射器的柱塞使其挤压通过70μm的无菌金属筛(Fisher),将脾和淋巴结处理成单细胞悬浮液。在不含huIL-6但有低葡萄糖的上述改良的RPMI培养基中收集细胞。细胞通过离心洗涤两次。在最后一次洗涤后,通过台盼蓝确定细胞密度。细胞以1500rpm离心10分钟;弃去上清液。将细胞重悬于适当体积的10%在FBS(Hyclone)中的二甲亚砜(DMSO,Sigma)中,并且以1ml/小瓶分散。然后在放置于液氮(LN2)容器中以长期贮存之前,将小瓶在-70℃下贮存24小时。
通过将全血与不含FBS的上述低葡萄糖培养基的等份混合来分离外周血单核细胞(PBMC)。将35ml的全血混合物小心层叠在8mlLympholyte Rabbit(Cedarlane)上,一起放入45ml尖底管(Corning),且在室温下以2500rpm离心30分钟而没有中断。离心后,使用玻璃巴斯德吸管(VWR)将PBMC层小心移除,合并并且放置在干净的50ml小瓶中。细胞通过在室温下以1500rpm离心10分钟用上述改良的培养基洗涤两次,并且细胞密度通过台盼蓝染色来确定。在最后一次洗涤后,细胞重悬于适当体积的10%DMSO/FBS培养基中,并且如上所述冷冻。
B细胞培养物
在建立B细胞培养物的当天,将PBMC、脾细胞或淋巴结小瓶解冻以进行使用。小瓶从LN
2容器取出,且放置在37℃下水浴直到解冻。将小瓶的内容物转移至15ml尖底离心管(Corning),并且将10ml上述改良的RPMI缓慢加至所述管中。细胞以1.5K rpm离心5分钟,并且弃去上清液。将细胞重悬于10ml的新鲜培养基中。细胞密度和生存力通过台盼蓝来确定。再次洗涤细胞,并以1E07细胞/80μl培养基重悬。将生物素化huIL-6以3μg/ml的终浓度添加至细胞悬浮液,并且在4℃温育30分钟。未结合的B-huIL-6用磷酸盐缓冲的氟化物(PBF):不含Ca/Mg的PBS(Hyclone)、2mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5%牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-不含生物素)的两次10ml洗涤来移除。在第二次洗涤后,细胞以1E07细胞/80μl PBF重悬。将20μl MACS
链霉抗生物素蛋白珠(Milteni)/10E7细胞添加至细胞悬浮液。细胞在4℃下温育15分钟。细胞用2ml PBF/10E7细胞洗涤一次。在洗涤之后,细胞以1E08细胞/500μl的PBF重悬并静置。MACS
MS柱(Milteni)在磁性台架(Milteni)上用500ml PBF预清洗。将细胞悬浮液通过预滤器应用至所述柱,且收集未结合的部分。用1.5mlPBF缓冲液洗涤柱。从磁性台架取下柱并将其放在清洁、无菌5ml的聚丙烯Falcon管上。将1ml PBF缓冲液添加至柱的顶部,并且收集阳性选择细胞。阳性和阴性细胞部分的得率和生存力通过台盼蓝染色确定。阳性选择得到平均1%的起始细胞浓度。
建立指示性细胞筛选以提供关于培养的接种水平的信息。三个10块板的组(总数为30板)以50、100和200富集的B细胞/孔接种。此外,每孔包含50K细胞/孔的经辐射的EL-4.B5细胞(5,000拉德)和在终体积为250μl/孔的高葡萄糖改良的RPMI培养基中的适当水平的T细胞上清液(范围从1%至5%,取决于制备物)。培养物在37℃下于4%CO2中温育5至7天。
鉴定选择性抗体分泌B细胞
在第5至7天之间就抗原识别和功能活性测试培养物。
抗原识别筛选
所用的ELISA规格如上所述,除了50μl的来自B细胞培养物(BCC)孔(所有30板)的上清液用作抗体的来源。将条件培养基转移至抗原包被的板。在鉴定阳性孔后,移除上清液并转移至96孔主板(master plate)。然后原始培养板通过移除除了40μl/孔的所有上清液和添加60l/孔的16%在FBS中的DMSO来进行冷冻。将板包裹在纸巾中以缓慢冷冻,并且在-70℃下放置。
功能活性筛选
然后如前所述在T1165增殖测定中就功能活性筛选主板,除了B行是用于背景对照的仅培养基,C行是用于阳性增殖对照的培养基+IL-6且D-G行和第2-11列是来自BCC的孔(50μl/孔、单点)。将40μl IL-6以2.5倍于确定的用于测定的EC50浓度加至所有孔中(除了培养基行)。温育1小时后,将Ab/Ag复合物转移至组织培养物(TC)处理的96孔平底板。将在不含huIL-6的改良的RPMI培养基中的20μl细胞悬浮液(T1165以20,000细胞/孔)加至所有孔(终体积为每孔100μl)。减去背景,并且将观察到的OD值转化成抑制%。
B细胞回收
包含目的孔的板从-70℃取出,并且每孔的细胞用5-200μl培养基/孔的洗涤物来回收。洗涤物混合在1.5ml无菌离心管中,并且细胞以1500rpm沉淀2分钟。
将所述管倒置,重复旋转,且小心移除上清液。将细胞重悬于100μl/管的培养基中。将100μl生物素化IL-6包被的链霉抗生物素蛋白M280dyna珠(Invitrogen)和16μl在培养基中从1∶100稀释的山羊抗兔H&L IgG-FITC加至细胞悬浮液。
移除20μl细胞/珠/FITC悬浮液,并且在先前用sigmacote(Sigma)和不透水层(35至40液滴/载玻片)处理的载玻片(Corning)上制备5μl液滴。添加石蜡油(JT Baker)从浸没液滴,并且将载玻片在暗处于37℃、4%CO2下温育90分钟。
产生抗体的特异性B细胞可通过因抗体分泌围绕它们的荧光环、珠相关的生物素化抗原的识别以及随后通过荧光-IgG检测试剂的检测来鉴定。一旦鉴定出目的细胞,经由微操作器(Eppendorf)回收所述荧光环的中心的细胞。将合成且输出抗体的单细胞转移至250μl微量离心管并且放置于干冰中。在回收所有目的细胞后,将这些转移至-70℃用于长期贮存。
实施例8:制备结合HuTNF-α的抗体
通过使用本文所述的抗体选择方案,本领域技术人员能产生显示对TNF-α的有效功能拮抗作用的抗体集合。所述抗体阐明了多种TNF-α表位,因而可提供靶向先前鉴定的TNF-α表位的抗体如Remicade
(英夫利昔单抗)的有用替代物或辅助物(adjunctives)。
筛选方法可用于鉴定结合替代性TNF-α表位的抗体,同时保留显著的功能拮抗作用。在初级抗原识别筛选后,测试阳性BCC孔对TNF-α的功能拮抗作用以及表位竞争如与英夫利昔单抗的竞争。通过Forte Biooctet抗体-TNF-α结合竞争研究来建立独特表位识别。参见图2,追踪显示功能活性和缺乏竞争的BCC孔,并且回收存在于这些孔中的抗体的编码序列。大多数回收的序列显示了原始靶特征:有效抗原识别、功能拮抗作用和不同表位识别。因此,所得到的抗体集合建立了与有效功能拮抗作用相关的多个新型表位区域。
免疫策略:
使用如对huIL-6所述的相同方案用TNF-α(R&D#210-TA)免疫兔。
ABS滴度评价
针对TNF-α的抗原识别测定通过对huIL-6所述的方案来确定,除了板用此细胞因子以上述浓度进行包被。
功能滴度评价
样品的功能活性通过TNF-α刺激的L929和/或WEH I细胞毒性测定来确定。L929或WEHI细胞通常保持在不含huIL-6的上述培养基中。在测定的当天,细胞密度通过台盼蓝来确定。细胞以1E06细胞/ml重悬且在无菌平底96孔组织培养板中以50μl/孔(体积被调整为样品和平行测定的数目)铺板。板在37℃下温育2小时。
分开地,在圆底96孔板中,血清样品以1∶100的稀释度(在所述的培养基中),随后以1∶10的稀释度横越板(第2-10列、第11列是用于TNF-α对照的仅培养基),将50μl/孔添加,一式5份(B-F行、G行是用于背景对照的仅培养基)。以50μl/孔的以4倍于最终EC50的浓度(先前测定每批次浓度)包含TNF-α的培养基和1μg/ml放线菌素D添加至所有样品孔,除了F行。板在37℃下温育1小时。
在1小时时,将50μl的血清/Ag复合物和对照转移至包含50μl/孔的固定密度的反应细胞(终体积=100μl/孔)的96孔平底板,并且在37℃下温育24小时(第1和12列以及A和H行用200μl培养基填充以防止蒸发和导致边缘效应)。
在24小时时,根据制造商方案将20μl/孔的CellTiter96试剂(Promega)加入至所有测试孔,并且板在37℃下温育2小时。2小时后,将板轻轻振摇以使测试孔均质。在490nm波长处读板。使用Graph PadPrizm(使用非线性S形剂量/反应曲线)对OD对稀释度作图,并且确定功能滴度。
组织收获
如以上对huIL-6所述收获、处理并且冷冻兔脾、淋巴结和全血。
B细胞培养物(BCC)
如对huIL-6所述制备B细胞培养物,除了使用生物素化huTNF-α进行细胞富集。
抗原识别筛选
如上所述以单点的形式进行抗原识别筛选。
功能活性筛选
功能活性筛选通过WEHI细胞毒性测定来进行。来自主板的上清液以单点的形式在TNF-α刺激的WEHI细胞毒性测定(如上所述)中进行测试。根据下列模板在不稀释的情况下(as neat)测试上清液:
F行是用于背景对照的仅培养基(50μl/孔)
G行是用于阳性细胞毒性对照的培养基+TNF-α
B-E行和第2-11列是来自BCC的孔(40μl/孔,单点)。
将40μl TNF-α+放线菌素D以4倍确定的用于测定的EC50浓度添加至所有孔(除培养基行)。温育1小时后,将所述Ab/Ag复合物转移至TC处理的96孔平底板。将20μl细胞悬浮液(以1E06细胞/ml的WEHI)添加至所有孔(终体积:100μl/孔),并且板在37℃下温育24小时。在24小时时,根据制造商说明书加入CellTiter 96试剂。在490nm波长处读板,从孔中减去背景并且将OD值转化成抑制%。
重组抗体的次级功能活性测定:阻断用huTNF-α处理的HUVEC细
胞的IL-6表达
人脐静脉上皮细胞(HUVEC)通常保持在上皮生长培养基(EGM)培养基和适合的HUVEC补充物(Cambrex)中。在测定的当天,HUVEC生存力通过台盼蓝来确定。细胞在测定所需的适合体积的培养基(100μl/孔)中以5E05/ml重悬。将细胞铺板在96孔平底培养板的中间孔中,并且将200μl培养基添加至所有外部孔以防止蒸发。板在37℃下温育24小时。
在24小时时,以4倍所需的终浓度在EGM中制备适当的抗体稀释液(起始Ab浓度=1ug/ml;横越板进行1∶3稀释,除了最后一行)。将相同体积的在EGM中的rhuTNF-α(4倍于所需终浓度)添加至孔。板在37℃下温育1小时以形成抗体/抗原复合物。在1小时时,从HUVEC培养板移除并弃去50μl培养基。添加50μl Ab-Ag混合物,且板在37℃下温育48小时。包括标准阳性和阴性对照:仅huTNF-α(第11列)、用于背景生长的仅培养基(不含Ab/不含TNF)(G行)。
在48小时时,通过ELISA评价条件培养基IL-6水平。Immulon板用1ug/ml山羊抗huIL-6以50μl/孔在4℃下包被过夜或在室温下包被1小时。板在板洗涤器中用PBS+0.5%吐温20洗涤(200μl/孔;3次)。板在室温下用200μl/孔FSG封闭1小时。吸出所述封闭溶液,并且将板吸干。huIL-6标准在A和B行(重复试验)进行设定,以1ug/ml起始、然后以1∶3稀释横越板(所有稀释在FSG中进行),留下第12列作为空白。将来自HUVEC培养物的样品在标准曲线下添加至孔,并且在室温下温育1小时。重复洗涤。将1ug/ml ALD515v5(抗huIL-6)以50μl/孔添加至板,并且在室温下温育1小时。重复洗涤。将以1∶5000稀释的二抗抗人IgG Fc HRP以50μl/孔添加,并且在室温下温育45分钟。重复洗涤。用50μl/孔3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)进行测定,最少5分钟。反应用50μl/孔HCl终止,并且在板读数器中于450nm处读板。使用Graph Pad Prizm分析数据。
B细胞回收
除了不使用B-huTNF-α之外,如对huIL-6的那样进行foci方案。
实施例9:制备结合Aβ的抗体
Aβ的两种形式用于在兔中产生免疫反应:Aβ1-40和Aβ1-42肽。通过使用本文所述的抗体选择方案,本领域技术人员能鉴定通过C-末端氨基酸序列独特表位范围选择性识别Aβ的各种形式的抗体。此外,本领域技术人员能鉴定在肽的中央区和N-末端具有有效抗原识别的抗体。筛选策略如下:(1)使用特异于免疫方案的抗原进行初步BCC筛选,和(2)使用代表目的区域(分别为N-末端(1-12)、中央区(10-35)和C-末端(34-40和36-42))的更小型的肽进行选择性筛选。由用所需第二筛选选择性鉴定的孔中的BCC产生的抗体的编码序列通过在回收期中使用小型肽种类来回收。小型肽在此过程中的新型用途证明高度有效;建立有效的选择性抗体回收,在聚集回收过程、特别是在靶抗原中期望限制性表位的情况下支持小型肽(6-mer或更大)的用途。
免疫策略
用于每种Aβ肽的两种兔用从Anaspec获得的下列肽免疫:来自American Peptide的Aβ1-40、Aβ1-42、KLH-Cys-Aβ1-40和Aβ1-42-KLH。根据对huIL-6所述的程序进行免疫。
ABS滴度评价
抗原识别测定通过对huIL-6所述的ELISA方案来确定,除了链霉抗生物素蛋白包被的板(Sigma)用于通过在1×PBS(Hyclone)中以上述的浓度使用生物素化肽Aβ生物素-1-40和Aβ生物素-1-42来在室温下固定抗原1小时。随后步骤如上所述。市售可得的特异性肽的抗体用作对照。筛选对抗所有肽的血清样品以确定滴度特异性。
组织收获
如以上对huIL-6所述收获、处理和冷冻兔脾、淋巴结和全血。
B细胞培养物
除了B细胞富集,如对huIL-6所述建立B细胞培养物,使用下述试剂和策略。对于用Aβ1-40肽免疫的动物,Aβb-1-40用于富集。对于用Aβ1-42肽免疫的动物,使用Aβb-1-42进行首次通过富集,且使用Aβb-1-40进一步富集流出物。根据富集程序标记板。
抗原识别筛选
板通过上述的ELISA方案来筛选,使用生物素化肽。板主要针对Aβ1-40和Aβ1-42肽两者进行筛选。为进一步明确说明表位位置以及为鉴定对每个肽的N-末端、中央区和C-末端有特异性的抗体,代表各个这些区域的肽片段用于二次筛选。一旦鉴定出阳性孔,将它们组合成主板,并且通过ELISA减少方案来进行进一步的肽图绘制(mapping)。
链霉抗生物素蛋白包被的板的孔用每个下列肽(包被的孔的数目依赖于在初次筛选上鉴定的阳性孔的数目)在1×PBS中以50μl/孔、1ug/ml包被:Aβb-10-35、Aβb-34-40、Aβb-36-44、Aβb-38-42(所有通过委托合成而制备;American Peptide)。阳性孔的50μl/孔上清液与包被在孔上的各个肽连续温育(在室温下1小时)(不含上清液的孔在每次连续温育时用FSG填充)。如先前所述,进行剩余的ELISA方案。选择具有所需抗体特征的孔用于B细胞回收。
B细胞回收
如上所述聚集选择的孔,除了使用具有对由ELISA减少方案绘制的区域有适合阳性特异性的针对每个区域的生物素化肽试剂。
实施例10:回收分离的B细胞可变的轻链和重链序列和表达重组
抗体
用于轻链和重链的编码序列从先前已在-70℃下贮存的单个B细胞中回收。使用两步逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)过程。在步骤1中,编码目的区域的RNA通过基于标准RT的方法回收,随后扩增。通过产生用于定向克隆入表达载体的适合DNA片段的巢式引物PCR扩增进行步骤2:轻链:HindIII/BsiWI和重链:HindIII/XhoI。用于此回收过程的特异性序列从宿主动物基因组的序列分析中得到。新型序列的主要来源是兔,以及小鼠和大鼠。引物序列为:
|
引物SEQ ID NO. |
序列(5′至3′) |
Vk有义外部 |
1 |
AG[GA]ACCCAGCATGGACA[CT][CGA]A |
Vk有义内部 |
2 |
GATATCAAGCTTCGAATCGACATGGACACGAGGGCCCCC (HindIII/SfuI) |
Ck反义外部 |
3 |
GGA[TC][AG]G[AT]ATTTATT[CT]GCCAC[GA]CACA |
Ck反义内部 |
4 |
TCTAGACGTACGTTTGACCACCACCTCGGTCCCTC(BBsiWI) |
VH有义外部 |
5 |
AGAC[AG]CTCACCATGGAGACT |
VH有义内部 |
6 |
GATATCAAGCTTACGCTCACCATGGAGACTGGGC(HindIII) |
Cg CHl反义外部 |
7 |
ACTGGCTCCGGGAGGTA |
Cg CHl反义内部 |
8 |
CGCGCGCTCGAGACGGTGACSAGGGTSCCYKGGCCCC(XhoI) |
然后将克隆的cDNA连接入能表达重组轻链和重链的两个不同的哺乳动物表达载体(κ轻链恒定区和γ-1(γ-1)重链恒定区)。这些构建体在框架中制备,并且并入包括于序列回收中的天然信号序列。对各种表达质粒进行大规模DNA制备,并且通过将两种质粒转染进入HEK293细胞,来进行全长兔/人嵌合抗体的瞬时产生。培养5天后,通过离心移除所得的细胞,且就抗原识别直接测试条件培养基,或经由蛋白质A色谱法而亲和力纯化重组抗体。
然后使用上述的ELISA方法就抗原识别测试抗体。此外,对于纯化的抗体,通过ForteBio Octect测量而建立Kd。最终,测试归因于与回收序列相关的特定孔的原始功能修饰特性。
用于轻链和重链序列回收的实验性方法
本方法基于制造商对Qiagen One Step RT-PCR试剂盒的说明中所述的技术。制备通常的主混合物(master mix),并且其包括RNasin(Promega)以防止RNA降解。将50μL包含0.58μM每步1个引物(引物SEQ ID NO:1、3、5和7)的RT-PCR主混合物添加至包含先前回收的冷冻细胞的250μl eppendorf管,并且在冰上小心混合。用下列循环方案进行一步RT-PCR:(1)50℃,30分钟;(2)95℃,15分钟;(3)94℃,30秒;(4)54℃,30秒;(5)72℃,1分钟;(6)进入步骤3,共35个循环;(7)72℃,3分钟;和(8)4℃,保持。
当这些循环结束时,使用1.5μL初次RT-PCR反应物在单独的反应中进行第二次PCR扩增以回收轻链和重链可变区域。使用下列循环方案用0.4μM第二巢式PCR引物轻链(引物SEQ ID NO:2和4)和重链(引物SEQ ID NO:6和8)进行KOD聚合酶驱动的扩增(Novagen):(1)94℃,2分钟;(2)94℃,30秒;(3)60℃,30秒;(4)72℃,45秒;(5)进入步骤2,共35个循环;(6)72℃,3分钟;和(7)4℃,保持。
在完成第二次扩增后,取出10μL反应物并且通过2%TAE琼脂糖凝胶电泳来分析。剩余的40μL反应物经由Qiagen Qiaquick PCRClean-up试剂盒来纯化,并且洗脱成75μL。
随后使用下列条件消化这些扩增子(轻链用HindIII/BsiWI,重链用HindIII/XhoI):10μL纯化的PCR产物、3μL 10×NewEngland Biolabs限制性酶缓冲液2、0.5μL HindIII(5U)和0.5μL BsiWI(5U)或0.5uL XhoI,在37℃下60分钟,然后在55℃下30分钟。该消化物经由Qiagen Qiaquick PCR方法来纯化。随后将这些连接入适合的表达载体。然后2μL的这种反应物用于转化TOP10(Invitrogen)或XL-10(Stratagene),并且将转化的细胞涂布在LB/卡那霉素(50μg/mL)上。
使用下列引物经由PCR筛选方法就插入物筛选所得的克隆:
|
引物SEQ ID NO. |
序列(5′至3′) |
载体 |
9 |
GCGCGCCACCAGACATAATAGCT |
重链 |
10 |
AGCCCAAGGTCACCGTGCTAGAG |
轻链 |
11 |
GTATTTATTCGCCACACACACACGATG |
挑选克隆放至60μL LB/卡那霉素,且温育高达30分钟。在30分钟时,取出约1μL,并用于包含2μM引物对(SEQ ID NO:9/10用于重链和SEQ ID NO:9/11用于轻链)的标准30μL KOD扩增反应(Novagen)。扩增方案如下:(1)96℃,2分钟;(2)96℃,20秒;(3)68℃,25秒;(4)进入步骤2,重复共40个循环;和(5)68℃,2分钟。
取出5μL,且在2%琼脂糖上进行分析。在证实正确的可变区插入物后,5μL各种反应物在10μL终体积的New Biolabs限制性酶缓冲液2中用Alu1(New England Biolabs)进行消化,并且在4%TAE琼脂糖凝胶电泳上进行分析。鉴定每个回收孔的独特Alu模式。随后对这些进行处理用于序列表征。