CN104284903A - 抗磷脂酶d4抗体 - Google Patents

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Abstract

结合磷脂酶D4(PLD4)蛋白的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段。

Description

抗磷脂酶D4抗体
技术领域
本发明涉及结合磷脂酶D4的抗体。在下文中，"磷脂酶D"可被缩写为PLD，并且"磷脂酶D4"等可被缩写为PLD4等。
背景领域
干扰素(在下文中，"干扰素"可被缩写为IFN)是抗病毒免疫反应中最重要的细胞因子。人血中的干扰素生成细胞(IPC：IPC是未分化的基于淋巴细胞的树突细胞，其被定位为树突细胞(DC)的前体细胞。IPC还可称为浆细胞样树突细胞或浆细胞样树突状细胞(pDC)。此后，在本说明书中，IPC和pDC是同义的，并且在下文中一律以术语pDC相称)，表达CD4和主要组织相容性复合物II类蛋白。然而，由于不充分的这样的细胞的数量、快速细胞凋亡和另外地谱系(系统)标志物的缺乏，直至现在仍未进行细胞的分离或具体表征。已发现pDC为树突细胞的CD4+CD11c-2型前体细胞，并且发现在微生物的刺激后pDC产生的IFN比其它血细胞产生的IFN要高200至1000倍。因此，pDC为抗病毒/抗肿瘤免疫反应中的决定性免疫系统效应细胞。
IFNα和IFNβ被称为I型IFN，其具有抗病毒活性或抗肿瘤活性。在另一方面，已发现IFNα与自身免疫疾病相关。例如，已报导具有自身免疫疾病例如系统性红斑狼疮和慢性类风湿关节炎的患者中的IFNα的异常产生。此外，已报导了其中在施用重组IFNα2或IFN后自身免疫疾病症状表达或加重的病例。还已提出自身免疫症状可能通过IFNα的中和来缓和。
此外，还已显示IFNα诱导树突细胞(DC)的分化。已预期树突细胞的分化的诱导构成了自身免疫疾病的重要机制，因为树突细胞是抗原呈递细胞。事实上，已有人提出IFNα的树突细胞分化的诱导与系统性红斑狼疮的发生深度相关。如上所述，已指出了IFNα与自身免疫疾病以及抗肿瘤活性的密切关系。此外，IFNα还与银屑病的发生深度相关。
仅少数pDC存在于血液中。预期占据外周血淋巴细胞的pDC的比率为1％或更少。然而，pDC具有极高的IFN产生能力。pDC的IFN产生能力达到例如3000pg/mL/104个细胞。也就是说，可认为在病毒感染时在血液中产生的大多数IFNα或IFNβ由pDC引起，尽管细胞数目很少。
pDC通过病毒刺激分化成树突细胞，并且诱导T细胞产生IFN-γ或白细胞介素(IL)-10。此外，pDC还通过IL-3刺激分化成树突细胞。在IL-3刺激后分化的树突细胞诱导T细胞产生Th2细胞因子(IL-4、IL-5、IL-10)。如上所述，pDC具有这样的性质：取决于刺激的不同其分化成不同的树突细胞。
因此，pDC是具有个方面的细胞，即一方面作为IFN生成细胞，另一方面作为树突细胞的前体细胞。细胞的任一方面在免疫系统中都起着重要作用。即，pDC是在各个方面支持免疫系统的重要细胞之一。
在体液因子例如IFN的活性调节中，识别所述因子的抗体的施用是有效的。例如，利用抗IL-1或IL-4抗体治疗自身免疫疾病的尝试是实用的。此外，也类似地对于IFN，中和抗体被当作自身免疫疾病的治疗剂。可预期相似的方法对于IFN生成pDC是有效的。然而，这样的方法基于在产生后体液因子的作用的抑制。如果期望的体液因子的产生可被直接控制，则可获得进一步的基本疗效。
已报导了识别人pDC的抗体。例如，抗-BDCA-2单克隆抗体为人pDC-特异性单克隆抗体(Dzionek,A.等人J.Immunol,165：6037-6046,2000)。已发现抗-BDCA-2单克隆抗体具有抑制人pDC的IFN产生的作用(J.Exp.Med.194：1823-1834,2001)。此外，还已报导识别小鼠干扰素生成细胞的单克隆抗体抑制干扰素的产生(Blood2004 Jun 1:103/11：4201-4206.Epub 2003Dec)。还已报导小鼠pDC的单克隆抗体减少树突细胞的数目(J.Immunol.2003,171：6466-6477)。
类似地，如果提供可识别人pDC并且调节活性的抗体，则其将是有用的。例如，本发明人已显示识别Ly49Q的抗体特异性结合小鼠pDC。然而，Ly49Q的抗体不干扰小鼠pDC的活性(B1ood,2005年4月1日,第105卷,第7卷,pp.2787-2792)。
PLD是催化磷脂酰胆碱的水解反应以产生磷脂酸和胆碱，并且在不同细胞中引起信号转导的酶。预期产生的磷脂酸作为脂质信号分子。
PLD1和PLD2常规地已知为两种类型的哺乳动物PLD，并且在其N末端区域包含Phox同源结构域(PX结构域)(其可与磷脂酰肌醇酯键合)和血小板白细胞C激酶底物同源性结构域(pleckstrin homologydomain)(PH结构域)。两个结构域都参与PLD膜靶向。
PLD1和PLD2还包含两个His-x-Lys-x-x-x-x-Asp序列(HKD基序)。该HKD基序是PLD活性的必需结构域。
已预期由PLD1和PLD2产生磷脂酸参与细胞骨架的重构、胞吐作用、吞噬作用、癌化、细胞粘附、趋化作用等，并且在神经系统、免疫系统等中起着中枢作用。
尽管迄今人Hu-K4和小鼠SAM9被正式命名为PLD3，但它们缺乏PX和PH结构域，并且未显示PLD活性，尽管它们具有2个HKD基序。此外，尽管存在3个PLD家族成员，即PLD4、PLD5和PLD6，但这些非经典PLD几乎不为人知。
搜索小鼠小脑发育中的基因表达模式的小脑发育转录组数据库(CDT-DB)，作为其结果，鉴定了PLD4，其为在发育时受控制的转录产物(参见Tao等人,Nat.Methods 2(8),591-598(2005))。PLD4的基本特征未曾报导。考虑从现在应当确定PLD4是否显示酶促活性，以及PLD4的去糖基化形式是否具有PLD活性。
PLD4为由SEQ ID NO：1所示的506个氨基酸的序列(Tao等人,Nat.Methods 2(8),591-598(2005)和Clark等人,Genome Res.13(10),2265-2270(2003))。PLD4蛋白具有两个假定的PDE区域(磷酸二酯酶基序)(其由两个在C末端区域中保守的HKD基序(His-x-Lys-x-x-x-x-Asp的氨基酸序列，其中x为其它氨基酸)构成)和假定的磷酸化位点(Thr 472)。PLD4蛋白的结构预测为II型单变跨膜蛋白(monotropic transmembrane protein)。此外，PLD4蛋白的N末端区域不具有PX区域和PH区域，所述区域由为经典PLD家族的PLD1和PLD2所具有(图1和2)。
在另一个方面，尽管根据其具有两个HKD基序的事实，PLD4属于PLD家族，但PLD4缺乏PX结构域和PH结构域，而是具有替代的假定的跨膜结构域。
在优选地位于出生后1周的小鼠的胼胝体和白质区(包括小脑白质)周围的细胞亚群中发现了特征性的从低水平至中等水平的PLD4的mRNA表达。这些表达PLD4mRNA的细胞已被鉴定为Ibal阳性小神经胶质细胞(参见Tao等人,Nat.Methods 2(8),591-598(2005))。
出生后1周的时期是当髓磷脂形成的活化在小鼠的胼胝体和小脑白质中开始时的时期。在该时期中，PLD4在存在于白质中的变形虫样(活化状态)小神经胶质细胞中高度表达。根据这些事实，预期了白质中的PLD4表达细胞在该时期参与髓磷脂形成的可能性。特别地，PLD4在吞噬小泡中的积累变得明显，并且提出了PLD4表达细胞参与吞噬作用的可能性。从处于活化状态的变形虫样小神经胶质细胞，各种细胞因子或生长因子被分泌，吞噬作用也被活化。预期额外的少突胶质细胞(中枢神经系统中的神经胶质细胞，其形成包卷和连接至轴突的髓磷脂)在发育阶段引起脑的白质中的细胞凋亡。已预期了这样的可能性：额外的少突胶质细胞被降解并从变形虫样小神经胶质细胞被除去以分泌信号分子，从而安排在白质中髓磷脂形成的环境。已提出PLD4参与这些过程，包括髓磷脂形成。
PLD4mRNA表达也普遍地见于非神经组织中，但主要分布在脾中。在脾红髓的边缘带周围检测到强PLD4表达，并且从细胞的膜级分收集的脾PLD4蛋白被高度N-糖基化。当PLD4在异质性细胞系统中表达时，它们位于内质网和高尔基体中。异源表达的PLD4未显示PLD酶促活性(Plos ONE www.plosone.org,November 2010,第5卷,Issue 11,e13932)。
根据在时间和位置方面受限的PLD4表达的模式，已提出PLD4在出生后最初阶段的脑发育时期在小神经胶质细胞或脾边缘区的细胞的共同功能中起作用。
上文中已概述了神经组织和非神经组织中PLD4mRNA的表达和PLD4分布。然而，本发明人发现PLD4mRNA以下文中描述的细胞种类的水平在处于静止期的pDC(静息pDC)中特异性高度表达。
抗全长人PLD4蛋白的小鼠抗-人PLD4多克隆抗体是商购可得的(PLD4纯化的MaxPab小鼠多克隆抗体(B01P)，目录号H00122618-B01P，由Abnova Corporation生产的)。然而，一直未获得仅结合PLD4的特定位点的单克隆抗体或可特异性结合PLD4的单克隆抗体。
引用列表
非专利文献
(1)Tao et al.,Nat.Methods 2(8),591-598(2005)
(2)Clark et al.,Genome Res.13(10),2265-2270(2003)
(3)Plos ONE www.plosone.org,November 2010,Volume 5,Issue11,e13932
(4)Catalog of mouse PLD4polyclonal antibody against full lengthhuman PLD4protein
(Abnova,catalog No.H00122618-B01P)
(5)Dzionek,A.et al.J.Immunol.165：6037-6046,2000
(6)J.Exp.Med.194:1823-1834,2001
(7)Blood 2004 Jun 1:103/11:4201-4206.Epub 2003Dec
(8)J.Immunol.2003,171:6466-6477
(9)Blood,1 April 2005,Vol.105,No.7,pp.2787-2792
(10)Nat.Methods 2(8),591-598(2005)
发明概述
技术问题
待由本发明解决的问题是提供结合PLD4的抗体，和检测、鉴定或分离pDC。此外，待由本发明解决的问题是调节pDC的活性。
问题的解决
本发明人通过PLD4的研究确认了PLD4的表达在pDC，特别地，除了处于活化期的pDC以外，处于静止期的pDC中特异性升高。因此，本发明人尝试制备PLD4抗体和阐明其作用。
为了获得识别少量来源于活生物体的蛋白质的抗体，通常将通过基因重组技术制备的蛋白质用作免疫原。本发明人尝试基于已被显示(Nat.Methods 2(8),591-598(2005))的PLD4cDNA的碱基序列和由其编码的氨基酸序列(GenBank登录号NM_138790.2)的信息表达PLD4。
为了获得蛋白质的抗体，通常尝试将天然蛋白质的部分氨基酸序列用作免疫原。然而，为了获得识别细胞表面上的分子的抗体，必需选择构成被抗体识别为细胞表面上的表位的部分的区域。因此，已预期使用片段氨基酸序列作为免疫原来获得特异于PLD4的抗体是不现实的。
在这样的情况下，本发明人显示特定免疫原的使用允许获得结合pDC的抗体。此外，本发明人确认了所获得的抗体特异性识别人pDC，并且还具有调节其活性的作用，从而完成了本发明。即，本发明涉及下文中描述的抗-PLD4抗体、其制备方法及其用途。
本发明如下：
(1)结合磷脂酶D4(PLD4)蛋白的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段。
(2)上述(1)中描述的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SYWMH(SEQ ID NO：2)、作为CDR2的序列DIYPGSDSTNYNEKFKS(SEQ ID NO：3)以及作为CDR3的序列GGWLDAMDY(SEQ ID NO：4)。
(3)上述(1)中描述的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在轻链可变区中具有作为CDR1的序列RASQDISNYLN(SEQ ID NO：5)、作为CDR2的序列YTSRLHS(SEQ ID NO：6)，以及作为CDR3的序列QQGNTLPW(SEQ ID NO：7)。
(4)上述(1)中描述的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SYWMH、作为CDR2的序列DIYPGSDSTNYNEKFKS以及作为CDR3的序列GGWLDAMDY，和在轻链可变区中具有作为CDR1的序列RASQDISNYLN、作为CDR2的序列YTSRLHS以及作为CDR3的序列QQGNTLPW。
(5)上述(1)中描述的单克隆抗体(3B4抗体)或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列TYWMH(SEQ IDNO：8)、作为CDR2的序列AIYPGNSETSYNQKFKG(SEQ ID NO：9)以及作为CDR3的序列GYSDFDY(SEQ ID NO：10)。
(6)上述(1)中描述的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在轻链可变区中具有作为CDR1的序列HASQGIRSNIG(SEQ ID NO：11)、作为CDR2的序列HGTNLED(SEQ ID NO：12)以及作为CDR3的序列VQYVQFP(SEQ ID NO：13)。
(7)上述(1)中描述的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列TYWMH、作为CDR2的序列AIYPGNSETSYNQKFKG以及作为CDR3的序列GYSDFDY，和在轻链可变区具有作为CDR1的序列HASQGIRSNIG、作为CDR2的序列HGTNLED以及作为CDR3的序列VQYVQFP。
(8)上述(1)中描述的单克隆抗体(5B7抗体)或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列DYNLH(SEQ IDNO：14)、作为CDR2的序列YIYPYNGNTGYNQKFKR(SEQ IDNO：15)以及作为CDR3的序列GGIYDDYYDYAIDY(SEQ ID NO：16)。
(9)上述(1)中描述的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在轻链可变区中具有作为CDR1的序列RASENIYSHIA(SEQ ID NO：17)、作为CDR2的序列GATNLAH(SEQ ID NO：18)以及作为CDR3的序列QHFWGTP(SEQ ID NO：19)。
(10)上述(1)中描述的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列DYNLH、作为CDR2的序列YIYPYNGNTGYNQKFKR以及作为CDR3的序列GGIYDDYYDYAIDY，和在轻链可变区中具有作为CDR1的序列RASENIYSHIA、作为CDR2的序列GATNLAH以及作为CDR3的序列QHFWGTP。
(11)上述(1)中描述的单克隆抗体(8C11抗体)或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SYYLY(SEQ IDNO：20)、作为CDR2的序列LINPTNSDTIFNEKFKS(SEQ ID NO：21)以及作为CDR3的序列EGGYGYGPFAY(SEQ ID NO：22)。
(12)上述(1)中描述的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在轻链可变区中具有作为CDR1的序列TSSQTLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO：23)、作为CDR2的序列KVSNRFS(SEQ ID NO：24)以及作为CDR3的序列HSTHVP(SEQ ID NO：25)。
(13)上述(1)中描述的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SYYLY、作为CDR2的序列LINPTNSDTIFNEKFKS以及作为CDR3的序列EGGYGYGPFAY，和在轻链可变区具有作为CDR1的序列TSSQTLVHSNGNTYLH、作为CDR2的序列KVSNRFS以及作为CDR3的序列HSTHVP。
(14)上述(1)中描述的单克隆抗体(10C3抗体)或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SYGMS(SEQ IDNO：26)、作为CDR2的序列TISSGGSYIYYPESVKG(SEQ ID NO：27)以及作为CDR3的序列LYGGRRGYGLDY(SEQ ID NO：28)。
(15)上述(1)中描述的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在轻链可变区中具有作为CDR1的序列RSSKSLLHSDGITYLY(SEQID NO：29)、作为CDR2的序列QMSNLAS(SEQ ID NO：30)以及作为CDR3的序列AQNLEL(SEQ ID NO：31)。
(16)上述(1)中描述的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SYGMS、作为CDR2的序列TISSGGSYIYYPESVKG以及作为CDR3的序列LYGGRRGYGLDY，和在轻链可变区具有作为CDR1的序列RSSKSLLHSDGITYLY、作为CDR2的序列QMSNLAS以及作为CDR3的序列AQNLEL。
(17)上述(1)中描述的单克隆抗体(13D4抗体)或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SHYYWT(SEQ IDNO：32)、作为CDR2的序列YISYDGSNNYNPSLKN(SEQ ID NO：33)以及作为CDR3的序列EGPLYYGNPYWYFDV(SEQ ID NO：34)。
(18)上述(1)中描述的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在轻链可变区中具有作为CDR1的序列RASQDIDNYLN(SEQ IDNO：35)、作为CDR2的序列YTSRLHS(SEQ ID NO：36)以及作为CDR3的序列QQFNTLP(SEQ ID NO：37)。
(19)上述(1)中描述的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SHYYWT、作为CDR2的序列YISYDGSNNYNPSLKN以及作为CDR3的序列EGPLYYGNPYWYFDV，和在轻链可变区中具有作为CDR1的序列RASQDIDNYLN、作为CDR2的序列YTSRLHS以及作为CDR3的序列QQFNTLP。
(20)上述(1)中描述的单克隆抗体(13H11)或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SHYYWS(SEQ IDNO：38)、作为CDR2的序列YISYDGSNNYNPSLKN(SEQ ID NO：39)以及作为CDR3的序列EGPLYYGNPYWYFDV(SEQ ID NO：40)。
(21)上述(1)中描述的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在轻链可变区中具有作为CDR1的序列RASQDIDNYLN(SEQ IDNO：41)、作为CDR2的序列YTSRLHS(SEQ ID NO：42)以及作为CDR3的序列QQFNTLP(SEQ ID NO：43)。
(22)上述(1)中描述的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SHYYWS、作为CDR2的序列YISYDGSNNYNPSLKN以及作为CDR3的序列EGPLYYGNPYWYFDV，和在轻链可变区具有作为CDR1的序列RASQDIDNYLN、作为CDR2的序列YTSRLHS以及作为CDR3的序列QQFNTLP。
(23)通过在登录号：NITE BP-1211、NITE BP-1212、NITE BP-1213和NITE BP-1214下保藏的杂交瘤mp5B7、mp7B4、mp13D4和mp13H11之任一产生的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段。
(24)产生上述(1)或(2)中描述的单克隆抗体之任一的杂交瘤。
(25)在登录号：NITE BP-1211、NITE BP-1212、NITEBP-1213或NITE BP-1214下保藏的杂交瘤mp5B7,mp7B4,mp13D4或mp13H11。
(26)制备单克隆抗体的方法，包括培养上述(25)中描述的杂交瘤和从培养物收集单克隆抗体的过程。
(27)制备产生结合PLD4的单克隆抗体的细胞的方法，包括下列过程:
1)给免疫动物施用编码包含PLD4细胞外结构域的氨基酸序列的重组PLD4-Ig融合蛋白的过程，和
2)从免疫动物的抗体产生性细胞选择产生结合PLD4的抗体的抗体产生性细胞的过程。
(28)上述(27)中描述的方法，其中表达PLD4的细胞是以可表达的方式保留编码包含PLD4细胞外结构域的氨基酸序列的外源性多核苷酸的细胞。
(29)上述(28)中描述的方法，其中细胞为动物细胞。
(30)上述(29)中描述的方法，其中细胞为人来源的细胞。
(31)上述(30)中描述的方法，其中人来源的细胞为HEK-293T细胞。
(32)上述(27)至(31)的任一项中描述的方法，包括递增地克隆获得的抗体产生性细胞的过程。
(33)制备结合PLD4细胞外结构域的单克隆抗体的方法，包括培养通过上述(29)中描述的方法获得的抗体产生性细胞和从培养物收集单克隆抗体的过程。
(34)识别PLD4的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其可通过下列过程获得:
1)给免疫动物施用编码包含PLD4细胞外结构域的氨基酸序列的重组PLD4-Ig融合蛋白的过程，
2)从免疫动物的抗体产生性细胞选择产生结合PLD4的抗体的抗体产生性细胞的过程，和
3)培养过程2)中选择的抗体产生性细胞，和从培养物收集识别PLD4的抗体的过程。
(35)用于制备结合PLD4的抗体的免疫原，其包含(a)以可表达的方式外源性地保留编码包含PLD4细胞外结构域的氨基酸序列的多核苷酸的动物细胞，或其细胞膜级分。
(36)上述(35)中描述的免疫原，其中动物细胞为人来源的细胞。
(37)检测浆细胞样树突细胞的方法，包括将结合PLD4细胞外结构域的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段与测试细胞接触，随后检测结合细胞的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段的过程。
(38)用于检测浆细胞样树突细胞的试剂，其包含结合PLD4细胞外结构域的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段。
(39)抑制浆细胞样树突细胞的活性的方法，包括将下述组分的任一种与浆细胞样树突细胞接触的过程：
(a)结合PLD4并抑制浆细胞样树突细胞的活性的单克隆抗体，或包含其抗原结合区的片段，和
(b)免疫球蛋白或包含其抗原结合区的片段，其中所述免疫球蛋白中移植了单克隆抗体(a)的互补决定区。
(40)抑制活生物体的浆细胞样树突细胞的活性的方法，包括给活生物体施用下述组分的任一种的过程：
(a)结合PLD4并抑制浆细胞样树突细胞的活性的单克隆抗体，或包含其抗原结合区的片段，和
(b)免疫球蛋白或包含其抗原结合区的片段，其中所述免疫球蛋白中移植了单克隆抗体(a)的互补决定区。
(41)上述(39)或(40)中描述的方法，其中浆细胞样树突细胞的活性是干扰素生成活性和干扰素生成细胞的存活之一，或其两者。
(42)用于抑制浆细胞样树突细胞的活性的试剂，其包含下述组分的任一种作为活性组分：
(a)结合PLD4并抑制浆细胞样树突细胞的活性的单克隆抗体，或包含其抗原结合区的片段，和
(b)免疫球蛋白或包含其抗原结合区的片段，其中所述免疫球蛋白中移植了单克隆抗体(a)的互补决定区。
(43)上述(42)中描述的用于抑制干扰素生成细胞的活性的试剂，其中浆细胞样树突细胞的活性是干扰素生成活性和干扰素生成细胞的存活的任一种，或其两者。
本发明的作用
本发明提供了特异性识别PLD4的抗体、在抗体的制备中有用的免疫以及使用免疫原制备抗-PLD4抗体的方法。PLD4是属于PLD4家族的膜蛋白。本发明人显示特异性识别PLD4的抗体可容易地获得。可通过本发明获得的抗-PLD4抗体是具有高度特异性的抗体，其可区分人pDC与表达其它PLD家族的细胞。
在优选方面，由本发明提供的抗-PLD4抗体结合人pDC。此外，本发明的抗体特异性识别人pDC。因此，本发明的抗体对于pDC的检测或分离是有用的。pDC是产生大部分I型IFN的细胞。因此，这样的检测或分离在与pDC相关的疾病例如自身免疫疾病的诊断或研究中是非常重要的。
此外，在优选方面，由本发明提供的抗-PLD4抗体具有调节人pDC活性的作用。因此，本发明的抗-PLD4抗体可用于抑制pDC活性。因此，如果使用本发明的抗体来进行pDC活性的抑制，则可预期对于其中IFNα表达已上升的自身免疫疾病的患者的治疗作用。
pDC在少量细胞中产生大量IFN。在IFN的中和中，抗体是必需的，这取决于IFN分子的数目。然而，在本发明中，生产细胞的活性被直接抑制。作为其结果，相较于抗-IFN抗体的中和，使用更少量的抗体可预期强有力的IFN抑制作用。此外，在其中连续产生IFN的情况下，预期通过IFN抗体的中和将仍然为瞬时抑制。然而，在本发明，pDC活性被抑制，并且据此，可预期在长时间内的IFN生成抑制作用。
附图概述
图1是举例说明人PLD4(C14或fl75)蛋白的氨基酸序列(506个残基)的图表。可预见的是来自N末端的第31至第53残基是跨膜结构域，如使用"SOSUI程序(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)"分析的，该程序是针对跨膜区域的预测系统。第54至第506残基包含两个磷酸二酯酶基序，该蛋白被预测为II型跨膜蛋白:
图2是代表人PLD4蛋白的预测结构的示意图。结构在氨基酸506个残基中具有2个HKD(HxKxxxxD)基序，苏氨酸残基472可能是磷酸化位点:
图3是举例说明人PLD4蛋白与异种动物的同源分子种类的同源性的图表。PLD4蛋白在从小鼠至人的进化过程中是保守的:
图4是举例说明与人PLD4蛋白家族的同源性(旁系同源物)的图表:
图5是举例说明PLD4基因在负责人免疫的细胞中的人pDC-特异性表达的图表。PLD4基因在处于静止期的pDC中高表达，在CD19+B细胞中低表达:
图6是举例说明人PLD4mRNA的组织表达模式的图表。其在脾和外周血白细胞中高表达:
图7是举例说明重组人PLD4-Ig融合蛋白的结构的示意图。通过PCR扩增对应于人PLD4细胞外结构域(56-506氨基酸)的cDNA片段。将该片段插入在N末端包含小鼠Igκ前导区段和小鼠IgG2a重链恒定Fc区域(铰链+CH2+CH3)的N-Flag pcDNA3.1表达载体的BamHI-EcoRI克隆位点。用质粒瞬时转染293F细胞，收集培养上清液:
图8是举例说明对人PLD4的结合特异性的FACS分析图。mp11G9.6和ch11G9.6抗体特异性识别人PLD4，但不识别人PLD3-293T或PLD5-293T转染子:
图9是举例说明与食蟹猴PLD4的交叉反应性的FACS分析图。mp11G9.6和ch11G9.6抗体能够识别293T转染子上的食蟹猴PLD4:
图10是举例说明人PBMC的mp11G9.6抗体的染色的FACS测量图。mp11G9.6抗体强有力地识别人PBMC中的BDCA2+pDC:
图11是举例说明CAL-1细胞的纯化的抗-PLD4抗体的染色的FACS分析图:
图12是举例说明人PLD4-CT125稳定细胞株的抗-PLD4抗体的染色的FACS分析图:
图13是举例说明人PBMC的抗-PLD4抗体的染色的FACS分析图。所有抗-PLD4抗体能够识别人PBMC中的BDCA2+pDC:
图14是表示人PLD、食蟹猴PLD4、恒河猴PLD4和小鼠PLD4的蛋白的多重比对和同源性的图表:
图15是举例说明采用Flag标记的食蟹猴PLD4表达载体至人PLD4-293T细胞的瞬时基因引入的抗-PLD4抗体的染色的FACS分析图。通过抗-Flag抗体确认了食蟹猴PLD4蛋白的细胞表面表达:
图16是举例说明食蟹猴PLD4-CT125细胞的抗-PLD4抗体的染色的FACS测量图。在抗-PLD4抗体当中，7种(3B4、5B7、7B4、13D4、13H11、14C1和11G9.6)抗体可结合食蟹猴PLD4-CT125稳定转染子:
图17是举例说明采用Flag标记的恒河猴PLD4表达载体至人PLD4-293T细胞内的瞬时基因引入的抗-PLD4抗体的染色的FACS分析图。通过抗-Flag抗体确认了恒河猴PLD4蛋白的细胞表面表达:
图18-1和图18-2是举例说明恒河猴PBMC的抗-PLD4抗体的染色的FACS分析图。在抗-PLD4抗体当中，5种(5B7、7B4、13D4、13H11和14C1)抗体特异性结合恒河猴PBMC中的食蟹猴的pDC细胞群(谱系-CD123+HLA-DR+):
图19是举例说明针对人PLD4-CT125稳定细胞株的抗-PLD4抗体的解离常数摩尔浓度(nM单位，Kd值)的图:
图20是举例说明10种类型的抗-PLD4抗体的CDC活性的图。靶细胞：人PLD4-CT125(小鼠2B4T细胞淋巴细胞)稳定转染子抗体浓度：10μg/mL效应子：1％未成熟家兔补体:
图21是举例说明抗-PLD4抗体(mp11G9.6抗体和ch11G9.6抗体)的CDC活性的图。靶细胞：人PLD4-CT125(小鼠2B4T细胞淋巴细胞)稳定转染子抗体浓度：0.1μg/mL至30μg/mL效应子：1％未成熟家兔补体:
图22是举例说明抗-PLD4嵌合抗体的ADCC活性的图。靶细胞：人PLD4-CHO稳定转染子抗体浓度：10μg/mL:
图23是举例说明从3个健康个体分离的人PBMC中抗-PLD4嵌合抗体(ch11G9.6)的处理对IFN-α分泌的抑制的测量(利用ELISA)的图:和
图24是举例说明在利用抗-PLD4嵌合抗体的处理后人pDC丢失的图。
图25是利用抗人原代pDC的嵌合抗-PLD4Ab的ADCC测定的结果。
图26是在嵌合抗-PLD4Ab存在的情况下通过CpG2216诱导的来自PBMC的IFNα产生。
用于进行本发明的模式
本发明人发现PLD4是在处于静止期的浆细胞样树突细胞(静息pDC)中在mRNA水平和蛋白质水平上特异性表达的分子。未建立制备识别PLD4的抗体的方法。
有报导认为小鼠PLD4是在出生后的最初阶段的小脑或胼胝体中的处于发育期的变形虫样(活化状态)小神经胶质细胞中表达的分子。然而，人PLD4的表达直至现在还不清楚。具体地，直至现在仍未报道人PLD4在免疫系统中的表达、细胞内定位、结构、功能等。本发明确认直至现在被认为仅在细胞质中表达的人PLD4是在人浆细胞样树突细胞(pDC)中表达为II型跨膜蛋白的细胞表面标志物。因此，PLD4抗体对pDC的结合成为可能，并且已证明PLD4抗体可用作意欲调节B细胞和pDC细胞的功能的治疗性抗体的分子靶。
本发明人通过基因表达分析确认了PLD4在人pDC中特异性表达。可以预见的是如果获得可在免疫学上区分PLD4与其它分子的抗体，则其可用于pDC研究。然而，在包含PLD4的PLD家族中存在许多分子，其在结构上彼此十分相似。分子例如PLD1,PLD2,PLD3和PLD5，包括作为PLD4的PLD，包含具有特别高的同源性的氨基酸序列(图4)。因此，可以预见的是使用利用构成PLD4(或细胞外结构域)的氨基酸序列(部分序列)的肽的免疫原难以获得彼此区分这些分子的抗体。因此，本发明人尝试使用重组PLD4-Ig融合蛋白作为免疫原来获得抗PLD4的抗体，所述重组PLD4-Ig融合蛋白编码包含PLD4细胞外结构域的氨基酸序列。
本发明人重复研究以获得识别PLD4的抗体，并显示使用重组PLD4-Ig融合蛋白作为免疫原获得期望的抗体，并且完成了本发明。也就是说，本发明涉及结合PLD4细胞外结构域的单克隆抗体，或包含其抗原结合区的片段。
在本发明中，PLD4是在人pDC中表达的天然分子，或在免疫学上与在人pDC中表达的PLD4等同的分子。在本发明中，可确认抗体对PLD4的结合，例如，如下文中描述的。
·基于与人细胞的反应性的确认：
根据本发明人获得的发现，可以预见的是根据其在人pDC中显示特异性表达的事实，PLD4可用作pDC标志物。
基于PLD4的这样的表达特征谱，与pDC的至少部分亚组的结合活性是本发明中结合PLD4的抗体的重要特征之一。一些细胞是pDC的事实可通过每一个细胞家族中固有的细胞表面标志物来确定。例如，对期望的细胞的结合通过结合细胞表面标志物的抗体和结合活性待确认的抗体的双重染色来确认。也就是说，本发明中的pDC包括表达例如BDCA2的细胞。
·基于与表达PLD4基因的转化细胞的反应性的确认：
本发明人确认了当在某些条件下表达PLD4基因时在人pDC中表达的PLD4的免疫学特征被重建。因此，与PLD4的反应性还可基于抗体对于其中已人工地引入了编码PLD4的基因的细胞的反应性来确认。也就是说，本发明涉及单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗体结合包含构成PLD4细胞外结构域的氨基酸序列作为细胞外结构域的分子。同时，细胞外结构域由对应于SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的从SEQ ID NO 1(图1)的N末端开始的54至506的氨基酸序列构成。
例如，在用包含编码PLD4的DNA的表达载体转化的细胞中，在人pDC中表达的PLD4的免疫学特征得以维持。因此，表达PLD4的转化细胞优选作为用于在本发明中确认抗体对PLD4的细胞外结构域的结合特性的细胞。当在本发明中通过转化细胞确认抗体的反应性时，非转化细胞被期望地用作对照。
随后，本发明中结合PLD4的抗体可以是显示与已知表达除PLD4外的PLD家族的细胞家族的交叉性质的抗体，或可以是不显示这样的交叉性质的抗体。未显示交叉性质的抗体优选作为本发明中结合PLD4的抗体。具体地，本发明中结合PLD4的抗体优选为这样的抗体，在与其中对pDC的结合被确认的条件相同的条件下，可能不能确认所述抗体与已知表达除PLD4外的PLD家族的细胞家族的结合。
也就是说，本发明中结合PLD4细胞外结构域的单克隆抗体优选包括具有下述免疫学特征的单克隆抗体。
a)结合人pDC，
b)在允许结合人pDC的条件下，可能不能确认对选自单核细胞、巨噬细胞、CD34阳性细胞和来源于这些细胞的树突细胞的一个或多个种类的细胞的结合。
具体地，本发明的单克隆抗体优选为这样的抗体，在允许结合人pDC的条件下，可能不能确认所述抗体对单核细胞、巨噬细胞、B细胞、CD34阳性细胞和来源于这些细胞的树突细胞的结合。
或者，本发明中结合PLD4细胞外结构域的单克隆抗体优选包括具有下述免疫学特征的单克隆抗体。
c)对利用以可表达的方式保留编码PLD4的DNA的表达载体转化的转化细胞的结合，
d)在允许结合转化细胞c)的条件下，可能不能确认与被转化前的c)的宿主细胞的结合。
本发明中抗-PLD4单克隆抗体不与PLD家族的其它分子交叉反应的事实，可通过使用其中每一个PLD家族被强制表达的细胞来确认。也就是说，通过将编码每一个PLD家族的氨基酸序列的cDNA引入适当的宿主细胞来进行强制表达。将获得的转化细胞与交叉性质待确认的抗-PLD4单克隆抗体接触。如果未显示对表达除PLD4外的PLD家族分子的细胞的结合，则可确认抗体可在免疫学上区分PLD4与其它PLD家族分子。例如，在下文中描述的实例中确认了大多数通过本发明获得的抗-PLD4单克隆抗体不与与PLD4具有特别高的同源性的PLD3和PLD5以及另外的PLD1和PLD2交叉反应。因此，本发明中的单克隆抗体优选为结合PLD4但可能不能检测到其在相同条件下对PLD3,PLD5,PLD1或PLD2的结合的单克隆抗体。如果使用可在免疫学上区分这些PLD家族分子与PLD4的抗体，则可特异性地检测PLD4表达的变化。
可以例如根据流式细胞术原理来确认结合活性待确认的单克隆抗体对每一个种类的细胞的结合。为了通过流式细胞术原理确认抗体的反应性，用产生可检测信号的分子或原子团标记抗体是有利的。一般地，使用荧光标记或发光标记。为了通过流式细胞术的原理分析荧光标记抗体对细胞的结合，可使用荧光激活细胞分选术(FACS)。通过使用FACS，可有效地确认抗体对细胞的多重结合。
具体地，例如，将最初已知能够鉴定pDC的抗体A和待分析对pDC的结合特征的抗体B同时与包括pDC的细胞家族反应。抗体A和抗体B已用可彼此区分它们的荧光信号进行了标记。如果从相同细胞家族检测到两种信号，则可确认这样的抗体结合相同细胞家族。也就是说，发现抗体A和抗体B具有相同结合特征。如果抗体A和抗体B结合不同的细胞家族，则很明显它们的结合特征彼此不同。
本发明的优选单克隆抗体的实例包括例如由杂交瘤mp5B7、mp7B4、mp13D4和mp13H11产生的单克隆抗体。
杂交瘤mp5B7、mp7B4、mp13D4和mp13H11于2012年1月27日在登录号：NITE BP-1211、NITE BP-1212、NITE BP-1213和NITEBP-1214下被保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(NITE)。下面将描述详细说明保藏的内容。
(1)保藏机构的名称和地址
名称：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(NITE)
地址：2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818JAPAN
(2)保藏日期：2012年1月27日
(3)登录号NITE BP-1211(杂交瘤mp5B7)
NITE BP-1212(杂交瘤mp7B4)
NITE BP-1213(杂交瘤mp13D4)
NITE BP-1214(杂交瘤mp13H11)
本发明的单克隆抗体可以是包含其抗原结合区的片段。例如，通过IgG酶促消化产生的包含抗原结合位点的抗体片段可在本发明中用作抗体。具体地，通过用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶进行消化，可获得抗体片段例如Fab或F(ab')2。此外，包含其中植入某一单克隆抗体的互补决定区(CDR)的可变区的免疫球蛋白片段包括在包含抗原结合区的片段中。众所周知，这些抗体片段可用作对抗原具有结合亲和力的抗体分子。或者，可使用通过基因重组构建的抗体，只要其维持抗原结合所必需的活性。通过基因重组构建的抗体的实例包括，例如，嵌合抗体、CDR移植抗体、单链Fv、双特异性抗体(双体)、线性抗体和通过抗体片段形成的多特异性抗体等。基于单克隆抗体获得这样的抗体的方法或产生其的抗体产生性细胞是已知的。
本发明的单克隆抗体可通过使用重组PLD4-Ig融合蛋白或表达人PLD4的转化细胞作为免疫原来获得。即，本发明涉及制备产生结合PLD4细胞外结构域的单克隆抗体的细胞的方法，所述方法包括下列过程。
(1)给免疫动物施用包含PLD4细胞外结构域的外源蛋白的过程，和
(2)从免疫动物的抗体产生性细胞选择产生结合PLD4的抗体的抗体产生性细胞的过程。
可培养这样获得的抗体产生性细胞或抗体产生性细胞的永生化细胞，可从培养物收集期望的单克隆抗体。已知多种方法为用于永生化抗体产生性细胞的方法。
可以例如通过制备其中以可表达的方式保留下文描述的编码包含PLD4细胞外结构域的氨基酸序列的外源性多核苷酸(a)的细胞，来获得在本发明中用作免疫原的转化细胞。
本发明中的外源性多核苷酸是指通过人工引入宿主细胞的多核苷酸。在其中人细胞用作细胞的情况下，将人基因引入人细胞。在这样的组合中，人工引入的多核苷酸也称为外源性多核苷酸。因此，PLD4的异位表达包括在外源性多核苷酸表达中。
本发明的PLD4细胞外结构域是指对应于SEQ ID NO 1中所述的氨基酸序列的细胞外结构域的位置54-506的氨基酸序列。例如，按下列顺序从N末端侧包含每一个区域的氨基酸序列优选在本发明中作为包含PLD4细胞外结构域的氨基酸序列。
[细胞内区域+跨膜结构域+细胞外结构域]
或者，如下描述的部分缺乏细胞内区域的氨基酸序列也包括在本发明的包含PLD4细胞外结构域的氨基酸序列中。
[部分细胞内区域+跨膜结构域+细胞外结构域]
此外，如下描述的缺乏细胞内区域的结构包括在本发明的包含PLD4细胞外结构域的氨基酸序列中。
[跨膜结构域+细胞外结构域]
上述结构中除细胞外结构域外的其它区域可以是选自由SEQ IDNO 1所示的氨基酸序列的序列，或可以是与另一个同源氨基酸序列的组合。例如，构成信号序列、跨膜结构域和细胞内区域的氨基酸序列可用作除PLD4外的PLD家族分子的氨基酸序列。或者，还可组合除人外的其它物种的PLD家族的氨基酸序列。此外，构成除细胞外结构域外的其它区域的氨基酸序列可在其中可维持区域的每一个功能的范围内包含突变。此外，可将其它区域插在所述区域的每一个区域之间。例如，在信号序列与细胞外结构域之间，还可插入表位标记例如FLAG。具体地，信号序列是在蛋白质翻译后转移至细胞膜的步骤中经历加工，随后除去的区域。因此，诱导翻译的蛋白质穿过细胞膜的任意氨基酸序列可用作信号序列。更具体地，PLD4的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)优选作为包含PLD4细胞外结构域的氨基酸序列。
因此，本发明的上述多核苷酸(a)可以是编码构成上述结构[细胞内区域+跨膜结构域+细胞外结构域]的氨基酸序列的任意碱基序列。例如，SEQ ID NO 1的氨基酸序列由SEQ ID NO 44中描述的cDNA碱基序列编码。
作为本发明的免疫原的重组PLD4-Ig融合蛋白可通过将以可表达的方式保留上述多核苷酸的表达载体引入适当的宿主细胞来获得。重组PLD4-Ig融合蛋白的cDNA碱基序列由SEQ ID NO 125表示，氨基酸序列由SEQ ID NO 126表示。
本发明的宿主细胞优选为哺乳动物细胞。具体地，来源于人、猴、小鼠或大鼠的细胞可用作宿主细胞。具体地，人来源的细胞优选作为宿主细胞。例如，HEK-293T细胞为可优选在本发明中用作宿主细胞的人胚胎来源的肾细胞株。HEK-293T细胞可作为ATCC CRL-11268来获得。除此以外，来源于免疫动物的细胞可用作宿主细胞。如果来源于免疫动物的细胞用作免疫原，针对宿主细胞的免疫反应是小的。因此，可有效地获得外源性地表达的抗PLD4细胞外结构域的抗体。因此，例如，当小鼠用作免疫动物时，来源于小鼠的细胞也可用作宿主细胞。
可将上述多核苷酸加载至可在宿主细胞中诱导表达的载体，以转化细胞。可使用可在哺乳动物细胞中诱导表达的商购可得的载体。例如，表达载体例如pCMV-Script(R)载体、pSG5载体(由Stratagene生产的)、pcDNA3.1(由Invitrogen生产的)、pMXs-IP逆转录病毒载体(由Cell BioLabs生产的)等可用于本发明。
将这样获得的转化细胞与另外的组分例如佐剂(必要时)一起给免疫动物施用。作为佐剂，可使用弗氏完全佐剂等。在其中小鼠用作免疫动物的情况下，将纯化的重组PLD4-Ig融合蛋白给BALB/c小鼠施用。作为佐剂，使用完全和不完全弗氏佐剂(由SIGMA生产的)，在第一次以200μg/小鼠施用，在第二次至第四次以50μg/小鼠施用。通常地，间隔性地多次施用免疫原，直至抗体滴度增加。例如，在短时间免疫法的情况下，以2至4天，更具体地3天的间隔施用转化细胞，在施用2至3次后，收集抗体产生性细胞。此外，还可在以每周约1次的间隔施用5至6次后收集抗体产生性细胞。
为了获得本发明的单克隆抗体，克隆收集的抗体产生性细胞。为了进行克隆，优选使抗体产生性细胞永生化。例如，可将以杂交瘤法为代表的细胞融合法或通过Epstein-Barr病毒(EBV)进行的转化用作永生化抗体产生性细胞的方法。
抗体产生性细胞每一个细胞产生一种抗体。因此，如果可建立来源于一个细胞的细胞群(也就是说，克隆)，则可获得单克隆抗体。杂交瘤法是指其中将抗体产生性细胞与适当的细胞株融合、永生化，随后克隆的方法。永生化的抗体产生性细胞可通过方法例如有限稀释法来克隆。许多用于杂交瘤法的细胞株是已知的。这些细胞株在基于淋巴细胞的细胞的永生化效率上是优秀的，并且具有选择细胞融合已获成功的细胞所必需的各种基因标志物。此外，在其中期望获得抗体产生性细胞的情况下，还可使用缺乏抗体产生能力的细胞株。
例如，小鼠骨髓瘤P3x63Ag8.653(ATCC CRL-1580)或P3x63Ag8U.1(ATCC CRL-1597)普遍用作用于小鼠或大鼠的细胞融合法的有用细胞株。一般而言，杂交瘤通过同种的细胞的融合来制备。然而，还可从近缘的异种物种之间的异种杂交瘤获得单克隆抗体。
细胞融合的具体方案是已知的。也就是说，将免疫动物的抗体产生性细胞与适当的融合伴侣混合，和经历细胞融合。作为抗体产生性细胞，可使用脾细胞、从淋巴结收集的淋巴细胞、外周血B细胞等。作为融合伴侣，可使用上述各种细胞株。对于细胞融合，使用聚乙二醇法或电融合法。
随后，基于融合细胞具有的选择标志物选择细胞融合已获成功能的细胞。例如，在其中将HAT敏感性细胞株用于细胞融合的情况下，通过选择在HAT培养基中生长的细胞来选择细胞融合已获成功的细胞。此外，确认由选择的细胞产生的抗体是否具有期望的反应性。
基于抗体的反应性筛选每一个杂交瘤。也就是说，通过上述方法选择产生结合PLD4的抗体的杂交瘤。优选，在其中亚克隆选择的杂交瘤并且期望的抗体的产生最终被确认的情况下，将杂交瘤选择作为产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤。
具体地，可基于与人细胞的反应性或与表达PLD4基因的转化细胞的反应性来选择期望的杂交瘤。可根据免疫测定的原理检测结合细胞的抗体。例如，可将其中将细胞用作抗原的ELISA用于检测期望的抗体。具体地，将杂交瘤的培养上清液与固定人pDC或用作免疫原的转化细胞的载体接触。在其中培养上清液包含期望的抗体的情况下，抗体被固定在载体上的细胞捕获。随后，将固相与培养上清液分离，必需时洗涤，随后可检测被捕获在固相上的抗体。在抗体的检测中，可使用识别抗体的抗体。例如，可利用抗-小鼠免疫球蛋白抗体检测小鼠的抗体。如果识别抗体的抗体已被标记，则其检测非常容易。作为标记，可使用酶、荧光色素、发光色素等。
在另一个方面，作为固定细胞的载体，可使用颗粒或微量滴定板的内壁。塑料制成的颗粒或容器的表面可通过物理吸附固定细胞。例如，聚苯乙烯制成的珠粒或反应容器可用作用于固定细胞的载体。
在选择杂交瘤中，可存在预测的不是抗PLD4抗体的产生，而是针对用作免疫原的转化细胞的宿主细胞的抗体的产生的情况。例如，当如实施例中所示人细胞用作免疫原并且小鼠用作免疫动物时，人细胞被当作外来物质，并且预测产生结合其的抗体。在本发明中，期望获得识别PLD4的抗体。因此，识别除PLD4外的其它人细胞抗原的抗体的获得不是必需的。为了通过筛选排除产生这样的抗体的杂交瘤，可在确认抗体反应性之前初步吸附不期望的抗体。
可利用结合预测存在的抗体的抗原吸附不期望的抗体。具体地，例如，可利用其中可能未检测到PLD4的表达的细胞吸附针对除PLD4外的其它人细胞抗原的抗体。在本发明中，用于免疫原的宿主细胞优选作为用于吸附不期望的抗体的抗原。
必要时，确认经确认具有对抗原的结合活性的单克隆抗体的对pDC的活性的实际影响。可以例如通过下述方法确认对pDC的影响。
可从通过培养产生单克隆抗体的杂交瘤获得的培养物收集本发明的单克隆抗体。可体外或体内培养杂交瘤。在体外培养中，可使用已知的培养基例如RPMI 1640来培养杂交瘤。由杂交瘤分泌的免疫球蛋白积累在培养上清液中。因此，本发明的单克隆抗体可通过收集培养上清液和必要时纯化其来获得。免疫球蛋白的纯化在未添加有血清的培养基中是非常容易的。然而，为了杂交瘤的快速生长和抗体产量的提高，还可向培养基中添加10％左右的胎牛血清。
还可体内培养杂交瘤。具体地，可通过将杂交瘤接种至裸鼠的腹腔中来在腹腔中培养杂交瘤。单克隆抗体在腹水中积累。因此，收集腹水，必要时纯化其，以获得必需的单克隆抗体。取决于目的，可适当地修饰或加工获得的单克隆抗体。
可通过从杂交瘤获得编码抗体的抗原结合区的cDNA，将其插入适当的表达载体来表达本发明的单克隆抗体。用于获得编码抗体的可变区的cDNA并在适当的宿主细胞中表达其的技术是已知的。此外，其中将包含抗原结合区的可变区连接于恒定区以产生嵌合抗体的方法是已知的。例如，可通过将可变区的基因连接于分别编码人IgG1重链恒定区和人Igκ轻链恒定区的基因来产生嵌合抗体。此外，已知可通过将构成可变区的CDR整合入另一个免疫球蛋白分子的框架区来将单克隆抗体的抗原结合活性移植至所述另一个免疫球蛋白。通过使用这样的策略，建立了将异种免疫球蛋白所具有的抗原结合活性移植至人免疫球蛋白的方法。例如，可存在其中将支持CDR的框架区的部分氨基酸序列从小鼠抗体的可变区移植至人可变区的情况。随后，可将人抗体的这些人源化、重建的可变区连接于人抗体的恒定区，以获得人源化抗体。
本发明的优选单克隆抗体的实例包括例如，由分别在登录号：NITE BP-1211、NITE BP-1212、NITE BP-1213和NITE BP-1214下保藏的杂交瘤mp5B7、mp7B4、mp13D4、mp13H11等产生的单克隆抗体。
作为包含可变区的嵌合抗体，或其中构成可变区的CDR是移植的人源化抗体，具有来源于IgG或IgM的恒定区的抗体优选包括在本发明的抗体中。具体地，本发明的抗体更优选为具有如下组合作为构成抗体的可变区的CDR的序列的抗体：
重链CDR1：DYNLH,
CDR2：YIYPYNGNTGYNQKFKR,
CDR3：GGIYDDYYDYAIDY和
轻链CDR1：RASENIYSHIA,
CDR2：GATNLAH,
CDR3：QHFWGTP,
具有如下组合作为构成可变区的CDR的序列的抗体：
重链CDR1：SHYYWT,
CDR2：YISYDGSNNYNPSLKN,
CDR3：EGPLYYGNPYWYFDV和
轻链CDR1：RASQDIDNYLN,
CDR2：YTSRLHS,
CDR3：QQFNTLP,
或具有如下组合作为构成可变区的CDR的序列的抗体：
重链CDR1：SHYYWS,
CDR2：YISYDGSNNYNPSLKN,
CDR3：EGPLYYGNPYWYFDV和
轻链CDR1：RASQDIDNYLN,
CDR2：YTSRLHS,
CDR3：QQFNTLP。
本发明人已确认抗PLD4单克隆抗体对PLD4表达细胞具有CDC作用。因此，具有IgG-或IgM-来源的恒定区的抗体对PLD4表达细胞具有通过CDC作用产生的细胞毒性的作用。这样的抗体用于抑制PLD4表达细胞例如pDC的细胞数目。
识别PLD4的嵌合抗体或人源化抗体可使用编码它们的多核苷酸，通过基因工程来制备。
未获得可特异性识别PLD4的抗体。通过利用本发明的免疫原，已第一次提供了识别PLD4的抗体。也就是说，本发明提供了识别PLD4的抗体，其可通过下述方法来获得。
(1)给免疫动物施用包含PLD4细胞外结构域的蛋白质的过程，
(2)从免疫动物的抗体产生性细胞选择产生结合PLD4的抗体的抗体产生性细胞的过程，和
(3)培养(2)中选择的抗体产生性细胞，从培养物收集识别PLD4的抗体的过程。
已发现PLD4在人pDC中特异性表达。在人pDC中的特异性表达还由本发明人通过利用SAGE的基因表达分析来获得确认。然而，在过去的报导中PLD4表达水平全都基于mRNA来分析。此外，已知PLD4蛋白仅在细胞质中表达。本发明已发现PLD4也在细胞表面上表达。由于未提供可检测PLD4的抗体，因此没有常规地进行蛋白质表达状态的分析。由本发明提供的结合PLD4细胞外结构域的抗体已实现了PLD4蛋白的分析。
如实际上由本发明人确认的，基于本发明的结合PLD4细胞外结构域的单克隆抗体已特异性地检测到人pDC。也就是说，本发明涉及检测浆细胞样树突细胞的方法，其包括步骤：将结合PLD4细胞外结构域的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段与测试细胞接触，随后检测结合细胞的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段。
通过基于本发明的PLD4的检测，可确认一些细胞是否是pDC。也就是说，本发明提供了使用PLD4作为指标鉴定pDC的方法。或者，可基于本发明分离对于其检测到PLD4的细胞，从而分离人pDC。也就是说，本发明提供了使用PLD4作为指标分离pDC的方法。
在本发明中，结合PLD4细胞外结构域的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段可具有标记。例如，可利用发光色素或荧光色素标记其来容易地检测抗体。更具体地，将荧光色素标记的抗体与可能含有pDC的细胞群接触，随后可使用荧光色素作为指标来检测结合本发明的抗体的细胞。此外，如果分离利用荧光色素检测到的细胞，可分离pDC。可根据FACS的原理容易地进行一系列步骤。
或者，还可将本发明的抗体结合于固相载体例如磁珠。结合于固相载体的抗体识别PLD4，从而将pDC捕获在固相载体上。作为其结果，可检测或分离pDC。
基于本发明的pDC检测法所必需的抗体可提供为用于检测pDC的试剂。也就是说，本发明提供了用于检测pDC的试剂，其包含结合PLD4细胞外结构域的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段。在本发明的用于检测pDC的试剂中，除了抗体以外，还可组合阳性对照或阴性对照。例如，可将用作免疫原的表达PLD4细胞外结构域的转化细胞或从人收集的pDC等用作阳性对照。通常地，仅可从外周血获得少量人pDC。因此，转化细胞在本发明的试剂中特别优选作为阳性对照。另一方面，作为阴性对照，可使用不表达PLD4的任意细胞。
也就是说，本发明提供了用于检测人pDC的试剂盒，其包含结合PLD4细胞外结构域的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段。
此外，本发明人分析了结合PLD4细胞外结构域的抗体对pDC的影响。作为其结果，已确认结合PLD4细胞外结构域的抗体抑制pDC活性。也就是说，本发明涉及抑制干扰素生成细胞的活性的方法，其包括将下列组分的任一种与pDC接触的步骤：
(a)结合PLD4并抑制pDC活性的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，和
(b)其中植入单克隆抗体(a)的互补决定区的免疫球蛋白或包含其抗原结合区的片段。
或者，本发明涉及抑制活生物体中的pDC活性的方法，其包括给活生物体施用下列组分的任一种的步骤：
(a)结合PLD4并抑制pDC活性的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，
(b)其中植入单克隆抗体(a)的互补决定区的免疫球蛋白或包含其抗原结合区的片段，和
(c)编码(a)或(b)中描述的组分的多核苷酸。
本发明的pDC是指具有IFN产生能力并且在细胞表面上表达PLD4的细胞。在下文中，除非明确地另有所指，否则pDC不仅是作为树突细胞的前体细胞的细胞，而且还包括具有IFN产生能力和在细胞表面上表达PLD4的细胞。鉴定这样的pDC的方法是已知的。例如，可使用几种细胞表面标志物作为指标区分pDC与其它血液细胞。具体地，人pDC细胞表面标志物的特征谱是如下文中描述的(Shortman,K.和Liu,YJ.Nature Reviews 2：151-161,2002)。近年来，还有报导将BDCA-2阳性细胞指定为pDC(Dzione k,A.等人J.Immunol.165：6037-6046,2000)。
[人pDC的细胞表面抗原的特征谱]
CD4阳性和CDI23阳性，
谱系(CD3、CD14、CD16、CD19、CD20和CD56)阴性，CD11c阴性
因此，具有这些已知标志物的表达特征谱和具有IFN产生能力的细胞也可称为pDC。此外，属于具有与这些标志物的表达特征谱的表达模式不同的特征谱，但具有在活生物体中产生IFN的能力的细胞家族的细胞包括在pDC中。
此外，由人pDC显示的共同特征的实例包括下述特征。
[细胞的形态学特征]
·与浆细胞相似
·具有平滑细胞表面的圆形细胞
·相对大的细胞核
[细胞的功能特征]
·病毒感染时在短时间内产生大量I型IFN
·病毒感染后分化成树突细胞
本发明中pDC活性的抑制是指pDC的至少一个功能的抑制。pDC功能的实例包括IFN产生和细胞存活。细胞存活可另外地被称为细胞数目。因此，这些功能的一个或两个的抑制称为pDC活性的抑制。已发现由pDC产生的I型IFN是各种疾病的原因。因此，pDC细胞数目或INF产生的抑制可用作治疗这样的疾病的策略。
例如，已指出自身免疫疾病的病理状态与IFNα的关系。大部分IFNα由pDC产生。因此，如果其产生被抑制，则可缓解由IFNα引起的病理状态。同时，在本发明中，pDC的INF产生的抑制是指由pDC产生的至少一种IFN的产生的抑制。本发明的IFN优选为I型IFN。在它们当中，IFNα是重要的。
也就是说，本发明涉及IFN产生的抑制剂，其包含结合PLD4细胞外结构域的抗体作为活性成分。或者，本发明提供了抑制IFN产生的方法，其包括施用结合PLD4细胞外结构域的抗体的过程。此外，本发明涉及结合PLD4细胞外结构域的抗体在制备抑制IFN产生的药物组合物中的用途。
在少量细胞中产生大量IFN的细胞包括在pDC中。例如，接受病毒等的刺激的树突细胞的前体细胞产生大部分由活生物体产生的IFN。产生大量IFN的pDC的细胞数目的抑制的结果是导致IFN产生的抑制。因此，pDC细胞数目的抑制也可缓解由IFNα引起的病理状态。
在本发明的优选方面，确认了抗-PLD4单克隆抗体结合PLD4表达细胞，并且通过补体依赖细胞毒性(CDC)作用赋予细胞毒性。CDC作用是抗体药物的重要作用机制之一。本发明的抗-PLD4单克隆抗体还具有通过CDC作用产生的对于PLD4表达细胞例如pDC的强细胞毒性作用。也就是说，在优选方面，可预期抗-PLD4单克隆抗体的不仅通过抑制IFN产生的机制，而且还通过对于pDC的细胞毒性产生的抑制IFN产生的作用。
本发明使用的识别PLD4细胞外结构域的抗体可基于上述方法获得。本发明的抗体可以是任何种类。此外，抗体所源自的生物种类不受限制。此外，包含抗体的抗原结合区的片段可用作抗体。例如，通过IgG的酶促消化产生的包含抗原结合部位的抗体片段可用作本发明的抗体。具体地，抗体片段例如Fab或F(ab')2可通过利用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的消化来获得。众所周知这些抗体片段可用作对抗原具有亲和力的抗体分子。或者，还可使用通过基因重组构建的抗体，只要其维持必需的抗原结合活性。通过基因重组构建的抗体的实例包括嵌合抗体、CDR移植抗体、单链Fv、双特异性抗体(双体)、线性抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体等。基于单克隆抗体获得这些抗体的方法是已知的。
必要时可修饰本发明的抗体。根据本发明，识别PLD4细胞外结构域的抗体具有抑制pDC活性的作用。也就是说，已预见了抗体本身具有对于pDC的细胞毒性的可能性。显示强效应子作用的抗体的亚类是已知的。或者，还可通过用细胞毒性剂修饰抗体来增强抑制pDC活性的作用。细胞毒性剂的实例包括下述试剂。
毒素：假单胞杆菌内毒素(PE)、白喉毒素和篦麻毒素
放射性同位素：Tc99m、Sr89、I131和Y90
抗癌剂：卡奇霉素、丝裂霉素和紫杉醇。
包含蛋白的毒素可通过双功能试剂结合抗体、其片段等。或者，还可用编码抗体的基因缀合编码毒性的基因来产生它们的融合蛋白。将放射性同位素与抗体结合的方法也是已知的。例如，使用螯合剂，利用放射性同位素标记抗体的方法是已知的。此外，可通过使用糖链、双功能试剂等将抗癌剂结合于抗体。
在本发明中，还可将人工地结构修饰的抗体用作活性组分。例如，已知增强抗体的细胞毒性或稳定性的各种修饰。具体地，其中重链的糖链被修饰的免疫球蛋白是已知的(Shinkawa,T.等人J.Biol.Chem.278：3466-3473.2003)。糖链的修饰增强免疫球蛋白的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。
当将结合PLD4细胞外结构域的抗体与pDC接触时，其抑制pDC的活性。因此，这样的抗体可用作抑制pDC活性的试剂，或用于抑制pDC的方法。也就是说，本发明提供了用于抑制pDC活性的试剂，其包含至少一个种类的选自下述(a)至(c)的组分作为活性组分。或者，本发明涉及抑制pDC活性的方法，其包括施用至少一个种类的选自下述(a)至(c)的组分的步骤。此外，本发明涉及至少一个种类的选自下述(a)至(c)的组分用于制备用于调节pDC活性的试剂的用途。
(a)结合PLD4细胞外结构域的抗体或包含其抗原结合区的片段,
(b)其中植入单克隆抗体(a)的互补决定区的免疫球蛋白或包含其抗原结合区的片段。
作为本发明的抑制pDC活性的单克隆抗体，可使用识别PLD4细胞外结构域的单克隆抗体。可将一个种类或多个种类的单克隆抗体用于本发明。例如，可混合多个种类的识别PLD4细胞外结构域的单克隆抗体，将其用于本发明。
可以以下述方式确认抗体具有抑制pDC的IFN产生活性的作用的事实。pDC在病毒刺激后产生大量IFN。在病毒刺激之前、之后或与之同时给pDC提供抗体，将IFN产生能力与其中未给pDC提供抗体的对照相比较。可通过测量pDC培养物的上清液中包含的IFN-α或IFN-β来评价IFN产生能力。作为比较的结果，如果抗体的添加显著地减少了上清液中IFN的量，可确认测试的抗体具有抑制IFN产生活性的作用。测量这些IFN的方法是已知的。pDC是在活生物体中产生大部分IFN的细胞。因此，pDC的IFN产生活性的抑制可在活生物体中调节IFN的产生状态。
本发明的pDC的活性包括pDC细胞数目的维持。因此，本发明的pDC活性的抑制包括pDC细胞数目的抑制。如果确认pDC细胞数目在抗体存在的情况下被抑制，则认为抗体抑制pDC活性。与IFN产生类似，可将来源于与活性待确认的抗体的物种相同的动物物种的无活性免疫球蛋白用作比较的对照。可通过细胞计数来定量比较pDC细胞数目。可用FACS或显微镜来计数细胞数目。
此外，还假定作为病毒感染等的结果pDC分化成称为树突细胞2(DC2)的诱导Th2的细胞。如果病毒刺激后产生IFN的pDC被抑制，则存在至Th2的分化也可被抑制的可能性。因此，还可预期抑制IFN产生的本发明的单克隆抗体具有针对各种过敏性疾病的治疗作用。
在其中给与抗体所源自的生物物种不同的宿主施用识别PLD4细胞外结构域的抗体的情况下，期望将抗体加工成几乎不被宿主识别为外来物质的形式。例如，可通过如下所述加工分子来使免疫球蛋白几乎不被识别为外来物质。下述加工免疫球蛋白分子的方法是已知的。
·从其删除恒定区的包含抗原结合区的片段(MonoclonalAntibodies:Principles and Practice,第3版,Academic Press Limited.l995:Antibody Engineering,A Practical Approach,IRL PRESS,1996)
·利用单克隆抗体的抗原结合区和宿主免疫球蛋白的恒定区构成的嵌合抗体(Gene Expression Experiment Manual,Kodansha Ltd.l994(由Isao ISHIDA和Tamie ANDO编辑的))
·其中用单克隆抗体的CDR置换了宿主免疫球蛋白中的互补决定区(CDR)的CDR置换抗体(Gene Expression Experiment Manual,Kodansha Ltd.1994(由Isao ISHIDA和Tamie ANDO编辑的))
或者，人免疫球蛋白可变区的基因还可通过噬菌体展示法(McCafferty J等人,Nature 348:552-554,1990:Kretzschmar T等人,Curr Opin Biotechnol.2002Dec:13(6)：598-602.)获得。在噬菌体展示法中，将编码人免疫球蛋白可变区的基因整合入噬菌体基因。通过使用不同的免疫球蛋白基因作为来源，还可制备噬菌体文库。噬菌体将可变区表达为构成其本身的蛋白质的融合蛋白。由噬菌体表达在噬菌体表面上的可变区维持对抗原的结合活性。因此，结合抗原或其中表达抗原的细胞等的噬菌体的选择可从噬菌体文库筛选其中表达具有期望的结合活性的可变区的噬菌体。此外，这样选择的噬菌体颗粒保留编码具有期望的结合活性的可变区的基因。也就是说，编码具有期望结合活性的可变区的基因可在噬菌体展示法中使用可变区的结合活性作为指标来获得。
可将根据本发明的用于抑制pDC活性的试剂或抑制pDC活性的方法中的识别PLD4细胞外结构域的抗体或包含至少其抗原结合区的抗体片段以蛋白质或编码蛋白质的多核苷酸的形式进行施用。在施用多核苷酸中，期望使用其中将编码期望的蛋白质的多核苷酸置于适当的启动子控制之下以表达期望的蛋白质的载体。在载体中，还可放置增强子或终止子。保留构成免疫球蛋白的重链和轻链的基因并且可表达免疫球蛋白分子的载体是已知的。可表达免疫球蛋白的载体可通过将其引入细胞来施用。在对活生物体的施用中，可经由施用至活生物体中来感染细胞的载体可就这样直接施用。或者，还可首先将载体引入从活生物体分离的淋巴细胞，随后将其再返还至活生物体内(离体)。
在基于本发明的用于抑制pDC活性的试剂中或抑制pDC活性的方法中给活生物体施用的单克隆抗体的量，通常为作为免疫球蛋白每1kg的体重0.5mg至100mg，例如1mg至50mg，优选2mg至10mg的量。可适当的调整给活生物体施用抗体的间隔，以便可在治疗期间维持免疫球蛋白在生物体中的有效浓度。具体地，可以例如以1至2周的间隔进行施用。施用途径是任意的。本领域技术人员可在治疗中适当地选择有效施用途径。具体地，施用途径的实例包括口服或非口服施用。例如，可通过静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、皮下注射等全身性或局部施用抗体。本发明中用于非口服施用的适当制剂的实例包括注射剂、栓剂、喷雾剂等。此外，在其中给细胞施用免疫球蛋白的情况下，将免疫球蛋白以通常1μg/mL，优选10μg/mL或更高，更优选50μg/mL或更高，更优选0.5mg/mL或更高的浓度施用至培养液。
在本发明的用于抑制pDC活性的试剂或抑制pDC活性的方法中，可通过任何方法将单克隆抗体给活生物体施用。通常地，将单克隆抗体与药学上可接受的载体混合。必要时，可将添加剂例如增稠剂、稳定剂、防腐剂和增溶剂与单克隆抗体混合在一起。这样的载体或添加剂的实例包括乳糖、柠檬酸、硬脂酸、硬脂酸镁、蔗糖、淀粉、滑石、明胶、琼脂、植物油、乙二醇等。称为“药学上可接受的”的术语是指由每一个国家的政府监管机构批准的，或每一个国家的药典或被广泛承认的药典中列出的用于动物、哺乳动物和特别地人的那些。还可以以单次剂量或多份剂量的冻干粉剂或片剂的形式提供本发明的用于抑制pDC活性的试剂。还可在施用前将冻干粉剂或片剂与无菌水、生理盐水或注射用缓冲液组合以将组合物溶解至期望的浓度。
此外，在其中以免疫球蛋白表达载体的形式施用本发明的用于抑制pDC活性的试剂的情况下，用分开的质粒共转染重链和轻链，可以以每1kg体重0.1至10mg，例如，1至5mg的量施用每一种质粒。此外，将1至5μg/106个细胞的载体用于体外引入细胞。在下文中，将基于实施例更具体地解释本发明。
同时，将本说明书中引用的全部现有技术文献通过引用并入本说明书。
尽管将利用下文中的实施例更具体地描述本发明，但本发明绝不限于这样的实施例。
实施例
实施例1
A.PLD4表达的分析
A-1)使用SAGE文库的分析
利用SAGETM(基因表达系列分析)法比较静息pDC、人单核细胞和利用灭活疱疹病毒(HSV-1)处理的活化pDC中的基因表达。分析方法是如下描述的。
从人外周血将单核细胞分离为CD14阳性细胞，利用BDCA-4+分离试剂盒(Miltenyi Biotec公司)和MACS系统(Miltenyi Biotec公司)将人pDC细胞分离为BDCA-4阳性细胞。此外，在灭活的HSV-1存在的情况下培养人pDC细胞12小时，从而制备活化的pDC(pDC+HSV)。从每一种细胞提取总RNA，使用I-SAGETM试剂盒(Invitrogen公司)制备SAGE文库。利用SAGE2000分析软件(Invitrogen公司)分析获得的约100,000个标记的碱基序列的数据。作为其结果，单核细胞/pDC/pDC+HSV的分值为0/9/0基因，也就是说，发现了PLD4(磷脂酶D家族，成员4,C14或f175:GenBank登录号：NM_138790.2)，其为已知的基因，为显示静息pDC细胞特异性表达的基因(图1,Tao等人,Nat.Methods 2(8),591-598(2005):Clark等人,Genome Res.13(10),2265-2270(2003))。PLD4为由SEQ ID NO：44所示的碱基序列编码的506个氨基酸的序列(SEQ IDNO：1)。PLD4蛋白具有两个假定的PDE区域(磷酸二酯酶基序)(由两个在C末端区域中保守的HKD基序(His-x-Lys-x-x-x-x-Asp氨基酸序列，x为其它氨基酸)构成)和假定的磷酸化位点(Thr 472)。PLD4蛋白的结构被预测为II型单变跨膜蛋白。此外，PLD4蛋白在N末端区域不具有PX区域(Phox同源性结构域)和PH区域(Pleckstrin同源性结构域)，所述区域为属于经典PLD家族的PLD1和PLD2所具有(图1和2)。
A-2)通过定量实时PCR进行的人的负责免疫的各种细胞中PLD4mRNA的表达分析。
已特别地检查了PLD4mRNA在血细胞中的表达。从人外周血通过细胞分选器分离和获取每一种细胞。从每一个分离和获取的细胞家族提取RNA，随后合成cDNA。通过使用获得的cDNA作为模板，进行定量实时PCR，分析PLD4mRNA的表达水平。
对于定量实时PCR反应，使用Platinum SYBR Green qPCRSuper Mix-UDG试剂盒(Invitrogen公司)利用ABI PRISM 7000进行定量PCR。将序列检测系统软件(Applied Biosystem公司)用于数据分析。PCR反应条件和使用的引物的碱基序列如下。
PLD4的正向引物：5’ATG GAC TGG CGG TCT CTG 3'(SEQID NO：45)
PLD4的反向引物：5'TGG AAG GTC TTC TCC AGG TC 3'(SEQ ID NO：46)
GAPDH的正向引物：5'AGC CAC ATC GCT CAG ACA C 3'(SEQ ID NO：47)
GAPBH的反向引物：5'GCC CAA TAC GAC CAA ATC C 3'(SEQ ID NO：48)
1个循环，于58℃进行2分钟，
1个循环，于95℃进行10分钟，
50个循环[于95℃进行15秒，和于60℃进行60秒]，
检查了pDC、利用HSV刺激的pDC(pDC+HSV)、B细胞(CD19+细胞)、活化的B细胞(CD19+细胞)、T细胞(CD3+细胞)和利用肌霉素和PMA((12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐)刺激的活化的T细胞。作为结果，显示了PLD4表达在处于静止期的pDC中特别高，在CDI9+B细胞中低。其它人血级分cDNA使用BDTM MTC多组织cDNA板(Multiple Tissue cDNA Panels)(Cat.No.636750,Takara Bio公司)(图5)。
A-3)通过定量实时PCR进行的人组织中PLD4mRNA的表达分析
此外，使用ABI PRISM 7000(Applied Biosystem公司)通过定量PCR检查其它器官或组织中的表达。作为cDNA板，使用BDTM MTC多组织cDNA板(Human I:Cat.No.636742,Human immune:Cat.No.636748:全部来自Takara Bio公司)。使用的引物的碱基序列显示如下。
PLD4的正向引物：5'ATG GAC TGG CGG TCT CTG 3'(SEQID NO：49)
PLD4的反向引物：5'TGG AAG GTC TTC TCC AGG TC 3'(SEQ ID NO：50)
GAPDH的正向引物：5'AGC CAC ATC GCT CAG ACA C 3'(SEQ ID NO：51)
GAPDH反向引物：5'GCC CAA TAC GAC CAA ATC C 3'(SEQID NO：52)
使用Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG试剂盒(Invitrogen公司)利用ABI PRISM 7000进行定量PCR。使用序列检测系统软件(Applied Biosystem公司)进行分析。反应条件描述如下。
步骤1：1个循环，于50℃进行2分钟
步骤2：1个循环，于95℃进行10分钟
步骤3：50个循环，于95℃进行15秒和于60℃进行1分钟
通过利用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的基因表达水平进行标准化来比较每一个组织之间的PLD4基因的表达，已知GAPDH原状稳定地表达。作为其结果，PLD4mRNA在脾和外周血白细胞中显示相对高的表达。此外，已发现PLD4mRNA广泛地在其它组织中表达。然而，PLD4mRNA的表达水平少于静息pDC细胞的表达水平的1/100(图6)。
人PLD4表达载体的制备
进行PLD4基因表达载体的制备以表达人PLD4蛋白。利用EcoRI酶从整合入pCR4-TOPO克隆性载体(Open Biosystem,Cat,No.MHS4771-99610856)的PLD4cDNA克隆仅取出PLD4基因，随后将其整合入pcDNA3.1表达载体(人PLD4-pcDNA3.1载体)。通过使用获得的人PLD4-pcDNA3.1质粒作为模板，利用包含EcoRI、Not I和Kozak序列(GCC GCC ACC)的引物(引物的信息如下所述)扩增PLD4基因。利用pMX-IP逆转录病毒载体(人PLD4-pMX-IP逆转录病毒载体)将PCR产物克隆在EcoRI和Not I位点。在PCR反应中，使用1个单位的KOD Plus DNA聚合酶(TOYOBO公司)，反应条件为1个循环(于94℃进行2分钟)，随后于94℃进行15秒和于68℃进行1分钟30秒的25个循环。
正向引物(SEQ ID NO：53)：5'ttt GAA TTC gcc gcc acc ATGCTG AAG CCT 3'(30-聚体)
反向引物(SEQ ID NO：54)：5'aaa gcg gcc gcT CAG CCC TGCCAA ACG CAG TCC T 3'(34-聚体)
与序列分析一起，利用人PLD4-pMX-IP逆转录病毒瞬时转染HEK(人胚胎肾)-293T细胞(在下文中，293T细胞)，通过细胞染色，随后进行FACS法来确认人PLD4是否在293T细胞的表面上表达。
实施例2
抗-人PLD4抗体的特异性的检查
可利用其中强制表达每一个PLD家族的细胞来确认抗-PLD4单克隆抗体不与PLD家族的其它分子交叉反应的事实。人PLD4属于PLD家族，存在多个具有高度同源性的分子。人PLD4显示与人PLD3的约41％的同源性，和与人PLD5的约29.3％的同源性(图4)。
1)人PLD3和人PLD5的表达载体的制备
对于人PLD3(cDNA SEQ ID NO：55，氨基酸SEQ ID NO：127)和人PLD5(cDNA SEQ ID NO：56，氨基酸SEQ ID NO：123)，利用PCR从整合入pCMV-SPORT6载体的人PLD3克隆(K.K.DNAFORM公司,Cat.No 5189261)，和整合入pCR-Blunt II-TOPO载体的人PLD5克隆(K.K.DNAFORM公司,Cat.No 40025860)仅扩增PLD3和PLD5基因，将每一个基因克隆在Flag-标记的pcDNA3.1(Invitrogen公司)的Hind III和EcoRI位点上，从而制备表达载体(引物的信息是如下描述的)。
(对于人PLD3)
正向引物：huPLD3-IF(Hind III)
序列：5'ttt AAG CTT gcc gcc acc ATG AAG CCT AAA CTGATG TAC 3'(39-聚体)SEQ ID NO：57)
反向引物：huPLD4-1518R(EcoRI)
序列：5'ttt gaa ttc TCA ctt atc gtc gtc atc ctt gta atc GAG CAGGCG GCA GGC GTT GCC 3’(57-聚体)(SEQ ID NO：58)
(对于人PLD5)
正向引物：huPLD5-IF(Hind III)。
序列：5'ttt AAG CTT gcc gcc acc ATG GGA GAG GAT GAGGAT GGA 3'(39-聚体)(SEQ ID NO：59)
反向引物：huPLD5-1383R(EcoRI)
序列：5'ttt gaa ttc TCA ctt atc gtc gtc atc ctt gta atc TAC GTTCCG GGG ATC CTT TCC 3'(57-聚体)(SEQ ID NO：60)
在上述引物序列中，加以下划线的部分代表编码添加的FLAG标签的碱基序列，斜体字类型代表限制性内切酶的Hind III切割位点或EcoRI位点。
与序列分析一起，利用人PLD3-pcDNA3.1载体或人PLD5-pcDNA3.1载体瞬时转染293T细胞，通过细胞染色，随后通过FACS法确认人PLD4是否在293T细胞的表面上表达。
作为其结果，抗体不与其中显示表达人PLB3或人PLD5的细胞反应，这表明这些抗-PLD4抗体特异性识别人PLD4分子(图8)。
人PLD4表达细胞稳定株的制备
将制备的人PLD4-pMX-IP载体与作为逆转录病毒包装载体的pCL-Eco载体(IMGENEX,Cat.No.10045P)一起共转染至293T细胞，从而进行基因引入。基因引入实验使用FuGENE(注册商标)HD转染剂(Roche)作为转染剂。2天后，收集其中分泌了含有人PLD4基因的逆转录病毒的细胞培养上清液，用其感染CT125细胞株(2B4小鼠T细胞淋巴细胞肿瘤细胞系)。根据pMX-IP逆转录病毒载体包含抗嘌呤霉素基因的事实，在嘌呤霉素存在的情况下培养感染的CT125细胞仅允许表达人PLD4的细胞存活，从而导致其选择。通过FACS分选术进一步将已选择的人PLD4表达CT125细胞(在下文中，人PLD4-CT125)选择为仅允许人PLD4的更高表达的CT125细胞，培养所述细胞。为了确定人PLD4表达，利用调整至5μg/mL的商购可得的小鼠抗-人PLD4多克隆抗体(Abnova,Cat#:HOO122618-B01P)对CT125细胞进行染色，随后进行FACS分析。作为其结果，建立了人PLD4-CT125细胞稳定株，将其用于杂交瘤的FACS筛选。
食蟹猴和恒河猴的PLD4表达载体的构建，和人PLD4表达细胞稳定株的制备
为了表达食蟹猴和恒河猴的PLD4蛋白，进行猴PLD4基因的克隆和表达载体的构建。
1)食蟹猴PLD4和恒河猴PLD4基因的克隆
在Genbank数据库(XM_002805227.1)等中报道了恒河猴的PLD4的cDNA序列(但为部分)，其全长cDNA未见报道。此外，由于食蟹猴的PLD4基因序列仍无报导，因此从食蟹猴和恒河猴的PBMC(分别地10mL：SHIN NIPPON BIOMEDICAL LABORATORIES,LTD.)进行基因克隆。
从猴子的外周血提取总RNA，使用寡-dT引物和SuperScriptChoice System for cDNA Synthesis试剂盒从5μg的总RNA合成cDNA。
通过使用制备的cDNA作为模板，使用具有下列碱基序列的引物，利用PCR法扩增食蟹猴PLD4和恒河猴PLD4基因。
正向引物(cynoPLD4-32F)：5'AGA TGC TGA AGC CTC TTCGGA GAG Cg 3'(SEQ ID NO：61)
反向引物(cynoPLD4-1554R)：5'TCA GCC CTG CCA AACGCA GTC CTG G3'(SEQ ID NO：62)
使用1％琼脂糖凝胶通过电泳分离经扩增的食蟹猴PLD4的约1521个碱基对和恒河猴PLD4cDNA片段的l521个碱基对，收集其，使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning试剂盒(Invitrogen公司)将其克隆入pCR4Blunt-TOPO质粒载体(Invitrogen公司)。分析获得的基因的碱基序列，所述序列由SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：124表示。确认了期望的食蟹猴PLD4和恒河猴PLD4基因能够被克隆。
人PLD4蛋白显示与食蟹猴PLD4(SEQ ID NO：129)具有约94.4％的蛋白质序列同一性，和与恒河猴PLD4(SEQ ID NO：130)具有约94％的蛋白质序列同一性。图14举例说明人PLD4与食蟹猴PLD4、恒河猴PLD4和小鼠PLD4(cDNA SEQ ID NO：131，氨基酸SEQ ID NO：132)的蛋白质序列的同源性。
2)食蟹猴PLD4表达细胞稳定株的制备
食蟹猴PLD4表达细胞稳定株通过使用制备的食蟹猴PLD4-pMX-IP载体以与制备人PLD4表达细胞稳定株的方法相同的方法，在嘌呤霉素存在的情况下培养利用逆转录病毒载体感染的CT125细胞来建立。
为了确定食蟹猴的PLD4表达，用商购可得的小鼠抗-人PLD4多克隆抗体(其还代表与猴PLD4的交叉反应性)(Abnova,Cat#：H00122618-B01P)对细胞进行染色，随后进行FACS分析。作为其结果，建立了食蟹猴PLD4-CT125细胞稳定株，将其用于杂交瘤的FACS筛选(图16)。
人PLD4-Ig融合蛋白的制备
为了用作抗-人PLD4单克隆抗体的制备中的免疫原，利用2步PCR法扩增其中融合人PLD4蛋白的细胞外区域(56-506a.a)与小鼠IgG2a Fc片段(包含重链铰链的部分、CH2和CH3的234个a.a)的2142bp的DNA片段，构建人PLD4-Ig pcDNA3.1和人PLD4-Ig pEE14.4的表达载体质粒(cDNA和蛋白质的序列示于序列表中)。
为了从培养上清液获得蛋白质，将Maxi-prep DNA瞬时转染至Freestyle 293F细胞(在下文中，293F细胞，catalog No.R790-07:Invitrogen)。在转染后7天，将共转染的293F细胞的培养液收集在50mL管中，在4℃于2,070g的条件下离心5分钟。利用具有0.45μm孔径的注射器式滤器(catalog No.431220:CORNING)过滤上清液，将培养上清液收集在一起。
利用AKTA-FPLC系统的蛋白A亲和柱纯化收集的细胞培养上清液，纯化重组人PLD4-Ig融合蛋白的蛋白质(图7)。
实施例3
A.抗-人PLD4单克隆抗体的制备
A-1)免疫
使用上述重组PLD4-Ig融合蛋白作为免疫原。将PLD4-Ig融合蛋白皮下施用至3只BALB/c小鼠的背部。将弗氏佐剂(完全和不完全)(SIGMA)用作佐剂，第一次以200μg/小鼠施用，第二至第四次以50μg/小鼠施用。
A-2)抗-血清滴度的确认
在第3次免疫和第4次免疫后收集血液，利用ELISA评估血清中的抗-PLD4-Ig滴度。
将PLD4-Ig融合蛋白固相化于96孔微量滴定板中。将抗血清从1,000倍开始乘3逐步稀释，将稀释系列制备至729,000倍。将每一个样品以50μL添加至抗原固相化的板中，进行初次反应。洗涤后，利用HRP标记抗-小鼠IgG(κ,λ)抗体进行二次反应，随后利用OPD(邻-苯二胺)进行颜色检测(490nm)。
A-3)细胞融合
从对于其抗血清滴度的增加得到验证的小鼠分离脾细胞。利用PEG法融合分离的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(P3U1)，从HAT培养基进行融合脾细胞的选择和培养。
使用CAL-1细胞的杂交瘤的FACS筛选
利用FACS评价产生获自HAT选择培养的融合脾细胞的每一个克隆的抗体。将2×105个人pDC样细胞株CAL-1细胞与50μL的每一个下述杂交瘤的培养上清液在4℃反应15分钟。用FACS缓冲液(1％FBS+PBS)洗涤细胞2次，随后离心，取出上清液。使用PE标记抗-小鼠IgG抗体(BD Bioscience：550589)作为第二抗体在4℃反应20分钟。将从HAT选择培养开始10天后的培养液用作每一个克隆的培养上清液的原始倍数。作为其结果，杂交瘤培养上清液的3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11、14C1和11G9.6与CAL-1细胞良好反应(图11)。
使用人PLD4-CT125稳定细胞株的杂交瘤的FACS筛选
利用FACS评价产生获自HAT选择培养的融合脾细胞的每一个克隆的抗体。将2×105个人PLD4-CT125与50μL的每一个下述杂交瘤的培养上清液在4℃反应15分钟。用FACS缓冲液(1％FBS+PBS)洗涤细胞2次，随后离心，取出上清液。使用PE标记抗-小鼠IgG抗体(BD Bioscience：550589)作为第二抗体在4℃反应20分钟。作为其结果，杂交瘤培养上清液的3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11、14C1和11G9.6与人PLD4-CT125细胞良好反应(图12)。
A-5)使用人外周血pDC的FACS筛选
[人PBMC的分离]
收集20mL的健康个体的外周血，使用HISTOPAQUE-1077(SIGMA公司)利用比重离心机分离外周血单核细胞(PBMC)。将每一个样品的1×106PBMC染色。用FACS缓冲液洗涤细胞，随后添加Fc封闭试剂(Militenyi公司)的5倍稀释物25μL，在4℃反应15分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞，随后添加50μL的每一个杂交瘤的细胞培养上清液和小鼠IgG2b,κ，在4℃反应20分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞，随后添加PE标记抗-小鼠IgG抗体，在4℃反应20分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞，随后添加APC标记抗-BDCA2抗体的10倍稀释物50μL，在4℃反应20分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞，随后将其重悬浮于300μL的FACS缓冲液中，利用FACS Calibur(BD)进行分析。mp11G9.6抗体显示对pDC的结合(图10)。
此外，9个类型的PLD4抗体3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13Hll和14C1显示对于pDC细胞群的特异性结合反应，所述pDC细胞是BDCA2阳性细胞(图13)。
A-6)抗-PLD4抗体对猴的交叉反应性
使用食蟹猴PLD4-CT125稳定细胞株和恒河猴PLD4-293T瞬时转染子细胞的杂交瘤的FACS筛选
利用FACS评价产生获自HAT选择培养的融合脾细胞的每一个克隆的抗体。将2×105个人PLD4-CT125与50μL的每一个下述杂交瘤的培养上清液在4℃反应15分钟。用FACS缓冲液(1％FBS+PBS)洗涤细胞2次，随后离心，取出上清液。使用PE标记抗-小鼠IgG抗体(BD Bioscience：550589)作为第二抗体在4℃反应20分钟。作为其结果，10个类型的PLD4抗体中有7个类型的抗体3B4、5B7、7B4、13D4、13H11、14C1和11G9.6与食蟹猴PLD4-CT125细胞和恒河猴PLD4-293T细胞良好反应(图15，图16和图17)。
A-7)抗-PLD4抗体对猴PBMC的交叉反应性
使用96％Ficoll-Paque(商标)PLUS(GE Healthcare公司,Cat No.17-1440-02)利用比重从外周血(10mL:SHIN NIPPON BIOMEDICALLABORATORIES,LTD.)离心恒河猴的PBMC。对于FACS，每样品使用5×105个细胞。用FACS缓冲液洗涤细胞，随后添加10μL的10％的利用FACS缓冲液稀释的食蟹猴血清，在4℃反应20分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞，随后添加100μL的每一个杂交瘤的细胞培养上清液和10μg/mL的小鼠IgG2a,κ或小鼠IgG1,κ，在4℃反应15分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞，随后添加1μg/mL的APC标记抗-小鼠IgG抗体，在4℃反应20分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞，随后添加FITC标记抗-谱系1抗体、PE标记抗-CD123抗体和PcrCP-Cy5.5标记抗-HLA-DR抗体的10倍稀释物25μL，在4℃进行15分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞，随后重悬浮于300μL的FACS缓冲液中，用FACScalibur进行分析。使用的杂交瘤培养上清液特异于PLD4，选择与CAL-1细胞或人pDC良好结合的10种类型：3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11、14C1和11G9.6。作为其结果，5个类型的杂交瘤细胞培养上清液即5B7、7B4、13D4、13H11和14C1特异性结合食蟹猴的pDC细胞群(谱系-CD123+HLA-DR+)(图18)。
A-8)通过有限稀释法进行的杂交瘤的克隆
1)通过有限稀释法进行的克隆和第2次筛选
为了克隆经选择的9个类型(3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11和14C1)的杂交瘤(除11G9.6杂交瘤外)，进行有限稀释。将有限稀释物接种在2块96孔板上。接种后6天，在显微镜下观察细胞，收集所有孔中作为单克隆来源的并且显示良好生长的培养上清液。以收集的培养上清液作为样品进行FACS分析。
在FACS分析中，使用每一个克隆的培养上清液来对细胞株CAL-1的表面抗原进行染色，随后将PE标记抗-小鼠IgG抗体(BDBioscience：550589)用作第二抗体来染色。作为每一个克隆的培养上清液，将有限稀释物接种后7天的培养液用作原始倍数。
2)克隆和第3次筛选
基于第2次筛选的FACS分析结果和每一个孔中的细胞状态，从每一个克隆选择1个孔，再次进行有限稀释。如2)类似地进行有限稀释，以收集的培养上清液作为样品进行FACS分析(第3次)。基于FACS分析数据等，通过有限稀释法克隆了下列9个类型(3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11和14C1)的克隆，并将抗-人PLD4抗体生成杂交瘤建立为稳定细胞株。
3)至单个11G9.6杂交瘤的转化
收集11G9.6杂交瘤而非上述9个类型，用分选缓冲液(1％FBS/PBS)将其悬浮至1×105个细胞/mL。使用FACS Aria(BD)进行单细胞分选。整合数据，将整合的数据产生为X轴:FSC和Y轴：SSC的二维点阵图。在点阵图上，用门(gate)包围活细胞。将门覆盖以从活细胞门中的细胞排除双联体，分离细胞群体，将其置于96孔平板中至为1个细胞/孔。将单细胞分选后的细胞培养在HAT培养基(RPMI1640+2mM L-谷氨酰胺,10Unit/mL青霉素-链霉素,10mM HEPES,1mM丙酮酸钠,50μM 2-ME)+杂交瘤生长补充剂HFCS(Roche公司)中。随后，使用杂交瘤的细胞培养上清液对CAL-1细胞、人PLD4-CT125表达稳定细胞株、人PBMC和猴PLD4-CT125表达稳定细胞株进行染色，选择单个杂交瘤的11G9.6。
4)冷冻细胞小瓶的制备和培养上清液的收集
基于上述FACS分析结果和每一个孔的细胞状态，从每一个克隆选择1个孔。对于选择的孔，以50mL规模进行扩增培养。培养基为包含10％FCS和青霉素-链霉素的RPMI 1640。将细胞培养至亚汇合，冷冻，以1×106个细胞/管的细胞数目进行保藏。作为用于冷冻和保藏的液体，使用BAMBANKER(NIPPON Genetics,Co.Ltd.)。此外，收集和保藏此时的培养上清液。
实施例4
抗体的纯化
通过使用蛋白A亲和柱(rProtein A Sepharose Fast Flow(catalogNo.17-1279-01,GE Healthcare公司)的纯化从杂交瘤的培养上清液获得10个类型(3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11、14C1和11G9.6)的纯化的抗体。使用Pierce Rapid ELISA Mouse mAbIsotyping试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)确认同种型。作为其结果，3B4和14C1为小鼠IgG1,κ，10C3为小鼠IgG2a,κ，其它为小鼠IgG2b,κ。进行内毒素浓度的测量，因为如果内毒素包含在纯化的抗体中，则其可对性质测定试验的结果具有影响。使用的试剂盒为Endospecy ES-50M set、Toxicolor DIA-MP set和内毒素标准CSE-Lset(SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION公司)。作为其结果，任何纯化的抗体的内毒素浓度为作为参照值的0.3EU/mg或更少的Ab。
纯化的抗体的反应性的检查
利用为人pDC样细胞株的CAL-1细胞确认纯化的抗体的结合能力。作为结果，可确认任何抗体维持对细胞表面上的人PLD4的结合能力(图11)。此外，抗体还特异性结合人外周血的pDC细胞群(BDCA2+)(图13)。
纯化的PLD4抗体的Kd值的计算
对于纯化的抗体的结合能力，将人PLD4-CT125表达稳定细胞株在低浓度至高浓度(0.001μg/mL至30μg/mL)的纯化的PLD4抗体浓度上反应至几乎100％的阳性染色率。使用Graph Pad Prism第5版软件对染色阳性的细胞的频率和抗体进行数据分析，以nM为单位计算解离常数摩尔浓度(Kd值)。根据抗-PLD4抗体的Kd值(nM)都为1nM或更小或差不多1nM(除2个克隆3B4和14C1外)的事实，抗-PLD4抗体非常强地结合人PLD4-CT125细胞(图19)。
实施例5
抗-PLD4抗体对于表达人PLD4-CT125细胞的补体依赖性细胞毒性活性
使用未成熟兔血清作为补体来源针对表达人PLD4的CT125细胞稳定株(在下文中，称为HuPLD4-CT-125)测量抗-PLD4抗体的补体依赖性细胞毒性活性(在下文中，称为CDC活性)。活性的指标为从由细胞释放的乳糖酶脱氢酶(LDH)的测量值计算的细胞毒性。将每一种细胞以2×104个细胞/50μL/孔分配至96孔U底板。在CDC培养基(RPMI1640+0.1％BSA+10mM HEPES+2mM L-谷氨酰胺+1％Pen-Strep)中制备1％幼兔补体(CEDARLANE公司)。给细胞添加10μg/mL的小鼠同种型对照抗体(小鼠IgG2b,κ)和10个类型的抗-PLD4小鼠纯化抗体(3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11、14C1和11G9.6)，反应1小时。关于测定系统，使用CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega公司)试剂盒。作为其结果，对于靶细胞HuPLD4-CT-125，8个类型的PLD4抗体(5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11和11G9.6)在10μg/mL的抗体浓度上显示约33.5％至71.1％的CDC活性(除2个类型的其重链同种型为小鼠IgG1的PLD4抗体3B4和14C外)(图20)。
实施例6
浓度依赖性、补体依赖性细胞毒性活性
将抗-PLD4抗体(11G9.6)的小鼠同种型对照抗体(小鼠IgG2b,κ)、抗-PLD4小鼠抗体(mp11G9.6Ab)、人同种型对照抗体(人IgG1,κ)和抗-PLD4嵌合抗体(ch11G9Ab)调整至0.1μg/mL至30μg/mL的总共6个点的抗体浓度。作为测定系统，使用CytoTox 96Non-RadioactiveCytotoxicity Assay(Promega公司)试剂盒。作为其结果，对于靶细胞HuPLD4-CT-125，mp11G9.6Ab在3μg/mL的抗体浓度上显示约70％的浓度依赖性CDC活性。在另一方面，作为嵌合抗体的ch11G9Ab甚至在30μg/mL的高浓度上显示10％或更小的CDC活性(图21)。
实施例7
嵌合抗体的制备
将10个类型制备为产生小鼠抗-PLD4抗体的杂交瘤，并使用。
1.恒定区的同种型的确认
确认从产生抗-PLD4抗体的杂交瘤产生的小鼠抗-PLD4抗体的恒定区的同种型。使用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)从10个类型(3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11、14C1和11G9.6)的杂交瘤的培养上清液确认同种型。作为其结果，3B4和14C1为小鼠IgG1和小鼠Igκ，10C3为小鼠IgG2a和小鼠Igκ，其它为小鼠IgG2b和小鼠Igκ。
2.编码小鼠抗-PLD4抗体的可变区的cDNA的克隆
2-1)总RNA的分离
按照试剂盒所附说明书，使用商购可得试剂盒"RNeasy Mini试剂盒"(Qiagen公司,catalog No.：74106)从11G9.6杂交瘤分离总RNA。从细胞数目为5×106个的杂交瘤细胞株制备其，获得约79μg总RNA。
2-2)编码小鼠重链可变区的cDNA的扩增和片段化
使用5μg在2-1)中分离的总RNA，通过5’RACE PCR法扩增编码小鼠重链可变区的cDNA。在扩增中，使用商购可得试剂盒"5'RACE System for Rapid Amplification of cDNA ENDs,2.0版试剂盒"(Invitrogen公司,catalog No.：18374-058)。细节如下。首先，通过逆转录酶从2-1)中获得的总RNA合成单链cDNA。此时，使用的反义引物(GSP1)如下。取决于每一条小鼠重链的同种型，不同地使用cDNA扩增中使用的GSP1引物。
例如，在具有小鼠IgG1重链的3B4和14C1杂交瘤的重链可变区的克隆中，使用下列反义引物。
GSP1引物：mu IgG1VH-GSP1
序列：5’-CCA GGA GAG TGG GAG AGG CTC TTC TCAGTA TGG TGG-3’(36-聚体)(SEQ ID NO：64)
GSP2引物：mu IgG1VH-GSP2
序列：5’-GGC TCA GGG AAA TAG CCC TTG ACC AGGCAT CC-3’(32-聚体)(SEQ ID NO：65)
在具有小鼠IgG2a重链的10C3杂交瘤的重链可变区的克隆中，使用下列反义引物。
GSP1引物：mu IgGHγ1-GSP1
序列：5’TCC AGA GTT CCA GGT CAC TGT CAC 3’(24-聚体)(SEQ ID NO：66)
GSP2引物：mu IgGHγ1-GSP2
序列：5’AGG GGC CAG TGG ATA GAC AGA TGG 3’(24-聚体)(SEQ ID NO：67)
在具有小鼠IgG2b重链的5B7、7B4、8C11、11D10、13D4、13H11和11G9.6杂交瘤的重链可变区的克隆中，使用下列反义引物。
GSP1引物：mu IgGHγ2B-GSP1
序列：5’TCC AGA GTT CCA AGT CAC AGT CAC 3’(24-聚体)(SEQ ID NO：68)
GSP2引物：mu IgGHγ2B-GSP2
序列：5’AGG GGC CAG TGG ATA GAC TGA TGG 3’(24-聚体)(SEQ ID NO：69)
此外，使用末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)向单链cDNA的3’末端添加为核苷酸同聚物的dC。随后，使用在3’末端具有与dC(锚定序列)互补的核苷酸聚合物的锚定引物(SEQ ID NO：70)和反义引物(GSP2)通过PCR法扩增cDNA。此外，使用获得的PCR产物作为模板和使用AUAP引物(SEQ ID NO：71)和表1中显示的反义引物(GSP2)，通过巢式PCR法扩增cDNA。此外，通过1.5％的低熔点琼脂糖法纯化该PCR产物。
用于5’RACE的锚定引物(SEQ ID NO：70)
5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGGIIG-3’36-聚体)
用于5’RACE的AUAP引物(SEQ ID NO：71)
5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3’20-聚体)
2-3)编码小鼠轻链可变区的cDNA的扩增和片段化
与2-2)类似地，从在2-1)中分离的总RNA扩增编码小鼠轻链可变区的cDNA。此时，取决于每一条小鼠轻链的同种型，不同地使用用于cDNA扩增的GSP1引物。
由于10个类型的PLD4抗体具有小鼠Igκ轻链，因此将下列反义引物用于轻链克隆。
GSP1引物：mu IgG VLκ-GSP1
序列：5’-CAC TAC TTC CTG TTG AAG CTC TTG ACG ATGG-3’(31-聚体)(SEQ ID NO：72)
GSP2引物：mu IgG VLκ-GSP2
序列：5’-GTG AGT GGC CTC ACA GGT ATA GC-3’(23-聚体)(SEQ ID NO：73)
通过1.5％的低熔点琼脂糖法纯化获得的PCR产物。
2-4)cDNA碱基序列的确认和CDR区的确定
按照试剂盒所附说明书，使用商购可得试剂盒"Zero Blunt TOPOPCR Cloning试剂盒"(Invitrogen公司,catalog No.：1325137)，利用pCR4Blunt-TOPO载体分别克隆2-2)中获得的重链可变区和2-3)中获得的轻链可变区的cDNA片段，将克隆产物转化至大肠杆菌感受态细胞以获得大肠杆菌转化子。从该转化子获得质粒，将质粒DNA样品送至Operon Biotechnology Co.Ltd公司(Tokyo)进行序列分析，确认质粒中的cDNA碱基序列。在序列分析中，使用"Sequencher DNAsequence assembly and analysis软件4.2.2版(Gene CodesCorporation)"和"GENETYX-MAC 11.1.1版软件(GENETYXCORPORATION)"的软件。
提取正确序列的转录物，不包括无活性RNA的转录物(因为移码、无义突变等存在于互补决定区(在下文中称为"CDR区")的周围)。此外，对于质粒中包含的cDNA碱基序列，确认与免疫球蛋白数据库的同源性(IgBLAST,URL：www.ncbi.nlm.nih.gov/Igblast/)，按照Kabat编号系统的分析方法(Kabat等人,1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,National Institutes of Health Publication No.91-3242,第5版,united States Department of Health and HumanServices,Bethesda,MD)，测定每一个可变区中的CDR区(CDR:CDR1、CDR2和CDR3)、FW区(构架区)和可变区的序列。
获得的小鼠11G9.6抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ IDNO：74，氨基酸序列为SEQ ID NO：75。小鼠11G9.6抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
获得的小鼠3B4抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：76，氨基酸序列为SEQ ID NO：77。小鼠3B4抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
获得的小鼠5B7抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：78，氨基酸序列为SEQ ID NO：79。小鼠5B7抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。
获得的小鼠7B4抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：80，氨基酸序列为SEQ ID NO：81。小鼠7B4抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。7B4抗体为具有与5B7抗体的重链和轻链可变区CDR序列相同的重链和轻链可变区CDR序列的抗体。
获得的小鼠8C11抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：82，氨基酸序列为SEQ ID NO：83。小鼠8C11抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：20、SEQID NO：21和SEQ ID NO：22。
获得的小鼠10C3抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：84，氨基酸序列为SEQ ID NO：85。小鼠10C3抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：26、SEQID NO：27和SEQ ID NO：28。
获得的小鼠11D10抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ IDNO：86，氨基酸序列为SEQ ID NO：87。小鼠11D10抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28。11D10抗体为具有与10C3抗体的重链相同的轻链可变区CDR序列的抗体。然而，重链同种型(10C3为小鼠IgG2a的恒定区，11D10为小鼠IgG2b的恒定区)不同。
获得的小鼠13D4抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：88，氨基酸序列为SEQ ID NO：89。小鼠13D4抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：33和SEQ ID NO：34。
获得的小鼠13H11抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ IDNO：90，氨基酸序列为SEQ ID NO：91。小鼠13H11抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40。
获得的小鼠14C1抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：92，氨基酸序列为SEQ ID NO：93。小鼠14C1抗体重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40。14C1抗体为具有与13H11抗体的重链和轻链可变区的CDR序列相同的重链和轻链可变区的CDR序列的抗体。然而，重链同种型(13H11为小鼠IgG2b的恒定区，14C1为小鼠IgG1的恒定区)是不同的。
小鼠11G9.6抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：94，氨基酸序列为SEQ ID NO：95。小鼠11G9.6抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：7。
小鼠3B4抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：96，氨基酸序列为SEQ ID NO：97。小鼠3B4抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。
小鼠5B7抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：98，氨基酸序列为SEQ ID NO：99。小鼠5B7抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19。
小鼠7B4抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：100，氨基酸序列为SEQ ID NO：101。小鼠7B4抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19。
小鼠8C11抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：102，氨基酸序列为SEQ ID NO：103。小鼠8C11抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25。
小鼠10C3抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：104，氨基酸序列为SEQ ID NO：105。小鼠10C3抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31。
小鼠11D10抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：106，氨基酸序列为SEQ ID NO：107。小鼠11D10抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：30和SEQ ID NO：31。
小鼠13D4抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：108，氨基酸序列为SEQ ID NO：109。小鼠13D4抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37。
小鼠13H11抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：100，氨基酸序列为SEQ ID NO：111。小鼠13H11抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：42和SEQ ID NO：43。
小鼠14C1抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：112，氨基酸序列为SEQ ID NO：113。小鼠14C1抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43。
3.嵌合抗体11G9.6的表达载体的制备
3-1.编码人Ig恒定区的cDNA的克隆
按照试剂盒所附说明书，使用商购可得试剂盒"Zero Blunt TOPOPCR Cloning试剂盒"(由Invitrogen公司生产的,catalog No.：1325137)，分别用pCR4Blunt-TOPO载体从人PBMC的总RNA克隆人IgG1重链恒定区和人Igκ轻链恒定区的cDNA，将其转化至大肠杆菌感受态细胞以获得大肠杆菌转化子。从该转化子获得质粒，将质粒DNA样品送至Operon Biotechnology Co.Ltd(Tokyo)进行序列分析，确认质粒中的cDNA碱基序列。
3-2.编码嵌合PLD4抗体的重链的cDNA的制备
通过与具有在2-2中获得的小鼠11G9.6抗体的重链可变区和人IgG1的重链恒定区的pEE6.4载体表达载体的连接来制备编码嵌合PLD4抗体的重链的cDNA。利用PCR法扩增小鼠11G9.6抗体的重链可变区，获得约450个碱基长度的PCR产物。此时，引物是如表1中显示的。通过1.5％的低熔点琼脂糖法纯化获得的PCR产物。
[表1]
表1
将在2-2中获得的小鼠11G9.6抗体的重链可变区经历PCR法来获得"编码11G9.6重链可变区的PCR产物"。利用Hind III和Apa I限制性内切酶消化编码11G9.6的重链可变区的PCR产物，利用1.5％琼脂糖凝胶法进行纯化。将该产物溶解于ddH2O，将其用作编码重链可变区的cDNA片段的溶液。
使用引物chi11G9VH-IF(Hind III)和chi11G9VL-408R，利用PCR从包含11G9.6VH区的pCR4Blunt-TOPO质粒克隆扩增获得的cDNA，其中引入优选用于将嵌合11G9.6的VH编码区克隆至pEE6.4载体(由Lonza Biologics,Slough,UK生产的)的限制性位点(Hind III和Apa I)和理想的Kozak序列(GCCGCCACC)作为Hind III和Apa I的克隆位点。Chi11G9VH-pEE6.4载体包含人IgG1的重链恒定区。使用Hind III和Apa I将VH PCR片段按读框插入pEE6.4载体。通过cDNA碱基序列分析研究构建体。为了进行序列分析，将质粒DNA样品送至Operon Biotechnology Co.Ltd(Tokyo)，确认质粒中的cDNA碱基序列。
3.3编码嵌合PLD4抗体的轻链的cDNA的制备
为了制备编码嵌合PLD4抗体的轻链的cDNA，将2-3中获得的小鼠11G9.6抗体的轻链可变区与在3-2中获得的人Igκ的轻链恒定区融合以产生PCR片段，通过基于重叠延伸PCR法的方法将PCR片段扩增成约730个碱基长度的PCR产物。
利用Hind III和EcoR I限制性内切酶消化编码11G9.6的轻链可变区的PCR产物，随后用1.5％琼脂糖凝胶法进行纯化。将该产物溶解于ddH2O中，将其用作编码轻链可变区的cDNA片段的溶液。
使用引物chi11G9VL-IF(Hind)和chi11G9VL-726R(R I)，利用PCR从包含11G9.6VL区的pCR4Blunt-TOPO质粒克隆扩增获得的编码嵌合11G9的VL的cDNA，其中引入了优选用于pEE14.4载体(由Lonza Biologics生产的)的克隆的限制性位点(Hind III和EcoR I)和理想的Kozak序列。Chi11G9VL-pEE14.4载体包含κ的轻链恒定区。使用Hind III和EcoR I将VL PCR片段按读框插入pEE14.4载体。通过cDNA碱基序列分析研究构建体。
3.4嵌合PLD4抗体(ch11G9VH/VL)的双基因Lonza表达载体的构建
通过标准克隆技术，从嵌合PLD4抗体重链表达载体(chi11G9VH-pEE6.4)和嵌合PLD4抗体轻链载体(chi11G9VL-pEE14.4)构建组合在一个双基因载体中的嵌合PLD4抗体(chi11G9DG载体)Lonza表达载体。
4.293F细胞中的瞬时表达
使用80μg的chillG9DG Lonza载体DNA(瞬时表达载体质粒)。
在转染前一天，在250mL爱伦美氏瓶(catalog No.431144:由CORNING生产的)中将293F细胞以8×105个细胞/mL组合至80mL，随后在振荡的条件下将其在37℃和8％CO2浓度的条件下培养7天。
在培养7天后，将转染的293F细胞的培养液收集至50mL管中，以2,070g的条件在4℃离心5分钟。用具有0.45μm孔径的注射器式滤器(catalog No.431220:由CORNING生产的)过滤上清液，收集培养上清液以用于抗体纯化。
5.抗-PLD4嵌合抗体的纯化
通过使用收集的培养上清液，使用AKTA-FPLC(由GEHealthcare Japan生产的)和软件Unicorn 5.0进行抗体纯化。
作为用于嵌合11G9.6抗体纯化的柱子，使用HiTrap MabSelectSuRe 1mL(catalog No.11-0034-93,Lot No.10032458:由GEHealthcare Japan生产的)。柱子条件如下。使用结合缓冲液(20mM磷酸钠,0.15M NaCl,pH 7.4)和洗脱缓冲液(20mM柠檬酸钠,pH 3.4)进行亲和纯化。为了在纯化后利用PBS替代抗体的缓冲液，使用Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Unit 10kMWCO进行缓冲液交换。
通过测量280nm处的吸光度来计算纯化的抗体的浓度，其中1mg/mL计算为1.38OD。
对于纯化的抗-PLD4嵌合抗体的ch11G9.6Ab，利用流式细胞术和SDS-PAGE分析蛋白质质量。
实施例8
测量制备的抗-人PLD4嵌合抗体(ch11G9.6Ab)的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC活性)。对于该活性，将从由细胞释放的乳糖酶脱氢酶(LDH)的测量值计算的细胞毒性用作指标。使用HISTOPAQUE-1077利用比重离心机纯化变成效应细胞的人外周血单核细胞。作为将为靶的细胞，使用人PLD4基因的利用CHO-K1细胞株(中国仓鼠卵巢细胞株)的强制转化细胞(下文中，HuPLD4-CHO)(2×104/孔)。将效应细胞与靶细胞以10:1、20:1、40:1和80:1的比率混合，添加10mg/mL的ch11G9Ab或同种型对照抗体(人IgG1,κ)，在37℃培养4小时，评价抗体的细胞毒性活性的效应。作为其结果，取决于效应细胞，抗-hPLD4嵌合抗体的ch11G9Ab显示最大约50％左右的对作为靶的HuPLD4-CHO细胞的ADCC活性(图22)。这样的结果证明制备的抗-PLD4嵌合抗体破坏选择性表达PLD4的细胞。
检查抗-PLD4抗体对pDC的作用。纯化来自人外周血的PBMC，将其与10μg/mL抗-人PLD4嵌合抗体混合，培养24小时。随后，利用CpG2216(其为pDC中表达的Toll样受体9的配体)刺激细胞24小时以诱导IFNα产生。在CpG刺激后，测试产生的IFNα的量，确认了IFNα的产生完全被抗-PLD4嵌合抗体的ch11G9Ab的处理抑制(图23)。关于该机制，发现当在ch11G9Ab处理后24小时收集细胞，并用抗-CD123抗体、抗-HLA―DR抗体和抗-谱系1抗体的三重染色确认了pDC细胞时，pDC细胞群相较于同种型对照抗体(人IgG1,κ)的处理减少更多(图24)。这些结果表明抗-PLD4嵌合抗体破坏特异性表达PLD4的pDC，作为其结果，由CpG2216刺激引起的IFNα产生被抑制。
除了ch11G9.6Ab以外，在人原代pDC中检查嵌合抗-PLD4Ab例如ch3B4Ab、ch5B7Ab、ch8C11Ab、ch10C3Ab、ch13D4Ab、ch13H11Ab的生物功能。为了检查pDC的ADCC测定，利用ch3B4Ab、ch5B7Ab、ch8C11Ab、ch10C3Ab、ch13D4Ab、ch13H11Ab、ch11G9.6Ab或同种型Ab培养全人PBMC，进行14h。收获细胞，进行BDCA2和BDCA4染色以通过流式细胞术鉴定pDC。利用嵌合PLD4Ab的处理相较于同种型Ab处理的PBMC完全耗尽pDC(图25)。还测量了具有嵌合抗-PLD4Ab的PBMC的培养物的IFNα产生。利用ch3B4Ab、ch5B7Ab、ch8C11Ab、ch10C3Ab、ch13D4Ab、ch13H11Ab、ch11G9.6Ab或同种型Ab处理全人PBMC。24h后，将可诱导IFNα的CpG2216添加至培养物，将细胞再培养24h。收获培养上清液，通过ELISA测量IFNα的产量。相较于同种型Ab处理的PBMC，所有嵌合PLD4Ab处理的PBMC完全消除了IFNα的产生(图26)。这些结果表明嵌合抗-PLD4Ab通过利用ADCC活性耗尽pDC来消除pDC功能例如大量的IFNα产生。
1.获得的抗-PLD4小鼠11G9.6抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：74，氨基酸序列为SEQ ID NO：75。小鼠11G9.6抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
抗-PLD4小、鼠11G9.6抗体的重链可变区的核酸序列(504bp)[大写字母：小鼠11G9.6VH可变区，小写字母：小鼠IgG2b重链恒定区](SEQ ID NO：74)
ATGAGATCACAGTTCTCTATACAGTTACTGAGCACACAGAACCTCACCTTGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGACTTCAGTGAAAATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCGGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTTATCCTGGTAGTGATAGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGAGGGTGGTTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaagggc
小鼠11G9.6抗体的重链可变区的氨基酸序列(168a.a.)[大写字母：小鼠11G9.6VH可变区，小写字母：小鼠IgG2b重链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)(SEQ ID NO：75)。
MRSQFSIQLLSTQNLTLGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQQPGAELVKPGTSVKMSCKASGYTFTWVKQRPGQGLEWIGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWGQGTSVTVSSakttppsvyplapkg
11G9.6抗体的重链可变区的CDR1
SYWMH(SEQ ID NO：2)
11G9.6抗体的重链可变区的CDR2
DIYPGSDSTNYNEKFKS(SEQ ID NO：3)
11G9.6抗体的重链可变区的CDR3
GGWLDAMDY(SEQ ID NO：4)
获得的抗-PLD4小鼠11G9.6抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：38，氨基酸序列为SEQ ID NO：39。小鼠11G9.6抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42。
抗-PLD4小鼠11G9.6抗体的轻链可变区的核酸序列(421bp)[大写字母：小鼠11G9.6VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区](SEQID NO：94)
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatcaagggcgaat
小鼠11G9.6抗体的轻链可变区的氨基酸序列(140a.a.)[大写字母：小鼠11G9.6VL可变区，小写字母：小鼠Igκ的轻链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)(SEQ ID NO：95)。
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCWYQQKPDGTVKLLIYGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC TFGGGTKLEIKradaaptvsikge
11G9.6抗体的轻链可变区的CDR1
RASQDISNYLN(SEQ ID NO：5)
11G9.6抗体的轻链可变区的CDR2
YTSRLHS(SEQ ID NO：6)
11G9.6抗体的轻链可变区的CDR3
QQGNTLPW(SEQ ID NO：7)
2.获得的抗-PLD4小鼠3B4抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：76，氨基酸序列为SEQ ID NO：77。小鼠3B4抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
抗-PLD4小鼠3B4抗体的重链可变区的核酸序列(437bp)[大写字母：小鼠3B4VH可变区，小写字母：小鼠IgG1重链恒定区]
ATGGAATGTAACTGGATACTTCCTTTTATTCTGTCGGTAATTTCAGGGGTCTCCTCAGAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGACTGTGCTGTCAAGGCCTGGGGCTTCCGTGACGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCGACAGCTTTACCACCTACTGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTAGAATGGATTGGTGCTATCTATCCTGGAAATAGTGAAACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCAAACTGACTGCAGTCACATCCGCCAGCACTGCCTATATGGAGTTCACTAGCCTGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACGGGGGGTTATTCCGACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAgccaaaacgacacccccatctgtctatccact
小鼠3B4抗体的重链可变区的氨基酸序列(145a.a.)[大写字母：小鼠3B4VH可变区，小写字母：小鼠IgG1重链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。
MECNWILPFILSVISGVSSEVQLQQSGTVLSRPGASVTMSCKASGDSFTWVKQRPGQGLEWIGKAKLTAVTSASTAYMEFTSLTNEDSAVYYCTGGYSDFDYWGQGTTLTVSSakttppsvyp
3B4抗体的重链可变区的CDR1
TYWMH
3B4抗体的重链可变区的CDR2
AIYPGNSETSYNQKFKG
3B4抗体的重链可变区的CDR3
GYSDFDY
获得的抗-PLD4小鼠3B4抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQID NO：96，氨基酸序列为SEQ ID NO：97。小鼠3B4抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。
抗-PLD4小鼠3B4抗体的轻链可变区的核酸序列(459bp)[大写字母：小鼠3B4VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区]
ATGATGGTCCTTGCTCAGTTTCTTGCATTCTTGTTGCTTTGGTTTCCAGGTGCAGGATGTGACATCCTGATGACCCAATCTCCATCCTCCATGTCTGTATCTCTGGGAGACACAGTCAGCATCACTTGCCATGCAAGTCAGGGCATTAGAAGTAATATAGGGTGGTTGCAGCAGAAACCAGGGAAATCATTTAAGGGCCTGATCTTTCATGGAACCAACTTGGAAGATGGAGTTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGAGGATCTGGAGCAGATTATTCTCTCACCATCAACAGCCTGGAATCTGAAGATTTTGCAGACTATTACTGTGTACAGTATGTTCAGTTTCCTCCAACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAGAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtg
小鼠3B4抗体的轻链可变区的氨基酸序列(153a.a.)[大写字母：小鼠3B4VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。
MMVLAQFLAFLLLWFPGAGCDILMTQSPSSMSVSLGDTVSITCWLQQKPGKSFKGLIFGVPSRFSGRGSGADYSLTINSLESEDFADYYCPTFGSGTKLEIRradaaptvsifppsseqltsggasvv
3B4抗体的轻链可变区的CDR1
HASQGIRSNIG
3B4抗体的轻链可变区的CDR2
HGTNLED
3B4抗体的轻链可变区的CDR3
VQYVQFP
3.获得的抗-PLD4小鼠5B7抗体的重链可变区的核酸序列为SEQID NO：78，氨基酸序列为SEQ ID NO：79。小鼠5B7抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。
抗-PLD4小鼠5B7抗体的重链可变区的核酸序列(475bp)[大写字母：小鼠5B7VH可变区，小写字母：小鼠IgG2b重链恒定区]
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGCGTCCACTCTGAGGTCCAGCTTCAGCAGTCAGGACCTGAACTGGTGAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACTTGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTTATCCTTACAATGGTAATACTGGCTACAACCAGAAGTTCAAGAGGAAGGCCACATTGACTGTAGACAATTCCTCCGGCACAGTCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGGAGGGATCTATGATGATTACTACGACTATGCTATCGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaagggcgaat
小鼠5B7抗体的重链可变区的氨基酸序列(158a.a.)[大写字母：小鼠5B7VH可变区，小写字母：小鼠IgG2b重链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。
MGWSWIFLFLLSGTAGVHSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTWVKQSHGKSLEWIGKATLTVDNSSGTVYMELRSLTSEDSAVYYCARWGQGTSVTVSSakttppsvyplapkge
5B7抗体的重链可变区的CDR1
DYNLH
5B7抗体的重链可变区的CDR2
YIYPYNGNTGYNQKFKR
5B7抗体的重链可变区的CDR3
GGIYDDYYDYAIDY
获得的抗-PLD4小鼠5B7抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQID NO：98，氨基酸序列为SEQ ID NO：99。小鼠5B7抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19。
抗-PLD4小鼠5B7抗体的轻链可变区的核酸序列(467bp)[大写字母：小鼠5B7VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区]
ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGATGCCAGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCGCCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTCATATAGCATGGTATCAGCAGAAAGAGGGAAAATCTCCTCAGCGCCTGGTCTATGGTGCAACAAACTTAGCACATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTTCAGTCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttctt
小鼠5B7抗体的轻链可变区的氨基酸序列(155a.a.)[大写字母：小鼠5B7VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。
MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPASLSVSVGETVAITCWYQQKEGKSPQRLVYGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYYC WTFGGGTKLEIKradaaptvsifppsseqltsggasvvcf
5B7抗体的轻链可变区的CDR1
RASENIYSHIA
5B7抗体的轻链可变区的CDR2
GATNLAH
5B7抗体的轻链可变区的CDR3
QHFWGTP
4.获得的抗-PLD4小鼠7B4抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：80，氨基酸序列为SEQ ID NO：81。小鼠7B4抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。
抗-PLD4小鼠7B4抗体的重链可变区的核酸序列(470bp)[大写字母：小鼠7B4VH可变区，小写字母：小鼠IgG2b重链恒定区]
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGCGTCCACTCTGAGGTCCAGCTTCAGCAGTCAGGACCTGAACTGGTGAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACTTGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTTATCCTTACAATGGTAATACTGGCTACAACCAGAAGTTCAAGAGGAAGGCCACATTGACTGTAGACAATTCCTCCGGCACAGTCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGGAGGGATCTATGATGATTACTACGACTATGCTATCGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaaggg
小鼠7B4抗体的重链可变区的氨基酸序列(156a.a.)[大写字母：小鼠7B4VH可变区，小写字母：小鼠IgG2b重链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。
MGWSWIFLFLLSGTAGVHSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTWVKQSHGKSLEWIGKATLTVDNSSGTVYMELRSLTSEDSAVYYCARWGQGTSVTVSSakttppsvyplapk
7B4抗体的重链可变区的CDR1
DYNLH
7B4抗体的重链可变区的CDR2
YIYPYNGNTGYNQKFKR
7B4抗体的重链可变区的CDR3
GGIYDDYYDYAIDY
获得的抗-PLD4小鼠7B4抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQID NO：100，氨基酸序列为SEQ ID NO：101。小鼠7B4抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19。
抗-PLD4小鼠7B4抗体的轻链可变区的核酸序列(454bp)[大写字母：小鼠7B4VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区]
ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGATGCCAGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCGCCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTCATATAGCATGGTATCAGCAGAAAGAGGGAAAATCTCCTCAGCGCCTGGTCTATGGTGCAACAAACTTAGCACATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTTCAGTCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcag
小鼠7B4抗体的轻链可变区的氨基酸序列(151a.a.)[大写字母：小鼠7B4VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。
MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPASLSVSVGETVAITCWYQQKEGKSPQRLVYGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYYC WTFGGGTKLEIKradaaptvsifppsseqltsggas
7B4抗体的轻链可变区的CDR1
RASENIYSHIA
7B4抗体的轻链可变区的CDR2
GATNLAH
7B4抗体的轻链可变区的CDR3
QHFWGTP
5.获得的抗-PLD4小鼠8C11抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：82，氨基酸序列为SEQ ID NO：83。小鼠8C11抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22。
抗-PLD4小鼠8C11抗体的重链可变区的核酸序列(462bp)[大写字母：小鼠8C11VH可变区，小写字母：小鼠IgG2b重链恒定区]
ATGGGATGGAGCTATATCATCCTCTTTTTGGTAGCAACAGCAACAGGGGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGTCGGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTATTTGTACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGACTGATTAATCCTACCAATAGTGATACTATCTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACACGAGAGGGGGGATATGGTTACGGCCCGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaagggc
小鼠7B4抗体的重链可变区的氨基酸序列(154a.a.)[大写字母：小鼠8C11VH可变区，小写字母：小鼠IgG2b重链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。
MGWSYIILFLVATATGVHSQVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTWVRQRPGQGLEWIGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRWGQGTLVTVSAakttppsvyplapkg
8C11抗体的重链可变区的CDR1
SYYLY
8C11抗体的重链可变区的CDR2
LINPTNSDTIFNEKFKS
8C11抗体的重链可变区的CDR3
EGGYGYGPFAY
获得的抗-PLD4小鼠8C11抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQID NO：102，氨基酸序列为SEQ ID NO：103。小鼠8C11抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25。
抗-PLD4小鼠8C11抗体的轻链可变区的核酸序列(457bp)[大写字母：小鼠8C11VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区]
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCACATCTAGTCAGACCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCACAGTACACATGTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggag
小鼠8C11抗体的轻链可变区的氨基酸序列(152a.a.)[大写字母：小鼠8C11VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCWYLQKPGQSPKLLIYGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC FTFGSGTKLEIKradaaptvsifppsseqltsg
8C11抗体的轻链可变区的CDR1
TSSQTLVHSNGNTYLH
8C11抗体的轻链可变区的CDR2
KVSNRFS
8C11抗体的轻链可变区的CDR3
HSTHVP
6.获得的抗-PLD4小鼠10C3抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：84，氨基酸序列为SEQ ID NO：85。小鼠10C3抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28。
抗-PLD4小鼠10C3抗体的重链可变区的核酸序列(450bp)[大写字母：小鼠10C3VH可变区，小写字母：小鼠IgG2a重链恒定区]
ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGCCCTCATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAGGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGCTATGGCATGTCTTGGTTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTTACATCTACTATCCAGAAAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTATTGTGTAAGACTCTACGGTGGTAGGAGAGGCTATGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacagccccatcggtctatcca
小鼠10C3抗体的重链可变区的氨基酸序列(150a.a.)[大写字母：小鼠10C3VH可变区，小写字母：小鼠IgG2a重链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。
MNFGLSLIFLALILKGVQCEVQLVESGGDLVRPGGSLKLSCAASGFSFSWFRQTPDKRLEWVARFTISRDNARNILYLQMSSLKSEDTAMYYCVRWGQGTSVTVSSakttapsvyp
10C3抗体的重链可变区的CDR1
SYGMS
10C3抗体的重链可变区的CDR2
TISSGGSYIYYPESVKG
10C3抗体的重链可变区的CDR3
LYGGRRGYGLDY
获得的抗-PLD4小鼠10C3抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQID NO：104，氨基酸序列为SEQ ID NO：105。小鼠10C3抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31。
抗-PLD4小鼠10C3抗体的轻链可变区的核酸序列(423bp)[大写字母：小鼠10C3VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区]
ATGAGGTTCTCTGCTCAGCTTCTGGGGCTGCTTGTGCTCTGGATCCCTGGATCCACTGCGGAAATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTGATGGCATCACTTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTACACGTTCCGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatc
小鼠10C3抗体的轻链可变区的氨基酸序列(141a.a.)[大写字母：小鼠10C3VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。
MRFSAQLLGLLVLWIPGSTAEIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCWYLQKPGQSPQLLIYGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYC YTFGGGTKLEIKradaaptvsi
10C3抗体的轻链可变区的CDR1
RSSKSLLHSDGITYLY
10C3抗体的轻链可变区的CDR2
QMSNLAS
10C3抗体的轻链可变区的CDR3
AQNLEL
7.获得的抗-PLD4小鼠11D10抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：86，氨基酸序列为SEQ ID NO：87。小鼠11D10抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28。
抗-PLD4小鼠11D10抗体的重链可变区的核酸序列(450bp)[大写字母：小鼠11D10VH可变区，小写字母：小鼠IgG2b重链恒定区]
ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGCCCTCATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAGGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGCTATGGCATGTCTTGGTTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTTACATCTACTATCCAGAAAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTATTGTGTAAGACTCTACGGTGGTAGGAGAGGCTATGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatcca
小鼠11D10抗体的重链可变区的氨基酸序列(150a.a.)[大写字母：小鼠11D10VH可变区，小写字母：小鼠IgG2b重链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。
MNFGLSLIFLALILKGVQCEVQLVESGGDLVRPGGSLKLSCAASGFSFSWFRQTPDKRLEWVARFTISRDNARNILYLQMSSLKSEDTAMYYCVRWGQGTSVTVSS akttppsvyp
11D10抗体的重链可变区的CDR1
SYGMS
11D10抗体的重链可变区的CDR2
TISSGGSYIYYPESVKG
11D10抗体的重链可变区的CDR3
LYGGRRGYGLDY
获得的抗-PLD4小鼠11D10抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQID NO：106，氨基酸序列为SEQ ID NO：107。小鼠11D10抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31。
抗-PLD4小鼠11D10抗体的轻链可变区的核酸序列(423bp)[大写字母：小鼠11D10VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区]
ATGAGGTTCTCTGCTCAGCTTCTGGGGCTGCTTGTGCTCTGGATCCCTGGATCCACTGCGGAAATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTGATGGCATCACTTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatc
小鼠11D10抗体的轻链可变区的氨基酸序列(141a.a.)[大写字母：小鼠11D10VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。
MRFSAQLLGLLVLWIPGSTAEIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCWYLQKPGQSPQLLIYGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYC YTFGGGTKLEIKradaaptvsi
11D10抗体的轻链可变区的CDR1
RSSKSLLHSDGITYLY
11D10抗体的轻链可变区的CDR2
QMSNLAS
11D10抗体的轻链可变区的CDR3
AQNLEL
8.获得的抗-PLD4小鼠13D4抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：88，氨基酸序列为SEQ ID NO：89。小鼠13D4抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34。
抗-PLD4小鼠13D4抗体的重链可变区的核酸序列(472bp)[大写字母：小鼠13D4VH可变区，小写字母：小鼠IgG2b重链恒定区]
ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAATCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTCATTATTACTGGACCTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATAAGCTACGACGGTAGCAATAACTACAACCCATCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATAACTGTGCAAGAGAGGGCCCGCTCTACTATGGTAACCCCTACTGGTATTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaagggcg
小鼠13D4抗体的重链可变区的氨基酸序列(157a.a.)[大写字母：小鼠13D4VH可变区，小写字母：小鼠IgG2b重链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。
MKVLSLLYLLTAIPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITWIRQFPGNKLEWMGRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYNCARWGAGTTVTVSSakttppsvyplapkg
13D4抗体的重链可变区的CDR1
SHYYWT
13D4抗体的重链可变区的CDR2
YISYDGSNNYNPSLKN
13D4抗体的重链可变区的CDR3
EGPLYYGNPYWYFDV
获得的抗-PLD4小鼠13D4抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQID NO：108，氨基酸序列为SEQ ID NO：109。小鼠13D4抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37。
抗-PLD4小鼠13D4抗体的轻链可变区的核酸序列(404bp)[大写字母：小鼠13D4VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区]
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGGGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTGACAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATGTTGCCACTTACTTTTGCCAGCAGTTTAATACGCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAAcgggctgatgctgcaccaactgt
小鼠13D4抗体的轻链可变区的氨基酸序列(134a.a.)[大写字母：小鼠13D4VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCWYQQKPDGTVKLLIYGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDVATYFCRTFGGGTKLEIKradaapt
13D4抗体的轻链可变区的CDR1
RASQDIDNYLN
13D4抗体的轻链可变区的CDR2
YTSRLHS
13D4抗体的轻链可变区的CDR3
QQFNTLP
9.获得的抗-PLD4小鼠13H11抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：90，氨基酸序列为SEQ ID NO：91。小鼠13H11抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40。
抗-PLD4小鼠13H11抗体的重链可变区的核酸序列(471bp)[大写字母：小鼠13H11VH可变区，小写字母：小鼠IgG2b重链恒定区]
ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCTCCAGTCATTATTACTGGAGTTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAGACTGGAATGGATGGGCTACATAAGCTACGACGGTAGCAATAACTACAACCCATCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATAACTGTGCAAGAGAGGGCCCGCTCTACTATGGTAACCCCTACTGGTATTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaagggc
小鼠13H11抗体的重链可变区的氨基酸序列(157a.a.)[大写字母：小鼠13H11VH可变区，小写字母：小鼠IgG2b重链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。
MKVLSLLYLLTAIPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSISWIRQFPGNRLEWMGRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYNCAR WGAGTTVTVSSakttppsvyplapkg
13H11抗体的重链可变区的CDR1
SHYYWS
13H11抗体的重链可变区的CDR2
YISYDGSNNYNPSLKN
13H11抗体的重链可变区的CDR3
EGPLYYGNPYWYFDV
获得的抗-PLD4小鼠13H11抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQID NO：110，氨基酸序列为SEQ ID NO：111。小鼠13H11抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43。
抗-PLD4小鼠13H11抗体的轻链可变区的核酸序列(414bp)[大写字母：小鼠13H11VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区]
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGGGGCAGCGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTGACAATTATTTAAACTGGTATCAGCAAAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAACAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGTTTAATACGCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttc
小鼠13H11抗体的轻链可变区的氨基酸序列(138a.a.)[大写字母：小鼠13H11VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGGSVTISCWYQQKPDGTVKLLIYGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCRTFGGGTKLEIKradaaptvsif
13H11抗体的轻链可变区CDR1
RASQDIDNYLN
13H11抗体的轻链可变区CDR2
YTSRLHS
13H11抗体的轻链可变区CDR3
QQFNTLP
10.获得的抗-PLD4小鼠14C1抗体的重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO：92，氨基酸序列为SEQ ID NO：93。小鼠14C1抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40。
抗-PLD4小鼠14C1抗体的重链可变区的核酸序列(470bp)[大写字母：小鼠14C1VH可变区，小写字母：小鼠IgG1重链恒定区]
ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCTCCAGTCATTATTACTGGAGTTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAGACTGGAATGGATGGGCTACATAAGCTACGACGGTAGCAATAACTACAACCCATCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATAACTGTGCAAGAGAGGGCCCGCTCTACTATGGTAACCCCTACTGGTATTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctaaggg
小鼠14C1抗体的重链可变区的氨基酸序列(156a.a.)[大写字母：小鼠14C1VH可变区，小写字母：小鼠IgG1重链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。
MKVLSLLYLLTAIPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSISWIRQFPGNRLEWMGRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYNCAR WGAGTTVTVSS akttppsvyplapk
14C1抗体的重链可变区的CDR1
SHYYWS
14C1抗体的重链可变区的CDR2
YISYDGSNNYNPSLKN
14C1抗体的重链可变区的CDR3
EGPLYYGNPYWYFDV
获得的抗-PLD4小鼠14C1抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQID NO：112，氨基酸序列为SEQ ID NO：113。小鼠14C1抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43。
抗-PLD4小鼠14C1抗体的轻链可变区的核酸序列(465bp)[大写字母：小鼠14C1VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区]
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGGGGCAGCGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTGACAATTATTTAAACTGGTATCAGCAAAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAACAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGTTTAATACGCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttc
小鼠14C1抗体的轻链可变区的氨基酸序列(155a.a.)[大写字母：小鼠14C1VL可变区，小写字母：小鼠Igκ轻链恒定区]。加以下划线的序列代表信号序列，双下划线代表CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGGSVTISCWYQQKPDGTVKLLIYGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCRTFGGGTKLEIKradaaptvsifppsseqltsggasvvcf
14C1抗体的轻链可变区的CDR1
RASQDIDNYLN
14C1抗体的轻链可变区的CDR2
YTSRLHS
14C1抗体的轻链可变区的CDR3
QQFNTLP
制备的嵌合11G9抗体的重链和轻链的碱基序列和氨基酸序列分别是下列序列号。
重链
SEQ ID NO：120(碱基序列)
SEQ ID NO：121(氨基酸序列)
轻链
SEQ ID NO：122(碱基序列)
SEQ ID NO：123(氨基酸序列)
11.抗-PLD4嵌合11G9抗体的重链的核酸序列(1401bp)[大写字母：嵌合11G9VH可变区，小写字母：人IgG1重链恒定区](SEQ IDNO：120)
ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTcagGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGACTTCAGTGAAAATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCGGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTTATCCTGGTAGTGATAGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGAGGGTGGTTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
12.抗-PLD4嵌合11G9抗体的重链的氨基酸序列(466a.a.)[大写字母：嵌合11G9VH可变区，小写字母：人IgG1重链恒定区](SEQ IDNO：121)
MKVLSLLYLLTAIPGILSQVQLQQPGAELVKPGTSVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGDIYPGSDSTNYNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGWLDAMDYWGQGTSVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
13.抗-PLD4嵌合11G9抗体的轻链的核酸序列(705bp)[大写字母：嵌合11G9VL可变区，小写字母：人Igκ轻链恒定区](SEQ IDNO：122)
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgctag
14.抗-PLD4嵌合11G9抗体的轻链的氨基酸序列(234a.a.)[大写字母：嵌合11G9VL可变区，小写字母：人Igκ轻链恒定区](SEQ IDNO：123)
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLETKrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
PLD4-相关分子的cDNA和蛋白质的序列
>人PLD4cDNA(1521bp)(SEQ ID NO：44)
ATGCTGAAGCCTCTTTGGAAAGCAGCAGTGGCCCCCACATGGCCATGCTCCATGCCGCCCCGCCGCCCGTGGGACAGAGAGGCTGGCACGTTGCAGGTCCTGGGAGCGCTGGCTGTGCTGTGGCTGGGCTCCGTGGCTCTTATCTGCCTCCTGTGGCAAGTGCCCCGTCCTCCCACCTGGGGCCAGGTGCAGCCCAAGGACGTGCCCAGGTCCTGGGAGCATGGCTCCAGCCCAGCTTGGGAGCCCCTGGAAGCAGAGGCCAGGCAGCAGAGGGACTCCTGCCAGCTTGTCCTTGTGGAAAGCATCCCCCAGGACCTGCCATCTGCAGCCGGCAGCCCCTCTGCCCAGCCTCTGGGCCAGGCCTGGCTGCAGCTGCTGGACACTGCCCAGGAGAGCGTCCACGTGGCTTCATACTACTGGTCCCTCACAGGGCCTGACATCGGGGTCAACGACTCGTCTTCCCAGCTGGGAGAGGCTCTTCTGCAGAAGCTGCAGCAGCTGCTGGGCAGGAACATTTCCCTGGCTGTGGCCACCAGCAGCCCGACACTGGCCAGGACATCCACCGACCTGCAGGTTCTGGCTGCCCGAGGTGCCCATGTACGACAGGTGCCCATGGGGCGGCTCACCAGGGGTGTTTTGCACTCCAAATTCTGGGTTGTGGATGGACGGCACATATACATGGGCAGTGCCAACATGGACTGGCGGTCTCTGACGCAGGTGAAGGAGCTTGGCGCTGTCATCTATAACTGCAGCCACCTGGCCCAAGACCTGGAGAAGACCTTCCAGACCTACTGGGTACTGGGGGTGCCCAAGGCTGTCCTCCCCAAAACCTGGCCTCAGAACTTCTCATCTCACTTCAACCGTTTCCAGCCCTTCCACGGCCTCTTTGATGGGGTGCCCACCACTGCCTACTTCTCAGCGTCGCCACCAGCACTCTGTCCCCAGGGCCGCACCCGGGACCTGGAGGCGCTGCTGGCGGTGATGGGGAGCGCCCAGGAGTTCATCTATGCCTCCGTGATGGAGTATTTCCCCACCACGCGCTTCAGCCACCCCCCGAGGTACTGGCCGGTGCTGGACAACGCGCTGCGGGCGGCAGCCTTCGGCAAGGGCGTGCGCGTGCGCCTGCTGGTCGGCTGCGGACTCAACACGGACCCCACCATGTTCCCCTACCTGCGGTCCCTGCAGGCGCTCAGCAACCCCGCGGCCAACGTCTCTGTGGACGTGAAAGTCTTCATCGTGCCGGTGGGGAACCATTCCAACATCCCATTCAGCAGGGTGAACCACAGCAAGTTCATGGTCACGGAGAAGGCAGCCTACATAGGCACCTCCAACTGGTCGGAGGATTACTTCAGCAGCACGGCGGGGGTGGGCTTGGTGGTCACCCAGAGCCCTGGCGCGCAGCCCGCGGGGGCCACGGTGCAGGAGCAGCTGCGGCAGCTCTTTGAGCGGGACTGGAGTTCGCGCTACGCCGTCGGCCTGGACGGACAGGCTCCGGGCCAGGACTGCGTTTGGCAGGGCTGA
>人PLD4蛋白(506个氨基酸)(SEQ ID NO：1)
MLKPLWKAAVAPTWPCSMPPRRPWDREAGTLQVLGALAVLWLGSVALICLLWQVPRPPTWGQVQPKDVPRSWEHGSSPAWEPLEAEARQQRDSCQLVLVESIPQDLPSAAGSPSAQPLGQAWLQLLDTAQESVHVASYYWSLTGPDIGVNDSSSQLGEALLQKLQQLLGRNISLAVATSSPTLARTSTDLQVLAARGAHVRQVPMGRLTRGVLHSKFWVVDGRHIYMGSANMDWRSLTQVKELGAVIYNCSHLAQDLEKTFQTYWVLGVPKAVLPKTWPQNFSSHFNRFQPFHGLFDGVPTTAYFSASPPALCPQGRTRDLEALLAVMGSAQEFIYASVMEYFPTTRFSHPPRYWPVLDNALRAAAFGKGVRVRLLVGCGLNTDPTMFPYLRSLQALSNPAANVSVDVKVFIVPVGNHSNIPFSRVNHSKFMVTEKAAYIGTSNWSEDYFSSTAGVGLVVTQSPGAQPAGATVQEQLRQLFERDWSSRYAVGLDGQAPGQDCVWQG
>食蟹猴PLD4cDNA(1521bp)(SEQ ID NO：63)
ATGCTGAAGCCTCTTCGGAGAGCgGCAGTGACCCCCATGTGGCCGTGCTCCATGCTGCCCCGCCGCCTGTGGGACAGAGAGGCTGGCACGTTGCAGGTCCTGGGAGTGCTGGCTATGCTGTGGCTGGGCTCCATGGCTCTTACCTACCTCCTGTGGCAAGTGCGCCGTCCTCCCACCTGGGGCCAGGTGCAGCCCAAGGACGTGCCCAGGTCCTGGGGGCATGGTTCCAGCCCAGCTCTGGAGCCCCTGGAAGCGGAGGTCAGGAAGCAGAGGGACTCCTGCCAGCTTGTCCTTGTGGAAAGCATCCCCCAGGACCTGCCATTTGCAGCCGGCAGCCTCTCCGCCCAGCCTCTGGGCCAGGCCTGGCTGCAGCTGCTGGACACTGCCCAGGAGAGCGTCCACGTGGCTTCATACTACTGGTCCCTCACAGGGCCCGACATTGGGGTCAACGACTCATCTTCCCAGCTGGGAGAGGCCCTTCTGCAGAAGCTGCAGCAGCTGCTGGGCAGGAACATTTCCTTGGCTGTGGCCACCAGCAGTCCAACACTGGCCAGGAAGTCCACCGACCTGCAGGTCCTGGCTGCCCGAGGTGCCCAGGTACGACGGGTGCCCATGGGGCGGCTCACCAGGGGCGTTTTGCACTCCAAATTCTGGGTTGTGGATGGACgGCACATATACATGGGCAGTGCcAACATGGACTGGCGGTCCCTGACGCAGGTGAAGGAGCTTGGCGCTGTCATCTATAACTGCAGCCACCTGGCCCAAGACCTGGAGAAGACCTTCCAGACCTACTGGGTGCTGGGGGTGCCCAAGGCTGTCCTCCCCAAAACCTGGCCTCAGAACTTCTCATCTCACATCAACCGTTTCCAGCCCTTCCAGGGCCTCTTTGATGGGGTGCCCACCACTGCCTACTTCTCAGCATCGCCACCcGCACTCTGTCCCCAGGGCCGCACCCCTGACCTGGAGGCGCTGTTGGCGGTGATGGGGAGCGCCCAGGAGTTCATCTATGCCTCCGTGATGGAGTATTTCCCTACCACgCGCTTCAGCCACCCCCGCAGGTACTGGCCGGTGCTGGACAACGCGCTGCGGGCGGCAGCCTTCAGCAAGGGTGTGCGCGTGCGCCTGCTGGTCAGCTGCGGACTCAACACGGACCCCACCATGTTCCCCTATCTGCGGTCCCTGCAGGCGCTCAGCAACCCCGCGGCCAACGTCTCTGTGGACGTGAAAGTCTTCATCGTGCCGGTGGGGAATCATTCCAACATCCCGTTCAGCAGGGTGAACCACAGCAAGTTCATGGTCACGGAGAAGGCAGCCTACATAGGCACCTCCAACTGGTCGGAGGATTACTTCAGCAGCACGACGGGGGTGGGCCTGGTGGTCACCCAGAGCCCCGGCGCGCAGCCCGCGGGGGCCACGGTACAGGAGCAGCTGCGGCAGCTCTTTGAGCGGGACTGGAGTTCGCGCTACGCCGTCGGCCTGGACGGACAGGCTCCGGGCCAGGACTGCGTTTGGCAGGGCTGA
>食蟹猴PLD4蛋白(506个氨基酸)(SEQ ID NO：129)
MLKPLRRAAVTPMWPCSMLPRRLWDREAGTLQVLGVLAMLWLGSMALTYLLWQVRRPPTWGQVQPKDVPRSWGHGSSPALEPLEAEVRKQRDSCQLVLVESIPQDLPFAAGSLSAQPLGQAWLQLLDTAQESVHVASYYWSLTGPDIGVNDSSSQLGEALLQKLQQLLGRNISLAVATSSPTLARKSTDLQVLAARGAQVRRVPMGRLTRGVLHSKFWVVDGRHIYMGSANMDWRSLTQVKELGAVIYNCSHLAQDLEKTFQTYWVLGVPKAVLPKTWPQNFSSHINRFQPFQGLFDGVPTTAYFSASPPALCPQGRTPDLEALLAVMGSAQEFIYASVMEYFPTTRFSHPRRYWPVLDNALRAAAFSKGVRVRLLVSCGLNTDPTMFPYLRSLQALSNPAANVSVDVKVFIVPVGNHSNIPFSRVNHSKFMVTEKAAYIGTSNWSEDYFSSTTGVGLVVTQSPGAQPAGATVQEQLRQLFERDWSSRYAVGLDGQAPGQDCVWQG
>恒河猴PLD4cDNA(1521bp)(SEQ ID NO：124)
ATGCTGAAGCCTCTTCGGAGAGCGGCAGTGACCCCCATGTGGCCGTGCTCCATGCTGCCCCGCCGCCTGTGGGACAGAGAGGCTGGCACGTTGCAGGTCCTGGGAGTGCTGGCTATGCTGTGGCTGGGCTCCATGGCTCTTACCTACCTCCTGTGGCAAGTGCGCTGTCCTCCCACCTGGGGCCAGGTGCAGCCCAGGGACGTGCCCAGGTCCTGGGGGCATGGTTCCAGCCTAGCTCTGGAGCCCCTGGAAGCGGAGGTCAGGAAGCAGAGGGACTCCTGCCAGCTTGTCCTTGTGGAAAGCATCCCCCAGGACCTGCCATTTGCAGCCGGCAGCCTCTCCGCCCAGCCTCTGGGCCAGGCCTGGCTGCAGCTGCTGGACACTGCCCAGGAGAGCGTCCACGTGGCTTCATACTACTGGTCCCTCACAGGGCCCGACATTGGGGTCAACGACTCATCTTCCCAGCTGGGAGAGGCCCTTCTGCAGAAGCTGCAGCAGCTGCTGGGCAGGAACATTTCCTTGGCTGTGGCCACCAGCAGTCCAACACTGGCCAGGAAGTCCACCGACCTGCAGGTCCTGGCTGCCCGAGGTGCCCAGGTACGACGGGTGCCCATGGGGCGGCTCACCAGGGGCGTTTTGCACTCCAAATTCTGGGTTGTGGATGGACGGCACATATACATGGGCAGTGCCAACATGGACTGGCGGTCCCTGACGCAGGTGAAGGAGCTTGGCGCTGTCATCTATAACTGCAGCCACCTGGCCCAAGACCTGGAGAAGACCTTCCAGACCTACTGGGTGCTGGGGGTGCCCAAGGCTGTCCTCCCCAAAACCTGGCCTCAGAACTTCTCATCTCACATCAACCGTTTCCAGCCCTTCCAGGGCCTCTTTGATGGGGTGCCCACCACTGCCTACTTCTCAGCATCGCCACCCGCACTCTGTCCCCAGGGCCGCACCCCTGACCTGGAGGCGCTGTTGGCGGTGATGGGGAGCGCCCAGGAGTTCATCTATGCCTCCGTGATGGAGTATTTCCCTACCACGCGCTTCAGCCACCCCCGCAGGTACTGGCCGGTGCTGGACAACGCGCTGCGGGCGGCAGCCTTCAGCAAGGGTGTGCGCGTGCGCCTGCTGGTCAGCTGCGGACTCAACACGGACCCCACCATGTTCCCCTATCTGCGGTCCCTGCAGGCGCTCAGCAACCCCGCGGCCAACGTCTCTGTGGACGTGAAAGTCTTCATCGTGCCGGTGGGGAATCATTCCAACATCCCGTTCAGCAGGGTGAACCACAGCAAGTTCATGGTCACGGAGAAGGCAGCCTACATAGGCACCTCCAACTGGTCGGAGGATTACTTCAGCAGCACGACGGGGGTGGGCCTGGTGGTCACCCAGAGCCCCGGCGCGCAGCCCGCGGGGGCCACGGTACAGGAGCAGCTGCGGCAGCTCTTTGAGCGGGACTGGAGTTCGCGCTACGCCGTCGGCCTGGACGGACAGGCTCCGGGCCAGGACTGCGTTTGGCAGGGCTGA
>恒河猴PLD4蛋白(506个氨基酸)(SEQ ID NO：130)
MLKPLRRAAVTPMWPCSMLPRRLWDREAGTLQVLGVLAMLWLGSMALTYLLWQVRCPPTWGQVQPRDVPRSWGHGSSLALEPLEAEVRKQRDSCQLVLVESIPQDLPFAAGSLSAQPLGQAWLQLLDTAQESVHVASYYWSLTGPDIGVNDSSSQLGEALLQKLQQLLGRNISLAVATSSPTLARKSTDLQVLAARGAQVRRVPMGRLTRGVLHSKFWVVDGRHIYMGSANMDWRSLTQVKELGAVIYNCSHLAQDLEKTFQTYWVLGVPKAVLPKTWPQNFSSHINRFQPFQGLFDGVPTTAYFSASPPALCPQGRTPDLEALLAVMGSAQEFIYASVMEYFPTTRFSHPRRYWPVLDNALRAAAFSKGVRVRLLVSCGLNTDPTMFPYLRSLQALSNPAANVSVDVKVFIVPVGNHSNIPFSRVNHSKFMVTEKAAYIGTSNWSEDYFSSTTGVGLVVTQSPGAQPAGATVQEQLRQLFERDWSSRYAVGLDGQAPGQDCVWQG
>小鼠PLD4cDNA(1512个碱基对)(SEQ ID NO：131)
ATGGACAAGAAGAAAGAGCACCCAGAGATGCGGATACCACTCCAGACAGCAGTGGAGGTCTCTGATTGGCCCTGCTCCACATCTCATGATCCACATAGCGGACTTGGCATGGTACTGGGGATGCTAGCTGTACTGGGACTCAGCTCTGTGACTCTCATCTTGTTCCTGTGGCAAGGGGCCACTTCTTTCACCAGTCATCGGATGTTCCCTGAGGAAGTGCCCTCCTGGTCCTGGGAGACCCTGAAAGGAGACGCTGAGCAGCAGAATAACTCCTGTCAGCTCATCCTTGTGGAAAGCATCCCCGAGGACTTGCCATTTGCAGCTGGCAGCCCCACTGCCCAGCCCCTGGCCCAGGCTTGGCTGCAGCTTCTTGACACTGCTCGGGAGAGCGTCCACATTGCCTCGTACTACTGGTCCCTCACTGGACTGGACATTGGAGTCAATGACTCGTCTTCTCGGCAGGGAGAGGCCCTTCTACAGAAGTTCCAACAGCTTCTTCTCAGGAACATCTCTGTGGTGGTGGCCACCCACAGCCCAACATTGGCCAAGACATCCACTGACCTCCAGGTCTTGGCTGCCCATGGTGCCCAGATACGACAAGTGCCCATGAAACAGCTTACTGGGGGTGTTCTACACTCCAAATTCTGGGTTGTGGATGGGCGACACGTCTACGTGGGCAGCGCCAACATGGACTGGCGGTCCCTGACTCAGGTGAAGGAACTTGGTGCAATCATCTACAACTGCAGCAACCTGGCTCAAGACCTTGAGAAAACATTCCAGACCTACTGGGTGCTAGGGACTCCCCAAGCTGTTCTCCCTAAAACCTGGCCTCGGAACTTCTCATCCCACATCAACCGCTTCCATCCCTTGCGGGGTCCCTTTGATGGGGTTCCCACCACGGCCTATTTCTCGGCCTCCCCTCCCTCCCTCTGCCCGCATGGCCGGACCCGGGATCTGGACGCAGTGTTGGGAGTGATGGAGGGTGCTCGCCAGTTCATCTATGTCTCGGTGATGGAGTATTTCCCTACCACGCGCTTCACCCACCATGCCAGGTACTGGCCCGTGCTGGACAATGCGCTACGGGCAGCGGCCCTCAATAAGGGTGTGCATGTGCGCTTACTGGTCAGCTGCTGGTTCAACACAGACCCCACCATGTTCGCTTATCTGAGGTCCCTGCAGGCTTTCAGTAACCCCTCGGCTGGCATCTCAGTGGATGTGAAAGTCTTCATCGTGCCTGTGGGAAATCATTCCAACATCCCGTTCAGCCGCGTGAACCACAGCAAGTTCATGGTCACAGACAAGACAGCCTATGTAGGCACCTCTAACTGGTCAGAAGACTACTTCAGCCACACCGCTGGTGTGGGCCTGATTGTCAGCCAGAAGACCCCCAGAGCCCAGCCAGGCGCAACCACCGTGCAGGAGCAGCTGAGGCAACTCTTTGAACGAGACTGGAGTTCCCACTATGCTATGGACCTAGACAGACAAGTCCCGAGCCAGGACTGTGTCTGGTAG
>小鼠PLD4蛋白(503个氨基酸)(SEQ ID NO：132)
MDKKKEHPEMRIPLQTAVEVSDWPCSTSHDPHSGLGMVLGMLAVLGLSSVTLILFLWQGATSFTSHRMFPEEVPSWSWETLKGDAEQQNNSCQLILVESIPEDLPFAAGSPTAQPLAQAWLQLLDTARESVHIASYYWSLTGLDIGVNDSSSRQGEALLQKFQQLLLRNISVVVATHSPTLAKTSTDLQVLAAHGAQIRQVPMKQLTGGVLHSKFWVVDGRHVYVGSANMDWRSLTQVKELGAIIYNCSNLAQDLEKTFQTYWVLGTPQAVLPKTWPRNFSSHINRFHPLRGPFDGVPTTAYFSASPPSLCPHGRTRDLDAVLGVMEGARQFIYVSVMEYFPTTRFTHHARYWPVLDNALRAAALNKGVHVRLLVSCWFNTDPTMFAYLRSLQAFSNPSAGISVDVKVFIVPVGNHSNIPFSRVNHSKFMVTDKTAYVGTSNWSEDYFSHTAGVGLIVSQKTPRAQPGATTVQEQLRQLFERDWSSHYAMDLDRQVPSQDCVW
>人PLD3cDNA序列(SEQ ID NO：55)
ATGAAGCCTAAACTGATGTACCAGGAGCTGAAGGTGCCTGCAGAGGAGCCCGCCAATGAGCTGCCCATGAATGAGATTGAGGCGTGGAAGGCTGCGGAAAAGAAAGCCCGCTGGGTCCTGCTGGTCCTCATTCTGGCGGTTGTGGGCTTCGGAGCCCTGATGACTCAGCTGTTTCTATGGGAATACGGCGACTTGCATCTCTTTGGGCCCAACCAGCGCCCAGCCCCCTGCTATGACCCTTGCGAAGCAGTGCTGGTGGAAAGCATTCCTGAGGGCCTGGACTTCCCCAATGCCTCCACGGGGAACCCTTCCACCAGCCAGGCCTGGCTGGGCCTGCTCGCCGGTGCGCACAGCAGCCTGGACATCGCCTCCTTCTACTGGACCCTCACCAACAATGACACCCACACGCAGGAGCCCTCTGCCCAGCAGGGTGAGGAGGTCCTCCGGCAGCTGCAGACCCTGGCACCAAAGGGCGTGAACGTCCGCATCGCTGTGAGCAAGCCCAGCGGGCCCCAGCCACAGGCGGACCTGCAGGCTCTGCTGCAGAGCGGTGCCCAGGTCCGCATGGTGGACATGCAGAAGCTGACCCATGGCGTCCTGCATACCAAGTTCTGGGTGGTGGACCAGACCCACTTCTACCTGGGCAGTGCCAACATGGACTGGCGTTCACTGACCCAGGTCAAGGAGCTGGGCGTGGTCATGTACAACTGCAGCTGCCTGGCTCGAGACCTGACCAAGATCTTTGAGGCCTACTGGTTCCTGGGCCAGGCAGGCAGCTCCATCCCATCAACTTGGCCCCGGTTCTATGACACCCGCTACAACCAAGAGACACCAATGGAGATCTGCCTCAATGGAACCCCTGCTCTGGCCTACCTGGCGAGTGCGCCCCCACCCCTGTGTCCAAGTGGCCGCACTCCAGACCTGAAGGCTCTACTCAACGTGGTGGACAATGCCCGGAGTTTCATCTACGTCGCTGTCATGAACTACCTGCCCACTCTGGAGTTCTCCCACCCTCACAGGTTCTGGCCTGCCATTGACGATGGGCTGCGGCGGGCCACCTACGAGCGTGGCGTCAAGGTGCGCCTGCTCATCAGCTGCTGGGGACACTCGGAGCCATCCATGCGGGCCTTCCTGCTCTCTCTGGCTGCCCTGCGTGACAACCATACCCACTCTGACATCCAGGTGAAACTCTTTGTGGTCCCCGCGGATGAGGCCCAGGCTCGAATCCCATATGCCCGTGTCAACCACAACAAGTACATGGTGACTGAACGCGCCACCTACATCGGAACCTCCAACTGGTCTGGCAACTACTTCACGGAGACGGCGGGCACCTCGCTGCTGGTGACGCAGAATGGGAGGGGCGGCCTGCGGAGCCAGCTGGAGGCCATTTTCCTGAGGGACTGGGACTCCCCTTACAGCCATGACCTTGACACCTCAGCTGACAGCGTGGGCAACGCCTGCCGCCTGCTCTGA
>人PLD3蛋白(490个氨基酸)(SEQ ID NO：127)
MKPKLMYQELKVPAEEPANELPMNEIEAWKAAEKKARWVLLVLILAVVGFGALMTQLFLWEYGDLHLFGPNQRPAPCYDPCEAVLVESIPEGLDFPNASTGNPSTSQAWLGLLAGAHSSLDIASFYWTLTNNDTHTQEPSAQQGEEVLRQLQTLAPKGVNVRIAVSKPSGPQPQADLQALLQSGAQVRMVDMQKLTHGVLHTKFWVVDQTHFYLGSANMDWRSLTQVKELGVVMYNCSCLARDLTKIFEAYWFLGQAGSSIPSTWPRFYDTRYNQETPMEICLNGTPALAYLASAPPPLCPSGRTPDLKALLNVVDNARSFIYVAVMNYLPTLEFSHPHRFWPAIDDGLRRATYERGVKVRLLISCWGHSEPSMRAFLLSLAALRDNHTHSDIQVKLFVVPADEAQARIPYARVNHNKYMVTERATYIGTSNWSGNYFTETAGTSLLVTQNGRGGLRSQLEAIFLRDWDSPYSHDLDTSADSVGNACRLL
>人PLD5cDNA(1338个碱基对)(SEQ ID NO：56)
ATGGGAGAGGATGAGGATGGACTCTCAGAAAAAAATTGCCAAAATAAATGTCGAATTGCCCTGGTGGAAAATATTCCTGAAGGCCTTAACTATTCAGAAAATGCACCATTTCACTTATCACTTTTCCAAGGCTGGATGAATTTACTCAACATGGCCAAAAAGTCTGTTGACATAGTGTCTTCCCATTGGGATCTCAACCACACTCATCCATCAGCATGTCAGGGTCAACGTCTTTTTGAAAAGTTGCTCCAGCTGACTTCGCAAAATATTGAAATCAAGCTAGTGAGTGATGTAACAGCTGATTCAAAGGTATTAGAAGCCTTGAAATTAAAGGGAGCCGAGGTGACGTACATGAACATGACCGCTTACAACAAGGGCCGGCTGCAGTCCTCCTTCTGGATCGTGGACAAACAGCACGTGTATATCGGCAGTGCCGGTTTGGACTGGCAATCCCTGGGACAGATGAAAGAACTCGGTGTCATCTTCTACAACTGCAGCTGCCTGGTCCTAGATTTACAAAGGATATTTGCTCTATATAGTTCATTAAAATTCAAAAGCAGAGTGCCTCAAACCTGGTCCAAAAGACTCTATGGAGTCTATGACAATGAAAAGAAATTGCAACTTCAGTTGAATGAAACCAAATCTCAAGCATTTGTATCGAATTCTCCAAAACTCTTTTGCCCTAAAAACAGAAGTTTTGACATAGATGCCATCTACAGTGTGATAGATGATGCCAAGCAGTATGTGTACATCGCTGTCATGGACTACCTGCCTATCTCCAGCACAAGCACCAAAAGGACTTACTGGCCAGACTTGGATGCAAAAATAAGAGAAGCATTAGTTTTACGAAGCGTTAGAGTTCGACTCCTTTTAAGCTTCTGGAAGGAAACTGATCCCCTTACGTTTAACTTTATTTCATCTCTTAAAGCGATTTGCACTGAAATAGCCAACTGCAGTTTGAAAGTTAAATTTTTTGATCTGGAAAGAGAGAATGCTTGTGCTACAAAAGAACAAAAGAATCACACCTTTCCTAGGTTAAATCGCAACAAGTACATGGTGACAGATGGAGCAGCTTATATTGGAAATTTTGATTGGGTAGGGAATGATTTCACTCAGAATGCTGGCACGGGCCTTGTTATCAACCAGGCAGATGTGAGGAACAACAGAAGCATCATTAAGCAACTTAAAGATGTGTTTGAAAGGGACTGGTATTCACCGTATGCCAAAACCTTACAGCCAACCAAACAGCCGAACTGCTCAAGCCTGTTCAAACTCAAACCCCTCTCCAACAAAACTGCCACAGACGACACAGGCGGAAAGGATCCCCGGAACGTATGA
>人PLD5蛋白(445个氨基酸)(SEQ ID NO：128)
MGEDEDGLSEKNCQNKCRIALVENIPEGLNYSENAPFHLSLFQGWMNLLNMAKKSVDIVSSHWDLNHTHPSACQGQRLFEKLLQLTSQNIEIKLVSDVTADSKVLEALKLKGAEVTYMNMTAYNKGRLQSSFWIVDKQHVYIGSAGLDWQSLGQWKELGVIFYNCSCLVLKLQRIFALYSSLKFKSRVPQTWSKRLYGVYDNEKKLQLQLNETKSQAFVSNSPKLFCPKNRSFDIDAIYSVIDDAKQYVYIAVMDYLPISSTSTKRTYWPDLDAKIREALVLRSVRVRLLLSFWKETDPLTFNFISSLKAICTEIANCSLKVKFFDLERENACATKEQKNHTFPRLNRNKYMVTDGAAYIGNFDWVGNDFTQNAGTGLVINQADVRNNRSIIKQLKDVFERDWYSPYAKTLQPTKQPNCSSLFKLKPLSNKTATDDTGGKDPRNV
>人PLD4-Ig融合蛋白cDNA(2142 bp)(SEQ ID NO：125)
ATGGAGTTTCAGACCCAGGTCTTTGTATTCGTGTTGCTCTGGTTGTCTGGTGTTGATGGAgattacaaggatgacgacgataaaGGATCCcccagagggcccacaatcaagccctgtcctccatgcaaatgcccagcacctaacctcttgggtggaccatccgtcttcatcttccctccaaagatcaaggatgtactcatgatctccctgagccccatagtcacatgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgacccagatgtccagatcagctggtttgtgaacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaacccatagagaggattacaacagtactctccgggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactggatgagtggcaaggagttcaaatgcaaggtcaacaacaaagacctcccagcgcccatcgagagaaccatctcaaaacccaaagggtcagtaagagctccacaggtatatgtcttgcctccaccagaagaagagatgactaagaaacaggtcactccgacctgcatggccacagacttcacgcctgaagacatttacgtggagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacactgaaccagtcctggactctgatggttcttacttcatgtacagcaagctgagagtggaaaagaagaaccgggtggaaagaaatagctactcctgttcagtggtccacgagggtctgcacaatcaccacacgactaagagcttctcccggactccgggtaaaCGTCCTCCCACCTGGGGCCAGGTGCAGCCCAAGGACGTGCCCAGGTCCTGGGAGCATGGCTCCAGCCCAGCTTGGGAGCCCCTGGAAGCAGAGGCCAGGCAGCAGAGGGACTCCTGCCAGCTTGTCCTTGTGGAAAGCATCCCCCAGGACCTGCCATCTGCAGCCGGCAGCCCCTCTGCCCAGCCTCTGGGCCAGGCCTGGCTGCAGCTGCTGGACACTGCCCAGGAGAGCGTCCACGTGGCTTCATACTACTGGTCCCTCACAGGGCCTGACATCGGGCTCAACGACTCGTCTTCCCAGCTGGGAGAGGCTCTTCTGCAGAAGCTGCAGCAGCTGCTGGGCAGGAACATTTCCCTGGCTGTGGCCACCAGCAGCCCGACACTGGCCAGGACATCCACCGACCTGCAGGTTCTGGCTGCCCGAGGTGCCCATGTACGACAGGTGCCCATGGGGCGGCTCACCAGGGGTGTTTTGCACTCCAAATTCTGGGTTGTGGATGGACGGCACATATACATGGGCAGTGCCAACATGGACTGGCGGTCTCTGACGCAGGTGAAGGAGCTTGGCGCTGTCATCTATAACTGCAGCCACCTGGCCCAAGACCTGGAGAAGACCTTCCAGACCTACTGGGTACTGGGGGTGCCCAAGGCTGTCCTCCCCAAAACCTGGCCTCAGAACTTCTCATCTCACTTCAACCGTTTCCAGCCCTTCCACGGCCTCTTTGATGGGGTGCCCACCACTGCCTACTTCTCAGCGTCGCCACCAGCACTCTGTCCCCAGGGCCGCACCCGGGACCTGGAGGCGCTGCTGGCGGTGATGGGGAGCGCCCAGGAGTTCATCTATGCCTCCGTGATGGAGTATTTCCCCACCACGCGCTTCAGCCACCCCCCGAGGTACTGGCCGGTGCTGGACAACGCGCTGCGGGCGGCAGCCTTCGGCAAGGGCGTGCGCGTGCGCCTGCTGGTCGGCTGCGGACTCAACACGGACCCCACCATGTTCCCCTACCTGCGGTCCCTGCAGGCGCTCAGCAACCCCGCGGCCAACGTCTCTGTGGACGTGAAAGTCTTCATCGTGCCGGTGGGGAACCATTCCAACATCCCATTCAGCAGGGTGAACCACAGCAAGTTCATGGTCACGGAGAAGGCAGCCTACATAGGCACCTCCAACTGGTCGGAGGATTACTTCAGCAGCACGGCGGGGGTGGGCTTGGTGGTCACCCAGAGCCCTGGCGCGCAGCCCGCGGGGGCCACGGTGCAGGAGCAGCTGCGGCAGCTCTTTGAGCGGGACTGGAGTTCGCGCTACGCCGTCGGCCTGGACGGACAGGCTCCGGGCCAGGACTGCGTTTGGCAGGGCTGA
>人PLD4-Ig融合蛋白(713个氨基酸)(SEQ ID NO：126)
MEFQTQVFVFVLLWLSGVDGDYKDDDDKGSPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKRPPTWGQVQPKDVPRSWEHGSSPAWEPLEAEARQQRDSCQLVLVESIPQDLPSAAGSPSAQPLGQAWLQLLDTAQESVHVASYYWSLTGPDIGVNDSSSQLGEALLQKLQQLLGRNISLAVATSSPTLARTSTDLQVLAARGAHVRQVPMGRLTRGVLHSKFWVVDGRHIYMGSANMDWRSLTQVKELGAVIYNCSHLAQDLEKTFQTYWVLGVPKAVLPKTWPQNFSSHFNRFQPFHGLFDGVPTTAYFSASPPALCPQGRTRDLEALLAVMGSAQEFIYASVMEYFPTTRFSHPPRYWPVLDNALRAAAFGKGVRVRLLVGCGLNTDPTMFPYLRSLQALSNPAANVSVDVKVFIVPVGNHSNIPFSRVNHSKFMVTEKAAYIGTSNWSEDYFSSTAGVGLVVTQSPGAQPAGATVQEQLRQLFERDWSSRYAVGLDGQAPGQDCVWQG
[登录号]
NITE BP-1211
NITE BP-1212
NITE BP-1213
NITE BP-1214
[序列表中的文字]
SEQ ID NO 45：正向引物
SEQ ID NO 46：反向引物
SEQ ID NO 47：正向引物
SEQ ID NO 48：反向引物
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SEQ ID NO 70：n为脱氧肌苷
SEQ ID NO 71：AUAP引物
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SEQ ID NO 116：引物
SEQ ID NO 117：引物
SEQ ID NO 118：引物
SEQ ID NO 119：引物

Claims (43)

1.一种结合磷脂酶D4(PLD4)蛋白的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段。
2.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SYWMH、作为CDR2的序列DIYPGSDSTNYNEKFKS以及作为CDR3的序列GGWLDAMDY。
3.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在轻链可变区中具有作为CDR1的序列RASQDISNYLN、作为CDR2的序列YTSRLHS，以及作为CDR3的序列QQGNTLPW。
4.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SYWMH、作为CDR2的序列DIYPGSDSTNYNEKFKS以及作为CDR3的序列GGWLDAMDY，并且在轻链可变区中具有作为CDR1的序列RASQDISNYLN、作为CDR2的序列YTSRLHS以及作为CDR3的序列QQGNTLPW。
5.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列TYWMH、作为CDR2的序列AIYPGNSETSYNQKFKG以及作为CDR3的序列GYSDFDY。
6.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在轻链可变区中具有作为CDR1的序列HASQGIRSNIG、作为CDR2的序列HGTNLED以及作为CDR3的序列VQYVQFP。
7.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列TYWMH、作为CDR2的序列AIYPGNSETSYNQKFKG以及作为CDR3的序列GYSDFDY，并且在轻链可变区具有作为CDR1的序列HASQGIRSNIG、作为CDR2的序列HGTNLED以及作为CDR3的序列VQYVQFP。
8.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列DYNLH、作为CDR2的序列YIYPYNGNTGYNQKFKR以及作为CDR3的序列GGIYDDYYDYAIDY。
9.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在轻链可变区中具有作为CDR1的序列RASENIYSHIA、作为CDR2的序列GATNLAH以及作为CDR3的序列QHFWGTP。
10.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列DYNLH、作为CDR2的序列YIYPYNGNTGYNQKFKR以及作为CDR3的序列GGIYDDYYDYAIDY，并且在轻链可变区中具有作为CDR1的序列RASENIYSHIA、作为CDR2的序列GATNLAH以及作为CDR3的序列QHFWGTP。
11.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SYYLY、作为CDR2的序列LINPTNSDTIFNEKFKS以及作为CDR3的序列EGGYGYGPFAY(8C11抗体)。
12.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在轻链可变区中具有作为CDR1的序列TSSQTLVHSNGNTYLH、作为CDR2的序列KVSNRFS以及作为CDR3的序列HSTHVP。
13.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SYYLY、作为CDR2的序列LINPTNSDTIFNEKFKS以及作为CDR3的序列EGGYGYGPFAY，并且在轻链可变区具有作为CDR1的序列TSSQTLVHSNGNTYLH、作为CDR2的序列KVSNRFS以及作为CDR3的序列HSTHVP。
14.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SYGMS、作为CDR2的序列TISSGGSYIYYPESVKG以及作为CDR3的序列LYGGRRGYGLDY。
15.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在轻链可变区中具有作为CDR1的序列RSSKSLLHSDGITYLY、作为CDR2的序列QMSNLAS以及作为CDR3的序列AQNLEL。
16.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SYGMS、作为CDR2的序列TISSGGSYIYYPESVKG以及作为CDR3的序列LYGGRRGYGLDY，并且在轻链可变区具有作为CDR1的序列RSSKSLLHSDGITYLY、作为CDR2的序列QMSNLAS以及作为CDR3的序列AQNLEL。
17.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SHYYWT、作为CDR2的序列YISYDGSNNYNPSLKN以及作为CDR3的序列EGPLYYGNPYWYFDV。
18.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在轻链可变区中具有作为CDR1的序列RASQDIDNYLN、作为CDR2的序列YTSRLHS以及作为CDR3的序列QQFNTLP。
19.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SHYYWT、作为CDR2的序列YISYDGSNNYNPSLKN以及作为CDR3的序列EGPLYYGNPYWYFDV，并且在轻链可变区中具有作为CDR1的序列RASQDIDNYLN、作为CDR2的序列YTSRLHS以及作为CDR3的序列QQFNTLP。
20.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SHYYWS、作为CDR2的序列YISYDGSNNYNPSLKN以及作为CDR3的序列EGPLYYGNPYWYFDV。
21.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在轻链可变区中具有作为CDR1的序列RASQDIDNYLN、作为CDR2的序列YTSRLHS以及作为CDR3的序列QQFNTLP。
22.权利要求1的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其在重链可变区中具有作为CDR1的序列SHYYWS、作为CDR2的序列YISYDGSNNYNPSLKN以及作为CDR3的序列EGPLYYGNPYWYFDV，并且在轻链可变区具有作为CDR1的序列RASQDIDNYLN、作为CDR2的序列YTSRLHS以及作为CDR3的序列QQFNTLP。
23.一种单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其由在登录号：NITE BP-1211、NITE BP-1212、NITE BP-1213和NITE BP-1214下保藏的杂交瘤mp5B7、mp7B4、mp13D4和mp13H11之任一个产生。
24.一种杂交瘤，其产生权利要求1或2的单克隆抗体之任一个。
25.杂交瘤mp5B7、mp7B4、mp13D4或mp13H11，其在登录号：NITE BP-1211、NITE BP-1212、NITE BP-1213或NITE BP-1214下进行了保藏。
26.一种制备单克隆抗体的方法，包括培养权利要求25的杂交瘤:和从培养物收集单克隆抗体。
27.一种制备产生结合PLD4的单克隆抗体的细胞的方法，包括下列过程：
1)给免疫动物施用编码包含PLD4细胞外结构域的氨基酸序列的重组PLD4-Ig融合蛋白的过程，和
2)从免疫动物的抗体产生性细胞选择产生结合PLD4的抗体的抗体产生性细胞的过程。
28.权利要求27的方法，其中表达PLD4的细胞是以可表达的方式保留编码包含PLD4细胞外结构域的氨基酸序列的外源性多核苷酸的细胞。
29.权利要求28的方法，其中所述细胞为动物细胞。
30.权利要求29的方法，其中所述细胞为人来源的细胞。
31.权利要求30的方法，其中所述人来源的细胞为HEK-293T细胞。
32.权利要求27-31的任一项的方法，包括递增地克隆获得的抗体产生性细胞的过程。
33.一种制备结合PLD4细胞外结构域的单克隆抗体的方法，包括：培养通过权利要求29的方法获得的抗体产生性细胞:和从培养物收集单克隆抗体。
34.一种识别PLD4的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，其能通过下列过程获得:
1)给免疫动物施用编码包含PLD4细胞外结构域的氨基酸序列的重组PLD4-Ig融合蛋白，
2)从免疫动物的抗体产生性细胞选择产生结合PLD4的抗体的抗体产生性细胞，和
3)培养过程2)中选择的抗体产生性细胞，和从培养物收集识别PLD4的抗体。
35.一种用于制备结合PLD4的抗体的免疫原，其包含(a)以可表达的方式外源性地保留编码包含PLD4细胞外结构域的氨基酸序列的多核苷酸的动物细胞，或其细胞膜级分。
36.权利要求35的免疫原，其中所述动物细胞为人来源的细胞。
37.一种检测浆细胞样树突细胞的方法，其包括：将结合PLD4细胞外结构域的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段与测试细胞接触:和检测结合细胞的单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段。
38.一种用于检测浆细胞样树突细胞的试剂，其包含：结合PLD4细胞外结构域的单克隆抗体；或包含其抗原结合区的片段。
39.一种抑制浆细胞样树突细胞的活性的方法，包括：将下述组分的任一种与所述浆细胞样树突细胞接触：
(a)结合PLD4并抑制浆细胞样树突细胞的活性的单克隆抗体，或包含其抗原结合区的片段，和
(b)免疫球蛋白或包含其抗原结合区的片段，其中所述免疫球蛋白中移植了单克隆抗体(a)的互补决定区。
40.一种抑制活生物体中的浆细胞样树突细胞的活性的方法，包括：给活生物体施用下述组分的任一种：
(a)结合PLD4并抑制浆细胞样树突细胞的活性的单克隆抗体，或包含其抗原结合区的片段，和
(b)免疫球蛋白或包含其抗原结合区的片段，其中所述免疫球蛋白中移植了单克隆抗体(a)的互补决定区。
41.权利要求39或40的方法，其中浆细胞样树突细胞的活性是干扰素生成活性和干扰素生成性细胞的存活之一，或两者。
42.一种用于抑制浆细胞样树突细胞的活性的试剂，其包含：下述组分之任一种作为活性组分：
(a)结合PLD4并抑制浆细胞样树突细胞的活性的单克隆抗体，或包含其抗原结合区的片段，和
(b)免疫球蛋白或包含其抗原结合区的片段，其中所述免疫球蛋白中移植了单克隆抗体(a)的互补决定区。
43.权利要求42的用于抑制干扰素生成性细胞的活性的试剂，其中浆细胞样树突细胞的活性是干扰素生成活性和干扰素生成性细胞的存活之一，或两者。
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