ES2873035T3 - Anticuerpo antifosfolipasa D4 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo que se une a la proteína fosfolipasa D4 (PLD4) humana sobre una célula dendrítica plasmocitoide (pDC) para su uso en un método de prevención o tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria asociada con pDC, en el que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo suprime una actividad de pDC.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo antifosfolipasa D4

Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo que se une a la fosfolipasa D4. En lo sucesivo, "fosfolipasa D" puede abreviarse como PLD, y "fosfolipasa D4" puede abreviarse como PLD4.

Antecedentes de la técnica

El interferón (en lo sucesivo, el "interferón" puede abreviarse como IFN) es la citoquina más importante en la respuesta inmunitaria antivirus. La célula productora de interferón en sangre humana es la IPC. La IPC es una célula dendrítica indiferenciada basada en linfocitos posicionada como una célula precursora de la célula dendrítica (DC). La IPC también puede denominarse célula dendrítica plasmocitoide (pDC). En la presente memoria descriptiva, IPC y pDC son sinónimos, y en principio se mencionan uniformemente en los sucesivo como un término de pDC, y expresan CD4 y la proteína del complejo histocompatible mayor de clase II. Sin embargo, el aislamiento o la caracterización particular de las células no se ha realizado hasta ahora debido a un número insuficiente de tales células, su rápida apoptosis y también por la falta de un marcador de linaje (sistema). Se ha revelado que pDC es una célula precursora de la célula dendrítica de tipo CD4+CD11c-2, y se ha descubierto que la pDC produce más IFN en 200 a 1000 veces que otras células sanguíneas después de la estimulación por un microorganismo. Por consiguiente, la pDC es una célula efectora del sistema inmunitario concluyente en una respuesta inmunitaria antivirus/antitumoral.

El IFNa y el IFNp se conocen como IFN de tipo I que tienen actividad antivirus o actividad antitumoral. Por otro lado, se ha revelado que el IFNa está asociado con enfermedades autoinmunitarias. Por ejemplo, se ha informado de una producción anormal de IFNa en pacientes con enfermedades autoinmunitarias, como el lupus eritematoso sistémico y la artritis reumatoide crónica. Además, se ha informado de un caso en el que los síntomas de enfermedades autoinmunitarias se expresan o se agravan tras la administración de un IFNa2 o IFN recombinante. También se ha sugerido que es probable que los síntomas autoinmunitarios se alivien mediante la neutralización del IFNa.

Además, también se ha revelado que IFNa induce la diferenciación de células dendríticas (DC). Se ha contemplado que la inducción de la diferenciación de una célula dendrítica constituye un mecanismo importante en una enfermedad autoinmunitaria, ya que una célula dendrítica es una célula presentadora de antígenos. De hecho, se ha sugerido que la inducción de la diferenciación de una célula dendrítica de IFNa está profundamente asociada con el desarrollo de lupus eritematoso sistémico. Como se describió anteriormente, se ha señalado una estrecha relación de IFNa con enfermedades autoinmunitarias, así como con la actividad antitumoral. Además, el IFNa también está profundamente asociado con el desarrollo de la psoriasis.

Solo existen unas pocas pDC en la sangre. Se contempla que la proporción de pDC que ocupan los linfocitos de sangre periférica es del 1 % o menos. Sin embargo, las pDC tienen una capacidad de producción de IFN muy alta. La capacidad de producción de IFN de pDC alcanza, por ejemplo, 3000 pg/mL/104 células. Es decir, se puede decir que la mayor parte del IFNa o IFNp en la sangre producido en el momento de la infección por virus es provocado por pDC, aunque el número de células es pequeño.

La pDC se diferencia en una célula dendrítica mediante la estimulación del virus e induce la producción de IFN-y o interleuquina (IL)-10 por las células T. Además, la pDC también se diferencia en una célula dendrítica mediante estimulación con IL-3. La célula dendrítica diferenciada por estimulación con IL-3 induce la producción de citoquina Th2 (IL-4, IL-5, IL-10) por parte de la célula T. Como se describió anteriormente, la pDC tiene la propiedad de que se diferencia en diferentes células dendríticas dependiendo de la diferencia de estimulaciones.

Por consiguiente, pDC es una célula que tiene dos vertientes, es decir, una vertiente como célula productora de IFN y la otra vertiente como célula precursora de una célula dendrítica. Cualquiera de las células desempeña un papel importante en el sistema inmunitario. Es decir, pDC es una de las células importantes que apoyan al sistema inmunitario en varios aspectos.

En la regulación de la actividad de un factor humoral, como el IFN, la administración de un anticuerpo que reconoce el factor es eficaz. Por ejemplo, se ha intentado tratar enfermedades autoinmunitarias con un anticuerpo contra IL-1 o IL-4. Además, también para IFN y de manera similar, un anticuerpo de neutralización se considera un agente terapéutico para enfermedades autoinmunitarias. Se puede esperar que una estrategia similar sea eficaz para pDC que producen IFN. Sin embargo, tal estrategia se basa en la inhibición de la acción de un factor humoral después de producirse. Si se puede controlar directamente la producción de un factor humoral previsto, se pueden lograr efectos terapéuticos esenciales adicionales.

Se han descrito anticuerpos que reconocen la pDC humana. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-BDCA-2 es un anticuerpo monoclonal específico de pDC humana (Dzionek, A. et al., J. Immunol., 165:6037-6046, 2000). Se ha revelado que el anticuerpo monoclonal anti-BDCA-2 tiene la acción de suprimir la producción de IFN de pDC humana (J. Exp. Med., 194:1823-1834, 2001). Además, también se ha informado que un anticuerpo monoclonal que reconoce una célula productora de interferón de ratón suprime la producción de interferón (Blood, 1 de junio de 2004; 103/11:4201 -4206, publicación electrónica de diciembre de 2003). También se ha informado que el número de células dendríticas disminuye por un anticuerpo monoclonal para pDC de ratón (J. Immunol., 2003, 171:6466-6477).

De manera similar, sería útil si se proporcionara un anticuerpo que pueda reconocer la pDC humana y regular su actividad. Por ejemplo, los presentes inventores ya revelaron que un anticuerpo que reconoce Ly49Q se une específicamente a pDC de ratón. Sin embargo, el anticuerpo para Ly49Q no interfirió con la actividad de pDC de ratón (Blood, 1 de abril de 2005, vol. 105, n.27, pp. 2787-2792).

PLD es una enzima que cataliza una reacción de hidrólisis de fosfatidilcolina para producir ácido fosfatídico y colina, y provoca la señalización en varias células. Se contempla que el ácido fosfatídico producido actúa como una molécula señal de lípidos.

PLD1 y PLD2 se conocen convencionalmente como dos tipos de PLD de mamífero y contienen un dominio de homología Phox (dominio PX), que se puede unir a fosfatidilinositida, y un dominio de homología de pleckstrina (dominio PH) en la región N-terminal del mismo. Ambos dominios están implicados en la localización de membrana de PLD.

PLD1 y PLD2 contienen además dos secuencias His-x-Lys-x-x-x-x-Asp (motivo HKD). Este motivo HKD es un dominio esencial en la actividad PLD.

Se ha contemplado que el ácido fosfatídico producido por PLD1 y PLD2 está involucrado en la reconstitución del esqueleto celular, la exocitosis, la fagocitosis, la canceración, la adhesión celular, la quimiotaxis y similares, y que actúa centralmente en el sistema nervioso, el sistema inmunitario y similares.

Aunque Hu-K4 humano y SAM9 de ratón se denominan oficialmente PLD3 hasta ahora, carecen de dominios PX y PH, y no muestran actividad PLD aunque tienen dos motivos HKD. Además, aunque hay tres miembros de la familia de PLD, es decir, PLD4, PLD5 y PLD6, estas PLD no clásicas son poco conocidas.

Se buscó en la base de datos del transcriptoma de desarrollo cerebeloso (CDT-DB) para el patrón de expresión génica en el desarrollo del cerebelo de ratón y, como resultado, se identificó PLD4, que era un producto de transcripción que se controló en el momento del desarrollo (ver Tao et al., Nat. Methods, 2(8), 591-598 (2005)). No se han informado las características básicas de PLD4. Se considera que debería determinarse a partir de ahora si PLD4 presenta actividad enzimática o no, y si una forma desglicosilada de PLD4 tiene actividad PLD o no.

PLD4 es una secuencia de 506 aminoácidos representada por SEQ ID NO:1 (Tao et al., Nat. Methods, 2(8), 591-598 (2005); y Clark et al., Genome Res., 13(10), 2265-2270 (2003)). La proteína Pl D4 tiene dos regiones PDE provisionales (motivo de fosfodiesterasa), que están constituidas por dos motivos HKD (secuencia de aminoácidos de His-x-Lys-xxxx-Asp, en la que x son los otros aminoácidos) conservados en la región C-terminal, y un presunto sitio de fosforilación (Thr 472). La estructura de la proteína PLD4 se predice como una proteína transmembrana monotrópica de tipo II. Además, la región N-terminal de la proteína PLD4 no tiene una región PX ni una región PH, que sí poseen PLD1 y PLD2, que son la familia de PLD clásica (figuras 1 y 2).

Por otro lado, aunque PLD4 pertenece a la familia de PLD por el hecho de que tiene dos motivos HKD, PLD4 carece del dominio PX y del dominio PH, pero en su lugar tiene un dominio transmembrana putativo.

Se descubrió la expresión de ARNm de PLD4 que, de modo característico, es de nivel bajo a nivel medio, en una subpoblación de células que se localizaba preferentemente en el cuerpo calloso y la periferia de la región de la sustancia blanca, incluida la sustancia blanca del cerebelo de un ratón de 1 semana después del nacimiento. Estas células que expresan el ARNm de PLD4 se han identificado como microglia Ibal positiva (ver Tao et al., Nat. Methods, 2(8), 591-598 (2005)).

El período de 1 semana después del nacimiento es un período en el que comienza la activación de la formación de mielina en el cuerpo calloso y la sustancia blanca cerebelosa de un ratón. En este período, PLD4 se expresa en gran medida en la microglía ameboide (estado activado) que existe en la sustancia blanca. A partir de estos hechos, se contempla la posibilidad de que la célula de expresión de PLD4 en la sustancia blanca esté implicada en la formación de mielina en este período. En particular, la acumulación de PLD4 en la vesícula fagocítica se hace evidente y se sugiere la posibilidad de que la célula de expresión de PLD4 esté implicada en la fagocitosis. A partir de la microglía ameboide en estado activado, se secretan varias citoquinas o factores de crecimiento y también se activa la fagocitosis. Se contempla que oligodendrocitos adicionales (células de la glía en el sistema nervioso central, que forman mielina enrollada y adherida al axón) causan apoptosis en la sustancia blanca del cerebro en la etapa de desarrollo. Se ha contemplado la posibilidad de que los oligodendrocitos adicionales se degraden y se eliminen de la microglía ameboide para secretar una molécula señal, por lo que se ordena el entorno para la formación de mielina en la sustancia blanca. Se sugiere que PLD4 está involucrado en estos procesos, incluida la formación de mielina.

La expresión de ARNm de PLD4 se observa universalmente también en tejidos no nerviosos, pero se distribuye principalmente en el bazo. Se detecta una fuerte expresión de PLD4 en la periferia de la zona fronteriza de la pulpa roja del bazo, y la proteína PLD4 esplénica recogida de la fracción de membrana en la célula está altamente N-glicosilada. Cuando PLD4 se expresó en un sistema celular heterogéneo, se localizó en el retículo endoplásmico y el cuerpo de Golgi. La PLD4 expresada heterólogamente no mostró actividad enzimática PLD (Plos ONE www.plosone.org, noviembre de 2010, volumen 5, n.° 11, e13932).

A partir del patrón de expresión de PLD4 limitado en términos de tiempo y ubicación, se sugiere que PLD4 desempeña un papel en funciones comunes en la microglía o la célula en la región fronteriza del bazo en el momento del desarrollo del cerebro en la etapa inicial después del nacimiento.

La expresión de ARNm de PLD4 y la distribución de PLD4 en el tejido nervioso y en el tejido no nervioso se han resumido anteriormente. Sin embargo, los presentes inventores descubrieron que el ARNm de PLD4 se expresa específicamente a alto nivel en una célula pDC en el estadio de reposo (pDC en reposo) en el nivel de una especie celular descrita a continuación.

El anticuerpo policlonal de ratón anti-PLD4 humana contra la proteína PLD4 humana de longitud completa está disponible en el mercado (anticuerpo policlonal de ratón MaxPab purificado con PLD4 (B01P), n.° de catálogo H00122618-B01P, fabricado por Abnova Corporation). Sin embargo, no se ha obtenido un anticuerpo monoclonal que se una solo a un determinado sitio de PLD4, o un anticuerpo monoclonal que pueda unirse específicamente a PLD4. Otani etal., PLOS ONE, 6(11), e27544 (2011), describen anticuerpos policlonales generados contra un fragmento C-terminal de PLD4 de ratón.

Lista de citas

Bibliografía no relacionada con patentes:

(1) Tao et al., Nat. Methods, 2(8), 591-598 (2005)

(2) Clark et al., Genome Res., 13(10), 2265-2270 (2003)

(3) Plos ONE www.plosone.org, noviembre de 2010, volumen 5, n.° 11, e13932

(4) Catálogo de anticuerpos policlonales de PLD4 de ratón contra la proteína PLD4 humana de longitud completa (Abnova, n.° de catálogo H00122618-B01P)

(5) Dzionek, A., et al., J. Immunol., 165:6037-6046, 2000

(6) J. Exp. Med., 194:1823-1834, 2001

(7) Blood, 1 de junio de 2004; 103/11: 4201 -4206, publicación electrónica de diciembre de 2003

(8) J. Immunol., 2003, 171: 6466-6477

(9) Blood, 1 de abril de 2005, vol. 105, n.27, pp. 2787-2792

(10) Nat. Methods, 2(8), 591-598 (2005)

Sumario de la invención

Problema técnico

Un problema a resolver por la invención es proporcionar un anticuerpo que se una a PLD4 y detectar, identificar o aislar pDC. Además, un problema a resolver por la invención es regular la actividad de pDC.

Solución al problema

Los presentes inventores confirmaron a través de una investigación sobre PLD4 que la expresión de PLD4 aumenta específicamente en pDC, particularmente pDC en el estadio de reposo. En consecuencia, los presentes inventores intentaron la preparación del anticuerpo de PLD4 y la dilucidación de su acción.

Para obtener un anticuerpo que reconozca una pequeña cantidad de una proteína derivada de un organismo vivo, generalmente se usa como inmunógeno una proteína preparada mediante la tecnología de genes recombinantes. Los presentes inventores intentaron la expresión de PLD4 basándose en la información de la secuencia de bases del ADNc de PLD4 y una secuencia de aminoácidos (GenBank n.° de registro NM_138790.2) codificada por él, que ya ha sido revelada (Nat. Methods, 2(8), 591-598 (2005)).

Para obtener un anticuerpo de una proteína, a menudo se intenta el uso de una secuencia de aminoácidos parcial de una proteína natural como inmunógeno. Sin embargo, para que un anticuerpo reconozca una molécula en la superficie celular, es necesario seleccionar una región que constituya una parte reconocida por el anticuerpo como un epítopo en la superficie celular. Por consiguiente, se ha contemplado que no es realista utilizar un fragmento de secuencia de aminoácidos como inmunógeno para obtener un anticuerpo específico contra PLD4.

En tales circunstancias, los presentes inventores revelaron que el uso de un inmunógeno especial permite obtener un anticuerpo que se une a pDC. Además, los presentes inventores confirmaron que el anticuerpo así obtenido reconoce específicamente la pDC humana, y además tiene la acción de regular su actividad, y completaron la invención. Es decir, la invención se refiere a un anticuerpo anti-PLD4, un método de preparación del mismo y el uso del mismo que se describe a continuación.

La invención es la siguiente:

(1) Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo que se une a una proteína fosfolipasa D4 (PLD4) sobre una célula dendrítica plasmocitoide (pDC) para su uso en un método de prevención o tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria asociada con pDC, en el que dicho anticuerpo o el fragmento de anticuerpo suprime una actividad de pDC.

(2) El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo para su uso de acuerdo con (1) mencionado anteriormente, en el que la enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria en la que ha aumentado la expresión de IFNa.

(3) El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo para su uso de acuerdo con (2) mencionado anteriormente, en el que la enfermedad autoinmunitaria es lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide crónica o psoriasis.

(4) El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo para su uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (1) a (3) mencionados anteriormente, en el que la actividad de la pDC es la producción de IFN y/o la supervivencia de la pDC.

(5) Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo que se une a la proteína PLD4 humana sobre una pDC para su uso en un método de prevención o tratamiento de una enfermedad alérgica, en el que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo suprime la producción de IFN.

(6) El anticuerpo monoclonal, o un fragmento que contiene una región de unión al antígeno del mismo para su uso de acuerdo con cualquiera de (1) a (5) mencionados anteriormente, que contiene:

(a) la secuencia SYWMH (SEQ ID NO:2) como CDR1, la secuencia DIYPGSDSTNYNEKFKS (SEQ ID NO:3) como CDR2, y la secuencia Gg Wl DAMDY (s Eq ID NO:4) como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

(b) la secuencia RASQDISNYLN (SEQ ID NO:5) como CDR1, la secuencia YTSRLHS (SEQ ID NO:6) como CDR2 y la secuencia QQGNTLPW (SEQ ID NO:7) como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(c) la secuencia SYWMH como CDR1, la secuencia DIYPGSDSTNYNEKFKS como CDR2 y la secuencia GGWLDAMDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y contiene la secuencia RASQDISNYLN como CDR1, la secuencia YTSRLHS como CDR2 y la secuencia QQGNTLPW como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(d) la secuencia TYWMH (SEQ ID NO:8) como CDR1, la secuencia AIYPGNSETSYNQKFKG (SEQ ID NO:9) como CDR2, y la secuencia GYSDFDY (SEQ ID NO:10) como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

(e) la secuencia HASQGIRSNIG (SEQ ID NO:11) como CDR1, la secuencia HGTNLED (SEQ ID NO:12) como CDR2, y la secuencia VQYVQFP (SEQ ID NO:13) como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(f) la secuencia TYWMH como CDR1, la secuencia AIYPGNSETSYNQKFKG como CDR2 y la secuencia GYSDFDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y contiene la secuencia HASQGIRSNIG como CDR1, la secuencia HGTNLED como CDR2 y la secuencia VQYVQFP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(g) la secuencia DYNLH (SEQ ID NO:14) como CDR1, la secuencia YIYPYNGNTGYNQKFKR (SEQ ID NO:15) como CDR2, y la secuencia GGIYDDYYDYAIDY (SEQ ID NO:16) como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

(h) la secuencia RASENIYSHIA (SEQ ID NO:17) como CDR1, la secuencia GATNLAH (SEQ ID NO:18) como CDR2, y la secuencia QHFWGTP (SEQ ID NO:19) como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(i) la secuencia DYNLH como CDR1, la secuencia YIYPYNGNTGYNQKFKR como CDR2 y la secuencia GGIYDDYYDYAIDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y contiene la secuencia RASENIYSHIA como CDR1, la secuencia GATNLAH como CDR2, y la secuencia QHFVGTP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(j) la secuencia SYYLY (SEQ ID NO:20) como CDR1, la secuencia LINPTNSDTIFNEKFKS (SEQ ID NO:21) como CDR2, y la secuencia EGGYGYGPFAY (SEQ ID NO:22) como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

(k) la secuencia TSSQTLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO:23) como CDR1, la secuencia KVSNRFS (SEQ ID NO:24) como CDR2 y la secuencia HSTHVP (SEQ ID No :25) como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(l) la secuencia SYYLY como CDR1, la secuencia LINPTNSDTIFNEKFKS como CDR2 y la secuencia EGGYGYGPFAY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y contiene la secuencia TSSQTLVHSNGNTYLH como CDR1, la secuencia KVSNRFS como CDR2 y la secuencia HSTHVP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(m) la secuencia SYGMS (SEQ ID NO:26) como CDR1, la secuencia TISSGGSYIYYPESVKG (SEQ ID NO:27) como CDR2, y la secuencia LYGGRRGYGLDY (SEQ ID NO:28) como CDR3 en la región variable de cadena pesada; (n) la secuencia RSSKSLLHSDGITYLY (SEQ ID NO:29) como CDR1, la secuencia QMSNLAS (SEQ ID NO:30) como CDR2, y la secuencia AQNLEL (SEQ ID NO:31) como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(o) la secuencia SYGMS como CDR1, la secuencia TISSGGSYIYYPESVKG como CDR2 y la secuencia LYGGRRGYGLDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y contiene la secuencia RSSKSLLHSDGITYLY como CDR1, la secuencia QMSNLAS como CDR2 y la secuencia AQNLEL como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(p) la secuencia SHYYWT (SEQ ID NO:32) como CDR1, la secuencia YISYDGSNNYNPSLKN (SEQ ID NO:33) como CDR2, y la secuencia EGPLYYGNPYWYFDV (SEQ ID No :34) como CDR3 en la región variable de cadena pesada; (q) la secuencia RASQDIDNYLN (SEQ ID NO:35) como CDR1, la secuencia YTSRLHS (SEQ ID NO:36) como CDR2, y la secuencia QQFNTLP (SEQ ID NO:37) como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(r) la secuencia SHYYWT como CDR1, la secuencia YISYDGSNNYNPSLKN como CDR2 y la secuencia EGPLYYGNPYWYFDV como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y contiene la secuencia RASQDIDNYLN como CDR1, la secuencia YTSRLHS como CDR2, y la secuencia QQFNTLP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(s) la secuencia SHYYWS (SEQ ID NO:38) como CDR1, la secuencia YISYDGSNNYNPSLKN (SEQ ID NO:39) como CDR2, y la secuencia EGPLYYGNPYWYFDV (SEQ ID No :40) como CDR3 en la región variable de cadena pesada; (t) la secuencia RASQDIDNYLN (SEQ ID NO:41) como CDR1, la secuencia YTSRLHS (SEQ ID NO:42) como CDR2, y la secuencia QQFNTLP (SEQ ID NO:43) como CDR3 en la región variable de cadena ligera; o

(u) la secuencia SHYYWS como CDR1, la secuencia YISYDGSNNYNPSLKN como CDR2 y la secuencia EGPLYYGNPYWYFDV como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y contiene la secuencia RASQDIDNYLN como CDR1, la secuencia YTSRLHS como CDR2, y la secuencia QQFNTLP como CDR3 en la región variable de cadena ligera.

(7) El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene la región de unión al antígeno del mismo para su uso según (6) mencionado anteriormente, que tiene una cadena pesada indicada en SEQ ID: 121 y una cadena ligera indicada en SEQ ID: 123.

(8) El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo para su uso según uno cualquiera de (1) a (7) mencionados anteriormente, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

(9) El anticuerpo monoclonal, o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo para su uso de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (7) mencionados anteriormente, en el que el anticuerpo es producido por cualquiera de los hibridomas mp5B7, mp7B4, mp13D4, y mp13H11 que están depositados con los números de registro: NITE BP-1211, NITE BP-1212, NITE BP-1213 y NITE BP-1214.

(10) El anticuerpo monoclonal, o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo para su uso de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (9) mencionados anteriormente, en el que el anticuerpo se mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

(11) El anticuerpo monoclonal, o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo para su uso de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (10) mencionados anteriormente, en el que el anticuerpo se suministra en forma de polvo liofilizado o comprimido.

(12) Un vector de expresión que codifica el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo como se define en uno cualquiera de (1) a (9) mencionados anteriormente. (13) El vector de expresión de (12) mencionado anteriormente para su uso en un método de prevención o tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria asociada con pDC.

(14) El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo como se define en una cualquiera de (1) a (11) mencionados anteriormente o el vector de expresión de (12) mencionado anteriormente para su uso en un método de tratamiento el cuerpo humano por terapia.

(15) Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo como se define en uno cualquiera de (1) a (11) mencionados anteriormente, en la que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se une al dominio extracelular de PLD4.

Efectos de la invención

La invención proporciona un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo que se une a la proteína PLD4 sobre una célula dendrítica plasmocitoide (pDC) para su uso en un método de prevención o tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria asociada con pDC, en el que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo suprime una actividad de pDC. PLD4 es una proteína de membrana que pertenece a la familia de PLD. Los presentes inventores revelaron que se puede obtener fácilmente un anticuerpo que reconoce específicamente PLD4. El anticuerpo anti-PLD4 es un anticuerpo que tiene una alta especificidad, que distingue la pDC humana de una célula que expresa otras familias de PLD.

El anticuerpo anti-PLD4 se une a la pDC humana. Además, el anticuerpo reconoce específicamente la pDC humana. Por consiguiente, el anticuerpo es útil para la detección o el aislamiento de pDC. La pDC es una célula que produce la mayor parte del IFN tipo 1. Por consiguiente, tal detección o aislamiento es importante en el diagnóstico o la investigación de enfermedades asociadas con pDC, tales como enfermedades autoinmunitarias.

Además, el anticuerpo anti-PLD4 tiene la acción de regular la actividad de pDC humana. Por consiguiente, el anticuerpo anti-PLD4 suprime una actividad de pDC. Por consiguiente, si se emplea la supresión de la actividad de pDC usando el anticuerpo, se pueden esperar efectos terapéuticos para un paciente con una enfermedad autoinmunitaria en la que ha aumentado la expresión de IFNa.

La pDC produce una gran cantidad de IFN en un pequeño número de células. En la neutralización de IFN, es necesario un anticuerpo, que depende del número de moléculas de IFN. Sin embargo, en la invención, la actividad de la célula de producción se suprime directamente. Como resultado de ello, se puede esperar un potente efecto de supresión de IFN con una menor cantidad de anticuerpo en comparación con la neutralización de un anticuerpo anti-IFN. Además, en un caso en el que se produce IFN de forma continua, se espera que la neutralización por el anticuerpo de IFN permanezca como supresión transitoria. Sin embargo, en la invención, se suprime la actividad de pDC y, a partir de esto, se puede esperar un efecto de supresión de la producción de IFN durante un tiempo prolongado.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama que ilustra la secuencia de aminoácidos de la proteína PLD4 (C14orfl75) humana (506 restos). Se contempla que los 31 a 53 restos del N-terminal son un dominio transmembrana analizado usando el "programa SOSUI (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)", que es un sistema de predicción para una región transmembrana. Los 54 a 506 restos contienen dos motivos de fosfodiesterasa y se prevé que esta proteína sea una proteína transmembrana de tipo II;

La figura 2 es un diagrama esquemático que representa una estructura predicha de la proteína PLD4 humana. La estructura tiene dos motivos HKD (HxKxxxxD) en los restos aminoácidos 506, y el resto treonina 472 es posiblemente un sitio de fosforilación;

La figura 3 es un gráfico que ilustra la homología de la proteína PLD4 humana con especies moleculares homólogas en un animal heterogéneo. La proteína PLD4 se ha conservado en el proceso de evolución desde un ratón a un ser humano;

La figura 4 es un gráfico que ilustra la homología con la familia de proteínas de PLD4 humana (parálogos);

La figura 5 es un gráfico que ilustra la expresión específica de pDC humana del gen PLD4 en una célula responsable de la inmunidad humana. La expresión del gen PLD4 es alta en pDC en el estadio de reposo y la expresión es baja en células B CD19+;

La figura 6 es un gráfico que ilustra el patrón de expresión tisular del ARNm de PLD4 humano. La expresión es alta en el bazo y en los leucocitos de sangre periférica;

La figura 7 es un diagrama esquemático que ilustra la estructura de la proteína de fusión de Ig-PLD4 humana recombinante. Se amplificó mediante PCR un fragmento de ADNc que corresponde al dominio extracelular de PLD4 humano (56-506 aminoácidos). Este fragmento se insertó en el sitio de clonación BamHI-EcoRI del vector de expresión N-Flag pcDNA3.1 que contiene el segmento conductor de IgK de ratón y la región Fc constante de cadena pesada de IgG2a de ratón (bisagra CH2 CH3) en el N-terminal. Se transfectó temporalmente una célula 293F con un plásmido y se recogió el sobrenadante del cultivo;

La figura 8 es un diagrama de análisis FACS que ilustra la especificidad de unión a PLD4 humana. Los anticuerpos mp11 G9.6 y ch11 G9.6 reconocieron específicamente la PLD4 humana, pero no reconocieron los transfectantes PLD3-293T o PLD5-293T humanos;

La figura 9 es un diagrama de análisis FACS que ilustra la reactividad cruzada con PLD4 de mono cynomolgus. Los anticuerpos mp11 G9.6 y ch11G9.6 fueron capaces de reconocer la PLD4 de mono cynomolgus en el transfectante 293T; La figura 10 es un diagrama de medición de FACS que ilustra la tinción en el anticuerpo mp11G9.6 de PBMC humanas. El anticuerpo mp11 G9.6 reconoció fuertemente a pDC BDCA2+ en PBMC humanas;

La figura 11 es un diagrama de análisis FACS que ilustra la tinción en el anticuerpo anti-PLD4 purificado de la célula CAL-1;

La figura 12 es un diagrama de análisis FACS que ilustra la tinción en un anticuerpo anti-PLD4 de la cepa celular estable CT125- PLD4 humana;

La figura 13 es un diagrama de análisis FACS que ilustra la tinción en un anticuerpo anti-PLD4 de PBMC humanas. Todos los anticuerpos anti-PLD4 fueron capaces de reconocer pDC BDCA2+ en PBMC humanas;

La figura 14 es un diagrama que representa el alineamiento múltiple y la homología de las proteínas de PLD humana, PLD4 de mono cynomolgus, PLD4 de mono rhesus y PLD4 de ratón;

La figura 15 es un diagrama de análisis FACS que ilustra la tinción en un anticuerpo anti-PLD4 con la introducción transitoria del gen del vector de expresión de PLD4 de mono cynomolgus marcado con Flag en la célula 293T- PLD4 humana. La expresión en la superficie celular de la proteína PLD4 de mono cynomolgus se confirmó en el anticuerpo anti-Flag;

La figura 16 es un diagrama de medición FACS que ilustra la tinción en un anticuerpo anti-PLD4 de la célula CT125-PLD4 de mono cynomolgus. Entre los anticuerpos anti-PLD4, siete anticuerpos (3B4, 5B7, 7B4, 13D4, 13H11, 14Cl y 11 G9.6) pueden unirse al transfectante estable de CT 125-PLD4 de mono cynomolgus;

La figura 17 es un diagrama de análisis FACS que ilustra la tinción en un anticuerpo anti-PLD4, con la introducción transitoria del gen del vector de expresión de PLD4 de mono rhesus marcado con Flag en una célula 293T-PLD4 humana. La expresión en la superficie celular de la proteína PLD4 de mono rhesus se confirmó en el anticuerpo anti-Flag;

La figura 18 es un diagrama de análisis FACS que ilustra la tinción en un anticuerpo anti-PLD4 de PBMC de mono rhesus. Entre los anticuerpos anti-PLD4, cinco anticuerpos (5B7, 7B4, 13D4, 13H11 y 14C1) se unieron específicamente a la población de células pDC (linaje-CD123 HLA-DR+) de mono cynomolgus en PBMC de mono rhesus;

La figura 19 es un gráfico que ilustra la concentración molar de constante de disociación (unidad nM, valor Kd) de un anticuerpo anti-PLD4 contra la cepa celular estable de CT 125-PLD4 humana;

La figura 20 es un gráfico que ilustra la actividad CDC de diez tipos de anticuerpos anti-PLD4. Célula diana: CT 125-PLD4 humana (linfocito de células T 2B4 de ratón), concentración de anticuerpo transfectante estable: 10 pg/ml, efector: complemento de conejo inmaduro al 1 %;

La figura 21 es un gráfico que ilustra la actividad CDC de los anticuerpos anti-PLD4 (anticuerpo mp11 G9.6 y anticuerpo ch11G9.6). Célula diana: CT125-PLD4 humana (linfocito de células T 2B4 de ratón), concentración de anticuerpo transfectante estable: 0,1 pg/ml a 30 pg/ml, efector: complemento de conejo inmaduro al 1 %;

La figura 22 es un gráfico que ilustra la actividad ADCC de un anticuerpo quimérico anti-PLD4. Célula diana: transfectante estable de CHO- PLD4 humana, concentración de anticuerpo: 10 pg/ml;

La figura 23 es un gráfico que ilustra la medición con ELISA de la inhibición de la secreción de IFN-a por un tratamiento con un anticuerpo quimérico anti-PLD4 (ch11 G9.6) en PBMC humanas aisladas de tres individuos sanos; y La figura 24 es un diagrama que ilustra la pérdida de pDC humana después de un tratamiento con un anticuerpo quimérico anti-PLD4.

La figura 25 es el resultado del ensayo ADCC con Ab anti-PLD4 quiméricos contra pDC primarias humanas.

La figura 26 es la producción de IFNa a partir de PBMC por CpG2216 en presencia de Ab anti-PLD4 quiméricos. Modo de realización de la invención

Los presentes inventores descubrieron que la PLD4 es una molécula que se expresa específicamente al nivel de ARNm y al nivel de proteína en una célula dendrítica plasmocitoide en el estadio de reposo (pDC en reposo). No se ha establecido un método para preparar un anticuerpo que reconozca a PLD4.

Existe un informe que indica que la PLD4 de ratón es una molécula que se expresa en la microglia ameboide (estadio activado) en la etapa de desarrollo en el cerebelo o el cuerpo calloso en la etapa inicial después del nacimiento. Sin embargo, la expresión de PLD4 humana no se conocía hasta ahora. Particularmente, la expresión en el sistema inmunitario, la ubicación intracelular, la estructura, la función y similares de PLD4 humana no se habían indicado hasta ahora. Se confirmó mediante la invención que la PLD4 humana, que hasta ahora se contemplaba que se expresaba únicamente en el citoplasma, es un marcador de la superficie celular que se expresa en células dendríticas plasmocitoides humanas (pDC) como una proteína transmembrana de tipo II. Por consiguiente, la unión del anticuerpo de PLD4 a pDC se vuelve posible y se ha demostrado que el anticuerpo de PLD4 es útil como diana molecular de un anticuerpo terapéutico destinado a regular las funciones de células B y células pDC.

Los presentes inventores confirmaron mediante análisis de expresión génica que PLD4 se expresa específicamente en pDC humanas. Se contempló que, si se obtenía un anticuerpo que pudiera distinguir inmunológicamente PLD4 de otras moléculas, este sería útil para la investigación de pDC. Sin embargo, hay muchas moléculas en la familia de PLD, incluida PLD4, que son muy similares en estructura entre sí. Moléculas tales como PLD1, PLD2, PLD3 y PLD5, incluyendo PLD que es PLD4, abarcan una secuencia de aminoácidos que tiene una homología particularmente alta (figura 4). Por consiguiente, se contempló que sería difícil obtener un anticuerpo que distinga estas moléculas mutuamente usando un inmunógeno de un péptido que emplea una secuencia de aminoácidos (una secuencia parcial) que constituye PLD4 (o dominio extracelular). En consecuencia, los presentes inventores intentaron conseguir un anticuerpo contra PLD4 usando una proteína de fusión de Ig-PLD4 recombinante como inmunógeno, que codifica una secuencia de aminoácidos que abarca el dominio extracelular de PLD4.

Los presentes inventores repitieron las investigaciones para conseguir un anticuerpo que reconozca PLD4 y revelaron que el anticuerpo previsto se obtiene usando una proteína de fusión de Ig-PLD4 recombinante como inmunógeno.

PLD4 es una molécula natural que se expresa en pDC humanas, o una molécula inmunológicamente equivalente a PLD4 que se expresa en pDC humanas. La unión de un anticuerpo a PLD4 se puede confirmar, por ejemplo, como se describe a continuación.

• Confirmación basada en la reactividad con células humanas:

De acuerdo con los hallazgos obtenidos por los presentes inventores, se contempla que PLD4 pueda usarse como marcador de pDC, por el hecho de que exhibe expresión específica en pDC humanas.

En base a dicho perfil de expresión de PLD4, la actividad de unión con al menos un subconjunto parcial de pDC es una de las características importantes del anticuerpo que se une a PLD4. El hecho de que algunas células sean pDC puede confirmarse mediante un marcador de superficie celular inherente a cada familia celular. Por ejemplo, la unión a una célula deseada se confirma mediante la doble tinción de un anticuerpo que se une a un marcador de la superficie celular, y un anticuerpo que confirme su actividad de unión. Es decir, pDC en la invención engloba células que expresan, por ejemplo, BDCA2.

• Confirmación basada en la reactividad con la célula transformada que expresa el gen PLD4:

Los presentes inventores confirmaron que las características inmunológicas de PLD4 que se expresa en pDC humanas se reconstituyen cuando el gen PLD4 se expresa en determinadas condiciones. Por consiguiente, la reactividad con PLD4 también se puede confirmar basándose en la reactividad de un anticuerpo con una célula en la que se introduce artificialmente un gen que codifica PLD4. Es decir, el anticuerpo monoclonal es aquel que se une a una molécula que contiene una secuencia de aminoácidos que constituye el dominio extracelular de PLD4 como dominio extracelular, o un fragmento que contiene una región de unión al antígeno del mismo. Por otra parte, el dominio extracelular está constituido por una secuencia de aminoácidos que corresponde a 54 a 506 del N-terminal en la SEQ ID NO:1 (figura 1) de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO:1.

Por ejemplo, en una célula que se transforma con un vector de expresión que incluye ADN que codifica PLD4, se mantienen las características inmunológicas de PLD4 que se expresan en pDC humanas. Por consiguiente, una célula transformada que expresa PLD4 es preferible como célula para confirmar la propiedad de unión de un anticuerpo al dominio extracelular de PLD4. Cuando en la invención se confirma la reactividad de un anticuerpo con una célula transformada, es deseable utilizar una célula no transformada como control.

A continuación, el anticuerpo que se une a PLD4 puede ser un anticuerpo que muestra una propiedad cruzada con una familia celular que se sabe que expresa una familia de PLD distinta de PLD4, o puede ser un anticuerpo que no muestra dicha propiedad cruzada. El anticuerpo que no muestra propiedad cruzada es preferible como el anticuerpo que se une a PLD4. Específicamente, el anticuerpo que se une a PLD4 es preferiblemente un anticuerpo que puede no confirmarse para la unión con una familia celular que se sabe que expresa una familia de PLD distinta de PLD4, en las mismas condiciones que las condiciones en las que se confirma la unión a pDC.

Es decir, el anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PLD4 preferiblemente incluye un anticuerpo monoclonal que tiene las características inmunológicas descritas a continuación.

a) Unión a pDC humanas,

b) Puede no confirmarse su unión a una o múltiples especies de células seleccionadas de un grupo que consiste en monocitos, macrófagos, células CD34 positivas y células dendríticas derivadas de estas células, en condiciones que permitan la unión a pDC humanas.

Particularmente, el anticuerpo monoclonal es preferiblemente un anticuerpo cuya unión a monocitos, macrófagos, células B, células CD34 positivas y células dendríticas derivadas de estas células puede no confirmarse en condiciones que permitan la unión a pDC humanas.

Como alternativa, el anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PLD4 preferiblemente incluye un anticuerpo monoclonal que tiene las características inmunológicas que se describen a continuación.

c) Unión a una célula transformada que se transforma con un vector de expresión que conserva el ADN que codifica PLD4 de forma expresable,

d) Es posible que no se confirme la unión con la célula huésped de c) antes de ser transformada, en condiciones que permitan la unión a la célula transformada c).

El hecho de que el anticuerpo monoclonal anti-PLD4 no se cruce con otras moléculas de la familia de PLD puede confirmarse empleando una célula en la que cada familia de PLD se expresa obligatoriamente. Es decir, la expresión obligatoria se realiza mediante la introducción de ADNc que codifica la secuencia de aminoácidos de cada familia de PLD en una célula huésped apropiada. La célula transformada obtenida se pone en contacto con el anticuerpo monoclonal anti-PLD4 para confirmar la propiedad cruzada. Si no se muestra la unión a una célula que expresa moléculas de la familia de PLD distintas de PLD4, se puede confirmar que el anticuerpo puede distinguir inmunológicamente PLD4 de otras moléculas de la familia de PLD. Por ejemplo, se confirma en los ejemplos descritos a continuación que la mayoría de los anticuerpos monoclonales anti-PLD4 obtenidos no se cruzan con PLD3 y PLD5 que tienen una homología particularmente alta con PLD4, y además con PLD1 y PLD2. Por consiguiente, el anticuerpo monoclonal es preferiblemente un anticuerpo monoclonal que se une a PLD4, pero puede que no se detecte su unión a PLD3, PLD5, PLD1 o PLD2 en las mismas condiciones. Si se usa un anticuerpo que puede distinguir inmunológicamente estas moléculas de la familia de PLD de PLD4, se puede detectar específicamente el cambio de expresión de PLD4.

La unión de un anticuerpo monoclonal para confirmar su actividad de unión a cada especie de una célula puede confirmarse, por ejemplo, con el principio de citometría de flujo. Para confirmar la reactividad de un anticuerpo mediante el principio de citometría de flujo, es ventajoso marcar el anticuerpo con una molécula o grupo de átomos que produzca una señal detectable. Generalmente, se usa un marcador fluorescente o un marcador luminiscente. Para analizar la unión de un anticuerpo marcado con fluorescencia a una célula mediante el principio de citometría de flujo, se puede utilizar un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS). Mediante el uso de FACS, se pueden confirmar de forma eficaz múltiples uniones de un anticuerpo a una célula.

Específicamente, por ejemplo, un anticuerpo A que se sabe de manera preliminar que es capaz de identificar pDC, y un anticuerpo B que se va a analizar para determinar las características de unión con pDC, se hacen reaccionar al mismo tiempo con una familia de células que incluye pDC. El anticuerpo A y el anticuerpo B están marcados con una señal fluorescente que puede distinguirlos entre sí. Si se detectan ambas señales procedentes de la misma familia de células, se puede confirmar que dichos anticuerpos se unen a la misma familia de células. Es decir, se comprueba que el anticuerpo A y el anticuerpo B tienen las mismas características de unión. Si el anticuerpo A y el anticuerpo B se unen a una familia celular diferente, es evidente que sus características de unión son diferentes entre sí.

Los ejemplos de anticuerpos monoclonales preferidos para usar en la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas mp5B7, mp7B4, mp13D4 y mp13H11.

Los hibridomas mp5B7, mp7B4, mp13D4 y mp13H11 se depositaron con los números de registro: NITE BP-1211, NITE BP-1212, N iT e b P-1213 y NITE BP-1214 en el Instituto Nacional de Tecnología y Evaluación (NITE), depositario de microorganismos de patentes el 27 de enero, 2012. Los contenidos para especificar el depósito se describirán a continuación.

(1) Nombre y dirección de la autoridad de depósito

Nombre: Instituto Nacional de Tecnología y Evaluación (NITE) Depositario de Microorganismos de Patentes de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada

Dirección: 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818 JAPÓN

(2) Fecha de depósito: 27 de enero de 2012

(3) Números de registro:

NITE BP-1211 (hibridoma mp5B7)

NITE BP-1212 (hibridoma mp7B4)

NITE BP-1213 (hibridoma mp13D4)

NITE BP-1214 (hibridoma mp13H11)

El anticuerpo monoclonal puede ser un fragmento que contenga una región de unión al antígeno del mismo. Por ejemplo, puede usarse como anticuerpo un fragmento de anticuerpo que comprende un sitio de unión al antígeno que se produce mediante digestión enzimática de IgG. Específicamente, mediante digestión con papaína o pepsina, se puede obtener un fragmento de anticuerpo como Fab o F(ab')2. Además, un fragmento de inmunoglobulina que incluye una región variable en la que se trasplanta una región determinante de complementariedad (CDR) de algún anticuerpo monoclonal se incluye en el fragmento que contiene la región de unión al antígeno. Es ampliamente conocido que estos fragmentos de anticuerpos pueden usarse como una molécula de anticuerpo que tiene afinidad de unión por un antígeno. Como alternativa, se puede usar un anticuerpo construido por recombinación génica siempre que mantenga la actividad necesaria para la unión del antígeno. Los ejemplos del anticuerpo construido por recombinación génica incluyen, por ejemplo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de trasplante de CDR, un Fv monocatenario, un diacuerpo (diacuerpos), un anticuerpo lineal y un anticuerpo poliespecífico formado por fragmentos de anticuerpo. Se conoce un método para obtener dichos anticuerpos basado en un anticuerpo monoclonal, o una célula productora de anticuerpos que lo produce.

El anticuerpo monoclonal se puede obtener usando proteína de fusión de Ig-PLD4 recombinante, o una célula transformada que expresa PLD4 humana como inmunógeno. Es decir, la presente descripción se refiere a un método para preparar una célula que produce un anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PLD4, que contiene los procesos siguientes.

(1) un proceso de administración de una proteína extrínseca que contiene el dominio extracelular PLD4 a un animal que se va a inmunizar, y

(2) un proceso de selección de una célula productora de anticuerpos que produce un anticuerpo que se une a PLD4, a partir de células productoras de anticuerpos del animal inmunizado.

La célula productora de anticuerpos así obtenida, o una célula inmortalizada de la célula productora de anticuerpos pueden cultivarse y puede recogerse un anticuerpo monoclonal previsto del cultivo. Se conocen varios métodos como método para inmortalizar la célula productora de anticuerpos.

La célula transformada utilizada como inmunógeno se puede obtener, por ejemplo, preparando una célula en la que un polinucleótido extrínseco (a) que codifica la secuencia de aminoácidos que contiene el dominio extracelular de PLD4 descrito a continuación se mantiene de forma expresable.

El polinucleótido extrínseco en la presente descripción se refiere a un polinucleótido que se introduce artificialmente en una célula huésped. En el caso de que se utilice una célula humana como célula, se introduce un gen humano en la célula humana. En tal combinación, el polinucleótido introducido artificialmente también se denomina polinucleótido extrínseco. Por consiguiente, la expresión ectópica de PLD4 se engloba en la expresión de polinucleótidos extrínsecos.

El dominio extracelular de PLD4 en la invención se refiere a una secuencia de aminoácidos de 54-506 posiciones que se corresponde con el dominio extracelular en la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:1. Por ejemplo, son preferibles secuencias de aminoácidos que contienen cada una de las regiones en el siguiente orden desde el lado N-terminal como la secuencia de aminoácidos que contiene el dominio extracelular PLD4 en la invención.

[Región intracelular dominio transmembrana dominio extracelular]

Como alternativa, una secuencia de aminoácidos que carece parcialmente de la región intracelular como se describe a continuación también está incluida en la secuencia de aminoácidos que contiene el dominio extracelular de PLD4 en la presente invención.

[Región intracelular parcial dominio transmembrana dominio extracelular]

Además, una estructura que carece de la región intracelular como se describe a continuación está incluida en la secuencia de aminoácidos que contiene el dominio extracelular PLD4 en la presente invención.

[Dominio transmembrana dominio extracelular]

Otras regiones distintas del dominio extracelular en la estructura mencionada anteriormente pueden ser una secuencia seleccionada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:1, o pueden ser una combinación con otra secuencia de aminoácidos homóloga. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que constituye una secuencia señal, un dominio transmembrana y una región intracelular puede usarse como una secuencia de aminoácidos de moléculas de la familia de PLD distintas de PLD4. Como alternativa, también se puede combinar la secuencia de aminoácidos de la familia de PLD de otras especies distintas de la humana. Además, la secuencia de aminoácidos que constituye otras regiones además del dominio extracelular puede contener una mutación dentro de un intervalo en el que pueden mantenerse cada una de las funciones de las regiones. Además, se pueden interponer otras regiones entre cada una de las regiones. Por ejemplo, entre la secuencia señal y el dominio extracelular, también se puede insertar un marcador de epítopo, como FLAG. En particular, la secuencia señal es una región que se somete a procesamiento en la etapa de transporte a la superficie de la membrana celular después de la traducción de la proteína y se elimina. Por consiguiente, se puede utilizar como secuencia señal una secuencia de aminoácidos arbitraria que induce el paso de la proteína traducida a través de la membrana celular. Más específicamente, una secuencia de aminoácidos de PLD4 (SEQ ID NO:1) es preferible como una secuencia de aminoácidos que contiene el dominio extracelular de PLD4.

Por consiguiente, el polinucleótido (a) mencionado anteriormente puede ser una secuencia de bases arbitraria que codifica la secuencia de aminoácidos que constituye la estructura mencionada anteriormente [región intracelular dominio transmembrana dominio extracelular]. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 está codificada por la secuencia de bases de ADNc descrita en SEQ ID NO:44.

La proteína de fusión de Ig-PLD4 recombinante como inmunógeno puede obtenerse introduciendo un vector de expresión que conserva el polinucleótido mencionado anteriormente de una manera expresable, en una célula huésped apropiada. La secuencia de bases de ADNc de la proteína de fusión de Ig-PLD4 recombinante está representada por SEQ ID NO:125, y la secuencia de aminoácidos está representada por SEQ ID NO:126.

La célula huésped es preferiblemente una célula de mamífero. Específicamente, una célula derivada de un ser humano, un mono, un ratón o una rata puede usarse como célula huésped. Particularmente, la célula derivada de seres humanos es preferible como célula huésped. Por ejemplo, la célula HEK-293T es una cepa de células renales derivadas de embriones humanos que se puede utilizar preferiblemente como célula huésped. La célula HEK-293T está disponible como ATCC CRL-11268. Además de esto, una célula derivada de un animal que se va a inmunizar puede usarse como célula huésped. Si una célula derivada de un animal que se va a inmunizar se usa como inmunógeno, la respuesta inmunitaria contra la célula huésped es pequeña. Por tanto, se puede obtener eficazmente un anticuerpo contra el dominio extracelular de PLD4, que se expresa extrínsecamente. Por consiguiente, por ejemplo, cuando se utiliza un ratón como animal que se va a inmunizar, también se puede utilizar como célula huésped una célula derivada del ratón.

El polinucleótido mencionado anteriormente se puede cargar en un vector que puede inducir la expresión en una célula huésped para transformar la célula. Puede usarse un vector disponible en el mercado que puede inducir la expresión en una célula de mamífero. Por ejemplo, se puede usar un vector de expresión como el vector pCMV-Script(R), el vector pSG5 (fabricado por Stratagene), pcDNA3.1 (fabricado por Invitrogen) y el vector retroviral pMXs-IP (fabricado por Cell BioLabs).

La célula transformada así obtenida se administra a un animal que se va a inmunizar, con un componente adicional tal como un adyuvante si es necesario. Como adyuvante, por ejemplo, se puede usar el adyuvante completo de Freund. En el caso de que se utilice un ratón como animal que se va a inmunizar, se administra la proteína de fusión de Ig-PLD4 recombinante purificada a un ratón BALB/c. Como adyuvante, se usaron adyuvante de Freund, completo e incompleto (fabricado por SIGMA) y se administraron en 200 pg/ratón la primera vez y 50 pg/ratón de la segunda a la cuarta vez. Generalmente, se administra un inmunógeno varias veces a intervalos hasta que aumenta el título de anticuerpos. Por ejemplo, en un caso de método de inmunización a corto plazo, se administra una célula transformada en un intervalo de 2 a 4 días, más específicamente 3 días y, después de 2 a 3 veces de la administración, se pueden recolectar células productoras de anticuerpos. Además, las células productoras de anticuerpos también se pueden recolectar después de la administración de 5 a 6 veces en un intervalo de una vez por semana aproximadamente.

Para obtener el anticuerpo monoclonal, se clona la célula productora de anticuerpo recogida. Para la clonación, la célula productora de anticuerpos se inmortaliza preferiblemente. Por ejemplo, puede usarse un método de fusión celular representado por el método de hibridoma, o la transformación por el virus de Epstein-Barr (EBV) como método para inmortalizar la célula productora de anticuerpos.

Una célula productora de anticuerpos produce un tipo de anticuerpo por célula. Por consiguiente, si se puede establecer una población de células derivada de una célula (es decir, clonación), se puede obtener un anticuerpo monoclonal. El método de hibridoma se refiere a un método en el que una célula productora de anticuerpos se fusiona con una cepa celular apropiada, se inmortaliza y luego se clona. La célula productora de anticuerpos inmortalizada se puede clonar mediante un método como el método de dilución limitante. Se conocen muchas cepas celulares que son útiles en el método del hibridoma. Estas cepas de células son excelentes en la eficacia de inmortalización de una célula basada en linfocitos y contienen varios marcadores genéticos que son necesarios para seleccionar las células que han tenido éxito en la fusión celular. Además, en un caso en el que se pretenda adquirir una célula productora de anticuerpos, también se puede usar una cepa celular que carece de la capacidad de producción de anticuerpos.

Por ejemplo, el mieloma de ratón P3x63Ag8.653 (ATCC CRL-1580) o P3x63Ag8U.1 (ATCC CRL-1597) se usa universalmente como una cepa celular útil para un método de fusión celular de un ratón o una rata. Generalmente, un hibridoma se prepara mediante la fusión de células homogéneas. Sin embargo, también se puede obtener un anticuerpo monoclonal a partir de un heterohibridoma entre especies heterogéneas cercanas.

Se conoce un protocolo específico de fusión celular. Es decir, una célula productora de anticuerpos de un animal inmunizado se mezcla con un compañero de fusión apropiado y se somete a fusión celular. Como célula productora de anticuerpos, por ejemplo, se puede usar una célula esplénica, una célula de linfocito recogida del ganglio linfático, una célula B de sangre periférica. Como compañero de fusión, se pueden usar varias cepas de células descritas anteriormente. Para la fusión celular, se utiliza un método de polietilenglicol o un método de fusión eléctrica.

A continuación, las células que han tenido éxito en la fusión celular se seleccionan basándose en un marcador de selección que posee la célula de fusión. Por ejemplo, en un caso en el que se usa una cepa de células sensibles a HAT en la fusión celular, las células que han tenido éxito en la fusión celular se seleccionan seleccionando las células que crecen en el medio HAT. Además, se confirma si un anticuerpo producido por las células seleccionadas tiene la reactividad deseada.

Cada uno de los hibridomas se selecciona basándose en la reactividad del anticuerpo. Es decir, un hibridoma que produce un anticuerpo que se une a PLD4 se selecciona mediante el método descrito anteriormente. Preferiblemente, en un caso en el que se subclona un hibridoma seleccionado y finalmente se confirma la producción del anticuerpo previsto, el hibridoma se selecciona como un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal.

Específicamente, el hibridoma previsto se puede seleccionar basándose en la reactividad con una célula humana o la reactividad con una célula transformada que expresa el gen PLD4. Un anticuerpo que se une a una célula puede detectarse según el principio de un inmunoensayo. Por ejemplo, puede usarse un ELISA, en el que se usa una célula como antígeno, en la detección del anticuerpo previsto. Específicamente, un sobrenadante de cultivo del hibridoma se pone en contacto con un portador que inmoviliza la pDC humana, o una célula transformada usada como inmunógeno. En el caso de que el sobrenadante del cultivo contenga el anticuerpo previsto, el anticuerpo es capturado por la célula inmovilizada sobre el portador. Luego, la fase sólida se aísla del sobrenadante del cultivo, se lava si es necesario y luego se puede detectar el anticuerpo capturado sobre la fase sólida. En la detección del anticuerpo, se puede utilizar un anticuerpo que reconozca el anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo de un ratón puede detectarse mediante un anticuerpo antiinmunoglobulina de ratón. Si el anticuerpo que reconoce un anticuerpo está marcado, la detección del mismo es fácil. Como marcador, se puede usar, por ejemplo, una enzima, un pigmento fluorescente o un pigmento luminiscente.

Por otro lado, como portador que inmoviliza la célula, se puede utilizar una partícula o la pared interna de una placa de microtitulación. La superficie de una partícula o un recipiente de plástico puede inmovilizar la célula por adsorción física. Por ejemplo, pueden usarse esferas o un recipiente de reacción hecho de poliestireno como vehículo para inmovilizar la célula.

Al seleccionar el hibridoma, puede producirse un caso en el que se predice no la producción de un anticuerpo contra PLD4, sino la producción de un anticuerpo contra una célula huésped de una célula transformada utilizada como inmunógeno. Por ejemplo, cuando se usa una célula humana como inmunógeno y se usa un ratón como animal para ser inmunizado como se muestra en los ejemplos, la célula humana es reconocida como una sustancia extraña y se prevé que se producirá un anticuerpo que se une a ella. En la descripción, se pretende la obtención de un anticuerpo que reconoce PLD4. Por consiguiente, no es necesaria la obtención de un anticuerpo que reconozca otros antígenos de células humanas además de PLD4. Para excluir un hibridoma que produce dicho anticuerpo mediante selección, se puede absorber preliminarmente un anticuerpo no previsto antes de la confirmación de la reactividad del anticuerpo.

Los anticuerpos que no están previstos pueden ser absorbidos por un antígeno que se une a un anticuerpo que se predice que existe. Específicamente, por ejemplo, un anticuerpo contra otros antígenos de células humanas distintos de PLD4 puede ser absorbido por una célula para la que no se puede detectar la expresión de PLD4. En la descripción, la célula huésped utilizada para el inmunógeno es preferible como antígeno para absorber anticuerpos no deseados.

Un anticuerpo monoclonal que tiene actividad de unión confirmada a un antígeno se confirma para una influencia práctica sobre la actividad de pDC, si es necesario. La influencia sobre las pDC puede confirmarse, por ejemplo, mediante un método que se describe a continuación.

El anticuerpo monoclonal se puede recolectar de un cultivo que se obtiene cultivando un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal. El hibridoma se puede cultivar in vitro o in vivo. En el cultivo in vitro, el hibridoma se puede cultivar usando un medio conocido, como RPMI 1640. Las inmunoglobulinas secretadas por el hibridoma se acumulan en el sobrenadante del cultivo. Por consiguiente, el anticuerpo monoclonal se puede obtener recogiendo el sobrenadante del cultivo y purificándolo si es necesario. La purificación de inmunoglobulinas es fácil en un medio al cual no se le agrega con el suero. Sin embargo, con el fin de un crecimiento rápido del hibridoma y la estimulación de la producción de anticuerpos, también se puede añadir al medio aproximadamente 10 % de suero fetal bovino.

El hibridoma también se puede cultivar in vivo. Específicamente, el hibridoma se puede cultivar en la cavidad abdominal inoculando el hibridoma en la cavidad abdominal de un ratón atímico. El anticuerpo monoclonal se acumula en la ascitis. Por consiguiente, la ascitis se recoge y se purifica si es necesario, para obtener el anticuerpo monoclonal necesario. El anticuerpo monoclonal obtenido puede modificarse o procesarse de manera adecuada dependiendo del objetivo.

El anticuerpo monoclonal se puede expresar adquiriendo ADNc que codifica la región de unión al antígeno del anticuerpo desde el hibridoma e insertándolo en un vector de expresión apropiado. Se conoce una tecnología para adquirir ADNc que codifica una región variable de un anticuerpo y lo expresa en una célula huésped apropiada. Además, se conoce una estrategia en la que una región variable que contiene una región de unión al antígeno se une a una región constante para producir un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un gen de una región variable puede producir un anticuerpo quimérico al unirse a genes que codifican una región constante de cadena pesada de IgG1 humana y una región constante de cadena ligera kappa de Ig humana, respectivamente. Además, se sabe que la actividad de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal se puede trasplantar a otra inmunoglobulina incorporando CDR, que constituyen una región variable en una región de marco de otra molécula de inmunoglobulina. Usando esto, se establece un método para trasplantar la actividad de unión al antígeno que posee una inmunoglobulina heterogénea a una inmunoglobulina humana. Por ejemplo, puede haber un caso en el que una secuencia de aminoácidos parcial de una región de marco que porta CDR se trasplante a una región variable humana desde una región variable de un anticuerpo de ratón. A continuación, estas regiones variables humanizadas y reconstituidas de un anticuerpo humano pueden unirse a una región constante de un anticuerpo humano, para obtener un anticuerpo humanizado.

Los ejemplos de anticuerpos monoclonales preferidos incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas mp5B7, mp7B4, mp13D4 y mp13H11, que se han depositado con los números de registro: NITE BP-1211, NITE BP-1212, NITE BP-1213 y NITE BP-1214, respectivamente.

Como anticuerpo quimérico que contiene la región variable, o el anticuerpo humanizado en el que se trasplanta una CDR que constituye la región variable, un anticuerpo que tiene una región constante derivada de IgG o IgM está contenido preferiblemente en el anticuerpo para su uso en la invención. Particularmente, el anticuerpo es más preferiblemente un anticuerpo que tiene una combinación de:

CDR1 de cadena pesada: DYNLH,

CDR2 de cadena pesada: YIYPYNGNTGYNQKFKR,

CDR3 de cadena pesada: GGIYDDYYDYAIDY y

CDR1 de cadena ligera: RASENIYSHIA,

CDR2 de cadena ligera: GATNLAH,

CDR3 de cadena ligera: QHFWGTP,

como una secuencia de CDR que constituye la región variable del anticuerpo, un anticuerpo que tiene una combinación de: CDR1 de cadena pesada: SHYYWT,

CDR2 de cadena pesada: YISYDGSNNYNPSLKN,

CDR3 de cadena pesada: EGPLYYGNPYWYFDV y

CDR1 de cadena ligera: RASQDIDNYLN,

CDR2 de cadena ligera: YTSRLHS,

CDR3 de cadena ligera: QQFNTLP,

como una secuencia de CDR que constituye la región variable, o un anticuerpo que tiene una combinación de: CDR1 de cadena pesada: SHYYWS,

CDR2 de cadena pesada: YISYDGSNNYNPSLKN,

CDR3 de cadena pesada: EGPLYYGNPYWYFDV y

CDR1 de cadena ligera: RASQDIDNYLN,

CDR2 de cadena ligera: YTSRLHS,

CDR3 de cadena ligera: QQFNTLP,

como una secuencia de CDR que constituye la región variable.

Los presentes inventores han confirmado que el anticuerpo monoclonal contra PLD4 tiene acción CDC para una célula de expresión de PLD4. Por consiguiente, el anticuerpo que tiene una región constante derivada de IgG o IgM, tiene una acción de citotoxicidad para una célula de expresión de PLD4 mediante la acción de CDC. Dicho anticuerpo es útil para suprimir el número de células de una célula de expresión de PLD4 como pDC.

Se puede preparar un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado que reconoce PLD4 mediante ingeniería genética usando un polinucleótido que los codifica.

No se obtuvo un anticuerpo que pueda reconocer específicamente PLD4. El inmunógeno de la descripción ha proporcionado por primera vez un anticuerpo que reconoce PLD4. Es decir, el anticuerpo que reconoce PLD4 se puede obtener mediante los procesos que se describen a continuación.

(1) un proceso de administración de una proteína que contiene un dominio extracelular PLD4, a un animal que se va a inmunizar,

(2) un proceso de selección de una célula productora de anticuerpos que produce un anticuerpo que se une a PLD4, a partir de células productoras de anticuerpos del animal inmunizado, y

(3) un proceso de cultivo de la célula productora de anticuerpos seleccionada en (2) y recogida de un anticuerpo que reconoce PLD4 del cultivo.

Se ha descubierto que PLD4 se expresa específicamente en pDC humana. La expresión específica en pDC humanas también fue confirmada por análisis de expresión génica con SAGE por los presentes inventores. Sin embargo, el nivel de expresión de PLD4 se analizó en base a ARNm en un informe del pasado. Además, se sabe que la proteína PLD4 se expresa solo en el citoplasma. La invención ha revelado que PLD4 también se expresa en la superficie celular. Dado que no se proporcionó un anticuerpo que pueda detectar PLD4, el análisis del estado de expresión de proteínas no se realizó de manera convencional. El anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PLD4 ha realizado un análisis de la proteína PLD4.

Como han confirmado de forma práctica los presentes inventores, el anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PLD4 ha detectado específicamente pDC humanas. Es decir, la descripción se refiere a un método para detectar una célula dendrítica plasmocitoide, que contiene las etapas de poner en contacto un anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PLD4, o un fragmento que contiene una región de unión al antígeno del mismo, con una célula de ensayo. y detectar un anticuerpo monoclonal que se une a la célula, o un fragmento que contiene una región de unión al antígeno del mismo.

Mediante la detección de PLD4, se puede confirmar si alguna célula es pDC o no. Es decir, la descripción proporciona un método para identificar pDC usando PLD4 como índice. Como alternativa, una célula para la que se detecta PLD4 puede aislarse basándose en la descripción, por lo que se pueden aislar pDC humanas. Es decir, la descripción proporciona un método para aislar pDC usando PLD4 como índice.

Puede marcarse un anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PLD4, o un fragmento que contiene una región de unión al antígeno del mismo. Por ejemplo, el anticuerpo puede detectarse fácilmente marcándolo con un pigmento luminiscente o un pigmento fluorescente. Más específicamente, el anticuerpo marcado con pigmento fluorescente se pone en contacto con una población celular que posiblemente contiene pDC, y una célula que se une al anticuerpo puede detectarse usando el pigmento fluorescente como índice. Además, si se aísla una célula detectada con el pigmento fluorescente, se pueden aislar pDC. Se pueden poner en práctica fácilmente una serie de etapas en el principio de FACS.

Como alternativa, el anticuerpo también puede estar unido a un portador en fase sólida, tal como una partícula magnética. El anticuerpo que está unido al portador en fase sólida reconoce PLD4, y la pDC se captura sobre el portador en fase sólida. Como resultado de ello, se pueden detectar o aislar pDC.

El anticuerpo que es necesario en el método de detección de pDC basado en la descripción puede suministrarse como reactivo para la detección de pDC. Es decir, la descripción proporciona un reactivo para la detección de pDC que contiene un anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PLD4, o un fragmento que contiene una región de unión al antígeno del mismo. En el reactivo para la detección de pDC de la descripción, se puede combinar un control positivo o un control negativo además del anticuerpo. Por ejemplo, una célula transformada que expresa el dominio extracelular de PLD4 usado como inmunógeno, o pDC recolectada de un ser humano, puede usarse como control positivo. Por lo general, solo se puede obtener una pequeña cantidad de pDC humanas a partir de la sangre periférica. Por consiguiente, una célula transformada es particularmente preferible como control positivo en el reactivo de la descripción. Por otro lado, como control negativo, se puede usar una célula arbitraria que no exprese PLD4.

Es decir, la descripción proporciona un kit para la detección de pDC humanas que contiene un anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PLD4, o un fragmento que contiene una región de unión al antígeno del mismo.

Además, los inventores analizaron la influencia del anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PLD4 en pDC. Como resultado de ello, se confirmó que el anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PLD4 suprime la actividad de pDC. Es decir, la descripción se refiere a un método para suprimir la actividad de una célula productora de interferón, que contiene una etapa de poner en contacto cualquiera de los componentes siguientes con pDC:

(a) un anticuerpo monoclonal que se une a PLD4 y suprime la actividad de pDC, o un fragmento que contiene una región de unión al antígeno del mismo, y

(b) una inmunoglobulina en la que se trasplanta una región determinante de complementariedad del anticuerpo monoclonal (a), o un fragmento que contiene una región de unión al antígeno del mismo.

Como alternativa, la descripción se refiere a un método para suprimir la actividad de pDC en un organismo vivo, que contiene una etapa de administración de cualquiera de los componentes siguientes a un organismo vivo:

(a) un anticuerpo monoclonal que se une a PLD4 y suprime la actividad de pDC, o un fragmento que contiene una región de unión al antígeno del mismo,

(b) una inmunoglobulina en la que se trasplanta una región determinante de complementariedad del anticuerpo monoclonal (a), o un fragmento que contiene una región de unión al antígeno del mismo, y

(c) un polinucleótido que codifica el componente descrito en (a) o (b).

La pDC en la invención se refiere a una célula que tiene capacidad de producción de IFN y que expresa PLD4 en la superficie celular. En lo sucesivo, a menos que se indique lo contrario en concreto, la pDC no es solo una célula que es una célula precursora de una célula dendrítica, sino que contiene una célula que tiene capacidad de producción de IFN y que expresa PLD4 en la superficie celular. Se conoce un método para identificar tal pDC. Por ejemplo, la pDC se puede distinguir de otras células sanguíneas utilizando varios marcadores de superficie celular como índice. Específicamente, el perfil de un marcador de superficie celular de pDC humana es como se describe a continuación (Shortman, K. y Liu, Y.J., Nature Reviews, 2:151-161,2002). En los últimos años, también se produjo un informe que incluyó a las células positivas para BDCA-2 en las pDC (Dzione k, A. et a l, J. Immunol., 165:6037-6046, 2000).

Perfil del antígeno de superficie celular de pDC humana:

CD4 positivo y CDI23 positivo.

Linaje (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 y CD56) negativo, CD11c negativo

Por consiguiente, una célula que tiene el perfil de expresión de estos marcadores conocidos y tiene capacidad de producción de IFN también puede denominarse pDC. Además, una célula que pertenece a una familia de células que tiene un perfil diferente del patrón de expresión del perfil de expresión de estos marcadores, pero que tiene capacidad de producción de IFN en un organismo vivo, se engloba en las pDC.

Además, los ejemplos de características comunes que presenta la pDC humana incluyen las características que se describen a continuación.

Característica morfológica de la célula

• Similar a una célula plasmática

• Célula redonda con superficie celular lisa

• Núcleo relativamente grande

Característica funcional de la célula

• Producción de una gran cantidad de IFN de tipo I en poco tiempo en el momento de la infección por el virus.

• Diferenciación en células dendríticas después de una infección por virus.

La supresión de la actividad de pDC en la invención se refiere a la supresión de al menos una de las funciones de las pDC. Los ejemplos de las funciones de las pDC incluyen la producción de IFN y la supervivencia celular. La supervivencia celular puede denominarse también como el número de células. Por consiguiente, la supresión de una o ambas de estas funciones se denomina supresión de la actividad de pDC. Se ha revelado que el IFN de tipo I producido por pDC es una causa de diversas enfermedades. Por consiguiente, la supresión del número de células pDC o la producción de IFN es útil como estrategia para tratar tales enfermedades.

Por ejemplo, se ha señalado la relación de las afecciones patológicas de una enfermedad autoinmunitaria con IFNa. La mayor parte del IFNa es producida por pDC. Por consiguiente, si se suprime su producción, se pueden aliviar las afecciones patológicas causadas por IFNa. Por otra parte, en la invención, la supresión de la producción de IFN por pDC se refiere a la supresión de la producción de al menos un tipo de IFN producido por pDC. El IFN en la invención es preferiblemente IFN de tipo I. Entre estos, el IFNa es importante.

Es decir, la invención se refiere a un supresor de la producción de IFN, que contiene el anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PLD4 como componente activo. Como alternativa, la descripción proporciona un método para suprimir la producción de IFN, que contiene un proceso de administración de un anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PLD4. Además, la descripción se refiere al uso de un anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PLD4 en la preparación de una composición farmacéutica que suprime la producción de IFN.

Una célula que produce una gran cantidad de IFN en un pequeño número de células está incluida en las pDC. Por ejemplo, una célula precursora de una célula dendrítica que es recibida con la estimulación por un virus produce la mayor parte del IFN producido por un organismo vivo. La supresión del número de células de pDC que produce una gran cantidad de IFN conduce a la supresión de la producción de IFN. Por consiguiente, la supresión del número de células pDC también puede aliviar las afecciones patológicas causadas por IFNa.

En un aspecto preferido de la invención, se confirmó que el anticuerpo monoclonal anti-PLD4 se une a una célula de expresión de PLD4 e imparte citotoxicidad mediante la acción de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

La acción de CDC es uno de los mecanismos de acción importantes de un fármaco de anticuerpo. El anticuerpo monoclonal anti-PLD4 también tiene una potente acción de citotoxicidad contra una célula de expresión de PLD4, como pDC, por la acción de CDC. Es decir, se puede esperar que el anticuerpo monoclonal anti-PLD4, en un aspecto preferido, tenga efectos de supresión de la producción de IFN no solo por un mecanismo de supresión de la producción de IFN, sino también por citotoxicidad para pDC.

El anticuerpo que reconoce un dominio extracelular de PLD4 usado en la invención puede obtenerse basándose en el método descrito anteriormente. El anticuerpo puede ser de cualquier clase. Además, la especie biológica de la que se deriva el anticuerpo no está limitada. Además, se puede utilizar como anticuerpo un fragmento que contiene una región de unión al antígeno del anticuerpo. Por ejemplo, puede usarse como anticuerpo un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de unión al antígeno producido por digestión enzimática de IgG. Específicamente, un fragmento de anticuerpo, tal como Fab o F(ab')2, puede obtenerse mediante digestión con papaína o pepsina. Es ampliamente conocido que estos fragmentos de anticuerpos pueden usarse como una molécula de anticuerpo que tiene afinidad de unión por un antígeno. Como alternativa, también se puede usar un anticuerpo construido por recombinación génica siempre que mantenga la actividad de unión al antígeno necesaria. Los ejemplos del anticuerpo construido por recombinación génica incluyen un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de trasplante de CDR, un Fv monocatenario sencilla, un diacuerpo (diacuerpos), un anticuerpo lineal y un anticuerpo poliespecífico formado por un fragmento de anticuerpo. Se conoce un método de obtención de estos anticuerpos basado en un anticuerpo monoclonal.

El anticuerpo puede modificarse, si es necesario. El anticuerpo que reconoce un dominio extracelular de PLD4 tiene la acción de suprimir la actividad de pDC. Es decir, se ha contemplado la posibilidad de que el propio anticuerpo tenga citotoxicidad para pDC. Se conoce una subclase del anticuerpo que exhibe una fuerte acción efectora. Como alternativa, los efectos de la supresión de la actividad de las pDC se pueden incrementar más modificando el anticuerpo con un agente citotóxico. Los ejemplos del agente citotóxico incluyen los agentes descritos a continuación.

Toxinas: endotoxina de Pseudomonas (PE), toxina diftérica y ricina

Isótopo radiactivo: Tc99m, Sr89, 1131 e Y90

Agente anticanceroso: caliqueamicina, mitomicina y paclitaxel

Las toxinas que contienen una proteína pueden unirse, por ejemplo, a un anticuerpo o un fragmento del mismo mediante un reactivo bifuncional. Como alternativa, un gen que codifica las toxinas también puede conjugarse con un gen que codifica el anticuerpo, para obtener una proteína de fusión de estas. También se conoce un método de unión de un isótopo radiactivo a un anticuerpo. Por ejemplo, se conoce un método para marcar un anticuerpo con un isótopo radiactivo usando un agente quelante. Además, un agente anticáncer puede unirse a un anticuerpo usando, por ejemplo, una cadena de azúcar o un reactivo bifuncional.

En la invención, también se puede utilizar como componente activo un anticuerpo con estructura modificada artificialmente. Por ejemplo, se conocen varias modificaciones para mejorar la citotoxicidad o la estabilidad de un anticuerpo. En concreto, se conoce una inmunoglobulina, en la que se modifica la cadena de azúcar de la cadena pesada (Shinkawa, T. et al., J. Biol. Chem., 278:3466-3473. 2003). La modificación de la cadena de azúcar aumenta la actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) de la inmunoglobulina.

El anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PLD4 suprime la actividad de la pDC cuando el anticuerpo se pone en contacto con la pDC. Por consiguiente, tal anticuerpo puede usarse como un agente para suprimir la actividad de pDC, o en un método para suprimir la pDC. Es decir, la descripción proporciona un agente para suprimir la actividad de pDC, que contiene al menos un tipo de componente seleccionado de un grupo que consiste en (a) y (b) descritos a continuación como un componente activo. Como alternativa, la descripción se refiere a un método para suprimir la actividad de pDC, que contiene una etapa de administrar al menos un tipo de componente seleccionado de un grupo que consiste en (a) y (b) descritos a continuación. Además, la descripción se refiere al uso de al menos un tipo de componente seleccionado de un grupo que consiste en (a) y (b) descritos a continuación en la preparación de un agente para regular la actividad de pDC.

(a) Un anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PLD4, o un fragmento que contiene una región de unión al antígeno del mismo,

(b) una inmunoglobulina en la que se trasplanta una región determinante de la complementariedad del anticuerpo monoclonal (a), o un fragmento que contiene una región de unión al antígeno del mismo.

Como anticuerpo monoclonal que suprime la actividad de pDC en la descripción, puede usarse un anticuerpo monoclonal que reconoce un dominio extracelular de PLD4. En la descripción se pueden usar una o varias clases de anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, pueden mezclarse múltiples especies de anticuerpos monoclonales que reconocen un dominio extracelular de PLD4 y usarse en la descripción.

El hecho de que el anticuerpo tenga la acción de suprimir la actividad de producción de IFN de pDC puede confirmarse de la manera que se describe a continuación. La pDC produce una gran cantidad de IFN tras la estimulación viral. El anticuerpo se administra a pDC antes, después o al mismo tiempo que la estimulación viral, y la capacidad de producción de IFN se compara con un control en el que el anticuerpo no se administra a la pDC. La capacidad de producción de IFN se puede evaluar midiendo el IFN-a o IFN-p contenido en el sobrenadante de un cultivo de pDC. Como resultado de la comparación, si la cantidad de IFN en el sobrenadante se reduce significativamente mediante la adición del anticuerpo, se puede confirmar que el anticuerpo ensayado tiene la acción de suprimir la capacidad de producción de IFN. Se conoce un método para medir estos IFN. La pDC es una célula que produce la mayor parte del IFN en un organismo vivo. Por consiguiente, la supresión de la capacidad de producción de IFN de pDC puede regular el estado de producción de IFN en un organismo vivo.

La actividad de pDC en la invención abarca el mantenimiento del número de células de pDC. Por consiguiente, la supresión de la actividad de pDC en la invención incluye la supresión del número de células de pDC. Si se confirma que el número de células de pDC se suprime en presencia del anticuerpo, se considera que el anticuerpo suprime la actividad de pDC. De manera similar a la producción de IFN, una inmunoglobulina inactiva que se deriva de la misma especie animal que la especie del anticuerpo cuya actividad se va a confirmar puede usarse como control para la comparación. El número de células de pDC se puede comparar cuantitativamente mediante recuento de células. El número de células se puede contar con FACS o con un microscopio.

Además, también se supone que la pDC se diferencia en una célula que induce Th2 denominada célula dendrítica 2 (DC2) como resultado de una infección, por ejemplo, por un virus. Si se suprime la pDC que produce IFN tras la estimulación del virus, existe la posibilidad de que también se pueda suprimir la diferenciación a Th2. Por consiguiente, también se puede esperar que el anticuerpo monoclonal que suprime la producción de IFN tenga efectos terapéuticos para diversas enfermedades alérgicas.

En un caso en el que el anticuerpo que reconoce un dominio extracelular de PLD4 se administra a un huésped que es diferente de la especie biológica de la que se deriva el anticuerpo, resulta deseable procesar el anticuerpo para producir una forma que difícilmente sea reconozca como sustancia extraña por el huésped. Por ejemplo, se puede hacer que la inmunoglobulina sea apenas reconocida como una sustancia extraña procesando la molécula como se describe a continuación. Se conoce un método de procesamiento de una molécula de inmunoglobulina como se describe a continuación.

• Un fragmento que contiene la región de unión al antígeno, de la cual se elimina la región constante (Monoclonal antibodies: Principles and Practice, tercera edición, Academic Press Limited. 1995; Antibody Engineering, A Practial Approach, IRL p ReSS, 1996)

• Un anticuerpo quimérico constituido con una región de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal y una región constante de inmunoglobulina del huésped (Gen Expression Experiment Manual, Kodansha Ltd., 1994 (editado por Isao ISHIDA y Tamie ANDO))

• Un anticuerpo con CDR sustituida, en el que la región determinante de complementariedad (CDR) en una inmunoglobulina del huésped se sustituye por una CDR de un anticuerpo monoclonal (Gen Expression Experiment Manual, Kodansha Ltd., 1994 (editado por Isao ISHIDA y Tamie ANDO))

Como alternativa, el gen de una región variable de inmunoglobulina humana también puede adquirirse mediante el método de presentación con fagos (McCafferty J. etal., Nature, 348:552-554, 1990; Kretzschmar T. et al., Curr. Opin. Biotechnol., diciembre de 2002, 13(6):598-602). En el método de presentación con fagos, el gen que codifica la región variable de inmunoglobulina humana se incorpora al gen del fago. Utilizando varios genes de inmunoglobulina como fuente, también se puede preparar un banco de fagos. Un fago expresa la región variable como una proteína de fusión de la proteína que ella misma constituye. La región variable expresada en la superficie del fago por el fago mantiene la actividad de unión al antígeno. Por consiguiente, la selección de un fago que se une a un antígeno o, por ejemplo, una célula en la que se expresa el antígeno, puede seleccionar un fago en el que se expresa una región variable que tiene la actividad de unión deseada a partir de un banco de fagos. Además, una partícula del fago así seleccionada conserva un gen que codifica la región variable que tiene la actividad de unión deseada. Es decir, un gen que codifica una región variable que tiene la actividad de unión deseada puede adquirirse usando la actividad de unión de la región variable como índice en el método de presentación con fagos.

El anticuerpo que reconoce un dominio extracelular de PLD4, o un fragmento de anticuerpo que contiene al menos su región de unión al antígeno en el agente para suprimir la actividad de pDC, o el método para suprimir la actividad de pDC, se puede administrar como una proteína o un polinucleótido que codifica la proteína. Al administrar el polinucleótido, es deseable utilizar un vector en el que un polinucleótido que codifica la proteína deseada se dispone bajo el control de un promotor apropiado para expresar la proteína deseada. En el vector, también se puede disponer un potenciador o un terminador. Se conoce un vector que conserva genes de cadena pesada y cadena ligera que constituyen una inmunoglobulina y que puede expresar la molécula de inmunoglobulina. El vector que puede expresar una inmunoglobulina se puede administrar introduciéndolo en una célula. En la administración a un organismo vivo, un vector que puede infectar una célula al administrarse a un organismo vivo puede administrarse tal cual. Como alternativa, también puede introducirse primero un vector en un linfocito aislado de un organismo vivo y devolverse nuevamente al organismo vivo (ex vivo).

La cantidad de anticuerpo monoclonal que se administra a un organismo vivo en el agente para suprimir la actividad de la pDC, o el método para suprimir la pDC, suele ser de 0,5 mg a 100 mg, por ejemplo, de 1 mg a 50 mg, preferiblemente de 2 mg a 10 mg por 1 kg de peso corporal como una inmunoglobulina. El intervalo de administración del anticuerpo a un organismo vivo puede regularse adecuadamente de modo que se pueda mantener una concentración eficaz de la inmunoglobulina en el organismo durante el período de tratamiento. Específicamente, la administración se puede realizar, por ejemplo, en un intervalo de 1 a 2 semanas. La vía de administración es arbitraria. Un experto en la técnica puede seleccionar adecuadamente una vía de administración eficaz en el tratamiento. Específicamente, los ejemplos de la vía de administración incluyen la administración oral o no oral. Por ejemplo, el anticuerpo se puede administrar sistémica o localmente mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal o inyección subcutánea. Los ejemplos de una formulación apropiada para la administración no oral en la invención incluyen una inyección, un supositorio y un pulverizado. Además, en un caso en el que se administra una inmunoglobulina a una célula, la inmunoglobulina se administra a un líquido de cultivo habitualmente en 1 pg/ml, preferiblemente 10 pg/ml o más, más preferiblemente 50 pg/ml o más, y más preferiblemente 0,5 mg/ml o más.

En el agente para suprimir la actividad de pDC o en el método para suprimir la actividad de pDC, el anticuerpo monoclonal puede administrarse mediante cualquier método a un organismo vivo. Normalmente, el anticuerpo monoclonal se mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Junto con el anticuerpo monoclonal, se pueden mezclar aditivos tales como un agente espesante, un estabilizante, un conservante y un agente solubilizante si es necesario. Los ejemplos de tales vehículos o aditivos incluyen lactosa, ácido cítrico, ácido esteárico, estearato de magnesio, sacarosa, almidón, talco, gelatina, agar, aceite vegetal y etilenglicol. Los términos denominados "farmacéuticamente aceptables" se refieren a los aprobados por la supervisión gubernamental de cada país, o los enumerados en una farmacopea de cada país o una farmacopea generalmente reconocida para su uso en un animal, un animal mamífero y particularmente en un ser humano. El agente para suprimir la actividad de las pDC también se puede suministrar en forma de polvo liofilizado o comprimido en una dosis única o en dosis múltiples. El comprimido o polvo liofilizado se puede combinar además con agua esterilizada, disolución salina fisiológica o una disolución tampón para inyección para disolver la composición hasta una concentración deseada antes de la administración.

Además, en un caso en el que el agente para suprimir la actividad de pDC se administra como un vector de expresión de inmunoglobulina, la cadena pesada y la cadena ligera se cotransfectan con un plásmido separado, y cada uno de los plásmidos se puede administrar en 0,1 a 10 mg, por ejemplo, de 1 a 5 mg por 1 kg de peso corporal. Además, se usa un vector de 1 a 5 pg/106 células para la introducción en una célula in vitro. En lo sucesivo, la invención se explicará más específicamente en base a los ejemplos.

Aunque la invención se describirá más específicamente con los ejemplos siguientes, la invención no se limita en absoluto a dichos ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1

A. Análisis de la expresión de PLD4

A-1) Análisis usando un banco de SAGE

Las expresiones de genes en pDC en reposo, monocitos humanos y pDC activadas tratadas con virus del herpes inactivo (HSV-1) se compararon mediante el método SAGE™ (Análisis en serie de expresión génica). El método de análisis es el que se describe a continuación.

A partir de sangre periférica humana, se aisló el monocito como una célula CD14 positiva, y la célula pDC humana se aisló como célula BDCA-4 positiva con el kit de aislamiento BDCA-4+ (empresa Miltenyi Biotec) y el sistema MACS (empresa Miltenyi Biotec). Además, la célula pDC humana se cultivó durante 12 horas en presencia de HSV-1 inactivo, para preparar la pDC activada (pDC HSV). Se extrajo el ARN total de cada una de las células y se preparó el banco de SAGE utilizando el kit I-SAGE™ (empresa Invitrogen). Los datos obtenidos de aproximadamente 100.000 secuencias de bases marcadas se analizaron con el software de análisis SAGE2000 (empresa Invitrogen). Como resultado de ello, el valor de puntuación de monocitos/pDC/pDC HSV fue de 0/9/0 genes, es decir, se encontró PLD4 (familia de fosfolipasa D, miembro 4, C14orf175; número de registro de GenBank: NM_138790.2) , que es un gen conocido por mostrar expresión específica de células pDC en reposo (figura 1, Tao et al., Nat. Methods, 2(8), 591-598 (2005); Clark et al., Genome Res., 13(10), 2265-2270 (2003)). PLD4 es una secuencia de 506 aminoácidos (SEQ ID NO:1) codificada por una secuencia de bases representada por SEQ ID NO:44. La proteína PLD4 tiene dos regiones PDE provisionales (motivo de fosfodiesterasa) constituidas con dos motivos HKD (secuencia de aminoácidos His-x-Lys-xxxx-Asp, la x son los otros aminoácidos) conservados en la región C-terminal, y un sitio de fosforilación provisional (Thr 472). La estructura de la proteína PLD4 se predice como proteína transmembrana monotrópica de tipo II. Además, la proteína PLD4 no tiene región PX (dominio de homología Phox) ni región PH (dominio de homología de pleckstrina) en la región N-terminal, que sí poseen PLD1 y PLD2 que pertenecen a la familia de PLD clásica (figuras 1 y 2).

A-2) Análisis de expresión de ARNm de PLD4 en diversas células humanas responsables de la inmunidad mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Se revisó específicamente la expresión de ARNm de PLD4 en una célula sanguínea. A partir de sangre periférica humana, se aislaron cada una de las células y se extrajeron mediante un clasificador de células. A partir de cada una de las familias de células aisladas y extraídas, se extrajo el ARN y se sintetizó el ADNc. Utilizando el ADNc obtenido como molde, se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real y se analizó el nivel de expresión del ARNm de PLD4.

Para la reacción de PCR cuantitativa en tiempo real, la PCR cuantitativa se realizó con ABI PRISM 7000 usando el kit Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG (empresa Invitrogen). En el análisis de los datos se utilizó el software del sistema de detección de secuencias (empresa Applied Biosystem). Las condiciones de la reacción de PCR y la secuencia de bases de los cebadores usados son las siguientes.

Cebador directo para PLD4: 5' ATG GAC TGG CGG TCT CTG 3' (SEQ ID NO:45)

Cebador inverso para PLD4: 5' TGG AAG GTC TTC TCC AGG TC 3' (SEQ ID NO:46)

Cebador directo para GAPDH: 5' AGC CAC ATC GCT CAG ACA C 3' (SEQ ID NO:47)

Cebador inverso para GAPBH: 5' GCC CAA TAC GAC CAA ATC C 3' (SEQ ID NO:48)

1 ciclo a 58 °C durante 2 minutos,

1 ciclo a 95 °C durante 10 minutos,

50 ciclos de [95 °C durante 15 segundos y 60 °C durante 60 segundos],

Fueron estudiadas pDC, pDC (pDC HSV) estimuladas con HSV, células B (células CD19+), células B activadas (células CD19+), células T (células CD3+) y células T activadas estimuladas con inomicina y PMA (12-miristato 13-acetato de forbol). Como resultado, se observó que la expresión de PLD4 era específicamente alta en las pDC en el estadio de reposo y baja en las células B CD19+. Con el otro ADNc de la fracción de sangre humana se utilizaron paneles de ADNc de múltiples tejidos BD™ MTC (n.° de cat. 636750, empresa Takara Bio) (figura 5).

A-3) Análisis de expresión de ARNm de PLD4 en tejido humano mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Además, las expresiones en otros órganos o tejidos se revisaron mediante PCR cuantitativa utilizando ABI PRISM 7000 (empresa Applied Biosystem). Como panel de ADNc, se utilizó el panel de ADNc de múltiples tejidos BD™ MTC (humano I; n.° de cat. 636742, Inmunológico humano; n.° de cat. 636748; todos de la empresa Takara Bio). Las secuencias de bases de los cebadores usados se representan como sigue.

Cebador directo para PLD4: 5' ATG GAC TGG CGG TCT CTG 3' (SEQ ID NO:49)

Cebador inverso para PLD4: 5' TGG AAG GTC TTC TCC AGG TC 3' (SEQ ID NO:50)

Cebador directo para GAPDH: 5' AGC CAC ATC GCT CAG ACA C 3' (SEQ ID NO:51)

Cebador inverso para GAPDH: 5' GCC CAA TAC GAC CAA ATC C 3' (SEQ ID NO:52)

La PCR cuantitativa se realizó con ABI PRISM 7000 utilizando el kit Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG (empresa Invitrogen). En el análisis se utilizó el software del sistema de detección de secuencias (empresa Applied Biosystem). Las condiciones de reacción son las que se describen a continuación.

Etapa 1: 1 ciclo a 50 °C durante 2 minutos

Etapa 2: 1 ciclo a 95 °C durante 10 minutos

Etapa 3:50 ciclos a 95 °C durante 15 segundos y a 60 °C durante 1 minuto

Las expresiones de los genes PLD4 se compararon entre cada uno de los tejidos mediante estandarización con el nivel de expresión génica de GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa), que se sabe que se expresa homeostáticamente. Como resultado de ello, el ARNm de PLD4 exhibió una expresión relativamente alta en el bazo y leucocitos de sangre periférica. Además, se reveló que el ARNm de PLD4 se expresaba ampliamente en otros tejidos. Sin embargo, el nivel de expresión del ARNm de PLD4 era menos de 100 veces el nivel de expresión de la célula pDC en reposo (Figura 6).

Preparación de un vector de expresión de PLD4 humano

La preparación del vector de expresión del gen PLD4 se realizó para expresar una proteína PLD4 humana. A partir del clon de ADNc de PLD4 incorporado en un vector de clonación pCR4-TOPO (Open Biosystem, n.° de cat. MHS4771-99610856), solo se extrajo el gen PLD4 con la enzima EcoRI y se incorporó a un vector de expresión pcDNA3.1 (vector PLD4 humana-pcDNA3.1). Usando el plásmido PLD4 humana-pcDNA3.1 obtenido como molde, el gen PLD4 se amplificó con un cebador que contenía secuencias EcoRI, Not I y Kozak (GCC GCC ACC) (la información de los cebadores es como se describe a continuación). El producto de PCR se clonó en los sitios EcoRI y Not I con el vector de retrovirus pMX-IP (vector de retrovirus PLD4 humana-pMX-IP). En la reacción de PCR, se utilizó 1 unidad de ADN polimerasa KOD Plus (empresa TOYOBO) y las condiciones de reacción fueron 1 ciclo a 94 °C durante 2 minutos, y luego 25 ciclos de [94 °C durante 15 segundos y 68 °C durante 1 minuto y 30 segundos].

Cebador directo (SEQ ID NO: 53): 5' ttt GAATTC gcc gcc acc ATG CTG AAG CCT 3' (30-mero)

Cebador inverso (SEQ ID NO: 54): 5' aaa gcg gcc gcT CAG CCC TGC CAA ACG CAG TCC T 3' (34-mero)

Junto con el análisis de secuencia, se transfectó transitoriamente la célula HEK (riñón embrionario humano)-293T (en adelante, célula 293T) con el vector retrovírico PLD4 humana-pMX-IP, y se confirmó si la PLD4 humana se expresaba en la superficie de la célula 293T con tinción celular y luego con el método FACS.

Ejemplo 2

Análisis de la especificidad del anticuerpo anti-PLD4 humana

El hecho de que el anticuerpo monoclonal anti-PLD4 no se cruza con otras moléculas de la familia de PLD puede confirmarse empleando una célula en la que cada uno de los miembros de la familia de PLD se expresa obligatoriamente. La PLD4 humana pertenece a la familia de PLD y hay múltiples moléculas que tienen una alta homología. La PLD4 humana muestra aproximadamente 41 % de homología con la PLD3 humana y aproximadamente 29,3 % de homología con la PLD5 humana (figura 4).

1) Preparación de vectores de expresión de PLD3 humana y PLD5 humana

Para la PLD3 humana (ADNc, SEQ ID NO:55; aminoácidos, SEQ ID NO:127) y la PLD5 humana (ADNc, SEQ ID NO:56; aminoácidos, s Eq ID NO:123) del clon de PLD3 humana (empresa K.K.DNAFORM, n.° de cat. 5189261) incorporado en el vector pCMV-SPORT6, y el clon de PLD5 humana (empresa K.K.DNAFORM, n.° de cat. 40025860) incorporado en el vector pCR-Blunt II-TOPO, solo los genes PLD3 y PLD5 fueron amplificados con PCR, y cada uno de los genes fue clonado en los sitios Hind III y EcoRI de pcDNA3.1 marcado con Flag (empresa Invitrogen), con lo que se prepara un vector de expresión (la información de los cebadores es como se describe a continuación).

Para la PLD3 humana:

Cebador directo: huPLD3-IF (Hind III)

Secuencia: 5' ttt AAG CTT gcc gcc acc ATG AAG CCT AAA CTG ATG TAC 3' (39-mero), SEQ ID NO:57) Cebador inverso: huPLD4-1518R (EcoRI)

Secuencia: 5' ttt gaa ttc TCA ctt ate gtc gtc ate ctt gta ate GAG CAG GCG GCA GGC GTT GCC 3 ’ (57-mero), (SEQ ID NO: 58)

Para PLD5 humana:

Cebador directo: huPLD5-IF (Hind III).

Secuencia: 5' ttt AAG CTT gcc gcc acc ATG GGA GAG GAT GAG GAT GGA 3' (39-mero), (SEQ ID NO:59) Cebador inverso: huPLD5-1383R (EcoRI)

Secuencia: 5' ttt gaa ttc TCA ctt ate etc gtc ate ctt gta ate TAC GTT CCG GGG ATC CTT TCC 3' (57-mero), (SEQ ID NO: 60)

Entre las secuencias de cebadores mencionadas anteriormente, las partes subrayadas representan secuencias de bases que codifican los marcadores FLAG añadidos, y la cursiva representa el sitio de corte Hind III o el sitio EcoRI de las enzimas de restricción.

Junto con el análisis de secuencia, la célula 293T se transfectó transitoriamente con el vector PLD3 humana-pcDNA3.1 o el vector PLD5 humana-pcDNA3.1, y se confirmó si la PLD4 humana se expresaba en la superficie de la célula 293T con tinción celular, y luego con el método FACS.

Como resultado de ello, los anticuerpos no reaccionaron con una célula en la que parecía expresarse la PLB3 humana o la PLD5 humana, lo que sugirió que estos anticuerpos anti-PLD4 reconocían moléculas de PLD4 humana específicamente (figura 8).

Preparación de una cepa estable de células de expresión PLD4 humana

El vector PLD4 humana-pMX-IP preparado se cotransfectó a células 293T junto con el vector pCL-Eco (IMGENEX, n. ° de cat. 10045P), que es un vector de encapsulación de retrovirus, por lo que se realiza la introducción de genes. El experimento de introducción de genes utilizó el reactivo de transfección FuGENE (marca registrada) HD (Roche) como reactivo de transfección. Después de 2 días, se recogió el sobrenadante del cultivo celular, al cual se secretó el retrovirus que contenía el gen de PLD4 humana, y se infectó con la cepa de células CT125 (serie de células tumorales de linfocitos de células T de ratón 2B4). Debido al hecho de que el vector de retrovirus pMX-IP contiene un gen resistente a puromicina, el cultivo de células CT125 infectadas en presencia de puromicina permite la supervivencia solo de las células que expresan la PLD4 humana, lo que conduce a su selección. Las células CT 125 de expresión de PLD4 humana seleccionadas (en lo sucesivo, CT125-PLD4 humana) se seleccionaron después solo para las células CT125 que permiten una mayor expresión de PLD4 humana mediante clasificación FACS, y se cultivaron. Para la confirmación de la expresión de PLD4 humana, las células CT125 se tiñeron con anticuerpo policlonal de ratón anti-PLD4 humana disponible en el mercado (Abnova, n.° de cat. HOO122618-B01P) ajustado a 5 pg/mL, y se realizó el análisis FACS. Como resultado de ello, se estableció una cepa estable de células CT125-PLD4 humana y se usó en la selección con FACS del hibridoma.

Construcción de vectores de expresión de PLD4 de mono cynomolgus y mono rhesus, y preparación de una cepa estable de células de expresión de PLD4 humana

Para las expresiones de las proteínas PLD4 de mono cynomolgus y mono rhesus, se realizó la clonación del gen PLD4 de mono y la construcción de vectores de expresión.

1) Clonación del gen PLD4 de mono cynomolgus y del gen PLD4 de mono rhesus

La secuencia de ADNc de PLD4 del mono rhesus se ofrece, por ejemplo, en la base de datos de Genbank (XM_002805227.1), pero no se ofrece su ADNc de longitud total y parcial. Además, dado que la secuencia del gen PLD4 del mono cynomolgus aún no se ha ofrecido, se realizó la clonación de genes a partir de PBMC (10 ml, respectivamente; Sh IN NIPPON BIOMEDICAL LABORATORIES, LTD.) de mono cynomolgus y de mono rhesus.

Se extrajo el ARN total de la sangre periférica del mono y, a partir de 5 pg del mismo, se sintetizó ADNc usando un cebador de oligo-dT y el kit SuperScript Choice System para la síntesis de ADNc.

Utilizando el ADNc preparado como molde, el gen PLD4 de mono cynomolgus y el gen PLD4 de mono rhesus se amplificaron con el método de PCR utilizando los cebadores con las siguientes secuencias de bases.

Cebador directo (cynoPLD4-32F): 5' AGA TGC TGA AGC CTC TTC GGA GAG Cg 3' (SEQ ID NO:61)

Cebador inverso (cynoPLD4-1554R): 5' TCA GCC CTG CCAAAC GCA GTC CTG G 3' (SEQ ID NO:62)

Aproximadamente 1521 pares de bases amplificadas de PLD4 de mono cynomolgus y 1521 pares de bases de un fragmento de ADNc de PLD4 de mono rhesus se aislaron mediante electroforesis utilizando gel de agarosa al 1 %, y se recogieron y clonaron en el vector de plásmido pCR4Blunt-TOPO (empresa Invitrogen) utilizando el kit de clonación de PCR Zero Blunt TOPO (empresa Invitrogen). Se analizaron las secuencias de bases del gen obtenido, que están representadas por SEQ ID NO:63 y SEQ ID NO:124. Se confirmó que la PLD4 de mono cynomolgus y el gen PLD4 de mono rhesus previstos podían clonarse.

La proteína PLD4 humana tiene aproximadamente 94,4 % de identidad con la secuencia de proteína con PLD4 de mono cynomolgus (SEQ ID NO:129), y aproximadamente 94 % de identidad con la secuencia de proteína con PLD4 de mono rhesus (SEQ ID NO:130). La figura 14 ilustra la homología de las secuencias de proteínas de PLD4 humana con PLD4 de mono cynomolgus, pLd4 de mono rhesus y PLD4 de ratón (ADNc, SEQ ID nO:131; aminoácidos, SEQ ID NO:132).

2) Preparación de una cepa estable de células de expresión de PLD4 de mono cynomolgus

La cepa estable de células de expresión de PLD4 de mono cynomolgus se estableció cultivando células CT 125 infectadas con un vector de retrovirus en presencia de puromicina, con el mismo método que el método de preparación de la cepa estable de células de expresión de PLD4 humana utilizando el vector PLD4-pMX-IP de mono cynomolgus preparado.

Para la confirmación de la expresión de PLD4 de mono cynomolgus, las células se tiñeron con anticuerpo policlonal de ratón anti-PLD4 humana disponible en el mercado (Abnova, n.° de cat. H00122618-B01P) que presenta reactividad cruzada también con PLD4 de mono, y se realizó un análisis FACS. Como resultado de ello, se estableció la cepa estable de células CT125-PLD4 de mono cynomolgus, y se usó en la selección con FACS del hibridoma (figura 16).

Preparación de una proteína de fusión de PLD4 humana-Ig

Para su uso como inmunógeno en la preparación de un anticuerpo monoclonal anti-PLD4 humana, se fusionaron 2142 pb de un fragmento de ADN, en el que la región extracelular de la proteína PLD4 humana (56-506 aa) y el fragmento Fc de IgG2a de ratón (234 aa que contiene una porción del bisagra de cadena pesada, CH2 y CH3), se amplificaron con el método de PCR de 2 etapas, y se construyeron plásmidos de vector de expresión de PLD4 humana-Ig pcDNA3.1 y PLD4 humana-Ig pEE14.4 (las secuencias del ADNc y la proteína se especifican en la lista de secuencias).

Para obtener una proteína a partir del sobrenadante del cultivo, se transfectó transitoriamente ADN de Maxi-prep a la célula Freestyle 293F (en lo sucesivo, célula 293F, n.° de catálogo R790-07; Invitrogen). El día 7 después de la transfección, el líquido de cultivo de la célula 293F cotransfectada se recogió en un tubo de 50 ml y se centrifugó en condiciones de 2.070 g a 4 °C durante 5 minutos. El sobrenadante se filtró con un filtro de jeringa que tenía un tamaño de poro de 0,45 pm (n.° de catálogo 431220; CORNING) y los sobrenadantes del cultivo se recogieron juntos.

El sobrenadante del cultivo celular recogido se purificó con una columna de afinidad de proteína A del sistema AKTA-FPLC, y se purificó la proteína de la proteína de fusión de PLD4 humana-Ig recombinante (figura 7).

Ejemplo 3

A. Preparación de un anticuerpo monoclonal anti-PLD4 humana

A-1) Inmunización

Como inmunógeno, se utilizó la proteína de fusión de Ig-PLD4 recombinante mencionada anteriormente. La proteína de fusión de PLD4-Ig se administró por vía subcutánea a la parte posterior de 3 ratones de ratón BALB/c. Se usaron adyuvante de Freund, completo e incompleto (SIGMA) como adyuvante, y se administraron 200 pg/ratón la primera vez y 50 pg/ratón de la segunda a la cuarta vez.

A-2) Confirmación del título del antisuero

La sangre se recogió después de la tercera inmunización y la cuarta inmunización, y el título de anti-PLD4-Ig en el suero se evaluó con ELISA.

La proteína de fusión de PLD4-Ig se preparó en fase sólida en una placa de microtitulación de 96 pocillos. El antisuero se diluyó de modo discontinuo desde 1000 veces en 3 veces, y se prepararon series de dilución hasta 729.000 veces. Cada una de las muestras se añadió a la placa con el antígeno en fase sólida a 50 pl y se realizó la reacción primaria. Después del lavado, se realizó una reacción secundaria con anticuerpo anti-IgG de ratón (k, A) marcado con HRP y se detectó el color (490 nm) con OPD (orto-fenilendiamina).

A-3) Fusión celular

Se aislaron células esplénicas de un ratón en el que se reconoció un aumento del título del antisuero. La célula esplénica aislada y la célula de mieloma de ratón (P3U1) se fusionaron con el método PEG, y la selección y el cultivo de la célula esplénica de fusión se realizó a partir de medio HAT.

Selección FACS del hibridoma utilizando células CAL-1

Los anticuerpos que producen cada clon de la célula esplénica de fusión obtenida a partir del cultivo de selección HAT se evaluaron con FACS. Se hicieron reaccionar células CAL-1 de la cepa de células similares a pDC humanas en 2 x 105 con 50 pl del sobrenadante del cultivo de cada uno de los hibridomas descritos a continuación durante 15 minutos a 4 °C. Las células se lavaron con tampón FACS (FBS al 1 % PBS) dos veces, se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante. La reacción se realizó durante 20 minutos a 4 °C usando anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con PE (BD Bioscience: 550589) como anticuerpo secundario. El líquido de cultivo después de 10 días desde el inicio del cultivo de selección con HAT se utilizó como número de veces original para el sobrenadante de cultivo de cada clon. Como resultado de ello, 3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 1³ H¹1, 14C1 y 11G9.6 de los sobrenadantes del cultivo de hibridoma reaccionaron bien con la célula CAL-1 (figura 11).

Selección con FACS del hibridoma utilizando una cepa de células estables CT125-PLD4 humana

Los anticuerpos que producen cada clon de la célula esplénica de fusión obtenida del cultivo de selección HAT se evaluaron con FACS. Se hicieron reaccionar CT 125-PLD4 humana en 2 x 105 durante 15 minutos a 4 °C con 50 pl de sobrenadante de cultivo de cada uno de los hibridomas descritos a continuación. Las células se lavaron con tampón FACS (FBS al 1 % PBS) dos veces, se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante. La reacción se realizó durante 20 minutos a 4 °C usando anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con PE (BD Bioscience: 550589) como anticuerpo secundario. Como resultado de ello, 3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 14C1 y 11G9.6 de los sobrenadantes del cultivo de hibridoma reaccionaron bien con la célula CT 125-PLD4 humana (figura 12).

A-5) Selección con FACS utilizando pDC de sangre periférica humana

Aislamiento de PBMC humanas

Se recolectaron 20 mL de sangre periférica de un individuo sano, y se aislaron las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con una centrifugadora de gravedad específica usando HISTOPAQUE-1077 (empresa SIGMA). Se tiñeron 1 x 106 PBMC para cada muestra. Las células se lavaron con tampón FACS y luego se añadieron 25 pl de una dilución en 5 veces de reactivo de bloque Fc (empresa Militenyi) y se hicieron reaccionar a 4 °C durante 15 minutos. Las células se lavaron con tampón FACS y luego se añadieron 50 pl del sobrenadante del cultivo celular de cada hibridoma e IgG2b, k de ratón, y se hicieron reaccionar a 4 °C durante 20 minutos. Las células se lavaron con tampón FACS y luego se añadieron con anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con PE y se hicieron reaccionar a 4 °C durante 20 minutos. Las células se lavaron con tampón FACS y luego se añadieron 50 pl de una dilución en 10 veces de anticuerpo anti-BDCA2 marcado con APC y se hicieron reaccionar a 4 °C durante 20 minutos. Las células se lavaron con tampón FACS y luego se resuspendieron en 300 pl de tampón FACS y se analizaron con FACS Calibur (BD). El anticuerpo mp11 G9.6 mostró unión a pDC (figura 10).

Además, 9 tipos de anticuerpos de PLD4 de 3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13Hll y 14C1 mostraron una reacción de unión específica para la población de células pDC, que es una célula positiva para BDCA2 (figura 13).

A-6) Reactividad cruzada del anticuerpo anti-PLD4 con mono

Selección con FACS del hibridoma utilizando la cepa de células estables CT125-PLD4 de mono cynomolgus y una célula transfectante transitoria 293T-PLD4 de mono rhesus

Los anticuerpos que producen cada clon de la célula esplénica de fusión obtenida a partir del cultivo de selección HAT se evaluaron con FACS. Se hicieron reaccionar CT125-PLD4 humana en 2 x 105 con 50 pl de sobrenadante de cultivo de cada uno de los hibridomas descritos a continuación durante 15 minutos a 4 °C. Las células se lavaron con tampón FACS (FBS al 1 % PBS) dos veces, se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante. La reacción se realizó durante 20 minutos a 4 °C usando anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con PE (BD Bioscience: 550589) como anticuerpo secundario. Como resultado de esto, 7 tipos de anticuerpos 3B4, 5B7, 7B4, 13D4, 13H11, 14C1 y 11G9.6 entre 10 tipos de los anticuerpos de PLD4 reaccionaron bien contra la célula CT125-PLD4 de mono cynomolgus y la célula PLD4-293T de mono rhesus. (figura 15, figura 16 y figura 17).

A-7) Reactividad cruzada del anticuerpo anti-PLD4 con PBMC de mono

Se centrifugaron PBMC de mono rhesus de sangre periférica (10 ml; SHIN NIPPON BIOMEDICAL LABORATORIES, LTD.) con gravedad específica utilizando 96 % de Ficoll-Paque (marca comercial) PLUS (empresa GE Healthcare, n.° de cat. 17-1440-02). Para FACS, se utilizaron 5 x 105 células por muestra. Las células se lavaron con tampón celular FACS y luego se añadieron 10 pl de suero de mono cynomolgus al 10 % diluido con tampón FACS y se hicieron reaccionar a 4 °C durante 20 minutos. Las células se lavaron con tampón FACS y luego se añadieron 100 pl del sobrenadante del cultivo celular de cada hibridoma y 10 pg/ml de IgG2a, k de ratón o IgG1, k de ratón, y se hicieron reaccionar a 4 °C durante 15 minutos. Las células se lavaron con tampón FACS y luego se añadieron 1 pg/ml de anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con APC y se hicieron reaccionar a 4 °C durante 20 minutos. Las células se lavaron con tampón FACS y luego se hicieron reaccionar con 25 pL de dilución en 10 veces de anticuerpo anti-linaje 1 marcado con FITC, anticuerpo anti-CD123 marcado con PE y anticuerpo anti-HLA-DR marcado con PcrCP-Cy5.5. a 4 °C durante 15 minutos. Las células se lavaron con tampón FACS y luego se resuspendieron en 300 pl de tampón FACS y se analizaron con FACS calibur. El sobrenadante del cultivo de hibridoma usado era específico para PLD4, y se seleccionaron 10 tipos de 3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 14C1 y 11G9.6 que se unieron bien a la célula CAL-1 o la pDC humana. Como resultado de ello, 5 tipos de sobrenadantes de cultivo de células de hibridoma, concretamente, 5B7, 7B4, 13D4, 13H11 y 14C1, se unieron específicamente a la población de células pDC de mono cynomolgus (linaje-CD 123+ HLA-DR+) (figura 18).

A-8) Clonación del hibridoma mediante el método de dilución limitante

1) Clonación y segunda selección mediante el método de dilución limitante

Para la clonación de 9 tipos seleccionados (3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11 y 14C1) de hibridomas excepto el hibridoma 11 G9.6, se realizó una dilución limitante. La dilución limitante se sembró en 2 secciones de una placa de 96 pocillos. Después de 6 días desde la siembra, las células se observaron al microscopio y se recogieron los sobrenadantes de cultivo derivados de monoclones y que mostraron un buen crecimiento en todos los pocillos. Se realizó un análisis FACS para el sobrenadante de cultivo recogido como muestra.

En el análisis FACS, el antígeno de superficie de la cepa celular CAL-1 se tiñó usando el sobrenadante de cultivo de cada clon, seguido de anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con PE (BD Bioscience: 550589) como anticuerpo secundario. Como sobrenadante de cultivo de cada clon, el líquido de cultivo después de 7 días desde la siembra de la dilución limitante se usó como número de veces original.

2) Clonación y tercera selección

Basándose en los resultados del análisis FACS de la segunda selección y del estado de las células en cada pocillo, se seleccionó 1 pocillo de cada clon y se realizó de nuevo una dilución limitante. La dilución limitante se realizó de manera similar a la de 2), y se realizó el análisis FACS (3°) para el sobrenadante del cultivo recolectado como muestra. En base a los datos del análisis FACS y similares, se clonaron los siguientes 9 tipos (3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11 y 14C1) de los clones mediante el método de dilución limitante, y se estableció el hibridoma que produce el anticuerpo anti-PLD4 humana como cepa celular estable.

3) Conversión a hibridoma único 11 G9.6

El hibridoma 11G9.6, distinto de los 9 tipos antes mencionados, se recogió y se suspendió con un tampón de clasificación (FBS al 1 %/PBS) para obtener 1 x 105 células/mL. La clasificación de células individuales se realizó utilizando FACS Aria (BD). Los datos se incorporaron y los datos incorporados se desarrollaron en un diagrama de puntos bidimensional con eje X: FSC y eje Y: SSC. En el diagrama de puntos, las células vivas se rodearon con una ventana de análisis. La ventana de análisis se cubrió para excluir el doblete de las células en la ventana de análisis de células vivas, la población de células se aisló y se llevó a una placa plana de 96 pocillos para obtener 1 célula/pocillo. Las células, después de la clasificación de células individuales, se cultivaron en medio HAT (RPMI 1640+ L-glutamina 2 mM, 10 unidades/ml de penicilina-estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, 2-ME 50 pM) suplemento de crecimiento de hibridoma HFCS (empresa Roche). Luego, se tiñeron las células CAL-1, la cepa celular estable de expresión de CT125-PLD4 humana, las PBMC humanas y la cepa celular estable de expresión de CT125-PLD4 de mono usando el sobrenadante de cultivo celular del hibridoma, y se seleccionó 11G9.6 de un único hibridoma.

4) Preparación de un vial de células congeladas y recolección del sobrenadante del cultivo

Basándose en los resultados del análisis FACS descritos anteriormente y el estado celular de cada pocillo, se seleccionó 1 pocillo de cada clon. Para el pozo seleccionado, el cultivo de expansión se realizó a una escala de 50 mL. El medio era RPMI 1640 que contenía FCS al 10 % y penicilina estreptomicina. Las células se cultivaron hasta ser subconfluentes, y se congelaron y se conservaron a un número de células de 1 x 106 células/tubo. Como líquido para congelar y conservar, se utilizó BAMBANKER (NIPPON Genetics, Co. Ltd.). Además, se recogió y conservó el sobrenadante del cultivo en este momento.

Ejemplo 4

Purificación de anticuerpos

Se obtuvieron 10 clases (3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 14C1 y 11G9.6) de anticuerpos purificados a partir de los sobrenadantes del cultivo de los hibridomas mediante purificación utilizando una columna de afinidad de proteína A (rProtein A Sepharose Fast Flow (n.° de catálogo 17-1279-01, empresa GE Healthcare). Los isotipos se confirmaron usando el kit de isotipificación de mAb de ratón Pierce Rapid ELISA (empresa Thermo Fisher Scientific). Como resultado, 3B4 y 14C1 fueron IgG1, k, de ratón, 10C3 fue IgG2a, k, de ratón y las otras fueron IgG2b, k, de ratón. Se realizó la medición de la concentración de endotoxina, ya que si el anticuerpo purificado contenía endotoxina, esto podría influir en los resultados de un ensayo de determinación de propiedades. Los kits utilizados fueron el equipo Endospecy ES-50M, el equipo Toxicolor DIA-MP y el equipo de patrones de endotoxina CSE-L (empresa SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION). Como resultado, la concentración de endotoxina de cualquier anticuerpo purificado fue de 0,3 UE/mg o menos Ab que era el valor de referencia.

Análisis de la reactividad del anticuerpo purificado

La capacidad de unión del anticuerpo purificado se confirmó con la célula CAL-1 que es una cepa de células de tipo pDC humanas. Como resultado, se pudo confirmar que cualquier anticuerpo mantenía la capacidad de unión a PLD4 humana en la superficie celular (figura 11). Además, el anticuerpo también se unió específicamente a la población de células pDC (BDCA2+) de sangre periférica humana (figura 13).

Cálculo del valor de Kd del anticuerpo de PLD4 purificado

Para la capacidad de unión del anticuerpo purificado, se hizo reaccionar la cepa celular estable de expresión CT 125-PLD4 humana hasta casi 100 % de la tasa de tinción positiva a una concentración baja hasta una concentración alta (0,001 pg/ml a 30 pg/ml) de concentración de anticuerpo de PLD4 purificado. Se analizaron los datos de la frecuencia de tinción de células positivas y del anticuerpo usando el software Graph Pad Prism versión 5, y se calculó la concentración molar de la constante de disociación (valor Kd) en unidades nM. Debido al hecho de que los valores de Kd (nM) de los anticuerpos anti-PLD4 eran todos de 1 nM o menos, o casi 1 nM excepto los 2 clones de 3B4 y 14C1, los anticuerpos anti-PLD4 se unieron muy fuertemente a la célula CT125-PLD4 humana (figura 19).

Ejemplo 5

Actividad de citotoxicidad dependiente del complemento del anticuerpo anti-PLD4 para la célula de expresión CT125-PLD4 humana

La actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (en lo sucesivo, denominada actividad CDC) del anticuerpo anti-PLD4 se midió para la cepa estable de células CT125 que expresa PLD4 humana (en lo sucesivo, referida como HuPLD4-CT-125) utilizando suero de conejo inmaduro como complemento. fuente. El índice de actividad fue la toxicidad celular calculada a partir del valor medido de lactasa deshidrogenasa (LDH) liberada desde la célula. Cada célula se dispensó a una placa de fondo en U de 96 pocillos a 2 x 104 células/50 pL/pocillo. Se preparó complemento de cría de conejo al 1 % (empresa CEDARLANE) en medio CDC (RPMI 1640 BSA al 0,1 % HEPES 10 mM L-glutamina 2 mM penicilina-estreptomicina al 1 %). Las células se añadieron con 10 pg/ml de anticuerpo de control de isotipo de ratón (IgG2b, ^k, de ratón) y 10 tipos de anticuerpos de ratón purificados anti-PLD4 (3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 14C1, y 11G9.6) y se hizo reaccionar durante 1 hora. Para el sistema de ensayo, se utilizó el kit de ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96 (empresa Promega). Como resultado de ello, para la célula diana de HuPLD4-CT-125, 8 tipos de anticuerpos de PLD4 (5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11 y 11G9.6) exhibieron una actividad CDC de aproximadamente 33,5 % al 71,1 % a 10 pg/ml de concentración de anticuerpo, excepto 2 tipos de anticuerpos de PLD4, 3B4 y 14C, cuyo isotipo de cadena pesada era IgG1 de ratón (figura 20).

Ejemplo 6

Se ajustó un anticuerpo de control de isotipo de ratón con actividad de citotoxicidad dependiente del complemento y dependiente de la concentración (IgG2b, k de ratón) del anticuerpo anti-PLD4 (11 G9.6), anticuerpo de ratón anti-PLD4 (mp11 G9.6 Ab), anticuerpo de control de isotipo humano (IgG1, ^k, humana) y anticuerpo quimérico anti-PLD4 (ch11G9 Ab) a un total de 6 puntos de la concentración de anticuerpo de 0,1 pg/ml a 30 pg/ml. Como sistema de ensayo, se utilizó el kit de ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96 (empresa Promega). Como resultado de ello, para la célula diana de HuPLD4-CT-125, mp11G9.6Ab exhibió aproximadamente 70 % de actividad CDC dependiente de la concentración a 3 pg/ml de la concentración de anticuerpo. Por otro lado, ch11G9Ab, que era un anticuerpo quimérico, exhibió 10 % o menos de la actividad CDC incluso a la alta concentración de 30 pg/ml (figura 21).

Ejemplo 7

Preparación de un anticuerpo quimérico

Se prepararon 10 tipos como un hibridoma que produce anticuerpo de ratón anti-PLD4 y se usaron.

1. Confirmación del isotipo de la región constante

Se confirmó el isotipo de la región constante del anticuerpo de ratón anti-PLD4 producido a partir del hibridoma que produce el anticuerpo anti-PLD4. A partir de los sobrenadantes del cultivo de los hibridomas de los 10 tipos (3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13h 11, 14C1 y 11G9.6), se confirmó el isotipo utilizando el kit de isotipificación de mAb de ratón Pierce Rapid ELISA (empresa Thermo Fisher Scientific). Como resultado de ello, 3B4 y 14C1 fueron IgG 1 de ratón e Ig kappa de ratón, 10C3 fue IgG2a de ratón e Ig kappa de ratón, y los otros fueron IgG2b de ratón e Ig kappa de ratón.

2. Clonación de ADNc que codifica la región variable del anticuerpo de ratón anti-PLD4

2-1) Aislamiento del ARN total

A partir del hibridoma 11 G9.6, se aisló el ARN total usando un kit disponible en el mercado, "RNeasy Mini Kit" (empresa Qiagen, n.° de catálogo: 74106) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al kit. Fue preparado a partir de 5 x 106 células de la cepa de células de hibridoma y se obtuvieron aproximadamente 79 pg de ARN total.

2-2) Amplificación y fragmentación del ADNc que codifica la región variable de cadena pesada de ratón

Se utilizaron 5 pg del ARN total aislado en 2-1) y se amplificó el ADNc que codifica la región variable de cadena pesada de ratón mediante el método de 5' RACE PCR. En la amplificación, se usó un kit disponible en el mercado, "5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA ENDs, Version 2.0 Kit" (empresa Invitrogen, n.° de catálogo: 18374-058). Los detalles son los siguientes. Primero, el ADNc monocatenario fue sintetizado por una enzima de transcripción inversa a partir del ARN total obtenido en 2-1). En ese momento, el cebador antisentido (GSP1) usado era el siguiente. Los cebadores GSP1 usados en la amplificación del ADNc se usaron de manera diferente dependiendo del isotipo de cada cadena pesada de ratón.

Por ejemplo, en la clonación de las regiones variables de cadena pesada de los hibridomas 3B4 y 14C1 que contienen cadenas pesadas de IgG1 de ratón, se utilizan los siguientes cebadores antisentido.

Cebador GSP1: mu IgG1VH-GSP1

Secuencia: 5'-CCA GGA GAG TGG GAG AGG CTC TTC TCA GTA TGG TGG-3 ' (36-mero), (SEQ ID NO:64)

Cebador GSP2: mu IgG1VH-GSP2

Secuencia: 5'-GGC TCA GGG AAA TAG CCC TTG ACC AGG CAT CC-3' (32-mero), (SEQ ID NO:65)

En la clonación de las regiones variables de cadena pesada del hibridoma 10C3 que contiene la cadena pesada de IgG2a de ratón, se utilizan los siguientes cebadores antisentido.

Cebador GSP1: mu IgGHY1 -GSP1

Secuencia: 5' TCC AGA GTT CCA GGT CAC TGT CAC 3' (24-mero), (SEQ ID NO:66)

Cebador GSP2: mu IgGHYl-GSP2

Secuencia: 5' AGG GGC CAG TGG ATA GAC AGA TGG 3' (24-mero), (SEQ ID NO:67)

En la clonación de las regiones variables de cadena pesada de los hibridomas 5B7, 7B4, 8C11, 11D10, 13D4, 13H11 y 11G9.6 que contienen la cadena pesada de IgG2b de ratón, se utilizan los siguientes cebadores antisentido.

Cebador GSP1: mu IgGHY2B-GSP1

Secuencia: 5' TCC AGA GTT CCA AGT CAC AGT CAC 3' (24-mero), (SEQ ID NO:68)

Cebador GSP2: mu IgGHY2B-GSP2

Secuencia: 5' AGG GGC CAG TGG ATA GAC TGA TGG 3' (24-mero), (SEQ ID NO:69)

Además, al extremo 3'-terminal del ADNc monocatenario se le añadió dC, que es un homopolímero de nucleótidos, usando desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT). Luego, el ADNc se amplificó mediante el método de PCR usando un cebador de anclaje que contiene un polímero de nucleótidos complementario a dC (secuencia de anclaje) (SEQ ID NO:70) en el extremo 3'-terminal y un cebador antisentido (GSP2). Además, el ADNc se amplificó mediante el método de PCR anidada usando el producto de PCR obtenido como molde y usando el cebador AUAP (SEQ ID NO:71) y el cebador antisentido que se muestra en la tabla 1 (GSP2). Además, este producto de PCR se purificó mediante el método de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5 %.

Cebador de anclaje para 5' RACE (SEQ ID NO:70)

5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3' (36-mero)

Cebador AUAP para 5' RACE (SEQ ID NO:71)

5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3' (20-mero)

2-3) Amplificación y fragmentación del ADNc que codifica la región variable de cadena ligera del ratón

El ADNc que codifica la región variable de cadena ligera de ratón se amplificó a partir del ARN total aislado en 2-1), de manera similar a 2-2). En ese momento, los cebadores GSP1 usados en la amplificación de ADNc se usaron de manera diferente dependiendo del isotipo de cada cadena ligera de ratón.

Se utilizan los siguientes cebadores antisentido para la clonación de cadenas ligeras, ya que los 10 tipos de anticuerpos de PLD4 tienen una cadena ligera de Ig kappa de ratón.

Cebador GSP1: mu IgG VL kappa-GSP1

Secuencia: 5'-CAC TAC TTC CTG TTG AAG CTC TTG ACG ATG G-3' (31-mero), (SEQ ID NO:72)

Cebador GSP2: mu IgG VL kappa-GSP2

Secuencia: 5'-GTG AGT GGC CTC ACA GGT ATA GC-3' (23-mero), (SEQ ID NO:73)

El producto de PCR obtenido se purificó mediante el método de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5 %.

2-4) Confirmación de la secuencia de bases del ADNc y determinación de la región CDR

Los fragmentos de ADNc de la región variable de cadena pesada obtenidos en 2-2) y la región variable de cadena ligera obtenida en 2-3) se clonaron, respectivamente, con el vector pCR4Blunt-TOPO utilizando un kit disponible en el mercado "Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit" (Empresa Invitrogen, n.° de catálogo: 1325137), de acuerdo con las instrucciones adjuntas al kit, y se transformaron en un célula competente de Escherichia coli para obtener un transformante de Escherichia coli. Se obtuvo un plásmido de este transformante, y la muestra de ADN plasmídico se envió para análisis de la secuencia a la empresa Operon Biotechnology Co. Ltd (Tokio), y se confirmó la secuencia de bases de ADNc en el plásmido. En el análisis de la secuencia, se utilizaron los software "Sequencher DNA Sequencher DNA Assembly and Analysis software versión 4.2.2 (Gene Codes Corporation)" y "GENeTy X-MAC Version. 11.1.1" (GENETYX CORPORATION)".

Se extrajo un transcrito de una secuencia correcta excluyendo un transcrito de ARN inactivo, ya que se producen desplazamientos de marco, mutaciones sin sentido y similares en la periferia de una región determinante de complementariedad (en lo sucesivo denominada "región CDR"). Además, para la secuencia de bases del ADNc contenida en el plásmido, se confirmó la homología con una base de datos de inmunoglobulinas (IgBLAST, URL: www.ncbi.nlm.nih.gov/Igblast/), y las secuencias de la región CDR en cada región variable (CDR; CDR1, CDR2 y CDR3), la región FW (regiones de trabajo del marco) y las regiones variables se determinaron de acuerdo con el método de análisis del sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91-3242, 5a ed., United States Department of Health and Human Services, Bethesda, MD).

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6 de ratón obtenido es SEQ ID NO:74, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:75. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6 de ratón son SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SeQ ID NO:4, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 3B4 de ratón obtenido es SEQ ID NO:76, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:77. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 3B4 de ratón son SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:10, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5B7 de ratón obtenido es SEQ ID NO:78, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:79. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5B7 de ratón son SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:16, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4 de ratón obtenido es SEQ ID NO:80, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:81. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4 de ratón son SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:16, respectivamente. El anticuerpo 7B4 es un anticuerpo que tiene las mismas secuencias CDR de la región variable de cadena pesada y cadena ligera que las del anticuerpo 5B7.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 8C11 de ratón obtenido es SEQ ID NO:82, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:83. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 8C11 de ratón son SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 10C3 de ratón obtenido es SEQ ID NO:84, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:85. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 10C3 de ratón son SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11D10 de ratón obtenido es SEQ ID NO:86, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:87. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11D10 de ratón son SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28, respectivamente. El anticuerpo 11D10 es un anticuerpo que tiene la misma secuencia CDR de la región variable de cadena ligera que la cadena pesada del anticuerpo 10C3. Sin embargo, el isotipo de la cadena pesada (10C3 es la región constante de la IgG2a de ratón y 11D10 es la región constante de la IgG2b de ratón) es diferente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13D4 de ratón obtenido es SEQ ID NO:88, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:89. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13D4 de ratón son SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 y SEQ ID NO:34, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H11 de ratón obtenido es SEQ ID NO:90, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:91. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H11 de ratón son SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 y SEQ ID NO:40, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14C1 de ratón obtenido es SEQ ID NO:92, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:93. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14C1 de ratón son SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 y SEQ ID NO:40, respectivamente. El anticuerpo 14C1 es un anticuerpo que tiene las mismas secuencias de CDR de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera que las del anticuerpo 13H11. Sin embargo, el isotipo de la cadena pesada (13H11 es la región constante de IgG2b de ratón y 14C1 es la región constante de IgG1 de ratón) es diferente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11G9.6 de ratón es SEQ ID NO:94, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:95. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la luz La región variable de la cadena del anticuerpo 11G9.6 de ratón son SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:7, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 3B4 de ratón es SEQ ID NO:96, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:97. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo de ratón 3B4 son SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 y s Eq ID NO:13, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5B7 de ratón es SEQ ID NO:98, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:99. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5B7 de ratón son SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 y s Eq ID NO:19, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 7B4 de ratón es SEQ ID NO:100, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:101. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 7B4 de ratón son SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 y s Eq ID NO:19, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 8C11 de ratón es SEQ ID NO:102, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:103. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 8C11 de ratón son SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 y s Eq ID NO:25, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 10C3 de ratón es SEQ ID NO:104, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:105. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 10C3 de ratón son SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 y s Eq ID NO:31, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11D10 de ratón es SEQ ID NO:106, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:107. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11D10 de ratón son SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 y SEQ ID NO:31, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13D4 de ratón es SEQ ID NO:108, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:109. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13D4 de ratón son SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36 y s Eq ID NO:37, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13H11 de ratón es SEQ ID NO:100, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:111. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13H11 de ratón son SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:43, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14C1 de ratón es SEQ ID NO:112, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:113. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14C1 de ratón son SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42 y s Eq ID NO:43, respectivamente.

3. Preparación del vector de expresión del anticuerpo quimérico 11G9.6

3-1. Clonación del ADNc que codifica la región constante de Ig humana

A partir del ARN total de PBMC humanas, se clonaron los ADNc de la región constante de cadena pesada de IgG1 humana y la región constante de cadena ligera kappa de Ig humana, y se clonaron con el vector pCR4Blunt-TOPO, respectivamente, utilizando un kit disponible en el mercado, "Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit" (fabricado por la empresa Invitrogen, n.° de catálogo: 1325137) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al kit, y se transformaron en una célula competente de Escherichia coli para obtener un transformante de Escherichia coli. Se obtuvo un plásmido de este transformante y la muestra de ADN plasmídico se envió para el análisis de la secuencia a Operon Biotechnology Co. Ltd (Tokio), y se confirmó la secuencia de bases del ADNc en el plásmido.

3-2. Preparación del ADNc que codifica la cadena pesada del anticuerpo de PLD4 quimérico

El ADNc que codifica la cadena pesada de un anticuerpo de PLD4 quimérico se preparó mediante acoplamiento con el vector de expresión pEE6.4 que contiene la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6 de ratón obtenido en 2-2, y la región constante de cadena pesada de la IgG1 humana. La región variable de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6 de ratón se amplificó con un método de PCR y se obtuvo un producto de PCR de aproximadamente 450 bases de longitud. En ese momento, el cebador es como se muestra en la tabla 1. El producto de PCR obtenido se purificó mediante el método de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5 %.

Tabla 1

Tabla 1

La región variable de cadena pesada del anticuerpo 11 G9.6 de ratón obtenido en 2-2 se sometió a un método de PCR para obtener un producto de PCR que codifica la región variable de cadena pesada de 11G9.6. El producto de PCR que codifica la región variable de cadena pesada del 11G9.6 se digirió con las enzimas de restricción Hind III y Apa I y se purificó con el método de gel de agarosa al 1,5 %. Este se disolvió en ddH²O, que se tomó como una disolución de un fragmento de ADNc que codifica la región variable de cadena pesada.

El ADNc obtenido se amplificó con PCR a partir del clon del plásmido pCR4Blunt-TOPO que contenía la región V^h de 11G9.6, utilizando los cebadores chi11 G9VH-IF (Hind III) y chi11G9VL-408R, en los que se introdujeron los sitios de restricción (Hind III y Apa I) preferidos para la clonación de la región de código V^h de 11G9.6 quimérico en el vector pEE6.4 (fabricado por Lonza Biologics, Slough, Reino Unido) y la secuencia Kozak ideal (GCCGCCACC), como sitios de clonación de Hind III y Apa I. El vector chi11G9VH-pEE6.4 contiene la región constante de cadena pesada de la IgG1 humana. El fragmento de PCR DE V^h se insertó en el vector pEE6.4 dentro de marco utilizando Hind III y Apa I. La construcción se investigó mediante análisis de secuencia de bases del ADNc. Para el análisis de la secuencia, la muestra de ADN plasmídico se envió a Operon Biotechnology Co. Ltd (Tokio) y se confirmó la secuencia de bases del ADNc en el plásmido.

3.3 Preparación del ADNc que codifica la cadena ligera del anticuerpo de PLD4 quimérico

Para preparar el ADNc que codifica la cadena ligera del anticuerpo de PLD4 quimérico, la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11 G9.6 de ratón obtenida en 2-3 y la región constante de cadena ligera de la Ig kappa humana obtenida en 3-2 se fusionaron para obtener un fragmento de PCR, y el fragmento de PCR se amplificó a un producto de PCR de aproximadamente 730 bases de longitud mediante una estrategia basada en un método de PCR de extensión por solapamiento.

El producto de PCR que codifica la región variable de cadena ligera del 11 G9.6 se digirió con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, y se purificó con el método de gel de agarosa al 1,5 %. Este se disolvió en ddH²O, que se tomó como una disolución de un fragmento de ADNc que codifica la región variable de cadena ligera.

El ADNc obtenido que codifica V^l del 11G9 quimérico se amplificó con PCR a partir del clon del plásmido pCR4Blunt-TOPO que contenía la región V^l de 11 G9.6, utilizando los cebadores chi11G9VL-IF (Hind) y chi11G9VL-726R (RI), en los que se introdujeron los sitios de restricción (Hind III y EcoR I) preferidos para la clonación del vector pEE14.4 (fabricado por Lonza Biologics) y la secuencia ideal de Kozak. El vector chi11G9VL-pEE14.4 contiene la región constante de cadena ligera de kappa. El fragmento de PCR de V^l se insertó en el vector pEE14.4 dentro de marco utilizando Hind III y EcoR I. La construcción se investigó mediante análisis de la secuencia de bases del ADNc.

3.4 Construcción del vector de expresión Lonza de doble gen del anticuerpo de PLD4 quimérico (ch11G9VH/VL)

El vector de expresión Lonza del anticuerpo de PLD4 quimérico (vector chi11G9DG) combinado en un vector de 2 genes se construyó a partir del vector de expresión de la cadena pesada del anticuerpo de PLD4 quimérico (chi11G9VH-pEE6.4) y el vector de cadena ligera del anticuerpo de PLD4 quimérico (chi11G9VL-pEE14.4) mediante la tecnología de clonación convencional.

4. Expresión transitoria en la célula 293F

Se usaron 80 pg de ADN del vector Lonza chillG9DG, un plásmido de vector de expresión transitoria.

Se combinaron células 293F con 80 ml a 8 x 105 células/mL en matraz Erlenmyer de 250 mL (n.° de catálogo 431144; fabricado por CORNING) el día anterior a la transfección, y se cultivaron en las condiciones de 37 °C y 8 % de concentración de CO² durante 7 días con agitación.

Después del cultivo durante 7 días, el líquido de cultivo de la célula 293F transfectada se recogió en un tubo de 50 ml y se centrifugó en las condiciones de 2.070 g a 4 °C durante 5 minutos. El sobrenadante se filtró con un filtro de jeringa que tenía un tamaño de poro de 0,45 pm (n.° de catálogo 431220; fabricado por CORNING) y el sobrenadante del cultivo se recogió para la purificación del anticuerpo.

5. Purificación del anticuerpo quimérico anti-PLD4

Utilizando el sobrenadante del cultivo recogido, se realizó la purificación del anticuerpo utilizando AKTA-FPLC (fabricado por GE Healthcare Japan) y el software Unicorn 5.0.

Como columna para la purificación del anticuerpo quimérico 11G9.6, se utilizó HiTrap MabSelect SuRe 1 ml (n.° de catálogo 11 -0034-93, n.° de lote 10032458; fabricado por GE Healthcare Japan). Las condiciones de la columna fueron las siguientes. La purificación por afinidad se realizó usando un tampón de unión (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,4) y un tampón de elución (citrato de sodio 20 mM, pH 3,4). Para reemplazar el tampón del anticuerpo después de la purificación con PBS, se realizó un intercambio de tampón utilizando la unidad de diálisis Slide-A-Lyzer MINI 10kMWCO.

La concentración del anticuerpo purificado se calculó midiendo la absorbancia a 280 nm, en la que 1 mg/ml se calculó como una DO de 1,38.

Para el ch11G9.6Ab del anticuerpo quimérico anti-PLD4 purificado, se analizó la calidad de la proteína con el método de la citometría de flujo y SDS-PAg E.

Ejemplo 8

Se midió la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (actividad ADCC) del anticuerpo quimérico anti-PLD4 humana preparado (ch11 G9.6 Ab). Para la actividad, se utilizó como índice la toxicidad celular calculada a partir del valor de medición de la lactasa deshidrogenasa (LDH) liberada de la célula. La célula mononuclear de sangre periférica humana que se convirtió en una célula efectora se purificó con una centrífuga de gravedad específica usando HISTOPAQUE-1077. Como la célula diana, se usó una célula transformada obligatoria del gen de PLD4 humana que emplea una cepa de células CHO-K1 (cepa de células de ovario de hámster chino) (en adelante, HuPLD4-CHO) (2 x 104/pocillo). El efector y la célula diana se mezclaron en una proporción de 10:1,20:1,40:1 y 80:1, y se agregaron 10 mg/mL de ch11G9Ab o anticuerpo de control de isotipo (IgG1, k, humana), cultivado a 37 °C durante 4 horas, y se evaluó el efecto de la actividad citotóxica del anticuerpo. Como resultado de ello, ch11G9Ab del anticuerpo quimérico anti-hPLD4 exhibió un máximo de aproximadamente 50 % de actividad ADCC con las células HuPLD4-CHO que eran la diana, dependiendo de la célula efectora (figura 22). Dichos resultados demostraron que el anticuerpo quimérico anti-PLD4 preparado dañaba las células que expresaban PLD4 de forma selectiva.

Se analizaron los efectos del anticuerpo anti-PLD4 sobre pDC. Se purificaron PBMC de sangre periférica humana, se mezclaron con 10 pg/ml de anticuerpo quimérico anti-PLD4 humana y se cultivaron durante 24 horas. Luego, las células se estimularon durante 24 horas con CpG2216, que es un ligando del receptor 9 de tipo Toll expresado en pDC, para inducir la producción de IFNa. Después de la estimulación con CpG, se ensayó la cantidad de IFNa producido y se confirmó que la producción de IFNa se inhibió completamente mediante el tratamiento con ch11G9Ab del anticuerpo quimérico anti-PLD4 (figura 23). En cuanto a este mecanismo, se descubrió que cuando las células se recolectaron 24 horas después del tratamiento con ch11G9Ab, y las células pDC se confirmaron con tinción triple del anticuerpo anti-CD123, anticuerpo anti-HLA-DR y anticuerpo anti-linaje 1, la población de células pDC disminuyó más que con el tratamiento con el anticuerpo de control de isotipo (IgG1, k, humana) (figura 24). Estos resultados indicaron que el anticuerpo quimérico anti-PLD4 dañó a las pDC que expresaban específicamente PLD4 y, como resultado de ello, se inhibió la producción de IFNa mediante la estimulación con CpG2216.

Además de ch11G9.6Ab, se examinó la función biológica de Ab quiméricos anti-PLD4, tales como ch3B4Ab, ch5B7Ab, ch8C11Ab, ch10C3Ab, ch13D4Ab, ch13H11Ab en pDC primarias humanas. Para examinar el ensayo de ADCC en busca de pDC, se cultivaron PBMC humanas completas con ch3B4Ab, ch5B7Ab, ch8C11Ab, ch10C3Ab, ch13D4Ab, ch13H11Ab, ch11G9.6Ab o Ab de isotipo durante 14 h. Las células se recolectaron y se tiñeron con BDCA2 y BDCA4 para identificar las pDC mediante citometría de flujo. El tratamiento con los Ab quiméricas de PLD4 disminuyó completamente las pDC, en comparación con las PBMC tratadas con Ab de isotipo (figura 25). La producción de IFNa también se midió en el cultivo de PBMC con los Ab quiméricos anti-PLD4. Se trataron PBMC humanas completas con ch3B4Ab, ch5B7Ab, ch8C11Ab, ch10C3Ab, ch13D4Ab, ch13H11Ab, ch11G9.6Ab o Ab de isotipo. 24 horas más tarde, se añadió CpG2216 inducible por IFNa al cultivo y las células se cultivaron adicionalmente durante 24 h. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron y se midió la producción de IFNa mediante ELISA. Todas las PBMC tratadas con Ab quimérico de PLD4 abolieron completamente la producción de IFNa, en comparación con las PBMC tratadas con Ab de isotipo (figura 26). Estos resultados indicaron que el Ab anti-PLD4 quimérico abolió la función de pDC, tal como una gran cantidad de producción de IFNa, disminuyendo las pDC mediante la actividad de ADCC.

1. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11 G9.6 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:74, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:75. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y Las CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6 de ratón son SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6 de ratón anti-PLD4 (504 pb) [Mayúsculas: región variable 11G9.6VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón] (SEQ ID NO:74 )

ATGAGATCACAGTTCTCTATACAGTTACTGAGCACACAGAACCTCACCTTGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGT AGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGACTTCAGTGA AAAIGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGIGAAGCAGAGGCCGGGACAAGGCCTT GAGTGGATTGGAGAIATTIATCCTGGTAGTGATAGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGT AGACACATCCTCCAGCACÁGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGÁGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAÁGÁG GAGGGTGGTTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatca g tctatccactggcccctaagggc

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6 de ratón (168 a.a.) [Mayúsculas: región variable 11 G9.6VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) (SEQ ID NO:75).

MRSOFSIOLLSTQNLTLGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQQPGAELVKFGTSVKMSCK ASGYTFTSYWMHWVKQRPGOGLEWIGDIYPGSDSTNYNEKFKSKATLTVDTSSSTA

YMOT ,SST ,TS EPS AVYYC ARGGWLD AMDY WGOGTS VTV S Sakttpps vyplapkg

CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11 G9.6

SYWMH (SEQ ID NO:2)

CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11 G9.6

DIYPGSDSTNYNEKFKS (SEQ ID NO:3)

CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11 G9.6

GGWLDAMDY (SEQ ID NO:4)

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11G9.6 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:38, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:39. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11 G9.6 de ratón son SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 y SEQ ID NO:42, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11G9.6 de ratón anti-PLD4 (421 pb) [Mayúsculas: región variable 11G9.6VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón] (SEQ ID NO:94 )

ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGAC TACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGÍCAGGACATTAGCAATTATTTAA ACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCA AGGTTCAGT GGCAGTGGGTC TGGAACAGATTATTCTCTCAC CA1TAGCAAC CTGGAGCAAGAAGATATTGC CACTTACTT TTGCCAACAGGGTAATACGCnCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgggctgatgctgcaccaa c tg ta te c a tc a a g g g c g a a t

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11G9.6 de ratón (140 a.a.) [Mayúsculas: región variable 11G9.6VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) (SEQ ID NO:95).

CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11 G9.6

RASQDISNYLN (SEQ ID NO:5)

CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11 G9.6

YTSRLHS (SEQ ID NO:6)

CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11 G9.6

QQGNTLPW (SEQ ID NO:7)

2. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 3B4 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:76, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:77. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 3B4 de ratón son SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:10, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 3B4 de ratón anti-PLD4 (437 pb) [Mayúsculas: región variable 3B4VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG1 de ratón] ATGGAATGTAACTGGATACTTCCTTTTATTCTGTCGGTAATTTCAGGGGTCTCCTCAGAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGG GACTGTGCTGTCAAGGCCTGGGGCTTCCGTGACGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCGACAGCTTTACCACCTACTGGATGC ACTGGGTAAAACAGAGGCCXGGACAGGGTCTAGAATGGATTGGTGCTATCTATCCTGGAAATAGTGAAACTAGCTACAAC CAGAAGTICAAGGGCAAGGCCAAACTGACTGCAGTCACATCCGCCAGCACTGCCTATATGGAGTTCACTAGCCTGACAAA TGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACGGGGGGTTATTCCGACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCT C C T C A gccaaaacg acacc ccc atctgtc ta tcc act

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 3B4 de ratón (145 a.a.) [Mayúsculas: región variable 3B4VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG1 de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3). MECNWILPFILSVISGVSSEVOLOOSGTVLSRPGASVTMSCKASGDSFTTYWMHWVK

o r p g o g l e w ig a iy p g n s e t s y n o k f k g k a k l t a y t s a s t a y m e f t s l t n e d s a v y y

CTGGY SDFDY WGQGTTLTV S S akttpps vyp

CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 3B4

TYWMH CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 3B4

AIYPGNSETSYNQKFKG CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 3B4

GYSDFDY

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 3B4 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:96, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:97. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 3B4 de ratón son SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:13, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 3B4 de ratón anti-PLD4 (459 pb) [Mayúsculas: región variable 3B4VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón]

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 3B4 de ratón (153 a.a.) [Mayúsculas: región variable 3B4VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

MMVLAOFLAFLLLWFPGAGCDILMTQSPSSMSVSLGPTVSITCHASOGIRSNIGWLO OKPGKSFKGLIFHGTNLEDGVPSRFSGRGSGADYSLTINSLESEPFADYYCVQYVQFP PTFGSGTKLEIRradaaptvsifppsseqltsggasw

CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 3B4

HASQGIRSNIG CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 3B4

HGTNLED CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 3B4

VQYVQFP

3. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5B7 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:78, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:79. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5B7 de ratón son SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:16, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5B7 de ratón anti-PLD4 (475 pb) [Mayúsculas: región variable 5B7VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón] ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGCGTCCACTCTGAGGTCCAGCTTCAGCAGTCAGG ACCTGAACTGGTGAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACTTGC ACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATITATCCTTACAATGGTAATACTGGCTACAAC CAGAAGTTCAAGAGGAAGGCCACATTGACTGTAGACAATTCCTCCGGCACAGTCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATC TGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGGAGGGATCTATGATGATTACTACGACTATGCTATCGACTATTGGGGTC AA GGAACCTCA GTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaagggcgaat La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5B7 de ratón (158 a.a.) [Mayúsculas: región variable 5B7VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3). MGWSW1FLFLLSGTAGVHSEYOLOOSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNLHWY

KOS HGKSLE WIGYIYP YNGNTGYNQKFKRK ATLTVDN S S GTVYMELRS LTSEDS AY YYCARGGIYDPYYDYAIDYWGQGTSVTVSSakttppsvyplapkge

CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5B7

DYNLH CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5B7

YIYPYNGNTGYNQKFKR

CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5B7

GGIYDDYYDYAIDY

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5B7 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:98, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:99. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5B7 de ratón son SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:19, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5B7 de ratón anti-PLD4 (467 pb) [Mayúsculas: región variable 5B7VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón] ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCIGCTGTGGCTTACAGATGCCAGATGTGACATCCAGATGACTCAGTC TCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGICGCCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTCAXATAG CATGGTATCAGCAGAAAGAGGGAAAATCTCCTCAGCGCCTGGTCTATGGTGCMCAAACTTAGCACATGGTGTGCCATCA AGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTAITCCCTCAAGATCAACAGCCnCAGTCTGAAGATTTTGGGAGTTATTA CTGTCAACATTTTTGGGGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgggct ga t ge t gcaccaa c tg ta tc c a t c t tc c c a c c a tc c a g tg a g c a g t ta a c a tc tg g a g g tg c c tc a g tc g tg tg c íte t t

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5B7 de ratón (155 a.a.) [Mayúsculas: región variable 5B7VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

MS VPTO VLGLLLLWLTDARCDIOMTQSP AS LS V S VGET V AIT CRASENIY S HIAWYO QKEGKSPQRLVYGATNLAHGVPSRFSGSGSGTOYSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWGT

p WTFGGGTKLEIKradaaptvsifpp sseqltsggas w c f

CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5B7

RASENIYSHIA CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5B7

GATNLAH CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5B7

QHFWGTP

4. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:80, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:81. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4 de ratón son SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:16, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4 de ratón anti-PLD4 (470 pb) [Mayúsculas: región variable 7B4VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón] ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGCGTCCACTCTGAGGTCCAGCTTCAGCAG1CAGG ACCXGAACTGGTGAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACTTGC ACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTTATCCTTACAATGGTAATACTGGCTACAAC CAGAAGTTCAAGAGGAAGGCCACATTGACTGTAGACAATTCCTCCGGCACAGTCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATC TGAGGACTCIGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGGAGGGATCTATGATGAITACTACGACTATGCTATCGACTATTGGGGIC AAGGAACCTCAGICACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaaggg

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4 de ratón (156 a.a.) [Mayúsculas: región variable 7B4VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3). MGWSWIFLFLLSGTAGVHSEVQLQOSGPELYKPGASYKISCKASGYTFTPYNLHWV KOSHGKSLEWIGYIYPYNGNTGYNQKFKRKATLTVDNSSGTVYMELRSLTSEPSAV YY C ARGGIYDDYYD Y A1DY WGOGTS VT VSS akttppswplapk

CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4

DYNLH

CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4

YIYPYNGNTGYNQKFKR CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4

GGIYDDYYDYAIDY

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 7B4 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:100, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:101. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 7B4 de ratón son SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:19, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 7B4 de ratón anti-PLD4 (454 pb) [Mayúsculas: región variable 7B4VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón] ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGATGCCAGATGTGACATCCAGATGACTCAGTC TCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCGCCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTCATATAG CATGGTATCAGCAGAAAGAGGGAAAATCTCCTCAGCGCCTGGTCTATGGTGCAACAAACTTAGCACATGGTGTGCCATCA AGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTTCAGTCTGAAGATTTTGGGAGTTATTA CTGTCAACATTTTTGGGGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgggctgatgctgcaccaa c t g ta tc c a t c t t c c c a c c a tc c a g tg a g c a g t la a c a tc tg g a g g tg c c tc a g

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 7B4 de ratón (151 a.a.) [Mayúsculas: región variable 7B4VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

MS VPTQ VLGLLLLWLTD ARCDIQMTQSP AS LS VS VGETV AITCRASENIY S HIA WY O OKEGKSPORLVYGATNLAHGVPSRFSGSGSGTOYSLKINSLOSEDFGSYYCOHFWGT FWTF GGGTKLEIKradaaptvs ifpp sseqltsggas

CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 7B4

RASENIYSHIA CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 7B4

GATNLAH CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 7B4

QHFWGTP

5. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 8C11 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:82, y la secuencia de aminoácidos es SeQ ID NO:83. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 8C11 de ratón son SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 8C11 de ratón anti-PLD4 (462 pb) [Mayúsculas: región variable 8C11VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón] ATGGGATGGAGCTATATCATCCTCTTTTTGGTAGCAACAGCAACAGGGGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGTCGGG GGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTATTTGT ACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGACTGATTAATCCTACCAATAGTGATACTATCTTCAAT GAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATC TGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACACGAGAGGGGGGATATGGTTACGGCCCGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTC TGGTCACTGTCTCTGCAgccaaaacaacacccccatcagtctatecacfcggcccctaagggc

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4 de ratón (154 a.a.) [Mayúsculas: región variable 8C11VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

MGWSYIILFLVATATGVHSOVOLOOSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYYLYWV RQRPGOGLEWIGLINPTN SDTIFNEKFKS K ATI TVDKSSSTAYMOÍ .SKT .TSF.DS AVYY

CTREGGY GY GPF AY WGQGTLVTVS Aakttppswplapkg

CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 8C11

SYYLY CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 8C11

LINPTNSDTIFNEKFKS CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 8C11

EGGYGYGPFAY

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 8C11 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:102, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:103. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 8C11 de ratón son SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 8C11 de ratón anti-PLD4 (457 pb) [Mayúsculas: región variable 8C11VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón] ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCC ACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCACATCTAGTCAGACCCTTGTACACAGTAATGGM ACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCT GGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCÁGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCT GGGAGTTTATTTCTGCTCTCACAGTACACAIGTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAAcgggctg a tg c tg c a c c a a c tg ta tc c a íc t t c c c a c c a te c a g tg a g c a g t ta a c a tc tg g a g

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 8C11 de ratón (152 a.a.) [Mayúsculas: región variable 8C11VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

MKLP VRLLVLMFWIP ASS S D WMTQTFLS LP V S LGDQ AS ISCTS SQTLVH SNGNTYLH WYLOKPGOSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVBAEDLGVYFCSHST HYEFTFGSGTKLEIKradaaptvsifppsseqltsg

CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 8C11

TSSQTLVHSNGNTYLH CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 8C11

KVSNRFS CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 8C11

HSTHVP

6. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 10C3 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:84, y la secuencia de aminoácidos es SeQ ID NO:85. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 10C3 de ratón son SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 10C3 de ratón anti-PLD4 (450 pb) [Mayúsculas: región variable 10C3VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2a de ratón] ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGCCCTCATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG GGGAGACTTAGTGAGGCCIGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGCTATGGCATGT CTTGGTTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTTACATCTACTATCCA GAAAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGICTGAAGTC TGAGGACACAGCCATGTATTATTGTGTAAGACTCTACGGTGGTAGGAGAGGCTATGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAA CCTCAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacagccccatcggtctatcca

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 10C3 de ratón (150 a.a.) [Mayúsculas: región variable 10C3VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2a de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

MNFGLSLIFLALILKGV OCE V OLVES GGDL V RPGGS LKLS CAAS GFS FS S Y GMS WFRQ TPDKRLEWVATISSGGSYrYYPF.SVKGRFTISRDNARNILYLOMSST.KSF.DTAMYYCV

RLY GGRRGY GLDY WGQGTS VT VS S akttans vvn

CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 10C3

SYGMS CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 10C3

TISSGGSYIYYPESVKG CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 10C3

LYGGRRGYGLDY

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 10C3 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:104, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:105. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 10C3 de ratón son SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 y SEQ ID NO:31, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 10C3 de ratón anti-PLD4 (423 pb) [Mayúsculas: región variable 10C3VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón] ATGAGGTTCTCTGCTCAGCTTCTGGGGCIGCTTGTGCTCTGGATCCCIGGATCCACTGCGGAAAITGTGATGACGCAGGC TGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGICTCCTACATAGTGATG GCATCACTTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCC TCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGA TGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAcgggctg atg c tgcaccaactg tatccatc

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 10C3 de ratón (141 a.a.) [Mayúsculas: región variable 10C3VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

MRFSAQLLGLLVLWIPGSTAEIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSDGITYLY WYLOKPGOSPOLLIYOMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAON LELYTFGGGTKLEIKradaaptvsi

CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 10C3

RSSKSLLHSDGITYLY CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 10C3

QMSNLAS CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 10C3

AQNLEL

7. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11D10 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:86, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:87. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11D10 de ratón son SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 y s Eq ID NO:28, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11D10 de ratón anti-PLD4 (450 pb) [Mayúsculas: región variable 11D10VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón] ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGAT1TTCCTTGCCCTCATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG GGGAGACTTAGTGAGGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGCTATGGCATGT CTTGGTTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGXCGCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTTACATCTACTATCCA GAAAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCICCAGAGACAATGCCAGGAACATCCTGTACCTGCAAAIGAGCAGTCTGAAGTC TGAGGACACAGCCATGTATTATTGTGTAAGACTCTACGGTGGTAGGAGAGGCTATGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAA CCTCAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccecatcagtctateca

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11D10 de ratón (150 a.a.) [Mayúsculas: región variable 11D10VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

MNFGLSLIFLALILKGVOCEVQLVESGGDLVRPGGSLKLSCAASGFSFSSYGMSWFRO TPDKRLE W V ATI SS GGS Y1YYPES VKGRFTIS RDNARNILYLOMS S LKS EDT AM YY C V RLYGGRRGYGLDYWGQGTSVTVSS akttppsvyp

CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11D10

SYGMS CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11D10

TISSGGSYIYYPESVKG CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11D10

LYGGRRGYGLDY

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11D10 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:106, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:107. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11D10 de ratón son SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 y SEQ ID NO:31, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11D10 de ratón anti-PLD4 (423 pb) [Mayúsculas: región variable 11D10VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón] ATGAGGTTCTCTGCTCAGCTTCTGGGGCTGCTTGTGCTCTGGATCCCTGGATCCACTGCGGAAATTGTGATGACGCAGGC TGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTGATG GCATCACTTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGICTCCTCAGCTCCTGATTIATCAGATGTCCAACCTTGCC T CAGGAGT CC CAGACAGGTT CAGTAGCAGTGGGT CAGGAACT GATTT CACACTGAGAAT CAGCAGAGTGGAGGC TGAGGA TGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAcgggctg a tg c tg c a c c a a c tg ta te c a te

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (141 a.a.) del anticuerpo 11D10 de ratón [Mayúsculas: región variable 11D10VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

MRFSAOLLGLLVLW1PGSTAEIVMTQAAFSNPVTLGTSAS1SCRSSKSLLHSDGITYLY WYLQKPGQS POLLIY QMSNL ASG VPDRFS S S GS GTDFTLRIS RVE AED Y GVYY C AON LELYTFGGGTKLEIKradaaptvsi

CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11D10

RSSKSLLHSDGITYLY CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11D10

QMSNLAS CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11D10

AQNLEL

8. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13D4 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:88, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:89. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13D4 de ratón son SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 y SEQ ID NO:34, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13D4 de ratón anti-PLD4 (472 pb) [Mayúsculas: región variable 13D4VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]

ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACC TGGCCTCGTGAAACCTTCTCAATCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTCATTATTACTGGA CCTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATAAGCTACGACGGTAGCAATAACTACAACCCA TCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTXGAATTCTGTGACTACTGA GGACACAGCTACATATAACTGTGCAAGAGAGGGCCCGCTCTACTATGGTAACCCCTACTGGTATTTCGATGTCTGGGGCG CAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaagggcg

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13D4 de ratón (157 a.a.) [Mayúsculas: región variable 13D4VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

MKVLSLLYLLTAIPGILSDVQLQESGPGLVKPSOSLSLTCSVTGYSITSHYYWTWIRQF PGNKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNOFFLKLNSVTTEPTATYNCAR

E GPLYY GNP YWYFD V WG AGTTVT V S S akttnns wolapkg

CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13D4

SHYYWT

CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13D4

YISYDGSNNYNPSLKN

CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13D4

EGPLYYGNPYWYFDV

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13D4 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:108, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:109. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13D4 de ratón son SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36 y SEQ ID NO:37, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13D4 de ratón anti-PLD4 (404 pb) [Mayúsculas: región variable 13D4VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón]

ATGATGTCCTCTGCTCAGXTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGAC TACAXCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGGGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTGACAATTATTTAA ACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAÁACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCA AGGITCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATGTTGCCACTTACTT TTGCCAGCAGTTTAATACGCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAAcgggc t ga t ge t ge accaa ctgt

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13D4 de ratón (134 a.a.) [Mayúsculas: región variable 13D4VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIOMTOTTSSLSASLGPRVTISCRASODIDNYLNWYQ OKPDGTYKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDVATYFCOQFNTLPR TFGGGTKLEIKradaapt

CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13D4

RASQDIDNYLN

CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13D4

YTSRLHS

CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13D4

QQFNTLP

9. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H11 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:90, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:91. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H11 de ratón son SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 y SEQ ID NO:40, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H11 de ratón anti-PLD4 (471 pb) [Mayúsculas: región variable 13H11VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón] ATGAAAGTGIXGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATICCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACC TGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCTCCAGTCATTATTACTGGA GTIGGATCCGGCAGTT.TCCAGGAAACAGACTGGAATGGATGGGCTACATAAGCTACGACGGTAGCAATAACTACAACCCA TCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACXACTGA GGACACAGCTACATATAACTGTGCAAGAGAGGGCCCGCTCTACTATGGTAACCCCTACTGGTATTTCGATGTCTGGGGCG CAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggeccctaagggc

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H11 de ratón (157 a.a.) [Mayúsculas: región variable 13H11VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

MKVLSLLYLLTAIPGILSDVOLOESGPGLVKPSOSLSLTCSVTGYSÍSSHYYWSWTROF PGNRLE WMGYIS YDGSNNYNPS LKNRISITRJDTSKNQFF LKLNS VTTEDT ATYN C AR F.

GPLYY GNPYWYFDV WGAGTTVTV S S akttnnswnlankg

CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H11

SHYYWS CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H11

YISYDGSNNYNPSLKN CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H11

EGPLYYGNPYWYFDV

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13H11 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:110, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:111. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13H11 de ratón son SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:43, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13H11 de ratón anti-PLD4 (414 pb) [Mayúsculas: región variable 13H11VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón] ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGAC TACÁTCCICCCTGTCTGCCTCTCTGGGGGGCAGCGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTGACAATTATITAA ACTGGTATCAGCAAAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCA AGGTTCAGIGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAACAAGAAGATATTGCCACTTACTT TTGCCAACAGTTTAATACGCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgggctgaf,gcf.gcaccaa c t g t a t c c a t c í te

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13H11 de ratón (138 a.a.) [Mayúsculas: región variable 13H11VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

MMSSAOFLGLLLLCFOGTRCDIOMTOTTSSLSASLGGSVTISCRASODIDNYLNWYO

OKPDGT VKLLIY YTS RLH S G VPS RFSGS GS GTD Y S LTISNLEOEDIATYFCOOFNTLPR TFGGGTKLEIKradaaptvsif

CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13H11

RASQDIDNYLN CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13H11

YTSRLHS CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13H11

QQFNTLP

10. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14C1 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:92, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:93. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14C1 de ratón son SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 y SEQ ID NO:40, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14C1 de ratón anti-PLD4 (470 pb) [Mayúsculas: región variable 14C1VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG1 de ratón] ATGAMGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACC TGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCTCCAGTCATTATTACTGGA GTTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAGACTGGAATGGATGGGCTACATAAGCTACGACGGTAGCAATAACTACAACCCA TCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGA GGACACAGCTACATATAACTGTGCMGAGAGGGCCCGCTCTACTATGGTAACCCCTACTGGTATTTCGATGTCTGGGGCG CAGGGACCACGGTCACCGICTCCTCAgccaaaacgacacccccatcígtctatccactggcccctaaggg

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14C1 de ratón (156 a.a.) [Mayúsculas: región variable 14C1VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG1 de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

MKVLS LLYLLT AIPGILS D V OLOE SGPGLVKP S OS LSLTCS v t g Y SIS SHYYWS WIRQF PGNRLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRTSITRDTSKNOFFT.KT.NSVTTFJyrATYNr.APF.

GPLYYGNPYWYFDVWGAGTTVTVS S akttppsvyplapk

CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14C1

SHYYWS CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14C1

YISYDGSNNYNPSLKN CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14C1

EGPLYYGNPYWYFDV

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14C1 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO:112, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO:113. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14C1 de ratón son SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:43, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14C1 de ratón anti-PLD4 (465 pb) [Mayúsculas: región variable 14ClVL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón] ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGAC TACAICCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGGGGCAGCGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTGACAATTATTTAA ACTGGTATCAGCAAAAACCAGATGGAACTGTTAAACICCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCA AGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAACAAGAAGATATTGCCACTTACTT TTGCCAACAGTTTAATACGCnCCICGGACGTTCGGTGGAGGCÁCCAAGCTGGAAATCAAAcgggcígaígctgcaccaa c t g t a t c e a t c t íc c c a c c a t c c a g íg a g c a g ít a a c a t c t g g a g g t g c c íc a g t c g t g t g c t t e

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14C1 de ratón (155 a.a.) [Mayúsculas: región variable 14C1VL de ratón, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal y el subrayado doble representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

MMSSAOFLGLLLLCFQGTRCDIOMTQTTS S LS AS LGGSVTISCRASODIDNYLNWYO OKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTPYSLTISNLEOEDIATYFCOOFNTLPR TFGGGTKLEIKradaaptvsifppsseqltsggaswcf

CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14C1

RASQDIDNYLN CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14C1

YTSRLHS CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14C1

QQFNTLP

Las secuencias de bases y las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 11G9 quimérico preparado siguen los números de secuencia, respectivamente.

Cadena pesada

SEQ ID NO:120 (secuencia de bases)

SEQ ID NO:121 (secuencia de aminoácidos)

Cadena ligera

SEQ ID NO:122 (secuencia de bases)

SEQ ID NO:123 (secuencia de aminoácidos)

11. La secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada del anticuerpo 11G9 quimérico anti-PLD4 (1401 pb) [Mayúsculas: región variable quimérica 11G9VH, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG1 humana] (SEQ ID NO:120)

ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTA'ICCIGTCTcagGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGC TGAACTGGTGAAGCCTGGGACTTCAGTGAAAATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACT GGGTGAAGCAGAGGCCGGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTTATCCTGGTAGTGATAGTACTAACTACAATGAG AAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGA GGACTCTGCGGTCTATTA'CTGTGCAAGAGGAGGGTGGTTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCG T CT CCT CA gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggcc ctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtegtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgca caccttcceggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggca cccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgac aaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaa ggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtgg'tggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagt tcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgt gtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagcect cccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaecetgcccccatccc gggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggct tctatcccagcgacatcgccgtggagtgg gagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacag caagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtct tctcatgctccgtgatgca ígaggctctgcacaacc actacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga

12. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo 11G9 quimérico anti-PLD4 (466 a.a.) [Mayúsculas: región variable quimérica 11G9VH, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG1 humana] (SEQ ID NO:121)

MKVLSLLYLLTAIPGÍLSQVQLQQPGAELVKPGTSVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGDIYPGSDSTNYNE KFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGWLDAMDYWGQGTSVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaa lgc lvkd yfpepvtvsw iisg a ltsgvh ífpav lq ssg ly s lssvvÉ vpsss lg tqty icnvnh kpsntkvd kkvepkscd k íhtcppcpape llggpsvfIfppkpkdtlraisrtpevtcvyvdvshedpevkfnw yvdgveyhnaktkpreeqynsíyr yy sy ltv lh qd w lngke ykckvsnka lpap iekt iskakgqprepqyyt lppsrd le ltknqvs ltc lvkgfypsd iavew e sngqpennykt tppv1d sdgs í f 1ysk ltvdks rwqqgnv f sesvráhea1hnhy t q k s 1s 1spgk

13. La secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera del anticuerpo 11G9 quimérico anti-PLD4 (705 pb) [Mayúsculas: región variable quimérica 11G9VL, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK humana] (SeQ ID NO:122)

ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATAICCAGATGACACAGAC TACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAA ACTGGTATCAGCAGAMCCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCA AGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTT TTGC CAACAGGG1AATAC GCTTCCGT GGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAAT CAAAc gaac t gt ggc t ge ac c a t ctgtcttea te ttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaac ígcctctgttgtgtgcctgctgaataact ictat cccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcagga cagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtc íacgcct gcgaag ícacccatcagggcc ígagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgc íag

14. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo 11G9 quimérico anti-PLD4 (234 a.a.) [Mayúsculas: región variable quimérica 11G9VL, minúsculas: región constante de cadena ligera de IgK humana] (SeQ ID NO:123)

MMS SAQF LGLL LLCF QGTRCDIQMTQTTSSL SASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQGKPDGTVKLLIYYTSRLHS GVP S RFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKrtvaapsvfífppsdeqlksgtasvvcllnnfy preakvaw kvdnalqsgnsaesvteqdskdstyslsst1 tlskadyekhkvyaceYthaglsspvtksfíirgec

Secuencia de ADNc y proteína en moléculas relacionadas con PLD4

> ADNc de PLD4 humana (1521 pb) (SEQ ID NO:44)

ATGCTGAAGCCTCTTTGGAAAGCAGCAGTGGCCCCCACATGGCCATGCTCCATGCCGCCCCGCCGCCCGTGGGACAGAGA GGCTGGCACGTTGCAGGTCCTGGGAGCGCTGGCTGTGCTGTGGCTGGGCTCCGTGGCTCTTATCTGCCTCCTGTGGCAAG TGCCCCGTCCTCCCACCTGGGGCCAGGTGCAGCCCAAGGACGTGCCCAGGTCCTGGGAGCATGGCTCCAGCCCAGCTTGG GAGCCCCTGGAAGCAGAGGCCAGGCAGCAGAGGGACTCCTGCCAGCTTGTCCTTGTGGAAAGCATCCCCCAGGACCTGCC ATCTGCAGCCGGCAGCCCCTCTGCCCAGCCTCIGGGCCAGGCCTGGCTGCAGCTGCTGGACACTGCCCAGGAGAGCGTCC ACGTGGCnCATACTACTGGTCCCTCACAGGGCCTGACATCGGGGTCAACGACTCGTCTTCCCAGCTGGGAGAGGCTCTT CTGCAGAAGCTGCAGCAGCTGCTGGGCAGGAACATTTCCCTGGCTGTGGCCACCAGCAGCCCGACACTGGCCAGGACATC C AC CGAC C'í GC AGGT TCT GGC T GCC CíIaGgFgC C C ATGTAC GA C A GG'Í GCCC ATGGGtSc GGC TC C AGGGGT GTTT T G C ACTCCAAATTCTGGGTTGTGGATGGACGGCACATATACATGGGCAGTGCCAACATGGACTGGCGGTCTCTGACGCAGGTG AAGGAGCTTGGCGCTGTCATCTATAACTGCAGCCACCTGGCCCAAGACCTGGAGAAGACCTTCCAGACCTACTGGGTACI GGGGGTGCCCAAGGCTGTCCTCCCCAAAACCTGGCCTCAGAACTTCTCATCTCACTTCAACCGTTTCCAGCCCTTCCACG GCCTCTTTGATGGGGTGCCCACCACTGCCTÁCTTCTCAGCGTCGCCACCAGCACTCTGTCCCCAGGGCCGCACCCGGGAC CTGGAGGCGCTGCTGGCGGTGATGGGGAGCGCCCAGGAGTTCATCTATGCCTCCGTGATGGAGTATTTCCCCACCACGCG CTTCAGCCACCCCCCGAGGTACTGGCCGGTGCTGGACAACGCGCTGCGGGCGGCAGCCTTCGGCAAGGGCGTGCGCGTGC GCCTGCTGGTCGGCTGCGGACTCAACACGGACCCCACCATGTTCCCCTACCTGCGGTCCCTGCAGGCGCTCAGCAACCCC GCGGCCAACGTCTCTGTGGACGTGAAAGTCTTCATCGTGCCGGTGGGGAACCATTCCAACATCCCATTCAGCAGGGTGAA CCACAGCAAGTTCATGGTCACGGAGAAGGCAGCCTACATAGGCACCTCCAACTGGTCGGAGGATTACTTCAGCAGCACGG CGGGGGTGGGCTTGGTGGTCACCCAGAGCCCTGGCGCGCAGCCCGCGGGGGCCACGGTGCAGGAGCAGCTGCGGCAGCTC TTTGAGCGGGACTGGAGTTCGCGCTACGCCGTCGGCCTGGACGGACAGGCTCCGGGCCAGGACTGCGTTTGGCAGGGCTG

A

> Proteína PLD4 humana (506 aminoácidos) (SEQ ID NO:1)

MLKPLWKAAVAPTWPCSMPPRRPWDREAGTLQVLGALAVLWLGSVALÍCLLWQVPRPPTffGQVQPKLVPR SWEHGSSPAWEPLEAEARQQRDSCQLVLVESIPQDLPSAAGSPSAQPLGQAWLQLLDTAQESVHVASYYW SLTGPDIGVNDSSSQLGEALLQKLQQLLGRNISLAVATSSPTLARTSTDLQVLAARGAHVRQVPMGRLTR GYLHSKFWVVDGRHIYMGSAMDMSLTQYKELGAVIYNCSHLAGDLEKTFGTYWVLGVPKAVLPKTWPQ NFSSHFNRFQPFHGLFDGVPTTAYFSASPPALCPQGRTRDLEALLAVMGSAQEFIYASVMEYFPTTRFSH PPRYWPVLDNALRAAAFGKGVRYRLLVGCGLNTDPTMFPYLRSLQALSNPAANVSVDVKYFIVPYGNHSN IPFSRVNHSKFMVTEKAAYIGTSNWSEDYFSSTAGYGLYYTQSPGAQPAGATVQEQLRQLFERDWSSRYA YGLDGQAPGQDCYWQG

> ADNc de PLD4 de mono cynomolgus (1521 pb) (SEQ ID NO:63)

ATGCTGAAGC CTCTTC GGAGAGC gGCAGTGAC C C C CATGTGGC C GTGCTCCATGCTGCCCC GC C GC CTGTGGGACAGAGA GGCTGGCACGTTGCAGGTCCTGGGAGTGCTGGCTATGCTGTGGCTGGGCTCCATGGCTCTTACCTACCTCCTGTGGCAAG TGCGCCGTCCTCCCACCTGGGGCCAGGTGCAGCCCAAGGACGTGCCCAGGTCCTGGGGGCATGGTTCCAGCCCAGCTCTG GAGCCCCTGGAAGCGGAGGTCAGGAAGCAGAGGGACTCCTGCCAGCTTGTCCTTGTGGAAAGCATCCCCCAGGACCTGCC ATTTGCAGCCGGCAGCC1CTCCGCCCAGCCTCTGGGCCAGGCCTGGCTGCAGCTGCTGGACACTGCCCAGGAGAGCGTCC ACGTGGCTTCATACTACTGGTCCCTCACAGGGCCCGACATTGGGGTCAACGACTCATCTTCCCAGCTGGGAGAGGCCCTT C TGCAGAAGCT GCAGCAGC TGCIGGGCAGGAACATTTCC TTGGC TGTGGCCAC CAGCAGTC CAACACTGGCCAGGAAGTC CACCGACCTGCAGGTCCTGGCTGCCCGAGGTGCCCAGGTACGACGGGIGCCCATGGGGCGGCTCACCAGGGGCGTTTTGC ACTCCAAATTCTGGGTTGTGGATGGACgGCACATATACATGGGCAGTGCcAACATGGACTGGCGGTCCCTGACGCAGGTG MGGAGCTTGGCGCTGTCATCTATAACTGCAGCCACCTGGCCCAAGACCTGGAGAAGACCTTCCAGACCTACTGGGTGCT GGGGGTGCCCMGGCTG1CCTCCCCAAAACCTGGCCTCAGAACTTCTCATCTCACATCAACCGTTTCCAGCCCTTCCAGG GCCTCTTTGATGGGGTGCCCACCACTGCCTACTTCTCAGCATCGCCACCcGCACTCTGTCCCCAGGGCCGCACCCCTGAC CTGGAGGCGCTGTTGGCGGTGATGGGGAGCGCCCAGGAGTTCATCTATGCCTCCGTGATGGAGTATTTCCCTACCACgCG CTTCAGCCACCCCCGCAGGTACTGGCCGGTGCTGGACAACGCGCTGCGGGCGGCAGCCTTCAGCAAGGGTGTGCGCGTGC GCCTGCTGGTCAGCTGCGGACTCAACACGGACCCCACCATGTTCCCCTATCTGCGGTCCCTGCAGGCGCTCAGCAACCCC GCGGCCAACGTCTCTGTGGACG1GAAAGTCTTCATCGTGCCGGTGGGGAATCATTCCAACATCCCGTTCAGCAGGGTGAA CCACAGCAAGTTCATGGTCACGGAGAAGGCAGCCTACATAGGCACCTCCAACTGGTCGGAGGATTACTTCAGCAGCACGA CGGGGGTGGGCCTGGTGGTCACCCAGAGCCCCGGCGCGCAGCCCGCGGGGGCCACGGTACAGGAGCAGCTGCGGCAGCTC TTTGAGCGGGACTGGAGTTCGCGCTACGCCGTCGGCCTGGACGGACAGGCTCCGGGCCAGGACTGCGTTTGGCAGGGCTG

A

> Proteína PLD4 de mono cynomolgus (506 aminoácidos) (SEQ ID NO:129) MLKPLRRAAVTPMWPCSMLPRRLWDREAGTLQYLGYLAMLWLGSMALTYLLWQVRRPPTWGQVQPKDYPRSWGHGSSPAL EPIBAEVRKGRDSCGLVIVESIPQDLPFAAGSLSAQPLGQAWLQLLDTAQESVHVASYYWSLTGPMGVNDSSSQLGEÁL LGKLQQLLGRN í SLAVAT SSPTLARKSTDLQVLAARGAQYRRYPMGRLTRGVLHSKFWVVDGRHIYMGSANMDWRSLTQV KELGAVIYNCSHiAQDLEKTFQTYWVLGVPKAVLPKTWPQNFSSHINRFQPFQGLFDGVPTTAYFSASPPALCPQGRTPD LEALLAVMGSAQEFIYASVMEYFPTTRFSHPRRYWPVLDNALRAAAFSKGYRVRLLVSCGLNTDPTMFPYLRSLQALSNP MNVSVDYKVFIYPYGNHSNIPFSRYNHSKFMYTEKAAYIGTSNWSEDYFSS1TGVGLVVTQSPGAQPAGATVQEQLRQL FERDWSSRYAYGLÜGQAPGGDCYWQG

> ADNc de PLD4 de mono rhesus (1521 pb) (SEQ ID NO:124)

ATGCTGAAGCCTCTTCGGAGAGCGGCAGTGACCCCCATGTGGCCGTGCTCCATGCTGCCCCGCCGCCTGTGGGACAGAGA GGCTGGCACGTTGCAGGTCCTGGGAGTGCTGGCTATGCTGTGGCTGGGCTCCATGGCTCTTACCTACCTCCTGTGGCAAG TGCGCTGTCCTCCCACCTGGGGCCAGGTGCAGCCCAGGGACGTGCCCAGGTCCTGGGGGCATGGTTCCAGCCTAGCTCTG GAGGCCCTGGAAGCGGAGGTCAGGAAGCAGAGGGACTCCTGCCAGCTTGTCCTTGTGGAAAGCATCCCCCAGGACCTGCC ATTTGCAGCCGGCAGCCTCTCCGCCCAGCCTCTGGGCCAGGCCTGGCTGCAGCTGCTGGACACTGCCCAGGAGAGCGTCC ACGTGGCTTCATACTACTGGTCCCTCACAGGGCCCGACATTGGGGTCAACGACTCA1CTTCCCAGCTGGGAGAGGCCCTT CTGCAGAAGCTGCAGCAGCTGCTGGGCAGGAACATTTCCTTGGCTGTGGCCACCAGCAGTCCAACACTGGCCAGGAAGTC CACCGACCTGCAGGTCCTGGCTGCCCGAGGTGCCCAGGTACGACGGGTGCCCATGGGGCGGCTCACCAGGGGCGTTTTGC ACTCCAAATTCTGGGTTGTGGATGGACGGCACATATACATGGGCAGTGCCAACATGGACTGGCGGTCCCTGACGCAGGTG AAGGAGCTTGGCGCTGICATCTATAACTGCAGCCACCTGGCCCAAGACCTGGAGAAGACCTTCCAGACCTACTGGGTGCT GGGGGTGCCCAAGGCTGTCCTCCCCAAAACCTGGCCTCAGAACTTCTCATCTCACATCAACCGTTTCCAGCCCTTCCAGG GCCTCTTTGATGGGGTGCCCACCACTGCCTACTTCTCAGCATCGCCACCCGCACTCTGTCCCCAGGGCCGCACCCCTGAC CTGGAGGCGCTGTTGGCGGTGATGGGGAGCGCCCAGGAGTTCATCTATGCCTCCGTGATGGAGTATTTCCCTACCACGCG CTTCAGCCACCCCCGCAGGTACTGGCCGGTGCTGGACAACGCGCTGCGGGCGGCAGCCTTCAGCAAGGGTGTGCGCGTGC GCCTGCTGGTCAGCTGCGGACTCAACACGGACCCCACCATGTTCCCCTATCTGCGGTCCCTGCAGGCGCTCAGCAACCCC GCGGCCAACGTCTCTGTGGACGTGAAAGTCTTCAICGTGCCGGTGGGGAATCATTCCAACATCCCGTTCAGCAGGGTGAA CCACAGCAAGTTCATGGTCACGGAGAAGGCAGCCTACATAGGCACCTCCAACTGGTCGGAGGATTACTTCAGCAGCACGA CGGGGGTGGGCCTGGTGGTCACCCAGAGCCCCGGCGCGCAGCCCGCGGGGGCCACGGTACAGGAGCAGCTGCGGCAGCTC TTTGAGCGGGACTGGAGTTCGCGCTACGCCGTCGGCCTGGACGGACAGGCTCCGGGCCAGGACTGCGTTTGGCAGGGCTG

A

> Proteína PLD4 de mono rhesus (506 aminoácidos) (SEQ ID NO:130)

MLKPLRRAAVTPMWPCSMLPRRLWPREAGIIQVLGYLAMLWLGSMALTYLLWQVRCPPIWGQYQPRDYPRSWGHGSSLAL EPLEAEVRKQRDSCGLVLVESIPQDLPFAAGSLSAQPLGQAWLQLLDTAQESVHYASYYWSLTGPDIGYNDSSSQLGEAL LGKLGQLLGRNISLAVATSSPTLARKSTDLQVLAARGAQVRRYPMGRLTRGVLHSKFWVVDGRHIYMGSANMDWRSLTQV KELGAVIYNCSHLAQDLEKTFQTYffVLGVPKAVLPKTWPQNFSSHINRFQPFQGLFDGVPTTAYFSASPPALCPQGRTPD LEALLAVMGSAQ.EFIYASYMEYFPTTRFSHPRRYWPVLMALRAAAFSKGYRVRLLVSCGIJTDPTMFPYLRSLQALSNP AANV SVDVKVFIYPVGNHSNIPF SRVNHSKFMVTEKAAYIGTSNWSEDYFS STTGVGLVVTQSPGAQPAGATVQEQLRQL FERDWS SRYAYGLD GQAP GQD CYWQG

> ADNc de PLD4 de ratón (1512 pares de bases) (SEQ ID NO:131)

ATGGACAAGAAGAAAGAGCACCCAGAGAXGCGGAXACCACXCCAGACAGCAGTGGAGGTCTCTGAXTGGCCCTGCXCCAC ATCTCATGATCCACATAGCGGACTTGGCATGGTACTGGGGATGCTAGCTGTACTGGGACTCAGCTCTGTGACTCTCATCT TGTTCCTGTGGCAAGGGGCCACTTCTTTCACCAGTCATCGGATGTTCCCTGAGGAAGTGCCCTCCTGGTCCTGGGAGACC CTGAAAGGAGACGCTGAGCAGCAGAATAACTCCTGTCAGCTCATCCTTGTGGAAAGCATCCCCGAGGACTTGCCAfTTGC AGCTGGCAGCCCCACTGCCCAGCCCCTGGCCCAGGCTTGGCTGCAGCTTCTTGACACTGCTCGGGAGAGCGTCCACATTG CCTCGTACTACTGGTCCCTCACTGGACTGGACATTGGAGTCAATGACXCGTCTTCTCGGCAGGGAGAGGCCCTICTACAG AAGTTCCAACAGCTTCTTCTCAGGAACATCTCTGTGGTGGTGGCCACCCACAGCCCAACATTGGCCAAGACATCCACTGA CCTCCAGGTCTTGGCTGCCCATGGTGCCCAGATACGACAAGTGCCCATGAAACAGCTTACTGGGGGTGTTCTACACTCCA AATTCTGGGTTGTGGATGGGCGACACGTCTACGTGGGCAGCGCCÁACATGGACTGGCGGTCCCTGACTCAGGTGAAGGAA CTTGGTGCAATCATCTACAACTGCAGCAACCIGGCTCAAGACCTTGAGAAAACATTCCAGACCTACTGGGTGCTAGGGAC TCCCCAAGCTGTTCTCCCTAAAACCTGGCCTCGGAACTTCTCATCCCACATCAACCGCTTCCATCCCTTGCGGGGTCCCT TTGATGGGGTTCCCACCACGGCCTATTTCTCGGCCTCCCCTCCCTCCC1CTGCCCGCATGGCCGGACCCGGGATCTGGAC GCAGTGTTGGGAGTGATGGAGGGTGCTCGCCAGTTCATCTATGTCTCGGTGATGGAGTATTTCCCTACCACGCGCTTCAC CCACCATGCCAGGTACTGGCCCGTGCTGGACAATGCGCTACGGGCAGCGGCCCTCAATAAGGGTGTGCATGTGCGCTTAC TGGTCAGCTGCTGGTTCAACACAGACCCCACCATGTTCGCTTATCTGAGGTCCCTGCAGGCTTTCAGTAACCCCTCGGCT GGCATCT CAGTGGATGTGAAAGTC TTCATCGTGC CTGT GGGAAAT CATTC CAACATCC CGTTCAGCCGCGTGAAC CACAG CAAGTXCAXGGXCACAGACAAGACAGCCXAXGXAGGCACCXCXAACTGGXCAGAAGACXACXXCAGCCACACCGCIGGXG TGGGCCTGATTGTCAGCCAGAAGACCCCCAGAGCCCAGCCAGGCGCMCCACCGTGCAGGAGCAGCTGAGGCAACTCTTT GAACGAGACTGGAGTTCCCACTATGCTATGGACCTAGACAGACAAGTCCCGAGCCAGGACTGTGTCTGGTAG

> Proteína PLD4 de ratón (503 aminoácidos) (SEQ ID NO:132)

MDKKKEHPEJiífR IPLQTAVEVSDWPCST SHDPHSGLGMVLGML AVLGLSS VTLILFLWQGAT SFT SHRMFPEE VP Sff Sff ET LKGDAEQQNN SCQLILVE SIPEDLPFAAGSP TAQPLAQAWLQLLD1ARESVHIASYYWSLTGLDIGVND S SSRQGEALL Q KFQQLLLRNISWVATHSPTLAKTSTDLQVLAAHGAOIRQVPMKQLTGGVLHSKFWVVDGRHVYVGSANMDWRSLTQVKE LGAimCSNLAQDLEKTFQTYWVLGXPQAVLPKTWPRNFSSHINRFHPLRGPFDGVPXTAYFSASPPSLCPHGRXRDLD AVLGVMEGARQFIYVSVMEYFPTXRFTHHARYWPVLDNALRAAALNKGVHVRLLVSCWFNTDPTMFAYLRSLQAFSNPSA GISYDVKVFIVPVGNHSNIPFSRVNHSKFMVTDKTAYVGTSNWSEDYFSHTAGVGLIVSQKTPRAQPGATTVQEQLRQLF ERDWSSHYAMDLDRQVPSQDCVW

> Secuencia de ADNc de PLD3 humana (SEQ ID NO:55)

ATGAAGCC TAAACT GATGTAC CAGGAGC T GAAGGTGCCTGCAGAGGAGCCCGCCAAT GAGC TGCCCATGAATGAGATTGA GGCGTGGAAGGCTGCGGAAAAGAAAGCCCGCTGGGTCCTGCTGGTCCTCATTCTGGCGGTTGTGGGCTTCGGAGCCCTGA TGACTCAGCTGTTTCTATGGGAATACGGCGACTTGCATCTCTTTGGGCCCAACCAGCGCCCAGCCCCCTGCTATGACCCT TGCGAAGCAGTGCTGGTGGAAAGCATTCCTGAGGGCCTGGACTTCCCCAATGCC_1-CCACGGGGAACCCTTCCACCAGCCA GGCCTGGCTGGGCCTGCTCGCCGGTGCGCACAGCAGCCTGGACATCGCCTCCTTCTACTGGACCCTCACCAACAATGACA CCCACACGCAGGAGCCCTCTGCCCAGCAGGGTGAGGAGGTCCTCCGGCAGCTGCAGACCCTGGCACCAAAGGGCGTGAAC GTCCGCATCGCTGTGAGCAAGCCCAGCGGGCCCCAGCCACAGGCGGACCTGCAGGCTCTGCTGCAGAGCGGTGCCCAGGT CCGCATGGTGGACATGCAGAAGCTGACCCATGGCGTCCTGCATACCAAGTTCTGGGTGGTGGACCAGACCCACTTCTACC TGGGCAGTGCCAACATGGACTGGCGTTCACTGACCCAGGTCAAGGAGCTGGGCGTGGTCATGTACAACTGCAGCTGCCTG GCTCGAGACCTGACCAAGATCTTTGAGGCCTACTGGTTCCTGGGCCAGGCAGGCAGCTCCATCCCATCAACTTGGCCCCG GTTCTATGACACCCGCTACMCCAAGAGACACCAATGGAGATCTGCCTCAATGGAACCCCTGCTCTGGCCTACCTGGCGA GTGCGCCCCCACCCCTGTGTCCAAGTGGCCGCACTCCAGACCTGAAGGCTCTAC1CAACGTGGTGGACAATGCCCGGAG1 TTCATCTACGTCGCTGTCATGAACTACCTGCCCACTCTGGAGTTCTCCCACCCTCACAGGTTCTGGCCTGCCATTGACGA TGGGCTGCGGCGGGCCACCTACGAGCGTGGCGTCAAGGTGCGCCTGCTCATCAGCTGCTGGGGACACTCGGAGCCATCCA TGCGGGCCTTCCTGCTCTCTCTGGCTGCCCTGCGTGACAACCATACCCACTCTGACATCCAGGTGAAACTCTTTGTGGTC CCCGCGGATGAGGCCCAGGCTCGAATCCCATATGCCCGTGTCAACCACAACAAGTACATGGTGACTGAACGCGCCACCTA CAXCGGAACCTCCAACXGGTCXGGCAACXACTTCACGGAGACGGCGGGCACCXCGCXGCXGGXGACGCAGA4XGGGAGGG GCGGCCTGCGGAGCCAGCXGGAGGCCAXXXXCCXGAGGGACXGGGACTCCCCXXACAGCCAXGACCXXGACACCXCAGCX GACAGCGXGGGCAACGCCXGCCGCCXGCXCXGA

> Proteína PLD3 humana (490 aminoácidos) (SEQ ID NO:127)

MKPKLMY QELKVPAEEPANELPMNEIEAWKAAEKKARWVLL VLILAVVGF GALMIQLFiWEYGDLHLFGPNQRPAPC YDP CEAVLVESIPEGLDFPHASTGNPSTSQAWLGLLAGAHSSLDIASFYWTLTNNDTHTQEPSAQQGEEVLRQLQTLAPKGVN VRIAVSKPSGPQPQADLQALLQSGAQVEMVDMQKLTHGVLHTKFffWDQTHFYLGSANMDTSRSLTQVKELGWMYNCSCL ARDLTKIFEAYWFLGGAGSSIPSnPRFYDTRYNQETPMEICLNGTPALAYLASAPPPLCPSGRTPDLKALLNVVDNARS FIYVAVMNYLPTLEFSHPHRFWPAIDDGLRRATYERGVKVRLLISCWGHSEPSMKAFLLSLAALRDNHTHSDIQVKLFVV PADEAQARIPYARVNHNKYMVTERATYIGTSNWSGNYFTETAGTSLLVTQNGRGGLRSQLEAIFLRDWDSPYSHDLDTSA DSVGNACRLL

> ADNc de PLD5 humana (1338 pares de bases) (SEQ ID NO:56)

ATGGGAGAGGATGAGGATGGACTCTCAGAAAAAAATTGCCAAAATAAATGTCGAAITGCCCTGGTGGAAAATATTCCTGA

'AGGCCTTMCTATTCAGAAAATGCACCATTTCACTTATCACTTTTCCAAGGCTGGATGAATTTACTCAACATGGCCAAAA AGTCTGTTGACATAGTGTCTTCCCATTGGGATCTCAACCACACICATCCATCAGCATGICAGGGTCAACGTCTTTTTGAA AAGTTGCTCCAGCTGACTTCGCAAAATATTGAAATCAAGCTAGTGAGTGATGTAACAGCTGATTCAAAGGTATTAGAAGC CTTGAMTTAAAGGGAGCCGAGGTGACGTACATGAACATGACCGCTIACAACAAGGGCCGGCTGCAGTCCTCCTTCTGGA TCGTGGACAAACAGCACGTGTATATCGGCAGTGCCGGTTTGGACTGGCAATCCCTGGGACAGATGAAAGAACTCGGTGTC ATCTXCTACAACTGCAGCTGCCTGGTCCTAGATTTACAAAGGATATTTGCTCTATATAGTTCATTAAAATTCAAAAGCAG AGTGCCTCAAACCTGGTCCAAAAGACTCTATGGAGTCTATGACAATGAAAAGAAATTGCAACTTCAGTTGAATGAAACCA AATCTCAAGCATTTGTATCGAATTCTCCAAAACTCTTTTGCCCTAAAAACAGAAGTTTTGACATAGATGCCATCTACAGT GTGATAGATGATGCCAAGCAGTATGTGTACATCGCTGTCATGGACTACCTGCCTATCTCCAGCACAAGCACCAAAAGGAC TTACTGGCCAGACT1GGATGCAAAAATAAGAGAAGCATTAGTTTTACGAAGCGTTAGAGTTCGACTCCTTTTAAGCTTCT GGAAGGAAACTGATCCCCTTACGTTTAACTTTATTTCATCTCTTAAAGCGATTTGCACTGAAATAGCCAACTGCAGTTTG AAAGTTAAATTTTTT'GATCTGGAAAGAGAGAATGCTTGTGCTACAAAAGAACAAAAGAATCACACCTTTCCTAGGTTAAA TCGCAACAAGTACATGGTGACAGATGGAGCAGCTTATA1TGGAAATTTTGATTGGGTAGGGAATGATTTCACICAGAATG CTGGCACGGGCCTTGTTATCAACCÁGGCAGATGTGAGGAACAACAGAAGCATCATTAAGCAACTTAAAGATGTGTTTGAA AGGGACTGGTATTCACCGTATGCCAAAACCTTACAGCCAACCAAACAGCCGAACTGCTCAAGCCTGTTCAAACTCAAACC GCTCTCCAACAAAACTGCCACAGACGACACAGGCGGAAAGGATCCCCGGAACGTATGA

> Proteína PLD5 humana (445 aminoácidos) (SEQ ID NO:128)

MGEDEPGL S EKN C QNKC RI AL YEN IPEGLN Y S ENAPF HLS L F QGWMNLL NMAKKS VDIVS SHWD LNHTHPSACQGQRLFE KLLQLTSQNIEIKLVSDVTADSKVLEALKLKGAEVTYMNMTAYNKGRLQSSFWIVDKQHVYÍGSAGLDWQSLGQMKELGV IFYNCSCLVLDIQRIFALYSSLKFKSRVPQTWSKRLYGVYDNEKKLQLQLNETKSQAFVSNSPKLFCPKNRSFDIDAÍYS VIDDAKQYVYIAVMDYLPISST STKRTYWPDLDAKIREALVLRSVRVRLLLSFWKETDPLTFNFISSLKAICTEIAKCSL KVKFFDLERENACATKEQKNHTFPRLNRNKYMVTDGAAYIGNFDWGNDFTQNAGTGLVINQADVRNNRSIIKQLKDVFE RDWYSPYAKTLQPTKGPNCSSLFKLKPiSNKTATDDTGGKDPRNV

> ADNc de la proteína de fusión de Ig-PLD4 humana (2142 pb) (SEQ ID NO:125) ATGGAGTTTCAGACCCAGGTCTTTGTATTCGTGTTGCTCTGGTTGTCTGGTGTTGATGGAgaüacaaggatgacgacga taaaGGATCCcccagagggcccacaatcaagccctgtcctccatgcaaatgcccagcacctaacctcttgggtggaccat ccgtcücatcüccctccaaagatcaaggatgtactcatgatetccctgagccccatagtcacatgtgtggtggtggat gtgagcgaggatgacccagaígtccagaícagctggtttgtgaacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaaccca tagagaggattacaacagtactctccgggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactggatgagtggcaaggagt tcaaatgcaaggteaacaacaaagacctcccagcgcccatcgagagaaccatctcaaaacccaaagggtcagtaagagct ccacaggtatatgtcttgcctccaccagaagaagagaígactaagaaacaggtcactctgaccígcatggtcacagactt catgcctgaagacatttacgtggagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacactgaaccagtcctgg actctgaíggttcttacttcatglacagcaagctgagagtggaaaagaagaactgggtggaaagaaatagctactcctgt tcagtggíccacgagggtcígcacaatcaccacacgactaagagctIctcccggactccgggtaaaCGTCCTCCCACCTG GGGCCAGGTGCAGCCCAAGGACGTGCCCAGGTCCTGGGAGCATGGCTCCAGCCCAGCTTGGGAGCCCCTGGAAGCAGAGG CCAGGCAGCAGAGGGACTCCTGCCAGCTTGTCCTTGTGGAAAGCATCCCCCAGGACCTGCCATCTGCAGCCGGCAGCCCC TCTGCCCAGCCTCTGGGCCAGGCCTGGCTGCAGCTGCTGGACACTGCCCAGGAGAGCGTCCACGTGGCTTCATACTACTG GTCCCTCACAGGGCCTGACATCGGGGTCAACGACTCGTCTTCCCAGCTGGGAGAGGCTCTTCTGCAGAAGCIGCAGCAGC TGCTGGGCAGGAACATTTCCCTGGCTGTGGCCACCAGCAGCCCGACACTGGCCAGGACATCCACCGACCTGCAGGTTCTG GCTGCCCGAGGTGCCCATGTACGACAGGTGCCCATGGGGCGGCTCACCAGGGGTGTTTTGCACTCCAAATTCTGGGTTGT GGATGGACGGCACATATACATGGGCAGTGCCAACATGGACTGGCGGTCTCTGACGCAGGTGAAGGAGCTTGGCGCTGTCA TCTATAACTGCAGCCACCTGGCCCAAGACCTGGAGAAGACCTTCCAGACCTACTGGGTACTGGGGGTGCCCAAGGCTGTC CTCCCCAAAACCTGGCCTCAGAACTTCTCATCTCACTTCAACCGTTTCCAGCCCTTCCACGGCCTCTTTGATGGGGTGCC CACCACTGCCTACTTCTCAGCGTCGCCACCAGCACTCTGTCCCCAGGGCCGCACCCGGGACCTGGAGGCGCTGCTGGCGG TGATGGGGAGCGCCCAGGAGTTCATCTATGCCTCCGTGATGGAGTATTTCCCCACCACGCGCTTCAGCCACCCCCCGAGG TACTGGCCGGTGCTGGACAACGCGCTGCGGGCGGCAGCCTTCGGCAAGGGCGTGCGCGTGCGCCTGCTGGTCGGCTGCGG ACTCAACACGGACCCCACCATGTTCCCCTACCTGCGGTCCCTGCAGGCGCTCAGCAACCCCGCGGCCAACGTCTCTGTGG ACGTGAAAGTCTTCATCGTGCCGGTGGGGAACCATTCCAACATCCCATTCAGCAGGGTGAACCACAGCAAGTTCATGGTC ACGGAGAAGGCAGCCTACATA§GCACCTCCMCTGGTCGGAGGA?IACT!CAGCAGCAeGG£GGGGGTGGGCTTGGTGGT CACCCAGAGCCCTGGCGCGCAGCCCGCGGGGGCCACGGTGCAGGAGCAGCTGCGGCAGCTCTTTGAGCGGGACTGGAGTT CGCGCTACGCCGTCGGCCTGGACGGACAGGCTCCGGGCCAGGACTGCGTTTGGCAGGGCTGA

> Proteína de fusión de Ig-PLD4 humana (713 aminoácidos) (SEQ ID NO:126)

MEFQTQVFYFVLLWLSGVDGDYKDDDDKGSPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVD YSEDDPDVQISWFYNNVEYHTAQTQTHREDYNSTLRVYSALPIQHQDWMSGKEFKCKYNNKDLPAPIERTISKPKGSVRA PQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRYEKKNWVERNSYSC SVVHEGLHNHHTTKSFSRIPGKRPPTWGQYGPKDVPRSWEHGSSPAWEPLEAEARQQRDSCQLVLYESIPQDLPSAAGSP SAQPLGQAWLQLLDTAQESVHVASYYWSLTGPDIGVNDSSSQLGEALLQKLQQLLGRNISLAVATSSPTLARTSTDLQVL AARGAHYRQYPMGRLTRGVLHSKFWVVDGRHIYMGSANMDWRSLTQYKELGAVIYNCSHLAQDLEKTFQTYWVLGVPKAV LPKTWPQNFSSHFNRFQPFHGLFDGVPTTAYFSASPPALCPQGRTRDLEALLAYMGSAQEFIYASVMEYFPTTRFSHPPR YWPVLDNALRAAAFGKGYRYRLLYGCGLNIDPTMFPYLRSLQALSNPAANVSVDVKYFIVPVGNHSNIPFSRVNHSKFMV TEKAAYIGTSNWSEDYFSSTAGVGLYYTQSPGAQPAGATYQEQLRQLFERDWSSRYAVGLDGQAPGQDCVWQG

Número de registro:

NITE BP-1211

NITE BP-1212

NITE BP-1213

NITE BP-1214

Texto libre de la lista de secuencias:

SEQ ID NO 45: cebador directo

SEQ ID NO 46: cebador inverso

SEQ ID NO 47: cebador directo

SEQ ID NO 48: cebador inverso

SEQ ID NO 49: cebador directo

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1 Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo que se une a la proteína fosfolipasa D4 (PLD4) humana sobre una célula dendrítica plasmocitoide (pDC) para su uso en un método de prevención o tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria asociada con pDC, en el que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo suprime una actividad de pDC.
2. 2. - El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 1, en el que la enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria en la que ha aumentado la expresión de IFNa.
3. 3. - El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 2, en el que la enfermedad autoinmunitaria es el lupus eritematoso sistémico, la artritis reumatoide crónica o la psoriasis.
4. 4. - El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la actividad de la pDC es la producción de IFN y/o la supervivencia de la pDC.
5. 5. - Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo que se une a la proteína PLD4 humana sobre una pDC para su uso en un método de prevención o tratamiento de una enfermedad alérgica, en el que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo suprime la producción de IFN.
6. 6. - El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que contiene:

   (a) la secuencia SYWMH como CDR1, la secuencia DIYPGSDSTNYNEKFKS como CDR2 y la secuencia GGWLDAMDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

   (b) la secuencia RASQDISNYLN como CDR1, la secuencia YTSRLHS como CDR2 y la secuencia QQGNTLPW como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

   (c) la secuencia SYWMH como CDR1, la secuencia DIYPGSDSTNYNEKFKS como CDR2 y la secuencia GGWLDAMDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y contiene la secuencia RASQDISNYLN como CDR1, la secuencia YTSRLHS como CDR2 y la secuencia QQGNTLPW como CDR3 en la región variable de la cadena ligera;

   (d) la secuencia TYWMH como CDR1, la secuencia AIYPGNSETSYNQKFKG como CDR2 y la secuencia GYSDFDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

   (e) la secuencia HASQGIRSNIG como CDR1, la secuencia HGTNLED como CDR2 y la secuencia VQYVQFP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

   (f) la secuencia TYWMH como CDR1, la secuencia AIYPGNSETSYNQKFKG como CDR2 y la secuencia GYSDFDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y contiene la secuencia HASQGIRSNIG como CDR1, la secuencia HGTNLED como CDR2 y la secuencia VQYVQFP como CDR3 en la región variable de cadena ligera; (g) la secuencia DYNLH como CDR1, la secuencia YIYPYNGNTGYNQKFKR como CDR2 y la secuencia GGIYDDYYDYAIDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

   (h) la secuencia RASENIYSHIA como CDR1, la secuencia GATNLAH como CDR2 y la secuencia QHFWGTP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

   (i) la secuencia DYNLH como CDR1, la secuencia YIYPYNGNTGYNQKFKR como CDR2 y la secuencia GGIYDDYYDYAIDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y contiene la secuencia RASENIYSHIA como CDR1, la secuencia GATNLAH como CDR2, y la secuencia QHFWGTP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

   (j) la secuencia SYYLY como CDR1, la secuencia LINPTNSDTIFNEKFKS como CDR2 y la secuencia EGGYGYGPFAY como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

   (k) la secuencia TSSQTLVHSNGNTYLH como CDR1, la secuencia KVSNRFS como CDR2 y la secuencia HSTHVP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

   (l) la secuencia SYYLY como CDR1, la secuencia LINPTNSDTIFNEKFKS como CDR2 y la secuencia EGGYGYGPFAY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y contiene la secuencia TSSQTLVHSNGNTYLH como CDR1, la secuencia KVSNRFS como CDR2 y la secuencia HSTHVP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

   (m) la secuencia SYGMS como CDR1, la secuencia TISSGGSYIYYPESVKG como CDR2 y la secuencia LYGGRRGYGLDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

   (n) la secuencia RSSKSLLHSDGITYLY como CDR1, la secuencia QMSNLAS como CDR2 y la secuencia AQNLEL como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

   (o) la secuencia SYGMS como CDR1, la secuencia TISSGGSYIYYPESVKG como CDR2 y la secuencia LYGGRRGYGLDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y tiene la secuencia RSSKSLLHSDGITYLY como CDR1, la secuencia QMSNLAS como CDR2 y la secuencia AQNLEL como CDR3 región variable de cadena ligera;

   (p) la secuencia SHYYWT como CDR1, la secuencia YISYDGSNNYNPSLKN como CDR2 y la secuencia EGPLYYGNPYWYFDV como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

   (q) la secuencia RASQDIDNYLN como CDR1, la secuencia YTSRLHS como CDR2 y la secuencia QQFNTLP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

   (r) la secuencia SHYYWT como CDR1, la secuencia YISYDGSNNYNPSLKN como CDR2 y la secuencia EGPLYYGNPYWYFDV como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y tiene la secuencia RASQDIDNYLN como CDR1, la secuencia YTSRLHS como CDR2, y la secuencia QQFNTLP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

   (s) la secuencia SHYYWS como CDR1, la secuencia YISYDGSNNYNPSLKN como CDR2 y la secuencia EGPLYYGNPYWYFDV como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

   (t) la secuencia RASQDIDNYLN como CDR1, la secuencia YTSRLHS como CDR2 y la secuencia QQFNTLP como CDR3 en la región variable de cadena ligera; o

   (u) la secuencia SHYYWS como CDR1, la secuencia YISYDGSNNYNPSLKN como CDR2 y la secuencia EGPLYYGNPYWYFDV como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y contiene la secuencia RASQDIDNYLN como CDR1, la secuencia YTSRLHS como CDR2, y la secuencia QQFNTLP como CDR3 en la región variable de cadena ligera.
7. 7. - El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene la región de unión al antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 6, que tiene una cadena pesada indicada en SEQ ID:121 y una cadena ligera indicada en SEQ ID:123.
8. 8. - El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.
9. 9. - El anticuerpo monoclonal, o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo es producido por uno cualquiera de los hibridomas mp5B7, mp7B4, mp13D4 y mp13H11 que están depositados con los números de registro: NITE BP-1211, NITE BP-1212, NITE BP-1213 y NITE BP-1214.
10. 10. - El anticuerpo monoclonal, o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el anticuerpo se mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. 11. - El anticuerpo monoclonal, o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el anticuerpo se suministra en forma de polvo liofilizado o comprimido.
12. 12. - Un vector de expresión que codifica el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
13. 13. - El vector de expresión de la reivindicación 12 para su uso en un método de prevención o tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria asociada con pDC.
14. 14. - El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o el vector de expresión de la reivindicación 12, para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano mediante terapia.
15. 15. - Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión al antígeno del mismo según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se une al dominio extracelular de PLD4.