ES2694165T3 - Anticuerpo anti-fosfolipasa D4 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo que se une a la proteína fosfolipasa D4 humana (PLD4) en una célula dendrítica plasmocitoide.

Description

Anticuerpo anti-fosfolipasa D4

Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo que se une a la fosfolipasa D4. De aquí en adelante, "fosfolipasa D" se puede abreviar como PLD, y "fosfolipasa D4" se puede abreviar como PLD4.

Técnica anterior

El interferón (de aquí en adelante, el "interferón" puede abreviarse como IFN) es la citocina más importante en la respuesta inmunitaria anti-viral. La célula productora de interferón en la sangre humana (IPC: IPC es una célula dendrítica basada en linfocitos indiferenciados posicionada como una célula precursora de la célula dendrítica (DC). La IPC también puede denominarse célula dendrítica plasmocitoide o célula dendrítica plasmocitoide (pDC). De aquí en adelante, en la presente memoria descriptiva, IPC y pDC son sinónimos, y son referidos de manera uniforme con el término pDC en principio a continuación.) expresa CD4 y la proteína de complejo mayor de hitocompatibilidad de clase II. Sin embargo, el aislamiento o la caracterización particular de las células no se han realizado hasta ahora debido a un número insuficiente de tales células, apoptosis rápida y carencia de marcador de linaje (sistema). Se ha revelado que pDC es célula precursora de tipo CD4+CD11c-2 de la célula dendrítica, y se encontró que pDC produce IFN más de 200 a 1000 veces más que otras células sanguíneas después de la estimulación por unmicroorganismo. Por consiguiente, pDC es una célula efectora concluyente del sistema inmunitario en una respuesta inmunitaria antiviral/antitumoral.

IFNα y IFNβ se conocen como IFN de tipo I que tienen actividad antiviral o actividad antitumoral. Por otro lado, se ha revelado que el IFNα está asociado con enfermedades autoinmunitarias. Por ejemplo, se ha informado sobre una producción anormal de IFNα en pacientes con enfermedades autoinmunitarias tales como lupus eritematoso sistémico y artritis reumatoide crónica. Además, se ha informado de un caso en el que los síntomas de la enfermedad autoinmunitaria se expresan o agravan después de la administración de un IFNα2 o IFN recombinantes. También se ha sugerido que los síntomas autoinmunes pueden aliviarsemediante la neutralización de IFNα.

Además, también se ha revelado que el IFNα induce la diferenciación de las células dendríticas (DC). Se ha contemplado que la inducción de la diferenciación de una célula dendrítica constituye un mecanismo importante en una enfermedad autoinmunitaria ya que una célula dendrítica es una célula presentadora de antígenos. De hecho, se ha sugerido que la inducción de la diferenciación de una célula dendrítica de IFNα está profundamente asociada con el desarrollo del lupus eritematoso sistémico. Como se describió anteriormente, se ha señalado la estrecha relación del IFNα con las enfermedades autoinmunitarias y la actividad antitumoral. Además, el IFNα también está profundamente asociado con el desarrollo de psoriasis.

Sólo existen en la sangre unas pocas pDC. Se contempla que la proporción de pDC que ocupa el linfocito de sangre periférica es de 1% o menos. Sin embargo, la pDC tiene una capacidad de producción de IFN muy alta. La capacidad de producción de IFN de pDC alcanza, por ejemplo, 3.000 pg/mL/104 células. Es decir, se puede decir que la mayor parte del IFNα o IFNβ en la sangre producida en el momento de la infección del virus es causada por pDC, aunque el número de células es pequeño.

La pDC se diferencia a una célula dendrítica por estimulación mediante virus, e induce la producción de IFN-γ o interleucina (IL)-10 por las células T. Además, la pDC también se diferencia a una célula dendrítica por la estimulación con IL-3. Las células dendríticas diferenciadas tras la estimulación con IL-3 inducen la producción de citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-10) por parte de las células T. Como se describió anteriormente, la pDC tiene la propiedad de que se diferencia a diferentes células dendríticas dependiendo de la diferencia de estimulaciones.

Por consiguiente, la pDC es una célula que tiene dos vertientes, es decir, una vertiente como célula productora de IFN, y la otro vertiente como célula precursora de una célula dendrítica. Cualquiera de las células juega un papel importante en el sistema inmunológico. Es decir, la pDC es una de las células importantes que apoyan el sistema inmunológico en varios aspectos.

En la regulación de la actividad de un factor humoral como el IFN, es eficaz la administración de un anticuerpo que reconoce el factor. Por ejemplo, estuvo en uso práctico un intento de tratar enfermedades autoinmunitarias con un anticuerpo contra IL-1 o IL-4. Además, también para el IFN, el anticuerpo de neutralización se considera un agente terapéutico para enfermedades autoinmunitarias. Se puede esperar que un enfoque similar sea eficaz para IFN que produce pDC. Sin embargo, tal enfoque se basa en la inhibición de la acción de un factor humoral después de producirse. Si la producción de un factor humoral previsto puede controlarse directamente, se pueden lograr otros efectos terapéuticos esenciales.

Se ha informado sobre anticuerpos que reconocen pDC humana. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-BDCA2 es un anticuerpo monoclonal humano específico de pDC (Dzionek, A. et al. J. Immunol, 165: 6037-6046, 2000). Se ha revelado que el anticuerpo monoclonal anti-BDCA-2 tiene la acción de suprimir la producción de IFN de la pDC humana (J. Exp. Med. 194: 1823-1834, 2001). Además, también se ha informado de que un anticuerpo monoclonal que reconoce a las células productoras de interferón de ratón suprime la producción de interferón (Blood 1 de junio de 2004; 103/11: 4201-4206. Epub dic. 2003). También se ha informado de que el número de células dendríticas disminuye por un anticuerpomonoclonal para pDC de ratón (J. Immunol. 2003, 171: 6466-6477).

De manera similar, resultaría útil proporcionar un anticuerpo que pueda reconocer la pDC humana y regular su actividad. Por ejemplo, los autores de la presente invención revelaron que un anticuerpo que reconoce Ly49Q se une específicamente a pDC de ratón. Sin embargo, el anticuerpo para Ly49Q no interfirió en la actividad de pDC de ratón (Blood, 1 de abril de 2005, vol. 105, No. 7, pág. 2787-2792).

La PLD es una enzima que cataliza una reacción de hidrólisis de la fosfatidilcolina para producir ácido fosfatídico y colina, y causa la señalización en varias células. Se contempla que el ácido fosfatídico producido funciona como una molécula de señal lipídica.

La PLD1 y PLD2 se conocen convencionalmente como dos tipos de PLD de mamíferos, y contienen el dominio de homología Phox (dominio PX), que es unible a fosfatidil inositido, y el dominio de homología de pleckstrina (dominio PH) en la región N terminal del mismo. Ambos dominios están implicados en la elección como diana de la membrana PLD.

La PLD1 y PLD2 contienen además dos secuencias His-x-Lys-x-x-x-x-Asp (motivo HKD). Este motivo HKD es un dominio esencial en la actividad de PLD.

Se ha contemplado que el ácido fosfatídico producido por PLD1 y PLD2 está implicado en la reconstitución del esqueleto celular, exocitosis, fagocitosis, cáncer, adhesión celular, quimiotaxis y similares, y actúa centralmente en el sistema nervioso, el sistemainmunitario y similares.

Aunque Hu-K4 humana y SAM9 de ratón se nombran oficialmente como PLD3 hasta ahora, carecen de los dominios PX y PH, y no muestran actividad PLD a pesar de que tienen dos motivos HKD. Además, aunque hay tres miembros de la familia PLD, es decir, PLD4, PLD5 y PLD6, estos PLD no clásicos son poco conocidos.

Se buscó en la base de datos de transcriptomas de desarrollo cerebeloso (CDT-DB) para determinar el patrón de expresión génica en el desarrollo del cerebelo de ratón y, como resultado de ello, se identificó PLD4, que era un producto de transcripción que se controló en el momento del desarrollo (véase Tao et al., Nat. Methods 2(8), 591598 (2005)). Las características básicas de PLD4 no han sido referidas. Se considera que se debe determinar a partir de ahora si PLD4 exhibe o no actividad enzimática, y si una forma desglicosilada de PLD4 tiene actividad PLD

o no.

La PLD4 es una secuencia de 506 aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 (Tao et al., Nat. Methods 2(8), 591-598 (2005) y Clark et al., Genome Res. 13(10), 2265-2270 (2003)). La proteína PLD4 tiene dos regiones PDE inciertas (motivo fosfodiesterasa), que están constituidas por dos motivos HKD (secuencia de aminoácidos de His-x-Lys-xxxx-Asp, en donde x son los otros aminoácidos) conservados en la región C-terminal, y un sitio de presunta fosforilación (Thr 472). La estructura de la proteína PLD4 sepredice como una proteína transmembrana monotrópica de tipo II. Además, la región N terminal de la proteína PLD4 no tiene la región PX y la región PH, que son poseídas por PLD1 y PLD2 que sonla familia PLD clásica (FIG. 1 y 2).

Por otro lado, aunque PLD4 pertenece a la familia PLD por el hecho de que tiene dos motivos HKD, PLD4 carece de dominio PX y dominio PH, pero en cambio tiene un supuestodominio transmembrana.

La expresión de ARNm de PLD4, que fue característicamente de un nivel bajo a un nivel medio, se encontró en una subpoblación celular que se localizó preferentemente en el cuerpo calloso y la periferia de la región de la materia blanca, incluida la materia blanca del cerebelo de un ratón 1 semana después del nacimiento. Estas células que expresan el ARNm de PLD4 se han identificado como microglia Ibal positiva (véase Tao et al., Nat. Methods 2(8), 591-598 (2005)).

El período de 1 semana después del nacimiento es un período en el que la activación de la formación de mielina comienza en el cuerpo calloso y en la sustancia blanca cerebelosa de un ratón. En este período, el PLD4 se expresa altamente en la microglía ameboide (estado activado) que existe en la materia blanca. A partir de estos hechos, se contempla la posibilidad de que la célula de expresión de PLD4 en la materia blanca esté involucrada en la formación de mielina en este período. Particularmente, se hace evidente la acumulación de PLD4 en la vesícula fagocítica, y se sugiere la posibilidad de que la célula de expresión de PLD4 esté involucrada en la fagocitosis. Desde la microglia ameboide en el estado activado, se secretan varias citocinas o factores de crecimiento, y la

fagocitosis también se activa. Se contempla que el oligodendrocito adicional (célula de la glía en el sistema nervioso central, que forma la mielina a medida que se enrolla y se une al axón) causa la apoptosis en la materia blanca del cerebro en la etapa de desarrollo. Se ha contemplado la posibilidad de que el oligodendrocito extra se degrade y se elimine de la microglía ameboide para secretar una molécula señal, por medio de lo cual se organiza el entorno para

5 la formación de mielina en la materia blanca. Se sugiere que la PLD4 está implicada en estos procesos, incluida la formación demielina.

La expresión del ARNm de PLD4 también se observa universalmente en tejidos no nerviosos, pero se distribuye principalmente en el bazo. La fuerte expresión de PLD4 se detecta en la periferia de la zona limítrofe de la pulpa roja

10 del bazo, y la proteína PLD4 esplénica recolectada de la fracción de membrana en la célula está altamente Nglicosilada. Cuando PLD4 se expresó en un sistema celular heterogéneo, se localizó en el retículo endoplásmico y el cuerpo de Golgi. La PLD4 expresada de forma heteróloga no mostró la actividad enzimática de PLD (Plos ONE www.plosone.org, noviembre de 2010, Volumen 5, Número 11, e13932).

15 A partir del patrón de expresión de PLD4 limitado en términos de tiempo y ubicación, se sugiere que PLD4 desempeña un papel en las funciones comunes en la microglía o en la célula en la región limítrofe del bazo en el momento del desarrollo cerebral en la etapainicial después del nacimiento.

La expresión del ARNm de PLD4 y la distribución de PLD4 en el tejido nervioso y en el tejido no nervioso se han

20 analizado anteriormente. Sin embargo, los autores de la presente invención descubrieron que el ARNm de PLD4 se expresa sumamente de manera específica en una célula pDC en la etapa de reposo (pDC en reposo) a nivel de una especie celular descrita a continuación.

El anticuerpo policlonal de ratón anti-PLD4 humana contra la proteína PLD4 humana completa está disponible

25 comercialmente (anticuerpo policlonal de ratón MaxPab purificado contra PLD4 (B01P), número de catálogo H00122618-B01P, fabricado por Abnova Corporation). Sin embargo, no se ha obtenido un anticuerpo monoclonal que se una solo a un determinado sitio de PLD4, o un anticuerpo monoclonal que pueda unirse específicamente a PLD4.

30 Lista de referencias

Literatura no relacionada con patentes

(1)

Tao et al., Nat. Methods 2(8), 591-598 (2005) 35 (2)Clarketal.,GenomeRes.13(10),2265-2270(2003)

(3)

Plos ONE www.plosone.org, noviembre de 2010, Volumen 5, Tema 11, e13932

(4)

Catalog of mouse PLD4 polyclonal antibody against full length human PLD4 protein (Abnova, número de catálogo H00122618-B01P)

(5)

Dzionek, A. et al. J.Immunol. 165: 6037-6046, 2000 40 (6) J. Exp. Med.194: 1823-1834, 2001

(7)

Blood 1 dejunio de 2004; 103/11: 4201-4206. Epub dic. 2003

(8)

J. Immunol. 2003, 171: 6466-6477

(9)

Blood, 1 de abril de 2005, vol. 105, Núm. 7, pág. 2787-2792

(10)

Nat. Methods 2(8), 591-598 (2005) 45

Compendio de la invención

Problema técnico

50 Un problema a resolver por la invención es proporcionar un anticuerpo que se una a PLD4, y detectar, identificar o aislar la pDC. Además, un problema aresolver por lainvención es regular la actividad de las pDC.

Solución al problema

55 Los autores de la presente invención confirmaron a través de una investigación para PLD4 que la expresión de PLD4 aumenta específicamente en pDC, particularmente pDC en la etapa de reposo, además de pDC en la etapa activa. En consecuencia, los autores de la presente invención probaron la preparación del anticuerpo contra PLD4 y el esclarecimiento de su acción.

60 Con el fin de obtener un anticuerpo que reconozca una ligera cantidad de una proteína derivada de un organismo vivo, se utiliza generalmente como inmunógeno una proteína preparada mediante tecnología de genes recombinantes. Los autores de la presente invención probaron la expresión de PLD4 basándose en la información de la secuencia de bases del ADNc de PLD4, y una secuencia de aminoácidos (Núm. Acceso GenBank NM_138790.2) codificada por la misma, que ya ha sido revelada (Nat. Methods 2(8), 591-598 (2005)).

Con el fin de obtener un anticuerpo de una proteína, a menudo se intenta el uso de una secuencia parcial de aminoácidos de una proteína natural como inmunógeno. Sin embargo, para que un anticuerpo reconozca una molécula en la superficie celular, es necesario seleccionar una región que constituya una parte reconocida por el anticuerpo tal como un epítopo en la superficie celular. Por consiguiente, se ha contemplado que no es realista utilizar una secuencia de aminoácidos fragmento como un inmunógeno para obtener un anticuerpo específico para PLD4.

Bajo tales circunstancias, los autores de la presente invención revelaron que el uso de un inmunógeno especial permite obtener un anticuerpo que se une a pDC. Además, los autores de la presente invención confirmaron que el anticuerpo así obtenido reconoce específicamente la pDC humana, y además tiene una acción de regulación de su actividad, y completaron la invención. Es decir, la invención se refiere a un anticuerpo anti-PLD4, a un método de preparación del mismo, y a su uso descrito a continuación.

La invención es la siguiente:

(1)

Un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo que se une ala proteína de la fosfolipasa D4 humana(PLD4) en una célula dendrítica plasmocitoide.

(2)

El anticuerpo monoclonal, o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo como se describe en el apartado (1) mencionado anteriormente,

(a)

que tiene la secuencia SYWMH (SEQ ID NO: 2) como CDR1, la secuencia DIYPGSDSTNYNEKFKS (SEQ ID NO: 3) como CDR2, y la secuencia GGWLDAMDY (SEQ ID NO: 4) como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

(b)

que tiene la secuencia RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 5) como CDR1, la secuencia YTSRLHS (SEQ ID NO: 6) como CDR2, y la secuencia QQGNTLPW (SEQ ID NO: 7) como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(c)

que tiene la secuencia SYWMH como CDR1, la secuencia DIYPGSDSTNYNEKFKS como CDR2 y la secuencia GGWLDAMDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y tiene la secuencia RASQDISNYLN como CDR1, la secuencia YTSRLHS como CDR2, y la secuencia QQGNLLPWC en la región variable de cadena ligera;

(d)

que tiene la secuencia TYWMH (SEQ ID NO: 8) como CDR1, la secuencia AIYPGNSETSYNQKFKG (SEQ ID NO: 9) como CDR2, y la secuencia GYSDFDY (SEQ ID NO: 10) como CDR3 en la región variable de cadena pesada (anticuerpo 8C11);

(e)

que tiene la secuencia HASQGIRSNIG (SEQ ID NO: 11) como CDR1, la secuencia HGTNLED (SEQ ID NO: 12) como CDR2 y la secuencia VQYVQFP (SEQ ID NO: 13) como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(f)

que tiene la secuencia TYWMH como CDR1, la secuencia AIYPGNSETSYNQKFKG como CDR2, y la secuencia GYSDFDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y tiene la secuencia HASQGIRSNIG como CDR1, la secuencia HGTNLED como CDR2, y la secuencia VQVVVQQQ en la región variable de cadena ligera;

(g)

que tiene la secuencia DYNLH (SEQ ID NO: 14) como CDR1, la secuencia YIYPYNGNTGYNQKFKR (SEQ ID NO: 15) como CDR2, y la secuencia GGIYDDYYDYAIDID (SEQ ID NO: 16) como CDR3 en la región de la cadena dela cadena pesada;

(h)

que tiene la secuencia RASENIYSHIA (SEQ ID NO: 17) como CDR1, la secuencia GATNLAH (SEQ ID NO: 18) como CDR2 y la secuencia QHFWGTP (SEQ ID NO: 19) como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(i)

que tiene la secuencia DYNLH como CDR1, la secuencia YIYPYNGNTGYNQKFKR como CDR2, y la secuencia GGIYDDYYDYAIDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y tiene la secuencia RASENIYSHIA como CDR1, la secuencia GATNLAH como CDR2, y la secuencia QHFWGTP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(j)

que tiene la secuencia SYYLY (SEQ ID NO: 20) como CDR1, la secuencia LINPTNSDTIFNEKFKS (SEQ ID NO: 21) como CDR2, y la secuencia EGGYGYGPFAY (SEQ ID NO: 22) como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

(k)

que tiene la secuencia TSSQTLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 23) como CDR1, la secuencia KVSNRFS (SEQ ID NO: 24) como CDR2, y la secuencia HSTHVP (SEQ ID NO: 25) como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(l)

que tiene la secuencia SYYLY como CDR1, la secuencia LINPTNSDTIFNEKFKS como CDR2, y la secuencia EGGYGYGPFAY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y tiene la secuencia TSSQTLVHSNGNTYLH como CDR1, la secuencia KVSRRFS como CDR2, y la secuencia HSTHVP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(m)

que tiene la secuencia SYGMS (SEQ ID NO: 26) como CDR1, la secuencia TISSGGSYIYYPESVKG (SEQ ID NO: 27) como CDR2 y la secuencia LYGGRRGYGLDY (SEQ ID NO: 28) como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

(n)

que tiene la secuencia RSSKSLLHSDGITYLY (SEQ ID NO: 29) como CDR1, la secuencia QMSNLAS

(SEQ ID NO: 30) como CDR2, y la secuencia AQNLEL (SEQ ID NO: 31) como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(o)

que tiene la secuencia SYGMS como CDR1, la secuencia TISSGGSYIYYPESVKG como CDR2, y la secuencia LYGGRRGYGLDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y tiene la secuencia RSSKSLLHSDGITYLY como CDR1, la secuencia QMSNLAS como CDR2, y la secuencia AQNLEL como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(p)

que tiene la secuencia SHYYWT (SEQ ID NO: 32) como CDR1, la secuencia YISYDGSNNYNPSLKN (SEQ ID NO: 33) como CDR2, y la secuencia EGPLYYGNPYWYFDV (SEQ ID NO: 34) como CDR3 en la región variable de cadena dela cadena pesada;

(q)

que tiene la secuencia RASQDIDNYLN (SEQ ID NO: 35) como CDR1, la secuencia YTSRLHS (SEQ ID NO: 36) como CDR2 y la secuencia QQFNTLP (SEQ ID NO: 37) como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(r)

que tiene la secuencia SHYYWT como CDR1, la secuencia YISYDGSNNYNPSLKN como CDR2, y la secuencia EGPLYYGNPYWYFDV como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y tiene la secuencia RASQDIDNYLN como CDR1, la secuencia YTSRLHS, como CDR2, y la secuencia QQFNTLP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(s)

que tiene la secuencia SHYYWS (SEQ ID NO: 38) como CDR1, la secuencia YISYDGSNNYNPSLKN (SEQ ID NO: 39) como CDR2, y la secuencia EGPLYYGNPYWYFDV (SEQ ID NO: 40) como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

(t)

que tiene la secuencia RASQDIDNYLN (SEQ ID NO: 41) como CDR1, la secuencia YTSRLHS (SEQ ID NO: 42) como CDR2 y la secuencia QQFNTLP (SEQ ID NO: 43) como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

(u)

que tiene la secuencia SHYYWS como CDR1, la secuencia YISYDGSNNYNPSLKN como CDR2, y la secuencia EGPLYYGNPYWYFDV como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y tiene la secuencia RASQDIDNYLN como CDR1, la secuencia YTSRLHS como CDR2, y la secuencia QQFNTLP como CDR3 en la región variable de cadena ligera.

(3)

El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contienen la región de unión a antígeno del mismo como se describe en el apartado (2) mencionado anteriormente, que tiene una cadena pesada expuesta en SEQ ID: 121 y una cadena ligera expuesta en SEQ ID: 123.

(4)

El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo como se describe en cualquiera de los apartados (1) a (3) mencionados anteriormente, en donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo suprimen una actividad de la célula dendrítica plasmocitoide.

(5)

El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo como sedescribeen el apartado (4) mencionado anteriormente, en dondela actividad es la producción de interferón (IFN) y/ola supervivencia de la célula dendrítica plasmocitoide.

(6)

El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo como se describe en cualquiera de los apartados (1) a (5) mencionados anteriormente, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

(7)

Un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo, producido por cualquiera de los hibridomas mp5B7, mp7B4, mp13D4 y mp13H11 que se depositan bajo los Números de Acceso: NITE BP-1211, NITE BP-1212, NITE BP-1213, y NITE BP-1214.

(8)

Un método para preparar una célula que produce un anticuerpo monoclonal que se une a PLD4 como se describe en cualquiera de los apartados (1), (4) y (5) mencionados anteriormente, que contienen los siguientes procedimientos;

1) un procedimiento de administración de la proteína de fusión PLD4-Ig recombinante que codifica una secuencia de aminoácidos que contiene un dominio extracelular de PLD4, para inmunizar a un animal, y 2) un procedimiento de selección de una célula productora de anticuerpos que produce un anticuerpo que se une a PLD4 a partir de células productoras de anticuerpos del animal inmunizado mediante la unión de dicho anticuerpo de unión a PLD4 a una célula que expresa PLD4; y opcionalmente 3) un procedimiento de clonación delas células productoras de anticuerpos obtenidas de forma gradual.

(9)

El método descrito en el apartado (8) mencionado anteriormente, en el que la célula que expresa PLD4 es una célula que retiene un polinucleótido extrínseco que codifica una secuencia de aminoácidos que contiene el dominio extracelular de PLD4 de unamanera expresable.

(10)

Un método para preparar un anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PLD4, que comprende cultivar células productoras de anticuerpos obtenidas mediante el método descrito en el apartado

(9)

mencionado anteriormente, y recoger un anticuerpomonoclonal del cultivo.

(11)

El anticuerpo monoclonal, o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo como se describe en cualquiera de los apartados (1), (4) y (5) mencionados anteriormente, que pueden obtenerse mediante los siguientes procedimientos;

1) administrando una proteína de fusión PLD4-Ig recombinante que codifica una secuencia de

aminoácidos que contiene un dominio extracelular de PLD4, para inmunizar a un animal, 2) seleccionando una célula productora de anticuerpos que produce un anticuerpo que se une a PLD4 a partir de células productoras de anticuerpos del animal inmunizado, y 3) cultivando las células productoras de anticuerpos seleccionadas en el procedimiento 2), y recolectando un anticuerpo que reconoce PLD4 del cultivo.

(12)

Un método ex vivo un para detectar una célula dendrítica plasmocitoide, que comprende poner en contacto con una célula de prueba el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno como se describe en cualquiera de los apartados (1) a (7) mencionados anteriormente, y detectar el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo que se une a la célula.

(13)

El uso del anticuerpo monoclonal, o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo como se describe en cualquiera de los apartados (1) a (7) mencionados anteriormente como un reactivo para la detección de una célula dendrítica plasmocitoide ex vivo

(14)

Un método para suprimir una actividad de una célula dendrítica plasmocitoide humana, ex vivo que comprende poner en contacto con la célula cualquiera deloscomponentes descritos a continuación:

(a)

el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo como se describe en cualquiera de los apartados (1) a (7) mencionados anteriormente, y

(b)

una inmunoglobulina o un fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno en la que se transplantan las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo monoclonal de cualquiera de los apartados (1) a (7) mencionados anteriormente.

(15)

Cualquiera de:

(a)

el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo como se describe en cualquiera de los apartados (1) a (7) mencionados anteriormente, y

(b)

una inmunoglobulina o un fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo, en los que las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo monoclonal de cualquiera de los apartados (1) a (7) mencionados anteriormente se trasplantan para su uso en un método de suprimir una actividad de una célula dendrítica plasmocitoide humana en un organismo vivo, que comprende administrar cualquiera de (a) y (b) al ser humano vivo.

Efectos dela invención

La invención proporciona un anticuerpo monoclonal que se une a PLD4 humana en una célula dendrítica plasmocitoide. PLD4 es una proteína de membrana que pertenece a la familia PLD. Los autores de la presente invención revelaron que se puede obtener fácilmente un anticuerpo que reconoce específicamente PLD4. El anticuerpo anti-PLD4 que se puede obtener mediante la invención es un anticuerpo que tiene una alta especificidad, que distingue la pDC humana de una célula que expresa otras familias de PLD.

El anticuerpo anti-PLD4 proporcionado por la invención se une a pDC humana. Además, el anticuerpo de la invención reconoce específicamente la pDC humana. Por consiguiente, el anticuerpo de la invención es útil para la detección o el aislamiento de pDC. La pDC es una célula queproduce la mayoría de IFN tipo 1. En consecuencia, tal detección o aislamiento es importante en el diagnóstico o la investigación de enfermedades asociadas con la pDC, tales como las enfermedades autoinmunitarias.

Además, en un aspecto preferido, el anticuerpo anti-PLD4 proporcionado por la invención tiene una acción de regulación de la actividad de pDC humana. Por consiguiente, el anticuerpo anti-PLD4 de la invención se puede utilizar para suprimir la actividad de pDC. Por consiguiente, si se emplea la supresión de la actividad de pDC utilizando el anticuerpo de la invención, se pueden esperar efectos terapéuticos para un paciente de una enfermedad autoinmunitaria en la que ha aumentadola expresión de IFNα.

La pDC produce una gran cantidad de IFN en un pequeño número de células. En la neutralización de IFN, es necesario un anticuerpo, que depende del número de moléculas de IFN. Sin embargo, en la invención, la actividad de la célula de producción se suprime directamente. Como resultado de ello, se puede esperar un potente efecto de supresión de IFN conmenos cantidad de anticuerpo en comparación con la neutralización de un anticuerpo anti-IFN. Además, en caso de que el IFN se produzca de manera continua, se espera que la neutralización por el anticuerpo contra IFN semantenga como supresión transitoria. Sin embargo, en la invención, la actividad de pDC se suprime, y de esto, se puede esperar un efecto de supresión dela producción deIFN durante un tiempo prolongado.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es un diagrama que ilustra la secuencia de aminoácidos de la proteína PLD4 (C14orfl75) humana

(506 residuos). Secontempla quelos 31 a 53 residuos del extremo N-terminal son un dominio transmembrana como se analiza utilizando el "programa SOSUI (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)", que es el sistema de predicción para una región transmembrana. Los residuos 54 a 506 contienen dos motivos fosfodiesterasa, y se predice que esta proteína es una proteína transmembrana de tipo II; La FIG. 2 es un diagrama esquemático que representa una estructura predicha de la proteína PLD4 humana. La estructura tiene dos motivos HKD (HxKxxxxD) en los residuos del aminoácido 506, y el residuo de treonina 472 es posiblemente un sitio defosforilación; La FIG. 3 es un gráfico que ilustra la homología de la proteína PLD4 humana con especies moleculares homólogas en un animal heterogéneo. La proteína PLD4 se ha conservado en el procedimiento de evolución de un ratón a un ser humano; La FIG. 4 es un gráfico queilustra la homología con la familia de proteínas PLD4 humana (paráloga); La FIG. 5 es un gráfico que ilustra la expresión específica de pDC humana del gen PLD4 en una célula responsable de la inmunidad humana. La expresión del gen PLD4 es alta en pDC en la etapa de reposo, y la expresión es baja en células B CD19+; La FIG. 6 es un gráfico que ilustra el patrón de expresión tisular del ARNm de PLD4 humana. La expresión es alta en el bazo y en losleucocitos de sangre periférica; La FIG. 7 es un diagrama esquemático que ilustra la estructura de la proteína de fusión PLD4-Ig humana recombinante. Un fragmento de ADNc que corresponde al dominio extracelular de PLD4 humana (56-506 aminoácidos) se amplificó mediante PCR. Este fragmento se insertó en el sitio de clonación BamHI-EcoRI del vector de expresión pcDNA3.1 de N-Flag que contiene el segmento líder de IgK de ratón y la región Fc constante de cadena pesada de IgG2a de ratón (bisagra + CH2 + CH3) en el extremo N terminal. La célula 293F setransfectótemporalmente con un plásmido y se recogió el sobrenadante del cultivo; La FIG. 8 es un diagrama de análisis FACS que ilustra la especificidad de unión a PLD4 humana. Los anticuerpos mp11G9.6 y ch11G9.6 reconocen específicamente PLD4 humana, pero no reconocen transfectantes PLD3-293T o PLD5-293T humanos; La FIG. 9 es un diagrama de análisis FACS que ilustra la reactividad cruzada con PLD4 de mono cinomolgo. Los anticuerpos mp11G9.6 y ch11G9.6 fueron capaces de reconocer PLD4 de mono cinomolgo en el transfectante 293T; La FIG. 10 es un diagrama de medición FACS que ilustra la tinción en el anticuerpo mp11G9.6 de PBMC humanas.Elanticuerpomp11G9.6reconociófuertementepDCBDCA2+ enPBMChumanas; La FIG. 11 es un diagrama de análisis FACS que ilustra la tinción en el anticuerpo anti-PLD4 purificado de células CAL-1; La FIG. 12 es un diagrama de análisis FACS que ilustra la tinción en el anticuerpo anti-PLD4 de la cepa de células estable PLD4-CT125 humana; La FIG. 13 es un diagrama de análisis FACS que ilustra la tinción en el anticuerpo anti-PLD4 de las PBMC humanas. Todos los anticuerpos anti-PLD4 fueron capaces de reconocer pDC BDCA2+ en PBMC humanas; La FIG. 14 es un diagrama que representa la alineación múltiple y la homología de las proteínas de PLD humana, PLD4 demono cinomolgo, PLD4 demono rhesus yPLD4 de ratón; La FIG. 15 es un diagrama de análisis FACS que ilustra la tinción en el anticuerpo anti-PLD4 con la introducción del gen transitorio del vector de expresión PLD4 del mono cinomolgo etiquetado con Flag en células PLD4-293T humanas. La expresión en la superficie celular de la proteína PLD4 demono cinomolgo se confirmó en el anticuerpo anti-Flag; La FIG. 16 es un diagrama de medición FACS que ilustra la tinción en el anticuerpo anti-PLD4 de células PLD4-CT125 demono cinomolgo. Entre los anticuerpos anti-PLD4, siete (3B4, 5B7, 7B4, 13D4, 13H11, 14C1 y 11G9.6) pueden unirse al transfectante estable PLD4-CT125 del mono cinomolgo; La FIG. La Fig. 17 es un diagrama de análisis FACS que ilustra la tinción en el anticuerpo anti-PLD4, con la introducción transitoria del gen del vector de expresión PLD4 del mono rhesus etiquetado con Flag en la célula PLD4-293T humana. La expresión en la superficie celular de la proteína PLD4 del mono rhesus se confirmó en el anticuerpo anti-Flag; La FIG. 18-1 y la FIG. 18-2 son diagramas de análisis FACS que ilustran la tinción en el anticuerpo anti-PLD4 de las PBMC de monos rhesus. Entre los anticuerpos anti-PLD4, cinco (5B7, 7B4, 13D4, 13H11 y 14C1) se unieron específicamente a la población de células pDC (Linaje-CD123 + HLA-DR+) de mono cinomolgo en PBMC demono rhesus; La FIG. 19 es un gráfico que ilustra la concentración molar de la constante de disociación (unidad nM, valor Kd) del anticuerpo anti-PLD4 contra la cepa celular estable PLD4-CT125 humana; La FIG. 20 es un gráfico que ilustra la actividad CDC de diez tipos de anticuerpos anti-PLD4. Célula diana: PLD4-CT125 humana (linfocito de células T 2B4 de ratón), concentración de anticuerpo transfectante estable: 10 µg/mL, efector: complemento de conejo inmaduro al 1%; La FIG. 21 es un gráfico que ilustra la actividad de CDC de los anticuerpos anti-PLD4 (anticuerpo mp11G9.6 y anticuerpo ch11G9.6). Célula diana: PLD4-CT125 humana (linfocito de células T 2B4 de ratón), concentración de anticuerpo transfectante estable: 0,1 µg/mL a 30 µg/ml, efector: complemento de conejo inmaduro al 1%; La FIG. 22 es un gráfico que ilustra la actividad ADCC del anticuerpo quimérico anti-PLD4. Célula diana: PLD4-CHO humana, concentración de anticuerpo transfectante estable: 10 µg/ml; La FIG. 23 es un gráfico que ilustra la medición con ELISA de la inhibición de la secreción de IFN-α mediante

tratamiento con anticuerpo quimérico anti-PLD4 (ch11G9.6) en PBMC humanas aisladas de tres individuos sanos; y La FIG. 24 es un diagrama que ilustra la pérdida de pDC humana después del tratamiento con anticuerpo quimérico anti-PLD4. La FIG. 25 es un resultado del ensayo ADCC con Ab quiméricos anti-PLD4 contra pDC primarias humanas. La FIG. 26 es la producción de IFNα a partir de PBMC por CpG2216 en presencia de Ab anti-PLD4 quiméricos.

Modo de llevar a cabo la invención.

Los autores de la presente invención encontraron que PLD4 es una molécula que se expresa específicamente a nivel de ARNm y a nivel de proteína en una célula dendrítica plasmocitoide en la etapa de reposo (pDC en reposo). No se ha establecido un método para preparar un anticuerpoque reconozca PLD4.

Existe un informe de que la PLD4 de ratón es una moléculaque se expresa en microglia ameboide (estado activado) en la etapa de desarrollo en el cerebelo o en el cuerpo calloso en la etapa inicial después del nacimiento. Sin embargo, la expresión de PLD4 humana no se conoce hasta ahora. Particularmente, la expresión en el sistema inmunológico, la ubicación intracelular, la estructura, la función y similares de PLD4 humana no se han referido hasta ahora. La invención confirmó que la PLD4 humana, que hasta ahora se contemplaba que solo se expresaba en el citoplasma, es un marcador de la superficie celular que se expresa en células plasmocitoides dendríticas (pDC) como proteína transmembrana de tipo II. En consecuencia, es posible la unión del anticuerpo contra PLD4 a pDC, y se ha demostrado que el anticuerpo contra PLD4 es útil como diana molecular de un anticuerpo terapéutico destinado a regular las funciones delas células B y las células pDC.

Los autores de la presente invención confirmaron mediante análisis de expresión génica que PLD4 se expresa específicamente en pDC humana. Se considera que si se obtiene un anticuerpo que pueda distinguir PLD4 inmunológicamente de otras moléculas, éste sería útil para la investigación de pDC. Sin embargo, existen muchas moléculas en la familia PLD, incluyendo PLD4, que tienen una estructura muy similar entre sí. Moléculas tales como PLD1, PLD2, PLD3 y PLD5, incluyendo PLD que es PLD4, abarcan una secuencia de aminoácidos que tiene una homología particularmente alta (Figura 4). Por consiguiente, se consideró que es difícil obtener un anticuerpo que distinga mutuamente estas moléculas utilizando un inmunógeno de un péptido que emplea una secuencia de aminoácidos (una secuencia parcial) que constituye PLD4 (o dominio extracelular). En consecuencia, los autores de la presente invenciónintentaron la adquisición de un anticuerpo contra PLD4 utilizando una proteína de fusión PLD4-Ig recombinante como inmunógeno, que codifica una secuencia de aminoácidos que abarca el dominio extracelular de PLD4.

Los autores de la presente invención repitieron las investigaciones para adquirir un anticuerpo que reconoce PLD4 y revelaron que el anticuerpo deseado se obtiene utilizando una proteína de fusión PLD4-Ig recombinante como inmunógeno, y completaron la invención. Es decir, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PLD4, o un fragmento que contiene una región de unión a antígeno del mismo.

En la invención, PLD4 es una molécula natural que se expresa en pDC humana, o una molécula inmunológicamente equivalente a PLD4 que se expresa en pDC humana. En la invención, la unión de un anticuerpo a PLD4 se puede confirmar, por ejemplo, como se describe a continuación.

Confirmación basada en la reactividad con células humanas: De acuerdo con los hallazgos obtenidos por los autores de la presente invención, se contempla que se puede utilizar PLD4 comomarcador de pDC, debido al hecho de que exhibe expresión específica en pDC humana.

Basándose en dicho perfil de expresión de PLD4, la actividad de unión a al menos un subconjunto parcial de pDC es una de las características importantes del anticuerpo que se une a PLD4 en la invención. El hecho de que alguna célula sea pDC puede confirmarse mediante un marcador de superficie celular inherente en cada familia de células. Por ejemplo, la unión a una célula deseada se confirma mediante doble tinción de un anticuerpo que se une a un marcador de la superficie celular y se confirma que un anticuerpo confirma la actividad de unión. Es decir, pDC en la invención abarca células que expresan, por ejemplo, BDCA2.

Confirmación basada en la reactividad con células transformadas que expresan el gen PLD4: Los autores de la presente invención confirmaron que las características inmunológicas de PLD4 que se expresan en pDC humana se reconstituyen cuando el gen de PLD4 se expresa en ciertas condiciones. Por consiguiente, la reactividad con PLD4 también puede confirmarse basándose en la reactividad de un anticuerpo para una célula en la que se introduce artificialmente un gen que codifica PLD4. Es decir, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que se une a una molécula que contiene una secuencia de aminoácidos que constituye el dominio extracelular de PLD4 como dominio extracelular, o un fragmento que contiene una región de unión a antígeno del mismo. Paralelamente, el dominio extracelular está constituido

por una secuencia de aminoácidos que corresponde a 54 a 506 desde el extremo N-terminal en SEQ ID NO 1 (FIG. 1) de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO 1.

Por ejemplo, en una célula que se transforma con un vector de expresión que abarca el ADN que codifica PLD4, se mantienen las características inmunológicas de PLD4 que se expresan en pDC humana. Por consiguiente, una célula transformada que expresa PLD4 es preferible como célula para confirmar la propiedad de unión de un anticuerpo al dominio extracelular de PLD4 en la invención. Cuando la reactividad de un anticuerpo por una célula transformada se confirma en la invención, se utiliza deseablemente como control una célula no transformada.

A continuación, el anticuerpo que se une a PLD4 en la invención puede ser un anticuerpo que muestra propiedades cruzadas con una familia celular que se sabe que expresa una familia de PLD diferente a PLD4, o puede ser un anticuerpo que no muestra dicha propiedad cruzada. El anticuerpo que no muestra ninguna propiedad cruzada es preferible como anticuerpo que se une a PLD4 en la invención. Específicamente, el anticuerpo que se une a PLD4 en la invención es preferiblemente un anticuerpo cuya unión a una familia de células que se sabe que expresan una familia de PLD distinta de PLD4 puede no estar confirmada, en las mismas condiciones que las condiciones en las que se confirma la unión a pDC.

Es decir, el anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PLD4 en la invención preferiblemente abarca un anticuerpo monoclonal quetiene las características inmunológicas descritas a continuación.

a) Unión a pDC humana, b) La unión a una o varias especies de células seleccionadas de un grupo que consiste en monocitos, macrófagos, células CD34 positivas y células dendríticas derivadas de estas células puede no estar confirmada, en condiciones que permiten la unión ala pDC humana.

Particularmente, el anticuerpo monoclonal de la invención es preferiblemente un anticuerpo cuya unión a monocitos, macrófagos, células B, células CD34 positivas y células dendríticas derivadas de estas células puede no estar confirmada, en condiciones que permiten la unión a pDC humana.

Alternativamente, el anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PLD4 en la invención preferiblemente abarca un anticuerpo monoclonal que tiene características inmunológicas que se describen a continuación.

c) Unión a una célula transformada que se transforma con un vector de expresión que retiene el ADN que codifica PLD4 de una manera expresable, d) La unión a la célula anfitriona de c) antes de ser transformada puede no estar confirmada, en condiciones que permitan la unión a la célula transformada c).

El hecho de que el anticuerpo monoclonal anti-PLD4 no se cruce con otras moléculas de la familia PLD en la invención, puede confirmarse empleando una célula en la que cada familia PLD se expresó obligatoriamente. Es decir, la expresión obligatoria se realiza mediante la introducción de ADNc que codifica la secuencia de aminoácidos de cada familia PLD en una célula anfitriona apropiada. La célula transformada obtenida se pone en contacto con el anticuerpo monoclonal anti-PLD4 para confirmar la propiedad cruzada. Si no se muestra la unión a una célula que exprese moléculas de la familia PLD distintas de PLD4, se puede confirmar que el anticuerpo puede distinguir inmunológicamente PLD4 de otras moléculas de la familia PLD. Por ejemplo, se confirma en los ejemplos que se describen a continuación que la mayoría de los anticuerpos monoclonales anti-PLD4 obtenidos por la invención no se cruzan con PLD3 y PLD5 que tienen una homología particularmente alta con PLD4, y adicionalmente con PLD1 y PLD2. Por consiguiente, el anticuerpo monoclonal en la invención es preferiblemente un anticuerpo monoclonal que se une a PLD4, pero cuya unión a PLD3, PLD5, PLD1 o PLD2 no se puede detectar en las mismas condiciones. Si se utiliza un anticuerpo que puede distinguir inmunológicamente estas moléculas de la familia PLD de PLD4, se puede detectar específicamente el cambio en la expresión de PLD4.

La unión de un anticuerpo monoclonal cuya actividad de unión se debe confirmar, a cada especie de una célula, se puede confirmar, por ejemplo, en el principio de citometría de flujo. Con el fin de confirmar la reactividad de un anticuerpo mediante el principio de citometría de flujo, es ventajoso marcar el anticuerpo con una molécula o grupo de átomos que produce una señal detectable. Generalmente, se utiliza una etiqueta fluorescente o una etiqueta luminiscente. Para analizar la unión de un anticuerpo marcado con fluorescencia a una célula mediante el principio de citometría de flujo, se puede utilizar un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS). Al utilizar FACS, se pueden confirmar eficazmente los enlaces múltiples de un anticuerpo a una célula.

Específicamente, por ejemplo, un anticuerpo A que se sabe preliminarmente que es capaz de identificar pDC, y un anticuerpo B que se debe analizar para determinar las características de unión a pDC, se hacen reaccionar al mismo tiempo con una familia de células que abarca pDC. El anticuerpo A y el anticuerpo B están en la marca con una señal fluorescente que puede distinguirlos entre sí. Si ambas señales se detectan en la misma familia de células, se

puede confirmar que dichos anticuerpos se unen a la misma familia de células. Es decir, se encuentra que el anticuerpo A y el anticuerpo B tienen las mismas características de unión. Si el anticuerpo A y el anticuerpo B se unen a unafamilia celular diferente, es evidente que las características de unión de ellos son diferentes entre sí.

5 Los ejemplos de anticuerpos monoclonales preferidos en la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales producidos por hibridomasmp5B7, mp7B4, mp13D4 ymp13H11.

Los hibridomas mp5B7, mp7B4, mp13D4 y mp13H11 se depositaron bajo los Números de Acceso: NITE BP-1211, NITE BP-1212, NITE BP-1213 y NITE BP-1214 en el National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent

10 Microorganisms Depositary el 27 de enero de 2012. Los contenidos para especificar el depósito se describirán a continuación.

(1) Nombre y dirección de la autoridad de depósito

15 Nombre: National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Advanced Industrial Science and Technology Patent Microorganisms DepositaryDirección: 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818 JAPÓN

(2) Fecha de depósito: 27 de enero de 2012 20 (3) Números de acceso NITE BP-1211 (hibridoma mp5B7)

NITE BP-1212 (hibridoma mp7B4) NITE BP-1213 (hibridoma mp13D4) NITE BP-1214 (hibridoma mp13H11)

25 El anticuerpo monoclonal de la invención puede ser un fragmento que contiene una región de unión a antígeno del mismo. Por ejemplo, como anticuerpo en la invención se puede utilizar un fragmento de anticuerpo que abarca un sitio de unión a antígeno que se produce mediante digestión enzimática de IgG. Específicamente, mediante digestión con papaína o pepsina, se puede obtener un fragmento de anticuerpo tal como Fab o F(ab')2. Además, un

30 fragmento de inmunoglobulina que abarca una región variable en la que se transplanta una región de determinación de la complementariedad (CDR) de algún anticuerpo monoclonal, está incluido en el fragmento que contiene la región de unión al antígeno. Es ampliamente conocido que estos fragmentos de anticuerpos se pueden utilizar como una molécula de anticuerpo que tiene afinidad de unión a un antígeno. Alternativamente, se puede utilizar un anticuerpo construido por recombinación de genes siempre que mantenga la actividad necesaria para la unión al

35 antígeno. Los ejemplos del anticuerpo construido mediante recombinación génica incluyen, por ejemplo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo con CDR transplantada, un Fv de cadena única, un diacuerpo (diacuerpos), un anticuerpo lineal y un anticuerpo poliespecífico formado por fragmentos de anticuerpos. Se conoce un método para obtener tales anticuerpos basándose en un anticuerpo monoclonal o una célula productora de anticuerpos que lo produce.

40 El anticuerpo monoclonal de la invención se puede obtener utilizando la proteína de fusión PLD4-Ig recombinante, o una célula transformada que expresa PLD4 humana como inmunógeno. Es decir, la presente invención se refiere a un método para preparar una célula que produce un anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PLD4, que contiene los procedimientos siguientes.

(1)

Procedimiento de administración de la proteína de fusión PLD4-Ig recombinante que codifica una secuencia de aminoácidos que contiene el dominio extracelular de PLD4 para inmunizar a un animal, y

(2)

procedimiento de selección de una célula productora de anticuerpos que produce un anticuerpo que se

une a PLD4 de células productoras de anticuerpos del animal inmunizado mediante la unión de dicho 50 anticuerpo de unión a PLD4 a una célula que expresa PLD4.

Las células productoras de anticuerpos obtenidas de este modo, o las células inmortalizadas de las células productoras de anticuerpos pueden cultivarse, y se puede recoger del cultivo un anticuerpo monoclonal deseado. Se conocen varios métodos comométodo para inmortalizar la célula productora de anticuerpos.

55 La célula transformada utilizada como inmunógeno en la invención se puede obtener, por ejemplo, preparando una célula en la que se conserva de manera expresable un polinucleótido extrínseco (a) que codifica la secuencia de aminoácidos que contiene el dominio extracelular de PLD4 descrito a continuación.

60 El polinucleótido extrínseco en la presente invención se refiere a un polinucleótido que se introduce artificialmente en una célula anfitriona. En caso de que se utilice una célula humana como célula, se introduce un gen humano en la célula humana. En dicha combinación, el polinucleótido introducido artificialmente también se conoce como el polinucleótido extrínseco. Por consiguiente, la expresión ectópica de PLD4 se engloba en la expresión de polinucleótido extrínseco.

El dominio extracelular de PLD4 en la invención se refiere a una secuencia de aminoácidos de las posiciones 54-506 que corresponde al dominio extracelular en la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO 1. Por ejemplo, son preferibles secuencias de aminoácidos que contienen cada una de las regiones en el orden siguiente desde el lado N-terminal como secuencia de aminoácidos que contiene el dominio extracelular de PLD4 en lainvención.

[Región intracelular + dominio transmembrana + dominio extracelular]

Alternativamente, también se incluye en la secuencia de aminoácidos que contiene el dominio extracelular de PLD4 en la presente invención una secuencia de aminoácidos que carece parcialmente de la región intracelular como se describe a continuación.

[Región intracelular parcial + dominio transmembrana + dominio extracelular]

Además, en la secuencia de aminoácidos que contiene el dominio extracelular de PLD4 en la presente invención se incluye una estructura que carece de la región intracelular como se describe a continuación.

[Dominio transmembrana + dominio extracelular]

Otras regiones que el dominio extracelular en la estructura mencionada anteriormente pueden ser una secuencia seleccionada entre la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO 1, o pueden ser una combinación con otra secuencia de aminoácidos homóloga. Por ejemplo, se puede utilizar una secuencia de aminoácidos que constituye una secuencia señal, un dominio transmembrana y una región intracelular como secuencia de aminoácidos de moléculas de la familia PLD distintas de PLD4. Alternativamente, también se puede combinar la secuencia de aminoácidos de la familia PLD de otras especies que no sean humanas. Además, la secuencia de aminoácidos que constituye otras regiones distintas del dominio extracelular puede contener mutación dentro de un rango en el que se pueden mantener cada una de las funciones de las regiones. Además, se pueden interponer otras regiones entre cada una de las regiones. Por ejemplo, entre la secuencia señal y el dominio extracelular, también se puede insertar una etiqueta epitópica tal como FLAG. Particularmente, la secuencia señal es una región que se somete a procesamiento en la etapa de transporte a la superficie de la membrana celular después de la traducción de la proteína, y se elimina. Por consiguiente, se puede utilizar una secuencia de aminoácidos arbitraria que induzca el paso de la proteína traducida a través de la membrana celular. Más específicamente, una secuencia de aminoácidos de PLD4 (SEQ ID NO 1) es preferible como secuencia de aminoácidos que contiene el dominio extracelular de PLD4.

Por consiguiente, el polinucleótido (a) mencionado anteriormente en la invención puede ser una secuencia de bases arbitraria que codifica la secuencia de aminoácidos que constituye la estructura mencionada anteriormente [región intracelular + dominio transmembrana + dominio extracelular]. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 1 está codificada por la secuencia de bases de ADNc descrita en SEQ ID NO 44.

La proteína de fusión PLD4-Ig recombinante como inmunógeno en la invención se puede obtener introduciendo un vector de expresión que retiene el polinucleótido mencionado anteriormente de una manera expresable, en una célula anfitriona apropiada. La secuencia de bases de ADNc de la proteína de fusión PLD4-Ig recombinante está representada por SEQ ID NO 125, y la secuencia de aminoácidos está representada por SEQ ID NO 126.

La célula anfitriona en la invención es preferiblemente una célula demamífero. Específicamente, una célula derivada de un ser humano, un mono, un ratón o una rata se puede utilizar como célula anfitriona. Particularmente, la célula derivada de seres humanos es preferible como célula anfitriona. Por ejemplo, la célula HEK-293T es una cepa de células renales derivadas de embriones humanos que se puede utilizar preferiblemente como la célula anfitriona en la invención. La célula HEK-293T está disponible como ATCC CRL-11268. Además de eso, se puede utilizar una célula derivada de un animal inmunizado como célula anfitriona. Si se utiliza una célula derivada de un animal inmunizado como inmunógeno, la respuesta inmunitaria contra la célula anfitriona es pequeña. Por lo tanto, se puede obtener de manera eficaz un anticuerpo contra el dominio extracelular de PLD4, que se expresa de forma extrínseca. Por consiguiente, por ejemplo, cuando se utiliza un ratón como el animal inmunizado, también se puede utilizar una célula derivada del ratón como célula anfitriona.

El polinucleótido mencionado anteriormente se puede cargar en un vector que puede inducir la expresión en una célula anfitriona para transformar la célula. Se puede utilizar un vector disponible comercialmente que puede inducir la expresión en una célula de mamífero. Por ejemplo, se puede utilizar un vector de expresión tal como pCMV-Script Vector, pSG5 Vector (fabricado por Stratagene), pcDNA3.1 (fabricado por Invitrogen) y el vector retroviral pMXs-IP (fabricado por Cell BioLabs) para la invención.

La célula transformada así obtenida se administra a un animal inmunizado, con un componente adicional como coadyuvante si fuera necesario. Como coadyuvante, por ejemplo, se puede utilizar el coadyuvante completo de Freund. En caso de que se utilice un ratón como animal inmunizado, se administra la proteína de fusión PLD4-Ig

recombinante purificada al ratón BALB/c. Como coadyuvante, se utilizaron coadyuvante completo e incompleto de Freund (fabricado por SIGMA), y se administraron en 200 µg/ratón la primera vez, y 50 µg/ratón la segunda vez hasta la cuarta vez. En general, un inmunógeno se administra múltiples veces a intervalos hasta que aumenta el título de anticuerpo. Por ejemplo, en caso de un método de inmunización a corto plazo, una célula transformada se administra en un intervalo de 2 a 4 días, más específicamente 3 días, y después de administrarla de 2 a 3 veces, se pueden recolectar células productoras de anticuerpos. Además, las células productoras de anticuerpos también se pueden recolectar después de administrarla 5 a 6 veces a un intervalo de una vez a la semanamás o menos.

Con el fin de obtener el anticuerpo monoclonal en la invención, la célula productora de anticuerpo recogida se clona. Para la clonación, la célula productora de anticuerpos se inmortaliza preferiblemente. Por ejemplo, se puede utilizar un método de fusión celular representado por un método de hibridoma, o transformación por el virus de Epstein-Barr (EBV) como método para inmortalizar la célula productora de anticuerpos.

Una célula productora de anticuerpos produce un tipo de anticuerpo por célula. Por consiguiente, si se puede establecer una población celular derivada de una célula (es decir, clonación), se puede obtener un anticuerpo monoclonal. El método de hibridoma se refiere a un método en el que una célula productora de anticuerpos se fusiona con una cepa celular apropiada, se inmortaliza y a continuación se clona. La célula productora de anticuerpos inmortalizada puede clonarse mediante un método tal como el método de dilución limitante. Se conocen muchas cepas celulares que son útiles en el método del hibridoma. Estas cepas celulares tienen una eficacia de inmortalización excelente de una célula basada en linfocitos y tienen varios marcadores genéticos que son necesarios para seleccionar las células que han tenido éxito en la fusión celular. Además, en un caso en el que se pretende la adquisición de la célula productora de anticuerpos, también se puede utilizar una cepa celular que carece de capacidad de producción de anticuerpos.

Por ejemplo, el mieloma de ratón P3x63Ag8.653 (ATCC CRL-1580) o P3x63Ag8U.1 (ATCC CRL-1597) se utiliza universalmente como cepa celular útil para un método de fusión celular de ratón o rata. Generalmente, un hibridoma se prepara por fusión de células homogéneas. Sin embargo, también se puede adquirir un anticuerpo monoclonal a partir de un heterohibridoma entre especies heterogéneas cercanas.

Se conoce un protocolo específico de la fusión celular. Es decir, una célula productora de anticuerpos de un animal inmunizado se mezcla con un compañero de fusión apropiado y se somete a fusión celular. Como célula productora de anticuerpos, por ejemplo, se puede utilizar una célula esplénica, una célula linfocítica recolectada del ganglio linfático o una célula B de sangre periférica. Como compañero de fusión, se pueden utilizar diversas cepas celulares descritas anteriormente. Para la fusión celular, se utiliza un método con polietilenglicol o un método de fusión eléctrica.

A continuación, las células que han tenido éxito en la fusión celular se seleccionan en función de un marcador de selección que posee la célula de fusión. Por ejemplo, en caso de que se utilice una cepa celular sensible a HAT en la fusión celular, las células que han tenido éxito en la fusión celular se seleccionan seleccionando las células que crecen en el medio HAT. Además, se confirma un anticuerpo producido por las células seleccionadas si tiene reactividad prevista.

Cada uno de los hibridomas se analiza en función de la reactividad del anticuerpo. Es decir, un hibridoma que produce un anticuerpo que se une a PLD4 se selecciona mediante el método descrito anteriormente. Preferiblemente, en caso de que el hibridoma seleccionado sea subclonado, y finalmente se confirma la producción del anticuerpo deseado, el hibridoma se selecciona como un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de la invención.

Específicamente, el hibridoma deseado puede seleccionarseen función dela reactividad con una célula humana o la reactividad con una célula transformada que expresa el gen PLD4. Un anticuerpo que se une a una célula puede detectarse basándose el principio de un inmunoensayo. Por ejemplo, se puede utilizar ELISA, en el que se utiliza una célula como antígeno, en la detección del anticuerpo deseado. Específicamente, un sobrenadante de cultivo del hibridoma se pone en contacto con un portador que inmoviliza la pDC humana, o una célula transformada utilizada como inmunógeno. En caso de que el sobrenadante del cultivo contenga el anticuerpo deseado, el anticuerpo es capturado por la célula inmovilizada en el portador. A continuación, la fase sólida se aísla del sobrenadante del cultivo, se lava si fuera necesario y a continuación se puede detectar el anticuerpo capturado en la fase sólida. En la detección del anticuerpo, se puede utilizar un anticuerpo que reconozca el anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo anti-ratón puede detectar un anticuerpo de ratón. Si el anticuerpo que reconoce un anticuerpo está en la marca, la detección del mismo es fácil. Como marca, por ejemplo, se puede utilizar una enzima, un pigmento fluorescente o un pigmento luminiscente.

Por otro lado, como portador que inmoviliza la célula, se puede utilizar una partícula o la pared interna de una placa de microtitulación. La superficie de una partícula o un recipiente de plástico, puede inmovilizar la célula por adsorción física. Por ejemplo, se pueden utilizar esferas o un recipiente de reacción de poliestireno como portador

para inmovilizar la célula.

Al seleccionar el hibridoma, puede haber un caso en el que la predicción no sea la producción de un anticuerpo contra PLD4, sino la producción de un anticuerpo contra una célula anfitriona de una célula transformada utilizada como inmunógeno. Por ejemplo, cuando se utiliza una célula humana como inmunógeno y se utiliza un ratón como un animal inmunizado como semuestra en los Ejemplos, la célula humana sereconoce como una sustancia extraña, y se pronostica que se produce un anticuerpo que se une a ella. En la invención, se desea la adquisición de un anticuerpo que reconozca PLD4. En consecuencia, no es necesaria la adquisición de un anticuerpo que reconozca otros antígenos de células humanas distintos de PLD4. Con el fin de excluir un hibridoma que produce tal anticuerpo mediante escrutinio, un anticuerpo no deseado puede ser absorbido preliminarmente antes de la confirmación de la reactividad del anticuerpo.

Los anticuerpos que no son deseados pueden ser absorbidos por un antígeno que se une a un anticuerpo que se pronostica que existe. Específicamente, por ejemplo, un anticuerpo contra otros antígenos celulares humanos que no sea PLD4 puede ser absorbido por una célula para la cual no se puede detectar la expresión de PLD4. En la invención, la célula anfitriona utilizada para el inmunógeno es preferible como antígeno para la absorción de anticuerpos no deseados.

Un anticuerpo monoclonal que se confirma que tiene actividad de unión a un antígeno, se confirma para la influencia práctica sobre la actividad de pDC, si fuera necesario. La influencia en pDC se puede confirmar, por ejemplo, mediante un método que se describe a continuación.

El anticuerpo monoclonal de la invención puede recogerse de un cultivo que se obtiene cultivando un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal. El hibridoma se puede cultivar in vitro o in vivo. En el cultivo in vitro, el hibridoma se puede cultivar utilizando un medio conocido tal como RPMI 1640. Las inmunoglobulinas secretadas por el hibridoma se acumulan en el sobrenadante del cultivo. Por consiguiente, el anticuerpomonoclonal de la invención se puede obtener recogiendo el sobrenadante del cultivo y purificándolo si fuera necesario. La purificación de la inmunoglobulina es fácil en un medio al que no se añade suero. Sin embargo, con el propósito de un rápido crecimiento del hibridoma y la promoción de la producción de anticuerpos, también se puede añadir al medio suero fetal bovino al 10%.

El hibridoma también se puede cultivar in vivo. Específicamente, el hibridoma se puede cultivar en la cavidad abdominal inoculando el hibridoma en la cavidad abdominal de un ratón carente de sistema inmunitario. El anticuerpo monoclonal se acumula en la ascitis. Por consiguiente, la ascitis se recolecta, y se purifica si fuera necesario, para obtener el anticuerpo monoclonal necesario. El anticuerpo monoclonal obtenido puede modificarse o procesarse adecuadamente dependiendo del propósito.

El anticuerpo monoclonal de la invención puede expresarse adquiriendo ADNc que codifica la región de unión a antígeno del anticuerpo del hibridoma, e insertándolo en un vector de expresión apropiado. Se conoce una tecnología para adquirir ADNc que codifica una región variable de un anticuerpo y lo expresa en una célula anfitriona apropiada. Además, se conoce un enfoque en el que una región variable que contiene una región de unión a antígeno se une a una región constante para proporcionar un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un gen de una región variable puede proporcionar un anticuerpo quimérico mediante la unión a genes que codifican una región constante de cadena pesada de IgG1 humana y una región constante de cadena ligera de Ig kappa humana, respectivamente. Además, se sabe que la actividad de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal se puede trasplantar a otra inmunoglobulina incorporando CDR que constituye una región variable a una región de marco de otra molécula de inmunoglobulina. Usando esto, se establece un método de transplante de la actividad de unión a antígeno poseída por una inmunoglobulina heterogénea a una inmunoglobulina humana. Por ejemplo, puede haber un caso en el que una secuencia parcial de aminoácidos de una región de marco que soporta CDR se trasplanta a una región variable humana desde una región variable de un anticuerpo de ratón. A continuación, estas regiones variables reconstituidas humanizadas de un anticuerpo humano pueden conectarse a una región constante de un anticuerpo humano, para obtener un anticuerpo humanizado.

Los ejemplos de anticuerpos monoclonales preferidos en la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas mp5B7, mp7B4, mp13D4 y mp13H11, que se han depositado bajo los Números de acceso: NITE BP-1211, NITE BP-1212, NITE BP-1213, y NITE BP-1214, respectivamente.

Como anticuerpo quimérico que contiene la región variable, o anticuerpo humanizado en el que se trasplanta la CDR que constituye la región variable, un anticuerpo quetiene una región constante derivada de IgG o IgM está contenido preferiblemente en el anticuerpo de la invención. En particular, el anticuerpo de la invención es más preferiblemente un anticuerpo que tiene una combinación de:

cadena pesada CDR1: DYNLH,

CDR2: YIYPYNGNTGYNQKFKR, CDR3: GGIYDDYYDYAIDY y

cadena ligera CDR1: RASENIYSHIA,

5 CDR2: GATNLAH, CDR3: QHFWGTP,

como secuencia de CDR que constituye la región variable del anticuerpo, un anticuerpo que tiene una combinación 10 de:

cadena pesada CDR1: SHYYWT,

CDR2: YISYDGSNNYNPSLKN, 15 CDR3: EGPLYYGNPYWYFDV y

cadena ligera CDR1: RASQDIDNYLN,

CDR2: YTSRLHS, 20 CDR3: QQFNTLP,

como secuencia de CDR que constituye laregión variable, oun anticuerpo que tiene una combinación de:

cadena pesada CDR1: SHYYWS,

25 CDR2: YISYDGSNNYNPSLKN, CDR3: EGPLYYGNPYWYFDV y

cadena ligera CDR1: RASQDIDNYLN,

30 CDR2: YTSRLHS, CDR3: QQFNTLP,

como secuencia de CDR que constituye laregión variable.

35 Los autores de la presente invención han confirmado que el anticuerpo monoclonal contra PLD4 tiene acción de CDC para una célula de expresión de PLD4. Por consiguiente, el anticuerpo que tiene una región constante derivada de IgG o IgM, tiene una acción de citotoxicidad para la célula de expresión de PLD4 mediante la acción de la CDC. Dicho anticuerpo es útil para suprimir el número de células de una célula de expresión de PLD4tal como pDC.

40 Se puede preparar un anticuerpo quimérico, o un anticuerpo humanizado que reconoce PLD4 mediante ingeniería genética utilizando un polinucleótido quelos codifica.

No se obtuvo un anticuerpo que pueda reconocer específicamente PLD4. Un anticuerpo que reconoce PLD4 se ha 45 proporcionado por primera vez por el inmunógeno de la descripción. Es decir, la invención proporciona un anticuerpo que reconoce PLD4, que se puede obtener mediante los procedimientos descritos a continuación.

(1) Procedimiento de administración de una proteína de fusión PLD4-Ig recombinante que codifica una secuencia de aminoácidos que contiene un dominio extracelular de PLD4, a un animal inmunizado

50 (2) procedimiento de selección de una célula productora de anticuerpos que produce un anticuerpo que se une a PLD4, a partir de células productoras de anticuerpos del animal inmunizado, y

(3) procedimiento de cultivo de la célula productora de anticuerpos seleccionada en el apartado (2) y recolección de un anticuerpo quereconoce PLD4 del cultivo.

55 Se ha revelado que PLD4 se expresa específicamente en pDC humanas. La expresión específica en pDC humanas también se confirmó mediante análisis de expresión génica con SAGE por los autores de la presente invención. Sin embargo, el nivel de expresión de PLD4 se analizó basándose en el ARNm en un informeanterior. Además, se sabe que la proteína PLD4 se expresa solo en el citoplasma. La invención ha revelado que PLD4 también se expresa en la superficie celular. Dado que no se proporcionó un anticuerpo que pueda detectar PLD4, el análisis para

60 determinar el estado de expresión de la proteína no se realizó de manera convencional. El anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PLD4 proporcionado por la invención ha realizado un análisis dela proteína PLD4.

Como confirmaron prácticamente los autores de la presente invención, el anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PLD4 basado en la invención detecta específicamente la pDC humana. Es decir, la

invención se refiere a un método ex vivo para detectar una célula dendrítica plasmocitoide humana, que contiene las etapas de poner en contacto con una célula de prueba el anticuerpo monoclonal de la invención, o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno, y detectar el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo que se une ala célula.

Mediante la detección de PLD4 basándose en la invención, se puede confirmar si alguna célula es pDC o no. Es decir, la invención proporciona un método para identificar pDC utilizando PLD4 como índice. Alternativamente, se puede aislar una célula para la cual se detecta PLD4 basándose en la invención, por medio de lo cual se aísla pDC humana. Es decir, la descripción proporciona un método para aislar pDC utilizando PLD4 comoíndice.

En la invención, un anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PLD4, o un fragmento que contiene una región de unión a antígeno del mismo pueden estar en la marca. Por ejemplo, el anticuerpo puede detectarse fácilmente marcándolo con un pigmento luminiscente o pigmento fluorescente. Más específicamente, el anticuerpo marcado con pigmento fluorescente se pone en contacto con una población celular que posiblemente contiene pDC, y se puede detectar una célula que se une al anticuerpo de la invención utilizando el pigmento fluorescente como índice. Además, si se aísla una célula detectada con el pigmento fluorescente, se puede aislar pDC. Se pueden implementar fácilmente una serie de etapas en el principio de FACS.

Alternativamente, el anticuerpo de la invención también puede estar unido a un portador en fase sólida tal como una partícula magnética. El anticuerpo que está unido al portador en fase sólida reconoce PLD4, y pDC se captura en el portador en fase sólida. Como resultado de ello, se puede detectar o aislar la pDC.

El anticuerpo que es necesario en el método de detección ex vivo de pDC basado en la invención puede suministrarse como un reactivo para la detección de pDC. Es decir, la invención proporciona el uso del anticuerpo monoclonal de la invención o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo como reactivo para la detección de pDC ex vivo. En el reactivo para la detección de pDC, se puede combinar un control positivo o un control negativo además del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden utilizar como control positivo una célula transformada que expresa el dominio extracelular de PLD4 utilizado como inmunógeno, o la pDC recolectada de un ser humano. Por lo general, solo se puede obtener poca pDC humana de la sangre periférica. Por consiguiente, una célula transformada es particularmente preferible como control positivo en el reactivo. Por otro lado, como control negativo, se puede utilizar una célula arbitraria que no expresa PLD4.

Es decir, la descripción proporciona un kit para la detección de pDC humana que contiene un anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PLD4, o un fragmento que contiene una región de unión a antígeno del mismo.

Además, los autores de la presente invención analizaron la influencia del anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PLD4 en pDC. Como resultado de ello, se confirmó que el anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PLD4 suprime la actividad de pDC. Es decir, la invención se refiere a un método para suprimir una actividad de una célula dendrítica plasmocitoide humana ex vivo, que comprende poner en contacto uno de los componentes siguientes con la célula:

(a)

el anticuerpomonoclonal de la invención, o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo, que se une a PLD4 y suprimela actividad pDC, y

(b)

una inmunoglobulina o un fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno en la que se trasplantanlas regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo monoclonal (a).

Alternativamente, la descripción se refiere a un método para suprimir la actividad de pDC en un organismo vivo, que contiene una etapa para administrar cualquiera de los componentes siguientes a un organismo vivo:

(a)

un anticuerpo monoclonal que se une a PLD4 y suprime la actividad de pDC, o un fragmento que contiene una región de unión a antígeno del mismo,

(b)

una inmunoglobulina en la que se trasplanta una región determinante de la complementariedad del anticuerpo monoclonal (a), o un fragmento que contiene una región de unión a antígeno del mismo, y

(c)

un polinucleótido que codifica el componente descrito en los apartados (a) o (b).

La pDC de la invención se refiere a una célula que tiene capacidad de producción de IFN y expresa PLD4 en la superficie de la célula. De aquí en adelante, a menos que se indique lo contrario, pDC no es solo una célula que es una célula precursora de una célula dendrítica, sino que contiene una célula que tiene capacidad de producción de IFN y expresa PLD4 en la superficie celular. Se conoce un método para identificar dicha pDC. Por ejemplo, pDC se puede distinguir de otras células sanguíneas utilizando varios marcadores de la superficie celular como índice. Específicamente, el perfil de un marcador de la superficie celular de pDC humana es el que se describe a continuación (Shortman, K. y Liu, YJ. Nature Reviews 2: 151-161, 2002). En los últimos años, también existe un informe que posicionó la célula positiva para BDCA-2 como pDC (Dzione k, A. et al. J. Immunol. 165: 6037-6046,

2000).

[Perfil del antígeno de superficie celular dela pDC humana]

Positivo para CD4 y positivo para CDI23,

Negativo para el linaje (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 y CD56), negativo para CD11c

Por consiguiente, una célula que tiene el perfil de expresión de estos marcadores conocidos y tiene capacidad de producción de IFN también puede denominarse pDC. Además, una célula que pertenece a una familia de células que tiene un perfil diferente del patrón de expresión del perfil de expresión de estos marcadores, pero que tiene capacidad de producción de IFN en un organismo vivo está incluida en las pDC.

Además, los ejemplos de características comunes exhibidas por la pDC humana incluyen las características que se describen a continuación.

Característicamorfológica de la célula.

 Similar a la célula de plasmática

 Celda redonda con superficie celular lisa.

 Núcleo relativamente grande

[Característicafuncional de la célula]

 Producción de una gran cantidad deIFN tipo I en poco tiempo en el momento dela infección por el virus

 Diferenciación a células dendríticas después de lainfección por el virus.

La supresión de la actividad de pDC en la invención se refiere a la supresión de al menos una de las funciones de pDC. Los ejemplos de las funciones de pDC incluyen la producción de IFN y la supervivencia celular. La supervivencia celular se puede referir como el número de célula en otras palabras. En consecuencia, la supresión de una o ambas funciones se denomina supresión de la actividad de pDC. Se ha revelado que el IFN tipo I producido por pDC es causa de varias enfermedades. Por consiguiente, la supresión del número de células pDC o la producción deIFN es útil como estrategia para tratar tales enfermedades.

Por ejemplo, se ha señalado la relación de las condiciones patológicas de una enfermedad autoinmunitaria con el IFNα. La mayor parte del IFNα es producido por pDC. Por consiguiente, si se suprime su producción, se pueden aliviar las condiciones patológicas causadas por el IFNα. Mientras tanto, en la invención, la supresión de la producción de IFN por pDC se refiere a la supresión de la producción de al menos un tipo de IFN producido por pDC. El IFN en lainvención es preferiblementeIFN tipo I. Entre ellos, es importante el IFNα.

Es decir, la invención se refiere a un supresor de la producción de IFN, que contiene el anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PLD4 como un componente activo. Alternativamente, la descripción proporciona un método para suprimir la producción de IFN, que contiene un procedimiento de administración de un anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PLD4. Además, la descripción se refiere al uso de un anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PLD4 en la preparación de una composición farmacéutica que suprimela producción deIFN.

Una célula que produce una gran cantidad de IFN en un pequeño número de células está incluida en las pDC. Por ejemplo, una célula precursora de una célula dendrítica que es recibida con estimulación por un virus o similar produce la mayoría de los IFN producidos por un organismo vivo. La supresión del número de células de pDC que produce una gran cantidad de IFN conduce a la supresión de la producción de IFN como resultado. En consecuencia, la supresión del número de células pDC también puede aliviar las condiciones patológicas causadas por el IFNα.

En un aspecto preferido de la invención, se confirmó que el anticuerpo monoclonal anti-PLD4 se une a una célula de expresión de PLD4 e imparte citotoxicidad mediante la acción de la Citotoxicidad Dependiente del Complemento (CDC). La acción de los CDC es uno de los mecanismos de acción importantes de un fármaco anticuerpo. El anticuerpo monoclonal anti-PLD4 de la invención también tiene una potente acción de citotoxicidad para una célula de expresión de PLD4 tal como pDC por la acción de la CDC. Es decir, se puede esperar que el anticuerpo monoclonal anti-PLD4 en un aspecto preferido, tenga efectos de la supresión de la producción de IFN no solo por un mecanismo de supresión de la producción deIFN, sino también por la citotoxicidad para pDC.

El anticuerpo que reconoce un dominio extracelular de PLD4 utilizado en la invención se puede obtener basándose en el método descrito anteriormente. El anticuerpo en la invención puede ser de cualquier clase. Además, una especie biológica de la que se deriva el anticuerpo no está limitada. Asimismo, se puede utilizar un fragmento que contiene una región de unión a antígeno del anticuerpo como el anticuerpo. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo

que contiene un sitio de unión a antígeno producido por digestión enzimática de IgG se puede utilizar como el anticuerpo en la invención. Específicamente, se puede obtener un fragmento de anticuerpo tal como Fab o F(ab')2 por digestión con papaína o pepsina. Es ampliamente conocido que estos fragmentos de anticuerpos se pueden utilizar como molécula de anticuerpo que tiene afinidad de unión por un antígeno. Alternativamente, también se puede utilizar un anticuerpo construido por recombinación de genes siempre quemantenga la actividad necesaria de unión al antígeno. Los ejemplos del anticuerpo construido por recombinación génica incluyen un anticuerpo quimérico, un anticuerpo con CDR trasplantada, un Fv de cadena única, un diacuerpo (diacuerpos), un anticuerpo lineal y un anticuerpo poliespecífico formado por un fragmento de anticuerpo. Se conoce un método para obtener estos anticuerpos basándoseen un anticuerpo monoclonal.

El anticuerpo en la invención puede ser modificado, si fuera necesario. De acuerdo con la invención, el anticuerpo que reconoce un dominio extracelular de PLD4 tiene una acción de supresión dela actividad de pDC. Es decir, se ha contemplado la posibilidad de que el propio anticuerpo tenga citotoxicidad para pDC. Se conoce una subclase del anticuerpo que exhibe una fuerte acción efectora. Alternativamente, los efectos de supresión de la actividad de pDC se pueden aumentar adicionalmente modificando el anticuerpo con un agente citotóxico. Los ejemplos del agente citotóxico incluyen los agentes descritos a continuación.

Toxinas: Endotoxina de Pseudomonas (PE), toxina diftérica y ricina

Isótopo radioactivo: Tc99m, Sr89, 1131 e Y90

Agente anticanceroso: caliqueamicina, mitomicina y paclitaxel

Las toxinas que contienen una proteína pueden unirse a, por ejemplo, un anticuerpo, o un fragmento del mismo mediante un reactivo bifuncional. Alternativamente, también se puede conjugar un gen que codifica las toxinas con un gen que codifica el anticuerpo, para proporcionar una proteína de fusión de los mismos. También se conoce un método para unir un isótopo radiactivo a un anticuerpo. Por ejemplo, se conoce un método para marcar un anticuerpo con un isótopo radioactivo utilizando un agente quelato. Además, se puede unir un agente anticanceroso a un anticuerpo utilizando, por ejemplo, una cadena de azúcar o un reactivo bifuncional.

En la invención, el anticuerpo de estructura modificada artificialmente también se puede utilizar como un componente activo. Por ejemplo, se conocen diversas modificaciones para mejorar la citotoxicidad o la estabilidad de un anticuerpo. Específicamente, se conoce una inmunoglobulina, en la cual semodifica la cadena de azúcar dela cadena pesada (Shinkawa, T. et al. J. Biol. Chem. 278: 3466-3473. 2003). La modificación de la cadena de azúcar aumentó la actividad de la inmunoglobulina mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) de la inmunoglobulina.

El anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PLD4 suprime la actividad de pDC cuando el anticuerpo se pone en contacto con la pDC. Por consiguiente, tal anticuerpo se puede utilizar como agente para suprimir la actividad de pDC, o en un método para suprimir pDC. Es decir, la descripción proporciona un agente para suprimir la actividad de pDC, que contiene al menos un tipo de componente seleccionado de un grupo que consiste en los apartados (a) y (b) descritos a continuación como componente activo. Alternativamente, la invención se relaciona con uno de los apartados (a) y (b) descritos a continuación para su uso en un método para suprimir la actividad de pDC humana en un ser humano vivo, que contiene una etapa de administrar al menos un tipo de componente seleccionado de un grupo que consiste en los apartados (a) y (b) descritos a continuación. Además, la descripción se refiere al uso de al menos un tipo de componente seleccionado de un grupo que consiste en los apartados (a) y

(b) descritos a continuación en la preparación de un agente para regular la actividad de pDC.

(a)

El anticuerpo monoclonal de lainvención, o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo, que se une a un dominio extracelular de PLD4.

(b)

Una inmunoglobulina o un fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno en la que se trasplantanlas regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo monoclonal (a).

Como anticuerpo monoclonal que suprime la actividad de pDC en la invención, se puede utilizar un anticuerpo monoclonal que reconoce un dominio extracelular de PLD4. Se pueden utilizar una clase o múltiples clases de anticuerpos monoclonales en la invención. Por ejemplo, se pueden combinarse y utilizar en la invención múltiples especies de los anticuerposmonoclonales quereconocen un dominio extracelular de PLD4.

El hecho de que el anticuerpo tenga una acción de supresión de la actividad de producción de IFN de pDC, se puede confirmar de la manera que se describe a continuación. La pDC produce una gran cantidad de IFN tras la estimulación viral. El anticuerpo se administra a pDC antes, después o al mismo tiempo de la estimulación viral, y la capacidad de producción de IFN se compara con un control en el que el anticuerpo no se administra a la pDC. La capacidad de producción de IFN puede evaluarsemidiendo el IFN-α o el IFN-β contenidos en el sobrenadante de un cultivo de pDC. Como resultado de la comparación, si la cantidad de IFN en el sobrenadante se reduce significativamente mediante la adición del anticuerpo, se puede confirmar que el anticuerpo probado tiene la acción de suprimir la capacidad de producción de IFN. Se conoce un método para medir estos IFN. La pDC es una célula

que produce la mayoría de IFN en un organismo vivo. En consecuencia, la supresión de la capacidad de producción de IFN de pDC puede regular el estado de producción deIFN en un organismo vivo.

La actividad de pDC en la invención abarca el mantenimiento del número de células pDC. Por consiguiente, la supresión de la actividad de pDC en la invención abarca la supresión del número de células de pDC. Si se confirma que el número de células pDC se suprime en presencia del anticuerpo, se descubre que el anticuerpo suprime la actividad de pDC. De manera similar a la producción de IFN, se puede utilizar una inmunoglobulina inactiva que se obtiene de la misma especie animal que la especie del anticuerpo que se confirmará para la actividad, como control para la comparación. El número de células pDC puede compararse cuantitativamente por recuento de células. El número de células se puede contar mediante FACS o con unmicroscopio.

Además, también se supone que la pDC se diferencia en una célula que induce Th2 llamada célula dendrítica 2 (DC2) como resultado dela infección, por ejemplo, de un virus. Si se suprimela producción deIFN por la pDC tras la estimulación por el virus, existe la posibilidad de que la diferenciación a Th2 también se pueda suprimir. Por consiguiente, también se puede esperar que el anticuerpo monoclonal de la invención que suprime la producción de IFN tenga efectos terapéuticos para diversas enfermedades alérgicas.

En un caso en el que el anticuerpo que reconoce un dominio extracelular de PLD4 se administra a un anfitrión que es diferente de la especie biológica de la que se obtiene el anticuerpo, es deseable procesar el anticuerpo en una forma que difícilmente es reconocida como una sustancia extraña por el anfitrión. Por ejemplo, la inmunoglobulina puede convertirse en difícilmente reconocida como una sustancia extraña al procesar la molécula como se describe a continuación. Se conoce un método para procesar una molécula de inmunoglobulina como se describe a continuación.

 Fragmento que contiene la región de unión a antígeno, de la cual se elimina la región constante

(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, tercera edición, Academic Press Limited. 1995; Antibody

Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)

 Anticuerpo quimérico constituido con una región de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal y una

región constante de inmunoglobulina del anfitrión (Gene Expression Experiment Manual, Kodansha Ltd.

1994 (editado por Isao ISHIDA and Tamie ANDO))

 Anticuerpo con CDR sustituida en el que la región determinante de la complementariedad (CDR) en una

inmunoglobulina del anfitrión es sustituida por la CDR de un anticuerpo monoclonal (Gene Expression

Experiment Manual, Kodansha Ltd. 1994(editado por Isao ISHIDA and Tamie ANDO))

Alternativamente, el gen de una región variable de inmunoglobulina humana también se puede adquirir por el método de presentación en fagos (McCafferty J et al., Nature 348:552-554, 1990; Kretzschmar T et. a1., Curr Opin Biotechnol. Diciembre 2002; 13(6): 598-602.). En el método de presentación en fagos, el gen que codifica la región variable de la inmunoglobulina humana se incorpora al gen del fago. Utilizando varios genes de inmunoglobulina como fuente, también se puede preparar una biblioteca de fagos. Un fago expresa la región variable como una proteína de fusión de la proteína que la constituye. La región variable expresada en la superficie del fago por el fago mantiene la actividad de unión al antígeno. Por consiguiente, la selección de un fago que se une a un antígeno o, por ejemplo, una célula en la que se expresa el antígeno, puede seleccionar un fago en el que se expresa una región variable que tiene una actividad de unión prevista desde una biblioteca de fagos. Además, una partícula del fago así seleccionado retiene un gen que codifica la región variable que tiene la actividad de unión prevista. Es decir, se puede adquirir un gen que codifica una región variable que tiene una actividad de unión prevista utilizando la actividad de unión dela región variable como índice en el método de presentación en fagos.

El anticuerpo que reconoce un dominio extracelular de PLD4, o un fragmento de anticuerpo que contiene al menos su región de unión a antígeno en el agente para suprimir la actividad de pDC, o el método de supresión de la actividad de pDC, se puede administrar como una proteína o un polinucleótido que codifica la proteína. Al administrar el polinucleótido, es deseable utilizar un vector en el que un polinucleótido que codifica la proteína deseada, se disponga bajo el control de un promotor apropiado para expresar la proteína deseada. En el vector, también se puede disponer un potenciador o un terminador. Se conoce un vector que retiene genes de una cadena pesada y una cadena ligera que constituyen unainmunoglobulina, y puede expresar lamolécula de inmunoglobulina. El vector que puede expresar una inmunoglobulina se puede administrar introduciéndolo en una célula. En la administración a un organismo vivo, un vector que puede infectar una célula al administrarse en un organismo vivo, se puede administrar tal cual. Alternativamente, también se puede introducir primero un vector en un linfocito aislado de un organismo vivo, y devolverse nuevamente al organismo vivo (ex vivo).

La cantidad de anticuerpo monoclonal que se administra a un organismo vivo en el agente para suprimir la actividad de pDC, o el método para suprimir la actividad de pDC, es generalmente de 0,5 mg a 100 mg, por ejemplo de 1 mg a 50 mg, preferiblemente de 2 mg a 10 mg por 1 kg de peso corporal como inmunoglobulina. El intervalo de administración del anticuerpo a un organismo vivo se puede regular adecuadamente de manera que se pueda mantener una concentración eficaz de la inmunoglobulina en el organismo durante el período de tratamiento.

Específicamente, la administración se puede realizar, por ejemplo, en un intervalo de 1 a 2 semanas. La vía de administración es arbitraria. Un experto en la técnica puede seleccionar adecuadamente una vía de administración eficaz en el tratamiento. Específicamente, los ejemplos de la vía de administración incluyen la administración oral o no oral. Por ejemplo, el anticuerpo se puede administrar sistémicamente o localmente mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal o inyección subcutánea. Los ejemplos de una formulación apropiada para administración no oral en la invención incluyen una inyección, un supositorio y un aerosol. Además, en caso de que se administre una inmunoglobulina a una célula, la inmunoglobulina se administra a un líquido de cultivo generalmente en 1 µg/mL, preferiblemente 10 µg/mL o más, más preferiblemente 50 µg/mL o más, y más preferiblemente 0,5 mg/mL o más.

En el agente para suprimir la actividad de pDC o el método para suprimir la actividad de pDC, el anticuerpo monoclonal se puede administrar mediante cualquier método a un organismo vivo. Normalmente, el anticuerpo monoclonal se mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Junto con el anticuerpo monoclonal, se pueden mezclar si fuera necesario aditivos tales como un agente espesante, un estabilizante, un conservante y un agente solubilizante. Los ejemplos de tales portadores o aditivos incluyen lactosa, ácido cítrico, ácido esteárico, estearato demagnesio, sacarosa, almidón, talco, gelatina, agar, aceite vegetal y etilenglicol. Los términos calificados como "farmacéuticamente aceptables" se refieren a aquellos aprobados por los supervisores gubernamentales de cada país, o los que figuran en una farmacopea de cada país o una farmacopea generalmente reconocida para su uso en un animal, un animal mamífero y particularmente un ser humano. El agente para suprimir la actividad de pDC también puede suministrarse en forma de comprimido o polvo liofilizado en una dosis única o dosis múltiples. El comprimido o polvo liofilizado se pueden combinar adicionalmente con agua esterilizada, solución salina fisiológica o una solución tampón para inyectables para disolver la composición a una concentración deseada antes de su administración.

Además, en caso de que se administre el agente para suprimir la actividad de pDC como un vector de expresión de inmunoglobulina, la cadena pesada y la cadena ligera se cotransfectan con un plásmido separado, y cada uno de los plásmidos se puede administrar de 0,1 a 10 mg, por ejemplo, de 1 a 5 mg por 1 kg de peso corporal. Además, se utiliza un vector de 1 a 5 µg/106 células para la introducción en una célula in vitro. De aquí en adelante, la invención se explicarámás específicamente en base a los Ejemplos.

Aunque la invención se describirá más específicamente con los Ejemplos siguientes, la invención no se limita a tales ejemplos en absoluto.

Ejemplos

Ejemplo 1

A. Análisis de la expresión de PLD4

A-1) Análisis utilizando biblioteca SAGE

Las expresiones génicas en pDC en reposo, monocitos humanos y pDC activadas tratadas con el virus del herpes inactivo (HSV-1) se compararon mediante el método SAGE™ (Serial Analysis of Gene Expression). El método de análisis es el que se describe a continuación.

A partir de sangre periférica humana, se aisló el monocito como una célula positiva para CD14 y se aisló la célula pDC humana como una célula positiva para BDCA-4 con el kit de aislamiento BDCA-4 + (Miltenyi Company Biotec) y el sistema MACS (Miltenyi Company Biotec). Además, la célula pDC humana se cultivó durante 12 horas en presencia de HSV-1 inactivo, para preparar la pDC activada (pDC+HSV). El ARN total se extrajo de cada una de las células y la biblioteca SAGE se preparó utilizando el kit I-SAGE™ (Invitrogen Company). Los datos obtenidos de aproximadamente 100.000 secuencias de bases etiquetadas se analizaron con el soporte lógico de análisis SAGE2000 (Invitrogen Company). Como resultado de esto, el valor de la puntuación de monocito/pDC/pDC+HSV fue genes 0/9/0, es decir, se encontró PLD4 (familia de la fosfolipasa D, miembro 4, C14orf175; Número de acceso de GenBank: NM_138790.2), que es un gen conocido como un gen que exhibe expresión específica de células pDC en reposo (Figura 1, Tao et al., Nat. Methods 2 (8), 591-598 (2005); Clark et al., Genome Res. 13(10), 2265-2270 (2003)). PLD4 es una secuencia de 506 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) codificada por una secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 44. La proteína PLD4 tiene dos regiones PDE inciertas (motivo fosfodiesterasa) constituidas con dos motivos HKD (His-x-Lys-xxxx-Asp secuencia de aminoácidos, las x son los otros aminoácidos conservados en la región C terminal, y un sitio de fosforilación incierta (Thr 472). La estructura de la proteína PLD4 se pronostica como proteína transmembrana monotrópica tipo II. Además, la proteína PLD4 no tiene la región PX (dominio de homología de Phox) y la región PH (dominio de homología de Pleckstrina) en la región N terminal, que son poseídas por PLD1 y PLD2 que son de la familia PLD clásica (FIG. 1 y 2).

A-2) Análisis de expresión del ARNm de PLD4 en diversas células humanas responsables de la inmunidad mediante

PCR cuantitativa en tiempo real

Se revisó específicamente la expresión del ARNm de PLD4 en una célula sanguínea. A partir de sangre periférica humana, cada una de las células se aisló y se recogió mediante un clasificador de células. A partir de cada una de las familias de células aisladas y recogidas, se extrajo el ARN y se sintetizó el ADNc. Utilizando el ADNc obtenido comomolde, se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real y se analizó el nivel de expresión del ARNm de PLD4.

Para la reacción de PCR cuantitativa en tiempo real, se realizó una PCR cuantitativa con ABI PRISM 7000 utilizando el kit Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG (Invitrogen Company). Se utilizó el Sequence Detection System Software (empresa Applied Biosystem) en el análisis de datos. Las condiciones de reacción de la PCR y la secuencia de bases delos cebadores utilizados son las siguientes.

Cebador directo para PLD4: 5' ATG GAC TGG CGG TCT CTG 3' (SEQ ID NO: 45) Cebador inverso para PLD4: 5' TGG AAG GTC TTC TCC AGG TC 3' (SEQ ID NO: 46) Cebador directo para GAPDH: 5' AGC CAC ATC GCT CAG ACA C 3' (SEQ ID NO: 47) Cebador inverso paraGAPBH: 5' GCC CAA TACGAC CAAATC C 3' (SEQ ID NO: 48) 1 Ciclo a 58°C durante 2minutos, 1 Ciclo a 95°C durante 10minutos, 50 ciclos de [95°C durante 15 segundos y 60°C durante 60 segundos], Se revisaron pDC, pDC (pDC+HSV) estimuladas con HSV, células B (células CD19+), células B activadas (células CD19+), células T (células CD3+) y células T activadas estimuladas con inomicina y PMA (Forbol 12miristato 13-acetato). Como resultado, seilustró quela expresión dePLD4 era específicamentealta en la pDC en la etapa de reposo y baja en la Célula B CDI9+ El otro ADNc de fracción de sangre humana utilizó Paneles de ADNc de Múltiples Tejidos BD™ MTC (Núm. de Cat. 636750, Takara Bio Company) (FIG. 5).

A-3) Análisis de expresión de ARNm de PLD4 en tejido humano mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Además, las expresiones en otros órganos o tejidos se revisaron mediante PCR cuantitativa utilizando ABI PRISM 7000 (Applied Biosystem Company). Como panel de ADNc, se utilizó Paneles de ADNc de Múltiples Tejidos BD™ MTC (Humana I; Núm de Cat. 636742, Inmune humano; Núm. de Cat. 636748; todos de Takara Bio Company). Las secuencias de bases de los cebadores utilizados se representan a continuación.

Cebador directo para PLD4: 5' ATG GAC TGG CGG TCT CTG 3' (SEQ ID NO: 49)

Cebador inverso para PLD4: 5' TGG AAG GTC TTC TCC AGG TC 3' (SEQ ID NO: 50)

Cebador directo para GAPDH: 5' AGC CAC ATC GCT CAG ACA C 3' (SEQ ID NO: 51)

Cebador inverso paraGAPDH: 5' GCC CAA TACGAC CAAATC C 3' (SEQ ID NO: 52)

La PCR cuantitativa se realizó con ABI PRISM 7000 con el kit Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG (empresa Invitrogen). Se utilizó el soporte lógico del sistema de detección de secuencia (Applied Biosystem Company) en el análisis. Las condiciones de reacción son las que se describen a continuación.

Etapa 1: 1 ciclo a 50°C durante 2minutos

Etapa 2: 1 ciclo a 95°C durante 10minutos

Etapa 3: 50 ciclos a 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 minuto

Las expresiones de los genes de PLD4 se compararon entre cada uno de los tejidos mediante la normalización con el nivel de expresión génica de GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa), que se sabe que se expresa homeostáticamente. Como resultado de ello, el ARNm de PLD4 exhibió una expresión relativamente alta en el bazo y en leucocitos de sangre periférica. Además, se reveló que el ARNm de PLD4 se expresaba ampliamente en otros tejidos. Sin embargo, el nivel de expresión del ARNm de PLD4 fue inferior a 100 veces el nivel de expresión de la célula pDC en reposo (Figura 6).

Preparación del vector de expresión de PLD4 humana

La preparación del vector de expresión del gen PLD4 se realizó con el fin de expresar una proteína PLD4 humana. A partir del clon de ADNc de PLD4 incorporado a un vector de clonación pCR4-TOPO (Open Biosystem, Núm. de Cat. MHS4771-99610856), únicamente el gen PLD4 se extrajo con la enzima EcoRI, y se incorporó a un vector de expresión pcDNA3.1 (vector PLD4-pcDNA3.1 humano). Utilizando el plásmido PLD4-pcDNA3.1 humano obtenido como molde, se amplificó el gen PLD4 con un cebador que contenía las secuencias de EcoRI, Not I y Kozak (GCC GCC ACC) (la información de los cebadores es la que se describe a continuación). El producto de la PCR se clonó en los sitios EcoRI y Not I con el vector de retrovirus pMX-IP (vector de retrovirus PLD4-pMX-IP humano). En la reacción de PCR, se utilizó 1 unidad de ADN polimerasa KOD Plus (TOYOBO Company), y las condiciones de reacción fueron 1 ciclo a 94°C durante 2 minutos, y a continuación 25 ciclos de [94°C durante 15 segundos y 68°C durante 1 minuto 30 segundos].

Cebador directo (SEQ ID NO: 53): 5' ttt GAA TTC gcc gcc acc ATG CTG AAG CCT 3' (polímero de 30 unidades) Cebador inverso (SEQ ID NO: 54): 5' aaa gcg gcc gcT CAG CCC TGC CAA ACG CAG TCC T 3' (polímero de 34 unidades)

Junto con el análisis de la secuencia, se transfectaron de forma transitoria células HEK (riñón embrionario humano)293T (en adelante, células 293T) con el vector de retrovirus PLD4-pMX-IP humano, y se confirmó si la PLD4 humana se expresaba en la superficie dela célula 293T con tinción celular, y a continuación con el método FACS.

Ejemplo 2

Revisión de la especificidad del anticuerpo anti-PLD4 humana

El hecho de que el anticuerpo monoclonal anti-PLD4 no se cruce con otras moléculas de la familia PLD, puede confirmarse empleando una célula en la que se expresa obligatoriamente cada una de las familias PLD. La PLD4 humana pertenece a la familia PLD, y existen múltiples moléculas que tienen una alta homología. La PLD4 humana ilustra aproximadamente 41% de la homología con PLD3 humana y aproximadamente 29,3% de la homología con PLD5 humana (Figura 4).

1) Preparación de vectores de expresión de PLD3 humana yPLD5 humana

Para la PLD3 humana (ADNc SEQ ID NO: 55, aminoácidos SEQ ID NO: 127) y PLD5 humana (ADNc SEQ ID NO 56, aminoácidos SEQ ID NO: 123), del clon de PLD3 humana (K.K.DNAFORM Company, Núm. de Cat. 5189261) incorporado al vector pCMV-SPORT6, y el clon PLD5 humana (KKDNAFORM Company, Núm. de Cat. 40025860) incorporado al vector pCR-Blunt II-TOPO, solo los genes PLD3 y PLD5 se amplificaron con PCR, y cada uno de los genes fue clonado en los sitios Hind III y EcoRI de pcDNA3.1 etiquetado con Flagg (Invitrogen Company), mediante el cual se prepara un vector de expresión (La información delos cebadores es la que se describe a continuación).

(Para PLD3 humana)

Cebador directo: huPLD3-IF (Hind III) Secuencia: 5' ttt AAG CTT gcc gcc acc ATG AAG CCT AAA CTG ATG TAC 3' (Polímero de 39 unidades) SEQ ID NO: 57) Cebador inverso: huPLD4-1518R (EcoRI) Secuencia: 5' ttt gaa ttc TCA ctt atc gtc gtc atc ctt gta atc GAG CAG GCG GCA GGC GTT GCC 3' (Polímero de 57 unidades) (SEQ ID NO: 58)

(Para PLD5 humana)

Cebador directo: huPLD5-IF (Hind III). Secuencia: 5' ttt AAG CTT gcc gcc acc ATG GGA GAG GAT GAG GAT GGA 3' (Polímero de 39 unidades) (SEQ ID NO: 59) Cebador inverso: huPLD5-1383R (EcoRI) Secuencia: 5' ttt gaa ttc TCA ctt atc gtc gtc atc ctt gta atc TAC GTT CCG GGG ATC CTT TCC 3' (Polímero de 57 unidades) (SEQ ID NO: 60)

Entre las secuencias de cebadores mencionadas anteriormente, las partes subrayadas representan secuencias de bases que codifican las etiquetas FLAG añadidas, y el tipo cursiva representa el sitio de corte Hind III o el sitio EcoRI de las enzimas de restricción.

Junto con el análisis de secuencia, las células 293T se transfectaron de forma transitoria con el vector PLD3-pcDNA3.1 humano o el vector PLD5-pcDNA3.1 humano, y si la PLD4 humana se expresó en la superficie de la célula 293T se confirmó con tinción celular, y a continuación mediante el método FACS.

Como resultado de ello, los anticuerpos no reaccionaron con una célula en la que parecía expresarse PLB3 humana

o PLD5 humana, lo que sugería que estos anticuerpos anti-PLD4 reconocían moléculas de PLD4 humana específicamente (Figura 8).

Preparación de la cepa estable de células de expresión de PLD4 humana

El vector PLD4-pMX-IP humano preparado se co-transfectó a células 293T junto con el vector pCL-Eco (IMGENEX, Núm. catálogo 10045P), que es un vector de empaquetamiento de retrovirus, mediante el cual se realiza la introducción del gen. El experimento de introducción de genes utilizó el Reactivo de Transfección FuGENE (marca registrada) HD (Roche) como reactivo de transfección. Después de 2 días, se recogió el sobrenadante del cultivo

celular, en el que se secretó el retrovirus que contenía el gen PLD4 humana, y se infectó con la cepa de células CT125 (serie de células de tumor de linfocitos de células T de ratón 2B4). Debido al hecho de que el vector de retrovirus pMX-IP contiene un gen resistente a la puromicina, el cultivo de células CT125 infectadas en presencia de puromicina permite la supervivencia únicamente células de que expresan PLD4 humana, lo que lleva a la selección de las mismas. Las células CT125 de expresión de PLD4 humana seleccionadas (en adelante, PLD4-CT125 humana) se seleccionaron adicionalmente para que únicamente las células CT125 permitieran una expresión más alta de PLD4 humana mediante clasificación de FACS y se cultivaron. Para la confirmación de la expresión de PLD4 humana, las células CT125 se tiñeron con anticuerpo policlonal de ratón anti-PLD4 humana asequible comercialmente (Abnova, Núm. de Cat.: HOO122618-B01P) ajustado a 5 µg/ml, y se realizó el análisis FACS. Como resultado de ello, se estableció la cepa estable de células PLD4-CT125 humana, y se utilizó en la selección mediante FACS del hibridoma.

Construcción de vectores de expresión de PLD4 de mono cinomolgo y rhesus, y preparación de la cepa estable de células de expresión de PLD4 humana

Para las expresiones de las proteínas PLD4 de mono cinomolgo y rhesus, se realizó la clonación del gen PLD4 de mono y la construcción de vectores de expresión. 1) Clonación del gen PLD4 de mono cinomolgo y PLD4 de mono rhesus

La secuencia de ADNc de PLD4 de mono rhesus es referida en la base de datos Genbank (XM_002805227.1) y similares, pero no se informa sobre un ADNc parcial, completo del mismo. Además, puesto que aún no se ha informado sobre la secuencia del gen PLD4 de mono cinomolgo, a partir de PBMC (10 mL respectivamente; SHIN NIPPON BIOMEDICAL LABORATORIES, LTD.) demono cinomolgo y mono rhesus, se realizó la clonación del gen.

El ARN total se extrajo de la sangre periférica del mono y, a partir de 5 µg del mismo, se sintetizó el ADNc utilizando el cebador oligo-dT y el sistema SuperScript Choice para el kit de síntesis de ADNc.

Utilizando el ADNc preparado como molde, el gen PLD4 del mono cinomolgo y el gen PLD4 del mono rhesus se amplificaron con el método de PCR utilizando los cebadores de las siguientes secuencias de bases.

Cebador directo (cynoPLD4-32F): 5' AGA TGC TGA AGC CTC TTC GGA GAG Cg 3' (SEQ ID NO: 61)

Cebador inverso (cynoPLD4-1554R): 5' TCAGCC CTG CCA AAC GCA GTC CTG G3' (SEQ ID NO: 62)

Amplificación de aproximadamente 1521 pares de bases de PLD4 de mono cinomolgo y se aislaron 1521 pares de bases de fragmento de ADNc de PLD4 de mono rhesus mediante electroforesis utilizando gel de agarosa al 1% y se recogieron y clonaron en un vector plasmídico pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen Company) utilizando el kit Zero Blunt TOPO PCR Cloning (Invitrogen Company). Se analizaron las secuencias de bases del gen obtenido, que están representadas por SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 124. Se confirmó que el gen PLD4 del mono cinomolgo y el gen PLD4 del mono rhesus fueron susceptibles de ser clonados.

La proteína PLD4 humana representa aproximadamente 94,4% de identidad con la secuencia de proteínas de PLD4 de mono cinomolgo (SEQ ID NO: 129), y aproximadamente 94% de identidad con la secuencia de proteínas de PLD4 de mono rhesus (SEQ ID NO: 130). La FIG. 14 ilustra la homología de las secuencias de proteínas de PLD4 humana con PLD4 de mono cinomolgo, PLD4 de mono rhesus y PLD4 de ratón (ADNc SEQ ID NO: 131, aminoácidos SEQ ID NO: 132).

2) Preparación de la cepa estable de células de expresión PLD4 demono cinomolgo

La cepa estable de células de expresión de PLD4 de mono cinomolgo se estableció cultivando células CT125 infectadas con un vector de retrovirus en presencia de puromicina, en el mismo método que el método de preparación de la cepa estable de células de expresión de PLD4 humana que utilizaba el vector PLD4-pMX-IP de mono cinomolgo preparado.

Para la confirmación de la expresión de PLD4 del mono cinomolgo, las células se tiñeron con el anticuerpo policlonal anti-PLD4 humana de ratón comercialmente disponible (Abnova, Núm. de Cat.: H00122618-B01P) que representan reactividad cruzada también con el análisis de PLD4 y de FACS. Como resultado de ello, se estableció la cepa estable de células PLD4-CT125 de mono cinomolgo, y se utilizó en la selección mediante FACS del hibridoma (Figura 16).

Preparación de la proteína de fusión PLD4-Ig humana

Para su uso como inmunógeno en la preparación de anticuerpo monoclonal anti-PLD4 humana, se amplificaron 2142 pb de un fragmento de ADN, en el que se fusionaron la región extracelular de la proteína PLD4 humana (56506 aa) y el fragmento Fc de IgG2a de ratón (234 aa que contienen una porción de la bisagra de la cadena pesada,

CH2 y CH3), con el método de PCR de 2 etapas, y se construyeron los plásmidos del vector de expresión de pDAD3.1 de PLD4-humana y pEE14.4 de PLD4-Ig humana (Las secuencias del ADNc y las proteínas se especifican en la lista de secuencias).

Para obtener una proteína del sobrenadante del cultivo, se transfectó transitoriamente el ADN Maxi-prep a células Freestyle 293F (en adelante, células 293F, Núm. de Cat. R790-07; Invitrogen). El día 7 después de la transfección, se recogió el líquido de cultivo de las células 293F cotransfectadas en un tubo de 50 mL y se realizó una centrifugación en condiciones de 2.070 g a 4°C durante 5 minutos. El sobrenadante se filtró con un filtro de jeringa con un tamaño de poro de 0,45 µm (Núm. de Cat. 431220; CORNING), y los sobrenadantes de cultivo se recogieron juntos.

El sobrenadante de cultivo celular recogido se purificó con una columna de afinidad de proteína A del sistema AKTA-FPLC, y se purificóla proteína dela proteína de fusión PLD4-Ig humana recombinante (Figura 7).

Ejemplo 3

A. Preparación de anticuerpomonoclonal anti-PLD4 humana

A-1) Inmunización

Como inmunógeno, se utilizó la proteína de fusión PLD4-Ig recombinantemencionada anteriormente. La proteína de fusión PLD4-Ig se administró por vía subcutánea al dorso de 3 ratones BALB/c. Como coadyuvante se utilizaron coadyuvante de Freund Completo e Incompleto (SIGMA), y se administraron 200 µg/ratón la primera vez y 50 µg/ratón de la segunda ala cuarta vez.

A-2) Confirmación del título de anti-suero.

La sangre se recogió después de la tercera inmunización y la cuarta inmunización, y el título de anti-PLD4-Ig en el suero se evaluó con ELISA.

La proteína de fusión PLD4-Ig se introdujo en fase sólida en una placa de microtitulación de 96 pocillos. El antisuero se diluyó escalonadamente 1:1.000 3 veces, y se prepararon series de diluciones hasta 1:729.000. Cada una de las muestras se añadió a la placa de fase sólida del antígeno en 50 µl y se realizó la reacción primaria. Después del lavado, la reacción secundaria se realizó con el anticuerpo anti-IgG de ratón (κ, λ) marcado con HRP, y se detectó el color (490 nm) conOPD (orto-fenilendiamina).

A-3) fusión celular

Se aislaron células esplénicas de un ratón para lo cual se reconoció un aumento del título anti-suero. La célula esplénica aislada y la célula de mieloma de ratón (P3U1) se fusionaron con el método de PEG, y la selección y el cultivo dela célula esplénica de fusión se realizaron a partir de medio HAT.

Escrutinio mediante FACS de hibridoma utilizando células CAL-1

Los anticuerpos que producen cada clon de la célula esplénica de fusión obtenida a partir del cultivo de selección HAT se evaluaron mediante FACS. Las células de la cepa CAL-1 de células similares a pDC humanas a 2 × 105 se hicieron reaccionar con 50 µl de sobrenadante de cultivo de cada uno de los hibridomas descritos a continuación durante 15 minutos a 4°C. Las células se lavaron con tampón FACS (FBS al 1% + PBS) dos veces, se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante. La reacción se realizó durante 20 minutos a 4°C utilizando un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con PE (BD Bioscience: 550589) como anticuerpo secundario. El líquido de cultivo después de 10 días desde el inicio del cultivo de selección con HAT se utilizó como multiplicidad de dilución original para el sobrenadante de cultivo de cada clon. Como resultado de ello, 3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 14C1 y 11G9.6 de los sobrenadantes de cultivo de hibridomas reaccionaron bien con las células CAL-1 (FIG. 11).

Escrutinio mediante FACS de hibridomas utilizando una cepa de células estable PLD4-CT125 humana

Los anticuerpos que producen cada clon de la célula esplénica de fusión obtenida del cultivo de selección HAT se evaluaron con FACS. Se hizo reaccionar PLD4-CT125 humana en 2 × 105 durante 15 minutos a 4°C con 50 µl de sobrenadante de cultivo de cada uno de los hibridomas descritos a continuación. Las células se lavaron con tampón FACS (FBS al 1% + PBS) dos veces, se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante. La reacción se realizó durante 20 minutos a 4°C utilizando un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con PE (BD Bioscience: 550589) como anticuerpo secundario. Como resultado de ello, 3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 14C1 y 11G9.6 de los sobrenadantes de cultivos de hibridomas reaccionaron bien con las células PLD4-CT125 humanas(FIG. 12).

A-5) Prueba de detección de FACS utilizando pDC de sangre periférica humana

[Aislamiento de PBMC humanas]

Se recogieron 20 mL de sangre periférica de un individuo sano y se aisló la célula mononuclear de sangre periférica (PBMC) con una centrífuga de gravedad específica utilizando HISTOPAQUE-1077 (SIGMA Company). Se tiñeron 1 × 106 PBMC para cada muestra. Las células se lavaron con tampón FACS y a continuación se les añadieron 25 µl de dilución 1:5 del reactivo de bloqueo de Fc (Militenyi Company) y se hicieron reaccionar a 4°C durante 15 minutos. Las células se lavaron con tampón FACS y a continuación se añadieron 50 µl del sobrenadante del cultivo celular de cada hibridoma e IgG2b de ratón, κ, y se hicieron reaccionar a 4°C durante 20 minutos. Las células se lavaron con tampón FACS y a continuación se les añadieron anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con PE y se hicieron reaccionar a 4°C durante 20 minutos. Las células se lavaron con tampón FACS y a continuación se les añadieron 50 µl de una dilución de 1:10 del anticuerpo anti-BDCA2 marcado con APC, y se hicieron reaccionar a 4°C durante 20 minutos. Las células se lavaron con tampón FACS y a continuación se resuspendieron en 300 µl de tampón FACS y se analizaron con FACS Calibur (BD). El anticuerpomp11G9.6 exhibióla unión a pDC (FIG. 10).

Además, 9 tipos de anticuerpos PLD4 de 3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11 y 14C1 mostraron una reacción de unión específica parala población de células pDC, que era una célula positiva para BDCA2 (FIG. 13).

A-6) Reactividad cruzada de anticuerpo anti-PLD4 para mono

Selección mediante FACS de hibridoma utilizando la cepa de células estables PLD4-CT125 de mono cinomolgo y la célula transfectante transitoria PLD4-293T demono rhesus

Los anticuerpos que producen cada clon de la célula esplénica de fusión obtenida del cultivo de selección HAT se evaluaron con FACS. Se hizo reaccionar PLD4-CT125 humana en 2 × 105 con 50 µl de sobrenadante de cultivo de cada uno de los hibridomas descritos a continuación durante 15 minutos a 4°C. Las células se lavaron con tampón FACS (FBS al 1% + PBS) dos veces, se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante. La reacción se realizó durante 20 minutos a 4°C utilizando un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con PE (BD Bioscience: 550589) como anticuerpo secundario. Como resultado de esto, 7 tipos de anticuerpos de 3B4, 5B7, 7B4, 13D4, 13H11, 14C1 y 11G9.6 entre 10 tipos de anticuerpos de PLD4 reaccionaron bien con las células PLD4-CT125 demono cinomolgo y las células PLD4-293T demonorhesus (FIG. 15, FIG. 16 y FIG 17).

A-7) Reactividad cruzada de anticuerpo anti-PLD4 para PBMC demono

Las PBMC de mono rhesus de sangre periférica (10 ml; SHIN NIPPON BIOMEDICAL LABORATORIES, LTD.) se centrifugaron con una gravedad específica utilizando Ficoll-Paque al 96% (marca registrada) PLUS (GE Healthcare Company, Núm. de Cat. 17-1440-02). Para la FACS, se utilizaron 5 × 105 células por muestra. Las células selavaron con tampón FACS y a continuación se les añadieron 10 µl de suero de mono cinomolgo al 10% diluido con tampón FACS y se hicieron reaccionar a 4°C durante 20 minutos. Las células se lavaron con tampón FACS y a continuación se les añadieron 100 µL del sobrenadante del cultivo celular de cada hibridoma y 10 µg/mL de IgG2a de ratón, κ o IgG1 de ratón, κ y se hicieron reaccionar a 4°C durante 15 minutos. Las células se lavaron con tampón FACS y a continuación se les añadieron 1 µg/mL de anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con APC y se hicieron reaccionar a 4°C durante 20 minutos. Las células se lavaron con tampón FACS y a continuación se hicieron reaccionar con 25 µl de dilución 1:10 de anticuerpo anti-Linaje 1 marcado con FITC, anticuerpo anti-CD123 marcado con PE y anticuerpo anti-HLA-DR marcado con PcrCP-Cy5.5 a 4°C durante 15 minutos. Las células se lavaron con tampón FACS y a continuación se resuspendieron en 300 µl de tampón FACS y se analizaron con FACS calibur. El sobrenadante de cultivo de hibridoma utilizado fue específico para PLD4, y se seleccionaron 10 tipos de 3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 14C1 y 11G9.6, que se unieron bien a las células CAL-1 o pDC humanas. Como resultado de ello, 5 tipos de sobrenadantes de cultivos celulares de hibridoma, es decir, 5B7, 7B4, 13D4, 13H11 y 14C1 se unieron específicamente a la población de células pDC demonos cinomolgos (Linaje-CD123+ HLA-DR+) (FIG. 18).

A-8) Clonación del hibridoma por el método de dilución limitante

1) Clonación y 2° escrutinio mediante el método de dilución limitante.

Para la clonación de 9 tipos seleccionados (3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11 y 14C1) de hibridomas, excepto el hibridoma 11G9.6, se realizó una dilución limitante. La dilución limitante se sembró en 2 piezas de placa de 96 pocillos. Después de 6 días desde la siembra, se observaron las células al microscopio y se recogieron los sobrenadantes de cultivo que se obtuvieron de monoclones ymostraron un buen crecimiento en todos los pocillos. Se realizó un análisismediante FACS del sobrenadante de cultivo recogido comomuestra.

En el análisis FACS, el antígeno de superficie de la cepa celular CAL-1 se tiñó utilizando el sobrenadante de cultivo de cada clon, seguido de un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con PE (BD Bioscience: 550589) como anticuerpo

secundario. Como sobrenadante de cultivo de cada clon, se utilizó el líquido de cultivo después de 7 días desde la siembra dela diluciónlimitante comomultiplicidad de dilución original.

2) Clonación y tercer escrutinio.

Basándose en los resultados del análisis FACS del segundo escrutinio y el estado celular en cada pocillo, se seleccionó 1 pocillo de cada clon y se realizó nuevamente una dilución limitante. La dilución limitante se realizó de manera similar a la mostrada en el apartado 2), y se realizó un análisis FACS (3º) para el sobrenadante de cultivo recogido como muestra. Basándose en los datos del análisis FACS y similares, se clonaron los 9 siguientes tipos (3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11 y 14C1) de los clones mediante el método de dilución limitante y se estableció el hibridoma de producción de anticuerpo anti-PLD4 humana como una cepa celular estable.

3) Conversión en un solo hibridoma 11G9.6

El hibridoma 11G9.6 distinto de los 9 tipos mencionados anteriormente se recogió y se suspendió con un tampón de clasificación (FBS al 1%/PBS) para que tuviera 1 × 105 células/mL. La clasificación de células individuales se realizó utilizando FACS Aria (BD). Se incorporaron los datos y los datos incorporados se desarrollaron para un diagrama de puntos bidimensional del eje X: FSC y eje Y: SSC. En el diagrama de puntos, las células vivas estaban rodeadas por ventana citométrica. La ventana citométrica se cubrió para excluir el doblete de las células en la ventana citométrica de células vivas, la población celular se aisló y se recogió en una placa plana de 96 pocillos para que tuviera 1 célula/pocillo. Las células después de la clasificación de células individuales se cultivaron en medio HAT (RPMI 1640+ 2 mM L-glutamina, 10 unidades/mL de penicilina-estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, 2-ME 50 µM) + suplemento de crecimiento de hibridoma HFCS (Empresa Company). A continuación, se tiñeron las células CAL-1, la cepa celular estable de expresión PLD4-CT125 humana, las PBMC humanas y la cepa celular estable de expresión PLD4-CT125 de mono utilizando el sobrenadante de cultivo de células del hibridoma, y se seleccionó 11G9.6 de hibridoma único.

4) Preparación de vial de células congeladas y recolección del sobrenadante de cultivo.

Basándose en los resultados del análisis FACS descritos anteriormente y el estado de la célula de cada pocillo, se seleccionó 1 pocillo de cada clon. Para el pocillo seleccionado, se realizó el cultivo de expansión a una escala de 50 ml. El medio era RPMI 1640 que contenía FCS al 10% y penicilina-estreptomicina. Las células se cultivaron hasta la subconfluencia, y se congelaron y conservaron a un número de células de 1 x 106 células/tubo. Como líquido de congelación y conservación, se utilizó BAMBANKER (NIPPON Genetics, Co. Ltd.). Además, se recogió y conservó el sobrenadante de cultivo en estemomento.

Ejemplo 4

Purificación De Anticuerpos

Se obtuvieron 10 tipos (3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 14C1 y 11G9.6) de anticuerpos purificados a partir de los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas mediante purificación utilizando la columna de afinidad de proteína A (rProtein A) Sepharose Fast Flow (Núm. de catálogo 17-1279-01, GE Healthcare Company). Los isotipos se confirmaron utilizando Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit (Thermo Fisher Scientific Company). Como resultado de ello, 3B4 y 14C1 fueron IgG1, κ, de ratón 10C3 fue IgG2a, κ de ratón y los otros fueron IgG2b, κ de ratón. La medición de la concentración de endotoxinas se realizó ya que si la endotoxina estuviera contenida en el anticuerpo purificado, podría influir en los resultados de una prueba de determinación de propiedades. Los kits utilizados fueron el grupo Endospecy ES-50M, el grupo Toxicolor DIA-MP y el grupo CSE-L patrón de endotoxina (SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION Company). Como resultado de ello, la concentración de endotoxinas de cualquier anticuerpo purificado fue de 0,3 UE/mg o menos de Ab, que era el valor de referencia.

Revisión de lareactividad del anticuerpo purificado.

La capacidad de unión del anticuerpo purificado se confirmó con células CAL-1 que son cepas de células similares a pDC humanas. Como resultado, se pudo confirmar que cualquier anticuerpo mantenía la capacidad de unión a PLD4 humana en la superficie celular (FIG. 11). Además, el anticuerpo también se unió específicamente a la población de células pDC (BDCA2+) dela sangre periférica humana (FIG. 13).

Cálculo del valor Kd del anticuerpo contra PLD4 purificado

Para determinar la capacidad de unión del anticuerpo purificado, la cepa celular estable de expresión de PLD4-CT125 humana se hizo reaccionar a casi 100% de la tasa de tinción positiva de baja concentración a alta concentración (0,001 µg/mL a 30 µg/mL) de concentración de anticuerpo contra PLD4 purificada. La frecuencia de

tinción de células positivas y de anticuerpos se sometió a análisis de datos utilizando el soporte lógico Graph Pad Prism versión 5, y la concentración molar de la constante de disociación (valor Kd) se calculó en una unidad nM. Debido al hecho de que los valores de Kd (nM) delos anticuerpos anti-PLD4 fueron todos 1 nM o menos o 1 nM casi excepto los 2 clones de 3B4 y 14C1, los anticuerpos anti-PLD4 se unieron muy fuertemente a la célula PLD4-CT125 humana ( Figura 19).

Ejemplo 5

Actividad de citotoxicidad dependiente del complemento del anticuerpo anti-PLD4 para células de expresión de PLD4-CT125 humanas

La actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (de aquí en adelante, denominada actividad CDC) del anticuerpo anti-PLD4 se midió para la cepa de células CT125 que expresa PLD4 humana (en adelante, denominada HuPLD4-CT-125) utilizando suero de conejo inmaduro como fuente de complemento. El índice de la actividad fue la toxicidad celular calculada a partir del valor medido de la Lactasa deshidrogenasa (LDH) liberada desde la célula. Cada célula se dispensó a una placa con fondo en forma de U de 96 pocillos en 2 x 104 células/50 µL/pocillo. Se preparó complemento de cría de conejo al 1% (CEDARLANE Company) en medio CDC (RPMI 1640 + BSA al 0,1%

+ HEPES 10 mM + L-glutamina 2 mM + Pen-Strep al 1%). A las células se les añadieron 10 µg/mL de anticuerpo de control de isotipo de ratón (IgG2b, κ de ratón) y 10 tipos de anticuerpos purificados de ratón anti-PLD4 (3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 14C1, y 11G9.6), y se dejaron reaccionando durante 1 hora. Para el sistema de ensayo, se utilizó el kit de ensayo de citotoxicidad no radioactiva CytoTox 96 (Promega Company). Como resultado de ello, para la célula diana de HuPLD4-CT-125, 8 tipos de los anticuerpos contra PLD4 (5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11 y 11G9.6) mostraron una actividad de CDC de aproximadamente 33,5% a 71,1% a 10 µg/mL de concentración de anticuerpo, excepto 2 tipos de anticuerpos contra PLD4, 3B4 y 14C, de los cuales el isotipo dela cadena pesada era IgG1 deratón (FIG. 20).

Ejemplo 6

La actividad citotóxica dependiente de la concentración, dependiente del complemento del anticuerpo de control de isotipo de ratón (IgG2b κ, de ratón) del anticuerpo anti-PLD4 (11G9.6), el anticuerpo de ratón anti-PLD4 (mp11G9.6 Ab), anticuerpo de control de isotipo humano (IgG1, κ humana), y el anticuerpo quimérico anti-PLD4 (ch11G9 Ab) se ajustaron a un total de 6 puntos de la concentración de anticuerpo de 0,1 µg/mL a 30 µg/mL. Como sistema de ensayo, se utilizó el kit del ensayo de citotoxicidad no radioactiva CytoTox 96 (Promega Company). Como resultado de esto, para la célula diana de HuPLD4-CT-125, mp11G9.6Ab exhibió aproximadamente 70% de actividad CDC dependiente de la concentración, a 3 µg/mL de concentración de anticuerpo. Por otro lado, ch11G9Ab, que era un anticuerpo quimérico, mostró 10% o menos de la actividad de los CDC incluso a 30 µg/mL de concentración máxima (FIG. 21).

Ejemplo 7

Preparación de anticuerpos quiméricos.

Se prepararon 10 clases en forma de un hibridoma que produce un anticuerpo anti-PLD4 deratón y se utilizaron.

1.

Confirmación deisotipo dela región constante.

Se confirmó el isotipo de la región constante del anticuerpo anti-PLD4 de ratón producido a partir del hibridoma que produce el anticuerpo anti-PLD4. A partir del cultivo de sobrenadantes de los hibridomas de 10 tipos (3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 14C1 y 11G9.6), se confirmó el isotipo utilizando Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit (Thermo Fisher Empresa científica). Como resultado de ello, 3B4 y 14C1 fueron IgG1 de ratón e Ig kappa de ratón, 10C3fue IgG2a de ratón e Ig kappa deratón, ylos otros sonIgG2b de ratón eIg kappa de ratón.

2.

Clonación del ADNc que codificala región variable del anticuerpo anti-PLD4 de ratón

2-1) Aislamiento de ARN total

A partir del hibridoma 11G9.6, se aisló el ARN total utilizando un kit disponible comercialmente, "RNeasy Mini Kit" (Qiagen Company, Núm. de Cat.: 74106) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al kit. Se preparó a partir de 5 × 106 células de la cepa de células del hibridoma y aproximadamente 79 µg de ARN total.

2-2) Amplificación y fragmentación de ADNc que codifica la región variable de cadena pesada del ratón

Se utilizaron 5 µg del ARN total aislado en el apartado 2-1), y el ADNc que codifica la región variable de cadena pesada del ratón se amplificó mediante el método de PCR 5' RACE. En la amplificación, se utilizó un kit disponible

comercialmente, "5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA ENDs, Version 2.0 Kit" (Invitrogen Company, Núm. de Cat.: 18374-058). Los detalles son los siguientes. Primero, se sintetizó ADNc monocatenario mediante la enzima de transcripción inversa a partir del ARN total obtenido en 2-1). En este momento, el cebador antisentido (GSP1) se utilizó de la siguiente manera. Los cebadores GSP1 utilizados en la amplificación del ADNc se utilizaron demanera diferente dependiendo del isotipo de cada cadena pesada deratón.

Por ejemplo, en la clonación de las regiones variables de la cadena pesada de los hibridomas 3B4 y 14C1 que tienen cadenas pesadas deIgG1 deratón, se utilizan los siguientes cebadores antisentido.

Cebador GSP1: mu IgG1VH-GSP1 Secuencia: 5'-CCA GGA GAG TGG GAG AGG CTC TTC TCA GTA TGG TGG-3' (Polímero de 36 unidades) (SEQ ID NO: 64) Cebador GSP2: mu IgG1VH-GSP2 Secuencia: 5'-GGC TCA GGG AAA TAG CCC TTG ACC AGG CAT CC-3' (Polímero de 32 unidades) (SEQ ID NO: 65)

En la clonación delas regiones variables de cadena pesada de hibridoma 10C3 que tienen cadena pesada de IgG2a de ratón, se utilizan los siguientes cebadores antisentido.

Cebador GSP1: mu IgGHγ1-GSP1

Secuencia: 5' TCC AGA GTT CCA GGT CAC TGT CAC 3' (Polímero de 24 unidades) (SEQ ID NO: 66)

Cebador GSP2: mu IgGHγ1-GSP2

Secuencia: 5' AGG GGC CAG TGG ATA GAC AGA TGG 3' (Polímero de 24 unidades) (SEQ ID NO: 67)

En la clonación de las regiones variables de la cadena pesada de 5B7, 7B4, 8C11, 11D10, 13D4, 13H11 y 11G9.6 que tienen cadenas pesadas deIgG2b de ratón, se utilizan los siguientes cebadores antisentido.

Cebador GSP1: mu IgGHγ2B-GSP1

Secuencia: 5' TCC AGA GTT CCA AGT CAC AGT CAC 3' (Polímero de 24 unidades) (SEQ ID NO: 68)

Cebador GSP2: mu IgGHy2B-GSP2

Secuencia: 5' AGG GGC CAG TGG ATA GAC TGA TGG 3' (Polímero de 24 unidades) (SEQ ID NO: 69)

Además, al extremo 3' del ADNc de hebra sencilla, se le añadió dC, que es un homopolímero nucleotídico, utilizando desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT). A continuación, se amplificó el ADNc por el método de PCR utilizando un cebador de anclaje que tiene un polímero nucleotídico complementario a dC (secuencia de anclaje) (SEQ ID NO: 70) en el extremo 3', y un cebador antisentido (GSP2). Además, el ADNc se amplificó mediante el método de PCR Anidada utilizando el producto de PCR obtenido como molde y utilizando el cebador AUAP (SEQ ID NO: 71) y el cebador antisentido que se muestra en la Tabla 1 (GSP2). Además, este producto de PCR se purificó mediante un método de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5%.

Cebador ancla para 5' RACE (SEQ ID NO: 70) 5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3' Polímero de 36 unidades) cebador AUAP para RACE 5' (SEQ ID NO: 71) 5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3' Polímero de 20 unidades)

2-3) Amplificación y fragmentación de ADNc que codifica la región variable de cadena ligera del ratón

El ADNc que codifica la región variable de cadena ligera del ratón se amplificó a partir del ARN total del apartado 21) aislado, de manera similar al apartado 2-2). En este momento, los cebadores GSP1 utilizados en la amplificación del ADNc se utilizaron demanera diferente dependiendo del isotipo de cada cadena ligera deratón.

Los siguientes cebadores antisentido se utilizan para la clonación de cadenas ligeras, ya que los 10 tipos de anticuerpos PLD4 tienen cadenas ligeras kappa deIg de ratón.

Cebador GSP1: mu IgG VL kappa-GSPl Secuencia: 5'-CAC TAC TTC CTG TTG AAG CTC TTG ACG ATG G-3' (Polímero de 31 unidades) (SEQ ID NO: 72) Cebador GSP2: mu IgG VL kappa-GSP2 Secuencia: 5'-GTG AGT GGC CTC ACA GGT ATA GC-3' (Polímero de 23 unidades) (SEQ ID NO: 73)

El producto de PCR obtenido se purificómediante unmétodo de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5%.

2-4) Confirmación de la secuencia de bases de ADNc y determinación de la región CDR

Los fragmentos de ADNc de la región variable de cadena pesada obtenidos en el apartado 2-2), y la región variable de cadena ligera obtenida en el apartado 2-3) se clonaron, respectivamente, con el vector pCR4Blunt-TOPO utilizando un kit disponible comercialmente "Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit". (Invitrogen Company, Núm. de Cat.: 1325137), de acuerdo con las instrucciones adjuntas al kit, y se transformaron en una célula competente de Escherichia coli para obtener un transformante de Escherichia coli. Se obtuvo un plásmido a partir de este transformante, y la muestra de ADN plasmídico se envió para el análisis de secuencia a Operon Biotechnology Co. Ltd Company (Tokio), y se confirmó la secuencia de bases de ADNc en el plásmido. En el análisis de la secuencia, se utilizaron los programas de soporte lógico "Sequencher DNA sequence assembly and analysis software versión

4.2.2 (Gene Codes Corporation)" y soporte lógico "GENETYX-MAC Versión. 11.1.1" (GENETYX CORPORATION)".

Se extrajo un transcrito de una secuencia correcta excluyendo un transcrito de ARN inactivo, ya que se producen cambio de marco, mutación sin sentido y similares en la periferia de una región determinante de la complementariedad (de aquí en adelante, "región CDR"). Además, para la secuencia de bases de ADNc contenida en el plásmido, se confirmó la homología con la base de datos de inmunoglobulinas (IgBLAST, URL: www.ncbi.nlm.nih.gov/Igblast/), y las secuencias de la región CDR en cada región variable (CDR; CDR1, CDR2 y CDR3), la región FW (Regiones de trabajo marco) y las regiones variables se determinaron de acuerdo con el método de análisis del sistema de numeración de Kabat (Kabat et al, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication Núm. 91-3242, 5ª ed., United States Department of Health and Human Services, Bethesda, MD).

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6 de ratón obtenido es SEQ ID NO: 74, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 75. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6 de ratón son SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 3B4 de ratón obtenido es SEQ ID NO: 76, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 77. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 3B4 de ratón son SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5B7 de ratón obtenido es SEQ ID NO: 78, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 79. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5B7 de ratón son SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4 de ratón obtenido es SEQ ID NO: 80, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 81. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4 de ratón son SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. El anticuerpo 7B4 es un anticuerpo que tiene las mismas secuencias CDR de la región variable de cadena pesada y de cadena ligera quelasdel anticuerpo 5B7.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 8C11 de ratón obtenido es SEQ ID NO: 82, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 83. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la variable de cadena pesada la región del anticuerpo 8C11 del ratón son SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 10C3 de ratón obtenido es SEQ ID NO: 84, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 85. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 10C3 de ratón son SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11D10 de ratón obtenido es SEQ ID NO: 86, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 87. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11D10 de ratón son SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, respectivamente. El anticuerpo 11D10 es un anticuerpo que tiene la misma secuencia CDR de la región variable de cadena ligera que la cadena pesada del anticuerpo 10C3. Sin embargo, el isotipo de la cadena pesada (10C3 es la región constante de IgG2a de ratón, y 11D10 es la región constante de IgG2b de ratón) es diferente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13D4 de ratón obtenido es SEQ ID NO: 88, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 89. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13D4 de ratón son SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H11 de ratón obtenido es SEQ ID NO: 90, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 91. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H11 de ratón son SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14C1 de ratón obtenido es SEQ ID NO: 92, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 93. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14C1 de ratón son SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40, respectivamente. El anticuerpo 14C1 es un anticuerpo que tiene las mismas secuencias CDR de las regiones variables de cadena pesada y ligera que las del anticuerpo 13H11. Sin embargo, el isotipo de la cadena pesada (13H11 es la región constante de IgG2b de Ratón, y 14C1 es la región constante de IgG1 de ratón) es diferente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11G9.6 del ratón es SEQ ID NO: 94, y la secuencia deaminoácidos es SEQ ID NO: 95. Las secuencias deaminoácidos deCDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11G9.6 de ratón son SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 3B4 de ratón es SEQ ID NO: 96, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 97. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 3B4 de ratón son SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5B7 de ratón es SEQ ID NO: 98, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 99. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5B7 de ratón son SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 7B4 de ratón es SEQ ID NO: 100, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 101. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 7B4 de ratón son SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 8C11 del ratón es SEQ ID NO: 102, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 103. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 8C11 del ratón son SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 10C3 de ratón es SEQ ID NO: 104, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 105. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 10C3 de ratón son SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11D10 de ratón es SEQ ID NO: 106, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 107. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11D10 de ratón son SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13D4 de ratón es SEQ ID NO: 108, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 109. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13D4 de ratón son SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13H11 de ratón es SEQ ID NO: 100, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 111. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13H11 de ratón son SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14C1 de ratón es SEQ ID NO: 112, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 113. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14C1 de ratón son SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43, respectivamente.

3. Preparación del vector de expresión del anticuerpo quimérico 11G9.6

3-1. Clonación de ADNc que codificala región constante de Ig humana

A partir del ARN total de las PBMC humanas, se clonaron los ADNc de la región constante de cadena pesada de IgG1 humana y la región constante de la cadena ligera kappa de IgG humana, y se clonaron con el vector

5 pCR4Blunt-TOPO, respectivamente, utilizando un kit disponible comercialmente "Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit" (fabricado por Invitrogen Company, Núm. de Cat.: 1325137) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al kit, y se transformaron en una célula competente de Escherichia coli para obtener un transformante de Escherichia coli. Se obtuvo un plásmido a partir de este transformante, y la muestra de ADN plasmídico se envió para el análisis de la secuencia a Operon Biotechnology Co. Ltd (Tokio), y se confirmóla secuencia dela base de ADNc en el plásmido.

10 3-2. Preparación de ADNc que codifica la cadena pesada del anticuerpo contra PLD4 quimérico

El ADNc que codifica la cadena pesada de un anticuerpo contra PLD4 quimérico se preparó mediante ligación con el vector de expresión del vector pEE6.4 que tiene la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6 de ratón

15 obtenido en el apartado 2-2, y la región constante de cadena pesada de IgG1 humana. La región variable de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6 de ratón se amplificó con el método de PCR y se obtuvo un producto de PCR de aproximadamente 450 bases de longitud. En este momento, el cebador es el que se muestra en la Tabla 1. El producto de PCR obtenido se purificó mediante unmétodo de agarosa de bajo punto defusión al 1,5%.

20 [Tabla 1]

Tabla 1 5

Nombre de cebador Secuencia

Cebador de expresión de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6 quimérico

1)

chi11G9VH-IF (Hind3) (93-mero)

2)

chi11G9VH-444R (ApaI) (42-mero)

Cebador de expresión de cadena ligera del anticuerpo 11G9.6 quimérico

5)

chi11G9VL-IF (Hind) (39-mero)

6)

chi11G9VL-408R (33-mero)

7)

chi11G9VL-385F (33-mero)

8)

chi11G9VL-726R (RI) (30-mero)

La región variable de cadena pesada del anticuerpo de ratón 11G9.6 obtenido en el apartado 2-2 se sometió a un método de PCR para obtener el "Producto de PCR que codifica la región variable de cadena pesada de 11G9.6". El producto de la PCR que codifica la región variable de cadena pesada de 11G9.6 se digirió con las enzimas de restricción Hind III y Apa I, y se purificó con un método en gel de agarosa al 1,5%. Esto se disolvió en ddH2O, que se tomó como una solución de unfragmento de ADNc que codificaba la región variable de cadena pesada.

El ADNc obtenido seamplificó con PCR a partir del clon del plásmido pCR4Blunt-TOPO quecontienela región VH de 11G9.6, que utiliza cebadores chiG9VH-IF (Hind III) y chi11G9VL-408R, en los cuales se introdujeron los sitios de restricción (Hind III y Apa I) preferidos para la clonación de la región que codifica VH de 11G9.6 quimérico en el vector pEE6.4 (fabricado por Lonza Biologics, Slough, Reino Unido), y la secuencia Kozak ideal (GCCGCCACC) como sitios de clonación del vector Hind III y Apa I. Chi11G9VH-pEE6.4 contiene La región constante de cadena pesada de IgG1 humana. El fragmento PCR de VH se insertó en el vector pEE6.4 en marco utilizando Hind III y Apa

I. La construcción se investigó mediante el análisis de la secuencia de bases de ADNc. Para el análisis de la secuencia, la muestra de ADN plasmídico se envió a Operon Biotechnology Co. Ltd (Tokio), y se confirmó la secuencia de bases de ADNc en el plásmido.

3.3 Preparación de ADNc que codificala cadena ligera del anticuerpo contra PLD4 quimérico

Para preparar el ADNc que codifica la cadena ligera del anticuerpo contra PLD4 quimérico, se fusionaron la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11G9.6 de ratón obtenido en el apartado 2-3, y la región constante de la cadena ligera de Ig kappa humana obtenida en el apartado 3-2 para proporcionar un fragmento de PCR, y el fragmento de PCR se amplificó a un producto de PCR de aproximadamente 730 bases de longitud mediante un enfoque basado en un método de PCR de extensión por solapamiento.

El producto de la PCR que codifica la región variable de cadena ligera de 11G9.6 se digirió con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I y se purificó con un método en gel de agarosa al 1,5%. Esto fue disuelto en ddH2O, que se tomó como una solución de un fragmento de ADNc que codificala región variable de cadena ligera.

El ADNc obtenido que codifica VL de 11G9 quimérico se amplificó con PCR a partir del clon del plásmido pCR4Blunt-TOPO que contiene la región VL de 11G9.6, utilizando los cebadores chi11G9VL-IF (Hind) y chi11G9VL-726R (R I), en los que se introdujeron los sitios de restricción (Hind III y EcoR I) preferidos para la clonación del vector pEE14.4 (fabricado por Lonza Biologies), y la secuencia ideal de Kozak. El vector Chi11G9VL-pEE14.4 contiene la región constante de la cadena ligera de kappa. La El fragmento de PCR VL se insertó en el vector pEE14.4 en marco utilizando HindIII y EcoR I. El constructo se investigó mediante análisis de secuencia de bases de ADNc.

3.4

Construcción del vector de expresión Lonza de doble gen del anticuerpo contra PLD4 quimérico (ch11G9VH/VL)

El anticuerpo contra PLD4 quimérico (vector chi11G9DG), el vector deexpresión Lonza combinado en un vector de2 genes se construyó a partir del vector de expresión de cadena pesada del anticuerpo contra PLD4 quimérico (chi11G9VH-pEE6.4), y el vector de cadena ligera del anticuerpo contra PLD4 quimérico (chi11G9VL-pEE14.4) mediante tecnología de clonación convencional.

4.

Expresión transitoria en células 293F

Se utilizaron 80 µg de ADN del vector Lonza chi11G9DG, un plásmido vector de expresión transitoria.

Las células 293F se combinaron hasta 80 mL en 8 × 105 células/mL en un matraz Erlenmyer de 250 mL (Núm. de Cat. 431144; fabricado por CORNING) el día anterior a la transfección y se cultivaron en las condiciones de 37°C y concentración de CO2 al 8% durante 7 días con agitación.

Después del cultivo durante 7 días, el líquido de cultivo de las células 293F transfectadas se recogió en un tubo de 50 mL y se realizó una centrifugación en condiciones de 2,070 g a 4°C durante 5 minutos. El sobrenadante se filtró con un filtro de jeringa con un tamaño de poro de 0,45 µm (Núm. de Cat. 431220; fabricado por CORNING), y el sobrenadante del cultivo serecogió para la purificación del anticuerpo.

5. Purificación del anticuerpo quimérico anti-PLD4.

Utilizando el sobrenadante de cultivo recogido, la purificación de anticuerpos se realizó utilizando AKTA-FPLC (fabricado por GE Healthcare Japan) y el soporte lógico Unicorn 5.0.

Como columna para la purificación del anticuerpo 11G9.6 quimérico, se utilizó HiTrap MabSelect SuRe 1 mL (Núm. de Cat. 11-0034-93, lote Núm. 10032458; fabricado por GE Healthcare Japan). Las condiciones de la columna son las siguientes. La purificación por afinidad se realizó utilizando un tampón de unión (fosfato sódico 20mM, NaCl 0,15 M, pH 7,4) y un tampón de elución (citrato sódico 20 mM, pH 3,4). Con el fin de reemplazar el tampón del anticuerpo

después de la purificación con PBS, se realizó un intercambio de tampón utilizando la Unidad de Diálisis MINI SlideA-Lyzer 10kMWCO.

La concentración del anticuerpo purificado se calculó midiendo la absorbancia a 280 nm, en donde 1 mg/mL se calculó como DO 1,38.

Para ch11G9.6Ab del anticuerpo quimérico anti-PLD4 purificado, la calidad de la proteína se analizó con el método de citometría de flujo y SDS-PAGE.

Ejemplo 8

Se midió la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (actividad ADCC) del anticuerpo quimérico anti-PLD4 humana preparado (ch11G9.6 Ab). Para determinar la actividad, se utilizó un índice de toxicidad celular calculada a partir del valor de medición de la lactasa deshidrogenasa (LDH) liberada desde la célula. La célula mononuclear de sangre periférica humana que se convirtió en una célula efectora se purificó con una centrífuga de gravedad específica utilizando HISTOPAQUE-1077. Como célula que debía ser la diana, se utilizaron células transformadas preceptivas del gen PLD4 humano empleando una cepa de células CHO-K1 (cepa de células de ovario de hámster chino) (en adelante, HuPLD4-CHO) (2 × 104/pocillo). El efector y la célula diana se mezclaron a una proporción de 10:1, 20:1, 40:1 y 80:1, y se les añadieron 10 mg/mL de ch11G9Ab o anticuerpo de control de isotipo (IgG1 humana, κ), se cultivaron a 37°C durante 4 horas, y se evaluó el efecto de la actividad de citotoxicidad del anticuerpo. Como resultado de ello, ch11G9Ab del anticuerpo quimérico anti-hPLD4 mostró un máximo de aproximadamente 50% de actividad ADCC contra las células HuPLD4-CHO que eran la diana, dependientemente de la célula efectora (FIG. 22). Dichos resultados demostraron que el anticuerpo quimérico anti-PLD4 preparado dañó las células que expresaban PLD4 selectivamente.

Se revisaron los efectos del anticuerpo anti-PLD4 en pDC. Las PBMC de la sangre periférica humana se purificaron, se mezclaron con 10 µg/mL de anticuerpo quimérico anti-PLD4 humana y se cultivaron durante 24 horas. A continuación, las células se estimularon durante 24 horas con CpG2216, que era un ligando del receptor 9 tipo Toll expresado en pDC, para inducir la producción de IFNα. Después de la estimulación con CpG, se sometió a ensayo la cantidad de IFNα producido, y se confirmó que la producción de IFNα se inhibía completamente mediante el tratamiento de ch11G9Ab del anticuerpo quimérico anti-PLD4 (FIG. 23). En cuanto a este mecanismo, se descubrió que cuando las células se recogieron 24 horas después del tratamiento con ch11G9Ab, y las células pDC se confirmaron con la tinción triple del anticuerpo anti-CD 123, el anticuerpo anti-HLA-DR y el anticuerpo anti-Linaje 1, la población de células pDC disminuyó más que con el tratamiento del anticuerpo de control de isotipo (IgG1 humana, κ) (FIG. 24). Estos resultados indicaron que el anticuerpo quimérico anti-PLD4 dañó la pDC que expresaba específicamente PLD4, y como resultado de ello, se inhibió la producción de IFNα por medio de estimulación con CpG2216. Además de ch11G9.6Ab, se examinaron las funciones biológicas de Ab quiméricos anti-PLD4, tales como ch3B4Ab, ch5B7Ab, ch8C11Ab, ch10C3Ab, ch13D4Ab, ch13H11Ab, en pDC primarias humanos. Con el fin de examinar el ensayo de ADCC para pDC, se cultivaron PBMC humanas completas con ch3B4Ab, ch5B7Ab, ch8C11Ab, ch10C3Ab, ch13D4Ab, ch13H11Ab, ch11G9.6Ab, o Ab de isotipo durante 14 h. Las células se recogieron y se tiñeron con BDCA2 y BDCA4 para identificar pDC mediante citometría de flujo. El tratamiento con Ab quiméricos contra PLD4 agotó completamente las pDC en comparación con las PBMC tratadas con el Ab de isotipo (FIG. 25). La producción de IFNα también se midió en el cultivo de PBMC con los Ab quiméricos anti-PLD4. Las PBMC humanas completas se trataron con ch3B4Ab, ch5B7Ab, ch8C11Ab, ch10C3Ab, ch13D4Ab, ch13H11Ab, ch11G9.6Ab, o Ab de isotipo. Después de 24 h, se añadió CpG2216 inducible por IFNα al cultivo y las células se cultivaron adicionalmentedurante24 h. Los sobrenadantes decultivo serecogieron y se midió la producción deIFNα mediante ELISA. Todas las PBMC quiméricas tratadas con Ab PLD4 eliminaron completamente la producción de IFNα en comparación con las PBMC tratadas con isotipo Ab (FIG. 26). Estos resultados indicaron que el Ab quimérico anti-PLD4 abolió la función de las pDC, por ejemplo disminuyendo en gran medida las cantidades de producción deIFNα al agotar las pDC a través de la actividad ADCC.

1.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO: 74, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 75. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6 de ratón son SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente.

2.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6 de ratón anti-PLD4 (504 pb) [Mayúsculas: región variable de 11G9.6VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada deIgG2b de ratón] (SEQ ID NO: 74)

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6 de ratón (168 a.a.) [Mayúsculas: región variable de 11G9.6VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa las regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) (SEQ ID NO: 75).

10 CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6 SYWMH (SEQ ID NO: 2) CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6 DIYPGSDSTNYNEKFKS (SEQ ID NO: 3) CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11G9.6

15 GGWLDAMDY (SEQ ID NO: 4)

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11G9.6 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO: 38, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 39. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11G9.6 de ratón son SEQ ID NO: 40,

20 SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11G9.6 de ratón anti-PLD4 (421 pb) [Mayúsculas: región variable de 11G9.6VL de ratón, minúsculas: región constante de la cadena ligera de IgK de

25 La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11G9.6 de ratón (140 a.a.) [Mayúsculas: región variable de 11G9.6VL de ratón, minúsculas: región constante de la cadena ligera de Igκ de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa las regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) (SEQ ID NO: 95).

CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11G9.6 RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 5)

35 CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11G9.6 YTSRLHS (SEQ ID NO: 6) CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11G9.6 QQGNTLPW (SEQ ID NO: 7)

40 2. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 3B4 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO: 76, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 77. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 3B4 de ratón son SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 3B4 de ratón anti-PLD4 (437 pb) [Mayúsculas: región variable de 3B4VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG1 de ratón]

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 3B4 de ratón (145 a.a.) [mayúsculas: región variable de 3B4VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG1 de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 3B4

15 TYWMH CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 3B4 AIYPGNSETSYNQKFKG CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 3B4 GYSDFDY

20 La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 3B4 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO: 96, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 97. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 3B4 de ratón son SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13, respectivamente.

25 La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 3B4 de ratón anti-PLD4 (459 pb) [mayúsculas: región variable de 3B4VL de ratón, minúsculas: región constante de la cadena ligera de IgK deratón]

30 La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 3B4 de ratón (153 a.a.) [mayúsculas: región variable de 3B4VL de ratón, minúsculas: región constante de la cadena ligera de IgK de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 3B4 HASQGIRSNIG CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 3B4 HGTNLED CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 3B4 VQYVQFP

3. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5B7 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO: 78, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 79. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5B7 de ratón son SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5B7 de ratón anti-PLD4 (475 pb) [mayúsculas: región variable de 5B7VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]

10 La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5B7 de ratón (158 a.a.) [mayúsculas: región variable de 5B7VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5B7 DYNLH

20 CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5B7 YIYPYNGNTGYNQKFKR CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 5B7 GGIYDDYYDYAIDY

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5B7 de ratón anti-PLD4

25 obtenido es SEQ ID NO: 98, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 99. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5B7 de ratón son SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo de ratón 5B7 anti-PLD4 (467 pb) [mayúsculas: región variable de 5B7VL de ratón, minúsculas: región constante de la cadena ligera de

30 Igκ de ratón]

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5B7 de ratón (155 a.a.) [mayúsculas: región variable de 5B7VL de ratón, minúsculas: región constante de la cadena ligera de Igκ de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa las regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5B7 RASENIYSHIA

CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5B7 GATNLAH CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 5B7 QHFWGTP

4. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO: 80, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 81. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4 de ratón son SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4 de ratón anti-PLD4 (470 pb) [mayúsculas: región variable de 7B4VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4 de ratón (156 a.a.) [mayúsculas: región variable de 7B4VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa las regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4 DYNLH CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4 YIYPYNGNTGYNQKFKR CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4 GGIYDDYYDYAIDY

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 7B4 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO: 100, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 101. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 7B4 de ratón son SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 7B4 de ratón anti-PLD4 (454 pb) [mayúsculas: región variable de 7B4VL de ratón, minúsculas: región constante de la cadena ligera de Igκ de ratón]

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 7B4 de ratón (151 a.a.) [mayúsculas: región variable de 7B4VL de ratón, minúsculas: región constante de la cadena ligera de Igκ de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa las regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 7B4 RASENIYSHIA

5 CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 7B4 GATNLAH CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 7B4 QHFWGTP

10 5. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 8C11 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO: 82, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 83. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 8C11 de ratón son SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 8C11 de ratón anti

15 PLD4 (462 pb) [mayúsculas: región variable de 8C11VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 7B4 de ratón (154 a.a.) [mayúsculas: región variable de 8C11VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 8C11 SYYLY CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 8C11

30 LINPTNSDTIFNEKFKS CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 8C11 EGGYGYGPFAY

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 8C11 de ratón anti-PLD4

35 obtenido es SEQ ID NO: 102, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 103. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 8C11 de ratón son SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 8C11 de ratón anti-PLD4 (457 pb) [mayúsculas: región variable de 8C11VL de ratón, minúsculas: región constante de la cadena ligera de IgK de

40 ratón]

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 8C11 de ratón (152 a.a.) 5

[mayúsculas: región variable de 8C11VL de ratón, minúsculas: región constante de la cadena ligera de IgK de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 8C11 TSSQTLVHSNGNTYLH CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 8C11 KVSNRFS CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 8C11 HSTHVP

6. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 10C3 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO: 84, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 85. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 10C3 de ratón son SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 10C3 de ratón anti-PLD4 (450 pb) [mayúsculas: región variable de 10C3VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2a de ratón]

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 10C3 de ratón (150 a.a.) [mayúsculas: región variable de 10C3VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2a de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 10C3 SYGMS CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 10C3 TISSGGSYIYYPESVKG CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 10C3 LYGGRRGYGLDY

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 10C3 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO: 104, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 105. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 10C3 de ratón son SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 10C3 de ratón anti-PLD4 (423 pb) [mayúsculas: región variable de 10C3VL de ratón, minúsculas: región constante de la cadena ligera de Igκ de ratón]

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 10C3 de ratón (141 a.a.) [mayúsculas: región variable de 10C3VL de ratón, minúsculas: región constante de la cadena ligera de Igκ de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

10 CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 10C3 RSSKSLLHSDGITYLY CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 10C3 QMSNLAS CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 10C3

15 AQNLEL

7. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11D10 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO: 86, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 87. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11D10 de ratón

20 son SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11D10 de ratón anti-PLD4 (450 pb) [mayúsculas: región variable de 11D10VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena

25 La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11D10 de ratón (150 a.a.) [mayúsculas: región variable de 11D10VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11D10 SYGMS

35 CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11D10 TISSGGSYIYYPESVKG CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 11D10 LYGGRRGYGLDY

40 La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11D10 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO: 106, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 107. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11D10 de ratón son SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31, respectivamente.

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11D10 de ratón anti-PLD4 (423 pb) [mayúsculas: región variable de 11D10VL de ratón, minúsculas: región constante de la cadena ligera de Igκ deratón]

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (141 a.a.) del anticuerpo 11D10 de ratón [mayúsculas: región variable de 11D10VL de ratón, minúsculas: región constante de la cadena ligera de IgK de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11D10

15 RSSKSLLHSDGITYLY CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11D10 QMSNLAS CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 11D10 AQNLEL

8. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13D4 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO: 88, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 89. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13D4 de ratón son SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, respectivamente.

25 La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13D4 de ratón anti-PLD4 (472 pb) [mayúsculas: región variable de 13D4VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]

30 La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13D4 de ratón (157 a.a.) [Mayúsculas: región variable de 13D4VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13D4 SHYYWT

40 CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13D4 YISYDGSNNYNPSLKN CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13D4 EGPLYYGNPYWYFDV

45 La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13D4 de ratón anti-PLD4 41

obtenido es SEQ ID NO: 108, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 109. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13D4 de ratón son SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13D4 de ratón anti-PLD4 (404 pb) [mayúsculas: región variable de 13D4VL de ratón, minúsculas: región constante de la cadena ligera de IgK de ratón]

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13D4 de ratón (134 a.a.) [mayúsculas: región variable de 13D4VL de ratón, minúsculas: región constante de la cadena ligera del Igκ de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13D4 RASQDIDNYLN CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13D4

20 YTSRLHS CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13D4 QQFNTLP

9. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H11 de ratón anti

25 PLD4 obtenido es SEQ ID NO: 90, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 91. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H11 de ratón son SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H11 de ratón anti-PLD4 (471 pb) [Mayúsculas: región variable de 13H11VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena

30 pesada de IgG2b de ratón]

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H11 de ratón (157 a.a.) [mayúsculas: región variable de 13H11VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG2b de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

40 CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H11 SHYYWS CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H11 YISYDGSNNYNPSLKN

45 CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H11 42

EGPLYYGNPYWYFDV

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13H11 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO: 110, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 111. Las secuencias de

5 aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13H11 de ratón son SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13H11 de ratón anti-PLD4 (414 pb) [mayúsculas: región variable de ratón 13H11VL, minúsculas: región constante de la cadena ligera de Igκ deratón]

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13H11 de ratón (138 a.a.) [Mayúsculas: región variable del 13H11VL de ratón, minúsculas: región constante de la cadena ligera de ratón IgK]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

20 CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13H11 RASQDIDNYLN CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13H11 YTSRLHS CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 13H11

25 QQFNTLP

10. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14C1 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO: 92, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 93. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14C1 de ratón

30 son SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14C1 de ratón anti-PLD4 (470 pb) [mayúsculas: región variable de 14C1VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG1 de ratón]

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14C1 de ratón (156 a.a.) [mayúsculas: región variable de 14C1VH de ratón, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG1 de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

CDR1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14C1 45 SHYYWS 43

CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14C1 YISYDGSNNYNPSLKN CDR3 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 14C1 EGPLYYGNPYWYFDV

La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14C1 de ratón anti-PLD4 obtenido es SEQ ID NO: 112, y la secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 113. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14C1 de ratón son SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14C1 de ratón anti-PLD4 (465 pb) [mayúsculas: región variable de ratón 14C1VL, minúsculas: región constante de la cadena ligera de ratón IgK]

La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14C1 de ratón (155 a.a.) [mayúsculas: región variable de 14C1VL de ratón, minúsculas: región constante de la cadena ligera de Igκ de ratón]. La secuencia subrayada representa una secuencia señal, y el doble subrayado representa regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3).

CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14C1 RASQDIDNYLN CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14C1 YTSRLHS CDR3 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 14C1 QQFNTLP

Las secuencias de bases y las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 11G9 quimérico preparadotienen los siguientes Núm. de Secuencia, respectivamente. Cadena pesada

SEQ ID NO: 120 (secuencia de bases) SEQ ID NO: 121 (secuencia de aminoácidos)

Cadena ligera

SEQ ID NO: 122 (secuencia de bases) SEQ ID NO: 123 (secuencia de aminoácidos)

11. La secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada del anticuerpo 11G9 quimérico anti-PLD4 (1401 pb) [Mayúsculas: región variable de 11G9VH quimérico, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG1 humana] (SEQ ID NO: 120)

12.

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo 11G9 quimérico anti-PLD4 (466 a.a.) [Mayúsculas: región variable de 11G9VH quimérico, minúsculas: región constante de cadena pesada de IgG1 humana] (SEQ ID NO: 121)

13.

La secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera del anticuerpo 11G9 quimérico anti-PLD4 (705 pb) [Mayúsculas: región variable de 11G9VL quimérico, minúsculas: región constante de la cadena ligera de Igκ humana] (SEQ ID NO: 122)

14. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo 11G9 quimérico anti-PLD4 (234 a.a.)

15 [Mayúsculas: región variable de 11G9VL quimérico, minúsculas: región constante de la cadena ligera de IgK humana] (SEQ ID NO: 123)

20 Secuencia de ADNc y proteína en moléculas relacionadas con PLD4 > ADNc de PLD4 humana (1521 pb) (SEQ ID NO: 44)

> Proteína PLD4 humana (506 aminoácidos) (SEQ ID NO: 1)

> ADNc de PLD4 demono cinomolgo (1521 pb) (SEQ ID NO: 63)

> Proteína PLD4 demono cinomolgo (506 aminoácidos) (SEQ ID NO: 129)

> ADNc de PLD4 demono rhesus (1521 pb) (SEQ ID NO: 124)

10 >ProteínaPLD4demonorhesus(506aminoácidos)(SEQIDNO:130)

> ADNc de PLD4 de ratón(1512 pares de bases) (SEQ ID NO: 131)

> Proteína PLD4 deratón (503 aminoácidos) (SEQ ID NO: 132)

10 > Proteína PLD3 humana (490 aminoácidos) (SEQ ID NO: 127)

> ADNc de PLD5 humana (1338 pares de bases) (SEQ ID NO: 56)

> Proteína PLD5 humana (445 aminoácidos) (SEQ ID NO: 128)

10 > ADNc de la proteína de fusión PLD4-Ig humana (2142 pb) (SEQ ID NO: 125)

> Proteína de fusión PLD4-Ig humana(713 aminoácidos) (SEQ ID NO: 126)

[Número de acceso]

10

NITE BP-1211 NITE BP-1212

NITE BP-1213 NITE BP-1214

15 20

[Lista de secuencias de texto libre] SEQ ID NO 45: Cebador directo SEQ ID NO 46: Cebador inverso SEQ ID NO 47: Cebador directo SEQ ID NO 48: Cebador inverso SEQ ID NO 49: Cebador directo SEQ ID NO 50: Cebador inverso SEQ ID NO 51: Cebador directo SEQ ID NO 52: Cebador inverso SEQ ID NO 53: Cebador directo

50

SEQ ID NO 54: Cebador inverso SEQ ID NO 70: Cebador de anclaje SEQ ID NO 70: n es desoxiinosina SEQ ID NO 71: Cebador AUAP

5 SEQ ID NO 72: Cebador SEQ ID NO 73: Cebador SEQ ID NO 114: Cebador SEQ ID NO 115: Cebador SEQ ID NO 116: Cebador

10 SEQ ID NO 117: Cebador SEQ ID NO 118: Cebador SEQ ID NO 119: Cebador

LISTA DE SECUENCIAS

<110> SBI BIOTECH CO., LTD.

<120> ANTICUERPO ANTI-FOSFOLIPASA D4

20 <130>W6651-000000

<160> 136

<170> Patent In versión 3.4 25

<210> 1

<211> 506

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1).. (506)

35 <400> 1

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

10 <210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 4

<210> 5 20 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5 25

<210> 6

<211> 7

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens 40

<400> 7

45 <210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

50 <400> 8

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 10

20 <210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25 <400> 11

<210> 12 30 <211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12 35

<210> 13

<211> 7 40 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 5

<212> PRT 50 <213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 14

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25

<400> 17

30 <210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35 <400> 18

<210> 19

<211> 7 40 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 5

<212> PRT 50 <213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

20 <210> 23

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25 <400> 23

<210> 24 30 <211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24 35

<210> 25

<211> 6 40 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 5

<212> PRT 50 <213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 28

20 <210> 29

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25 <400> 29

30

<210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens

35

<400> 30

40

<210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 31

45

50

<210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

10 <210> 34

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 34

<210> 35 20 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35 25

<210> 36

<211> 7 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 7

<212> PRT 40 <213> Homo sapiens.

<400> 37

<210> 38

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens 50

<400> 38

55 <210> 39

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 15

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<400> 40

<210> 41

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20

<400> 41

25 <210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

30 <400> 42

<210> 43 35 <211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43 40

<210> 44

<211> 1521 45 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 44

<210> 45

<211> 18 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador directo 10

<400> 45 atggactggc ggtctctg 18

<210> 46 15 <211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 20 <223> cebador inverso

<400> 46 tggaaggtct tctccaggtc 20

25 <210> 47 <211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador directo

<400> 47 agccacatcg ctcagacac

<210> 48

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso

<400> 48 gcccaatacg accaaatcc

<210> 49

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador directo

<400> 49 atggactggc ggtctctg

<210> 50

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso

<400> 50 tggaaggtct tctccaggtc

<210> 51

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador directo

<400> 51 agccacatcg ctcagacac

<210> 52

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso

<400> 52 gcccaatacg accaaatcc

5

<210> 53 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador directo

10

<400> 53 tttgaattcg ccgccaccat gctgaagcct 30

15

<210> 54 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador inverso

20

<400> 54 aaagcggccg ctcagccctg ccaaacgcag tcct 34

25

<210> 55 <211> 1473 <212> ADN <213> Homo sapiens

30

<220> Gen <221> <222> (1)..(1473)

<400> 55

<210> 56

<211> 1338 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Gen 10 <222> (1)..(1338)

<400> 56

<210> 57

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador directo

<400> 57 tttaagcttg ccgccaccat gaagcctaaa ctgatgtac 39

<210> 58

<211> 57

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso

<400> 58 tttgaattct cacttatcgt cgtcatcctt gtaatcgagc aggcggcagg cgttgcc 57

<210> 59

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador directo

<400> 59 tttaagcttg ccgccaccat gggagaggat gaggatgga 39

<210> 60

<211> 57

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso

<400> 60 tttgaattct cacttatcgt cgtcatcctt gtaatctacg ttccggggat cctttcc 57

<210> 61

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador directo

<400> 61 agatgctgaa gcctcttcgg agagcg 26

<210> 62

<211> 25 <212> ADN <213> Artificial

5

<220> <223> cebador inverso

10 15

<400> 62 tcagccctgc caaacgcagt cctgg <210> 63 <211> 1521 <212> ADN <213> Macaca fascicularis <220> Gen <221> <222> (1).. (1521) 25

20

<400> 63

<210> 64 25 <211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 64 ccaggagagt gggagaggct cttctcagta tggtgg 36

<210> 65

<211> 32

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 65 ggctcaggga aatagccctt gaccaggcat cc 32

<210> 66

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 66 tccagagttccaggtcactgtcac 24

<210> 67

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 67 aggggccagt ggatagacag atgg 24

<210> 68

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 68 tccagagttc caagtcacag tcac 24

<210> 69

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 69 aggggccagt ggatagactg atgg 24

<210> 70

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador de anclaje

<220>

<221> rasgo_misc

<222> (24).. (25)

<223> n es desoxiisosina.

<220>

<221> rasgo_misc

<222> (29).. (30)

<223> n es desoxiisosina.

<220>

<221> rasgo_misc

<222> (34)..(35)

<223> n es desoxiisosina.

<400> 70 ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng 36

<210> 71

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador AUAP

<400> 71 ggccacgcgt cgactagtac 20

<210> 72

<211> 31

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 72 cactacttcc tgttgaagct cttgacgatg g 31

<210> 73

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 73 gtgagtggcc tcacaggtat agc 23

<210> 74

<211> 504

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 74

<210> 75

<211> 168

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 75

<210> 76

<211> 437

<212>

ADN 15 <213> Mus musculus

<400> 76

<210> 77

<211> 145

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 77

<210> 78

<211> 475

<212>

ADN 15 <213> Mus musculus

<400> 78

<210> 79

<211> 158

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 79

<210> 80 15 <211> 470

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 80 20

<210> 81

<211> 156

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 81

<210> 82 15 <211> 462

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 82 20

<210> 83

<211> 154

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 83

<210> 84 15 <211> 450

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 84 20

<210> 85

<211> 150

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 85

<210> 86 15 <211> 450

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 86 20

<210> 87

<211> 150

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 87

<210> 88 15 <211> 472

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 88 20

<210> 89

<211> 157

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 89

<210> 90

<211> 471

<212>

ADN 15 <213> Mus musculus

<400> 90

<210> 91

<211> 157

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 91

<210> 92

<211> 470

<212>

ADN 15 <213> Mus musculus

<400> 92

<210> 93

<211> 156

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 93

<210> 94

<211> 421

<212>

ADN 15 <213> Mus musculus

10 10

<400> 94 5 <210> 95

<211> 140

<212> PRT

<213> Mus musculus

10 <400> 95

<210> 96 15 <211> 459

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 96 20

<210> 97

<211> 153

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 97

<210> 98

<211> 467

<212> ADN 15 <213> Mus musculus

<400> 98

<210> 99

<211> 155

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 99

<210> 100 15 <211> 454

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 100 20

<210> 101

<211> 151

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 101

<210> 102 15 <211> 457

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 102 20

<210> 103

<211> 152

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 103

<210> 104 15 <211> 423

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 104 20

<210> 105

<211> 141

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 105

<210> 106 15 <211> 423

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 106 20

<210> 107

<211> 141

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 107

<210> 108

<211> 404

<212>

ADN 15 <213> Mus musculus

<400> 108

<210> 109

<211> 134

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 109

<210> 110

<211> 414

<212>

ADN 15 <213> Mus musculus

<400> 110

<210> 111

<211> 138

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 111

<210> 112

<211> 465

<212>

ADN 15 <213> Mus musculus

10 <400> 112

<210> 113

<211> 155

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 113

<210> 114 10 <211> 93

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 15 <223> cebador

<400> 114

20 25

<210> 115 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador

30

<400> 115 cgatgggccc ttggtgctag ctgaggagac ggtgactgag gt 42

<210> 116 <211> 39 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 116 accaagcttg ccgccaccat gatgtcctct gctcagttc 39

<210> 117

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 117 agccacagtt cgtttgattt ccagcttggt gcc 33

<210> 118

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 118 ctggaaatca aacgaactgt ggctgcacca tct 33

<210> 119

<211> 30

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 119 aaagaattcc tagcactctc ccctgttgaa 30

<210> 120

<211> 1401

<212> ADN

<213> Quimera sp.

<400> 120 5 <210> 121

<211> 466

<212> PRT

<213> Quimera sp.

10 <400> 121

<210> 122

<211> 705

<212> ADN

<213> Quimera sp.

<400> 122 <210> 123

<211> 234

<212> PRT

<213> Quimera sp.

<400> 123

<210> 124

<211> 1521 5 <212> ADN

<213> Macaca mulata

<220>

Gen <221> 10 <222> (1)..(1521)

<400> 124

<210> 125

<211> 2142

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 125

<210> 126

<211> 713

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 126

<210> 127

<211> 490

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 127

<210> 128

<211> 445

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 128

<210> 129

<211> 506

<212> PRT

<213> Macaca fascicularis

<400> 129

<210> 130

<211> 506

<212> PRT

<213> Macaca mulata

<400> 130

<210> 131

<211> 1512

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 131

<210> 132

<211> 503

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 132

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo que se une a la proteína fosfolipasa D4 humana (PLD4) en una célula dendrítica plasmocitoide.

2. 2.

   El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1,

   (a)

   que tiene la secuencia SYWMH como CDR1, la secuencia DIYPGSDSTNYNEKFKS como CDR2 y la secuencia GGWLDAMDY como CDR3 en laregión variable de cadena pesada;

   (b)

   que tiene la secuencia RASQDISNYLN como CDR1, la secuencia YTSRLHS como CDR2 y la secuencia QQGNTLPW como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

   (c)

   que tiene la secuencia SYWMH como CDR1, la secuencia DIYPGSDSTNYNEKFKS como CDR2 y la secuencia GGWLDAMDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y tiene la secuencia RASQDISNYLN como CDR1, la secuencia YTSRLHS como CDR2, y la secuencia QQGNLLPWC en la región variable de cadena ligera;

   (d)

   que tiene la secuencia TYWMH como CDR1, la secuencia AIYPGNSETSYNQKFKG como CDR2 y la secuencia GYSDFDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

   (e)

   que tiene la secuencia HASQGIRSNIG como CDR1, la secuencia HGTNLED como CDR2 y la secuencia VQYVQFP como CDR3 en laregión variable de cadena ligera;

   (f)

   que tiene la secuencia TYWMH como CDR1, la secuencia AIYPGNSETSYNQKFKG como CDR2, y la secuencia GYSDFDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y tiene la secuencia HASQGIRSNIG como CDR1, la secuencia HGTNLED como CDR2, y la secuencia VQVVVQQQ en la región variable de cadena ligera;

   (g)

   que tiene la secuencia DYNLH como CDR1, la secuencia YIYPYNGNTGYNQKFKR como CDR2 y la secuencia GGIYDDYYDYAIDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

   (h)

   que tiene la secuencia RASENIYSHIA como CDR1, la secuencia GATNLAH como CDR2 y la secuencia QHFWGTP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

   (i)

   que tiene la secuencia DYNLH como CDR1, la secuencia YIYPYNGNTGYNQKFKR como CDR2, y la secuencia GGIYDDYYDYAIDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y tiene la secuencia RASENIYSHIA como CDR1, la secuencia GATNLAH como CDR2, y la secuencia QHFWGTP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

   (j)

   que tiene la secuencia SYYLY como CDR1, la secuencia LINPTNSDTIFNEKFKS como CDR2, y la secuencia EGGYGYGPFAY como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

   (k)

   que tiene la secuencia TSSQTLVHSNGNTYLH como CDR1, la secuencia KVSNRFS como CDR2, y la secuencia HSTHVP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

   (l)

   que tiene la secuencia SYYLY como CDR1, la secuencia LINPTNSDTIFNEKFKS como CDR2, y la secuencia EGGYGYGPFAY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y tiene la secuencia TSSQTLVHSNGNTYLH como CDR1, la secuencia KVSRRFS como CDR2, y la secuencia HSTHVP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

   (m)

   que tiene la secuencia SYGMS como CDR1, la secuencia TISSGGSYIYYPESVKG como CDR2 y la secuencia LYGGRRGYGLDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

   (n)

   que tiene la secuencia RSSKSLLHSDGITYLY como CDR1, la secuencia QMSNLAS como CDR2, y la secuencia AQNLEL como CDR3 en laregión variable de cadena ligera;

   (o)

   que tiene la secuencia SYGMS como CDR1, la secuencia TISSGGSYIYYPESVKG como CDR2, y la secuencia LYGGRRGYGLDY como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y tiene la secuencia RSSKSLLHSDGITYLY como CDR1, la secuencia QMSNLAS como CDR2, y la secuencia AQNLEL como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

   (p)

   que tiene la secuencia SHYYWT como CDR1, la secuencia YISYDGSNNYNPSLKN como CDR2, y la secuencia EGPLYYGNPYWYFDV como CDR3 en la región variable de cadena de la cadena pesada;

   (q)

   que tiene la secuencia RASQDIDNYLN como CDR1, la secuencia YTSRLHS como CDR2 y la secuencia QQFNTLP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

   (r)

   que tiene la secuencia SHYYWT como CDR1, la secuencia YISYDGSNNYNPSLKN como CDR2, y la secuencia EGPLYYGNPYWYFDV como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y tiene la secuencia RASQDIDNYLN como CDR1, la secuencia YTSRLHS, comoCDR2, y la secuencia QQFNTLP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

   (s)

   que tiene la secuencia SHYYWS como CDR1, la secuencia YISYDGSNNYNPSLKN como CDR2, y la secuencia EGPLYYGNPYWYFDV como CDR3 en la región variable de cadena pesada;

   (t)

   que tiene la secuencia RASQDIDNYLN como CDR1, la secuencia YTSRLHS como CDR2 y la secuencia QQFNTLP como CDR3 en la región variable de cadena ligera;

   (u)

   que tiene la secuencia SHYYWS como CDR1, la secuencia YISYDGSNNYNPSLKN como CDR2, y la secuencia EGPLYYGNPYWYFDV como CDR3 en la región variable de cadena pesada, y tiene la secuencia RASQDIDNYLN como CDR1, la secuencia YTSRLHS como CDR2, y la secuencia QQFNTLP como CDR3 en la región variable de cadena ligera.

3. 3.

   El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contienen la región de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 2, que tiene una cadena pesada expuesta en SEQ ID: 121 y una cadena ligera expuesta en SEQ ID: 123.

4. 4.

   El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo suprimen una actividad dela célula dendrítica plasmocitoide.

5. 5.

   El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la actividad es la producción de interferón (IFN) y/o la supervivencia de la célula dendrítica plasmocitoide.

6. 6.

   El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

7. 7.

   Un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo, que está siendo producido por uno cualquiera de los hibridomas mp5B7, mp7B4, mp13D4 y mpl3Hl 1 que se depositan bajo los Números de Acceso: NITE BP-1211, NITE BP-1212, NITE BP-1213, y NITE BP-1214.

8. 8.

   Un método para preparar una célula que produce un anticuerpo monoclonal que se une a PLD4 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 y 5, que comprende los siguientes procedimientos:

   1) un procedimiento de administración de la proteína de fusión PLD4-Ig recombinante que codifica una secuencia de aminoácidos que contiene un dominio extracelular de PLD4 para inmunizar a un animal no humano; y 2) un procedimiento de selección de una célula productora de anticuerpos que produce un anticuerpo que se une a PLD4 a partir de células productoras de anticuerpos del animal no humano inmunizado mediante la unión de dicho anticuerpo de unión a PLD4 a una célula queexpresa PLD4; y opcionalmente 3) un procedimiento de clonación delas células productoras de anticuerpos obtenidas de forma gradual.

9. 9.

   El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la célula que expresa PLD4 es una célula que retiene un polinucleótido extrínseco que codifica una secuencia de aminoácidos que contiene el dominio extracelular de PLD4 de una manera expresable.

10. 10.

    Un método para preparar un anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PLD4, que comprende cultivar células animales productoras de anticuerpos obtenidas mediante el método de acuerdo con la reivindicación 9 yrecoger un anticuerpomonoclonal del cultivo.

11. 11.

    El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 y 5, que se puede obtener mediante los siguientes procedimientos;

    1) administrando una proteína de fusión PLD4-Ig recombinante que codifica una secuencia de aminoácidos que contiene un dominio extracelular de PLD4 parainmunizar a un animal no humano, 2) seleccionando una célula productora de anticuerpos que produce un anticuerpo que se une a PLD4 de células productoras de anticuerpos del animal no humano inmunizado, y 3) cultivando las células productoras de anticuerpos seleccionadas en el procedimiento 2), y recolectando un anticuerpo que reconoce PLD4 del cultivo.

12. 12.

    Un método ex vivo para detectar una célula dendrítica plasmocitoide humana, que comprende poner en contacto con una célula de prueba el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y detectar el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión aantígeno del mismo que se une a la célula.

13. 13.

    El uso del anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 como reactivo para la detección de una célula dendrítica plasmocitoide ex vivo.

14. 14.

    Un método para suprimir una actividad de una célula dendrítica plasmocitoide humana ex vivo, que comprende poner en contacto con la célula cualquiera delos componentes descritos a continuación:

    (a)

    el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y

    (b)

    una inmunoglobulina o un fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno en la que se transplantan las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

    5 15. Cualquiera de:

    (a)

    el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y

    (b)

    una inmunoglobulina o un fragmento de anticuerpo que contiene una región de unión a antígeno en la que

    10 se transplantan las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,

    para su uso en un método para suprimir una actividad de una célula dendrítica plasmocitoide humana en un ser humano vivo, que comprende administrar cualquiera de(a) y(b) al ser humano vivo.

    118 119

    121 122 123

    127 128 129