KR20140126337A - 항-포스포리파아제 ｄ4 항체 - Google Patents

항-포스포리파아제 ｄ4 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR20140126337A
KR20140126337A KR1020147023620A KR20147023620A KR20140126337A KR 20140126337 A KR20140126337 A KR 20140126337A KR 1020147023620 A KR1020147023620 A KR 1020147023620A KR 20147023620 A KR20147023620 A KR 20147023620A KR 20140126337 A KR20140126337 A KR 20140126337A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sequence
ser
leu
antibody
pld4
Prior art date
Application number
KR1020147023620A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102098413B1 (ko
Inventor
민권 조
도모히데 야마자키
마유키 엔도
고지 이시다
Original Assignee
에스비아이 바이오테크 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47748721&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20140126337(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 에스비아이 바이오테크 가부시키가이샤 filed Critical 에스비아이 바이오테크 가부시키가이샤
Publication of KR20140126337A publication Critical patent/KR20140126337A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102098413B1 publication Critical patent/KR102098413B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

포스포리파아제 D4 (PLD4) 단백질에 결합하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편

Description

항-포스포리파아제 Ｄ4 항체 {ANTI-PHOSPHOLIPASE D4 ANTIBODY}
본 발명은 포스포리파아제 D4 에 결합하는 항체에 관한 것이다. 이하, "포스포리파아제 D" 를 PLD 로 약칭할 수 있으며, "포스포리파아제 D4" 등은 PDL4 등으로 약칭될 수 있다.
인터페론 (이하, "인터페론"은 IFN 으로 약칭될 수 있음) 은 항-바이러스 면역 응답에 있어서 가장 중요한 사이토카인이다. 인간의 혈액 중 인터페론 생성 세포 (IPC: IPC 는 수지상 세포 (DC) 의 전구 세포로서 배치된 미분화된 림프구-기재 수지상 세포이다. IPC 는 또한 형질세포양 수지상 세포 또는 플라스마사이토이드 수지상 세포 (pDC) 로 불리울 수 있다. 이하, 본 명세서에서, IPC 및 pDC 는 동의어로, 이하 원칙적으로 pDC 의 용어로 통일함) 는 CD4 및 주요 조직적합 복합체 클래스 II 단백질을 발현한다. 그러나, 이러한 세포의 불충분한 개수, 급속한 아폽토시스, 및 추가적인 리니지 (계통) 마커의 결핍으로 인해, 세포의 단리 또는 특정 특성화는 지금까지 행해지고 있지 않았다. pDC 는 수지상 세포의 CD4+CD11c-2 타입 전구체 세포인 것으로 밝혀져 있으며, pDC 는 미생물에 의한 자극 후 다른 혈액 세포보다도 200 내지 1000 배 많은 IFN 을 생성한다는 점이 발견되어 있다. 따라서, pDC 는 항-바이러스/항-종양 면역 응답에 있어서 결정적인 면역계 효과기 세포이다.
IFNα 및 IFNβ 는 항-바이러스 활성 또는 항-종양 활성을 지닌 타입 I IFN 로서 공지되어 있다. 반면, IFNα 는 자가면역 질환과 관련되어 있다는 점도 밝혀져 있다. 예를 들어, 전신성 홍반 루푸스, 만성 류마티스 관절염 등의 자가면역 질환의 환자에서 IFNα 의 비정상적인 생성이 보고된 바 있다. 더욱이, 재조합 IFNα2 또는 IFN 의 투여에 의해 자가면역 질환 증상이 발현 또는 악화된 증례가 보고된 바 있다. 또한 IFNα의 중화에 의해 자가면역 증상이 완화될 가능성도 시사되어 있다.
게다가, IFNα 이 수지상 세포 (DC) 의 분화를 유도한다는 점이 밝혀져 있다. 수지상 세포는 항원 제시 세포이므로 수지상 세포의 분화 유도가 자가면역 질환에 있어서 중요한 메카니즘을 구성하고 있다고 고려된 바 있다. 실제로, IFNα 의 수지상 세포의 분화 유도는 전신 홍반 루푸스의 발증과 깊은 관련이 있다는 점이 시사되어 있다. 상술된 바와 같이, 항-종양 활성뿐 아니라 IFNα 의 자가면역 질환과의 밀접한 관계가 지적되어 있다. 게다가, IFNα 은 건선 발증과도 깊은 연관이 있다.
pDC 는 혈액 중에 단지 소량 존재한다. 말초혈 림프구에 차지하는 pDC 의 비율은 1% 이하인 것으로 여겨진다. 그러나, pDC 는 매우 높은 IFN-생성능을 지닌다. pDC 의 IFN-생성능은 예를 들어 3000 pg/mL/104 세포에 달한다. 즉, 비록 세포의 수는 적지만, 바이러스 감염시에 발생된 혈중 IFNα 또는 IFNβ 의 대부분은 pDC 에 의해 초래된 것이라고 말할 수 있다.
pDC 는 바이러스 자극에 의해 수지상 세포 내로 분화되고, T-세포에 의해 IFN-γ 또는 인터류킨 (IL)-10 의 생산을 유도한다. 게다가, pDC 는 또한 IL-3 자극에 의해서도 수지상 세포 내로 분화된다. IL-3 자극시 분화된 수지상 세포는 T 세포에 의해 Th2 사이토카인 (IL-4, IL-5, IL-10) 의 생성을 유도한다. 상술된 바와 같이, pDC 는 자극의 차이에 따라 상이한 수지상 세포 내로 분화되는 성질을 지닌다.
따라서, pDC 는 두 측면, 즉 IFN 생성 세포로서의 한 측면과 수지상 세포의 전구체 세포로서의 다른 측면의 두 측면을 지닌 세포이다. 어느 쪽의 세포로도 면역계에서 중요한 역할을 수행한다. 다시 말해, pDC 는 여러 면에서 면역계를 지탱하는 중요한 세포들 중 하나이다.
IFN 과 같은 액성 인자의 활성 조절에 있어서, 그 인자를 인식하는 항체의 투여가 유효하다. 예를 들면, IL-1 또는 IL-4 에 대한 항체에 의해 자가면역 질환을 치료하는 시도가 실용화되었다. 또한, IFN 있어서와 같이, 중화 항체가 자가면역 질환의 치료제로서 여겨진다. IFN 생성 pDC 에 있어서도 유사한 접근이 유효하다고 기대될 수 있다. 그러나 이러한 접근은 생성된 후 액성 인자의 작용 저해를 근거로 한다. 목적의 액성 인자의 생산을 직접적으로 제어할 수 있다면, 보다 본질적인 치료 효과를 달성할 수 있다.
인간 pDC 를 인지하는 항체가 보고되어 있다. 예를 들어, 항-BDCA-2 모노클로날 항체가 인간 pDC-특이적 모노클로날 항체이다 (Dzionek, A. et al. J. Immunol, 165: 6037-6046, 2000). 항-BDCA-2 모노클로날 항체는 인간 pDC 의 IFN 생성을 억제하는 작용을 지니고 있다는 점이 밝혀져 있다 (J. Exp. Med. l94: 1823-1834, 2001). 추가적으로, 마우스 인터페론-생성 세포를 인지하는 모노클로날 항체가 인터페론의 생산을 억제한다는 것도 보고되어 있다 (Blood 2004 Jun 1; 103/11: 4201-4206. Epub 2003 Dec). 마우스 pDC 에 대한 모노클로날 항체에 의해 수지상 세포의 개수가 감소된다는 점도 보고되어 있다 (J. Immunol. 2003, 171: 6466-6477).
마찬가지로, 인간 pDC 를 인식하고 그 활성을 조절할 수 있는 항체가 제공된다면 유용할 것이다. 예를 들어, 본 발명자들은 이미 Ly49Q 를 인식하는 항체가 마우스 pDC 에 특이적으로 결합한다는 점을 밝혔다. 그러나, Ly49Q 에 대한 항체는 마우스 pDC 의 활성을 간섭하지는 않았다 (B1ood, 1 April 2005, Vol. 105, No.7, pp. 2787-2792).
PLD 은 포스파티딜 콜린의 가수분해 반응을 촉매작용하여 포스파티드산 및 콜린을 생산해 각종 세포에서 시그널링을 일으키는 효소이다. 생성된 포스파티드산은 지질 시그널 분자로서 기능한다고 여겨진다.
PLD1 및 PLD2 가 2 종의 포유동물 PLD 로서 통상 공지되어 있으며, 이는 그의 N 말단 영역에 포스파티딜 이노시티드에 결합가능한 Phox 상동성 도메인 (PX 도메인) 및 플렉스트린 (pleckstrin) 상동성 도메인 (PH 도메인) 을 포함한다. 상기 도메인 양자 모두는 PLD 멤브레인 타겟팅에 관여한다.
PLD1 및 PLD2 은 추가로 2 개의 His-x-Lys-x-x-x-x-Asp 서열 (HKD 모티프) 를 포함한다. 상기 HKD 모티프는 PLD 활성에 있어서 필수적인 도메인이다.
PLD1 및 PLD 에 의해 생성된 포스파티드산이 세포 골격의 재구성, 세포외배출, 포식 작용, 암화, 세포 부착, 화학주성 등에 관여하고, 신경계, 면역계 등에 중심적으로 작용한다고 생각된다.
인간 Hu-K4 및 마우스 SAM9 는 지금까지 공식적으로 PLD3 으로 명명되어 있지만, 이들은 PX 및 PH 도메인이 결여되어 있으며, 2 종의 HKD 모티프를 지님에도 불구하고 PLD 활성을 보이지 않는다. 더욱이, 3 종의 PLD 패밀리 멤버, 즉 PLD4, PLD5, 및 PLD6 이 존재하지만, 이들 비(非)고전적인 PLD 는 거의 공지되어 있지 않다.
마우스 소뇌 발달에서 유전자 발현 패턴에 대한 소뇌발달 트랜스크립톰 데이타베이스 (CDT-DB) 를 검색하였고, 그 결과, 발달시에 제어된 전사 생성물인 PLD 가 동정되었다 (Tao et al., Nat. Methods 2(8), 591-598(2005) 참조). PLD4 의 염기성 특성은 보고되어 있지 않다. PLD4 가 효소 활성을 나타내는지 또는 그렇지 않은지에 대해, 및 PLD4 의 탈글리코실화 형태가 PLD 활성을 갖는지 아닌지에 대해 이제는 결정되어야 할 사항이라는 점으로 여겨진다.
PLD4 는 SEQ ID NO: 1 로 나타낸 506 아미노산 서열이다 (Tao et al., Nat. Methods 2(8), 591-598(2005) 및 Clark et al., Genome Res. 13(10), 2265-2270(2003)). PLD4 단백질은 C 말단 영역에 보존된 2 종의 HKD 모티프 (His-x-Lys-x-x-x-x-Asp 의 아미노산 서열, 이때, x 는 기타 아미노산임) 로 구성되는 2 종의 잠정적인 PDE 영역 (포스포디에스테라아제 모티프) 및 추정적인 인산화 부위 (Thr 472) 를 가진다. PLD4 단백질의 구조는 타입 II 모노트로픽 (monotropic) 트랜스멤브레인 단백질로서 예측된다. 게다가, PLD4 단백질의 N 말단 영역은 고전적인 PLD 패밀리인 PLD1 및 PLD2 이 소유하는 PX 영역 및 PH 영역을 갖지 않고 있다 (도 1 및 2).
반면에, PLD4 은 2 종의 HKD 모티프를 갖는다는 사실로부터 PLD 패밀리에 속하나, PLD4 는 PX 도메인 및 PH 도메인이 결여되어 있으나, 그 대신에 추정상 트랜스멤브레인 도메인을 가진다.
저 수준에서 중간 수준까지 특징적인 PLD4 의 mRNA 발현이, 생후 1 주간의 마우스의 소뇌 백색질을 포함하는 백색질 영역 주변 및 뇌들보에서 우선적으로 국한된 세포 소집단에서 발견되었다. PLD4 mRNA 를 발현하는 이들 세포는 Ibal 양성 미세아교세포로서 동정되어져 있다 (Tao et al., Nat. Methods 2(8), 591-598(2005) 참조).
생후 1 주간이라고 하는 시기는 마우스의 뇌들보 및 소뇌 백색질에서는 미에린 형성이 활성화되기 시작하는 시기이다. 이 시기에, 백색질 내에 존재하는 아메바양 (amoeboid; 활성화 상태) 미세아교세포에 있어서 PLD4 은 고발현된다. 이러한 사실로부터, 이 시기에 백색질 내의 PLD4 발현 세포가 미엘린 형성에 관여하고 있을 가능성도 고려된다. 특히, PLD4 이 포식세포성 비히클 내 PLD4 축적이 명확해지고 있어 PLD4 발현 세포가 포식 작용에 관여하고 있다는 가능성이 시사된다. 활성화 상태인 아메바양 미세아교세포로부터, 여러가지 사이토카인 또는 성장 인자가 분비되고, 동시에 포식 작용이 활성화된다. 여분의 희소돌기아교세포 (축색에 휘감겨 부착되어 미엘린을 형성하는 중추 신경계 내 아교세포) 가 아톱포시스를 발달기의 뇌의 백색질에서 야기한다고 여겨진다. 여분의 희소돌기아교세포가 아메바양 미세아교세포에서부터 분해 및 제거되어 시그널 분자를 분비하는 것에 의해 백색질 내의 미엘린 형성 환경을 갖추고 있을 가능성이 고려된 바 있다. PLD4 가 미엘린 형성을 포함하는 이들의 과정에 관여되어 있는 것으로 시사되어 있다.
PLD4 mRNA 발현은 비신경 조직에서도 또한 보편적으로 보여지나, 주로 비장에 분포되어 있다. 강한 PLD4 발현은 비장 적색수의 경계 영역 주변에서 검출되고, 세포 내 멤브레인 분획에서 회수된 비장 PLD4 단백질은 고도로 N-글리코실화되어 있다. PLD4 가 이종 세포계에 발현되는 경우, 이들은 소포체 및 골기체에 국한되어 있다. 이종-발현한 PLD4 은 PLD 효소 활성을 나타내지 않았다 (Plos ONE www.plosone.org, November 2010, Volume 5, Issue 11, e13932).
시간 및 위치 측면에서 제한된 PLD 발현 패턴으로부터, PLD4 가 생후 초기의 뇌의 발달시의 미세아교세포 또는 비장 경계 영역의 세포에서 공통되는 기능 면에 있어서 역할을 수행한다는 점이 시사된다.
신경 조직 및 비(非)신경조직에서 PLD4 mRNA 발현 및 PLD4 분포가 상기에 개략적으로 설명되어 있다. 그러나, 본 발명자들은 PLD4 mRNA 가 후술되는 바와 같이 세포 종 수준 (level) 으로서 휴지기 (resting stage) 의 pDC 세포에서 특이적으로 고발현되어 있다는 점을 발견했다.
전장 인간 PLD4 단백질에 대한 마우스 항-인간 PLD4 폴리클로날 항체가 시판중이다 (PLD4 정제 MaxPab 마우스 폴리클로날 항체 (B01P), catalog No. H00122618-B01P, Abnova Corporation 제작). 그러나, PLD4 의 특정한 부위에만 결합하는 모노클로날 항체 또는 PLD4 에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체는 수득되지 않았다.
인용 문헌
비특허 문헌
(1) Tao et al., Nat. Methods 2(8), 591-598 (2005)
(2) Clark et al., Genome Res. 13(10), 2265-2270 (2003)
(3) Plos ONE www.plosone.org, November 2010, Volume 5, Issue 11, e13932
(4) Catalog of mouse PLD4 polyclonal antibody against full length human PLD4 protein (Abnova, catalog No. H00122618-B01P)
(5) Dzionek, A. et al. J.Immunol. 165: 6037-6046, 2000
(6) J. Exp. Med.194:1823-1834, 2001
(7) Blood 2004 Jun 1;103/11:4201-4206. Epub 2003 Dec
(8) J. Immunol. 2003, 171:6466-6477
(9) Blood, 1 April 2005, Vol. 105, No. 7, pp. 2787-2792
(10) Nat. Methods 2(8), 591-598(2005)
본 발명의 개요
기술적 과제
본 발명으로써 해결하고자 하는 과제는 PLD4 에 결합하는 항체를 제공하고, pDC 를 검출, 동정 또는 단리하는 것이다. 나아가, 본 발명으로써 해결하고자 하는 과제는 pDC 의 활성을 조절하는 것이다.
본 발명자들은, PLD4 에 관한 연구를 통해서, PLD4 의 발현이 pDC, 특히 pDC 에서 활성기의 pDC 에 더해 휴지기의 pDC 에서 특이적으로 상승한다는 점을 확인했다. 결과적으로, 본 발명자들은 PLD4 항체의 제작 및 이의 작용 해명을 시험해 보았다.
생물 유래의 소량의 단백질을 인식하는 항체를 수득하기 위해, 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 단백질을 일반적으로 면역원으로서 이용한다. 본 발명자들은 이미 밝혀진 바 있는 PLD4 cDNA 의 염기 서열 및 이에 의해 인코딩된 아미노산 서열 (GenBank Accession No. NM_138790.2) 의 정보를 바탕으로 PLD4 의 발현을 시험했다 (Nat. Methods 2(8), 591-598 (2005)).
단백질의 항체를 수득하기 위해, 천연 단백질의 부분 아미노산 서열을 면역원으로서 이용하는 것이 자주 시도된다. 그러나, 항체가 세포 표면 상 분자를 인식하기 위해서는, 세포 표면 상에 에피토프로서 항체에 의해 인식된 부분을 구성하는 영역을 선택해야 하는 것이 필수적이다. 따라서, 단편 아미노산 서열을 면역원으로서 이용해 PLD4 에 특이적인 항체를 수득하는 것은 현실적이지 않다고 간주되어져 있다.
이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 특수한 면역원을 이용해 pDC 에 결합하는 항체를 수득할 수 있다는 점을 밝혀냈다. 더욱이, 본 발명자들은 이렇게 해서 수득한 항체가 인간 pDC 를 특이적으로 인식하고, 추가로 그의 활성을 조절하는 작용을 지닌다는 점을 확인해 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명은 후술되는 바와 같이 항-PLD4 항체, 이의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 하기와 같다:
(1) 포스포리파아제 D4 (PLD4) 단백질에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 영역을 포함하는 단편.
(2) 상기 (1) 에 있어서, 중쇄 가변 영역에서 CDR1 로서 서열 SYWMH (SEQ ID NO: 2), CDR2 로서 서열 DIYPGSDSTNYNEKFKS (SEQ ID NO: 3) 및 CDR3 으로서 서열 GGWLDAMDY (SEQ ID NO: 4) 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(3) 상기 (1) 에 있어서, 경쇄 가변 영역에서, CDR1 로서 서열 RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 5), CDR2 로서 서열 YTSRLHS (SEQ ID NO: 6), 및 CDR3 으로서 서열 QQGNTLPW (SEQ ID NO: 7) 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(4) 상기 (1) 에 있어서, 중쇄 가변 영역에서 CDR1로서 서열 SYWMH, CDR2 로서 서열 DIYPGSDSTNYNEKFKS 및 CDR3 으로서 서열 GGWLDAMDY, 및 경쇄 가변 영역에서 CDR1 로서 서열 RASQDISNYLN, CDR2 로서 서열 YTSRLHS, 및 CDR3 으로서 서열 QQGNTLPW 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(5) 상기 (1) 에 있어서, 중쇄 가변 영역에서 CDR1 으로서 서열 TYWMH (SEQ ID NO: 8), CDR2 로서 서열 AIYPGNSETSYNQKFKG (SEQ ID NO: 9), CDR3 으로서 서열 GYSDFDY (SEQ ID NO: 10) 를 갖는, 모노클로날 항체 (3B4 항체) 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(6) 상기 (1) 에 있어서, 경쇄 가변 영역에서 CDR1 로서 서열 HASQGIRSNIG (SEQ ID NO: 11), CDR2 로서 서열 HGTNLED (SEQ ID NO: 12), 및 CDR3 으로서 서열 VQYVQFP (SEQ ID NO: 13) 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원-결합 영역을 포함하는 단편.
(7) 상기 (1) 에 있어서, 중쇄 가변 영역에서 CDR1 로서 서열 TYWMH, CDR2 로서 서열 AIYPGNSETSYNQKFKG, 및 CDR3 으로서 서열 GYSDFDY, 및 경쇄 가변 영역에서 CDR1 으로서 서열 HASQGIRSNIG, CDR2 로서 서열 HGTNLED, 및 CDR3 으로서 서열 VQYVQFP 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원-결합 영역을 포함하는 단편.
(8) 상기 (1) 에 있어서, 중쇄 가변 영역에서 CDR1 로서 서열 DYNLH (SEQ ID NO: 14), CDR2 로서 서열 YIYPYNGNTGYNQKFKR (SEQ ID NO: 15), 및 CDR3 으로서 서열 GGIYDDYYDYAIDY (SEQ ID NO: 16) 을 갖는, 모노클로날 항체 (5B7 항체), 또는 그의 항원-결합 영역을 포함하는 단편.
(9) 상기 (1) 에 있어서, 경쇄 가변 영역에서 CDR1 로서 서열 RASENIYSHIA (SEQ ID NO: 17), CDR2 로서 서열 GATNLAH (SEQ ID NO: 18), 및 CDR3 으로서 서열 QHFWGTP (SEQ ID NO: 19) 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(10) 상기 (1) 에 있어서, 중쇄 가변 영역에서 CDR1 로서 서열 DYNLH, CDR2 로서 서열 YIYPYNGNTGYNQKFKR, 및 CDR3 으로서 서열 GGIYDDYYDYAIDY 을 갖고, 경쇄 가변 영역에서 CDR1 으로서 서열 RASENIYSHIA, CDR2 로서 서열 GATNLAH, 및 CDR3 으로서 서열 QHFWGTP 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 갖는 단편.
(11) 상기 (1) 에 있어서, 중쇄 가변 영역에서 CDR1 로서 서열 SYYLY (SEQ ID NO: 20), CDR2 로서 서열 LINPTNSDTIFNEKFKS (SEQ ID NO: 21), 및 CDR3 으로서 서열 EGGYGYGPFAY (SEQ ID NO: 22) 을 갖는, 모노클로날 항체 (8C11 항체), 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(12) 상기 (1) 에 있어서, 경쇄 가변 영역에서 CDR1 로서 서열 TSSQTLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 23), CDR2 로서 서열 KVSNRFS (SEQ ID NO: 24), 및 CDR3 으로서 서열 HSTHVP (SEQ ID NO: 25) 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(13) 상기 (1) 에 있어서, 중쇄 가변 영역에서 CDR1 으로서 서열 SYYLY, CDR2 로서 서열 LINPTNSDTIFNEKFKS, 및 CDR3 으로서 서열 EGGYGYGPFAY, 경쇄 가변 영역에서 CDR1 로서 서열 TSSQTLVHSNGNTYLH, CDR2 로서 서열 KVSNRFS, 및 CDR3 으로서 서열 HSTHVP 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(14) 상기 (1) 에 있어서, 중쇄 가변 영역에서 CDR1 로서 서열 SYGMS (SEQ ID NO: 26), CDR2 로서 서열 TISSGGSYIYYPESVKG (SEQ ID NO: 27), 및 CDR3 으로서 서열 LYGGRRGYGLDY (SEQ ID NO: 28) 을 갖는, 모노클로날 항체 (10C3 항체), 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(15) 상기 (1) 에 있어서, 경쇄 가변 영역에서 CDR1 로서 서열 RSSKSLLHSDGITYLY (SEQ ID NO: 29), CDR2 로서 서열 QMSNLAS (SEQ ID NO: 30), 및 CDR3 으로서 서열 AQNLEL (SEQ ID NO: 31) 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(16) 상기 (1) 에 있어서, 중쇄 가변 영역에서 CDR1 로서 서열 SYGMS, CDR2 로서 서열 TISSGGSYIYYPESVKG, 및 CDR3 으로서 서열 LYGGRRGYGLDY, 및 경쇄 가변 영역에서 CDR1 로서 서열 RSSKSLLHSDGITYLY, CDR2 로서 서열 QMSNLAS, 및 CDR3 으로서 서열 AQNLEL 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(17) 상기 (1) 에 있어서, 중쇄 가변 영역에서 CDR1 으로서 서열 SHYYWT (SEQ ID NO: 32), CDR2 로서 서열 YISYDGSNNYNPSLKN (SEQ ID NO: 33), 및 CDR3 으로서 서열 EGPLYYGNPYWYFDV (SEQ ID NO: 34) 을 갖는, 모노클로날 항체 (13D4 항체), 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(18) 상기 (1) 에 있어서, 경쇄 가변 영역에서 CDR1 으로서 서열 RASQDIDNYLN (SEQ ID NO: 35), CDR2 로서 서열 YTSRLHS (SEQ ID NO: 36), 및 CDR3 으로서 서열 QQFNTLP (SEQ ID NO: 37) 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(19) 상기 (1) 에 있어서, 중쇄 가변 영역에서 CDR1 으로서 서열 SHYYWT, CDR2 로서 서열 YISYDGSNNYNPSLKN, 및 CDR3 으로서 서열 EGPLYYGNPYWYFDV, 및 경쇄 가변 영역에서 CDR1 로서 서열 RASQDIDNYLN, CDR2 로서 서열 YTSRLHS, 및 CDR3 으로서 서열 QQFNTLP 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(20) 상기 (1) 에 있어서, 중쇄 가변 영역에서 CDR1 으로서 서열 SHYYWS (SEQ ID NO: 38), CDR2 로서 서열 YISYDGSNNYNPSLKN (SEQ ID NO: 39), 및 CDR3 으로서 서열 EGPLYYGNPYWYFDV (SEQ ID NO: 40) 을 갖는, 모노클로날 항체 (13H11), 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(21) 상기 (1) 에 있어서, 경쇄 가변 영역에서 CDR1 으로서 서열 RASQDIDNYLN (SEQ ID NO: 41), CDR2 로서 서열 YTSRLHS (SEQ ID NO: 42), 및 CDR3 으로서 서열 QQFNTLP (SEQ ID NO: 43) 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(22) 상기 (1) 에 있어서, 중쇄 가변 영역에서 CDR1 으로서 서열 SHYYWS, CDR2 로서 서열 YISYDGSNNYNPSLKN, 및 CDR3 으로서 서열 EGPLYYGNPYWYFDV, 및 경쇄 가변 영역에서 CDR1 으로서 서열 RASQDIDNYLN, CDR2 로서 서열 YTSRLHS, 및 CDR3 으로서 서열 QQFNTLP 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(23) 수탁 번호: NITE BP-1211, NITE BP-1212, NITE BP-1213, 및 NITE BP-1214 로서 기탁된 하이브리도마 mp5B7, mp7B4, mp13D4, 및 mp13H11 중 어느 하나에 의해 생성된 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(24) 상기 (1) 또는 (2) 에 기술된 바와 같은 모노클로날 항체들 중 어느 하나를 생성하는 하이브리도마.
(25) 수탁 번호: NITE BP-1211, NITE BP-1212, NITE BP-1213 또는 NITE BP-1214 로서 기탁된 하이브리도마 mp5B7, mp7B4, mp13D4 또는 mp13H11.
(26) 상기 (25) 에 기재된 하이브리도마를 배양하고 그 배양물로부터 모노클로날 항체를 수집하는 프로세스를 포함하는 모노클로날 항체의 제조 방법.
(27) 하기 프로세스를 포함하는, PLD4 에 결합하는 모노클로날 항체를 생성하는 세포의 제조 방법:
1) PLD4 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩 (encoding) 하는 재조합 PLD4-Ig 융합 단백질을 면역 동물에 투여하는 프로세스, 및
2) 면역 동물의 항체-생성 세포로부터 PLD4 에 결합하는 항체를 생성하는 항체-생성 세포를 선택하는 프로세스.
(28) 상기 (27) 에 있어서, PLD4 를 발현하는 세포가 PLD4 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 외래성 폴리뉴클레오티드를 발현 가능한 방식으로 보유하는 세포인 방법.
(29) 상기 (28) 에 있어서, 세포가 동물 세포인 방법.
(30) 상기 (29) 에 있어서, 세포가 인간-유래 세포인 방법.
(31) 상기 (30) 에 있어서, 인간-유래 세포가 HEK-293T 세포인 방법.
(32) 상기 (27) 내지 (31) 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 항체-생성 세포를 클로닝하는 프로세스를 점증적으로 (incrementally) 포함하는 방법.
(33) 상기 (29) 에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득된 항체-생성 세포를 배양하고, 그 배양물로부터 모노클로날 항체를 수집하는 프로세스를 포함하는, PLD4 세포외 도메인에 결합하는 모노클로날 항체의 제조 방법.
(34) 하기의 프로세스에 의해 수득될 수 있는, PLD4 를 인식하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편:
1) PLD4 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 재조합 PLD4-Ig 융합 단백질을 면역 동물에 투여하는 프로세스,
2) 면역 동물의 항체-생성 세포로부터 PLD4 에 결합하는 항체를 생성하는 항체-생성 세포를 선택하는 프로세스, 및
3) 프로세스 2) 에서 선택된 항체-생성 세포를 배양하고, 그 배양물로부터 PLD4 를 인식하는 항체를 수집하는 프로세스.
(35) (a) PLD4 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 외래적으로 발현가능한 방식으로 보유하는 동물 세포, 또는 그의 세포막 분획을 포함하는, PLD4 에 결합하는 항체를 제조하기 위한 면역원.
(36) 상기 (35) 에 있어서, 동물 세포가 인간-유래 세포인 면역원.
(37) PLD4 세포외 도메인에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 테스트 세포와 접촉시키고, 그 세포에 결합하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 검출하는 프로세스를 포함하는, 플라스마사이토이드 수지상 세포의 검출 방법.
(38) PLD4 세포외 도메인에 결합하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 포함하는 플라스마사이토이드 수지상 세포의 검출용 시약.
(39) 후술되는 성분들 중 어느 하나를 플라스마사이토이드 수지상 세포와 접촉시키는 프로세스를 포함하는, 플라스마사이토이드 수지상 세포의 활성을 억제하는 방법:
(a) PLD4 에 결합하고, 플라스마사이토이드 수지상 세포의 활성을 억제하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편, 및
(b) 모노클로날 항체 (a) 의 상보성 결정 영역이 이식된 면역글로불린, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(40) 후술되는 성분들 중 어느 하나를 생물에 투여하는 프로세스를 포함하는, 생물 내 플라스마사이토이드 수지상 세포의 활성을 억제하는 방법:
(a) PLD4 에 결합하고, 플라스마사이토이드 수지상 세포의 활성을 억제하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편, 및
(b) 모노클로날 항체 (a) 의 상보성 결정 영역이 이식된 면역글로불린, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(41) 상기 (39) 또는 (40) 에 있어서, 플라스마사이토이드 수지상 세포의 활성이 인터페론 생성 활성 및 인터페론 생성 세포의 생존 중 어느 하나이든가 또는 이들 양자 모두인 방법.
(42) 활성 성분으로서 후술되는 성분들 중 어느 하나를 포함하는 플라스마사이토이드 수지상 세포의 활성 억제제:
(a) PLD4 에 결합하고, 플라스마사이토이드 수지상 세포의 활성을 억제하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편, 및
(b) 모노클로날 항체 (a) 의 상보성 결정 영역이 이식된 면역글로불린, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
(43) 상기 (42) 에 있어서, 플라스마사이토이드 수지상 세포의 활성이 인터페론 생성 활성 및 인터페론 생성 세포의 생존 중 어느 하나이든가 또는 이들 양자 모두인 인터페론 생성 세포의 활성 억제제.
본 발명은 PD4 를 특이적으로 인식하는 항체, 그 항체의 제조에 유용한 면역성, 및 면역원을 이용한 항-PDL4 항체의 제조 방법을 제공한다. PLD4 는 PLD4 패밀리에 속하는 막 단백질이다. 본 발명자들은 PLD4 를 특이적으로 인식하는 항체를 용이하게 수득할 수 있다는 점을 밝혔다. 본 발명에 의해 수득될 수 있는 항-PLD4 항체는 다른 PLD 패밀리를 발현하는 세포와 인간 pDC 를 구별하는, 높은 특이성을 지닌 항체이다.
바람직한 측면에서, 본 발명에 의해 제공된 항-PLD4 항체는 인간 pDC 에 결합한다. 나아가, 본 발명의 항체는 인간 pDC 를 특이적으로 인식한다. 따라서, 본 발의 항체는 pDC 의 검출 또는 단리에 있어서 유용하다. pDC 는 대부분의 타입 1 IFN 을 생성하는 세포이다. 따라서, 이러한 검출 또는 단리는 자가면역 질환과 같은 pDC 이 관여하는 질환의 진단 또는 연구에 있어서 중요하다.
나아가, 바람직한 측면에서, 본 발명에 의해 제공된 항-PLD4 항체는 인간 pDC 활성을 조절하는 작용을 지닌다. 따라서, 본 발명의 항-PLD4 항체는 pDC 활성 억제에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체를 이용한 pDC 활성 억제를 이용하는 경우, IFNα 발현이 상승된 자가면역 질환의 환자에 있어서 치료 효과를 기대할 수 있다.
pDC 는 다량의 IFN 을 소수의 세포에서 생성한다. IFN 의 중화에서, IFN 분자수에 따른 항체가 필수적이다. 그러나, 본 발명에 있어서, 생산 세포의 활성은 직접 억제된다. 그 결과로서, 항-IFN 항체의 중화와 비교시 보다 소량의 항체에서 강력한 IFN 억제 효과를 기대할 수 있다. 더욱이, IFN 이 지속적으로 생성되는 경우, IFN 항체에 의한 중화는 일시적인 억제로서 머무를 것으로 예상된다. 그러나, 본 발명에 있어서, pDC 활성이 억제되고, 이로부터, IFN-생성 억제 효과를 장기간에 걸쳐 기대할 수 있다.
도 1 은 인간 PLD4 (C14orfl75) 단백질의 아미노산 서열 (506 잔기) 을 나타내는 도해이다. N 말단으로부터 31 내지 53 잔기가 트랜스멤브레인 영역을 위한 예측 시스템인 "SOSUI program (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)" 을 사용하여 분석한 바와 같이 트랜스멤브레인 도메인이라고 생각된다. 54 내지 406 잔기는 2 개의 포스포디에스테라아제 모티프를 포함하고, 이 단백질이 타입 II 트랜스멤브레인 단백질인 것으로 예상된다;
도 2 는 인간 PLD4 단백질의 예상되는 구조를 나타내는 모식도이다. 상기 구조는 2 개의 HKD (HxKxxxxD) 모티프를 아미노산 506 잔기에서 가지며, 트레오닌 472 잔기는 인산화 부위일 가능성이 있다;
도 3 은 이종 동물에서 상동성 분자 종과의 인간 PLD4 단백질의 상동성을 나타내는 그래프이다. PLD4 단백질은 마우스에서 인간에 이르기까지의 진화 과정에서 보존되어 있다.
도 4 는 인간 PLD4 단백질 패밀리 (이원성; paralogous) 와의 상동성을 나타내는 그래프이다;
도 5 는 인간 면역을 담당하는 세포에 있어서 PLD4 유전자의 인간 pDC-특이적 발현을 나타내는 그래프이다. PLD4 유전자의 발현은 휴지기의 pDC 에서 높고, CD19 + B 세포에서는 그 발현이 낮다;
도 6 은 인간 PLD4 mRNA 의 조직 발현 패턴을 나타내는 그래프이다. 비장 및 말초 혈액 백혈구에서 발현은 높다;
도 7 은 재조합 인간 PLD4-Ig 융합 단백질의 구조를 나타내는 모식도이다. 인간 PLD4 세포외 도메인 (56-506 아미노산) 에 해당하는 cDNA 단편을 PCR 로써 증폭시켰다. 상기 단편을 N 말단에 마우스 Igκ 리더 분절 및 마우스 IgG2a 중쇄 불변 Fc 영역 (힌지 + CH2 + CH3) 을 포함하는 N-Flag pcDNA3.1 발현 벡터의 BamHI-EcoRI 클로닝 부위에 삽입했다. 293F 세포를 플라스미드에 일시적으로 트랜스펙션하고, 배양 상청액을 수집했다;
도 8 은 인간 PLD4 에 대한 결합 특이성을 나타내는 FACS 분석도이다. mp11G9.6 및 ch11G9.6 항체는 인간 PLD4 를 특이적으로 인식했지만, 인간 PLD3-293T 또는 PLD5-293T 트랜스펙션체는 인식하지 않았다;
도 9 는 사이노몰거스 (cynomolgus) 원숭이 PLD4 와 교차 반응성을 나타내는 FACS 분석도이다. mp11G9.6 및 ch11G9.6 항체는 293T 트랜스펙션체 상 사이노몰거스 원숭이 PLD4 를 인식할 수 있었다;
도 10 은 인간 PBMC 의 mp11G9.6 항체에서 염색을 나타내는 FACS 측정도이다. mp11G9.6 항체는 인간 PBMC 에서 BDCA2 + pDC 를 강하게 인식했다;
도 11 은 CAL-1 세포의 정제된 항-PLD4 항체에서 염색을 나타내는 FACS 분석도이다;
도 12 는 인간 PLD4-CT125 안정성 세포 균주의 항-PLD4 항체에서 염색을 나타내는 FACS 분석도이다;
도 13 은 인간 PBMC 의 항-PLD4 항체에서 염색을 나타내는 FACS 분석도이다. 항-PLD4 항체 모두는 인간 PBMC 에서 BDCA2 + pDC 를 인식할 수 있었다;
도 14 는 인간 PLD, 사이노몰거스 원숭이 PLD4, 레서스 (rhesus) 원숭이 PLD4, 및 마우스 PLD4 의 단백질의 다중 정렬 및 상동성을 나타내는 도이다;
도 15 는 인간 PLD4-293T 세포 내에 Flag 태그된 사이노몰거스 원숭이 PLD4 발현 벡터를 일과성 유전자 도입한 항-PLD4 항체에서의 염색을 나타내는 FACS 분석도이다. 사이노몰거스 원숭이 PLD4 단백질의 세포 표면 발현을 항-Flag 항체에서 확인했다;
도 16 은 사이노몰거스 원숭이 PLD4-CT125 세포의 항-PLD4 항체에서 염색을 나타내는 FACS 측정도이다. 항-PLD4 항체들 중에서, 7 종 (3B4, 5B7, 7B4, 13D4, 13H11, 14Cl, 및 11G9.6) 의 항체가 사이노몰거스 원숭이 PLD4-CT125 안정성 트랜스펙션체에 결합할 수 있다;
도 17 는 인간 PLD4-293T 세포 내로 Flag 태그된 레서스 원숭이 PLD4 발현 벡터를 일과성 유전자 도입한 항-PLD4 항체에서 염색을 나타내는 FACS 분석도이다. 레서스 원숭이 PLD4 단백질의 세포 표면 발현을 항-Flag 항체에서 확인했다;
도 18a 및 도 18b 는 레서스 원숭이 PBMC 의 항-PLD4 항체에서 염색을 나타내는 FACS 분석도이다. 항-PLD4 항체들 중, 5 종 (5B7, 7B4, 13D4, 13H11, 및 14C1) 항체는 레서스 원숭이 PBMC 에서 사이노몰거스 원숭이의 pDC 세포군 (Lineage-CD123 + HLA-DR+) 에 특이적으로 결합하였다;
도 19 는 인간 PLD4-CT125 안정성 세포 균주에 대한 항-PLD4 항체의 분해 상수 몰 농도 (nM 단위, Kd 값) 를 나타내는 그래프이다.
도 20 은 10 종류의 항-PLD4 항체의 CDC 활성을 나타내는 그래프이다. 표적 세포: 인간 PLD4-CT125 (마우스 2B4 T 세포 림프구) 안정성 트랜스펙션체 항체 농도: 10 ㎍/mL 효과기 (effector): 1% 미성숙 토끼 보체;
도 21 은 항-PLD4 항체 (mp11G9.6 항체 및 ch11G9.6 항체) 의 CDC 활성을 나타내는 그래프이다. 표적 세포: 인간 PLD4-CT125 (마우스 2B4 T 세포 림프구) 안정성 트랜스펙션체 항체 농도: 0.1 ㎍/mL 내지 30 ㎍/mL 효과기: 1% 미성숙 토끼 보체;
도 22 는 항-PLD4 키메라 항체의 ADCC 활성을 나타내는 그래프이다. 표적 세포: 인간 PLD4-CHO 안정성 트랜스펙션체 항체 농도: 10 ㎍/mL;
도 23 은 3 명의 건강한 개체에게서 단리된 인간 PBMC 에서 항-PLD4 키메라 항체 (ch11G9.6) 로의 처리에 의한 IFN-α 분비 저해를 ELISA 로 측정한 그래프이고; 및
도 24 는 항-PLD4 키메라 항체로 처리 후 인간 pDC 손실을 나타내는 도이다.
도 25 는 인간 1차 pDC 에 대한 키메라 항-PLD4 Abs 를 이용한 ADCC 검정 결과이다.
도 26 은 키메라 항-PLD4 Abs 의 존재 하 CpG2216 에 의한 PBMS 로부터의 IFNα 생성이다.
본 발명자들은 PLD4 이 휴지기의 플라스마사이토이드 수지상 세포에서 (휴지 pDC) mRNA 수준 및 단백질 수준으로 특이적으로 발현된 분자인 점을 알아냈다. PLD4 를 인식하는 항체의 제조 방법은 확립되어 있지 않다.
마우스 PLD4 는 생후 초기의 소뇌 또는 뇌들보에서 발달기의 아메바양 (활성화 상태) 미세아교세포에서 발현되는 분자이다. 그러나, 인간 PLD4 의 발현은 지금까지 전혀 알려져 있지 않다. 특히, 면역계에 있어서 인간 PLD4 의 발현, 세포내 국소화, 구조, 기능 등은 지금까지 보고된 바 없다. 본 발명에 의해 지금까지 세포질 내로만 발현되는 것으로 생각된 인간 PLD4 가 타입 II 트랜스멤브레인 단백질로서 인간 플라스마사이토이드 수지상 세포 (pDC) 에 발현된 세포 표면 마커인 점이 확인되었다. 따라서, PLD4 항체가 pDC 에 결합하는 것이 가능하게 되고, PLD4 항체가 B 세포 및 pDC 세포의 기능 조절을 목적으로 하는 치료용 항체의 분자 타겟으로서 유용하다는 것이 증명되었다.
본 발명자들은 PLD4 가 인간 pDC 에서 특이적으로 발현되는 점을 유전자 발현 분석에 의해 확인했다. PLD4 를 다른 분자와 면역학적으로 구별할 수 있는 항체가 수득되면, pDC 연구에 유용할 것이라고 여겨졌다. 그러나, PLD4 를 포함한 PLD 패밀리에서 서로 구조가 매우 유사한 다수의 분자가 존재한다. PLD4 인 PLD 를 포함해, PLD1, PLD2, PLD3, 및 PLD5 와 같은 분자는 특히 상동성이 높은 아미노산 서열을 포함한다 (도 4). 따라서, PLD4 (또는 세포외 도메인) 을 구성하는 아미노산 서열 (부분 서열) 을 사용한 펩티드의 면역원을 이용해 상기 분자들을 서로 구별하는 항체를 수득하는 것이 곤란하다고 여겨졌다. 결과적으로, 본 발명자들은 PLD4 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 재조합 PLD4-Ig 융합 단백질을 면역원으로서 이용해 PLD4 에 대한 항체의 획득을 시도했다.
본 발명자들은 PLD4 를 인식하는 항체를 획득하기 위해 연구를 거듭하고, 목적된 항체를 재조합 PLD4-Ig 융합 단백질을 면역원으로서 이용해 수득하여 본 발명을 완성했다. 즉, 본 발명은 PLD4 세포외 도메인에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, PLD4 는 인간 pDC 에서 발현된 천연 분자, 또는 인간 pDC 에서 발현된 PLD4 과 면역학적으로 동등한 분자이다. 본 발명에서, PLD4 와 항체의 결합은 예를 들어 후술되는 바와 같이 확인할 수 있다.
* 인간 세포와의 반응성에 근거하는 확인:
본 발명자들에 의해 수득된 발견에 따르면, PLD4 는 인간 pDC 에서 특이적 발현을 보이는 사실로부터 pDC 마커로서 이용될 수 있다.
이러한 PLD4 의 발현 프로파일에 근거하여, pDC 의 적어도 일부의 서브세트와의 결합 활성이 본 발명에 있어서 PLD4 와 결합하는 항체의 중요한 특징들 중 하나이다. 일부 세포가 pDC 인 점은 각 세포 패밀리에서 고유한 세포 표면 마커에 의해 확인할 수 있다. 예를 들어, 목적된 세포와의 결합은, 세포 표면 마커와 결합하는 항체와 결합 활성을 확인해야 할 항체의 이중 염색에 의해 확인된다. 다시 말해, 본 발명에서 pDC 는 예를 들어 BDCA1 를 발현하는 세포를 포함한다.
* PLD4 유전자를 발현하는 형질전환된 세포와의 반응성을 근거로 한 확인:
본 발명자들은 특정한 조건 하에서 PLD4 유전자가 발현되는 경우 인간 pDC 에서 발현된 PLD4 의 면역학적 특징이 재구성되는 것을 확인했다. 따라서, PLD4 와의 반응성은 또한 PLD4 를 인코딩하는 유전자를 인위적으로 도입한 세포에 대한 항체의 반응성에 근거해 확인할 수도 있다. 다시 말해, 본 발명은 PLD4 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열을 세포외 도메인으로서 포함하는 분자와 결합하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편에 관한 것이다. 한편, 세포외 도메인은 SEQ ID NO 1 로써 나타낸 아미노산 서열의 SEQ ID NO 1 의 N 말단에서 (도 1) 54 내지 506 에 상당하는 아미노산 서열에 의해 구성된다.
예를 들어, PLD4 를 인코딩하는 DNA 를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 세포에서, 인간 pDC 에서 발현된 PLD4 의 면역학적 특징은 유지된다. 따라서, PLD4 를 발현하는 형질전환된 세포가 본 발명에 있어서 PLD4 의 세포외 도메인에 대한 항체의 결합 특성을 확인하기 위한 세포로서 바람직하다. 형질전환된 세포에 의해 항체의 반응성을 본 발명에서 확인하는 경우, 비(非)형질전환된 세포가 바람직하게 대조군으로서 사용된다.
다음으로, 본 발명에 있어서, PLD4 에 결합하는 항체는 PLD4 이외의 PLD 패밀리를 발현하는 것으로 공지된 세포 패밀리와의 교차성을 보이는 항체일 수 있거나, 또는 이러한 교차성을 보이지 않는 항체일 수 있다. 교차성을 보이지 않는 항체가 본 발명에 있어서 PLD4 에 결합하는 항체로서 바람직하다. 구체적으로, 본 발명에서 PLD4 에 결합하는 항체는, pDC 에 대한 결합을 확인한 조건과 동일한 조건 하에서, PLD4 이외의 PLD 패밀리를 발현하고 있는 것으로 공지된 세포 패밀리와의 결합을 확인할 수 없는 항체인 것이 바람직하다.
즉, 본 발명에 있어서 PLD4 세포외 도메인에 결합하는 모노클로날 항체는 바람직하게 후술된 면역학적 특징을 가진 모노클로날 항체를 포함한다.
a) 인간 pDC 와의 결합,
b) 인간 pDC 와의 결합을 허용하는 조건 하에서, 단핵구, 대식세포, CD34 양성 세포, 및 이들 세포로부터 유래된 수지상 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1 또는 복수종의 세포와의 결합을 확인할 수 없음.
특히, 본 발명의 모노클로날 항체는 바람직하게, 인간 pDC 와의 결합을 허용하는 조건 하에서, 단핵구, 대식세포, B 세포, CD34 양성세포 및 이들 세포로부터 유래된 수지상 세포와의 결합을 확인할 수 없는 항체이다.
대안적으로, 본 발명에서 PLD4 세포외 도메인과 결합하는 모노클로날 항체는 후술된 면역학적 특징을 가진 모노클로날 항체를 포함하는 것이 바람직하다.
c) PLD4 를 인코딩하는 DNA 를 발현가능하게 보유한 발현 벡터로 형질전환시킨 형질전환된 세포와 결합함,
d) 형질전환된 세포 c) 와 결합을 허용하는 조건 하, 형질전환 이전에 숙주 세포와의 결합을 확인할 수 없음.
항-PLD4 모노클로날 항체는 본 발명에서 PLD 패밀리의 다른 분자와 교차하지 않는다는 점이 각 PLD 패밀리를 강제 발현시킨 세포를 사용해서 확인할 수 있다. 다시 말해, 강제 발현은 적절한 숙주 세포 내로 각 PLD 패밀리의 아미노산 서열을 인코딩하는 cDNA 를 도입함으로써 수행된다. 수득된 형질전환된 세포는, 교차 특성을 확인해야 할 항-PLD4 모노클로날과 접촉된다. PLD4 이외의 PLD 패밀리 분자를 발현하는 세포와의 결합이 나타나지 않는 경우, 그 항체가 PLD4 를 다른 PLD 패밀리 분자와 면역학적으로 구별할 수 있다는 점을 확인할 수 있다. 예를 들어, 후술되는 실시예에 있어서 대부분의 본 발명에 의해 수득된 항-PLD4 모노클로날 항체가 특히 PLD4 와 고 상동성을 가진 PLD3 및 PLD5, 및 나아가 PLD1 및 PLD2 와도 교차하지 않는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명에서 모노클로날 항체는 바람직하게, PLD4 와 결합하나, 동일 조건 하에서 PLD3, PLD5, PLD1, 또는 PLD2 과의 결합에 대해서는 검출할 수 없는 모노클로날 항체다. 이들 PLD 패밀리 분자를 PLD4 와 면역학적으로 구별할 수 있는 항체를 이용하는 경우, PLD4 발현의 변화를 특이적으로 검출할 수 있다.
결합 활성에 대해 확인해야 할 모노클로날 항체와 각 종의 세포와의 결합을, 예를 들어 유세포분석 원리로 확인할 수 있다. 유세포분석 원리에 의한 항체의 반응성을 확인하기 위해, 검출가능한 시그널을 생성하는 분자 또는 원자단으로 항체를 표지하는 것이 유리하다. 일반적으로, 형광 표지 또는 발광 표지가 이용된다. 형광-표지된 항체의 세포와의 결합을 유세포분석의 원리로써 분석하기 위해, 형광-활성화 세포 분류기 (fluorescence-activated cell sorter; FACS) 를 이용할 수 있다. FACS 를 이용함으로써, 항체의 세포와의 다중 결합을 효율적으로 확인할 수 있다.
구체적으로, 예를 들어 pDC 를 동정할 수 있는 것으로 사전에 공지되어 있는 항체 A 및 pDC 와의 결합 특성을 분석해야 할 항체 B 를 동시에 pDC 포함 세포 패밀리와 반응시킨다. 항체 A 및 항체 B 는 서로 구별할 수 있는 형광 시그널로 표지한다. 양자의 시그널을 동일 세포 패밀리로부터 검출하는 경우, 이러한 항체가 동일 세포 패밀리에 결합한다는 점을 확인할 수 있다. 즉, 항체 A 및 항체 B 는 동일한 결합 특성을 갖는다는 점을 발견했다. 항체 A 및 항체 B 가 상이한 세포 패밀리와 결합하는 경우, 이들의 결합 특성은 서로 다르다는 점은 자명하다.
본 발명에 있어서 바람직한 모노클로날 항체의 예는 예를 들어 하이브리도마 mp5B7, mp7B4, mp13D4, 및 mp13H11 에 의해 생성된 모노클로날 항체를 포함한다.
하이브리도마 mp5B7, mp7B4, mp13D4 및 mp13H11 은 2012 년 1 월 27 일에 National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganisms Depositary 에서 수탁 번호: NITE BP-1211, NITE BP-1212, NITE BP-1213, 및 NITE BP-1214 로서 기탁되었다. 상기 기탁을 명시하는 내용을 후술한다.
(1) 기탁 기관의 명칭 및 주소
명칭: National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Advanced Industrial Science and Technology Patent Microorganisms Depositary
주소 : 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818 JAPAN
(2) 기탁일: 2012 년 1 월 27 일
(3) 수탁 번호 NITE BP-1211 (하이브리도마 mp5B7)
NITE BP-1212 (하이브리도마 mp7B4)
NITE BP-1213 (하이브리도마 mp13D4)
NITE BP-1214 (하이브리도마 mp13H11)
본 발명의 모노클로날 항체는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편일 수 있다. 예를 들어, IgG 효소 소화 (digestion) 에 의해 생성된 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편이 본 발명에서 항체로서 이용될 수 있다. 구체적으로, 파파인 또는 펩신으로의 소화에 의해, 항체 단편, 예컨대 Fab 또는 F(ab')2 가 수득될 수 있다. 또한, 일부 모노클로날 항체의 상보성 결정 영역 (CDR) 이 이식되어 있는 가변 영역을 포함하는 면역글로불린 단편이 항원 결합 영역을 포함하는 단편에 포함된다. 이들 항체 단편은 항원과의 결합 친화성을 갖는 항체 분자로서 이용될 수 있다는 점이 널리 공지되어 있다. 대안적으로, 유전자 재조합에 의해 구축된 항체가 항원 결합에 필수적인 활성을 유지하고 있는 한 사용될 수 있다. 유전자 재조합에 의해 구축된 항체의 예에는, 예를 들어 키메라 항체, CDR 이식 항체, 단쇄 Fv, 디아바디 (디아바디들), 선형 항체 및 항체 단편에 의해 형성된 다가특이성 항체 등이 포함된다. 모노클로날 항체 또는 이를 생성하는 항체-생성 세포를 바탕으로 상기 항체를 수득하는 방법이 공지되어 있다.
본 발명의 모노클로날 항체는 재조합 PLD4-Ig 융합 단백질, 또는 인간 PLD4 를 발현하는 형질전환된 세포를 면역원으로서 이용함으로써 수득될 수 있다. 즉, 본 발명은 하기의 프로세스를 포함하는, PLD4 세포외 도메인에 결합하는 모노클로날 항체를 생성하는 세포의 제조 방법에 관한 것이다.
(1) PLD4 세포외 도메인을 포함하는 외래성 단백질을 면역 동물에 투여하는 프로세스, 및
(2) 면역 동물의 항체-생성 세포로부터, PLD4 에 결합하는 항체를 ㅅ행성하는 항체-생성 세포를 선택하는 프로세스.
이렇게 하여 수득된 항체-생성 세포 또는 항체-생성 세포의 불멸화 (immortalized) 세포를 배양할 수 있고, 목적의 모노클로날 항체를 상기 배양물로부터 수집할 수 있다. 각종 방법이 항체-생성 세포를 불멸화하는 방법으로서 공지되어 있다.
본 발명에서 면역원으로서 이용된 형질전환된 세포는, 예를 들어 하기의 PLD4 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 외래성의 폴리뉴클레오티드 (a) 를 발현가능하게 보유한 세포를 제조함으로써 수득될 수 있다.
본 발명에서 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 인위적으로 도입된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 인간 세포를 세포로서 이용하는 경우에, 인간 유전자를 인간 세포에 도입한다. 이러한 조합에 있어서, 인위적으로 도입된 폴리뉴클레오티드가 또한 외래성 폴리뉴클레오티드로서 지칭된다. 따라서, PLD4 의 이소성 (ectopic) 발현이 외래성 폴리뉴클레오티드 발현에 포함된다.
본 발명에 있어서 PLD4 세포외 도메인은 SEQ ID NO 1 에 기재된 아미노산 서열 중 세포외 도메인에 상당하는 54-506 위치의 아미노산 서열을 지칭한다. 예를 들어, N 말단측에서 하기의 순서대로 각 영역을 포함하는 아미노산 서열이 본 발명에서 PLD4 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 서열로서 바람직하다.
[세포내 영역 + 트랜스멤브레인 도메인 + 세포외 도메인]
대안적으로, 후술되는 바와 같이 세포내 영역이 부분적으로 결여된 아미노산 서열이 또한 본 발명에서 PLD4 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 서열에 포함된다.
[부분 세포내 영역 + 트랜스멤브레인 도메인 + 세포외 도메인]
나아가, 후술되는 세포내 영역이 결여된 구조가 본 발명에서 PLD4 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 서열에 포함된다.
[트랜스멤브레인 도메인 + 세포외 도메인]
상술된 구조에서 세포외 도메인 이외 영역은 SEQ ID NO 1 로써 나타낸 아미노산 서열로부터 선택된 서열일 수 있거나, 또는 또 다른 상동성 아미노산 서열과의 조합일 수 있다. 예를 들어, 시그널 서열, 트랜스멤브레인 도메인 및 세포내 영역을 구성하는 아미노산 서열이 PLD4 이외의 PLD 패밀리 분자의 아미노산 서열로서 이용될 수 있다. 대안적으로, 인간 이외의 기타 종의 PLD 패밀리의 아미노산 서열이 또한 조합될 수 있다. 나아가, 세포외 도메인 이외의 영역을 구성하는 아미노산 서열은 각 영역의 기능을 유지할 수 있는 범위 내에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 게다가, 기타 영역이 각 영역들 사이에 개재될 수 있다. 예를 들어, 시그널 서열과 세포외 도메인 사이에, 에피토프 태그, 예컨대 FLAG 가 삽입될 수도 있다. 특히, 시그널 서열은 단백질 번역 후 세포막 표면에 이송되는 단계에서 프로세싱에 적용되어 제거되는 영역이다. 따라서, 번역된 단백질의 세포막의 통과를 유도하는 임의의 아미노산 서열을, 시그널 서열로서 이용할 수 있다. 보다 구체적으로, PLD4 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO 1) 이 PLD4 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 서열로서 바람직하다.
따라서, 본 발명에서 상술된 폴리뉴클레오티드 (a) 는 상기 언급된 구조 [세포내 영역 + 트랜스멤브레인 도메인 + 세포외 도메인] 를 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 임의의 염기 서열일 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO 1 의 아미노산 서열은 SEQ ID NO 44 에 기재된 cDNA 염기 서열에 의해 인코딩된다.
본 발명에서 면역원으로서 재조합 PLD4-Ig 융합 단백질은, 상술된 폴리뉴클레오티드를 발현 가능하게 보유하는 발현 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입함으로써 수득할 수 있다. 재조합 PLD4-Ig 융합 단백질의 cDNA 염기 서열은 SEQ ID NO 125 로써 나타내고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO 126 로써 나타낸다.
본 발명에서 숙주 세포는 바람직하게 포유동물 세포이다. 구체적으로, 인간, 원숭이, 마우스 또는 래트에서 유래된 세포가 숙주 세포로서 이용될 수 있다. 특히, 인간-유래 세포가 숙주 세포로서 바라직하다. 예를 들어, HEK-293T 세포가 본 발명에서 숙주 세포로서 바람직하게 이용될 수 있는 인간 배아-유래 신장 세포 균주이다. HEK-293T 세포는 ATCC CRL-11268 로서 입수 가능하다. 이에 추가적으로, 면역 동물에서 유래된 세포를 숙주 세포로서 이용할 수 있다. 면역 동물에서 유래된 세포를 면역원으로서 이용하는 경우, 숙주 세포에 대한 면역 응답이 적다. 따라서, 외래적으로 발현되는 PLD4 세포외 도메인에 대한 항체를 효율적으로 수득할 수 있다. 그에 따라, 예를 들어 마우스를 면역 동물로서 이용하는 경우, 마우스 유래 세포가 숙주 세포로서 이용될 수 있다.
상술된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 발현을 유도할 수 있는 벡터에 로딩되어 세포를 형질전환할 수 있다. 포유동물 세포에서 발현을 유도할 수 있는 시판중인 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, pCMV-Script(R) 벡터, pSG5 벡터 (Stratagene 제작), pcDNA3.1 (Invitrogen 제작), pMXs-IP 레트로바이러스 벡터 (Cell BioLabs 제작), 등과 같은 발현 벡터가 본 발명에서 사용될 수 있다.
이렇게 수득된 형질전환된 세포가, 필요한 경우 아쥬번트 (adjuvant) 와 같은 추가 성분과 함께 면역 동물에 투여된다. 아쥬번트로서, 프로인트 완전 아쥬번트 등을 이용할 수 있다. 마우스를 면역 동물로서 이용하는 경우에, 정제된 재조합 PLD4-Ig 융합 단백질을 BALB/c 마우스에 투여한다. 아쥬번트로서, 프로인트 완전 및 불완전 아쥬번트 (SIGMA 제작) 을 이용하고, 처음에는 200 ㎍/마우스, 및 2 회부터 4 회째까지는 50 ㎍/마우스 투여했다. 일반적으로, 면역원은 항체 역가가 상승할 때까지 간격을 두고 복수회 투여된다. 예를 들어, 단기간의 면역법의 경우, 형질전환된 세포를 2 내지 4 일 간격으로 보다 구체적으로는 3 일 간격으로 투여하고 2 내지 3 회 투여 후, 항체-생성 세포를 수집할 수 있다. 추가적으로, 항체-생성 세포가 또한 주 1 회 정도의 간격으로 5 내지 6 회 투여 후에 수집될 수도 있다.
본 발명에 있어서 모노클로날 항체를 수득하기 위해, 수집된 항체-생성 세포를 클로닝한다. 클로닝을 위해, 항체-생성 세포를 불멸화하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 하이브리도마법으로 나타낸 세포 융합 방법 또는 Epstein-Barr 바이러스 (EBV) 에 의한 형질전환을, 항체-생성 세포를 불멸화하기 위한 방법으로서 이용할 수 있다.
항체-생성 세포는 1 개의 세포 당 1 종류의 항체를 생성한다. 그에 따라, 하나의 세포로부터 유래된 세포 집단이 확립될 수 있는 경우 (즉, 클로닝), 모노클로날 항체가 수득될 수 있다. 하이브리도마 방법은 항체-생성 세포를 적절한 세포 균주와 융합시켜 불멸화한다음 클로닝한 방법을 지칭한다. 불멸화된 항체-생성 세포는 한계희석법과 같은 방법에 의해 클로닝될 수 있다. 하이브리도마 방법에서 유용한 다수의 세포 균주가 공지되어 있다. 이들 세포 균주는 림프구-기재 세포의 불멸화 효능에 있어서 우수하고, 세포 융합에 성공한 세포의 선택에 필수적인 각종 유전자 마커를 갖는다. 나아가, 항체-생성 세포의 획득을 목적으로 하는 경우에, 항체 생성능이 결여된 세포 균주가 또한 이용될 수도 있다.
예를 들어, 마우스 골수종 P3x63Ag8.653 (ATCC CRL-1580) 또는 P3x63Ag8U.l (ATCC CRL-1597) 가 마우스 또는 래트의 세포융합법을 위한 유용한 세포균주로서 널리 이용된다. 일반적으로, 하이브리도마가 동종의 세포들의 융합에 의해 제조된다. 그러나, 모노클로날 항체는 또한 근접한 이종 종들 사이에서 헤테로하이브리도마로부터 획득될 수도 있다.
세포 융합의 구체적인 프로토콜은 공지되어 있다. 즉, 면역 동물의 항체-생성 세포를 적절한 융합 파트너와 혼합하고, 세포 융합시킨다. 항체-생성 세포로서, 비장 세포, 림프절로부터 채취한 림프구 세포, 말초혈 B 세포 등이 이용될 수 있다. 융합 파트너로서, 상술된 각종 세포 균주가 이용될 수 있다. 세포 융합에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 방법 또는 전기융합법을 이용한다.
다음으로, 융합 세포에 의해 소유된 선택 마커에 근거해 세포 융합에 성공한 세포를 선택한다. 예를 들어, HAT 감수성 세포 균주를 세포 융합에 사용하는 경우에, HAT 배지에서 성장시킨 세포를 선택함으로써 세포 융합에 성공한 세포를 선택한다. 더욱이, 선택된 세포에 의해 생성된 항체가 이것이 목적의 반응성을 지니고 있는 것을 확인한다.
각 하이브리도마는 항체의 반응성에 기초하여 스크리닝된다. 다시 말해, 상술된 바와 같은 방법에 의해, PLD4 에 결합하는 항체를 생성하는 하이브리도마가 선택된다. 바람직하게, 선택된 하이브리도마가 서브클로닝되어 최종적으로 목적된 항체의 생성이 확인되는 경우, 상기 하이브리도마는 본 발명의 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마로서 선택된다.
구체적으로, 목적의 하이브리도마가 인간 세포와의 반응성, 또는 PLD4 유전자를 발현하는 형질전환된 세포와의 반응성을 기초로 선택될 수 있다. 세포에 결합하는 항체는 면역검정의 원리에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 세포를 항원으로서 이용하는 ELISA 를 목적 항체의 검출에 이용할 수 있다. 구체적으로, 하이브리도마의 배양 상청액을, 인간 pDC 또는 면역원으로서 이용된 형질전환된 세포를 고정화한 담체와 접촉시킨다. 배양 상청액이 목적의 항체를 포함하는 경우, 항체는 담체 상 고정된 세포에 의해 포획된다. 이어서, 고체 상이 배양 상청액으로부터 단리되고, 필요한 경우 세정한 다음 고체 상에 포획된 항체를 검출할 수 있다. 항체의 검출에서, 항체를 인지하는 항체가 이용될 수 있다. 예를 들어, 마우스의 항체가 항-마우스 면역글로불린 항체에 의해 검출될 수 있다. 항체를 인식하는 항체를 표지하면, 그의 검출이 용이하다. 표지로서, 효소, 형광 색소, 발광 색소 등을 이용할 수 있다.
한편, 세포를 고정화하는 담체로서, 입자, 또는 마이크로타이터 플레이트의 내벽을 이용할 수 있다. 플라스틱으로 만든 입자 또는 용기의 표면은 세포를 물리적 흡착에 의해 고정할 수 있다. 예를 들어, 폴리스티렌으로 만든 비즈 또는 반응 용기가 세포 고정용 담체로서 이용될 수 있다.
하이브리도마 선택에 있어서, PLD4 에 대한 항체의 생산이 아닌 면역원으로서 이용된 형질전환된 세포의 숙주 세포에 대한 항체의 생산이 예측되는 경우가 존재할 수 있다. 예를 들어, 실시예에 나타낸 바와 같이, 인간 세포를 면역원으로서 이용하고, 마우스를 면역 동물로서 이용하는 경우, 인간 세포는 외래 물질로서 인식되어, 이에 결합되는 항체가 생성되는 것이 예측된다. 본 발명에서, PLD4 를 인식하는 항체의 획득을 의도한다. 따라서, PLD4 이외의 기타 인간 세포 항원을 인식하는 항체의 획득은 필수적인 것은 아니다. 이러한 항체를 생성하는 하이브리도마를 스크리닝에 의해 배제하기 위해, 항체 반응성의 확인 이전에 목적하지 않은 항체를 미리 흡수할 수 있다.
목적되지 않은 항체는 존재가 예측되는 항체에 결합하는 항원에 의해 흡수될 수 있다. 구체적으로, 예를 들어 PLD4 이외의 다른 인간 세포 항원에 대한 항체가 PLD4 의 발현을 검출할 수 없는 세포에 의해 흡수될 수 있다. 본 발명에 있어서, 면역원에 있어서 사용된 숙주 세포는 목적하지 않은 항체를 흡수하기 위한 항원으로서 바람직하다.
항원에 대한 결합 활성이 확인된 모노클로날 항체는, 필요에 따라 pDC 의 활성에 대한 실제의 영향이 확인된다. pDC 에 대한 영향은 예를 들어 후술되는 방법에 의해 확인될 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체는 이 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 배양함으로써 수득된 배양물로부터 수집될 수 있다. 하이브리도마는 시험관 내 또는 생체 내 배양될 수 있다. 시험관 내 배양에 있어서, 하이브리도마는 RPMI 1640 과 같은 공지의 배지를 이용함으로써 배양될 수 있다. 하이브리도마에 의해 분비된 면역글로불린은 배양 상청액에 축적된다. 따라서, 본 발명의 모노클로날 항체는 배양 상청액을 수집하고, 필요에 따라 이것을 정제함으로써 수득될 수 있다. 면역글로불린의 정제는 혈청을 첨가하지 않은 배지에서 용이하다. 그러나, 하이브리도마의 신속한 성장 및 항체 생성의 촉진을 목적으로, 10% 정도의 소 태아 혈청을 배지에 첨가할 수도 있다.
하이브리도마가 또한 생체 내에 있어서 배양될 수도 있다. 구체적으로, 하이브리도마는 누드 마우스의 복강에 하이브리도마를 접종함으로써 복강 내에서 배양될 수 있다. 모노클로날 항체는 복수 (ascites) 중에 축적된다. 따라서, 복수를 채집하고, 필요에 따라 정제해 필수적인 모노클로날 항체를 수득한다. 수득된 모노클로날 항체는 적절히 수식될 수 있거나 또는 목적에 따라 프로세싱될 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체는 하이브리도마로부터 항체의 항원 결합 영역을 인코딩하는 cDNA 를 획득하고, 이것을 적절한 발현 벡터 내로 삽입함으로써 발현시킬 수 있다. 항체의 가변 영역을 인코딩하는 cDNA 를 획득하고 이것을 적절한 숙주 세포 내로 발현되게 하는 기술이 공지되어 있다. 또한, 항원 결합 영역을 포함하는 가변 영역을 불변 영역에 결합시켜 키메라 항체를 수득시키는 접근법이 공지되어 있다. 예를 들어, 가변 영역의 유전자는, 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 및 인간 Ig 카파 경쇄 불변 영역 각각을 인코딩하는 유전자와 결합시킴으로써 키메라 항체를 제공할 수 있다. 나아가, 모노클로날 항체의 항원 결합 활성이, 가변 영역을 구성하는 CDR 을 다른 면역글로불린 분자의 프레임 영역에 혼입함으로써 또 다른 면역글로불린에 이식될 수 있는 것이 공지되어 있다. 이를 이용해, 이종의 면역글로불린이 소유하는 항원 결합 활성을 인간 면역글로불린에 이식하는 방법이 확립된다. 예를 들어, CDR 을 지지하는 프레임 영역의 일부의 아미노산 서열이 마우스 항체의 가변 영역에서 인간 가변 영역으로 이식되는 경우가 존재할 수 있다. 다음으로, 인간 항체의 이들 인간화, 재구성된 가변 영역은 인간 항체의 불변 영역에 연결되어 인간화 항체를 수득할 수 있다.
본 발명에서 바람직한 모노클로날 항체의 예에는 예를 들어, 수탁 번호: NITE BP-1211, NITE BP-1212, NITE BP-1213, 및 NITE BP-1214 로서 각각 기탁되어 있는 하이브리도마 mp5B7, mp7B4, mp13D4, mp13H11, 등에 의해 생성된 모노클로날 항체가 포함된다.
가변 영역을 포함하는 키메라 항체, 또는 가변 영역을 구성하는 CDR 이 이식된 인간화 항체, IgG 또는 IgM 으로부터 유래된 불변 영역을 가진 항체가 본 발명의 항체에 바람직하게 포함된다. 특히, 본 발명의 항체는
하기의 조합을 가진 항체:
항체의 가변 영역을 구성하는 CDR 의 서열로서,
중쇄 CDR1: DYNLH,
CDR2: YIYPYNGNTGYNQKFKR,
CDR3: GGIYDDYYDYAIDY 및
경쇄 CDR1: RASENIYSHIA,
CDR2: GATNLAH,
CDR3: QHFWGTP,
하기의 조합을 가진 항체:
가변 영역을 구성하는 CDR 의 서열로서,
중쇄 CDR1: SHYYWT,
CDR2: YISYDGSNNYNPSLKN,
CDR3: EGPLYYGNPYWYFDV 및
경쇄 CDR1: RASQDIDNYLN,
CDR2: YTSRLHS,
CDR3: QQFNTLP,
또는 하기의 조합을 가진 항체:
가변 영역을 구성하는 CDR 의 서열로서,
중쇄 CDR1: SHYYWS,
CDR2: YISYDGSNNYNPSLKN,
CDR3: EGPLYYGNPYWYFDV 및
경쇄 CDR1: RASQDIDNYLN,
CDR2: YTSRLHS,
CDR3: QQFNTLP,
이 더욱 바람직하다.
본 발명자들은 PLD4 에 대한 모노클로날 항체가 PLD4 발현 세포에 대한 CDC 작용을 지닌다는 점을 확인했다. 그에 따라, IgG- 또는 IgM-유래 불변 영역을 가진 항체는 CDC 작용에 의해 PLD4 발현을 위한 세포독성 작용을 가진다. 이러한 항체는 pDC 와 같은 PLD4 발현 세포의 세포수를 억제하는데 있어서 유용하다.
PLD4 를 인식하는 키메라 항체 또는 인간화 항체가 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 유전자 공학으로써 제조될 수 있다.
PLD4 를 특이적으로 인식할 수 있는 항체는 수득하지 못했다. PLD4 를 인식하는 항체가 본 발명의 면역원에 의해 처음으로 제공되었다. 즉, 본 발명은 후술되는 프로세스에 의해 수득가능한 PLD4 를 인식하는 항체를 제공한다.
(1) PLD4 세포외 도메인을 포함하는 단백질을 면역 동물에 투여하는 프로세스,
(2) 면역 동물의 항체-생성 세포로부터, PLD4 에 결합하는 항체를 생성하는 항체-생성 세포를 선택하는 프로세스, 및
(3) (2) 에서 선택된 항체-생성 세포를 배양하고 그 배양물로부터 PLD4 를 인식하는 항체를 수집하는 프로세스.
PLD4 가 인간 pDC 에서 특이적으로 발현된다는 점이 밝혀져 있다. 인간 pDC 에서 특이적 발현은 또한 본 발명자들에 의해 SAGE 에 의한 유전자 발현 분석에 의해 확인되었다. 그러나, 과거 보고에 있어서는 PLD4 발현 수준은 모두 mRNA 를 근거로 분석되어 있었다. 추가적으로, PLD4 단백질은 세포질 내에서만 발현되는 것으로 공지되어 있다. PLD4 가 또한 세포 표면에도 발현된다는 점이 본 발명에 의해 밝혀졌다. PLD4 를 검출할 수 있는 항체가 제공되지 않기 때문에, 단백질 발현 상태 분석은 통상적으로 행해지지 않았다. 본 발명에 의해 제공된 PLD4 세포외 도메인에 결합하는 항체는 PLD4 단백질의 분석을 실현시켰다.
실제로 본 발명자들에 의해 확인된 바, 본 발명에 기초하는 PLD4 세포외 도메인에 결합하는 모노클로날 항체는 인간 pDC 를 특이적으로 검출하였다. 즉, 본 발명은 PLD4 의 세포외 도메인에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을, 테스트 세포와 접촉시키고, 그 세포에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 플라스마사이토이드 수지상 세포의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명을 근거로 하여 PLD4 을 검출함으로써, 어떤 세포가 pDC 인지 아닌지를 확인할 수 있다. 즉, 본 발명은 PLD4 를 지표로서 이용해 pDC 를 동정하는 방법을 제공한다. 대안적으로, 본 발명에 근거하여 PLD4 가 검출된 세포를 단리함으로써 인간 pDC 를 분리할 수 있다. 다시 말해, 본 발명은 지표로서 PLD4 를 이용해 pDC 를 단리하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, PLD4 세포외 도메인에 결합하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편은 표지될 수 있다. 예를 들면, 발광 색소 또는 형광 색소로 표지하는 것에 의해, 항체를 용이하게 검출할 수 있다. 보다 구체적으로는, 형광 색소-표지된 항체를 pDC 을 포함할 가능성이 있는 세포 집단과 접촉시켜, 본 발명의 항체가 결합한 세포를 형광 색소를 지표로서 이용해 검출할 수 있다. 더욱이, 형광 색소로 검출된 세포를 단리하면, pDC 을 단리할 수 있다. 일련의 단계가, FACS 의 원리에 의해 용이하게 실시될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 항체를 자성 입자 등의 고체 상 담체에 결합시켜 놓을 수도 있다. 고체 상 담체에 결합한 항체가 PLD4 을 인식하고, pDC 이 고체 상 담체에 포획된다. 그 결과, pDC 을 검출 또는 단리할 수 있다.
본 발명에 근거하는 pDC 의 검출 방법에 필요한 항체는, pDC 검출용 시약으로서 공급할 수 있다. 즉, 본 발명은 PLD4 의 세포외 도메인에 결합하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 포함하는 pDC 의 검출용 시약을 제공한다. 본 발명의 pDC의 검출용 시약에는, 항체에 더해서, 양성대조군 또는 음성 대조군을 조합시킬 수 있다. 예를 들면, 면역원으로서 이용된 PLD4 의 세포외 도메인을 발현하는 형질전환된 세포, 또는 인간으로부터 수집된 pDC 등이 양성 대조군으로서 이용될 수 있다. 보통, 인간 pDC 은 말초피로부터는 조금밖에 수득할 수 없다. 따라서, 특히 형질전환된 세포는, 본 발명의 시약에 있어서의 양성 대조군으로서 바람직하다. 한편, 음성 대조군으로서, PLD4을 발현하지 않는 임의인 세포를 이용할 수 있다.
즉, 본 발명은 PLD4 의 세포외 도메인에 결합하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 포함하는 인간 pDC 의 검출용 키트를 제공한다.
또 본 발명자들은 PLD4 세포외 도메인에 결합하는 항체가 pDC 에 주는 영향을 분석했다. 그 결과, PLD4 세포외 도메인에 결합하는 항체는 pDC 의 활성을 억제하는 것이 확인되었다. 즉, 본 발명은 하기 성분들 중 어느 하나를 pDC 에 접촉시키는 단계를 포함하는 인터페론-생성 세포의 활성 억제 방법에 관한 것이다:
(a) PLD4 에 결합하고 pDC 의 활성을 억제하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편, 및
(b) 모노클로날 항체 (a) 의 상보성 결정 영역을 이식한 면역글로불린, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
대안적으로, 본 발명은 하기 성분들 중 어느 하나를 생물에 투여하는 단계를 포함하는 생물 중의 pDC 의 활성억제 방법에 관한 것이다:
(a) PLD4 에 결합하고 pDC 의 활성을 억제하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편,
(b) 모노클로날 항체 (a) 의 상보성 결정 영역이 이식된 면역글로불린, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편, 및
(c) (a) 또는 (b)에 기재된 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
본 발명에 있어서 pDC 는 IFN 생성능을 갖고, 그 세포 표면에 PLD4 을 발현하는 세포를 지칭한다. 이하, 특별히 달리 언급되지 않는 한, pDC 는 수지상 세포의 전구 세포인 세포뿐만이 아니라, IFN 생성능을 갖고, 그 세포 표면에 PLD4 을 발현하는 세포를 포함한다. 이러한 pDC 의 동정 방벙은 공지되어 있다. 예를 들면 몇개의 세포 표면 마커를 지표로서 이용해 pDC 을 다른 혈액세포와 구별할 수 있다. 구체적으로는, 인간 pDC 세포 표면 마커의 프로파일은 다음에 기재된 바와 같다 (Shortman, K. and Liu, YJ. Nature Reviews 2: 151-l61, 2002). 최근, BOCA-2 양성 세포를 pDC 에 위치시킨 보고도 또한 존재한다 (Ozione k， A. et al.].Immunol.165:6037-6046, 2000).
[인간 pDC 의 세포 표면 항원의 프로파일]
CD4 양성 및 CDI23 양성,
Lineage (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, 및 CD56) 음성, CD11c 음성
따라서, 이들 공지된 마커의 발현 프로파일을 갖고 IFN 생성능을 가진 세포를 또한 pDC 로서 지칭할 수 있다. 나아가, 이들 마커의 발현 프로파일의 발현 패턴과 상이한 프로파일을 갖는 세포 패밀리에 속하나, 생물 내 IFN 생성능을 갖는 세포가 pDC 에 포함된다.
나아가, 인간 pDC 로써 나타낸 공통적인 특징의 예에는 후술되는 바와 같은 특징이 포함된다.
[세포의 형태상의 특징]
* 형질 세포와 유사
* 매끄러운 세포 표면을 갖는 둥근 세포
* 비교적 큰 핵
[세포의 기능적 특징]
* 바이러스 감염시 단기간에 다량의 타입 I IFN 의 생성,
* 바이러스 감염 후 수지상 세포로의 분화
본 발명에 있어서 pDC 의 활성 억제는 pDC 기능의 적어도 하나의 억제를 지칭한다. pDC 의 기능의 예는 IFN 생산 및 세포 생존을 포함한다. 세포의 생존은 세포수로 바꿔 말할 수도 있다. 따라서, 이들 기능의 양쪽 또는 어느 하나를 억제하는 것을 pDC 활성의 억제로 지칭된다. pDC 에 의해 생성된 타입 I IFN 이 각종 질환의 원인이 되어 있는 것이 밝혀져 있다. 따라서, pDC 의 세포수 또는 IFN 의 생산 억제가 그러한 질환의 치료 전략으로서 유용하다.
예를 들면, 자가면역 질환의 병리학적 용태와 IFNα의 관련성이 지적되어 있다. IFNα 의 대부분이 pDC 에 의해 생성된다. 따라서, 그 생산성을 억제하면, IFNα 에 의해 초래되는 병리학적 용태를 완화할 수 있다. 한편, 본 발명에 있어서, pDC 에 의한 IFN 생산 억제란, pDC 이 생성하는 1 종류 이상의 IFN 의 생성 억제를 지칭한다. 본 발명에 있어서의 IFN 은 바람직하게 타입 I IFN 이다. 이들 중, IFNα 이 중요하다.
즉, 본 발명은 PLD4 세포외 도메인에 결합하는 항체를 활성 성분으로서 함유하는 IFN 생산의 억제제에 관한 것이다. 대안적으로, 본 발명은 PLD4 의 세포외 도메인에 결합하는 항체를 투여하는 프로세스를 포함하는 IFN 의 생산 억제 방법을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 PLD4 의 세포외 도메인에 결합하는 항체의, IFN 생산을 억제하는 의약 조성물의 제조에서의 용도에 관한 것이다.
소수의 세포에 대량의 IFN 을 생성하는 세포가 pDC 에 포함된다. 예를 들면, 바이러스 등에 의한 자극을 받은 수지상 세포의 전구 세포는 생물이 생성하는 IFN 의 대부분을 생성한다. 대량의 IFN 을 생성하는 pDC 의 세포수 억제는, 결과로서 IFN 의 생성을 억제하게 된다. 따라서, pDC 세포수의 억제에 의해서도, IFNα 에 의해 초래되는 병리학적 용태를 완화할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 항-PLD4 모노클로날 항체는 PLD4 발현 세포에 결합하고, 보체 의존성 세포 독성 (CDC) 작용에 의해 세포독성을 부여하는 것이 확인되었다. CDC 작용은 항체 의약의 중요한 작용 기작 중 하나이다. 본 발명의 항-PLD4 모노클로날 항체도, CDC 작용에 의해, pDC 등의 PLD4 발현 세포에 대한 강력한 세포독성 작용을 갖는다. 즉, 항-PLD4 모노클로날 항체는 바람직한 양태에 있어서, IFN 생산의 억제 기작에 의해서뿐 아니라 pDC 에 대한 세포독성에 의해서도, IFN 생산 억제 효과를 기대할 수 있다.
본 발명에서 이용된 PLD4 세포외 도메인을 인식하는 항체는 앞서 기재된 바와 같은 방법에 근거해서 수득할 수 있다. 본 발명에 있어서의 항체는 임의의 클래스일 수 있다. 또한, 항체가 유래하는 생물 종은 한정되지 않는다. 더욱이, 항체의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 항체로서 이용할 수 있다. 예를 들면, IgG 의 효소적인 소화에 의해 생성된 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편도 본 발명에서 항체로서 이용할 수 있다. 구체적으로, 파파인 또는 펩신에 의한 소화에 의해, Fab 또는 F(ab')2 등의 항체 단편을 수득할 수 있다. 이것들의 항체 단편은, 항원과의 결합 친화성을 갖는 항체 분자로서 이용할 수 있다는 점이 널리 공지되어 있다. 대안적으로, 필요한 항원 결합 활성을 유지하고 있는 한, 유전자 재조합에 의해 구축된 항체를 이용할 수도 있다. 유전자 재조합에 의해 구축된 항체의 예에는 키메라 항체, CDR 이식 항체, 단쇄 Fv, 디아바디 (디아바디들), 선형 항체, 및 항체 단편에 의해 형성된 다가특이성 항체 등이 포함된다. 모노클로날 항체를 기초로 이들의 항체를 수득하는 방법이 공지되어 있다.
본 발명에 있어서, 항체는 필요에 따라 수식될 수 있다. 본 발명에 따르면, PLD4 세포외 도메인을 인식하는 항체는 pDC 의 활성을 억제하는 작용을 지닌다. 다시 말해, 항체 그 자체가 pDC 에 대한 세포독성을 갖고 있을 가능성이 고려되었다. 강한 효과기 작용을 나타내는 항체의 서브클래스가 공지되어 있다. 대안적으로, 항체를 세포독성제로 수식함으로써, pDC 의 활성 억제 효과를 추가 증강시킬 수 있다. 세포독성제의 예에는 이하에 기술된 물질이 포함된다:
독소: 슈도모나스 엔도톡신 (Pseudomonas Endotoxin; PE), 디프테리아 독소, 및 리신 (ricin)
방사성 동위원소: Tc99m, Sr89, I131, 및 Y90
항암제: 칼리케아마이신 (calicheamicin), 미토마이신 (mitomycin), 및 파클리탁셀 (paclitaxel)
단백질 포함 독소는 2관능성 시약에 의해 항체, 그의 단편 등에 결합할 수 있다. 대안적으로, 독소를 인코딩하는 유전자를 항체를 인코딩하는 유전자와 접합하여, 이들의 융합 단백질을 수득할 수 있다. 방사성 동위원소를 항체에 결합하는 방법이 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 항체를 방사성 동위원소로 킬레이트제를 이용해 표지하는 방법이 공지되어 있다. 나아가, 항암제가 당 사슬 또는 이관능성 시약 등의 이용에 의해 항체에 결합할 수 있다.
본 발명에 있어서, 인위적으로 구조를 변경한 항체가 또한 활성 성분으로서 이용될 수도 있다. 예를 들어, 항체의 세포독성 또는 안정성을 개선을 위한 각종 수식이 공지되어 있다. 구체적으로, 중쇄의 당 사슬이 수식되어 있는 면역글로불린이 공지되어 있다 (Shinkawa, T. et al. J. Biol. Chem. 278: 3466-3473. 2003). 당 사슬의 수식은 면역글로불린의 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 를 증강시킨다.
PLD4 세포외 도메인에 결합하는 항체는, 이것이 pDC 에 접촉되는 경우, pDC 의 활성을 억제한다. 따라서, 이러한 항체를, pDC 의 활성억제제, 또는 pDC 억제 방법에 이용할 수 있다. 즉, 본 발명은 하기 (a) 내지 (c) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 종류의 성분을 활성 성분으로서 포함하는 pDC 의 활성 억제제를 제공한다. 대안적으로, 본 발명은 하기 (a) 내지 (c) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 종류의 성분을 투여하는 단계를 포함하는 pDC 활성 억제 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 하기 (a) 내지 (c) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 종류의 성분의 pDC 활성 조절제의 제조에 있어서의 용도에 관한 것이다.
(a) PLD4 세포외 도메인에 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편,
(b) 항체 (a) 의 상보성 결정 영역을 이식한 면역글로불린, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
본 발명에 있어서 pDC 의 활성을 억제하는 모노클로날 항체로서는, PLD4 세포외 도메인을 인식하는 모노클로날 항체를 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서는 1 종류 또는 복수 종류의 모노클로날 항체를 이용할 수 있다. 예를 들면, PLD4 세포외 도메인을 인식하는 복수 종의 모노클로날 항체를 블렌딩하고, 본 발명에 이용할 수 있다.
항체가 pDC 의 IFN 생성 활성의 억제 작용을 갖는 것은 하기에 기재된 바와 같은 방식으로 확인할 수 있다. pDC 은 바이러스의 자극에 의해 IFN 을 대량 생성한다. 바이러스 자극 전후, 또는 동시에 항체를 pDC 에 제공하고, 항체를 pDC 에 제공하지 않은 대조군과, IFN 생성능을 비교한다. IFN 생성능은, pDC 배양물의 상청액에 포함된 IFN-α 또는 IFN-β 를 측정함으로써 평가될 수 있다. 비교 결과, 항체 첨가에 의해, 상청액 중의 IFN 의 양이 유의하게 저하되면, 테스트된 항체는 IFN 생성능을 억제하는 작용을 갖는 것을 확인할 수 있다. 이들 IFN 의 측정 방법은 공지되어 있다. pDC 은 생물에 있어서의 IFN 의 대부분을 생성하는 세포다. 따라서, pDC의 IFN 생성능의 억제는 생물의 IFN 생성 상태를 조절할 수 있다.
본 발명에 있어서 pDC 의 활성에는 pDC 의 세포수 유지가 포함된다. 따라서, 본 발명에서의 pDC 의 활성 억제는, pDC 의 세포수 억제를 포함한다. pDC 의 세포수가 항체의 존재 하에서 억제되는 것으로 확인되면, 그 항체는 pDC 의 활성을 억제하고 있는 것으로 알게 된다. IFN 생산과 마찬가지로, 활성을 확인해야 할 항체와 동일한 동물 종에서 유래하는 불활성 면역글로불린을 비교 대조군로서 사용할 수 있다. pDC 의 세포수는 세포의 계수에 의해 정량적으로 비교할 수 있다. 세포수는 FACS 또는 현미경에 의해 계수될 수 있다.
더욱이, pDC 은 바이러스 등의 감염 결과, 수지상 세포 2 (DC2) 로 불리우는 Th2 를 유도하는 세포에 분화되는 것으로 추정된다. 바이러스 자극시, IFN 생산의 pDC 가 억제되면, Th2 로의 분화도 억제될 수 있을 가능성이 있다. 따라서, IFN 생성을 억제하는 본 발명의 모노클로날 항체는 각종 알레르기 질환의 치료 효과를 갖는 것으로 기대할 수 있다.
PLD4 세포외 도메인을 인식하는 항체를 그 항체가 유래하는 생물 종과는 다른 숙주에 투여하는 경우, 항체를, 상기 숙주에 의한 외래 물질로서 인식되기 어려운 형태로 프로세싱하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 하기에 기술되는 바와 같은 분자를 프로세싱하는 것에 의해, 면역글로불린을 외래 물질로서 인식되기 어렵게 할 수 있다. 하기에 기술되는 바와 같은 면역글로불린 분자를 프로세싱하는 방법이 공지되어 있다.
* 불변 영역이 결실된 항원 결합 영역을 포함하는 단편 (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, Academic Press Limited. l995; 항체 Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)
* 모노클로날 항체의 항원 결합 영역 및 숙주 면역글로불린의 불변 영역으로 구성된 키메라 항체 (Gene Expression Experiment Manual, Kodansha Ltd. l994 (Isao ISHIDA 및 Tamie ANDO 편집))
* 숙주 면역글로불린에서 상보성 결정 영역 (CDR) 이 모노클로날 항체의 CDR 로 치환되어 있는 CDR-치환된 항체 (Gene Expression Experiment Manual, Kodansha Ltd. 1994 (Isao ISHIDA 및 Tamie ANDO 편집))
대안적으로, 파아지 디스플레이 법 (McCafferty J et al., Nature 348:552-554, 1990; Kretzschmar T et. a1., Curr Opin Biotechnol. 2002 Dec; 13(6): 598-602.) 에 의해, 인간 면역글로불린 가변 영역의 유전자를 획득할 수도 있다. 파아지 디스플레이 방법에 있어서는, 인간 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 유전자를 파아지 유전자에 혼입된다. 다양한 면역글로불린 유전자를 공급원으로서 이용해, 파아지 라이브러리를 작성할 수도 있다. 파아지는 자신을 구성하는 단백질의 융합 단백질로서 가변 영역을 발현한다. 파아지에 의해 파아지 표면 상에 발현된 가변 영역은 항원의 결합 활성을 유지한다. 따라서, 항원 또는 항원이 발현된 세포 등에 결합하는 파아지를 선택함으로써, 파아지 라이브러리로부터 목적된 결합 활성을 갖는 가변 영역이 발현되어 있는 파아지를 스크리닝할 수 있다. 더욱, 이렇게 해서 선택된 파아지 입자는, 목적의 결합 활성을 갖는 가변 영역을 인코딩하는 유전자를 보유한다. 다시 말해, 파아지 디스플레이법에 있어서 가변 영역의 결합 활성을 지표로서 이용해 목적의 결합 활성을 갖는 가변 영역을 인코딩하는 유전자가 획득될 수 있다.
본 발명에 따른 pDC 의 활성억제제 또는 억제 방법에 있어서, PLD4 세포외 도메인을 인식하는 항체, 또는 그의 적어도 항원 결합 영역을 포함하는 항체 단편은 단백질로서, 또는 그 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 투여될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 투여하기 위해서는, 목적의 단백질을 발현하도록 적당한 프로모터의 제어 하에 목적의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 배치한 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 그 벡터에는, 인핸서 또는 터미네이터가 또한 배치될 수도 있다. 면역글로불린을 구성하는 중쇄 및 경쇄의 유전자를 보유하고, 면역글로불린분자를 발현할 수 있는 벡터가 공지되어 있다. 면역글로불린을 발현할 수 있는 벡터는, 세포에 도입하는 것에 의해 투여될 수 있다. 생물로의 투여에서, 생물로의 투여에 의해 세포를 감염시킬 수 있는 벡터가 그대로 투여될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 또한 일단 생물로부터 단리된 림프구에 도입될 수 있고, 다시 생물로 되돌릴 수 있다 (생체 외).
본 발명에 근거하는 pDC 의 활성 억제제에서 또는 억제 방법에 있어서, 생물에 투여되는 모노클로날 항체의 양은, 면역글로불린으로서 체중 1 kg 당 보통 0.5m g 내지 100 mg, 예를 들면 1 mg 내지 50 mg, 바람직하게는 2 mg 내지 10 mg 이다. 생물로의 항체의 투여 간격은, 치료 기간 동안 생물 내에 있어서의 면역글로불린의 유효 농도를 유지할 수 있게끔 적당히 조절할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 투여는 1 내지 2 주간 간격으로 실시될 수 있다. 투여 경로는 임의이다. 당업자는 치료에서 효과적인 투여 경로를 적당히 선택할 수 있다. 구체적으로는, 투여 경로의 예에는 경구 또는 비경구적인 투여가 포함된다. 예를 들면, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해, 전신 또는 국소적으로 항체가 투여될 수 있다. 본 발명에 있어서의 비경구 투여에 적당한 제제의 예에는 주사제, 좌제, 분무제 등이 포함된다. 또한, 세포에 면역글로불린이 투여되는 경우, 면역글로불린은 배양액에 보통 1 ㎍/mL, 바람직하게 10 ㎍/mL 이상, 더욱 바람직하게 50 ㎍/mL 이상, 및 보다 바람직하게 0.5 mg/mL 이상 투여된다.
본 발명 의 pDC 의 활성 억제제 또는 억제 방법에 있어서, 모노클로날 항체가 임의인 방법에 의해 생물에 투여될 수 있다. 통상적으로, 모노클로날 항체는 약학적으로 허용되는 담체와 블렌딩된다. 모노클로날 항체와 함께, 필요에 따라, 증후제, 안정화제, 방부제 및 가용화제 등의 첨가제가 블렌딩될 수 있다. 이러한 담체 또는 첨가제의 예는 락토오스, 시트르산, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 수크로오스, 전분, 탈크, 젤라틴, 아가, 식물성 오일, 에틸렌 글리콜 등을 포함한다. "약학적으로 허용되는" 이라는 용어는 각 국가의 정부의 감독 당국에 의해 승인되어 있는 것이거나, 또는 각국의 약전 또는 동물, 포유동물, 특히 인간에서 사용하기 위해 일반적으로 인지되어 있는 약전에 열거된 것을 지칭한다. 본 발명의 pDC 활성 억제제는 1 회 또는 복수 회 용량의 동결건조 분말 또는 정제의 형태로 공급될 수도 있다. 동결 건조 분말 또는 정제는 투여 전에 원하는 농도까지 조성물을 용해하기 위해 주사용의 멸균수, 생리 식염수 또는 완충 용액과 추가로 조합될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 pDC 활성 억제제가 면역글로불린 발현 벡터로서 투여되는 경우, 중쇄 및 경쇄가 별개의 플러스미드와 공동-트랜스펙션되고, 각 플라스미드는 예를 들어 체중 1 kg 당 0.1 내지 10 mg, 예를 들어 1 내지 5 mg 투여될 수 있다. 게다가, 시험관 내에 있어서 세포에 도입하기 위해 1 내지 5 ㎍/106 세포의 벡터가 사용된다. 이하, 본 발명을 실시예를 근거로 하여 추가 구체적으로 설명할 것이다.
한편, 본 명세서에서 인용된 모든 선행 기술 문헌이 참조로서 본 명세서에 포함된다.
본 발명이 하기의 실시예와 함께 보다 구체적으로 설명되지만, 본 발명은 전혀 이러한 실시예에 제한되는 것이 아니다.
실시예
실시예 1
A. PLD4 발현 분석
A-1) SAGE 라이브러리를 이용한 분석
휴지 pDC, 인간 단핵구 및 불활성화 헤르페스 바이러스 (HSV-1) 로 처리한 활성화 pDC 에 있어서 유전자 발현을, SAGETM (Serial Analysis of Gene Expression) 방법으로써 비교했다. 분석 방법은 하기에 기술된 바와 같다.
인간 말초 혈액에서, 단핵구를 CD14 양성 세포로서 단리하고, 인간 pDC 세포를 BDCA-4 양성 세포로서 BDCA-4+ 단리 키트 (Miltenyi Biotec company) 및 MACS 시스템 (Miltenyi Biotec company) 으로 단리했다. 더욱이 인간 pDC 세포를, 불활성 HSV-1 존재 하에서 12 시간 배양해서, 활성화 pDC (pDC + HSV) 을 제조했다. 각각의 세포로부터 전체의 RNA 를 추출하고, I-SAGE™ 키트 (Invitrogen company) 을 이용해 SAGE 라이브러리를 제작했다. 약 100,000 태그된 염기 서열의 수득된 데이타를, SAGE2000 Analysis Software (Invitrogen company) 로 분석했다. 그 결과, 단핵구/pDC/pDC+ HSV 의 스코어 값은 0/9/0 의 유전자, 즉 휴지 pDC 세포 특이적인 발현을 나타내는 유전자로서 공지된 유전자인 PLD4 (포스포리파아제 D 패밀리, 멤버 4, C14orf175; GenBank Accession Number: NM_138790.2) 을 발견했다 (도 1, Tao et al., Nat. Methods 2(8), 591-598(2005); Clark et al., Genome Res. 13(10), 2265-2270(2003)). PLD4 은 SEQ ID NO :44 로 나타낸 염기 서열에 의해 인코딩된 506 아미노산 서열 (SEQ ID NO :1) 이다. PLD4 단백질은 C 말단 영역에서 보존된 2 개의 HKD 모티프 (His-x-Lys-x-x-x-x-Asp 아미노산 서열, x 는 그 밖의 아미노산임) 으로 구성되는 2 개의 잠정적인 PDE 영역 (포스포디에스테라아제 모티프) 및 잠정적인 인산화 부위 (Thr 472) 를 가진다. PLD4 단백질의 구조는 타입 II 모노트로픽 트랜스멤브레인 단백질로서 예측된다. 또한, N 말단 영역에는 고전적인 PLD 패밀리인 PLD1 및 PLD2 이 소유한 PX 영역 (Phox 상동성 도메인) 및 PH 도메인 (Pleckstrin 상동성 도메인) 을 지니고 있지 않다 (도 1 및 2).
A-2) 정량적 실시간 PCR 에 의한 면역 담당의 인간 각종 세포에서 PLD4 mRNA 의 발현 분석
혈액 세포에서 PLD4 mRNA 의 발현을 상세히 검토했다. 인간 말초 혈액으로부터, 각각의 세포를 세포 분류기로써 단리해 취했다. 단리해 취한 세포 패밀리 각각으로부터, RNA 를 추출하고, cDNA 를 합성했다. 수득된 cDNA 를 주형으로서 이용해, 정량적 실시간 PCR 을 수행하고, PLD4 mRNA 의 발현 수준을 분석했다.
정량적 실시간 PCR 반응에 있어서, 정량적 PCR 은 Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG 키트 (Invitrogen company) 를 이용해 ABI PRISM 7000 으로 행했다. 데이타 분석에 Sequence Detection System Software (Applied Biosystem company) 을 이용했다. PCR 반응 조건 및 사용된 프리머의 염기 서열은 하기와 같다.
PLD4 에 대한 전방향 프라이머: 5'ATG GAC TGG CGG TCT CTG 3' (SEQ ID NO: 45)
PLD4 에 대한 역방향 프라이머: 5' TGG AAG GTC TTC TCC AGG TC 3' (SEQ ID NO: 46)
GAPDH 에 대한 전방향 프라이머: 5' AGC CAC ATC GCT CAG ACA C 3' (SEQ ID NO: 47)
GAPBH 에 대한 역방향 프라이머: 5' GCC CAA TAC GAC CAA ATC C 3' (SEQ ID NO: 48)
2 분 동안 58℃ 에서의 1 사이클,
10 분 동안 95℃ 에서의 1 사이클,
[15 초 동안 95℃ 및 60 초 동안 60℃] 의 50 사이클,
pDC, HSV 로 자극된 pDC (pDC+HSV), B 세포 (CD19+ 세포), 활성화 B 세포 (CD19+ 세포), T 세포 (CD3+ 세포), 및 Inomycin 및 PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) 으로 자극된 활성화 T 세포를 검토했다. 그 결과, PLD4 발현이 휴지기의 pDC 에서 특이적으로 높고, CDI9+ B 세포에서 낮다는 점이 실증되었다. 기타 인간 혈액 분획 cDNA 는 BDTM MTC Multiple Tissue cDNA Panels (Cat. No. 636750, Takara Bio company) 을 이용했다 (도 5).
A-3) 정량적 실시간 PCR 에 의한 인간 조직에서 PLD4 mRNA 의 발현 분석
나아가, 그 밖의 기관 또는 조직에서의 발현을, ABI PRISM 7000 (Applied Biosystem company)을 이용한 정량적 PCR 에 의해 검토했다. cDNA 패널로서, BDTM MTC multiple tissue cDNA panel (Human I; Cat. No. 636742, Human immune; Cat. No. 636748; all Takara Bio company) 를 이용했다. 사용된 프라이머의 염기 서열은 하기와 같이 나타낸다.
PLD4 에 대한 전방향 프라이머: 5' ATG GAC TGG CGG TCT CTG 3' (SEQ ID NO: 49)
PLD4 에 대한 역방향 프라이머: 5' TGG AAG GTC TTC TCC AGG TC 3' (SEQ ID NO: 50)
GAPDH 에 대한 전방향 프라이머: 5' AGC CAC ATC GCT CAG ACA C 3' (SEQ ID NO: 51)
GAPDH 에 대한 역방향 프라이머: 5' GCC CAA TAC GAC CAA ATC C 3' (SEQ ID NO: 52)
정량적 PCR 을 Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG 키트 (Invitrogen company) 를 이용해 ABI PRISM 7000 로 수행했다. Sequence Detection System Software (Applied Biosystem company) 을 분석에 이용했다. 반응 조건은 하기에 기재된 바와 같다.
단계 1: 2 분 동안 50℃ 에서의 1 사이클,
단계 2: 10 분 동안 95℃ 에서의 1 사이클,
단계 3: 15 초 동안 95℃ 및 1 분 동안 60℃ 에서의 50 사이클
PLD4 유전자의 발현을, 항상성있게 발현되는 것으로 공지된 GAPDH (글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제) 의 유전자 발현 수준으로 표준화함으로써, 각 조직들 사이에서 비교했다. 그 결과, PLD4 mRNA 는 비장 및 말초혈 백혈구에서 비교적 높은 발현을 보였다. 또한, PLD4 mRNA 가 다른 조직에서도 광범위하게 발현되었음을 밝혀냈다. 그러나, PLD4 mRNA 의 발현 수준은 휴지 pDC 세포의 발현 수준의 100 배 미만이였다 (도 6).
인간 PLD4 발현 벡터의 제조
PLD4 유전자 발현 벡터의 제조를, 인간 PLD4 단백질을 발현하기 위해 수행했다. pCR4-TOPO 클로닝 벡터에 혼입된 PLD4 cDNA 클론 (Open Biosystem, Cat, No. MHS4771-99610856) 으로부터, 오로지 PLD4 유전자를 EcoRI 효소로 취하고 pcDNA3.1 발현 벡터 (인간 PLD4-pcDNA3.1 벡터) 에 혼입했다. 수득된 인간 PLD4-pcDNA3.1 플라스미드를 주형으로서 이용해, PLD4 유전자를, EcoRI, Not I, 및 Kozak 서열 (GCC GCC ACC) 을 포함하는 프라이머로 증폭했다 (프라이머의 정보는 하기에 기술된 바와 같음). PCR 생성물을 pMX-IP 레트로바이러스 벡터 (인간 PLD4-pMX-IP 레트로바이러스 벡터)로 EcoRI 및 Not I 부위에 클로닝했다. PCR 반응에서, 1 단위의 KOD Plus DNA 폴리머라아제 (TOYOBO company) 를 이용하고, 반응 조건은 2 분간 94℃ 에서 1 사이클 후 [15 초간 94℃ 및 1 분 30 초간 68℃] 의 25 사이클이었다.
전방향 프라이머 (SEQ ID NO: 53): 5' ttt GAA TTC gcc gcc acc ATG CTG AAG CCT 3' (30-mer)
역방향 프라이머 (SEQ ID NO: 54): 5' aaa gcg gcc gcT CAG CCC TGC CAA ACG CAG TCC T 3' (34-mer)
서열 분석과 함께, HEK (Human Embryonic Kidney)-293T 세포 (이하, 293T 세포) 를 인간 PLD4-pMX-IP 레트로바이러스 벡터로 일시적으로 트랜스펙션하고, 인간 PLD4 가 293T 세포의 표면상에 발현되는지 여부를, 세포 염색 후 FACS 방법으로 확인했다.
실시예 2
항-인간 PLD4 항체의 특이성 검토
항-PLD4 모노클로날 항체가 PLD 패밀리의 다른 분자와 교차하지 않는 것을, 각 PLD 패밀리를 강제 발현시킨 세포를 이용해 확인할 수 있다. PLD4 패밀리에 속하고 높은 상동성을 지닌 분자가 다수 존재한다. 인간 PLD4 는 인간 PLD3 과 약 41% 상동성을, 인간 PLD5 와 약 29.3% 상동성을 보인다 (도 4).
1) 인간 PLD3 및 인간 PLD5 의 발현 벡터의 제조
인간 PLD3 (cDNA SEQ ID NO: 55, 아미노산 SEQ ID NO: 127) 및 인간 PLD5 (cDNA SEQ ID NO: 56, 아미노산 SEQ ID NO: 123) 에 대해서, pCMV-SPORT6 벡터에 혼입된 인간 PLD3 클론 (K.K.DNAFORM company, Cat. No 5189261) 및 pCR-Blunt II-TOPO 벡터에 혼입된 인간 PLD5 클론 (K.K.DNAFORM company, Cat. No 40025860) 으로부터, 오로지 PLD3 및 PLD5 유전자만을 PCR 로 증폭시키고, 유전자 각각을 Flag-태깅된 pcDNA3.1 (Invitrogen company) 의 Hind III 및 EcoRI 부위에 클로닝하여, 발현 벡터를 제조했다 (프라이머 정보는 후술된 바와 같음).
(인간 PLD3 을 위한)
전방향 프라이머: huPLD3-IF (Hind III)
서열: 5' ttt AAG CTT gcc gcc acc ATG AAG CCT AAA CTG ATG TAC 3' (39-mer) SEQ ID NO: 57)
역방향 프라이머: huPLD4-1518R (EcoRI)
서열: 5' ttt gaa ttc TCA ctt atc gtc gtc atc ctt gta atc GAG CAG GCG GCA GGC GTT GCC 3'(57-mer) (SEQ ID NO: 58)
(인간 PLD5 을 위한)
전방향 프라이머: huPLD5-IF (Hind III).
서열: 5' ttt AAG CTT gcc gcc acc ATG GGA GAG GAT GAG GAT GGA 3' (39-mer) (SEQ ID NO: 59)
역방향 프라이머: huPLD5-1383R (EcoRI)
서열: 5' ttt gaa ttc TCA ctt atc gtc gtc atc ctt gta atc TAC GTT CCG GGG ATC CTT TCC 3' (57-mer) (SEQ ID NO: 60)
상술된 프라이머 서열 중에서, 밑줄그은 부분은 부가된 FLAG 태그를 인코딩하는 염기 서열을 나타내고, 이탤릭체는 제한 효소의 Hind III 절단 부위 또는 EcoRI 부위를 나타낸다.
서열 분석과 함께, 293T 세포를 인간 PLD3-pcDNA3.l 벡터 또는 인간 PLD5-pcDNA3.1 벡터로 일시적으로 트랜스펙션하였고, 인간 PLD4 가 293T 세포의 표면 상에 발현되는지 여부를 세포 염색 후 FACS 방법으로 확인했다.
그 결과, 항체는 인간 PLD3 또는 인간 PLD5 이 발현된 것으로 보이는 세포와 반응하지 않았고, 이는 이들 항-PLD4 항체가 인간 PLD4 분자를 특이적으로 인식했다는 점을 시사했다 (도 8).
인간 PLD4 발현 세포 안정성 균주의 제조
제조된 인간 PLD4-pMX-IP 벡터를, 레트로바이러스 패키징 벡터인 pCL-Eco 벡터 (IMGENEX, Cat. No. 10045P) 와 함께 293T 세포에 공동트랜스펙션해, 유전자 도입을 수행했다. 유전자 도입 실험은 FuGENE (등록 상표) HD Transfection Reagent (Roche) 을 트랜스펙션 시약으로서 이용했다. 2 일 후, 인간 PLD4 유전자-포함 레트로바이러스가 분비되어 있는 세포 배양 상청액을 수집하고, CT125 세포 균주 (2B4 마우스 T 세포 림프구 종양 세포 시리즈) 에 감염시켰다. pMX-IP 레트로바이러스 벡터가 퓨로마이신-내성 유전자를 포함하는 사실로부터, 감염된 CT125 세포의 퓨로마이신의 존재 하에서 배양하면, 인간 PLD4 를 발현하는 세포만을 생존시켜 그의 선택을 도모 가능하게 할 수 있다. 선택된 인간 PLD4 발현 CT125 세포 (이하, 인간 PLD4-CT125) 를, FACS 분류에 의해 보다 높은 인간 PLD4 의 발현을 허용하는 CT125 세포만을 추가로 선택해 배양했다. 인간 PLD4 발현을 확인하기 위해, CT125 세포를 5 ㎍/ml 로 조정한 시판중인 마우스 항-인간 PLD4 폴리클로날 항체 (Abnova, Cat #:HOO122618-B01P) 로 염색하고 FACS 분석을 행했다. 그 결과, 인간 PLD4-CT125 세포 안정성 균주가 확립되었고, 이를 하이브리도마의 FACS 스크리닝에 사용했다.
사이노몰거스 원숭이 및 레서스 원숭이의 PLD4 발현 구축, 및 인간 PLD4 발현 세포 안정성 균주의 제조
사이노몰거스 원숭이 및 레서스 원숭이의 PLD4 단백질의 발현을 위해, 원숭이 PLD4 유전자의 클로닝 및 발현 벡터의 구축을 행했다.
1) 사이노몰거스 원숭이 PLD4 및 레서스 원숭이 PLD4 유전자의 클로닝
레서스 원숭이의 PLD4 의 cDNA 서열이 Genbank 데이타베이스 (XM_002805227.1) 등에 보고되어 있지만, 일부이며, 그의 전장의 cDNA 는 보고되어 있지 않다. 더욱이, 사이노몰거스 원숭이의 PLD4 유전자 서열은 아직 보고되어 있지 않기 때문에, 사이노몰거스 원숭이 및 레서스 원숭이의 PBMC (각각 10 mL; SHIN NIPPON BIOMEDICAL LABORATORIES, LTD.) 로부터, 유전자 클로닝을 행했다.
전체 RNA 를 원숭이의 말초혈로부터 추출하고, 그의 5 ㎍ 로부터, cDNA 를 올리고-dT 프라이머 및 SuperScript Choice System for cDNA Synthesis 키트를 이용해 합성했다.
제조된 cDNA 를 주형으로서 이용해, 사이노몰거스 원숭이 PLD4 및 레서스 원숭이 PLD4 유전자를, 하기의 염기 서열의 프라이머를 이용해 PCR 방법으로 증폭시켰다.
전방향 프라이머 (cynoPLD4-32F): 5' AGA TGC TGA AGC CTC TTC GGA GAG Cg 3' (SEQ ID NO: 61)
역방향 프라이머 (cynoPLD4-1554R): 5' TCA GCC CTG CCA AAC GCA GTC CTG G3' (SEQ ID NO: 62)
증폭된 약 1521 염기쌍의 사이노몰거스 원숭이 PLD4 및 l521 염기쌍의 레서스 원숭이 PLD4 cDNA 단편을, 1% 아가로오스 겔을 이용한 전기영동으로써 단리하고 수집하고, Zero Blunt TOPO PCR Cloning kit (Invitrogen company) 를 이용해 pCR4Blunt-TOPO 플라스미드 벡터 (Invitrogen company) 에 클로닝했다. 수득된 유전자의 염기 서열을 분석하고, 이를 SEQ ID NO: 63 및 SEQ ID NO: 124 로써 나타낸다. 목적의 사이노몰거스 원숭이 PLD4 및 레서스 원숭이 PLD4 유전자가 클로닝될 수 있음을 확인했다.
인간 PLD4 단백질은 사이노몰거스 원숭이 PLD4 (SEQ ID NO: 129) 과 약 94.4% 의 단백질 서열 동일성을 나타내며, 및 레서스 원숭이 PLD4 (SEQ ID NO: 130) 의 단백질 서열과는 약 94% 동일성을 나타낸다. 도 14 는 인간 PLD4 의 단백질 서열의 사이노몰거스 원숭이 PLD4, 레서스 원숭이 PLD4, 및 마우스 PLD4 (cDNA SEQ ID NO: 131, 아미노산 SEQ ID NO: 132) 에 대한 상동성을 나타낸다.
2) 사이노몰거스 원숭이 PLD4 발현 세포 안정성 균주의 제조
사이노몰거스 원숭이 PLD4 발현 세포 안정성 균주는, 제조된 사이노몰거스 원숭이 PLD4-pMX-IP 벡터를 이용한 인간 PLD4 발현 세포 안정성 균주 제조 방법과 동일한 방법으로 퓨로마이신의 존재 하 레트로바이러스 벡터로 감염시킨 CT125 세포를 배양함으로써 확립했다.
사이노몰거스 원숭이의 PLD4 발현을 확인하기 위해, 세포를, 원숭이 PLD4 로도 교차반응성을 나타내는 시판중인 마우스 항-인간 PLD4 폴리클로날 항체 (Abnova, Cat #: H00122618-B01P) 로 염색하고 FACS 분석을 수행했다. 그 결과, 사이노몰거스 원숭이 PLD4-CT125 세포 안정성 균주가 확립되고, 하이브리도마의 FACS 스크리닝에 이용했다 (도 16).
인간 PLD4-Ig 융합 단백질의 제조
항-인간 PLD4 모노클로날 항체의 제조에서 면역원으로서 사용하기 위해, 인간 PLD4 단백질의 세포외 영역 (56-506 a.a) 및 마우스 IgG2a Fc 단편 (중쇄 힌지, CH2 및 CH3 의 부분을 포함하는 234 a.a) 이 융합된 2142 bps 의 DNA 단편을 2 단계 PCR 방법으로써 증폭시키고, 인간 PLD4-Ig pcDNA3.1 및 인간 PLD4-Ig pEE14.4 의 발현 벡터 플라스미드를 구축했다 (cDNA 및 단백질의 서열은 서열 리스트에 명기함).
배양 상청액으로부터 단백질을 수득하기 위해, Maxi-prep DNA 을 Freestyle 293F 세포 (이하, 293F 세포, catalog No. R790-07; Invitrogen) 에 일시적으로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후 7 일 후에, 공동트랜스펙션된 293F 세포의 배양액을 50 ml 튜브에 수집하고, 5 분 동안 4℃ 에서 2,070 g 의 조건 하에 원심분리를 행했다. 상청액을 0.45 ㎛ 구멍 크기를 갖는 시린지 필터 (catalog No. 431220; CORNING) 를 이용해 필터링하고, 배양 상청액을 함께 수집했다.
수집된 세포 배양 상청액을 AKTA-FPLC 시스템의 단백질 A 친화도 컬럼으로 정제하고, 재조합 인간 PLD4-Ig 융합 단백질의 단백질을 정제했다 (도 7).
실시예 3
A. 항-인간 PLD4 모노클로날 항체의 제조
A-1) 면역화
면역원으로서, 상술된 재조합 PLD4-Ig 융합 단백질을 이용했다. PLD4-Ig 융합 단백질을, BALB/c 마우스 3 마리의 등뒤에 피하 투여했다. 프로인트 완전 및 불완전 아쥬번트 (SIGMA) 를 아쥬번트로서 이용하고, 처음에는 200 ㎍/마우스를 2 회 내지 4 회째에는 50 ㎍/마우스를 투여했다.
A-2) 항-혈청 역가의 확인
혈액을 3 회 면역화 및 4 회 면역화 후에 수집하고, 혈청 내 항-PLD4-Ig 역가를 ELISA 로 평가했다.
PLD4-Ig 융합 단백질을, 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 고체-상화 (phased) 했다. 항-혈청을 1000 배부터 3 배 단계희석하고, 729,000 배까지 희석 시리즈를 제조했다. 샘플 각각을 항원 고체-상화 플레이트에 50 ㎕ 첨가하고, 1차 반응을 수행했다. 세정 후, 2 차 반응을 HRP 표지 항-마우스 IgG (κ, λ) 항체로 수행하고, OPD (오르토-페닐렌디아민)으로 색 검정했다 (490 nm).
A-3) 세포 융합
비장 세포를, 항-혈청 역가의 상승이 인지된 마우스로부터 단리했다. 단리된 비장 세포 및 마우스 골수종 세포 (P3U1) 를 PEG 방법으로 융합하고, 융합 비장 세포의 선택 및 배양을 HAT 배지로부터 행했다.
CAL-1 세포를 이용한 하이브리도마의 FACS 스크리닝
HAT 선택 배양으로부터 얻은 융합 비장 세포의 각 클론을 생성하는 항체를 FACS 로 평가했다. 인간 pDC-like 세포 균주 CAL-1 세포 (2x105) 를 하기 각 하이브리도마의 50 ㎕ 배양 상청액과 4℃ 에서 15 분 동안 반응시켰다. 세포를 FACS 버퍼 (1% FBS + PBS) 로 2 회 세정하고, 원심분리하고, 상청액을 제거했다. 반응을 20 분 동안 4℃ 에서, PE 표지된 항-마우스 IgG 항체 (BD Bioscience: 550589) 를 2 차 항체로서 이용해 행했다. HAT 선택 배양 시작 후 10 일째에 배양액을, 각 클론의 배양 상청액에 대한 원래의 배 (original fold) 로서 이용했다. 그 결과, 하이브리도마 배양 상청액의 3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 14C1, 및 11G9.6 가 CAL-1 세포와 잘 반응했다 (도 11).
인간 PLD4-CT125 안정성 세포 균주를 이용한 하이브리도마의 FACS 스크리닝
HAT 선택 배양으로부터 수득한 융합 비장 세포의 각 클론을 생성하는 항체를 FACS 로 평가했다. 인간 PLD4-CT125 (2x105) 을 후술되는 각 하이브리도마의 배양 상청액 50 ㎕ 와 4℃ 에서 15 분 동안 반응시켰다. 세포를 FACS 버퍼 (1% FBS + PBS) 로 2 회 세정하고, 원심분리하고, 상청액을 제거했다. 반응을 20 분 동안 4℃ 에서 PE 표지된 항-마우스 IgG 항체 (BD Bioscience: 550589) 를 2 차 항체로서 이용해 행했다. 그 결과, 3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 14C1, 및 llG9.6 의 하이브리도마 배양 상청액은 인간 PLD4-CT125 세포와 잘 반응했다 (도 12).
A-5) 인간 말초혈 pDC 을 이용한 FACS 스크리닝
[인간 PBMC 의 단리]
건강한 개체의 20 mL 의 말초혈을 수집하고, 말초혈 단핵구 세포 (PBMC) 를 HISTOPAQUE-1077 (SIGMA company)를 이용한 비중 원심분리로 단리했다. 1x106 PBMC 를 모든 샘플마다 염색했다. 세포를 FACS 버퍼로 세정한 다음, Fc 블록 시약 (Militenyi company) 의 5 배 희석으로 25 ㎕ 첨가하고, 15 분 동안 4℃ 에서 반응시켰다. 세포를 FACS 버퍼로 세정한 다음 각 하이브리도마의 세포 상청액 50 ㎕, 및 마우스 IgG2b, κ 를 첨가하고, 4℃ 에서 20 분간 반응시켰다. 세포를 FACS 버퍼로 세정한 다음 PE-표지된 항-마우스 IgG 항체를 첨가하고 4℃ 에서 20 분간 반응시켰다. 세포를 FACS 버퍼로 세정한 다음 50 ㎕ 의 10 배 희석의 APC-표지된 항-BDCA2 항체를 첨가하고, 4℃ 에서 20 분간 반응시켰다. 세포를 FACS 버퍼로 세정한 다음 300 ㎕ 의 FACS 버퍼 중 재현탁하고 FACS Calibur (BD) 로 분석했다. mp11G9.6 항체는 pDC 와의 결합을 보였다 (도 10).
더욱이, 3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13Hll, 및 14C1 의 9 종류의 PLD4 항체는 BDCA2 양성 세포인 pDC 세포군에 있어서도 특이적 결합 반응을 보였다 (도 13).
A-6) 항-PLD4 항체의 원숭이와의 교차-반응성
사이노몰거스 원숭이 PLD4-CT125 안정성 세포 균주 및 레서스 원숭이 PLD4-293T 일시적 트랜스펙션체 세포를 이용한 하이브리도마의 FACS 스크리닝.
HAT 선택 배양으로부터 수득된 융합 비장 세포의 각 클론을 생성하는 항체를 FACS 로 평가했다. 인간 PLD4-CT125 (2x105) 을 15 분 동안 4℃ 에서 후술된 각 하이브리도마의 50 ㎕ 배양 상청액과 반응시켰다. 세포를 FACS 버퍼 (1% FBS + PBS) 로 2 회 세정하고, 원심분리하고. 상청액을 제거했다. 반응을 20 분 동안 4℃ 에서 PE 표지된 항-마우스 IgG 항체 (BD Bioscience: 550589) 를 2 차 항체로 이용해 행했다. 그 결과, 10 종류의 항체들 중 3B4, 5B7, 7B4, 13D4, 13H11, 14C1, 및 11G9.6 항체의 7 종류의 항체는 사이노몰거스 원숭이 PLD4-CT125 세포 및 레서스 원숭이 PLD4-293T 세포에 잘 반응했다 (도 15, 도 16, 및 도 17).
A-7) 원숭이 PBMC 에 대한 항-PLD4 항체의 교차 반응성
말초혈로부터 레서스 원숭이의 PBMC (10 mL; SHIN NIPPON BIOMEDICAL LABORATORIES, LTD.) 를 96% Ficoll-Paque (상표) PLUS (GE Healthcare company, Cat No. 17-1440-02) 를 이용해 비중 원심분리했다. FACS 를 위해, 5x 105 의 세포를 샘플당 이용했다. 세포를 FACS 버퍼 세포로 세정한 다음 FACS 버퍼로 희석된 10% 사이노몰거스 원숭이 혈청 10 ㎕ 를 더하고 4℃ 에서 20 분간 반응시켰다. 세포를 FACS 버퍼로 세정한 다음, 각 하이브리도마의 세포 배양 상청액 100 ㎕ 및 10 ㎍/mL 의 마우스 IgG2a, κ 또는 마우스 IgG1, κ 를 첨가하고, 4℃ 에서 15 분 반응시켰다. 세포를 FACS 버퍼로 세정한 다음 1 ㎍/mL 의 APC-표지된 항-마우스 IgG 항체를 첨가하고 4℃ 에서 20 분간 반응시켰다. 세포를 FACS 버퍼로 세정한 다음 25 ㎕ 의 10 배 희석의 FITC-표지된 항-Lineage 1 항체, PE-표지된 항-CD123 항체, 및 PcrCP-Cy5.5-포지된 항-HLA-DR 항체와, 4℃ 에서 15 분간 반응시켰다. 세포를 FACS 버퍼로 세정한 다음 300 ㎕ 의 FACS 버퍼 중 재현탁하고, FACS calibur 로 분석했다. 사용된 하이브리도마 배양 상청액은 PLD4 에 특이적이었고, CAL-1 세포 또는 인간 pDC 에 잘 결합된 10 종류의 3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 14C1, 및 11G9.6 을 선택했다. 그 결과로서, 5 종류의 하이브리도마 세포 배양 상청액, 즉 5B7, 7B4, 13D4, 13H11, 및 14C1 가 사이노몰거스 원숭이의 pDC 세포군 (Lineage-CD123+ HLA-DR+) 에 특이적으로 결합했다 (도 18).
A-8) 한계 희석 방법에 의한 하이브리도마의 클로닝
1) 한계 희석 방법에 의한 클로닝 및 제 2 차 스크리닝
11G9.6 하이브리도마를 제외하고 선택된 9 종류 (3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 및 14C1) 의 하이브리도마의 클로닝을 위해, 한계 희석을 행했다. 한계 희석은 2 장의 96 웰 플레이트 상에서 파종했다. 파종으로부터 6 일 후에, 세포를 현미경으로 관찰하고, 모노클론-유래되고 모든 웰에서 양호한 성장을 보이는 배양 상청액을 수집했다. FACS 분석을 샘플로서 수집된 배양 상청액에 대해 행했다.
FACS 분석에서, 세포 균주 CAL-1 의 표면 항원을, 각 클론의 배양 상청액 다음 2차 항체로서 PE-표지된 항-마우스 IgG 항체 (BD Bioscience: 550589) 를 이용해 염색했다. 각 클론의 배양 상청액으로서, 한계 희석 파종 후 7 일 후에 배양액을 원래의 배로 이용했다.
2) 클로닝 및 3 차 스크리닝
제 2 차 스크리닝의 FACS 분석 결과 및 각 웰에서의 세포 상태를 바탕으로, 1 개의 웰을 각 클론에서부터 선택하고, 한계 희석을 다시 수행했다. 한계 희석을 2) 에서와 마찬가지로 행하고, FACS 분석 (제 3 차) 을 샘플로서 수집된 배양 상청액에 대해서 행했다. FACS 분석 데이타 등에 기초하고, 하기의 9 종류 (3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 및 14C1) 의 클론을 한계 희석 방법에 의해 클로닝하고, 항-인간 PLD4 항체-생성 하이브리도마를 안정성 세포 균주로서 확립했다.
3) 단일 11G9.6 하이브리도마로의 전환
상술된 9 종류 이외의 11G9.6 하이브리도마를 수집하고, 분류 버퍼 (1% FBS/PBS) 로 1x105 세포/mL 가 되도록 현탁했다. 단일 세포 분류를, FACS Aria (BD) 를 이용해 행했다. 데이타를 통합하고, 통합된 데이타를 X 축: FSC 및 Y 축: SSC 의 2차원 도트 플롯 (dot plot) 으로 전개했다. 도트 플롯에서, 생 세포는 게이트 (gate) 에 둘러싸여 있었다. 생 세포 게이트 내의 세포로부터 더블릿 (doublet) 을 제외하기 위해 게이트를 걸고, 세포 집단을 96 웰 평평 플레이트로 1 세포/웰이 되게 단리하고 취했다. 단일 세포 분류 후 세포를 HAT 배지 (RPMI 1640+ 2 mM L-글루타민, 10 단위/mL 페니실린-스트렙타마이신, 10 mM HEPES, 1 mM 나트륨 피루베이트, 50 μM 2-ME) + 하이브리도마 성장 보충 HFCS (Roche company) 에서 배양했다. 이어서, CAL-1 세포, 인간 PLD4-CT125 발현 안정성 세포 균주, 인간 PBMC 및 원숭이 PLD4-CT125 발현 안정성 세포 균주를 하이브리도마의 세포 배양 상청액을 이용해 염색하고, 11G9.6 의 단일 하이브리도마를 선택했다.
4) 동결 세포 바이알의 제조 및 배양 상청액의 회수
상술된 FACS 분석 결과 및 각 웰의 세포 상태를 바탕으로, 1 웰을 각 클론으로부터 선택했다. 선택된 웰에 있어서, 확대 배양을 50 mL 스케일로 행했다. 배지는 10% FCS 및 페니실린 스트렙토마이신 포함 RPMI 1640 이었다. 세포를 하위-포화 (subconfluent) 까지 배양하고, 세포수 1x 106/튜브로 동결 및 보존했다. 동결 및 보존액으로서, BAMBANKER (NIPPON Genetics, Co. Ltd.) 을 이용했다. 추가적으로, 이때의 배양 상청액을 회수 및 보존했다.
실시예 4
항체의 정제
10 종류 (3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 14C1, 및 11G9.6) 의 정제된 항체를, 단백질 A 친화도 컬럼 (rProtein A Sepharose Fast Flow (catalog No. 17-1279-01, GE Healthcare company) 을 이용한 정제로써 하이브리도마의 배양 상청액으로부터 수득했다. 이소타입을 Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit (Thermo Fisher Scientific company) 를 이용해 확인했다. 그 결과로서, 3B4 및 14C1 는 마우스 IgGl, κ 이고, 10C3 는 마우스 IgG2a, κ 이고, 나머지는 마우스 IgG2b, κ 였다. 엔도톡신이 정제된 항체에 함유되어 있으면 이것이 특성 결정 테스트의 결과에 영향을 미칠 수 있으므로, 엔도톡신 농도 측정을 행했다. 사용된 키트는 Endospecy ES-50M 세트, Toxicolor DIA-MP 세트, 및 endotoxin standard CSE-L 세트 (SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION company) 였다. 그 결과로서, 임의의 정제된 항체의 엔도톡신 농도는 기준값인 0.3 EU/mg Ab 이하였다.
정제된 항체의 반응성 검토
정제된 항체의 결합능을, 인간 pDC-유사 세포 균주인 CAL-1 세포로 확인했다. 결과로서, 임의의 항체가 세포 표면 상 인간 PLD4 에 대한 결합능을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다 (도 11). 게다가, 상기 항체는 또한 인간 말초혈의 pDC 세포군 (BDCA2+) 에 특이적으로 결합했다 (도 13).
정제된 PLD4 항체의 Kd 값 산출
정제된 항체의 결합능에 있어서, 인간 PLD4-CT125 발현 안정성 세포 균주를 정제된 PLD4 항체의 농도를 저농도로부터 고농도까지(0.001 ㎍/mL 내지 30 ㎍/mL), 양성 염색율이 거의 100% 까지 되게 반응시켰다. 세포의 양성 염색율 및 항체를 Graph Pad Prism version 5 소프트웨어를 이용해 데이타 분석하고, 해리 상수 몰 농도 (Kd 값) 을 nM 단위로 컴퓨터 계산했다. 항-PLD4 항체의 Kd값 (nM) 은 3B4 및 14C1 의 2 클론을 제외하고, 모두 1nM 이하 또는 1 nM 부근의 Kd 값을 보인 점으로부터, 항-PLD4 항체는 인간 PLD4-CT125 세포에 매우 강력히 결합했다.
실시예 5
항-PLD4 항체의 인간 PLD4-CT125 발현 세포에 대한 보체 의존적 세포독성 활성
항-PLD4 항체의 보체 의존적 세포독성 활성 (이하, CDC 활성) 을, 보체 공급원으로서 미성숙 토끼 혈청을 이용해 인간 PLD4 를 발현하는 CT125 세포 안정성 균주에 대해 측정했다. 활성 지표는, 세포로부터 방출된 락토오스 데히드로게나아제 (LDH) 의 측정값으로부터 산출된 세포 독성이었다. 각 세포를 96 웰 U 바닥 플레이트에 2 x 104 세포/50 ㎕/웰로 분배했다. 1% Baby rabbit 보체 (CEDARLANE company) 를, CDC 배지 (RPMI 1640 + 0.1% BSA + 10 mM HEPES + 2 mM L-글루타민 + 1% Pen-Strep) 에서 제조했다. 세포에 10 ㎍/mL 의 마우스 이소타입 대조군 항체 (마우스 IgG2b, κ) 및 10 종류의 항-PLD4 마우스 정제된 항체 (3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 14C1, 및 11G9.6) 를 부가하고 1 시간 반응시켰다. 검정 시스템을 위해, CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega company) Kit 를 이용했다. 그 결과, HuPLD4-CT-125 의 타겟 세포에 있어서, 8 종류의 PLD4 항체 (5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 및 11G9.6) 가, 중쇄 이소타입이 마우스 IgG1 인 3B4 및 14C 의 2 종류의 PLD4 항체를 제외하고, 10 ㎍/mL 의 항체 농도로 약 33.5% 내지 71.1% 의 CDC 활성을 보였다 (도 20).
실시예 6
항-PLD4 항체 (11G9.6) 의 농도-의존적 보체-의존적 세포독성 활성 마우스 이소타입 대조군 항체 (마우스 IgG2b, κ), 항-PLD4 마우스 항체 (mp11G9.6 Ab), 인간 이소타입 대조군 항체 (human IgGl, κ), 및 항-PLD4 키메라 항체 (ch11G9 Ab) 를 0.1 ㎍/mL 내지 30 ㎍/mL 까지의 합계 6 점의 항체 농도로 조절했다. 검정 시스템으로서, CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega company) 키트를 이용했다. 그 결과로서, HuPLD4-CT-125 의 표적 세포에 대하여, mp11G9.6Ab 는 3 ㎍/mL 의 항체 농도로 농도 의존적으로 약 70% CDC 활성을 보였다. 한편, 키메라 항체인 ch11G9Ab 는 30 ㎍/mL 의 고농도에서도 10% 이하의 CDC 활성을 보였다 (도 21).
실시예 7
키메라 항체의 제조
마우스 항-PLD4 항체를 생성하는 하이브리도마로서 10 종류를 제조하고 이용했다.
1. 불변 영역의 이소타입의 확인
항-PLD4 항체를 생성하는 하이브리도마로부터 생성된 마우스 항-PLD4 항체의 불변 영역의 이소타입을 확인했다. 10 종류 (3B4, 5B7, 7B4, 8C11, 10C3, 11D10, 13D4, 13H11, 14C1, 및 11G9.6) 의 하이브리도마의 배양 상청액으로부터, 이소타입을 Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit (Thermo Fisher Scientific company) 을 이용해 확인했다. 그 결과, 3B4 및 14C1 는 마우스 IgG1, 마우스 Ig kappa 였고, 10C3 는 마우스 IgG2a 및 마우스 Ig kappa 였고, 나머지는 마우스 IgG2b 및 마우스 Ig kappa 이다.
2. 마우스 항-PLD4 항체의 가변 영역을 인코딩하는 cDNA 의 클로닝
2-1) 전체 RNA 의 단리
11G9.6 하이브리도마로부터, 전체 RNA 를 시판중인 키트 "RNeasy Mini Kit" (Qiagen company, catalog No.: 74106) 를 이용해 그에 첨부된 지시 사항에 따라 단리했다. 이것을 5x106 세포수의 하이브리도마 세포 균주로부터 제조하고 약 79 ㎍ 의 전체 RNA 를 수득했다.
2-2) 마우스 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 cDNA 의 증폭 및 단편화
2-1) 에서 단리된 5 ㎍ 의 전체 RNA 를 이용하고, 마우스 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 cDNA 를 5'RACE PCR 방법으로써 증폭시켰다. 증폭에 있어서, 시판중인 키트 "5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA ENDs, Version 2.0 Kit" (Invitrogen company, catalog No.: 18374-058) 를 이용했다. 상세 사항은 하기와 같다. 먼저, 2-1) 에서 수득된 전체 RNA 로부터 역전사 효소에 의해 단일-가닥 cDNA 를 합성했다. 동시에, 이용된 안티센스 프라이머 (GSP1) 을 하기와 같다. cDNA 의 증폭에서 사용된 GSP1 프라이머는 각각의 마우스 중쇄의 이소타입에 따라 상이하게 사용되었다.
예를 들어, 마우스 IgG1 중쇄를 갖는 3B4 및 14C1 하이브리도마의 중쇄 가변 영역의 클로닝에 있어서, 하기의 안티센스 프라이머를 이용한다.
GSP1 프라이머: mu IgG1VH-GSP1
서열: 5'-CCA GGA GAG TGG GAG AGG CTC TTC TCA GTA TGG TGG-3'(36-mer) (SEQ ID NO: 64)
GSP2 프라이머: mu IgG1VH-GSP2
서열: 5'-GGC TCA GGG AAA TAG CCC TTG ACC AGG CAT CC-3'(32-mer) (SEQ ID NO: 65)
마우스 IgG2a 중쇄를 갖는 10C3 하이브리도마의 중쇄 가변 영역의 클로닝에 있어서, 하기의 안티센스 프라이머를 이용한다.
GSP1 프라이머: mu IgGHγ1-GSP1
서열: 5'TCC AGA GTT CCA GGT CAC TGT CAC 3'(24-mer) (SEQ ID NO: 66)
GSP2 프라이머: mu IgGHγ1-GSP2
서열: 5'AGG GGC CAG TGG ATA GAC AGA TGG 3'(24-mer) (SEQ ID NO: 67)
마우스 IgG2b 중쇄를 갖는 5B7, 7B4, 8C11, 11D10, 13D4, 13H11, 및 11G9.6 하이브리도마의 중쇄 가변 영역의 클로닝에 있어서, 하기의 안티센스 프라이머가 사용된다.
GSP1 프라이머: mu IgGHγ2B-GSP1
서열: 5'TCC AGA GTT CCA AGT CAC AGT CAC 3'(24-mer) (SEQ ID NO: 68)
GSP2 프라이머: mu IgGHγ2B-GSP2
서열: 5'AGG GGC CAG TGG ATA GAC TGA TGG 3'(24-mer) (SEQ ID NO: 69)
나아가, 단일-가닥 cDNA 의 3'-말단에, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 (TdT) 를 이용해 뉴클레오티드 호모폴리머인 dC 를 첨가했다. 이어서, cDNA 를 dc (고정 (anchor) 서열)과 상보적인 뉴클레오티드 중합체를 3'-말단에 갖는 고정 프라이머 (SEQ ID NO: 70) 및 안티센스 프라이머 (GSP2) 를 이용해 PCR 방법으로써 증폭시켰다. 나아가, 수득된 PCR 생성물을 주형으로서 이용하고, AUAP 프라이머 (SEQ ID NO: 71) 및 표 1 에 나타낸 안티센스 프라이머 (GSP2) 를 이용해 Nested PCR 방법으로써 cDNA 를 증폭시켰다. 나아가, 상기 PCR 생성물을 1.5% 저융점 아가로오스 방법에 의해 정제했다.
5'RACE 용 고정 프라이머 (SEQ ID NO: 70)
5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3' (36-mer)
5'RACE 용 AUAP 프라이머 (SEQ ID NO: 71)
5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3' (20-mer)
2-3) 마우스 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 cDNA 의 증폭 및 단편화
마우스 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 cDNA 를, 단리된 2-1) 에서 전체 RNA 로부터 2-2) 와 유사하게 하여 증폭시켰다. 이때, cDNA 의 증폭에 사용된 GSP1 프라이머를 각 마우스 경쇄의 이소타입에 따라 상이하게 사용했다.
하기의 안티센스 프라이머를, 10 종류의 PLD4 항체가 마우스 Ig 카파 경쇄를 갖기 때문에 경쇄에 대해 이용했다.
GSP1 프라이머: mu IgG VL kappa-GSP1
서열: 5'-CAC TAC TTC CTG TTG AAG CTC TTG ACG ATG G-3'(31-mer) (SEQ ID NO: 72)
GSP2 프라이머: mu IgG VL kappa-GSP2
서열: 5'-GTG AGT GGC CTC ACA GGT ATA GC-3'(23-mer) (SEQ ID NO: 73)
수득된 PCR 생성물을 1.5% 저융점 아가로오스 방법에 의해 정제했다.
2-4) cDNA 염기 서열의 확인 및 CDR 영역의 결정
2-2) 에서 수득된 중쇄 가변 영역, 및 2-3) 에서 수득된 경쇄 가변 영역의 cDNA 단편을, 각각 시판중인 키트 "Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit" (Invitrogen company, catalog No.: 1325137) 로, 그에 첨부된 지시 사항에 따라 pCR4Blunt-TOPO 벡터로 클로닝하고, 대장균 경쟁 세포에 형질전환시켜 대장균 형질전환체를 수득했다. 상기 형질전환체로부터 플라스미드를 수득하고, 플라스미드 DNA 샘플을 Operon Biotechnology Co. Ltd company (Tokyo) 에 서열 분석을 위해 보내고, 플라스미드 내 cDNA 염기 서열을 확인했다. 서열 분석에 있어서, 소프트웨어 "Sequencher DNA sequence assembly and analysis software version 4.2.2 (Gene Codes Corporation)" 및 "GENETYX-MAC Version. 11.1.1 software (GENETYX CORPORATION)" 을 이용했다.
프레임 시프트, 넌센스 돌연변이 등이 상보성-결정 영역 (이하, "CDR 영역" 으로서 지칭) 의 주변에서 발생하기 때문에, 불활성 RNA 의 전사물을 제외하고 올바른 서열의 전사물이 추출되었다. 더욱이, 플라스미드에 포함된 cDNA 염기 서열에 있어서, Immunoglobulins 데이타베이스 (IgBLAST, URL: www.ncbi.nlm.nih.gov/Igblast/) 로 상동성을 확인하고,각 가변 영역 내 CDR 영역 (CDR; CDR1, CDR2, 및 CDR3), FW 영역 (골격부 영역) 및 가변 영역을 Kabt 넘버링 시스템 (Kabat et al, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91-3242, 5th ed., united States Department of Health and Human Services, Bethesda, MD) 의 분석 방법에 따라 결정했다.
수득된 마우스 11G9.6 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 74 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 75 이다. 마우스 11G9.6 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4 이다.
수득된 마우스 3B4 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 76 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 77 이다. 마우스 3B4 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 및 SEQ ID NO: 10 이다.
수득된 마우스 5B7 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 78 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 79 이다. 마우스 5B7 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, 및 SEQ ID NO: 16 이다.
수득된 마우스 7B4 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 80 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 81 이다. 마우스 7B4 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, 및 SEQ ID NO: 16 이다. 7B4 항체는 5B7 항체의 것과 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR 서열을 가진 항체이다.
수득된 마우스 8C11 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 82 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 83 이다. 마우스 8C11 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 및 SEQ ID NO: 22 이다.
수득된 마우스 10C3 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 84 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 85 이다. 마우스 10C3 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, 및 SEQ ID NO: 28 이다.
수득된 마우스 11D10 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 86 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 87 이다. 마우스 11D10 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, 및 SEQ ID NO: 28 이다. 11D10 항체는 10C3 항체의 동일한 경쇄 가변 영역 CDR 서열 내지 중쇄를 가진 항체이다. 그러나, 중쇄 이소타입 (10C3 은 마우스 IgG2a 의 불변 영역이고, 11D10 는 마우스 IgG2b 의 불변 영역임) 은 상이하다.
수득된 마우스 13D4 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 88 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 89 이다. 마우스 13D4 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 및 SEQ ID NO: 34 이다.
수득된 마우스 13H11 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 90 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 91 이다. 마우스 13H11 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, 및 SEQ ID NO: 40 이다.
수득된 마우스 14C1 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 92 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 93 이다. 마우스 14C1 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, 및 SEQ ID NO: 40 이다. 14C1 항체는 13H11 항체의 것과 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 CDR 서열을 가진 항체이다. 그러나, 중쇄 이소타입 (13H11 은 마우스 IgG2b 의 불변 영역이고, 14C1 는 마우스 IgG1 의 불변 영역임) 은 상이하다.
마우스 11G9.6 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 94 이고 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 95 이다. 마우스 11G9.6 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 및 SEQ ID NO: 7 이다.
마우스 3B4 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 96 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 97 이다. 마우스 3B4 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 및 SEQ ID NO: 13 이다.
마우스 5B7 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 98 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 99 이다. 마우스 5B7 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, 및 SEQ ID NO: 19 이다.
마우스 7B4 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 100 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 101 이다. 마우스 7B4 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, 및 SEQ ID NO: 19 이다.
마우스 8C11 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 102 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 103 이다. 마우스 8C11 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, 및 SEQ ID NO: 25 이다.
마우스 10C3 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 104 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 105 이다. 마우스 10C3 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, 및 SEQ ID NO: 31 이다.
마우스 11D10 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 106 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 107 이다. 마우스 11D10 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, 및 SEQ ID NO: 31 이다.
마우스 13D4 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 108 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 109 이다. 마우스 13D4 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, 및 SEQ ID NO: 37 이다.
마우스 13H11 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 100 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 111 이다. 마우스 13H11 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, 및 SEQ ID NO: 43 이다.
마우스 14C1 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 112 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 113 이다. 마우스 14C1 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, 및 SEQ ID NO: 43 이다.
3. 키메라 항체 11G9.6 의 발현 벡터의 제조
3-1. 인간 Ig 불변 영역을 인코딩하는 cDNA 의 클로닝
인간 PBMC 의 전체 RNA 로부터, 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 및 인간 Ig kappa 경쇄 불변 영역의 cDNA 를 클로닝하고, 각각 시판 중인 키트 "Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit" (Invitrogen company 제작, catalog No.: 1325137) 를 그에 첨부된 지시 사항에 따라 pCR4Blunt-TOPO 벡터로 클로닝하고, 대장균 경쟁 세포로 형질전환시켜 대장균 형질전환체를 수득했다. 상기 형질전환체로부터 플라스미드를 수득하고, 플라스미드 DNA 샘플을 Operon Biotechnology Co. Ltd (Tokyo) 에 서열 분석을 위해 보내고, 플라스미드 내 cDNA 염기 서열을 확인했다.
3-2. 키메라 PLD4 항체의 중쇄를 인코딩하는 cDNA 의 제조
키메라 PLD4 항체의 중쇄를 인코딩하는 cDNA 를 2-2 에서 수득된 마우스 11G9.6 항체의 중쇄 가변 영역 및 인간 IgG1 의 중쇄 불변 영역을 가진 pEE6.4 벡터 발현 벡터로 리게이션으로써 제조했다. 마우스 11G9.6 항체의 중쇄 가변 영역을 PCR 방법으로 증폭하고, 약 450 염기장의 PCR 생성물을 수득했다. 이때, 프라이머를 표 1 에 나타낸다. 수득된 PCR 생성물을 1.5% 저용융점 아가로오스 방법으로써 정제했다.
Figure pct00001
2-2 에서 수득된 마우스 11G9.6 항체의 중쇄 가변 영역을 PCR 방법에 적용시켜 "11G9.6 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 PCR 생성물"을 수득했다. 11G9.6 의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 PCR 생성물을 Hind III 및 Apa I 제한 효소로 소화하고, 1.5% 아가로오스 겔 방법으로 정제했다. 이를 ddH2O 중에 용해하고, 이를 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 cDNA 단편의 용액으로서 취했다.
수득된 cDNA 를, 키메라 11G9.6 의 VH 코드 영역의 EE6.4 벡터 (Lonza Biologics, Slough, UK 제작) 으로의 클로닝에 바람직한 제한 부위 (Hind III 및 Apa I) 및 이상적인 Kozak 서열 (GCCGCCACC) 을 Hind III 및 Apa I 의 클로닝 부위로서 도입된 프라이머 chi11G9VH-IF (Hind III) 및 chi11G9VL-408R 를 이용해 11G9.6 VH 영역을 포함하는 pCR4Blunt-TOPO 플라스미드 클론으로부터 PCR 로 증폭했다. Chi11G9VH-pEE6.4 벡터는 인간 IgG1 의 중쇄 불변 영역을 포함한다. VH PCR 단편을, Hind III 및 Apa I 을 이용해 인-프레임으로 pEE6.4 벡터에 삽입했다. 구축물을 cDNA 염기 서열 분석으로 조사했다. 서열 분석을 위해, 플라스미드 DNA 샘플을 Operon Biotechnology Co. Ltd (Tokyo) 에 보내고, 플라스미드 내 cDNA 염기 서열을 확인했다.
3.3 키메라 PLD4 항체의 경쇄를 인코딩하는 cDNA 의 제조
키메라 PLD4 항체의 경쇄를 인코딩하는 cDNA 를 제조하기 위해, 2-3 에서 수득된 마우스 11G9.6 항체의 경쇄 가변 영역 및 3-2 에서 수득된 인간 Ig 카파의 경쇄 불변 영역을 융합해 PCR 단편을 수득하고, 이 PCR 단편을, 오버랩 신장 PCR 방법을 기초로 하는 접근법으로써 약 730 염기장의 PCR 생성물로 증폭시켰다.
11G9.6 의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 PCR 생성물을 Hind III 및 EcoR I 제한 효소로 소화시키고, 1.5% 아가로오스 겔 방법으로 정제했다. 이를 ddH2O 중에 용해하고, 이를 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 cDNA 단편의 용액으로서 취했다.
키메라 11G9 의 VL 을 인코딩하는 수득된 cDNA 를, pEE14.4 벡터 (Lonza Biologics 제작) 의 클로닝을 위한 바람직한 제한 부위 (Hind III 및 EcoR I) 및 이상적 Kozak 서열을 도입한 프라이머 chi11G9VL-IF (Hind) 및 chi11G9VL-726R (R I) 를 이용해, 11G9.6 VL 영역을 포함하는 pCR4Blunt-TOPO 플라스미드 클론으로부터 PCR 로 증폭시켰다. Chi11G9VL-pEE14.4 벡터는 카파의 경쇄 불변 영역을 포함한다. VL PCR 단편을, Hind III 및 EcoR I 을 이용해 인-프레임으로 pEE14.4 벡터에 삽입했다. 구축물을 cDNA 염기 서열 분석으로써 조사했다.
3.4 키메라 PLD4 항체 (ch11G9VH/VL) 의 이중 유전자 Lonza 발현 벡터의 구축
하나의 2-유전자 벡터에서 조합된 키메라 PLD4 항체 (chi11G9DG 벡터) Lonza 발현 벡터를, 키메라 PLD4 항체 중쇄 발현 벡터 (chi11G9VH-pEE6.4), 및 키메라 PLD4 항체 경쇄 벡터 (chi11G9VL-pEE14.4) 로부터, 표준 클로닝 기술로써 구축했다.
4. 293F 세포에서 일시적 발현
80 ㎍ 의 chillG9DG Lonza 벡터 DNA, 일시적 발현 벡터 플라스미드를 이용했다.
293F 세포를, 트랜스펙션 전일에 250 mL Erlenmyer 플라스크 (catalog No. 431144; CORNING 제작) 에서 8×105 세포/mL 에서 80 mL 로 조합해 37℃ 및 8% CO2 농도의 조건에서 7 일 동안 진탕 하 배양했다.
7 일 동안 배양 후, 트랜스펙션된 293F 세포의 배양액을 50 mL 튜브에 회수하고, 원심분리를 2,070 g 로 4℃ 에서 5 분간 행했다. 상청액을 0.45 ㎛ 구멍 크기를 가진 시린지 필터 (catalog No. 431220; CORNING 제작) 로 여과하고, 배양 상청액을 항체 정제를 위해 회수했다.
5. 항-PLD4 키메라 항체의 정제
수집된 배양 상청액을 이용해, 항체 정제를 AKTA-FPLC (GE Healthcare Japan 제조) 및 software Unicorn 5.0 을 이용해 행했다.
키메라 11G9.6 항체 정제용의 컬럼으로서, HiTrap MabSelect SuRe 1 mL (catalog No. 11-0034-93, Lot No. 10032458; GE Healthcare Japan 제작) 을 이용했다. 컬럼 조건은 하기와 같다. 친화도 정제를 결합 버퍼 (20 mM 나트륨 포스페이트, 0.l5 M NaCl, pH 7.4) 및 용리 버퍼 (20 mM 나트륨 시트레이트, pH 3.4) 를 이용해 행했다. 정제 후 항체의 버퍼를 PBS 로 대체하기 위해, 버퍼 교환을 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Unit 10kMWCO 를 이용해 행했다.
정제된 항체의 농도는, 280 nm 에서 흡광도를 측정함으로써 계산하고, 이때 1 mg/mL 을 1.38 OD 로서 산출했다.
정제된 항-PLD4 키메라 항체의 ch11G9.6Ab 에 있어서, 단백질 품질을, 유세포분석 방법 및 SDS-PAGE 로 분석했다.
실시예 8
제조된 항-인간 PLD4 키메라 항체 (ch11G9.6 Ab) 의 항체-의존적 세포 세포독성 (ADCC 활성) 을 측정했다. 활성에 있어서, 세포로부터 방출된 락타아제 데히드로게나아제 (LDH) 의 측정치로 산출된 세포 독성을 지표로서 이용했다. 효과기 세포가 된 인간 말초혈 단핵구 세포를 HISTOPAQUE-1077 를 이용한 비중 원심분리로 정제했다. 표적이 되는 세포로서, CHO-K1 세포 균주 (중국 햄스터 난소 세포 균주) 를 이용하는 인간 PLD4 유전자의 강제 형질전환된 세포 (이하, HuPLD4-CHO) 를 이용했다 (2x104/웰). 효과기 및 표적 세포를 10:1, 20:1, 40:1, 및 80:1 의 비율로 혼합하고, 10 mg/mL 의 ch11G9Ab 또는 이소타입 대조군 항체 (인간 IgG1, κ) 를 더해, 37℃ 에서 4 시간 배양하고, 항체의 세포독성 활성의 효과를 평가했다. 그 결과, 항-hPLD4 키메라 항체의 ch11G9Ab 은 효과기 세포에 의존적으로 표적인 HuPLD4-CHO 세포에 대해 최대 약 50% 정도의 ADCC 활성을 보였다 (도 22). 이러한 결과는 제조된 항-PLD4 키마레 항체가 PLD4 를 발현하는 세포를 선택적으로 손상시킨다는 점을 입증시켰다.
pDC 에 대한 항-PLD4 항체의 효과를 검토했다. 인간 말초 혈액으로부터 PBMC 를 정제하고, 10 ㎍/mL 의 항-인간 PLD4 키메라 항체와 혼합해 24 시간 배양했다. 이어서, 세포를 24 시간 동안 pDC 에서 발현된 Toll-유사 수용체 9 의 리간드인 CpG2216 로 자극해 IFNα 생성을 유도했다. CpG 자극 후, 생성된 IFNα 의 양을 시험하고, IFNα 생성이 항-PLD4 키메라 항체의 ch11G9Ab 처리로써 완전히 저해되었음을 확인했다 (도 23). 상기 기작에 있어서, 세포를 ch11G9Ab 처리후 24 시간 후에 회수하고 pDC 세포를 항-CD123 항체, 항-HLA-DR 항체 및 항-Lineage 1 항체의 3중 염색으로 확인한 경우, pDC 세포군이 이소타입 대조군 항체 (인간 IgG1, κ) 처리보다도 더 감소되었음을 알아냈다 (도 24). 이들 결과는, 항-PLD4 키메라 항체가 PLD4 를 특이적으로 발현하는 pDC 를 손상시키고, 그 결과, CpG2216 자극에 의한 IFNα 생성이 저해됨을 지시한다.
ch11G9.6Ab 에 더해, ch3B4Ab, ch5B7Ab, ch8C11Ab, ch10C3Ab, ch13D4Ab, ch13H11Ab 등의 키메라 항-PLD4 Abs 의 생물학적 기능을 인간 일차 pDC 에서 조사했다. pDC 에 대한 ADCC 검정을 조사하기 위해, 전체 인간 PBMC 를 ch3B4Ab, ch5B7Ab, ch8C11Ab, ch10C3Ab, ch13D4Ab, ch13H11Ab, ch11G9.6Ab 또는 이소타입 Ab 와 함께 14 시간 동안 배양했다. 세포를 수확하고, BDCA2 및 BDCA4 를 염색해 유세포분석으로써 pDC 를 동정했다. 키메라 PLD4 Abs 로의 처리는 이소타입 Ab-처리된 PBMC 와 비교할 때 pDC 를 완전하게 격감시켰다 (도 25). IFNα 생성을 또한 키메라 항-PLD4 Abs 와 PBMC 의 배양에서 측정했다. 전체 인간 PBMC 를 ch3B4Ab, ch5B7Ab, ch8C11Ab, ch10C3Ab, ch13D4Ab, ch13H11Ab, ch11G9.6Ab, 또는 이소타입 Ab 로 처리했다. 24 시간 후에, IFNα 유도성 CpG2216 를 배양물에 첨가하고, 세포를 추가 24 시간 동안 배양했다. 배양 상청액을 회수하고 ELISA 로써 IFNα 생성을 측정했다. 키메라 PLD4 Ab-처리된 PBMC 전부는 이소타입 Ab-처리된 PBMC 와 비교시 IFNα 생성을 완전히 폐지시켰다 (도 26). 이들 결과는, 키메라 항-PLD4 Ab 가 다량의 IFNα 생성과 같은 pDC 기능을 ADCC 활성을 통한 pDC 를 소실시킴으로써 폐지시킨다는 점을 지시한다.
1. 수득된 항-PLD4 마우스 11G9.6 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 74 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 75 이다. 마우스 11G9.6 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4 이다.
항-PLD4 마우스 11G9.6 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열 (504 bp) [대문자: 마우스 11G9.6VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG2b 중쇄 불변 영역] (SEQ ID NO: 74)
Figure pct00002
마우스 11G9.6 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (168 a.a.) [대문자: 마우스 11G9.6VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG2b 중쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) (SEQ ID NO: 75) 을 나타낸다.
Figure pct00003
11G9.6 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1
SYWMH (SEQ ID NO: 2)
11G9.6 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR2
DIYPGSDSTNYNEKFKS (SEQ ID NO: 3)
11G9.6 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR3
GGWLDAMDY (SEQ ID NO: 4)
수득된 항-PLD4 마우스 11G9.6 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 38 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 39 이다. 마우스 11G9.6 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, 및 SEQ ID NO: 42 이다.
항-PLD4 마우스 11G9.6 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열 (421 bp) [대문자: 마우스 11G9.6VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역] (SEQ ID NO: 94)
Figure pct00004
마우스 11G9.6 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (140 a.a.) [대문자: 마우스 11G9.6VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 의 경쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) (SEQ ID NO: 95) 을 나타낸다.
Figure pct00005
11G9.6 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR1
RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 5)
11G9.6 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2
YTSRLHS (SEQ ID NO: 6)
11G9.6 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR3
QQGNTLPW (SEQ ID NO: 7)
2. 수득된 항-PLD4 마우스 3B4 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 76 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 77 이다. 마우스 3B4 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 및 SEQ ID NO: 10 이다.
항-PLD4 마우스 3B4 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열 (437 bp) [대문자: 마우스 3B4VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG1 중쇄 불변 영역]
Figure pct00006
마우스 3B4 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (145 a.a.) [대문자: 마우스 3B4VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG1 중쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 을 나타낸다.
Figure pct00007
3B4 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1
TYWMH
3B4 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR2
AIYPGNSETSYNQKFKG
3B4 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR3
GYSDFDY
수득된 항-PLD4 마우스 3B4 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 96 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 97 이다. 마우스 3B4 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 및 SEQ ID NO: 13 이다.
항-PLD4 마우스 3B4 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열 (459 bp) [대문자: 마우스 3B4VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역]
Figure pct00008
마우스 3B4 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (153 a.a.) [대문자: 마우스 3B4VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 을 나타낸다.
Figure pct00009
3B4 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR1
HASQGIRSNIG
3B4 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2
HGTNLED
3B4 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR3
VQYVQFP
3. 수득된 항-PLD4 마우스 5B7 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 78 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 79 이다. 마우스 5B7 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, 및 SEQ ID NO: 16 이다.
항-PLD4 마우스 5B7 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열 (475 bp) [대문자: 마우스 5B7VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG2b 중쇄 불변 영역]
Figure pct00010
마우스 5B7 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (158 a.a.) [대문자: 마우스 5B7VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG2b 중쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 을 나타낸다.
Figure pct00011
5B7 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1
DYNLH
5B7 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR2
YIYPYNGNTGYNQKFKR
5B7 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR3
GGIYDDYYDYAIDY
수득된 항-PLD4 마우스 5B7 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 98 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 99 이다. 마우스 5B7 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, 및 SEQ ID NO: 19 이다.
항-PLD4 마우스 5B7 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열 (467 bp) [대문자: 마우스 5B7VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역]
Figure pct00012
마우스 5B7 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (155 a.a.) [대문자: 마우스 5B7VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 을 나타낸다.
Figure pct00013
5B7 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR1
RASENIYSHIA
5B7 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2
GATNLAH
5B7 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR3
QHFWGTP
4. 수득된 항-PLD4 마우스 7B4 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 80 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 81 이다. 마우스 7B4 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, 및 SEQ ID NO: 16 이다.
항-PLD4 마우스 7B4 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열 (470 bp) [대문자: 마우스 7B4VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG2b 중쇄 불변 영역]
Figure pct00014
마우스 7B4 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (156 a.a.) [대문자: 마우스 7B4VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG2b 중쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 을 나타낸다.
Figure pct00015
7B4 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1
DYNLH
7B4 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR2
YIYPYNGNTGYNQKFKR
7B4 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR3
GGIYDDYYDYAIDY
수득된 항-PLD4 마우스 7B4 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 100 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 101 이다. 마우스 7B4 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, 및 SEQ ID NO: 19 이다.
항-PLD4 마우스 7B4 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열 (454 bp) [대문자: 마우스 7B4VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역]
Figure pct00016
마우스 7B4 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (151 a.a.) [대문자: 마우스 7B4VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 을 나타낸다.
Figure pct00017
7B4 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR1
RASENIYSHIA
7B4 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2
GATNLAH
7B4 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR3
QHFWGTP
5. 수득된 항-PLD4 마우스 8C11 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 82 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 83 이다. 마우스 8C11 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, 및 SEQ ID NO: 22 이다.
항-PLD4 마우스 8C11 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열 (462 bp) [대문자: 마우스 8C11VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG2b 중쇄 불변 영역]
Figure pct00018
마우스 7B4 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (154 a.a.) [대문자: 마우스 8C11VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG2b 중쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 을 나타낸다.
Figure pct00019
8C11 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1
SYYLY
8C11 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR2
LINPTNSDTIFNEKFKS
8C11 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR3
EGGYGYGPFAY
수득된 항-PLD4 마우스 8C11 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 102 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 103 이다. 마우스 8C11 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 이다.
항-PLD4 마우스 8C11 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열 (457 bp) [대문자: 마우스 8C11VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역]
Figure pct00020
마우스 8C11 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (152 a.a.) [대문자: 마우스 8C11VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 을 나타낸다.
Figure pct00021
8C11 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR1
TSSQTLVHSNGNTYLH
8C11 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2
KVSNRFS
8C11 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR3
HSTHVP
6. 수득된 항-PLD4 마우스 10C3 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 84 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 85 이다. 마우스 10C3 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, 및 SEQ ID NO: 28 이다.
항-PLD4 마우스 10C3 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열 (450 bp) [대문자: 마우스 10C3VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG2a 중쇄 불변 영역]
Figure pct00022
마우스 10C3 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (150 a.a.) [대문자: 마우스 10C3VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG2a 중쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 을 나타낸다.
Figure pct00023
10C3 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1
SYGMS
10C3 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR2
TISSGGSYIYYPESVKG
10C3 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR3
LYGGRRGYGLDY
수득된 항-PLD4 마우스 10C3 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 104 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 105 이다. 마우스 10C3 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, 및 SEQ ID NO: 31 이다.
항-PLD4 마우스 10C3 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열 (423 bp) [대문자: 마우스 10C3VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역]
Figure pct00024
마우스 10C3 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (141 a.a.) [대문자: 마우스 10C3VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 을 나타낸다.
Figure pct00025
10C3 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR1
RSSKSLLHSDGITYLY
10C3 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2
QMSNLAS
10C3 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR3
AQNLEL
7. 수득된 항-PLD4 마우스 11D10 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 86 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 87 이다. 마우스 11D10 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, 및 SEQ ID NO: 28 이다.
항-PLD4 마우스 11D10 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열 (450 bp) [대문자: 마우스 11D10VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG2b 중쇄 불변 영역]
Figure pct00026
마우스 11D10 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (150 a.a.) [대문자: 마우스 11D10VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG2b 중쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 을 나타낸다.
Figure pct00027
11D10 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1
SYGMS
11D10 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR2
TISSGGSYIYYPESVKG
11D10 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR3
LYGGRRGYGLDY
수득된 항-PLD4 마우스 11D10 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 106 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 107 이다. 마우스 11D10 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, 및 SEQ ID NO: 31 이다.
항-PLD4 마우스 11D10 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열 (423 bp) [대문자: 마우스 11D10VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역]
Figure pct00028
마우스 11D10 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (141 a.a.) [대문자: 마우스 11D10VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 을 나타낸다.
Figure pct00029
11D10 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR1
RSSKSLLHSDGITYLY
11D10 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2
QMSNLAS
11D10 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR3
AQNLEL
8. 수득된 항-PLD4 마우스 13D4 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 88 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 89 이다. 마우스 13D4 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, 및 SEQ ID NO: 34 이다.
항-PLD4 마우스 13D4 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열 (472 bp) [대문자: 마우스 13D4VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG2b 중쇄 불변 영역]
Figure pct00030
마우스 13D4 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (157 a.a.) [대문자: 마우스 13D4VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG2b 중쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 을 나타낸다.
Figure pct00031
13D4 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1
SHYYWT
13D4 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR2
YISYDGSNNYNPSLKN
13D4 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR3
EGPLYYGNPYWYFDV
수득된 항-PLD4 마우스 13D4 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 108 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 109 이다. 마우스 13D4 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, 및 SEQ ID NO: 37 이다.
항-PLD4 마우스 13D4 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열 (404 bp) [대문자: 마우스 13D4VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역]
Figure pct00032
마우스 13D4 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (134 a.a.) [대문자: 마우스 13D4VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 을 나타낸다.
Figure pct00033
13D4 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR1
RASQDIDNYLN
13D4 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2
YTSRLHS
13D4 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR3
QQFNTLP
9. 수득된 항-PLD4 마우스 13H11 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 90 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 91 이다. 마우스 13H11 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, 및 SEQ ID NO: 40 이다.
항-PLD4 마우스 13H11 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열 (471 bp) [대문자: 마우스 13H11VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG2b 중쇄 불변 영역]
Figure pct00034
마우스 13H11 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (157 a.a.) [대문자: 마우스 13H11VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG2b 중쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 을 나타낸다.
Figure pct00035
13H11 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1
SHYYWS
13H11 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR2
YISYDGSNNYNPSLKN
13H11 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR3
EGPLYYGNPYWYFDV
수득된 항-PLD4 마우스 13H11 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 110 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 111 이다. 마우스 13H11 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, 및 SEQ ID NO: 43 이다.
항-PLD4 마우스 13H11 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열 (414 bp) [대문자: 마우스 13H11VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역]
Figure pct00036
마우스 13H11 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (138 a.a.) [대문자: 마우스 13H11VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) (SEQ ID NO: 95) 을 나타낸다.
Figure pct00037
13H11 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR1
RASQDIDNYLN
13H11 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2
YTSRLHS
13H11 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR3
QQFNTLP
10. 수득된 항-PLD4 마우스 14C1 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 92 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 93 이다. 마우스 14C1 항체의 중쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, 및 SEQ ID NO: 40 이다.
항-PLD4 마우스 14C1 항체의 중쇄 가변 영역의 핵산 서열 (470 bp) [대문자: 마우스 14C1VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG1 중쇄 불변 영역]
Figure pct00038
마우스 14C1 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (156 a.a.) [대문자: 마우스 14C1VH 가변 영역, 소문자: 마우스 IgG1 중쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 을 나타낸다.
Figure pct00039
14C1 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1
SHYYWS
14C1 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR2
YISYDGSNNYNPSLKN
14C1 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR3
EGPLYYGNPYWYFDV
수득된 항-PLD4 마우스 14C1 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 112 이고, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 113 이다. 마우스 14C1 항체의 경쇄 가변 영역에서 CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, 및 SEQ ID NO: 43 이다.
항-PLD4 마우스 14C1 항체의 경쇄 가변 영역의 핵산 서열 (465 bp) [대문자: 마우스 14C1VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역]
Figure pct00040
마우스 14C1 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (155 a.a.) [대문자: 마우스 14C1VL 가변 영역, 소문자: 마우스 Igκ 경쇄 불변 영역]. 밑줄그은 서열은 시그널 서열을 나타내고, 두줄 밑줄은 CDR 영역 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 을 나타낸다.
Figure pct00041
14C1 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR1
RASQDIDNYLN
14C1 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2
YTSRLHS
14C1 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR3
QQFNTLP
제조된 키메라 11G9 항체의 중쇄 및 경쇄의 염기 서열 및 아미노산 서열은 각각 하기 서열 번호이다:
중쇄
SEQ ID NO: 120 (염기 서열)
SEQ ID NO: 121 (아미노산 서열)
경쇄
SEQ ID NO: 122 (염기 서열)
SEQ ID NO: 123 (아미노산 서열)
11. 항-PLD4 키메라 11G9 항체의 중쇄의 핵산 서열 (1401 bp) [대문자: 키메라 11G9VH 가변 영역, 소문자: 인간 IgG1 중쇄 불변 영역] (SEQ ID NO: 120)
Figure pct00042
12. 항-PLD4 키메라 11G9 항체의 중쇄의 아미노산 서열 (466 a.a.) [대문자: 키메라 11G9VH 가변 영역, 소문자: 인간 IgG1 중쇄 불변 영역] (SEQ ID NO: 121)
Figure pct00043
13. 항-PLD4 키메라 11G9 항체의 경쇄의 핵산 서열 (705 bp) [대문자: 키메라 11G9VL 가변 영역, 소문자: 인간 Igκ 경쇄 불변 영역] (SEQ ID NO: 122)
Figure pct00044
14. 항-PLD4 키메라 11G9 항체의 경쇄의 아미노산 서열 (234 a.a.) [대문자: 키메라 11G9VL 가변 영역, 소문자: 인간 Igκ 경쇄 불변 영역] (SEQ ID NO: 123)
Figure pct00045
PLD4-관련 분자에서 cDNA 및 단백질의 서열
> 인간 PLD4 cDNA (1521 bp) (SEQ ID NO: 44)
Figure pct00046
> 인간 PLD4 단백질 (506 아미노산) (SEQ ID NO: 1)
Figure pct00047
> 사이노몰거스 원숭이 PLD4 cDNA (1521 bp) (SEQ ID NO: 63)
Figure pct00048
> 사이노몰거스 원숭이 PLD4 단백질 (506 아미노산) (SEQ ID NO: 129)
Figure pct00049
> 레서스 원숭이 PLD4 cDNA (1521 bp) (SEQ ID NO: 124)
Figure pct00050
> 레서스 원숭이 PLD4 단백질 (506 아미노산) (SEQ ID NO: 130)
Figure pct00051
> 마우스 PLD4 cDNA (1512 염기쌍) (SEQ ID NO: 131)
Figure pct00052
> 마우스 PLD4 단백질 (503 아미노산) (SEQ ID NO: 132)
Figure pct00053
> 인간 PLD3 cDNA 서열 (SEQ ID NO: 55)
Figure pct00054
> 인간 PLD3 단백질 (490 아미노산) (SEQ ID NO: 127)
Figure pct00055
> 인간 PLD5 cDNA (1338 염기쌍) (SEQ ID NO: 56)
Figure pct00056
> 인간 PLD5 단백질 (445 아미노산) (SEQ ID NO: 128)
Figure pct00057
> 인간 PLD4-Ig 융합 단백질 cDNA (2142 bp) (SEQ ID NO: 125)
Figure pct00058
> 인간 PLD4-Ig 융합 단백질 (713 아미노산) (SEQ ID NO: 126)
Figure pct00059
[수탁 번호]
NITE BP-1211
NITE BP-1212
NITE BP-1213
NITE BP-1214
[서열 목록 자유 텍스트]
SEQ ID NO 45: 전방향 프라이머
SEQ ID NO 46: 역방향 프라이머
SEQ ID NO 47: 전방향 프라이머
SEQ ID NO 48: 역방향 프라이머
SEQ ID NO 49: 전방향 프라이머
SEQ ID NO 50: 역방향 프라이머
SEQ ID NO 51: 전방향 프라이머
SEQ ID NO 52: 역방향 프라이머
SEQ ID NO 53: 전방향 프라이머
SEQ ID NO 54: 역방향 프라이머
SEQ ID NO 70: 고정 프라이머
SEQ ID NO 70: n 은 데옥시이노신임
SEQ ID NO 71: AUAP 프라이머
SEQ ID NO 72: 프라이머
SEQ ID NO 73: 프라이머
SEQ ID NO 114: 프라이머
SEQ ID NO 115: 프라이머
SEQ ID NO 116: 프라이머
SEQ ID NO 117: 프라이머
SEQ ID NO 118: 프라이머
SEQ ID NO 119: 프라이머
National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary (NPMD) NITEBP-1211 20120127 National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary (NPMD) NITEBP-1212 20120127 National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary (NPMD) NITEBP-1213 20120127 National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary (NPMD) NITEBP-1214 20120127
SEQUENCE LISTING <110> SBI BIOTECH CO., LTD. <120> ANTI PHOSPHOLIPASE D4 ANTIBODY <130> W6651-000000 <160> 132 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 506 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(506) <400> 1 Met Leu Lys Pro Leu Trp Lys Ala Ala Val Ala Pro Thr Trp Pro Cys 1 5 10 15 Ser Met Pro Pro Arg Arg Pro Trp Asp Arg Glu Ala Gly Thr Leu Gln 20 25 30 Val Leu Gly Ala Leu Ala Val Leu Trp Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 35 40 45 Cys Leu Leu Trp Gln Val Pro Arg Pro Pro Thr Trp Gly Gln Val Gln 50 55 60 Pro Lys Asp Val Pro Arg Ser Trp Glu His Gly Ser Ser Pro Ala Trp 65 70 75 80 Glu Pro Leu Glu Ala Glu Ala Arg Gln Gln Arg Asp Ser Cys Gln Leu 85 90 95 Val Leu Val Glu Ser Ile Pro Gln Asp Leu Pro Ser Ala Ala Gly Ser 100 105 110 Pro Ser Ala Gln Pro Leu Gly Gln Ala Trp Leu Gln Leu Leu Asp Thr 115 120 125 Ala Gln Glu Ser Val His Val Ala Ser Tyr Tyr Trp Ser Leu Thr Gly 130 135 140 Pro Asp Ile Gly Val Asn Asp Ser Ser Ser Gln Leu Gly Glu Ala Leu 145 150 155 160 Leu Gln Lys Leu Gln Gln Leu Leu Gly Arg Asn Ile Ser Leu Ala Val 165 170 175 Ala Thr Ser Ser Pro Thr Leu Ala Arg Thr Ser Thr Asp Leu Gln Val 180 185 190 Leu Ala Ala Arg Gly Ala His Val Arg Gln Val Pro Met Gly Arg Leu 195 200 205 Thr Arg Gly Val Leu His Ser Lys Phe Trp Val Val Asp Gly Arg His 210 215 220 Ile Tyr Met Gly Ser Ala Asn Met Asp Trp Arg Ser Leu Thr Gln Val 225 230 235 240 Lys Glu Leu Gly Ala Val Ile Tyr Asn Cys Ser His Leu Ala Gln Asp 245 250 255 Leu Glu Lys Thr Phe Gln Thr Tyr Trp Val Leu Gly Val Pro Lys Ala 260 265 270 Val Leu Pro Lys Thr Trp Pro Gln Asn Phe Ser Ser His Phe Asn Arg 275 280 285 Phe Gln Pro Phe His Gly Leu Phe Asp Gly Val Pro Thr Thr Ala Tyr 290 295 300 Phe Ser Ala Ser Pro Pro Ala Leu Cys Pro Gln Gly Arg Thr Arg Asp 305 310 315 320 Leu Glu Ala Leu Leu Ala Val Met Gly Ser Ala Gln Glu Phe Ile Tyr 325 330 335 Ala Ser Val Met Glu Tyr Phe Pro Thr Thr Arg Phe Ser His Pro Pro 340 345 350 Arg Tyr Trp Pro Val Leu Asp Asn Ala Leu Arg Ala Ala Ala Phe Gly 355 360 365 Lys Gly Val Arg Val Arg Leu Leu Val Gly Cys Gly Leu Asn Thr Asp 370 375 380 Pro Thr Met Phe Pro Tyr Leu Arg Ser Leu Gln Ala Leu Ser Asn Pro 385 390 395 400 Ala Ala Asn Val Ser Val Asp Val Lys Val Phe Ile Val Pro Val Gly 405 410 415 Asn His Ser Asn Ile Pro Phe Ser Arg Val Asn His Ser Lys Phe Met 420 425 430 Val Thr Glu Lys Ala Ala Tyr Ile Gly Thr Ser Asn Trp Ser Glu Asp 435 440 445 Tyr Phe Ser Ser Thr Ala Gly Val Gly Leu Val Val Thr Gln Ser Pro 450 455 460 Gly Ala Gln Pro Ala Gly Ala Thr Val Gln Glu Gln Leu Arg Gln Leu 465 470 475 480 Phe Glu Arg Asp Trp Ser Ser Arg Tyr Ala Val Gly Leu Asp Gly Gln 485 490 495 Ala Pro Gly Gln Asp Cys Val Trp Gln Gly 500 505 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Asp Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Gly Trp Leu Asp Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Thr Tyr Trp Met His 1 5 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Glu Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Tyr 1 5 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 His Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Asn Ile Gly 1 5 10 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 His Gly Thr Asn Leu Glu Asp 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Val Gln Tyr Val Gln Phe Pro 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asp Tyr Asn Leu His 1 5 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Arg <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Gly Ile Tyr Asp Asp Tyr Tyr Asp Tyr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser His Ile Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gly Ala Thr Asn Leu Ala His 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gln His Phe Trp Gly Thr Pro 1 5 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ser Tyr Tyr Leu Tyr 1 5 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Leu Ile Asn Pro Thr Asn Ser Asp Thr Ile Phe Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Glu Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly Pro Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Thr Ser Ser Gln Thr Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 His Ser Thr His Val Pro 1 5 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro Glu Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Leu Tyr Gly Gly Arg Arg Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Ala Gln Asn Leu Glu Leu 1 5 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Ser His Tyr Tyr Trp Thr 1 5 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn 1 5 10 15 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Glu Gly Pro Leu Tyr Tyr Gly Asn Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 15 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Gln Gln Phe Asn Thr Leu Pro 1 5 <210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Ser His Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn 1 5 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Glu Gly Pro Leu Tyr Tyr Gly Asn Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 15 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Gln Gln Phe Asn Thr Leu Pro 1 5 <210> 44 <211> 1521 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 atgctgaagc ctctttggaa agcagcagtg gcccccacat ggccatgctc catgccgccc 60 cgccgcccgt gggacagaga ggctggcacg ttgcaggtcc tgggagcgct ggctgtgctg 120 tggctgggct ccgtggctct tatctgcctc ctgtggcaag tgccccgtcc tcccacctgg 180 ggccaggtgc agcccaagga cgtgcccagg tcctgggagc atggctccag cccagcttgg 240 gagcccctgg aagcagaggc caggcagcag agggactcct gccagcttgt ccttgtggaa 300 agcatccccc aggacctgcc atctgcagcc ggcagcccct ctgcccagcc tctgggccag 360 gcctggctgc agctgctgga cactgcccag gagagcgtcc acgtggcttc atactactgg 420 tccctcacag ggcctgacat cggggtcaac gactcgtctt cccagctggg agaggctctt 480 ctgcagaagc tgcagcagct gctgggcagg aacatttccc tggctgtggc caccagcagc 540 ccgacactgg ccaggacatc caccgacctg caggttctgg ctgcccgagg tgcccatgta 600 cgacaggtgc ccatggggcg gctcaccagg ggtgttttgc actccaaatt ctgggttgtg 660 gatggacggc acatatacat gggcagtgcc aacatggact ggcggtctct gacgcaggtg 720 aaggagcttg gcgctgtcat ctataactgc agccacctgg cccaagacct ggagaagacc 780 ttccagacct actgggtact gggggtgccc aaggctgtcc tccccaaaac ctggcctcag 840 aacttctcat ctcacttcaa ccgtttccag cccttccacg gcctctttga tggggtgccc 900 accactgcct acttctcagc gtcgccacca gcactctgtc cccagggccg cacccgggac 960 ctggaggcgc tgctggcggt gatggggagc gcccaggagt tcatctatgc ctccgtgatg 1020 gagtatttcc ccaccacgcg cttcagccac cccccgaggt actggccggt gctggacaac 1080 gcgctgcggg cggcagcctt cggcaagggc gtgcgcgtgc gcctgctggt cggctgcgga 1140 ctcaacacgg accccaccat gttcccctac ctgcggtccc tgcaggcgct cagcaacccc 1200 gcggccaacg tctctgtgga cgtgaaagtc ttcatcgtgc cggtggggaa ccattccaac 1260 atcccattca gcagggtgaa ccacagcaag ttcatggtca cggagaaggc agcctacata 1320 ggcacctcca actggtcgga ggattacttc agcagcacgg cgggggtggg cttggtggtc 1380 acccagagcc ctggcgcgca gcccgcgggg gccacggtgc aggagcagct gcggcagctc 1440 tttgagcggg actggagttc gcgctacgcc gtcggcctgg acggacaggc tccgggccag 1500 gactgcgttt ggcagggctg a 1521 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 45 atggactggc ggtctctg 18 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 46 tggaaggtct tctccaggtc 20 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 47 agccacatcg ctcagacac 19 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 48 gcccaatacg accaaatcc 19 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 49 atggactggc ggtctctg 18 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 50 tggaaggtct tctccaggtc 20 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 51 agccacatcg ctcagacac 19 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 52 gcccaatacg accaaatcc 19 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 53 tttgaattcg ccgccaccat gctgaagcct 30 <210> 54 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 54 aaagcggccg ctcagccctg ccaaacgcag tcct 34 <210> 55 <211> 1473 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(1473) <400> 55 atgaagccta aactgatgta ccaggagctg aaggtgcctg cagaggagcc cgccaatgag 60 ctgcccatga atgagattga ggcgtggaag gctgcggaaa agaaagcccg ctgggtcctg 120 ctggtcctca ttctggcggt tgtgggcttc ggagccctga tgactcagct gtttctatgg 180 gaatacggcg acttgcatct ctttgggccc aaccagcgcc cagccccctg ctatgaccct 240 tgcgaagcag tgctggtgga aagcattcct gagggcctgg acttccccaa tgcctccacg 300 gggaaccctt ccaccagcca ggcctggctg ggcctgctcg ccggtgcgca cagcagcctg 360 gacatcgcct ccttctactg gaccctcacc aacaatgaca cccacacgca ggagccctct 420 gcccagcagg gtgaggaggt cctccggcag ctgcagaccc tggcaccaaa gggcgtgaac 480 gtccgcatcg ctgtgagcaa gcccagcggg ccccagccac aggcggacct gcaggctctg 540 ctgcagagcg gtgcccaggt ccgcatggtg gacatgcaga agctgaccca tggcgtcctg 600 cataccaagt tctgggtggt ggaccagacc cacttctacc tgggcagtgc caacatggac 660 tggcgttcac tgacccaggt caaggagctg ggcgtggtca tgtacaactg cagctgcctg 720 gctcgagacc tgaccaagat ctttgaggcc tactggttcc tgggccaggc aggcagctcc 780 atcccatcaa cttggccccg gttctatgac acccgctaca accaagagac accaatggag 840 atctgcctca atggaacccc tgctctggcc tacctggcga gtgcgccccc acccctgtgt 900 ccaagtggcc gcactccaga cctgaaggct ctactcaacg tggtggacaa tgcccggagt 960 ttcatctacg tcgctgtcat gaactacctg cccactctgg agttctccca ccctcacagg 1020 ttctggcctg ccattgacga tgggctgcgg cgggccacct acgagcgtgg cgtcaaggtg 1080 cgcctgctca tcagctgctg gggacactcg gagccatcca tgcgggcctt cctgctctct 1140 ctggctgccc tgcgtgacaa ccatacccac tctgacatcc aggtgaaact ctttgtggtc 1200 cccgcggatg aggcccaggc tcgaatccca tatgcccgtg tcaaccacaa caagtacatg 1260 gtgactgaac gcgccaccta catcggaacc tccaactggt ctggcaacta cttcacggag 1320 acggcgggca cctcgctgct ggtgacgcag aatgggaggg gcggcctgcg gagccagctg 1380 gaggccattt tcctgaggga ctgggactcc ccttacagcc atgaccttga cacctcagct 1440 gacagcgtgg gcaacgcctg ccgcctgctc tga 1473 <210> 56 <211> 1338 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(1338) <400> 56 atgggagagg atgaggatgg actctcagaa aaaaattgcc aaaataaatg tcgaattgcc 60 ctggtggaaa atattcctga aggccttaac tattcagaaa atgcaccatt tcacttatca 120 cttttccaag gctggatgaa tttactcaac atggccaaaa agtctgttga catagtgtct 180 tcccattggg atctcaacca cactcatcca tcagcatgtc agggtcaacg tctttttgaa 240 aagttgctcc agctgacttc gcaaaatatt gaaatcaagc tagtgagtga tgtaacagct 300 gattcaaagg tattagaagc cttgaaatta aagggagccg aggtgacgta catgaacatg 360 accgcttaca acaagggccg gctgcagtcc tccttctgga tcgtggacaa acagcacgtg 420 tatatcggca gtgccggttt ggactggcaa tccctgggac agatgaaaga actcggtgtc 480 atcttctaca actgcagctg cctggtccta gatttacaaa ggatatttgc tctatatagt 540 tcattaaaat tcaaaagcag agtgcctcaa acctggtcca aaagactcta tggagtctat 600 gacaatgaaa agaaattgca acttcagttg aatgaaacca aatctcaagc atttgtatcg 660 aattctccaa aactcttttg ccctaaaaac agaagttttg acatagatgc catctacagt 720 gtgatagatg atgccaagca gtatgtgtac atcgctgtca tggactacct gcctatctcc 780 agcacaagca ccaaaaggac ttactggcca gacttggatg caaaaataag agaagcatta 840 gttttacgaa gcgttagagt tcgactcctt ttaagcttct ggaaggaaac tgatcccctt 900 acgtttaact ttatttcatc tcttaaagcg atttgcactg aaatagccaa ctgcagtttg 960 aaagttaaat tttttgatct ggaaagagag aatgcttgtg ctacaaaaga acaaaagaat 1020 cacacctttc ctaggttaaa tcgcaacaag tacatggtga cagatggagc agcttatatt 1080 ggaaattttg attgggtagg gaatgatttc actcagaatg ctggcacggg ccttgttatc 1140 aaccaggcag atgtgaggaa caacagaagc atcattaagc aacttaaaga tgtgtttgaa 1200 agggactggt attcaccgta tgccaaaacc ttacagccaa ccaaacagcc gaactgctca 1260 agcctgttca aactcaaacc cctctccaac aaaactgcca cagacgacac aggcggaaag 1320 gatccccgga acgtatga 1338 <210> 57 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 57 tttaagcttg ccgccaccat gaagcctaaa ctgatgtac 39 <210> 58 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 58 tttgaattct cacttatcgt cgtcatcctt gtaatcgagc aggcggcagg cgttgcc 57 <210> 59 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 59 tttaagcttg ccgccaccat gggagaggat gaggatgga 39 <210> 60 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 60 tttgaattct cacttatcgt cgtcatcctt gtaatctacg ttccggggat cctttcc 57 <210> 61 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 61 agatgctgaa gcctcttcgg agagcg 26 <210> 62 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 62 tcagccctgc caaacgcagt cctgg 25 <210> 63 <211> 1521 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <220> <221> gene <222> (1)..(1521) <400> 63 atgctgaagc ctcttcggag agcggcagtg acccccatgt ggccgtgctc catgctgccc 60 cgccgcctgt gggacagaga ggctggcacg ttgcaggtcc tgggagtgct ggctatgctg 120 tggctgggct ccatggctct tacctacctc ctgtggcaag tgcgccgtcc tcccacctgg 180 ggccaggtgc agcccaagga cgtgcccagg tcctgggggc atggttccag cccagctctg 240 gagcccctgg aagcggaggt caggaagcag agggactcct gccagcttgt ccttgtggaa 300 agcatccccc aggacctgcc atttgcagcc ggcagcctct ccgcccagcc tctgggccag 360 gcctggctgc agctgctgga cactgcccag gagagcgtcc acgtggcttc atactactgg 420 tccctcacag ggcccgacat tggggtcaac gactcatctt cccagctggg agaggccctt 480 ctgcagaagc tgcagcagct gctgggcagg aacatttcct tggctgtggc caccagcagt 540 ccaacactgg ccaggaagtc caccgacctg caggtcctgg ctgcccgagg tgcccaggta 600 cgacgggtgc ccatggggcg gctcaccagg ggcgttttgc actccaaatt ctgggttgtg 660 gatggacggc acatatacat gggcagtgcc aacatggact ggcggtccct gacgcaggtg 720 aaggagcttg gcgctgtcat ctataactgc agccacctgg cccaagacct ggagaagacc 780 ttccagacct actgggtgct gggggtgccc aaggctgtcc tccccaaaac ctggcctcag 840 aacttctcat ctcacatcaa ccgtttccag cccttccagg gcctctttga tggggtgccc 900 accactgcct acttctcagc atcgccaccc gcactctgtc cccagggccg cacccctgac 960 ctggaggcgc tgttggcggt gatggggagc gcccaggagt tcatctatgc ctccgtgatg 1020 gagtatttcc ctaccacgcg cttcagccac ccccgcaggt actggccggt gctggacaac 1080 gcgctgcggg cggcagcctt cagcaagggt gtgcgcgtgc gcctgctggt cagctgcgga 1140 ctcaacacgg accccaccat gttcccctat ctgcggtccc tgcaggcgct cagcaacccc 1200 gcggccaacg tctctgtgga cgtgaaagtc ttcatcgtgc cggtggggaa tcattccaac 1260 atcccgttca gcagggtgaa ccacagcaag ttcatggtca cggagaaggc agcctacata 1320 ggcacctcca actggtcgga ggattacttc agcagcacga cgggggtggg cctggtggtc 1380 acccagagcc ccggcgcgca gcccgcgggg gccacggtac aggagcagct gcggcagctc 1440 tttgagcggg actggagttc gcgctacgcc gtcggcctgg acggacaggc tccgggccag 1500 gactgcgttt ggcagggctg a 1521 <210> 64 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 64 ccaggagagt gggagaggct cttctcagta tggtgg 36 <210> 65 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 65 ggctcaggga aatagccctt gaccaggcat cc 32 <210> 66 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 66 tccagagttc caggtcactg tcac 24 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 67 aggggccagt ggatagacag atgg 24 <210> 68 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 68 tccagagttc caagtcacag tcac 24 <210> 69 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 69 aggggccagt ggatagactg atgg 24 <210> 70 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> anchor primer <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is deoxyisosine. <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is deoxyisosine. <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is deoxyisosine. <400> 70 ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng 36 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AUAP primer <400> 71 ggccacgcgt cgactagtac 20 <210> 72 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 72 cactacttcc tgttgaagct cttgacgatg g 31 <210> 73 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 73 gtgagtggcc tcacaggtat agc 23 <210> 74 <211> 504 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 74 atgagatcac agttctctat acagttactg agcacacaga acctcacctt gggatggagc 60 tgtatcatcc tcttcttggt agcaacagct acaggtgtcc actcccaggt ccaactgcag 120 cagcctgggg ctgaactggt gaagcctggg acttcagtga aaatgtcctg caaggcttct 180 ggctacacct tcaccagcta ctggatgcac tgggtgaagc agaggccggg acaaggcctt 240 gagtggattg gagatattta tcctggtagt gatagtacta actacaatga gaagttcaag 300 agcaaggcca cactgactgt agacacatcc tccagcacag cctacatgca actcagcagc 360 ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagag gagggtggtt ggatgctatg 420 gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcctcag ccaaaacaac acccccatca 480 gtctatccac tggcccctaa gggc 504 <210> 75 <211> 168 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 75 Met Arg Ser Gln Phe Ser Ile Gln Leu Leu Ser Thr Gln Asn Leu Thr 1 5 10 15 Leu Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 20 25 30 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 35 40 45 Pro Gly Thr Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 50 55 60 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 65 70 75 80 Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Asp Ser Thr Asn Tyr Asn 85 90 95 Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser 100 105 110 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 115 120 125 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Trp Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 130 135 140 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 145 150 155 160 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Lys Gly 165 <210> 76 <211> 437 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 76 atggaatgta actggatact tccttttatt ctgtcggtaa tttcaggggt ctcctcagag 60 gttcagctcc agcagtctgg gactgtgctg tcaaggcctg gggcttccgt gacgatgtcc 120 tgcaaggctt ctggcgacag ctttaccacc tactggatgc actgggtaaa acagaggcct 180 ggacagggtc tagaatggat tggtgctatc tatcctggaa atagtgaaac tagctacaac 240 cagaagttca agggcaaggc caaactgact gcagtcacat ccgccagcac tgcctatatg 300 gagttcacta gcctgacaaa tgaggactct gcggtctatt actgtacggg gggttattcc 360 gactttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctcagccaa aacgacaccc 420 ccatctgtct atccact 437 <210> 77 <211> 145 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 77 Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Ile Ser Gly 1 5 10 15 Val Ser Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ser Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Thr Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Ser Phe 35 40 45 Thr Thr Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Glu Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Phe Thr Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Gly Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr 130 135 140 Pro 145 <210> 78 <211> 475 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 78 atgggatgga gctggatctt tctcttcctc ctgtcaggaa ctgcaggcgt ccactctgag 60 gtccagcttc agcagtcagg acctgaactg gtgaaacctg gggcctcagt gaagatatcc 120 tgcaaggctt ctggatacac attcactgac tacaacttgc actgggtgaa gcagagccat 180 ggaaagagcc ttgagtggat tggatatatt tatccttaca atggtaatac tggctacaac 240 cagaagttca agaggaaggc cacattgact gtagacaatt cctccggcac agtctacatg 300 gagctccgca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag aggagggatc 360 tatgatgatt actacgacta tgctatcgac tattggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 420 tcctcagcca aaacaacacc cccatcagtc tatccactgg cccctaaggg cgaat 475 <210> 79 <211> 158 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 79 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Asn Leu His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Arg Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Gly 85 90 95 Thr Val Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Asp Asp Tyr Tyr Asp Tyr Ala 115 120 125 Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys 130 135 140 Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Lys Gly Glu 145 150 155 <210> 80 <211> 470 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 80 atgggatgga gctggatctt tctcttcctc ctgtcaggaa ctgcaggcgt ccactctgag 60 gtccagcttc agcagtcagg acctgaactg gtgaaacctg gggcctcagt gaagatatcc 120 tgcaaggctt ctggatacac attcactgac tacaacttgc actgggtgaa gcagagccat 180 ggaaagagcc ttgagtggat tggatatatt tatccttaca atggtaatac tggctacaac 240 cagaagttca agaggaaggc cacattgact gtagacaatt cctccggcac agtctacatg 300 gagctccgca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag aggagggatc 360 tatgatgatt actacgacta tgctatcgac tattggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 420 tcctcagcca aaacaacacc cccatcagtc tatccactgg cccctaaggg 470 <210> 81 <211> 156 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 81 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Asn Leu His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Arg Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Gly 85 90 95 Thr Val Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Asp Asp Tyr Tyr Asp Tyr Ala 115 120 125 Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys 130 135 140 Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Lys 145 150 155 <210> 82 <211> 462 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 82 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag caacaggggt ccactcccag 60 gtccaactgc agcagtcggg ggctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagttgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc tactatttgt actgggtgag gcagaggcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat tggactgatt aatcctacca atagtgatac tatcttcaat 240 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcatacatg 300 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtacacg agagggggga 360 tatggttacg gcccgtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagcc 420 aaaacaacac ccccatcagt ctatccactg gcccctaagg gc 462 <210> 83 <211> 154 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 83 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Tyr Leu Tyr Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Thr Asn Ser Asp Thr Ile Phe Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly Pro Phe Ala Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 140 Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Lys Gly 145 150 <210> 84 <211> 450 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 84 atgaacttcg ggctcagctt gattttcctt gccctcattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggagactta gtgaggcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcag tttcagtagc tatggcatgt cttggtttcg ccagactcca 180 gacaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtggtg gtagttacat ctactatcca 240 gaaagtgtga aggggcgatt caccatctcc agagacaatg ccaggaacat cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt attgtgtaag actctacggt 360 ggtaggagag gctatggttt ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 420 gccaaaacaa cagccccatc ggtctatcca 450 <210> 85 <211> 150 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 85 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Phe Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn 85 90 95 Ile Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Val Arg Leu Tyr Gly Gly Arg Arg Gly Tyr Gly Leu Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr 130 135 140 Ala Pro Ser Val Tyr Pro 145 150 <210> 86 <211> 450 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 86 atgaacttcg ggctcagctt gattttcctt gccctcattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggagactta gtgaggcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcag tttcagtagc tatggcatgt cttggtttcg ccagactcca 180 gacaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtggtg gtagttacat ctactatcca 240 gaaagtgtga aggggcgatt caccatctcc agagacaatg ccaggaacat cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt attgtgtaag actctacggt 360 ggtaggagag gctatggttt ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 420 gccaaaacaa cacccccatc agtctatcca 450 <210> 87 <211> 150 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 87 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Phe Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn 85 90 95 Ile Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Val Arg Leu Tyr Gly Gly Arg Arg Gly Tyr Gly Leu Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr 130 135 140 Pro Pro Ser Val Tyr Pro 145 150 <210> 88 <211> 472 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 88 atgaaagtgt tgagtctgtt gtacctgttg acagccattc ctggtatcct gtctgatgta 60 cagcttcagg agtcaggacc tggcctcgtg aaaccttctc aatctctgtc tctcacctgc 120 tctgtcactg gctactccat caccagtcat tattactgga cctggatccg gcagtttcca 180 ggaaacaaac tggaatggat gggctacata agctacgacg gtagcaataa ctacaaccca 240 tctctcaaaa atcgaatctc catcactcgt gacacatcta agaaccagtt tttcctgaag 300 ttgaattctg tgactactga ggacacagct acatataact gtgcaagaga gggcccgctc 360 tactatggta acccctactg gtatttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 420 tcctcagcca aaacaacacc cccatcagtc tatccactgg cccctaaggg cg 472 <210> 89 <211> 157 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 89 Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ile 1 5 10 15 Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro 20 25 30 Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr 35 40 45 Ser His Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 100 105 110 Asn Cys Ala Arg Glu Gly Pro Leu Tyr Tyr Gly Asn Pro Tyr Trp Tyr 115 120 125 Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys 130 135 140 Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Lys Gly 145 150 155 <210> 90 <211> 471 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 90 atgaaagtgt tgagtctgtt gtacctgttg acagccattc ctggtatcct gtctgatgta 60 cagcttcagg agtcaggacc tggcctcgtg aaaccttctc agtctctgtc tctcacctgc 120 tctgtcactg gctactccat ctccagtcat tattactgga gttggatccg gcagtttcca 180 ggaaacagac tggaatggat gggctacata agctacgacg gtagcaataa ctacaaccca 240 tctctcaaaa atcgaatctc catcactcgt gacacatcta agaaccagtt tttcctgaag 300 ttgaattctg tgactactga ggacacagct acatataact gtgcaagaga gggcccgctc 360 tactatggta acccctactg gtatttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 420 tcctcagcca aaacaacacc cccatcagtc tatccactgg cccctaaggg c 471 <210> 91 <211> 157 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 91 Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ile 1 5 10 15 Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro 20 25 30 Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Ser 35 40 45 Ser His Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 100 105 110 Asn Cys Ala Arg Glu Gly Pro Leu Tyr Tyr Gly Asn Pro Tyr Trp Tyr 115 120 125 Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys 130 135 140 Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Lys Gly 145 150 155 <210> 92 <211> 470 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 92 atgaaagtgt tgagtctgtt gtacctgttg acagccattc ctggtatcct gtctgatgta 60 cagcttcagg agtcaggacc tggcctcgtg aaaccttctc agtctctgtc tctcacctgc 120 tctgtcactg gctactccat ctccagtcat tattactgga gttggatccg gcagtttcca 180 ggaaacagac tggaatggat gggctacata agctacgacg gtagcaataa ctacaaccca 240 tctctcaaaa atcgaatctc catcactcgt gacacatcta agaaccagtt tttcctgaag 300 ttgaattctg tgactactga ggacacagct acatataact gtgcaagaga gggcccgctc 360 tactatggta acccctactg gtatttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 420 tcctcagcca aaacgacacc cccatctgtc tatccactgg cccctaaggg 470 <210> 93 <211> 156 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 93 Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ile 1 5 10 15 Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro 20 25 30 Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Ser 35 40 45 Ser His Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 100 105 110 Asn Cys Ala Arg Glu Gly Pro Leu Tyr Tyr Gly Asn Pro Tyr Trp Tyr 115 120 125 Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys 130 135 140 Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Lys 145 150 155 <210> 94 <211> 421 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 94 atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc ctgttgctct gttttcaagg taccagatgt 60 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 120 atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 180 gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 240 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 300 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtggac gttcggtgga 360 ggcaccaagc tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat caagggcgaa 420 t 421 <210> 95 <211> 140 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 95 Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn 100 105 110 Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Lys Gly Glu 130 135 140 <210> 96 <211> 459 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 96 atgatggtcc ttgctcagtt tcttgcattc ttgttgcttt ggtttccagg tgcaggatgt 60 gacatcctga tgacccaatc tccatcctcc atgtctgtat ctctgggaga cacagtcagc 120 atcacttgcc atgcaagtca gggcattaga agtaatatag ggtggttgca gcagaaacca 180 gggaaatcat ttaagggcct gatctttcat ggaaccaact tggaagatgg agttccatca 240 aggttcagtg gcagaggatc tggagcagat tattctctca ccatcaacag cctggaatct 300 gaagattttg cagactatta ctgtgtacag tatgttcagt ttcctccaac gttcggctcg 360 gggacaaagt tggaaataag acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtg 459 <210> 97 <211> 153 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 97 Met Met Val Leu Ala Gln Phe Leu Ala Phe Leu Leu Leu Trp Phe Pro 1 5 10 15 Gly Ala Gly Cys Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser 20 25 30 Val Ser Leu Gly Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly 35 40 45 Ile Arg Ser Asn Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe 50 55 60 Lys Gly Leu Ile Phe His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn 85 90 95 Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Val 100 105 110 Gln Phe Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg Arg 115 120 125 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val 145 150 <210> 98 <211> 467 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 98 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcgcc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtcatatag catggtatca gcagaaagag 180 ggaaaatctc ctcagcgcct ggtctatggt gcaacaaact tagcacatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag ccttcagtct 300 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtggac gttcggtgga 360 ggcaccaagc tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttctt 467 <210> 99 <211> 155 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 99 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Val Ser Val Gly Glu Thr Val Ala Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Ile Tyr Ser His Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Glu Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Gln Arg Leu Val Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala His Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn 85 90 95 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp 100 105 110 Gly Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe 145 150 155 <210> 100 <211> 454 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 100 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcgcc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtcatatag catggtatca gcagaaagag 180 ggaaaatctc ctcagcgcct ggtctatggt gcaacaaact tagcacatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag ccttcagtct 300 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtggac gttcggtgga 360 ggcaccaagc tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcag 454 <210> 101 <211> 151 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 101 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Val Ser Val Gly Glu Thr Val Ala Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Ile Tyr Ser His Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Glu Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Gln Arg Leu Val Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala His Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn 85 90 95 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp 100 105 110 Gly Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser 145 150 <210> 102 <211> 457 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 102 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60 gttgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 tcttgcacat ctagtcagac ccttgtacac agtaatggaa acacctattt acattggtac 180 ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc acagtacaca tgttccattc 360 acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggag 457 <210> 103 <211> 152 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 103 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Thr Leu 35 40 45 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser His Ser Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 145 150 <210> 104 <211> 423 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 104 atgaggttct ctgctcagct tctggggctg cttgtgctct ggatccctgg atccactgcg 60 gaaattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 120 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtgatg gcatcactta tttgtattgg 180 tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 240 tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 300 agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct agaactttac 360 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atc 423 <210> 105 <211> 141 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 105 Met Arg Phe Ser Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Ala Glu Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro 20 25 30 Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser 35 40 45 Leu Leu His Ser Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile 130 135 140 <210> 106 <211> 423 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 106 atgaggttct ctgctcagct tctggggctg cttgtgctct ggatccctgg atccactgcg 60 gaaattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 120 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtgatg gcatcactta tttgtattgg 180 tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 240 tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 300 agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct agaactttac 360 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atc 423 <210> 107 <211> 141 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 107 Met Arg Phe Ser Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Ala Glu Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro 20 25 30 Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser 35 40 45 Leu Leu His Ser Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile 130 135 140 <210> 108 <211> 404 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 108 atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc ctgttgctct gttttcaagg taccagatgt 60 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctggggga cagagtcacc 120 atcagttgca gggcaagtca ggacattgac aattatttaa actggtatca gcagaaacca 180 gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 240 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 300 gaagatgttg ccacttactt ttgccagcag tttaatacgc ttcctcggac gttcggtgga 360 ggcaccaaac tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgt 404 <210> 109 <211> 134 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 109 Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Asp Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Phe Asn 100 105 110 Thr Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Ala Asp Ala Ala Pro Thr 130 <210> 110 <211> 414 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 110 atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc ctgttgctct gttttcaagg taccagatgt 60 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggggg cagcgtcacc 120 atcagttgca gggcaagtca ggacattgac aattatttaa actggtatca gcaaaaacca 180 gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 240 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggaacaa 300 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag tttaatacgc ttcctcggac gttcggtgga 360 ggcaccaagc tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttc 414 <210> 111 <211> 138 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 111 Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Gly Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Asp Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Phe Asn 100 105 110 Thr Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe 130 135 <210> 112 <211> 465 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 112 atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc ctgttgctct gttttcaagg taccagatgt 60 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggggg cagcgtcacc 120 atcagttgca gggcaagtca ggacattgac aattatttaa actggtatca gcaaaaacca 180 gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 240 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggaacaa 300 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag tttaatacgc ttcctcggac gttcggtgga 360 ggcaccaagc tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttc 465 <210> 113 <211> 155 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 113 Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Gly Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Asp Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Phe Asn 100 105 110 Thr Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe 145 150 155 <210> 114 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 114 accaagcttg ccgccaccat gaaagtgttg agtctgttgt acctgttgac agccattcct 60 ggtatcctgt ctcaggtcca actgcagcag cct 93 <210> 115 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 115 cgatgggccc ttggtgctag ctgaggagac ggtgactgag gt 42 <210> 116 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 116 accaagcttg ccgccaccat gatgtcctct gctcagttc 39 <210> 117 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 117 agccacagtt cgtttgattt ccagcttggt gcc 33 <210> 118 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 118 ctggaaatca aacgaactgt ggctgcacca tct 33 <210> 119 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 119 aaagaattcc tagcactctc ccctgttgaa 30 <210> 120 <211> 1401 <212> DNA <213> Chimaera sp. <400> 120 atgaaagtgt tgagtctgtt gtacctgttg acagccattc ctggtatcct gtctcaggtc 60 caactgcagc agcctggggc tgaactggtg aagcctggga cttcagtgaa aatgtcctgc 120 aaggcttctg gctacacctt caccagctac tggatgcact gggtgaagca gaggccggga 180 caaggccttg agtggattgg agatatttat cctggtagtg atagtactaa ctacaatgag 240 aagttcaaga gcaaggccac actgactgta gacacatcct ccagcacagc ctacatgcaa 300 ctcagcagcc tgacatctga ggactctgcg gtctattact gtgcaagagg agggtggttg 360 gatgctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctcagc tagcaccaag 420 ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 480 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 720 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg a 1401 <210> 121 <211> 466 <212> PRT <213> Chimaera sp. <400> 121 Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ile 1 5 10 15 Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro 20 25 30 Gly Thr Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 35 40 45 Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Asp Ser Thr Asn Tyr Asn Glu 65 70 75 80 Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr 85 90 95 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Trp Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 122 <211> 705 <212> DNA <213> Chimaera sp. <400> 122 atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc ctgttgctct gttttcaagg taccagatgt 60 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 120 atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 180 gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 240 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 300 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtggac gttcggtgga 360 ggcaccaagc tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gctag 705 <210> 123 <211> 234 <212> PRT <213> Chimaera sp. <400> 123 Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn 100 105 110 Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 124 <211> 1521 <212> DNA <213> Macaca mulatta <220> <221> gene <222> (1)..(1521) <400> 124 atgctgaagc ctcttcggag agcggcagtg acccccatgt ggccgtgctc catgctgccc 60 cgccgcctgt gggacagaga ggctggcacg ttgcaggtcc tgggagtgct ggctatgctg 120 tggctgggct ccatggctct tacctacctc ctgtggcaag tgcgctgtcc tcccacctgg 180 ggccaggtgc agcccaggga cgtgcccagg tcctgggggc atggttccag cctagctctg 240 gagcccctgg aagcggaggt caggaagcag agggactcct gccagcttgt ccttgtggaa 300 agcatccccc aggacctgcc atttgcagcc ggcagcctct ccgcccagcc tctgggccag 360 gcctggctgc agctgctgga cactgcccag gagagcgtcc acgtggcttc atactactgg 420 tccctcacag ggcccgacat tggggtcaac gactcatctt cccagctggg agaggccctt 480 ctgcagaagc tgcagcagct gctgggcagg aacatttcct tggctgtggc caccagcagt 540 ccaacactgg ccaggaagtc caccgacctg caggtcctgg ctgcccgagg tgcccaggta 600 cgacgggtgc ccatggggcg gctcaccagg ggcgttttgc actccaaatt ctgggttgtg 660 gatggacggc acatatacat gggcagtgcc aacatggact ggcggtccct gacgcaggtg 720 aaggagcttg gcgctgtcat ctataactgc agccacctgg cccaagacct ggagaagacc 780 ttccagacct actgggtgct gggggtgccc aaggctgtcc tccccaaaac ctggcctcag 840 aacttctcat ctcacatcaa ccgtttccag cccttccagg gcctctttga tggggtgccc 900 accactgcct acttctcagc atcgccaccc gcactctgtc cccagggccg cacccctgac 960 ctggaggcgc tgttggcggt gatggggagc gcccaggagt tcatctatgc ctccgtgatg 1020 gagtatttcc ctaccacgcg cttcagccac ccccgcaggt actggccggt gctggacaac 1080 gcgctgcggg cggcagcctt cagcaagggt gtgcgcgtgc gcctgctggt cagctgcgga 1140 ctcaacacgg accccaccat gttcccctat ctgcggtccc tgcaggcgct cagcaacccc 1200 gcggccaacg tctctgtgga cgtgaaagtc ttcatcgtgc cggtggggaa tcattccaac 1260 atcccgttca gcagggtgaa ccacagcaag ttcatggtca cggagaaggc agcctacata 1320 ggcacctcca actggtcgga ggattacttc agcagcacga cgggggtggg cctggtggtc 1380 acccagagcc ccggcgcgca gcccgcgggg gccacggtac aggagcagct gcggcagctc 1440 tttgagcggg actggagttc gcgctacgcc gtcggcctgg acggacaggc tccgggccag 1500 gactgcgttt ggcagggctg a 1521 <210> 125 <211> 2142 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 125 atggagtttc agacccaggt ctttgtattc gtgttgctct ggttgtctgg tgttgatgga 60 gattacaagg atgacgacga taaaggatcc cccagagggc ccacaatcaa gccctgtcct 120 ccatgcaaat gcccagcacc taacctcttg ggtggaccat ccgtcttcat cttccctcca 180 aagatcaagg atgtactcat gatctccctg agccccatag tcacatgtgt ggtggtggat 240 gtgagcgagg atgacccaga tgtccagatc agctggtttg tgaacaacgt ggaagtacac 300 acagctcaga cacaaaccca tagagaggat tacaacagta ctctccgggt ggtcagtgcc 360 ctccccatcc agcaccagga ctggatgagt ggcaaggagt tcaaatgcaa ggtcaacaac 420 aaagacctcc cagcgcccat cgagagaacc atctcaaaac ccaaagggtc agtaagagct 480 ccacaggtat atgtcttgcc tccaccagaa gaagagatga ctaagaaaca ggtcactctg 540 acctgcatgg tcacagactt catgcctgaa gacatttacg tggagtggac caacaacggg 600 aaaacagagc taaactacaa gaacactgaa ccagtcctgg actctgatgg ttcttacttc 660 atgtacagca agctgagagt ggaaaagaag aactgggtgg aaagaaatag ctactcctgt 720 tcagtggtcc acgagggtct gcacaatcac cacacgacta agagcttctc ccggactccg 780 ggtaaacgtc ctcccacctg gggccaggtg cagcccaagg acgtgcccag gtcctgggag 840 catggctcca gcccagcttg ggagcccctg gaagcagagg ccaggcagca gagggactcc 900 tgccagcttg tccttgtgga aagcatcccc caggacctgc catctgcagc cggcagcccc 960 tctgcccagc ctctgggcca ggcctggctg cagctgctgg acactgccca ggagagcgtc 1020 cacgtggctt catactactg gtccctcaca gggcctgaca tcggggtcaa cgactcgtct 1080 tcccagctgg gagaggctct tctgcagaag ctgcagcagc tgctgggcag gaacatttcc 1140 ctggctgtgg ccaccagcag cccgacactg gccaggacat ccaccgacct gcaggttctg 1200 gctgcccgag gtgcccatgt acgacaggtg cccatggggc ggctcaccag gggtgttttg 1260 cactccaaat tctgggttgt ggatggacgg cacatataca tgggcagtgc caacatggac 1320 tggcggtctc tgacgcaggt gaaggagctt ggcgctgtca tctataactg cagccacctg 1380 gcccaagacc tggagaagac cttccagacc tactgggtac tgggggtgcc caaggctgtc 1440 ctccccaaaa cctggcctca gaacttctca tctcacttca accgtttcca gcccttccac 1500 ggcctctttg atggggtgcc caccactgcc tacttctcag cgtcgccacc agcactctgt 1560 ccccagggcc gcacccggga cctggaggcg ctgctggcgg tgatggggag cgcccaggag 1620 ttcatctatg cctccgtgat ggagtatttc cccaccacgc gcttcagcca ccccccgagg 1680 tactggccgg tgctggacaa cgcgctgcgg gcggcagcct tcggcaaggg cgtgcgcgtg 1740 cgcctgctgg tcggctgcgg actcaacacg gaccccacca tgttccccta cctgcggtcc 1800 ctgcaggcgc tcagcaaccc cgcggccaac gtctctgtgg acgtgaaagt cttcatcgtg 1860 ccggtgggga accattccaa catcccattc agcagggtga accacagcaa gttcatggtc 1920 acggagaagg cagcctacat aggcacctcc aactggtcgg aggattactt cagcagcacg 1980 gcgggggtgg gcttggtggt cacccagagc cctggcgcgc agcccgcggg ggccacggtg 2040 caggagcagc tgcggcagct ctttgagcgg gactggagtt cgcgctacgc cgtcggcctg 2100 gacggacagg ctccgggcca ggactgcgtt tggcagggct ga 2142 <210> 126 <211> 713 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Met Glu Phe Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Val Leu Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Val Asp Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Pro Arg 20 25 30 Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn 35 40 45 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp 50 55 60 Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp 65 70 75 80 Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn 85 90 95 Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn 100 105 110 Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp 115 120 125 Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro 130 135 140 Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala 145 150 155 160 Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys 165 170 175 Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile 180 185 190 Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn 195 200 205 Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys 210 215 220 Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys 225 230 235 240 Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Gly Lys Arg Pro Pro Thr Trp Gly Gln Val Gln Pro 260 265 270 Lys Asp Val Pro Arg Ser Trp Glu His Gly Ser Ser Pro Ala Trp Glu 275 280 285 Pro Leu Glu Ala Glu Ala Arg Gln Gln Arg Asp Ser Cys Gln Leu Val 290 295 300 Leu Val Glu Ser Ile Pro Gln Asp Leu Pro Ser Ala Ala Gly Ser Pro 305 310 315 320 Ser Ala Gln Pro Leu Gly Gln Ala Trp Leu Gln Leu Leu Asp Thr Ala 325 330 335 Gln Glu Ser Val His Val Ala Ser Tyr Tyr Trp Ser Leu Thr Gly Pro 340 345 350 Asp Ile Gly Val Asn Asp Ser Ser Ser Gln Leu Gly Glu Ala Leu Leu 355 360 365 Gln Lys Leu Gln Gln Leu Leu Gly Arg Asn Ile Ser Leu Ala Val Ala 370 375 380 Thr Ser Ser Pro Thr Leu Ala Arg Thr Ser Thr Asp Leu Gln Val Leu 385 390 395 400 Ala Ala Arg Gly Ala His Val Arg Gln Val Pro Met Gly Arg Leu Thr 405 410 415 Arg Gly Val Leu His Ser Lys Phe Trp Val Val Asp Gly Arg His Ile 420 425 430 Tyr Met Gly Ser Ala Asn Met Asp Trp Arg Ser Leu Thr Gln Val Lys 435 440 445 Glu Leu Gly Ala Val Ile Tyr Asn Cys Ser His Leu Ala Gln Asp Leu 450 455 460 Glu Lys Thr Phe Gln Thr Tyr Trp Val Leu Gly Val Pro Lys Ala Val 465 470 475 480 Leu Pro Lys Thr Trp Pro Gln Asn Phe Ser Ser His Phe Asn Arg Phe 485 490 495 Gln Pro Phe His Gly Leu Phe Asp Gly Val Pro Thr Thr Ala Tyr Phe 500 505 510 Ser Ala Ser Pro Pro Ala Leu Cys Pro Gln Gly Arg Thr Arg Asp Leu 515 520 525 Glu Ala Leu Leu Ala Val Met Gly Ser Ala Gln Glu Phe Ile Tyr Ala 530 535 540 Ser Val Met Glu Tyr Phe Pro Thr Thr Arg Phe Ser His Pro Pro Arg 545 550 555 560 Tyr Trp Pro Val Leu Asp Asn Ala Leu Arg Ala Ala Ala Phe Gly Lys 565 570 575 Gly Val Arg Val Arg Leu Leu Val Gly Cys Gly Leu Asn Thr Asp Pro 580 585 590 Thr Met Phe Pro Tyr Leu Arg Ser Leu Gln Ala Leu Ser Asn Pro Ala 595 600 605 Ala Asn Val Ser Val Asp Val Lys Val Phe Ile Val Pro Val Gly Asn 610 615 620 His Ser Asn Ile Pro Phe Ser Arg Val Asn His Ser Lys Phe Met Val 625 630 635 640 Thr Glu Lys Ala Ala Tyr Ile Gly Thr Ser Asn Trp Ser Glu Asp Tyr 645 650 655 Phe Ser Ser Thr Ala Gly Val Gly Leu Val Val Thr Gln Ser Pro Gly 660 665 670 Ala Gln Pro Ala Gly Ala Thr Val Gln Glu Gln Leu Arg Gln Leu Phe 675 680 685 Glu Arg Asp Trp Ser Ser Arg Tyr Ala Val Gly Leu Asp Gly Gln Ala 690 695 700 Pro Gly Gln Asp Cys Val Trp Gln Gly 705 710 <210> 127 <211> 490 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Met Lys Pro Lys Leu Met Tyr Gln Glu Leu Lys Val Pro Ala Glu Glu 1 5 10 15 Pro Ala Asn Glu Leu Pro Met Asn Glu Ile Glu Ala Trp Lys Ala Ala 20 25 30 Glu Lys Lys Ala Arg Trp Val Leu Leu Val Leu Ile Leu Ala Val Val 35 40 45 Gly Phe Gly Ala Leu Met Thr Gln Leu Phe Leu Trp Glu Tyr Gly Asp 50 55 60 Leu His Leu Phe Gly Pro Asn Gln Arg Pro Ala Pro Cys Tyr Asp Pro 65 70 75 80 Cys Glu Ala Val Leu Val Glu Ser Ile Pro Glu Gly Leu Asp Phe Pro 85 90 95 Asn Ala Ser Thr Gly Asn Pro Ser Thr Ser Gln Ala Trp Leu Gly Leu 100 105 110 Leu Ala Gly Ala His Ser Ser Leu Asp Ile Ala Ser Phe Tyr Trp Thr 115 120 125 Leu Thr Asn Asn Asp Thr His Thr Gln Glu Pro Ser Ala Gln Gln Gly 130 135 140 Glu Glu Val Leu Arg Gln Leu Gln Thr Leu Ala Pro Lys Gly Val Asn 145 150 155 160 Val Arg Ile Ala Val Ser Lys Pro Ser Gly Pro Gln Pro Gln Ala Asp 165 170 175 Leu Gln Ala Leu Leu Gln Ser Gly Ala Gln Val Arg Met Val Asp Met 180 185 190 Gln Lys Leu Thr His Gly Val Leu His Thr Lys Phe Trp Val Val Asp 195 200 205 Gln Thr His Phe Tyr Leu Gly Ser Ala Asn Met Asp Trp Arg Ser Leu 210 215 220 Thr Gln Val Lys Glu Leu Gly Val Val Met Tyr Asn Cys Ser Cys Leu 225 230 235 240 Ala Arg Asp Leu Thr Lys Ile Phe Glu Ala Tyr Trp Phe Leu Gly Gln 245 250 255 Ala Gly Ser Ser Ile Pro Ser Thr Trp Pro Arg Phe Tyr Asp Thr Arg 260 265 270 Tyr Asn Gln Glu Thr Pro Met Glu Ile Cys Leu Asn Gly Thr Pro Ala 275 280 285 Leu Ala Tyr Leu Ala Ser Ala Pro Pro Pro Leu Cys Pro Ser Gly Arg 290 295 300 Thr Pro Asp Leu Lys Ala Leu Leu Asn Val Val Asp Asn Ala Arg Ser 305 310 315 320 Phe Ile Tyr Val Ala Val Met Asn Tyr Leu Pro Thr Leu Glu Phe Ser 325 330 335 His Pro His Arg Phe Trp Pro Ala Ile Asp Asp Gly Leu Arg Arg Ala 340 345 350 Thr Tyr Glu Arg Gly Val Lys Val Arg Leu Leu Ile Ser Cys Trp Gly 355 360 365 His Ser Glu Pro Ser Met Arg Ala Phe Leu Leu Ser Leu Ala Ala Leu 370 375 380 Arg Asp Asn His Thr His Ser Asp Ile Gln Val Lys Leu Phe Val Val 385 390 395 400 Pro Ala Asp Glu Ala Gln Ala Arg Ile Pro Tyr Ala Arg Val Asn His 405 410 415 Asn Lys Tyr Met Val Thr Glu Arg Ala Thr Tyr Ile Gly Thr Ser Asn 420 425 430 Trp Ser Gly Asn Tyr Phe Thr Glu Thr Ala Gly Thr Ser Leu Leu Val 435 440 445 Thr Gln Asn Gly Arg Gly Gly Leu Arg Ser Gln Leu Glu Ala Ile Phe 450 455 460 Leu Arg Asp Trp Asp Ser Pro Tyr Ser His Asp Leu Asp Thr Ser Ala 465 470 475 480 Asp Ser Val Gly Asn Ala Cys Arg Leu Leu 485 490 <210> 128 <211> 445 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Met Gly Glu Asp Glu Asp Gly Leu Ser Glu Lys Asn Cys Gln Asn Lys 1 5 10 15 Cys Arg Ile Ala Leu Val Glu Asn Ile Pro Glu Gly Leu Asn Tyr Ser 20 25 30 Glu Asn Ala Pro Phe His Leu Ser Leu Phe Gln Gly Trp Met Asn Leu 35 40 45 Leu Asn Met Ala Lys Lys Ser Val Asp Ile Val Ser Ser His Trp Asp 50 55 60 Leu Asn His Thr His Pro Ser Ala Cys Gln Gly Gln Arg Leu Phe Glu 65 70 75 80 Lys Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gln Asn Ile Glu Ile Lys Leu Val Ser 85 90 95 Asp Val Thr Ala Asp Ser Lys Val Leu Glu Ala Leu Lys Leu Lys Gly 100 105 110 Ala Glu Val Thr Tyr Met Asn Met Thr Ala Tyr Asn Lys Gly Arg Leu 115 120 125 Gln Ser Ser Phe Trp Ile Val Asp Lys Gln His Val Tyr Ile Gly Ser 130 135 140 Ala Gly Leu Asp Trp Gln Ser Leu Gly Gln Met Lys Glu Leu Gly Val 145 150 155 160 Ile Phe Tyr Asn Cys Ser Cys Leu Val Leu Asp Leu Gln Arg Ile Phe 165 170 175 Ala Leu Tyr Ser Ser Leu Lys Phe Lys Ser Arg Val Pro Gln Thr Trp 180 185 190 Ser Lys Arg Leu Tyr Gly Val Tyr Asp Asn Glu Lys Lys Leu Gln Leu 195 200 205 Gln Leu Asn Glu Thr Lys Ser Gln Ala Phe Val Ser Asn Ser Pro Lys 210 215 220 Leu Phe Cys Pro Lys Asn Arg Ser Phe Asp Ile Asp Ala Ile Tyr Ser 225 230 235 240 Val Ile Asp Asp Ala Lys Gln Tyr Val Tyr Ile Ala Val Met Asp Tyr 245 250 255 Leu Pro Ile Ser Ser Thr Ser Thr Lys Arg Thr Tyr Trp Pro Asp Leu 260 265 270 Asp Ala Lys Ile Arg Glu Ala Leu Val Leu Arg Ser Val Arg Val Arg 275 280 285 Leu Leu Leu Ser Phe Trp Lys Glu Thr Asp Pro Leu Thr Phe Asn Phe 290 295 300 Ile Ser Ser Leu Lys Ala Ile Cys Thr Glu Ile Ala Asn Cys Ser Leu 305 310 315 320 Lys Val Lys Phe Phe Asp Leu Glu Arg Glu Asn Ala Cys Ala Thr Lys 325 330 335 Glu Gln Lys Asn His Thr Phe Pro Arg Leu Asn Arg Asn Lys Tyr Met 340 345 350 Val Thr Asp Gly Ala Ala Tyr Ile Gly Asn Phe Asp Trp Val Gly Asn 355 360 365 Asp Phe Thr Gln Asn Ala Gly Thr Gly Leu Val Ile Asn Gln Ala Asp 370 375 380 Val Arg Asn Asn Arg Ser Ile Ile Lys Gln Leu Lys Asp Val Phe Glu 385 390 395 400 Arg Asp Trp Tyr Ser Pro Tyr Ala Lys Thr Leu Gln Pro Thr Lys Gln 405 410 415 Pro Asn Cys Ser Ser Leu Phe Lys Leu Lys Pro Leu Ser Asn Lys Thr 420 425 430 Ala Thr Asp Asp Thr Gly Gly Lys Asp Pro Arg Asn Val 435 440 445 <210> 129 <211> 506 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 129 Met Leu Lys Pro Leu Arg Arg Ala Ala Val Thr Pro Met Trp Pro Cys 1 5 10 15 Ser Met Leu Pro Arg Arg Leu Trp Asp Arg Glu Ala Gly Thr Leu Gln 20 25 30 Val Leu Gly Val Leu Ala Met Leu Trp Leu Gly Ser Met Ala Leu Thr 35 40 45 Tyr Leu Leu Trp Gln Val Arg Arg Pro Pro Thr Trp Gly Gln Val Gln 50 55 60 Pro Lys Asp Val Pro Arg Ser Trp Gly His Gly Ser Ser Pro Ala Leu 65 70 75 80 Glu Pro Leu Glu Ala Glu Val Arg Lys Gln Arg Asp Ser Cys Gln Leu 85 90 95 Val Leu Val Glu Ser Ile Pro Gln Asp Leu Pro Phe Ala Ala Gly Ser 100 105 110 Leu Ser Ala Gln Pro Leu Gly Gln Ala Trp Leu Gln Leu Leu Asp Thr 115 120 125 Ala Gln Glu Ser Val His Val Ala Ser Tyr Tyr Trp Ser Leu Thr Gly 130 135 140 Pro Asp Ile Gly Val Asn Asp Ser Ser Ser Gln Leu Gly Glu Ala Leu 145 150 155 160 Leu Gln Lys Leu Gln Gln Leu Leu Gly Arg Asn Ile Ser Leu Ala Val 165 170 175 Ala Thr Ser Ser Pro Thr Leu Ala Arg Lys Ser Thr Asp Leu Gln Val 180 185 190 Leu Ala Ala Arg Gly Ala Gln Val Arg Arg Val Pro Met Gly Arg Leu 195 200 205 Thr Arg Gly Val Leu His Ser Lys Phe Trp Val Val Asp Gly Arg His 210 215 220 Ile Tyr Met Gly Ser Ala Asn Met Asp Trp Arg Ser Leu Thr Gln Val 225 230 235 240 Lys Glu Leu Gly Ala Val Ile Tyr Asn Cys Ser His Leu Ala Gln Asp 245 250 255 Leu Glu Lys Thr Phe Gln Thr Tyr Trp Val Leu Gly Val Pro Lys Ala 260 265 270 Val Leu Pro Lys Thr Trp Pro Gln Asn Phe Ser Ser His Ile Asn Arg 275 280 285 Phe Gln Pro Phe Gln Gly Leu Phe Asp Gly Val Pro Thr Thr Ala Tyr 290 295 300 Phe Ser Ala Ser Pro Pro Ala Leu Cys Pro Gln Gly Arg Thr Pro Asp 305 310 315 320 Leu Glu Ala Leu Leu Ala Val Met Gly Ser Ala Gln Glu Phe Ile Tyr 325 330 335 Ala Ser Val Met Glu Tyr Phe Pro Thr Thr Arg Phe Ser His Pro Arg 340 345 350 Arg Tyr Trp Pro Val Leu Asp Asn Ala Leu Arg Ala Ala Ala Phe Ser 355 360 365 Lys Gly Val Arg Val Arg Leu Leu Val Ser Cys Gly Leu Asn Thr Asp 370 375 380 Pro Thr Met Phe Pro Tyr Leu Arg Ser Leu Gln Ala Leu Ser Asn Pro 385 390 395 400 Ala Ala Asn Val Ser Val Asp Val Lys Val Phe Ile Val Pro Val Gly 405 410 415 Asn His Ser Asn Ile Pro Phe Ser Arg Val Asn His Ser Lys Phe Met 420 425 430 Val Thr Glu Lys Ala Ala Tyr Ile Gly Thr Ser Asn Trp Ser Glu Asp 435 440 445 Tyr Phe Ser Ser Thr Thr Gly Val Gly Leu Val Val Thr Gln Ser Pro 450 455 460 Gly Ala Gln Pro Ala Gly Ala Thr Val Gln Glu Gln Leu Arg Gln Leu 465 470 475 480 Phe Glu Arg Asp Trp Ser Ser Arg Tyr Ala Val Gly Leu Asp Gly Gln 485 490 495 Ala Pro Gly Gln Asp Cys Val Trp Gln Gly 500 505 <210> 130 <211> 506 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 130 Met Leu Lys Pro Leu Arg Arg Ala Ala Val Thr Pro Met Trp Pro Cys 1 5 10 15 Ser Met Leu Pro Arg Arg Leu Trp Asp Arg Glu Ala Gly Thr Leu Gln 20 25 30 Val Leu Gly Val Leu Ala Met Leu Trp Leu Gly Ser Met Ala Leu Thr 35 40 45 Tyr Leu Leu Trp Gln Val Arg Cys Pro Pro Thr Trp Gly Gln Val Gln 50 55 60 Pro Arg Asp Val Pro Arg Ser Trp Gly His Gly Ser Ser Leu Ala Leu 65 70 75 80 Glu Pro Leu Glu Ala Glu Val Arg Lys Gln Arg Asp Ser Cys Gln Leu 85 90 95 Val Leu Val Glu Ser Ile Pro Gln Asp Leu Pro Phe Ala Ala Gly Ser 100 105 110 Leu Ser Ala Gln Pro Leu Gly Gln Ala Trp Leu Gln Leu Leu Asp Thr 115 120 125 Ala Gln Glu Ser Val His Val Ala Ser Tyr Tyr Trp Ser Leu Thr Gly 130 135 140 Pro Asp Ile Gly Val Asn Asp Ser Ser Ser Gln Leu Gly Glu Ala Leu 145 150 155 160 Leu Gln Lys Leu Gln Gln Leu Leu Gly Arg Asn Ile Ser Leu Ala Val 165 170 175 Ala Thr Ser Ser Pro Thr Leu Ala Arg Lys Ser Thr Asp Leu Gln Val 180 185 190 Leu Ala Ala Arg Gly Ala Gln Val Arg Arg Val Pro Met Gly Arg Leu 195 200 205 Thr Arg Gly Val Leu His Ser Lys Phe Trp Val Val Asp Gly Arg His 210 215 220 Ile Tyr Met Gly Ser Ala Asn Met Asp Trp Arg Ser Leu Thr Gln Val 225 230 235 240 Lys Glu Leu Gly Ala Val Ile Tyr Asn Cys Ser His Leu Ala Gln Asp 245 250 255 Leu Glu Lys Thr Phe Gln Thr Tyr Trp Val Leu Gly Val Pro Lys Ala 260 265 270 Val Leu Pro Lys Thr Trp Pro Gln Asn Phe Ser Ser His Ile Asn Arg 275 280 285 Phe Gln Pro Phe Gln Gly Leu Phe Asp Gly Val Pro Thr Thr Ala Tyr 290 295 300 Phe Ser Ala Ser Pro Pro Ala Leu Cys Pro Gln Gly Arg Thr Pro Asp 305 310 315 320 Leu Glu Ala Leu Leu Ala Val Met Gly Ser Ala Gln Glu Phe Ile Tyr 325 330 335 Ala Ser Val Met Glu Tyr Phe Pro Thr Thr Arg Phe Ser His Pro Arg 340 345 350 Arg Tyr Trp Pro Val Leu Asp Asn Ala Leu Arg Ala Ala Ala Phe Ser 355 360 365 Lys Gly Val Arg Val Arg Leu Leu Val Ser Cys Gly Leu Asn Thr Asp 370 375 380 Pro Thr Met Phe Pro Tyr Leu Arg Ser Leu Gln Ala Leu Ser Asn Pro 385 390 395 400 Ala Ala Asn Val Ser Val Asp Val Lys Val Phe Ile Val Pro Val Gly 405 410 415 Asn His Ser Asn Ile Pro Phe Ser Arg Val Asn His Ser Lys Phe Met 420 425 430 Val Thr Glu Lys Ala Ala Tyr Ile Gly Thr Ser Asn Trp Ser Glu Asp 435 440 445 Tyr Phe Ser Ser Thr Thr Gly Val Gly Leu Val Val Thr Gln Ser Pro 450 455 460 Gly Ala Gln Pro Ala Gly Ala Thr Val Gln Glu Gln Leu Arg Gln Leu 465 470 475 480 Phe Glu Arg Asp Trp Ser Ser Arg Tyr Ala Val Gly Leu Asp Gly Gln 485 490 495 Ala Pro Gly Gln Asp Cys Val Trp Gln Gly 500 505 <210> 131 <211> 1512 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 131 atggacaaga agaaagagca cccagagatg cggataccac tccagacagc agtggaggtc 60 tctgattggc cctgctccac atctcatgat ccacatagcg gacttggcat ggtactgggg 120 atgctagctg tactgggact cagctctgtg actctcatct tgttcctgtg gcaaggggcc 180 acttctttca ccagtcatcg gatgttccct gaggaagtgc cctcctggtc ctgggagacc 240 ctgaaaggag acgctgagca gcagaataac tcctgtcagc tcatccttgt ggaaagcatc 300 cccgaggact tgccatttgc agctggcagc cccactgccc agcccctggc ccaggcttgg 360 ctgcagcttc ttgacactgc tcgggagagc gtccacattg cctcgtacta ctggtccctc 420 actggactgg acattggagt caatgactcg tcttctcggc agggagaggc ccttctacag 480 aagttccaac agcttcttct caggaacatc tctgtggtgg tggccaccca cagcccaaca 540 ttggccaaga catccactga cctccaggtc ttggctgccc atggtgccca gatacgacaa 600 gtgcccatga aacagcttac tgggggtgtt ctacactcca aattctgggt tgtggatggg 660 cgacacgtct acgtgggcag cgccaacatg gactggcggt ccctgactca ggtgaaggaa 720 cttggtgcaa tcatctacaa ctgcagcaac ctggctcaag accttgagaa aacattccag 780 acctactggg tgctagggac tccccaagct gttctcccta aaacctggcc tcggaacttc 840 tcatcccaca tcaaccgctt ccatcccttg cggggtccct ttgatggggt tcccaccacg 900 gcctatttct cggcctcccc tccctccctc tgcccgcatg gccggacccg ggatctggac 960 gcagtgttgg gagtgatgga gggtgctcgc cagttcatct atgtctcggt gatggagtat 1020 ttccctacca cgcgcttcac ccaccatgcc aggtactggc ccgtgctgga caatgcgcta 1080 cgggcagcgg ccctcaataa gggtgtgcat gtgcgcttac tggtcagctg ctggttcaac 1140 acagacccca ccatgttcgc ttatctgagg tccctgcagg ctttcagtaa cccctcggct 1200 ggcatctcag tggatgtgaa agtcttcatc gtgcctgtgg gaaatcattc caacatcccg 1260 ttcagccgcg tgaaccacag caagttcatg gtcacagaca agacagccta tgtaggcacc 1320 tctaactggt cagaagacta cttcagccac accgctggtg tgggcctgat tgtcagccag 1380 aagaccccca gagcccagcc aggcgcaacc accgtgcagg agcagctgag gcaactcttt 1440 gaacgagact ggagttccca ctatgctatg gacctagaca gacaagtccc gagccaggac 1500 tgtgtctggt ag 1512 <210> 132 <211> 503 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 132 Met Asp Lys Lys Lys Glu His Pro Glu Met Arg Ile Pro Leu Gln Thr 1 5 10 15 Ala Val Glu Val Ser Asp Trp Pro Cys Ser Thr Ser His Asp Pro His 20 25 30 Ser Gly Leu Gly Met Val Leu Gly Met Leu Ala Val Leu Gly Leu Ser 35 40 45 Ser Val Thr Leu Ile Leu Phe Leu Trp Gln Gly Ala Thr Ser Phe Thr 50 55 60 Ser His Arg Met Phe Pro Glu Glu Val Pro Ser Trp Ser Trp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Lys Gly Asp Ala Glu Gln Gln Asn Asn Ser Cys Gln Leu Ile Leu 85 90 95 Val Glu Ser Ile Pro Glu Asp Leu Pro Phe Ala Ala Gly Ser Pro Thr 100 105 110 Ala Gln Pro Leu Ala Gln Ala Trp Leu Gln Leu Leu Asp Thr Ala Arg 115 120 125 Glu Ser Val His Ile Ala Ser Tyr Tyr Trp Ser Leu Thr Gly Leu Asp 130 135 140 Ile Gly Val Asn Asp Ser Ser Ser Arg Gln Gly Glu Ala Leu Leu Gln 145 150 155 160 Lys Phe Gln Gln Leu Leu Leu Arg Asn Ile Ser Val Val Val Ala Thr 165 170 175 His Ser Pro Thr Leu Ala Lys Thr Ser Thr Asp Leu Gln Val Leu Ala 180 185 190 Ala His Gly Ala Gln Ile Arg Gln Val Pro Met Lys Gln Leu Thr Gly 195 200 205 Gly Val Leu His Ser Lys Phe Trp Val Val Asp Gly Arg His Val Tyr 210 215 220 Val Gly Ser Ala Asn Met Asp Trp Arg Ser Leu Thr Gln Val Lys Glu 225 230 235 240 Leu Gly Ala Ile Ile Tyr Asn Cys Ser Asn Leu Ala Gln Asp Leu Glu 245 250 255 Lys Thr Phe Gln Thr Tyr Trp Val Leu Gly Thr Pro Gln Ala Val Leu 260 265 270 Pro Lys Thr Trp Pro Arg Asn Phe Ser Ser His Ile Asn Arg Phe His 275 280 285 Pro Leu Arg Gly Pro Phe Asp Gly Val Pro Thr Thr Ala Tyr Phe Ser 290 295 300 Ala Ser Pro Pro Ser Leu Cys Pro His Gly Arg Thr Arg Asp Leu Asp 305 310 315 320 Ala Val Leu Gly Val Met Glu Gly Ala Arg Gln Phe Ile Tyr Val Ser 325 330 335 Val Met Glu Tyr Phe Pro Thr Thr Arg Phe Thr His His Ala Arg Tyr 340 345 350 Trp Pro Val Leu Asp Asn Ala Leu Arg Ala Ala Ala Leu Asn Lys Gly 355 360 365 Val His Val Arg Leu Leu Val Ser Cys Trp Phe Asn Thr Asp Pro Thr 370 375 380 Met Phe Ala Tyr Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Ser Asn Pro Ser Ala 385 390 395 400 Gly Ile Ser Val Asp Val Lys Val Phe Ile Val Pro Val Gly Asn His 405 410 415 Ser Asn Ile Pro Phe Ser Arg Val Asn His Ser Lys Phe Met Val Thr 420 425 430 Asp Lys Thr Ala Tyr Val Gly Thr Ser Asn Trp Ser Glu Asp Tyr Phe 435 440 445 Ser His Thr Ala Gly Val Gly Leu Ile Val Ser Gln Lys Thr Pro Arg 450 455 460 Ala Gln Pro Gly Ala Thr Thr Val Gln Glu Gln Leu Arg Gln Leu Phe 465 470 475 480 Glu Arg Asp Trp Ser Ser His Tyr Ala Met Asp Leu Asp Arg Gln Val 485 490 495 Pro Ser Gln Asp Cys Val Trp 500

Claims (43)

  1. 포스포리파아제 D4 (PLD4) 단백질에 결합하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  2. 제 1 항에 있어서, 중쇄 가변 영역에서 CDR1 로서 서열 SYWMH, CDR2 로서 서열 DIYPGSDSTNYNEKFKS 및 CDR3 으로서 서열 GGWLDAMDY 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  3. 제 1 항에 있어서, 경쇄 가변 영역에서, CDR1 로서 서열 RASQDISNYLN, CDR2 로서 서열 YTSRLHS 및 CDR3 으로서 서열 QQGNTLPW 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  4. 제 1 항에 있어서, 중쇄 가변 영역에서, CDR1 로서 서열 SYWMH, CDR2 로서 서열 DIYPGSDSTNYNEKFKS 및 CDR3 으로서 서열 GGWLDAMDY, 및 경쇄 가변 영역에서, CDR1 로서 서열 RASQDISNYLN, CDR2 로서 서열 YTSRLHS, 및 CDR3 으로서 서열 QQGNTLPW 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  5. 제 1 항에 있어서, 중쇄 가변 영역에서, CDR1 로서 서열 TYWMH, CDR2 로서 서열 AIYPGNSETSYNQKFKG, 및 CDR3 으로서 서열 GYSDFDY 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  6. 제 1 항에 있어서, 경쇄 가변 영역에서, CDR1 으로서 서열 HASQGIRSNIG, CDR2 로서 서열 HGTNLED, 및 CDR3 으로서 서열 VQYVQFP 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  7. 제 1 항에 있어서, 중쇄 가변 영역에서, CDR1 으로서 서열 TYWMH, CDR2 로서 서열 AIYPGNSETSYNQKFKG, 및 CDR3 으로서 서열 GYSDFDY, 및 경쇄 가변 영역에서, CDR1 으로서 서열 HASQGIRSNIG, CDR2 로서 서열 HGTNLED, 및 CDR3 으로서 서열 VQYVQFP 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  8. 제 1 항에 있어서, 중쇄 가변 영역에서, CDR1 로서 서열 DYNLH, CDR2 로서 서열 YIYPYNGNTGYNQKFKR, 및 CDR3 으로서 서열 GGIYDDYYDYAIDY 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  9. 제 1 항에 있어서, 경쇄 가변 영역에서, CDR1 로서 서열 RASENIYSHIA, CDR2 로서 서열 GATNLAH, 및 CDR3 으로서 서열 QHFWGTP 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  10. 제 1 항에 있어서, 중쇄 가변 영역에서, CDR1 로서 서열 DYNLH, CDR2 로서 서열 YIYPYNGNTGYNQKFKR, 및 CDR3 으로서 서열 GGIYDDYYDYAIDY, 및 경쇄 가변 영역에서, CDR1 으로서 서열 RASENIYSHIA, CDR2 로서 서열 GATNLAH, 및 CDR3 으로서 서열 QHFWGTP 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  11. 제 1 항에 있어서, 중쇄 가변 영역에서, CDR1 으로서 서열 SYYLY, CDR2 로서 서열 LINPTNSDTIFNEKFKS, 및 CDR3 으로서 서열 EGGYGYGPFAY 을 갖는 모노클로날 항체 (8C11 항체), 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  12. 제 1 항에 있어서, 경쇄 가변 영역에서, CDR1 으로서 서열 TSSQTLVHSNGNTYLH, CDR2 로서 서열 KVSNRFS, 및 CDR3 으로서 서열 HSTHVP 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  13. 제 1 항에 있어서, 중쇄 가변 영역에서, CDR1 으로서 서열 SYYLY, CDR2 로서 서열 LINPTNSDTIFNEKFKS, 및 CDR3 으로서 서열 EGGYGYGPFAY, 및 경쇄 가변 영역에서, CDR1 으로서 서열 TSSQTLVHSNGNTYLH, CDR2 로서 서열 KVSNRFS, 및 CDR3 으로서 서열 HSTHVP 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  14. 제 1 항에 있어서, 중쇄 가변 영역에서, CDR1 으로서 서열 SYGMS, CDR2 로서 서열 TISSGGSYIYYPESVKG, 및 CDR3 으로서 서열 LYGGRRGYGLDY 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  15. 제 1 항에 있어서, 경쇄 가변 영역에서, CDR1 으로서 서열 RSSKSLLHSDGITYLY, CDR2 로서 서열 QMSNLAS, 및 CDR3 으로서 서열 AQNLEL 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  16. 제 1 항에 있어서, 중쇄 가변 영역에서, CDR1 으로서 서열 SYGMS, CDR2 로서 서열 TISSGGSYIYYPESVKG, 및 CDR3 으로서 서열 LYGGRRGYGLDY, 및 경쇄 가변 영역에서, CDR1 으로서 서열 RSSKSLLHSDGITYLY, CDR2 로서 서열 QMSNLAS, 및 CDR3 으로서 서열 AQNLEL 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  17. 제 1 항에 있어서, 중쇄 가변 영역에서, CDR1 으로서 서열 SHYYWT, CDR2 로서 서열 YISYDGSNNYNPSLKN, 및 CDR3 으로서 서열 EGPLYYGNPYWYFDV 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  18. 제 1 항에 있어서, 경쇄 가변 영역에서, CDR1 로서 서열 RASQDIDNYLN, CDR2 로서 서열 YTSRLHS, 및 CDR3 으로서 서열 QQFNTLP 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  19. 제 1 항에 있어서, 중쇄 가변 영역에서, CDR1 로서 서열 SHYYWT, CDR2 로서 서열 YISYDGSNNYNPSLKN, 및 CDR3 으로서 서열 EGPLYYGNPYWYFDV, 및 경쇄 가변 영역에서, CDR1 로서 서열 RASQDIDNYLN, CDR2 로서 서열 YTSRLHS, 및 CDR3 으로서 서열 QQFNTLP 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  20. 제 1 항에 있어서, 중쇄 가변 영역에서, CDR1 으로서 서열 SHYYWS, CDR2 로서 서열 YISYDGSNNYNPSLKN, 및 CDR3 으로서 서열 EGPLYYGNPYWYFDV 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  21. 제 1 항에 있어서, 경쇄 가변 영역에서, CDR1 으로서 서열 RASQDIDNYLN, CDR2 로서 서열 YTSRLHS, 및 CDR3 으로서 서열 QQFNTLP 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  22. 제 1 항에 있어서, 중쇄 가변 영역에서, CDR1 으로서 서열 SHYYWS, CDR2 로서 서열 YISYDGSNNYNPSLKN, 및 CDR3 으로서 서열 EGPLYYGNPYWYFDV, 및 경쇄 가변 영역에서, CDR1 로서 서열 RASQDIDNYLN, CDR2 로서 서열 YTSRLHS, 및 CDR3 으로서 서열 QQFNTLP 을 갖는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  23. 수탁 번호: NITE BP-1211, NITE BP-1212, NITE BP-1213, 및 NITE BP-1214 로서 기탁된 하이브리도마 mp5B7, mp7B4, mp13D4, 및 mp13H11 중 어느 하나에 의해 생성되는, 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  24. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 모노클로날 항체 중 어느 하나를 생성하는 하이브리도마.
  25. 수탁 번호: NITE BP-1211, NITE BP-1212, NITE BP-1213 또는 NITE BP-1214 로서 기탁된, 하이브리도마 mp5B7, mp7B4, mp13D4 또는 mp13H11.
  26. 제 25 항에 따른 하이브리도마를 배양하고; 및 그 배양물로부터 모노클로날 항체를 수집하는 것을 포함하는, 모노클로날 항체의 제조 방법.
  27. 하기 프로세스를 포함하는, PLD4 에 결합하는 모노클로날 항체를 생성하는 세포의 제조 방법:
    1) PLD4 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 재조합 PLD4-Ig 융합 단백질을 면역 동물에 투여하는 프로세스; 및
    2) 면역 동물의 항체-생성 세포로부터 PLD4 에 결합하는 항체를 생성하는 항체-생성 세포를 선택하는 프로세스.
  28. 제 27 항에 있어서, PLD4 를 발현하는 세포가 PLD4 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 외래성 폴리뉴클레오티드를 발현 가능한 방식으로 보유하는 세포인 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 세포가 동물 세포인 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 세포가 인간-유래 세포인 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 인간-유래 세포가 HEK-293T 세포인 방법.
  32. 제 27 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 항체-생성 세포를 클로닝하는 프로세스를 점증적으로 포함하는 방법.
  33. 제 29 항에 따른 방법에 의해 수득된 항체-생성 세포를 배양하고; 그 배양물로부터 모노클로날 항체를 수집하는 것을 포함하는, PLD4 세포외 도메인에 결합하는 모노클로날 항체의 제조 방법.
  34. 하기의 프로세스에 의해 수득될 수 있는, PLD4 를 인식하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편:
    1) PLD4 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 재조합 PLD4-Ig 융합 단백질을 면역 동물에 투여하는 프로세스,
    2) 면역 동물의 항체-생성 세포로부터 PLD4 에 결합하는 항체를 생성하는 항체-생성 세포를 선택하는 프로세스, 및
    3) 프로세스 2) 에서 선택된 항체-생성 세포를 배양하고, 그 배양물로부터 PLD4 를 인식하는 항체를 수집하는 프로세스.
  35. (a) PLD4 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 외래적으로 발현가능한 방식으로 보유하는 동물 세포, 또는 그의 세포막 분획을 포함하는, PLD4 에 결합하는 항체를 제조하기 위한 면역원.
  36. 제 35 항에 있어서, 동물 세포가 인간-유래 세포인 면역원.
  37. PLD4 세포외 도메인에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 테스트 세포와 접촉시키고, 그 세포에 결합하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 검출하는 것을 포함하는, 플라스마사이토이드 수지상 세포의 검출 방법.
  38. PLD4 세포외 도메인에 결합하는 모노클로날 항체; 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편을 포함하는 플라스마사이토이드 수지상 세포의 검출용 시약.
  39. 후술되는 성분들 중 어느 하나를 플라스마사이토이드 수지상 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 플라스마사이토이드 수지상 세포의 활성을 억제하는 방법:
    (a) PLD4 에 결합하고, 플라스마사이토이드 수지상 세포의 활성을 억제하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편, 및
    (b) 모노클로날 항체 (a) 의 상보성 결정 영역이 이식된 면역글로불린, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  40. 후술되는 성분들 중 어느 하나를 생물에 투여하는 것을 포함하는, 생물 내 플라스마사이토이드 수지상 세포의 활성을 억제하는 방법:
    (a) PLD4 에 결합하고, 플라스마사이토이드 수지상 세포의 활성을 억제하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편, 및
    (b) 모노클로날 항체 (a) 의 상보성 결정 영역이 이식된 면역글로불린, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  41. 제 39 항 또는 제 40 항에 있어서, 플라스마사이토이드 수지상 세포의 활성이 인터페론 생성 활성 및 인터페론 생성 세포의 생존 중 어느 하나이거나 또는 이들 양자 모두인 방법.
  42. 활성 성분으로서 후술되는 성분들 중 어느 하나를 포함하는 플라스마사이토이드 수지상 세포의 활성 억제제:
    (a) PLD4 에 결합하고, 플라스마사이토이드 수지상 세포의 활성을 억제하는 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편, 및
    (b) 모노클로날 항체 (a) 의 상보성 결정 영역이 이식된 면역글로불린, 또는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 단편.
  43. 제 42 항에 있어서, 플라스마사이토이드 수지상 세포의 활성이 인터페론 생성 활성 및 인터페론 생성 세포의 생존 중 어느 하나이거나 또는 이들 양자 모두인 인터페론 생성 세포의 활성 억제제.
KR1020147023620A 2012-01-31 2013-01-31 항-포스포리파아제 ｄ4 항체 KR102098413B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2012-018266 2012-01-31
JP2012018266 2012-01-31
PCT/JP2013/052781 WO2013115410A2 (en) 2012-01-31 2013-01-31 Anti-phospholipase d4 antibody

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140126337A true KR20140126337A (ko) 2014-10-30
KR102098413B1 KR102098413B1 (ko) 2020-04-07

Family

ID=47748721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147023620A KR102098413B1 (ko) 2012-01-31 2013-01-31 항-포스포리파아제 ｄ4 항체

Country Status (15)

Country Link
US (2) US9944715B2 (ko)
EP (2) EP3431504B1 (ko)
JP (4) JP6118345B2 (ko)
KR (1) KR102098413B1 (ko)
CN (2) CN112442128B (ko)
AU (2) AU2013215886B2 (ko)
CA (1) CA2863009C (ko)
DK (2) DK2809683T3 (ko)
ES (2) ES2873035T3 (ko)
HU (2) HUE054362T2 (ko)
IL (1) IL233794B (ko)
PL (2) PL3431504T3 (ko)
PT (1) PT2809683T (ko)
TR (1) TR201819828T4 (ko)
WO (1) WO2013115410A2 (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9944715B2 (en) * 2012-01-31 2018-04-17 Sbi Biotech Co., Ltd. Anti-phospholipase D4 antibody
TR201910330T4 (tr) * 2013-07-30 2019-07-22 Sbi Biotech Co Ltd Anti-fosfolin d4 antikoru içeren ilaç.
EP3088519A4 (en) * 2013-12-24 2017-09-13 Astellas Pharma Inc. Novel anti-human bdca-2 antibody
CN109069628A (zh) * 2016-01-14 2018-12-21 Bps生物科学有限公司 抗pd-1抗体及其用途
BR112018067951A2 (pt) * 2016-03-10 2019-02-05 Viela Bio Inc moléculas que se ligam a ilt7 e métodos de uso destas
CN105624325B (zh) * 2016-03-31 2019-06-11 北京泱深生物信息技术有限公司 肺腺癌的诊治标记物
HUE054037T2 (hu) * 2017-10-14 2021-08-30 Abbvie Inc CD71 elleni, aktiválható antitest hatóanyag konjugátumok és eljárások alkalmazásukra
CN110042123B (zh) * 2019-01-07 2023-01-17 西北农林科技大学 一种通过诱导表达zfp57提高牛体细胞克隆效率的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7098015B2 (en) * 1999-06-11 2006-08-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 27875, 22025, 27420, 17906, 16319, 55092 and 10218 molecules and uses therefor
CN1878795A (zh) 2002-12-02 2006-12-13 阿布格尼克斯公司 针对磷脂酶a2的抗体及其应用
BRPI0506125B8 (pt) * 2004-07-09 2021-05-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpo anti - glipicano 3, seu método de produção, polinucleotídeo, vetor e inibidor do crescimento de células
US9944715B2 (en) * 2012-01-31 2018-04-17 Sbi Biotech Co., Ltd. Anti-phospholipase D4 antibody
TR201910330T4 (tr) * 2013-07-30 2019-07-22 Sbi Biotech Co Ltd Anti-fosfolin d4 antikoru içeren ilaç.

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PLOS ONE 제5권 제11호 e13932 (2010-11-11) *
PLOS ONE 제6권 제11호 e27544 (2011-11-15) *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019048874A (ja) 2019-03-28
PT2809683T (pt) 2019-01-17
HUE054362T2 (hu) 2021-09-28
PL3431504T3 (pl) 2021-10-18
JP7244102B2 (ja) 2023-03-22
WO2013115410A3 (en) 2013-09-26
JP2021019630A (ja) 2021-02-18
BR112014018539A8 (pt) 2017-07-11
EP2809683A2 (en) 2014-12-10
US20150044226A1 (en) 2015-02-12
EP3431504A1 (en) 2019-01-23
ES2873035T3 (es) 2021-11-03
JP2017155045A (ja) 2017-09-07
TR201819828T4 (tr) 2019-01-21
CA2863009A1 (en) 2013-08-08
CN112442128B (zh) 2024-05-17
AU2013215886B2 (en) 2017-11-09
US20180258185A1 (en) 2018-09-13
BR112014018539A2 (ko) 2017-06-20
DK3431504T3 (da) 2021-06-28
JP6830471B2 (ja) 2021-02-17
DK2809683T3 (en) 2018-12-10
WO2013115410A2 (en) 2013-08-08
AU2018200934A1 (en) 2018-03-01
US10336834B2 (en) 2019-07-02
PL2809683T3 (pl) 2019-03-29
CA2863009C (en) 2020-07-07
US9944715B2 (en) 2018-04-17
IL233794B (en) 2021-04-29
ES2694165T3 (es) 2018-12-18
EP3431504B1 (en) 2021-03-24
CN104284903B (zh) 2020-10-09
CN104284903A (zh) 2015-01-14
HUE041552T2 (hu) 2019-05-28
EP2809683B1 (en) 2018-10-03
JP2015508056A (ja) 2015-03-16
AU2018200934B2 (en) 2019-09-12
CN112442128A (zh) 2021-03-05
AU2013215886A1 (en) 2014-08-14
JP6118345B2 (ja) 2017-04-19
KR102098413B1 (ko) 2020-04-07
IL233794A0 (en) 2014-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102098413B1 (ko) 항-포스포리파아제 ｄ4 항체
CN112533955B (zh) 抗b7-h3抗体
CN110776566A (zh) 抗ilt7抗体
JP7036729B2 (ja) 治療用抗ｃｄ９抗体
US20210130493A1 (en) Medicament comprising anti-phospholipase d4 antibody
KR101950898B1 (ko) 항-robo4 항체
CN116940595A (zh) 抗tigit抗体及其用途
BR112014018539B1 (pt) Método de preparar um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal, hibridoma, anticorpo monoclonal ou um fragmento contendo uma região de ligação ao antígeno do mesmo, método de preparar um anticorpo monoclonal, método ex vivo de detectar uma célula dendrítica plasmacitóide, reagente para a detecção de uma célula dendrítica plasmacitóide, método ex vivo de suprimir uma atividade de uma célula dendrítica plasmacitóide e agente para suprimir uma atividade de uma célula dendrítica plasmacitóide

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant