CN112533955B - 抗b7-h3抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与B7H3(B7‑H3)分子的胞外区结合的抗体及其免疫反应性片段及其用途，尤其是在癌症治疗中的用途。本发明尤其涉及人源化抗B7‑H3抗体及其抗原结合片段，其能够增强针对癌性细胞的免疫系统活化。

Description

抗B7-H3抗体
本发明涉及与B7H3(B7-H3)分子的胞外区结合的抗体及其免疫反应性片段及其用途，尤其是在癌症治疗中的用途。本发明尤其涉及人源化抗B7-H3抗体及其抗原结合片段，其能够增强针对包括癌性细胞在内的患病组织的免疫系统活化。
发明的背景
B7同源性3蛋白(B7-H3)(也称为CD276和B7RP-2，在本文中称为“B7-H3”或“B7H3”)是免疫球蛋白超家族的I型跨膜糖蛋白。目前，已发现B7超家族的七个成员：B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡配体2(PD-L2)、B7-H3和B7-H4(Collins,M.等(2005)“The B7 Family of Immune-RegulatoryLigands,”Genome Biol.6:223.1-223.7)。
人B7-H3包含推定的信号肽，V样和C样Ig结构域，跨膜区和胞质区。存在两种人B7-H3的同种型，即具有单个IgV-IgC样结构域的2IgB7-H3同种型(2IgB7-H3同种型)和具有IgV-IgC-IgV-IgC样结构域的4IgB7-H3同种型。人组织和细胞系中主要的B7-H3同种型是4IgB7-H3同种型(Steinberger等人,J.Immunol.172(4):2352-9(2004))。
B7-H3在包括自然杀伤(NK)细胞、T细胞和抗原提呈细胞(APC)在内的许多免疫细胞中无基础性表达的，但其表达是可诱导的，例如，通过细胞因子，如IFN-γ和GM-CSF诱导(Sharpe,A.H.等(2002)"The B7-CD28 Superfamily,"Nature Rev.Immunol.2:1 16-126)。B7-H3转录本还在多种人类组织中表达，包括结肠、心脏、肝脏、胎盘、前列腺、小肠、睾丸和子宫，以及成骨细胞、成纤维细胞、上皮细胞和非淋巴谱系的其他细胞(Nygren等.FrontBiosci.3:989-93(2011))。然而，正常组织中的蛋白表达通常维持在低水平。
B7-H3还在多种人类癌症中表达，包括前列腺癌、透明细胞肾细胞癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、急性髓细胞性白血病(AML)，非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、卵巢癌、结直肠癌、结肠癌、肾癌、肝细胞癌、肾癌、头颈癌、下咽鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、子宫内膜癌和泌尿道上皮细胞癌。
已特异性结合B7-H3的抗体和其他分子已有描述(参见，美国专利号7,527,969；7,368,554；7,358,354；和7,279,567；PCT公开号WO 2008/116219；WO 2006/016276；WO 2004/093894；WO 04/001381；WO 2002/32375；WO2002/10187和WO 2001/094413,EP 1292619B)。尽管已存在这所有的抗体和分子，我们仍需要改进的，能够结合癌细胞并促进或介导针对癌细胞的免疫应答的抗体或分子，从而用以诊断和治疗这些癌症。
发明概述
本文提供的抗体及其免疫反应性片段以高亲和力结合在细胞(例如，癌细胞)上表达的B7H3(B7-H3)分子，并促进针对癌细胞的有效免疫应答。本文提供的抗体及其免疫反应性片段能够增强免疫系统的活化，由此提供重要的治疗和诊断剂，用于靶向与B7-H3分子的表达和/或活性相关的病理状况。因此，本发明提供了与B7-H3结合有关的方法、组合物、试剂盒和制品。
在一方面，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包含重链(HC)可变区序列和轻链(LC)可变区序列，其中所述抗体结合B7-H3的胞外区，结合亲和力经SPR分析确定为约1.5nM或优于1.5nM，例如通过SPR分析确定为1.0-1.4nM,0.5-1.0nM,0.1-0.5nM,0.4nM,0.3nM,0.2nM,0.1nM或更优的。
在某些实施方案中，本发明提供了权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中
(a)所述HC包含含有STALATDY(SEQ ID NO:3)或STALATGY(SEQ ID NO:9)的CDR3序列；或
(b)所述LC包含含有QQWSSYPLT(SEQ IDNO:6)或QQWSSYPLT(SEQ ID NO:12)的CDR3序列；或
(c)所述HC包含含有STALATDY(SEQ ID NO:3)的CDR3序列，且所述LC包含含有QQWSSYPLT(SEQ ID NO:6)的CDR3序列；或
(d)所述HC包含含有STALATGY(SEQ ID NO:9)的CDR3序列，且所述LC包含含有QQWSSYPLT(SEQ ID NO:12)的CDR3序列。
某些实施方案中，所述HC进一步包含含有MIHPNSGTFNYNERFKR(SEQ ID NO:2)或MIHPNSGAFNYNERFKT(SEQ ID NO:8)的CDR2序列。在某些实施方案中，所述HC进一步包含含有GYNFNNYWMH(SEQ ID NO:1)或GYTFTNYWMH(SEQ ID NO:7)的CDR1序列。在某些实施方案中，所述LC进一步包含含有DTSNLAS(SEQ ID NO:5)或DTSNLAS(SEQ ID NO:11)的CDR2序列。在某些实施方案中，所述LC进一步包含含有SASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)或SASSSVSYMY(SEQID NO:10)的CDR1序列。在某些实施方案中，所述HC包含
(a)HC CDR1，其含有氨基酸序列GYNFNNYWMH(SEQ IDNO:1)；和/或
(b)HC CDR2，其含有氨基酸序列MIHPNSGTFNYNERFKR(SEQ ID NO:2)；和/或
(c)HC CDR3，其含有氨基酸序列STALATDY(SEQ ID NO:3)；和/或
所述LC包含
(a)LC CDR1，其含有氨基酸序列SASSSVSYMY(SEQ ID NO:4)；和/或
(b)LC CDR2，其含有氨基酸序列DTSNLAS(SEQ ID NO:5)；和/或
(c)LC CDR3，其含有氨基酸序列QQWSSYPLT(SEQ ID NO:6)。
在某些实施方案中，所述HC包含
(a)HC CDR1，其含有氨基酸序列GYTFTNYWMH(SEQ ID NO:7)；和/或
(b)HC CDR2，其含有氨基酸序列MIHPNSGAFNYNERFKT(SEQ ID NO:8)；和/或
(c)HC CDR3，其含有氨基酸序列STALATGY(SEQ ID NO:9)；和/或
所述LC包含
(a)LC CDR1，其含有氨基酸序列SASSSVSYMY(SEQ ID NO:10)；和/或
(b)LC CDR2，其含有氨基酸序列DTSNLAS(SEQ ID NO:11)；和/或
(c)LC CDR3，其含有氨基酸序列QQWSSYPLT(SEQ ID NO:12)。
在某些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含人受体框架(Acceptor framework)。在某些实施方案中，所述人受体框架源自人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施方案中，所述人受体框架包含针对VL的κI框架序列亚组和针对VH的III框架序列亚组。一般而言，所述序列的亚组是如Kabat等Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEdition,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),卷1-3中的亚组。在某些实施方案中，针对VL，所述亚组是如Kabat等(同上)中的亚组κI。在某些实施方案中，针对VH，所述亚组是如Kabat等(同上)中的亚组III。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含人共有框架。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含人共有框架，其具有氨基酸序列的改变，例如，1-15、1-10、2-9、3-8、4-7或5-6个氨基酸的改变。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含HC可变区序列，所述HC可变区序列包含选自下组的任意氨基酸序列：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17，和与SEQ ID NO:13、16和17中的任一个具有多于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含LC可变区序列，所述LC可变区序列包含选自下组的任意氨基酸序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19，和与SEQ ID NO:14、15、18和19中的任一个具有多于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述HC可变区序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且所述LC可变区序列包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述HC可变区序列包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且所述LC可变区序列包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体是IgG1、IgG2或IgG4同种型。在某些实施方案中，所述抗原结合片段选自下组：Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段为封闭抗体(blocking antibody)或拮抗剂抗体(antagonist antibody)，其抑制或降低其结合的B7-H3分子的生物学活性。优选的所述封闭抗体或拮抗剂抗体基本或完全抑制B7-H3分子的生物学活性。
在一方面，本发明提供了一种双特异性分子，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述第二抗体或其抗原结合片段特异性地结合在肿瘤细胞表面表达的肿瘤抗原，其中所述肿瘤抗原选自下组：A33；ADAM-9；ALCAM；BAGE；β-连环蛋白；CA125；羧肽酶M；CD103；CD19；CD20；CD22；CD23；CD25；CD27；CD28；CD36；CD40/CD154；CD45；CD46；CD5；CD56；CD79a/CD79b；CDK4；CEA；CTLA4；细胞角蛋白8；EGF-R；EphA2；ErbB1；ErbB3；ErbB4；GAGE-1；GAGE-2；GD2/GD3/GM2；HER-2/neu；人乳头瘤病毒-E6；人乳头瘤病毒-E7；JAM-3；KID3；KID31；KSA(17-1A)；LUCA-2；MAGE-1；MAGE-3；MART；MUC-1；MUM-1；N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶；抑瘤素M；pl5；PIPA；PSA；PSMA；ROR1；TNF-β受体；TNF-α受体；TNF-γ受体；转铁蛋白受体；和VEGF受体。
在一方面，本发明提供了一种多肽，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段。
在一方面，本发明提供了一种多肽，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段的HC可变区和/或LC可变区。
在一方面，本发明提供了一种免疫缀合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段，其与治疗剂连接。在某些实施方案中，所述治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。
在一方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段、双特异性分子、多肽或免疫缀合物，和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含抗癌药剂。在某些实施方案中，所述药剂是抗体、化学治疗剂、放射治疗剂、激素治疗剂、毒素或免疫治疗剂。
在一方面，本发明提供了一种用于治疗癌症的制品或试剂盒，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段、双特异性分子、多肽、免疫缀合物或组合物，以及包装插页，所述插页具有关于本发明抗体或其抗原结合片段、双特异性分子、多肽、免疫缀合物或组合物用途的必要信息。
在一方面，本发明提供了一种用于诊断癌症的制品或试剂盒，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段，以及包装插页，所述插页具有关于本发明抗体或其抗原结合片段用途的必要信息。
在一方面，本发明提供了一种编码本发明的抗体或其抗原结合片段HC可变区和/或LC可变区的分离的核酸，一种包含所述核酸的表达载体，或包含所述表达载体的一种宿主细胞。
在一方面，本发明提供了一种用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在上述宿主细胞中表达所述抗体或其抗原结合片段，并且从所述宿主细胞中分离所述抗体或其抗原结合片段。
在一方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，其包括向患有癌症疾病的患者施用有效量的如上所述的本发明的抗体或其抗原结合片段、双特异性分子、多肽、免疫缀合物、组合物、制品或试剂盒。在某些实施方案中，所述癌症选自下组：黑素瘤、结肠直肠腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌和肾透明细胞癌。
在一方面，本发明提供了一种用于检测或定量B7-H3多肽表达或活性的方法，其包括使本发明的抗体或其抗原结合片段与来自受试者的样品接触。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段用可检测物质标记。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是放射性标记的、荧光标记的或酶标记的。
在一方面，本发明提供了一种预测受试者患癌风险的方法，其包括通过使用本发明的抗体或其抗原结合片段来检测、定量或监测B7-H3多肽的表达或活性。
在一方面，本发明提供了一种监测药剂治疗癌症的有效性的方法，所述癌症显示出B7-H3表达水平或活性升高，其包括通过使用本发明的抗体或其抗原结合片段来检测或定量B7-H3多肽的表达或活性。
附图说明
图1A-B图1A显示了本发明中结合人B7H3、小鼠B7H3和食蟹猴B7H3蛋白的人源化抗B7H3抗体的ELISA分析实验结果。图1B显示了使用Biacore 8K的表面等离子体共振(SPR)结合分析的实验结果。解离(kd)和缔合(ka)速率常数的数据使用Biacore 8K评价软件获得。平衡解离常数(KD)由kd比ka计算得出。
图2人源化抗B7H3抗体与在细胞系表面稳定表达的BaF3/B7H3-2Ig和BaF3/B7H3-4Ig的细胞表面结合亲和力。
图3人源化抗B7H3抗体与经刺激的人PBMC上表达的B7H3的结合亲和力。
图4人源化抗B7H3抗体在体外诱导的ADCC。结果显示，人源化抗B7H3抗体能够以剂量依赖方式介导ADCC和ADCP。
图5抗B7H3抗体阻断B7H3对T细胞活化的抑制。结果显示，抗B7H3抗体逆转了B7H3对抗CD3刺激的T细胞活化的抑制作用。
图6 C57BL6/J小鼠中的B16F10鼠科黑色素瘤同源模型。结果显示，抗B7H3抗体可以在体内研究中减少黑素瘤肿瘤生长。
图7BALB/C裸鼠中的SW620人结直肠腺癌异种移植模型。结果显示，抗B7H3抗体可以减少异种移植模型中人结肠直肠腺癌的生长。
发明详述
本发明在本文中提供了结合B7-H3蛋白，尤其是人B7-H3蛋白或多肽的抗体及其片段。本发明还涉及所述抗体及其片段的用途，用以增强免疫系统的活化，以抵抗例如癌细胞。本发明进一步提供了制备抗B7-H3抗体、编码抗B7-H3抗体的多核苷酸以及包含编码抗B7-H3抗体的多核苷酸的细胞的方法。
1.定义
应当理解，本公开不限于本文描述的方面，其本身当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定方面，而不意图进行限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限制。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与该技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文引用的所有技术和专利公开通过引用以其整体并入本文。除非另有说明，本领域技术人员将采用本领域技术范围内的组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA常规技术。参见，例如，Sambrook和Russell编辑(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版；Harlow和Lane编辑(1999)Antibodies,A Laboratory Manual.MONOCLONAL ANTIBODIES:A PRACTICAL APPROACH(Shepherd,P.等编辑,2000)Oxford University Press,USA,New York N.Y.。
如本文所用，“B7-H3”是共刺激分子的B7/CD28超家族的成员，其起T细胞应答的辅助调节因子的作用。B7-H3是I型跨膜蛋白，其与其他B7家族成员共享20％-27％氨基酸同一性。鼠科B7-H3由单个胞外可变型免疫球蛋白(Ig)V-IgC结构域和标志性细胞内结构域(2IgB7-H3)组成，而人B7-H3具有另外的同种型，即所谓的4Ig B7-H3，其包含几乎一致的IgV-IgC结构域串联重复。B7H3(2Ig)可以参考：NCBI参考序列：NM_025240.2；和B7H3(4Ig)可以参考：NCBI参考序列：NM_001024736.1。(Entrez基因ID：80381，UniProtKB：Q5ZPR3 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/最后访问于2014年10月20日)。
如本发明中所使用的，术语“抗体”，也称为“免疫球蛋白”，涵盖具有天然抗体结构特征的抗体和具有与天然抗体不同结构特征但表现出对B7H3分子(B7-H3，CD276和B7RP-2)的结合特异性的抗体样分子。术语抗体旨在涵盖免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性片段，即，含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
术语“重链”(“HC”)、“轻链”(“LC”)、“轻链可变区”(“VL”)，“重链可变区”(“VH”)，“框架区”(“FR”)指天然存在的免疫球蛋白中的结构域和合成(例如，重组)结合蛋白(例如，人源化抗体)的相应结构域。天然存在的免疫球蛋白(例如，IgG)的基本结构单元是具有两条轻链和两条重链的四聚体。每条链的氨基末端(“N”)部分包括约100至110或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每条链的羧基末端(“C”)部分定义为恒定区，轻链具有单个恒定结构域，且重链通常具有三个恒定结构域和铰链区。因此，天然存在的IgG分子的轻链的结构为N-VL-CL-C，且IgG重链的结构为N-VH-CH1-H-CH2-CH3-C(其中H为铰链区)。IgG分子的可变区由互补决定区(CDR)(包含与抗原接触的残基)和非CDR节段(称为框架节段，其其维持结构并确定CDR环的位置)组成。因此，所述VL和VH结构域具有结构N-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-C。
在天然抗体中，可变性在抗体的可变区分布不均匀。其集中于轻链和重链可变区中被称为互补决定区(CDR)或高变区的三个节段中。可变结构域中更加高保守的部分称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变区各自包含通过三个CDR连接的四个FR区。每条链中的CDR由FR区紧连在一起，并与来自另一条链的CDR共同促成抗体的抗原结合位点的形成[参见Kabat,E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest NationalInstitute of Health,Bethesda,MD(1987)]。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”(或简称“抗体片段”)指抗体的一个或多个片段，其保留与抗原(例如，B7H3分子(B7-H3，CD276和B7RP-2)，诸如人B7H3)特异性结合的能力。所述抗体片段仅包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选地保留当其存在于完整抗体中时与该部分通常相关的至少一个，优选地大部分或全部功能。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个具有单个抗原结合位点，和一个残余Fc片段，其名称反映了其易于结晶的能力。“Fab”片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。“Fab'”片段与Fab片段的区别在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。“Fab'-SH”指代的Fab'中，恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离硫醇基团。“F(ab')”片段由胃蛋白酶消化产物“F(ab')2”的铰链半胱氨酸二硫键断裂产生的。
“Fd”片段由VH和CH1结构域组成。“dAb”片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546)由VH结构域组成。分离的互补决定区(CDR)和两个或更多个分离的CDR的组合，可任选地通过合成接头连接。
“Fv”片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成。单链Fv(scFv)由一个重链可变区和一个轻链可变区组成，其通过柔性肽接头共价地连接为一条单链多肽链。
术语“双体抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用接头(因为太短而无法容许同一条链上的两个结构域之间配对)，所述结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双体抗体在例如EP 404,097；WO 93/11161；和,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-48(1993)中有更全面的描述。
使用本领域技术人员已知的常规技术，例如通过重组DNA技术，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割，获得这些抗体片段。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指从基本均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备中出现的突变，这样的变体通常以少量存在)，构成群体的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位。
如本文所用，术语“嵌合抗体”意指一种抗体，其中使用重组DNA技术，把来自一个物种的单克隆抗体的Fc恒定区(例如，小鼠Fc恒定区)替换为来自另一物种的抗体的Fc恒定区(例如，人Fc恒定区)。参见，例如，Robinson等,PCT/US86/02269；Morrison等,欧洲专利申请173,494.
如本文所用，术语“人源化抗体”指包括人框架区和来自非人(例如小鼠、大鼠、兔或合成)免疫球蛋白的一个或多个CDR的抗体。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，而提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。在一方面，所有CDR来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。因此，除可能的CDR外，人源化免疫球蛋白的所有部分与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。可以通过基因工程的手段构建人源化抗体(参见例如，美国专利号5,585,089)。
“受体人框架”意指包含源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“源自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列，或者其可含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是1-10、2-9、3-8、4-7或5-6个。
“人共有框架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常见的氨基酸残基的框架。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。一般而言，所述序列的亚组是如Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),1-3卷中的亚组。在某些实施方案中，对于VL，所述亚组是如Kabat等(同上)中的亚组κI。在某些实施方案中，对于VH，所述亚组是如Kabat等(同上)中的亚组III。
如本文所用，术语“人抗体”意图包括具有源自人种系免疫球蛋白序列可变区和恒定区的抗体。本技术的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，由随机或位点特异性体外诱变或由体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文所使用的术语“人抗体”不意图包括这种抗体，其中源自另一哺乳动物物种的种系(诸如兔)的CDR序列已嫁接入人框架序列。因此，如本文所用，术语“人抗体”指一种抗体，其中基本上所述蛋白的每个部分(例如，CDR、框架、CL、CH结构域(例如，CH1、CH2、CH3)、铰链、VL、VH)在人类中基本上无免疫原性，仅有微小的序列变化或变异。因此，人抗体不同于嵌合或人源化抗体。应当指出，人抗体可以由能够表达功能性重排的人免疫球蛋白(例如，重链和/或轻链)基因的非人动物或原核或真核细胞产生。
如本文所用，短语“双特异性抗体”或“双特异性抗原结合抗体”或“双功能抗体”是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂交抗体。就本发明而言，“双特异性抗体”特异性结合B7H3和另一种抗原，例如，在肿瘤细胞上表达的肿瘤抗原。
“缀合物”是缀合至一个或多个异源分子的抗体，所述异源分子包括但不限于细胞毒性剂。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的阻断抗体或拮抗剂抗体基本或完全抑制抗原的生物学活性。
如本文所用，术语“分离的”指基本上不含其他材料的分子或生物学或细胞材料。例如，当通过重组DNA技术生产时，基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基的核酸或肽，或者在化学合成时，基本不含化学物质的前体或其他化学物质。此外，“分离的核酸”意在包括不天然以片段存在且不会在天然状态下发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中还用于指从其他细胞蛋白分离的多肽，并且意在涵盖纯化的和重组的多肽。
如本文所用，在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中使用的“同源性”或“同一性”百分比，指两个或更多个序列或亚序列是相同的或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，例如在指定的区域上(例如，编码本文所述抗体的核苷酸序列或本文所述抗体的氨基酸序列)具有，至少80％同一性，优选地至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性。同源性可以通过比较各序列中的位置来确定，可以为了比较的目的对所述位置进行比对。当经比较的序列中的一个位置由相同的碱基或氨基酸占据时，则所述分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度是匹配数或序列共有的同源位置数的函数。可以使用本领域已知的软件程序做比对和确定同源性百分比或序列的同一性。优选地，使用默认参数做比对。优选的比对程序是使用默认参数的BLAST。优选的程序是BLASTN和BLASTP。这些程序的细节可以在以下因特网地址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。
“亲和力”指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如，抗原)之间非共价相互作用的总强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”指固有结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括，例如，Biacore，放射免疫测定(RIA)和ELISA。
分子X对其伴侣Y的亲和力通常可以通过平衡解离常数(KD)来表示，该常数以比率koff/kon(kd/ka)计算。参见，例如，Chen,Y.,等,(1999)J.MoI Biol293:865-881。低亲和力抗体通常结合抗原缓慢并趋向于易于解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并趋向于保持更长时间的结合。在本发明的一个实施方案中，“解离速率(kd)”通过使用表面等离振子共振测定来测量。根据本发明，“开启速率”或“缔合的速率”或“缔合速率(ka)”或“kon”也可以使用相同的表面等离子体共振技术确定，并且通过同时拟合缔合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(BIAcore评价软件)计算。
如本文所用，术语“EC50”指在体外或体内测定中，结合B7H3和/或诱导应答的抗体或其抗原结合片段的浓度，其为最大结合或应答的50％，即最大结合或应答至基线的一半。
术语“癌症”、“赘生物(neoplasm)”和“肿瘤(tumor)”在本发明中可以互换使用，是指由细胞的异常不受控制的生长导致的赘生物或肿瘤，所述异常不受控制的生长使其对宿主生物体致病。在一些实施方案中，癌症指局限于局部的良性肿瘤。在其他实施方案中，癌症指已经侵入并破坏了邻近身体结构并扩散到远端的恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症与特异性癌症抗原相关。
如本文所用，受试者疾病的“治(treating)”或“治疗(treatment)”指用于获得有益或所需结果的方法，所述结果包括但不限于以下的一种或多种：一种或多种症状的减轻或改善，病况(包括疾病)范围的缩小，病况(包括疾病)的稳定(即，不恶化)状态，病况(包括疾病)的延缓或减慢，病况(包括疾病)的进展、改善或缓和，状态和缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。
“药学上可接受的载体”是与活性成分构成药物制剂的载体。药学上可接受的载体包括但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“包装插页”用于指代通常包括在治疗产品商业包装中的说明书。一般而言，在包装插页上有关于治疗产品的使用信息，诸如适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告。
本发明将针对特定实施方案并参考某些附图进行描述，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求来限定。如本说明书和权利要求中所使用的术语“包含”不排除其他元件或步骤。当提及单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如，“一(a)”或“一个(an)”，“该(the)”，除非特别说明，否则其包括该名词的复数形式。
2.抗B7-H3抗体及其制备的方法
本发明涵盖分离的抗B7-H3抗体或其片段，包含编码抗B7-H3抗体或其片段的多核苷酸序列。
本发明的抗B7-H3抗体优选地为单克隆的。在本发明的范围内还涵盖本文提供的抗B7-H3抗体的Fab、Fab'、Fab'-SH和F(ab')2片段。这些抗体片段可以通过诸如酶促消化的传统手段产生，或者可以通过重组技术生成。抗B7-H3抗体及其片段可用于诊断和治疗目的，包括癌症的诊断和治疗。
单克隆抗体是从基本上均质的抗体群体中获得的，即，除了可能天然存在的突变可少量存在以外，构成该群体的单个抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”表明该抗体的特征为不是不同抗体的混合物。可以使用杂交瘤方法或重组DNA方法(美国专利号4,816,567)制作本发明的单克隆抗B7-H3抗体。
在杂交瘤方法中，通过整个B7-H3分子或所述分子的部分(例如，包含B7-H3的胞外区的多肽)，与佐剂一起，免疫小鼠或其他适当的宿主动物，诸如仓鼠。可以使用本领域公知的方法制备B7-H3分子或包含B7-H3分子胞外区的多肽。在一个实施方案中，使用含有B7-H3的胞外区(ECD)的多肽免疫动物，所述胞外区与免疫球蛋白重链的Fc部分融合。在一个实施方案中，使用B7-H3-IgG1融合蛋白免疫动物。两周后，对动物进行加强免疫。7至14天后，对动物采血，并测定血清的抗B7-H3效价。对动物加强免疫直至效价平稳。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂(诸如，聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,59-103页(Academic Press,1986))。
将由此制备的杂交瘤细胞接种并培养于合适的培养基中，该培养基优选地含有一种或多种抑制未融合亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。优选的骨髓瘤细胞是有效融合的，支持通过所选的产生抗体的细胞稳定高水平地产生抗体，并对培养基(诸如HAT培养基)敏感的那些骨髓瘤细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠科骨髓瘤细胞系，诸如SP-2或X63-Ag8-653细胞。(Kozbor,J.Immunol,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))还对人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于人单克隆抗体的产生进行了描述。
测定培养杂交瘤细胞的培养基产生针对B7-H3的单克隆抗体的能力。优选地，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定，诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。
然后可以通过本领域的常规方法确定单克隆抗体的结合亲和力。鉴定出产生具有所需的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限的稀释程序来亚克隆并通过标准方法培养克隆(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,59-103页(Academic Press,1986))。
用于该目的的合适的培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以作为腹水肿瘤在动物体内生长。通过常规免疫球蛋白纯化程序，将经亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水液体或血清中适当地分离。
本发明的抗B7-H3抗体的制作可以通过使用组合文库筛选具有所需的一种或多种活性的合成抗体克隆。大体上，合成抗体克隆通过筛选噬菌体文库来挑选，所述噬菌体文库含有展示抗体可变区(Fv)不同片段的噬菌体，所述Fv片段与噬菌体外壳蛋白融合。这种噬菌体文库通过针对目的抗原的亲和色谱淘选。
克隆表达的Fv片段可结合目的抗原，其吸附至抗原，由此从文库中的非结合克隆中分离出来。然后从抗原上洗脱结合的克隆，并且可以通过抗原吸附/洗脱的额外循环进一步富集。本发明的任何抗B7-H3抗体均可通过以下方法获得：设计合适的抗原筛选程序，选择目的噬菌体克隆，然后使用来自目的噬菌体克隆的Fv序列和Kabat等在Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),1-3卷中描述的合适的恒定区(Fc)序列构建全长抗B7-H3抗体克隆。
VH和VL基因的组库(repertoire)可以通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以搜索其中的抗原结合克隆，如Winter等,Ann.Rev.Immunol,12:433-455(1994)中所述。来自免疫来源的文库向免疫原提供高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。或者，可以克隆幼稚(naive)组库以向广泛的非自身和自身抗原提供单一来源的人抗体，而无需任何免疫，如Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，幼稚文库还可以通过克隆来自干细胞的未重排的V基因节段，并使用含有随机序列的PCR引物以编码高度可变的CDR3区并在体外完成重排来合成制作，如Hoogenboom和Winter,J.MoI Biol,227:381-388(1992)中所述。
由幼稚文库(天然的或合成的)产生的抗体可以具有中等亲和力，但是亲和力成熟也可以通过构建二级文库并从中重新选择而在体外进行模拟。例如，可以通过在Hawkins等,J.MoL Biol.,226:889-896(1992)的方法中或Gram等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,89:3576-3580(1992)的方法中使用易错聚合酶(在Leung等,Technique,1:11-15(1989)中报道的)在体外随机引入突变。另外，亲和力成熟可以在所选的单个Fv克隆中，通过随机突变一个或多个CDR来进行(例如，使用PCR和携带跨越目的CDR的随机序列的引物)，并筛选更高亲和力的克隆。另一种有效的方法是把通过噬菌体展示所选的VH或VL结构域与获得自未经免疫的供体的天然存在的V结构域变体组库重组，并在几轮链改组中筛选更高的亲和力，如Marks等,BiotechnoL,10:779-783(1992)中所述。
对于B7-H3，即使亲和力略有不同，也可以在具有不同亲和力的噬菌体抗体之间选择。然而，所选抗体的随机突变(例如，如在上述的一些亲和力成熟技术中所进行的)可能会产生许多突变体，大多数与抗原结合，少数几个具有更高的亲和力。为了保留所有更高亲和力的突变体，噬菌体可以与过量的生物素化的B7-H3一起孵育，但是生物素化的B7-H3的摩尔浓度低于对B7-H3的目标摩尔亲和常数。然后，高亲和力结合噬菌体可通过链霉亲和素包被的顺磁珠捕获。这样的“平衡捕获”容许根据抗体的结合亲和力来选择抗体，其敏感性容许从具有低亲和力的大量过量噬菌体中分离具有小到两倍高亲和力的突变体克隆。
抗B7-H3克隆可基于活性的表现来选择。在一个实施方案中，本发明提供了阻断B7-H3受体与其配体之间结合的抗B7-H3抗体。具有本文所述的特性的本发明的抗B7-H3抗体可以通过任何方便的方法针对所需特性通过筛选抗B7-H3杂交瘤克隆来获得。例如，如果所需的抗体为阻断或不阻断B7-H3受体与B7-H3配体结合的抗B7-H3单克隆抗体，则可以在结合竞争测定中测试候选抗体，诸如竞争性结合ELISA，其中板子的孔用B7-H3包被，具有过量B7-H3受体的抗体的溶液铺在经包被的板上，并通过酶促反应检测结合的抗体，例如使结合的抗体与缀合有HRP的抗Ig抗体或生物素化的抗Ig抗体接触，并进行HRP显色反应(例如通过用链霉亲和素-HRP和/或过氧化氢使板子显色，并使用ELISA酶标仪在490nm处通过分光光度法检测HRP显色反应)。
3.分离的多核苷酸、载体、宿主细胞和重组方法
编码本发明杂交瘤来源的单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA易于使用常规方法分离和测序(例如，通过使用寡核苷酸引物，其经设计以从杂交瘤或噬菌体DNA模板中特异性扩增目的重链和轻链编码区)。一经分离，所述DNA可置于表达载体中，然后转染到宿主细胞中(例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)，以在重组宿主细胞中获得所需的单克隆抗体的合成。
编码本发明的Fv克隆的DNA可以与编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列(例如，合适的DNA序列可以从Kabat等(同上)获得)结合以形成编码全长或部分长度的重链和/或轻链的克隆。应当理解，任意同种型的恒定区可以用于该目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且这样的恒定区可以从任意人类或动物物种获得。Fv克隆，其源自一个动物(诸如人)物种的可变结构域DNA，然后与另一动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂交”，如本文所用的“嵌合”和“杂交”抗体的定义中包括全长重链和/或轻链的编码序列。在一个优选的实施方案中，源自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成针对所有人的、全长的或部分长度的重链和/或轻链的编码序列。
编码源自本发明的杂交瘤的抗B7-H3抗体的DNA还可以经过修改，例如，用人重链和轻链恒定结构域的编码序列替换源自杂交瘤克隆的同源鼠科序列(例如，如Morrison等,Proc.Natl Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中的方法)。编码杂交瘤或Fv克隆来源的抗体或片段的DNA可以通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接至免疫球蛋白编码序列来进一步修改。以这种方式，制备具有本发明Fv克隆或杂交瘤克隆来源的抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂交”抗体。
为了重组产生本发明的抗体，编码它的核酸经分离并插入可复制的载体中以用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。编码抗体的DNA使用常规程序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)易于分离和测序。许多种载体可用。载体的选择部分取决于要使用的宿主细胞。一般而言，优选的宿主细胞是原核或真核(通常是哺乳动物)来源的。应当理解，任何同种型的恒定区可以用于该目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且这样的恒定区可以从任意人类或动物物种获得。
4.缀合物及其制备方法
本发明的抗B7-H3抗体或其片段与一种或多种其他分子(诸如毒素，例如卡奇霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、海兔毒素类(dolastatins)、aurostatins、单端孢霉烯(trichothecene)和CC1065)，以及这些毒素具有毒素活性的衍生物)的缀合物或免疫缀合物也在本文中考虑。
在一些实施方案中，所述缀合物包含缀合至一个或多个美登木素生物碱分子的本发明的抗体(全长或片段)。美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白聚合起作用的有丝分裂抑制剂。美登木素(maytansine)最初是从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrate)中分离的(美国专利号3,896,111)。随后，发现某些微生物也产生美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。
含有美登木素生物碱类的免疫缀合物，其制备方法及其治疗用途公开在例如美国专利5,208,020、5,416,064号和欧洲专利EP 0 425 235B1中，其公开内容在此通过引用明确地并入。
抗体和美登木素生物碱的缀合物可以使用多种双功能蛋白偶联剂制作，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫杂环戊烷(IT)，亚氨酸酯的双功能衍生物。
在一些实施方案中，所述免疫缀合物包含本发明的抗体，其缀合至海兔毒素类或海兔毒素肽类似物和衍生物，auristatins(美国专利号5635483；5780588)。
通常，基于肽的药物部分可以通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。这样的肽键可以例如根据肽化学领域中公知的液相合成方法来制备。auristatin/海兔毒素药物部分可根据以下方法制备：US 5635483；US 5780588。还可参见Doronina(2003)Nat Biotechnol 21(7):778-784。
本发明进一步考虑了抗体和具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNase)之间形成的免疫缀合物。
为了选择性破坏肿瘤，所述抗体可包含高放射性原子。多种放射性同位素可用于产生放射性缀合的抗体。放射性或其他标记可以已知方式掺入缀合物。例如，所述肽可以是生物合成的，或者可以使用合适的氨基酸前体通过化学氨基酸合成来合成，包括例如用氟-9代替氢。"Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy"(Chatal,CRC Press 1989)详细描述了其他方法。
5.抗体片段及其制备方法
本发明涵盖抗体片段。在某些情况下，使用抗体片段而不是完整抗体具有优势。较小的片段尺寸容许快速清除，并可促进其进入实体瘤。
已经开发了用于产生抗体片段的多种技术。传统上，这些片段经由完整抗体的蛋白水解消化而获得(参见，例如，Morimoto等,Journal ofBiochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992)；和Brennan等,Science,229:81(1985))。然而，这些片段现在可以直接由重组宿主细胞产生。Fab、Fv和ScFv抗体片段可在大肠杆菌中表达并从大肠杆菌中分泌，由此容许这些片段便利地大量产生。抗体片段可以从上述抗体噬菌体文库中分离。或者，Fab'-SH片段可以直接从大肠杆菌中回收并经化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，F(ab')2片段可以直接从重组宿主细胞培养物中分离。美国专利5,869,046号中描述了体内半衰期增加的Fab和F(ab')2片段，其包含挽救受体结合表位残基。其他产生抗体片段的技术对技术熟练的人员会是显而易见的。
在其他实施方案中，所选的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利5,571,894号；和5,587,458。Fv和sFv是唯一具有完整结合位点而没有恒定区域的种类。因此，它们适合于在体内使用期间减少非特异性结合。可以构建sFv融合蛋白以在sFv的氨基或羧基末端产生效应蛋白的融合。参见Antibody Engineering，编辑Borrebaeck，同上。所述抗体片段也可以是“线性抗体”，例如，如美国专利US 5,641,870号中所述的。这样的线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
6.人源化抗体和人抗体
本发明涵盖人源化抗体。人源化非人抗体的多种方法是本领域已知的。例如，人源化抗体可以具有从非人来源引入其的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”的可变结构域。基本上可以按照Winter和同事的方法进行人源化(Jones等(1986)Nature321:522-525；Riechmann等(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyen等(1988)Science 239:1534-1536)，通过用高变区序列取代人抗体的相应序列。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567号)，其中基本上小于完整的人可变结构域的部分经由来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些高变区残基和可能的一些FR残基经啮齿动物抗体中类似位点残基取代的人抗体。用于制作人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链)的选择对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳-拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域序列。然后，将最接近啮齿动物的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims等(1993)J.Immunol.151:2296；Chothia等(1987)J.MoI.Biol.196:901。另一种方法使用特定框架，所述框架源自轻链或重链的特定亚组的所有人抗体的共有序列。
进一步重要的是将抗体人源化并保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。为了达到该目标，根据一个方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型对亲本序列和多种概念性人源化产物进行分析的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是普遍可获得的并且为本领域技术人员所熟悉。说明并显示所选候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。对这些展示内容进行检视，可分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中可能的作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。通过这种方式，可以从受体和输入序列中选择并结合FR残基，以获得所需的抗体特征，诸如对B7-H3的增加的亲和力。
转基因动物(例如小鼠)，其在没有内源性免疫球蛋白产生的情况下，免疫后，也能够产生一整个组库的人抗体。例如，已有描述显示在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失完全抑制了内源性抗体的产生。向这样的种系突变小鼠中导入人种系免疫球蛋白基因阵列会在抗原激发后产生人抗体。参见，例如，Jakobovits等,Nature,362:255(1993)；Bruggermann等,Year in Immunol,7:33(1993)。
基因改组(Gene shuffling)也可用于从非人(例如啮齿动物)抗体中得到人抗体，其中所述人抗体与起始非人抗体具有相似的亲和力和特异性。根据该方法(也称为“表位印迹”)，将通过上述噬菌体展示技术获得的非人抗体片段的重链或轻链可变区替换为一组库的人V结构域基因，创建非人链/人链scFv或Fab嵌合体群。用抗原进行选择可分离非人链/人链嵌合scFv或Fab，其中人链恢复了去除初始噬菌体展示克隆中相应的非人链时被破坏的抗原结合位点，即表位控制(印记)对人链伴侣的选择。当重复该过程以替换剩余的非人链时，则获得人抗体(参见1993年4月1日公开的PCT WO 93/06213)。与通过CDR嫁接的传统非人抗体的人源化不同，该技术提供了完全的人抗体，其没有非人来源的FR或CDR残基。
7.双特异性抗体及其制备方法
双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，优选人或人源化抗体。在当前情况下，结合特异性之一是针对B7-H3的，另一个是针对任意其他抗原的。示例性的双特异性抗体可结合抗B7-H3蛋白的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒剂定位于表达抗B7-H3的细胞。这些抗体具有B7-H3结合臂和结合细胞毒性剂的臂。
双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)。制作双特异性抗体的方法是本领域已知的。通常，双特异性抗体的重组生产基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个重链具有不同的特异性。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机组合，这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生可能具有10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。对正确分子的纯化，其通常通过亲和色谱步骤完成，相当麻烦，并且产率低。根据不同且更优选的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合物优选与免疫球蛋白重链恒定结构域融合，该结构域包含铰链、CH2和CH3区的至少一部分。优选的在至少一个融合物中具有第一重链恒定区(CH1)，所述CH1含有轻链结合所必需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。当在构建体中使用比例不等的三个多肽链提供最佳产率时，其为实施方案中调节三个多肽片段的相互比例提供了极大灵活性。然而，当至少两条多肽链以相等比例表达导致高产率或当比例没有特别意义时，则可以在一个表达载体中插入两个或全部三个多肽链的编码序列。
在该方法的优选实施方案中，所述双特异性抗体由在一个臂中具有第一结合特异性的杂种免疫球蛋白重链和在另一个臂中的杂种免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。已经发现，该不对称结构有助于将所需的双特异性化合物从不需要的免疫球蛋白链组合中分离，因为仅在双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链提供了一种便利的分离方式。该方法在WO 94/04690中公开。生成双特异性抗体的进一步细节参见，例如，Suresh等,Methods in Enzymology,121:210(1986)。
8.药物成分
通过把具有所需纯度的抗体与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20th edition(2000))混合，制备包含本发明的抗体的治疗制剂，以水溶液、冻干或其他干燥制剂的形式储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对受试者无毒，包括缓冲剂(诸如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其他有机酸)；抗氧化剂(包括抗坏血酸和蛋氨酸)；防腐剂；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸)；单糖、二糖和其他碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂(诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇)；成盐的反荷离子(诸如钠)；金属络合物；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
根据所治疗的特定适应症所需要的，本文的制剂还可含有一种以上的活性化合物，优选地为具有互补活性而不对彼此造成不利影响活性的那些化合物。这样的分子适于以对预期目的有效的量存在于组合中。
在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或大乳剂中，所述活性成分也可包裹在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有本发明的免疫球蛋白的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成型制品的形式，例如，薄膜或微胶囊。
9.抗B7-H3抗体的诊断和治疗用途
在一方面，基于本文公开的抗体和B7-H3的特异性结合，本发明的抗体可以用于检测和定量生理样品，诸如尿液、血浆、细胞裂解液和活检样品中的B7-H3多肽。因此，本文公开的抗B7-H3抗体可用于在诊断上监测组织中的B7-H3水平，例如，以确定癌症的进展和/或给定治疗方案的功效。本领域技术人员知晓，本文公开的B7-H3抗体可以与可检测材料偶联以促进检测。在某些实施方案中，本文公开的抗B7-H3抗体或其片段与固体载体结合以促进检测。
在另一方面，基于本文公开的抗体和B7-H3的特异性结合，本发明的抗体可以用于，例如，通过亲和色谱法或免疫沉淀法分离，通过流式细胞术方法分析或分选细胞，以及通过免疫组织化学、细胞学分析、ELISA或免疫沉淀法检测固定的组织样品或细胞涂片样品中的B7-H3多肽。
在某些实施方案中，要检测、定量或分析的B7-H3分子是人B7-H3蛋白或其片段。在某些实施方案中，将B7-H3蛋白或其片段置于溶液中(诸如裂解溶液或含有破碎细胞的亚细胞级分的溶液)，或存在于B7-H3阳性细胞的表面上，或含有B7-H3和其他细胞成分的复合物中。
本公开的检测方法可以用于在体外以及体内检测生物样品中B7-H3多肽的表达水平。用于检测B7-H3多肽的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、流式细胞仪、免疫沉淀、放射免疫测定和免疫荧光(例如，IHC)。此外，用于检测B7-H3多肽的体内技术包括将标记的抗B7-H3抗体引入受试者。仅作为示例，可以用放射性标志物标记抗体，可以通过标准成像技术检测所述放射性标志物在受试者中的存在和位置。
可用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域已知的，并且包括酶标记(诸如葡萄糖氧化酶)和放射性同位素或其他放射性试剂，以及荧光标记(诸如荧光素和若丹明(rhodamine))，以及生物素。
本文公开的B7-H3抗体或其片段可以用作任意种类的生物样品的诊断试剂。一方面，本文公开的B7-H3抗体可用作人类生物样品的诊断试剂。B7-H3抗体可以用于检测多种标准测定形式的B7-H3多肽。这样的形式包括免疫沉淀、蛋白质印迹、ELISA、放射免疫测定、流式细胞术、IHC和免疫计量测定。
本发明还提供了抗B7-H3抗体及其片段的预后(或预测)用途，用于确定受试者是否处于患有与增加的B7-H3多肽表达或活性相关的内科疾病或病况的风险中(例如，检测癌前细胞)。因此，本文公开的抗B7-H3抗体及其片段可以用于预后或预测目的，以在内科疾病或病况(例如癌症)的发作前预防性治疗个体，所述内科疾病或病况(例如癌症)特征在于B7-H3多肽表达或活性的增加，或与B7-H3多肽表达或活性的增加相关。
本公开的另一方面提供了用于确定受试者中B7-H3表达的方法，以由此筛选内科疾病或病况(例如癌症)的治疗或预防性化合物，所述内科疾病或病况(例如癌症)特征在于B7-H3多肽表达或活性的增加，或与B7-H3多肽表达或活性的增加相关。
在某些实施方案中，上述内科疾病或病况为癌前病况或癌症，所述内科疾病或病况特征在于B7-H3多肽的表达或活性或B7-H3多肽表达或活性的增加，或与B7-H3多肽的表达或活性或B7-H3多肽表达或活性的增加相关。在某些实施方案中，可以使用预后测定来鉴定患有癌症或处于患癌风险的受试者。因此，本公开提供了一种方法，其用于鉴定与B7-H3多肽表达水平增加相关的疾病或病况(例如癌症)，其中测试样品获取自受试者并可检测到B7-H3多肽，其中与对照样本相比，存在B7-H3多肽水平的增加则可预测受试者患有与增加的B7-H3多肽表达水平相关的疾病或病况(例如癌症)或处于患该病或病况(例如癌症)的风险中。
在另一方面，本公开提供了用于确定受试者是否可以用治疗剂进行有效治疗的方法，所述治疗剂针对与B7-H3多肽表达的增加相关的病症或病况(例如癌症)，其中生物学样品获自受试者并且使用B7-H3抗体检测B7-H3多肽。确定从受试者获得的生物样品中B7-H3多肽的表达水平，并将其与在从无疾病的受试者获得的生物样品中发现的B7-H3表达水平比较。与从健康受试者获得的样品相比，从疑似患有疾病或病况的受试者获得的样品中B7-H3多肽水平升高指示待测试的受试者中B7-H3相关的疾病或病况(例如癌症)。
在一方面，本公开提供了监测药剂对B7-H3多肽表达的治疗功效的方法。这样的测定可以应用于药物筛选和临床试验。例如，可以在表现出升高的B7-H3表达的受试者例如被诊断有癌症的患者的临床试验中监测药剂降低B7-H3多肽水平的有效性。可以通过施用药剂并观察应答来鉴定影响B7-H3多肽表达的药剂。以此方式，B7-H3多肽的表达模式可以用作标志物，指示受试者对药剂的生理反应。
前述仅仅是使用本发明的抗B7-H3抗体及其片段的示例性测定。现在或以后开发的使用抗体或其片段用于测定B7-H3的其他方法也包括在本发明的范围内。
在一方面，本发明提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包括向需要这样的治疗的受试者施用有效量的特异性结合B7-H3的抗B7-H3抗体或其片段。本发明的抗体可以用于治疗、抑制与包括B7-H3分子的一种或多种抗原分子的表达和/或活性有关，或与包括B7-H3分子的一种或多种抗原分子的表达和/或活性增加有关的疾病、病症或病况，延迟其进展，预防/延迟其复发，改善或预防该疾病、病症或病况。
对于本发明的抗B7-H3抗体或其片段的治疗用途，本发明的抗体的适当剂量(当单独使用或与其他药剂联合使用时，会取决于要治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、是否为预防或治疗目的而施用抗体、既往治疗、患者的临床病史和对该抗体的应答，以及主治医师的判断。适当地将该抗体向患者施用一次或多次。根据疾病的类型和严重程度，向患者施用抗体的合适剂量为约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)，可选地，例如通过一次或多次单独施用，还是通过连续输注。
本发明的抗体可以单独使用或与其他组合物组合用于治疗。例如，本发明的抗体可以与另一种抗体，类固醇(诸如可吸入的、全身或皮肤类固醇)，化学治疗剂(包括化学治疗剂的混合物)，其他细胞毒性剂、抗血管生成剂、细胞因子和/或生长抑制剂共施用。上述这样的联合疗法包括组合施用(其中两种或更多种药剂包括在相同或分开的制剂中)和分开施用，在这种情况下，在施用一种或多种其他药剂之前、期间和/或之后，可以施用本发明的抗B7-H3抗体或其片段。组合施用的治疗剂的有效量取决于诸如以下因素：要使用的治疗剂的类型和要治疗的特定患者。并且通常会由医生或兽医决定。
10.试剂盒和制品
本公开提供了用于确定B7-H3的表达水平的诊断方法。在一个具体的方面，本公开提供了用于确定B7-H3的表达水平的试剂盒。所述试剂盒包含本文公开的抗B7-H3抗体或其片段以及关于如何使用试剂盒的说明书，例如，用于收集样本和/或进行检测和/或分析结果的说明书。所述试剂盒可用于检测生物样本(例如任意体液)中B7-H3多肽的存在，所述体液包括但不限于，例如，痰、血清、血浆、淋巴液、囊肿液、尿液、粪便、脑脊髓液、腹水或血液，包括人体组织的活检样品。所述测试样品还可以是肿瘤细胞、与肿瘤相邻的正常细胞、与肿瘤组织类型相应的正常细胞、血细胞、外周血淋巴细胞或它们的组合。
在某些实施方案中，所述试剂盒可进一步包含本发明的抗B7-H3抗体之外的一种或多种其他B7-H3抗体，其能够结合生物样品中的B7-H3多肽。所述一种或多种B7-H3抗体可以带标记。在某些实施方案中，所述试剂盒包含例如附接至固相支持物的第一抗体，其结合B7-H3多肽；并且，任选地；2)第二、不同的抗体，其与B7-H3多肽或第一抗体结合并缀合至可检测的标记。
所述试剂盒还可以包含，例如，缓冲剂、防腐剂或蛋白稳定剂。所述试剂盒还可包含检测可检测标记所必需的组分，例如酶或底物。所述试剂盒还可以含有一种对照样本或一系列对照样本，其可以经测定并与测试样本进行比较。所述试剂盒的每个组分可以装在一个单独的容器中，所有多个容器可以放在一个包装中，同时在包装插页写上有关如何使用试剂盒的说明，例如，用于收集样品和/或进行检测和/或分析结果的说明。
在另一方面，本发明提供了一种制品，其包含用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料。所述制品包含容器和容器上或与容器相连的标签或包装插页，所述标签或包装插页上具有例如治疗适应症、施用方案和警告的书面说明。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。所述容器可以由多种材料形成，诸如玻璃或塑料。所述容器容纳包含本发明的抗B7-H3抗体或其片段的组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合时，对治疗、预防和/或诊断内科疾病或病况(例如，癌症)有效，所述内科疾病或病况(例如，癌症)的特征在于包括B7-H3多肽的一种或多种分子的表达和/或活性的增加，或与一种或多种分子的表达和/或活性的增加相关。
所述制品可包含：(a)第一容器，其中含有组合物，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)第二、第三或第四容器，其具有包含另一种活性成分的组合物。另外，所述制品可进一步包含含有药学上可接受的缓冲液(诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)和葡萄糖溶液)的容器。其可进一步包括从商业和用户角度来看所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
实施例
实施例1抗B7H3鼠科抗体的生成
B7H3 KO小鼠(16-18g，6周龄，根据Suh KW等,Nat Immunol,4(9):899-906,2003中的叙述制备，通过皮下注射含有完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich，目录号F6881)的人B7H3-Fc融合蛋白(R&D系统)10μg进行免疫，以3天为间隔重复免疫5次。末次加强免疫3天后，仔细解剖靠近注射部位的淋巴结。用PEG1500(聚乙二醇1500,RocheTM.目录号:783641,10×4ml置于75mM Hepes中PEG 50％W/V)融合淋巴细胞与Ag8.653骨髓瘤细胞(Sigma-Aldrich，目录号85011420)，并用HAT selection(Sigma目录号：H0262)和HFCS(杂交瘤融合及克隆补剂(Hybridoma Fusion and Cloning Supplement)，50x，Roche目录号：11-363-735-001)克隆。在杂交瘤上清液中，通过ELISA和流式细胞术在转染了人B7H3的BAF3细胞上针对结合人B7H3-Fc的抗体的产生进行筛选(参见实施例2和3)。所选的鼠科抗B7H3#23和#27使用CDR嫁接和反向突变进行人源化。
通过CDR嫁接的抗体人源化：选择受体框架。使用NCBI Ig-Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/)在人种系的数据库中搜索亲本抗体的可变区序列。重链和轻链的CDR序列(SEQ ID NO:1-12)分别显示如下。为每条重链和轻链选择五个不同的人受体(即与亲本抗体具有高度同源性的人可变区)。人受体的CDR用它们的小鼠对应物取代，产生了人源化可变区序列。设计、合成五条人源化重链和五条人源化轻链，并将其插入表达载体中。表达所述人源化抗体，然后将其用于亲和力等级测试。选择对#23-VH5-VL2，#27-VH2-VL1和#27-VH2-VL2具有最强结合亲和力的抗体用于反向突变。在这些变体中，基于结合和功能测定选择了#23-VH5-4/VL2-3、#23-VH5-4/VL2-4、#27-VH2-1/VL2-1、#27-VH2-1/VL2-2、#27-VH2-2/VL2-1和#27-VH2-2/VL2-2(SEQ ID No:13-19)。
#23-CDR1H氨基酸序列(SEQ ID NO:1)
GYNFNNYWMH
#23-CDR2H氨基酸序列(SEQ ID NO:2)
MIHPNSGTFNYNERFKR
#23-CDR3H氨基酸序列(SEQ ID NO:3)
STALATDY
#23-CDR1L氨基酸序列(SEQ ID NO:4)
SASSSVSYMY
#23-CDR2L氨基酸序列(SEQ ID NO:5)
DTSNLAS
#23-CDR3L氨基酸序列(SEQ ID NO:6)
QQWSSYPLT
#27-CDR1H氨基酸序列(SEQ ID NO:7)
GYTFTNYWMH
#27-CDR2H氨基酸序列(SEQ ID NO:8)
MIHPNSGAFNYNERFKT
#27-CDR3H氨基酸序列(SEQ ID NO:9)
STALATGY
#27-CDR1L氨基酸序列(SEQ ID NO:10)
SASSSVSYMY
#27-CDR2L氨基酸序列(SEQ ID NO:11)
DTSNLAS
#27-CDR3L氨基酸序列(SEQ ID NO:12)
QQWSSYPLT
可变重链结构域(#23-VH5-4)氨基酸序列(SEQ ID NO:13)
QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKASGYNFNNYWMHWVRQRPGKGLEWIGMIHPNSGTFNYNERFKRKATLTVDKSISTAYLQWSSLKAEDTAMYYCAKSTALATDYWGQGTLVTVSS
可变轻链结构域(#23-VL2-3)氨基酸序列(SEQ ID NO:14)
QIVLTQSPSTLSASVGDRVTITCSASSSVSYMYWYQQKPGKAPKLLIYDTSNLASGVPIRFSGSGSGTSYTLTISSLQPDDFATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIK
可变轻链结构域(#23-VL2-4)氨基酸序列(SEQ ID NO:15)
QIVLTQSPSTLSASVGDRVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGKAPKLLIYDTSNLASGVPIRFSGSGSGTSYTLTISSMQPDDFVTYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIK
可变重链结构域(#27-VH2-1)氨基酸序列(SEQ ID NO:16)
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGMIHPNSGAFNYNERFKTRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTALATGYWGQGTLVTVSS
可变重链结构域(#27-VH2-2)氨基酸序列(SEQ ID NO:17)
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVKQAPGQGLEWIGMIHPNSGAFNYNERFKTRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTALATGYWGQGTLLTVSS
可变轻链结构域(#27-VL2-1)氨基酸序列(SEQ ID NO:18)
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSSVSYMYWYQQKPGKSPKLLIYDTSNLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIK
可变轻链结构域(#27-VL2-2)氨基酸序列(SEQ ID NO:19)
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGKSPKLLIYDTSNLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFVTYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIK
实施例2.人源化抗B7H3抗体的亲和力的分析
为了测试人源化抗B7H3抗体的结合亲和力，进行了ELISA分析。把0.5M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中的人B7H3、小鼠B7H3和食蟹猴B7H3(2ug/ml，在PBS中)包被在MaxiSorp 96孔板(NUNC，449824)上，在4℃孵育过夜。经包被的板用脱脂牛奶(5％，在PBST中)封闭1小时。将人源化抗B7H3抗体稀释并添加到板中，并在室温下孵育2小时。用PBST洗涤三遍(1x PBS，含0.05％tween-20)以消除未结合的抗体。加入山羊抗人IgG-HRP(Easybio，BE0122，在PBS中1:5000)并孵育1小时。用PBST洗涤三遍(1x PBS，含0.05％tween-20)以消除未结合的抗体。加入TMB(eBioscience，00-4201-56)(50ul/孔)进行显色，并用2N H2SO4(50ul/孔)终止。在450nm和570nM测量光密度。如图1A和表1所示，抗体以高亲和力结合人、小鼠和食蟹猴B7H3蛋白。mAb与食蟹猴B7H3的结合能力与其和人B7-H3蛋白的结合能力相似。
表1.与人、小鼠和食蟹猴B7H3蛋白的亲和力
Figure BDA0002849538550000281
Figure BDA0002849538550000291
此外，使用Biacore 8K通过表面等离子体共振(SPR)结合分析进一步分析上述mAb的亲和力。SPR是在负介电常数材料与正介电常数材料之间的界面上的由入射光激发的传导电子共振震荡。通过Fc捕获法把抗体固定在传感器芯片上。以人B7-H3胞外区(NCBI参考序列：NM_025240.2)作为分析物。使用Biacore 8K评价软件获得解离(kd)和缔合(ka)速率常数的数据。平衡解离常数(KD)由kd与ka的比计算。如图1B和表2所示，所有人源化抗B7-H3mAb以高亲和力(<1.5nM)与人B7-H3胞外区结合。
表2.选择的人源化抗体的动力学数据
Figure BDA0002849538550000292
实施例3.结合在B7H3稳定细胞系上的人源化抗B7H3抗体
为评价抗B7H3抗体在细胞表面的结合亲和力，在BaF3细胞系上构建不同B7H3亚型的两个稳定细胞系(B7H3-2Ig和B7H3-4Ig)。人B7H3-2Ig和4Ig的全长DNA是全合成的。消化DNA序列并将其连接到pcDNA3.4中以分别构建全长质粒。进行电穿孔以把全长质粒转染到BaF3细胞中。通过G418(Ameresco，E859-1G，浓度优化至1mg/ml)筛选阳性克隆，并通过流式细胞仪检测B7H3表达。
用BaF3/B7H3-2Ig和BaF3/B7H3-4Ig分别以相同方法测试细胞表面结合亲和力。用PBS洗涤细胞，并以5x10^5个细胞/孔的细胞密度将其等分至96孔U型底板。对于活/死染色，把LIVE/
Figure BDA0002849538550000301
Fixable Aqua死细胞染色试剂盒(Life Technologies，L34957)应用(PBS中1:1000，100ul/孔)于细胞，并在4℃孵育10分钟。把FACS缓冲液(PBS中含2％FBS，100ul/孔)添加至每个孔以终止染色。离心(1200rpm，5min)以丢弃上清液，并用FACS缓冲液洗涤一次。将人源化抗B7H3抗体在FACS缓冲液中稀释至相应浓度，然后添加至每个孔(100ul/孔)。把细胞在4℃孵育30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤两次。添加Alexa
Figure BDA0002849538550000302
594标记的山羊抗人IgG(Jackson Immuno Research，109-585-088)(FACS缓冲液中1:500)以标记结合的抗体。在4℃孵育细胞30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤两次。在流式细胞仪上分析细胞，结果示于图2。数据表明抗体以高亲和力结合在细胞上表达的B7H3。例如，#27mAb的结合EC50小于1nM。数据证实，mAb不仅结合板上的人B7-H3胞外区蛋白，而且还有效结合细胞表面上表达的人B7-H3分子。
实施例4.对受刺激的PBMC的人源化抗B7H3抗体结合测定
外周血单个核细胞(PBMC)含有单核细胞，所述单核细胞在刺激下会上调细胞表面上的B7H3表达。这一实施例用于评价人源化抗B7H3抗体对单核细胞的结合亲和力。用PBS把人血沉棕黄层稀释至两倍Ficoll(GE，17-1440-02)的体积。将稀释的血沉棕黄层轻轻铺在Ficoll上，并在20℃以2500rpm离心40分钟，不加制动。小心地从Ficoll及其透明上清液之间抽出PBMC层。添加PBMC 5体积的PBS，并在20℃以1200rpm离心10分钟。丢弃上清液，并再次用PBS洗涤。为了消除血小板，在20℃以900rpm离心8分钟。PBMC用培养基(含10％FBS和1％PS的RPMI-1640)重悬，计数并等分至96孔板(5x10^5个细胞/孔)，加入LPS(100ng/ml)。孵育24h后，将细胞用PBS洗涤两次。对于活/死染色，把LIVE/
Figure BDA0002849538550000303
Fixable Aqua死细胞染色试剂盒(Life technologies,L34957)应用(PBS中1:1000，100ul/孔)于细胞，并在4℃孵育10分钟。把FACS缓冲液(PBS中2％FBS，100ul/孔)添加至每个孔以终止染色。离心(1200rpm，5min)以丢弃上清液，并用FACS缓冲液洗涤一次。将人源化抗B7H3抗体在FACS缓冲液中稀释至相应浓度，然后添加至各孔(100ul/孔)。将细胞在4℃孵育30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤两次。添加Alexa
Figure BDA0002849538550000304
594标记的山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，109-585-088)(FACS缓冲液中1:500)以标记结合的抗体。把细胞在4℃孵育30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤两次。在流式细胞仪上测试细胞。结果显示在图3中。数据显示抗体以高亲和力结合在从人PBMC得到的原代细胞上表达的B7H3，即源自#27的mAb的结合EC50小于1nM，源自#23的mAb的结合EC50小于3nM。数据证实人源化mAb可以有效结合具有生理结构的B7-H3分子，这对开发治疗性抗体至关重要。所述mAb满足抗体药物的结合特征的要求。
实施例5.人源化抗B7H3抗体体外诱导ADCC
具有IgG1同种型的人源化抗B7H3抗体会介导效应细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。稳定细胞系，BaF3/B7H3-4Ig，被用作靶细胞，而人PBMC被用作效应细胞。将BaF3/B7H3-4Ig细胞(5x10^7个细胞/ml，在PBS中)在37℃在水浴中用CFSE(Sigma，21888，5nM)标记10分钟，避光。向细胞中添加至少5体积的完全培养基，并在冰上快速孵育5分钟。离心去除上清液。将用完全培养基重悬的细胞等分(4000个细胞/孔，100ul/孔)至96孔U形底板。将人源化抗B7H3抗体稀释至相应浓度，并添加至经标记的细胞。将PBMC效应细胞以25:1的E:T(效应细胞:靶细胞)比例添加至每个孔。细胞在37℃于CO2培养箱中孵育4h。细胞用PBS洗涤一次。死细胞用Fixable Viability Dye eFluorTM660(eBioscience，65-0864-18，在PBS中1:1000)阳性染色。PBMC效应细胞用抗CD45标志物(Biolegend，304032)标记。ADCC百分比等于CFSE阳性细胞中死细胞的比例。抗体依赖性细胞介导的吞噬(ADCP)等于CFSE阳性细胞中抗CD45阳性细胞的比例。如图4所示，人源化抗B7-H3抗体能够以剂量依赖的方式介导ADCC以及ADCP。数据表明，mAb可以开发为治疗药物(消耗抗体药物)以杀死癌细胞。此外，由于其具有将化学物质带入具有高表达B7H3分子的靶细胞(包括癌细胞)的能力，因此可以开发成抗体-药物缀合物。那些癌症包括但不限于前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌、肾透明细胞癌(Loo K等,Clin Cancer Res,2012)。
实施例6.抗B7H3抗体阻断B7H3对T细胞活化的抑制
B7H3是T细胞活化的抑制剂。为研究抗B7H3抗体的阻断作用，建立了PBMC功能测定。将PBS中的抗CD3(BD，555329，0.125ug/ml)和B7H3-4Ig(10ug/ml)在4℃包被于96孔板(100ul/孔)中过夜。用PBS洗涤板一次，并在37℃用完全培养基封闭30分钟。将抗B7H3抗体在完全培养基中稀释至相应浓度，然后添加至经包被的板。将抗体在37℃孵育1h，并用完全培养基洗涤一次。从新鲜的血沉棕黄层分离PBMC，如实施例4所述。在完全培养基中重悬后，将PBMC等分至每个孔(3x10^5个细胞/孔，200ul/孔)。将细胞在CO2培养箱中孵育过夜。第二天，死细胞用LIVE/
Figure BDA0002849538550000321
Fixable Aqua死细胞染色试剂盒(Life technologies,L34957)标记。T细胞用抗CD3(Biolegend，317322)，抗CD4(BD，562402)和抗CD8(BD，557834)标记，将活化标志物CD69(Biolegend，310922)作为抗体阻断作用的指示物进行标记。用流式细胞仪测试细胞。如图5所示，抗B7H3抗体逆转了B7-H3对抗CD3刺激的T细胞活化的抑制作用。已发表的数据分析了B7-H3在鼠源癌症模型中的作用(Lee Yh,等,Cell Research,2017)，并表明B7-H3在肿瘤免疫中起着至关重要的负调控作用。本文中的数据表明，通过阻断B7-H3生物活性，mAb很有希望被开发成为用于治疗癌症的治疗剂。
实施例7.抗B7H3抗体的治疗功效
1.C57BL6/J小鼠中的B16F10鼠源黑素瘤同基因模型
B16F10肿瘤细胞在体外以单层培养物的形式维持于补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中，环境为37℃、空气中有5％CO2。隔天用胰蛋白酶-EDTA处理对肿瘤细胞做常规传代培养。每只小鼠皮下接种B16F10肿瘤细胞(2×105个，处于0.1ml PBS中)用于肿瘤发展。当平均肿瘤大小达到129mm3时开始治疗。将小鼠随机分为4组，分别为：PBS，抗B7H3 27-1-5(PG-D0、3)或27-1(PG-D5、8、10)mIgG2b 10mg/kg，抗B7H3 23-2-3mIgG2a 10mg/kg和23-2-3mIgG2b 10mg/kg。每组的治疗安排均在PG-D0、3、5、8、10。如图6所示，抗B7H3抗体可在体内研究中减少黑素瘤肿瘤生长。数据证明对包括黑素瘤在内的表达B7-H3的癌症具有显着的治疗作用。
2.在BALB/C裸鼠中SW620人结肠直肠腺癌异种移植模型
SW620肿瘤细胞在体外以单层培养物形式维持于补充有10％胎牛血清的1640培养基中，环境为37℃、空气中有5％CO2。隔天用胰蛋白酶-EDTA处理对肿瘤细胞做常规传代培养。每只小鼠皮下接种SW620肿瘤细胞(5x106个，处于0.1ml PBS中)用于肿瘤发展。当平均肿瘤大小达到188mm3时开始治疗。将小鼠随机分为2组：PBS和抗B7H3 23-2-3mIgG2a 10mg/kg。每组的治疗安排为每周两次，连续3周。如图7所示，抗B7H3抗体可以减少异种移植模型中人结肠直肠腺癌的生长。数据证明对包括结直肠腺癌在内的表达B7-H3的癌症具有显着的治疗作用。
序列表
<110> 苏州鑫康合生物医药科技有限公司
<120> 抗B7-H3抗体
<130> FB00061PCT
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #23-CDR1H氨基酸序列
<400> 1
Gly Tyr Asn Phe Asn Asn Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #23-CDR2H氨基酸序列
<400> 2
Met Ile His Pro Asn Ser Gly Thr Phe Asn Tyr Asn Glu Arg Phe Lys
1 5 10 15
Arg
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #23-CDR3H氨基酸序列
<400> 3
Ser Thr Ala Leu Ala Thr Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #23-CDR1L氨基酸序列
<400> 4
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #23-CDR2L氨基酸序列
<400> 5
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #23-CDR3L氨基酸序列
<400> 6
Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #27-CDR1H氨基酸序列
<400> 7
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #27-CDR2H氨基酸序列
<400> 8
Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ala Phe Asn Tyr Asn Glu Arg Phe Lys
1 5 10 15
Thr
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #27-CDR3H氨基酸序列
<400> 9
Ser Thr Ala Leu Ala Thr Gly Tyr
1 5
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #27-CDR1L氨基酸序列
<400> 10
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #27-CDR2L氨基酸序列
<400> 11
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> #27-CDR3L氨基酸序列
<400> 12
Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 13
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链结构域(#23-VH5-4)氨基酸序列
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Thr Phe Asn Tyr Asn Glu Arg Phe
50 55 60
Lys Arg Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Thr Ala Leu Ala Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链结构域(#23-VL2-3)氨基酸序列
<400> 14
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ile Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链结构域(#23-VL2-4)氨基酸序列
<400> 15
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ile Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 16
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链结构域(#27-VH2-1)氨基酸序列
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ala Phe Asn Tyr Asn Glu Arg Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Ala Leu Ala Thr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链结构域(#27-VH2-2)氨基酸序列
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ala Phe Asn Tyr Asn Glu Arg Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Ala Leu Ala Thr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链结构域(#27-VL2-1)氨基酸序列
<400> 18
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链结构域(#27-VL2-2)氨基酸序列
<400> 19
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

Claims (25)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含HC可变区序列和LC可变区序列，其中所述抗体结合B7-H3的胞外区，结合亲和力经SPR分析确定为约1.5nM或优于1.5nM，其中所述抗体或其抗原结合片段为以下(a)或(b)中的任一种：
(a) 所述HC包含如SEQ ID NO: 1所示的CDR1序列，如SEQ ID NO: 2所示的CDR2序列，和如SEQ ID NO: 3所示的CDR3序列；所述LC包含如SEQ ID NO: 4所示的CDR1序列，如SEQID NO: 5所示的CDR2序列，和如SEQ ID NO: 6所示的CDR3序列；
(b) 所述HC包含如SEQ ID NO: 7所示的CDR1序列，如SEQ ID NO: 8所示的CDR2序列，和如SEQ ID NO: 9所示的CDR3序列；所述LC包含如SEQ ID NO: 10所示的CDR1序列，如SEQID NO: 11所示的CDR2序列，和如SEQ ID NO: 12所示的CDR3序列。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
3.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含人受体框架。
4. 权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述HC可变区序列为SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 13具有多于80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，并且所述LC可变区序列为SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 14具有多于80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
5. 权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述HC可变区序列为SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 13具有多于80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，并且所述LC可变区序列为SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 15具有多于80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
6. 权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述HC可变区序列为SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 16具有多于80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，并且所述LC可变区序列为SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 18具有多于80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
7. 权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述HC可变区序列为SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 17具有多于80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，并且所述LC可变区序列为SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 18具有多于80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
8. 权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述HC可变区序列为SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 17具有多于80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，并且所述LC可变区序列为SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 19具有多于80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
9.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是IgG1、IgG2或IgG4同种型。
10.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自下组：Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv。
11.一种双特异性分子，其包含权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，和第二抗体或其抗原结合片段。
12.权利要求11所述的双特异性分子，其中所述第二抗体或其抗原结合片段特异性地结合在肿瘤细胞表面表达的肿瘤抗原，其中所述肿瘤抗原选自下组：A33；ADAM-9；ALCAM；BAGE;β-连环蛋白；CA125；羧肽酶M；CD103；CD19；CD20；CD22；CD23；CD25；CD27；CD28；CD36；CD40/CD154；CD45；CD46；CD5；CD56；CD79a/CD79b；CDK4；CEA；CTLA4；细胞角蛋白8；EGF-R；EphA2；ErbB1；ErbB3；ErbB4；GAGE-1；GAGE-2；GD2/GD3/GM2；HER-2/neu；人乳头瘤病毒-E6；人乳头瘤病毒-E7；JAM-3；KID3；KID31；KSA；LUCA-2；MAGE-1；MAGE-3；MART；MUC-1；MUM-1；N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶；抑瘤素M；pl5；PIPA；PSA；PSMA；ROR1；TNF-β受体；TNF-α受体；TNF-γ受体；转铁蛋白受体；和VEGF受体。
13.一种多肽，其包含权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
14.一种多肽，其包含权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的HC可变区和LC可变区。
15.一种免疫缀合物，其包含权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与治疗剂连接。
16.权利要求15所述的免疫缀合物，其中所述治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。
17.一种组合物，其包含权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，权利要求11或12所述的双特异性分子，权利要求13或14所述的多肽或权利要求15或16所述的免疫缀合物，和药学上可接受的载体。
18.权利要求17所述的组合物，其进一步包含抗癌药剂。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述药剂是抗体、化学治疗剂、放射治疗剂、激素治疗剂、毒素或免疫治疗剂。
20.一种用于治疗癌症的制品或试剂盒，其包含权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，权利要求11或12所述的双特异性分子，权利要求13或14所述的多肽，权利要求15或16所述的免疫缀合物，或权利要求17-19中任一项所述的组合物。
21.一种用于诊断癌症的制品或试剂盒，其包含权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
22.一种分离的核酸，其编码权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的HC可变区和LC可变区。
23.一种表达载体，其包含权利要求22所述的核酸。
24.一种宿主细胞，其包含权利要求23所述的表达载体。
25.一种用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在权利要求24所述的宿主细胞中表达所述抗体或其抗原结合片段，并且从所述宿主细胞中分离所述抗体或其抗原结合片段。
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