CN118515764A - 免疫调节蛋白分子b7-h3的结合蛋白及其应用 - Google Patents

免疫调节蛋白分子b7-h3的结合蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫调节蛋白分子B7‑H3的结合蛋白及其应用。揭示了一种B7‑H3特异性的抗体，其能与B7‑H3特异性结合，刺激抗原特异性免疫细胞(如T细胞)应答，可以应用于抑制与B7‑H3表达(包括过表达)相关或者是受到B7‑H3功能影响的疾病，例如肿瘤或病毒感染。

Description

免疫调节蛋白分子B7-H3的结合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于免疫学领域；具体地，涉及一种免疫调节蛋白分子B7-H3的结合蛋白及其应用。
背景技术
B7-H3(又称CD276)是一种I型跨膜蛋白，属于B7免疫调节分子家族。B7-H3与其他家族成员存在20％-27％相似性，与B7-H1(PD-L1)有相似的分子结构。B7-H3蛋白由染色体15q24基因编码，结构上包括由涵盖胞外域、跨膜域和短胞内域在内的316个氨基酸(2IgB7-H3亚型)组成，分子量为45kDa。它包含一个28AA信号肽，一个由免疫球蛋白恒定(IgC)和可变(IgV)结构组成的217AA细胞外区域，一个跨膜区域和45个氨基酸的胞质结构域。由于外显子重复，人B7-H3蛋白包含一对或两对相同的胞外结构域造成了两种亚型：2IgB7-H3由一对免疫球蛋白可变区(IgV)样和免疫球蛋白恒定区(IgC)样胞外结构域组成；4IgB7-H3包含两对相同的IgV样和IgC样胞外结构域，也是人类细胞中的主要亚型。
B7-H3是免疫调节分子B7家族成员，在头颈部肿瘤，膀胱癌，直肠癌，胰腺癌，卵巢癌等多种实体瘤中过表达。B7-H3在免疫细胞抗肿瘤活性中主要发挥共抑制作用，有利于肿瘤细胞逃避免疫监视。肿瘤表达B7-H3可抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫反应，B7-H3高表达与NSCLC患者对PD-1抗体无应答有关。此外，该蛋白高表达还与卵巢癌中CD8 T细胞浸润降低以及耗竭有关。因此，B7-H3的过度表达与肿瘤患者的免疫治疗的不良预后有关。B7-H3蛋白能够间接激活NF-kΒ、PI3K/Akt和JAK/STAT3通路以诱导细胞存活和增殖；抑制转录因子NRF2，导致活性氧(ROS)和HIF1a水平增加，从而诱导有氧糖酵解并导致肿瘤生长。因此，B7-H3还有促进肿瘤增殖代谢和转移的作用。
B7-H3在多种实体瘤种中广泛高表达，及其对免疫细胞抗肿瘤活性中的共抑制效应，意味着靶向B7-H3的抗体药物，及其衍生的双抗和ADC药物和基于B7-H3抗体抗原结合序列的CAR-T细胞治疗方法，具备应用于广阔的实体瘤治疗的可行性。
作为泛癌细胞靶标，B7-H3在多种难治、易复发实体瘤中高表达，其中包括中枢神经肿瘤，头颈部肿瘤，三阴乳腺癌，非小细胞肺癌和肾脏肿瘤，且B7-H3的高表达与肿瘤免疫治疗效果不佳有相关性。因此，B7-H3抗体既可以靶向治疗中枢神经肿瘤，头颈部肿瘤，三阴乳腺癌，非小细胞肺癌和肾脏肿瘤等难治、易复发实体瘤，也可以联合免疫治疗针对性治疗免疫治疗不敏感的实体瘤病例。
MacroGenics的B7-H3抗体MGA271(Enoblituzumab)联合PD-1单抗(Pembrolizumab)在治疗头颈鳞状细胞癌和非小细胞肺癌的临床研究中表现优于PD-1单抗Pembrolizumab和Nivolumab的单药。尽管如此，MGA271在亲和力等方面的表现还有需要提高的空间。
发明内容
本发明的目的在于提供免疫调节蛋白分子B7-H3的结合蛋白及其应用。
在本发明的第一方面，提供结合免疫调节分子B7-H3的抗体(包括其抗原结合片段)，其具有显著改善的抑制免疫调节分子B7-H3与其受体分子(细胞表面受体分子)的结合的作用。
在一种或多种实施方式中，该抗体具有轻链可变区和重链可变区，其中，重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
在一种或多种实施方式中，重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。
在一种或多种实施方式中，所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。
在一种或多种实施方式中，所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列。
在一种或多种实施方式中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区：其重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；或，其重链可变区具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；或，其重链可变区具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一种或多种实施方式中，所述抗体还包括重链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11所示序列具有80％以上(如85％、90％、93％、95％、97％或99％以上)相同性、轻链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12所示具有80％以上(如85％、90％、93％、95％、97％或99％以上)相同性且保留结合活性的抗体。
在一种或多种实施方式中，所述抗体包括：单克隆抗体、人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在一种或多种实施方式中，所述抗体包括：Fab、Fab’-SH、Fv、Fd、scFv或(Fab’)2片段。
在一种或多种实施方式中，所述抗体为IgG抗体。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸或含有该多核苷酸的构建体，所述多核苷酸编码所述的结合免疫调节分子B7-H3的抗体；较佳地，所述的构建体为表达载体。
在本发明的另一方面，提供一种抗体表达系统，所述表达系统含有所述的构建体或基因组中整合有外源的所述的多核苷酸；较佳地所述表达系统为细胞(表达系统)。
在一种或多种实施方式中，所述细胞(宿主细胞)为哺乳动物细胞。
在一种或多种实施方式中，所述哺乳动物细胞包括(但不限于)：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，Vero细胞，HEK-293细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，BHK细胞，PER-C6细胞；较佳的，为CHO细胞。
在本发明的另一方面，提供一种制备所述的抗体的方法，包括：在适合表达所述抗体的条件下，利用所述的抗体表达系统进行表达，从而表达出所述的抗体；较佳地，还包括纯化分离出所述抗体。
在本发明的另一方面，提供所述的抗体的用途，用于：制备特异性靶向表达免疫调节分子B7-H3的细胞的抗肿瘤药物，所述药物通过刺激抗原特异性免疫细胞(如T细胞)应答抑制肿瘤；制备抗体药物偶联物或免疫缀合物；制备双功能(双特异性)或多功能(多特异性)抗体；制备嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
在本发明的另一方面，提供一种融合蛋白或免疫缀合物，其包括所述的抗体，以及与之操作性连接的功能性分子。
在一种或多种实施方式中，所述功能性分子包括：抑制肿瘤的分子，靶向肿瘤表面标志物的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物，细胞毒素，放射性同位素，生物活性蛋白质，融合伴侣，基于嵌合抗原受体技术的胞外铰链区、跨膜区及胞内信号区，或其组合。
在一种或多种实施方式中，所述靶向免疫细胞的表面标志物的分子是结合免疫细胞表面标志物的抗体或配体。
在一种或多种实施方式中，所述的抑制肿瘤的分子是抗肿瘤毒素或抗肿瘤细胞因子。
在一种或多种实施方式中，所述靶向肿瘤表面标志物的分子是结合肿瘤表面标志物的抗体或配体。
在一种或多种实施方式中，所述的融合伴侣包括(但不限于)：具有延长体内半衰期作用的蛋白或活性结构域。
在一种或多种实施方式中，所述结合免疫细胞表面标志物的抗体结合的抗原包括(但不限于)：CD3、CD20、FcRH5、HER2、LYPD1、LY6G6D、PMEL17、LY6E、CD19、CD33、CD22、CD79A、CD79B、EDAR、GFRA1、MRP4、RET、Steap1或TenB2。
在一种或多种实施方式中，所述结合肿瘤表面标志物的抗体是识别免疫调节分子B7-H3以外的其它抗原的抗体，所述的其它抗原包括(但不限于)：EGFR，EGFRvIII，mesothelin，HER2，EphA2，cMet，EpCAM，MUC1，MUC16，CEA，Claudin 18.2，Claudin6，WT1，NY-ESO-1，MAGE 3，CD47，ASGPR1或CDH16。
在一种或多种实施方式中，所述的抗肿瘤细胞因子包括(但不限于)：IL-2、IL-12、IL-15、IFN-beta、TNF-alpha。
在一种或多种实施方式中，所述抗肿瘤毒素包括(但不限于)：美登素，奥利司他汀，单甲基澳瑞他汀，美登木素生物碱，多拉司他汀，卡奇霉素，氨甲蝶呤，长春地辛，紫杉烷如多烯紫杉醇、紫杉醇、拉洛紫杉醇、特西紫杉醇或欧塔紫杉醇，单端孢霉毒素，CC1065，DXd，Duocarmycin，Calicheamicin，Pyrrolobenzodiazepines或SN-38。
在一种或多种实施方式中，所述具有延长体内半衰期作用的蛋白或活性结构域包括(但不限于)：免疫球蛋白Fc区、优选人免疫球蛋白Fc区，血清白蛋白(如人源的HSA)或其片段。
在一种或多种实施方式中，所述免疫球蛋白为选自IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM中的一种或多种的组合，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型中的一种或多种的组合。
在一种或多种实施方式中，所述抗体以及与之操作性连接的功能性分子之间设有连接肽；所述连接肽优选选自由丙氨酸和/或丝氨酸和/或甘氨酸组成的柔性多肽链，连接肽的长度优选为3～30个氨基酸。
在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，包括所述的抗体、所述的融合蛋白或免疫缀合物；较佳地，所述的药物组合物中还包括药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的抗体、所述的融合蛋白或免疫缀合物、或含有它们的药物组合物在制备用于抑制肿瘤或刺激抗原特异性免疫细胞(如T细胞)应答的制剂、试剂盒或药盒中的用途。
在一种或多种实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤；较佳地，所述肿瘤包括表达免疫调节分子B7-H3的肿瘤；较佳地，所述肿瘤包括(但不限于)：卵巢癌，乳腺癌(三阴乳腺癌)，中枢神经肿瘤，头颈部肿瘤，膀胱癌，直肠癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，肾脏肿瘤。
在本发明的另一方面，提供一种试剂盒或药盒，包括所述的抗体、所述的融合蛋白或免疫缀合物、或含有它们的药物组合物。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒或药盒中还含有：免疫刺激性抗体、化疗剂和抗病毒药物。
在一种或多种实施方式中，所述免疫刺激性抗体选自如下的一种或多种：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体和抗CTLA-4抗体。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒或药盒中还含有用于装入所述抗体、融合蛋白、免疫缀合物或药物组合物的容器，所述容器为一个或多个。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒或药盒中还含有使用说明书(包装插页)，说明所述抗体、融合蛋白、免疫缀合物或药物组合物的使用/服用方法。
在本发明的另一方面，提供一种在受试者中刺激免疫反应的方法，该方法包括给予该受试者上面任一所述的抗体，从而刺激该受试者的免疫反应。
在一种或多种实施方式中，所述受试者为携带肿瘤的受试者，并且给予该受试者所述的抗体刺激了针对该肿瘤的免疫反应。
在一种或多种实施方式中，所述受试者为携带病毒的受试者，并且给予该受试者所述的抗体刺激了针对该病毒的免疫反应。
在本发明的另一方面，提供一种抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，该方法包括给予该受试者前面所述的抗体。
在本发明的另一方面，提供一种治疗受试者中病毒感染的方法，该方法包括给予该受试者前面所述的抗体。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、5个IgG4单克隆抗体与人B7-H3标签融合蛋白结合的ELISA检测结果。
图2、瞬时转染的ExpiCHO-S细胞制备的B7-H3单克隆抗体的SEC-HPLC检测纯度。图中从上至下依次是：BM(PC)、13725、14479。
图3、B7-H3单克隆抗体同人B7-H3-his结合的ELISA检测结果。
图4、B7-H3单克隆抗体同人B7-H4-his结合的ELISA检测结果。
图5、B7-H3单克隆抗体同人PD-L1-ECD-mFc结合的ELISA检测结果。
图6、B7-H3单克隆抗体同小鼠B7-H3-his结合的ELISA检测结果。
图7、B7-H3单克隆抗体同小鼠B7-H4-huFc结合的ELISA检测结果。
图8、B7-H3单克隆抗体同乳腺癌细胞系MCF-7的细胞结合活性检测结果。
图9、B7-H3单克隆抗体同卵巢癌细胞系OVCAR-3的细胞结合活性检测结果。
图10、B7-H3单克隆抗体同人Insulin结合活性检测结果。
图11、B7-H3单克隆抗体同DNA结合活性检测结果。
图12、B7-H3人源化单克隆抗体ADCC检测结果。
图13、小鼠荷瘤模型体内抗肿瘤药效。图中显示为肿瘤的平均体积±SEM。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，揭示了一种B7-H3特异性的抗体，其能与B7-H3特异性结合，刺激抗原特异性免疫细胞(如T细胞)应答，可以应用于抑制与B7-H3表达(包括过表达)相关或者是受到B7-H3功能影响的疾病，例如肿瘤或病毒感染。
1)抗体
本发明涉及抗B7-H3抗体。在优选的实施方案中，本发明提供一种抗B7-H3抗体，其包含含有至少1、2、3、4、5或6个选自以下的高变区(HVR)或称为互补决定区(CDR)的结合域：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:13或19的氨基酸序列或与该序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:14或20的氨基酸序列或与该序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:15或21的氨基酸序列或与该序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:16或22的氨基酸序列或与该序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:17或23的氨基酸序列或与该序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:18或24的氨基酸序列或与该序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列。在一些情况下，抗B7-H3抗体所具有的重链可变(VH)域(区)可包括与SEQ ID NO:1或5具有至少90％序列同源性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:1或5的氨基酸序列，和/或其轻链可变(VL)域(区)包含与SEQ ID NO:3或6具有至少90％序列同源性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:3或6的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗B7-H3抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQID NO:11。轻链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12。
在一些实施方案中，抗B7-H3抗体包含如下的重链可变区和轻链可变区的组合：
(1)氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3；(No.13725)；
(2)氨基酸序列SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；(No.14479)；
(3)氨基酸序列SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；(No.13683)；
(4)氨基酸序列SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；(No.14463)；
(5)氨基酸序列SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；(No.14471)。
在优选的实施方案中，抗B7-H3抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5，轻链可变区包含氨基酸序列SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:6。
2)抗体片段
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体为抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、(Fab’)2、Fv及scFv片段及下文所描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编(Springer-Verlag,Berlin)，第269-315页(1994)；也可参见WO 93/16185；及美国专利第5,571,894号及第5,587,458号。
双功能抗体为具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可为二价或双特异性的。参见例如EP0404097A2；WO 1993/011161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三功能抗体及四功能抗体也描述于Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)中。
单域抗体为包含抗体的所有或部分重链可变域或所有或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体为人类单域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利第6,248,516B1号)。
抗体片段可通过各种技术产生，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由如本文中所描述的重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生。
3)嵌合抗体及人源化抗体
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体为嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利第4,816,567号；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中。
在某些实施方案中，嵌合抗体为人源化抗体。典型地，非人类抗体经人源化以降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人类抗体的特异性及亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR，(或其部分)源自于非人类抗体，且FR(或其部分)源自于人类抗体序列。人源化抗体任选地也将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基经来自于非人类抗体(例如获得HVR残基的抗体)的相应残基取代，例如以修复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制造方法可查阅例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，且进一步描述于例如以下文献中：Riechmann等人,Nature 332:323-327(1988)；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号及第7,087,409号；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重整”)；Dall’Acqua等人，Methods36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；及Osbourn等人，Methods 36:61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述针对FR改组的“指导选择”法)。
4)人类抗体
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体为人类抗体。人类抗体可使用本领域中已知的各种技术产生。
人类抗体可通过将免疫原施用给经修饰的转基因动物，然后用抗原攻击制备完整人类抗体或具有人类可变区的完整抗体。此类动物典型地含有所有或部分人类免疫球蛋白基因座，其置换内源免疫球蛋白基因座或存在于染色体外或随机整合于动物染色体中。在此类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座一般已灭活。关于由转基因动物获得人类抗体的方法，参见例如美国专利第6,075,181号及第6,150,584号(描述XENOMOUSETM技术)；美国专利第5,770,429号；美国专利第7,041,870号(描述K-M技术)；及美国申请公布第US2007/0061900号。得自于由此类动物产生的完整抗体的人类可变区可经进一步修饰，例如通过与不同的人类恒定区组合。
人类抗体也可通过基于杂交瘤的方法制造。已描述用于产生人类单克隆抗体的人类骨髓瘤及小鼠-人类杂交骨髓瘤细胞株，参见例如Kozbor等人，J.Immunol.，133:3001-3005(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，第51-63页；Marcel Dekker，Inc.，New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147:86-95(1991)。经由人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体也描述于Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。其他方法包括例如美国专利第7,189,826号(描述由杂交瘤细胞株产生单克隆人类IgM抗体)及倪,现代免疫学,26(4):265-268(2006)(描述人类-人类杂交瘤技术)中所描述的方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers及Histol.Histopathol.,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-191(2005)中。
人类抗体也可通过分离选自人类来源噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列来制备。接着可将此类可变域序列与所要的人类恒定域组合。本发明实施例部分描述了通过噬菌体展示库筛选人类抗体的过程。
具体地，可通过针对具有结合B7-H3活性的抗体筛选组合库来分离具有高亲和力的本发明抗体。例如，本领域中已知用于产生噬菌体展示库及针对具有所要结合特征的抗体筛选此类库的多种方法。此类方法可查阅例如Hoogenboom等人，Methods in MolecularBiology 178:1-37(O’Brien等人编,Human Press,Totowa，NJ，2001)，且进一步描述于例如以下文献中：McCafferty等人，Nature 348:552-554(1990)；Clackson等人，Nature352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)；Marks及Bradbury，Methodsin Molecular Biology 248:161-175(Lo编，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)单独克隆VH及VL基因谱系，且随机重组于噬菌体库中，接着可如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.12:433-455(1994)中所描述针对抗原-结合噬菌体进行筛选。噬菌体典型地将抗体片段呈现为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自于免疫源的库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。描述人类抗体噬菌体库的专利公布包括例如：美国专利第5,750,373号及美国专利公布第2005/0079574号、第2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号。
自人类抗体库分离的抗体或抗体片段在本文中被视为人类抗体或人类抗体片段。
5)多特异性抗体
在任何上述方面中，本文中所提供的抗B7-H3抗体为多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体为对至少两个不同的位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一个结合特异性针对B7-H3，而另一结合特异性针对任何其他抗原(例如第二生物分子，例如免疫细胞表面抗原，例如肿瘤抗原)。相应地，双特异性抗B7-H3抗体可对B7-H3及其他抗原，例如CD3、CD20、FcRH5、HER2、LYPD1、LY6G6D、PMEL17、LY6E、CD19、CD33、CD22、CD79A、CD79B、EDAR、GFRA1、MRP4、RET、Steap1或TenB2有结合特异性。双特异性抗体也可制备为全长抗体或抗体片段。
用于制造多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链配对的重组共表达(参见Milstein及Cuello,Nature 305:537-540(1983))；WO93/08829；及Traunecker等人，EMBO J.10:3655-3659(1991))WO 2009/080253；Schaefer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,108:11187-11192(2011))，WO 2009/089004等。
6)抗体变体
本发明的抗体涵盖本发明抗B7-H3抗体的氨基酸序列变体。例如，可能需要进一步改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质而制备的抗体变体。抗体的氨基酸序列变体可通过向编码该抗体的核苷酸序列中引入适当修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或取代。可对缺失、插入及取代进行任何组合以获得最终构建体，可使最终构建体具有所要特征，例如抗原结合。
a.取代变体、插入变体及缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。取代型突变诱发的相关位点包括HVR及FR。保守取代显示于以下“优选取代”标题下。更多实质性变化提供于如下“例示性取代”标题下，且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述。可将氨基酸取代引入相关抗体中且针对所希望获得的活性(例如保留/改善抗原结合或改善ADCC或CDC)来筛选产物。
例示性氨基酸取代及优选氨基酸取代
可根据共同侧链性质对氨基酸进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将必然伴有将这些类别之一的成员交换成另一类别。
一种类型取代型变体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体或人类抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，选择用于进一步研究的所得变体将在某些生物学性质(例如增加亲和力)方面相对于亲本抗体得以修饰(例如改善)和/或将实质上保留亲本抗体的某些生物学性质。例示性取代型变体为亲和力成熟抗体，其可使用例如基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(诸如本文中所描述的那些)便利地产生。简言之，使一个或多个HVR残基突变且使变异抗体展现于噬菌体上，且针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
在某些实施方案中，一个或多个HVR(CDR)内可发生取代、插入或缺失，只要此类变化实质上不削弱抗体结合B7H3的能力即可。例如，可在HVR中进行实质上不降低结合亲和力的保守变化(例如，如本文中所提供的保守取代)。例如，此类变化可在HVR中的抗原接触残基以外。在以上所提供的变异VH及VL序列的某些实施方案中，各HVR未改变或含有不超过1、2或3个氨基酸取代。
用于鉴别可靶向以进行突变诱发的抗体残基或区域的适用方法称为“丙氨酸扫描突变诱发”，如Cunningham及Wells(1989)Science，244:1081-1085所描述。
7)重组方法
本发明的抗B7-H3抗体可使用重组方法来制备，例如，如美国专利第4,816,567号中所描述。在一个实施方案中，提供编码本文中所描述的抗B7-H3抗体的经分离核酸。此类核酸可编码包含该抗体(例如该抗体的轻链和/或重链)的VL的氨基酸序列和/或包含其VH的氨基酸序列。在另一实施方案中，提供包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在另一实施方案中，提供包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，经转化而具有)：(1)包含编码包含该抗体的VL的氨基酸序列及包含该抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体；或(2)包含编码包含该抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体及包含编码包含该抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，该宿主细胞为真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、SP2/0细胞)。在一个实施方案中，提供制造抗B7-H3抗体的方法，其中该方法包括在适合表达该抗体的条件下培养如上文所提供的包含编码该抗体的核酸的宿主细胞，及包括自该宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该抗体。
为了重组生产抗B7-H3抗体，分离编码抗体的核酸(例如，如上所描述)插入一个或多个载体中以便在宿主细胞中进行进一步克隆和/或表达。此类核酸可使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码该抗体的重链及轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离并测序。
适用于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文中所描述的原核细胞或真核细胞。例如，可在细菌中产生抗体，尤其在不需要糖基化及Fc效应功能时。对于在细菌中表达抗体片段及多肽，参见例如美国专利第5,648,237号、第5,789,199号及第5,840,523号。在表达之后，可自细菌细胞浆中分离处于可溶性部分中的抗体且可进一步纯化。
除原核生物以外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也为抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括糖基化途径已“人源化”从而产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体的真菌及酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；及Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适用于表达糖基化抗体的宿主细胞也来源于多细胞生物体(无脊椎动物及脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物及昆虫细胞。已鉴别许多可用于结合昆虫细胞，尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的杆状病毒菌株。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号及第6,417,429号(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞株可能适用。适用哺乳动物宿主细胞株的其他实例为经SV40转化的猴类肾CV1细胞株(COS-7)；人类胚肾细胞株(例如，如Graham等人,J.Gen.Virol.36:59-74(1977)中所描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(例如，如Mather,Biol.Reprod.23:243-252(1980)中所描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人类子宫颈癌细胞(HELA)；犬类肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A)；人类肺细胞(W138)；人类肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；例如，如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所描述的TRI细胞；MRC 5细胞；及FS4细胞。其他适用哺乳动物宿主细胞株包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220(1980))；及骨髓瘤细胞株，诸如Y0、NS0及SP2/0。关于适用于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞株的综述，参见例如Yazaki及Wu，Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。
本发明B7-H3抗体与人B7-H3的亲和力KD低于1.0pM，优于Macrogenics的MGA271等B7-H3抗体，在治疗实体瘤包括中枢神经肿瘤，头颈部肿瘤，三阴乳腺癌，非小细胞肺癌和肾脏肿瘤等方面具有优异的应用前景。
8)免疫缀合物
本发明也提供包含本文中的抗B7-H3抗体与一种或多种细胞毒性剂结合的免疫缀合物，此类细胞毒性剂为诸如化学治疗剂或化学治疗药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素等。
在一个实施方案中，免疫缀合物为抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物结合，包括但不限于美登素(参见美国专利第5,208,020号、第5,416,064号及欧洲专利EP0425235B1)；奥利司他汀，诸如单甲基奥利司他汀药物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(参见美国专利第5,635,483号及第5,780,588号及第7,498,298号)；多拉司他汀；卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号及第5,877,296号；Hinman等人,CancerRes.53:3336-3342(1993)；及Lode等人,Cancer Res.58:2925-2928(1998))，氨甲蝶呤；长春地辛；紫杉烷，诸如多烯紫杉醇、紫杉醇、拉洛紫杉醇(larotaxel)、特西紫杉醇(tesetaxel)及欧塔紫杉醇(ortataxel)；单端孢霉毒素(trichothecene)；及CC1065。
在另一实施方案中，免疫缀合物包含如本文中所描述的抗B7-H3抗体与酶活性毒素或其片段的缀合物，该酶活性毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链及单端孢霉毒素等。
在另一实施方案中，免疫缀合物包含如本文中所描述的抗B7-H3抗体与放射性原子结合形成的放射性缀合物。多种放射性同位素可用于产生放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu的放射性同位素。
抗体与细胞毒性剂的缀合物可使用多种双官能蛋白偶合剂制造，诸如N-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、丁二酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚胺基硫杂环戊烷(IT)、酰亚胺酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二丁二酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
9)药物制剂
本发明的抗B7-H3抗体的药物制剂通过将具有所要纯度的抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合制成冻干制剂或水溶液形式来制备。药学上可接受的载体在所采用的剂量及浓度下一般对受体无毒，且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷酰氨酸、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨糖醇；成盐相对离子，诸如钠；金属配合物(例如锌-蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。
例示性冻干抗体制剂描述于美国专利第6,267,958号中。水性抗体制剂包括美国专利第6,171,586号及WO2006/044908中所描述的那些，后者的制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的制剂也可含有超过一种对于所治疗的特定适应症而言必需存在的活性成分，优选具有不会对彼此造成不利影响的互补活性的活性成分。例如，可能需要进一步提供额外治疗剂(例如化学治疗剂、细胞毒性剂、生长抑制剂和/或抗激素剂)。此类活性成分适合以组合形式以对预定目的有效的量存在。
10)制品
本发明还提供了含有本发明抗体或药物组合物的制品。该制品包含容器及处于该容器上或与该容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。此类容器可由各种材料制成，诸如玻璃或塑料。该容器容纳本发明组合物自身或该组合物与另一组合物的组合，且可具有无菌进入口(例如，该容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的瓶塞的小瓶)。该组合物中的至少一种活性剂为本发明的抗体。该标签或包装插页指示该组合物用于治疗选定肿瘤或病毒感染。此外，该制品可包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的抗体；及(b)其中含有组合物的第二容器，其中该组合物包含另一细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明的此实施方案中的制品可进一步包含指示此类组合物可用于治疗肿瘤或病毒感染的包装插页。可选地，或另外，该制品可进一步包括第二(或第三)容器，该容器包含药学上可接受的缓冲剂，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可进一步包括自商业及使用者的立场来看合乎需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针及注射器。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社(2016)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、抗B7-H3单克隆抗体的制备
1.1高亲和力结合人B7-H3重组融合蛋白的单链抗体的淘选
本实施例中，从全人源单链scFv噬菌体展示文库中淘选高亲和力结合人B7-H3重组融合蛋白的单链抗体，该方法涉及利用如下所述的全人源单链scFv噬菌体展示文库，以及使用人B7-H3-6*His重组融合蛋白(近岸蛋白，cat#CK62)，大肠杆菌TG1(Lucigen，cat#60502-1)以及M13KO7辅助噬菌体(Thermo Fisher，cat#18311019)。
全人源单链scFv噬菌体展示文库构建自含有pBR3.22启动子和M13噬菌体pIII蛋白展示系统的噬菌粒载体pCLS1.0，其C端含有Myc-His标签。文库构建时使用大肠杆菌TG1。该全人源单链scFv噬菌体展示文库采取常规方法建立，简述如下：利用RNA提取试剂盒(TaKaRa，cat#9767)从商购健康人群PBMCs(澳赛尔斯,cat#PB-003F-S，50个样本)中获得RNA，每个全人源scFv单链噬菌体展示子文库由五或十个样本的RNA混合建立。用逆转录试剂盒(Thermo Fisher，cat#4368814)将RNA逆转录合成cDNA第一链，按文献(CaiX.，GarenA.PNAS，1995.92(14):6537-6541)以及V-base数据库设计合成扩增人类抗体可变区基因的特异性引物。以cDNA第一链为模板，通过PCR分别扩增人类抗体重链可变区和轻链可变区基因。利用分子克隆技术分别将人类抗体重链可变区及轻链可变区基因片段克隆至噬菌粒载体pCLS1.0。具体的，人类抗体轻链可变区由Nhe I/Not I双酶切克隆至载体pCLS1.0，并电转化至大肠杆菌TG1，获得噬菌体轻链子文库，获得载体pCLS1.0-VL。继续用Sfi I/Xho I双酶切将人类抗体重链可变区克隆至载体pCLS1.0-VL)。利用相同方法获得具有重链和轻链可变区组合的全人源scFv噬菌体展示子文库。各个子文库总计库容为9×109。
淘选实验中的人B7-H3-6*His标签融合蛋白均利用生物素标记试剂盒(BiotinLabeling Kit-NH2(Dojindo，cat#LK03))标记生物素。淘选实验简述如下：利用大肠杆菌TG1制备M13KO7辅助噬菌体，测定滴度约为1.0×1013，并将其侵染OD600值为0.5-0.6的上述全人源scFv单链噬菌体展示文库，以获得第一轮输入(input)噬菌体。利用液相淘选策略，通过事先和M-280 Streptavidin(Thermo,cat#11206D)预孵育的经生物素标记的人B7-H3-6*His标签重组融合蛋白富集结合人B7-H3的scFv单链抗体的噬菌体。用pH2.2，0.1M的甘氨酸-盐酸溶液洗脱富集的所述单链抗体噬菌体，得到第一轮输出(output)噬菌体。用第一轮输出噬菌体侵染OD600值为0.5-0.6的TG1大肠杆菌，以获得第二轮输入噬菌体，继续使用上述生物淘选方法得到与人B7-H3-6*His标签重组融合蛋白结合的第二轮输出噬菌体。重复第二轮生物淘选过程进行第三轮或第四轮淘选，将经过第三轮或者第四轮淘选富集的输出噬菌体侵染大肠杆菌TG1，获得单克隆，通过噬菌体ELISA鉴定、挑选和人B7-H3-6*His标签重组融合蛋白具有高亲和力的单克隆大肠杆菌进行测序分析，获得20个克隆，见表1。
表1、20个克隆
13683 14350 14463 14470 14479
13723 14457 14464 14471 14482
13724 14458 14466 14474 14487
13725 14460 14469 14478 14488
1.2通过流式分析选择结合B7-H3蛋白的单链抗体进行IgG转换
为了测试20个单克隆scFv单链抗体与细胞表面B7-H3蛋白结合的能力，将带有该scFv单链抗体的大肠杆菌单克隆用IPTG诱导表达可溶scFv单链抗体蛋白，取过滤后的上清与过表达B7-H3的CHO细胞检测结合活性。将所述的20个IPTG诱导表达的可溶scFv单链抗体蛋白、2YT培养基(生工生物工程(上海)股份有限公司，cat#SD7019)及空白对照PBS(Hyclone，cat#SH30256.01)分别与过表达B7-H3的CHO细胞4℃共孵育1h。然后用冷的1×PBS缓冲液将细胞洗涤两次。加入1:50稀释的anti-His-PE标记的抗体(Miltenyi Biotec，cat#130-092-691)，并将混合物在4℃下孵育30分钟，之后用冷的1×PBS缓冲液洗涤两次,用Guava easyCyte HT流式细胞仪(MERCK MILLIPORE)分析所述诱导表达的scFv单链抗体与过表达B7-H3的CHO细胞的结合活性。流式分析时针对过表达B7-H3的CHO细胞框选设门，通过PE信号强度考察结合活性。20个IPTG诱导表达的可溶scFv单链抗体蛋白与过表达B7-H3的人CHO细胞的结合活性如表2所示，有5个抗体蛋白(13725，14479，13683，14463，14471)具有与过表达B7-H3的CHO细胞的最高的结合活性。
表2
选取13725，14479，13683，14463，14471这5个scFv单链抗体，序列如下(氨基酸序列中以下划线表示相应抗体的CDR区)：
13725克隆的单链抗体的VH链的氨基酸(SEQ ID NO:1)及核苷酸序列(SEQ ID NO:2)：
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARLQGGTMVRGVRYYGMDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1)
gaggtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaagatctcctgtaagggttctggatacagctttaccagctactggatcggctgggtgcgccagatgcccgggaaaggcctggagtggatggggatcatctatcctggtgactctgataccagatacagcccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagccgacaagtccatcagcaccgcctacctgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgagacttcaggggggtactatggttcggggagtacgctactacggtatggacgtctggggccaagggaccctggtcaccgtctcgagc(SEQ ID NO:2)
13725克隆单链抗体的VL链的氨基酸(SEQ ID NO:3)及核苷酸序列(SEQ ID NO:4)：
ETTLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGRSYLVWYQQKPGQAPRLLIYGASTRAPGISDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGTSPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:3)
gaaacgacactcacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctcctggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttggccgcagttacttagtctggtatcaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatttatggtgcatccacccgggcccctggcatctcagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtacctcaccgtacacttttggccaggggaccaaagtggagatcaaa(SEQ ID NO:4)
14479克隆单链抗体的VH链的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)：
EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREVLYYYDSSGYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
14479克隆单链抗体的VL链的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)：
QSVLTQPPSVSAAPGQDITISCSGASSNIGKAFVSWYQQFPGEVPKLLIYGTSKRPSGTPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCATWDNSLGAWVFGGGTKLTVL
13683克隆单链抗体的VH链的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)：
GVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRDDFWTGSMDVWGQGTMVTVSS
13683克隆单链抗体的VL链的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTD
FTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPYTFGQGTKLEIK
14463克隆单链抗体的VH链的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)：
EVQLVQSGAEVKNPGSSVKVSCKASGGTFRNYGFSWVRQAPGQGLEWMGRFIPVVDMSNYAQKFQG
RVTITADKSTNTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGAVAGSGATLDYWGQGTLVTVSS
14463克隆单链抗体的VL链的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)：
QPVLTQSPSASGTPGERVTISCSGSSSNIGSNYVNWYQQLPGMAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSG
TSASLAISGLQSEDEADYYCSTWDYSLNGVVFGGGTKVTVL
14471克隆单链抗体的VH链的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)：
QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVT
ISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSNWFDPWGQGTLVTVSS
14471克隆单链抗体的VL链的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)：
DIWMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSG
TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYINPLTFGGGTKVEIK
对上述进行分子克隆转换成IgG4的形式。将包含前导肽、Nhe I/Not I酶切位点、重链基因恒定区及人IgG4-Fc的序列克隆构建至pCDNA3.3+，得到载体pCDNA3.3-IgG4。同样的，将包含前导肽、Nhe I/BsiW I酶切位点、轻链Kappa基因恒定区序列克隆构建至pCDNA3.3+，得到载体pCDNA3.3-VKappa，或者将包含前导肽、BamH I/Hind III酶切位点、轻链lambda基因恒定区序列克隆构建至pCDNA3.3+，得到载体pCDNA3.3-VLambda。将前述scFv单链抗体的重链可变区基因核苷酸序列两端加上Nhe I/Not I位点，插入到pCDNA3.3-IgG4质粒的相应位点中；将前述scFv单链抗体的轻链可变区核苷酸序列两端加上Nhe I/BsiW I位点，插入到pCDNA3.3-VKappa质粒的相应位点中或是利用BamH I/Hind III酶切位点将scFv单链抗体的轻链可变区核苷酸序列插入到pCDNA3.3-VLambda载体中。获得表达所述单克隆抗体的重组质粒，参见表3，其中所有重链都为IgG4(Padlan EA,Mol.Immunol.,1994,31(3):169-217.Anatomy of the antibody molecule)；以BM(PC)作为阳性对照抗体(Patent EP2542256，BRCA69D)。
1.3IgG4单克隆抗体的表达、纯化、鉴定
将上述表3所列的含重链可变区和轻链可变区的重组质粒以及含对照抗体BM(PC)的重链可变区和轻链可变区的重组质粒用ExpiFectamineTM CHO Transfection Kit(Thermo Fisher,cat#A29129)脂质体法瞬时转染悬浮培养的Expi CHO-STM细胞(ThermoFisher,cat#A29127)。
在30ml ExpiCHO Expression培养基(Thermo Fisher,cat#A2910001)中，以37℃，8％CO2，120rpm的转速条件下培养前述获得的转染ExpiCHO-S细胞。
经过10-14天培养的转染细胞，通过二级离心处理(第一级离心条件20min，400g；第二级离心条件20min，10000g)，去除细胞和细胞碎片，得到上清液。将澄清的上清液装载入蛋白A亲和层析柱(GE Healthcare，cat#GE-17-5438-04)，通过三步淋洗(淋洗缓冲液依次为含150mM NaCl,pH 5.0的磷酸盐缓冲液；20mM柠檬酸钠-1M氯化钠pH 5.0；20mM柠檬酸钠pH 5.0的淋洗缓冲液)来去除杂质，然后通过pH 3.0的20mM柠檬酸钠溶液分离捕获目标抗体。最后通过超滤浓缩步骤将目标抗体置换至pH 7.4的1×PBS缓冲液中。
1.4抗体结合活性分析
将纯化出来的5个IgG抗体(13683，13725，14463，14471，14479)利用ELISA的方法检测其与人B7-H3*His标签重组融合蛋白抗原的体外结合活性。该实验使用了一种商购人B7-H3-6*His标签融合蛋白(近岸蛋白，cat#CK62)。将人B7-H3*His标签融合蛋白用包被缓冲液(碳酸盐缓冲液)稀释至浓度1μg/ml，4℃过夜包被至96孔板(CORNING，cat#9018)中。经pH 7.4的1xPBS缓冲液洗涤三次后，用3％的BSA封闭2h。将抗人B7-H3全人源单克隆抗体(13683，13725，14463，14471，14479)用pH 7.4的1xPBS缓冲液从10μg/ml开始进行3倍梯度稀释，与包被抗体在25℃共孵育2h。然后用带HRP标签的抗-hIGFc检测抗体检测所述抗体与人B7-H3-6*His标签融合蛋白抗原的结合。
如图1和表3所示，全人源单克隆抗体13725、14479与人B7-H3-6*His标签融合蛋白抗原亲和力尤为理想，其中13725具有最佳亲和力。
表3、IgG4单克隆抗体与人B7-H3-6*His标签融合蛋白体外结合活性
受试样品 EC50(μg/ml)
13725 0.048
14479 0.079
13683 0.158
14463 0.122
14471 0.150
全人源单克隆抗体13725、14479抗体的CDR区序列如表4。
表4
实施例2、由转染的ExpiCHO-S细胞制备B7-H3单克隆抗体
将含有优选克隆B7-H3的重链和轻链基因的重组质粒用ExpiFectamineTM CHOTransfection Kit(Thermo Fisher,cat#A29129)脂质体法瞬时转染较大规模(200-600ml)悬浮培养的ExpiCHO-S细胞(Thermo Fisher,cat#A29127)，转染，培养，纯化方法如实施例的1.3所述，制备目标抗体。
通过超滤浓缩步骤将目标抗体置换至pH7.4的1×PBS缓冲液中，用以进行后续各项体外和体内活性检测和质量分析实验。
实施例3、瞬时表达、纯化的B7-H3单克隆抗体的纯度分析
本实施例中，通过分子筛液相色谱(SEC-HPLC)分析B7-H3单克隆抗体13725、14479的蛋白纯度。
20μg抗人B7-H3全人源单克隆抗体(浓度调整至1mg/ml)加载到HPLC色谱仪(Agilent Technologies)的色谱柱(TOSOH，型号：TSKgel G3000 SWXL)，流动相为50mM磷酸盐缓冲液，300mM氯化钠，pH 7.0，流速为0.8ml/min，检测波长为280nm。结果如图2和表5。峰值计算使用ChemStation软件进行分析，本发明的抗人B7-H3全人源单克隆抗体13725、14479的主峰百分比＞99.2％、多聚体峰百分比＜1％，纯度高。
表5、B7-H3单克隆抗体的SEC主峰纯度百分比
实施例4、B7-H3单克隆抗体与人B7-H3-His蛋白、人B7-H4-His蛋白、人PD-L1-ECD-mFc蛋白、小鼠B7-H3-His蛋白、小鼠B7-H4-huFc蛋白的结合
4.1、ELISA检测B7-H3单克隆抗体13725，14479与多种蛋白的结合
该实验使用了商购人B7-H3-His蛋白(近岸蛋白，cat#CK62)、人B7-H4-His蛋白(Acro，B74-H5222)、人PD-L1-ECD-mFc蛋白(近岸蛋白，cat#CM06)、小鼠B7-H3-His蛋白(近岸蛋白，cat#CM83)、小鼠B7-H4-huFc蛋白(近岸蛋白，cat#CS04)。将待测蛋白抗原分别用pH7.4的1xPBS包被缓冲液稀释至浓度1μg/ml，4℃过夜包被至96孔板(CORNING，cat#9018)中。经pH 7.4的1xPBS缓冲液洗涤三次后，用5％的脱脂牛奶封闭2h。将待测抗人B7-H3全人源单克隆抗体13725，14479用pH 7.4的1xPBS缓冲液从10μg/ml开始进行3倍梯度稀释，与包被蛋白抗原在25℃共孵育2h。然后用稀释1:4000的带HRP标签的抗-人IgG-Fab检测抗体检测所述抗体与各个蛋白抗原的结合。
检测结果见图3至图7，抗B7-H3全人源单克隆抗体13725、14479与人B7-H3-His蛋白具有高的结合活性，结合的EC50值可见表6，表7。同时发现13725、14479也与小鼠B7-H3-His蛋白结合；而与人B7-H4-His，小鼠B7-H4-huFc，以及人PD-L1-ECD-mFc蛋白几乎不结合。说明13725、14479特异性好。
表6、B7-H3单克隆抗体与人B7-H3-His蛋白的结合活性
受试样品 EC50(μg/ml)
13725 0.059
14479 0.095
表7、B7-H3单克隆抗体与小鼠B7-H3-His蛋白的结合活性
样品ID EC50(μg/ml)
13725 1.238
14479 0.847
4.2、B7-H3单克隆抗体的亲和平衡解离常数KD的检测
B7-H3单克隆抗体与人B7-H3-His蛋白相结合的能力采用Octet Red96生物分子相互作用仪系统(Octet Red96，ForteBio)进行检测，以BM(PC)为阳性对照抗体。抗人IgG Fc(AHC)的动力学级生物传感器(Fortebio，#18-5063)经pH 1.7的甘氨酸预处理后浸泡在测定PBS缓冲液中。抗B7-H3单克隆抗体以10μg/ml的浓度固定到AHC生物传感器。然后将加载了B7-H3单克隆抗体的AHC生物传感器浸入到不同浓度的人B7-H3-His抗原和缓冲液中。分析物柱的最后稀释点只包含检测缓冲液，以测试缓冲液与负载生物传感器之间的非特异性结合。从0到300秒检测到了抗原与抗体结合，随后300到900秒发生解离。用检测缓冲液确定了60秒的基线。抗B7-H3的单克隆抗体的亲和力曲线是以1:1结合的动力学传感单价结合模型拟合的。结合动力学分析如表8所示。
表8、人B7-H3-His蛋白与B7-H3单克隆抗体的亲和力
样品ID KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
BM(PC) 2.60E-11 3.80E+05 9.89E-06
13725 <1.0E-12 1.71E+05 <1.0E-07
14479 1.38E-10 1.89E+05 2.61E-05
根据表8可见，本发明获得的13725与14479克隆的抗体与人B7-H3-His蛋白均具有良好的亲和力，其中13725的亲和力尤为理想，达到了令人意外的低于1.0E-12的KD值。
实施例5、B7-H3单克隆抗体与高表达B7-H3的肿瘤细胞系的结合活性
本实施例进行一项体外结合活性测试(Concentration for 50％of maximalEffect，EC50)，该测试能够说明抗人B7-H3全人源单克隆抗体13725，14479与人高表达B7-H3的肿瘤细胞系有较强的结合。MCF-7是人乳腺癌细胞系，OVCAR-3是人卵巢癌细胞系。两种细胞表面均高表达B7-H3。培养MCF-7，OVCAR-3于96孔板中，细胞铺板密度为106/孔。用1xPBS缓冲液将13725，14479从30μg/ml进行3倍梯度稀释，并将IgG4阴性对照(IgG4 iso)稀释到10μg/ml，与MCF-7，OVCAR-3细胞在37℃共孵育2h。接着用稀释1:200的山羊抗人IgG-Fc-PE标记的抗体(Abcam，cat#ab98596)孵育1h，并利用Guava easyCyte HT流式细胞仪(MERCK MILLIPORE)进行所述抗体与细胞的结合活性分析。结果如图8，图9和表9所示，B7-H3单克隆抗体13725、14479与高表达B7-H3的肿瘤细胞系MCF-7和OVCAR-3均能够高亲和结合，靶向性好、非特异性低。
表9、B7-H3单克隆抗体与MCF-7，OVCAR-3细胞的结合活性
样品ID MCF-7EC50(μg/ml) OVCAR3 EC50(μg/ml)
13725 0.20 0.17
14479 1.41 1.45
IgG4 iso No Binding No Binding
实施例6、B7-H3单克隆抗体与胰岛素的结合活性
本实施例进行一项体外结合活性测试，测试抗人B7-H3全人源单克隆抗体13725，14479与人胰岛素(Insulin)的结合活性，并与已上市产品Hercepin，Rituxan比较，分析B7-H3全人源单克隆抗体在临床应用时的潜在的非特异性结合。
该实验首先将人胰岛素(Sigma,cat.I2643)用pH 7.4的1xPBS包被缓冲液稀释至浓度10μg/ml，4℃过夜包被至96孔板(CORNING，cat#9018)中。经pH 7.4的1xPBS缓冲液洗涤三次后，用5％的脱脂牛奶封闭2h。将待测抗人B7-H3全人源单克隆抗体13725，14479，Herceptin以及Rituxan用pH 7.4的1xPBS缓冲液从10μg/ml开始进行3倍梯度稀释，与包被Insulin在25℃共孵育2h。然后用羊抗-人IgG-HRP检测抗体(1:5000)检测所述抗体与Insulin的结合，计算样品各个浓度点的OD450检测信号相对于PBS的OD450检测信号的倍数作为分数(Score)值，4参数拟合量效关系曲线。检测结果见图10，抗B7-H3全人源单克隆抗体13725，14479对人胰岛素蛋白的结合能力与Herceptin，Rituxan对人胰岛素蛋白的结合能力相当，EC50值可见表10。
表10、B7-H3单克隆抗体与人胰岛素的结合活性
实施例7、B7-H3单克隆抗体与DNA的结合活性
本实施例进行一项体外结合活性测试，测试抗人B7-H3全人源单克隆抗体13725，14479与鲑鱼DNA的结合活性，并与已上市产品Hercepin，Rituxan比较，分析B7-H3全人源单克隆抗体在临床应用时的潜在的非特异性结合。
该实验首先将鲑鱼DNA(Sigma,cat.D1626)用pH 7.4的1xPBS包被缓冲液稀释至浓度10μg/ml，4℃过夜包被至96孔板(CORNING，cat#9018)中。经pH 7.4的1xPBS缓冲液洗涤三次后，用5％的脱脂牛奶封闭2h。将待测抗人B7-H3全人源单克隆抗体13725，14479，Herceptin以及Rituxan用pH 7.4的1xPBS缓冲液从10μg/ml开始进行3倍梯度稀释，与包被DNA在25℃共孵育2h。然后用羊抗-人IgG-HRP检测抗体(1:5000)检测所述抗体与DNA的结合，计算样品各个浓度点的OD450检测信号相对于PBS的OD450检测信号的倍数作为分数(Score)值，4参数拟合量效关系曲线。检测结果见图11，抗B7-H3全人源单克隆抗体13725，14479对鲑鱼DNA的结合能力与Herceptin，Rituxan对鲑鱼DNA的结合能力相当，EC50值可见表11。
表11、B7-H3单克隆抗体与DNA的结合活性
样品ID 人胰岛素EC50(μg/ml)
13725 0.410
14479 0.369
Herceptin 0.190
Rituxan 0.402
实施例8、B7-H3抗体DSF热稳定性分析
本实施例对人源化抗B7-H3单克隆抗体13725，14479进行DSF检测，考察热稳定性。将抗B7-H3单克隆抗体与荧光基团SYPRO Orange 5000×(Thermo，cat.S6650)利用PBS稀释混合在PCR八联管中，混合体系20μl/管，其中抗体终浓度0.2mg/ml，SYPRO Orange的终浓度是5×。接着将PCR八联管至于荧光PCR仪ABI 7500，采取连续模式进行溶解曲线实验。扫描温度25-99℃，25℃平衡5min，升温速率为1％，在升温过程中采集数据，报告基团ROX，淬灭基团选择None。
检测结果见表12，人源化抗B7-H3单克隆抗体13725，14479具有高的Tm值，热稳定性较好。
表12、B7-H3单克隆抗体热稳定性(DSF)分析结果
样品ID Tm(℃)
13725 72.2
14479 61.0
实施例9、B7-H3单克隆抗体的ADCC体外杀伤活性实验
本实施例对人源化抗B7-H3单克隆抗体13725，14479以及阳性对照抗体BM(PC)进行ADCC活性检测。靶细胞是人乳腺癌细胞系MCF-7，效应细胞是人PBMC。实验过程描述如下，将人PBMC(澳赛尔斯,cat#PB-003F-S)悬液用RPMI 1640分析培养基稀释至1×107cells/mL，并以50μl/孔加入96孔板中，将抗B7-H3单克隆抗体用RPMI 1640分析培养基稀释至5μg/mL，作为第1个浓度点S01，从S01开始进行3倍梯度稀释一共得到10个浓度点S01～S10，并以50μl/孔加入含有PBMC的孔中，同时将MCF-7细胞悬液用RPMI 1640培养基稀释至2×105cells/mL，50μl/孔加入含有单克隆抗体以及PBMC的孔中。单克隆抗体、效应细胞以及靶细胞添加混合完成后将96孔板置于37℃，5％ CO2的恒温培养箱中培养5～6h。利用LDH显色试剂盒(Promega，Cytotoxicity Assay(Non-Radioactive)，cat.G1780)进行显色，并计算各个加样孔的靶细胞杀伤率。根据加样单克隆抗体浓度和对应靶细胞杀伤率的量效关系用GraphPad Prism进行4-参数拟合非线性回归，分析B7-H3单克隆抗体的ADCC活性。
检测结果见图12以及表13，人源化抗B7-H3单克隆抗体13725，14479具有强的ADCC活性，其中13725尤为理想。
表13、B7-H3单克隆抗体ADCC分析结果
样品ID EC50(ng/ml)
BM(PC) 11.43
13725 6.99
14479 16.59
实施例10、B7-H3单克隆抗体体内抑制肿瘤细胞生长的功效
为了测试B7-H3全人源单克隆抗体13725、14479在体内抑制肿瘤细胞生长的功效，使用SCID小鼠在第0天各自皮下注射植入约1×106个人乳腺癌MDA-MB-231细胞，在肿瘤长至均值为50～100(mm3)左右时开始分组给药，连续三周每周给药两次，从给药开始连续三至四周观察测量肿瘤体积均值。动物分为3组(n＝6)：(1)IgG4 iso阴性对照，10mg/kg，BIWx3，ip；(2)13725单克隆抗体，10mg/kg，BIWx3，ip；(3)14479单克隆抗体，10mg/kg，BIWx3，ip。
结果如表14和图13所示，B7-H3人源化单克隆抗体13725，14479以及BM(PC)阳性对照均能够有效抑制肿瘤生长，平均肿瘤生长抑制率的计算是Ti或者Vi表示在某一特定时间点处理组或者对照组平均肿瘤体积；T0或V0表示分组后给药前处理组或者对照组平均肿瘤体积)，单克隆抗体13725、14479的肿瘤生长抑制效果均较为理想；其中13725最强，平均肿瘤生长抑制率为41.48％。
表14、荷瘤模型体内B7-H3抗体的肿瘤抑制效果
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (17)

1.结合免疫调节分子B7-H3的抗体，其具有显著改善的抑制免疫调节分子B7-H3与其受体分子的结合的作用。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，该抗体具有轻链可变区和重链可变区，其中，重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO:16所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO:18所示；或
重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO:22所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO:24所示。
3.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列；或，
所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ IDNO:6所示氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区：
其重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；或，
其重链可变区具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；或，
其重链可变区具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
5.如权利要求1-4任一所述的抗体，其特征在于，所述抗体包括：单克隆抗体、人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体；或
所述抗体包括：Fab、Fab’-SH、Fv、Fd、scFv或(Fab’)2片段；或
所述抗体为IgG抗体。
6.一种分离的多核苷酸或含有该多核苷酸的构建体，所述多核苷酸编码权利要求1-5任一所述的结合免疫调节分子B7-H3的抗体；较佳地，所述的构建体为表达载体。
7.一种抗体表达系统，所述表达系统含有权利要求6中所述的构建体或基因组中整合有外源的权利要求6中所述的多核苷酸；较佳地所述表达系统为细胞。
8.一种制备权利要求1-5任一所述的抗体的方法，包括：在适合表达所述抗体的条件下，利用权利要求7所述的抗体表达系统进行表达，从而表达出所述的抗体；较佳地，还包括纯化分离出所述抗体。
9.权利要求1-5任一所述的抗体的用途，用于：
制备特异性靶向表达免疫调节分子B7-H3的细胞的抗肿瘤药物，所述药物通过刺激抗原特异性免疫细胞应答抑制肿瘤；
制备抗体药物偶联物或免疫缀合物；
制备双功能或多功能抗体；
制备嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
10.一种融合蛋白或免疫缀合物，其包括权利要求1-5任一所述的抗体，以及与之操作性连接的功能性分子。
11.如权利要求10所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述功能性分子包括：抑制肿瘤的分子，靶向肿瘤表面标志物的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物，细胞毒素，放射性同位素，生物活性蛋白质，融合伴侣，基于嵌合抗原受体技术的胞外铰链区、跨膜区及胞内信号区，或其组合。
12.如权利要求11所述的免疫缀合物，其特征在于，所述靶向免疫细胞的表面标志物的分子是结合免疫细胞表面标志物的抗体或配体；或
所述的抑制肿瘤的分子是抗肿瘤毒素或抗肿瘤细胞因子；或
所述靶向肿瘤表面标志物的分子是结合肿瘤表面标志物的抗体或配体；或
所述的融合伴侣包括：具有延长体内半衰期作用的蛋白或活性结构域。
13.如权利要求12所述的免疫缀合物，其特征在于，所述结合免疫细胞表面标志物的抗体结合的抗原包括：CD3、CD20、FcRH5、HER2、LYPD1、LY6G6D、PMEL17、LY6E、CD19、CD33、CD22、CD79A、CD79B、EDAR、GFRA1、MRP4、RET、Steap1或TenB2；或
所述结合肿瘤表面标志物的抗体是识别免疫调节分子B7-H3以外的其它抗原的抗体，所述的其它抗原包括：EGFR，EGFRvIII，mesothelin，HER2，EphA2，cMet，EpCAM，MUC1，MUC16，CEA，Claudin 18.2，Claudin 6，WT1，NY-ESO-1，MAGE 3，CD47，ASGPR1或CDH16；或
所述的抗肿瘤细胞因子包括：IL-2、IL-12、IL-15、IFN-beta、TNF-alpha；或
所述抗肿瘤毒素包括：美登素，奥利司他汀，单甲基澳瑞他汀，美登木素生物碱，多拉司他汀，卡奇霉素，氨甲蝶呤，长春地辛，紫杉烷如多烯紫杉醇、紫杉醇、拉洛紫杉醇、特西紫杉醇或欧塔紫杉醇，单端孢霉毒素，CC1065，DXd，Duocarmycin，Calicheamicin，Pyrrolobenzodiazepines或SN-38；或
所述具有延长体内半衰期作用的蛋白或活性结构域包括：免疫球蛋白Fc区、优选人免疫球蛋白Fc区，血清白蛋白或其片段。
14.一种药物组合物，包括权利要求1-5任一所述的抗体、权利要求9-13任一所述的融合蛋白或免疫缀合物；较佳地，所述的药物组合物中还包括药学上可接受的载体。
15.权利要求1-5任一所述的抗体、权利要求9-13任一所述的融合蛋白或免疫缀合物、或含有它们的药物组合物在制备用于抑制肿瘤或刺激抗原特异性免疫细胞应答的制剂、试剂盒或药盒中的用途。
16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括实体瘤；较佳地，所述肿瘤包括表达免疫调节分子B7-H3的肿瘤；较佳地，所述肿瘤包括：卵巢癌，乳腺癌，中枢神经肿瘤，头颈部肿瘤，膀胱癌，直肠癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，肾脏肿瘤。
17.一种试剂盒或药盒，包括权利要求1-5任一所述的抗体、权利要求9-13任一所述的融合蛋白或免疫缀合物、或含有它们的药物组合物。
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