JP2022537072A - ヒト化抗vegf fab抗体断片及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
別段の記載がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されている意味を有する。本発明の目的では、以下の用語は、当技術分野において一般に理解される意味と一貫するように定義されている。
本発明は、組換えヒトVEGF165タンパク質を使用してウサギを免疫化し、次いで、ファージディスプレイライブラリースクリーニングによって、組換えヒトVEGF165タンパク質に特異的に結合する抗体クローンVEGF165-R988を得た。VEGF165-R988 scFv抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を次いで、ウサギIgG1重鎖定常領域又はウサギカッパ軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列を有するpSTEP2ベクターに、PCRによって挿入し、そして、培養して発現させた。高純度の抗体が、タンパク質A精製カラムを使用して精製された。ELISAは、ウサギ抗体VEGF165-R988がVEGFR2タンパク質へのVEGF165タンパク質の結合を効果的に阻害し得ること、及びVEGF165-R988がVEGF165のHUVEC増殖促進能力を効果的に中和し得ることを示した。
本発明はまた、本発明の抗体又はその一部分をコードする核酸分子にも関する。これらの核酸分子の配列には、限定はしないが、配列番号2~3、4~7、16~17、20~21、41~49、及び52~53が含まれる。
本発明はまた、本発明の1つ又は複数のヌクレオチド配列を含む組換え構築物も提供する。本発明の組換え構築物は、本発明の抗体をコードする核酸分子をプラスミド、ファージミド、ファージ、又はウイルスベクター等のベクターに挿入することによって構築される。
所望の抗体をコードする構造的DNA配列を、適切な翻訳開始シグナル及び翻訳終結シグナル及び機能的プロモーターと共に、作動可能なリーディングフレームに挿入することによって、細菌において使用するための発現ベクターが構築される。ベクターは、1つ又は複数の表現型選択マーカー、及び、ベクターの維持を確実にし、必要に応じて宿主内で増殖させるための、複製起点を有する。形質転換のための適切な原核生物宿主としては、大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、並びにシュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、及びスタフィロコッカス属(Staphylococcus)の複数の種が含まれる。
哺乳動物宿主細胞における発現のための好ましい調節配列としては、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)に由来するプロモーター及び/又はエンハンサー(例えば、CMVプロモーター/エンハンサー)、シミアンウイルス40(SV40)のプロモーター及び/又はエンハンサー(例えば、SV40プロモーター/エンハンサー)、アデノウイルスのプロモーター及び/又はエンハンサー(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))、並びにポリオーマウイルスのプロモーター及び/又はエンハンサーが含まれる。ウイルス調節エレメント及びこれらの配列のさらなる記載については、例えば、Stinskiによる米国特許第5,168,062号、Bellらによる米国特許第4,510,245号、及びSchaffnerらによる米国特許第4,968,615号を参照されたい。組換え発現ベクターはまた、複製起点及び選択マーカー(例えば、Axelらによる米国特許第4,399,216号、米国特許第4,634,665号、及び米国特許第5,179,017号を参照されたい)も含む。適切な選択マーカーは、G418、ハイグロマイシン、又はメトトレキサート等の薬物に対する耐性をベクターが導入されている宿主細胞に付与する遺伝子を含む。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子はメトトレキサートに対する耐性を付与し、一方、neo遺伝子はG418に対する耐性を付与する。
本発明のヒト化抗体VEGF-H988 Fabの特徴解析及び機能解析を行った。解析は、本発明の抗体が以下の利点を有することを示した:
(1)VEGF-H988 FabのVEGF165タンパク質への結合能力は、ルセンティスのそれに類似している、
(2)VEGF-H988 FabのVEGF165タンパク質への結合親和性は、ルセンティスのそれよりも良好であり、ルセンティスの約3.75倍である、
(3)VEGF165-H988 Fabは、組換えヒトVEGF165タンパク質に特異的に結合し、組換えマウスmVEGF164タンパク質とは交差結合しない、
(4)VEGF165-H988 Fabは、VEGF165タンパク質へのVEGFR2タンパク質の結合を効果的に阻害し得、その阻害能力はルセンティスよりも明らかに良好である、
(5)VEGF-H988 Fabの中和活性は異なる濃度の組換えヒトVEGF165でルセンティスよりも強力であり、その中和活性は高濃度のVEGF165でEYLEAよりも強力であり、その中和活性は異なる濃度のVEGF165でベバシズマブ及びブロルシズマブよりも強力であるが、コンベルセプトの活性と同等である。
本発明の抗体は、限定はしないが、高齢性黄斑変性(AMD)、糖尿病黄斑浮腫(DME)、網膜浮腫、変性近視、及び脈絡膜新生血管(CNV)の発生を含む、脈絡膜新生血管を特徴とする眼の疾患を含む、血管新生に関連する疾患を治療するために使用することができる。
本発明の抗体は、本発明の抗体及び1つ又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤を含む医薬組成物を形成するために、少なくとも1つの他の作用剤(例えば、安定な化合物)と共に調製することができる。場合によって、医薬組成物は、さらなる治療剤を含有し得る。
本発明はまた、前述の本発明の医薬組成物を含有する1つ又は複数の容器を含む薬学的パッケージ及びキットにも関する。このような容器には、医薬品又は生物製剤の製造、使用、又は販売を管理している政府機関によって規定された形態の仕様書が添付されていてよく、これは、前記医薬品又は生物製剤を製造、使用、又は販売している上記機関によるヒト投与についての承認を反映している。
本発明の医薬組成物は、当技術分野において公知の様式で、例えば、従来の混合方法、溶解方法、造粒方法、トローチ調製方法、製粉方法、乳化方法、カプセル化方法、包埋方法、又は凍結乾燥方法によって調製することができる。
上記の本発明の抗体を含む医薬組成物はまた、抗新生物剤等の1つ又は複数の他の治療剤と組み合わされ、この場合、得られた組み合わせ物は、許容できない副作用を生じさせない。
抗体ファージディスプレイライブラリーを使用する、VEGFR2へのVEGF165の結合を遮断するウサギ抗体のスクリーニング
1.1 ウサギの免疫化
組換えヒトVEGF165タンパク質(Sino Biological, Inc社から入手、カタログ番号11066-HNAH)を使用して、ウサギを免疫化した。ヒトVEGF165タンパク質の細胞外領域Met1~Arg191のアミノ酸配列(UniProt P15692-4)は、配列番号1である。
TriPure単離試薬(Roche社から入手、カタログ番号11 667 165 001)を使用してRNAをウサギ脾臓組織から抽出し、逆転写キット(Invitrogen社から入手、カタログ番号18080-051)を使用してRNAを逆転写することによってcDNAを得た。ウサギ抗体の軽鎖可変領域の配列を増幅するために10対のプライマーを設計し、重鎖可変領域の配列を増幅するために4対のプライマーを設計した(Barbas C Fら、CSHL Press. 2004)。伸長PCRをオーバーラップさせることによって、ウサギ抗体の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする配列を、scFvをコードするヌクレオチド配列にアセンブルし、以下のリンカーによって軽鎖及び重鎖可変領域を連結させた(Jones S Tら、Bio/technology. 1991、9(1): 88)。
TCTAGTGGTGGCGGTGGTTCGGGCGGTGGTGGAGGTGGTAGTTCTAGATCTTCC(SSGGGGSGGGGGGSSRSS)(配列番号2)、
VEGF165-R988 scFv抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列をPCR増幅し、Sca I+Kpn I(Fermentas社)で消化した、重鎖シグナルペプチド(配列番号43)及びウサギ重鎖IgG1定常領域(配列番号6)をコードするヌクレオチド配列を有するpSTEP2ベクターに、in-fusion方法によって挿入し、こうして、重鎖(配列番号52)を発現するベクターを得た。VEGF165-R988 scFv抗体の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列をPCR増幅し、Sca I+BamH I(Fermentas社)で消化した、軽鎖シグナルペプチド(配列番号44)及びウサギカッパ軽鎖定常領域(配列番号7)をコードするヌクレオチド配列を有するpSTEP2ベクターに、in-fusion方法によって挿入し、こうして、軽鎖(配列番号53)を発現するベクターを得た。組換えプラスミドを抽出し、HEK-293細胞にトランスフェクトし、発現のために7日間培養し、そして、培養上清をタンパク質A精製カラムによって精製して、高純度の抗体を得た。
1.4.1 ウサギ抗体は、VEGFR2-hisへのVEGF165の結合を遮断する
1μg/mLの濃度のVEGF165タンパク質(SinoBiological, Inc.社から入手した)を、100μL/ウェルで一晩、4℃で、96ウェルプレートに被覆した。翌日、プレートを洗浄し、室温で1時間遮断させた。5μg/mLのVEGFR2-ビオチンタンパク質(SinoBiological, Inc.社から入手した)100μL、及び異なる濃度の抗体VEGF-R988を添加し、共インキュベートした。プレートを洗浄して未結合の抗体を除去し、ストレプトアビジン/HRP(Beijing ZSGB-Bio Co., Ltd.社から入手した)とインキュベートし、次いで、繰り返し洗浄し、そして、色素生成性基質溶液を添加して発色させた。発色が止まった後、OD450を測定した。VEGF165を標的化するウサギ抗体の濃度を水平座標として取り、阻害率PI%を垂直座標として取って、graphPad Prism 6.0ソフトウェアをデータ解析及び曲線チャートの作成に使用した。阻害率(%)=(ODブランク-ODサンプル)/ODブランク×100%であり、式中、ODブランクは、VEGFR2-ビオチンのみが添加され、ウサギ抗体は添加されていないウェルのOD値を指し、ODサンプルは、VEGFR2-ビオチン及びウサギ抗体の両方が添加されたウェルのOD値を指す。
前記ウサギ抗体の、VEGF165によって誘導される臍帯静脈内皮細胞増殖の中和効果を、WST-8法を使用して検出した。ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECを、4×103個細胞/ウェルで96ウェルプレートに接種し、10%FBS及び5%L-Glnを含有するM199培地中で4時間培養し、次いで、異なる濃度の抗体VEGF-R988を50μL/ウェルで添加し、次いで、最終濃度10ng/mLのVEGF-165を10μL/ウェルで添加し、96ウェルプレートを、37℃、5%CO2の細胞インキュベーターで3日間インキュベートし、そしてブランクウェルB(細胞なし)、ネガティブコントロールM(細胞接種あり、抗体サンプルなし、VEGF-165の添加あり)、並びにM'(細胞接種あり、抗体サンプルなし、及びVEGF-165なし)を使用した。インキュベーション後、10μL/ウェルのWST-8色素生成溶液を添加し、96ウェルプレートをCO2インキュベーターでインキュベートして発色させ、発色が止まった後、OD450及びOD630をマイクロプレートリーダーで測定した。読み取り値は(OD450-OD630)であり、各群のOD値をその群の読み取り値マイナスブランクウェルBの読み取り値として定義して抗体の中和率を計算し、中和率%=(ネガティブコントロールMのOD値-サンプルのOD値)/(ネガティブコントロールMのOD値-M'のOD値)×100%であった。標準曲線を、抗体サンプル濃度を水平座標として取り、中和率を垂直座標として取って、統計ソフトウェアGraphPad Prismの自動解析機能を使用して計算し、4パラメータロジスティック回帰方程式を使用して、標準的な「S」曲線を当てはめて、抗体サンプルの半数効果濃度(EC50)を計算した。
ウサギ抗体VEGF-R988のヒト化、修飾、及びそのFab断片の産生
2.1 ウサギ抗体VEGF-R988の軽鎖及び重鎖のCDRの決定
実施例1.2で決定されたVEGF-R988 scFv抗体のヌクレオチド配列に基づいて、VEGF-R988 scFvの重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を推定した。配列番号8/9を参照されたい。
ウサギ抗体のヒト化を、CDR移植の従来のヒト化方法を使用して行った。その配列がウサギ軽鎖又は重鎖可変領域の配列に近い、ヒト抗体の軽鎖又は重鎖可変領域を、鋳型として選択し、ウサギ軽鎖又は重鎖の3つのCDR(Table 1(表3))の各々をヒト抗体の可変領域に挿入して、ヒト化軽鎖可変領域(VL)又はヒト化重鎖可変領域(VH)配列をそれぞれ得た。VEGF-R988の軽鎖可変領域のヒト鋳型は、VEGF-R988の軽鎖に65.30%相同なIGKV1-27*01であり、重鎖可変領域のヒト鋳型は、VEGF-R988の重鎖に53.20%相同なIGHV4-4*08である。
ウサギ由来のフレームワーク領域内の一部の重要なアミノ酸はCDR活性の維持に必須であるため、これら重要なアミノ酸を、対応するウサギ抗体アミノ酸配列に復帰突然変異させ、以下の部位を復帰突然変異させた: 軽鎖では、1位をEに復帰突然変異させ、2位をLに復帰突然変異させ、4位をLに復帰突然変異させ、そして63位をKに復帰突然変異させた。一方、重鎖では、3位をVに復帰突然変異させ、37位をVに復帰突然変異させ、47位をYに復帰突然変異させ、78位をVに復帰突然変異させ、79位をDに復帰突然変異させ、そして91位をFに復帰突然変異させた。全ての上記の部位は、Kabatのナンバリングスキームを参照することによってナンバリングした。ヒト化抗体VEGF-H988-10を、CDRヒト化移植及びフレームワーク領域の復帰突然変異によって得た。
VEGF-H988-10の重鎖可変領域(配列番号20)を全遺伝子合成方法によって得、次いで、Sca I+Nhe I(Fermentas社)で消化した、重鎖シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列(配列番号43)及びヒトIgG1定常領域をコードするヌクレオチド配列(配列番号47)を有するpSTEP2ベクターに、in-fusion方法によって挿入して、VEGF-H988-10重鎖(配列番号16)を発現するベクターを得た。VEGF-H988-10の軽鎖可変領域(配列番号21)を全遺伝子合成方法によって得、次いで、Sca I+BsiW I(Fermentas社)で消化した、軽鎖シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列(配列番号44)及びヒトカッパ定常領域をコードするヌクレオチド配列(配列番号48)を有するpSTEP2ベクターに、in-fusion方法によって挿入して、VEGF-H988-10軽鎖(配列番号17)を発現するベクターを得た。プラスミドを抽出し、HEK-293細胞にトランスフェクトし、細胞を7日間培養した。培養上清をタンパク質A精製カラムで精製して、高純度の抗体を得た。
順に結合された、軽鎖シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列(配列番号44)、ヒト化抗体軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列(配列番号46)、及びヒト抗体カッパ軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列(配列番号48)を有する、前述のVEGF-H988 Fab軽鎖及びシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列(配列番号42)をPCR増幅し、自社開発のpGSベクター(Kpn I+Xba I)にin-fusion方法によって挿入し、正確なプラスミドをシーケンシングによって確認した。順に結合された、重鎖シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列(配列番号43)、ヒト化抗体重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列(配列番号45)、及びヒトIgG1重鎖CH1定常領域をコードするヌクレオチド配列(配列番号49)を有する、VEGF-H988 Fab重鎖及びシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列(配列番号41)をPCR増幅し、軽鎖を正確に有することが確認されているpGSベクター(Nhe I+Not I)に、in-fusion方法によって挿入し、VEGF-R988 Fabの軽鎖及び重鎖の両方を発現する正確なベクターを、シーケンシングによって確認した。これら発現ベクターは、選択マーカーとしてのGS遺伝子、並びに抗体軽鎖及び重鎖の発現エレメントを有する、真核性の発現ベクターである。これら発現ベクターをCHO-K1-GS-欠損細胞にトランスフェクトし、VEGF-H988 Fab高発現細胞系をMSXスクリーニングによって得た。抗体発現が高いクローンをELISAアッセイによって選択し、高発現細胞系を、細胞の増殖状態及び抗体薬のための重要な質的特徴の両方を考慮することによって選択した。無血清懸濁液培養を使用して、VEGF-H988 Fabを産生するCHO細胞系を培養して、純度及び質の高いVEGF-H988 Fab断片を得た。
ヒト化VEGF-H988 Fab断片の特徴解析
3.1 VEGF165へのVEGF-H988 Fab断片の結合の特徴解析
3.1.1 VEGF-H988 Fab断片はVEGF165に特異的に結合する
異なる濃度の(0.15ng/mL、0.46ng/mL、1.37ng/mL、4.12ng/mL、12.35ng/mL、37.04ng/mL、111.11ng/mL、333.33ng/mL、1000ng/mL、及び3000ng/mL)組換えヒトVEGF165タンパク質(SinoBiological, Inc.社から入手した)を、100μL/ウェルで一晩、4℃で、96ウェルプレートに被覆した。翌日、プレートを洗浄し、室温で1時間遮断させた。1μg/mLのVEGF165-H988 Fab断片、ルセンティス(Norvatis社から入手した)、又はネガティブコントロールH7N9-R1 Fab断片(Sino Biological, Inc.社から入手した)100μLとそれぞれインキュベートした後、プレートを洗浄して未結合の抗体を除去し、次いで、ヤギF(ab')2抗ヒトIgG F(ab')2/HRP(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.社から入手した)とインキュベートし、繰り返し洗浄し、そして、色素生成性基質溶液を添加して発色させた。発色が止まった後、OD450を測定した。組換えヒトVEGF165タンパク質の濃度を水平座標として取り、OD450値を垂直座標として取って、graphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用して「S」曲線チャートを当てはめ、組換えヒトVEGF165タンパク質への抗体断片の結合を解析した。
VEGF165-H988 Fab断片及びルセンティスの親和性を、ストレプトアビジンで被覆されたセンサー及び固定されたビオチン標識VEGF165タンパク質を使用して、複数の濃度で測定した。
組換えヒトVEGF165タンパク質又は組換えマウスmVEGF164タンパク質(Sino Biological, Inc.社から入手した)を0.1μg/mL、1μg/mL、及び10μg/mLまでそれぞれ希釈し、100μL/ウェルで一晩、4℃で、96ウェルプレートに被覆した。翌日、プレートを洗浄し、室温で1時間遮断させた。100μLのVEGF165-H988 Fab断片、ルセンティス又はネガティブコントロールH7N9-R-Fabを2μg/mLの濃度でそれぞれ添加し、そして1時間インキュベートした。プレートを洗浄して未結合の抗体を除去した。プレートをヤギF(ab')2抗ヒトIgG F(ab')2/HRP(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.社)とインキュベートし、次いで、繰り返し洗浄し、そして色素生成性基質溶液を添加して発色させた。発色が止まった後、OD450を測定した。タンパク質濃度を水平座標として取り、OD450値を垂直座標として取って、graphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用して棒チャートを作成した。
1μg/mLの濃度のVEGF165タンパク質を、100μL/ウェルで一晩、4℃で、96ウェルプレートに被覆した。翌日、プレートを洗浄し、室温で1時間遮断させた。2μg/mLのVEGFR2-hisタンパク質(SinoBiological, Inc.社から入手した)100μLを各ウェルに添加し、異なる濃度のヒト化VEGF-H988 Fab断片、ルセンティス、又はネガティブコントロールH7N9-R1-Fab(SinoBiological, Inc.社から入手した)をそれぞれ添加し、そして共インキュベートした。プレートを洗浄して未結合の抗体を除去した。プレートをC-his-R023/HRPとインキュベートし、次いで繰り返し洗浄し、そして、色素生成性基質溶液を添加して発色させた。発色が止まった後、OD450を測定し、各群について2回ずつ試験した。抗体の濃度を水平座標として取り、阻害率PI%を垂直座標として取って、graphPad Prism 6.0ソフトウェアをデータ解析及び曲線チャートの作成に使用して、IC50値を計算した。阻害率(%)=(ODブランク-ODサンプル)/ODブランク×100%であり、式中、ODブランクは、VEGFR2-hisのみが添加され、ヒト抗体は添加されていないウェルのOD値を指し、ODサンプルは、VEGFR2-his及びヒト化抗体の両方が添加されたウェルのOD値を指す。
ヒト化Fab断片の、VEGF165によって誘導されるHUVEC細胞増殖の中和効果を、WST-8法を使用することによって検出した。HUVEC細胞を、4×103個細胞/ウェルで96ウェルプレートに接種し、10%FBS及び5%L-Glnを含有するM199培地中で4時間培養し、次いで、異なる濃度のヒト化Fab断片を50μL/ウェルで添加し、次いで、最終濃度1000ng/mL、100ng/mL、又は10ng/mLのVEGF-165を10μL/ウェルで添加し、96ウェルプレートを、37℃、5%CO2の細胞インキュベーターで3日間インキュベートし、ブランクウェルB(細胞なし)、ネガティブコントロールM(細胞接種あり、抗体サンプルの添加なし、VEGF-165の添加あり)、及びM'コントロール(細胞接種あり、抗体サンプルの添加なし、及びVEGF-165の添加なし)を使用した。インキュベーション後、10μL/ウェルのWST-8色素生成溶液を添加し、96ウェルプレートをCO2インキュベーターでインキュベートして発色させ、発色が安定化した後、OD450及びOD630をマイクロプレートリーダーで測定した。読み取り値は(OD450-OD630)であり、各群のOD値をその群の読み取り値マイナスブランクウェルBの読み取り値として定義して抗体の中和率を計算し、中和率%=(ネガティブコントロールMのOD値-サンプルのOD値)/(ネガティブコントロールMのOD値-M'のOD値)×100%であった。標準曲線を、抗体サンプル濃度を水平座標として取り、中和率を垂直座標として取って、統計ソフトウェアGraphPad Prismの自動解析機能を使用して計算し、4パラメータロジスティック回帰方程式を使用して、標準的な「S」曲線を当てはめて、抗体サンプルの半数効果濃度(EC50)を計算した。
Claims (25)
- 配列番号27で示されるアミノ酸配列を有する重鎖CDR1領域、及び配列番号28で示されるアミノ酸配列を有する重鎖CDR2領域、及び配列番号29で示されるアミノ酸配列を有する重鎖CDR3領域を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号24で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1領域、配列番号25で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2領域、及び配列番号26で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3領域を有する軽鎖可変領域
を含む、単離された抗VEGF抗体のFab断片。 - 配列番号36で示されるアミノ酸配列又は配列番号36に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号37で示されるアミノ酸配列又は配列番号37に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、請求項1に記載の抗VEGF抗
体のFab断片。 - 重鎖定常領域CH1及び軽鎖定常領域を更に含むFab断片であり、好ましくは、重鎖定常領域CH1が、配列番号40で示されるアミノ酸配列又は配列番号40に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するIgG1重鎖定常領域であり、且つ/或いは軽鎖定常領域が、配列番号39で示されるアミノ酸配列又は配列番号39に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域である、請求項1又は2に記載の抗VEGF抗体のFab断片。
- 重鎖シグナルペプチド及び軽鎖シグナルペプチドを更に含み、好ましくは、前記重鎖シグナルペプチドが、配列番号34で示されるアミノ酸配列又は配列番号34に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ/或いは前記軽鎖シグナルペプチドが、配列番号35で示されるアミノ酸配列又は配列番号35に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列である、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗VEGF抗体のFab断片。
- IgG抗体に関連するFab抗体断片、好ましくは、IgG1抗体に関連するFab抗体断片である、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗VEGF抗体のFab断片。
- モノクローナルである、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗VEGF抗体のFab断片。
- 組換えヒトVEG165タンパク質に対する前記抗VEGF抗体又はその抗原結合断片の結合親和性KDが、0.01-8E-10M、好ましくは0.1-5E-10M、及び更に好ましくは0.5-3E-10M、最も好ましくは1.54E-10Mである、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗VEGF抗体のFab断片。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の抗VEGF抗体のFab断片及びさらなる治療剤を含む、抗体-薬剤コンジュゲートであって、好ましくは前記抗VEGF抗体のFab断片がリンカーを介してさらなる治療剤と結合している、抗体-薬剤コンジュゲート。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の抗VEGF抗体のFab断片をコードする核酸。
- 配列番号45で示されるヌクレオチド配列及び/又は配列番号46で示されるヌクレオチド配列を含み、好ましくは、配列番号49で示されるヌクレオチド配列及び/又は配列番号48で示されるヌクレオチド配列を更に含み、更に好ましくは、配列番号41で示されるヌクレオチド配列及び/又は配列番号42で示されるヌクレオチド配列を含む、請求項9に記載の核酸。
- 請求項9又は10に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項9若しくは10に記載の核酸又は請求項11に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 請求項12に記載の宿主細胞をFab抗体断片の発現に適した条件下で培養する工程、及び発現したFab抗体断片を培養培地から採取する工程を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗VEGF抗体のFab断片を産生するための方法。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の抗VEGF抗体のFab断片、又は請求項8に記載の抗体-薬剤コンジュゲート、又は請求項9若しくは10に記載の核酸、又は請求項11に記載の発現ベクター、及び薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
- 血管新生に関連する疾患の治療における、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗VEGF抗体のFab断片、又は請求項8に記載の抗体-薬剤コンジュゲート、又は請求項14に記載の医薬組成物の使用。
- 血管新生に関連する前記疾患が眼の疾患である、請求項15に記載の抗VEGF抗体のFab断片又は抗体-薬剤コンジュゲート又は医薬組成物の使用。
- 前記眼の疾患が、高齢性黄斑変性(AMD)、糖尿病黄斑浮腫(DME)、網膜浮腫、変性近視、脈絡膜新生血管(CNV)を含む、脈絡膜新生血管を特徴とする、請求項16に記載の抗VEGF抗体のFab断片又は抗体-薬剤コンジュゲート又は医薬組成物の使用。
- 必要とする対象に、治療有効量の請求項1から7のいずれか一項に記載の抗VEGF抗体のFab断片、又は請求項8に記載の抗体-薬剤コンジュゲート、又は請求項14に記載の医薬組成物を投与し、これによって血管新生に関連する疾患を治療する工程を含む、血管新生に関連する疾患を治療するための方法。
- 血管新生に関連する前記疾患が眼の疾患である、請求項18に記載の方法。
- 前記眼の疾患が、高齢性黄斑変性(AMD)、糖尿病黄斑浮腫(DME)、網膜浮腫、変性近視、脈絡膜新生血管(CNV)を含む、脈絡膜新生血管を特徴とする、請求項19に記載の方法。
- 血管新生に関連する疾患の治療のための医薬の調製における、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗VEGF抗体のFab断片、又は請求項8に記載の抗体-薬剤コンジュゲート、又は請求項14に記載の医薬組成物の使用。
- 血管新生に関連する前記疾患が眼の疾患である、請求項21に記載の使用。
- 前記眼の疾患が、高齢性黄斑変性(AMD)、糖尿病黄斑浮腫(DME)、網膜浮腫、変性近視、脈絡膜新生血管(CNV)を含む、脈絡膜新生血管を特徴とする、請求項22に記載の使用。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の抗VEGF抗体のFab断片、又は請求項8に記載の抗体-薬剤コンジュゲート、又は請求項14に記載の医薬組成物、及び1つ又は複数のさらなる治療剤を含む、薬学的組み合わせ物。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の抗VEGF抗体のFab断片、又は請求項8に記載の抗体-薬剤コンジュゲート、又は請求項14に記載の医薬組成物を含み、好ましくは、投与のためのデバイスを更に含む、キット。
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