JP7214921B2 - ヒト化抗il17a抗体及びその使用 - Google Patents
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Description
別段の記載がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されている意味を有する。本発明の目的では、以下の用語は、当技術分野において一般に理解される意味と一貫するように定義されている。
本発明は、組換えヒトIL17Aタンパク質を使用してマウスを免疫化し、次いで、ファージディスプレイライブラリースクリーニングによって、組換えヒトIL17Aタンパク質に特異的に結合する抗体クローンIL17A-M069を得た。IL17A-M069 scFv抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を次いで、PCRによって、マウスIgG1定常領域又はマウスカッパ軽鎖定常領域をそれぞれコードするヌクレオチド配列を有するpSTEP2ベクターに挿入し、そして、培養して発現させた。高純度の抗体を、タンパク質A精製カラムを使用して精製した。ELISAは、前記マウス抗体が、IL17Aによって誘導されるHFF細胞のIL-6分泌を遮断し得ることを示した。
本発明はまた、本発明の抗体又はその一部分をコードする核酸分子にも関する。これらの核酸分子の配列には、限定はしないが、配列番号2~7、26~33、36~37、40~41、及び43が含まれる。
本発明はまた、本発明の1つ又は複数のヌクレオチド配列を含む組換え構築物も提供する。本発明の組換え構築物は、本発明の抗体をコードする核酸分子をプラスミド、ファージミド、ファージ、又はウイルスベクター等のベクターに挿入することによって構築される。
所望の抗体をコードする構造的DNA配列を、適切な翻訳開始シグナル及び翻訳終結シグナル及び機能的プロモーターと共に、作動可能なリーディングフレームに挿入することによって、細菌において使用するための発現ベクターが構築される。ベクターは、1つ又は複数の表現型選択マーカー、及び、ベクターの維持を確実にし、必要に応じて宿主内で増殖させるための、複製起点を有する。形質転換のための適切な原核生物宿主としては、大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、並びにシュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、及びスタフィロコッカス属(Staphylococcus)の複数の種が含まれる。
哺乳動物宿主細胞における発現のための好ましい調節配列としては、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)に由来するプロモーター及び/又はエンハンサー(例えば、CMVプロモーター/エンハンサー)、シミアンウイルス40(SV40)のプロモーター及び/又はエンハンサー(例えば、SV40プロモーター/エンハンサー)、アデノウイルスのプロモーター及び/又はエンハンサー(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))、並びにポリオーマウイルスのプロモーター及び/又はエンハンサーが含まれる。ウイルス調節エレメント及びこれらの配列の更なる記載については、例えば、Stinskiによる米国特許第5,168,062号、Bellらによる米国特許第4,510,245号、及びSchaffnerらによる米国特許第4,968,615号を参照されたい。組換え発現ベクターはまた、複製起点及び選択マーカー(例えば、Axelらによる米国特許第4,399,216号、米国特許第4,634,665号、及び米国特許第5,179,017号を参照されたい)も含む。適切な選択マーカーは、G418、ハイグロマイシン、又はメトトレキサート等の薬物に対する耐性をベクターが導入されている宿主細胞に付与する遺伝子を含む。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子はメトトレキサートに対する耐性を付与し、一方、neo遺伝子はG418に対する耐性を付与する。
本発明のヒト化IL17A-H069抗体の特徴解析及び機能解析を行った。解析は、本発明の抗体が以下の利点を有することを示した:
本発明の抗体は、結腸直腸がんを治療するために使用することができる。本発明の抗体はまた、前記障害を治療するための薬剤を調製するためにも使用することができる。
本発明の抗体は、本発明の抗体及び1つ又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤を含む医薬組成物を形成するために、少なくとも1つの他の作用剤(例えば、安定な化合物)と共に調製することができる。場合によって、医薬組成物は、更なる治療剤を含有し得る。
本発明はまた、前述の本発明の医薬組成物を含有する1つ又は複数の容器を含む薬学的パッケージ及びキットにも関する。このような容器には、医薬品又は生物製剤の製造、使用、又は販売を管理している政府機関によって規定された形態の仕様書が添付されていてよく、これは、前記医薬品又は生物製剤を製造、使用、又は販売している上記機関によるヒト投与についての承認を反映している。
本発明の医薬組成物は、当技術分野において公知の様式で、例えば、従来の混合方法、溶解方法、造粒方法、トローチ調製方法、製粉方法、乳化方法、カプセル化方法、包埋方法、又は凍結乾燥方法によって調製することができる。
上記の本発明の抗体を含む医薬組成物はまた、抗新生物剤等の1つ又は複数の他の治療剤と組み合わされ、この場合、得られた組み合わせ物は、許容できない副作用を生じさせない。
IL17A抗体のスクリーニング
1.1 マウスの免疫化
マウスを、適切な変更を加えた、StGrothら(de StGroth及びScheidegger、1980)によって記載されている方法に従って、IL17Aで免疫化した。組換えヒトIL17Aタンパク質(SinoBiological, Inc社から入手、カタログ番号10247-H07B)を使用してマウスを免疫化した。IL17Aタンパク質のアミノ酸配列(UniprotKB Q16552)は、Met1~Ala155(配列番号1)である。組換えヒトIL17Aタンパク質をリン酸アルミニウムアジュバントと混合し(ここで、1回目及び4回目の免疫化は、完全フロイントアジュバントCFAエマルジョン型PBSを追加して行った)、マウスを当該混合物で、それぞれ2週間、3週間、及び3週間の間隔で4回、50μg/用量の用量で、複数の部位で、皮下で免疫化した。3回目の免疫化から、各免疫化の7日後に、眼の内眼角網状組織を介して血液を回収した。マウス抗IL17Aの血清力価を、被覆された組換えヒトIL17Aタンパク質を使用して、ELISAによって測定した。4回目の免疫化による血清の力価は、1:8000に希釈した後に標的に達し(ELISA、OD>1.0)、マウスを、4回目の免疫化の75日後に、25μgの組換えヒトIL17Aタンパク質で、静脈内でブーストした。4日後、マウスを屠殺し、脾臓組織を取り出し、液体窒素中で凍結した。
TriPure単離試薬(Roche社から入手、カタログ番号第11 667 165 001)を使用してRNAをマウス脾臓組織から抽出し、逆転写キット(Invitrogen社から入手、カタログ番号18080-051)を使用してRNAを逆転写することによってcDNAを得た。(Jones及びBendig 1991)において記載されている方法に従って、マウス抗体の軽鎖可変領域の配列を増幅するために2対のプライマーを設計し、重鎖可変領域の配列を増幅するために1対のプライマーを設計した。オーバーラップ伸長PCRによって、マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする配列を、scFvをコードするヌクレオチド配列にアセンブルし、次いで、これらの2つのヌクレオチド配列をリンカー(配列番号2)によって連結して、scFvをコードするヌクレオチド配列にアセンブルし、次いで、制限エンドヌクレアーゼSfi I(Fermentas社)によってファージベクターpComb3x(Sino Biological, Inc.社)に酵素的にライゲーションし、コンピテントX-Blueに電気的形質転換して、マウスscFv抗体ファージディスプレイライブラリーを構築した。ライブラリーのサイズは(sic)である。陽性抗IL17A抗体に富むファージライブラリーを、ファージ抗体パンニング(Aitken 2002)のプロセスに従ってELISAアッセイでスクリーニングして得た。組換えヒトIL17Aタンパク質を特異的に結合するscFv抗体を、富んだライブラリーの個々のコロニーファージによって発現させ、組換えヒトIL17Aタンパク質へのこれらの結合をELISAによって試験した。1つのコロニーのscFv抗体のヌクレオチド配列を配列番号3と決定し、IL17A-M069と名付けた抗体は、実施例1.3の工程後にこのコロニーに由来する。
scFv抗体重鎖可変領域(配列番号4)、重鎖シグナルペプチド配列(配列番号43)、及びマウスIgG1重鎖定常領域配列(配列番号6)をコードするヌクレオチド配列を、オーバーラップ伸長PCRで増幅及びアセンブルし、Hind III+Xba I(Fermentas社)で消化したpSTEP2ベクターに挿入し、こうして、完全重鎖(配列番号36)発現ベクターを得た。同様に、scFv抗体軽鎖可変領域(配列番号5)、軽鎖シグナルペプチド配列(配列番号29)、及びマウスカッパ軽鎖定常領域配列(配列番号7)をコードするヌクレオチド配列をオーバーラップ伸長PCRで増幅及びアセンブルし、Hind III+Xba I(Fermentas社)で消化したpSTEP2ベクターに挿入し、こうして、完全軽鎖(配列番号37)発現ベクターを得た。重鎖シグナルペプチド、重鎖可変領域、及びマウスIgG1重鎖定常領域をアセンブルするためのプライマーは、以下の通りであった。
マウスIL17Aモノクローナル抗体の機能解析
2.1マウス抗体IL17A-M069は、IL17Aによって誘導されるHFF細胞のIL-6分泌を遮断する
Beerli、Bauerら、2014によって記載されているように、IL17Aは、インビトロ条件下で、ヒト包皮線維芽細胞HFFのサイトカインIL-6分泌を刺激する。抗IL17A抗体をこの系に添加して、HFF細胞からのIL-6の分泌を検出することによって、IL17Aに対するIL17A抗体の中和効果を確認した。HFF細胞(ATCC、SCRC-1041)を96ウェルプレートに1×104個/ウェルの細胞密度で接種し、15%FBSを含有するDMEM培地中で一晩培養した。翌日、異なる濃度のIL17A-M069抗体及びポジティブコントロールTaltzバイオシミラーをそれぞれ10μL/ウェルで添加し、次いで、最終濃度50ng/mLのIL17Aタンパク質を10μL/ウェルで添加した。96ウェルプレートを37℃、5%CO2の細胞インキュベーターで48時間インキュベートし、ブランクウェルB(細胞なし)、ネガティブコントロールM'(細胞接種あり、抗体サンプルなし、IL17Aの添加あり)、及びM(細胞接種あり、抗体サンプルなし、及びIL17Aなし)を使用した。インキュベーション後、上清を回収し、IL-6の分泌をELISAによって測定した。サンプルウェル及びM'群ウェルのIL-6分泌をM群ウェルのIl-6分泌からそれぞれ差し引いて、阻害率を計算する。阻害率%=(1-サンプルウェルのIL-6分泌)/M'群ウェルのIL-6分泌×100%である。抗体サンプル濃度を水平座標として取り、IL-6分泌を垂直座標として取って、統計ソフトウェアを使用して標準曲線を計算した。結果を図1に示し、マウス抗体IL17A-M069は、IL17Aによって誘導されるHFF細胞のIL-6分泌を遮断し得、IL17Aに対するIL17A-M069の最大阻害率及び阻害濃度中央値は、ポジティブコントロールTaltzバイオシミラーのそれに類似しており、マウス抗体IL17A-M069及びTaltzバイオシミラーの最大阻害率は、それぞれ96.33%及び97.35%であり、EC50はそれぞれ243.3ng/mL及び246.6ng/mLであった。したがって、IL17A-M069は、インビトロ活性が良好な好ましい抗体であり、その後のヒト化修飾及び機能解析をIL17A-M069で行った。
IL17A抗体IL17A-M069のヒト化及び産生
実施例2におけるマウス抗体IL17A-M069の機能解析の結果に基づいて、ヒト化及び産生を適切に行った。
実施例1.3で決定された抗体IL17A-M069-scFvのヌクレオチド配列に基づいて、抗体IL17A-M069-scFvの重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を推定した。配列番号8/9を参照されたい。
マウス抗体のヒト化を、CDR移植の従来のヒト化方法を使用して行った(Kettleborough、Saldanhaら、1991)。マウス軽鎖又は重鎖可変領域により近いヒト抗体軽鎖又は重鎖可変領域(類似性>50%)を鋳型として選択し、マウス軽鎖又は重鎖の3つのCDR配列(配列番号10~15)の各々をヒト抗体の可変領域に挿入して、ヒト化軽鎖可変領域(VL)又はヒト化重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列をそれぞれ得た。IL17A-M069の軽鎖可変領域のヒト鋳型は、IL17A-M069の軽鎖に75.2%相同なIGKV4-1*01であり、重鎖可変領域のヒト鋳型は、IL17A-M069の重鎖に65.3%相同なIGHV1-69-2*01である。
マウス由来のフレームワーク領域内の一部の重要なアミノ酸はCDRの空間構造の安定性及び抗体結合活性の維持に必須であるため、これら重要なアミノ酸を、安定な空間構造を有する抗体が得られるまで、対応するマウス抗体アミノ酸に復帰突然変異させ、Kabatインデックスシステムに従って、以下の部位を復帰突然変異させた:軽鎖では、48位をVに復帰突然変異させ、49位をDに復帰突然変異させ、そして87位をFに復帰突然変異させた。一方、重鎖では、24位をAに復帰突然変異させ、そして43位をHに復帰突然変異させた。ヒト化抗体IL17A-H069を、CDRヒト化移植及びフレームワーク領域の復帰突然変異によって得、その重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をそれぞれ配列番号16/17で示す。連続的に連結した重鎖/軽鎖シグナルペプチド配列(配列番号20/21)、ヒト化抗体重鎖/軽鎖可変領域配列(配列番号22/23)、ヒト化抗体IgG1重鎖定常領域/ヒトカッパ軽鎖定常領域配列(配列番号24/25)をそれぞれ含む、シグナルペプチドを有する形態のその重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を、それぞれ配列番号18/19で示す。
順に結合された、軽鎖シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列(配列番号29)、ヒト化抗体軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列(配列番号31)、及びヒト抗体カッパ軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列(配列番号33)を有する、抗体IL17A-H069軽鎖及びシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列(配列番号27)をPCR増幅し、自社開発のpGSベクター(Kpn I+Xba I)にin-fusion方法によって挿入し、正確なプラスミドをシーケンシングによって確認した。同様に、順に結合された、重鎖シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列(配列番号28)、ヒト化抗体重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列(配列番号30)、及びヒト抗体IgG1抗体重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列(配列番号32)を有する、シグナルペプチドを有する抗体IL17A-H069重鎖をコードするヌクレオチド配列(配列番号26)をPCR増幅し、軽鎖遺伝子を正確に有することが確認されているpGSベクター(Nhe I+Not I)に、in-fusion方法によって挿入し、そして、IL17A-H069の軽鎖及び重鎖の両方を発現する正確なベクターを、シーケンシングによって確認した。これら発現ベクターは、選択マーカーとしてのGS遺伝子、並びに抗体軽鎖及び重鎖の発現エレメントを有する、真核性の発現ベクターである。これら発現ベクターをCHO-K1-GS-欠損細胞にトランスフェクトし、IL17A-H069高発現細胞系をMSXスクリーニングによって得た。抗体発現が高いクローンをELISAアッセイによって選択し、高発現細胞系を、細胞の増殖状態及び抗体薬のための重要な質的特徴の両方を考慮することによって選択した。無血清懸濁液培養を使用して、IL17A-H069を産生するCHO細胞系を培養して、純度が高く質の高いIL17A-H069抗体を得た。
ヒト化抗体IL17A-H069の抗原結合親和性の解析
4.1 IL17Aタンパク質に対するヒト化抗体の結合親和性の解析
4.1.1 組換えヒトIL17Aタンパク質へのIL17A-H069の結合
異なる濃度の組換えヒトIL17Aタンパク質(SinoBiological, Inc.社)を、100μL/ウェルで一晩、4℃で、96ウェルプレートに被覆した。翌日、プレートを洗浄し、室温で1時間遮断させた。2μg/mLのCOSENTYXバイオシミラー(SinoCelltech Co., Ltd.社)及びIL17A-H069(SinoCelltech Co., Ltd.社)100μLとそれぞれインキュベートした後、プレートを洗浄して未結合の抗体を除去し、次いで、ヤギ抗ヒトIgG Fc/HRPとインキュベートし、繰り返し洗浄し、そして色素生成性基質溶液を添加して発色させた。発色が安定した後、OD450を測定した。組換えヒトIL17Aタンパク質の濃度を水平座標として取り、OD450値を垂直座標として取って、graphPad Prism 6.0ソフトウェアをデータ解析に使用し、用量-有効性曲線を作成し、半数影響濃度EC50値を計算した。
異なる濃度の組換えヒトIL17A/F二量体タンパク質(SinoBiological, Inc.社、CT047-HNAE)を、100μL/ウェルで一晩、4℃で、96ウェルプレートに被覆した。翌日、プレートを洗浄し、室温で1時間遮断させた。2μg/mLのCOSENTYXバイオシミラー(SinoCelltech Co., Ltd.社)及びIL17A-H069(SinoCelltech Co., Ltd.社)100μLとそれぞれインキュベートした後、プレートを洗浄して未結合の抗体を除去し、次いで、ヤギ抗ヒトIgG Fc/HRPとインキュベートし、繰り返し洗浄し、そして、色素生成性基質溶液を添加して発色させた。発色が安定した後、OD450を測定した。組換えヒトIL17A/Fタンパク質の濃度を水平座標として取り、OD450値を垂直座標として取って、graphPad Prism 6.0ソフトウェアをデータ解析に使用し、用量-有効性曲線を作成し、半数影響濃度EC50値を計算した。
ビオチン化されたIL7Aタンパク質又はIL17A/Fタンパク質に対する、異なる濃度(0.42nM、0.90nM、1.74nM、及び3.47nM)のIL17A-H069、並びに異なる濃度(0.90nM、1.74nM、3.47nM、6.94nM、及び13.9nM)のポジティブコントロールCOSENTYX(Norvatis社、SHM12)の親和性を、Octet生体分子相互作用アッセイシステムを使用してそれぞれ決定した。Table 2(表4)の結果は、組換えヒトIL17Aタンパク質に対するIL17A-H069の結合親和性KDの値が2.88E-11Mであり、会合速度定数konが6.71E+05M-1s-1であり、そして解離速度定数koffが1.93E-05s-1であり、一方で、IL17Aタンパク質に対するCOSENTYXの結合親和性KDの値が9.55E-11Mであり、会合速度定数konが1.78E+05M-1s-1であり、そして解離速度定数koffが1.70E-05s-1であることを示した。組換えヒトIL17A/Fタンパク質に対するIL17A-H069の結合親和性KDの値は5.37E-10Mであり、会合速度定数konは1.44E+05M-1s-1であり、そして解離速度定数koffは7.72E-05s-1であった。一方で、IL17A/Fタンパク質に対するCOSENTYXの結合親和性KDの値は1.10E-09Mであり、会合速度定数konは8.00E+04M-1s-1であり、そして解離速度定数koffは8.79E-05s-1であった。結果は、IL17A-H069がCOSENTYXのそれよりも強力な親和性でIL17Aタンパク質を結合し、IL17A-H069の親和性がCOSENTYXのそれの約3.32倍であり、そしてIL17A-H069がより速い会合速度を有し、そのため、IL17A-H069がCOSENTYXよりも強力なIL17Aタンパク質への結合能力を有すること、IL17A-H069がCOSENTYXのそれよりも強力な親和性でIL17A/Fタンパク質を結合し、IL17A-H069の親和性がCOSENTYXの親和性の約2.05倍であり、そして、IL17A-H069がより速い会合速度を有し、したがって、IL17A-H069がCOSENTYXよりも強力なIL17A/Fタンパク質への結合能力を有することを示した。
異なる濃度の組換えヒトIL17Aタンパク質(Sino Biological, Inc.社)及びマウスmIL17Aタンパク質(Sino Biological, Inc.社)を、ウェル当たり100μLで一晩、4℃で、96ウェルプレートにそれぞれ被覆した。翌日、プレートを洗浄し、室温で1時間遮断させた。2μg/mLのIL17A-H069(Sino Biological, Inc.社)、ポジティブコントロールCOSENTYX(Norvatis社、SHM12)、及びネガティブコントロール抗体H7N9-R1(SinoCelltech Co., Ltd.社)100μLをそれぞれ添加し、インキュベートした。プレートを洗浄して未結合の抗体を除去した。プレートをヤギ抗ヒトIgG Fc/HRP(Sino Biological, Inc.社)とインキュベートし、次いで、繰り返し洗浄し、そして色素生成性基質溶液を添加して発色させた。発色が安定した後、OD450を測定した。図4に示す結果は、IL17A-H069がマウスmIL17Aタンパク質との交差結合を有さないことを示している。
4.2.1 IL17A-H069は、受容体IL17RAへのIL17Aタンパク質の結合を遮断する
0.4μg/mLの濃度のIL17Aタンパク質を、ウェル当たり100μLで一晩、4℃で、96ウェルプレートに被覆した。翌日、プレートを洗浄し、室温で1時間遮断させた。2μg/mLのビオチン化されたタンパク質IL17RA-His-ビオチン(Sino Biological, Inc.社)100μLを各ウェルに添加し、次いで、異なる濃度のIL17A-H069(SinoCelltech Co., Ltd.社)、ポジティブコントロールCOSENTYX(Norvatis社、SHM12)、ポジティブコントロールTaltz(Eli Lilly社)、及びネガティブコントロール抗体H7N9-R1(SinoCelltech Co., Ltd.社)をそれぞれ添加し、インキュベートした。プレートを洗浄して未結合の抗体を除去した。プレートをストレプトアビジン/HRP(Beijing ZSGB-Bio Co., Ltd.社、SA-5004)とインキュベートし、次いで繰り返し洗浄し、そして色素生成性基質溶液を添加して発色させた。発色が安定した後、OD450を測定し、各群について2回ずつ試験した。
5μg/mLの濃度のIL17RA-Fcタンパク質(Sino Biological, Inc.社)を、ウェル当たり100μLで一晩、4℃で、96ウェルプレートに被覆した。翌日、プレートを洗浄し、室温で1時間遮断させた。0.8μg/mLのIL17A/F-ビオチンタンパク質(Sino Biological, Inc.社)100μLを各ウェルに添加し、次いで、異なる濃度のIL17A-H069(SinoCelltech Co., Ltd.社)、ポジティブコントロールCOSENTYXバイオシミラー(SinoCelltech Co., Ltd.社)、ポジティブコントロールTaltzバイオシミラー(SinoCelltech Co., Ltd.社)、及びネガティブコントロール抗体H7N9-R1(SinoCelltech Co., Ltd.社)をそれぞれ添加し、インキュベートした。プレートを洗浄して未結合の抗体を除去した。プレートをストレプトアビジン/HRP(Beijing ZSGB-Bio Co., Ltd.社、SA-5004)とインキュベートし、次いで繰り返し洗浄し、そして色素生成性基質溶液を添加して発色させた。発色が安定した後、OD450を測定した。
ヒト化抗体IL17A-H069の機能解析
5.1 IL17A-H069は、IL17Aによって誘導される又はIL17A/Fによって誘導されるHFF細胞のIL-6分泌を遮断する
HFF細胞を96ウェルプレートに1×104個/ウェルの細胞密度で接種し、15%FBSを含有するDMEM培地中で一晩培養した。翌日、異なる濃度のIL17A-H069(SinoCelltech Co., Ltd.社)及びポジティブコントロールCOSENTYX(Norvatis社)又はポジティブコントロールTaltz(Eli Lilly社)をそれぞれ10μL/ウェルで添加した。その後、最終濃度50ng/mLのIL17Aタンパク質(Sino Biological, Inc社、12047-HNAS)又は最終濃度1μg/mLのIL17A/Fタンパク質(Sino Biological, Inc社、CT047-HNAE)10μLを各ウェルにそれぞれ添加した。96ウェルプレートを37℃、5%CO2の細胞インキュベーターで48時間インキュベートし、ブランクウェルB(細胞なし)、ネガティブコントロールM'(細胞接種あり、抗体サンプルなし、IL17A又はIL17A/Fの添加あり)、並びにM(細胞接種あり、抗体サンプルなし、及びIL17A又はIL17A/Fなし)を使用した。インキュベーション後、上清を回収し、IL-6の分泌をELISAによって測定した。サンプルウェル及びM'群ウェルのIL-6分泌をM群ウェルのIl-6分泌からそれぞれ差し引いて、阻害率を計算する。阻害率%=(1-サンプルウェルのIL-6分泌)/M'群ウェルのIL-6分泌×100%である。抗体サンプル濃度を水平座標として取り、IL-6分泌を垂直座標として取って、統計ソフトウェアを使用して標準曲線を計算し、4パラメータロジスティック回帰方程式を使用して、標準的な「S」曲線を当てはめて、抗体サンプルの半数影響濃度(EC50)を計算した。
マウスにおけるヒト化抗体のインビボでの有効性
6.1 hPBMC免疫再構成マウス乾癬(PsO)モデルにおけるIL17A-H069のインビボでの有効性
3頭のドナーから得たhPBMCを使用して、全部で60頭の、ヒト化免疫系を有するB-NDGマウス(Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd.社)を得た(ドナーのhPBMC当たり20頭のマウス)。末梢血を1週間後に回収し、ヒト由来細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって測定した。20頭のマウスが0.04~1.5%の間のヒト由来細胞パーセンテージを有しており、31頭のマウスが1.5~7%のパーセンテージを有しており、そして8頭のマウスが>7%のパーセンテージを有していた。1.5~7%のパーセンテージを有するマウスを選択してIMQ(イミキモド)誘導性マウス乾癬モデルを確立し、これに基づいて、IL17A-H069の有効性を評価した。
ヒト化抗体のインビボでの薬物動態学
7.1 カニクイザルにおけるIL17A-H069の単回皮下注射の薬物動態学
この実施例において、IL17A-H069抗体の単回皮下注射を1mg/kgの用量でカニクイザルに投与した。血清を、投与前、並びに投与の1時間後、2時間後、4時間後、6時間後、8時間後、24時間後、48時間後、3日後、4日後、7日後、10日後、14日後、17日後、21日後、24日後、28日後、31日後、及び35日後にそれぞれ回収した。確立されたELISA法を使用して、サル血清中のIL17A-H069の薬物濃度を測定し、非コンパートメント解析(NCA)Phoenix-WinNonlin(Pharsight社)6.4ソフトウェアを使用して、薬物動態学的パラメータを計算した。IL17A-H069の単回皮下注射後のインビボでの薬物変化プロファイルの動的パターンを調べた。IL17A-H069の単回皮下注射後の体内の薬物の動的変化を調べる。
Claims (22)
- 配列番号13で示されるアミノ酸配列を有する重鎖CDR1領域、及び配列番号14で示されるアミノ酸配列を有する重鎖CDR2領域、及び配列番号15で示されるアミノ酸配列を有する重鎖CDR3領域を有する、重鎖可変領域、並びに
配列番号10で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1領域、配列番号11で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2領域、及び配列番号12で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3領域を有する、軽鎖可変領域
を含む、単離された抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。 - 配列番号22で示されるアミノ酸配列又は配列番号22に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域、及び
配列番号23で示されるアミノ酸配列又は配列番号23に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域
を含む、請求項1に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。 - ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項1に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。
- 重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を更に含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片であって、好ましくは、
前記重鎖定常領域が、配列番号24で示されるアミノ酸配列又は配列番号24に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、IgG1重鎖定常領域であり、且つ/或いは
前記軽鎖定常領域が、配列番号25で示されるアミノ酸配列又は配列番号25に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、ヒトカッパ軽鎖定常領域である、
抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。 - 重鎖可変領域に連結したシグナルペプチド、及び/又は軽鎖可変領域に連結したシグナルペプチドを更に含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片であって、好ましくは、
重鎖可変領域に連結した前記シグナルペプチドが、配列番号20で示されるアミノ酸配列又は配列番号20に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ/或いは
軽鎖可変領域に連結した前記シグナルペプチドが、配列番号21で示されるアミノ酸配列又は配列番号21に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列である、
抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。 - IgG抗体、好ましくはIgG1抗体である、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。
- モノクローナル抗体である、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。
- 組換えヒトIL17Aタンパク質に対する前記抗IL17A抗体又はその抗原結合断片の結合親和性KDが、0.1-10E-11M、好ましくは0.5-5E-11M、そして更に好ましくは2.88E-11Mである、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。
- 組換えヒトIL17A/Fタンパク質に対する前記抗IL17A抗体又はその抗原結合断片の結合親和性KDが、0.1-10E-10M、好ましくは0.5-5E-10M、そして更に好ましくは5.37E-10Mである、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗原結合断片が、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、又は単鎖抗体分子であり、単鎖抗体分子が、好ましくはscFv、ジ-scFv、トリ-scFv、ダイアボディ、又はscFabである、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片、及び更なる治療剤を含む、抗体-薬物コンジュゲートであって、好ましくは、前記抗IL17A抗体又はその抗原結合断片がリンカーを介して更なる治療剤と結合している、抗体-薬物コンジュゲート。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
- 重鎖可変領域をコードする、配列番号30で示されるヌクレオチド配列、及び/又は、軽鎖可変領域をコードする、配列番号31で示されるヌクレオチド配列を含む、請求項12に記載の核酸。
- 請求項12又は13に記載の核酸を含む、発現ベクター。
- 請求項12若しくは13に記載の核酸、又は請求項14に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項15に記載の宿主細胞を抗体発現に適した条件下で培養する工程、及び発現した抗体を培養培地から採取する工程を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片を産生するための方法。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項11に記載の抗体-薬物コンジュゲート、又は請求項12若しくは13に記載の核酸、又は請求項14に記載の発現ベクター、及び薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
- 乾癬の治療において使用するための、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項11に記載の抗体-薬物コンジュゲート、又は請求項17に記載の医薬組成物。
- 乾癬を治療するための、請求項17に記載の医薬組成物。
- 乾癬の治療のための医薬の調製における、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項11に記載の抗体-薬物コンジュゲート、又は請求項17に記載の医薬組成物の使用。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項11に記載の抗体-薬物コンジュゲート、又は請求項17に記載の医薬組成物、及び1つ又は複数の更なる治療剤を含む、医薬組み合わせ物。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項11に記載の抗体-薬物コンジュゲート、又は請求項17に記載の医薬組成物を含み、好ましくは、投与のためのデバイスを更に含む、キット。
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