JP2022535151A - ヒト化抗ｉｌ１７ａ抗体及びその使用 - Google Patents

ヒト化抗ｉｌ１７ａ抗体及びその使用 Download PDF

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Abstract

IL17Aに結合するヒト化モノクローナル抗体及び当該抗体をコードする核酸配列(重鎖/軽鎖可変領域を含む)、当該核酸配列を有するベクター、医薬組成物、並びにキットが提供される。当該モノクローナル抗体は、高い親和性でIL17Aタンパク質に特異的に結合し得、受容体IL17RAへのIL17A及びIL17A/Fの結合を遮断する強力な能力を有し、そして、乾癬の治療等に使用することができる。

Description

本発明は腫瘍免疫療法の分野に関するものであり、ヒト化抗IL17Aモノクローナル抗体薬及びその適用に関する。
IL-17とも一般に呼ばれるIL17Aは、分子量が35kDの、155のアミノ酸からなる炎症性サイトカインである。これはヘルパーT細胞17によって主に分泌され、T細胞17に加えて、CD4+細胞、CD8+T細胞、及びγδ-T細胞もまた、IL-17を分泌し得る。IL-17ファミリーは6つのメンバー、IL17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D(IL-27)、IL-17E(IL-25)、及びIL-17Fを有し(Gu、Wuら、2013)、とりわけIL17A及びIL-17Fが最も重要なメンバーである。アミノ酸相同性が55%であるため、IL17A及びIL-17Fは、ジスルフィド結合によって結合されたホモ二量体又はヘテロ二量体を形成し得る(Dubin及びKolls、2009)。マクロファージ、樹状細胞、造血細胞、骨芽細胞、線維芽細胞等のIL-17受容体ファミリーの様々なIL-17RA発現細胞に結合すると、IL17A/A二量体又はIL-17A/F二量体は、NFκB、C/EBP、MAPK、及び受容体細胞における他のシグナル経路を活性化して、これらの細胞による炎症性因子及びケモカイン(IL-6、IL-8、CXCL1等)の分泌を誘導し得、好中球を動員し得、そして炎症応答の発現を媒介し得る(Mitra、Raychaudhuriら、2014)。乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、及び強直性脊椎炎等の多くの炎症関連性の自己免疫疾患の発生及び発症は、IL-17経路に緊密に関連し(Wang、Suzukiら、2017)、これは患者の血清中のIL-17発現レベルの有意な上方調節を伴い(Marinoni、Ceribelliら、2014)、持続性の炎症応答をもたらす。更に、IL-17はまた、皮膚の内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、及びケラチン生成細胞に直接作用し得、複数の炎症性因子の放出を増大させ、病理学的皮膚を生じさせる(Mitra、Raychaudhuriら、2014;Brembilla、Senraら、2018)。したがって、IL-17経路の遮断は、自己免疫疾患プロセスを阻害する実現可能性を提供する。
現在販売されている、IL-17を標的化する抗体薬は、Novartis社のCOSENTYX(登録商標)/セクキヌマブ(US7807155B2)、及びEli Lilly社のTaltz(登録商標)/イキセキズマブ(US7838638B2/CN101326195B)であり、主なメカニズムは以下の通りである:IL17A及びIL17A/Fへのその結合を介して、受容体(IL-17RA/C)へのIL17Aの結合を阻害し、連続して、炎症性因子及びケモカインの放出が遮断され、こうして自己免疫疾患が効果的に軽減される(Fala 2016;Liu、Luら、2016)。セクキヌマブは、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、及び強直性脊椎炎の治療に承認されている。イキセキズマブは、尋常性乾癬及び乾癬性関節炎の治療に承認されている。本発明におけるヒト化モノクローナルIL17A抗体は、高い親和性でIL17Aタンパク質を特異的に結合することができ、受容体IL17RAへのIL17A、IL17A/Fの結合を遮断する強力な能力を有し、そして、同等の薬物と比較して優れた又は同等の、IL17A、IL17A/Fによるヒト表皮線維芽細胞HFFの炎症性サイトカイン分泌の誘導を遮断する能力を有する。マウス乾癬モデルにおいて、前記抗体はまた、同等の薬物よりも有意に良好なインビボでの薬力学的活性を示し、投与後のPASIスコアは有意に低い。前記ヒト化抗体は、カニクイザルにおいて、皮下注射後の迅速な吸収、長い半減期、及びより良好な薬物曝露を含む、好ましい薬物動態学的プロファイルを示し、これは、より長い投与サイクルの基礎となる。本発明の抗体は、限定はしないが乾癬の治療への使用が計画されている。
米国特許第5,500,362号 米国特許第5,821,337号 米国特許第6,737,056号 米国特許第6,194,551号 WO1999/51642 米国特許第4,816,397号 米国特許第5,168,062号 米国特許第4,510,245号 米国特許第4,968,615号 米国特許第4,399,216号 米国特許第4,634,665号 米国特許第5,179,017号
Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD. 1991 Chothia及びLesk、J MolBiol 196:901～917(1987) Kabatら: Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、US Department of Health and Human Services、PHS、NIH、NIH Publication 第91～3242、1991 Altschulら、1990、J. Mol. Biol. 215: 403～410 Guyerら、Journal of Immunology 117: 587 (1976) Kimら、Journal of Immunology 24: 249 (1994) Gazzano-Santoroら、J. Immunol Methods 202: 163 (1996) Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、N. Y.、1989 Ausubel, F. M.、Brent, R.、Kingston, R. E.、Moore, D. D.、Sedman, J. G.、Smith, J. A.、及びStruhl, K.編(1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons Ausubel, F. M.ら(編) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) Urlaub及びChasin、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216～4220 R.J. Kaufman及びP.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621 Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science、John Wiley & Sons, NY、N.Y.、(1997～2001)
本発明は、新規な構造を有するIL17A結合抗体を開発することによって、上記の要求を満たす。本発明は、高い親和性でIL17Aを特異的に結合し、受容体IL17RAへのIL17A、IL17A/Fの結合を遮断する強力な能力を有する、ヒト化モノクローナル抗体を開示する。他の同等の薬物と比較して、本明細書において提供される抗体は、IL17A及びIL17A/Fによるヒト表皮線維芽細胞HFFの炎症性サイトカイン分泌の誘導を遮断する、優れた又は同等の能力を有する。マウス乾癬モデルにおいて、前記抗体はまた、同等の薬物よりも、インビボでの薬理学的活性という有意な利点を示し、また、投与後のPASIスコアを有意に低減させた。カニクイザルでの薬物動態学的研究において、前記ヒト化抗体は、皮下注射後の迅速な吸収、長い半減期、より良好な薬物曝露等を含む、優れた薬物動態学的特徴を示し、これは、より長い投与サイクルの基礎となる。本発明のヒト化モノクローナル抗体は、乾癬の治療に使用することができる。
一態様において、本発明は、配列番号13で示されるアミノ酸配列を有する重鎖CDR1領域、配列番号14で示されるアミノ酸配列を有する重鎖CDR2領域、及び配列番号15で示されるアミノ酸配列を有する重鎖CDR3領域を有する重鎖可変領域、並びに配列番号10で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1領域、配列番号11で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2領域、及び配列番号12で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3領域を有する軽鎖可変領域を含む、単離された抗IL17A抗体又はその抗原結合断片を提供する。(マウス抗体M069及びヒト化抗体H069が共有している6つのCDRは、マウス及びヒトにおいて同一である)
一実施形態において、前記抗IL17A抗体又はその抗原結合断片は、配列番号22で示されるアミノ酸配列又は配列番号22に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列又は配列番号23に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する。(ヒト化抗体H069の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列)
一実施形態において、前記抗IL17A抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。
一実施形態において、前記抗IL17A抗体は、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を更に含み、好ましくは、前記重鎖定常領域は、配列番号24で示されるアミノ酸配列又は配列番号24に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するIgG1重鎖定常領域であり、且つ/或いは、前記軽鎖定常領域は、配列番号25で示されるアミノ酸配列又は配列番号25に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒトカッパ軽鎖定常領域である。(ヒト化抗体H069の重鎖及び軽鎖定常領域のアミノ酸配列)
一実施形態において、前記抗IL17A抗体は、重鎖可変領域に連結したシグナルペプチド及び/又は軽鎖可変領域に連結したシグナルペプチドを更に含み、好ましくは、重鎖可変領域に連結した前記シグナルペプチドは、配列番号20で示されるアミノ酸配列又は配列番号20に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ/或いは、軽鎖可変領域に連結した前記シグナルペプチドは、配列番号21で示されるアミノ酸配列又は配列番号21に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列である。(ヒト化抗体H069の重鎖及び軽鎖シグナルペプチドのアミノ酸配列)
一実施形態において、前記抗IL17A抗体又はその抗原結合断片は、IgG抗体、好ましくはIgG1抗体である。
一実施形態において、前記抗IL17A抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体である。
一実施形態において、組換えヒトIL17Aタンパク質に対する前記抗IL17A抗体又はその抗原結合断片の結合親和性KDは、0.1-10E-11M、好ましくは0.5-5E-11M、そして更に好ましくは2.88E-11Mである。
一実施形態において、組換えヒトIL17A/Fタンパク質に対する前記抗IL17A抗体又はその抗原結合断片の結合親和性KDは、0.1-10E-10M、好ましくは0.5-5E-10M、そして更に好ましくは5.37E-10Mである。
一実施形態において、前記抗原結合断片は、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fd断片、Fd'断片、単鎖抗体分子、又は単一ドメイン抗体であり、単鎖抗体分子は、好ましくはscFv、ジ-scFv、トリ-scFv、ダイアボディ、又はscFabである。
別の態様において、本発明は、本明細書において記載される抗IL17A抗体又はその抗原結合断片及び更なる治療剤を含む、抗体-薬物コンジュゲートを提供し、好ましくは、前記抗IL17A抗体又はその抗原結合断片は、リンカーを介して更なる治療剤と結合している。
更に別の態様において、本発明は、本明細書において記載される抗IL17A抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。
一実施形態において、前記核酸は、重鎖可変領域をコードする、配列番号30で示されるヌクレオチド配列、及び/又は軽鎖可変領域をコードする、配列番号31で示されるヌクレオチド配列を含む。
更に別の態様において、本発明は、本明細書において記載される核酸を含む発現ベクターを提供する。
更に別の態様において、本発明は、本明細書において記載される核酸又は本明細書において記載される発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
更に別の態様において、本発明は、本明細書において記載される宿主細胞を抗体発現に適した条件下で培養する工程、及び発現した抗体を培養培地から回収する工程を含む、本明細書において記載される抗IL17A抗体又はその抗原結合断片を産生するための方法を提供する。
更に別の態様において、本発明は、本明細書において記載される抗IL17A抗体若しくはその抗原結合断片、又は本明細書において記載される抗体-薬物コンジュゲート、又は本明細書において記載される核酸、又は本明細書において記載される発現ベクター、及び薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物を提供する。
更に別の態様において、本発明は、乾癬の治療のための、本明細書において記載される抗IL17A抗体若しくはその抗原結合断片、又は本明細書において記載される抗体-薬物コンジュゲート、又は本明細書において記載される医薬組成物を提供する。
更に別の態様において、本発明は、必要とする対象に治療有効量の本明細書において記載される抗IL17A抗体若しくはその抗原結合断片、又は本明細書において記載される抗体-薬物コンジュゲート、又は本明細書において記載される医薬組成物を投与し、これによって乾癬を治療する工程を含む、乾癬を治療するための方法を提供する。
更に別の態様において、本発明は、乾癬の治療のための医薬の調製における、本明細書において記載される抗IL17A抗体若しくはその抗原結合断片、又は本明細書において記載される抗体-薬物コンジュゲート、又は本明細書において記載される医薬組成物の使用を提供する。
更に別の態様において、本発明は、本明細書において記載される抗IL17A抗体若しくはその抗原結合断片、又は本明細書において記載される抗体-薬物コンジュゲート、又は本明細書において記載される医薬組成物、及び1つ又は複数の更なる治療剤を含む、医薬組成物を提供する。
更に別の態様において、本発明は、本明細書において記載される抗IL17A抗体若しくはその抗原結合断片、又は本明細書において記載される抗体-薬物コンジュゲート、又は本明細書において記載される医薬組成物を含み、好ましくは、投与のためのデバイスを更に含む、キットを提供する。
IL17A-M069が、IL17Aによって誘導されるHFF細胞のIL-6分泌を遮断することを示す図である。 組換えヒトIL17Aタンパク質へのIL17A-H069の結合を示す図である。 組換えヒトIL17A/Fタンパク質へのIL17A-H069の結合を示す図である。 IL17A-H069とマウスIL17Aタンパク質との間の種交差結合を示す図である。 IL17A-H069がIL17Aタンパク質へのIL17RAの結合を遮断することを示す図である。 IL17A-H069がIL17A/Fタンパク質へのIL17RAの結合を遮断することを示す図である。 IL17A-H069がIL17A介在性のHFF細胞のIL-6分泌を遮断することを示す図である。 マウス乾癬モデルにおける、乾癬面積及び重篤度指標PASIに対するIL17A-H069の効果を示す図である。 カニクイザルにおける、IL17A-H069の単回皮下注射の薬物濃度-時間曲線を示す図である。
本発明の様々な態様は、単離された抗IL17A抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片を含む抗体-薬物コンジュゲート、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸及び発現ベクター、及び前記核酸又は発現ベクターを有する宿主細胞、前記抗IL17A抗体又はその抗原結合断片を産生するための方法、前記抗IL17A抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物、及び乾癬を治療するための前記抗IL17A抗体又はその抗原結合断片の使用方法に関する。
定義
別段の記載がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されている意味を有する。本発明の目的では、以下の用語は、当技術分野において一般に理解される意味と一貫するように定義されている。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの」、「a/an」、「別の」、及び「前記」は、文脈から別段のことが明らかに示されない限り、対象物の複数形の指定を含む。
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子を指し、また、所望の生物学的活性を示すあらゆる形態の抗体を指す。これらとしては、限定はしないが、モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体及び多重特異的抗体(例えば二重特異的抗体)、並びに更には抗体断片が含まれる。典型的には、完全長抗体の構造は、好ましくは、ジスルフィド結合によって典型的に相互接続されている、4つのポリペプチド鎖、2つの重(H)鎖、及び2つの軽(L)鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を有する。各軽鎖は、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を有する。この典型的な完全長抗体構造に加えて、構造はまた、他の誘導体形態も含む。
前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、これらに点在する、より保存的な領域(フレームワーク領域(FR)と呼ばれる)及び超可変領域(相補性決定領域(CDR)と呼ばれる)に更に分けることができる。
用語「相補性決定領域」(CDR、例えば、CDR1、CDR2、及びCDR3)は、その存在が抗原の結合に必要な、抗体の可変領域内のアミノ酸残基を指す。各可変領域は、CDR1、CDR2、及びCDR3と同定されている3つのCDR領域を典型的に有する。各相補性決定領域は、Kabatによって定義されている「相補性決定領域」のアミノ酸残基(Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD. 1991)及び/又は「高可変ループ」のアミノ酸残基(Chothia及びLesk、J MolBiol 196:901～917(1987))を有し得る。
用語「フレームワーク」又は「FR」残基は、本明細書において定義されるCDR残基以外の可変領域内の残基である。
各重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、3つのCDR及び最大4つのFRを典型的に有し、前記CDR及びFRは、以下の順序で、例えば、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及びFR4の順序で、アミノ末端からカルボキシル末端まで配列している。
所与の抗体の相補性決定領域(CDR)及びフレームワーク領域(FR)は、Kabatシステム(Kabatら: Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、US Department of Health and Human Services、PHS、NIH、NIH Publication 第91～3242、1991)を使用して同定することができる。
用語「定常領域」は、抗原への抗体の結合に直接的には関与しないが抗体依存性の細胞傷害性等の様々なエフェクター機能を示す、抗体の軽鎖及び重鎖内のアミノ酸配列を指す。
抗体の重鎖は、その定常領域のアミノ酸配列の抗原性の違いに従って、α、δ、ε、γ、及びμという5つのクラスに分類することができる。重鎖が軽鎖と完全な抗体を形成する場合、これはIgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMという5つのクラスに分類することができ、これらは更にIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、及びIgA2等のサブクラス(アイソタイプ)に分類することができる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλに分類することができる。
「抗体の抗原結合断片」は、親抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持し、親抗体の抗原結合領域又は可変領域(例えば1つ又は複数のCDR)の少なくとも一部を典型的に含む、無傷抗体分子の一部を含む。抗原結合断片の例としては、限定はしないが、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fd断片、Fd'断片、単鎖抗体分子(例えば、scFv、ジ-scFv、若しくはトリ-scFv、ダイアボディ、又はscFab)、単一ドメイン抗体が含まれる。
用語「抗体断片」は、「抗原結合断片」として上記で記載したものに加えて、限定はしないがFc断片を含む、親抗体の生物学的特性の少なくとも一部を保持する、無傷ではない抗体分子を指す。
用語「抗体-薬物コンジュゲート」又は「ADC」は、場合によって治療剤又は細胞傷害剤であり得る化学的薬物(本明細書において作用剤とも呼ばれる)の1つ又は複数に化学的に連結している、抗体又はその抗原結合断片等の結合タンパク質を指す。好ましい実施形態において、ADCは、抗体、細胞傷害薬又は治療薬、及び薬物を抗体に連結又はコンジュゲートさせ得るリンカーを含む。ADCは、2、4、6、又は8つの装薬物質を含む、抗体にコンジュゲートした1～8のいずれかの値の薬物を通常有する。ADCに含まれ得る薬物の非限定的な例は、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、免疫調節剤、遺伝子療法のためのベクター、アルキル化剤、抗IL17A剤、代謝拮抗剤、ホウ素を含有する作用剤、化学療法保護剤、ホルモン、抗ホルモン剤、コルチコステロイド、光活動性治療剤、オリゴヌクレオチド、放射性核種剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、及び放射線増感剤である。
用語「キメラ抗体」は、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の由来源又は種に由来し、残りの部分が異なる由来源又は種に由来する、抗体を指す。「キメラ抗体」はまた、上記に定義した機能的断片でもあり得る。「ヒト化抗体」は、「キメラ抗体」のサブセットである。
用語「ヒト化抗体」又は「ヒト化抗原結合断片」は、本明細書において、(i)非ヒト由来源(例えば、異種免疫系を有するトランスジェニックマウス)に由来し、ヒト生殖系配列に基づく、抗体若しくは抗体断片、又は(ii)可変領域が非ヒト由来のものであり定常領域がヒト由来のものであるキメラ抗体である、抗体若しくは抗体断片、又は(iii)可変領域のCDRが非ヒト由来のものであり、可変領域の1つ若しくは複数のフレームワーク領域がヒト由来のものであり、且つ、定常領域が存在する場合にはヒト由来のものである、CDR移植体である、抗体若しくは抗体断片、として定義される。「ヒト化」の目的は、考えられる最大の親和性を保持しながら、ヒト体内において、非ヒト由来抗体の免疫原性を排除することである。非ヒト由来源抗体のフレームワーク配列に最も類似しているヒトフレームワーク配列をヒト化のための鋳型として選択することが有利である。一部のケースにおいて、親和性の低下を避けるために、ヒトフレームワーク配列内の1つ又は複数のアミノ酸を非ヒト構築物内の対応する残基で置き換えることが必要である場合がある。
用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体集団に由来する抗体を指し、すなわち、集団に含まれる全ての単一の抗体は、非常にわずかな量で存在し得る考えられる突然変異(例えば天然の突然変異)を除いて同一である。用語「モノクローナル」は、したがって、問題となっている抗体の性質を指し、すなわち、関連のない抗体の混合物ではない。異なるエピトープに対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物中の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに対して向けられている。モノクローナル抗体調製物は、その特異性に加えて、他の抗体によって通常は汚染されていないという利点を有する。用語「モノクローナル」は、任意の特定の方法による前記抗体の産生を要するとは理解されない。
抗体は、腫瘍関連ペプチド抗原標的(このケースではPD-1)等の標的抗原に「特異的に結合」し、すなわち、前記抗原を発現する細胞又は組織を標的化する治療剤として前記抗体を使用することを可能にするために十分な親和性で前記抗原を結合し、また、他のタンパク質と顕著には交差反応しないか、又は、上記の標的タンパク質のホモログ及びバリアント(例えば、突然変異形態、スプライスバリアント、若しくはタンパク質加水分解トランケート形態)以外のタンパク質と顕著には交差反応しない。
用語「結合親和性」は、分子の個々の結合部位とその結合パートナーとの間の非共有結合相互作用を合わせたものの強度を指す。別段の記載がない限り、「結合親和性」は、本明細書において使用される場合、結合対のメンバー(例えば抗体及び抗原)間の1:1の相互作用を反映する、内因性の結合親和性を指す。本明細書において使用される場合、用語「KD」は、抗体-抗原相互作用の平衡解離定数を指す。本明細書において使用される場合、用語「kon」は、抗体が抗原に結合する速度定数を指す。本明細書において使用される場合、用語「koff」は、抗体が抗体/抗原複合体から解離する速度定数を指す。「KD」、「結合速度定数kon」、及び「解離速度定数koff」は、分子(例えば抗体)とその結合パートナー(例えば抗原)との間の親和性を説明するために一般に使用される。親和性は、すなわち、受容体が特定のタンパク質を結合する緊密性の程度である。結合親和性は、2つの分子の間の水素結合、静電気的相互作用、疎水性力、及びファンデルワールス力等の非共有結合性の分子間相互作用の影響を受ける。更に、リガンドとその標的分子との間の結合親和性は、他の分子の存在の影響を受け得る。親和性は、本明細書において記載されるELISAを含む、当技術分野において公知の従来の方法によって解析することができる。
用語「エピトープ」には、抗体又はT細胞受容体に特異的に結合するあらゆるタンパク質決定基クラスターが含まれる。エピトープ決定基クラスターは、典型的には、分子の化学的に活性な表面基(例えば、アミノ酸又は糖側鎖又はこれらの組み合わせ)からなり、特異的な三次元構造の特徴及び特異的な電荷の特徴を有することが多い。
用語「単離された」抗体は、抗体が発現している細胞の成分から同定及び単離されている抗体である。単離された抗体には、前記抗体の天然環境における少なくとも1つの成分が不在の組換え細胞内部のin situ抗体が含まれる。しかし、通常は、単離された抗体は、少なくとも1つの精製工程を介して調製される。
2つのポリペプチド又は核酸配列の間の「配列同一性」は、前記配列間で同一の残基の数を、残基の総数に対するパーセンテージとして示し、小さい方の比較対象分子のサイズに基づいて計算される。同一性パーセンテージを計算する場合、アラインされる配列は、配列間のマッチが最大となるような方法でマッチされ、マッチ内のギャップ(存在する場合)は、特定のアルゴリズムによって解決される。2つの配列の間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法としては、限定はしないが、GAP、BLASTP、BLASTN、及びFASTAを含む、GCGプログラムパッケージが含まれる(Altschulら、1990、J. Mol. Biol. 215: 403～410)。上記の手順は、International Center for Biotechnology Information(NCBI)及び他のソースから公開されている。周知のスミス・ウォーターマンアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用することができる。
用語「Fc受容体」又は「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体を指す。天然配列のヒトFcR、好ましくは、FcγRI、FcγRII、及びFcγRIIIアイソフォームを含む、IgG抗体に結合する受容体(ガンマ受容体)、並びにこれらの受容体のバリアントが好ましい。全ての他のFcRが、用語「FcR」に含まれる。この用語にはまた、胎児への母親のIgGの輸送に関与する新生児受容体(FcRn)も含まれる(Guyerら、Journal of Immunology 117: 587 (1976)、及びKimら、Journal of Immunology 24: 249 (1994))。
用語「新生児Fc受容体」は、「FcRn」と省略されるが、IgG抗体のFc領域に結合する。新生児Fc受容体(FcRn)は、インビボでのIgG様抗体の代謝運命において重要な役割を有する。FcRnは、IgGをリソソーム分解経路から守るように機能し、これによって、血清中でのそのクリアランスを低減させ、その半減期を延ばす。したがって、IgGのインビトロでのFcRn結合特性/特徴は、循環におけるそのインビボでの薬物動態学的特性の指標である。
用語「エフェクター機能」は、抗体のFc領域に起因し得る生物学的活性を指し、このFc領域はアイソタイプごとに変化する。抗体のエフェクター機能の例としては、C1q結合及び補体依存性細胞傷害性(CDC)、Fc受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性(ADCC)、抗体依存性細胞食作用(ADCP)、サイトカイン分泌、免疫複合体介在性の抗原提示細胞による抗原の取り込み、細胞表面受容体の下方調節(例えばB細胞受容体)、並びにB細胞活性化が含まれる。
用語「エフェクター細胞」は、1つ又は複数のFcRを発現し、エフェクター機能を実行する、白血球を指す。一態様において、前記エフェクター細胞は、少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を実行する。ADCCを仲介するヒト白血球の例としては、末梢血単核球(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞傷害性T細胞、及び好中球が含まれる。エフェクター細胞は、天然由来源、例えば血液から単離することができる。エフェクター細胞は通常、エフェクター相に関連するリンパ球であり、サイトカインを産生するために機能するか(ヘルパーT細胞)、病原体に感染した細胞を殺傷するか(細胞傷害性T細胞)、又は抗体を分泌する(分化型B細胞)。
「免疫細胞」には、造血系に由来し、免疫応答において役割を有する、細胞が含まれる。免疫細胞としては、B細胞及びT細胞等のリンパ球、ナチュラルキラー細胞、並びに、単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球等の骨髄細胞が含まれる。
「抗体依存性細胞介在性細胞傷害性」又は「ADCC」は、分泌されたIgが、ある特定の細胞傷害性細胞(例えば、NK細胞、好中球、及びマクロファージ)に存在するFcγ受容体に結合して、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合し、次いで例えば細胞毒を使用して前記標的細胞を殺傷することを可能にする、細胞傷害性の形態を指す。標的抗体のADCC活性を評価するために、米国特許第5,500,362号又は米国特許第5,821,337号又は米国特許第6,737,056号(Presta)において記載されているインビトロADCCアッセイ等の、インビトロADCCアッセイを行うことができる。このようなアッセイにおいて使用するための有用なエフェクター細胞としては、PBMC及びNK細胞が含まれる。
「補体依存性細胞傷害性」又は「CDC」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。補体活性化の従来の経路は、補体系の第1の成分(C1q)を、その対応する抗原に結合する抗体(適切なサブクラスの)に結合させることによって開始される。補体活性化を評価するために、Gazzano-Santoroら、J. Immunol Methods 202: 163 (1996)において記載されているCDCアッセイ等の、CDCアッセイを行うことができる。例えば、米国特許第6,194,551号及びWO1999/51642において、Fc領域のアミノ酸配列が改変されたポリペプチドバリアント(バリアントFc領域を有するポリペプチド)、及びC1q結合が増強又は低減しているポリペプチドバリアントが記載されている。
用語「COSENTYXバイオシミラー」及び「Taltzバイオシミラー」は、それぞれ、COSENTYX及びTaltzの構造に従って調製された抗体を指す。
本発明の抗体のアミノ酸配列
本発明は、組換えヒトIL17Aタンパク質を使用してマウスを免疫化し、次いで、ファージディスプレイライブラリースクリーニングによって、組換えヒトIL17Aタンパク質に特異的に結合する抗体クローンIL17A-M069を得た。IL17A-M069 scFv抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を次いで、PCRによって、マウスIgG1定常領域又はマウスカッパ軽鎖定常領域をそれぞれコードするヌクレオチド配列を有するpSTEP2ベクターに挿入し、そして、培養して発現させた。高純度の抗体を、タンパク質A精製カラムを使用して精製した。ELISAは、前記マウス抗体が、IL17Aによって誘導されるHFF細胞のIL-6分泌を遮断し得ることを示した。
次いで、ヒト化CDRの移植のための従来の方法を使用して、その配列がマウス軽鎖又は重鎖可変領域の配列により近いヒト抗体軽鎖又は重鎖可変領域を鋳型として選択し、マウス抗体軽鎖又は重鎖の3つのCDR(Table 1(表3))の各々を前記ヒト抗体の可変領域に挿入することによって、ヒト化軽鎖可変領域(VL)配列及び重鎖可変領域(VH)配列を得た。マウスフレームワーク領域の重要な部位はCDR活性の安定性の維持に必須であるため、当該重要な部位を、マウス抗体の対応する配列に復帰突然変異させた。IL17A-H069軽鎖/重鎖発現ベクターを全遺伝子合成によって得、CHO-K1-GS欠損細胞にトランスフェクトし、培養して発現させ、そして、抗体発現が高いクローンを更なる培養のために選択して、純度が高く質が高いIL17A-H069抗体を得た。
本発明の核酸
本発明はまた、本発明の抗体又はその一部分をコードする核酸分子にも関する。これらの核酸分子の配列には、限定はしないが、配列番号2～7、26～33、36～37、40～41、及び43が含まれる。
本発明の核酸分子は、本明細書において開示されている配列に限定されず、これらのバリアントも含む。本発明におけるバリアントは、ハイブリダイゼーションにおけるそれらの物理的特性を参照して記載され得る。当業者には、核酸ハイブリダイゼーション技術を使用して、核酸が、それらの補体及びそれらの同等物又はホモログを同定するために使用され得ることが認識されよう。また、ハイブリダイゼーションが100%未満の相補性で行われ得ることも認識されよう。しかし、条件が適切に選択されれば、ハイブリダイゼーション技術を使用して、特定のプローブに対するDNA配列の構造的関連性に基づいて前記DNA配列を区別することができる。このような条件についてのガイダンスについては、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、N. Y.、1989、並びにAusubel, F. M.、Brent, R.、Kingston, R. E.、Moore, D. D.、Sedman, J. G.、Smith, J. A.、及びStruhl, K.編(1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sonsを参照されたい。
組換えベクター及び発現
本発明はまた、本発明の1つ又は複数のヌクレオチド配列を含む組換え構築物も提供する。本発明の組換え構築物は、本発明の抗体をコードする核酸分子をプラスミド、ファージミド、ファージ、又はウイルスベクター等のベクターに挿入することによって構築される。
本明細書において提供される抗体は、軽鎖及び重鎖又はこれらの一部分をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞において組換え発現させることによって調製することができる。抗体を組換え発現させるために、宿主細胞に軽鎖及び/又は重鎖又はこれらの一部分をコードするヌクレオチド配列を有する1つ又は複数の組換え発現ベクターをトランスフェクトして、前記軽鎖及び重鎖を前記宿主細胞において発現させることができる。標準的な組換えDNA法が、重鎖及び軽鎖をコードする核酸を調製する及び/又は得るため、これらの核酸を組換え発現ベクターに組み込むため、並びに前記ベクターを宿主細胞に導入するために使用される。例えば、Sambrook、Fritsch、及びManiatis (編), Molecular Cloning; A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor, N.Y.、(1989)、Ausubel, F. M.ら(編) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)、並びに、Bossらによる米国特許第4,816,397号において記載されているもの。
適切な宿主細胞は、原核細胞及び真核細胞である。原核宿主細胞の例は細菌であり、真核宿主細胞の例は、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞である。調節配列の選択を含む、発現ベクターの設計が、宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル、及び発現が構成的であるか誘導性であるか等の多くの因子によって決定されることが理解されるべきである。
細菌発現
所望の抗体をコードする構造的DNA配列を、適切な翻訳開始シグナル及び翻訳終結シグナル及び機能的プロモーターと共に、作動可能なリーディングフレームに挿入することによって、細菌において使用するための発現ベクターが構築される。ベクターは、1つ又は複数の表現型選択マーカー、及び、ベクターの維持を確実にし、必要に応じて宿主内で増殖させるための、複製起点を有する。形質転換のための適切な原核生物宿主としては、大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、並びにシュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、及びスタフィロコッカス属(Staphylococcus)の複数の種が含まれる。
細菌ベクターは、例えば、ファージベース、プラスミドベース、又はファージミドベースであり得る。これらのベクターは、選択マーカー、及び周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)のエレメントを通常有する市販されているプラスミドに由来する細菌複製起点を有し得る。適切な宿主株を形質転換し、宿主株を適切な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適切な方法(例えば、温度変化又は化学的誘導)によって抑制解除/誘導し、そして細胞を更なる時間にわたり培養する。細胞は通常、遠心分離によって採取され、物理的又は化学的方法によって破壊され、そして、得られた租抽出物は更なる精製のために保持される。
細菌系において、様々な発現ベクターを、発現させるタンパク質の使用目的に従って、有利に選択することができる。例えば、多くのこのようなタンパク質が抗体産生又はペプチドライブラリースクリーニングのために産生される場合には、例えば、精製が容易な融合タンパク質産物の高レベルの発現を指示するベクターが望ましい場合がある。
哺乳動物での発現及び精製
哺乳動物宿主細胞における発現のための好ましい調節配列としては、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)に由来するプロモーター及び/又はエンハンサー(例えば、CMVプロモーター/エンハンサー)、シミアンウイルス40(SV40)のプロモーター及び/又はエンハンサー(例えば、SV40プロモーター/エンハンサー)、アデノウイルスのプロモーター及び/又はエンハンサー(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))、並びにポリオーマウイルスのプロモーター及び/又はエンハンサーが含まれる。ウイルス調節エレメント及びこれらの配列の更なる記載については、例えば、Stinskiによる米国特許第5,168,062号、Bellらによる米国特許第4,510,245号、及びSchaffnerらによる米国特許第4,968,615号を参照されたい。組換え発現ベクターはまた、複製起点及び選択マーカー(例えば、Axelらによる米国特許第4,399,216号、米国特許第4,634,665号、及び米国特許第5,179,017号を参照されたい)も含む。適切な選択マーカーは、G418、ハイグロマイシン、又はメトトレキサート等の薬物に対する耐性をベクターが導入されている宿主細胞に付与する遺伝子を含む。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子はメトトレキサートに対する耐性を付与し、一方、neo遺伝子はG418に対する耐性を付与する。
宿主細胞への発現ベクターのトランスフェクションは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、及びDEAE-デキストラントランスフェクション等の標準的な技術を使用して行うことができる。
本明細書において提供される抗体を発現させるための適切な哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)[Urlaub及びChasin、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216～4220において記載されているdhfr-CHO細胞を含み、例えばR.J. Kaufman及びP.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621において記載されているDHFR選択マーカーが利用される]、NSO骨髄腫細胞、COS細胞、並びにSP2細胞が含まれる。
本発明の抗体は、限定はしないが、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、タンパク質Aアフィニティークロマトグラフィー、タンパク質Gアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含む公知の方法によって、組換え細胞培養物から回収及び精製することができる。高性能液体クロマトグラフィー(「HPLC」)も、精製に使用することができる。例えば第1、4、6、8、9、及び10章の各々が参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science、John Wiley & Sons, NY、N.Y.、(1997～2001)を例えば参照されたい。
本発明の抗体の特徴及び機能
本発明のヒト化IL17A-H069抗体の特徴解析及び機能解析を行った。解析は、本発明の抗体が以下の利点を有することを示した:
(1)COSENTYXバイオシミラーよりも良好な、組換えヒトIL17Aタンパク質への特異的結合(ヒト化IL17A-H069抗体のEC50は46ng/mLであり、一方、COSENTYXバイオシミラーのEC50は74.8ng/mLである)(実施例4.1.1)。
(2)COSENTYXバイオシミラーよりも良好な、組換えヒトIL17A/F二量体タンパク質への特異的結合(ヒト化IL17A-H069抗体のEC50は36.3ng/mLであり、一方、COSENTYXバイオシミラーのEC50は63.9ng/mLである)(実施例4.1.2)。
(3)組換えヒトIL17Aタンパク質との良好な結合親和性(COSENTYXバイオシミラーよりもはるかに高く、2.88E-11M対9.55-11M)及び好ましい会合速度(COSENTYXよりもはるかに速く、6.71E+05M-1s-1対1.78E+05M-1s-1)、良好な結合親和性(COSENTYXバイオシミラーよりも高く、5.37E-10M対1.10-09M)及び好ましい会合速度(COSENTYXバイオシミラーよりも速く、1.44E+05M-1s-1対8.00E+04M-1s-1)(実施例4.1.3)。
(4)マウスmIL17Aタンパク質への種交差結合活性がない(実施例4.1.4)。
(5)COSENTYXバイオシミラーよりも有意に良好であるが、Taltzバイオシミラーに近く、組換えヒトIL17Aタンパク質を効果的に結合し、IL17Aタンパク質による受容体IL17RAの結合を効果的に阻害する(IC50:0.50μg/mL対2.99μg/mL対0.50μg/mL、最大阻害率:85.4%対73.5%対89.5%)(実施例4.2.1)。
(6)COSENTYXバイオシミラー及びTaltzバイオシミラーよりも良好に、組換えヒトIL17A/F二量体タンパク質を効果的に結合し、IL17Aタンパク質による受容体IL17RAの結合を効果的に阻害する(IC50:1.02μg/mL対1.2μg/mL対1.35μg/mL、最大阻害率:92.3%、87.9%、及び75%)(実施例4.2.2)。
(7)IL17A、IL17A/Fによって誘導されるHFF細胞のIL-6分泌を遮断する。中和IL17Aの活性は、COSENTYXバイオシミラーのそれよりもはるかに高く(EC50 0.19μg/mL対0.22μg/mL、最大中和率94.6%対51.6%)、中和IL17Aの活性は、Taltzバイオシミラーのそれに近く(EC50 0.20μg/mL対0.19μg/mL、最大中和率90.3%対95.9%)、中和IL17A/Fの活性はまた、COSENTYXバイオシミラーのそれよりも高く(EC50 1.19μg/mL対2.25μg/mL、最大中和率85.0%対79.5%)、そして、中和IL17A/Fの活性は、低濃度ではTaltzバイオシミラーよりも良好であるが、高濃度ではTaltzバイオシミラーに近い(EC50:0.83μg/mL対1.10μg/mL、最大中和率:72.90%対76.3%)(実施例5.1)。
(8)マウス乾癬モデルにおいて確認すると、本発明の抗体は、Taltzバイオシミラーよりも有意に良好な有効性で、乾癬の進行を効果的に軽減し、症候を低減させる(実施例6)。
(9)薬物動態学的に、本発明の抗体は、皮下注射後のより速い吸収及びより長い半減期を有する(実施例7)。
使用
本発明の抗体は、結腸直腸がんを治療するために使用することができる。本発明の抗体はまた、前記障害を治療するための薬剤を調製するためにも使用することができる。
医薬組成物
本発明の抗体は、本発明の抗体及び1つ又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤を含む医薬組成物を形成するために、少なくとも1つの他の作用剤(例えば、安定な化合物)と共に調製することができる。場合によって、医薬組成物は、更なる治療剤を含有し得る。
キット
本発明はまた、前述の本発明の医薬組成物を含有する1つ又は複数の容器を含む薬学的パッケージ及びキットにも関する。このような容器には、医薬品又は生物製剤の製造、使用、又は販売を管理している政府機関によって規定された形態の仕様書が添付されていてよく、これは、前記医薬品又は生物製剤を製造、使用、又は販売している上記機関によるヒト投与についての承認を反映している。
調製及び保存
本発明の医薬組成物は、当技術分野において公知の様式で、例えば、従来の混合方法、溶解方法、造粒方法、トローチ調製方法、製粉方法、乳化方法、カプセル化方法、包埋方法、又は凍結乾燥方法によって調製することができる。
許容可能な担体に配合された本発明の化合物を含む医薬組成物が既に調製されていたら、適応状態の治療のために、これらを適切な容器に入れ、ラベル付けしてよい。このようなラベルは、薬物の量、頻度、及び投与経路を含む。
組み合わせ物
上記の本発明の抗体を含む医薬組成物はまた、抗新生物剤等の1つ又は複数の他の治療剤と組み合わされ、この場合、得られた組み合わせ物は、許容できない副作用を生じさせない。
本発明は、以下の非限定的な実験例を参照して更に理解されよう。以下の実施例における実験方法は、別段の特定がない限り、全て従来の方法である。以下の実施例で使用される実験材料は、別段の特定がない限り、従来の生化学的試薬の販売者から購入した。
(実施例1)
IL17A抗体のスクリーニング
1.1 マウスの免疫化
マウスを、適切な変更を加えた、StGrothら(de StGroth及びScheidegger、1980)によって記載されている方法に従って、IL17Aで免疫化した。組換えヒトIL17Aタンパク質(SinoBiological, Inc社から入手、カタログ番号10247-H07B)を使用してマウスを免疫化した。IL17Aタンパク質のアミノ酸配列(UniprotKB Q16552)は、Met1～Ala155(配列番号1)である。組換えヒトIL17Aタンパク質をリン酸アルミニウムアジュバントと混合し(ここで、1回目及び4回目の免疫化は、完全フロイントアジュバントCFAエマルジョン型PBSを追加して行った)、マウスを当該混合物で、それぞれ2週間、3週間、及び3週間の間隔で4回、50μg/用量の用量で、複数の部位で、皮下で免疫化した。3回目の免疫化から、各免疫化の7日後に、眼の内眼角網状組織を介して血液を回収した。マウス抗IL17Aの血清力価を、被覆された組換えヒトIL17Aタンパク質を使用して、ELISAによって測定した。4回目の免疫化による血清の力価は、1:8000に希釈した後に標的に達し(ELISA、OD>1.0)、マウスを、4回目の免疫化の75日後に、25μgの組換えヒトIL17Aタンパク質で、静脈内でブーストした。4日後、マウスを屠殺し、脾臓組織を取り出し、液体窒素中で凍結した。
1.2 抗体ファージディスプレイライブラリーの構築及びスクリーニング
TriPure単離試薬(Roche社から入手、カタログ番号第11 667 165 001)を使用してRNAをマウス脾臓組織から抽出し、逆転写キット(Invitrogen社から入手、カタログ番号18080-051)を使用してRNAを逆転写することによってcDNAを得た。(Jones及びBendig 1991)において記載されている方法に従って、マウス抗体の軽鎖可変領域の配列を増幅するために2対のプライマーを設計し、重鎖可変領域の配列を増幅するために1対のプライマーを設計した。オーバーラップ伸長PCRによって、マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする配列を、scFvをコードするヌクレオチド配列にアセンブルし、次いで、これらの2つのヌクレオチド配列をリンカー(配列番号2)によって連結して、scFvをコードするヌクレオチド配列にアセンブルし、次いで、制限エンドヌクレアーゼSfi I(Fermentas社)によってファージベクターpComb3x(Sino Biological, Inc.社)に酵素的にライゲーションし、コンピテントX-Blueに電気的形質転換して、マウスscFv抗体ファージディスプレイライブラリーを構築した。ライブラリーのサイズは(sic)である。陽性抗IL17A抗体に富むファージライブラリーを、ファージ抗体パンニング(Aitken 2002)のプロセスに従ってELISAアッセイでスクリーニングして得た。組換えヒトIL17Aタンパク質を特異的に結合するscFv抗体を、富んだライブラリーの個々のコロニーファージによって発現させ、組換えヒトIL17Aタンパク質へのこれらの結合をELISAによって試験した。1つのコロニーのscFv抗体のヌクレオチド配列を配列番号3と決定し、IL17A-M069と名付けた抗体は、実施例1.3の工程後にこのコロニーに由来する。
1.3 マウスIL17Aモノクローナル抗体の産生
scFv抗体重鎖可変領域(配列番号4)、重鎖シグナルペプチド配列(配列番号43)、及びマウスIgG1重鎖定常領域配列(配列番号6)をコードするヌクレオチド配列を、オーバーラップ伸長PCRで増幅及びアセンブルし、Hind III+Xba I(Fermentas社)で消化したpSTEP2ベクターに挿入し、こうして、完全重鎖(配列番号36)発現ベクターを得た。同様に、scFv抗体軽鎖可変領域(配列番号5)、軽鎖シグナルペプチド配列(配列番号29)、及びマウスカッパ軽鎖定常領域配列(配列番号7)をコードするヌクレオチド配列をオーバーラップ伸長PCRで増幅及びアセンブルし、Hind III+Xba I(Fermentas社)で消化したpSTEP2ベクターに挿入し、こうして、完全軽鎖(配列番号37)発現ベクターを得た。重鎖シグナルペプチド、重鎖可変領域、及びマウスIgG1重鎖定常領域をアセンブルするためのプライマーは、以下の通りであった。
Figure 2022535151000001
軽鎖シグナルペプチド、軽鎖可変領域、及びマウスカッパ軽鎖定常領域をアセンブルするためのプライマーは、以下の通りであった。
Figure 2022535151000002
293E細胞(ATCC)を、SCD4-4-TC2培地(SinoBiological, Inc.社)を用いて、フラスコ内で、200mL/フラスコの容積で、0.3～0.4×106個細胞/mLの密度の初回接種で継代し、フラスコを、CO2振とう器内で、175rpmの回転速度で、37℃で、細胞密度が1.5～3×106個細胞/mLに達するまで培養した。次いで、軽鎖及び重鎖をコードするプラスミドを1:1の比率で混合し、混合したプラスミドDNA100μg及び800μLのTF2トランスフェクション試薬を培養フラスコに添加し、これを次いで、振とう器内で、175rpmの回転速度で、37℃で、回収のための7日目まで培養した。培養培地を4000rpmで25分間遠心分離し、上清を回収し、上清の1/5の容積のストックバッファーを添加した。タンパク質Aクロマトグラフィーカラムを5～10倍のカラム容積のPBSバッファーで平衡化した後、濾過した培養上清をクロマトグラフィーカラムに添加し、5～10倍のカラム容積で再び平衡化し、次いで、カラムを酢酸ナトリウムバッファーで溶出してサンプルを回収した。サンプルをTrisで中和して、中性溶液中で高純度のマウスモノクローナル抗体を得た。
(実施例2)
マウスIL17Aモノクローナル抗体の機能解析
2.1マウス抗体IL17A-M069は、IL17Aによって誘導されるHFF細胞のIL-6分泌を遮断する
Beerli、Bauerら、2014によって記載されているように、IL17Aは、インビトロ条件下で、ヒト包皮線維芽細胞HFFのサイトカインIL-6分泌を刺激する。抗IL17A抗体をこの系に添加して、HFF細胞からのIL-6の分泌を検出することによって、IL17Aに対するIL17A抗体の中和効果を確認した。HFF細胞(ATCC、SCRC-1041)を96ウェルプレートに1×104個/ウェルの細胞密度で接種し、15%FBSを含有するDMEM培地中で一晩培養した。翌日、異なる濃度のIL17A-M069抗体及びポジティブコントロールTaltzバイオシミラーをそれぞれ10μL/ウェルで添加し、次いで、最終濃度50ng/mLのIL17Aタンパク質を10μL/ウェルで添加した。96ウェルプレートを37℃、5%CO2の細胞インキュベーターで48時間インキュベートし、ブランクウェルB(細胞なし)、ネガティブコントロールM'(細胞接種あり、抗体サンプルなし、IL17Aの添加あり)、及びM(細胞接種あり、抗体サンプルなし、及びIL17Aなし)を使用した。インキュベーション後、上清を回収し、IL-6の分泌をELISAによって測定した。サンプルウェル及びM'群ウェルのIL-6分泌をM群ウェルのIl-6分泌からそれぞれ差し引いて、阻害率を計算する。阻害率%=(1-サンプルウェルのIL-6分泌)/M'群ウェルのIL-6分泌×100%である。抗体サンプル濃度を水平座標として取り、IL-6分泌を垂直座標として取って、統計ソフトウェアを使用して標準曲線を計算した。結果を図1に示し、マウス抗体IL17A-M069は、IL17Aによって誘導されるHFF細胞のIL-6分泌を遮断し得、IL17Aに対するIL17A-M069の最大阻害率及び阻害濃度中央値は、ポジティブコントロールTaltzバイオシミラーのそれに類似しており、マウス抗体IL17A-M069及びTaltzバイオシミラーの最大阻害率は、それぞれ96.33%及び97.35%であり、EC50はそれぞれ243.3ng/mL及び246.6ng/mLであった。したがって、IL17A-M069は、インビトロ活性が良好な好ましい抗体であり、その後のヒト化修飾及び機能解析をIL17A-M069で行った。
(実施例3)
IL17A抗体IL17A-M069のヒト化及び産生
実施例2におけるマウス抗体IL17A-M069の機能解析の結果に基づいて、ヒト化及び産生を適切に行った。
3.1 IL17A抗体IL17A-M069の軽鎖及び重鎖のCDR配列の決定
実施例1.3で決定された抗体IL17A-M069-scFvのヌクレオチド配列に基づいて、抗体IL17A-M069-scFvの重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を推定した。配列番号8/9を参照されたい。
Kabatインデックスシステム(Abhinandan及びMartin 2008;Dondelinger、Fileeら、2018)並びにIMGTナンバリングシステム(Lefranc 2014)を参照して、マウス抗体IL17A-M069-scFvの軽鎖及び重鎖の3つのCDRの各々のアミノ酸配列を決定した。Table 1(表3)及び配列番号10～15を参照されたい。次の工程で、軽鎖及び重鎖の前述のそれぞれの3つのCDRを移植し、これは、最終的に得られたヒト化抗体IL17A-H069において保持されていた。実施例3.2及び3.3を参照されたい。
Figure 2022535151000003
3.2 マウス抗体のCDR移植
マウス抗体のヒト化を、CDR移植の従来のヒト化方法を使用して行った(Kettleborough、Saldanhaら、1991)。マウス軽鎖又は重鎖可変領域により近いヒト抗体軽鎖又は重鎖可変領域(類似性>50%)を鋳型として選択し、マウス軽鎖又は重鎖の3つのCDR配列(配列番号10～15)の各々をヒト抗体の可変領域に挿入して、ヒト化軽鎖可変領域(VL)又はヒト化重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列をそれぞれ得た。IL17A-M069の軽鎖可変領域のヒト鋳型は、IL17A-M069の軽鎖に75.2%相同なIGKV4-1*01であり、重鎖可変領域のヒト鋳型は、IL17A-M069の重鎖に65.3%相同なIGHV1-69-2*01である。
3.3 ヒト化可変領域のフレームワーク領域での復帰突然変異
マウス由来のフレームワーク領域内の一部の重要なアミノ酸はCDRの空間構造の安定性及び抗体結合活性の維持に必須であるため、これら重要なアミノ酸を、安定な空間構造を有する抗体が得られるまで、対応するマウス抗体アミノ酸に復帰突然変異させ、Kabatインデックスシステムに従って、以下の部位を復帰突然変異させた:軽鎖では、48位をVに復帰突然変異させ、49位をDに復帰突然変異させ、そして87位をFに復帰突然変異させた。一方、重鎖では、24位をAに復帰突然変異させ、そして43位をHに復帰突然変異させた。ヒト化抗体IL17A-H069を、CDRヒト化移植及びフレームワーク領域の復帰突然変異によって得、その重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をそれぞれ配列番号16/17で示す。連続的に連結した重鎖/軽鎖シグナルペプチド配列(配列番号20/21)、ヒト化抗体重鎖/軽鎖可変領域配列(配列番号22/23)、ヒト化抗体IgG1重鎖定常領域/ヒトカッパ軽鎖定常領域配列(配列番号24/25)をそれぞれ含む、シグナルペプチドを有する形態のその重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を、それぞれ配列番号18/19で示す。
3.4 ヒト化モノクローナル抗体IL17A-H069の産生
順に結合された、軽鎖シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列(配列番号29)、ヒト化抗体軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列(配列番号31)、及びヒト抗体カッパ軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列(配列番号33)を有する、抗体IL17A-H069軽鎖及びシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列(配列番号27)をPCR増幅し、自社開発のpGSベクター(Kpn I+Xba I)にin-fusion方法によって挿入し、正確なプラスミドをシーケンシングによって確認した。同様に、順に結合された、重鎖シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列(配列番号28)、ヒト化抗体重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列(配列番号30)、及びヒト抗体IgG1抗体重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列(配列番号32)を有する、シグナルペプチドを有する抗体IL17A-H069重鎖をコードするヌクレオチド配列(配列番号26)をPCR増幅し、軽鎖遺伝子を正確に有することが確認されているpGSベクター(Nhe I+Not I)に、in-fusion方法によって挿入し、そして、IL17A-H069の軽鎖及び重鎖の両方を発現する正確なベクターを、シーケンシングによって確認した。これら発現ベクターは、選択マーカーとしてのGS遺伝子、並びに抗体軽鎖及び重鎖の発現エレメントを有する、真核性の発現ベクターである。これら発現ベクターをCHO-K1-GS-欠損細胞にトランスフェクトし、IL17A-H069高発現細胞系をMSXスクリーニングによって得た。抗体発現が高いクローンをELISAアッセイによって選択し、高発現細胞系を、細胞の増殖状態及び抗体薬のための重要な質的特徴の両方を考慮することによって選択した。無血清懸濁液培養を使用して、IL17A-H069を産生するCHO細胞系を培養して、純度が高く質の高いIL17A-H069抗体を得た。
(実施例4)
ヒト化抗体IL17A-H069の抗原結合親和性の解析
4.1 IL17Aタンパク質に対するヒト化抗体の結合親和性の解析
4.1.1 組換えヒトIL17Aタンパク質へのIL17A-H069の結合
異なる濃度の組換えヒトIL17Aタンパク質(SinoBiological, Inc.社)を、100μL/ウェルで一晩、4℃で、96ウェルプレートに被覆した。翌日、プレートを洗浄し、室温で1時間遮断させた。2μg/mLのCOSENTYXバイオシミラー(SinoCelltech Co., Ltd.社)及びIL17A-H069(SinoCelltech Co., Ltd.社)100μLとそれぞれインキュベートした後、プレートを洗浄して未結合の抗体を除去し、次いで、ヤギ抗ヒトIgG Fc/HRPとインキュベートし、繰り返し洗浄し、そして色素生成性基質溶液を添加して発色させた。発色が安定した後、OD450を測定した。組換えヒトIL17Aタンパク質の濃度を水平座標として取り、OD450値を垂直座標として取って、graphPad Prism 6.0ソフトウェアをデータ解析に使用し、用量-有効性曲線を作成し、半数影響濃度EC50値を計算した。
図2に示す結果は、組換えヒトIL17Aタンパク質へのCOSENTYXバイオシミラーの結合のEC50値が74.8ng/mLであり、R2=0.9993であること、組換えヒトIL17Aタンパク質へのIL17A-H069の結合のEC50値が46ng/mLであり、R2=0.9958であることを示している。これは、組換えヒトIL17Aタンパク質へのIL17A-H069の結合能力がCOSENTYXバイオシミラーのそれよりもわずかに良好であることを示している。
4.1.2 組換えヒトIL17A/IL17Fタンパク質へのIL17A-H069の結合
異なる濃度の組換えヒトIL17A/F二量体タンパク質(SinoBiological, Inc.社、CT047-HNAE)を、100μL/ウェルで一晩、4℃で、96ウェルプレートに被覆した。翌日、プレートを洗浄し、室温で1時間遮断させた。2μg/mLのCOSENTYXバイオシミラー(SinoCelltech Co., Ltd.社)及びIL17A-H069(SinoCelltech Co., Ltd.社)100μLとそれぞれインキュベートした後、プレートを洗浄して未結合の抗体を除去し、次いで、ヤギ抗ヒトIgG Fc/HRPとインキュベートし、繰り返し洗浄し、そして、色素生成性基質溶液を添加して発色させた。発色が安定した後、OD450を測定した。組換えヒトIL17A/Fタンパク質の濃度を水平座標として取り、OD450値を垂直座標として取って、graphPad Prism 6.0ソフトウェアをデータ解析に使用し、用量-有効性曲線を作成し、半数影響濃度EC50値を計算した。
図3に示す結果は、組換えヒトIL17A/Fタンパク質へのCOSENTYXバイオシミラーの結合のEC50値が63.9ng/mLであり、R2=0.9999であること、組換えヒトIL17A/Fタンパク質へのIL17A-H069結合のEC50値が36.3ng/mLであり、R2=1.0であることを示している。これは、IL17A-H069の組換えヒトIL17A/F二量体タンパク質への結合能力がCOSENTYXバイオシミラーのそれよりもわずかに良好であることを示している。
4.1.3 組換えヒトIL17Aタンパク質及び組換えヒトIL17A/IL17Fタンパク質へのIL17A-H069の結合親和性のアッセイ
ビオチン化されたIL7Aタンパク質又はIL17A/Fタンパク質に対する、異なる濃度(0.42nM、0.90nM、1.74nM、及び3.47nM)のIL17A-H069、並びに異なる濃度(0.90nM、1.74nM、3.47nM、6.94nM、及び13.9nM)のポジティブコントロールCOSENTYX(Norvatis社、SHM12)の親和性を、Octet生体分子相互作用アッセイシステムを使用してそれぞれ決定した。Table 2(表4)の結果は、組換えヒトIL17Aタンパク質に対するIL17A-H069の結合親和性KDの値が2.88E-11Mであり、会合速度定数konが6.71E+05M-1s-1であり、そして解離速度定数koffが1.93E-05s-1であり、一方で、IL17Aタンパク質に対するCOSENTYXの結合親和性KDの値が9.55E-11Mであり、会合速度定数konが1.78E+05M-1s-1であり、そして解離速度定数koffが1.70E-05s-1であることを示した。組換えヒトIL17A/Fタンパク質に対するIL17A-H069の結合親和性KDの値は5.37E-10Mであり、会合速度定数konは1.44E+05M-1s-1であり、そして解離速度定数koffは7.72E-05s-1であった。一方で、IL17A/Fタンパク質に対するCOSENTYXの結合親和性KDの値は1.10E-09Mであり、会合速度定数konは8.00E+04M-1s-1であり、そして解離速度定数koffは8.79E-05s-1であった。結果は、IL17A-H069がCOSENTYXのそれよりも強力な親和性でIL17Aタンパク質を結合し、IL17A-H069の親和性がCOSENTYXのそれの約3.32倍であり、そしてIL17A-H069がより速い会合速度を有し、そのため、IL17A-H069がCOSENTYXよりも強力なIL17Aタンパク質への結合能力を有すること、IL17A-H069がCOSENTYXのそれよりも強力な親和性でIL17A/Fタンパク質を結合し、IL17A-H069の親和性がCOSENTYXの親和性の約2.05倍であり、そして、IL17A-H069がより速い会合速度を有し、したがって、IL17A-H069がCOSENTYXよりも強力なIL17A/Fタンパク質への結合能力を有することを示した。
Figure 2022535151000004
4.1.4 マウスIL17Aタンパク質に対するIL17A-H069の種交差反応性の決定
異なる濃度の組換えヒトIL17Aタンパク質(Sino Biological, Inc.社)及びマウスmIL17Aタンパク質(Sino Biological, Inc.社)を、ウェル当たり100μLで一晩、4℃で、96ウェルプレートにそれぞれ被覆した。翌日、プレートを洗浄し、室温で1時間遮断させた。2μg/mLのIL17A-H069(Sino Biological, Inc.社)、ポジティブコントロールCOSENTYX(Norvatis社、SHM12)、及びネガティブコントロール抗体H7N9-R1(SinoCelltech Co., Ltd.社)100μLをそれぞれ添加し、インキュベートした。プレートを洗浄して未結合の抗体を除去した。プレートをヤギ抗ヒトIgG Fc/HRP(Sino Biological, Inc.社)とインキュベートし、次いで、繰り返し洗浄し、そして色素生成性基質溶液を添加して発色させた。発色が安定した後、OD450を測定した。図4に示す結果は、IL17A-H069がマウスmIL17Aタンパク質との交差結合を有さないことを示している。
4.2 IL17A-H069は、受容体IL17RAへのIL17Aタンパク質及びIL17A/Fタンパク質の結合を遮断する
4.2.1 IL17A-H069は、受容体IL17RAへのIL17Aタンパク質の結合を遮断する
0.4μg/mLの濃度のIL17Aタンパク質を、ウェル当たり100μLで一晩、4℃で、96ウェルプレートに被覆した。翌日、プレートを洗浄し、室温で1時間遮断させた。2μg/mLのビオチン化されたタンパク質IL17RA-His-ビオチン(Sino Biological, Inc.社)100μLを各ウェルに添加し、次いで、異なる濃度のIL17A-H069(SinoCelltech Co., Ltd.社)、ポジティブコントロールCOSENTYX(Norvatis社、SHM12)、ポジティブコントロールTaltz(Eli Lilly社)、及びネガティブコントロール抗体H7N9-R1(SinoCelltech Co., Ltd.社)をそれぞれ添加し、インキュベートした。プレートを洗浄して未結合の抗体を除去した。プレートをストレプトアビジン/HRP(Beijing ZSGB-Bio Co., Ltd.社、SA-5004)とインキュベートし、次いで繰り返し洗浄し、そして色素生成性基質溶液を添加して発色させた。発色が安定した後、OD450を測定し、各群について2回ずつ試験した。
抗体濃度を水平座標として取り、阻害率%を垂直座標として取って、graphPad Prism 6.0ソフトウェアをデータ解析に使用し、チャートを作成し、IC50値を計算した。阻害率%=(ODブランク-ODサンプル)/ODブランク×100%であり、式中、ODブランクは、IL17RA-His-ビオチンタンパク質のみが添加され抗体は添加されていないサンプルのOD値であり、ODサンプルは、IL17RA-His-ビオチンタンパク質及び抗体の両方が添加されたサンプルのOD値である。
図5に示す結果は、ビオチン化されたIL17RAタンパク質が、被覆された組換えヒトIL17Aタンパク質を効果的に結合し得、抗体IL17A-H069が、その阻害曲線によって示されるように、受容体IL17RAへのIL17Aタンパク質の結合を、ポジティブコントロールCOSENTYXよりも有意に良好なプロファイルで阻害し得たが、IL17A-H069の、受容体IL17RAへのIL17Aタンパク質の結合の阻害プロファイルは、ポジティブコントロールTaltzのそれに近かったことを示している。IL17A-H069、COSENTYX、及びTaltzのIC50値は、それぞれ0.50μg/mL、2.99μg/mL、及び0.50μg/mLであり、最大阻害率は、それぞれ85.4%、73.5%、及び89.5%であった。
4.2.2 IL17A-H069は、受容体IL17RAへのIL17A/Fタンパク質の結合を遮断する
5μg/mLの濃度のIL17RA-Fcタンパク質(Sino Biological, Inc.社)を、ウェル当たり100μLで一晩、4℃で、96ウェルプレートに被覆した。翌日、プレートを洗浄し、室温で1時間遮断させた。0.8μg/mLのIL17A/F-ビオチンタンパク質(Sino Biological, Inc.社)100μLを各ウェルに添加し、次いで、異なる濃度のIL17A-H069(SinoCelltech Co., Ltd.社)、ポジティブコントロールCOSENTYXバイオシミラー(SinoCelltech Co., Ltd.社)、ポジティブコントロールTaltzバイオシミラー(SinoCelltech Co., Ltd.社)、及びネガティブコントロール抗体H7N9-R1(SinoCelltech Co., Ltd.社)をそれぞれ添加し、インキュベートした。プレートを洗浄して未結合の抗体を除去した。プレートをストレプトアビジン/HRP(Beijing ZSGB-Bio Co., Ltd.社、SA-5004)とインキュベートし、次いで繰り返し洗浄し、そして色素生成性基質溶液を添加して発色させた。発色が安定した後、OD450を測定した。
抗体濃度を水平座標として取り、阻害率%を垂直座標として取って、graphPad Prism 6.0ソフトウェアをデータ解析に使用し、チャートを作成し、IC50値を計算した。阻害率%=(ODブランク-ODサンプル)/ODブランク×100%であり、式中、ODブランクは、IL17A/F-ビオチンタンパク質のみが添加され抗体は添加されていないサンプルのOD値であり、ODサンプルは、IL17A/F-ビオチンタンパク質及び抗体の両方が添加されたサンプルのOD値である。
図6に示す結果は、IL17A/F-ビオチンタンパク質が、被覆された組換えヒトIL17RA-Fcタンパク質を効果的に結合し得、抗体IL17A-H069の添加が、IL17A/Fタンパク質によるその受容体IL17RA-Fcの結合を効果的に阻害し得たことを示している。IL17A-H069は、IL17A/Fタンパク質のその受容体IL17RA-Fcへの結合に対して、ポジティブコントロールCOSENTYXバイオシミラー及びポジティブコントロールTaltzバイオシミラーよりも良好な阻害効果を有する。IL17A-H069、COSENTYXバイオシミラー、及びTaltzバイオシミラーのIC50値はそれぞれ1.02μg/mL、1.20μg/mL、及び1.35μg/mLであり、最大阻害率は、それぞれ92.3%、87.9%、及び75%であった。
(実施例5)
ヒト化抗体IL17A-H069の機能解析
5.1 IL17A-H069は、IL17Aによって誘導される又はIL17A/Fによって誘導されるHFF細胞のIL-6分泌を遮断する
HFF細胞を96ウェルプレートに1×104個/ウェルの細胞密度で接種し、15%FBSを含有するDMEM培地中で一晩培養した。翌日、異なる濃度のIL17A-H069(SinoCelltech Co., Ltd.社)及びポジティブコントロールCOSENTYX(Norvatis社)又はポジティブコントロールTaltz(Eli Lilly社)をそれぞれ10μL/ウェルで添加した。その後、最終濃度50ng/mLのIL17Aタンパク質(Sino Biological, Inc社、12047-HNAS)又は最終濃度1μg/mLのIL17A/Fタンパク質(Sino Biological, Inc社、CT047-HNAE)10μLを各ウェルにそれぞれ添加した。96ウェルプレートを37℃、5%CO2の細胞インキュベーターで48時間インキュベートし、ブランクウェルB(細胞なし)、ネガティブコントロールM'(細胞接種あり、抗体サンプルなし、IL17A又はIL17A/Fの添加あり)、並びにM(細胞接種あり、抗体サンプルなし、及びIL17A又はIL17A/Fなし)を使用した。インキュベーション後、上清を回収し、IL-6の分泌をELISAによって測定した。サンプルウェル及びM'群ウェルのIL-6分泌をM群ウェルのIl-6分泌からそれぞれ差し引いて、阻害率を計算する。阻害率%=(1-サンプルウェルのIL-6分泌)/M'群ウェルのIL-6分泌×100%である。抗体サンプル濃度を水平座標として取り、IL-6分泌を垂直座標として取って、統計ソフトウェアを使用して標準曲線を計算し、4パラメータロジスティック回帰方程式を使用して、標準的な「S」曲線を当てはめて、抗体サンプルの半数影響濃度(EC50)を計算した。
上記の測定において、図7及びTable 3(表5)に示すように、IL17Aの中和におけるIL17A-H069の活性(EC50:0.19μg/mL、最大中和率:94.6%)は、ポジティブコントロールCOSENTYX(EC50:0.22μg/mL、最大中和率:51.6%)よりもはるかに高かった(図6A)。ポジティブコントロールTaltzと比較して、IL17Aの中和におけるIL17A-H069の活性(EC50:0.20μg/mL、最大中和率:90.3%)は、Taltzの中和活性(EC50:0.19μg/mL、最大中和率:95.9%)に近かった(図6C)。IL17A/Fの中和におけるIL17A-H069の活性(EC50:1.19μg/mL、最大中和率:85.0%)もまた、COSENTYXのそれ(EC50:2.25μg/mL、最大中和率:79.5%)よりもわずかに高かった(図6B)。ポジティブコントロールTaltzと比較して、高濃度では、IL17A/Fの中和におけるIL17A-H069の活性(EC50:0.83μg/mL、最大中和率:72.90%)は、Taltzのそれ(EC50:1.10μg/mL、最大中和率:76.3%)に近く、また、低濃度では、ポジティブコントロールTaltzよりも優れていた(図6D)。結論として、IL17A-H069は、IL17A及びIL17A/F中和のより良好な生物学的活性を有する。
Figure 2022535151000005
(実施例6)
マウスにおけるヒト化抗体のインビボでの有効性
6.1 hPBMC免疫再構成マウス乾癬(PsO)モデルにおけるIL17A-H069のインビボでの有効性
3頭のドナーから得たhPBMCを使用して、全部で60頭の、ヒト化免疫系を有するB-NDGマウス(Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd.社)を得た(ドナーのhPBMC当たり20頭のマウス)。末梢血を1週間後に回収し、ヒト由来細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって測定した。20頭のマウスが0.04～1.5%の間のヒト由来細胞パーセンテージを有しており、31頭のマウスが1.5～7%のパーセンテージを有しており、そして8頭のマウスが>7%のパーセンテージを有していた。1.5～7%のパーセンテージを有するマウスを選択してIMQ(イミキモド)誘導性マウス乾癬モデルを確立し、これに基づいて、IL17A-H069の有効性を評価した。
登録したマウスを以下の戦略に従ってグループ分けした:5頭の非モデル化マウスを正常コントロール群G1にグループ分けし、5頭の、薬物を投与されていない乾癬モデル化マウスを、G2群、すなわち乾癬モデル群にグループ分けし、7頭の、IL17A-H069を投与された乾癬モデル化マウスをG3群にグループ分けし、そして7頭の、ポジティブコントロールTaltzを投与された乾癬モデル化マウスをG4群にグループ化した。全てのマウスの背中の毛を剃って、約2cm×3cmのサイズの曝露された区域を形成し、毎日10日間、100mgのIMQクリームをG2、G3、及びG4群の各マウスの背中に塗布し、10mgのIMQクリームをG2、G3、及びG4群の各マウスの耳に塗布した。マウスのPASIスコアを毎日記録した。Table 4(表6)に示すPASIスコアリング基準に従って、マウスに、病変の紅斑、鱗屑、及び背部皮膚の肥厚の程度についてそれぞれスコア0～4を付与し、3つのスコアを合計して総スコアを得た。G3群及びG4群では、抗体投与はIMQクリーム塗布の1日目に開始し、10mpkの用量で週に2回行った。
Figure 2022535151000006
結果を図8に示す。正常コントロール群のマウスと比較して、PASIスコアは、乾癬モデル群のマウスにおいて有意に高く、このことは、このマウスモデルが乾癬をある程度特徴とし得ることを反映している。5日目から、PASIスコアは、乾癬モデル群と比較してIL17A-H069投与群において有意に低かった。また、Taltzコントロール群と比較して、IL17A-H069は、マウスにおける乾癬スコアの低減において、強力なインビボでの有効性を有しており、したがって、IL17A-H069は、乾癬モデルマウスにおける乾癬(PsO)の発病の軽減及び乾癬症候の低減において効果的である。
(実施例7)
ヒト化抗体のインビボでの薬物動態学
7.1 カニクイザルにおけるIL17A-H069の単回皮下注射の薬物動態学
この実施例において、IL17A-H069抗体の単回皮下注射を1mg/kgの用量でカニクイザルに投与した。血清を、投与前、並びに投与の1時間後、2時間後、4時間後、6時間後、8時間後、24時間後、48時間後、3日後、4日後、7日後、10日後、14日後、17日後、21日後、24日後、28日後、31日後、及び35日後にそれぞれ回収した。確立されたELISA法を使用して、サル血清中のIL17A-H069の薬物濃度を測定し、非コンパートメント解析(NCA)Phoenix-WinNonlin(Pharsight社)6.4ソフトウェアを使用して、薬物動態学的パラメータを計算した。IL17A-H069の単回皮下注射後のインビボでの薬物変化プロファイルの動的パターンを調べた。IL17A-H069の単回皮下注射後の体内の薬物の動的変化を調べる。
経時的なIL17A-H069薬物濃度の変化をTable 6(表7)及び図9に示す。Cmax及びAUClastにおいて、メスマウスとオスマウスとの間の有意な性別差はなく(結果は示されていない)、IL17A-H069の半減期t1/2は353.66時間であり、Tmax値は34時間であった。インビボでの曝露に関しては、IL17A-H069のAUClastは3846.86時間×μg/mLであった。
1mg/kgの用量では、IL17A-H069は、より短いTmax及びより長いt1/2を有し、したがって、IL17A-H06は、皮下注射後の速い吸収、長い半減期、及びより良好な薬物曝露等を含む、より優れた薬物動態学を示し、したがって、より長い投与サイクルの基礎となる。
Figure 2022535151000007
Figure 2022535151000008
Figure 2022535151000009
Figure 2022535151000010
Figure 2022535151000011
Figure 2022535151000012
Figure 2022535151000013
Figure 2022535151000014
Figure 2022535151000015
Figure 2022535151000016
Figure 2022535151000017
Figure 2022535151000018
Figure 2022535151000019
(参考文献)
Figure 2022535151000020
Figure 2022535151000021

Claims (22)

  1. 配列番号13で示されるアミノ酸配列を有する重鎖CDR1領域、及び配列番号14で示されるアミノ酸配列を有する重鎖CDR2領域、及び配列番号15で示されるアミノ酸配列を有する重鎖CDR3領域を有する、重鎖可変領域、並びに
    配列番号10で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1領域、配列番号11で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2領域、及び配列番号12で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3領域を有する、軽鎖可変領域
    を含む、単離された抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。
  2. 配列番号22で示されるアミノ酸配列又は配列番号22に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域、及び
    配列番号23で示されるアミノ酸配列又は配列番号23に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域
    を含む、請求項1に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。
  3. ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項1に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。
  4. 重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を更に含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片であって、好ましくは、
    前記重鎖定常領域が、配列番号24で示されるアミノ酸配列又は配列番号24に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、IgG1重鎖定常領域であり、且つ/或いは
    前記軽鎖定常領域が、配列番号25で示されるアミノ酸配列又は配列番号25に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、ヒトカッパ軽鎖定常領域である、
    抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。
  5. 重鎖可変領域に連結したシグナルペプチド、及び/又は軽鎖可変領域に連結したシグナルペプチドを更に含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片であって、好ましくは、
    重鎖可変領域に連結した前記シグナルペプチドが、配列番号20で示されるアミノ酸配列又は配列番号20に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ/或いは
    軽鎖可変領域に連結した前記シグナルペプチドが、配列番号21で示されるアミノ酸配列又は配列番号21に対して少なくとも90%、92%、95%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列である、
    抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。
  6. IgG抗体、好ましくはIgG1抗体である、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。
  7. モノクローナル抗体である、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。
  8. 組換えヒトIL17Aタンパク質に対する前記抗IL17A抗体又はその抗原結合断片の結合親和性KDが、0.1-10E-11M、好ましくは0.5-5E-11M、そして更に好ましくは2.88E-11Mである、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。
  9. 組換えヒトIL17A/Fタンパク質に対する前記抗IL17A抗体又はその抗原結合断片の結合親和性KDが、0.1-10E-10M、好ましくは0.5-5E-10M、そして更に好ましくは5.37E-10Mである、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。
  10. 前記抗原結合断片が、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fd断片、Fd'断片、単鎖抗体分子、又は単一ドメイン抗体であり、単鎖抗体分子が、好ましくはscFv、ジ-scFv、トリ-scFv、ダイアボディ、又はscFabである、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片。
  11. 請求項1から10のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片、及び更なる治療剤を含む、抗体-薬物コンジュゲートであって、好ましくは、前記抗IL17A抗体又はその抗原結合断片がリンカーを介して更なる治療剤と結合している、抗体-薬物コンジュゲート。
  12. 請求項1から10のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
  13. 重鎖可変領域をコードする、配列番号30で示されるヌクレオチド配列、及び/又は、軽鎖可変領域をコードする、配列番号31で示されるヌクレオチド配列を含む、請求項12に記載の核酸。
  14. 請求項12又は13に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  15. 請求項12若しくは13に記載の核酸、又は請求項14に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  16. 請求項15に記載の宿主細胞を抗体発現に適した条件下で培養する工程、及び発現した抗体を培養培地から採取する工程を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体又はその抗原結合断片を産生するための方法。
  17. 請求項1から10のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項11に記載の抗体-薬物コンジュゲート、又は請求項12若しくは13に記載の核酸、又は請求項14に記載の発現ベクター、及び薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
  18. 乾癬の治療において使用するための、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項11に記載の抗体-薬物コンジュゲート、又は請求項17に記載の医薬組成物。
  19. 必要とする対象に治療有効量の請求項1から10のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項11に記載の抗体-薬物コンジュゲート、又は請求項17に記載の医薬組成物を投与して、乾癬を治療する工程を含む、乾癬を治療するための方法。
  20. 乾癬の治療のための医薬の調製における、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項11に記載の抗体-薬物コンジュゲート、又は請求項17に記載の医薬組成物の使用。
  21. 請求項1から10のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項11に記載の抗体-薬物コンジュゲート、又は請求項17に記載の医薬組成物、及び1つ又は複数の更なる治療剤を含む、医薬組み合わせ物。
  22. 請求項1から10のいずれか一項に記載の抗IL17A抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項11に記載の抗体-薬物コンジュゲート、又は請求項17に記載の医薬組成物を含み、好ましくは、投与のためのデバイスを更に含む、キット。
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