CN114127106B - 人源化抗VEGF Fab抗体片段及其用途 - Google Patents

人源化抗VEGF Fab抗体片段及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于肿瘤免疫治疗领域，涉及人源化抗VEGF Fab抗体片段。本发明公开编码所述抗体片段的核酸序列(包括重/轻链可变区)、含有所述核酸序列的载体、药物组合物和试剂盒。本发明公开的抗VEGF Fab抗体片段可以以高亲和力特异性结合VEGF，阻断VEGF与受体VEGFR2结合，还能中和VEGF对HUVEC细胞的增殖作用。相比于全长结构，Fab片段的抗体具有更强的穿透性，和更低的胃肠道穿孔、高血压和出血等毒副作用且不能激发补体级联反应，从而降低引发眼内炎和自身免疫炎症反应的风险，可用于临床治疗多种以脉络膜新生血管为特征的眼病，包括但不局限于年龄相关性老年黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、视网膜水肿、退行性近视、脉络膜新生血管(CNV)。

Description

人源化抗VEGF Fab抗体片段及其用途
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体地涉及人源化抗VEGF Fab抗体片段。
背景技术
血管系统的发育是许多生理和病理过程的基础。血管内皮生长因子(Vascularendothelial growth factor，VEGF)是一组具有重要促血管生成活性的生长因子，具有促进内皮细胞有丝分裂和抗细胞凋亡，增加血管通透性，促进细胞迁移等作用。人VEGF基因定位在6p21.3染色体上，属于VEGF/PDGF超基因家族，编码的VEGF由二硫键连接组成二聚体。在人体，VEGF家族包括多个具有不同功能的成员：VEGFA(VEGF，具有多种不同的剪切形式)、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE、VEGFF和胎盘生长因子(Placenta growth factor，PIGF)。最近，将内分泌源性内皮生长因子(Endocrine gland-derived vascular endothelialgrowth factor，EG-VEGF)也纳入该家族中(Samson M et al.，J Clin EndocrinolMetab.2004；89(8)：4078-4088)。VEGF广泛分布于人体组织器官，其中眼部的视网膜色素上皮细胞、血管内皮细胞、神经细胞等均可表达(Goel H L et al.，Nat Rev Cancer.2013；13(12)：871)。VEGF受体有三种类型：VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。VEGF与受体胞外结构域结合触发受体二聚化，促进胞内结构域中酪氨酸残基自磷酸化，从而激活下游促进细胞增殖、迁移、抗凋亡和提高血管通透性的信号。VEGFR1和VEGFR2主要表达在血管内皮细胞，而VEGFR3主要表达在淋巴管内皮细胞。
目前已证实VEGF在调节正常和病理性血管生成的过程中起着重要的作用(Melincovici C S et al.，Rom J Morphol Embryol.2018；59(2)：455-467)。VEGF在多种可引起恶性腹水的肿瘤种过表达，并且肿瘤内VEGF的表达量同肿瘤细胞的迁移能力具有相关性。胃肠癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌等实体瘤病人体内VEGF的浓度和疾病分期呈正相关，并具有较低的存活率(Sebastian，K et al.，Oncologist.2009；14(12)：1242-1251)。眼后段疾病中多种病变例如年龄相关性老年黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、视网膜水肿、退行性近视、脉络膜新生血管(CNV)等的发生的发展也同VEGF表达水平密切相关(Patel J R et al.，Curr opin ophthalmol.2016；27(5)：387-392；Tan G S et al，.Lancet Diabetes Endo.2017；5(2)：143-155；Mitchell P et al.，Lancet.2018；392(10153)：1147-1159)。
VEGF的单克隆抗体药物通过抑制VEGF与内皮细胞表面受体VEGFR2和VEGFR1的相互作用，阻断下游信号通路转导，抑制内皮细胞扩增和新生血管生成。FDA批准用于治疗眼科疾病的靶向VEGF的抗体药物有Lucentis(雷珠单抗，2006年批准)，EYLEA(阿柏西普，2004年批准)，在中国上市的还有Conbercept(康柏西普)。Lucentis是一种人源性VEGFA抗体Fab片段，能结合所有活性形式的VEGFA和抑制其与VEGFR1及VEGFR2的结合，从而抑制血管内皮细胞的增殖迁移及降低血管的通透性，抑制脉络膜新生血管的形成。相比于全长结构，Fab片段的抗体更易于透过视网膜达视网膜下间隙，到达靶组织与VEGF紧密结合，从而抑制脉络膜新生血管的生成。通过血液循环渗透到全身系统中的Fab片段抗体仅0.09天或约2小时即被清除，可最大程度降低对正常VEGF的生理功能的影响，降低胃肠道穿孔、高血压和出血等毒副作用(Ferrara，N et al.，Retina.2006；26(8)：859-870；Van Wijngaarden et al.，Clin Exp Optom.2008；91(5)：427-437)。研究表明AMD同补体效应引起的炎性反应具有一定关系，Fab抗体片段不含Fc片段，不能激发补体级联反应，从而可降低引发眼内炎和自身免疫炎症反应的风险(Ferrara，N et al.，Retina.2006；26(8)：859-870)。Lucentis已获批用于治疗湿性AMD、CNV、DME和视网膜水肿。贝伐珠单抗(贝伐单抗)是被FDA批准用于治疗转移性结肠癌、非小细胞肺癌等实体瘤的重组人单抗药，目前作为批准范围外用药用于治疗AMD。阿柏西普和康柏西普为人源化重组融合蛋白，包含VEGFR上与配体结合的特定结构域，可与VEGF特异性高亲和力结合，阻断VEGF与受体的结合。相比贝伐珠单抗和Lucentis，阿柏西普对VEGF165具有更高的亲和力，在治疗DME上显现更优的疗效。阿柏西普已获批用于治疗湿性AMD、分支视网膜静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、CNV、DME和糖尿病性视网膜病变。康柏西普在中国已获批用于治疗湿性AMD。
由于该类药物为局部玻璃体内注射，频繁给药极易引发眼球和眼周感染而带来损伤。因此需要在药物上进行优化，提高药效，降低给药频率，给病人带来更大的治疗获益。
发明内容
本发明提供了新的人源化抗VEGF Fab抗体片段，可用于治疗以脉络膜新生血管为特征的眼病，包括但不限于年龄相关性老年黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、视网膜水肿、退行性近视、脉络膜新生血管等的发生(CNV)。
在一个方面，本发明提供了一种分离的抗VEGF抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的重链CDR1域、具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的重链CDR2域和具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的重链CDR3域的重链可变区，和具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的轻链CDR1域、具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的轻链CDR2域和具有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的轻链CDR3域的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述抗VEGF抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：22至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：23具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述抗VEGF抗体或其抗原结合片段进一步包含重链恒定区和轻链恒定区，优选地所述重链恒定区为氨基酸序列为SEQ ID NO：38的IgG1重链恒定区的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链恒定区为氨基酸序列为SEQ ID NO：39的轻链恒定区的氨基酸序列或与SEQ ID NO：39具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗VEGF抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或嵌合抗体。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的抗VEGF抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列的重链CDR1域、具有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列的重链CDR2域和具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的重链CDR3域的重链可变区，和具有SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的轻链CDR1域、具有SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的轻链CDR2域和具有SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列的轻链CDR3域的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述抗VEGF抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：36至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：37具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述抗VEGF抗体或其抗原结合片段为Fab片段，所述Fab片段进一步包含重链恒定区CH1和轻链恒定区，优选地所述重链恒定区CH1为氨基酸序列为SEQID NO：40的IgG1重链恒定区的氨基酸序列或与SEQ ID NO：40具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链恒定区为氨基酸序列为SEQ ID NO：39的轻链恒定区的氨基酸序列或与SEQ ID NO：39具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗VEGF抗体或其抗原结合片段进一步包含重链信号肽和轻链信号肽，优选地所述重链信号肽为氨基酸序列为SEQ ID NO：34的氨基酸序列或与SEQID NO：34具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链信号肽为氨基酸序列为SEQ ID NO：35的氨基酸序列或与SEQ ID NO：35具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗VEGF抗体或其抗原结合片段是Fab抗体片段。
在一些实施方式中，所述抗VEGF抗体或其抗原结合片段为IgG抗体，优选为IgG1抗体。
在一些实施方式中，所述抗VEGF Fab抗体片段为IgG抗体相关Fab抗体片段，优选为IgG1抗体相关Fab抗体片段。
在一些实施方式中，所述抗VEGF抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体。
在一些实施方式中，所述抗VEGF Fab抗体片段为单克隆的。
在一些实施方式中，所述抗VEGF抗体或其抗原结合片段与重组人VEGF165蛋白的结合亲和力KD为0.01-8E-10M，优选0.1-5E-10M，更优选0.5-3E-10M，最优选1.54E-10M。
在一些实施方式中，所述抗原结合片段为Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fd片段、Fd′片段、单链抗体分子或单域抗体；其中所述单链抗体分子优选为scFv、di-scFv、tri-scFv、双体抗体或scFab。
在又一个方面，本发明提供了一种抗体-药物缀合物，其包含本发明的抗VEGF抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂，优选地所述抗VEGF抗体或其抗原结合片段和所述另外的治疗剂通过接头连接。
在又一个方面，本发明提供了一种核酸，其编码本发明的抗VEGF抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，所述核酸包含SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列和/或SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列；或者其包含SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列和/或SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列；或者其包含SEQ ID NO：45所示的核苷酸序列和/或SEQ ID NO：46所示的核苷酸序列。优选地，所述核酸进一步包含SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列和/或SEQ IDNO：48所示的核苷酸序列。更优选地，所述核酸包含SEQ ID NO：41所示的核苷酸序列和/或SEQ ID NO：42所示的核苷酸序列。
在又一个方面，本发明提供了一种表达载体，其包含本发明的核酸。
在又一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的核酸或本发明的表达载体。
在又一个方面，本发明提供了一种用于产生本发明的抗VEGF抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在适合于抗体表达的条件下培养如本发明的宿主细胞，和从培养基中回收表达的抗体。
在又一个方面，本发明提供了一种用于产生本发明的抗VEGF抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在适合于Fab抗体片段表达的条件下培养如本发明的宿主细胞，和从培养基中回收表达的Fab抗体片段。
在又一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的抗VEGF抗体或其抗原结合片段，或本发明的抗体-药物缀合物，或本发明的核酸，或本发明的表达载体，及药学上可接受的载体。
在又一个方面，本发明提供本发明的抗VEGF抗体或其抗原结合片段或本发明的抗体-药物缀合物或本发明的药物组合物，其用于治疗与血管生成相关的病症。
在一些实施方式中，所述与血管生成相关的病症是眼病。
在一些实施方式中，所述眼病是以脉络膜新生血管为特征的眼病，包括年龄相关性老年黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、视网膜水肿、退行性近视、脉络膜新生血管(CNV)。
在又一个方面，本发明提供了一种用于治疗与血管生成相关的病症的方法，其包括向需要的受试者施用治疗有效量的本发明的抗VEGF抗体或其抗原结合片段或本发明的抗体-药物缀合物或本发明的药物组合物，从而治疗所述与血管生成相关的病症。
在一些实施方式中，所述与血管生成相关的病症是眼病。
在一些实施方式中，所述眼病是以脉络膜新生血管为特征的眼病，包括年龄相关性老年黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、视网膜水肿、退行性近视、脉络膜新生血管(CNV)。
在又一个方面，本发明提供了本发明的抗VEGF抗体或其抗原结合片段或本发明的抗体-药物缀合物或本发明所述的药物组合物在制备用于治疗与血管生成相关的病症的药物中的用途。
在一些实施方式中，所述与血管生成相关的病症是眼病。
在一些实施方式中，所述眼病是以脉络膜新生血管为特征的眼病，包括年龄相关性老年黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、视网膜水肿、退行性近视、脉络膜新生血管(CNV)。
在又一个方面，本发明提供了一种药物组合，其包含本发明的抗VEGF抗体或其抗原结合片段或本发明的抗体-药物缀合物或本发明的药物组合物与一种或多种另外的治疗剂。
在又一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含本发明的抗VEGF抗体或其抗原结合片段或本发明的抗体-药物缀合物或本发明的药物组合物，优选地，还进一步包含给药装置。
附图说明
本发明结合附图进行说明，附图中：
图1显示VEGF165兔源抗体VEGF-R988封闭VEGF165与VEGFR2蛋白结合。
图2显示VEGF165兔源抗体VEGF-R988中和VEGF165对HUVEC细胞的增殖。
图3显示ELISA检测人源化抗体VEGF-H988 Fab与VEGF165结合。
图4显示ELISA检测VEGF-H988 Fab与mVEGF164的种属交叉结合。
图5显示ELISA检测VEGF-H988 Fab阻断VEGF165与VEGFR2蛋白结合。
图6显示VEGF-H988 Fab对比Lucentis中和不同浓度VEGF165的作用。
图7显示VEGF-H988 Fab对比EYLEA中和不同浓度VEGF165的作用。
图8显示VEGF-H988 Fab对比Avastin中和不同浓度VEGF165的作用。
图9显示VEGF-H988 Fab对比Conbercept中和不同浓度VEGF165的作用。
图10显示VEGF-H988 Fab对比Brolucizumab中和不同浓度VEGF165的作用。
具体实施方式
本发明的各个方面涉及分离的抗VEGF Fab抗体片段、包含该抗体片段或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物、编码该Fab抗体片段的核酸和表达载体、包含该核酸或表达载体的宿主细胞、产生该抗VEGF Fab抗体片段的方法、包含该抗VEGF Fab抗体片段的药物组合物以及使用该抗VEGF Fab抗体片段治疗与血管生成相关的病症的方法。
定义
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的技术领域的普通技术人员通常理解的含义。为了本发明的目的，定义以下术语，以同本技术领域通常理解的含义保持一致。
当用于本文和所附权利要求书中时，单数形式“一”、“一种”、“另一”和“所述”包括复数指代对象，除非上下文明确地另有指示。
术语“抗体”意指免疫球蛋白分子，是指表现所需生物学活性的抗体的任何形式。包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)，甚至包括抗体片段。典型地，全长抗体结构优选包含4条多肽链，通常通过二硫键相互连接的2条重(H)链和2条轻(L)链。每条重链包含重链可变区和重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区和轻链恒定区。在此典型全长抗体结构外，其结构还包括其他衍生形式。
所述重链可变区和轻链可变区可进一步细分为更保守的区域(称为框架区(FR))和穿插其中的高变区(称为互补决定区(CDR))。
术语“互补决定区”(CDR，例如CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变区的这样一些氨基酸残基，其存在对于抗原结合来说是必需的。每个可变区通常具有3个被鉴别为CDR1、CDR2和CDR3的CDR区域。每个互补决定区可包含来自如Kabat所定义的“互补决定区”的氨基酸残基(Kabat等，Sequences of Proteins of Immulological Interest，5th Ed.PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.1991))和/或来自“高变环”的那些残基(Chothia和Lesk；J Mol Biol 196：901-917(1987))。
术语“构架”或“FR”残基是如本文中所定义的CDR残基之外的那些可变区残基。
每个重链可变区和轻链可变区通常包含3个CDR和最多达4个FR，所述CDR和FR从氨基末端至羧基末端以例如以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
给定抗体的互补性决定区(CDR)和框架区(FR)可以使用Kabat体系标识(Kabat等：Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生和公众服务部，PHS，NIH，NIH出版编号91-3242，1991)。
术语“恒定区”是指抗体的轻链和重链上的这样一些氨基酸序列，不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性。
根据其恒定区的氨基酸序列的抗原性差异，抗体的重链可以被分为α、δ、ε、γ和μ五类，当其与轻链组成完整的抗体，可被分为五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些类中的若干还可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可归入κ和λ。
“抗体的抗原结合片段”包含完整抗体分子的一部分，其保留母体抗体的至少某些结合特异性，通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗原结合片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fd片段、Fd′片段、单链抗体分子(例如scFv、di-scFv或tri-scFv、双体抗体或scFab)、单域抗体。Fab片段通常包含重链可变区(VH)和重链恒定区1(CH1)和轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。
术语“抗体片段”是指保留母体抗体的至少某些生物学特性的非完整抗体分子，其实例除上述“抗原结合片段”所述及的那些之外，还包括但不限于Fc片段。
术语“抗体-药物缀合物”或“ADC”是指与一种或多种化学药物(在本文中也称为药剂)化学连接的结合蛋白如抗体或其抗原结合片段)，其可以任选地是治疗剂或细胞毒性剂。在优选的实施方案中，ADC包括抗体、细胞毒性或治疗药物，以及能够使药物与抗体连接或缀合的接头。ADC通常具有与抗体缀合的1至8个中任一值的药物，包括2、4、6或8的载药物质。可以包含在ADC中的药物的非限制性实例是有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、免疫调节剂、用于基因治疗载体、烷化剂、抗血管生成剂、抗代谢药、含硼药剂、化疗保护剂、激素、抗激素剂、皮质类固醇、光活性治疗剂、寡核苷酸、放射性核素剂、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和放射致敏剂。
术语“嵌合抗体”是指重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而其余部分来源于不同来源或物种的抗体。“嵌合抗体”亦可以为如上定义的功能性的片段。“人源化抗体”是“嵌合抗体”的子集。
术语“人源化抗体”或“人源化抗原结合片段”在本文中被定义为这样的抗体或抗体片段：(i)来源于非人来源(例如，携带异源免疫系统的转基因小鼠)且基于人种系序列；或(ii)可变区是非人来源而恒定区是人来源的嵌合抗体；或者(iii)CDR移植的，其中可变区的CDR来自非人来源，而可变区的一个或多个构架区为人来源的，并且恒定区(如果有的话)是人来源的。“人源化”的目的是消除非人来源抗体在人体内的免疫原性，而同时最大可能地保留亲和力。选择与非人来源抗体构架序列最相似的人构架序列为模板进行人源化改造是有利的。在某些情况下，可能需要用非人构架中相应的残基替换人类构架序列中的一个或多个氨基酸，以避免亲和性的丧失。
“单克隆抗体”是指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即，所述包含单一抗体的群体除了可能以极少量存在的可能突变(例如天然突变)之外是相同的。因此，所述术语“单克隆”表明所述抗体的性质，即不是不相关抗体的混合物。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体均针对抗原上的单独一个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体制剂的优点在于它们通常不会被其他抗体污染。所述术语“单克隆”不应被理解为需要通过任何特定的方法产生所述抗体。
抗体“特异性结合”目的抗原例如肿瘤相关的多肽抗原靶(本文中，VEGF)，即以足够的亲和力结合所述抗原以使得所述抗体可用作治疗性试剂，靶向表达所述抗原的细胞或组织，并且与其他蛋白质无显著交叉反应或者与除了上文提到的抗原靶的同源体和变体(例如突变形式、剪接变体，或蛋白水解作用截短的形式)以外的蛋白质无显著交叉反应。
术语“结合亲和力”是指分子的单个结合位点与其结合伴侣之间非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，用于本文时“结合亲和力”是指固有的结合亲和力，其反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间1∶1的相互作用。如本文所用，术语“KD”是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。如本文所用，术语“kon”是指抗体与抗原结合的速率常数。如本文所用，术语“koff”是指抗体与抗体/抗原复合物解离的速率常数。“KD”、“结合速率常数kon”和“解离速率常数koff”通常用于描述分子(例如抗体)与其结合伴侣(例如抗原)之间的亲和力，即，配体结合特定蛋白的紧密程度。结合亲和力受非共价分子间相互作用的影响，例如氢键，静电相互作用，两个分子之间的疏水和范德华力。另外，配体与其靶分子之间的结合亲和力可能受到其他分子的存在的影响。亲和力可通过本领域中已知的常规方法来分析，包括本文描述的ELISA。
术语“表位”包括能够特异性结合至抗体或T细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链，或其组合)组成，并且通常具有特定三维结构特征以及特定的电荷特征。
术语“分离的”抗体是已经被鉴别并且从表达它的细胞的组分中分离的抗体。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，所述抗体的天然环境中的至少一种组分是不存在的。然而，通常情况下，分离的抗体是通过至少一个纯化步骤进行制备。
两条多肽或核酸序列之间的“序列同一性”表示所述序列之间相同的残基的数目占残基总数的百分比，且基于比较的分子中较小者的大小来计算。在计算同一性百分数时，将正在比较的序列以产生序列之间最大匹配的方式比对，通过特定算法解决比对中的空位(如果存在的话)。确定两个序列之间同一性的优选计算机程序方法包括，但不限于，GCG程序包，包括GAP、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)。上述程序可以公开地从国际生物技术信息中心(NCBI)和其他来源得到。熟知的SmithWaterman算法也可用于确定同一性。
术语“Fc受体”或“FcR”指与抗体Fc区结合的受体。优选天然序列的人FcR，且优选与IgG抗体结合的受体(γ受体)，其包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚型，以及这些受体的变体。其它FcR均被包含在术语“FcR”中。该术语也包括新生儿受体(FcRn)其负责将母体的IgG转运至胎儿(Guyer等，免疫学杂志117：587(1976)和Kim等，免疫学杂志24：249(1994))。
术语“新生儿Fc受体”、简称“FcRn”，其结合IgG抗体Fc区。新生儿Fc受体(FcRn)在体内IgG类抗体的代谢命运中起重要作用。FcRn行使功能以从溶酶体降解途径营救IgG，从而降低其在血清中的清除率并加长半衰期。因此，IgG体外FcRn结合性质/特征指示它在血液循环中的体内药代动力学性质。
术语“效应子功能”指可归因于抗体的Fc区的那些生物学活性，其随抗体同种型而不同。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和依赖补体的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、依赖抗体的细胞毒性(ADCC)、依赖抗体的吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调和B细胞激活。
术语“效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应子功能的白细胞。在一个方面，所述效应细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从天然来源，例如，血液中分离。效应细胞通常是与效应子阶段相关联的淋巴细胞，并发挥作用，以产生细胞因子(辅助T细胞)、杀死被病原体感染的细胞(细胞毒性T细胞)或分泌抗体(分化的B细胞)。
″免疫细胞″包括具有造血的起源并在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞包括：淋巴细胞，例如B细胞和T细胞；天然杀伤细胞；髓样细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和粒细胞。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式，其中结合到在某些细胞毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fcγ受体上的分泌Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合至承载抗原的靶细胞，随后使用例如细胞毒素杀死所述靶细胞。为了评估目的抗体的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，例如记载于美国专利No.5,500,362或5,821,337或美国专利No.6,737,056(Presta)中的体外ADCC测定法。用于这类测定法的有用效应细胞包括PBMC和NK细胞。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体的存在下靶细胞的裂解。典型的补体途径的活化是通过将补体系统的第一组分(C1q)与结合至其相应抗原的(适当亚类的)抗体结合来起始。为了评估补体活化，可进行CDC测定法，例如记载于Gazzano-Santoro等，J.Immunol Methods 202：163(1996)中的CDC测定法。例如在美国专利No.6,194,551 B1和WO1999/51642中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列的多肽变体(具有变体Fc区的多肽)和具有增强或降低的C1q结合的多肽变体。
“人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)”分离白脐带静脉，一般用于生理学和药理学研究，例如例如大分子转运、血液凝固、血管发生和纤维蛋白溶解作用。特别是可以用作血管生成研究和其他依赖VEGF的信号通路研究(相关内皮生长因子)研究的模型。
本发明的抗体的氨基酸序列
本发明首先采用重组人VEGF165蛋白来免疫兔，然后通过噬菌体展示文库筛选获得与重组人VEGF165蛋白特异性结合的抗体克隆VEGF165-R988。之后采用PCR方法将编码VEGF165-R988 scFv抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列分别插入带兔重链IgG1恒定区或兔轻链kappa恒定区核苷酸序列的pSTEP2载体中，并进行培养表达。采用蛋白A纯化柱进行纯化获得高纯度抗体。ELISA测试表明，兔源抗体VEGF165-R988可有效抑制VEGF165蛋白与VEGFR2蛋白结合，且VEGF165-R988可有效中和VEGF165促进HUVEC细胞增殖的能力。
然后，采用经典的人源化方式CDR移植方法，选择与兔轻链或重链可变区较接近的人抗体轻链或重链可变区为模板，将兔抗体轻链或重链的各3个CDR(表1)插入到该人抗体的可变区中，获得人源化的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)序列。由于兔源框架区有关键点对于支撑CDR的活性至关重要，因此将关键位点回复突变为兔抗体对应的序列。通过全基因合成的方法获得VEGF-H988-10轻链/重链表达载体，转染HEK-293细胞并进行培养表达，培养上清采用蛋白A纯化柱进行纯化获得高纯度VEGF-H988-10抗体。为了改善VEGF-H988-10抗体的亲和力，构建重链和轻链可变结构域CDR区(包括LCDR1、LCDR3、HCDR2和HCDR3)的SDM库，将4个突变库构建成scFv序列以基因3融合蛋白形式克隆至噬菌粒载体，对于各CDR通过可溶性抗原VEGF的结合能力筛选较优克隆，最终得到CDR亲和力和稳定性优化的VEGF-H988 Fab抗体片段并检测。
相比于全长结构，Fab片段的抗体具有更强的穿透性，和更低的胃肠道穿孔、高血压和出血等毒副作用且不能激发补体级联反应，从而降低引发眼内炎和自身免疫炎症反应的风险。
本发明的核酸
本发明还涉及编码本发明的抗体或其部分的核酸分子。这些核酸分子的序列包括但不限于SEQ ID NO：2-3、4-7、16-17、20-21、41-49和52-53。
本发明的核酸分子不限于本文公开的序列，还包括其变体。本发明中变体可以参照它们在杂交中的物理特性来描述。本领域技术人员会认识到利用核酸杂交技术，核酸可用于鉴别其互补物以及其等同物或同系物。还会认识到杂交可以以低于100％互补性发生。然而，考虑到条件的适当选择，杂交技术可用于基于DNA序列与特定探针的结构相关性来区分所述DNA序列。对于这类条件的指导参见Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd Ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989和Ausubel，F M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Sedman，J.G，Smith，J.A.，&Struhl，K.eds.(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York：JohnWiley and Sons。
重组载体和表达
本发明还提供了包含本发明的一个或多个核苷酸序列的重组构建体。通过将编码本发明的抗体的核酸分子插入载体例如质粒、噬粒、噬菌体或病毒载体中构建本发明的重组构建体。
本发明的抗体可通过在宿主细胞中重组表达编码轻链和重链或其部分的核苷酸序列来制备。为了以重组方法表达抗体，可用携带编码轻链和/或重链或其部分的核苷酸序列的一个或多个重组表达载体转染宿主细胞，以使得所述轻链和重链在所述宿主细胞中表达。标准重组DNA方法学被用于制备和/或获得编码重链和轻链的核酸、将这些核酸纳入重组表达载体中并且将所述载体引入至宿主细胞中，例如Sambrook，Fritsch and Maniatis(eds.)，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarbor，N.Y.，(1989)、Ausubel，F M.等(eds.)Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Associates，(1989)和Boss等的美国专利No.4,816,397中记载的那些。
合适的宿主细胞为原核细胞和真核细胞。原核宿主细胞的实例为细菌，真核宿主细胞的实例为酵母、昆虫或哺乳动物细胞。应理解，包括选择调节序列的表达载体的设计受到多种因素的影响，例如宿主细胞的选择、所需的蛋白质的表达水平以及表达是组成型的还是可诱导型的。
细菌表达
通过将编码所需抗体的结构DNA序列连同合适的翻译起始和终止信号以及有功能的启动子插入可操作阅读框中，来构建可用于细菌的可用表达载体。所述载体会包含一个或多个表型选择标记以及复制起点以确保维持所述载体，以及根据需要在宿主内提供扩增。用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)以及假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)中的多个物种。
细菌载体可以是例如基于噬菌体、质粒或噬粒的。这些载体可含有选择标记和细菌复制起点，其来源于通常含有公知的克隆载体pBR322(ATCC37017)的元件的可商购的质粒。转化合适的宿主菌株并使所述宿主菌株生长至适当细胞密度之后，通过适当的方法(例如，温度变化或化学诱导)将所选择的启动子去阻遏/诱导，并且将细胞培养额外的时间。通常通过离心收获细胞，通过物理或化学方法使细胞破裂，并且保留所得的粗提取物用于进一步纯化。
在细菌系统中，根据所表达的蛋白的目的用途，可有利地选择多种表达载体。例如，当要生产大量这样的蛋白用于生产抗体或用于筛选肽文库时，例如，可能需要指导易于纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体。
哺乳动物表达和纯化
用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白表达的病毒元件，例如源于巨细胞病毒(CMV)的启动子和/或增强子(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)的启动子和/或增强子(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒的启动子和/或增强子(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。对病毒调节元件及其序列的进一步描述参见例如，Stinski的U.S.5,168,062、Bell等的U.S.4,510,245和Schaffner等的U.S.4,968,615。重组表达载体还可以包括复制起点和选择标记(参见例如，Axel等的U.S.4,399,216、U.S.4,634,665和U.S.5,179,017)。合适的选择标记包括赋予已经引入所述载体的宿主细胞对药物例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性的基因。例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因赋予对甲氨蝶呤的抗性，而neo基因赋予对G418的抗性。
将所述表达载体至宿主细胞中的转染可以利用标准技术例如电穿孔、磷酸钙沉淀和DEAE-葡聚糖转染来进行。
用于表达本文提供的抗体的合适的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)[包括dhfr-CHO细胞，记载于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中，使用DHFR选择标记，例如记载于R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中]、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。
本发明的抗体可通过公知方法从重组细胞培养物回收和纯化，所述公知方法包括但不限于，硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、蛋白A亲和层析、蛋白G亲和层析、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟磷灰石色谱法以及凝集素色谱法。高效液相色谱法(“HPLC”)也可用于纯化。参见例如，Colligan，CurrentProtocols in Immunology或Current Protocols in Protein Science，John Wiley&Sons，NY，N.，，(1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，各自以引用的方式全文纳入本文。
本发明的抗体的特性和功能
对本发明的人源化VEGF-H988 Fab抗体进行特性分析和功能分析。分析结果表明，本发明的抗体具备以下优势：
(1)与VEGF165蛋白结合的能力与Lucentis相近；
(2)与VEGF165蛋白的结合亲和力强于Lucentis的亲和力，约为Lucentis的亲和力的3.75倍；
(3)与重组人VEGF165蛋白有特异性结合，与重组小鼠mVEGF164蛋白无交叉结合；
(4)有效抑制VEGFR2蛋白与VEGF165蛋白的结合，且阻断能力明显优于Lucentis；和
(5)在不同浓度重组人VEGF165条件下，中和作用均强于Lucentis；高浓度VEGF165下，中和活性强于EYLEA；不同浓度的VEGF165条件下，活性均强于贝伐珠单抗及Brolucizumab，而与Conbercept活性相当。
用途
本发明的抗体可用于治疗与血管生成相关的病症，包括以脉络膜新生血管为特征的眼病，包括但不限于年龄相关性老年黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、视网膜水肿、退行性近视、脉络膜新生血管等的发生(CNV)。
药物组合物
可将本发明的抗体与至少一种其他试剂(例如稳定化合物)制备成药物组合物，其包括本发明的抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。任选地，所述药物组合物可包含另外的治疗剂。
试剂盒
本发明还涉及药物包装和包含一个或多个容器的试剂盒，所述容器含有上文提到的本发明的药物组合物。其上附有管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定形式提示，其反映该药物被上述机构批准用于人类给药。
制备和储存
本发明的药物组合物可以以本领域中已知的方式制备，例如通过常规的混合、溶解、造粒、锭剂制备、研磨、乳化、包裹、包埋或冻干方法。
在已经制备包含配制于可接受的载体中的本发明化合物的药物组合物之后，可以将它们放置在适当的容器中并贴上标签用于治疗所标明的病症。这类标签会包括给药的量、频率和方法。
药物组合
上述包含本发明的抗体的药物组合物还与一种或多种其他治疗剂，例如抗肿瘤剂组合，其中所得组合不会引起不可接受的不利影响。
实施例
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买。
实施例1：采用噬菌体抗体展示文库筛选阻断VEGF165与VEGFR2结合的兔源抗体
1.1兔子免疫
采用重组人VEGF165蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司，Cat.11066-HNAH)来对兔子进行免疫。该人VEGF165蛋白(UniProtKB P15692-4)的胞外区Met1-Arg191氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
具体方法为：将重组人VEGF165蛋白与弗氏佐剂混合，使用混合物进行四次免疫，每次免疫剂量为500μg，皮下注射，免疫间隔依次为3周、2周、2周。从第四次免疫起，免疫后四天经眼眶内眦静脉丛采血。采用ELISA方法，包被重组人VEGF165蛋白以检测兔抗VEGF165的血清效价。第五次免疫血清滴度达到25000倍稀释，第五次免疫9周后使用25μg重组人VEGF165蛋白进行静脉注射加强，7天之后处死兔子，取兔子的脾脏组织冻存于液氮中。
1.2噬菌体抗体库筛选
用TriPure Isolation Reagent试剂(来源：Roche，Cat.No.11667 165 001)提取兔脾组织的RNA，用反转录试剂盒(来源：Invitrogen，Cat.No.18080-051)进行反转录获得cDNA。设计10对引物扩增兔抗体的轻链可变区序列，4对引物扩增重链可变区序列(BarbasC F et al.，CSHL Press.2004)。采用重叠延伸拼接PCR法将编码兔抗体轻链和重链可变区的序列拼接成编码scFv的核苷酸序列，轻重链可变区通过接头：
TCTAGTGGTGGCGGTGGTTCGGGCGGTGGTGGAGGTGGTAGTTCTAGATCTTCC(SSGGGGSGGGGGGSSRSS)(SEQ ID NO：2)
进行连接(Jones S T et al.，Bio/technology.1991；9(1)：88)，再通过限制性内切酶Sfi I(来源：Fermentas)酶切连接到噬菌体载体pComb3x(来源：北京义翘神州科技有限公司)中，电转化X-Blue感受态细胞以构建免疫兔的噬菌体展示scFv抗体库。将重组人VEGF165蛋白包被在ELISA板上，按照噬菌体抗体淘选的流程，筛选获得抗VEGF165阳性抗体富集的噬菌体文库(O′Brien，P.M.，&Aitken，R.(Eds.)，Springer Science&BusinessMedia.2002；ISBN：9780896037113)。从富集的文库中挑取单克隆噬菌体进行表达，用ELISA方法检测与重组人VEGF165蛋白的结合，筛选获得与重组人VEGF165特异性结合的抗体克隆，将筛选得到的克隆送测序公司测序获得VEGF165-R988 scFv抗体的核苷酸序列(SEQ IDNO：3)。
1.3靶向VEGF165兔源抗体的生产
以PCR扩增VEGF165-R988 scFv抗体的重链可变区核苷酸序列，通过in-fusion方法插入到带重链信号肽(SEQ ID NO：43)和兔重链IgG1恒定区(SEQ ID NO：6)的经Sca I+Kpn I(Fermentas)酶切的pSTEP2载体中获得重链(SEQ ID NO：52)表达载体。PCR扩增VEGF-R988 scFv抗体的轻链可变区核苷酸序列，通过in-fusion方法插入到带轻链信号肽(SEQID NO：44)和兔轻链kappa恒定区(SEQ ID NO：7)的经Sca I+BamH I(Fermentas)酶切的pSTEP2载体中获得轻链(SEQ ID NO：53)表达载体。提取重组质粒，转染HEK-293细胞进行培养表达7天，培养上清采用蛋白A纯化柱进行纯化获得高纯度抗体。
扩增重链可变区引物：
F1 ACCAGGGTGCTGAGTCAGTCGGTGGAGGAGTCC
R1 TGTGACCAGGGTACCTGGGCCCCA
扩增轻链可变区引物：
F2 ACAGGAGTGCATAGTGAGCTCGATCTGACCCAGAC
R2 GGTGCAACTGGATCCCCTTTGACGACCACCTCGGT
1.4靶向VEGF165兔源抗体功能检测
1.4.1兔源抗体阻断VEGF165结合VEGFR2-his
将浓度为1μg/mL的VEGF165蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司)包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1小时后，加入100μL 5μg/mL VEGFR2-生物素蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司)和不同浓度VEGF-R988抗体共同孵育。洗板去除未结合抗体，加入链霉亲和素/HRP(来源：北京中杉金桥)孵育后重复洗板，最后加入底物显色液进行显色。终止显色后酶标仪读取OD450。结果分析以抗体浓度为横坐标，抑制率PI％为纵坐标，利用GraphPad Prism绘图分析。抑制率PI％＝(OD空白-OD样品)/OD空白×100％，其中OD空白表示只加VEGFR2-生物素不加抗体组的OD值，OD样品表示同时加VEGFR2-生物素和抗体的待测组OD值。
如图1所示，VEGF-R988抗体可有效结合包被的VEGF165蛋白，并可有效的抑制VEGFR165蛋白与VEGFR2蛋白的结合。
1.4.2兔源抗体对HUVEC增殖的抑制
采用WST-8法，检测嵌合抗体中和VEGF165对脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞的增殖作用。96孔板接种HUVEC细胞4×103个细胞/孔，在含有10％FBS及5％L-Gln的M199培养基中培养4h后加入不同浓度的VEGF-R988抗体，50μL/孔。随后加入终浓度为10ng/mL的VEGF16510μL/孔。将96孔板置于37℃、5％CO2条件下的CO2培养箱内3天。设置检测空白孔B(无细胞)、阴性对照组M(接种细胞，不加样品，加VEGF165)和M’(接种细胞，不加样品及VEGF165)对照。培养结束后加入WST-8显色液，10μL/孔，将96孔板置于CO2培养箱中孵育，显色稳定后置酶标仪上于450nm、630nm处测定吸光度。以吸光度值(OD450-OD630)减去检测空白孔B的读值来计算抗体的中和率，中和率％＝(阴性对照M组OD值-样品OD值)/(阴性对照M组OD值-M’组OD值)×100％，采用统计软件GraphPad Prism的自动分析功能计算标准曲线，横坐标为样品的浓度，纵坐标为中和率，回归方程为四参数方程，得到“S”型曲线，计算样品半数有效浓度(EC50)。
如图2所示，VEGF-R988抗体可有效降低VEGF165促进HUVEC增殖的能力。
实施例2：兔抗体VEGF-R988的人源化、突变改造和Fab形式抗体的生产
2.1兔抗体VEGF-R988轻链及重链的CDR确定
根据实施例1.2中测定的VEGF-R988 scFv抗体的核苷酸序列，推导出VEGF-R988scFv的重链和轻链可变区氨基酸序列，见SEQ ID NO：8/9。
参考Kabat以及IMGT编号方式确定鼠抗体VEGF-R988-scFv轻链及重链各3个CDR的氨基酸序列，参见表1。上述的轻链及重链各3个CDR在后续步骤中被移植到人源化抗体VEGF-H988-10-scFv中，见实施例2.2。
表1：VEGF-R988轻链及重链CDR序列
名称 序列
LCDR1 QSSQTIYANRRLA(SEQ ID NO：10)
LCDR2 GASTLAS(SEQ ID NO：11)
LCDR3 AGYKSYDGDDVG(SEQ ID NO：12)
HCDR 1 GIDLSSYAISWV(SEQ ID NO：13)
HCDR2 YIWNAGNTYYASWAKG(SEQ ID NO：14)
HCDR3 ARGTLGDYNGMDP(SEQ ID NO：15)
2.2通过CDR移植将兔VEGF-R988人源化
兔抗体人源化采用经典的人源化方式CDR移植方法，选择与兔轻链或重链可变区较接近的人抗体轻链或重链可变区为模板，将兔抗体轻链或重链的各3个CDR(表1)插入到该人抗体的可变区中，获得人源化的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)序列。所用VEGF-R988的轻链可变区的人源模板为IGKV1-27*01，该模板与VEGF-R988轻链的同源性为65.30％，重链可变区的人源模板为IGHV4-4*08，该模板与VEGF-R988重链的同源性为53.20％。
2.3将人源化可变区序列的框架区回复突变
由于兔源框架区有关键点对于支持CDR的活性至关重要，因此将关键位点点回复突变为兔抗体对应的序列，其中轻链的第1位回复突变为E，第2位回复突变为L，第4位回复突变为L，第63位回复突变为K；重链的第3位回复突变为V，第37位回复突变为V，第47位回复突变为Y，第78位回复突变为V，第79位回复突变为D，第91位回复突变为F，回复位点均为Kabat编号。经CDR人源化移植和框架区回复突变获得人源化抗体VEGF-H988-10。
2.4人源化抗体VEGF-H988-10的生产及CDR亲和力优化
通过全基因合成的方法获得VEGF-H988-10重链可变区(SEQ ID NO：20)，通过in-fusion方法插入到带重链信号肽(SEQ ID NO：43)和人IgG1恒定区(SEQ ID NO：47)的经ScaI+Nhe I(Fermentas)酶切的pSTEP2载体中获得VEGF-H988-1O重链(SEQ ID NO：16)表达载体。通过全基因合成的方法获得VEGF-H988-10轻链可变区(SEQ ID NO：21)，通过in-fusion方法插入到带轻链信号肽(SEQ ID NO：44)和人kappa恒定区(SEQ ID NO：48)的经Sca I+BsiW I(Fermentas)酶切的pSTEP2载体中获得VEGF-H988-10轻链(SEQ ID NO：17)表达载体。提取质粒后转染HEK-293细胞进行培养表达7天，培养上清液采用蛋白A纯化柱进行纯化获得高纯度抗体。
全基因合成重链可变区引物：
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全基因合成轻链可变区引物：
为了改善VEGF-H988-10的亲和力，重链和轻链可变结构域CDR区构建SDM库，包括LCDR1、LCDR3、HCDR2三个饱和突变库；同时为了提高抗体的化学稳定性，需要将含有脱酰胺或者异构化位点改变成另一氨基酸残基。天冬酰胺的脱酰胺可在NG、NS、NA、NT等序列上，导致产生异天冬氨酸残基，影响抗体的稳定性或生物功能。VEGF-H988可变结构域HCDR3存在易脱酰胺位点，为了提高抗体的化学稳定性和生物功能同时构建了SDM库。将4个突变库构建成scFv序列以基因3融合蛋白形式克隆至噬菌粒载体，对于各CDR通过可溶性抗原VEGF的结合能力筛选较优克隆，最终得到CDR亲和力和稳定性优化的抗体VEGF-H988。VEGF-H988轻链及重链CDR序列见表2。
表2：VEGF-H988轻链及重链CDR序列
2.5人源化VEGF-H988 Fab的生产
将编码上述含有信号肽的VEGF-H988 Fab轻链核苷酸序列(SEQ ID NO：42)PCR扩增后，其中包含依次连接的轻链信号肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：44)、人源化抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：46)和人kappa轻链恒定区的核苷酸序列(SEQ ID NO：48)，通过in-fusion方法插入自主研发的pGS载体(Kpn I+Xba I)中，通过测序验证获得正确的质粒。将VEGF-H988 Fab重链Fab核苷酸序列(SEQ ID NO：41)PCR扩增后，其中包含依次连接的重链信号肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：43)、人源化抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：45)和人IgG1重链CH1恒定区的核苷酸序列(SEQ ID NO：49)，通过in-fusion方法插入已经构建正确的包含轻链的pGS载体(Nhe I+Not I)中，通过测序验证获得正确的VEGF-H988 Fab轻重链表达载体。该表达载体包含GS筛选基因和抗体轻、重链的表达元件的真核细胞表达载体。将该表达载体转染至CHO-K1-GS缺陷的细胞中，经MSX筛选获得VEGF-H988Fab高表达细胞株。采用ELISA检测选取抗体高表达的克隆，并结合细胞生长的状态和抗体药物的关键质量属性分析结果筛选获得高表达细胞株。采用无血清加料悬浮培养的方式培养VEGF-H988 Fab生产CHO细胞株，获得高纯度和高质量的VEGF-H988 Fab。
实施例3：人源化VEGF-H988 Fab特性分析
3.1 VEGF-H988 Fab结合VEGF165的特性
3.1.1 VEGF-H988 Fab特异性结合VEGF165
将不同浓度(0.15ng/mL、0.46ng/mL、1.37ng/mL、4.12ng/mL、12.35ng/mL、37.04ng/mL、111.11ng/mL、333.33ng/mL、1000ng/mL和3000ng/mL)的重组人VEGF165蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司)包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1h后，分别加入100μL 1μg/mL的VEGF165-H988 Fab、Lucentis(来源：Novartis)和阴性对照抗体H7N9-R1 Fab(来源：北京义翘神州科技有限公司)孵育1h，之后洗板去除未结合抗体，加入二抗山羊F(ab′)2抗人IgG F(ab′)2/HRP(来源：Jackson ImmunoResearch公司)孵育后重复洗板，加入底物显色液进行显色，终止后酶标仪读取OD450。以重组人VEGF165蛋白浓度为横坐标，OD450读数为纵坐标，利用GraphPad Prism 6.0软件拟合S型曲线并分析抗体与重组人VEGF165蛋白结合的EC50。
结果如图3所示，人源化抗体VEGF165-H988 Fab与重组人VEGF165的特异性结合EC50为18.75ng/mL，R2＝0.993；Lucentis结合的EC50为12.87ng/mL，R2＝0.989；人源化抗体VEGF165-H988 Fab与VEGF165蛋白结合的能力与Lucentis相近。阴性对照H7N9-R1Fab与重组人VEGF165蛋白无结合。
3.1.2 VEGF-H988 Fab与VEGF165蛋白的结合亲和力
使用链霉亲和素包被的Sensor固定生物素标记的VEGF165蛋白，检测多个浓度点的VEGF-H988 Fab、Lucentis与VEGF165的亲和力。
首先将重组人VEGF165蛋白与生物素以摩尔比1∶2的比率进行标记，方法如下：利用5000MW超滤管通过超滤形式将重组VEGF165蛋白的缓冲液(20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0)更换为PBS，UV定量后得到567.57μg蛋白，所得蛋白与20mM生物素溶液以1∶2摩尔比混匀，室温避光反应30分钟，通过5000MW超滤管再次过滤去除未标记的生物素，UV定量后加入等体积的甘油和终浓度0.1％的BSA后获得生物素标记蛋白。UV检测其浓度为2.08mg/mL。
然后测定不同浓度梯度VEGF-H988 Fab、Lucentis与生物素化的重组人VEGF165蛋白的亲和力，获得KD值为最终的亲和力。
如表3所示，VEGF-H988 Fab与重组人VEGF165蛋白结合亲和力KD值为1.54E-10(M)，结合常数kon值为2.74E+05(1/Ms)，解离常数kdis值为4.21E-05(1/s)；Lucentis与VEGF165蛋白结合亲和力KD值为5.78E-11(M)，结合常数kon值为5.36E+04(1/Ms)，解离常数kdis值为3.10E-05(1/s)。结果表明VEGF-H988 Fab亲和力强于Lucentis的亲和力，约为Lucentis的亲和力的3.75倍。因此VEGF-H988 Fab比Lucentis具有更强的结合VEGF165蛋白的能力。
表3 VEGF-H988-48-IgG1(Fab-N103G)、Lucentis与重组VEG165F蛋白的亲和力
3.1.3 VEGF-H988 Fab种属交叉
将重组人VEGF165蛋白、重组小鼠mVEGF164蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司)稀释到0.1μg/mL、1μg/mL和10μg/mL并分别包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1h，分别加入100μL浓度为2μg/mL的VEGF165-H988 Fab、Lucentis和阴性对照抗体H7N9-R-Fab孵育1h，洗板去除未结合抗体，加入检测二抗山羊F(ab′)2抗人IgGF(ab′)2/HRP(来源：Jackson ImmunoResearch公司)孵育后重复洗板，加入底物显色液进行显色，终止后酶标仪读取OD450。以蛋白浓度为横坐标，OD450读数为纵坐标，利用GraphPadPrism 6.0软件做柱状图。
结果如图4所示，VEGF165-H988 Fab与重组人VEGF165蛋白有特异性结合，与重组小鼠mVEGF164蛋白有交叉结合，Lucentis与重组小鼠mVEGF164蛋白无交叉结合。
3.2 VEGF-H988 Fab阻断受体结合特性
将浓度为1μg/mL的VEGF165蛋白包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1小时后，加入100μL 2μg/mL VEGFR2-his蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司)，再加入不同浓度的人源化VEGF-H988 Fab、Lucentis和阴性对照抗体H7N9-R1-Fab(来源：北京义翘神州科技有限公司)共同孵育。洗板去除未结合抗体，加入C-his-R023/HRP孵育后重复洗板，最后加入底物显色液进行显色，终止后酶标仪读取OD450，每组2次平行。
以抗体浓度为横坐标，抑制率PI％为纵坐标，利用GraphPad Prism软件分析并绘图并计算IC50值。抑制率PI％＝(OD空白-OD样品)/OD空白×100，其中OD空白表示只加VEGFR2-his不加抗体组的OD值，OD样品表示同时加VEGFR2-his和抗体的待测组OD值。
如图5所示，VEGFR2蛋白可有效结合包被的VEGF165蛋白，VEGF-H988Fab可有效抑制VEGFR2蛋白与VEGF165蛋白的结合，且VEGF-H988 Fab阻断能力明显优于Lucentis，阴性对照抗体无抑制作用。
3.3 VEGF-H988 Fab阻滞不同浓度VEGF165生长抑制活性
采用WST-8法，检测人源化抗体中和VEGF165对HUVEC细胞的增殖作用。96孔板接种HUVEC细胞4×103/孔，在含有10％FBS及5％L-GIn的M199培养基中培养4h后加入不同浓度的抗体，50μL/孔。随后加入终浓度分别为1000ng/mL、100ng/mL、10ng/mL的VEGF16510μL/孔。将96孔板置于37℃、5％CO2条件下的CO2培养箱内3天。设置检测空白孔B(无细胞)、阴性对照组M(接种细胞，不加样品，加VEGF165)和M’(接种细胞，不加样品及VEGF165)对照。培养结束后加入WST-8显色液，10μL/孔，将96孔板置于CO2培养箱中孵育，显色稳定后置酶标仪上于450nm、630nm处测定吸光度。以吸光度值(OD450-OD630)减去检测空白孔B的读值来计算抗体的中和率，中和率％＝(阴性对照M组OD值-样品OD值)/(阴性对照M组OD值-M’组OD值)×100％，采用统计软件GraphPad Prism的自动分析功能计算标准曲线，横坐标为样品的浓度，纵坐标为中和率，回归方程为四参数方程，得到“S”型曲线，计算样品半数有效浓度(EC50)。
如图6-10及表4所示，在不同浓度重组人VEGF165条件下，VEGF-H988Fab的中和作用均强于Lucentis。当VEGF165浓度为1000ng/mL、100ng/mL时，VEGF-H988 Fab的中和活性强于EYLEA，但当VEGF165浓度为10ng/mL时，VEGF-H988 Fab稍弱于EYLEA。不同浓度的VEGF165条件下，VEGF-H988 Fab的活性均强于贝伐珠单抗及Brolucizumab，而与Conbercept活性相当。随着VEGF165浓度的升高，VEGF-H988 Fab维持了较高的最大中和率，而EYLEA和Avastin则有所降低。
表4 VEGF-H988 Fab中和VEGF165作用的EC50及最大中和率
序列表
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Claims (34)

1.一种分离的抗VEGF Fab抗体片段，其包含由SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列组成的重链CDR1域、由SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列组成的重链CDR2域和由SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列组成的重链CDR3域的重链可变区，和由SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1域、由SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2域和由SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3域的轻链可变区。
2.如权利要求1所述的抗VEGF Fab抗体片段，其包含具有SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的轻链可变区。
3.如权利要求1或2所述的抗VEGF Fab抗体片段，其为Fab片段，所述Fab片段进一步包含重链恒定区CH1和轻链恒定区。
4.如权利要求3所述的抗VEGF Fab抗体片段，其中所述重链恒定区CH1为氨基酸序列为SEQ ID NO:40的IgG1重链恒定区的氨基酸序列，和/或所述轻链恒定区为氨基酸序列为SEQID NO:39的轻链恒定区的氨基酸序列。
5.如权利要求1或2所述的抗VEGF Fab抗体片段，其进一步包含重链信号肽和轻链信号肽。
6.如权利要求5所述的抗VEGF Fab抗体片段，其中所述重链信号肽为氨基酸序列为SEQID NO:34的氨基酸序列，和/或所述轻链信号肽为氨基酸序列为SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
7.如权利要求1或2所述的抗VEGF Fab抗体片段，其为IgG抗体Fab抗体片段。
8.如权利要求7所述的抗VEGF Fab抗体片段，其为IgG1抗体Fab抗体片段。
9.如权利要求1或2所述的抗VEGF Fab抗体片段，其为单克隆的。
10.如权利要求1或2所述的抗VEGF Fab抗体片段，其与重组人VEGF165蛋白的结合亲和力KD为0.01-8E-10M。
11.如权利要求10所述的抗VEGF Fab抗体片段，其中所述与重组人VEGF165蛋白的结合亲和力KD为0.1-5E-10M。
12.如权利要求11所述的抗VEGF Fab抗体片段，其中所述与重组人VEGF165蛋白的结合亲和力KD为0.5-3E-10M。
13.如权利要求12所述的抗VEGF Fab抗体片段，其中所述与重组人VEGF165蛋白的结合亲和力KD为1.54E-10M。
14.一种抗体-药物缀合物，其包含如权利要求1-13中任一项所述的抗VEGF Fab抗体片段和另外的治疗剂。
15.如权利要求14所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗VEGF Fab抗体片段和所述另外的治疗剂通过接头连接。
16.一种核酸，其编码根据权利要求1-13中任一项所述的抗VEGF Fab抗体片段。
17.如权利要求16所述的核酸，其包含SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列和/或SEQ IDNO:46所示的核苷酸序列。
18.如权利要求17所述的核酸，其进一步包含SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列和/或SEQ ID NO:48所示的核苷酸序列。
19.如权利要求18所述的核酸，其包含SEQ ID NO:41所示的核苷酸序列和/或SEQ IDNO:42所示的核苷酸序列。
20.一种表达载体，其包含如权利要求16-19中任一项所述的核酸。
21.一种宿主细胞，其包含如权利要求16-19中任一项所述的核酸或如权利要求20所述的表达载体。
22.一种用于产生如权利要求1-13中任一项所述的抗VEGF Fab抗体片段的方法，其包括在适合于Fab抗体片段表达的条件下培养如权利要求21所述的宿主细胞，和从培养基中回收表达的Fab抗体片段。
23.一种药物组合物，其包含如权利要求1-13中任一项所述的抗VEGF Fab抗体片段，或如权利要求14或15所述的抗体-药物缀合物，及药学上可接受的载体。
24.如权利要求1-13中任一项所述的抗VEGF Fab抗体片段或如权利要求14或15所述的抗体-药物缀合物或如权利要求23所述的药物组合物，其用于治疗与血管生成相关的病症。
25.如权利要求24所述的抗VEGF Fab抗体片段或者抗体-药物缀合物或者药物组合物，其中所述与血管生成相关的病症是眼病。
26.如权利要求25所述的抗VEGF Fab抗体片段或者抗体-药物缀合物或者药物组合物，其中所述眼病是以脉络膜新生血管为特征的眼病。
27.如权利要求25所述的抗VEGF Fab抗体片段或者抗体-药物缀合物或者药物组合物，其中所述眼病包括年龄相关性老年黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、视网膜水肿、退行性近视、脉络膜新生血管(CNV)。
28.如权利要求1-13中任一项所述的抗VEGF Fab抗体片段或如权利要求14或15所述的抗体-药物缀合物或如权利要求23所述的药物组合物在制备用于治疗与血管生成相关的病症的药物中的用途。
29.如权利要求28所述的用途，其中所述与血管生成相关的病症是眼病。
30.如权利要求29所述的用途，其中所述眼病是以脉络膜新生血管为特征的眼病。
31.如权利要求29所述的用途，其中所述眼病包括年龄相关性老年黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、视网膜水肿、退行性近视、脉络膜新生血管(CNV)。
32.一种药物组合产品，其包含如权利要求1-13中任一项所述的抗VEGF Fab抗体片段或如权利要求14或15所述的抗体-药物缀合物或如权利要求23所述的药物组合物与一种或多种另外的治疗剂。
33.一种试剂盒，其包含如权利要求1-13中任一项所述的抗VEGF Fab抗体片段或如权利要求14或15所述的抗体-药物缀合物或如权利要求23所述的药物组合物。
34.如权利要求33所述的试剂盒，其进一步包含给药装置。
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