CN107108727A - 对人vegf‑a有异常强的结合亲和力并具有与人vegf‑b的交叉反应性的抗人vegf抗体 - Google Patents

对人vegf‑a有异常强的结合亲和力并具有与人vegf‑b的交叉反应性的抗人vegf抗体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鼠源和人源化抗人VEGF抗体及其用途。与本领域的抗人VEGF抗体相比，本发明的抗人VEGF抗体对人VEGF‑A有更高的结合亲和力，在培养基中对于VEGF‑A诱导的内皮细胞增殖是更强的抑制剂。此外，这些抗体与人VEGF‑B交叉反应。当以相同剂量施用时，本发明的抗体能够比贝伐单抗(阿瓦斯汀TM)更大程度地抑制体内肿瘤生长。

Description

对人VEGF-A有异常强的结合亲和力并具有与人VEGF-B的交叉 反应性的抗人VEGF抗体
技术领域
本发明大体上涉及对人VEGF-A有异常强的结合亲和力且其还与人VEGF-B交叉反应的抗人VEGF抗体，具体涉及这些抗体的嵌合和人源化形式。
背景技术
血管生成是涉及新血管从已有血管生长的生理过程。这个过程对于生长和发育以及伤口愈合是至关重要的。然而，它也是恶性肿瘤发展和诸如增殖性视网膜病、类风湿性关节炎和牛皮癣的其他非肿瘤相关病状的基础(Folkman J.1971；Praidou A等人，2010；Canavese M等人，2010)。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是由基质和肿瘤细胞分泌以及少量由多种其他细胞分泌的蛋白质，其在刺激血管生成中起着关键作用(Ferrara N等人，2004)。VEGF过量可以导致血管生成相关疾病。例如，没有充足血液供应的情况下，实体癌就不能生长超过受限的尺寸，表达VEGF的癌更能生长和转移(Ferrara N.2005)。考虑到这些因素，用诸如用于癌症治疗的贝伐单抗(阿瓦斯汀)(Ferrara N等人，2005)和用于视网膜病变的雷珠单抗(Lucentis)(Ciulla TA等人，2009)的抗VEGF单克隆抗体开发了抗血管生成疗法。在过去几年中已深入研究和应用基于使用贝伐单抗和雷珠单抗的疗法(Van MeterME等人，2010；Ciulla TA等人，2009)。美国食品药品监督管理局(FDA)批准贝伐单抗联合标准化疗用于转移性肾癌、成胶质细胞瘤、转移性结肠癌和非小细胞肺癌，以及用于转移性乳腺癌中。然而，在美国，FDA的专家小组现已表示他们在晚期乳腺癌中未看到阿瓦斯汀有足够益处来值得冒其严重的风险。目前在非转移性乳腺癌、肾细胞癌、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、去势抵抗性前列腺癌、非转移性不能切除的肝癌及转移性或不可切除的局部晚期胰腺癌中也正在进行一些临床试验。贝伐单抗也在没有FDA批准的情况下使用，不过是在临床研究的基础上，用于治疗黄斑变性，黄斑变性也是以视网膜中血管增殖为特征的眼病。雷珠单抗是来源于与贝伐单抗相同的鼠源抗体的Fab抗体片段，并已经被FDA批准用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性。
尽管目前所批准的抗VEGF-A抗体的临床用途产生益处，但仍有关于治疗效果、副作用、治疗抵抗和治疗费用的许多问题有待解决。因此，开发新的更有效的抗人VEGF抗体是必要的。我们现已开发出新的抗人VEGF抗体，其出人意料地对人VEGF-A靶标有异常高的结合亲和力并具有与人VEGF-B的交叉反应性。即使根据其氨基酸序列，VEGF-B与VEGF-A密切相关，但VEGF-B血管生成功能具有血管存活所需的有效存活/抗凋亡作用(Li X等人，2009)。因此，VEGF-B对于维持支撑肿瘤生长的血管的完整性是非常重要的，且对其活动的干扰应该有助于更完全的抗肿瘤治疗。
发明内容
本申请说明了对人VEGF-A有异常强的结合亲和力并具有与人VEGF-B的交叉反应性的抗人VEGF抗体，与本领域的抗人VEGF抗体相比，其是抑制VEGF诱导培养物中内皮细胞增殖的更强的抑制剂。
本文所公开的鼠抗人VEGF抗体以不超过5×10-12M的KD值结合人VEGF-A，而本文所公开的抗人VEGF抗体的一种人源化形式以不超过1.0x10-10M的KD值结合人VEGF-A。此外，本文所公开的小鼠抗人VEGF抗体抑制VEGF-A诱导的体外HUVEC内皮细胞增殖的IC50值为约11ng/ml，而其人源化形式抑制VEGF-A诱导的体外HUVEC内皮细胞增殖的IC50值为约19ng/ml。本发明的抗人VEGF抗体结合到人VEGF-A165(SEQ ID NO：1)的三个区域，包含人VEGF-A165(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基16至25，45至54和79至92。所有这些区域参与VEGF-A与其受体(VEGFR)之间的相互作用。特别是，VEGF-A165的氨基酸16至25参与重要的接触区域(ShaliniL等人，2010)。对此，由于人和小鼠VEGF之间在包含氨基酸16至25的片段的具有高同源性(Fuh G等人，2006)，已经指出通过用于获得抗人VEGF单克隆抗体的传统方法可能很难获得针对此区域的单克隆抗体(Jin Kim K等人，1993)。然而，本发明所公开的免疫方案的改进出人意料地造成用经典方法(Kohler等人，1975)获得了针对此区域的单克隆抗体。这些单克隆抗体对VEGF-A分子有异常高的亲和力，还呈现出与人VEGF-B(SEQ ID NO：2)的交叉反应性。
通过根据治疗需要向对象施用治疗有效量的抗体，本文所公开抗体的人源化形式用于治疗VEGF相关的血管生成疾病包括癌症、年龄相关性黄斑变性、类风湿性关节炎和糖尿病性视网膜病变的用途在本发明的范围内。
附图说明
图1示出了通过本发明的小鼠mMcA-ABI-anti-VEGF-A单克隆抗体抑制VEGF诱导的HUVEC细胞培养物有丝分裂，以及通过抗VEGF单克隆抗体贝伐单抗(阿瓦斯汀TM)抑制VEGF诱导的HUVEC细胞培养物有丝分裂。实验过程如实施例5所述。每个点对应6次重复的平均和标准偏差。IC50值用GraphPad Prism 5程序计算。
图2示出了通过本发明小鼠mMcA-ABI-anti-VEGF-A单克隆抗体的人源化形式抑制VEGF诱导的HUVEC细胞培养物有丝分裂，以及通过抗VEGF单克隆抗体贝伐单抗(阿瓦斯汀TM)抑制VEGF诱导的HUVEC细胞培养物有丝分裂。实验过程如实施例5所述。每个点对应6次重复的平均和标准偏差。IC50值用GraphPad Prism 5程序计算。
图3示出了按以下剂量：1μg/小鼠或25μg/小鼠，一周两次，共五周，用本发明的小鼠mMcA-ABI-anti-VEGF-A单克隆抗体以及用本发明的小鼠mMcA-ABI-anti-VEGF-A单克隆抗体的人源化形式治疗后，裸鼠中IIB-Mel-J肿瘤生长的抑制。此后处死动物，切除肿瘤并称重。(＊)：根据非参数Kruskal-Wallis检验的统计学显著性。
图4示出了说明裸鼠中IIB-Mel-J肿瘤生长抑制的肿瘤图像，以示出本发明的小鼠mMcA-ABI-anti-VEGF-A单克隆抗体的人源化形式或者抗VEGF单克隆抗体贝伐单抗(阿瓦斯汀TM)的剂量作用。
图5示出了按以下剂量：1μg/小鼠或25μg/小鼠，一周两次，共五周，用本发明的小鼠mMcA-ABI-anti-VEGF-A单克隆抗体的人源化形式或者贝伐单抗(阿瓦斯汀TM)治疗后，裸鼠中IIB-Mel-J肿瘤生长的抑制。此后处死动物，切除肿瘤并称重。(＊)：根据非参数Kruskal-Wallis检验，相对于对照的统计学显著性。(＊＊)：根据非参数Kruskal-Wallis检验，相对于贝伐单抗治疗的统计学显著性。
具体实施方式
本发明的以下说明仅意在举例说明本发明的几个实施方式。然而，不意味着这些所讨论的实施方式限制本发明的范围，因为在不偏离本发明范围的情况下，许多改变和改进对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
缩略语
以下缩略语将在本发明的全文中使用：VEGF＝血管内皮细胞生长因子；VEGF-A＝血管内皮细胞生长因子变体A；VEGF-B＝血管内皮细胞生长因子变体B；VEGFR＝血管内皮细胞生长因子受体；HUVEC＝人脐静脉内皮细胞；KD＝特定抗体-抗原相互作用的解离常数；BSA＝牛血清白蛋白；
术语释义
本文所用术语“人VEGF”是指165个氨基酸的血管内皮细胞生长因子(VEGF-A165)(SEQ ID NO：1)，以及所述相关血管内皮细胞生长因子(Leung DW等人，1989，Houck，KA等人，1991)和如上所述那些生长因子的等位基因及加工形式(Ferrara N.1999)。
本文所用术语“人VEGF-B”是指186个氨基酸的血管内皮细胞生长因子变体(VEGF-B186)(SEQ ID NO：2)，其在病理状况下的血管存活中起着重要作用(Zhang F等人，2009)。
本文所用术语“抗体”包括任何以下分子种类：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。正常抗体包括两条重链和两条轻链。每一条重链由可变区和恒定区组成。每一条重链具有两个区，恒定区和可变区。每一条轻链同样具有恒定区和可变区。轻链和重链的可变区决定抗原的结合。两条链中的可变区通常含有三个称为互补决定区(CDR)的可变环状结构。该三个CDR插入在称为构架区(FR)的侧翼片段之间。FR比CDR明显更加保守。
抗体根据它们重链的结构分为不同同种型。有五种称为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的主要抗体同种型。
本文所用术语“抗原结合片段”是指结合指定抗原但不包括完整抗体的抗体片段。本领域公知的一些但非全部抗原结合片段的实例为：Fab、F(ab′)2、Fv和scFv。在某些实施方式中，抗原结合片段可以包括一个或多个CDR，其来自与一种或多种人抗体的FR组合的特异性抗体。
“Fab”是指结合抗原的抗体片段且其由每个重链和每个轻链的一个恒定域和一个可变域组成。在实验设置中，可以通过用木瓜蛋白酶消化抗体而产生Fab片段。
“F(ab′)2”是指能通过用在铰链抗体区下方切开的胃蛋白酶消化抗体而获得的抗体片段。
“Fv”是指抗体承载完整抗原结合位点的最小片段且其由结合到相同抗体重链可变区的轻链可变区组成。
“scFv”是指由肽接头连接的两个Fv片段组成的工程分子(Huston，J.S.等人，1988)。
本文所用术语“表位”是指抗原中结合抗体的特殊区域。
本文所用术语“癌”是指涉及导致恶性肿瘤形成和转移的失控的细胞分裂的医学病症。
本文所用术语“血管生成”是指涉及新血管从已有血管生长的生理过程。
本文所用短语“与过度血管生成相关的疾病”是指由血管生成异常增加引起的医学病症。
对其靶标抗原具有高亲和力的治疗性单克隆抗体
单克隆抗体对其靶标抗原的亲和力是针对治疗性能需要考虑的重要因素(HarmsBD等人，2012；Lippow MS等人，2007；Zhou Y等人，2012)。更高亲和力的抗体可能能够用更低的剂量来达到期望的临床效果。更低的剂量可以允许更方便的施用途径以及减少注射量，其可以转变为更低的产品成本。
被报道为高亲和力的抗体KD通常在纳摩尔范围内(Griffiths AD等人，1994；deHaard HJ等人，1999)，偶尔在亚纳摩尔范围内(Vaughan TJ等人，1996)。特别是，公知的抗VEGF治疗性单克隆抗体阿瓦斯汀TM(贝伐单抗)的KD在纳摩尔范围内(Presta，L.G.等人，1997)。
很少有描述KD在皮摩尔范围内的单克隆抗体的报道，且它们全部都是用非常规技术获得的(Yang W等人，1995；Rathanaswami P等人，2005；Zhao Q等人，2011；Pichinuk E等人，2012)。
本发明提供抗VEGF单克隆抗体，其鼠源形式以约5.0pM的KD值结合人VEGF-A165(SEQ ID NO：1)，其一种人源化形式以约100pM的KD值结合人VEGF-A165(SEQ ID NO：1)。
-本发明的鼠抗VEGF单克隆抗体和人源化形式两者同样具有与人VEGF-B(SEQ IDNO：2)的交叉反应性。
-本发明单克隆抗体的鼠源形式以约11ng/ml的IC50(比相同试验中贝伐单抗的IC50低5倍)中和HUVEC增殖试验中的VEGF-A，本发明抗体的人源化形式以约19ng/ml(比相同试验中贝伐单抗的IC50低3倍)的浓度中和该VEGF-A。
-本发明的鼠抗VEGF单克隆抗体和人源化形式两者的特征均为具有比贝伐单抗更优的体内抗肿瘤活性。这并不是显而易见的结果，因为众多因素决定体内的抗肿瘤活性(Rudnick SI等人，2009；Beckman RA等人，2007；Covell DG等人，1986；Thurber GM等人，2007；Jain RK等人，1990；Liang W等人，2006)。因此，具有较高亲和力以及同时具有较高的体内生物活性(诸如本文所公开的那一种)的抗体的发现是高度不可预测的。
本文所公开的是称为mMcA-AB1-anti-VEGF-A(小鼠单克隆抗体A-AB1-anti-VEGF-A)的亲本小鼠抗体、用于其生产的称为mMcA-AB1-anti-VEGF-A克隆的抗体的细胞系(杂交瘤细胞)、称为hMcA-ABI-VEGF-A的mMcA-AB1-anti-VEGF-A的人源化形式(人源化单克隆抗体A-AB1-anti-VEGF-A)和mMcA-AB1-anti-VEGF-A的工程化微形式。如下文所讨论的，亲本抗体mMcA-AB1-anti-VEGF-A大体上用Kohler的方法(Kohler G等人，1975)但采用如实施例1中所述的独特的免疫方案而获得。为了选择产生高生物学效率的抗人VEGF-A抗体的细胞克隆，使用HUVEC增殖试验(关于此试验的技术说明见实施例5)。产生最具活性抗体的细胞克隆(杂交瘤细胞)是上文提到的mMcA-AB1-anti-VEGF-A克隆。令我们惊奇的是，用BiacoreT100传感器测量时(关于此试验的技术说明见实施例2)，由这种细胞克隆产生的单克隆抗体对人VEGF-A165(SEQ ID NO：1)血管生成因子具有异常高的亲和力(KD在pM范围内)。mMcA-AB1-anti-VEGF-A的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列为：
重链可变区：
QVKLLESGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNFGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTNTGEPTYVDDFKGRFAFSLETSASSAYLQISNLNNEDTATYFCARYYGSTSVWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO：3)
轻链可变区：
ELVMTQTPSSLSASLGDRVTITCRASQDIFNYLNWYQQKPDGPIKLLIYYSSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLDREDIATYFCQQGFTLPWTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO：4)
CDR区以下划线标注
(关于测序的技术说明见实施例6)
表位分析表明mMcA-AB1-anti-VEGF-A结合VEGF-A165(SEQ ID NO：1)氨基酸序列的以下三个片段：
1：HHEVVKFMDVYQRSYCH(VEGF-A165的氨基酸11至27)
2：YIFKPSCVPLMR(VEGF-A165的氨基酸44至56)
3：QIMRIKPHQGQHIG(VEGF-A165的氨基酸79至92)
(关于表位作图的技术说明见实施例3)
有下划线的是被描述为对于VEGF-A与其受体VEGFR-2的结合很关键的氨基酸(Kiba A等人，2003)。据此，mMcA-AB1-anti-VEGF-A是唯一称为能够阻断VEGF-A与其受体VEGFR-2之间紧密相互作用的所有三个点的单克隆抗体。这可以至少部分解释与本领域已知的抗VEGF抗体相比，在生物试验中mMcA-AB1-anti-VEGF-A具有抑制VEGF-A的高效率。例如，mMcA-AB1-anti-VEGF-A显示出比贝伐单抗更大程度地抑制HUVEC增殖的能力(见实施例5)。另外，在抑制肿瘤生长方面，在试验剂量上，本发明的抗体被证明比贝伐单抗更有效(见实施例10)。值得一提的是，所有试验抗体均无明显的中和小鼠VEGF的活性(见实施例1)，该事实使得其抗肿瘤活性之间的比较有意义。在其抑制裸鼠中人肿瘤生长的效率方面，已将对小鼠VEGF具有中和活性的其他抗VEGF抗体和不与小鼠VEGF-A交叉反应的贝伐单抗(见美国专利8,101,177和美国专利8,034,905)进行了比较。因此，在人体中与贝伐单抗相比时，这些研究并不足以预测这些抗体的相对效率。对此，关于基质小鼠VEGF对人肿瘤异种种植物生长的影响的说明性讨论可以在Liang等人的研究中找到(Liang，W.C.等人，″Cross-Species Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)-Blocking AntibodiesCompletely Inhibit the Growth of Human Tumor Xenografts and Measure theContribution of Stromal VEGF，″J.Biol.Chem.281(2)：951-961(2006))。
如上文所讨论的，mMcA-AB1-anti-VEGF-A在体内抗肿瘤试验方面的这种优良性能并非显而易见，因为高亲和力(或者甚至体外UVEC试验中对VEGF-A活性的高抑制)不一定与体内抗肿瘤活性的高度增强相关，在体内许多其他因素可以影响活性。
如下文(实施例7)所述，获得了亲本抗体mMcA-AB1-anti-VEGF-A的超级人源化形式。为此，将mMcA-AB1-anti-VEGF-A的CDR之间的构架区替换为从人生殖细胞系的IgG基因获得的最同源的构架区(Tan P等人，2002)。这种方法引入了最少的小鼠氨基酸残基，以避免人治疗期间的免疫反应性。
(关于超级人源化过程的技术说明见实施例7)
mMcA-AB1-anti-VEGF-A的超级人源化形式(称为hMcA-AB1-anti-VEGF-A)的重链可变区及轻链可变区的序列是：
重链可变区：
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNFGMNWVROAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYVDDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARYYGSTSVWYFDVWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO：5)
轻链可变区：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASODIFNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYSSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGFTLPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：6)
CDR区以下划线标注
作为其亲本抗体，hMcA-AB1-anti-VEGF-A显示出比贝伐单抗更大程度地抑制HUVEC增殖的能力(见实施例9)。另外，作为其亲本抗体，hMcA-AB1-anti-VEGF-A显示出比贝伐单抗更大程度地抑制体内肿瘤生长的能力(见实施例10)。
在某些实施方式中，本文提供抗体和抗原结合片段，其包括如SEQ ID NO：5-6中所示的niMcA-AB1-anti-VEGF-A的CDR序列(SEQ ID NO：7-12)。
在某些实施例中，本文提供的抗体结合VEGF-A165(SEQ ID NO：I)的亲和力比贝伐单抗结合VEGF-A165的亲和力更大。例如，在某些实施例中，本文提供的抗体结合VEGF-A165的KD为约100pM，在其他实施例中KD为约5pM。
已经发现本文提供的抗体抑制HUVEC增殖的效率比贝伐单抗更高。例如，在某些实施例中，本文提供的抗体抑制HUVEC增殖的ID50为约19ng/ml，在另一实施例中ID50为约11ng/ml。因此，本文提供的抗体可用于治疗与血管生成增加相关的各种医学病症。例如，抗体可用于治疗癌症，通过抑制生长肿瘤的血管的增殖从而抑制肿瘤生长。已经在体内(实施例10)证实了本文提供的抗体的抗肿瘤效率。
在某些实施例中，本文提供的抗体抑制肿瘤生长的水平比贝伐单抗更高。在使用异种移植小鼠肿瘤模型的体内实验中，mMcA-AB1-anti-VEGF-A和hMcA-AB1-anti-VEGF-A比贝伐单抗更有效地抑制肿瘤生长。因此，在某些实施例中，本文提供的抗体可以以与贝伐单抗类似的剂量使用以实现更好的抗肿瘤效果，或以较低的剂量使用，以避免有效性相似时的次级不良副作用。
本文公开的抗体可用于治疗由VEGF过量表达引起的过度血管生成而引起的医学病症。作为眼部疾病和几种肿瘤疾病的这些病症的实例包括湿性AMD和糖尿病性视网膜病变(Crawford TN等人，2009；Albini A等人，2012)。
可用本文公开的抗体治疗的癌症病症包括但不限于恶性肿瘤、母细胞瘤、肉瘤、生殖细胞肿瘤、或血液或淋巴恶性肿瘤，诸如白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。更具体地说，可使用本文公开的抗体治疗的癌性病症和肿瘤类型包括但不限于鳞状细胞癌、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌或肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝癌(例如肝细胞癌/肝细胞瘤)、胃窦或胃癌(例如胃肠癌)、胰腺癌、脑肿瘤(例如成胶质细胞瘤/多形性成胶质细胞瘤(GBM)、非成胶质细胞瘤脑肿瘤或脑膜瘤)、神经胶质瘤(例如室管膜瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤或混合型神经胶质瘤诸如少突星形细胞瘤)、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(例如肝母细胞瘤、肝细胞癌/肝细胞瘤或肝癌)、膀胱癌(例如尿路上皮癌)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾或肾脏癌(例如肾杆状瘤)、前列腺癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌(例如肛门鳞状细胞癌)、甲状腺癌、头颈癌(例如鼻咽癌)、皮肤癌(例如黑色素瘤或鳞状细胞癌)、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、软骨肉瘤、软组织肉瘤(例如横纹肌肉瘤、纤维肉瘤、卡波西肉瘤)、类癌、眼癌(例如视网膜母细胞瘤)、间皮瘤、淋巴细胞性/淋巴细胞白血病(例如T细胞谱系和B细胞前体谱系的急性淋巴细胞性/淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞/淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性/成髓细胞白血病(AML)(包括肥大细胞白血病)、慢性骨髓性/髓细胞/成髓细胞白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)，霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤(BL)、蕈样肉芽肿病、塞扎里综合征、皮肤T细胞淋巴瘤、肥大细胞肿瘤、成神经管细胞瘤、肾母细胞瘤、孤立性浆细胞瘤、骨髓增生异常综合征、慢性和非慢性骨髓增生性疾病、中枢神经系统肿瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、真性红血细胞增多症、血小板增多症、特发性骨髓纤维化，以及儿科癌症，例如儿科肉瘤(例如成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤和和骨肉瘤)。此外，肿瘤可以是恶性的(例如癌症)或良性的(例如增生、囊肿、假性囊肿、错构瘤和良性肿瘤)。
可由本文所述的抗体和抗原结合片段治疗的其他病症包括炎性病症，诸如类风湿性关节炎、银屑病、硬皮病、慢性阻塞性肺病和哮喘。
在其他非治疗性实施例中，抗体或抗原结合片段可用于各种体外或体内诊断或检测应用。
本文公开的抗体可单独施用或与一种或多种另外的治疗剂组合施用。例如，本文公开的抗体或抗原结合片段可与化疗、放射疗法和癌症手术组合施用。此外，本文公开的抗体或抗原结合片段可以与由化疗或其他治疗剂引起的并发症的治疗组合施用。在某些实施例中，本文公开的抗体或抗原结合片段可作为相同药物组合物的部分施用。
在某些实施例中，与本文公开的抗体或抗原结合片段连接的偶联物可包含一种或多种意图改变抗体或抗原结合片段的一种或多种药代动力学(PK)性质的试剂，例如聚乙二醇(PEG)以增加半衰期。
在某些实施例中，提供了包含本文公开的抗体与一种或多种细胞因子组合的组合物。细胞因子的实例包括但不限于淋巴因子、单核因子、人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体生成激素(LH)、肝生长因子、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、肿瘤坏死因子α和β、米勒管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、整合素、血小板生成素(TPO)、神经生长因子如NGF-β、血小板生长因子、转化生长因子如TGF-α和TGF-β、胰岛素样生长因子I和II、促红血细胞生成素(EPO)、骨诱导因子、干扰素(诸如干扰素-α，-β和-γ)、集落刺激因子(诸如巨噬细胞-CSF、粒细胞巨噬细胞CSF和粒细胞-CSF)、白血细胞介素(诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11和IL-12)、肿瘤坏死因子(诸如TNF-α和TNF-β)以及其他多肽因子。本文公开的抗体或抗原结合片段可与任何细胞因子(包括上文所列的任何细胞因子)组合提供和/或施用。
在某些实施例中，提供的组合物包含与一种或多种化疗剂连接或组合的本文所公开的抗体或抗原结合片段。化疗剂的实例包括但不限于ALT-110、AMN-107(尼洛替尼)、氨柔比星、ARQ-197、阿曲生坦(Xinlay.RTM.)、AV-299、AZD 1152、AZD 2171、batabulin、BIO-111、BIO-140、骨化三醇、CC 8490、西仑吉肽、达沙替尼、decatanib、DN-101、edotecarin、enzastaurin、埃罗替尼、依维莫司、gimatecan、棉酚(例如棉酚乙酸盐)、GSK461364、GSK690693、IL13-PE38QQR、INO 1001、IPdR、ipilimumab、KRX-0402、Lep-etu、Ionafarnib、甲硫蒽酮、LY 317615、MK-0457、MLN8054、neuradiab、洛拉曲克、奥利美生、奥法木单抗、ON0910.Na、奥戈伏单抗、帕尼单抗、帕唑帕尼、PHA-739358、R-763、RTA 744、鲁比替康、Sdx102、他仑帕奈、坦罗莫司、替米利芬、汉防己甲素、ticilimumab、TKI-258、TLK 286、他比特定、凡德他尼、vitespan、Xr 311、扎木单抗、131-I-TM-601和唑来膦酸盐、组氨瑞林、氮杂胞苷、右丙亚胺、阿来组单抗、来那度胺、吉妥单抗、酮康唑、氮芥、替伊莫单抗、地西他滨、六甲三聚氰胺、贝沙罗汀、托西莫单抗、三氧化二砷、editronate、环孢菌素、Edwina-天冬酰胺酶、锶89、罗米地辛(FK-228)、ADS-100380、CG-781、CG-1521、IMT504、IMT506、IMT507、SB-556629、chlamydocin、伏立诺他、依托泊苷、吉西他滨、多柔比星、5′-脱氧-5-氟尿苷、长春新碱、替莫唑胺、喜树碱、伊立替康、奥沙利铂、他莫昔芬、阿那曲唑、己烯雌酚、贝伐单抗、亮丙瑞林、舒尼替尼、甲羟孕酮、雷洛昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、氨磷汀、NVP-LAQ824、辛二酰化物异羟肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、BAY43-9006、KRN951、氨鲁米特、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、天冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博来霉素、布舍瑞林、白消安(1，4-丁二醇二甲磺酸盐)、沙铂、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、甲二氯二乙胺、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、奥曲肽、edotreotide、奥沙利铂、帕米膦酸盐、喷司他丁、普卡霉素、卟吩姆、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链脲佐菌素、替尼泊苷、睾酮、沙利度胺、沙利度胺联合地塞米松、硫鸟嘌呤、噻替派、维甲酸、长春地辛、全反式视黄酸、或13-顺式-视黄酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲蜜胺、氟尿苷、5-脱氧尿苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、6-巯嘌呤、脱氧助间型霉素、骨化三醇、戊柔比星、光辉霉素、长春碱、长春瑞滨、拓扑替康、razoxin、马立马司他、COL-3、新伐司他、BMS-275291、角鲨胺、内皮抑素、SU5416、SU6668、EMD121974、白血细胞介素-12、EV1862、血管抑制素、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺内酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠单抗、地尼、白介素、吉非替尼、bortezimib、紫杉醇、多西紫杉醇、epithilone B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬(3-羟基他莫昔芬)、4-羟基他莫昔芬、pipendoxifene、ERA-923、阿佐昔芬、氟维司群、acolbifene、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、拓扑替康、PTK787/ZK222584、VX-745、PD 184352、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、BAY-43-9006、ZM336372、L-779450、黄酮吡啶酚、UCN-01、雷帕霉素、依维莫司。
在某些实施例中，本文提供的抗体与聚乙二醇化或非聚乙二醇化干扰素α-2a、聚乙二醇化或非聚乙二醇化干扰素α-2b、聚乙二醇化或非聚乙二醇化干扰素α-2c、聚乙二醇化或非聚乙二醇化干扰素αn-1、聚乙二醇化或非聚乙二醇化干扰素αn-3、以及聚乙二醇化、非聚乙二醇化复合干扰素或白蛋白-干扰素-α中的一种或多种组合。
包含止吐药的组合物可用于预防或治疗恶心、化疗的常见副作用。因此，在某些实施例中，提供了包含本文提供的抗体的组合物，该抗体与一种或多种抗癌剂以及一种或多种止吐药连接或组合，包括但不限于casopitant、Netupitant、帕洛诺司琼、阿瑞吡坦、苯海拉明、羟嗪、甲氧氯普胺、劳拉西泮、阿普唑仑、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、丙氯拉嗪、格拉司琼、昂丹司琼、多拉司琼和托烷司琼。
癌症治疗的其他副作用包括红血细胞和白血细胞缺乏。因此，提供了包含本文提供的抗体的组合物，该抗体与治疗红血细胞和/或白血细胞缺乏的试剂诸如G-CSF、聚乙二醇化G-CSF、GM-CSF、促红血细胞生成素以及聚乙二醇化促红血细胞生成素连接或组合。
在某些实施例中，提供了包含本文提供的抗体的组合物，该抗体与一种或多种抗高血压剂诸如利尿剂、肾上腺素能受体拮抗剂、肾上腺素能受体激动剂、钙通道阻断剂、ACE抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、醛固酮拮抗剂、血管扩张剂或中枢作用肾上腺素能药物组合。
在某些实施例中，本文公开的抗体可作为包含一种或多种生理上可耐受组分的药物组合物的部分施用。因此，在某些实施例中，本文提供了此类组合物和配制此类组合物的方法。包含本文公开的一种或多种抗体和一种或多种生理上可耐受组分的组合物可用于治疗与血管生成增加相关的疾病。
用于本文公开的药物组合物的生理上可耐受组分的实例为：药学可接受液体、凝胶或固体载体、稀释剂、佐剂、赋形剂、辅助物质以及本领域已知的其他组分或其组合。合适组分的实例为：抗氧化剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂或乳化剂。合适的抗氧化剂的实例为：甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巯基乙酸、硫代山梨醇、丁基羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯以及没食子酸丙酯。合适的载体的实例为：水性载体如生理氯化钠、林格氏溶液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液、非水性载体(诸如植物来源的不挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油)、抑菌或抑真菌浓度的抗微生物剂、等渗剂(诸如氯化钠或右旋糖)、缓冲剂(诸如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、抗氧化剂(诸如硫酸氢钠)、局部麻醉剂(诸如盐酸普鲁卡因)、悬浮和分散剂(诸如钠羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮)、乳化剂(诸如聚山梨醇酯80(TWEEN-80))、多价螯合剂或螯合剂(诸如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸))、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。可将用作载体的抗微生物剂加入多剂量容器中的药物组合物中，药物组合物包括苯酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。合适的赋形剂可包括例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可包括，例如，润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂、或试剂(诸如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精)。
本文所用术语“治疗有效量”或“有效剂量”是指有效治疗疾病或病症的药物剂量或浓度。例如、关于本文公开的抗体用于治疗癌症的用途，治疗有效量是抗体或抗原结合片段的剂量或浓度，其能够消除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长、抑制介导癌性病症的细胞的生长或增殖、抑制肿瘤细胞转移、改善与肿瘤或癌性病症相关的任何症状或标记、预防或延迟肿瘤或癌性病症的发展或其某种组合。
本文提供的抗体或抗原结合片段的有效剂量可使用本领域公知的方法确定。例如，可通过确定以特定剂量施用后，受试者被治疗的肿瘤是否收缩、停止生长或生长更慢来确定有效剂量。
在某些实施例中，本文提供的抗体可以以约0.01μg/小鼠至约100μg/小鼠的治疗有效剂量施用。给定剂量可以以各种时间间隔施用，例如每天一次、每天两次或更多次、每周两次或更多次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次或每两个或多个月一次。在某些实施例中，可在治疗过程中改变施用剂量。例如，在某些实施例中，初始施用剂量可以高于随后的施用剂量。在某些实施例中，施用剂量可根据受试者的反应在治疗过程中变化。
可调整剂量方案以提供最优的期望反应(例如治疗反应)。例如，可施用单一剂量，或者可随时间施用若干分次剂量。
包含本文公开的抗体并且在某些实施例中与化疗剂组合的药物组合物可通过本领域公知的方法制备。
本文公开的抗体和抗原结合片段可通过本领域已知的任何途径施用，诸如肠胃外(例如皮下、腹腔内、静脉内，包括静脉内输注、肌内或真皮内注射)或非肠胃外(例如口服、鼻内、眼内、舌下、直肠或局部)途径。在抗体通过注射施用的实施例中，可注射的药物组合物可以以任何常规形式制备，例如液体溶液、悬浮液、乳液，或适于产生液体溶液、悬浮液或乳液的固体形式。用于注射的制剂可包括待注射的无菌溶液、在使用前待与溶剂混合的无菌干燥可溶性产品诸如冻干粉末(包括皮下片剂)、待注射的无菌悬浮液、在使用前待与载体混合的无菌干燥不溶性产品、以及无菌乳液。溶液可以是水性或非水性的。
在某些实施例中，通过将本文公开的抗体或抗原结合片段溶解在合适的溶剂中来制备无菌冻干粉末。由粉末制备的溶剂可含有改善粉末或重构溶液的稳定性或其他药理学成分的赋形剂。可使用的赋形剂包括但不限于水、右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合适的试剂。溶剂可含有缓冲剂，例如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或本领域技术人员已知的其他此类缓冲剂，在一个实施例中，约为中性pH。随后无菌过滤溶液，然后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干，提供所需的制剂。在一个实施例中，将所得溶液等分放入管形瓶中用于冻干。每个管形瓶可含有单一剂量或多剂量的抗VEGF抗体或其组合物。
以注射用水重构冻干粉末提供用于肠胃外施用的制剂。在一个实施例中，为了重构将冻干粉末加入无菌水或其他液态合适载体中。精确量取决于给予的选定的治疗，并且可以由经验确定。
-在某些实施例中，提供了用于生产本文公开的抗体的系统和方法。本发明的小鼠抗体mMcA-ABI-anti-VEGF-A可以通过使用本领域公知的标准技术(例如参见Birch JR等人，1985)，在体内或体外培养生成mMcA-AB1-anti-VEGF-A的细胞克隆(杂交瘤)而产生。可选择地，可以使用表达系统。编码本发明的亲本小鼠单克隆抗体的DNA，可以从生产细胞分离或体外合成，插入克隆载体，并使用标准程序引入到合适的宿主细胞或细菌中(DaviesSL.2009，卷6，153-173)。
本文公开的小鼠亲本抗体的非天然形式(例如嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体)可以使用本领域公知的方法来制备(Morrison SL等人，1984；Neuberger MS等人，1984；Takeda S等人，1985)。表达系统也可用于生产本文公开的小鼠亲本单克隆抗体的不同抗体衍生物。这些表达系统包括编码抗体的多核苷酸、包含这些多核苷酸的载体以及包含这些载体的宿主细胞。编码本文公开的抗体的多核苷酸可使用本领域公知的方法分离或合成，并将其插入到可复制载体中用于扩增或克隆。
编码抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的多核苷酸可从单个载体表达，或者它们可以使用两个单独的载体表达，随后在体外组装。在某些实施例中，它们可在相同细胞内由两个单独的载体共表达并在细胞内组装。合适的载体可含有一种或多种调节序列的各种构型，例如启动子、增强子或转录起始序列，以及编码表型选择标记的基因。具有用于表达本文公开的抗体的合适主链的载体是本领域已知的(例如参见Davies SL等人，2009)。在某些实施例中，载体可含有编码人IgG免疫球蛋白的重链(CH)和轻链(CL)的恒定区的多核苷酸序列。可选择地，载体可仅表达抗体的VH和VL链，其中所表达的多肽包含Fv片段而不是完整抗体。可将载体插入到合适的宿主细胞中用于扩增或表达多核苷酸序列。宿主细胞可在本领域已知的多种培养基诸如极限必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Sigma)和Ham′s F10(Sigma)中培养用于生产抗体。培养基中可补充多种试剂，例如激素、生长因子、盐，缓冲剂、核苷酸、抗生素、微量元素、葡萄糖或其他能量源。培养条件如温度和pH可使用本领域公知的参数进行调节。表达后，本文提供的一种或多种抗体可使用本领域公知的方法纯化(例如参见Vijayalakshmi MA.1998)。
本文公开的抗体可包含用于特异性输送至肿瘤位置的偶联物。
提供以下实施例以更好地举例说明所要求保护的发明且并不应被解释为限制本发明的范围。下述所有具体组合物、物质和方法全部或部分地落入本发明的范围内。这些具体组合物、物质和方法并不旨在限制本发明，而仅旨在说明落入本发明范围内的具体实施方式。本领域一名技术人员可以在没有实施本发明的能力下且不脱离本发明范围开发等同组合物、物质和方法。应当理解本文中所述的程序可以在不脱离本发明范围的前提下进行多种改变。发明人旨在将这样的改变包括在本发明的范围内。
实施例
实施例1：抗VEGF单克隆抗体的产生：
通常根据Kohler方法产生单克隆抗体(Kohler G等人，1975)。然而，免疫方案较独特。简而言之，在10个月的周期内，每月一次给4周大的BALB/c雌性小鼠注射在氢氧化铝溶液( Alu，Pierce)中与阳离子化BSA( BSA and EDC Conjugation Kits，Pierce，France)偶联的人重组VEGF165(SEQ ID NO：I)。收集淋巴细胞并将其通过用聚乙二醇(PEG1500，BDH)处理与骨髓瘤细胞融合。之后，在HAT培养基(次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶，σ)中接种并培养杂交瘤细胞。针对不含BSA的VEGF-A采用直接ELISA检测特定抗体的存在。使用有限稀释法选择抗人VEGF抗体产生的克隆。之后，为了选择产生具有较高亲和力的抗人VEGF-A抗体的克隆细胞，利用HUVEC增殖试验。
利用这种方法分离出若干候选杂交瘤并将其冷冻。进一步研究其中之一名为mMcA-AB1-anti-VEGF-A的克隆。此种mMcA-AB1-anti-VEGF-A杂交瘤所产生的单克隆抗体被命名为mMcA-AB1-anti-VEGF-A(简称为小鼠AB1抗体)。通过标准技术(VijayalakshmiMA.1998)对此抗体进行纯化，包括使用G蛋白琼脂糖柱(HiTrap Protein GHP.GEHeaIthcare)的亲和力层析法。如由ELISA和表面等离子体共振所测得，本发明的小鼠AB1抗体及其衍生物未发生交叉反应或中和小鼠VEGF-A。
实施例2：复合物mMc-AB1-anti-VEGF-A/VEGF-A165的解离速率常数(KD)的测定
本发明的经纯化的小鼠单克隆抗体mMc-AB1-anti-VEGF-A与VEGF-A165(SEQ IDNO：1)蛋白之间的亲和力通过表面等离子共振(SPR)来测定。通过用Biacore T100评估软件拟合1：1相互作用模型的动力学分析来分别测定复合物mMc-AB1-anti-VEGF-A/VEGF-A165的亲和力常数KA与解离常数KD。结果如表1所示。
表1.mMcA-AB1-anti-VEGF-A/VEGF-A165相互作用的动力学参数
这一结果表明本发明的mMcA-AB1-anti-VEGF-A单克隆抗体对人VEGF-A具有异常高的亲和力(在pM范围内)。
实施例3：绘制被mMcA-AB1-anti-VEGF-A识别的VEGF-A165的表位。
通过LC Sciences(Huston，Texas)采用其PeptArrayTM系统绘制被mMcA-AB1-anti-VEGF-A识别的VEGF-A165的表位。根据VEGF165序列(SEQ ID NO：1)合成重叠肽。条件：结合缓冲液：IX PBS，pH 7.0；洗涤缓冲液：含有0.05％Tween-20和0.05％Triton X-100的IX PBS，pH 7.0。结合条件：mMc-AB1-anti-VEGF-A在结合缓冲液中的浓度为1μg/mL，25℃，1小时。检测条件：山羊抗鼠IgG Cy5偶联物在结合缓冲液中的浓度为10ng/mL，25℃，30分钟。在635nm通道，在PMT 700下扫描。分析结果显示mMc-AB1-anti-VEGF-A与以下三种VEGF-A165(SEQ IDNO：1)域的主接触点：
1：HHEVVKFMDVYQRSYCH(VEGF-A165的氨基酸11至27)
2：YIFKPSCVPLMR(VEGF-A165的氨基酸44至56)
3：QIMRIKPHQGQHIG(VEGF-A165的氨基酸79至92)
有下划线的是被描述为对于VEGF-A与其受体VEGFR-2的结合很关键的氨基酸(Kiba A等人，2003)。
实施例4：mMcA-AB1-anti-VEGF-A与人VEGF-B186(SEQ ID NO：2)的交叉反应性。
将mMcA-AB1-anti-VEGF-A(6.30-0.18μM)注射到固定化血管内皮细胞生长因子抗原B(VEGF-B186)(4000RU)。通过用Biacore T100评估软件拟合1∶1相互作用模型的动力学分析来分别测定KA与KD。动力学参数与常数如表2所示。
表2.mMcA-AB1-anti-VEGF-A与VEGF-B186之间相互作用的动力学参数。
Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(1/M) KA(M)
32.80±0.06x104 5.71±0.02x10-3 1.8x10-7 5.6x106
结果表明与其对VEGF-A的亲和力相比，mMcA-AB1-anti-VEGF-A能够以低亲和力与VEGF-B186交叉反应。
实施例5：mMcA-AB1-anti-VEGF-A对VEGF-A诱导的培养基中人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的中和活性。
将HUVEC细胞以2500细胞/孔的密度接种在96孔板中，其中含有50μl补充了10％FCS和50μg/ml庆大霉素的M199培养基。2小时后，将含有RPMI培养基中25μl经纯化的mMcA-AB1-anti-VEGF-A与M199完全培养基中75μl含有VEGF(20ng/ml)的100μl溶液添加到每个孔中。经24小时温育后，添加25μl含有2,5μCi/ml甲基-[3H]-胸苷的M199完全培养基，再继续温育48小时。之后，添加50μl 6M氯酸胍终止反应。经3次冻融循环完成细胞破裂，在Whatman-GFC过滤器中收集DNA并测量其放射活性。图1示出了本发明的mMcA-AB1-anti-VEGF-A单克隆抗体的中和能力与本领域的抗VEGF单克隆抗体贝伐单抗(Zondor SD等人，2004)的中和能力的比较图。
实施例6：mMcA-AB1-anti-VEGF-A的重链可变区及轻链可变区序列
为了获得编码mMcA-AB1-anti-VEGF-A的重链可变区及轻链可变区的基因序列，通过TRIzol(Gibco)方法从产生抗体的杂交瘤细胞中提取全部RNA。采用随机引物(Invitrogen)使用逆转录酶(Promega)合成cDNA。如所述扩增Fab区的重链可变区和轻链可变区(Sastry L.1989)。
用于扩增重链可变区(5′末端)的引物：
CPV 1. 5′-AGGT(C/G)(C/A)A(G/A)CT(G/T)CTCGAGTC(T/A)GG-3′
CPV 2. 5′-AGGTCC AGCTGCTCGAGTCTGG-3′
CPV 3. 5′-AGGTCC AGCTGCTCGAGTCAGG-3′
CPV 4. 5′-AGGTCCAGCTTCTCGAGTCTGG-3′
CPV 5. 5′-AGGTCC AGCTTCTCGAGTCAGG-3′
CPV 6. 5′-AGGTCC AACTGCTCGAGTCTGG-3′
CPV 7. 5′-AGGTCC AACTGCTCGAGTCAGG-3′
CPV 8. 5′-AGGTCCAACTTCTCGAGTCTGG-3′
CPV 9. 5′-AGGTCC AACTTCTCGAGTCAGG-3′
CPV 10. 5′-AGGTCGAACTTCTCGAGTC(T/A)GG-3′
用于扩增重链可变区(3′末端)的引物：
5′-AGGCTTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAATT-3′
用于扩增轻链可变区(5′末端)的引物：
CLV 1. 5′-CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA-3′
CLV 2. 5′-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA-3′
CLV 3. 5′-CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA-3′
CLV 4. 5′-CCAGATGTGAGCTCGTCATGACCCAGTCTCCA-3′
CLV 5. 5′-CCAGTTCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCA-3′
用于扩增轻链可变区(3′末端)的引物：
5′-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3′
将所得产物克隆至pComb 3载体(Barbas，C.F.1991)并测序。推导出的本发明的小鼠抗VEGF AB1单克隆抗体的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列结果如下：
重链可变区
QVKLLESGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNFGMNWVKOAPGKGLKWMGWINTNTGEPTYVDDFKGRFAFSLETSASSAYLQISNLNNEDTATYFCARYYGSTSVWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO：3)
轻链可变区
ELVMTQTPSSLSASLGDRVTITCRASODIFNYLNWYQQKPDGPIKLLIYYSSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLDREDIATYFCQQGFTLPWTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO：4)
注意：CDR区以下划线标注。
实施例7：mMcA-AB1-anti-VEGF-A的人源化
针对mMcA-AB1-anti-VEGF-A的人源化，将CDR之间的构架区替换为从人生殖细胞系的IgG基因获得的最同源构架区(Tan P等人，2002)。该方法引入最少的小鼠氨基酸残基，以避免人治疗期间的免疫反应性。同源性研究所使用的数据库为IMGT(www.imgt.org)。所设计的含有编码mMcA-AB1-anti-VEGF-A的CDR和人生殖细胞系的IgG基因构架区以及分泌信号的基因通过商业合成服务(GenScript Corporation，www.genscript.com)来合成。将对应于人源化重链可变区的合成基因插入到pFUSE-CHIg-hGI载体(InvivoGen)的EcoRI与Nhel位点中，将对应于人源化轻链可变区的合成基因插入到pFUSE2-CLIg-hk载体(InvivoGen)的BtsEII与BsiWI位点中。这两个载体均提供完整人IgG重链(pFUSE-CHIg-hGI)和人IgG轻链(pFUSE2-CLIg-hk)所必需的人恒定区，以获得人源化抗体。此外，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将质粒pFUSE-CHIg-hGI-P和pFUSE2-CLIg-hk-P共转染到NSO细胞中。选择表达抗VEGF抗体活性的细胞克隆，将其中之一用于抗体产生，并且使用本领域已知方法来提纯。
mMcA-AB1-anti-VEGF-A的人源化形式的重链可变区及轻链可变区序列如下：
重链可变区：
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNFGMNWVROAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYVDDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARYYGSTSVWYFDVWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO：5)
轻链可变区：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASODIFNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYSSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLOPEDIATYYCQQGFTLPWTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO：6)
注意：CDR区用下划线标注。
实施例8：mMc-AB1-anti-VEGF-A/VEGF-A165的复合人源化形式的解离速率常数(KD)的测定
通过表面等离子共振(SPR)测定人源化形式的mMcA-AB1-anti-VEGF-A与VEGF-A165(SEQ ID NO：1)之间的亲和力。通过用Biacore T100评估软件拟合1∶1相互作用模型的动力学分析来分别测定亲和力常数KA与解离常数KD。结果如表3所示。
表3.人源化mMc-AB1-anti-VEGF-A/VEGF-A165的相互作用的动力学参数。
Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(1/M) KA(M)
3.83±0.03x106 4.21±0.02x10-4 1.09x10-10 9.24x105
实施例9：在培养基中人源化mMcA-AB1-anti-VEGF-A对VEGF-A诱导的HUVEC增殖的中和活性。
将HUVEC细胞以2500细胞/孔的密度接种在96孔板中，其中含有50μl补充了10％FCS和50μg/ml庆大霉素的M199培养基。2小时后，将含有RPMI培养基中25μl经纯化的mMcA-AB1-anti-VEGF-A的与M199完全培养基中75μl含有VEGF(20ng/ml)的100μl溶液添加到每个孔中。经24小时温育后，添加25μl含有2,5μCi/ml甲基-[3H]-胸苷的M199完全培养基，再继续温育48小时。之后，添加50μl 6M氯酸胍终止反应。经3次冻融循环完成细胞破裂，在Whatman-GFC过滤器中收集DNA并测量其放射活性。图2示出了在培养基中人源化mMcA-AB1-anti-VEGF-A对VEGF-A诱导的HUVEC增殖的中和能力与本领域的抗VEGF单克隆抗体贝伐单抗的中和能力的比较图。
实施例10：抗VEGF抗体的体内活性
使用IIB-Mel-J细胞(Guerra，L.等人，Characterization of IIB-MEL-J：a newand highly heterogeneous human melanoma cell line.Pigment Cell Res，1989.2(6)：p.504-9)来研究裸鼠中的肿瘤生长抑制。将IIB-Mel-J细胞在补充有10％FBS、5g/ml胰岛素和50μg/ml庆大霉素的DMEM培养基中培养。使细胞在5％CO2中、于37℃下生长至汇合，将其收集、计数、清洗并以50x106细胞/ml浓度重悬浮在无菌Matrigel中。通过将5x106IIB-Mel-J细胞注射到小鼠的背侧以在4-6周龄裸Swiss鼠中建立异种种植物。6天后可触摸到肿瘤，将小鼠随机分成10组(n＝10)，每一组用PBS(对照组)或用三种不同浓度的不同抗体的PBS溶液进行如下腹腔内注射，一周两次：A组，用0.1ml PBS注射小鼠；B组，用0.1ml AB1抗体以1μg/小鼠的剂量注射小鼠；C组，用0.1ml AB1抗体以25μg/小鼠的剂量注射小鼠；D组，用0.1ml人源化形式的AB1抗体以1μg/小鼠的剂量注射小鼠；E组，用0.1ml人源化形式的AB1抗体以25μg/小鼠的剂量注射小鼠；F组，用0.1ml人源化形式的贝伐单抗(阿瓦斯汀TM)以1μg/小鼠的剂量注射小鼠，以及G组，用0.1ml阿瓦斯汀TM抗体以25μg/小鼠的剂量注射小鼠。通过用测径器测量长度和宽度，然后用以下公式来估算体积来跟踪肿瘤生长：1/2长度×宽度2。
在第40天处死动物，切除肿瘤并称重。结果表明，相较于注射PBS的小鼠，当AB1与人源化形式的AB1抗体两者均以所有试验剂量给小鼠施用时，均显著抑制肿瘤生长(p＜0.001)(图3)。另一方面，在这两种试验剂量下，经过40天治疗后，用AB1和人源化AB1抗体治疗的动物肿瘤比用贝伐单抗治疗的肿瘤平均更小(图4)。人源化形式的AB1与贝伐单抗之间的比较如图5中所示。在25μg/小鼠剂量下，这两个抗体之间的差异在统计学上是显著的(p＜0.001)。值得一提的是，所有试验抗体均无明显的中和小鼠VEGF的活性(Liang W，Wu X，Peale FV et al，Cross-species Vascular Endothelial Growth factor(VEGF)-blocking Antibodies Completely Inhibit the Growth of Human Tumor Xenograftsand Measure the Contribution of Stromal VEGF.JBC 281：951-961(2006)和实施例1)，该事实使得其抗肿瘤活性之间的比较有意义。
序列
SEQ ID NOS：12
SEQ ID NO：1
长度：165
类型：PRT
生物：智人
公开信息：
数据库入藏号：Genebank AAA35789
数据库登记日：1993-04-27
序列：1
APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
SEQ ID NO：2
长度：186
类型：PRT
生物：智人
公布信息：
数据库入藏号：GeneBank AAC50721.1
数据库登记日：1996-08-12
序列：2
PVSQPDAPGHQRKVVSWIDVYTRATCQPREVVVPLTVELMGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQHQVRMQILMIRYPSSQLGEMSLEEHSQCECRPKKKDSAVKPDRAATPHHRPQPRSVPGWDSAPGAPPADITHPTPAPGPSAHAAPSTTSALTPGP AAAAADAAAS SVAKGGA
SEQ ID NO：3
长度：121
类型：PRT
生物：小家鼠
其他信息：抗体重链可变区
序列：3
QVKLLESGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNFGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTNTGEPTYVDDFKGRFAFSLETSASSAYLQISNLNNEDTATYFCARYYGSTSVWYFDVWGAGTTVTVSS
SEQ ID NO：4
长度：108
类型：PRT
生物：小家鼠
其他信息：抗VEGF轻链可变区
序列：4
ELVMTQTPSSLSASLGDRVTITCRASQDIFNYLNWYQQKPDGPIKLLIYYSSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLDREDIATYFCQQGFTLPWTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：5
长度：121
类型：PRT
生物：人工序列
其他信息：重组抗VEGF重链可变区
序列：5
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYVDDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARYYGSTSVWYFDVWGRGTLVTVSS
SEQ ID NO：6
长度：108
类型：PRT
生物：人工序列
其他信息：重组抗VEGF抗体轻可变区
序列：6
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIFNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYSSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGFTLPWTFGQGTKVEIKR
SEQ ID NO：7
长度：10
类型：PRT
生物：小家鼠
其他信息：CDR区。SEQ ID NO：3的亚序列
序列：7
GYTFTNFGMN
SEQ ID NO：8
长度：17
类型：PRT
生物：小家鼠
其他信息：CDR区。SEQ ID NO：3的亚序列
序列：8
WTNTNTGEPTYVDDFKG
SEQ ID NO：9
长度：12
类型：PRT
生物：小家鼠
其他信息：CDR区。SEQ ID NO：3的亚序列
序列：9
YYGSTSVWYFDV
SEQ ID NO：10
长度：11
信号：PRT
生物：小家鼠
其他信息：CDR区。SEQ ID NO：4的亚序列
序列：10
RASQDIFNYLN
SEQ ID NO：11
长度：6
类型：PRT
生物：小家鼠
其他信息：CDR区。SEQ ID NO：4的亚序列
序列：11
YSSRLH
SEQ ID NO：12
长度：9
类型：PRT
生物：小家鼠
其他信息：CDR区。SEQ ID NO：4的亚序列
序列：12
QQGFTLPWT
SEQUENCE LISTING
<110> 科学和技术研究全国委员会（科尼特）
帕布·卡萨拉实验室有限公司
鲍迪, 艾伯特托
<120> 对人VEGF-A有异常强的结合亲和力并具有与人VEGF-B的交叉反应性的抗人V
EGF抗体
<150> US14/267,504
<151> 2014-05-01
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 165
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<300>
<308> Genebank AAA35789
<309> 1993-04-27
<313> (1)..(165)
<400> 1
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
1 5 10 15
Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu
20 25 30
Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys
35 40 45
Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu
50 55 60
Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile
65 70 75 80
Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe
85 90 95
Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg
100 105 110
Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe
115 120 125
Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser
130 135 140
Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys
145 150 155 160
Asp Lys Pro Arg Arg
165
<210> 2
<211> 185
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<300>
<308> GeneBank AAC50721.1
<309> 1996-08-12
<313> (1)..(185)
<400> 2
Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln Arg Lys Val Val Ser
1 5 10 15
Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln Pro Arg Glu Val Val
20 25 30
Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val Ala Lys Gln Leu Val
35 40 45
Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly Cys Cys Pro Asp Asp
50 55 60
Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln Val Arg Met Gln Ile
65 70 75 80
Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu
85 90 95
Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys Asp Ser Ala Val
100 105 110
Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg Pro Gln Pro Arg Ser
115 120 125
Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro Pro Ala Asp Ile Thr
130 135 140
His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala His Ala Ala Pro Ser Thr
145 150 155 160
Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Asp Ala Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala
180 185
<210> 3
<211> 121
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc_feature
<223> 抗体重链可变区
<400> 3
Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Val Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Asn Leu Asn Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Val Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc_feature
<223> 抗VEGF轻链可变区
<400> 4
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Phe Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Pro Ile Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ser Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Asp Arg
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Phe Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 5
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 重组抗VEGF重链可变区
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Val Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Val Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 重组抗VEGF抗体轻可变区
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Phe Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ser Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc_feature
<223> CDR区，SEQ ID NO: 3的亚序列
<400> 7
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Gly Met Asn
1 5 10
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc_feature
<223> CDR区，SEQ ID NO: 3的亚序列
<400> 8
Trp Thr Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc_feature
<223> CDR区，SEQ ID NO: 3的亚序列
<400> 9
Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Val Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc_feature
<223> CDR区，SEQ ID NO: 4的亚序列
<400> 10
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Phe Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc_feature
<223> CDR区，SEQ ID NO: 4的亚序列
<400> 11
Tyr Ser Ser Arg Leu His
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc_feature
<223> CDR区，SEQ ID NO: 4的亚序列
<400> 12
Gln Gln Gly Phe Thr Leu Pro Trp Thr
1 5

Claims (17)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人VEGF-A与VEGF-B，所述抗体或其抗原结合片段包括轻链免疫球蛋白和重链免疫球蛋白，所述轻链免疫球蛋白包括：包含SEQ IDNO：10中所列氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO：11中所列氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO：12中所列氨基酸序列的CDR3；所述重链免疫球蛋白包括：包含SEQ ID NO：7中所列氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO：8中所列氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO：9中所列氨基酸序列的CDR3。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：4中所列氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；以及包含SEQ ID NO：3中所列氨基酸序列的重链免疫球蛋白。
3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：6中所列氨基酸序列的轻链免疫球蛋白；以及包含SEQ ID NO：5中所列氨基酸序列的重链免疫球蛋白。
4.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由如下各项组成的群组：单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体、全人源抗体、二价抗体、抗独特型抗体、骆驼化单域抗体、双体抗体、scFv、scFv二聚体、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv′、Fv片段、Fab、Fab′、F(ab′)2、ds双体抗体、纳米抗体、域抗体和二价域抗体。
5.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括选自由如下各项组成的群组的免疫球蛋白恒定区：k轻链、γ1重链、γ2重链、γ3重链和γ4重链恒定区。
6.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，当以相同剂量施用时，所述抗体或其抗原结合片段能够比贝伐单抗更大程度地抑制肿瘤生长。
7.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段以不超过10-10的KD结合人VEGF165。
8.一种药物组合物，其包括如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段以及一种或多种抗氧化剂。
9.一种药物组合物，其包括如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段以及一种或多种药学上可接受的载体。
10.如权利要求10所述的药物组合物，其中，所述一种或多种抗氧化剂选自由如下各项组成的群组：甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巯基乙酸、硫代山梨醇、丁羟基茴香醚、丁羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。
11.一种药物组合物，其包括如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段与一种或多种选自如下各项组成的群组的另外的化疗剂的组合：卡培他滨、伊立替康+5-氟尿嘧啶+甲酰四氢叶酸组合、卡铂、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂和和5-氟尿嘧啶。
12.一种抑制血管生成或治疗有需要的患者体内疾病的方法，其包括向所述患者施用有效治疗量的如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段任选地与一种或多种另外的化疗剂连接或组合。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述疾病与异常的血管生成相关。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述疾病为与VEGF信号传送相关联的炎性疾病或为类风湿性关节炎。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述疾病为湿性急性黄斑变性或者糖尿病性视网膜病变。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述疾病为与增加的VEGF信号传送相关联的癌症。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌。
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