CN104797602A - 抗her3和抗her2抗体的组合疗法 - Google Patents

抗her3和抗her2抗体的组合疗法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗HER3抗体与某些抗HER抗体的组合疗法。

Description

抗HER3和抗HER2抗体的组合疗法
本发明涉及抗HER3抗体与某些抗HER抗体的组合疗法。
发明背景
人HER3(ErbB-3、ERBB3、c-erbB-3、c-erbB3、受体酪氨酸蛋白质激酶erbB-3、SEQ ID NO:17)编码受体酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGFR)家族的一名成员，该家族还包括HER1(又称为EGFR)、HER2、和HER4(Kraus,M.H.等,PNAS 86(1989)9193-9197；Plowman,G.D.等,PNAS 87(1990)4905-4909；Kraus,M.H.等,PNAS 90(1993)2900-2904)。与原型表皮生长因子受体一样，跨膜受体HER3由胞外配体结合域(ECD)、ECD内的二聚化域、跨膜域、胞内蛋白质酪氨酸激酶域(TKD)和C端磷酸化域组成。此膜结合蛋白具有胞外域内的HER3调蛋白(HRG)结合域，但没有活性激酶域。因此，它能结合此配体，但是不能经由蛋白质磷酸化将信号传送入细胞中。然而，它确实与确实具有激酶活性的其它HER家族成员形成异二聚体。异二聚化导致受体介导的信号传导途径的激活及其胞内域的转磷酸化。HER家族成员间的二聚体形成扩大HER3的信号传导潜力，并且是一种不仅用于信号多样化，而且用于信号放大的手段。例如，HER2/HER3异二聚体在HER家族成员间经由PI3K和AKT途径诱导最重要的促有丝分裂信号之一(Sliwkowski,M.X.等,J.Biol.Chem.269(1994)14661-14665；Alimandi,M.等,Oncogene.10(1995)1813-1821；Hellyer,N.J.,J.Biol.Chem.276(2001)42153-4261；Singer,E.,J.Biol.Chem.276(2001)44266-44274；Schaefer,K.L.,Neoplasia 8(2006)613-622)。
已经在许多癌症(包括前列腺、膀胱、和乳腺肿瘤)中报告了此基因的表达和/或其蛋白质的表达。已经表征了编码不同同等型的可变转录剪接变体。一种同等型缺乏膜间区，并且分泌到细胞外。此形式作用为调控膜结合形式的活性。还已经报告了别的剪接变体，但是它们尚未彻底表征。
WO 97/35885涉及HER3抗体。WO 2003/013602涉及HER活性抑制剂，包括HER抗体。WO 2007/077028、WO 2008/100624、WO2011076683、WO2011044311、WO2011136911、WO2012019024、WO2012022814、WO2012031198、WO2012044612、WO2012052230、WO2012059858涉及HER3抗体。
人HER2指也称作neu和c-erbB-2的185kDa生长因子受体(Slamon等,Science 235(1987)177-182；Swiss-Prot P04626)，其功能涉及人乳腺癌细胞中的赘生性转化。已经在20-30％的乳腺癌患者中鉴定出这种蛋白的过表达，其中它与区域性晚期疾病、肿瘤复发概率升高、和患者存活缩短有关。多达30-40％具有胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、腹膜癌、前列腺癌、或结肠直肠癌的患者也可展现这种蛋白的过表达。
HER受体一般会包含胞外域(其可结合HER配体)、亲脂性跨膜域、保守胞内酪氨酸激酶域、和羧基末端信号传导域(其包含数个能被磷酸化的酪氨酸残基)。HER2的胞外域包含四个域，即域I(氨基酸残基约1-195)、域II(氨基酸残基约196-320)、域III(氨基酸残基约321-488)、和域IV(氨基酸残基约489-632)(残基编号方式不含信号肽)。参见Garrett等,Mol.Cell.11(2003)495-505；Cho等,Nature 421(2003)756-760；Franklin等,Cancer Cell 5(2004)317-328；或Plowman等,Proc.Natl.Acad.Sci.90(1993)1746-1750和WO 2006/007398。
曲妥单抗(Trastuzumab)(以商品名赫赛汀销售)是一种重组人源化抗HER2单克隆抗体，用于治疗HER2过表达/HER2基因扩增的转移性乳腺癌。曲妥单抗特异性结合与Hudziak等,Mol.Cell.Biol.9(1989)1165-1172中记载的鼠抗HER2抗体4D5相同的HER2表位。曲妥单抗是鼠抗HER2抗体4D5的一种重组人源化型式(称作rhuMAb 4D5或曲妥单抗)，而且已经是在接受过广泛在先抗癌疗法的具有过表达HER2的转移性乳腺癌的患者中有临床活性的(Baselga等,J.Clin.Oncol.14(1996)737-744)。曲妥单抗及其制备方法记载于US 5,821,337。
帕妥珠单抗(Pertuzumab)是另一种重组人源化抗HER2单克隆抗体，用于治疗HER2阳性癌症。帕妥珠单抗特异性结合2C4表位，HER2胞外域上一种与曲妥单抗不同的表位。帕妥珠单抗是HER2二聚化抑制剂(HDI)的一个新类别中的第一个。经由其对HER2胞外域的结合，帕妥珠单抗抑制HER2(与其它HER家族成员)二聚化，由此抑制与肿瘤生长和进展有关的下游信号传导途径和细胞过程(Franklin,M.C.等,Cancer Cell 5(2004)317-328和Friess,T.等,Clin Cancer Res 11(2005)5300-5309)。帕妥珠单抗是鼠抗HER2抗体2C4的一种重组人源化型式(称作rhuMAb 2C4或帕妥珠单抗)，而且它与相应制备方法一起记载于WO 01/00245和WO 2006/007398。
“表位2C4”是HER2的胞外域中抗体2C4结合的区域。为了筛选结合2C4表位的抗体，可以实施诸如记载于Ed.Harlow and David Lane,Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)的常规交叉阻断测定法。或者，可以实施表位定位以评估抗体是否结合HER2的2C4表位(例如HER2中自约残基22至约残基584(含端点)的区域中的任何一个或多个残基)。表位2C4包含来自HER2的胞外域中的域II的残基。2C4和帕妥珠单抗在域I、II和III接合处结合HER2的胞外域。还可参见Franklin等,Cancer Cell 5(2004)317-328。
人HER1(也称作rErb-B1或人表皮生长因子受体(EGFR)，SEQ ID NO:19)是一种由c-erbB原癌基因编码的170kDa跨膜受体，且展现内在的酪氨酸激酶活性(Modjtahedi,H.等,Br.J.Cancer 73(1996)228-235；Herbst,R.S.和Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611)。SwissProt数据库条目P00533提供EGFR的序列。还有EGFR的同等型和变体(例如可变RNA转录物、截短型式、多态性、等)，包括但不限于那些由Swissprot数据库条目号P00533-1、P00533-2、P00533-3、和P00533-4鉴别的。已知EGFR结合包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、双调蛋白、肝素结合性EGF(hb-EGF)、β细胞调蛋白、和上皮调蛋白在内的配体(Herbst,R.S.和Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611；Mendelsohn,J.和Baselga,J.,Oncogene 19(2000)6550-6565)。EGFR经酪氨酸激酶介导的信号转导途径调节众多细胞过程，包括但不限于控制细胞增殖、分化、细胞存活、凋亡、血管发生、有丝分裂、和转移的信号转导途径的激活(Atalay,G.等,Ann.Oncology 14(2003)1346-1363；Tsao,A.S.和Herbst,R.S.,Signal 4(2003)4-9；Herbst,R.S.和Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611；Modjtahedi,H.等,Br.J.Cancer 73(1996)228-235)。
已经报告了众多人恶性疾患中的HER1过表达，包括膀胱、脑、头和颈、胰腺、肺、乳腺、卵巢、结肠、前列腺、和肾的癌症(Atalay,G.等,Ann.Oncology14(2003)1346-1363；Herbst,R.S.和Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611；Modjtahedi,H.等,Br.J.Cancer 73(1996)228-235)。在许多这些疾患中，EGFR过表达与患者预后较差有关(Herbst,R.S.和Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611；Modjtahedi,H.等,Br.J.Cancer 73(1996)228-235)。HER1也在正常组织的细胞中表达，特别是皮肤、肝、和胃肠道的上皮组织，尽管一般处于比恶性细胞低的水平(Herbst,R.S.和Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611)。
WO 2006/082515涉及自大鼠单克隆抗体ICR62衍生的人源化抗EGFR单克隆抗体及其糖工程化形式，它们用于癌症治疗。
发明概述
本发明提供抗HER3抗体与结合人HER2且抑制HER2二聚化的抗体或与结合HER1的抗体的组合疗法，其中所述结合人HER1的抗体特征在于是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。在一个实施方案中，所述结合人HER3的抗体特征进一步在于是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
本发明的一个方面是一种结合人HER3的抗体，其用于与结合人HER2且抑制HER2二聚化的抗体组合治疗癌症，其中所述癌症为HER2正常的癌症。
在一个实施方案中，所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQ ID NO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ ID NO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:6的CDR1L区或SEQ ID NO:7的CDR1L区。
在一个实施方案中，所述结合人HER3的抗体特征在于：作为重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQ ID NO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ ID NO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:7的CDR1L区。
在一个实施方案中，所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:10。
在一个实施方案中，上文所述结合人HER3的抗体特征进一步在于是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
在一个实施方案中，所述结合人HER2且抑制HER2二聚化的抗体为帕妥珠单抗。
在一个实施方案中，所述癌症特征在于HER3表达。
在一个实施方案中，所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌或头或颈癌乳腺癌。
令人惊讶的是，发现上文所述抗HER3抗体与结合人HER2且抑制HER2二聚化的抗体的组合疗法对HER2正常表达的癌症显示强肿瘤生长抑制，甚至在结合人HER2且抑制HER2二聚化的抗体在单独施用时只显示低至中等肿瘤生长抑制的肿瘤中亦如此。
本发明的另一个方面是一种结合人HER3的抗体，其用于与结合人HER1的抗体组合治疗癌症，其中所述结合人HER3的抗体和所述结合人HER1的抗体中至少其一特征在于所述抗体是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
在一个实施方案中，所述结合人HER3的抗体和所述结合人HER1的抗体二者均特征在于是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
在一个实施方案中，所述结合人HER3的抗体特征在于：作为重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQ ID NO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ ID NO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:7的CDR1L区。
在一个实施方案中，所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:10。
在一个实施方案中，所述结合人HER1的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:20；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:21。
在一个实施方案中，所述癌症特征在于HER3表达。
在一个实施方案中，所述癌症特征进一步在于HER1表达。
在一个实施方案中，所述癌症为肺癌或乳腺癌、结肠直肠癌、或头和颈癌(在一个实施方案中，特征在于HER3和HER1表达)。
令人惊讶的是，发现上文所述抗HER3抗体与结合人HER1的抗体的组合疗法显示强肿瘤生长抑制，甚至在结合人HER1的抗体在单独施用时只显示低至中等肿瘤生长抑制的肿瘤中亦如此，其中所述结合人HER3的抗体和所述结合人HER1的抗体中至少其一特征在于所述抗体是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
附图描述
图1A和B：抗HER3抗体在不同浓度中对MCF7细胞中受体磷酸化的百分比(％)抑制。
图1C     抗HER3抗体在不同浓度中对Mel-Juso细胞中受体磷酸化的百分比(％)抑制。
图2     单抗205(10mg/kg q7dx3,i.p.)处理导致移植头和颈癌FaDuSCCHN的异种移植物的肿瘤淤滞。
图3     单抗205(10mg/kg q7d,i.p.)处理导致移植HER2正常的MAXF449乳腺癌的异种移植物的肿瘤淤滞。
图4     单抗205(25mg/kg q7d,i.p.)处理导致移植7177 NSCLC的异种移植物的肿瘤淤滞。
图5     用单抗205.10.2与帕妥珠单抗组合处理HER2正常的乳腺癌细胞ZR-75-1异种移植物导致肿瘤生长抑制。
图6     RG7116在携带BxPC3人胰腺腺癌皮下异种移植物的SCID米色小鼠(n＝10只每组)中的体内功效。(A)在第24天开始用5剂每周i.p.RG7116处理小鼠，并用卡尺测量肿瘤尺寸。0.3mg/kg及以上的RG7116是高度有效的，而且显著抑制肿瘤生长。在第56天处死小鼠，并通过Western印迹对外植肿瘤组织检查HER3和pHER3的表达(B)，通过免疫组织化学检查HER3表达(C)。有效剂量的RG7116抑制HER3磷酸化且下调膜HER3水平。
图7     由HER3信号抑制介导的肿瘤生长抑制。(A)在SCID米色或Balb/c裸鼠(n＝10只每组)中作为s.c.异种移植物建立NSCLC细胞系或患者衍生肿瘤组织碎片，并用4-6剂每周RG7116(10-25mg/kg)处理。在鳞状肺模型中(以黑色条显示，包括半数检查的异种移植物模型中的完全消退)及在腺癌模型中(以灰色条显示，*指示c-Met高过表达模型，指示KRAS突变体模型)看到实质性TGI。(B)患者衍生鳞状肿瘤异种移植物(LXFE772)之一的时间过程，其中用6个周期的22mg/kgRG7116实现了完全消退。到第95天检测不到肿瘤。RG7116与其它抗HER抗体的组合增强功效。在一种s.c.头和颈异种移植物模型(FaDu细胞)中，当RG7116与GA201(一种糖工程化抗HER1抗体(EGFR))组合时实现完全肿瘤消退(图7C)；在一种s.c.患者衍生乳腺癌肿瘤异种移植物模型MAXF 449中，当RG7116与帕妥珠单抗(抗HER2)组合时实现完全肿瘤消退(图7D)。
发明详述
本发明包括结合人HER3的抗体，其特征在于：重链可变域包含SEQ IDNO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQ ID NO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ ID NO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:6的CDR1L区或SEQ ID NO:7的CDR1L区，其用于本文所述组合疗法。
本发明进一步包括依照本发明的抗体，其特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:9，或轻链可变域VL是SEQ IDNO:10，或轻链可变域VL是SEQ ID NO:11；或其人源化型式，其用于本文所述组合疗法。
本发明进一步包括依照本发明的抗体，其特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:9，或轻链可变域VL是SEQ IDNO:10，或轻链可变域VL是SEQ ID NO:11，其用于本文所述组合疗法。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于：作为重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQ ID NO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ ID NO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:6的CDR1L区，其用于本文所述组合疗法。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:9或轻链可变域VL是SEQ ID NO:11，其用于本文所述组合疗法。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于：作为重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQ ID NO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ ID NO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:7的CDR1L区，其用于本文所述组合疗法。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:10，其用于本文所述组合疗法。
在一个实施方案中，此类抗体是单克隆的。在一个实施方案中，此类抗体是人源化的或人的。在一个实施方案中，此类抗体是IgG1或IgG4亚类的。在一个实施方案中，此类抗体是IgG1亚类的单克隆人源化抗体。在一个实施方案中，此类抗体特征在于所述抗体是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
本发明包括具有其各自VH和VL或CDR的人源化抗体单抗205.10.1、单抗205.10.2和单抗205.10.3，其用于本文所述组合疗法。
抗体 VH VL
单抗205.10.1 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:9
单抗205.10.2 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:10
单抗205.10.3 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:11
在一个实施方案中，此类抗体包含人起源的恒定区，例如SEQ ID NO:12-16，优选SEQ ID NO:12-13的。
术语“抗体”涵盖各种形式的抗体结构，包括但不限于全抗体和抗体片段。优选地，依照本发明的抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、或别的遗传工程化抗体，只要依照本发明的特征性特性得到保留。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选其可变域或至少其抗原结合位点。抗体片段的例子包括双抗体、单链抗体分子、和自抗体片段形成的多特异性抗体。例如，scFv抗体记载于Huston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-88。另外，抗体片段包含具有结合相应抗原的VH域或VL域的特征(即能够与VL域或VH域一起装配成功能性抗原结合位点，并且由此提供依照本发明的抗体的特性)的单链多肽。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一氨基酸组成的抗体分子的制备物。
术语“嵌合抗体”指通常通过重组DNA技术制备的，包含来自小鼠的可变区(即结合区)和自不同来源或物种衍生的恒定区的至少一部分的单克隆抗体。包含小鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是尤其优选的。此类大鼠/人嵌合抗体是包含编码大鼠免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA区段的免疫球蛋白基因的表达产物。本发明所涵盖的“嵌合抗体”的其它形式是那些其中类或亚类已经自初始抗体的类或亚类修饰或改变的。此类“嵌合”抗体也称作“类转换抗体”。用于生成嵌合抗体的方法牵涉本领域现在公知的常规重组DNA和基因转染技术。参见例如Morrison,S.L.等,Proc.Natl.Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855；US 5,202,238和US 5,204,244。
术语“人源化抗体”或“抗体的人源化型式”指其中的框架或“互补决定区”(CDR)已经进行过修饰以包含特异性与亲本免疫球蛋白相比不同的免疫球蛋白的CDR的抗体。在一个优选的实施方案中，将VH和VL的CDR嫁接入人抗体的框架区中以制备“人源化抗体”。参见例如Riechmann,L.等,Nature332(1988)323-327；及Neuberger,M.S.等,Nature 314(1985)268-270。重和轻链可变框架区可以自相同或不同人抗体序列衍生。人抗体序列可以是天然存在的人抗体的序列。人重和轻链可变框架区列于例如Lefranc,M.-P.,CurrentProtocols in Immunology(2000)-附录1P A.1P.1-A.1P.37，并且经由IMGT，即国际ImMunoGeneTics信息系统(http://imgt.cines.fr)或经由http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk可存取。任选地，可以通过别的突变修饰框架区。特别优选的CDR对应于上文对嵌合抗体记录的那些代表识别抗原的序列的。优选地，此类人源化型式用人恒定区嵌合化(见例如序列SEQ ID NO:12-16)。如本文中所使用的，术语“人源化抗体”还包括如下的抗体，其在恒定区中进行修饰以生成依照本发明的特性，尤其是关于C1q结合/或FcR结合，例如通过“类转换”，即Fc部分的变化或突变(例如自IgG1至IgG4和/或IgG1/IgG4突变)来实现。
如本文中所使用的，术语“人抗体”意图包括具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk,M.A.和van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。也可以在转基因动物(例如小鼠)中生成人抗体，所述转基因动物在免疫接种后能够在没有内源免疫球蛋白生成的情况中生成人抗体的完整全集或选集。在此类种系突变体小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列会导致抗原攻击后生成人抗体(参见例如Jakobovits,A.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555；Jakobovits,A.等,Nature 362(1993)255-258；Brueggemann,M.D.等,Year Immunol.7(1993)33-40)。也可以在噬菌体展示文库中生成人抗体(Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks,J.D.等,J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole,A.等和Boerner,P.等的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole,A.等,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Liss,A.L.,p.77(1985)；及Boerner,P.等,J.Immunol.147(1991)86-95)。如已经对依照本发明的人源化抗体所提及的，如本文中所使用的，术语“人抗体”还包括如下的抗体，其在恒定区中进行修饰以生成依照本发明的特性，尤其是关于C1q结合/或FcR结合，例如通过“类转换”，即Fc部分的变化或突变(例如自IgG1至IgG4和/或IgG1/IgG4突变)来实现。
如本文中所使用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、创建或分离的所有人抗体，诸如自宿主细胞诸如NS0或CHO细胞或者自对于使用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的人免疫球蛋白基因或抗体而言转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变和恒定区。依照本发明的重组人抗体已经进行过体内体细胞超突变。如此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是如下的序列，它们虽然自人种系VH和VL序列衍生及与其相关，但可以并非天然存在于体内的人抗体种系全集内。
如本文中所使用的，术语“结合人HER3”、“特异性结合人HER3”、或“抗HER3抗体”可互换，并且指于25℃以1.0x 10-8mol/l或更低的KD值，在一个实施方案中，于25℃以1.0x10-9mol/l或更低的KD值的结合亲和力特异性结合人HER3抗原的抗体。于25℃用标准的结合测定法，诸如表面等离振子共振技术(GE-Healthcare Uppsala,Sweden)测定结合亲和力。一种用于测定结合亲和力的KD值的方法记载于实施例2b)。如此，如本文中所使用的，“结合人HER3的抗体”指于25℃以KD 1.0x 10-8mol/l或更低(在一个实施方案中，KD 1.0x 10-8mol/l-1.0x 10-13mol/l)的结合亲和力特异性结合人HER3抗原的抗体。
如本文中所使用的，术语“结合人HER2”、“特异性结合人HER2”、或“抗HER2抗体”可互换，并且指于25℃以1.0x 10-8mol/l或更低的KD值，在一个实施方案中，于25℃以1.0x10-9mol/l或更低的KD值的结合亲和力特异性结合人HER2抗原的抗体。于25℃用标准的结合测定法，诸如表面等离振子共振技术(GE-Healthcare Uppsala,Sweden)测定结合亲和力。一种用于测定结合亲和力的KD值的方法记载于实施例2b)。如此，如本文中所使用的，“结合人HER2的抗体”指于25℃以KD 1.0x 10-8mol/l或更低(在一个实施方案中，KD 1.0x 10-8mol/l-1.0x 10-13mol/l)的结合亲和力特异性结合人HER2抗原的抗体。
细胞表面上HER受体的配对称作二聚化。HER2与HER家族的其它成员二聚化，包括HER1、HER3、和HER4；认为HER2:HER3二聚化产生最强的促有丝分裂信号传导且激活2种调节细胞存活和生长的关键途径(丝裂原活化的蛋白质激酶(MAPK)途径和磷酸肌醇3-激酶(PI3K)途径)。如本文中使用的，术语“结合人HER2且抑制HER2二聚化的抗体”指如下的抗HER2抗体，其特异性结合人HER2抗原且抑制/阻断配体依赖性的HER2与HER1、HER3、和HER4的异二聚化，而且尤其抑制HER2/HER3二聚化(参见例如PERJETAPrescribing Information.Genentech,Inc.June 2012；Baselga J等,N Engl J Med.2012,366:109-119；Baselga J等,Nat Rev Cancer.2009,9:463-475；Hynes NE等,Nat Rev Cancer.2005,5:341-354；Yarden Y等,Nat Rev Mol Cell Biol.2001,2:127-137；Hsieh AC等,Br J Cancer.2007,97:453-457；Soltoff SP等,Mol CellBiol.1994,14:3550-3558)。此类抑制HER2二聚化的抗HER2抗体的例子记载于例如WO 01/00245和WO 2006/007398，其中记载帕妥珠单抗(称作rhuMAb2C4或帕妥珠单抗)作为一个例子。
如本文中所使用的，术语“结合人HER1”、“特异性结合人HER1”、或“抗HER1抗体”可互换，并且指于25℃以1.0x 10-8mol/l或更低的KD值，在一个实施方案中，于25℃以1.0x10-9mol/l或更低的KD值的结合亲和力特异性结合人HER1抗原的抗体。于25℃用标准的结合测定法，诸如表面等离振子共振技术(GE-Healthcare Uppsala,Sweden)测定结合亲和力。一种用于测定结合亲和力的KD值的方法记载于实施例2b)。如此，如本文中所使用的，“结合人HER1的抗体”指于25℃以KD 1.0x 10-8mol/l或更低(在一个实施方案中，KD 1.0x 10-8mol/l-1.0x 10-13mol/l)的结合亲和力特异性结合人HER1抗原的抗体。
人HER3(ErbB-3、ERBB3、c-erbB-3、c-erbB3、受体酪氨酸蛋白质激酶erbB-3、SEQ ID NO:17，包括信号肽)编码受体酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGFR)家族的一名成员，该家族还包括HER1(又称为EGFR)、HER2、和HER4(Kraus,M.H.等,PNAS 86(1989)9193-9197；Plowman,G.D.等,PNAS87(1990)4905-4909；Kraus,M.H.等,PNAS 90(1993)2900-2904)。与原型表皮生长因子受体一样，跨膜受体HER3由胞外配体结合域(ECD)、ECD内的二聚化域、跨膜域、胞内蛋白质酪氨酸激酶域(TKD)和C端磷酸化域组成。此膜结合蛋白HER3具有胞外域内的调蛋白(HRG)结合域，但没有活性激酶域。因此，它能结合此配体，但是不能经由蛋白质磷酸化将信号传送入细胞中。然而，它确实与确实具有激酶活性的其它HER家族成员形成异二聚体。异二聚化导致受体介导的信号传导途径的激活及其胞内域的转磷酸化。HER家族成员间的二聚体形成扩大HER3的信号传导潜力，并且是一种不仅用于信号多样化，而且用于信号放大的手段。例如，HER2/HER3异二聚体在HER家族成员间经由PI3K和AKT途径诱导最重要的促有丝分裂信号之一(SliwkowskiM.X.等,J.Biol.Chem.269(1994)14661-14665；Alimandi M.等,Oncogene.10(1995)1813-1821；Hellyer,N.J.,J.Biol.Chem.276(2001)42153-421561；Singer,E.,J.Biol.Chem.276(2001)44266-44274；Schaefer,K.L.,Neoplasia 8(2006)613-622)。
HER3抗体单抗205.10.1、单抗205.10.2、和单抗205.10.3显示与配体调蛋白(HRG)竞争结合HER3。
已经在许多癌症，包括前列腺、膀胱、和乳腺肿瘤中报告了此基因的表达和/或其蛋白质的表达。已经表征了编码不同同等型的可变转录剪接变体。一种同等型缺乏膜间区，并且分泌到细胞外。此形式作用为调控膜结合形式的活性。还已经报告了别的剪接变体，但是它们尚未彻底表征。
依照本发明，术语“人HER2”指也称作neu和c-erbB-2的185kDa生长因子受体(Slamon等,Science 235(1987)177-182；Swiss-Prot P04626；SEQ ID NO:18，包括信号肽)，其功能涉及人乳腺癌细胞中的赘生性转化。HER受体一般会包含胞外域(其可结合HER配体)、亲脂性跨膜域、保守胞内酪氨酸激酶域、和羧基末端信号传导域(其包含数个能被磷酸化的酪氨酸残基)。HER2的胞外域包含四个域，即域I(氨基酸残基约1-195)、域II(氨基酸残基约196-320)、域III(氨基酸残基约321-488)、和域IV(氨基酸残基约489-632)(残基编号方式不含信号肽)。参见Garrett等,Mol.Cell.11(2003)495-505；Cho等,Nature 421(2003)756-760；Franklin等,Cancer Cell 5(2004)317-328；或Plowman等,Proc.Natl.Acad.Sci.90(1993)1746-1750和WO 2006/007398。
帕妥珠单抗(Pertuzumab)是另一种重组人源化抗HER2单克隆抗体，用于治疗HER2阳性癌症。帕妥珠单抗特异性结合2C4表位，HER2胞外域上一种与曲妥单抗不同的表位。帕妥珠单抗是HER二聚化抑制剂(HDI)的一个新类别中的第一个。经由其对HER2胞外域的结合，帕妥珠单抗抑制HER2二聚化(尤其是配体激活的与其它HER家族成员的异二聚化)，由此抑制与肿瘤生长和进展有关的下游信号传导途径和细胞过程(Franklin,M.C.等,Cancer Cell 5(2004)317-328和Friess,T.等,Clin Cancer Res 11(2005)5300-5309)。帕妥珠单抗是鼠抗HER2抗体2C4的一种重组人源化型式(称作rhuMAb 2C4或帕妥珠单抗)，而且它与相应制备方法一起记载于WO01/00245和WO 2006/007398。
“表位2C4”是HER2的胞外域中抗体2C4结合的区域。为了筛选结合2C4表位的抗体，可以实施诸如记载于Ed.Harlow and David Lane,Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)的常规交叉阻断测定法。或者，可以实施表位定位以评估抗体是否结合HER2的2C4表位(例如HER2中自约残基22至约残基584(含端点)的区域中的任何一个或多个残基)。表位2C4包含来自HER2的胞外域中的域II的残基。2C4和帕妥珠单抗在域I、II和III接合处结合HER2的胞外域。还可参见Franklin等,Cancer Cell 5(2004)317-328。
术语“人HER1”(也称作rErb-B1或人表皮生长因子受体(EGFR)，SEQ IDNO:19，包括信号肽)是一种由c-erbB原癌基因编码的170kDa跨膜受体，且展现内在的酪氨酸激酶活性(Modjtahedi,H.等,Br.J.Cancer 73(1996)228-235；Herbst,R.S.和Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611)。SwissProt数据库条目P00533提供EGFR的序列。还有HER1的同等型和变体(例如可变RNA转录物、截短型式、多态性、等)，包括但不限于那些由Swissprot数据库条目号P00533-1、P00533-2、P00533-3、和P00533-4鉴别的。已知HER1结合包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、双调蛋白、肝素结合性EGF(hb-EGF)、β细胞调蛋白、和上皮调蛋白在内的配体(Herbst,R.S.和Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611；Mendelsohn,J.和Baselga,J.,Oncogene 19(2000)6550-6565)。HER1经酪氨酸激酶介导的信号转导途径调节众多细胞过程，包括但不限于控制细胞增殖、分化、细胞存活、凋亡、血管发生、有丝分裂、和转移的信号转导途径的激活(Atalay,G.等,Ann.Oncology 14(2003)1346-1363；Tsao,A.S.和Herbst,R.S.,Signal 4(2003)4-9；Herbst,R.S.和Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611；Modjtahedi,H.等,Br.J.Cancer 73(1996)228-235)。
WO 2006/082515涉及自大鼠单克隆抗体ICR62衍生的人源化抗HER1单克隆抗体及其糖工程化形式，它们用于癌症治疗。此类自大鼠单克隆抗体ICR62衍生的人源化、糖工程化抗体的一个例子是GA201(记载于WO2006/082515)。GA201是一种糖工程化抗HER1抗体，特征在于作为重链可变域VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:20(重链可变域VH，人源化<EGFR>ICR62-I-HHD)及作为轻链可变域VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:21(轻链可变域VL，人源化<EGFR>ICR62-I-KC)，且特征进一步在于所述抗体是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺酰基的化学活性表面聚集，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和或特定的电荷特征。表位是抗原中受到抗体结合的区域。
如本文中所使用的，“依照本发明的抗体的可变域”(轻链可变域(VL)、重链可变域(VH))意为直接牵涉抗体结合抗原的轻和重链域对之每种。可变轻和重链域具有相同的一般结构，并且每个域包含通过三个“高变区”(或互补决定区，CDR)连接的其序列广泛保守的四个框架(FR)区。框架区采取β-片层构象，而CDR可以形成连接β-片层结构的环。每条链中的CDR通过框架区保持其三维结构，并且与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体的重和轻链CDR3区在依照本发明的抗体的结合特异性/亲和力中发挥特别重要的作用，并且因此提供本发明的又一个目的。
在本文中使用时，术语“抗体的抗原结合部分”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。术语本发明的抗体的“抗原结合部分”含有6个互补决定区(CDR)，其以不同程度促成结合位点对抗原的亲和力。存在着三个重链可变域CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变域CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。术语“CDRH1”意指依照Kabat计算的重链可变区的CDR1区。CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3意指来自重(H)或轻(L)链的相应区。通过与氨基酸序列的汇编数据库比较来确定CDR和框架区(FR)的范围，在数据库中已经依照Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)依照序列间的可变性限定那些区域。
抗体的“Fc部分”不直接牵涉抗体对抗原的结合，但是展现出各种效应器功能。“抗体的Fc部分”是熟练技术人员公知的术语，并且基于木瓜蛋白酶对抗体的切割限定。根据其重链恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白分成类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的数种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4、IgA1、和IgA2。依照重链恒定区，免疫球蛋白的不同类分别称作α、δ、ε、γ、和μ。抗体的Fc部分直接牵涉ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)，其基于补体激活、C1q结合和Fc受体结合。术语“补体依赖性细胞毒性(CDC)”意指通过补体因子C1q结合大多数IgG抗体亚类的Fc部分启动的过程。C1q对抗体的结合是由所谓的结合位点处的限定的蛋白质-蛋白质相互作用引起的。此类结合位点是现有技术中已知的，并且例如记载于Boackle,R.J.等,Nature282(1979)742-743；Lukas,T.J.等,J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.和Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.等,Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.等,Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.等,J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.等,J.Virology 75(2001)12161-12168；Morgan,A.等,Immunology 86(1995)319-324；EP 0 307 434。此类结合位点是例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(依照Kabat,E.A.的EU索引的编号方式，见下文)。亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体通常显示补体激活及C1q和C3结合，而IgG4不激活补体系统，而且不结合C1q和C3。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体包含自人起源衍生的Fc部分，和优选人恒定区的所有其它部分。如本文中所使用的，术语“自人起源衍生的Fc部分”意指如下的Fc部分，它是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类的人抗体的Fc部分，例如来自人IgG1亚类的Fc部分、来自人IgG1亚类的突变Fc部分(优选具有L234A+L235A方面的突变)、来自人IgG4亚类的Fc部分或来自人IgG4亚类的突变Fc部分(优选具有S228P方面的突变)。优选的是SEQ ID NO:13(人IgG1亚类)、SEQ ID NO:14(具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类)的人重链恒定区。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体是人IgG1亚类或人IgG3亚类的。在一个实施方案中，依照本发明的抗体是人IgG1亚类的。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于恒定链是人起源的。此类恒定链是现有技术中公知的，并且例如由Kabat,E.A.(参见例如Johnson,G.和Wu,T.T.,Nucleic Acids Res.28(2000)214-218)描述。例如，一种有用的人重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO:13。例如，一种有用的人轻链恒定区包含κ轻链恒定区氨基酸序列SEQ ID NO:12。
如本申请内所使用的，术语“氨基酸”意指天然存在的羧基α-氨基酸的组，包括丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg,R)、天冬酰胺(asn,N)、天冬氨酸(asp,D)、半胱氨酸(cys,C)、谷氨酰胺(gln,Q)、谷氨酸(glu,E)、甘氨酸(gly,G)、组氨酸(his,H)、异亮氨酸(ile,I)、亮氨酸(leu,L)、赖氨酸(lys,K)、甲硫氨酸(met,M)、苯丙氨酸(phe,F)、脯氨酸(pro,P)、丝氨酸(ser,S)、苏氨酸(thr,T)、色氨酸(trp,W)、酪氨酸(tyr,Y)、和缬氨酸(val,V)。
如本文中所使用的，术语“核酸”或“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链，但是优选是双链DNA。在将核酸放置在与另一种核酸的功能性关系中时，它是“可操作连接的”。例如，若前序列或分泌前导的DNA以参与多肽分泌的前蛋白表达，则它与多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列可操作连接；或者若核糖体结合位点定位为使得便于翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接”意指所连接的DNA序列是共线的，并且在分泌前导的情况中，是连续的且在读码框中。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点处的连接来实现连接。若不存在此类位点，则依照常规的实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。如本文中所使用的，表述“细胞”、“细胞系”、和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称包括后代。如此，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代主题细胞和自其衍生的培养物，而不管传递的次数。还应当理解，由于有意或无意的突变，所有后代在DNA内容上可能不是正好相同的。包括具有在初始转化细胞中筛选的相同功能或生物学活性的变体后代。
优选地，本文所述抗HER3抗体特征在于恒定链是人起源的。此类恒定链是现有技术中公知的，并且例如由Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)描述。例如，一种有用的人轻链恒定区包含κ轻链恒定区氨基酸序列SEQ ID NO:12。例如，一种有用的人重链恒定区包含SEQ ID NO:13至16。
在另一方面，提供了一种抗HER3抗体，其用于相应组合疗法，其中所述抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH，和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10中的VH和VL序列；而且具有下列一项或多项特性(在实施例3和2中描述的测定法中测定)：
-抗HER3抗体抑制肿瘤细胞诸如MCF7细胞、FaDu细胞或Mel-Juso细胞中的HER3磷酸化(在一个实施方案中，抗HER3抗体在1.0μg/ml的浓度对MCF7细胞中的HER3磷酸化显示至少80％(在一个实施方案中至少90％)的抑制；在一个实施方案中，抗HER3抗体在0.1μg/ml的浓度对FaDu细胞中的HER3磷酸化显示至少80％(在一个实施方案中至少90％)的抑制；在一个实施方案中，抗HER3抗体在0.1μg/ml的浓度对Mel-Juso细胞中的HER3磷酸化显示至少60％(在一个实施方案中至少70％)的抑制)
-抗HER3抗体抑制肿瘤细胞诸如Mel-Juso细胞中的AKT磷酸化(在一个实施方案中，抗HER3抗体以小于0.50μg/ml的IC50值，在一个实施方案中，以小于0.35μg/ml的IC50值抑制Mel-Juso细胞中的AKT磷酸化)
-抗HER3抗体抑制肿瘤细胞诸如MDA-MB-175细胞的增殖(在一个实施方案中，抗HER3抗体以小于10μg/ml的IC50值抑制MDA-MB-175细胞的增殖)
-抗HER3抗体以小于5.0x 10-9M的KD值，在一个实施方案中，以小于3.0x 10-9M的KD值结合HER3。
另一方面，用于相应组合疗法的抗HER3抗体是US 2010/0255010中记载的双特异性抗HER3/抗HER1抗体。在一个实施方案中，双特异性抗HER3/抗HER1抗体特征在于包含US 2010/0255010中披露的特征性氨基酸序列，即A)(a)包含氨基酸序列LSGDWIH的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列VGEISAAGGYTD的HVR-H2；和(c)包含氨基酸序列ARESRVSFEAAMDY的HVR-H3；和(d)包含氨基酸序列NIATDVA的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列SASF的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列SEPEPYT的HVR-L3，或B)(a)具有US 2010/0255010中披露的氨基酸序列SEQ ID NO:30的重链可变域；(b)具有US 2010/0255010中披露的氨基酸序列SEQ ID NO:29的轻链可变域。
术语“抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)”指在存在效应细胞的情况中依照本发明的抗体对人靶细胞的裂解。优选地，通过在存在效应细胞(诸如新鲜分离的PBMC或自血沉棕黄层纯化的效应细胞，像单核细胞或天然杀伤(NK)细胞或永久生长NK细胞系)下用依照本发明的抗体处理HER3表达细胞的制备物来测量ADCC。
单克隆抗体的细胞介导的效应器功能(诸如ADCC)可以通过工程化改造其寡糖组分来增强，如记载于Umana,P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180,及US 6,602,684的。IgG1型抗体(最常用的治疗性抗体)是在每个CH2域中在Asn297处具有保守的N连接的糖基化位点的糖蛋白。两个附着于Asn297的复合双触角寡糖掩埋于CH2域间，这形成与多肽主链的广泛接触，并且其存在对于抗体介导效应器功能(诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC))是至关重要的(Lifely,M.R.等,Glycobiology 5(1995)813-822；Jefferis,R.等,Immunol.Rev.163(1998)59-76；Wright,A.和Morrison,S.L.,Trends Biotechnol.15(1997)26-32)。Umana,P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180和WO 99/54342显示了β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(“GnTIII”)(即一种催化两分型寡糖形成的糖基转移酶)在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过表达显著提高抗体的体外ADCC活性。Asn297碳水化合物的组成改变或其消除还影响对FcγR和C1q的结合(Umana,P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180；Davies,J.等,Biotechnol.Bioeng.74(2001)288-294；Mimura,Y.等,J.Biol.Chem.276(2001)45539-45547；Radaev,S.等,J.Biol.Chem.276(2001)16478-16483；Shields,R.L.等,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Shields,R.L.等,J.Biol.Chem.277(2002)26733-26740；Simmons,L.C.等,J.Immunol.Methods 263(2002)133-147)。
在例如WO 2005/044859、WO 2004/065540、WO2007/031875、Umana,P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180,WO 99/154342、WO 2005/018572、WO 2006/116260、WO 2006/114700、WO 2004/065540、WO 2005/011735、WO 2005/027966、WO 1997/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835和WO 2000/061739或例如Niwa,R.等,J.Immunol.Methods 306(2005)151-160；Shinkawa,T.等,J Biol Chem,278(2003)3466-3473；WO 03/055993和US 2005/0249722中报告了经由糖工程化改造增强单克隆抗体的细胞介导的效应器功能的方法。
在本发明的一个实施方案中，依照本发明的抗体是无岩藻糖基化的，这意味着抗体在Asn297处用糖链糖基化(若它包含IgG1或IgG3亚类的Fc部分)，其中所述糖链内岩藻糖的量是80％或更低(依照Kabat的编号方式)，例如在80％和1％之间。在另一个实施方案中，所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低，在一个实施方案中，在5％和65％之间，在一个实施方案中，0至65％，且在一个实施方案中，所述糖链内岩藻糖的量是0％。此类抗体在下文中称为“无岩藻糖基化抗体”或“非岩藻糖基化抗体”。此类无岩藻糖基化抗体显示增强的ADCC，而其它抗体特性保持基本上不受影响。
在又一个实施方案中，所述糖链内N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)的量是1％或更小和/或N端α-1,3-半乳糖的量是1％或更小。优选地，糖链显示了附着于CHO细胞中重组表达的抗体的Asn297的N连接聚糖的特征。
依照本发明的“Asn297”意指位于Fc区中的约第297位的氨基酸天冬酰胺。基于抗体的微小序列变异，Asn297也可以位于第297位上游或下游的一些氨基酸(通常不超过±3个氨基酸)，即第294位和第300位之间。
术语“糖链显示了附着于CHO细胞中重组表达的抗体的Asn297的N连接聚糖的特征”意指依照本发明的全长亲本抗体的Asn297处的糖链与未修饰的CHO细胞中表达的相同抗体的糖链(例如如那些在WO 2006/103100中报告的糖链)具有相同的结构和糖残基序列(除了岩藻糖残基外)。
如本申请内所使用的，术语“NGNA”意指糖残基N-羟乙酰基-神经氨酸。
在Asn297处发生人IgG1或IgG3的糖基化，作为以多至两个Gal残基为末端的核心岩藻糖化双触角复合寡糖糖基化。Kabat,E.,A.等,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD.(1991)及Brueggemann,M.等,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361；Love,T.W.等,Methods Enzymol.178(1989)515-527详细报告了IgG1或IgG3亚类的人重链恒定区。根据末端Gal残基的量，这些结构称为G0、G1(α-1,6-或α-1,3-)、或G2聚糖残基(Raju,T.,S.,Bioprocess Int.1(2003)44-53)。抗体Fc部分的CHO型糖基化例如由Routier,F.H.,Glycoconjugate J.14(1997)201-207描述。在非糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的抗体在Asn297处通常以至少85％的量进行岩藻糖化。全长亲本抗体的经修饰的寡糖可以是杂合的或复合的。优选地，两分型、还原的/非岩藻糖化的寡糖是杂合的。在另一个实施方案中，两分型、还原的/非岩藻糖化的寡糖是复合的。
依照本发明，“岩藻糖的量”意指通过MALDI-TOF质谱术(例如在LC/MS系统中)测量的，并以平均值计算的，相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如复合的、杂合的和高甘露糖结构)的总和，Asn297处糖链内所述糖的量(参见例如WO2008/077546)。岩藻糖的相对量是通过MALDI-TOF，含有岩藻糖的结构相对于经N-糖苷酶F处理的样品中鉴定的所有糖结构(例如分别为复合的、杂合的及寡和高甘露糖结构)的百分比。
优选地，通过重组手段来生成依照本发明的抗体。此类方法是现有技术中普遍已知的，并且包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达，随后分离抗体多肽，并且通常纯化至药学可接受纯度。对于蛋白质表达，通过标准方法将编码轻和重链或其片段的核酸插入表达载体中。在合适的原核或真核宿主细胞(诸如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、酵母、或大肠杆菌细胞)中实施表达，并且自细胞(自上清液或在细胞裂解后)回收抗体。抗体的重组生成是现有技术中公知的，并且例如记载于综述文章Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.等,ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880。抗体可以存在于整个细胞中，在细胞溶胞物中，或者为部分纯化的或基本上纯的形式。通过标准技术(包括柱层析和本领域中公知的其它技术(参见Ausubel,F.等编,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,NewYork(1987))来实施纯化以消除其它细胞组分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质。NS0细胞中的表达由例如Barnes,L.M.等,Cytotechnology 32(2000)109-123；Barnes,L.M.等,Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述。瞬时表达由例如Durocher,Y.等,Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述。可变域的克隆由Orlandi,R.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter,P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；Norderhaug,L.等,J.Immunol.Methods 204(1997)77-87描述。一种优选的瞬时表达系统(HEK 293)由Schlaeger,E.-J.和Christensen,K.,Cytotechnology 30(1999)71-83，及Schlaeger,E.-J.,J.Immunol.Methods 194(1996)191-199描述。通过常规的免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析自培养液适当地分离单克隆抗体。容易使用常规规程将编码单克隆抗体的DNA和RNA分离并测序。杂交瘤细胞可以充当此类DNA和RNA的来源。一旦分离，可以将DNA插入表达载体中，然后将表达载体转染入不另外生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞(诸如HEK 293细胞、CHO细胞、或骨髓瘤细胞)中，以获得重组单克隆抗体在宿主细胞中的合成。自所述细胞系可获得的抗体是本发明的优选实施方案。优选地，经由糖工程化改造制备无岩藻糖基化的抗体，如上文所描述的。
将依照本发明的重和轻链可变域与启动子、翻译起始、恒定区、3’非翻译区、多腺苷酸化、和转录终止的序列组合以形成表达载体构建体。可以将重和轻链表达构建体组合入单一载体中，共转染、连续转染、或分开转染入宿主细胞中，然后将所述宿主细胞融合以形成表达这两条链的单一宿主细胞。
在本发明的一个方面，以包含相应抗体的药物组合物施用组合的抗体。在另一方面，本发明提供了含有与药用载体一起配制的依照本发明的抗体的组合物，例如药物组合物。
如本文中所使用的，“药用载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂、等等。优选地，载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。
可以通过本领域中已知的多种方法来施用本发明的组合物。如熟练技术人员会领会的，施用的路径和/或模式会随期望的结果而变化。为了通过某些施用路径来施用本发明的化合物，可能有必要用某种材料包被化合物，或者与某种材料共施用化合物以阻止其失活。例如，可以将化合物在合适的载体(例如脂质体或稀释剂)中对受试者施用。药学可接受稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药用载体包括无菌水溶液或分散体和供临场制备无菌可注射溶液或分散体用的无菌粉剂。对药学活性物质使用此类介质和药剂是本领域中已知的。
如本文中所使用的，短语“胃肠外施用”意指通常通过注射进行的与肠和表面施用不同的施用模式，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
如本文中所使用的，术语“癌症”可以是例如肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠直肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、何杰金(Hodgkin)氏病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆癌(biliary cancer)、中枢神经系统(CNS)新生物、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme)、星形细胞瘤、神经鞘瘤(schwanoma)、室鼓膜瘤(ependymona)、髓母细胞瘤、脑脊膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病，包括任何上述癌症的顽固性型式、或一种或多种上述癌症的组合。
本发明的另一个方面是一种依照本发明的抗HER3抗体，其用于与结合人HER2且抑制HER2二聚化的抗体组合治疗癌症，其中所述癌症为HER2正常的癌症。本发明的另一个方面是结合人HER3的抗体在制造用于与结合人HER2且抑制HER2二聚化的抗体组合治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症为HER2正常的癌症。本发明的另一个方面是一种治疗罹患癌症的患者的方法，其通过与结合人HER2且抑制HER2二聚化的抗体组合将依照本发明的抗HER3抗体施用于所述需要此类治疗的患者来进行，其中所述癌症为HER2正常的癌症。在一个实施方案中，a)在这种组合中使用的抗HER3抗体特征在于作为VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:8且作为VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:10，b)在这种组合中使用的抗HER2抗体是帕妥珠单抗，且c)所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌或头或颈癌(或者在一个实施方案中，乳腺癌)。
本发明的另一个方面是一种依照本发明的抗HER3抗体，其用于与结合人HER1的抗体组合治疗癌症，其中所述结合人HER3的抗体和所述结合人HER1的抗体二者均特征在于是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。本发明的另一个方面是结合人HER3的抗体在制造用于与结合人HER1的抗体组合治疗癌症的药物中的用途，其中所述结合人HER3的抗体和所述结合人HER1的抗体二者均特征在于是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。本发明的另一个方面是一种治疗罹患癌症的患者的方法，其通过与结合人HER1的抗体组合将依照本发明的抗HER3抗体施用于所述需要此类治疗的患者来进行，其中所述结合人HER3的抗体和所述结合人HER1的抗体二者均特征在于是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。在一个实施方案中，a)在这种组合中使用的抗HER3抗体特征在于作为VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:8且作为VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:10，b)在这种组合中使用的抗HER1抗体特征在于作为VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:20且作为VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:21，且c)所述癌症为肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、或头和颈癌。
在本发明的一个优选实施方案中，所有此类上文所述癌症特征进一步在于HER3表达。HER3表达指HER3蛋白质和/或基因表达(扩增)。可以通过免疫组织化学方法来检测HER3的表达水平，而且可以用原位杂交方法(像荧光原位杂交(FISH)技术)来测量所述HER3基因扩增状态。关于蛋白质表达测定法以及基因扩增的检测，相应测定法和试剂盒是本领域公知的。或者，可使用其它方法(像qRT-PCR)来检测HER3基因表达水平。可以通过免疫组织化学方法等来检测HER3表达水平。此类方法是本领域公知的(参见例如下文关于HER2表达水平的类似方法和测试)。
在一个优选实施方案中，癌症特征在于高(升高的)pHER3/HER3比(通过例如新鲜冷冻的肿瘤组织的IHC来分析；在临床前背景中，Western印迹，使用phosphor-HER3抗体(αPhospho-HER3克隆21D3[Tyr1289]；Cell SignalingTechnologies，#4791)或抗HER3抗体(αHER3克隆C-17；Santa Cruz，#sc-285)实施标准SDS-PAGE和Western印迹。例如，可使用电化学发光(Amersham，RPN2209)来检测信号，并为测试的每种HER3抗体浓度计算HER3受体磷酸化的百分比抑制。为了分析肿瘤中的HER3磷酸化，制备肿瘤裂解物，并取等量(20μg/道)在SDS-PAGE上分开。如上所述实施针对HER3和磷酸化HER3(pHER3)的Western印迹)。
在HER3抗体与抗HER2抗体(该抗HER2抗体抑制HER2二聚化)的组合疗法的上下文中，如本文中使用的，术语“HER2正常的癌症”指包含具有正常HER2水平的癌细胞的癌/肿瘤组织等，意味着它们不具有为HER2阳性癌症定义的HER2过表达，或者它们不是HER2表达阴性的。为了本发明的目的，“HER2正常的癌症”具有2+的免疫组织化学(IHC)得分和<2.0的原位杂交(ISH)扩增比(即ISH阴性)或1+的免疫组织化学(IHC)得分和<2.0的原位杂交(ISH)扩增比(即ISH阴性)。因而，若在自患者获得的样品(诸如乳腺组织活检或乳腺组织切除术或自转移部位衍生的组织)中找到例如通过免疫组织化学方法检测到的低(IHC 1+)或中等(IHC 2+)HER2(蛋白质)表达水平和通过原位杂交检测到的无HER2基因扩增(ISH阴性，像HER2基因拷贝≤4个拷贝的HER2基因每个肿瘤细胞或HER2基因拷贝数对CEP17信号数之比<2.0)，则存在HER2正常的癌症。在一个实施方案中，“HER2正常的癌症”定义为免疫组织化学(IHC)得分为HER2(2+)且ISH阴性或者免疫组织化学(IHC)得分为HER2(1+)且ISH阴性(IHC 1+/ISH阴性或IHC 2+/ISH阴性)。
可以通过免疫组织化学方法来检测HER2的表达水平，而且可以用原位杂交方法(像荧光原位杂交(FISH)技术)来测量所述HER2基因扩增状态。关于蛋白质表达测定法以及基因扩增的检测，相应测定法和试剂盒是本领域公知的。或者，可使用其它方法(像qRT-PCR)来检测HER2基因表达水平。
可以通过免疫组织化学方法等来检测HER2表达水平。此类方法是本领域公知的，而且相应的商品化试剂盒是可得的。可以依照本发明使用的例示性试剂盒是由Dako公司生产并销售的HerceptTestTM或称作VentanaPathwayTM的测试等。可使用HercepTestTM提供的试剂并遵循HercepTestTM的方案来评估HER2蛋白质表达水平。本领域技术人员会知道别的通过免疫组织化学方法用于测定HER2表达水平的手段和方法；参见例如WO2005/117553。因此，本领域技术人员无需过度负担便能容易且可再现地测定HER2表达水平。然而，为了确保精确且可再现的结果，必须在能确保测试规程有效性的专门实验室中实施测试。
HER2表达水平可以在低表达水平、中等表达水平和高表达水平中归类。在本发明的上下文中优选的是，HER2正常的疾病定义为HER2表达水平低或弱(例如根据IHC的HER2(1+或2+))且ISH结果阴性，例如在癌症患者的样品中测定的。因此，使用免疫组织化学和原位杂交实施平行测试。
推荐用于评估反映本文中指派HER2(0)、HER2(+)、HER2(++)和HER2(+++)的HER2表达水平的乳腺癌中的IHC染色样式的评分系统如下：
下文IHC染色样式推荐用于测定乳腺癌中的HER2状态(参见DakoHerceptest包装插页)。
上述IHC染色样式常规用于测定乳腺癌中的HER2状态。本文中所使用的术语HER2(+)、HER2(++)和HER2(+++)等同于术语HER2(1+)、HER2(2+)和HER2(3+)。在本发明的上下文中所使用的“正常HER2蛋白质表达水平”对应于1+得分(依照本文中上文所显示的表的“阴性评估”)和2+得分(“弱阳性”)。如本文中上文详细描述的，蛋白质表达水平的评估(即表中所显示的评分系统)基于通过免疫组织化学方法获得的结果。因而，作为标准或例行地，用两种可得的得到FDA批准的商品化试剂盒(即Dako HerceptestTM和VentanaPathwayTM)之一通过免疫组织化学实施HER-2状态。这些是半定量测定法，它们将表达水平分层成0(每个细胞小于20,000个受体，通过IHC染色没有可见的表达)、1+(每个细胞约100,000个受体，部分膜染色，小于10％的细胞过表达HER2)、2+(每个细胞约500,000个受体，微弱的至中等的完全膜染色，大于10％的细胞过表达HER2)、和3+(每个细胞约2,000,000个受体，强的完全膜染色，大于10％的细胞过表达HER2)。
或者，可使用别的方法来评估HER2蛋白质表达水平，例如Western印迹、基于ELISA的检测系统等等。
下文IHC染色样式推荐用于测定胃癌中的HER2状态(参见DakoHerceptest包装插页)：
HER2正常的疾病定义为HER2表达水平低或弱(例如根据IHC的HER2(1+或2+))和ISH结果阴性。
依照上文，要评估的样品可以来自(得自)具有上文定义的HER2正常的癌症的患者。例如，样品可以得自肿瘤组织、肿瘤，而且因而是怀疑是表达HER2的肿瘤的肿瘤细胞或肿瘤组织，像乳腺肿瘤。本领域技术人员能够使用本领域已知的标准技术和本文中公开的方法来鉴定此类肿瘤和/或罹患相应癌症的个体/患者。通常，可以自任何生物学来源/生物体获得所述肿瘤细胞或癌细胞，特别是任何罹患上文所述癌症的生物学来源/生物体。在本发明的上下文中，特别有用的细胞优选是人细胞。可以自例如活检或生物学样品获得这些细胞。肿瘤/癌症/肿瘤细胞/癌细胞为实体肿瘤/癌症/肿瘤细胞/癌细胞。依照上文，癌/肿瘤细胞可以是乳腺癌/肿瘤细胞，或者所述样品包含癌/肿瘤细胞，诸如乳腺癌/肿瘤细胞。依照上文，所述肿瘤/癌症可以是乳腺肿瘤/癌。
在抗HER3抗体与抗HER1抗体的组合疗法的上下文中，其中所述结合人HER3的抗体和所述结合人HER1的抗体二者均(或至少其一)特征在于是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。HER1表达指HER1蛋白质和/或基因表达(扩增)。可以通过免疫组织化学方法来检测HER1的表达水平，而且可以用原位杂交方法(像荧光原位杂交(FISH)技术)来测量所述HER1基因扩增状态。关于蛋白质表达测定法以及基因扩增的检测，相应测定法和试剂盒是本领域公知的。或者，可使用其它方法(像qRT-PCR)来检测HER1基因表达水平。可以通过免疫组织化学方法等来检测HER1表达水平。此类方法是本领域公知的(见例如上文关于HER2表达水平的类似方法和测试)。本文所述抗体的组合物还可以含有佐剂诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌规程，见上文，及通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、酚、山梨酸等来确保防止微生物的存在。还可能期望将等张剂，诸如糖、氯化钠等纳入组合物中。另外，可以通过包括延迟吸收的药剂诸如单硬脂酸铝和明胶来引起可注射药物形式的吸收延长。
不管选择的施用路径，通过本领域技术人员已知的常规方法来将本发明的化合物(其可以以合适的水合形式使用)和/或本发明的药物组合物配制成药学可接受剂量形式。
可以改变活性成分在本发明的药物组合物中的实际剂量水平，从而获得对于实现特定患者、组成、和施用模式的期望的治疗响应有效的，而对患者无毒的活性成分量。选定的剂量水平会取决于多种药动学因素，包括所采用的本发明的特定组合物的活性、施用路径、施用时间、所采用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所采用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、一般健康和先前的医学史等医学领域公知的因素。
组合物必须是无菌的，而且是流体的，其程度使得组合物通过注射器可投递。在水外，载体优选是等张缓冲盐水溶液。
可以例如通过使用涂层材料诸如卵磷脂、在分散体的情况中通过维持所要求的粒度、及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况中，优选在组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇诸如甘露醇或山梨醇、和氯化钠。
除非另外指明，如本文中使用的，术语“治疗/处理”意指在患者中部分或完全逆转、缓解、抑制其进展、或预防肿瘤生长、肿瘤转移、或其它引起癌症的或赘生性的细胞。除非另外指明，如本文中使用的，术语“治疗/处理”指治疗/处理的动作。
短语“治疗方法”或其等同用语在应用于例如癌症时指设计为降低或消除患者中的癌细胞数目，或者减轻癌症症状的规程或作用过程。癌症或另一种增殖性病症的“治疗方法”不必意味着实际上会消除癌细胞或其它病症，实际上会降低细胞数目或病症，或实际上会减轻癌症或其它病症的症状。经常，甚至会实施如下的治疗癌症的方法，其具有较低的成功概率，但是然而鉴于医学史和估计的患者存活预期认为是总体有益的作用过程。
不证自明的是，以治疗有效量对患者施用抗体，治疗有效量是主题化合物或组合会引发研究人员、兽医、医生或其它临床医生寻找的组织、系统、动物或人的生物学或医学应答的量。
术语“与……组合”指在抗HER2抗体或抗HER1抗体以外施用抗HER3抗体的“共施用”。“共施用”意指在第二抗体以外同时或序贯施用第一抗体。共施用可以是同时的或者以任意次序序贯的，其中优选地，存在着所有活性剂同时施加其生物学活性的时段。当同时施用这两种抗体时，在同一天在一次施用中施用药剂，例如在一次连续输注期间。当序贯施用这两种抗体时，在同一天在两次分开施用中施用药剂，例如两次分开的连续输注，或者在第1天施用抗体之一且在第2天至第7天(优选在第2至4天)施用第二抗体。术语“共施用”就第一抗体和第二抗体的维持剂量而言意指若治疗周期对于这两种抗体都是合适的，则可以同时施用维持剂量，例如在一次连续输注期间。或者，在一天或数天内序贯施用维持剂量，例如每3周施用第一抗体的维持剂量且每2周施用第二抗体的维持剂量。其它治疗周期同样也可用于这两种抗体，通常1至4周，优选2至3周。
抗体共施用的量和施用的时机会取决于所治疗患者的类型(物种、性别、年龄、重量、等)和状况和所治疗疾病或状况的严重性。通常，使用抗体的典型剂量。例如，依照本发明的抗体的施用剂量可以是通过一次或多次分开的施用或通过连续输注的约1μg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗体。一种典型的日剂量可以范围为约1μg/kg至约100mg/kg。在一个优选的方面，以范围为约1mg/kg至约15mg/kg的剂量每2至3周施用抗体。曲妥单抗的一种优选剂量是作为连续输注施用的4mg/kg加载剂量和随后作为连续输注施用的2mg/kg至6mg/kg(优选2mg/kg)每3周输注，直至检测到疾病进展。
在本发明的上下文中，可以在本发明的组合治疗中使用额外的其它细胞毒剂、化疗剂或抗癌剂、或增强此类药剂的效果的化合物。此类药剂包括例如：烷化剂或具有烷基化作用的药剂，诸如环磷酰胺(cyclophosphamide)(CTX；例如)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)(CHL；例如瘤可宁)、顺铂(cisplatin)(CisP；例如)、白消安(busulfan)(例如马利兰)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、链脲菌素(streptozotocin)、三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine)(TEM)、丝裂霉素C(mitomycin C)，等等；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)(MTX)、依托泊苷(etoposide)(VP16；例如凡毕士)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)(6MP)、6-硫鸟嘌呤(6-thiocguanine)(6TG)、阿糖胞苷(cytarabine)(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)、卡培他滨(capecitabine)(例如希罗达)、达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)，等等；抗生素，诸如放线菌素D(actinomycin D)、多柔比星(doxorubicin)(DXR；例如阿霉素)、柔红霉素(daunorubicin)(道诺霉素(daunomycin))、博来霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)，等等；生物碱，诸如长春花生物碱诸如长春新碱(vincristine)(VCR)、长春碱(vinblastine)，等等；及其它抗肿瘤剂，诸如帕西他赛(paclitaxel)(例如泰素)和帕西他赛衍生物、细胞抑制剂、糖皮质激素诸如地塞米松(dexamethasone)(DEX；例如地卡特隆)和皮质类固醇诸如泼尼松(prednisone)、核苷酶抑制剂诸如羟基脲、氨基酸消减酶(amino acid depleting enzyme)诸如天冬酰胺酶、甲酰四氢叶酸(leucovorin)和其它叶酸衍生物、和相似的多种多样的抗肿瘤剂。也可以使用下列药剂作为额外的药剂：氨磷汀(arnifostine)(例如)、更生霉素(dactinomycin)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)(氮芥)、链佐星(streptozocin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、多柔比星脂质体(doxorubicin lipo)(例如)、吉西他滨(gemcitabine)(例如健择)、柔红霉素脂质体(daunorubicin lipo)(例如)、丙卡巴肼(procarbazine)、丝裂霉素(mitomycin)、多西他赛(docetaxel)(例如泰索帝)、阿地白介素(aldesleukin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、克拉屈滨(cladribine)、喜树碱(camptothecin)、CPT 11(伊立替康(irinotecan))、10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊达比星(idarubicin)、美司钠(mesna)、干扰素β、干扰素α、米托蒽醌(mitoxantrone)、托泊替康(topotecan)、亮丙瑞林(leuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalan)、巯嘌呤、普卡霉素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培门冬酶(pegaspargase)、喷司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素(plicamycin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替尼泊苷(teniposide)、睾内酯(testolactone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、尿嘧啶芥(uracil mustard)、长春瑞滨(vinorelbine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)。在一个实施方案中，本发明的组合治疗在没有此类额外的细胞毒剂、化疗剂或抗癌剂、或增强此类药剂的效果的化合物的情况中使用。
在本发明的上下文中，可以在本发明的组合治疗中使用抗激素剂。如本文中使用的，术语“抗激素剂”包括作用于调节或抑制激素对肿瘤作用的天然或合成的有机或肽化合物。抗激素剂包括例如：类固醇受体拮抗剂，抗雌激素类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制性4(5)-咪唑，其它芳香酶抑制剂，42-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，那洛昔芬(keoxifene)，LY117018，奥那司酮(onapristone)，和托瑞米芬(toremifene)(例如)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；及任何上述物质的药学可接受的盐、酸或衍生物；糖蛋白激素诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、和促黄体激素(LH)和LHRH(促黄体激素释放激素)的激动剂和/或拮抗剂；LHRH激动剂乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)，以(AstraZeneca)销售；LHRH拮抗剂D-丙氨酰胺N-乙酰基-3-(2-萘基)-D-丙氨酰-4-氯-D-苯基丙氨酰-3-(3-吡啶基)-D-丙氨酰-L-丝氨酰-N6-(3-吡啶基羰基)-L-赖氨酰-N6-(3-吡啶基-羰基)-D-赖氨酰-L-亮氨酰-N6-(1-甲基乙基)-L-赖氨酰-L-脯氨酰(例如Ares-Serono)；LHRH拮抗剂乙酸加尼瑞克(ganirelix acetate)；类固醇抗雄激素乙酸环丙孕酮(cyproterone acetate,CPA)和乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)，以(Bristol-Myers Oncology)销售；非类固醇抗雄激素氟他胺(flutamide)(2-甲基-N-[4,20-硝基-3-(三氟甲基)苯基丙酰胺)，以(Schering Corp.)销售；非类固醇抗雄激素尼鲁米特(nilutamide)(5,5-二甲基-3-[4-硝基-3-(三氟甲基-4’-硝基苯基)-4,4-二甲基-咪唑啉-二酮)；和其它非允许受体的拮抗剂，诸如RAR(视黄酸受体)、RXR(类维生素A X受体)、TR(甲状腺受体)、VDR(维生素D受体)、等等的拮抗剂。在一个实施方案中，本发明的组合治疗在没有此类另外的抗激素剂的情况中使用。
上文所述细胞毒剂和其它抗癌剂在化疗方案中的使用一般在癌症疗法领域中得到充分表征，并且其在本文中的使用归入关于监测耐受性和效力及关于控制施用路径和剂量的相同考虑，伴有一些调整。例如，细胞毒剂的实际剂量可以随通过使用组织培养方法测定的患者的培养细胞响应而变化。一般地，与在没有额外的其它药剂的情况中的使用量相比，剂量会是降低的。
有效细胞毒剂的典型剂量可以在制造商推荐的范围中，并且在通过体外响应或动物模型中的响应指示的情况中，可以降低多至约一个数量级的浓度或量。如此，实际剂量会取决于内科医生的判断、患者的状况、和治疗方法的有效性，其基于原代培养的恶性细胞或组织培养组织样品的体外响应性，或合适的动物模型中观察到的响应。
在本发明的上下文中，在本发明的组合治疗中，可以使用另外的抗增殖剂，包括例如：酶法尼基蛋白质转移酶的抑制剂和受体酪氨酸激酶PDGFR的抑制剂，包括美国专利No.6,080,769、6,194,438、6,258,824、6,586,447、6,071,935、6,495,564、6,150,377、6,596,735和6,479,513及国际专利公开文本WO 01/40217中披露和要求保护的化合物。在一个实施方案中，本发明的组合治疗在没有此类另外的抗增殖剂的情况中使用。
在本发明的上下文中，在本发明的组合治疗外，可以进行有效量的电离辐射和/或可以使用放射性药物。放射源可以是在所治疗的患者外部或内部。在来源在患者外部时，疗法称为外部束放射疗法(EBRT)。在放射源在患者内部时，治疗称作近程疗法(BT)。本发明的上下文中使用的放射性原子可以选自下组，包括但不限于镭、铯-137、铱-192、镅-241、金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘-123、碘-131、和碘-111。在依照本发明的EGFR激酶抑制剂是抗体的情况中，也有可能用此类放射性同位素标记抗体。在一个实施方案中，本发明的组合治疗在没有此类另外的电离辐射的情况中使用。
放射疗法是一种用于控制不可切除的或不能手术的肿瘤和/或肿瘤转移的标准治疗。已经在组合放射疗法与化学疗法时看到改善的结果。放射疗法基于如下的原则，即对靶区域投递的高剂量放射会导致肿瘤和正常组织两者中的生殖细胞(reproductive cell)死亡。放射剂量方案一般在放射吸收剂量(Gy)、时间和分级方面限定，并且必须由肿瘤学家小心限定。患者接受的放射量会取决于各种考虑因素，但是两项最重要的是肿瘤相对于身体的其它重要结构或器官的位置和肿瘤已经扩散的程度。经历放射疗法的患者的一种典型治疗过程会是在1至6周时段里的治疗日程表，以单一每日分数约1.8至2.0Gy一周5天对患者施用10-80Gy的总剂量。在本发明的一个优选的实施方案中，在用本发明的联合治疗和放射治疗人患者中的肿瘤时存在着协同。换言之，在与放射组合时(任选有额外的化疗剂或抗癌剂)，依靠构成本发明组合或单药疗法的药剂对肿瘤生长的抑制得到增强。例如，辅助放射疗法的参数包含在国际专利公开文本WO99/60023中。
依照已知的方法通过静脉内施用(作为推注或者通过在一段时间里连续输注)，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、或鞘内路径对患者施用抗体。静脉内或皮下施用抗体是优选的。
本发明进一步提供一种制品，其包括容器、容器内包含抗HER3抗体的组合物和指导组合物的使用者将所述抗HER3抗体与抑制HER2二聚化的抗HER2抗体组合施用于罹患HER2正常的癌症的患者的包装插页。
本发明进一步提供一种制品，其包括容器、容器内包含抗HER3抗体的组合物和指导组合物的使用者将所述抗HER3抗体与抑制HER2二聚化的抗HER2抗体组合施用于罹患癌症的患者的包装插页。
本发明进一步提供一种制品，其包括容器、容器内包含抗HER3抗体的组合物和指导组合物的使用者将所述抗HER3抗体与抗HER1抗体组合施用于罹患癌症的患者的包装插页，其中所述结合人HER3的抗体和所述结合人HER1的抗体二者均特征在于是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
术语“包装插页”指治疗性产品的商业包装中通常包括的用法说明书，其可含有关于有关此类治疗性产品的使用的适应证、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。
在一个实施方案中，制品容器可进一步包括药学可接受载体。制品可进一步包括无菌稀释剂，优选贮存在分开的另外的容器中。
下面列出本发明的一系列实施方案：
1.一种结合人HER3的抗体，其用于与结合人HER2且抑制HER2二聚化的抗体组合治疗癌症，其中所述癌症为HER2正常的癌症。
2.实施方案1的抗体，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQ IDNO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ ID NO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:6的CDR1L区或SEQ ID NO:7的CDR1L区。
3.实施方案1的抗体，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:9，或轻链可变域VL是SEQ ID NO:10，或轻链可变域VL是SEQ ID NO:11；或其人源化型式。
4.实施方案1的抗体，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：作为重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQID NO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ IDNO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:6的CDR1L区。
5.实施方案1的抗体，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:9，或轻链可变域VL是SEQ ID NO:11。
6.实施方案1的抗体，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：作为重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQID NO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ IDNO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:7的CDR1L区。
7.实施方案1的抗体，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:10。
8.实施方案1至7中任一项的抗体，其中所述结合人HER3的抗体特征在于是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
9.实施方案1至8中任一项的抗体，其中所述结合人HER2且抑制HER2二聚化的抗体为帕妥珠单抗。
10.实施方案1至9中任一项的抗体，其中所述癌症特征在于HER3表达。
11.实施方案1至10中任一项的抗体，其中所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌或头或颈癌乳腺癌。
下面列出本发明的另一系列实施方案：
1.结合人HER3的抗体在制造用于与结合人HER2且抑制HER2二聚化的抗体组合治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症为HER2正常的癌症。
2.实施方案1的用途，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQ IDNO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ ID NO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:6的CDR1L区或SEQ ID NO:7的CDR1L区。
3.实施方案1的用途，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:9，或轻链可变域VL是SEQ ID NO:10，或轻链可变域VL是SEQ ID NO:11；或其人源化型式。
4.实施方案1的用途，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：作为重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQID NO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ IDNO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:6的CDR1L区。
5.实施方案1的用途，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:9，或轻链可变域VL是SEQ ID NO:11。
6.实施方案1的用途，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：作为重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQID NO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ IDNO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:7的CDR1L区。
7.实施方案1的用途，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:10。
8.实施方案1至7中任一项的用途，其中所述结合人HER3的抗体特征在于是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
9.实施方案1至8中任一项的用途，其中所述结合人HER2且抑制HER2二聚化的抗体为帕妥珠单抗。
10.实施方案1至9中任一项的用途，其中所述癌症特征在于HER3表达。
11.实施方案1至10中任一项的用途，其中所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌或头或颈癌乳腺癌。
下面列出本发明的另一系列实施方案：
1.一种治疗罹患HER2正常的癌症的患者的方法，其中该方法包括共施用与结合人HER2且抑制HER2二聚化的抗体组合的结合人HER3的抗体。
2.实施方案1的方法，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQ IDNO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ ID NO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:6的CDR1L区或SEQ ID NO:7的CDR1L区。
3.实施方案1的方法，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:9，或轻链可变域VL是SEQ ID NO:10，或轻链可变域VL是SEQ ID NO:11；或其人源化型式。
4.实施方案1的方法，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：作为重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQID NO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ IDNO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:6的CDR1L区。
5.实施方案1的方法，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:9，或轻链可变域VL是SEQ ID NO:11。
6.实施方案1的方法，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：作为重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQID NO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ IDNO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:7的CDR1L区。
7.实施方案1的方法，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:10。
8.实施方案1至7中任一项的方法，其中所述结合人HER3的抗体特征在于是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
9.实施方案1至8中任一项的方法，其中所述结合人HER2且抑制HER2二聚化的抗体为帕妥珠单抗。
10.实施方案1至9中任一项的方法，其中所述癌症特征在于HER3表达。
11.实施方案1至10中任一项的方法，其中所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌或头或颈癌乳腺癌。
下面列出本发明的另一系列实施方案：
1.一种结合人HER3的抗体，其用于与结合人HER1的抗体组合治疗癌症，其中所述结合人HER3的抗体和所述结合人HER1的抗体中至少其一特征在于所述抗体是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
2.实施方案1的抗体，其中所述结合人HER3的抗体和所述结合人HER1的抗体二者均特征在于是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
3.实施方案1至2中任一项的抗体，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：作为重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQ ID NO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ ID NO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:7的CDR1L区。
4.实施方案1至2中任一项的抗体，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:10。
5.实施方案3至4中任一项的抗体，其中所述结合人HER1的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:20；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:21。
6.实施方案1至5中任一项的抗体，其中所述癌症特征在于HER3表达。
7.实施方案6的抗体，其中所述癌症特征在于HER1表达。
8.实施方案1至7中任一项的抗体，其中所述癌症为肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、或头和颈癌。
下面列出本发明的另一系列实施方案：
1.结合人HER3的抗体在制备用于与结合人HER1的抗体组合治疗癌症的药物中的用途，其中所述结合人HER3的抗体和所述结合人HER1的抗体中至少其一特征在于所述抗体是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
2.实施方案1的用途，其中所述结合人HER3的抗体和所述结合人HER1的抗体二者均特征在于是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
3.实施方案1至2中任一项的用途，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：作为重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQ ID NO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ ID NO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:7的CDR1L区。
4.实施方案1至2中任一项的用途，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:10。
5.实施方案3至4中任一项的用途，其中所述结合人HER1的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:20；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:21。
6.实施方案1至5中任一项的用途，其中所述癌症特征在于HER3表达。
7.实施方案6的用途，其中所述癌症特征在于HER1表达。
8.实施方案1至7中任一项的用途，其中所述癌症为肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、或头和颈癌。
下面列出本发明的另一系列实施方案：
1.一种治疗罹患癌症的患者的方法，其中该方法包括共施用与结合人HER1的抗体组合的结合人HER3的抗体，其中所述结合人HER3的抗体和所述结合人HER1的抗体中至少其一特征在于所述抗体是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
2.实施方案1的方法，其中所述结合人HER3的抗体和所述结合人HER1的抗体二者均特征在于是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
3.实施方案1至2中任一项的方法，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：作为重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQ ID NO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ ID NO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:7的CDR1L区。
4.实施方案1至2中任一项的方法，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:10。
5.实施方案3至4中任一项的方法，其中所述结合人HER1的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:20；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:21。
6.实施方案1至5中任一项的方法，其中所述癌症特征在于HER3表达。
7.实施方案6的方法，其中所述癌症特征在于HER1表达。
8.实施方案1至7中任一项的方法，其中所述癌症为肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、或头和颈癌。
提供以下实施例、序列表和图以帮助理解本发明，其实际范围在所附权利要求书中列出。应当理解，可以在不背离本发明的精神的前提下对所列规程做出修改。
序列表描述
SEQ ID NO:1     重链CDR3H，单抗205.10
SEQ ID NO:2     重链CDR2H，单抗205.10
SEQ ID NO:3     重链CDR1H，单抗205.10
SEQ ID NO:4     轻链CDR3L，单抗205.10
SEQ ID NO:5     轻链CDR2L，单抗205.10
SEQ ID NO:6     轻链CDR1L(变体1)，单抗205.10
SEQ ID NO:7     轻链CDR1L(变体2)，单抗205.10
SEQ ID NO:8     重链可变域VH，单抗205.10
SEQ ID NO:9     轻链可变域VL，单抗205.10.1
SEQ ID NO:10    轻链可变域VL，单抗205.10.2
SEQ ID NO:11    轻链可变域VL，单抗205.10.3
SEQ ID NO:12    人κ轻链恒定区
SEQ ID NO:13    自IgG1衍生的人重链恒定区
SEQ ID NO:14    在L234A和L235A上突变的自IgG1衍生的人重链恒定区
SEQ ID NO:15    自IgG4衍生的人重链恒定区
SEQ ID NO:16    在S228P上突变的自IgG4衍生的人重链恒定区
SEQ ID NO:17    人HER3(包括信号肽)
SEQ ID NO:18    人HER2(包括信号肽)
SEQ ID NO:19    人HER1(包括信号肽)
SEQ ID NO:20    抗HER1抗体GA201的重链可变域VH
SEQ ID NO:21    抗HER1抗体GA201的轻链可变域VL
实施例
实施例1
免疫
将NMRI小鼠用hHER3-ECD(自用)免疫，并用hu HER3-ECD加强。通过针对HER1/2/3-ECD-ELISA测试血清样品监测免疫应答。将来自具有足够的抗HER3免疫球蛋白滴度的小鼠的脾细胞冷冻，用于以后通过与小鼠骨髓瘤细胞系P3X63Ag8.653融合来永生化。完成一次融合，并通过不显示交叉反应性，但结合HER3-ECD的HER1/2/-ECD-ELISA筛选杂交瘤上清液，并选出抗HER3选择性杂交瘤。通过单细胞FACS分选克隆相关杂交瘤。将来自不同杂交瘤的单细胞克隆在体外培养以在组织培养液中生成抗体以供表征。通过测定其抑制HER3磷酸化、AKT磷酸化和MDA-MB-175细胞的肿瘤细胞增殖的能力选出抗体(见下文实施例)。自获得的抗体，将一种抗体进一步人源化以给出下列抗体，即具有其各自VH和VL或CDR的单抗205.10.1、单抗205.10.2和单抗205.10.3。
抗体 VH VL
单抗205.10.1 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:9
单抗205.10.2 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:10
单抗205.10.3 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:11
在一个实施方案中，使用人起源的恒定区，例如SEQ ID NO:12-13来制备此类抗体。
实施例2
结合测定法
a)用于结合人HER3ECD的抗原特异性ELISA
将与链霉亲合素结合蛋白(SBP)融合的可溶性人HER3胞外域在链霉亲合素板上捕获。为了限定抗体对SPB-CDCP1的最佳结合，已经用纯的和逐步稀释的HEK293上清液(在BSA/IMDM缓冲液中：100mg/ml BSA级分V，Roche10735078001，在Iscove氏改良的Dulbeccos培养基中溶解)包被由MicroCoat,Bernried,Germany(ID-No.1734776-001)供应的384孔聚苯乙烯板(NUNC，经链霉亲合素包被的)。使用嵌合205抗体的小鼠校正曲线，鉴定相对于微量滴定板的链霉亲合素结合能力而言HEK293上清液的最佳稀释因子。对于标准包被，将含有SBP-HER3的HEK293上清液稀释(在1:15和1:40之间)，并于2-80C温育过夜(每孔25μl)。微量滴定板的强烈清洗对于除去剩余的未结合的SBP-HER3是必需的。
测试未稀释的或使用12步稀释得到的依照本发明的抗体。将每孔12.5μl每种样品于室温温育90分钟。在使用PBS-T(在PBS中的0.1％Tween 20)强烈清洗后，添加25μl用于人抗体的与HRP偶联的山羊抗人IgG抗体(JacksonImmunoResearch,代码号：109-036-098,以1:10000稀释)，并温育1小时。在强烈清洗后，用ABTS片(Roche Diagnostics GmbH,产品目录编号：1112422)检测抗体的结合。使用标准光度计测量于405nm/492nm的吸光度。
表显示了不同抗体的相对结合比率。
b)通过Biacore分析表征抗HER3抗体对人HER3的胞外域(ECD)片段的结合：
对于亲和力测量，在SPR仪(Biacore T100)上通过标准的胺偶联和封闭化学将30μg/ml抗Fcγ抗体(来自山羊，Jackson Immuno Research)偶联至CM-5传感器芯片表面。在缀合后，将抗HER3抗体于25℃以5μL/分钟的流速注射，接着以30μL/分钟注射连续稀释(0nM至1000nM)的人HER3ECD。作为结合实验的运行缓冲液，使用PBS/0.1％BSA。然后，用10mM盐酸甘氨酸(pH 2.0)溶液的60秒脉冲再生芯片。
使用朗缪尔(Langmuir)1:1结合模型计算热力学参数(KD，对HER3的结合常数)。
在竞争性结合测定法(Biacore)中，单抗205.10.1、单抗205.10.2、和单抗205.10.3都显示对相同表位的结合。在此类测定法中调查记载于WO2007/077028的抗HER3抗体U1-7、U-53和U1-59和记载于WO 2008/100624的Ab#6，并且揭示了它们与抗体单抗205.10.1、单抗205.10.2、和单抗205.10.3结合不同表位。
实施例3
a)对MCF7、FaDu和Mel-Juso细胞中HER3磷酸化的抑制
依照以下方案在MCF7和FaDu细胞中实施测定法：以500,000个细胞/孔将细胞接种入经聚-D-赖氨酸包被的6孔板中在具有10％FCS的RPMI1640培养基中。温育24小时。通过抽吸除去培养基，在500μl/孔具有0.5％FCS的RPMI1640的情况中温育过夜。添加500μl具有0.5％FCS的RPMI 1640中的抗体。温育1小时。添加HRG-1b(终浓度500ng/ml)达10分钟。为了裂解细胞，除去培养基，并添加80μl冰冷的Triton-X-100细胞裂解缓冲液，并在冰上温育5分钟。在将裂解物转移入1.5ml反应管中并以14000rpm于4℃离心15分钟后，将上清液转移入新鲜的反应管中。将SDS加载缓冲液中含有等量蛋白质的样品在SDS PAGE上分离，并通过使用半干Western印迹来印迹至硝酸纤维素膜。通过1x NET缓冲液+0.25％明胶将膜封闭1小时，并分别通过抗体α磷酸-HER3/ErbB3(Tyr1289)(21D3),Cell Signaling,#4791检测pHER3，并通过抗体αErbB3(C-17),Santa Cruz,#sc-285检测HER3。在清洗并通过POD偶联的二抗检测信号后，用密度计扫描条带。调查抗HER3抗体单抗205.10.1、单抗205.10.2、和单抗205.10.3和还有记载于WO 2007/077028的抗HER3抗体U1-7、U-53和U1-59和记载于WO 2008/100624的Ab#6。在下文和图1A中显示了抗HER3抗体对MCF7细胞中受体磷酸化的百分比(％)抑制。
对MCF7细胞中HER3磷酸化的％抑制
在又一个实验中，调查抗HER3抗体单抗205.10.2、和还有记载于WO97/35885的抗HER3抗体8B8.2D9、和记载于WO 2003/013602的1B4C3和2D1D12。在下文和图1B中显示了抗HER3抗体对MCF7细胞中受体磷酸化的百分比(％)抑制。
对MCF7细胞中HER3磷酸化的％抑制
下文显示了抗HER3抗体对FaDu细胞中受体磷酸化的百分比(％)抑制。
对FaDu细胞中HER3磷酸化的％抑制
在又一个实施方案中，在Mel-Juso细胞中调查抗HER3抗体单抗205.10.2、和还有记载于WO 97/35885的抗HER3抗体8B8.2D9、和记载于WO2003/013602的1B4C3和2D1D12、和105.5(Millipore，产品目录编号05-47，在WO 2003/013602中称作α-HERECD)。依照关于MCF7和FaDu细胞的前述方案实施Mel-Juso细胞中的测定法。使细胞数目和培养基体积适应于12孔板。在下文和图1C中显示了抗HER3抗体对Mel-Juso细胞中受体磷酸化的百分比(％)抑制。
对Mel-Juso细胞中HER3磷酸化的％抑制
b)AKT磷酸化(ELISA)
依照以下方案在MCF7细胞中实施测定法：以30000个细胞/孔将MCF7细胞接种入经聚-D-赖氨酸包被的96孔板中在具有10％FCS的RPMI1640培养基中，并温育24小时。通过在干净的纸巾上轻打来除去培养基，用200μl无血清培养基仔细清洗，在100μl/孔具有0.5％FCS的RPMI 1640的情况中温育过夜。如上述的，除去培养基；添加100μl具有0.5％FCS的RPMI 1640中的抗体，并温育1.5小时。添加HRG-1b(终浓度5ng/ml)达10分钟。如上述的，除去培养基。为了裂解细胞，在冰上添加100μl冰冷的细胞裂解缓冲液，并通过移液约5次来重悬。以3000rpm于4℃将板离心10分钟，并将80μl上清液(或等分试样)转移入新鲜的聚丙烯板中，并在LN2中急速冷冻。于-80℃贮存，直至测定法。
AKT1,2(磷酸-Ser473)EIA试剂盒测定法设计#900-162：将样品(1:10稀释的)添加至用对AKT N端特异性的小鼠单抗包被的板。于RT在摇动的情况中温育1小时。清洗5次，于RT在摇动的情况中与生物素化的抗磷酸-AKT(Ser473)一起温育1小时。清洗5次，于RT在摇动的情况中与链霉亲合素-HRP缀合物一起温育30分钟。清洗5次，于RT在摇动的情况中与TMB底物一起温育30分钟。停止，并于450nm读取。
单抗205.10.2显示AKT磷酸化抑制的IC50为0.06μg/ml。
如对MCF7细胞所描述的，实施在Mel-Juso细胞中的pAKT ELISA。单抗205.10.2显示AKT磷酸化抑制的IC50为0.28μg/ml，所有其它分析物抗体显示IC50高于(>)50。
Mel-Juso细胞中的％AKT磷酸化抑制
抗体 IC50[μg/ml]
单抗205.10.2 0.28
105.5(α-HERECD) 0.81
1B4C3 >50
2D1D12 >50
8B8D9 >50
c)对肿瘤细胞增殖的抑制
评估HER3抗体单抗205.10.1、单抗205.10.2、和单抗205.10.3在使用MDA-MB-175细胞(VII人乳腺癌细胞，ATCC产品目录编号HTB-25)的细胞增殖测定法中的抗肿瘤效力。将每孔20,000个细胞接种入具有含有10％FCS的DMEM/F12细胞培养基的无菌96孔组织培养板中，并于37℃±1℃在5％±1％CO2的情况中温育1天。细胞是缓慢生长的细胞，倍增时间是约1.5天。将抗HER3抗体以稀释系列添加，并再温育6天。然后，使用读出评估细胞存活力。若细胞存活力降低至对照的大于50％，则对每个抗体浓度使用一式三份的均值计算IC50值；不然，若在最高浓度对细胞存活力的％抑制低于50％，则不可计算IC50，并且指示IC50[μg/ml]高于(>)最高的浓度。还调查记载于WO 2007/077028的抗HER3抗体U1-59和记载于WO2008/100624的Ab#6。
抗体 IC50[μg/ml]
单抗205.10.1 8.0
单抗205.10.2 3.8
单抗205.10.3 6.8
U1-59 12.4
Ab#6 >60μg/ml
在又一个实验中，调查记载于WO 97/35885的抗HER3抗体8B8.2D9和记载于WO 2003/013602的1B4C3。
实施例5
按1μg/ml比裂解(specLysis)％计，KPL-4肿瘤细胞中的体外ADCC
在指数生长期中用胰蛋白酶/EDTA(Gibco#25300-054)收集靶细胞KPL4(ADCC)，乳腺癌，在RPMI1640+2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺+10％FCS中培养。在清洗步骤并检查细胞数目和存活力后，于37℃在细胞培养箱中用钙黄绿素(Invitrogen#C3100MP；将1管形瓶在50μl DMSO中重悬，用于5ml培养基中的5百万(Mio)个细胞)标记所需等分试样30分钟。然后，将细胞用AIM-V培养基清洗3次，检查细胞数目和存活力，并将细胞数目调节至0.3百万/ml。
同时，通过密度梯度离心(Histopaque-1077,Sigma#H8889)依照制造商的方案(清洗步骤以400g 1x和350g 2x，各10分钟)制备作为效应细胞的PBMC(外周血单个核细胞)。检查细胞数目和存活力，并将细胞数目调节至15百万/ml。
将100μl经钙黄绿素染色的靶细胞在圆底96孔板中分配，添加50μl稀释的、无岩藻糖基化的抗体(单抗205.10.1、单抗205.10.2、单抗205.10.3，制备见下文)和50μl效应细胞。在一些实验中，将靶细胞与10mg/ml Redimune浓度的NF液体(ZLB Behring)混合。
通过在没有抗体的情况中共培养靶细胞和效应细胞测定充当对照的自发裂解，并通过仅对靶细胞的1％Triton X 100裂解测定最大裂解。将板于37℃在湿润的细胞培养箱中温育4小时。
使用细胞毒性检测试剂盒(LDH检测试剂盒，Roche#1644793)依照制造商的用法说明书通过测量来自受损伤细胞的LDH(乳酸脱氢酶)释放评估对靶细胞的杀伤。简言之，将100μl来自每个孔的上清液在透明平底96孔板中与来自试剂盒的100μl底物混合。在ELISA阅读器中于490nm测定底物的颜色反应的Vmax值至少10分钟。特异性抗体介导的杀伤的百分比如下计算：((A–SR)/(MR–SR)x100，其中A是特定抗体浓度的Vmax的均值，SR是自发释放的Vmax的均值，而MR是最大释放的Vmax的均值。
作为额外的读出，如下评估完整靶细胞的钙黄绿素保留，即在硼酸盐缓冲液(5mM硼酸钠+0.1％Triton)中裂解剩余的靶细胞，并在荧光读板仪中测量钙黄绿素荧光。单抗205.10.1、单抗205.10.2、单抗205.10.3显示约40-60％的按1μg/ml比裂解计的ADCC[KPL-4]。
通过分别在HEK293或CHO细胞中用4种质粒(两种用于抗体表达，一种用于融合GnTIII多肽表达(GnT-III表达载体)，及一种用于甘露糖苷酶II表达(高尔基甘露糖苷酶II表达载体))以4:4:1:1的比率共转染来制备无岩藻糖基化的抗体(单抗205.10.1、单抗205.10.2、单抗205.10.3)。
将完整的抗体重和轻链DNA序列在MPSV启动子的控制下且在合成的多聚A位点上游亚克隆入哺乳动物表达载体(一种用于轻链，而一种用于重链)中，每种载体携带EBV OriP序列。使用磷酸钙转染方法通过用抗体重和轻链表达载体共转染HEK293-EBNA细胞或CHO细胞生成抗体。通过磷酸钙方法转染指数生长的HEK293-EBNA细胞。对于糖工程化抗体的生成，分别用4种质粒(两种用于抗体表达，一种用于融合GnTIII多肽表达(GnT-III表达载体)，及一种用于甘露糖苷酶II表达(高尔基甘露糖苷酶II表达载体))以4:4:1:1的比率共转染细胞。使用补充有10％FCS的DMEM培养基将细胞以粘附的单层培养物在T烧瓶中培养，并在它们为50-80％汇合时转染。对于T150烧瓶的转染，在转染前24小时将1500万个细胞在25ml补充有FCS(最终为10％V/V)的DMEM培养基中接种，并将细胞于37℃在培养箱中在5％CO2气氛的情况中放置过夜。对于要生成的每种抗体，通过混合188μg总质粒载体DNA(4种载体，两种用于抗体表达(一种用于轻链和一种用于重链)，一种用于融合GnTIII多肽表达(GnT-III表达载体)，及一种用于甘露糖苷酶II表达(高尔基甘露糖苷酶II表达载体)，比率为4:4:1:1)、至终体积938μl的水和938μl 1M CaCl2溶液制备DNA、CaCl2和水的溶液。对此溶液添加1876μl50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4溶液(pH 7.05)，立即混合10秒，并于室温保持竖立20秒。将悬浮液用46ml补充有2％FCS的DMEM稀释，并分入两个T150烧瓶中，替换现有的培养基。
将细胞于37℃，5％CO2温育约17至20小时，然后用25ml DMEM，10％FCS更换培养基。转染后7天通过以210x g离心15分钟收获条件化培养基，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并添加终浓度0.01％w/v的叠氮化纳，并于4℃保持。
纯化分泌的无岩藻糖基化抗体，并例如通过MALDI/TOF-MS(如记载于例如WO 2008/077546的)分析附着于抗体Fc区的寡糖。对于此分析，通过PNG酶F消化自抗体用酶释放寡糖，其中抗体固定化于PVDF膜上或在溶液中。将含有释放的寡糖的所得消化溶液直接制备好进行MALDI/TOF-MS分析或者用EndoH糖苷酶进一步消化，之后将样品制备好进行MALDI/TOF-MS分析。Asn297处的糖链内岩藻糖的分析量是50-20％。
实施例6
抗HER3抗体单药疗法的体内抗肿瘤效力
可以在对SCID米色小鼠或裸鼠移植的各种肿瘤起源(例如，肺癌、SCCHN、乳腺和胰腺癌)的基于细胞和碎块的模型中检测抗体单抗205.10.1、单抗205.10.2、单抗205.10.3的体内抗肿瘤效力。举例而言，对SCCHN异种移植物模型FaDu(基于细胞系的)、乳腺癌模型MAXF449(基于碎块的)和NSCLC模型7177(基于碎块的)显示了数据。
测试剂
以来自Roche,Penzberg,Germany的储备溶液提供无岩藻糖基化的单抗205.10.2(在图2、3、4中称作单抗205)。抗体缓冲液包含组氨酸。将抗体溶液在注射前自储液在缓冲液中适当稀释。
细胞系和培养条件
FaDu人HNSCC细胞最初获自ATCC。将肿瘤细胞系在补充有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和0.1mM NEAA的MEM Eagle培养基中于37℃在水饱和的气氛中于5％CO2常规培养。用胰蛋白酶/EDTA一次实施培养物传代，每三天拆分。
肿瘤碎块
肿瘤碎块最初自患者采集，并s.c.移植至供体裸鼠。随后，将肿瘤碎块在体内连续传代。对于临床前研究，自供体小鼠生成小的肿瘤碎块，并在别的裸鼠(MAXF449,7177)上s.c.放置。
动物
雌性SCID米色小鼠或裸鼠购自育种者(例如，Charles River,Sulzfeld,Germany)，并在无特定病原体条件下以12小时光照/12小时黑暗的每日循环依照承诺的准则(GV-Solas；Felasa；TierschG)维持。实验研究方案得到地方政府审阅和批准。在到达后，将动物在动物房的检疫部分中维持1周以习惯新的环境并进行观察。定期实施连续健康监测。任意提供饮食食物(ProvimiKliba 3337)和水(酸化为pH 2.5-3)。
监测
每天对动物控制临床症状并检测不利效果。对于贯穿整个实验的监测，记录动物的体重。
动物的处理
在动物随机化后在细胞或碎块移植后在中值肿瘤大小是约100-150mm3时开始动物处理。将抗体作为单一药剂以10或25mg/kg i.p.q7d每周施用一次，随模型持续3–6周。在同一天施用相应的媒介物。
抗体效力
A)FaDu HNSCC异种移植物
自研究日14至35用抗体单抗205.10.2处理携带FaDu HNSCC(头和颈鳞状细胞癌)异种移植物的小鼠。结果，单抗205.10.2抗体的处理显示显著抗肿瘤效力，伴有s.c.FaDu异种移植物的肿瘤淤滞。肿瘤生长抑制(TGI)计算为98％。
单抗205的处理(10mg/kg q7dx3,i.p.)导致移植FaDu HNSCC的异种移植物的肿瘤淤滞(见图2)。
B)MAXF449乳腺癌异种移植物
自研究日64至91用抗体单抗205.10.2处理携带MAXF449乳腺癌异种移植物的小鼠。结果，单抗205.10.2抗体的处理显示显著抗肿瘤效力，伴有MAXF449异种移植物的肿瘤淤滞。肿瘤生长抑制(TGI)超过100％。
单抗205的处理(10mg/kg q7d,i.p.)导致移植MAXF449乳腺癌的异种移植物的肿瘤淤滞(见图3)。
C)7177 NSCLC异种移植物
自研究日28至56用抗体单抗205.10.2处理携带7177 NSCLC异种移植物的小鼠。结果，单抗205.10.2抗体的处理显示显著抗肿瘤效力，伴有7177NSCLC异种移植物的肿瘤淤滞。肿瘤生长抑制(TGI)超过100％。
单抗205的处理(25mg/kg q7d,i.p.)导致移植7177 NSCLC的异种移植物的肿瘤淤滞(见图4)。
实施例7
抗HER3疗法与帕妥珠单抗组合的体内抗肿瘤效力
将人乳腺癌细胞系ZR-75-1(它是一种HER2正常的癌细胞系且表达HER3)皮下(s.c.)接种入雌性Balb/c裸鼠的右体侧(5x106个细胞每只动物)。贯穿整个研究期给动物系统性补充17β-雌二醇药丸并s.c.施用抗生素cefocein(20mg/kg)(以每周一次间隔)。
在肿瘤细胞接种后第40天，将动物随机化并分派给3个处理组和1个媒介组，在所有组中产生约100mm3的中值肿瘤体积。在随机化那天，通过腹膜内施用Mab205.10.2(10mg/kg)、帕妥珠单抗(30mg/kg加载剂量，继以15mg/kg维持剂量)、Mab205.10.2加帕妥珠单抗的组合，以每周一次间隔开始处理。在第81天(即开始处理之后41天及最后一次(第6次)药疗之后6天)处死动物。
依照NCI方案计算初始肿瘤体积(TV)(TV＝(长度x宽度2)/2)，其中“长度”和“宽度”为肿瘤块的长和短直径，以mm计(Corbett等,1997)。自分期(肿瘤接种后第40天)直至研究结束(肿瘤接种后第81天)实施计算。
对于处理期期间百分比肿瘤生长抑制(TGI)的计算，将每个处理组与其相应媒介对照比较。TV第z天代表动物个体在指定研究日(第z天)的肿瘤体积，而TV第x天代表动物个体在分期日(第x天)的肿瘤体积。
应用下述公式：
处理对肿瘤体积的结果/功效，第81天
化合物 TGI(％)
抗HER2帕妥珠单抗i.p. 32.9
抗HER3Mab205.10.2i.p. 27.6
抗HER3Mab205.10.2i.p.+抗HER2帕妥珠单抗i.p. 53.2
实施例8
抗HER3(Mab205.10.2＝RG7116)疗法与帕妥珠单抗组合的体内抗肿瘤功效
通过使用人肿瘤细胞系(BxPC3、QG56、A549、NCI-H322M、NCI-H1975、HCC827、HCC827GR、NCI-H441、FaDu)或通过植入人肿瘤组织碎块，生成皮下异种移植物模型。基于高pHER3/HER3比(通过Western印迹进行分析)选择细胞系和碎块。依照德国动物福利法案(Tierschutzgesetz)指南进行所有实验。
对于基于细胞系的异种移植物模型，将细胞(5-10x 106个细胞)皮下(s.c.)注射入雌性SCID/米色(BxPC3、QG56、A549、NCI-H322M、NCI-H441、FaDu)或Balb/c裸鼠(HCC827、HCC827GR、NCI-H1975)(均来自CharlesRiver，Germany)。在第21-24天(取决于模型)将小鼠(n＝10只每组)随机化，针对初始肿瘤尺寸分层，之后开始治理。每周一次腹膜内(i.p.)给予Mab205.10.2(在这个实施例中缩写为RG7116)处理(剂量10-25mg/kg)(n＝2-5剂)。使用盐水作为媒介对照。每周一次用卡尺测量肿瘤体积(1/2(长度x(宽度)2))，并计算与对照动物相比的百分比肿瘤生长抑制(TGI)，如补充材料中所述进行。
通过将人肿瘤小碎块移植到NMRI裸鼠上，在Oncontest GmbH(Freiburg，Germany)或Experimental Pharmacology&Oncology Berlin-Buch GmbH(Berlin，Germany)评估皮下患者衍生肿瘤异种移植物模型(PDX)。将小鼠随机化(n＝10只每组)，并与基于细胞的模型类似地实施治疗。
使用一种常位的基于细胞系的异种移植物小鼠模型来评估ADCC的贡献。因此，将HER3重组A549-B34转染细胞i.v.注射(3x 106个细胞)入雌性SCID米色小鼠(Taconics)。在侦察动物(scout animal)中确认了肺中肿瘤生长的证据时，在第23天将小鼠随机化(n＝15只每组)。小鼠接受10-13次每周i.p.注射25mg/kg RG7116或非糖工程化RG7116或盐水对照。终止标准为伴有行动受损的患病。中值存活定义为该组中至少50％的动物被处死时的实验日。使用Kaplan-Meier曲线呈现存活数据，并依靠成对时序检验来比较每个处理组之间的中值存活差异。
RG7116处理导致对小鼠异种移植物肿瘤的强TGI
使用代表不同肿瘤实体(胰腺、TNBC、SSCHN和NSCLC)的皮下小鼠异种移植物模型调查RG7116的体内活性。所有模型均表达显著磷酸化的HER3，指示HER3在这些模型中是受到活化的；因此细胞生长可能依赖于HER3信号传导。由于皮下异种移植物模型在肿瘤部位缺乏免疫效应细胞，因此这些模型只反映经HER3信号传导抑制介导的抗肿瘤功效；没有来自ADCC的贡献。
RG7116在BxPC3小鼠异种移植物模型中展现剂量依赖性TGI(图6A)。RG7116在0.3至25mg/kg范围中的腹膜内剂量是高度有效的，而且导致与对照小鼠相比>90％的TGI。只有在0.1mg/kg的剂量实现了部分TGI。在研究结束时(第56天)，处死小鼠，并对外植肿瘤组织检查HER3和pHER3的存在情况。pHER3水平在以0.3-25mg/kg的剂量用单一药剂RG7116处理的小鼠中与对照动物相比显著降低(图4B)。只有无效剂量(0.1mg/kg)的RG7116未能完全抑制HER3磷酸化。在通过免疫组织化学检查外植组织时，RG7116的有效剂量看来与用媒介对照和0.1mg/kg RG7116处理的肿瘤外植体相比下调膜HER3水平(图4C)，动力学与Western印迹中看到的相同。
在HER3阳性人NSCLC(腺癌和鳞状)模型(基于细胞系和碎块的)中，单一药剂RG7116诱导有力的TGI(图7)。4-6个周期的10-25mg/kg剂量的每周RG7116处理在5/6种鳞状NSCLC模型中导致强TGI，包括3/6种中的肿瘤瘀滞或完全消退(图7A)。图5B显示一种例示性鳞状NSCLC模型(LXFE722)，其中实现了完全消退。在单一药剂RG7116没有抑制肿瘤生长的LXFE646模型中，在将RG7116与HER1靶向疗法组合时实现了肿瘤瘀滞(数据未显示)。还在5/10种腺癌NSCLC异种移植物模型中观察到实质性TGI(>50％)(图7A)。
所有NSCLC肿瘤模型的c-Met表达状态和KRAS突变状态是知道的。RG7116由HER3信号抑制介导的功效在过表达c-Met的三种腺癌细胞系(HCC827、Lu7397和NCI-H441)中是较低的，而在两种KRAS突变体模型(A549和LXFA983)中看到>50％的TGI。在第三种也过表达c-Met的KRAS突变体细胞系(NCI-H441)中没有看到TGI。
而且，在与靶向HER1(RG7160[GA201]；图7C)或HER2(帕妥珠单抗；图7D)的抗体组合时，RG7116在HER1(FaDu细胞，表达HER1)或HER2(MAXF449细胞，HER2正常的癌细胞)分别作为优选异二聚化配偶的模型中的功效得到增强。在这两种情况中，组合治疗引起较长持续时间和完全肿瘤消退。

Claims (16)

1.一种结合人HER3的抗体，其用于与结合人HER2且抑制HER2二聚化的抗体组合治疗癌症，其中所述癌症为HER2正常的癌症。
2.权利要求1的抗体，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQ IDNO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQID NO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:6的CDR1L区或SEQ ID NO:7的CDR1L区。
3.权利要求1的抗体，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：作为重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQID NO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ ID NO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:7的CDR1L区。
4.权利要求1的抗体，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:10。
5.权利要求1至4中任一项的抗体，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
6.权利要求1至5中任一项的抗体，其中所述结合人HER2且抑制HER2二聚化的抗体为帕妥珠单抗(pertuzumab)。
7.权利要求1至6中任一项的抗体，其中所述癌症特征在于HER3表达。
8.权利要求1至7中任一项的抗体，其中所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌或头或颈癌乳腺癌。
9.一种结合人HER3的抗体，其用于与结合人HER1的抗体组合治疗癌症，其中所述结合人HER3的抗体和所述结合人HER1的抗体中至少其一特征在于所述抗体是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
10.权利要求9的抗体，其中所述结合人HER3的抗体和所述结合人HER1的抗体二者均特征在于是在Asn297处用糖链糖基化的，其中所述糖链内岩藻糖的量是65％或更低。
11.权利要求9至10中任一项的抗体，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：作为重链可变域包含SEQ ID NO:1的CDR3H区、SEQ ID NO:2的CDR2H区、和SEQ ID NO:3的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3L区、SEQ ID NO:5的CDR2L区、和SEQ ID NO:7的CDR1L区。
12.权利要求9至10中任一项的抗体，其中所述结合人HER3的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:8；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:10。
13.权利要求11至12中任一项的抗体，其中所述结合人HER1的抗体特征在于：重链可变域VH是SEQ ID NO:20；且轻链可变域VL是SEQ ID NO:21。
14.权利要求9至13中任一项的抗体，其中所述癌症特征在于HER3表达。
15.权利要求14的抗体，其中所述癌症特征在于HER1表达。
16.权利要求9至15中任一项的抗体，其中所述癌症为肺癌或乳腺癌、结肠直肠癌、或头和颈癌。
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