CN113194993A

CN113194993A - 含高浓度抗vegf抗体的蛋白质溶液配制品

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Publication number: CN113194993A
Application number: CN201980081759.8A
Authority: CN
Inventors: J·西格; P·德莫尔
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2018-12-18
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2021-07-30
Also published as: WO2020128792A1; CL2021001587A1; IL283456A; TW202031289A; MX2021007393A; US20240182554A1; PE20211602A1; CO2021007830A2; CA3119241A1; CR20210318A; JP2022105056A; EP3897714A1; US11945859B2; JP2022513253A; SG11202104653XA; US20200190179A1; JOP20210152A1; AU2019407063B2; KR20210106476A; JP7089121B2

Abstract

本披露提供了抗VEGF抗体，将所述抗VEGF抗体配制为适合于注射、特别地玻璃体内注射的高浓度的、水性药物组合物。所述水性药物组合物可用于将高浓度的抗体活性成分递送至患者，而不出现高水平的抗体聚集以及高水平的亚可见微粒物质。本披露的水性组合物包含浓度为至少50mg/ml的抗体。本披露的水性药物组合物包含糖、缓冲剂、以及表面活性剂。

Description

含高浓度抗VEGF抗体的蛋白质溶液配制品

序列表

本申请包含按ASCII格式以电子方式提交并且特此通过引用以其全文并入的序列表。所述ASCII副本创建于2019年12月11日，命名为PAT058325_sequence_listing_2019_ST25.txt且大小为9KB。

技术领域

本发明涉及抗VEGF抗体的水性药物配制品、用于制备所述配制品的方法以及所述配制品的用途。

背景技术

血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成和新生血管形成的已知调节剂，并且已被证明是与肿瘤和眼内障碍相关的新生血管形成的关键介导者(Ferrara等人Endocr.Rev.[内分泌学评论]18：4-25(1997))。所述VEGF mRNA在许多人肿瘤中过表达，并且眼液中VEGF的浓度与患有糖尿病和其他局部缺血相关的视网膜病的患者中血管活性增殖的存在高度相关(Berkman等人，J Clin Invest[临床研究杂志]91：153-159(1993)；Brown等人HumanPathol.[人体病理学]26：86-91(1995)；Brown等人Cancer Res.[癌症研究]53：4727-4735(1993)；Mattern等人Brit.J.Cancer.[英国癌症杂志]73：931-934(1996)；和Dvorak等人AmJ.Pathol.[美国病理学杂志]146：1029-1039(1995)；Aiello等人N.Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]331：1480-1487(1994))。此外，最近的研究表明受AMD影响的患者中脉络膜新生血管膜中存在局部VEGF(Lopez等人Invest.Ophtalmo.Vis.Sci.[眼科学研究与视力学]37：855-868(1996))。抗VEGF中和抗体可用于抑制裸鼠中多种人肿瘤细胞系的生长，并且还可在缺血性视网膜障碍模型中抑制眼内血管生成(Kim等人Nature[自然]362：841-844(1993)；Warren等人J.Clin.Invest[临床研究杂志]95：1789-1797(1995)；Borgstrom等人Cancer Res.[癌症研究]56：4032-4039(1996)；以及Melnyk等人Cancer Res.[癌症研究]56：921-924(1996))(Adamis等人Arch.Opthalmol.[眼科学文献]114：66-71(1996))。

包括抗VEGF抗体在内的许多抗体被批准用于人类和其他哺乳动物中的治疗性用途。液体药物配制品中治疗性抗体的浓度根据，例如施用途径，广泛地变化。当需要小体积时，通常需要高浓度的抗体配制品。例如，对于玻璃体内注射或皮下施用可能希望高浓度的配制品。

然而，具有高浓度抗体的配制品可能具有较短的保质期，并且所配制的抗体可能会由于储存期间的化学和物理不稳定性而丧失生物学活性。已知聚集、脱酰胺和氧化是抗体降解的最常见的原因。特别地，聚集可以潜在地导致患者免疫反应增加，从而导致安全性问题。因此，必须最小化或防止聚集。

生物治疗配制品中微粒的形成也是主要的质量问题，因为人的肉眼通常可以看到数十微米至亚毫米和毫米大小范围内的微粒(参见D_as，2012，AAPS PharmSciTech[AAPS制药科技]，13：732-746)。治疗性眼用制剂中的微粒，即使是只能通过显微镜或光阻法才能看到，也会对眼睛造成伤害。因此，存在监管标准以确保眼用配制品中的亚可见微粒物质含量在某些限制内。例如，美国药典委员会(USP)设定了对眼用溶液中微粒物质的要求，通过显微镜或光阻法颗粒计数确定的，例如直径≥10μm的最大颗粒数为50个/mL，直径≥25μm的最大颗粒数为5个/mL，且直径≥50μm的最大颗粒数为2个/mL(参见USP通则<789>)。

用于生产高浓度抗体配制品的方法是已知的。但是，尚不存在一种通用的方法来克服抗体的氨基酸序列对其在各种药物赋形剂、缓冲液等存在下形成聚集物或降解的趋势的不可预测的影响。此外，制备含有高浓度的包含可接受水平的亚可见颗粒的蛋白质(例如抗体)的眼用配制品具有挑战性且不可预测。对于溶解度受限的蛋白质，需要高剂量的蛋白质药物配制品的开发具有挑战性，并且还导致一些制造、稳定性、分析和递送方面的挑战。聚集的浓度依赖性降解途径是开发这些较高浓度的蛋白质配制品的最大挑战。除了潜在的非天然蛋白质聚集和微粒形成外，还可能发生可逆的自缔合，所述可逆的自缔合导致粘度等特性，所述粘度使通过注射的递送变得麻烦。此外，随着储存的时间的流逝(例如在冰箱或冰柜中)，水性蛋白质配制品可能变得混浊(_cl_oudy)或浑浊(t_urbid)。混浊和浑浊通常与配制品中蛋白质的聚集或结晶有关。强烈优选在蛋白质配制品中避免任何混浊或浑浊，以避免在注射或以其他方式将其递送给患者之前需要过滤或其他澄清配制品的方法。

本发明的目的是提供另外的以及改善的具有高浓度的抗VEGF抗体和低水平的抗体聚集和亚可见颗粒的配制品，所述配制品适合于对人，特别是对人眼施用，并且能避免混浊/浑浊/结晶。

发明内容

因此，本发明涉及包含适用于眼用注射的高浓度抗VEGF抗体的水性药物组合物。在某些方面，本发明的水性药物组合物展现出低至检测不到的水平的抗体聚集或降解，在制造、制备、运输和长期储存过程中极少甚至是没有生物活性损失，所述抗VEGF抗体的浓度是至少约50mg/ml、60mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、120mg/ml、140mg/ml、160mg/ml、180mg/ml、或200mg/ml。

本发明提供了包含抗VEGF抗体、稳定剂、缓冲剂和表面活性剂的水性药物组合物。在某些方面，作为水性药物组合物包含：(i)至少50mg/ml的抗VEGF抗体，(ii)作为稳定剂的糖(例如蔗糖)，(iii)柠檬酸盐或组氨酸缓冲液，以及(iv)作为表面活性剂的聚山梨醇酯80。

在某些方面，所述水性药物组合物包含：至少50mg/ml的包含SEQ ID NO：1和SEQID NO：2的序列的抗VEGF抗体、约4.5％至11％(w/v)的蔗糖、10-20_mM的柠檬酸盐缓冲液、以及0.001％至0.05％的聚山梨醇酯80(w/v)，其中所述组合物的pH为约7.0至7.6。

本发明的具体优选实施例将因以下某些优选实施例和权利要求书的更详细的描述而变得显而易见。

附图说明

图1：165天后，具有5％的PEG的配制品1至6(F1至F6)中的抗体1008。

具体实施方式

本发明提供了包含高浓度抗VEGF抗体的水性药物组合物。在某些实施例中，本发明的水性药物组合物在2℃-8℃下是稳定的，持续至少18个月，并且适合于向眼睛施用，包括注射或输注，例如眼睛施用，例如玻璃体内施用。

本发明提供了新颖的药物配制品，特别地其中包含针对人VEGF的抗体的活性成分的新颖的药物配制品。在一方面，本发明涉及具有高浓度抗VEGF抗体的水性药物组合物。本发明的配制品中优选的抗VEGF抗体描述于WO 2009/155724中，其全部内容通过引用并入本文。

如本文所使用的，术语“抗体”包括全抗体及其任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”、“抗原结合多肽”或“免疫结合剂”)或其单链。“抗体”包括含有由二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白、或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(在本文缩写为V_H)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(在本文缩写为V_L)和轻链恒定区构成。轻链恒定区包含一个结构域，CL。V_H和V_L区可以进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的高变区，其间穿插有被称为框架区(FR)的较保守的区域。每个V_H和V_L由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。

术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)是指保持特异性地结合抗原(例如VEGF)的能力的抗体的一个或多个片段。已经显示，全长抗体的片段可以执行抗体的抗原结合功能。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，其是由V_L、V_H、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，其是包含在绞链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段，(v)由V_H结构域组成的单结构域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature[自然]341：544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地由合成接头接合的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然F_v片段的两个结构域V_L和V_H是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法将这两个结构域通过能够使它们形成为单条蛋白质链的合成接头来相连，其中V_L区和V_H区配对形成单价分子(被称为单链F_v(_scF_v)；参见例如，Bird等人(1988)Science[科学]242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85：5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域的技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用来筛选这些片段。抗原结合部分可以通过重组DNA技术产生，或通过完整的免疫球蛋白的酶促或化学裂解产生。抗体可以属于不同的同种型，例如IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE、或IgM抗体。

在优选实施例中，本发明的水性药物组合物包含具有如SEQ ID NO：1所示序列的可变重链和具有如SEQ ID NO：2所示序列的可变轻链。

VH：SEQ ID NO：1

VL：SEQ ID NO：2

在另一个优选的实施例中，所述抗VEGF抗体是包含如SEQ ID NO：3所示的序列的单链Fv(scFv)抗体片段：

例如，可产生本发明的水性药物组合物中的抗VEGF抗体，如WO 2009/155724中所描述。如本文所描述，可使用表达载体产生scFv。衍生自表达载体中的起始密码子的甲硫氨酸在未经翻译后切割的情况下存在于最终蛋白质中：

在某些实施例中，本发明的水性药物组合物中的所述抗VEGF抗体分别包含如SEQID NO：5、6和7所示的重链HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO：8、9和10所示的轻链LCDR1、LCDR2和LCDR3。

CDR	SEQ ID	序列
			HCDR1	SEQ ID NO：5	GFSLTDYYYMT
HCDR2	SEQ ID NO：6	FIDPDDDPYYATWAKG
			HCDR3	SEQ ID NO：7	GDHNSGWGLDI
LCDR1	SEQ ID NO：8	QASEIIHSWLA
			LCDR2	SEQ ID NO：9	LASTLAS
LCDR3	SEQ ID NO：10	QNVYLASTNGAN

在一个实施例中，本发明的水性药物组合物中抗VEGF抗体的浓度为至少50mg/ml。优选地，本发明的所述水性药物组合物包含约50mg/ml、约60mg/ml、约70mg/ml、约80mg/ml、约90mg/ml、约100mg/ml、约110mg/ml、约120mg/ml、约130mg/ml、约140mg/ml、约150mg/ml、约160mg/ml、约170mg/ml、约180mg/ml、约190mg/ml、约200mg/ml、约210mg/ml、约220mg/ml、约230mg/ml、约240mg/ml、约250mg/ml、或约300mg/ml的抗VEGF抗体。

在某些实施例中，本发明的所述水性药物组合物包含在约60mg/ml和约120mg/ml之间的抗VEGF抗体(例如，包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的抗体)。

在一个实施例中，本发明的所述水性药物组合物包含在约60mg/ml和约120mg/ml之间的抗VEGF抗体(其包含SEQ ID NO：3)。

在一个实施例中，本发明的所述水性药物组合物包含约60mg/ml的抗VEGF抗体(其包含SEQ ID NO：3)。

在一个实施例中，本发明的所述水性药物组合物包含约90mg/ml的抗VEGF抗体(其包含SEQ ID NO：3)。

在另一个实施例中，本发明的所述水性药物组合物包含约120mg/ml的抗VEGF抗体(其包含SEQ ID NO：3)。

在一个实施例中，本发明的所述水性药物组合物包含在约60mg/ml和约120mg/ml之间的抗VEGF抗体(其包含SEQ ID NO：4)。

在一个实施例中，本发明的所述水性药物组合物包含约60mg/ml的抗VEGF抗体(其包含SEQ ID NO：4)。

在另一个实施例中，本发明的所述水性药物组合物包含约120mg/ml的抗VEGF抗体(其包含SEQ ID NO：4)。

如本文所使用的，术语“约”包括并描述了值或参数本身。例如，“约x”包括并描述了“x”本身。如本文所使用的，当与测量值结合使用或用于修饰值、单位、常数或一系列值时，术语“约”除了包括该值或参数本身外，还指±1％-10％的变化。在一些实施例中，当与测量值结合使用或用于修饰值、单位、常数或一系列值时，术语“约”指±1％、±2％、±3％、±4％、±5％、±6％、±7％、±8％、±9％或±10％的变化。

如本文所使用的，术语“在......之间”包括并描述值或参数本身。例如，“在x和y之间”包括并描述“x”和“y”。

如本文所使用的，术语“稳定的”是指如本文所描述的抗VEGF抗体在储存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术可在本领域中获得并且在例如以下的文献中做了综述：Peptide and Protein DrugDelivery[肽和蛋白质药物递送]，247-301，Vincent Lee编辑，Marcel Dekker，Inc.[马塞尔·德克尔公司]，出版于纽约(N.Y.)(1991)和Jones，A.Adv.Drug Delivery Rev.[先进药物递送综述]10：29-90(1993)。可以在选定的温度下测量稳定性，持续选定的时间段，例如使用本文所描述的AEX-HPLC(阴离子交换高效液相色谱法)。优选地，所述水性配制品在室温(约25℃)或40℃下是稳定的，持续至少1周，和/或在约2℃-8℃下是稳定的，持续至少3个月、至少12个月、至少18个月、或至少24个月。

如果如本文所描述的所述抗VEGF抗体在肉眼检查颜色和/或透明度时，或通过UV光散射、AEX-HPLC、或尺寸排阻色谱法(SEC)、或本领域已知的其他合适方法所测量的，满足聚集、降解、沉淀和/或变性的定义的明确的发布规范，则所述抗VEGF抗体在药物配制品中“保持其物理稳定性”。

特别地，如果抗VEGF抗体符合美国药典委员会通则<789>中规定的眼用溶液要求，则所述抗VEGF抗体保持其物理稳定性。在一个实施例中，相对于微粒物质的存在，本发明的水性药物组合物满足USP<789>要求。因此，在某些实施例中，本发明的水性药物组合物中直径≥10μm的最大颗粒数为50个/mL，本发明的水性药物组合物中直径≥25μm的最大颗粒数为5个/mL，且本发明的水性药物组合物中直径≥50μm的最大颗粒数为2个/mL，所述颗粒数由美国药典委员会通则<789>要求的光阻法和/或显微颗粒计数方法确定)。

如本文所使用的，术语“蛋白质聚集”是指形成更高分子量的蛋白质种类，例如寡聚体或多聚体，而不是生物药物需要的定义种类(例如，单体)。因此，蛋白质聚集是用于形成通过共价键或非共价相互作用形成的所有种类的未进一步定义的多聚体种类的通用术语。聚集物可以通过尺寸排阻色谱法(SE-HPLC或SEC)进行测量。在一个实施例中，水性药物配制品中所述抗VEGF抗体的聚集物低于定量限。

如果在室温(约25℃)或40℃下保存至少1周和/或在约2℃-8℃稳定至少3个月至18个月后本文所描述的抗VEGF抗体的纯度未降低或基本未降低，则所述抗VEGF抗体在水性药物配制品中“保持其稳定性”。所述抗VEGF抗体的稳定性可通过任何合适的方法来评估，例如尺寸排阻色谱法(SEC)、毛细管凝胶电泳和/或阴离子交换色谱法(AEX)。在一个实施例中，所述抗VEGF抗体在水性药物组合物中是稳定的，其中在室温(约25℃)或40℃下储存至少1周和/或在约2℃-8℃下储存至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、或至少18个月后评估，通过SEC评估的主峰损失％为≤5％、≤4％、≤3％、≤2％、≤1％、≤0.5％、≤0.4％、≤0.3％、≤0.2％或≤0.1％。在优选实施例中，所述抗VEGF抗体在约2℃-8℃下储存至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、或至少18个月后，通过SEC评估的主峰损失为≤0.5％、≤0.4％、≤0.3％、≤0.2％或≤0.1％。在特别优选的实施例中，所述抗VEGF抗体在约2℃-8℃下储存至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、或至少18个月后，通过SEC评估的主峰损失为≤0.1％。

在一个实施例中，所述抗VEGF抗体在水性药物组合物中是稳定的，其中在室温(约25℃)或40℃下储存至少1周和/或在约2℃-8℃下储存至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、或至少18个月后评估，通过毛细管凝胶电泳(例如在还原条件下(例如SDS))评估的HC和LC之和的损失％为≤5％、≤4％、≤3％、≤2％、≤1％、≤0.5％、≤0.4％、≤0.3％、或≤0.2％。在优选实施例中，所述抗VEGF抗体在约2℃-8℃下储存至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、或至少18个月后，通过毛细管凝胶电泳评估的HC和LC之和的损失为≤0.5％、≤0.4％、≤0.3％、或≤0.2％。在特别优选的实施例中，所述抗VEGF抗体在约2℃-8℃下储存至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、或至少18个月后，通过毛细管凝胶电泳评估的HC和LC之和的损失为≤0.2％。

在一个实施例中，所述抗VEGF抗体在水性药物组合物中是稳定的，其中在约2℃-8℃下储存至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、或至少18个月后，通过阴离子交换色谱法(AEX)评估的酸性峰的总和％为≤2％、≤1.9％、≤1.8％、≤1.7％、或≤1.6％。在优选实施例中，所述抗VEGF抗体在约2℃-8℃下储存至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、或至少18个月后，通过阴离子交换色谱法评估的酸性峰的总和为≤2％。在另一个实施例中，所述抗VEGF抗体在水性药物组合物中是稳定的，其中在约25℃下储存至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、或至少18个月后，通过阴离子交换色谱法(AEX)评估的酸性峰的总和％为≤6％、≤5％、或≤4％。

在一个实施例中，所述抗VEGF抗体在水性药物组合物中是稳定的，其中在约2℃-8℃下储存至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、或至少18个月后，通过阴离子交换色谱法(AEX)评估的碱性峰的总和％为≤2％、≤1.9％、或≤1.8％。在优选实施例中，所述抗VEGF抗体在约2℃-8℃下储存至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、或至少18个月后，通过阴离子交换色谱法评估的碱性峰的总和为≤2％。在另一个实施例中，所述抗VEGF抗体在水性药物组合物中是稳定的，其中，在约25℃下储存至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、或至少18个月后，通过阴离子交换色谱法(AEX)评估的碱性峰的总和％为≤6％、≤5％、或≤4％。

如果在效能测定中(例如在HUVEC增殖效能测定中)，在给定时间处的如本文所描述的抗VEGF抗体的生物学活性是在水性药物配制品被制备的时间处所表现出的生物学活性的约10％以内，则所述抗VEGF抗体在所述药物配制品中“保持其生物学活性”。效能分析的实例是竞争ELISA。例如，在竞争性ELISA中，可以测量如本文实例中所描述的1008与VEGFR2/Fc竞争生物素化的VEGF的能力。观察到的信号与1008的浓度成反比，因为增加量的1008可以有效地阻断生物素化的VEGF与其受体VEGFR2/Fc的结合。每个样品都可以在96孔微量滴定板中对照1008参考标准进行分析，并且可以观察到样品相对于参考标准的相对效能。

在一个实施例中，所述抗VEGF抗体在水性药物组合物中是稳定的，其中所述抗VEGF抗体的生物学活性与参考样品相比在约65％和135％之间，并且其中在约2℃-8℃下储存至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、或至少18个月后评估生物学活性。

如本文所使用的，“水性”药物组合物是适用于药物用途的组合物，其中所述水性载体是蒸馏水。适用于药物用途的组合物可以是无菌的、均质的和/或等渗的。水性药物组合物可以直接以水性形式制备，例如在准备使用的预填充注射器中，或在由包含本发明的药物组合物(所述“液体配制品”)的小瓶制备的注射器中，或作为在使用前不久有待重构的冻干物。如本文所使用的，术语“水性药物组合物”是指液体配制品或重构的冻干配制品。在某些实施例中，本发明的所述水性药物组合物适合于向人类受试者眼睛施用。在具体的实施例中，本发明的所述水性药物组合物适合于玻璃体内施用。

本发明的水性药物组合物包含除所述抗VEGF抗体外的另外的组分，例如以下中的一种或多种：(i)稳定剂；(ii)缓冲剂；(iii)表面活性剂；以及(iv)游离氨基酸。包含此类另外的组分中的每一种可以给出具有低聚集的抗VEGF抗体的组合物。优选地，本发明的所述水性药物组合物除所述抗VEGF抗体外，还包括：(i)稳定剂；(ii)缓冲剂；以及(iii)表面活性剂。

用于本发明的合适的稳定剂可以用作，例如增粘剂、膨胀剂、增溶剂和/或类似物。所述稳定剂可以是离子的或非离子的(例如糖)。作为糖，它们包括但不限于单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，例如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡萄糖醇)等。例如，所述糖可以是蔗糖、海藻糖、棉子糖、麦芽糖、山梨糖醇或甘露糖醇。所述糖可以是糖醇或氨基糖，例如蔗糖或海藻糖。优选蔗糖。作为离子稳定剂，它们可包括盐例如NaCl或氨基酸组分例如精氨酸-HCl。在优选实施例中，糖以在3％和11％(w/v)之间的浓度存在于本发明的水性药物组合物中。在某些实施例中，所述糖为蔗糖，浓度为约4.5％至约11％。在另外的实施例中，所述糖是蔗糖，浓度为约5.5％至约7.0％(w/v)的蔗糖。在另外的实施例中，所述糖是蔗糖，浓度为约5.5％至约6.8％(w/v)的蔗糖。在另外的实施例中，所述糖是海藻糖，浓度为约5％至约10％(w/v)。在优选实施例中，所述水性药物组合物包含浓度为5.8％(w/v)的蔗糖。在另一个优选的实施例中，所述水性药物组合物包含浓度为6.4％(w/v)的蔗糖。

适用于本发明的缓冲剂包括但不限于有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐；三盐酸盐或磷酸盐缓冲液、氨丁三醇(tromethamine)盐酸盐或磷酸盐缓冲液。此外，氨基酸组分也可以用作缓冲剂。柠檬酸盐或组氨酸缓冲液特别有用，包括10-20mM组氨酸缓冲液，例如0.13％至0.26％(w/v)的组氨酸和0.03％-0.07％(w/v)的组氨酸盐酸盐一水合物)，或10-20mM的柠檬酸盐缓冲液，例如0.006％至0.012％的柠檬酸(w/v)和0.2％至0.6％的柠檬酸钠(w/v)。用于本发明配制品的柠檬酸可以是任何水合形式，例如无水或一水合物。在优选实施例中，所述水性药物组合物包含浓度为在约1和60mM之间，例如在约10-40mM之间、在约15-30mM之间、在约15-25mM之间、在约10-20mM之间、在约10-15mM之间的缓冲剂。在某些实施例中，所述缓冲剂是柠檬酸盐或组氨酸。在优选实施例中，所述水性药物组合物包含约10-15mM柠檬酸钠，例如约0.01mg/mL的柠檬酸一水合物和约0.43mg/mL的柠檬酸钠二水合物。

所述水性药物组合物包含此类缓冲剂或pH调节剂以提供改善的pH控制。在某些实施例中，本发明的水性药物组合物的pH在7.0和7.6之间。在一个实施例中，本发明的水性药物组合物的pH为约7.0-7.5、或约7.0-7.4、约7.0-7.3、约7.0-7.2、约7.1-7.6、约7.2-7.6、约7.3-7.6或约7.4-7.6。在一个实施例中，本发明的水性药物组合物具有的pH为约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5或约7.6。在优选实施例中，所述水性药物组合物的pH≥7.0。在优选实施例中，所述水性药物组合物的pH为约7.2。在另一个优选的实施例中，所述水性药物组合物的pH为约7.4。在另一个优选的实施例中，所述水性药物组合物的pH为约7.6。

如本文所使用的，术语“表面活性剂”在本文中是指具有两亲结构的有机物质。可根据表面活性部分的电荷将表面活性剂分类为用于各种药物组合物和生物材料制剂的非离子、阴离子、阳离子和分散剂。

适用于本发明的表面活性剂包括但不限于非离子表面活性剂、离子表面活性剂和两性离子表面活性剂。用于本发明的典型表面活性剂包括但不限于，山梨糖醇脂肪酸酯(例如，山梨糖醇单辛酸酯、山梨糖醇单月桂酸酯、山梨糖醇单棕榈酸酯)、山梨糖醇三油酸酯、甘油脂肪酸酯(例如，甘油单辛酸酯、甘油单肉豆寇酸酯、甘油单硬脂酸酯)、聚甘油脂肪酸酯(例如，十甘油酯单硬脂酸酯、十甘油酯二硬脂酸酯、十甘油酯亚油酸酯)、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇三硬酯酸)、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯)、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯甘油单硬脂酸酯)、聚乙二醇脂肪酸酯(例如，聚乙二醇二硬脂酸酯)、聚氧乙烯烷基醚(例如，聚氧乙烯十二烷基醚)、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚(例如，聚氧乙烯聚氧丙烯乙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚、聚氧乙烯聚氧丙烯十六醚)、聚氧乙烯烷基苯基醚(例如，聚氧乙烯壬苯基醚)、聚氧乙烯氢化蓖麻油(例如，聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油)、聚氧乙烯蜂蜡衍生物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇蜂蜡)、聚氧乙烯羊毛脂衍生物(例如，聚氧乙烯羊毛脂)、以及聚氧乙烯脂肪酸酰胺(例如，聚氧乙烯硬脂酸酰胺)；C₁₀-C₁₈烷基硫酸盐(例如十六烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、油烯基硫酸钠)、平均添加2至4摩尔的环氧乙烷单元的聚氧乙烯C₁₀-C₁₈烷基硫酸醚(例如，聚氧乙烯十二烷基硫酸钠)、以及C₁-C₁₈烷基磺基琥珀酸酯盐(例如，十二烷基磺基琥珀酸酯钠)；以及天然表面活性剂，例如卵磷脂、甘油磷脂、磷酸鞘酯(例如，鞘磷脂)和C_12-18脂肪酸的蔗糖酯。组合物可包含这些表面活性剂中的一种或多种。优选的表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯例如聚山梨醇酯20、40、60或80。特别地优选聚山梨醇酯80。在一个实施例中，所述水性药物组合物包含0.001％至0.05％的聚山梨醇酯80(w/v)。在另一个实施例中，所述水性药物组合物包含0.001％至0.01％的聚山梨醇酯80(w/v)。在又另一个实施例中，所述水性药物组合物包含0.001％至0.005％的聚山梨醇酯80(w/v)。在优选实施例中，所述水性药物组合物包含0.001％、0.002％、0.003％、0.004％或0.005％的聚山梨醇酯80(w/v)。在一个实施例中，所述水性药物组合物包含0.001％的聚山梨醇酯80(w/v)。在一个实施例中，所述水性药物组合物包含0.002％的聚山梨醇酯80(w/v)。在一个实施例中，所述水性药物组合物包含0.003％的聚山梨醇酯80(w/v)。在一个实施例中，所述水性药物组合物包含0.004％的聚山梨醇酯80(w/v)。在一个实施例中，所述水性药物组合物包含0.005％的聚山梨醇酯80(w/v)。在另一个优选的实施例中，所述水性药物组合物包含0.01％至0.05％的聚山梨醇酯80(w/v)。在一个实施例中，所述水性药物组合物包含0.01％的聚山梨醇酯80(w/v)。在一个实施例中，所述水性药物组合物包含0.02％的聚山梨醇酯80(w/v)。在一个实施例中，所述水性药物组合物包含0.03％的聚山梨醇酯80(w/v)。在一个实施例中，所述水性药物组合物包含0.04％的聚山梨醇酯80(w/v)。在一个实施例中，所述水性药物组合物包含0.05％的聚山梨醇酯80(w/v)。

用于本发明的合适的游离氨基酸包括但不限于，精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨基酸或天冬氨酸。优选包含碱性氨基酸，即精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸。如果组合物包含组氨酸，则所述组合物既可以充当缓冲剂又可以充当游离氨基酸，但是当使用组氨酸缓冲液时，通常要包含非组氨酸游离氨基酸，例如要包含组氨酸缓冲液和赖氨酸。氨基酸可以以其D-和/或L-形式存在，但L-形式是典型的。所述氨基酸可以任何合适的盐的形式存在，例如盐酸盐，例如精氨酸-HCl。在一个优选的实施例中，本发明的水性药物组合物不包含任何此类游离氨基酸。

可用于本发明水性药物组合物中的其他预期赋形剂包括，例如，抗微生物剂，抗氧化剂，抗静电剂，脂质如磷脂或脂肪酸，类固醇如胆固醇，蛋白质赋形剂如血清白蛋白(人血清白蛋白)、重组人白蛋白、明胶、酪蛋白，成盐抗衡离子如钠等。适用于本发明的配制品中的这些和另外的已知的药物赋形剂和/或添加剂是本领域已知的，例如列于以下：″TheHandbook of Pharmaceutical Excipients[药物赋形剂手册]，第4版，Rowe等人编，American Pharmaceuticals Association[美国医药协会](2003)；以及Remington：theScience and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学的科学与实践]，第21版，Gennaro编，Lippincott Williams&Wilkins[威尔金斯出版公司](2005)。在一个实施例中，所述水性药物组合物包含NaCl。在一个实施例中，所述水性药物组合物包含120mM NaCl。在一个实施例中，所述水性药物组合物包含透明质酸(HA)。透明质酸包括但不限于分子量为500-700kDa的HA。在一个实施例中，所述水性药物组合物包含0.1％HA。在另一个实施例中，所述水性药物组合物包含0.2％HA。

在某些实施例中，预期将抗VEGF抗体冻干以提供用于治疗患者的本发明的水性药物组合物。

抗体的冻干技术是本领域已知的，例如参见John F.Carpenter和MichaelJ.Pikal，1997(Pharm.Res.[药物研究]14，969-975)；Xialin(Charlie)Tang和MichaelJ.Pikal，2004(Pharm.Res.[药物研究]21，191-200)。因此，在一个实施例中，提供了通过冻干本文所描述的水性药物组合物而制备的冻干配制品。在另一个实施例中，提供了用于制备冻干物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)制备包含如本文所描述的抗VEGF抗体的水性药物组合物，以及(ii)冻干所述水性溶液。

在可将冻干物施用于患者之前，应先用水性重构液将其重构。此步骤允许冻干物中的抗体和其他组分重新溶解以给出适合于向患者注射的溶液。

用于重构的水性材料的体积指示了所得药物组合物中抗体的浓度。与冻干前体积相比，用较小体积的重组液进行重构可提供比冻干前更浓缩的组合物。所述重构因子(冻干后配制品的体积：冻干前配制品的体积)可为从1∶0.5至1∶6。1∶3的重构因子是有用的。如上所述，可以将本发明的冻干物重构以给出具有浓度为至少50mg/ml(即，至少60、70、80、90、100、110、120或130mg/ml)的抗VEGF抗体的水性组合物，并且相应地选择重构液的体积。如果需要，可以在向患者施用前适当稀释重构的配制品，以递送预期剂量。

冻干抗体的典型重构液包括无菌水或缓冲液，任选地包含防腐剂。如果所述冻干物包含缓冲剂，则所述重构液可包含另外的缓冲剂(所述缓冲剂可以与冻干物的缓冲剂相同或不同)，也可以不包含缓冲剂(例如WFI(注射用水)，或生理盐水)。

本文所描述的水性药物组合物可以为液体形式。在优选实施例中，所述水性药物组合物是液体的形式。在一个实施例中，所述水性药物组合物以液体形式包含在小瓶中。

包含抗VEGF抗体的本发明的水性药物组合物可用于治疗多种疾病或障碍。包含抗VEGF抗体的药物组合物对于治疗受试者的新生血管性眼部疾病特别有用。

可使用本发明的水性药物组合物治疗的“新生血管性眼部疾病”包括与眼部新生血管性相关的病症、疾病或障碍，其包括但不限于：血管生成异常、脉络膜新生血管形成(CNV)、视网膜血管通透性、视网膜水肿、糖尿病性视网膜病变(特别是增殖性糖尿病性视网膜病变)、糖尿病性黄斑水肿、新生血管性(渗出性)年龄相关性黄斑变性(AMD)(包括与nAMD(新生血管性AMD)相关的CNV)、与视网膜缺血相关的后遗症、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、和后段新生血管形成。

本发明的水性药物组合物除了抗VEGF抗体外可包含另外的活性成分。另外的药理剂可包括，例如，可用于治疗眼部疾病的其他抗体。

术语“治疗(treat/treating/treatment)”在本文中使用时表示本文所描述的治疗手段。所述“治疗”的方法采用向需要此类治疗的受试者(例如，患有VEGF介导的眼部障碍的受试者或最终可能获得此类障碍的受试者)施用本发明的抗体，以预防、治愈、延迟障碍或复发的障碍，减轻障碍或复发的障碍的严重性，或改善障碍或复发的障碍的一种或多种症状，或者为了延长受试者的存活使其超过在没有这样的治疗下所预期的存活期。

本发明的水性药物组合物可向患者施用。如本文所使用的，术语“受试者”或“患者”是指人和非人哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、兔、猪、马、狗、猫、绵羊和牛。优选地，受试者或患者是人。

施用将通常通过注射器进行。因此，本发明提供了递送装置(例如，注射器)，所述递送装置包括本发明的药物组合物(例如，预填充的注射器)，以及包括注射器和小瓶的试剂盒，所述小瓶包括本发明的药物组合物。患者将接受有效量的所述抗VEGF抗体作为主要活性成分(即足以达到或至少部分达到所需效果的量)。如果治疗有效剂量甚至可以产生与该疾病相关的症状或病症的逐步变化，则该治疗有效剂量是足够的。治疗有效剂量不必完全治愈该疾病或完全消除症状。优选地，治疗有效剂量可以至少部分地遏制已经患有该疾病的患者的疾病及其并发症。对该用途有效的量取决于所治疗障碍的严重性和患者自身免疫系统的一般状况。

剂量可以由具有治疗该疾病或病症的普通技术的医生，使用已知的剂量调整技术容易地确定。例如，通过考虑所需的剂量体积和一种或多种施用方式来确定本发明的水性药物组合物中使用的抗VEGF抗体的治疗有效量。通常，治疗有效的组合物以每剂从0.001mg/ml至约200mg/ml的剂量施用。优选地，在本发明的方法中使用的剂量为约60mg/ml至约120mg/ml(即，约60、70、80、90、100、110或120mg/ml)。在优选实施例中，在本发明的方法中使用的抗VEGF抗体的剂量是60mg/ml或120mg/ml。

在某些实施例中，剂量直接施用至患者的眼睛。在一个实施例中，每只眼睛的剂量为至少约0.5mg至高达约6mg。每只眼睛的优选剂量包括约0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.2mg、1.4mg、1.6mg、1.8mg、2.0mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg、4.0mg、4.5mg、5.0mg、5.5mg、和6.0mg。剂量可以以适合眼睛施用的各种体积施用，例如50μl或100μl，例如，包括3mg/50μl或6mg/50μl。也可以使用更小的体积，包括20μl或更少，例如约20μl、约10μl、或约8.0μl。在某些实施例中，将2.4mg/20μl、1.2mg/10μl或1mg/8.0μl(例如1mg/8.3μl)的剂量递送至患者的每只眼睛，用于治疗或改善上文所述的一种或多种疾病和障碍。递送可，例如，通过玻璃体内注射或输注实现。

本发明还提供了用于作为药物使用的本发明的配制品(即水性药物组合物)，例如，用于在向患者递送抗体中使用，或用于在治疗或改善上述一种或多种疾病和障碍中使用。

本发明进一步提供了用于向患者递送抗VEGF抗体的方法，所述方法包括向患者施用本发明的水性药物组合物的步骤。

在某些实施例中，用于向患者递送本发明的抗VEGF抗体的方法包括以下步骤：(i)重构本发明的冻干物以给出水性配制品，以及(ii)向患者施用所述水性配制品。理想情况下，步骤(ii)在步骤(i)的24小时内(例如，12小时内、6小时内、3小时内、或1小时内)发生。

在一个实施例中，所述水性药物组合物包含在小瓶中。在另一个实施例中，所述水性药物组合物包含在递送装置内。在一个实施例中，这种递送装置是预填充的注射器。在一个实施例中，用于向患者递送抗VEGF抗体的方法包括通过玻璃体内注射施用所述水性药物组合物。

按以下编号对本发明的某些具体实施例进行了描述：

1.一种水性药物组合物，其包含至少50mg/ml至约120mg/ml的抗VEGF抗体、约4.5％至11％(w/v)的蔗糖、5-20mM的柠檬酸钠、和0.001％至0.05％的聚山梨醇酯80(w/v)，所述抗VEGF抗体包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列，其中所述组合物的pH为约7.0至约7.6。

2.根据实施例1所述的水性药物组合物，其中所述抗VEGF抗体包含SEQ ID NO：3的序列。

3.根据实施例1或2所述的水性药物组合物，其中所述抗VEGF抗体包含SEQ ID NO：4的序列。

4.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，其中所述组合物的pH为约7.0。

5.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，其中所述组合物的pH为约7.1。

6.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，其中所述组合物的pH为约7.2。

7.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，其中所述组合物的pH为约7.3。

8.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，其中所述组合物的pH为约7.4。

9.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，所述水性药物组合物包含0.004％的聚山梨醇酯80(w/v)。

10.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，所述水性药物组合物包含0.02％的聚山梨醇酯80(w/v)。

11.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，其中所述水性药物组合物包含在约60mg/ml和约120mg/ml之间的抗VEGF抗体。

12.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，所述水性药物组合物包含约60mg/ml的抗VEGF抗体。

13.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，所述水性药物组合物包含约120mg/ml的抗VEGF抗体。

14.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，所述水性药物组合物包含5.5％至7.0％(w/v)的蔗糖。

15.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，所述水性药物组合物包含10-12mM的柠檬酸盐缓冲液。

16.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，所述水性药物组合物包含5.9％(w/v)的蔗糖、10mM的柠檬酸钠、0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80，并且其中所述pH为约7.2。

17.根据实施例16所述的水性药物组合物，所述水性药物组合物包含6mg抗VEGF抗体。

18.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，所述水性药物组合物包含6.4％(w/v)的蔗糖、12mM的柠檬酸钠、0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80，并且其中所述pH为约7.2。

19.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，所述水性药物组合物包含5.8％(w/v)的蔗糖、10mM的柠檬酸钠、0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80，并且其中所述pH为约7.2。

20.根据实施例18或19所述的水性药物组合物，所述水性药物组合物包含3mg的抗VEGF抗体。

21.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，所述水性药物组合物进一步包含NaCl。

22.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，所述水性药物组合物进一步包含0.1％-0.5％的透明质酸(HA)。

23.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，其中所述组合物在2℃-8℃是稳定的，持续至少18个月。

24.根据前述实施例中任一项所述的水性药物组合物，其中所述组合物是液体。

25.一种用于向受试者递送抗VEGF抗体的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施例1-24中任一项所述的水性药物组合物。

26.一种用于治疗由VEGF介导的眼部疾病或障碍的方法，所述方法包括向受试者施用根据实施例1-24中任一项所述的水性药物组合物。

27.根据实施例26所述的方法，其中所述眼部疾病或障碍是眼部新生血管性疾病。

28.根据实施例24-27中任一项所述的方法，其中所述施用是玻璃体内的。

29.根据实施例1-24中任一项所述的水性药物组合物用于在向受试者递送抗VEGF抗体中使用，包括向所述受试者施用所述水性药物组合物的步骤。

30.根据实施例1-24中任一项所述的水性药物组合物，用于在治疗由VEGF介导的眼部疾病或障碍中使用，包括向受试者施用所述水性药物组合物。

31.用于根据实施例30所述使用的水性药物组合物，其中所述眼部疾病或障碍是眼部新生血管性疾病。

32.用于根据实施例29-31中任一项所述使用的水性药物组合物，其中所述施用是玻璃体内的。

33.一种剂型，其包含根据实施例1-24中任一项所述的水性药物组合物。

34.一种递送装置，其包含根据实施例1-24中任一项所述的水性药物组合物。

35.根据实施例34所述递送装置，所述递送装置是预填充的注射器。

技术人员认识到，本文中教导的特征、方面和实施例都可以彼此组合，并且组合来自文本的各个部分的特征和/或实施例的特定方面将被认为是向技术人员充分披露的。

应当理解的是，每个实施例可以与一个或多个其他实施例组合，直到达到此类组合与实施例的描述相一致的程度。还应理解，以上提供的实施例应理解为包括所有实施例，包括由实施例的组合产生的此类实施例。

除非另外说明，否则如本文所使用的所有百分比均为重量百分比。

如本文所使用的并且除非另外说明，术语“一个/一种”意指“一个/一种”、“至少一个/至少一种”或“一个或多个/一种或多种”。除非上下文另外要求，如本文所使用的单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。

如本文所使用的，术语“包含”涵盖“包括”以及“由......组成”和“基本上由......组成”，例如，包含X的组合物可以仅由X组成或可包括另外的一些，例如，X+Y。

除非上下文另外明确指明，否则术语“或”在本文中意指术语“和/或”并且可与术语“和/或”互换使用。

在整个说明书中引用的任何专利、专利申请和参考文献的内容通过引用以其全文并入本文。

通过考虑在此所披露的本发明的说明书和实践方式，本发明的其他实施例对本领域技术人员将是明显的。本说明书和实例旨在被认为仅是示例性的，而本发明的真正范围和精神由所附权利要求及其等效物来指示。

实例

以下实例描述了配制品开发的努力，这些努力旨在鉴定合适的稳定化方法和组合物以提供包含所述抗体1008的稳定、高度浓缩的溶液，从而使得玻璃体内(IVT)配制品可在冷藏条件下具有至少12个月的保质期，满足眼科产品的法规要求。

所述1008抗体是与人血管内皮生长因子A(VEGF-A)结合并抑制其生物学活性的单链抗体。所表达的1008的氨基酸序列为SEQ ID NO：4。

当将1008配制成含有0.05％聚山梨醇酯80(pH 6.75)的15mM柠檬酸三钠/柠檬酸中的等渗溶液时，可观察到的亚可见微粒浓度为120mg/ml 1008。该初始配制品的主要问题是微粒物质超过了用于注射的眼用溶液的法规限制(USP<789>)。

以下实例概述了在2℃-8℃的温度下稳定储存至少18个月的60和120mg/ml 1008玻璃体内(IVT)溶液的配制品开发。所述配制品开发的努力的重点是抑制亚可见颗粒的形成，并满足USP对含量、纯度和效能的要求。

分析方法

以下方法用于所示的整个实例部分中。

微流成像(MFI)方法

用于分析针对60mg/ml优化研究的辅料筛选、研究1和研究2的MFI方法如下：

所使用的总样品量：0.50mL

清洗体积：0.20mL

分析体积：0.26mL

优化照明步骤是使用纯净的过滤后的无颗粒水进行的。

用于分析120mg/ml 1008研究3和研究4的MFI方法：

所使用的总样品量：0.80mL

清洗体积：0.23mL

分析体积：0.48mL

优化照明步骤是使用纯净的过滤后的无颗粒水进行的。

SEC方法

SE-HPLC(尺寸排阻色谱法)根据蛋白质的大小分离蛋白质。随着样品分子通过多孔颗粒固定相，通过差异排阻(differential exclusion)或包含样品分子来实现分离。能够维持0.25ml/分钟的流速和4℃的样品温度的高效液相色谱系统配备了TOSOHSuperSW3000柱(托索生物科学有限公司(Tosoh Bioscience LLC)，普鲁士王市，宾夕法尼亚州)和能够同时以214nm和280nm操作的检测器。该方法用于纯度测试。

AEX-HPLC方法

AEX-HPLC(阴离子交换高效液相色谱)可根据蛋白质净电荷分离蛋白质。此程序使用高效液相色谱(HPLC)进行，所述高效液相色谱能够保持0.8ml/min的流速，并带有一个包含强阴离子交换柱的温度控制柱区室(设定为25℃)、自动进样器(设定为4℃)以及可变波长UV检测器(能够在280nm下操作)。

CGE方法

实施毛细管凝胶电泳方法用于确定通过SDS凝胶毛细管电泳的分子量在10kDa和225kDa之间的蛋白质的身份和纯度。用贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)0.2％SDS凝胶缓冲液(pH为8)专有配制品动态填充所述毛细管。将蛋白质通过分子筛电泳进行分离。蛋白质分子量的对数与其相互的电泳迁移率呈线性关系。通过将蛋白质的迁移与分子量标准进行比较来确定蛋白质的身份。通过母峰和杂质的面积百分比分析来确定纯度。使用光电二极管阵列检测器(PDA)分析220nm处的样品。

实例1

6种配制品的配制品筛选研究

实施配制品筛选研究以鉴定一种合适的配制品以解决1008以120mg/mL的浓度储存时所观察到的结晶/混浊/浑浊形成的问题。

对具有不同量的盐(0和120mM NaCl)、聚山梨醇酯80(PS80)(0.05％和0.004％)以及pH值(6.8、7.0、7.3和7.6)的五种配制品(F2-F6)进行测定并与对照(F1)比较。表1提供了关于配制品F1至F6的组合物的详细信息。

表1.配制品筛选

浑浊度和pH

在配制品2中，在具有120mM NaCl浓度、pH 6.8、40℃的条件下4周后观察到浑浊度增加(错误！找不到参考来源。)。在错误！找不到参考来源中，所述结果与pH相关，这表明了pH作用。配制品4和5在pH为7.3下用较高和较低浓度的聚山梨醇酯80进行配制。这两种配制品(F4和F5)的浑浊度值在所有时间点和条件(表2)下彼此之差都在个位数以内，并且不认为这些值有显著差异。从数据中可以看到pH作用，其中较高的pH值对应于较低的浑浊度。与不含NaCl的配制品相比，含NaCl的配制品F2在5℃和25℃时也观察到稍高的浑浊度。对于所有六种配制品，目标pH均应在5℃和25℃下稳定保存长达12个月。所有pH值均在目标pH的可接受范围内。

通过光阻法的亚可见颗粒

在5℃和25℃下长达52周的所有配制品的颗粒计数均在USP<789>限制内。使用非USP小体积光阻法进行测量。配制品之间未观察到差异。

通过SEC评估的纯度/主峰

通过尺寸排阻色谱法(SEC)评估的纯度在5℃下经12个月保持稳定，未观察到任何配制品的明显降低。在25℃下，随着pH的增加和聚山梨醇酯80的增加，观察到通过SEC评估的主峰纯度显著下降。总体而言，所述模型表明，对于通过SEC评估的主峰，聚山梨醇酯80的影响比pH更为显著。在25℃下通过SEC评估的最大化主峰纯度的配制品是那些含有低聚山梨醇酯80浓度且pH值为6.8和7.0的配制品。主峰的下降主要是由于通过SEC评估的聚集物的形成。

通过AEX评估的纯度/主峰

通过阴离子交换色谱法(AEX)评估的纯度在5℃下稳定性经12个月有所下降(在5℃下经12个月AEX纯度下降约1％)。在加速和应力稳定性条件下，观察到AEX纯度显著下降(在25℃下，经6个月AEX纯度下降了约12％)。AEX主峰的变化主要由温度和时间驱动。pH设定点之间未观察到相关差异。在5℃和25℃下通过AEX观察到NaCl对F2配制品(pH 6.8、0.004％PS80、120mM NaCl)的作用，这表明NaCl具有稳定作用，并最小化了由于温度应力引起的AEX纯度降低。通过AEX评估的纯度在40℃下在长达6周的时间里降低了约27％。与具有较低聚山梨醇酯80浓度(0.004％)的配制品相比，较高的聚山梨醇酯80浓度(0.05％)导致主峰纯度显著降低。在40℃(4周)时，所有六种配制品的组合纯度数据(SEC和AEX)均显示，随着pH的增加和聚山梨醇酯80浓度的增加，纯度降低。

通过CE-SDS评估的纯度/主峰

通过毛细管电泳十二烷基硫酸钠(CE-SDS)在还原条件下评估的抗体1008的纯度在5℃下经12个月下降了约0.7％。在加速条件下，通过CE-SDS在还原条件下评估的抗体1008纯度在25℃下在长达6个月内降低了约5％，并确认片段化水平随pH的增加而增加，但对聚山梨醇酯80浓度无影响。

总体而言，针对pH、离子强度和聚山梨醇酯80浓度的稳定性结果证实，pH和聚山梨醇酯80浓度在所有温度下都是最重要的因素。具有较高pH值和较高聚山梨醇酯80的配制品导致通过SEC和AEX评估的较低的纯度。盐的添加对稳定性的影响最小，对亚可见微粒没有相关影响。表2总结了长达12个月(52周)的配制品稳定性研究的所有分析结果。

表2.配制品筛选稳定性的分析结果

表2续

PEG模型测定

开发PEG模型以能够快速选择针对120mg/mL的抗体1008的合适配制品。首先，定义合适的PEG浓度，在所述浓度下，原始配制品(pH为6.8)中的抗体1008在2℃-8℃下储存约7天后将形成可见的晶体。制备以下浓度的PEG：1％、2％、4％、5％、6％和8％。

表3.PEG测定-浓度选择

将PEG沉淀直接添加至抗体1008，并通过磁力搅拌溶解约10分钟。针对每种PEG浓度各制备含有1mL的五个小瓶，并将所述小瓶在两个温度条件下保存-温度(2℃-8℃，循环且在40℃下稳定)。每天肉眼观察每个小瓶持续1周。所有含有8％PEG配制品的小瓶在48小时后均显示出固体结晶形成，然后观察到分离为两相。对于PEG 6％小瓶，3个小瓶在第3天开始结晶，并且所有5个小瓶在6天后均形成白色固体晶体。对于5％PEG样品，所有小瓶均在第6天开始结晶。对于PEG 4％小瓶，5瓶中的4瓶在第8天开始结晶，并且第5瓶在30天后结晶。PEG 1％和2％的小瓶30天后均保持澄清。基于这些结果，选择所述5％PEG浓度用于进一步的筛选研究。

如表1中所描述，针对配制品1至6各制备含有1mL的五个小瓶，每天对每个小瓶进行肉眼观察。研究设计和测试条件如表4描述，并且165天(5.5个月)后的结果如图1所示。所有F1小瓶(对照，pH 6.8)7天后出现沉淀。F2小瓶(120mM NaCl，pH 6.8)在19天后开始沉淀，并且F3小瓶(pH 7.0)在22天后开始沉淀。剩下配制品(F4、F5以及F6)的所有小瓶在165天后均保持澄清。基于这项研究，pH 7.0下的结晶时间比对照缩短了三倍(长达22天)，而pH更高(7.3至7.6)的则缩短更多(所有F4、F5、F6小瓶在165天(5.5个月)后仍保持澄清)。较高的pH(＞7.0)水平与避免结晶相关。NaCl的存在也与避免结晶有关，但影响的持续时间较短。

表4.使用5％PEG的配制品筛选研究

稳健性研究

设计120mg/mL的抗体1008的稳健性研究以确认所选择的pH和聚山梨醇酯80浓度。选择目标pH为7.2(最小pH为7.0)以最小化化学降解、聚集和晶体形成的风险，并在制造和长期储存期间允许最小pH范围±0.2。选择目标聚山梨醇酯80的浓度为0.02％以最小化聚集并允许足够量的聚山梨醇酯80以最小化吸附并保持均质。选择十种配制品，其中配制品1(F1)作为对照，所述十种配制品含有不同量的聚山梨醇酯80(0.01％、0.03％以及目标量0.02％)和pH值(7.0-7.4、目标值7.2)。此外，所有样品在室温下均以250rpm的速度振荡3天，然后使其稳定放置以模拟制造操作和实际的运输条件。表5总结了用于配制品筛选的组分的浓度。此外，所有配制品进一步包含5.9％的蔗糖和10mM的柠檬酸钠缓冲液。

表5.用于稳健性研究的配制品

样品ID	抗体1008	pH	聚山梨醇酯80
				F1(对照)	120mg/ml	6.8	0.05％
F2	120mg/ml	7.0	0.01％
				F3	120mg/ml	7.0	0.02％
F4	120mg/ml	7.0	0.03％
				F5	120mg/ml	7.2	0.01％
F6(目标)	120mg/ml	7.2	0.02％
				F7	120mg/ml	7.2	0.03％
F8	120mg/ml	7.4	0.01％
				F9	120mg/ml	7.4	0.02％
F 10	120mg/ml	7.4	0.03％

在25℃(T＝0)下经振荡应力处理3天后，针对所有聚山梨酯80和pH水平，如通过SEC和AEX评估的纯度均未降低。振荡3天后，对于F1(对照)以及具有较低聚山梨醇酯80(0.01％)的F5和具有较高pH(7.4)的F9，观察到微粒物质计数增加了超过10微米。这对于F6不可见。以下表6A和6B中总结了在振荡3天时的稳健性研究的分析结果。

表6A.针对10种不同配制品(振荡后T0和T3天)的稳健性研究的分析结果

表6B.针对10种不同配制品(振荡后T0和T3天)的稳健性研究的分析结果

在5℃和25℃下的长达52周的稳定性时间点，针对所有配制品，尺寸范围在＞10μm和＞25μm内的颗粒计数分别远低于50个颗粒/mL和5个颗粒/mL的USP<789>限制。在2℃-8℃下储存的120mg/mL的所有配制品浑浊水平的平均值为从5至12NTU，其中在初始时间点的一个异常值为18NTU(F4)(经SEC和AEX评估，对于所有聚山梨醇酯80和25℃(T＝0)下的pH水平，在3天的震荡压力下纯度没有降低。振荡3天后，对于Fl(对照)以及具有较低聚山梨醇酯80(0.01％)的F5和具有较高pH(7.4)的F9，观察到微粒物质计数增加了超过10微米。这对于F6不可见。以下表6A和6B中总结了在振荡3天时的稳健性研究的分析结果。表6)。在稳定储存3个月后，溶液中的浑浊水平从10.8略下降至6.3NTU。超过此时间点，在长达52周的时间内任何配制品均无明显变化。对于任何配制品，均未观察到颜色和pH值的相关变化。关于通过AEX和SEC评估的主峰纯度，所有配制品均显示出最小的变化(经52周下降了约1.1％-1.2％)。没有可观察到的差异，这表明所述配制品在2℃-8℃下储存经12个月仍保持稳健。

通过SEC评估的纯度：没有观察到聚集物水平的相关变化，观察到的最大变化为0.1％。单体峰＞99％，并且在2℃-8℃下储存经12个月几乎没有变化。

通过SEC评估的聚集：由于通过SEC评估的聚集水平低于定量限，所有配制品在2℃-8℃下经12个月仍保持稳定。

通过CE-SDS评估的纯度：在5℃下，经12个月观察到了小幅下降(约1％)，对于pH较高的配制品而言，这种下降更为明显。聚山梨醇酯80中的浓度不依赖于片段的形成。纯度数据(25℃，6个月)证实了片段化水平随pH的增加而升高。未见聚山梨醇酯80浓度对通过CE-SDS评估的纯度具有影响。

下表7总结了稳健性研究的分析结果。

表7.针对10种配制品的稳健性研究的分析结果(T2W、T4W、T5W、T3M、T6M、T9M以及T12M)

表7续

已经详细地描述了本发明及其实施例。然而，本发明的范围不意图限于本说明书中描述的任何方法、制成品、物质组合物、化合物、手段、方法和/或步骤的具体实施例。可在不脱离本发明的精神和/或本质特征的情况下对所公开的材料做出各种修改、替换和变化。因此，本领域的普通技术人员将容易地从本公开了解，可根据本发明的此类相关实施例，利用与本文所描述的实施例执行基本上相同的功能或实现基本上相同结果的随后的修改、替换和/或变化。因此，以下权利要求书意图在其范围内涵盖对本文公开的方法、制成品、物质组合物、化合物、手段、方法和/或步骤的修改、替换和变化。除非对其另有说明，否则不应将权利要求书理解为限于所描述的顺序或要素。应当理解的是，在不脱离所附权利要求书的范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。