ES2861592T3 - Anticuerpos estables y solubles que inhiben el TNF - Google Patents

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Tea Gunde
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Abstract

Un inmunoligante que se une específicamente al TNFα humano, comprendiendo el inmunoligante: (i) una secuencia de marco variable de cadena pesada humana y secuencias de CDR H1, CDR H2 y CDR H3 que proceden de un inmunoligante de conejo, en donde el marco de la región variable de cadena pesada humana tiene al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 90, en donde el marco de la región variable de la cadena pesada comprende uno o más de los siguientes aminoácidos: treonina (T) en la posición 24, valina (V) en la posición 25, alanina (A) o glicina (G) en la posición 56, lisina (K) en la posición 82, treonina (T) en la posición 84, valina (V) en la posición 89 y arginina (R) en la posición 108 (numeración AHo); y (ii) una secuencia de marco variable de la cadena ligera humana y secuencias de CDR L1, CDR L2 y CDR L3 que proceden de un inmunoligante de conejo, en donde la secuencia de marco de la región variable de la cadena ligera humana tiene al menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 91, en donde las secuencias de dicha CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 y CDR L3 que proceden de un inmunoligante de conejo son: SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos estables y solubles que inhiben el TNF
Antecedentes de la Invención
El factor de necrosis tumoral alfa (TNFa, también conocido como caquectina), es una citoquina de mamíferos que se produce de forma natural y es producido por numerosos tipos de células, incluyendo monocitos y macrófagos en respuesta a endotoxinas u otros estímulos. TNFa es un mediador importante de las reacciones inflamatoria, inmunológica y patofisiológica (Grell, M., et al. (1995) Cell, 83: 793-802).
El TNFa soluble se forma mediante la escisión de una proteína transmembrana precursora (Kriegler, et al. (1988) Cell 53: 45-53), y los polipéptidos de 17 kDa secretados se ensamblan en complejos homotrímeros solubles (Smith, et al.(1987), J. Biol. Chem. 262: 6951-6954; para revisiones de TNFA, véase Butler, et al. (1986), Nature 320:584; Old (1986), Science 230: 630). Estos complejos se unen luego a receptores que se encuentran en una diversidad de células. La unión produce una serie de efectos pro-inflamatorios, incluyendo (i) la liberación de otras citoquinas pro­ inflamatorias, tales como interleuquina IL-6, IL-8 e IL-1, (ii) la liberación de metaloproteinasas de la matriz y (iii) la regulación positiva de la expresión de moléculas de adhesión endotelial, amplificando adicionalmente la cascada inflamatoria e inmune al atraer leucocitos hacia los tejidos extravasculares.
Un gran número de trastornos está asociado con niveles elevados de TNFa, muchos de ellos de importancia médica significativa. Se ha demostrado que el TNFa está regulado positivamente en un cierto número de enfermedades humanas, incluyendo enfermedades crónicas, tales como la artritis reumatoide (RA), trastornos inflamatorios del intestino, incluyendo la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, sepsis, insuficiencia cardíaca congestiva, asma bronquial y esclerosis múltiple. Ratones transgénicos para el TNFa humano producen niveles elevados de TNFa de forma constitutiva y desarrollan una poliartritis destructiva espontánea que se asemeja a la RA (Keffer et al. 1991, EMBO J., 10,4025-4031). Por lo tanto, al TNFa se le alude como una citoquina pro-inflamatoria.
El TNFa está ahora bien establecido como clave en la patogénesis de la RA, que es una enfermedad crónica, progresiva y debilitante, caracterizada por inflamación y destrucción de las articulaciones poliarticulares, con síntomas sistémicos de fiebre, malestar y fatiga. La RA también conduce a una inflamación sinovial crónica, con progresión frecuente a la destrucción del cartílago articular y del hueso. Se encuentran niveles elevados de TNFa tanto en el líquido sinovial como en la sangre periférica de pacientes que padecen RA. Cuando se administran agentes bloqueadores de TNFa a pacientes que padecen RA, estos reducen la inflamación, mejoran los síntomas y retrasan el daño articular (McKown et al. (1999), Arthritis Rheum. 42:1204-1208).
Fisiológicamente, el TNFa también está asociado con la protección de infecciones particulares (Cerami. et al. (1988), Immunol. Today 9:28). El TNFa es liberado por macrófagos que han sido activados por lipopolisacáridos de bacterias Gram-negativas. Como tal, el TNFa parece ser un mediador endógeno de importancia central implicado en el desarrollo y la patogénesis del choque endotóxico asociado con la sepsis bacteriana (Michie, et al. (1989), Br. J.Surg.76:670-671.; Debets. et al. (1989), Second Vienna Shock Forum, p. 463-466; Simpson, et al. (1989) Crit. Care Clin. 5: 27-47; Waage et al. (1987). Lancet 1: 355-357; Hammerle. et al. (1989) Second Vienna Shock Forum p. 715­ 718; Debets. et al. (1989), Crit. Care Med. 17:489-497; Calandra. et al. (1990), J. Infect Dis. 161:982-987; Revhaug et al. (1988), Arch. Surg. 123:162-170).
Al igual que con otros sistemas de órganos, también se ha demostrado que el TNFa juega un papel clave en el sistema nervioso central, en particular en los trastornos inflamatorios y autoinmunes del sistema nervioso, incluyendo la esclerosis múltiple, el síndrome de Guillain-Barré y la miastenia grave, y en los trastornos degenerativos. del sistema nervioso, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington. El TNFa también está implicado en trastornos de sistemas relacionados de la retina y del músculo, incluyendo neuritis óptica, degeneración macular, retinopatía diabética, dermatomiositis, esclerosis lateral amiotrófica y distrofia muscular, así como en lesiones del sistema nervioso, incluyendo lesión cerebral traumática. lesión aguda de la médula espinal y apoplejía.
La hepatitis es otro trastorno inflamatorio relacionado con el TNFa que, entre otros factores desencadenantes, puede ser provocado por infecciones virales, incluyendo los virus de Epstein-Barr, citomegalovirus y hepatitis A-E. La hepatitis provoca inflamación aguda del hígado en la región portal y lobular, seguida de fibrosis y progresión del tumor. El TNFa también puede mediar en la caquexia en el cáncer, que provoca la mayor parte de la morbilidad y mortalidad por cáncer (Tisdale M.J. (2004), Langenbecks Arch Surg. 389:299-305).
El papel clave que juega el TNFa en la inflamación, las respuestas inmunitarias celulares y la patología de muchas enfermedades ha conducido a la búsqueda de antagonistas de TNFa. Una clase de antagonistas de TNFa diseñada para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNFa son los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente a TNFa y con ello bloquean su función. El uso de anticuerpos anti-TNFa ha demostrado que un bloqueo de TNFa puede revertir los efectos atribuidos al TNFa, incluyendo la disminución de IL-1, GM-CSF, IL-6, IL-8, moléculas de adhesión y destrucción de tejidos(Feldmann et al. (1997), Adv. Immunol. 1997:283-350). Entre los inhibidores específicos de TNFa que se han comercializado recientemente se incluye un anticuerpo monoclonal quimérico de ratón-humano dirigido contra TNFa (infliximab, Remicade™; Centocor Corporation/Johnson & Johnson) que ha demostrado eficacia clínica en el tratamiento de la RA y la enfermedad de Crohn. Todos los inhibidores comercializados de TNFa se administran por vía intravenosa o subcutánea en intervalos semanales o más largos como inyecciones de bolo, lo que da como resultado concentraciones de partida altas que disminuyen de manera constante hasta la siguiente inyección. Su volumen de distribución es limitado.
A pesar de estos avances, sigue existiendo la necesidad de formas nuevas y eficaces de anticuerpos u otros inmunoligantes para el tratamiento de trastornos asociados al TNFa, tales como RA. En particular, existe una necesidad urgente de inmunoligantes con propiedades funcionales óptimas para el tratamiento eficaz y continuo de la artritis y otros trastornos mediados por TNFa que permitan una administración y formulación más flexibles y tengan una penetración tisular mejorada y, con ello, un volumen de distribución incrementado.
Sumario de la Invención
Por lo tanto, es un objeto general de la invención proporcionar un anticuerpo estable y soluble u otro inmunoligante, que se una específicamente al TNFa in vitro e in vivo. En una realización preferida, dicho inmunoligante es un anticuerpo scFv o un fragmento Fab.
La presente invención proporciona anticuerpos scFv estables y solubles y fragmentos Fab específicos para TNFa, que comprenden secuencias de cadena ligera y de cadena pesada específicas que están optimizadas para estabilidad, solubilidad, unión in vitro e in vivo de TNFa y baja inmunogenicidad. Dichos anticuerpos están diseñados para el diagnóstico y/o tratamiento de trastornos mediados por TNFa. También se describen ácidos nucleicos, vectores y células huéspedes para la expresión de los anticuerpos recombinantes de la invención, los métodos para aislarlos y el uso de dichos anticuerpos en medicina.
Breve Descripción de los Dibujos
La Figura 1 representa la capacidad relativa de los sobrenadantes de 44 hibridomas RabMab anti-TNF de unirse al TNFa (ensayo Biacore) y neutralizar su actividad (ensayo L929).
La Figura 2 representa la capacidad de 20 anticuerpos de cadena sencilla RabMab anti-TNF y 7 anticuerpos de cadena sencilla anti-TNF humanizados en la unión selectiva de TNFa (ensayo de secreción ELISA, téngase en cuenta que para este ensayo se utilizó sobrenadante de cultivo bacteriano, que no fue normalizado para el contenido de anticuerpos de cadena sencilla).
La Figura 3 representa la cinética de unión (Figura 3A) de EP43max y la cinética de unión (Figura 3B) de EP34max a TNF alfa humano.
La Figura 4 representa la potencia de EP43max (cuadrados blancos) la potencia (círculos negros) de ESBA105. La Ce 50 de EP43max es 1 ng/ml y la CE50 de ESBA105 es 6,5 ng/ml.
La Figura 5 representa el rendimiento de EP43max, EP6max y EP19max en un ensayo de despliegue térmico (FTIR).
La Figura 6 representa las curvas de desnaturalización térmica de EP43max y derivados del mismo en comparación mediante análisis FTIR.
La Figura 7 representa la comparación de EP43max (Figura 7A) y su variante EP43minmax (Figura 7B) en una prueba de esfuerzo térmico.
La Figura 8 representa la definición de CDR H1 utilizada en esta memoria para injertar sitios de unión a antígenos de anticuerpos monoclonales de conejo en los marcos de anticuerpos humanos altamente solubles y estables.
La Figura 9a ilustra la potencia de Epi34max y Adalimumab para bloquear la actividad citotóxica de 1000 pg/ml de TNFalfa humano recombinante (células L929 murinas). Se determinó que la CI50 para Ep34max y Adalimumab era 1,03 ng/ml y 8,46 ng/ml, respectivamente. La Figura 9b ilustra la potencia de Adalimumab y Epi34max para bloquear la actividad citotóxica de 10 pg/ml de TNFalfa humano recombinante (células Kym-1 humanas). Se determinó que la CI50 para Infliximab y Ep34max (791) era 66,2 ng/ml y 0,69 ng/ml, respectivamente.
La Figura 10a ilustra la potencia de Epi34max e Infliximab para bloquear la actividad citotóxica de 1000 pg/ml de TNFalfa humano recombinante (células L929 murinas). Se determinó que la CI50 para Ep34max e Infliximab era 1,04 ng/ml y 13,9 ng/ml, respectivamente. La Figura 10b ilustra la potencia de Infliximab y Epi34max (791) para bloquear la actividad citotóxica de 10 pg/ml de TNFalfa humano recombinante (células Kym-1 humanas). Se determinó que la CI50 para Infliximab y Ep34max era14,8 ng/ml y 0,63 ng/ml, respectivamente.
La Figura 11 ilustra el perfil de desnaturalización térmica de BioATR FT-IR ajustado a partir de los espectros infrarrojos transformados de Fourier en la región de la banda de amida I de Ep34max en comparación con ESBA903. La V50 para ESBA903 fue 71,12 y para EP34max 71, 50; la pendiente o ESBA9032,481 y 2,540 para EP34max.
La Figura 12 ilustra las curvas de despliegue térmico DSC de los anticuerpos scFv Ep34max y ESBA903. La Tm de EP 34max es 78,11°C y la Tm para ESBA903 es 76,19°C.
Descripción Detallada de la Invención
Es un objeto general de la invención proporcionar un inmunoligante estable y soluble que se una específicamente al TNFa in vitro e in vivo. En una realización preferida, dicho derivado de anticuerpo es un anticuerpo scFv o un fragmento Fab. Los inmunoligantes de la invención comprenden preferiblemente una cadena ligera y/o pesada.
D efin iciones
Con el fin de que la presente invención pueda entenderse más fácilmente, determinados términos y expresiones se definirán como sigue. A lo largo de la descripción detallada se recogen definiciones adicionales.
El término "anticuerpo", tal como se utiliza en esta memoria, es sinónimo de "inmunoglobulina". Anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden ser inmunoglobulinas enteras o fragmentos de las mismas, que comprenden al menos un dominio variable de una inmunoglobulina, tales como dominios variables individuales, Fv (Skerra A. y Pluckthun, A. (1988) Science 240:1038-41), scFv (Bird, R.E. et al. (1988) Science 242:423-26; Huston, J.S. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83), Fab, (Fab')2 u otros fragmentos bien conocidos por un experto en la técnica.
El término "CDR" se refiere a una de las seis regiones hipervariables dentro de los dominios variables de un anticuerpo que contribuyen principalmente a la unión del antígeno. Una de las definiciones más comúnmente utilizadas para las seis CDR fue proporcionada por Kabat E.A, et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242). Tal como se utiliza en esta memoria, la definición de Rabat de CDR's solo se aplica para CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena ligera (CDR L1, CDR L2, CDR L3 o L1, L2, L3), así como para CDR2 y CDR3 del dominio variable de la cadena pesada (c Dr H2, CDR H3 o H2, H3). Sin embargo, la CDR1 del dominio variable de la cadena pesada (CDR H1 o H1), tal como se utiliza en esta memoria, se define mediante los siguientes residuos (numeración según Kabat): Comienza con la posición 26 y termina antes de la posición 36. Esto es básicamente una fusión de CDR H1 según se define de manera diferente por Kabat y Chotia (véase también la Figura 8 para la ilustración).
La expresión "marco de anticuerpo", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la parte del dominio variable, ya sea VL o VH, que sirve como un armazón para los bucles de unión a antígeno (CDRs) de este dominio variable. En esencia, es el dominio variable sin las CDRs.
La expresión "anticuerpo de cadena sencilla", "Fv de cadena sencilla" o "scFv" pretende hacer referencia a una molécula que comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (o región; Vh) y un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (o región; Vl) conectada por un enlazador. Moléculas de scFv de este tipo pueden tener las estructuras generales: NH2-VL-enlazador-VH-COOH o NH2-VH-enlazador-VL-COOH.
El término "inmunoligante" se refiere a una molécula que contiene todo o parte del sitio de unión al antígeno de un anticuerpo, p. ej,. todo o parte del dominio variable de la cadena pesada y/o ligera, de modo que el inmunoligante reconoce específicamente un antígeno diana. Ejemplos no limitantes de inmunoligantes incluyen moléculas de inmunoglobulina de longitud completa y scFvs, así como fragmentos de anticuerpos, que incluyen, pero no se limitan a (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fab'; (iv) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Ch1; (v) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (vi) un anticuerpo de dominio único como un fragmento Dab que consiste en un dominio Vh o Vl, un anticuerpo camélido o un anticuerpo de tiburón (p. ej.,., Nanobodies® de Ig-NARs de tiburón); y (vii) un nanocuerpo, una región de cadena pesada que contiene el dominio variable y dos dominios constantes.
Los sistemas de numeración tal como se utilizan en esta memoria para identificar posiciones de residuos de aminoácidos en las regiones variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo corresponden al definido por A. Honegger, J.Mol.Biol. 309 (2001) 657-670 (el sistema AHo). as tablas de conversión entre el sistema AHo y el sistema más comúnmente utilizado según se define por Kabat et al. (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH N° 91-3242) se proporcionan en A. Honegger, J.Mol.Biol. 309 (2001) 657-670.
El término "epítopo" o la expresión "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une específicamente una inmunoglobulina o anticuerpo (p. ej.,TNF). Un epítopo incluye típicamente al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Véase, p. ej., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).
Las expresiones "unión específica", "unión selectiva", "unión selectiva" y "se une selectivamente" y "se une específicamente" se refieren a la unión de un anticuerpo a un epítopo en un antígeno predeterminado. Típicamente, el anticuerpo se une con una afinidad (Kd) de aproximadamente menos de 10-7 M, tal como aproximadamente menos de 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso menor.
El término "Kd" se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Típicamente, los anticuerpos de la invención se unen al TNF con una constante de equilibrio de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 10-7 M, tal como menos de aproximadamente 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso menor, por ejemplo, según se determina utilizando tecnología de resonancia de plasmón de superficie (SPR) en un instrumento BIACORE.
Tal como se utiliza en esta memoria, "identidad" se refiere a la coincidencia de secuencias entre dos polipéptidos, moléculas o entre dos ácidos nucleicos. Cuando una posición en las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma subunidad de monómero de base o aminoácido (por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, o una posición en cada uno de los dos polipéptidos está ocupada por una lisina), entonces las moléculas respectivas son idénticas en esa posición. El "porcentaje de identidad" entre dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias coinciden, entonces el dos secuencias tienen una identidad del 60%. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN CTGACT y CAGGTT comparten un 50% de identidad (3 de las 6 posiciones totales coinciden). Generalmente, se hace una comparación cuando dos secuencias están alineadas para dar la máxima identidad. Un alineamiento de este tipo se puede proporcionar utilizando, por ejemplo, el método de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453,implementado convenientemente por programas de ordenador tales como el programa Align (DNAstar, Inc.). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en www.gcg.com), utilizando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Secuencias "similares" son aquellas que, cuando se alinean, comparten residuos de aminoácidos idénticos y similares, en que residuos similares son sustituciones conservativas de los residuos de aminoácidos correspondientes en una secuencia de referencia alineada. En este sentido, una "sustitución conservadora" de un residuo en una secuencia de referencia es una sustitución con un residuo que es física o funcionalmente similar al residuo de referencia correspondiente, p. ej., que tiene un tamaño, forma, carga eléctrica, propiedades químicas, incluyendo la capacidad de formar enlaces covalentes o de hidrógeno, similares. Por lo tanto, una secuencia "modificada por sustitución conservadora" es aquella que se diferencia de una secuencia de referencia o de una secuencia de tipo salvaje en que están presentes una o más sustituciones conservadoras. El "porcentaje de similitud" entre dos secuencias es una función del número de posiciones que contienen residuos coincidentes o sustituciones conservadoras compartidas por las dos secuencias, dividido por el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos las secuencias están emparejadas y 2 de 10 posiciones contienen sustituciones conservadoras, entonces las dos secuencias tienen un 80% de similitud positiva.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "modificaciones de secuencia conservadoras" pretende hacer referencia a modificaciones de aminoácidos que no afectan negativamente o alteran las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones de secuencia conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de nucleótidos y aminoácidos. Por ejemplo, pueden introducirse modificaciones mediante técnicas estándares conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen aquellas en las que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales de carácter básico (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales de carácter ácido (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un anticuerpo anti-VEGF humano se reemplaza preferiblemente por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Métodos para identificar sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos que no eliminan la unión del antígeno son bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); y Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)).
"Secuencia consenso de aminoácidos", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una secuencia de aminoácidos que se puede generar utilizando una matriz de al menos dos, y preferiblemente más, secuencias de aminoácidos alineadas, y que permite huecos en la alineación, de modo que sea posible determinar el residuo de aminoácido más frecuente en cada posición. La secuencia consenso es aquella secuencia que comprende los aminoácidos que se representan con mayor frecuencia en cada posición. En el caso de que dos o más aminoácidos estén igualmente representados en una sola posición, la secuencia consenso incluye ambos o todos esos aminoácidos.
La secuencia de aminoácidos de una proteína se puede analizar a diversos niveles. Por ejemplo, la conservación o la variabilidad pueden exhibirse al nivel de residuo único, nivel de residuo múltiple, residuo múltiple con huecos, etc. Los residuos pueden exhibir conservación del residuo idéntico o pueden conservarse a nivel de clase. Ejemplos de clases de aminoácidos incluyen grupos R polares pero no cargados (Serina, Treonina, Asparagina y Glutamina); grupos R cargados positivamente (Lisina, Arginina e Histidina); grupos R cargados negativamente (Ácido glutámico y Ácido aspártico); grupos R hidrofóbicos (Alanina, Isoleucina, Leucina, Metionina, Fenilalanina, Triptófano, Valina y Tirosina); y aminoácidos especiales (Cisteína, Glicina y Prolina). El experto en la técnica conoce otras clases y se pueden definir utilizando determinaciones estructurales u otros datos para evaluar la sustituibilidad. En ese sentido, un aminoácido sustituible puede referirse a cualquier aminoácido que pueda sustituirse y mantener la conservación funcional en esa posición.
Sin embargo, se reconocerá que aminoácidos de la misma clase pueden variar en grado según sus propiedades biofísicas. Por ejemplo, se reconocerá que determinados grupos R hidrofóbicos (p. ej., Alanina, Serina o Treonina) son más hidrofílicos (es decir, de mayor hidrofilicidad o menor hidrofobicidad) que otros grupos R hidrofóbicos (p. ej., Valina o Leucina). La hidrofilicidad o hidrofobicidad relativa se puede determinar utilizando métodos reconocidos en la técnica (véase, p. ej., Rose et al., Science, 229: 834-838 (1985) y Cornette et al., J. Mol. Biol., 195: 659-685 (1987)).
Tal como se utiliza en esta memoria, cuando una secuencia de aminoácidos (p. ej., una primera secuencia Vh o Vl) se alinea con una o más secuencias de aminoácidos adicionales (p. ej., una o más secuencias de VH o VL en una base de datos), una posición de aminoácidos en una secuencia (p. ej., la primera secuencia Vh o Vl) puede compararse con una "posición correspondiente" en la una o más secuencias de aminoácidos adicionales. Tal como se utiliza en esta memoria, la "posición correspondiente" representa la posición equivalente en la o las secuencias que se comparan cuando las secuencias están alineadas de manera óptima, es decir, cuando las secuencias están alineadas para lograr el mayor porcentaje de identidad o porcentaje de similitud.
Inmunoligantes "quiméricos", tal como se utilizan en esta memoria, tienen una porción de la cadena pesada y/o ligera idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntico o homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de anticuerpos de este tipo. Anticuerpo humanizado, tal como se utiliza en esta memoria, es un subconjunto de anticuerpos quiméricos.
"Anticuerpos humanizados", tal como se utiliza en esta memoria, son inmunoligantes que han sido sintetizados utilizando tecnología de ADN recombinante para eludir la respuesta inmune a antígenos extraños. La humanización es una técnica bien establecida para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos monoclonales de fuentes xenogénicas. Un anticuerpo humanizado consiste en una región variable de cadena pesada humanizada, una región variable de cadena ligera humanizada y dominios constantes completamente humanos. La humanización de una región variable implica la elección de un marco aceptor, típicamente un marco aceptor humano, la extensión de las CDRs del inmunoligante donante a insertar en el marco aceptor del dominio variable y la sustitución de residuos del marco donante en el marco aceptor. Un método general para injertar CDRs en marcos aceptores humanos se ha descrito por Winter en la Patente de EE.UU. N° 5.225.539. El documento US 6.407.213 describe un cierto número de posiciones de aminoácidos del marco en las que se prefiere una sustitución del inmunoligante donante.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "propiedad funcional" es una propiedad de un polipéptido (p. ej., un inmunoligante) para el que una mejora (p. ej.,en relación con un polipéptido convencional) es deseable y/o ventajosa para un experto en la técnica, p. ej., con el fin de mejorar las propiedades de fabricación o la eficacia terapéutica del polipéptido. En una realización, la propiedad funcional es una estabilidad mejorada (p. ej., estabilidad térmica). En otra realización, la propiedad funcional es una solubilidad mejorada (p. ej., bajo condiciones celulares). En aún otra realización, la propiedad funcional es la no agregación. En aún otra realización, la propiedad funcional es una mejora en la expresión (p. ej., en una célula procariota). En aún otra realización, la propiedad funcional es una mejora en el rendimiento de replegamiento después de un proceso de purificación de cuerpos de inclusión. En determinadas realizaciones, la propiedad funcional no es una mejora en la afinidad de unión al antígeno.
La expresión "molécula de ácido nucleico" se refiere a moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o de doble cadena, pero preferiblemente es ADN de doble cadena. Un ácido nucleico está "operativamente enlazado" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está operativamente enlazado a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia.
El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN de doble cadena en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (p. ej., vectores de mamíferos no episomales) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped y, con ello, se replican junto con el genoma del huésped.
La expresión "célula huésped" se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión. Células huésped pueden incluir células bacterianas, microbianas, vegetales o animales. Las bacterias, que son susceptibles de transformación, incluyen miembros de las enterobacteriaceae, tales como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tales como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus y Haemophilus influenzae. Microbios adecuados incluyen Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Líneas de células huésped animales adecuadas incluyen células CHO (líneas de ovario de hámster chino) y células NS0.
Los términos "tratar", "tratando" y "tratamiento" se refieren a medidas terapéuticas o preventivas descritas en esta memoria. Los métodos de "tratamiento" emplean la administración a un sujeto, que necesita dicho tratamiento, de un anticuerpo de la presente invención, por ejemplo, un sujeto que tiene un trastorno mediado por TNFa o un sujeto que finalmente puede adquirir un trastorno de este tipo, con el fin de prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad de o mejorar uno o más síntomas del trastorno o trastorno recurrente, o con el fin de prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de un tratamiento de este tipo.
La expresión "trastorno mediado por TNF" o "enfermedad mediada por TNF" se refiere a cualquier trastorno, cuyo inicio, progresión o persistencia de síntomas o estados patológicos requiere la participación de TNF. Trastornos mediados por TNF ilustrativos incluyen, pero no se limitan a estados de inflamación crónicos y/o autoinmunes en general, trastornos inflamatorios inmuno-mediados en general, enfermedad inflamatoria del SNC, enfermedades inflamatorias que afectan el ojo, las articulaciones, la piel, las membranas mucosas, el sistema nervioso central, el tracto gastrointestinal, el tracto urinario o pulmón, estados de uveítis en general, retinitis, uveítis por HLA-B27+, enfermedad de Behcet, síndrome del ojo seco, glaucoma, síndrome de Sjogren, diabetes mellitus (incluida neuropatía diabética), resistencia a la insulina, estados de artritis en general, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis reactiva y síndrome de Reiter, artritis juvenil, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barre, miastenia grave, esclerosis lateral amiotrófica, sarcoidosis, glomerulonefritis, enfermedad renal crónica, cistitis, psoriasis (incluida artritis psoriática), hidradenitis supurativa, paniculitis, pioderma gangrenoso, síndrome SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), acné, síndrome de Sweet, pénfigo, enfermedad de Crohn (incl. manifestaciones extraintestinales), colitis ulcerosa, asma bronquial, neumonitis por hipersensibilidad, alergias generales, rinitis alérgica, sinusitis alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), fibrosis pulmonar, granulomatosis de Wegener, síndrome de Kawasaki, arteritis de células gigantes, vasculitis de Churg-Strauss, poliarteritis nodosa, quemaduras, enfermedad de injerto frente a huésped, reacciones de huésped frente a injerto, episodios de rechazo después de un trasplante de órgano o de médula ósea, estados sistémicos y locales de vasculitis en general, lupus eritematodo sistémico y discoide, polimiositis y dermatomiositis, esclerodermia, pre-eclampsia, pancreatitis aguda y crónica, hepatitis viral, hepatitis alcohólica, inflamación post-quirúrgica tal como después de una cirugía ocular (p. ej., cirugía de cataratas (reemplazo del cristalino) o cirugía de glaucoma), cirugía articular (incluida cirugía artroscópica), cirugía en estructuras relacionadas con las articulaciones (p. ej. Ligamentos), cirugía oral y/o dental, procedimientos cardiovasculares mínimamente invasivos (p. ej., PTCA, aterectomía, colocación de stent), procedimientos laparoscópicos y/o endoscópicos intra-abdominales y ginecológicos, procedimientos urológicos endoscópicos (p. ej., cirugía de próstata, ureteroscopia, cistoscopia, cistitis intersticial) o inflamación perioperatoria (prevención) en general, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, Parálisis de Bell, enfermedad de Creutzfeld-Jakob. Osteólisis relacionada con el cáncer, inflamación relacionada con el cáncer, dolor relacionado con el cáncer, caquexia relacionada con el cáncer, metástasis óseas, formas de dolor agudo y crónico, independientemente de si están provocadas por efectos centrales o periféricos del TNFa y si se clasifican como inflamatorias, formas de dolor nociceptivas o neuropáticas, ciática, lumbalgia, síndrome del túnel carpiano, síndrome de dolor regional complejo (CRPS), gota, neuralgia posherpética, fibromialgia, estados de dolor local, síndromes de dolor crónico debido a tumor metastásico, dismenorrea. Sepsis bacteriana, viral o fúngica, tuberculosis, SIDA, aterosclerosis, enfermedad de las arterias coronarias, hipertensión, dislipidemia, insuficiencia cardíaca e insuficiencia cardíaca crónica. La expresión "dosis eficaz" o "dosificación eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para alcanzar o al menos parcialmente lograr el efecto deseado. La expresión "dosis terapéuticamente eficaz" se define como una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya padece la enfermedad. Cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad del trastorno que se esté tratando y del estado general del propio sistema inmunológico del paciente.
El término "sujeto" se refiere a cualquier animal humano o no humano. Por ejemplo, los métodos y las composiciones de la presente invención se pueden utilizar para tratar a un sujeto con un trastorno mediado por TNF.
El término "lagomorfos" se refiere a miembros del orden taxonómico Lagomorpha, que comprende las familias Leporidae (p. ej., liebres y conejos) y Ochotonidae (picas). En una realización más preferida, el lagomorfo es un conejo. El término "conejo", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un animal que pertenece a la familia de los lepóridos.
Se utilizaron diferentes nomenclaturas para los inmunoligantes generados. Por lo general, se identifican con un número (p. ej., n° 34). En aquellos casos en los que se utilizó un prefijo tal como EP o Epi (p. ej., EP 34 que es idéntico a Epi 34 o al n° 34), con ello se indica el mismo inmunoligante.
A menos que se defina lo contrario, todaslas expresiones y los términos técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Diversos aspectos de la invención se describen con más detalle en las siguientes subsecciones. Se entiende que las diversas realizaciones, preferencias e intervalos pueden combinarse a voluntad. Además, dependiendo de la realización específica, es posible que no se apliquen definiciones, realizaciones o intervalos seleccionados.
A nticuerpos anti-TNFa
En un aspecto, la presente invención proporciona inmunoligantes que se unen a TNFa y, por lo tanto, son adecuados para bloquear la función de TNFa in vivo. Las CDR de estos inmunoligantes se derivan de anticuerpos monoclonales anti-TNFa de conejo tal como se describe en el documento US 7.431.927. Se sabe que los anticuerpos de conejo tienen afinidades particularmente altas. Además, las secuencias de CDR descritas en esta memoria son secuencias naturales, lo que significa que no es necesario realizar maduración por afinidad alguna de los inmunoligantes resultantes. En una realización preferida, el inmunoligante neutraliza el TNFa in vivo.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un inmunoligante, que se une específicamente a TNFa, que comprende al menos una secuencia de aminoácidos de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 o CDRL3. Secuencias de aminoácidos de CDR ilustrativas para su uso en los inmunoligantes de la invención se establecen en las SEQ ID N°: 3-50 (Tabla 1). Las CDRs recogidas en SEQ ID N°s: 3-50 se pueden injertar en cualquier armazón de unión adecuado utilizando cualesquiera métodos reconocidos en la técnica (véase, p.b ej., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Véase. U.S.A. 86:10029-10033; Patente de EE.UU. N° 5.225.539 expedida a Winter, y Patentes de EE.UU. N°s.
5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 expedidas a Queen et al.). Las CDRs de diferentes anticuerpos parentales se pueden combinar en un anticuerpo para generar especies de anticuerpos adicionales. Sin embargo, se prefiere que los inmunoligantes descritos en esta memoria estén humanizados, por lo que son adecuados para aplicaciones terapéuticas.
Por lo tanto, en una realización, la invención proporciona un inmunoligante que se une específicamente al TNFa humano, comprendiendo el inmunoligante:
(i) una región variable de cadena pesada humanizada (VH), comprendiendo la región variable de cadena pesada una secuencia marco variable de cadena pesada humana y secuencias de CDR H1, CDR H2 y CDR H3 que proceden de un inmunoligante de conejo; y/o
(ii) una región variable de cadena ligera humanizada (VL), comprendiendo la región variable de cadena ligera una secuencia marco variable de cadena ligera humana y secuencias de CDR L1, CDR L2 y CDR L3 que proceden de un inmunoligante de conejo.
Como se conoce en la técnica, muchas cadenas VH de conejo tienen cisteínas apareadas extra en relación con las equivalentes murinas y humanas. Además del puente disulfuro conservado formado entre cys22 y cys92, también hay un puente cys21-cys79, así como un puente interCDR S-S formado entre el último residuo de CDRH1 y el primer residuo de CDR H2 en algunas cadenas de conejo. Además, los pares de residuos de cisteína se encuentran a menudo en la CDR-L3. Además, muchas CDRs de anticuerpos de conejo no pertenecen a ninguna estructura canónica previamente conocida. En particular, la CDR-L3 es a menudo mucho más larga que la CDR-L3 de un equivalente humano o murino.
Además de los conejos, la invención se puede utilizar para injertar CDRs de cualquier lagomorfo.
En el caso de los anticuerpos, las CDRs de conejo recogidas en las SEQ ID N°s: 3-50 pueden injertarse en las regiones marco de cualquier anticuerpo de cualquier especie. Sin embargo, se ha descubierto previamente que anticuerpos o derivados de anticuerpos que comprenden los marcos identificados en el llamado cribado de "control de calidad" (documento WO0148017) se caracterizan por una estabilidad y/o solubilidad generalmente altas y, por lo tanto, también pueden ser útiles en el contexto de aplicaciones extracelulares. tales como neutralizar el TNFa humano.
Además de ello, se ha descubierto, además, que una combinación particular de estos marcos solubles y estables VL (cadena ligera variable) y VH (cadena pesada variable) es particularmente adecuada para acomodar CDRs de conejo. Sorprendentemente, se encontró que tras el injerto en dicho marco o sus derivados, la conformación de bucle de una gran diversidad de CDRs de conejo se podía mantener completamente, en gran medida independiente de la secuencia del marco donante. Además de ello, dicho marco o sus derivados que contienen diferentes CDRs de conejo están bien expresados y bien producidos contrariamente a las cadenas sencillas de tipo salvaje de conejo y todavía retienen casi completamente la afinidad de los anticuerpos de conejo donantes originales. Por consiguiente, en una realización, las CDRs recogidas en las SEQ ID N°s: 3-50 se injertan en las estructuras de anticuerpos humanos derivadas de la selección de "control de calidad" descrita en el documento EP1479694. Las secuencias de aminoácidos de marcos ilustrativos para su uso en la invención se establecen en las SEQ ID N°s: 1 y 2 que figuran a continuación.
SEQ If> Tío 1
Cadena ligera variable de P.V1.4
Figure imgf000009_0001
SEQ ID fío 2
Cadena pesada variable de P/V1.4
Figure imgf000009_0002
X puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural. Pueden estar presentes al menos tres y hasta 50 aminoácidos. Las CDRs se insertan típicamente en los sitios en donde X está presente.
En otras realizaciones, la invención proporciona un inmunoligante, que se une específicamente a TNFa, que comprende al menos una secuencia de aminoácidos de VH o de VL. Secuencias de aminoácidos de VH o VL ilustrativas para uso en los inmunoligantes de la invención se recogen en las SEQ ID N°s: 51-111.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona, además, un inmunoligante, que se une específicamente al TNFa, que comprende una secuencia de aminoácidos con una similitud sustancial con una secuencia de aminoácidos recogida en las SEQ ID N°s: 51-111, y en donde el inmunoligante retiene o mejora laa propiedades funcionales deseadas del inmunoligante anti-TNFa de la invención. Similitudes porcentuales ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, aproximadamente 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona, además, un inmunoligante, que se une específicamente al TNFa, que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad sustancial con una secuencia de aminoácidos recogida en las SEQ ID N°s: 51-111, y en donde el inmunoligante retiene o mejora laa propiedades funcionales deseadas del inmunoligante anti-TNFa de la invención. Identidades porcentuales ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, aproximadamente 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona, además, un inmunoligante, que se une específicamente al TNFa, que comprende una secuencia de aminoácidos con sustituciones conservativas con relación a una secuencia de aminoácidos recogida en las SEQ ID N°s: 51-111, y en donde el inmunoligante retiene o mejora laa propiedades funcionales deseadas del inmunoligante anti-TNFa de la invención.
En una realización más preferida, el inmunoligante de la invención comprende al menos una secuencia de CDR que es al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, 90%, 95% o 100% idéntica a una cualquiera de las SEQ ID N°s: 3-50.
En una realización preferida de la invención, se proporciona un inmunoligante que comprende al menos una, preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco, o lo más preferiblemente seis CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID N°s 3-8.
En otra realización preferida de la invención, se proporciona un inmunoligante que comprende al menos una, preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco, o lo más preferiblemente seis CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID N°s 9-14.
En otra realización preferida de la invención, se proporciona un inmunoligante que comprende al menos una, preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco, o lo más preferiblemente seis CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID N°s 15-20.
En otra realización preferida de la invención, se proporciona un inmunoligante que comprende al menos una, preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco, o lo más preferiblemente seis CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID N°s 21-26.
En otra realización preferida de la invención, se proporciona un inmunoligante que comprende al menos una, preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco, o lo más preferiblemente seis CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID N°s 27-32.
En otra realización preferida de la invención, se proporciona un inmunoligante que comprende al menos una, preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco, o lo más preferiblemente seis CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID N°s 33-38.
En otra realización preferida de la invención, se proporciona un inmunoligante que comprende al menos una, preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco, o lo más preferiblemente seis CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID N°s: 39-44.
En otra realización preferida de la invención, se proporciona un inmunoligante que comprende al menos una, preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco, o lo más preferiblemente seis CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID N°s 45-50.
Las secuencias de CDR proporcionadas en esta memoria en las SEQ ID Nos: 3-50 pueden comprender, además, sustituciones. Preferiblemente, las secuencias tienen 3, más preferiblemente 2, y lo más preferiblemente solo una sustitución o sustituciones. Preferiblemente, dichas sustituciones son tales que la capacidad de unión selectiva del inmunoligante no se ve afectada, pero la afinidad del inmunoligante está alterada, preferiblemente potenciada. Tabla 1 CDRs Donantes Rabmab
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
En otra realización, la invención proporciona anticuerpos que se unen a un epítopo del TNFa humano, tal como lo reconoce un anticuerpo monoclonal que contiene un conjunto de CDRs (H1-H3, L1-L3; pertenecientes a un clon Rabmab) tal como se recoge en la Tabla 1. Anticuerpos de este tipo pueden identificarse basándose en su capacidad para competir de forma cruzada con un anticuerpo de la Tabla 1 en un ensayo de unión de TNF estándar. La capacidad de un anticuerpo de prueba de inhibir la unión de un anticuerpo de la Tabla 1 al TNFa humano demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con el anticuerpo de la Tabla 1 por unirse al TNFa humano y, por lo tanto, implica al mismo epítopo en el TNFa humano que el anticuerpo de Tabla 1. En una realización preferida, el anticuerpo que se une al mismo epítopo en el TNFa humano que los anticuerpos expuestos en la Tabla 1 es un anticuerpo monoclonal humano. Anticuerpos monoclonales humanos de este tipo se pueden preparar y aislar como se describe en esta memoria.
En una realización, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la presente invención son anticuerpos de cadena sencilla (scFv) o fragmentos Fab. En el caso de los anticuerpos scFv, un dominio VL seleccionado se puede enlazar a un dominio VH seleccionado en cualquier orientación mediante un enlazador flexible. Un enlazador adecuado del estado de la técnica consiste en secuencias de aminoácidos GGGGS repetidas o variantes de las mismas. En una realización preferida de la presente invención se utiliza un enlazador (GGGGS) 4 (SEQ ID No: 72) o su derivado, pero también son posibles variantes de 1-3 repeticiones (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). Otros enlazadores que se pueden utilizar para la presente invención se describen por Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 y Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. Immunother. 50:51-59. La disposición puede ser NH2-VL-enlazador-VH-COOH o NH2-VH-enlazador-VL-COOH, siendo la primera orientación la preferida. En el caso de fragmentos Fab, los dominios variables VL de la cadena ligera seleccionados se condensan con la región constante de una cadena kappa de Ig humana, mientras que los dominios variables VH de la cadena pesada adecuados se condensan con el primer dominio constante (N-terminal) CH1 de una IgG humana. En el extremo C se forma un puente disulfuro entre cadenas entre los dos dominios constantes.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpos de la presente invención pueden tener afinidades por el TNF humano con constantes de disociación Kd en un intervalo de 1 fM -10 |jM. En una realización preferida de la presente invención, la Kd es < 1 nM. La afinidad de un anticuerpo por un antígeno se puede determinar experimentalmente utilizando un método adecuado (Berzofsky et al. "Antibody-Antigen Interactions", en Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed, Raven Press: Nueva York, NY (1992); Kuby, J. Immunology, W.H. Freeman and Company: Nueva York, NY) y métodos descritos en el mismo.
Anticuerpos preferidos incluyen anticuerpos que tienen una región de cadena variable pesada (VH) y/o de cadena variable ligera (VL) de entre las siguientes secuencias VH y VL (secuencias CDR subrayadas):
SEQ ID NO: 51
EP43min VH
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAñSGFSLSSGftMSWVRQñPGKGLEWVSVIISSGAT
YYA3WAK8RFTISRDNSKNTIYLQMNSLRAE DTAVYYCAKGGgDDSNSMGTFDPWGQ
GTLVTVSS SEQ ID NO: 52
EP43min VL
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSXSDWIAWYQQKPGKAPKLLIYGASRIASG VPSRFSGSGSC-AEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDKLFGQGTKLTVLG
SEQ ID NO: 53
EP43max VH
EVQLVE3GGGLVQPGGSLRL5GFVSGFSX.SS<3ftMSWVRQAPGKGLEWVGVXXSSGa.T
YYASWAKGF .r 15 KDT S KNTVYLQMNSLRAE DTAVYY CARGSPDDSNSMGTFDPWGQ
GTLVTVSS SEQ ID NO: 54
EP43max VL
ElVMTQSPSIL3AS'VGDRVIIKCQASQSISDWIAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLASG
FPSRF3SSGSGAEFTLTTSGLEPACFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTKLTVLG
SEQ ID NO: 55
EP43maxDHP VH
EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTVSSFSLSSGaMSWVRQAPGKGLEMVGVIISSGAT
YYASHAKGRFTISKDT5KNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARGGPDD5NSMGTFDEKGQ
GT3VTVSS
SEQ ID NO: 56
EP43minmaxVL:T22K VL
EIVMTQSPSTLSASVGDRV11KCQASQSISDWXAWYQQKPGKAPKLLlY^SRLASG
VPSRFSGSG5GAEFTLTISSLQPDJFATYYCQQGWSDSYVDS1.FGQGTKLTVLG
SEQ ID NO: 57
EP43minmaxVL:V58F VL
eivmtqspstlsasvgdrviitcqrsqsisdwlawyqqkpc-kapklliygasblasg
FPSRFSGSGSGAEFTLTIS5LQPDDFATYYCQQGWSDSYVDHLFGQGTKLTVLG
SEQ ID NO: 58
EP43minmaxVL:Q79E VL
EIVHTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIBDWLAWYQQKPGKAPKLL1YGASRIASG
VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLEPDDFATYYCQQGWSDSYVDtlX.FGQGTKLTVLG
SEQ ID NO: 59
EP43minmaxVL:D81 A VL
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCO&3QSIS0WLAWYQQKPGKAPKLLIYG&SRIASG
VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPADFATYYCQQGWSDSYVDSI.FGQGTKLTVLG
SEQ ID NO: 60
EPImin VH
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNDAISWVRQAPGKGLEWVSYISDWSXR YYAMWAQGRFTISRDK3KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRPGAGDNGIWGQGTLV
TVSS NOTA: EPImin CDR-H1 no coincide con la de EPImax
SEQ ID NO: 61
EPImin VL
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNRY1AWYQQKPGKAPKLLIYDASTIA
SGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGSGaJANGSFGQGTKLTVL
G
SEQ ID NO: 62
EPImax VH
EVQLVESGGGSVQPC-GSLRLSCTVSGIDLSNDAISWRQAPGKGLEWVAYISD'WSIR YYJmWftOGRFTlSKDTSKKTVYLQMNSLRAEDTATYYCARGftgGAGDMGIWGQSTTV TVSS SEQ ID NO: 63
EPImax VL EIVMTQSPSTLSASVGDKVIITCQSTESVYKKHYIAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLXISSLQPDDFATYYCAGYYRSGSGTAKGSFGQGTKLTVI-
SEQ ID NO: 64
EP6min VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSIiSRYGVSWVRQAPGKGLEWVSYIGERGRA YYRHWjVRSRFTISRDNSKHTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEVFNNGWGAFNIWGQG TLVTVSS SEQ ID NO: 65
EP6min VL EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQ&SESIYSGLawyQQKPGKAPKLLIYQ&STLRSG VPSRFSGSGSGAEFTLTI5SLQPDDFATYYCQQGFGTSNVEHPFGQGTKLTVLG SEQ ID NO: 66
EP6max VH EVQLVESGGGLVQPGGSLfiLSCTVgGFSLSRYGVSWVRQAPGKGLEWVGTIGEAGRA YYANWRRSRSTISRDTSKHTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGEVFMMGH'GfflLFNIWGQG TLVTVSS SEQ ID NO: 67
EP6max VL EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASESIYSGIAWYQQKPGKAPKLLIYQRS'SIASG VPSRFSGSGSGTDFYLAXSSLQPDDFATYYCQQGFGTSKVEWPFGQGTKLTVLG SEQ ID NO: 68
EP15min VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA5GFTFSRYGVSWVRQ.APGKGLEWVSAIGETGRA YYi«mftK5R?TXSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEEFNKSWG&5mWGQG TLVTVSS SEQ ID NO: 69
EP15min VL EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQRSEHIYTSIAWYQQKPGKAPKLLIYS&STIASG VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGgAISMVENPFGQGTKLTVLG SEQ ID NO: 70
EP15max VH EVQIiVESGGGSVQPGGSLRLSCTVSGFSLSRYGVBWVRQAPGKGIiEWVGAIGETGRA YY&NWRKSRSTISRDTSKNTVYLQiYNSLRAEDTATYYCARGEEFNtTGWGftFNIWGCiG TTVTVSS SEQ ID NO: 71
EP15max VL EIVMTQSPSTLSASVGDRV1ITCQASEHIITSLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTIASG VPSRFSGSGSGTEFTLTLSSLQPDDFATYYCQQGFATSNVENPFGQGTKLTVLG SEQ ID NO: 72
enlazador glicina-serina
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 73
EP19maxmod VH EVQLVESGGGLVgPGGSLRLSCTVSGFSLHSKEISWVRQAPGKC-LEWVGYIGNGGMT HYASmKSRFTISRPTSKKTVYLQMMSLRñEDTAVYYCASSVEYTOLYYLNIWGQGT LVTVSS *
SEQ ID NO: 74
EP19maxmod VL
EIVMTQSPSTLSASVG DRVIITCQASDNIYRQLAWY QQKPGKA PKLLIYDASTLQSG VPSRFSGSGSGTQFTLTISSLQPDDFATYYCLGVYGYSSDDGAAFGQGTKLTVLG SEQ ID NO: 75
EP19minmod VH
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSIMSBnglSWVRQAPGKGLEWVSYIGHGGMB HYAStCUKSRFTISRDNSKNTIYLQMNSLRAEDTAyYYCAK S V B Y TD LrY LN lWGQGT LVTVSS SEQ ID NO: 76
EP19minmod VL
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQRSDM ITRSLMYQQKPGKAPKLLIYDftSTLQSC-VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCLGVYgYBSDDGAAFGQGTKLTVLG SEQ ID NO: 77
EP34min VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTXSRSYWXCMVRQAPGKGIjEWVSCIYGDNP IYgLYaNWAKGRrTISRDNSKHTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGYADYAYDLWGQG TLVTVSS
SEQ ID NO: 78
EP34min VL EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSSQSVYGHXWMAWYQQKPGKñPKLLIYQftSKXA SGVFSRFSGSGSGAEFTITISSLQPDDFATYYCQGHENYGDRYAFGQGTKLTVLG SEQ ID NO: 79
EP34max VH EVQLVBSGGGLVQPGGBLRLSCTfiSGFTISRSYWICWRQAPGKC-LEWVACIYGDND ITPLYAHWftKGRFPVSTDTSKNTVYLQM>lSLRAEPTAVYYCARLGYADYAYDI,WGQG TLVTVSS SEQ ID NO: 80
EP34max VL EIVMTQSPSTLSASLGDRVIITCQSSQSVYaaiWMRWYQQKSGKAPKLLIYQ&SKIA SGVPSRFSGSGSGAEFSLTISSLQPDDPATYYCQGNFNTGDRYAFGQGTKLTVLG SEQ ID NO: 81
EP35min VH
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASg g 3?gSVGYWICWVRQAPGKGLEPrVSCIPAGTS GGTYYATWMCGRFTISRDFiSKNTLYLQMNSLRAEDTñVYYCAKGVSSWGYYFKLWGQ GTLVTVSS SEQ ID NO: 82
EP35min VL
EIVMGQSPSTLSASVGDRVIITCQ &SQ SISN IJAWYQQKPGKñPKLLIYAASKIASG VPSRF5GSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSBTHVDNTFGQGTKLTVLG SEQ ID NO: 83
EP35max VH EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFSFSVGYWICWVRQAPGKGLEWVñCIDAGTS GGTYYATWAKGRFTISKDTS KNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARGVSSNGYYFKLWGQ GTTVTVSS SEQ ID NO: 84
EP35max VL EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISMLL&WYQQKPGKAPKLL1VAASKLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGW3HTNVDNTFGQGTKLTVLG SEQ ID NO: 85
EP42min VH SVQLVESGGGIiVQPGGSLRLSCAASGFTFRKDAISWVRQAPGKGLEWVSYXSDWGIK YYASWVKGRFTISRDNSKMTLYLQMMSLRAEDTAVYYCAKGAPGAGPNGXWGQGTLV TVSS NOTA: EP42min CDR-H1 no coincide con la de EP42max
SEQ ID NO: 86
EP42min VL
e iv m t q s p s t l s a s v g d r v iit c q s ie s v y k m y l a w y q q k p g k a p k l l iy p a s t ia SGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGFSTANGSFGQGTKLTVL G SEQ ID NO: 87
EP42max VH
e v q l v e s g g g s v q p g g s l r l s c t v s g id l r h d a i s w v r q a p g k g l e w v s y is d w g ik YYASWVKGRFTISKDTS KWTVYLQMNSLRAE DTATYY CARGAPG&GDNGIWGQGTTV TVSS SEQ ID NO: 88
EP42max VL
EIVMTQSP
STLSASVGDRVIITCQSTBSVYKNNYIAWYQQKPGKñPKLIIYDASTL&SGVPSRgS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGFGTflNGSFGQGTKLTVLG
Producción de anticuerpos Anti-TN F
La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que los marcos de anticuerpos humanos altamente solubles y estables identificados mediante un ensayo de control de calidad (QC) son marcos particularmente adecuados para acomodar CDRs de otras especies animales no humanas, por ejemplo, CDRs de conejo. En particular, la invención se basa en el descubrimiento de que las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo humano particular (el denominado anticuerpo "FW 1.4") son particularmente adecuadas como aceptores de CDRs de una diversidad de anticuerpos de conejo de diferentes especificidades de unión. Aunque el marco FW1.4 de cadena sencilla humano de ESBATech tuvo un rendimiento claramente inferior en el ensayo de control de calidad y cuando se expresó en células HeLa cuando se utilizó junto con sus CDRs originales (tal como se describe en el documento WO03097697), se encontró, sorprendentemente, que, cuando se combina con otras CDRs, tales como CDRs de conejo, da lugar a anticuerpos de cadena sencilla muy estables, solubles y bien producibles. Además, los inmunoligantes humanizados generados por el injerto de CDRs de conejo en estos marcos ligeros y pesados altamente compatibles conservan de forma consistente y fiable las propiedades de unión de los anticuerpos de conejo de los que se derivan las CDRs de donantes. Además, inmunoligantes generados por los métodos de la invención exhiben de manera fiable propiedades funcionales superiores, tales como solubilidad y estabilidad. Por consiguiente, es un objeto general de la invención proporcionar métodos para injertar CDRs de conejo y otras CDRs no humanas, en los marcos de anticuerpos humanos de cadena ligera y/o de cadena pesada solubles y estables de SEQ ID NO: 1 (K127) y SEQ ID NO: 2 (a43), respectivamente, generando con ello anticuerpos humanizados con propiedades biofísicas superiores.
En una realización preferida, el marco comprende una o más sustituciones en el marco de cadena pesada (VH) en una posición del grupo que consiste en las posiciones H24, H25, H56, H82, H84, H89 y H108 (sistema de numeración AHo). Adicional o alternativamente, el marco puede comprender una sustitución en el marco de la cadena ligera (VH) en la posición L87 de acuerdo con el sistema de numeración AHo. Se ha demostrado que la presencia de dichas sustituciones proporciona un marco aceptor que conserva casi completamente la afinidad de los anticuerpos donantes originales. En una realización más preferida, la una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: treonina (T) en la posición H24, valina (V) en la posición H25, glicina (G) o alanina (A) en la posición H56, lisina (K) en la posición H82, treonina (T) en la posición H84, valina (V) en la posición H89 y arginina (R) en la posición H108 y treonina (T) en la posición L87 de acuerdo con el sistema de numeración AHo están presentes en la secuencia marco.
Por tanto, en una realización incluso más preferida, el marco aceptor es
SEQ ID NO. 89: marco de cadena pesada variable de rFW1.4 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(X)n=3-50 WVRQAPGKGLEWVG(X)n=3-50 RFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)n=3-50 WGQGTLV TVSS SEQ ID NO. 90: marco de cadena pesada variable de rFW1.4(V2) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS(X)n=3-50 WVRQAPGKGLEWVG(X)n=3-50 RFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)n=3-50 WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO. 91: marco de cadena ligera variable sustituida de FW1.4 EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=3-50 WYQQKPGKAPKLLIY(X)n=3-50 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=3-50FGQGTKLTVLG SEQ ID NO. 92: marco de rFW1.4 EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=3-50 WYQQKPGKAPKLLIY(X)n=3-50 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=3-50 FGQGTKLTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQL VESGGGL VQPGGSLRLSCT AS(X)n=3-50 WVRQAPGKGLEWVG(X)n=3-50 RFTISRDTSKNTVYLQMNS LRAEDTAVYYCAR(X)n=3-50 WGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 93: marco de rFW1.4(V2) EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=3-50 WYQQKPGKAPKLLIY(X)n=3-50 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X) FGQGTKLTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS(X)n=3-50 WVRQAPGKGLEWVG(X)n=3-50 RFTISKDTSKNTVYLQMNSLR AEDT AVYYCAR(X) n=3-50 WGQGTLVTVSS
X puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural; pueden estar presentes al menos tres y hasta 50 aminoácidos. Las CDRs se insertan típicamente en los sitios en donde X está presente.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpos de la presente invención pueden generarse utilizando técnicas rutinarias en el campo de la genética recombinante. Conociendo las secuencias de los polipéptidos, los ADNc que los codifican pueden generarse mediante síntesis génica por métodos bien conocidos en la técnica. Estos ADNc se pueden clonar en plásmidos de vector adecuados. Una vez que se obtiene el ADN que codifica un dominio VL y/o VH, se puede realizar una mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo, mediante PCR utilizando cebadores mutagénicos, para obtener diversos derivados. Se puede elegir la mejor secuencia de "partida" dependiendo del número de alteraciones deseadas en las secuencias VL y/o VH. Una secuencia preferida son las secuencias de TB-A y sus derivados, p. ej., secuencias scFv o secuencias de péptidos de fusión Fab, pueden elegirse como moldes para la mutagénesis y/o clonación impulsada por PCR.
Métodos para incorporar o injertar CDRs en regiones marco incluyen los recogidos en p. ej., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Véase. U.S.A. 86:10029-10033; Patente de EE.UU. N° 5.225.539 expedida a Winter y las Patentes de EE.UU. N°s 5.,530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 expedidas a Queen et al, así como los descritos en las Solicitudes Provisionales N°s de Serie 61/075.697 y 61/155.041, tituladas "Humanization of Rabbit Antibodies Using Universal Antibody Frameworks," presentada el 25 de junio de 2008 y el 4 de febrero de 2009, respectivamente.
Pueden utilizarse técnicas estándares de clonación y mutagénesis bien conocidas por el experto en la técnica para unir enlazadores, reorganizar dominios o construir fusiones para la producción de fragmentos Fab. Protocolos básicos que describen los métodos generales de esta invención se describen en Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook & Russell, 3a ed. 2001) y en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1999).
La secuencia de ADN que alberga un gen que codifica un polipéptido scFv o, en el caso de fragmentos Fab, que codifica dos genes separados o un operón bi-cistrónico que comprende los dos genes para las fusiones VL-Ck y VH-CH1 se clona en un vector de expresión adecuado, preferiblemente uno con un promotor inducible. Se debe tener cuidado de que frente a cada uno de los genes esté presente un sitio de unión al ribosoma apropiado que asegure la traducción. Debe entenderse que los anticuerpos de la presente invención comprenden las secuencias descritas en lugar de consistir en ellas. Por ejemplo, las estrategias de clonación pueden requerir que se elabore una construcción a partir de la cual esté presente un anticuerpo con uno o unos pocos residuos adicionales en el extremo N. Específicamente, la metionina derivada del codón de iniciación puede estar presente en la proteína final en los casos en los que no se ha escindido post-traducción. La mayoría de las construcciones de anticuerpos scFv dan lugar a una alanina adicional en el extremo N. En una realización preferida de la presente invención, se elige un vector de expresión para la expresión periplásmica en E. c o li(Krebber, 1997). Dicho vector comprende un promotor delante de una secuencia señal escindible. La secuencia codificante del péptido del anticuerpo se fusiona luego en marco a la secuencia señal escindible. Esto permite la fijación de objetivo del polipéptido expresado al periplasma bacteriano en donde se escinde la secuencia señal. Luego se pliega el anticuerpo. En el caso de los fragmentos Fab, los péptidos de fusión VL-Ck y VH-CH1 deben estar enlazados a una señal de exportación. El enlace S-S covalente se forma en las cisteínas C-terminales después de que los péptidos han alcanzado el periplasma. Si se prefiere la expresión citoplásmica de anticuerpos, dichos anticuerpos se pueden obtener habitualmente con altos rendimientos a partir de cuerpos de inclusión, que se pueden separar fácilmente de otros fragmentos celulares y proteínas. En este caso, los cuerpos de inclusión se solubilizan en un agente desnaturalizante, tal como, p. ej., hidrocloruro de guanidina (GndHCl) y luego se repliegan mediante procesos de renaturalización bien conocidos por los expertos en la técnica.
Los plásmidos que expresan los polipéptidos scFv o Fab se introducen en un huésped adecuado, preferiblemente una célula bacteriana, de levadura o de mamífero, lo más preferiblemente una cepa de E. coli adecuada, tal como, por ejemplo, JM83 para la expresión periplásmica o BL21 para la expresión en cuerpos de inclusión. El polipéptido puede recogerse del periplasma o formar cuerpos de inclusión y puede purificarse utilizando técnicas estándares tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, cromatografía de afinidad y/o filtración en gel conocidas por el experto en la técnica.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpos de la presente invención se pueden caracterizar con respecto al rendimiento, la solubilidad y la estabilidad in vitro. Las capacidades de unión hacia el TNF, preferiblemente hacia el TNFa humano, se pueden testar in vitro mediante ELISA o resonancia de plasmón de superficie (BIACore), utilizando TNF humano recombinante tal como se describe en el documento WO9729131, este último método también permite determinar la constante de velocidad koff, que preferiblemente debería ser menor que 10'3s_1. Se prefieren valores de Kd <10 nM.
Aparte de los anticuerpos con fuerte afinidad de unión por el TNF humano, también es deseable generar anticuerpos anti-TNF que tengan propiedades beneficiosas desde una perspectiva terapéutica. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser uno que muestre actividad neutralizante en un ensayo de citotoxicidad mediado por TNFalfa L929. En este ensayo, se indujo la toxicidad de células de fibroblastos L929 de ratón tratadas con Actinomicina con TNF humano recombinante (hTNF). Se determinó que el 90% de la citotoxicidad máxima inducida por hTNF estaba a una concentración de TNF de 1000 pg/ml.
Todas las células L929 se cultivaron en RPMI 1640 con rojo fenol, con medio de L-Glutamina complementado con suero de ternero fetal (al 10% v/v). La actividad neutralizante de aglutinantes anti-TNFa se evaluó en RPMI 1640 sin rojo fenol y suero de ternero fetal al 5%. Se añaden diferentes concentraciones (0 - 374 ng/mL) de ligantes anti-TNF a las células L929 en presencia de 1000 pg/ml de hTNF para determinar la concentración a la que el efecto antagonista alcanza la mitad de la inhibición máxima (CE50%) La curva de dosis-respuesta se ajustó con regresión sigmoidea no lineal con pendiente variable y se calculó la CE50.
Variantes Optim izadas
Los anticuerpos de la invención pueden optimizarse adicionalmente para potenciar las propiedades funcionales, p. ej., para potenciar la solubilidad y/o estabilidad.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención se optimizan de acuerdo con la metodología de "consenso funcional" descrita en la solicitud PCT N° de serie PCT/EP2008/001958, titulada "Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies", presentada el 12 de marzo de 2008. Por ejemplo, los inmunoligantes de TNFa de la invención se pueden comparar con una base de datos de scFv seleccionados funcionalmente para identificar posiciones de residuos de aminoácidos que son más o menos tolerantes a la variabilidad que la posición o posiciones correspondientes en el inmunoligante de VEGF, indicando con ello que este tipo de posición o posiciones de residuos identificadas puede ser adecuado para la modificación para mejorar la funcionalidad, tal como la estabilidad y/o solubilidad.
Posiciones de marco ilustrativas para la sustitución se describen en la solicitud PCT N° PCT/CH2008/000285, titulada "Methods of Modifying Antibodies, and Modified Antibodies with Improved Functional Properties", presentada el 25 de junio de 2008, y la solicitud PCT N° PCT/CH2008/000284, titulada "Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies", presentada el 25 de junio de 2008. Por ejemplo, una o más de las siguientes sustituciones pueden introducirse en una posición de aminoácido (se hace referencia a la numeración AHo para cada una de las posiciones de aminoácidos enumeradas a continuación) en la región variable de la cadena pesada de un inmunoligante de la invención:
(a) Q o E en la posición de aminoácido 1;
(b) Q o E en la posición de aminoácido 6;
(c) T, S o A en la posición de aminoácido 7, más preferiblemente T o A, incluso más preferiblemente T; (d) A, T, P, V o D, más preferiblemente T, P, V o D, en la posición de aminoácido 10;
(e) L o V, más preferiblemente L, en la posición de aminoácido 12;
(f) V, R, Q, M o K, más preferiblemente V, R, Q o M en la posición de aminoácido 13;
(g) R, M, E, Q o K, más preferiblemente R, M, E o Q, incluso más preferiblemente R o E, en la posición de aminoácido 14;
(h) L o V, más preferiblemente L, en la posición de aminoácido 19;
(i) R, T, K o N, más preferiblemente R, T o N, incluso más preferiblemente N, en la posición de aminoácido 20;
(j) I, F, L o V, más preferiblemente I, F o L, incluso más preferiblemente I o L, en la posición de aminoácido 21;
(k) R o K, más preferiblemente K, en la posición de aminoácido 45;
(l) T, P, V, A o R, más preferiblemente T, P, V o R, incluso más preferiblemente R, en la posición de aminoácido 47;
(m) K, Q, H o E, más preferiblemente K, H o E, incluso más preferiblemente K, en la posición de aminoácido 50;
(n) M o L, más preferiblemente I, en la posición de aminoácido 55;
(o) K o R, más preferiblemente K, en la posición de aminoácido 77;
(p) A, V, L o I, más preferiblemente A, L o I, incluso más preferiblemente A, en la posición de aminoácido 78; (q) E, R, T o A, más preferiblemente E, T o A, incluso más preferiblemente E, en la posición de aminoácido 82;
(r) T, S, I o L, más preferiblemente T, S o L, incluso más preferiblemente T, en la posición de aminoácido 86; (s) D, S, N o G, más preferiblemente D, N o G, incluso más preferiblemente N, en la posición de aminoácido 87;
(t) A, V, L o F, más preferiblemente A, V o F, incluso más preferiblemente V, en la posición de aminoácido 89;
(u) F, S, H, D o Y, más preferiblemente F, S, H o D, en la posición de aminoácido 90;
(v) D, Q o E, más preferiblemente D o Q, incluso más preferiblemente D, en la posición de aminoácido 92; (w) G, N, T o S, más preferiblemente G, N o T, incluso más preferiblemente G, en la posición de aminoácido 95;
(x) T, A, P, F o S, más preferiblemente T, A, P o F, incluso más preferiblemente F, en la posición de aminoácido 98;
(y) R, Q, V, I, M, F o L, más preferiblemente R, Q, I, M, F o L, incluso más preferiblemente Y, incluso más preferiblemente L, en la posición de aminoácido 103; y
(z) N, S o A, más preferiblemente N o S, incluso más preferiblemente N, en la posición de aminoácido 107.
Adicional o alternativamente, se pueden introducir una o más de las siguientes sustituciones en la región variable de la cadena ligera de un inmunoligante de la invención:
(aa) Q, D, L, E, S o I, más preferiblemente L, E, S o I, incluso más preferiblemente L o E, en la posición de aminoácido 1;
(bb) S, A, Y, I, P o T, más preferiblemente A, Y, I, P o T, incluso más preferiblemente P o T, en la posición de aminoácido 2;
(cc) Q, V, T o I, más preferiblemente V, T o I, incluso más preferiblemente V o T, en la posición de aminoácido 3;
(dd) V, L, I o M, más preferiblemente V o L, en la posición de aminoácido 4;
(ee) S, E o P, más preferiblemente S o E, incluso más preferiblemente S, en la posición de aminoácido 7; (ff) T o I, más preferiblemente I, en la posición de aminoácido 10;
(gg) A o V, más preferiblemente A, en la posición de aminoácido 11;
(hh) S o Y, más preferiblemente Y, en la posición de aminoácido 12;
(ii) T, S o A, más preferiblemente T o S, incluso más preferiblemente T, en la posición de aminoácido 14; (jj) S o R, más preferiblemente S, en la posición de aminoácido 18;
(kk) T o R, más preferiblemente R, en la posición de aminoácido 20;
(ll) R o Q, más preferiblemente Q, en la posición de aminoácido 24;
(mm) H o Q, más preferiblemente H, en la posición de aminoácido 46;
(nn) K, R o I, más preferiblemente R o I, incluso más preferiblemente R, en la posición de aminoácido 47; (oo) R, Q, K, E, T o M, más preferiblemente Q, K, E, T o M, en la posición de aminoácido 50;
(pp) K, T, S, N, Q o P, más preferiblemente T, S, N, Q o P, en la posición de aminoácido 53;
(qq) I o M, más preferiblemente M, en la posición de aminoácido 56;
(rr) H, S, F o Y, más preferiblemente H, S o F, en la posición de aminoácido 57;
(ss) I, V o T, más preferentemente V o T, R, incluso más preferentemente T, en la posición de aminoácido 74;
(tt) R, Q o K, más preferiblemente R o Q, incluso más preferiblemente R, en la posición de aminoácido 82; (uu) L o F, más preferiblemente F, en la posición de aminoácido 91;
(vv) G, D, T o A, más preferiblemente G, D o T, incluso más preferiblemente T, en la posición de aminoácido 92;
(xx) S o N, más preferiblemente N, en la posición de aminoácido 94;
(yy) F, Y o S, más preferiblemente Y o S, incluso más preferiblemente S, en la posición de aminoácido 101; y
(zz) D, F, H, E, L, A, T, V, S, G o I, más preferiblemente H, E, L, A, T,V, S, G o I, incluso más preferiblemente A o V, en la posición de aminoácido 103.
En otras realizaciones, los inmunoligantes de la invención comprenden una o más de las mutaciones potenciadoras de la solubilidad y/o estabilidad descritas en la Solicitud Provisional de EE.UU. N° de serie 61/075.692 titulada "Solubility Optimization of Immunobinders," presentada el 25 de junio de 2008. En determinadas realizaciones preferidas, el inmunoligante comprende una mutación potenciadora de la solubilidad en una posición de aminoácido seleccionada del grupo de posiciones de aminoácidos de cadena pesada que consiste en 12, 103 y 144 (convención de numeración AHo). En una realización preferida, el inmunoligante comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: (a) Serina (S) en la posición de aminoácido 12 de la cadena pesada; (b) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácido 103 de la cadena pesada; y (c) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácido 144 de la cadena pesada. En otra realización, el inmunoligante comprende las siguientes sustituciones: (a) Serina (S) en la posición de aminoácido 12 de la cadena pesada; (b) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácido 103 de la cadena pesada; y (c) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácido 144 de la cadena pesada.
Como se mencionó arriba, las combinaciones de las secuencias VL y VH, en particular de aquellas que tienen el mismo o esencialmente el mismo conjunto de secuencias CDR, pero diferentes secuencias marco, p. ej., debido a la presencia de las sustituciones arriba mencionadas, se pueden transponer y combinar mediante una secuencia de enlazador. Combinaciones ilustrativas, sin limitarse a, incluyen:
SEQ ID NO: 94
EP43 min
EÍVMTQSPSTLSASVGDRVHTCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG FSLSSGAMSWVRQAPGKGLEWVSVnSSGATYYASWAKGRFTISRDNSKNTI, YLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGPDDSNSMGTFDPWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 95
EP43max
EÍVMTQSPSTLSASVGDRVIIKCQASQSTSDWLAWYQQKPGItAPKLLIYGASR LASGFPSRFSGSGSGAEFTLTISGLEPADFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSG FSI.SSGAMSWVRQAPGRGLEWVGVIISSGATYYASWAKGRFTISKDTSKNTV YLQMNSLRAEDTAVYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 96
EP43minmax
EIVMTQSPSTLSASVGDRVnTCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSG FSLSSGA MSWRQAPGKGLEWVGVIISSGATYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNS LRAEDTAVYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 97
EP43max DHP
EIVMTQSPSTLSASVGDRVÍIKCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGFPSRFSGSGSGAEFTLTISGLEPADFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTVSGF SLSSG AMSWVRQAPGKGLEWVGVIISSGATYYASWAKGRFI1SKDTSKKTVYLQMN SLRAEDTATYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQGTSVTVSS SEQ ID NO: 98
EP43minmaxDHP
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGVPSRJFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTYLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSG AMSWVRQAPGKGLEWVGVIISSGATYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMN SLRAEDTATYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQGTSVTVSS SEQ ID NO: 99
EP43minmax VL T22K
EIVMTQSPSTLSASVGDRVEKCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLOYGASR LASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSG FSLSSGA MSWVRQAPGKGLEWVGVIiSSGATYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNS LRAEDTAVYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 100
EP43minmax VL: V58F
EIVMTQSPSTLSASVGDRV11TCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKELÍYGASR LASGFPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSG A MSWVRQAPGKGIJEWVGVnsSGATYYASWAKGRFTISKDTSKMTVYLQMNS LRAEDTAVYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQGTLVTYSS SEQ ID NO: 101
EP43minmax VL D81A
EWMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGVPSRF’SGSGSGAEFTLTISSLQPADFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCT\rSGFSLSSG A MSWVRQAPGKGLEWVGVIISSGATYYASWAKGRF11SKDTSKNTVYLQMNS LR.AEDTAVYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 102
EP43minmax VL Q79E
EIVMTQSPSTLSASVGDRVUTCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGVPSRFSGSGSGAEFTLTTSSLEPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSG A MSWVRQAPGKGLEWVGVnSSGATYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNS LRAEDTAVYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 103
EPImin
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDA STLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGSGTANGSFGQ GTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA AS GFTFSNDAISWVRQAPGKGLEWVSYTSDWS1RYYANWAQGRFTISRBNSKNT l y l q m n s l r a e d t a v y y c a k g a p g a g d n g iw g q g t l v t v s s
SEQ ID NO: 104
EPImax
Figure imgf000020_0001
SEQ ID NO: 105
EPIminmax EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDA
s t l a s g v p s r f s g s g s g a e f t l t is s l q p d d f a t y y c a g y y r s g s g t a n g s f g q GTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCT VSGIDLSNDAISWVRQAPGKGLEWYAYISDWSIRYYANWAQGRFTISKDTSK NTVYLQMNSLRAEDTATYYCARGAPGAGDNGIWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 106
EP6min
e iv m t q s p s t l s a s v g d r v iit c q a s e s iy s g l a w y q q k p g k a p k l l iy q a s t l ASGWSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGFGTSNVENPFGQGTKLT VLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSRY GVSWVRQAPGKGLEWVSTIGEAGRAYYANWARSRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYYCAKGEVFNNGWGAFNIWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 107
EP6max E1VMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASESIYSGLAWYQQKPGKAPKLLIYQASTL ASGVP SRFSGSGSGTDFTLAISSLQPDDF ATYY CQQGFGTSNVENPFGQGTKL TVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EV QLVESGGGLV QPGGSLRLS CTVSGFSLSR YGVS WVRQ APGKGLEWV GTIG EAGRAYYANWARSRSTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGEVFNN GWGAFNIWGQGTLVTVS S SEQ ID NO: 108
EP6minmax EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASESTYSGLAWYQQKPGKAPKLLIYQASTL ASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGFGTSNVENPFGQGTKLT VLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSRY GVSWVRQAPGKGLEWVGTIGEAGRAYYANWARSRSTISRDTSKNTVYLQM NSLRAEDTAVYYCARGEVFNNGWGAFMWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 109
EP15min EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEMYTSLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTL ASGVPSRESGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGFATSNVENPFGQGTKLT VLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRY GVSWVRQAPGKGLEWVSAIGETGRAYYANWAKSRFTTSRDNSKNTT.YI.QMN SLRAEDTAVYYCAKGEEFNNGWGAFN1WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 110
EP15max EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASENIYTSLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTL ASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGFATSNVENPFGQGTK1T VLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSE V QLVESGGGS V QPGGSLRLSCTVSGFSLSRY GVSWVRQAPGKGLEWVGAIGETGRAYYANWAKSRSTISRDTSKNTVYLQM NSLRAEDTATYYCARGEEFNNGWGAFNIWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 111
EP15minmax
e iv m t q s p s t l s a s v g d r v iit c q a s e n iy t s l a w y q q k p g k a p k l l iy s a s t l ASGVPSRPSGSGSGAEFTLTTSSLQPDDFATYYCQQGFATSNVENPFGQGTKLT VLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTVSGFSLSRY GVSWVRQAPGKGLEWVGAIGETGRAYYANWAKSRSTISRDTSKNTVYLQM NSLRAEDTATYYCARGEEFNNrGWGAFNIWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 112
EP19minmod EÍVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASDNIYRGLAWYQQKPGKAPKLLIYDAST LQSGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCLGVYGYSSDDGAAFGQGT KLTVLGGGCtCtSGGGGSGGGGSGCtGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFSLNSNEISWRQAPGKGLEWVSYIGNGGMTHYASWAKGRFTISRDNSKOT LYLQMNSI.RAEDTAVYYCAKSVEYTDLYYLNTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 113
EP19maxmod EIVMTQSPSTLSASVGDRVIÍTCQAlSDNIYRGLA'VVYQQKPGKAPKLLIYDAST LQSGVPSRJFSGSGSGTQFTLTISSLQPDDFATYYCLGVYGYSSDDGAAFGQGT KLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS GFSLNSNEISWYRQAPGKGLEWVGYIGNGGMTHYASWAKGRFTISRDTSKN TVYLQMNSERAEDTAVYYCASSVEYTDLYYLNTWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 114
EP34min EIVMTQSPSTLSASVGDR^ITCQSSQSVYGNIWMAWYQQKPGKAPKLLIYQA SKLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGT KLTVLGGGCtGSGCtGGSGGGCiSGGGGSEVQLVESGCtGLVQPGGSLRLSCAAS GFTISRSYWICWVRQAPGKGLEWVSCIYGDNDITPLYANWAKGRFTISRD'NS KNTL YLQMNSLRAEDTAVYY CAKLGY AD YAYDLWGQGTLVTVS S SEQ ID NO: 115
EP34max EIVMTQSPSTLSASLGDRVIITCQSSQSVYGNIWMAWYQQKSGKAPKLLIYQA SKLASGVPSRFSGSGSGAEFSLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGT KLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS GFTISRSYWICWVRQAPGKGLEWVACTYGDNDITPLYANWAKGRFPVSTDTS KNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGYADYAYDLWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 116
EP35min EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISNLLAWYQQKPGKAPKLLIYAASia ASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSHTNVDNTFGQGTKL TVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSV GYWICWVRQAPGRGLEWVSC1DAGTSGGTYYATWAKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDT AVY Y C AKGVS SN GY YFKI, WGQGTLVT V S S
SEQ ID NO: 117
EP35max E1VMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISNLLAWYQQKPGKAPKLLIVAASKL ASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSHTNVDNTFGQGTKL TVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFSFSVG YWICWVRQAPGKGLEWVACIDAGTSGGTYYATWAKGRFTISKDTSKNTVYL QMNS1JR AEDTATYYC ARGVSSNGYYFKL WGQGTTVTV SS
SEQ ID NO: 118
EP35minmax EFVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISNLLAWYQQKPGKAPKLLIYAASKL ASGVPSKFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSITTNVDNTFGQGTKL TVLG GGGG5GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFSFSVG YWTCWVRQAPGKGLEWVACIDAGTSGGTYYATWAKGRFTISKDTSKNTVYL QMNSLRAEDTATYYCARGVSSNGYYFfa-WGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 119
EP42min
EIVMTQSPSTLSASYGDRVUTCQSTESVYKNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDA STLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGFGTANGSFGQ GTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFRNDAISWVRQAPGKGLEWVSYTSDWGIKYYASWVKGRFTISRDNSK NTL YLQMNS LRAEDT AV YY C AKGAPGAGDN GIWGQGTLVTV S S SEQ ID NO: 120
EP42max
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYI.AWYQQKPGKAPKLUYDA
STLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTÍSSLQPDDFATYYCAGYYRSGFGTANGSFGQ GTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCT VSGIDL.RNDAISWVRQAPGKGLEWVSYISDWGIKYYASWVKGRFTISKDTSK
NTVYLQMNSLRAEDTATYYCARGAPGAGDNGÍWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 121
EP42minmax
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDA STLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGFGTANGSFGQ GTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQI.VESGGGSVQPGGSLRLSCT
VSGIDLRNDAISWVRQAPGKGLEWVSYISDWGIKYYASWKGRFTISKDTSK NTVYLQMNSLRAEDTATYYCARGAPGAGDNGIWGQGTTVTVSS
En una realización preferida, una secuencia tiene al menos un 90% de identidad, más preferiblemente al menos un 95% de identidad y lo más preferiblemente un 100% de identidad con una cualquiera de las secuencias SEQ ID N° 94-121.
Usos de anticuerpos Anti-TNF
Para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos anti-TNF de la invención se administran a un mamífero, preferiblemente un ser humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable tal como las arriba comentadas, incluyendo aquellos que se pueden administrar a un ser humano por vía intravenosa tal como un bolo o por infusión continua a lo largo de un período de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. Los anticuerpos también se administran de forma adecuada por vía intratumoral, peritumoral, intralesional o perilesional, para ejercer efectos terapéuticos locales así como sistémicos.
Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad a tratar tal como se define arriba, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, terapia previa, historial clínico del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico tratante. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos.
Los anticuerpos anti-TNF son útiles en el tratamiento de enfermedades mediadas por el TNF. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 |jg/kg a aproximadamente 50 mg/kg (p. ej., 0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosis diaria o semanal típica puede variar desde aproximadamente 1 jg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg o más, dependiendo de los factores arriba mencionados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se repite hasta que se produzca la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden resultar útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales, que incluyen, por ejemplo, formación de imágenes radiográficas de tumores.
De acuerdo con otra realización de la invención, la eficacia del anticuerpo para prevenir o tratar la enfermedad puede mejorarse administrando el anticuerpo en serie o en combinación con otro agente que sea eficaz para esos fines, tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) de carácter ácido o básico o factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar las actividades coagulantes del factor tisular, la proteína C o la proteína S (véase Esmon et al., Publicación de Patente PCT N° WO 91/01753, publicada el 21 de febrero de 1991), un anticuerpo capaz de unirse al receptor HER2 (véase Hudziak et al., Publicación de Patente PCT N° WO 89/06692, publicada el 27 de julio de 1989 ), o uno o más agentes terapéuticos convencionales, tales como, por ejemplo, agentes alquilantes, antagonistas del ácido fólico, antimetabolitos del metabolismo del ácido nucleico, antibióticos, análogos de pirimidina, 5-fluorouracilo, cisplatino, nucleósidos de purina, aminas, aminoácidos, nucleósidos de triazol o corticosteroides. Dichos otros agentes pueden estar presentes en la composición que se administra o pueden administrarse por separado. Además, el anticuerpo se administra de manera adecuada en serie o en combinación con tratamientos radiológicos, ya sea que impliquen irradiación o administración de sustancias radiactivas.
Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse como agentes de purificación por afinidad. En este procedimiento, los anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida, tal como una resina Sephadex o un papel de filtro, utilizando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene la proteína TNF (o un fragmento de la misma) a purificar, y luego el soporte se lava con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material de la muestra excepto la proteína TNF, que está unida al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado, tal como tampón de glicina, pH 5,0, que liberará la proteína TNF del anticuerpo.
Anticuerpos anti-TNF también pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico para la proteína TNF, p. ej., detectando su expresión en células, tejidos o suero específicos. Métodos de diagnóstico de este tipo pueden ser útiles en el diagnóstico de cáncer.
Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo se marcará típicamente con un resto detectable. Hay numerosas etiquetas disponibles que generalmente se pueden agrupar en las siguientes categorías:
(a) Radioisótopos, tales como 111 In, 99Tc,. 14C, 131I, 125I, 3H, 32P o 35S. El anticuerpo puede marcarse con el radioisótopo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, Volúmenes 1 y 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, Nueva York, N.Y., Pubs. (1991) por ejemplo, y la radiactividad se puede medir utilizando recuento por centelleo.
(b) Se encuentran disponibles marcadores fluorescentes tales como quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, lisamina, ficoeritrina y rojo Texas. Los marcadores fluorescentes se pueden conjugar con el anticuerpo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo. La fluorescencia se puede cuantificar utilizando un fluorímetro.
(c) Se encuentran disponibles diversos marcadores enzima-sustrato y la Pat. De EE.UU N° 4.275.149 proporciona una revisión de algunos de estos. La enzima cataliza generalmente una alteración química del sustrato cromogénico que se puede medir utilizando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede medirse espectrofotométricamente. Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia se describen arriba. El sustrato quimioluminiscente se excita electrónicamente mediante una reacción química y luego puede emitir luz que puede medirse (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona energía a un aceptor fluorescente. Ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (p. ej., luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; Pat. de EE.UU. N° 4.737.456 ), luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa, tal como como peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina,.beta.-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (p. ej., glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Técnicas para conjugar enzimas con anticuerpos se describen en O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, en Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, Nueva York, 73:147-166 (1981). Ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato incluyen, por ejemplo:
(i) Peroxidasa de rábano picante (HRPO) con hidrógeno peroxidasa como sustrato, en donde la hidrógeno peroxidasa oxida un precursor de colorante (p. ej., ortofenilendiamina (OPD) o hidrocloruro de 3,3',5,5-tetrametilbencidina (TMB));
(ii) fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de para-nitrofenilo como sustrato cromogénico; y
(iii) beta.-D-galactosidasa (.beta.-D-Gal) con un sustrato cromogénico (p. ej., P-nitrofenil-.beta.-D-galactosidasa) o sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-.beta.-D- galactosidasa.
Los expertos en la técnica disponen de numerosas otras combinaciones de enzima-sustrato. Para una revisión general de estos, véanse las Pat. de EE.UU. N°s 4.275.149 y 4.318.980. A veces, el marcador se conjuga indirectamente con el anticuerpo. El experto en la materia conocerá diversas técnicas para conseguir esto. Por ejemplo, el anticuerpo se puede conjugar con biotina y cualquiera de las tres amplias categorías de marcadores mencionadas anteriormente se puede conjugar con avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a la avidina y, por lo tanto, el marcador se puede conjugar con el anticuerpo de esta manera indirecta. Alternativamente, para lograr la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo, el anticuerpo se conjuga con un pequeño hapteno (p. ej., digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcadores arriba mencionados se conjuga con un anticuerpo antihapteno (p. ej., anticuerpo anti-digoxina). Por lo tanto, se puede lograr la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo.
En otra realización de la invención, no es necesario marcar el anticuerpo anti-TNF, y su presencia puede detectarse utilizando un anticuerpo marcado que se une al anticuerpo TNF.
Los anticuerpos de la presente invención se pueden emplear en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitiva, ensayos en sándwich directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, págs.147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
Los ensayos de unión competitiva se basan en la capacidad de un patrón marcado de competir con el analito de la muestra de prueba para unirse con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de proteína TNF en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de patrón que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de patrón que se une, los anticuerpos generalmente se insolubilizan antes o después de la competición, de modo que el patrón y el analito que se unen a los anticuerpos pueden separarse convenientemente del patrón y del analito que permanecen sin unir.
Los ensayos en sándwich implican el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción inmunogénica diferente, o epítopo, de la proteína que se ha de detectar. En un ensayo en sándwich, el analito de la muestra de prueba se une a un primer anticuerpo que se inmoviliza sobre un soporte sólido y, posteriormente, un segundo anticuerpo se une al analito, formando así un complejo insoluble de tres partes. Véase, p. ej., la Pat. de EE.UU. N° 4.376.110. El segundo anticuerpo puede estar marcado por sí mismo con un resto detectable (ensayos directos en sándwich) o puede medirse utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina marcado con un resto detectable (ensayo en sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo en sándwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso el resto detectable es una enzima.
Para la inmunohistoquímica, la muestra de tumor puede ser fresca o congelada o puede estar embebida en parafina y fijada con un conservante tal como formalina, por ejemplo.
Los anticuerpos también pueden utilizarse para ensayos de diagnóstico in vivo. Generalmente, el anticuerpo se marca con un radionucleido (tal como.sup.111 In,. 99Tc,. 14C,. 131 I, 125 I, 3 H, 32 P o 35 S), de modo que el tumor pueda localizarse utilizando inmunocentelleo.
El anticuerpo de la presente invención se puede proporcionar en un kit, una combinación empaquetada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. En los casos en los que el anticuerpo está marcado con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (p. ej., un sustrato precursor que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, se pueden incluir otros aditivos tales como estabilizadores, tampones (p. ej., un tampón de bloque o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos se pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse en forma de polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo excipientes que al disolverse proporcionarán una solución de reactivo que tenga la concentración apropiada.
Preparaciones Farm acéuticas
En un aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-TNF para el tratamiento de enfermedades mediadas por el TNF. La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a preparaciones que están en una forma tal que permiten que la actividad biológica del anticuerpo o derivado de anticuerpo sea inequívocamente eficaz, y que no contienen componentes adicionales que sean tóxicos para los sujetos a los que se administraría la formulación. Excipientes "farmacéuticamente aceptables" (vehículos, aditivos) son aquellos que pueden administrarse razonablemente a un mamífero en cuestión para proporcionar una dosis eficaz del ingrediente activo empleado.
Una formulación "estable" es aquella en la que el anticuerpo o derivado de anticuerpo en la misma conserva esencialmente su estabilidad física y/o estabilidad química y/o actividad biológica tras el almacenamiento. Diversas técnicas analíticas para medir la estabilidad de las proteínas están disponibles en la técnica y se revisan en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993), por ejemplo. La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada durante un período de tiempo seleccionado. Preferiblemente, la formulación es estable a temperatura ambiente (aproximadamente 30° C) o a 40° C durante al menos 1 mes y/o estable a aproximadamente 2-8° C durante al menos 1 año durante al menos 2 años. Además, la formulación es preferiblemente estable después de congelar (p. ej., a -70°C) y descongelar la formulación.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo "conserva su estabilidad física" en una formulación farmacéutica si no muestra signos de agregación, precipitación y/o desnaturalización tras el examen visual del color y/o la claridad, o según lo medido por dispersión de luz UV o cromatografía de exclusión por tamaño.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo "conserva su estabilidad química" en una formulación farmacéutica, si la estabilidad química en un momento dado es tal que se considera que la proteína aún conservará su actividad biológica tal como se define más adelante. La estabilidad química se puede evaluar detectando y cuantificando formas químicamente alteradas de la proteína. La alteración química puede implicar una modificación del tamaño (p. ej., recorte) que puede evaluarse utilizando cromatografía de exclusión por tamaño, SDS-PAGE y/o desorción/ionización láser asistida por una matriz con detección de masas por tiempo de vuelo (MALDI/TOF MS), por ejemplo. Otros tipos de alteración química incluyen la alteración de la carga (p. ej., que se produce como resultado de la desamidación) que puede evaluarse mediante cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo "conserva su actividad biológica" en una formulación farmacéutica, si la actividad biológica del anticuerpo en un momento dado está dentro de aproximadamente el 10% (dentro de los errores del ensayo) de la actividad biológica exhibida en el momento en el que la formulación se preparó según se determinó en un ensayo de unión a antígeno, por ejemplo. Otros ensayos de "actividad biológica" para anticuerpos se elaboran aquí a continuación.
Por "isotónico" se entiende que la formulación de interés tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas generalmente tendrán una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. La isotonicidad se puede medir utilizando, por ejemplo, un osmómetro de presión de vapor o de tipo congelador.
Un "poliol" es una sustancia con múltiples grupos hidroxilo e incluye azúcares (azúcares reductores y no reductores), alcoholes de azúcar y ácidos de azúcar. Polioles preferidos en esta memoria tienen un peso molecular que es menor que aproximadamente 600 kD (p. ej., en el intervalo de aproximadamente 120 a aproximadamente 400 kD). Un "azúcar reductor" es aquel que contiene un grupo hemiacetal que puede reducir los iones metálicos o reaccionar covalentemente con lisina y otros grupos amino en proteínas y un "azúcar no reductor" es uno que no tiene estas propiedades de un azúcar reductor. Ejemplos de azúcares reductores son fructosa, manosa, maltosa, lactosa, arabinosa, xilosa, ribosa, ramnosa, galactosa y glucosa. Azúcares no reductores incluyen sacarosa, trehalosa, sorbosa, melezitosa y rafinosa. Manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol y glicerol son ejemplos de alcoholes de azúcar. En cuanto a los ácidos de azúcar, estos incluyen L-gluconato y sales metálicas del mismo. Cuando se desea que la formulación sea estable a la congelación-descongelación, el poliol es preferiblemente uno que no cristalice a temperaturas de congelación (p. ej., -20°C) de manera que desestabilice el anticuerpo en la formulación. Azúcares no reductores tales como sacarosa y trehalosa son los polioles preferidos en esta memoria, prefiriéndose la trehalosa a la sacarosa, debido a la superior estabilidad en solución de la trehalosa.
Tal como se utiliza en esta memoria, "tampón" se refiere a una solución tamponada que resiste los cambios de pH por la acción de sus componentes conjugados ácido-base. El tampón de esta invención tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,0; preferiblemente de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,5; y lo más preferiblemente tiene un pH de aproximadamente 5,0. Ejemplos de tampones que controlarán el pH en este intervalo incluyen acetato (p. ej., acetato de sodio), succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros tampones de ácidos orgánicos. En los casos en los que se desee una formulación estable a la congelacióndescongelación, el tampón preferiblemente no es fosfato.
En un sentido farmacológico, en el contexto de la presente invención, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un anticuerpo o derivado de anticuerpo se refiere a una cantidad eficaz en la prevención o el tratamiento de un trastorno, para cuyo tratamiento el anticuerpo o derivado de anticuerpo es eficaz. Una "enfermedad/un trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con el anticuerpo o derivado de anticuerpo. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicos y agudos, incluidas las afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión.
Un "conservante" es un compuesto que puede incluirse en la formulación para reducir esencialmente la acción bacteriana en la misma, facilitando así la producción de una formulación multiusos, por ejemplo. Ejemplos de conservantes potenciales incluyen cloruro de octadecildimetilbencil amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en la que los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromáticos, tales como fenol, alcohol butílico y bencílico, alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol. El conservante más preferido en esta memoria es alcohol bencílico.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más anticuerpos o compuestos derivados de anticuerpos, junto con al menos un soporte o excipiente fisiológicamente aceptable. Composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, uno o más de agua, tampones (p. ej., solución salina tamponada neutra o solución salina tamponada con fosfato), etanol, aceite mineral, aceite vegetal, dimetilsulfóxido, hidratos de carbono (p. ej., glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, adyuvantes, polipéptidos o aminoácidos, tales como glicina, antioxidantes, agentes quelantes, tales como EDTA o glutatión y/o conservantes. Como se indicó arriba, otros ingredientes activos pueden (pero no es necesario) incluirse en las composiciones farmacéuticas proporcionadas en esta memoria.
Un soporte es una sustancia que puede asociarse con un anticuerpo o derivado de anticuerpo antes de la administración a un paciente, a menudo con el fin de controlar la estabilidad o biodisponibilidad del compuesto. Soportes para uso en formulaciones de este tipo son generalmente biocompatibles y también pueden ser biodegradables. Soportes incluyen, por ejemplo, moléculas monovalentes o multivalentes, tales como albúmina sérica (p. ej., humana o bovina), albúmina de huevo, péptidos, polilisina y polisacáridos, tales como aminodextrano y poliamidoaminas. Soportes también incluyen materiales de soporte sólido, tales como perlas y micropartículas que comprenden, por ejemplo, polilactato, poliglicolato, poli(lactida-co-glicolida), poliacrilato, látex, almidón, celulosa o dextrano. Un soporte puede portar los compuestos de diversas formas, incluyendo la unión covalente (ya sea directamente o mediante un grupo enlazador), interacción no covalente o mezcla.
Composiciones farmacéuticas se pueden formular para cualquier forma apropiada de administración, incluyendo, por ejemplo, la administración tópica, oral, nasal, rectal o parenteral. En determinadas realizaciones, se prefieren composiciones en una forma adecuada para uso oral. Formas de este tipo incluyen, por ejemplo, píldoras, comprimidos, trociscos, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsión, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. Aún dentro de otras realizaciones, las composiciones proporcionadas en esta memoria pueden formularse como un liofilizado. El término parenteral, tal como se utiliza en esta memoria, incluye inyección subcutánea, intradérmica, intravascular (p. ej., intravenosa), intramuscular, espinal, intracraneal, intratecal e intraperitoneal, así como cualquier técnica de inyección o infusión similar.
Composiciones destinadas para uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y pueden contener uno o más agentes, tales como agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes con el fin de proporcionar preparaciones atractivas y apetecibles. Comprimidos contienen el ingrediente activo mezclado con excipientes fisiológicamente aceptables que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Excipientes de este tipo incluyen, por ejemplo, diluyentes inertes (p. ej., carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio), agentes granulantes y desintegrantes (p. ej., almidón de maíz o ácido algínico), agentes aglutinantes (p. ej., almidón, gelatina o goma arábiga) y agentes lubricantes (p. ej., estearato de magnesio, ácido esteárico o talco). Los comprimidos pueden no estar recubiertos o pueden recubrirse mediante técnicas conocidas para retrasar la desintegración y la absorción en el tracto gastrointestinal y con ello proporcionar una acción sostenida a lo largo de un período más largo. Por ejemplo, se puede emplear un material de retardo de tiempo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.
Las formulaciones para uso oral también pueden presentarse en forma de cápsulas de gelatina dura en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte (p. ej., carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín), o en forma de cápsulas de gelatina blanda en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio de aceite (p. ej., aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva). Las suspensiones acuosas contienen el anticuerpo o derivado de anticuerpo mezclado con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Excipientes de este tipo incluyen agentes de suspensión (p. ej., carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidropropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia); y agentes dispersantes o humectantes (p. ej., fosfátidos que se producen de forma natural, tales como lecitina, productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos tales como estearato de polioxietileno, productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga tales como heptadecaetilenoxicetanol, productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol tal como monooleato de polietilensorbitán). Las suspensiones acuosas también pueden comprender uno o más conservantes, por ejemplo p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes aromatizantes y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina. Los jarabes y elixires se pueden formular con agentes edulcorantes, tales como glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa. Formulaciones de este tipo también pueden comprender uno o más agentes demulcentes, conservantes, aromatizantes y/o agentes colorantes.
Las suspensiones oleosas se pueden formular suspendiendo los ingredientes activos en un aceite vegetal (p. ej., aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco) o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante tal como cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Pueden añadirse agentes edulcorantes, tales como los arriba recogidos y/o agentes aromatizantes para proporcionar preparaciones orales agradables. Estas suspensiones se pueden conservar mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.
Polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el ingrediente activo mezclado con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. Agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados se ejemplifican por los ya mencionados arriba. También pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo, agentes edulcorantes, aromatizantes y colorantes.
Composiciones farmacéuticas también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal (p. ej., aceite de oliva o aceite de cacahuete), un aceite mineral (p. ej., parafina líquida) o una mezcla de los mismos. Agentes emulsionantes adecuados incluyen gomas que se producen de forma natural (p. ej., goma arábiga o goma de tragacanto), fosfátidos que se producen de forma natural (p. ej., soja, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol), anhídridos (p. ej., mono-oleato de sorbitán) y productos de condensación de ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol con óxido de etileno (p. e/'.,mono-oleato de polioxietilensorbitán). Una emulsión también puede comprender uno o más agentes edulcorantes y/o aromatizantes.
La composición farmacéutica se puede preparar como una suspensión acuosa u oleosa inyectable estéril en la que el modulador, dependiendo del vehículo y de la concentración utilizados, se suspende o se disuelve en el vehículo. Una composición de este tipo se puede formular de acuerdo con la técnica conocida utilizando agentes dispersantes, humectantes y/o agentes de suspensión adecuados, tales como los arriba mencionados. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran agua, 1,3-butanodiol, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, se pueden emplear aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite fijo suave, incluidos mono- o di-glicéridos sintéticos. Además, se pueden utilizar ácidos grasos tales como ácido oleico en la preparación de composiciones inyectables, y se pueden disolver en el vehículo adyuvantes, tales como anestésicos locales, conservantes y/o agentes tampón.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse como formulaciones de liberación sostenida (es.decir, una formulación tal como una cápsula que efectúa una liberación lenta del modulador después de la administración). Generalmente, formulaciones de este tipo pueden prepararse utilizando tecnología bien conocida y administrarse, por ejemplo, mediante implantación oral, rectal o subcutánea, o mediante implantación en el sitio objetivo deseado. Soportes para uso en formulaciones de este tipo son biocompatibles y también pueden ser biodegradables; preferiblemente, la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación de modulador. La cantidad de un anticuerpo o derivado de anticuerpo contenida en una formulación de liberación sostenida depende, por ejemplo, del sitio de implantación, de la velocidad y de la duración esperada de la liberación y la naturaleza de la enfermedad/del trastorno que se ha de tratar o prevenir.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpos proporcionados en esta memoria se administran generalmente en una cantidad que alcanza una concentración en un fluido corporal (p. ej., sangre, plasma, suero, CSF, líquido sinovial, linfa, líquido intersticial celular, lágrimas u orina) que es suficiente para unirse de forma detectable al TNF y prevenir o inhibir enfermedades/trastornos mediados por TNF. Se considera que una dosis es eficaz si da como resultado un beneficio discernible para el paciente tal como se describe en esta memoria. Dosis sistémicas preferidas varían de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 140 mg por kilogramo de peso corporal por día (aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 7 g por paciente por día), siendo las dosis orales en general aproximadamente 5-20 veces más altas que las dosis intravenosas. La cantidad de anticuerpo o derivado de anticuerpo que puede combinarse con los materiales de soporte para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del huésped tratado y del modo particular de administración. Formas unitarias de dosificación contendrán generalmente entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 500 mg de un ingrediente activo.
Las composiciones farmacéuticas se pueden empaquetar para tratar afecciones que responden a un anticuerpo o derivado de anticuerpo dirigido al TNF. Las composiciones farmacéuticas empaquetadas pueden incluir un recipiente que contenga una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo o derivado de anticuerpo tal como se describe en esta memoria e instrucciones (p. ej. etiquetado) que indiquen que la composición contenida se utilizará para tratar una enfermedad/un trastorno que responde a un anticuerpo o derivado de anticuerpo después de la administración en el paciente.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpos de la presente invención también pueden modificarse químicamente. Grupos modificadores preferidos son polímeros, por ejemplo, un polímero de polialqueno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituido, o un polisacárido ramificado o no ramificado. Un grupo efector de este tipo puede aumentar la semivida del anticuerpo in vivo. Ejemplos particulares de polímeros sintéticos incluyen poli(etilenglicol) (PEG), poli(propilenglicol), poli(alcohol vinílico) de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituidos, o derivados de los mismos. Polímeros que se producen de forma natural particulares incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glicógeno o derivados de los mismos. El tamaño del polímero se puede variar según se desee, pero generalmente estará en un intervalo de pesos moleculares medios de 500 Da a 50000 Da. Para la aplicación local en la que el anticuerpo está diseñado para penetrar en el tejido, un peso molecular preferido del polímero es de alrededor de 5000 Da. La molécula de polímero se puede fijar al anticuerpo, en particular al extremo C-terminal de la cadena pesada del fragmento Fab mediante un péptido bisagra enlazado covalentemente, tal como se describe en el documento WO0194585. Con respecto a la unión de restos de PEG, se hace referencia a "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnological and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nueva York y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, Nueva York.
Después de la preparación del anticuerpo o derivado de anticuerpo de interés tal como se describe arriba, se prepara la formulación farmacéutica que lo comprende. El anticuerpo a formular no ha sido sometido a liofilización previa y la formulación de interés en esta memoria es una formulación acuosa. Preferiblemente, el anticuerpo o derivado de anticuerpo en la formulación es un fragmento de anticuerpo, tal como un scFv. La cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo presente en la formulación se determina teniendo en cuenta los volúmenes de dosis deseados y el o los modos de administración, por ejemplo. De aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml y lo más preferiblemente de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml es una concentración de anticuerpo ilustrativa en la formulación.
Se prepara una formulación acuosa que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo en una solución tamponada de pH. El tampón de esta invención tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,0; preferiblemente de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,5; y lo más preferiblemente tiene un pH de aproximadamente 5,0. Ejemplos de tampones que controlarán el pH dentro de este intervalo incluyen acetato (p. ej., acetato de sodio), succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros tampones de ácidos orgánicos. La concentración de tampón puede ser de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, preferiblemente de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM, dependiendo, por ejemplo, del tampón y de la isotonicidad deseada de la formulación. El tampón preferido es acetato de sodio (aproximadamente 10 mM), pH 5,0.
En la formulación se incluye un poliol, que actúa como tonificante y puede estabilizar el anticuerpo. En realizaciones preferidas, la formulación no contiene una cantidad tonificante de una sal tal como cloruro de sodio, ya que esto puede hacer que el anticuerpo o derivado de anticuerpo precipite y/o puede resultar en oxidación a pH bajo. En realizaciones preferidas, el poliol es un azúcar no reductor, tal como sacarosa o trehalosa. El poliol se añade a la formulación en una cantidad que puede variar con respecto a la isotonicidad deseada de la formulación. Preferiblemente, la formulación acuosa es isotónica, en cuyo caso las concentraciones adecuadas del poliol en la formulación están en el intervalo de aproximadamente 1% a aproximadamente 15% p/v, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 2% a aproximadamente 10% p/v, por ejemplo. Sin embargo, también pueden ser adecuadas formulaciones hipertónicas o hipotónicas. La cantidad de poliol añadido también puede variar con respecto al peso molecular del poliol. Por ejemplo, se puede añadir una cantidad menor de un monosacárido (p. ej., manitol), en comparación con un disacárido (tal como trehalosa).
También se añade un tensioactivo a la formulación de anticuerpo o derivado de anticuerpo. Tensioactivos ilustrativos incluyen tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos (p. ej., polisorbatos 20, 80, etc.) o poloxámeros (p. ej., poloxámero 188). La cantidad de tensioactivo añadido es tal que reduce la agregación del anticuerpo/derivado de anticuerpo formulado y/o minimiza la formación de materiales en partículas en la formulación y/o reduce la adsorción. Por ejemplo, el tensioactivo puede estar presente en la formulación en una cantidad de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,5%, preferiblemente de aproximadamente 0,005% a aproximadamente 0,2% y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,1%.
En una realización, la formulación contiene los agentes arriba identificados (es decir, anticuerpo o derivado de anticuerpo, tampón, poliol y tensioactivo) y está esencialmente libre de uno o más conservantes, tales como alcohol bencílico, fenol, m-cresol, clorobutanol y bencetonio Cl. En otra realización, se puede incluir un conservante en la formulación, particularmente en los casos en los que la formulación es una formulación multidosis. La concentración de conservante puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 2%, más preferiblemente de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1%. Uno o más soportes, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables tales como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 21a edición, Osol, A. Ed. (2006)pueden incluirse en la formulación, siempre que no afecten negativamente a las características deseadas de la formulación. Soportes, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen; agentes tampón adicionales; co-disolventes; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes tal como EDTA; complejos metálicos (p. ej., complejos de Zn-proteína); polímeros biodegradables tales como poliésteres; y/o contraiones formadores de sales, tales como sodio.
Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la preparación de la formulación.
La formulación se administra a un mamífero que necesita tratamiento con el anticuerpo, preferiblemente un ser humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como la administración intravenosa en forma de bolo o por infusión continua a lo largo de un período de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerobroespinal, subcutánea. intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. En realizaciones preferidas, la formulación se administra al mamífero mediante administración intravenosa. Para tales fines, la formulación puede inyectarse utilizando una jeringa o vía una línea IV, por ejemplo.
La dosificación apropiada ("cantidad terapéuticamente eficaz") del anticuerpo dependerá, por ejemplo, del tipo de enfermedad a tratar, de la gravedad y del curso de la enfermedad, de si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, del historial clínico del paciente y de la respuesta al anticuerpo, del tipo de anticuerpo utilizado y de la discreción del médico tratante. El anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra de forma adecuada al paciente de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos y se puede administrar al paciente en cualquier momento desde el diagnóstico en adelante. El anticuerpo o derivado de anticuerpo puede administrarse como único tratamiento o junto con otros fármacos o terapias útiles para tratar la afección en cuestión. El anticuerpo o derivado de anticuerpo puede administrarse como único tratamiento o en unión con otros fármacos o terapias útiles para tratar la afección en cuestión.
Como proposición general, la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o derivado de anticuerpo administrado estará en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal del paciente, ya sea mediante una o más administraciones, siendo el intervalo típico de anticuerpo utilizado aproximadamente de 0,3 a aproximadamente 20 mg/kg, más preferiblemente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 15 mg/kg, administrados diariamente, por ejemplo. Sin embargo, pueden resultar útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas convencionales.
A rtícu lo s de M anufactura
En otra realización de la invención, se proporciona un artículo de manufactura que comprende un recipiente que contiene la formulación farmacéutica de la presente invención, preferiblemente una formulación farmacéutica acuosa, y opcionalmente proporciona instrucciones para su uso. Recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales y jeringas. El recipiente puede estar formado por una diversidad de materiales, tales como de vidrio o plástico. Un recipiente ilustrativo es un vial de vidrio de un solo uso de 3-20 cc. Alternativamente, para una formulación multidosis, el recipiente puede ser un vial de vidrio de 3-100 cc. El recipiente contiene la formulación y la etiqueta en, o asociada con el recipiente puede indicar instrucciones de uso. El artículo de manufactura puede incluir, además, otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso.
E jem plificación
La presente divulgación se ilustra, además, mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes adicionales. A lo largo de los ejemplos se utilizaron los siguientes materiales y métodos, a menos que se indique lo contrario.
Materiales y Métodos Generales
En general, la práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología (especialmente, p. ej., tecnología de anticuerpos) y técnicas estándares de preparación de polipéptidos. Véase, p. ej., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); y Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).
Mediciones de termoestabilidad
Se obtuvieron espectros de IR de transformada de Fourier de reflectancia total atenuada (FTIR-ATR) para diversas cadenas sencillas y moléculas de seguimiento utilizando la celda FT-IR Bio-ATR en un Tensor Bruker. Las moléculas se concentraron hasta 3 mg/ml y se dializaron durante la noche a 4°C frente a PBS, pH 6,5 y el flujo de tampón se recogió como blanco. Los perfiles de desnaturalización se obtuvieron enfrentando térmicamente las moléculas con un amplio intervalo de temperaturas en etapas de 5°C (25 a 95°C). Todas las manipulaciones de los espectros se realizaron utilizando el software OPUS. El tampón principal y el fondo atmosférico transitorio (CO2 y H2O) se restaron del espectro de proteínas. A continuación, se corrigió el espectro de proteína resultante en el valor de referencia y se determinó el espectro de amida de proteína I a partir de la anchura del pico resolvible más ancho en la región esperada. Los espectros de la segunda derivada se obtuvieron para los espectros de la banda de amida I utilizando una función polinomial de tercer grado con una derivada de la función. Los cambios en la estructura de la proteína se estimaron mediante el análisis de la segunda derivada de la amida I utilizando una curva de calibración lineal para los cálculos iniciales de ajuste de la curva, asumiendo una desnaturalización del 0% para las 3 mediciones inferiores y una desnaturalización del 100% para las 3 mediciones superiores. Los perfiles de desnaturalización se utilizaron para aproximar los puntos medios de las transiciones de despliegue térmico (TM) para cada variante que aplica el modelo sigmoidal de Boltzmann.
Mediciones de solubilidad
Se midió la solubilidad relativa de diversas moléculas de scFv después de potenciar la agregación de proteínas y la precipitación en presencia de sulfato de amonio. Se añadió sulfato de amonio a la proteína en soluciones acuosas para producir incrementos del 5% de saturación en la mezcla sal-proteína final. La precipitación en el intervalo dinámico se determinó empíricamente y los intervalos de saturación se redujeron en este intervalo a intervalos de saturación del 2,5% en la mezcla final. Después de la adición de sulfato de amonio, las muestras se mezclaron suavemente y se centrifugaron durante 30 minutos a 6000 rpm. La proteína restante en los sobrenadantes se recuperó para cada porcentaje de saturación de sulfato de amonio. Las curvas de solubilidad se determinaron midiendo la concentración de proteína en el sobrenadante utilizando el espectrofotómetro NanoDropTM 1000. Las mediciones de la proteína soluble restante en los sobrenadantes se normalizaron y se utilizaron para estimar los puntos medios de solubilidad relativa para cada una de las variantes que aplican el modelo sigmoidal de Boltzmann.
Prueba de Estabilidad a Corto Plazo
La proteína se examinó después de dos semanas de incubación a 40°C en busca de agregados solubles y productos de degradación. Las proteínas con una concentración de 10 mg/ml se dializaron durante la noche a 4°C frente a PBS con un amplio intervalo de pH (3,5, 4,5, 5,5, 6,5, 7,0, 7,5 y 8,5). La proteína de control con la misma concentración en tampón estándar PBS (pH 6,5) se almacenó a -80°C durante el período de 2 semanas. La determinación de las bandas de degradación por SDS-PAGE se realizó en los puntos de tiempo t = 0 y t = 14d y los agregados solubles se evaluaron en la SEC-HpLC. La determinación de la actividad restante después de 2 semanas a 40°C se realizó utilizando Biacore.
Ensayo de potencia
La actividad neutralizante de los ligantes anti-TNFa se evaluó en un ensayo de citotoxicidad L929 mediado por TNFa. La toxicidad de las células de fibroblastos de ratón L929 tratadas con Actinomicina se indujo con TNF humano (hTNF) recombinante. Se determinó que el 90% de la citotoxicidad máxima inducida por hTNF estaba a una concentración de TNF de 1000 pg/ml. Todas las células L929 se cultivaron en RPMI 1640 con rojo fenol, con medio de L-Glutamina complementado con suero de ternero fetal (al 10% v/v). La actividad neutralizante de aglutinantes anti-TNFa se evaluó en RPMI 1640 sin rojo fenol y suero de ternero fetal al 5%. Se añaden diferentes concentraciones (0 - 374 ng/mL) de ligantes anti-TNF a las células L929 en presencia de 1000 pg/ml de hTNF para determinar la concentración a la que el efecto antagonista alcanza la mitad de la inhibición máxima (CE50%) La curva de dosis-respuesta se ajustó con regresión sigmoidea no lineal con pendiente variable y se calculó la CE50.
Análisis de unión Biacore de scFvs anti-TNF
Para las mediciones de afinidad de unión a pH 5 y pH 7,4 (datos no mostrados), se emplearon mediciones de resonancia de plasmón de superficie con BIAcore™ -T100 utilizando un chip sensor NTA y TNF etiquetado con His (producido en ESBATech). La superficie del chip sensor de NTA consiste en una matriz de dextrano carboximetilado pre-inmovilizada con ácido nitrilotriacético (NTA) para la captura de moléculas etiquetadas con histidina mediante quelación Ni2 NTA. El níquel captura los trímeros N-his de TNFa humano (5 nM) a través de sus etiquetas his N-terminales y se inyecta ESBA105 (analito) a varias concentraciones que varían de 30 nM a 0,014 nM en etapas de dilución en serie de 3 veces. En la etapa de regeneración, el complejo formado por níquel, ligando y analito se elimina por lavado. Esto permite el uso de las mismas condiciones de regeneración para diferentes muestras. La señal de respuesta se genera mediante la tecnología de resonancia de plasmón de superficie (SPR) y se mide en unidades de resonancia (RU). Todas las mediciones se realizan a 25°C. Se generaron sensogramas para cada una de las muestras de scFv anti-TNF después de la corrección de la celda de referencia en línea seguida de la sustracción de la muestra de tampón. La constante de tasa de disociación aparente (kd), la constante de tasa de asociación aparente (ka) y la constante de equilibrio de disociación aparente (Kd) se calcularon utilizando el modelo de unión de Langmuir uno a uno con el software de evaluación BIAcore T100 versión 1.1.
Ejemplo 1:
Injerto de CDR y Humanización Funcional de anticuerpos monoclonales anti-TNF de conejo.
Injerto de CDR de Conejo
A diferencia de los métodos de humanización tradicionales que emplean el marco aceptor de anticuerpos humanos que comparte la mayor homología de secuencia con el anticuerpo donante no humano, las CDR de conejo se injertaron en el marco FW1.4 (SEQ ID N°s 1 y 2, unidas por un enlazador (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 72)) para generar un injerto Min o en el marco "en forma de conejo" rFW1.4 (SEQ ID N° 92) o su variante rFW1.4(v2) (Se Q ID N° 93) para generar un Max-injerto. Ambos marcos se seleccionaron principalmente por sus propiedades funcionales deseables (solubilidad y estabilidad), idoneidad estructural para adaptarse a una gran diversidad de CDRs de conejo y homología razonable con la secuencia consenso de dominio variable de conejo. El marco rFW1.4 es un derivado de FW1.4 que se diseñó adicionalmente con el objetivo de servir como marco aceptor universal para virtualmente cualquier conjunto de CDRs de conejo. Aunque la secuencia de marco estable y soluble FW1.4 exhibe una alta homología con los anticuerpos de conejo, no es la secuencia más homóloga disponible.
Identificación de residuos potencialmente implicados en la unión
Para cada una de las secuencias de dominio variable de conejo, se identificó el equivalente de la línea germinal de conejo más cercana. Si no se pudo establecer la línea germinal más cercana, la secuencia se comparó con el consenso del subgrupo o el consenso de secuencias de conejo con un alto porcentaje de similitud. Los residuos de marco raros se consideraron como posible resultado de la hipermutación somática y, por lo tanto, desempeñan un papel en la unión del antígeno. Por consiguiente, estos residuos se consideraron para el injerto en el marco aceptor rFW1.4 o rFW1.4 (v2) para generar Max-injertos. En particular, se injertaron residuos potencialmente implicados en el contacto directo con el antígeno o que influyen en la disposición de VL y VH. Se sustituyeron residuos adicionales descritos para influir en la estructura de la CDR si fuera necesario. No se realizaron sustituciones de marco cuando se injertaron CDRs en FW1.4 (Min-injertos). Se pueden identificar ejemplos de posiciones marco que se injertaron para obtener los Max-injertos tal como se describe en esta memoria haciendo un alineamiento de secuencia de las regiones marco de rFW1.4, rFW1.4 (v2) y las secuencias scFv de interés proporcionadas en esta memoria. Las herramientas web tal como se conocen en la técnica se pueden utilizar, por ejemplo, para dicho fin (p. ej., ClustalW disponible el 23 de junio de 2009 en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html o MultiAlin disponible el 23 de junio de 2009 en http://bioinfo.genotoul.fr/multalin). Todas las posiciones de marco en las que rFW1.4 y rFW1.4(v2) contienen el mismo residuo y en las que el scFv de interés revela un residuo diferente, son posiciones de marco que se injertaron para obtener los Max-injertos.
Transposición de dominios
Las cadenas ligeras variables de los Min-injertos se combinaron con los Max-injertos de cadena pesada variable para identificar combinaciones óptimas en términos de propiedades biofísicas (solubilidad y estabilidad) y actividad.
Clonación y expresión de scFvs
Los scFv descritos y caracterizados en esta memoria se produjeron como sigue. Las secuencias de VL humanizadas y las secuencias de VH humanizadas (SEQ ID NO: 51-88, sin SEQ ID NO: 72) se conectaron mediante el enlazador de SEQ ID NO: 72 para producir un scFv de la siguiente orientación: NH2-VL-enlazador-VH-COOH (véase, p. ej., SEQ ID NO: 94-121). En muchos casos, las secuencias de ADN que codifican los diversos scFv se sintetizaron de novo en el proveedor de servicios Entelechon GmbH (www.entelechon.com). Las inserciones de ADN resultantes se clonaron en el vector de expresión bacteriano pGMP002 a través de sitios de restricción NcoI y HindIII introducidos en el extremo 5' y 3' de la secuencia de ADN scFv, respectivamente. Entre la secuencia de ADN del dominio VL y el dominio VH se localiza un sitio de restricción BamHI. En algunos casos, el ADN que codifica scFv no se sintetizó de novo, pero las construcciones que expresan scFv se clonaron mediante transposición de dominios. Por consiguiente, los dominios VL se escindieron y se introdujeron en las nuevas construcciones mediante los sitios de restricción NcoI y BamHI, los dominios VH mediante los sitios de restricción BamHI y HindIII. En otros casos, se introdujeron mutaciones puntuales en el dominio VH y/o VL utilizando métodos de p Cr de ensamblaje de la técnica anterior. La clonación de GMP002 se describe en el Ejemplo 1 del documento WO2008006235. La producción del scFv se realizó de forma análoga a la de ESBA105 tal como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO2008006235.
Ejemplo 2: Perfilado y Selección de Anticuerpos Donantes de CDR de Conejo
El procedimiento experimental general que se siguió para la selección de anticuerpos de conejo ("RabMabs") con actividad inhibidora de TNF es el siguiente: Los anticuerpos de conejo se emplearon como anticuerpos donantes para CDRs en la generación de inmunoligantes de TNF altamente solubles. Los conejos se inmunizaron con TNFa antes de la esplenectomía. Se aislaron esplenocitos de los conejos para la generación de hibridomas. Se aisló un total de 44 hibridomas y se perfilaron los sobrenadantes de estos hibridomas para determinar la afinidad de unión, la potencia biológica y la especificidad de unión.
La Figura 1 representa la capacidad relativa de los sobrenadantes de los 44 hibridomas anti-TNF RabMab para neutralizar TNFa in vivo. La neutralización se testó midiendo la inhibición de la citotoxicidad de TNFa en fibroblastos L929 de ratón cultivados. Los sobrenadantes muestran diferentes eficacias en el ensayo con L929. Los valores de CE50 (concentración efectiva para lograr un 50% de inhibición) se determinaron en rastreos primarios (barras azules) y secundarios (barras rojas) y se normalizaron con respecto al mejor comportamiento en cada uno de los ensayos. La afinidad de unión al TNF también se midió mediante análisis BIACore para cada uno de los RabMabs (barras verdes).
Los RabMabs codificados por cada uno de los hibridomas también se secuenciaron y las secuencias se sometieron a análisis filogenético basado en la predicción de agrupaciones de epítopos. Se seleccionaron cuatro Rabmabs representativos (EPI-6, EPI-19, EPI-34 y EPI-43) con alta actividad de unión y potente actividad neutralizante de entre diferentes familias filogenéticas como anticuerpos donantes para injertos de CDR. Se seleccionaron cuatro (4) Rabmabs adicionales (EPI-1, EPI-15, EP-35 y EP-42) para el injerto de CDR basándose en su actividad favorable en un ELISA de secreción (véase la Figura 2).
Ejemplo 3: Injerto de CDR y Humanización Funcional de Anticuerpos Donantes de Conejo
A diferencia de los métodos de humanización tradicionales que emplean el marco aceptor de anticuerpos humanos que comparte la mayor homología de secuencia con el anticuerpo donante no humano, las CDRs de conejo se injertaron en un marco humano (FW 1.4) que fue preseleccionado por propiedades funcionales deseables (solubilidad y estabilidad) utilizando un ensayo de control de calidad. Aunque la secuencia de marco estable y soluble exhibió una alta homología con el RabMab, el anticuerpo aceptor seleccionado no es la secuencia más homóloga disponible.
Se generó un cierto número de injertos de CDR para cada uno de los rabmabs. El término "Min-injerto" o "min", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un dominio variable humanizado que se generó mediante el injerto de CDRs de conejo de un dominio variable de conejo en un marco aceptor humano de origen natural (FW 1.4, SEQ ID Nos. 1 y 2, enlazado por un enlazador (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 72)). No se realizan cambios en las regiones de marco. El marco en sí fue preseleccionado por sus propiedades funcionales deseables (solubilidad y estabilidad). El término "Max-injerto" o "max", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un dominio variable humanizado que se generó mediante el injerto de CDRs de conejo a partir de un dominio variable de conejo en el marco aceptor humano "conejo" "RabTor" (rFW14, SEQ ID NO 92), o en un derivado del mismo denominado rFW1.4 (v2) (Se Q ID NO 93). El marco "RabTor" se preparó incorporando residuos de conejo conservados (de lo contrario, que son bastante variables en otras especies) en posiciones del marco generalmente implicadas en la estructura y estabilidad del dominio variable del conejo, con el objetivo de generar un marco de aplicación universal que acepte virtualmente cualquier conjunto de CDRs de conejo sin la necesidad de injertar restos de marco del donante que no sean en posiciones que son diferentes en su presunta secuencia progenitora, p. ej., que se alteraron durante la hipermutación somática y, por lo tanto, posiblemente contribuyan a la unión del antígeno. La presunta secuencia progenitora se define como el equivalente de la línea germinal de conejo más cercana y, en caso de que no se pueda establecer el equivalente de la línea germinal más cercana, el consenso del subgrupo de conejo o el consenso de secuencias de conejo con un alto porcentaje de similitud. "Min-Max" o "minmax" se refieren a un dominio variable humanizado que consiste en una cadena ligera variable "Min-injerto" combinada con una cadena pesada variable "Max-injerto", mientras que "Max-Min" o "maxmin" se refieren a un dominio variable humanizado que consiste en una cadena ligera variable "Max-injerto" combinada con una cadena pesada variable "Min-injerto".
La Tabla 2 muestra un resumen de los datos de caracterización detallados para los anticuerpos de cadena sencilla humanizados que se originan a partir de ocho anticuerpos monoclonales de conejo o rabmabs diferentes (EP1, EP6, EP15, EP19, EP34, EP35, EP42 y EP43). Los llamados injertos "min" (p. ej., EP1min) se refieren a construcciones en las que solo se injertaron las CDRs del donante de conejo, mientras que para los denominados injertos "max", no solo las CDRs, sino también algunas posiciones de aminoácidos en el marco del donante fueron injertados. Adicionalmente, la Tabla 2 muestra los datos de dos anticuerpos de cadena sencilla marcados con His (EP34min_C-His y EP19max_C-His), así como el anticuerpo de cadena sencilla de referencia ESBA105 descrito en el documento WO 2006/131013. La tercera columna, a la que se aluden como "L929" indica las potencias relativas de los diferentes anticuerpos de cadena sencilla según se determina en un ensayo de L929 y en comparación con la potencia de ESBA105. Los valores de kon, koff y Kd se dan en unidades de M 'V , s_1 y M, respectivamente. La séptima columna da el punto medio del despliegue inducido térmicamente según se determina con FT-IR. La última columna indica el rendimiento relativo de proteína correctamente plegada obtenida de cuerpos de inclusión solubilizados después de un enfoque de replegamiento.
En la Figura 3 se dan algunos ejemplos de datos de BIACore que se incluyeron en la Tabla 2: Se muestran las cinéticas de unión para la unión de ESBA105 (Fig. 3a), EP43max (Fig. 3b) y EP34max (Fig. 3c) a TNFa humano. En la Figura 4 se dan ejemplos de ensayos de potencia celular, que compara ESBA105 (círculos negros) con EP43max (cuadrados en blanco) en un ensayo con L929. En las Figuras 9 y 10 se dan más ejemplos de ensayos de potencia celular que comparan EP34max con los anticuerpos comercializados infliximab y adalimumab.
Tabla 2: Resumen de los datos de caracterización detallados para los cuatro monoclonales de conejo (EP6, EP19, EP34 y EP4 ri n in r DR
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Ejemplo 4: Opt imización de la Solubi l idad y Estabi l idad de EP43max, un Potente Ligante de TNFa
Se seleccionó EP43max para una mayor optimización en función de su potente actividad de unión al TNF. La caracterización biofísica de este inmunoligante reveló que exhibe un alto punto medio de desnaturalización (Tm > 70 °C) en un ensayo de despliegue térmico (FTIR) (véase la Figura 5). No obstante, EP43max se sometió a optimización de solubilidad para estrechar su amplia fase de transición en el despliegue térmico. Con el fin de mejorar la solubilidad del EP43max nativo, las tres posiciones de residuos 12, 103 o 144 en la cadena VH se sustituyeron con aminoácidos con mayor hidrofilicidad. Se demostró que esta combinación aumenta la solubilidad de la proteína nativa sin afectar a la estabilidad o la actividad de unión. (V ^ S en la posición 12 de AHo, V ^ T en la posición 103 de AHo y L ^ T en la posición 144 de AI lo) se introdujeron para reemplazar los residuos hidrofóbicos en la interfaz del dominio V-C de la región de la cadena pesada variable (VH) de EP43max. Además de las mutaciones potenciadoras de la solubilidad, se identificaron nueve mutaciones estabilizadoras (T10S, K47R, Y57S, L91F y T103V en VL y E1Q, E6Q, S7T y V103L I en VH) en EP43max (véase la Tabla 3). Estos residuos estabilizadores se identificaron a partir de un análisis de consenso funcional de los marcos de control de calidad (QC) de ESBATech. Los residuos estabilizantes en las posiciones 1 y 3 en VL y en la posición 89 en VH ya estaban presentes en la molécula EP43max. Se identificó una mutación estabilizadora adicional (M ^ L) en la posición 4 de VL, pero se eliminó de la consideración basándose en su papel predicho en la unión del antígeno.
Tabla 3: Mutaciones estabilizadoras en EP43max
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Ejemplo 5: Variantes Opt imizadas de EP43max, un Potente Aglut inante de TNFa
Las Tablas 4 y 5 muestran los datos de caracterización para tres variantes optimizadas de EP43max. EP43_maxDHP es una variante de solubilidad mejorada de EP43max y comprende las tres mutaciones potenciadoras de la solubilidad anteriores (V ^ S en la posición 12 de AHo, V ^ T en la posición 103 de AHo y L ^ T en la posición 144 de AHo). Las variantes EP43_maxmin y EP43_minmax se generaron mediante la transposición de dominios entre injertos "min" y "max". P. ej., la variante "minmax" comprende la versión de injerto mínimo (solo CDR-injerto) de la cadena ligera y la versión de injerto máximo de la cadena pesada (es decir, c DRs de conejo injertadas más residuos de marco de conejo implicados en la unión de antígeno) mientras que la variante "maxmin" comprendía la versión de injerto máximo de la cadena ligera y la versión de injerto mínimo de la cadena pesada.
Tabla 4: D r riz i n r EP4 m x ri n l mi m
Figure imgf000034_0002
Tabla 5: D r riz i n r EP4 m x ri n l mi m
Figure imgf000034_0003
Las curvas de desnaturalización térmica de EP43max y sus variantes optimizadas se compararon mediante análisis FTIR (véase la Figura 6 y la Tabla 6). Se encontró que EP43minmax tiene un punto medio de despliegue más bajo que EP43max.
Tabla 6: Comparación de las curvas de desnaturalización térmica de EP43max y sus variantes optimizadas mediante análisis FTIR
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Además de ello, la variante mimax exhibió una transición de despliegue de una etapa, lo que indica que ambos dominios se despliegan a temperaturas muy similares. EP43 max (Figura 7A) y su variante EP43minmax (Figura 7B) se compararon adicionalmente en una prueba de esfuerzo térmico. El contenido de láminas beta y la concentración de proteína soluble se evaluaron después de la concentración térmica a temperaturas crecientes (50, 60 y 70 °C). EP43minmax fue considerablemente más estable que EP43max a la temperatura intermedia de 60°C.
Ejemplo 6: Comparaci ón de EP34max con l igantes de TNFa disponibles comercialmente
La capacidad de EP34max, Adalimumab e Infliximab de bloquear la actividad citotóxica de 1000 pg/ml de TNFalfa humano recombinante se comparó como se detalla anteriormente en un ensayo con L929. La capacidad de EP43max, Adalimumab e Infliximab de bloquear la actividad citotóxica de 10 pg/ml de TNFalfa humano recombinante se evaluó en un ensayo con Kym-1. Los resultados se muestran en las Figuras 9a, b y las Figuras 10a, b, respectivamente.
La Figura 9a ilustra la potencia de EP34max y Adalimumab para bloquear la actividad citotóxica de 1000 pg/ml de TNFalfa humano recombinante (células L929 murinas). Se determinó que la CI50 para EP34max y Adalimumab era 1,03 ng/ml y 8,45 ng/ml, respectivamente. La Figura 9b ilustra la potencia de Adalimumab y Ep34max de bloquear la actividad citotóxica de 10 pg/ml de TNFalfa humano recombinante (células Kym-1 humanas). Se determinó que la CI50 para Adalimumab y EP34max (791) era 66,2 ng/ml y 0,69 ng/ml, respectivamente.
La Figura 10a ilustra la potencia de EP34max e Infliximab para bloquear la actividad citotóxica de 1000 pg/ml de TNFalfa humano recombinante (células L929 murinas). Se determinó que la CI50 para EP34max e Infliximab era 1,04 ng/ml y 13,9 ng/ml, respectivamente. La Figura 10b ilustra la potencia de Infliximab y Ep34max (791) para bloquear la actividad citotóxica de 10 pg/ml de TNFalfa humano recombinante (células Kym-1 humanas). Se determinó que la CI50 para Infliximab y EP34max era 14,98 ng/ml y 0,63 ng/ml, respectivamente. Por lo tanto, en ambos casos, EP34max mostró un mejor comportamiento que Infliximab.
EQUIVALENTES
Numerosas modificaciones y realizaciones alternativas de la presente divulgación serán evidentes para los expertos en la técnica a la vista de la descripción anterior. Por consiguiente, esta descripción debe interpretarse como ilustrativa únicamente y tiene el propósito de enseñar a los expertos en la técnica el mejor modo de llevar a cabo la presente invención. En el caso de que una o más de la bibliografía incorporada y materiales similares difieran o contradigan esta solicitud, incluyendo expresiones y términos definidos, uso de expresiones y términos, técnicas descritas o similares, prevalece esta solicitud.
Los encabezamientos de las secciones que se utilizan en esta memoria son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes de la materia objeto descrita de modo alguno.
Si bien la presente divulgación se ha descrito junto con diversas realizaciones y ejemplos, no se pretende que las presentes enseñanzas se limiten a tales realizaciones o ejemplos.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un inmunoligante que se une específicamente al TNFa humano, comprendiendo el inmunoligante:
(i) una secuencia de marco variable de cadena pesada humana y secuencias de CDR H1, CDR H2 y CDR H3 que proceden de un inmunoligante de conejo, en donde el marco de la región variable de cadena pesada humana tiene al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 90, en donde el marco de la región variable de la cadena pesada comprende uno o más de los siguientes aminoácidos: treonina (T) en la posición 24, valina (V) en la posición 25, alanina (A) o glicina (G) en la posición 56, lisina (K) en la posición 82, treonina (T) en la posición 84, valina (V) en la posición 89 y arginina (R) en la posición 108 (numeración AHo); y
(ii) una secuencia de marco variable de la cadena ligera humana y secuencias de CDR L1, CDR L2 y CDR L3 que proceden de un inmunoligante de conejo, en donde la secuencia de marco de la región variable de la cadena ligera humana tiene al menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 91,
en donde las secuencias de dicha CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 y CDR L3 que proceden de un inmunoligante de conejo son: SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38, respectivamente.
2. El inmunoligante de la reivindicación 1, en donde el inmunoligante comprende una sustitución potenciadora de la solubilidad en las posiciones 12, 103 y 144 de la cadena pesada (numeración AHo).
3. El inmunoligante de la reivindicación 2, en donde la sustitución potenciadora de la solubilidad se selecciona del grupo que consiste en: (a) Serina (S) en la posición 12; (b) Treonina (T) en la posición 103; y (c) treonina (T) en la posición 144.
4. El inmunoligante de la reivindicación 1, que comprende:
una región variable de cadena pesada (VH) que tiene una secuencia de al menos 90% de identidad con SEQ ID NO: 77 o SEQ ID NO: 79, y una región variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos 90% de identidad con SEQ ID NO: 78 o SEQ ID NO: 80.
5. El inmunoligante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que es un anticuerpo, scFv, Fab o Dab.
6. Una composición que comprende el inmunoligante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un soporte farmacéuticamente aceptable.
7. La composición de la reivindicación 6, formulada para la administración tópica, oral, nasal, rectal o parenteral.
8. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una región de cadena pesada variable (VH) o una región de cadena ligera variable (VL) de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
9. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8.
10. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 9.
11. Una composición que comprende el inmunoligante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad mediada por TNFa humano, en donde la enfermedad mediada por TNFa se selecciona del grupo que consiste en estados de inflamación crónicos o autoinmunes en general, trastornos inflamatorios inmuno-mediados en general, enfermedad inflamatoria del SNC, enfermedades inflamatorias que afectan al ojo, las articulaciones, la piel, las membranas mucosas, el sistema nervioso central, el tracto gastrointestinal, el tracto urinario o pulmón, estados de uveítis en general, retinitis, uveítis por HLA-B27+, enfermedad de Behcet, síndrome del ojo seco, glaucoma, síndrome de Sjogren, diabetes mellitus, neuropatía diabética, resistencia a la insulina, estados de artritis en general, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis reactiva y síndrome de Reiter, artritis juvenil, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barre, miastenia grave, esclerosis lateral amiotrófica, sarcoidosis, glomerulonefritis, enfermedad renal crónica, cistitis, psoriasis, artritis psoriática, hidradenitis supurativa, paniculitis, pioderma gangrenoso, síndrome SAPHO, acné, síndrome de Sweet, pénfigo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, asma bronquial, neumonitis por hipersensibilidad, alergias generales, rinitis alérgica, sinusitis alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), fibrosis pulmonar, granulomatosis de Wegener, síndrome de Kawasaki, arteritis de células gigantes, vasculitis de Churg-Strauss, poliarteritis nodosa, quemaduras, enfermedad de injerto frente a huésped, reacciones de huésped frente a injerto, episodios de rechazo después de un trasplante de órgano o de médula ósea, estados sistémicos y locales de vasculitis en general, lupus eritematodo sistémico y discoide, polimiositis y dermatomiositis, esclerodermia, pre-eclampsia, pancreatitis aguda y crónica, hepatitis viral, hepatitis alcohólica, inflamación post-quirúrgica, cirugía articular, cirugía en estructuras relacionadas con las articulaciones, cirugía oral o dental, procedimientos cardiovasculares mínimamente invasivos, procedimientos laparoscópicos o endoscópicos intra-abdominales y ginecológicos, procedimientos urológicos endoscópicos o inflamación perioperatoria en general, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, parálisis de Bell, enfermedad de Creutzfeld-Jakob, osteólisis debida al cáncer, inflamación debida al cáncer, dolor debido al cáncer, caquexia debida al cáncer, metástasis óseas, formas de dolor agudo y crónico, formas de dolor nociceptivas o neuropáticas, ciática, lumbalgia, síndrome del túnel carpiano, síndrome de dolor regional complejo (CRPS), gota, neuralgia posherpética, fibromialgia, estados de dolor local, síndromes de dolor crónico debido a tumor metastásico, dismenorrea, sepsis bacteriana, viral o fúngica, tuberculosis, SIDA, aterosclerosis, enfermedad de las arterias coronarias, hipertensión, dislipidemia, insuficiencia cardíaca e insuficiencia cardíaca crónica.
12. Uso del inmunoligante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en la producción de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad mediada por TNFa humano.
13. El inmunoligante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad mediada por TNFa humano.
14. El uso de la reivindicación 12, o el inmunoligante para uso de la reivindicación 13, en donde la enfermedad mediada por TNFa se selecciona del grupo que consiste en estados de inflamación crónicos o autoinmunes en general, trastornos inflamatorios inmuno-mediados en general, enfermedad inflamatoria del SNC, enfermedades inflamatorias que afectan al ojo, las articulaciones, la piel, las membranas mucosas, el sistema nervioso central, el tracto gastrointestinal, el tracto urinario o pulmón, estados de uveítis en general, retinitis, uveítis por HLA-B27+, enfermedad de Behcet, síndrome del ojo seco, glaucoma, síndrome de Sjogren, diabetes mellitus, neuropatía diabética, resistencia a la insulina, estados de artritis en general, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis reactiva y síndrome de Reiter, artritis juvenil, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barre, miastenia grave, esclerosis lateral amiotrófica, sarcoidosis, glomerulonefritis, enfermedad renal crónica, cistitis, psoriasis, artritis psoriática, hidradenitis supurativa, paniculitis, pioderma gangrenoso, síndrome SAPHO, acné, síndrome de Sweet, pénfigo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, asma bronquial, neumonitis por hipersensibilidad, alergias generales, rinitis alérgica, sinusitis alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), fibrosis pulmonar, granulomatosis de Wegener, síndrome de Kawasaki, arteritis de células gigantes, vasculitis de Churg-Strauss, poliarteritis nodosa, quemaduras, enfermedad de injerto frente a huésped, reacciones de huésped frente a injerto, episodios de rechazo después de un trasplante de órgano o de médula ósea, estados sistémicos y locales de vasculitis en general, lupus eritematodo sistémico y discoide, polimiositis y dermatomiositis, esclerodermia, pre-eclampsia, pancreatitis aguda y crónica, hepatitis viral, hepatitis alcohólica, inflamación post-quirúrgica, cirugía articular, cirugía en estructuras relacionadas con las articulaciones, cirugía oral o dental, procedimientos cardiovasculares mínimamente invasivos, procedimientos laparoscópicos o endoscópicos intra-abdominales y ginecológicos, procedimientos urológicos endoscópicos o inflamación perioperatoria en general, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, parálisis de Bell, enfermedad de Creutzfeld-Jakob, osteólisis debida al cáncer, inflamación debida al cáncer, dolor debido al cáncer, caquexia debida al cáncer, metástasis óseas, formas de dolor agudo y crónico, formas de dolor nociceptivas o neuropáticas, ciática, lumbalgia, síndrome del túnel carpiano, síndrome de dolor regional complejo (CRPS), gota, neuralgia posherpética, fibromialgia, estados de dolor local, síndromes de dolor crónico debido a tumor metastásico, dismenorrea, sepsis bacteriana, viral o fúngica, tuberculosis, SIDA, aterosclerosis, enfermedad de las arterias coronarias, hipertensión, dislipidemia, insuficiencia cardíaca e insuficiencia cardíaca crónica.
15. El inmunoligante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para uso como producto farmacéutico.
16. El inmunoligante para uso de acuerdo con la reivindicación 15, para las vías de administración intramuscular, intraperitoneal, intracerobroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación.
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