CN106414498B - TNF α的结合成员 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗‑TNF α结合成员并特别涉及高度稳定和可溶的单价、高效TNF α‑结合抗体片段。此类结合成员可用于治疗炎性疾病和其它疾病以及用于诊断学。还提供了相关的核酸、载体、细胞和组合物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求在2014年3月26号提交欧洲专利局的欧洲专利申请EP 14 001 123的权益和 优先权。欧洲专利申请EP 14 001 123的内容通过引用用于所有目的以其全部并入本文,包 括所有的表、图和权利要求-以及包括并入本文不含有并依照PCT的规则4.18、在PCT的规 则20.5(a)中提及的说明书、权利要求书或附图的任何元素或部分。
参考序列表
本申请包括序列表。
发明领域
提供了针对TNF α的结合成员,例如人源化结合分子,特别是单价、高度有效且稳定的抗-TNF α试剂,例如抗体片段,其适用于治疗和诊断用途。在一些实施方式中,所述 结合成员是免疫球蛋白、其片段、或具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子,其对于TNF α是特异性的。还提供了编码此类结合成员的核酸分子、含有各自的核酸分子的序列的载体、含有所述载体或各自的核酸分子的核酸序列的宿主细胞、含有所述结合成员或所述核酸 分子的药物组合物和诊断组合物,及其用途。
背景
本发明的以下背景讨论仅提供用于帮助读者理解本发明并且不承认用于描述或构成本发明的 现有技术。
肿瘤坏死因子(TNF)α是有效的促炎细胞因子,其在免疫应答和炎性疾病中起到重要作用。其被描述为炎性反应、免疫反应和病理生理学反应的关键介导物。TNF α主要通 过单核细胞和活化巨噬细胞分泌,其还通过众多其它细胞类型,包括成纤维细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和上皮细胞来产生。
TNF α还被称为恶液质素,其以两种生物活性形式存在:跨膜形式和可溶性形式。TNF α的可溶性形式通过蛋白酶剪切从跨膜TNF α(tmTNF α)释放。两种TNF α形式 都是生物活性三聚体,结合TNF受体和发挥各种生物功能以帮助宿主防御。另外,跨膜和 可溶性TNF α两者都在炎性和自身免疫疾病的发病机理中起作用。
鉴定出TNF α的两种受体(TNF-R1和-R2)介导多效TNF α效应。这些受体在各种 细胞上表达,主要在单核细胞和巨噬细胞上表达。受体活化引发各种生物效应,包括促炎细胞因子产生例如IL-1、TNF α、IL-6、IL-8;趋化因子产生;嗜中性粒细胞活化;增加内皮 层的渗透性;和粘着分子的表达。因此,大量疾病与上调的TNF α水平相关,并因此TNF α抑制剂在医学治疗方面发现大量用途。数量日益增长的TNF α抑制剂的一个重要的子类 是生物药物。一些TNF α的生物抑制剂受到监管批准并且可市售。一组此类生物抑制剂是 全长免疫球蛋白。例如,英夫利昔单抗一种约150kDa的嵌合IgG,已被批准 用于治疗克罗恩病、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、银 屑病和贝赛特氏症(disease)。阿达木单抗一种约150kDa的IgG1,被批 准用于类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、克罗恩病、银屑病性关节炎、银屑病、强 直性脊柱炎、溃疡性结肠炎和贝赛特氏症。最后,戈利木单抗一种约150kDa 分子量的人IgG1,被批准用于类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎和溃疡性 结肠炎。
还有,一些经批准的生物TNF α抑制剂偏离全长免疫球蛋白结构。例如,依那西普是一种具有150kDa的分子量的TNF-受体2胞外结构域Fc融合蛋白,其已被批准 用于治疗类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、银屑病和强直性脊柱炎。另外,赛妥珠单抗一种约90kDa的人源化Fab-PEG缀合物,被批准并广泛 用于治疗克罗恩病和类风湿性关节炎。
尽管本领域中有进展,但是仍存在对于具有优化的生物物理学特征的组合的生物制 剂的需要。例如,皮肤病的局部治疗,即将TNF α抑制剂局部应用至皮肤,将是非常优选的应用途径,因为可避免全身治疗的副作用。但是,迄今为止,此类治疗是不可行的,尤其是,因为目前批准的免疫治疗剂太大而因此不能跨越皮肤角质层和/或归因于药物生产成本。
TNF α在银屑病和银屑病性关节炎中的关键作用是确立的(参见,例如CORDORO、KM和FLEDMAN SR.TNF-alpha inhibitors in dermatology.Skin Therapy Letter 2007,第12卷, 第4-6页)。银屑病是患病率为2-3%的常见疾病。虽然较轻度的形式可采用糖皮质激素和/或 维生素D3-类似物进行局部治疗,但是更严重的形式需要全身治疗,包括环孢霉素、甲氨蝶 呤或最终生物制剂(Prieto-Pérez R.等人,Pharmacogenomics.2013年10月;14(13):1623- 1634)。涉及使用单克隆抗体靶向例如TNF α(阿达木单抗、依那西普和英夫利昔单抗)的用 于严重银屑病的全身治疗的生物疗法的引入已基本上解决了罹患严重形式银屑病的患者的医 疗需求。虽然是高度有效的,但是这些药物与一些潜在严重和重大的不良事件相关。因此, 这些药物的收益风险比状况排除了大多数呈现轻度至中度形式银屑病的银屑病患者。可能例 如通过局部应用生物药物(即局部施用)来减少副作用。但是,归因于它们的大尺寸,全长抗 体不适于此类施用途径。
化脓性汗腺炎,也称作反常性痤疮(acne inversa),是另一种TNF α相关病症。所述 炎性慢性疾病通过带有顶泌腺的皮肤(例如腋窝、大腿内侧、腹股沟和臀部)中的脓肿簇来表 征(SCHEINFELD,N.Hidradenitis suppurativa:A practical review of possiblemedical treatments based on over 350hidradenitis patients.Dermatol OnlineJournal 2013,第19卷,第1页)。TNF α抑制剂已成功用于治疗所述罕见疾病(orphandisease)(Brunasso AM,Massone C.Treatment of hidradenitis suppurativa withtumour necrosis factor-alpha inhibitors:An update on infliximab.Acta DermVenereol.2011,第91(1)卷,第70页;Sotiriou E.等人,Etanercept for the treatmentof hidradenitis suppurativa,Acta Derm Venereol.2009,第89(1)卷,第82-3页)。针对TNF α的抗体也已有效用于治疗另一种罕见皮肤病坏疽性脓皮病(Reddick CL等人.Successful treatment of superficial pyoderma gangrenosum associated withhidradenitis suppurativa with adalimumab.Dermatol Online J.2010,第16(8)卷,第15页)。迄今为止,还未批准用于治 疗此类罕见疾病的生物药物,然而,市售生物制剂为标签外使用。
概述
在第一方面,提供TNF α的结合成员。在一些实施方式中,所述结合成员是人源化的,并 中和可溶性TNF α的活性。在一些实施方式中,所述结合成员是具有对TNF α有特异性 的免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子。在一些实施方式中,所述结合成员是对TNF α有 特异性的免疫球蛋白。在一些实施方式中,所述结合成员是对TNF α有特异性的抗体片段。在一些实施方式中,所述结合成员是哺乳动物免疫球蛋白或其片段。在一些实施方式中,所述结合成员是人源化免疫球蛋白或其片段。在一些实施方式中,所述结合成员是人免疫球蛋白或其片段。
在一个实施方式中,提供了单价结合成员,其以低于50皮摩尔(pM)的效力抑制可溶 性TNF α,如通过测量关于抑制可溶性人TNF α的生物效应的半峰抑制浓度IC50所确 定。
具有pM范围内的效力值的结合成员,特别是抗体片段,不管是否是人源化的,都是特别的,并且是常规方式不可获得的项目。这对于单价抗体片段特别正确,所述单价抗体片段仅包括一个可变轻链和重链,并因此缺乏包括两个轻链和两个重链的二价抗体的任何亲和 力效应。
此外,当将全长抗体转化成较小的片段时,其效力通常变弱。这不仅归因于伴随的化合价改变(例如,所述抗体片段可仅为单价的,而全长免疫球蛋白是二价或多价的),而且可能由空间原因造成。
在一些实施方式中,根据第一方面的结合成员包括由SEQ ID No:3至8限定的CDR序列。在一些实施方式中,所述结合成员包括由SEQ ID No:3至8组成的组的两个或更多个,优选所有的CDR序列。在一些实施方式中,所述结合成员包括由SEQ ID No:3限定的 CDR序列。在一些实施方式中,所述结合成员包括由与SEQ ID No:3具有至少80%氨基酸 同一性的序列限定的CDR序列。在一些实施方式中,所述结合成员包括由与SEQ ID No:3 具有至少90%氨基酸同一性的序列限定的CDR序列。在一些实施方式中,所述结合成员 包括由SEQID No:4限定的CDR序列。在一些实施方式中,所述结合成员包括由与SEQ ID No:4具有至少85%氨基酸同一性的序列限定的CDR序列。在一些实施方式中,所述结 合成员包括由SEQID No:5限定的CDR序列。在一些实施方式中,所述结合成员包括由与 SEQ ID No:5具有至少80%氨基酸同一性的序列限定的CDR序列。在一些实施方式中,所 述结合成员包括由与SEQ ID No:5具有至少85%氨基酸同一性的序列限定的CDR序列。在 一些实施方式中,所述结合成员包括由与SEQ ID No:5具有至少93%氨基酸同一性的序列 限定的CDR序列。在一些实施方式中,所述结合成员包括由SEQ ID No:6限定的CDR序 列。在一些实施方式中,所述结合成员包括由与SEQ ID No:6具有至少80%氨基酸同一性 的序列限定的CDR序列。在一些实施方式中,所述结合成员包括由与SEQ ID No:6具有至 少88%氨基酸同一性的序列限定的CDR序列。在一些实施方式中,所述结合成员包括由 SEQ ID No:7限定的CDR序列。在一些实施方式中,所述结合成员包括由与SEQ ID No:7 具有至少80%氨基酸同一性的序列限定的CDR序列。在一些实施方式中,所述结合成员包 括由与SEQ ID No:7具有至少94%氨基酸同一性的序列限定的CDR序列。在一些实施方式 中,所述结合成员包括由与SEQ IDNo:8具有至少80%氨基酸同一性的序列限定的CDR序 列。在一些实施方式中,所述结合成员包括由与SEQ ID No:8具有至少92%氨基酸同一性 的序列限定的CDR序列。在一些实施方式中,所述结合成员包括由SEQ ID No:3至8组成 的组的三个或更多个序列。
在一些实施方式中,本文公开的结合成员包括与SEQ ID No:1具有至少90%同一性 的可变轻链构架序列;和与SEQ ID No:2具有至少90%同一性的可变重链构架序列。在一 些实施方式中,本文公开的结合成员包括与SEQ ID No:1具有至少97%同一性的可变轻链 构架序列;和与SEQ ID No:2具有至少90%同一性的可变重链构架序列。在一些实施方式 中,本文公开的结合成员包括与SEQ ID No:1具有至少90%同一性的可变轻链构架序列; 和与SEQ ID No:2具有至少96%同一性的可变重链构架序列。
在优选的实施方式中,所述结合成员是包括SEQ ID No:9的序列的单链可变片段(scFv)。所述结合成员可为基本上由SEQ ID No:9的序列组成的单链可变片段(scFv)。在一些实施方式中,所述结合成员由SEQ ID No:9的序列组成。
本文提供的结合成员是高度稳定的,即它们在长时间段内保持为单体的和功能活性 的。这特别适用于抗体片段,并更特别适用于如本文公开的scFv。稳定性参数是用于提供可 行药物的关键因素。药物越稳定,货架半衰期越长。不稳定的抗体倾向于二聚或低聚并甚至 沉淀,由此减少保存期并最终因为例如增加的免疫原性而变得较不适于药物应用。各自的结 合成员在高浓度下还保持为单体的,这具有较小施用体积的优势。
对于某些治疗适应症,抗体片段在与全长免疫球蛋白相比较时提供优势,这可归因 于其较小的尺寸和缺乏免疫球蛋白的恒定区Fc。例如,scFv由于其小尺寸能够更有效地穿 透组织。此外,其在体循环中展示降低的保留,因其不能结合Fc受体例如FcRn,最终导致较高的肾清除率。这些良好的组织穿透的特性,以及随后组织内的均匀分布和小抗体片段的 快速消除,例如scFv从体循环中消除,对于慢性局部(local/topical)疾病以及急性全身疾病两 者是特别有利的。但是,在过去,该实际效用由于scFv的低稳定性和低生物效力而严重受 限。
如本文提供的结合成员关于人TNF α发挥非常高的抑制效力。生物上非常有效的结 合成员是特别有用的,因为其允许例如向患者施用低量的药物,从而减少治疗的总成本。另 外,使得疾病的分子靶标的更完全的中和可行。
此外,当应用最高效力的结合成员时,可设想在动物模型中以及在人疗法中的不同 的、新颖的应用途径。例如,至于局部应用的药物(例如应用至皮肤),尽管输送功效可能由 于角质层和/或其它生物结构的屏障功能而受限,但是治疗功效通过穿过此类生理屏障的另 外受限量的药物分子的高效力恢复。
通常,为了获得与用更有效的药物类似的药效学效果而必须施用的较高量的较低效 药物转化成大得多的静脉内或皮下应用体积。出于两个原因,此类较高的应用体积对于在动 物和人中的治疗用途是不利的:首先,用大体积药物治疗患者的不切实际,和其次,每单位 质量的生物制剂例如抗体分子是昂贵的。
治疗所需的较低量的药物转化成较低的药物生产成本。特别地,抗体片段适于低生 产成本,因为当与通常用于生产全长免疫球蛋白分子的哺乳动物表达系统相比较时,例如细 菌或酵母培养系统的使用一般导致较低的成本。待施用的较小量的药物和较便宜的制造方法 的组合开启了每个患者更加成本有效的药物的可能性。因此,更多的患者可能受益于此类药 物。
在第二方面,提供了核酸分子。所述核酸分子编码根据第一方面的结合成员。所述核酸分子通常含有编码根据第一方面的结合成员的序列。在一些实施方式中,所述核酸分子 基本上由编码根据第一方面的结合成员的序列组成。在一些实施方式中,所述核酸分子由编 码根据第一方面的结合成员的序列组成。在一些实施方式中,编码所述结合成员的序列与调 节区例如启动子可操作地相连。在一些实施方式中,编码所述结合成员的序列包括在表达盒 中。在一些实施方式中,所述核酸分子是分离的核酸分子。在一些实施方式中,所述核酸分 子包括在载体中。
在第三方面,提供了载体。所述载体含有编码根据第一方面的结合成员的序列。所述载体可含有根据第二方面的序列。
在第四方面,提供了宿主细胞。所述宿主细胞含有根据第二方面的核酸分子。在一些实施方式中,所述宿主细胞含有根据第三方面的载体。
在第五方面,提供了组合物。各自的组合物可含有根据第一方面的结合成员、根据第二方面的核酸分子、根据第三方面的载体、或根据第四方面的宿主细胞。此类组合物另外包括合适的载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可被配制用于美容、诊断或药物用途。
在第六方面,提供了治疗TNF α介导的疾病的方法。所述方法包括向有需要的对象施用根据第一方面的结合成员。所述方法通常包括向有需要的对象施用根据第五方面的药物 组合物。通常在一段时间内施用有效量的结合成员。因此可向对象重复施用有效量的结合成 员。因此可以多剂量向对象施用有效量的结合成员。在施用多剂量的情况下,所述剂量可在 整个治疗中是恒定的。在一些实施方式中,在治疗期间可改变所述剂量,例如增加或减少。 在一些实施方式中,以单一剂量的形式施用有效量的结合成员。在一些实施方式中,向患者 仅施用一次有效量的结合成员。
在一些实施方式中,根据第六方面的方法包括中断施用根据第一方面的结合成员。 在此类实施方式中,根据第六方面的方法可包括使生物样品与根据第一方面的结合成员接 触。所述生物样品可为体液样品。所述生物样品还可为活组织检查样品。在允许结合成员与 TNF α特异性结合的条件下进行所述生物样品与所述结合成员的接触。所述方法可另外包 括检测结合成员和TNF α之间是否已形成复合物。在一些实施方式中,所述方法可包括测 量所述结合成员和TNF α之间形成的复合物的量。所述方法可包括定量所述结合成员和 TNF α之间形成的复合物的量。
在一些实施方式中,将所述结合成员和TNF α之间形成的复合物的量与阈值相比较。若检测到所述结合成员和TNF α之间的复合物的量在阈值以下,则根据第六方面的方法可包括分别中断施用结合成员,和药物组合物。在一些实施方式中,根据第六方面的方法包括监测所述结合成员和TNF α之间形成的复合物的量。
若检测到所述结合成员和TNF α之间的复合物的量在阈值或以上,根据第六方面的 方法可包括分别继续施用所述结合成员,和药物组合物。
如本文所述的结合成员可例如用作药剂。各自的结合成员可例如用于治疗TNF α介 导的疾病。在一些实施方式中,如本文所述的结合成员用于诊断。如本文所述的结合成员还 可用于化妆品。在一些实施方式中,如本文所述的结合成员用于检测目的。如本文所述的结 合成员可例如用于结合测定。
因此,在一些实施方式中,所述结合成员用于医疗用途。换句话说,所述结合成员可用作治疗剂。在此方面,还提供了根据第一方面的结合剂在制造药剂中的用途。在一些实施方式中,所述用途是根据第一方面的结合剂在制造用于治疗TNF α介导的疾病的药剂中的用途。在此方面,还提供了用于治疗TNF α介导的疾病的药物组合物。还提供了用于治 疗TNF α介导的疾病的药剂。所述药剂包括根据第一方面的结合成员。所述药剂可基本上 由根据第一方面的结合成员组成。
此外,根据第二方面的核酸分子、根据第三方面的载体或根据第四方面的宿主细胞 可用作药剂。在一些实施方式中,根据第二方面的核酸分子、根据第三方面的载体或根据第 四方面的宿主细胞可用于治疗TNF α介导的疾病。在一些实施方式中,根据第二方面的核 酸分子、根据第三方面的载体或根据第四方面的宿主细胞可用于诊断。根据第二方面的核酸 分子、根据第三方面的载体或根据第四方面的宿主细胞还可用于化妆品。在一些实施方式 中,根据第二方面的核酸分子、根据第三方面的载体或根据第四方面的宿主细胞用于检测目 的。因此,本文公开的结合成员-或编码其的核酸分子、相应的载体或宿主细胞–可用于 生产可用于治疗TNF α介导的疾病的药剂。
在第七方面,提供了抑制TNF α和TNF-R1和/或TNF-R2之间的相互作用的方法。 所述方法包括提供TNF α和TNF-R1和/或TNF-R2的步骤。所述方法另外包括使TNF α 与根据第一方面的结合成员接触的步骤。
在第八方面,提供了抑制TNF α生物活性的方法。所述方法包括提供TNF α的步骤。所述方法还包括使TNF α与根据第一方面的结合成员接触的步骤。
在第九方面,提供了生产本文公开的结合成员的方法。所述方法包括培养根据第四 方面的宿主细胞。所述方法因此包括允许结合成员被表达。因此可形成反应混合物。所述方 法还包括回收所述结合成员,例如从形成的各自反应混合物中回收。在一些实施方式中,所 述方法包括纯化所述结合成员。
在一些实施方式中,根据第九方面的方法还可包括至少一个化学合成步骤。所述化 学合成步骤可例如为在获得结合成员之后对其进行修饰的步骤。说明性实例是翻译后修饰, 例如糖基化或PEG化。PEG化是共价结合一个或更多个聚乙二醇(PEG)分子。在一些实施方 式中,所述化学合成步骤经由共价结合引入脂质部分。在一些实施方式中,所述化学合成步 骤经由共价结合引入碳水化合物部分。在一些实施方式中,所述化学合成步骤引入可检测部 分,例如放射性标记。可检测的标记还可经由共价结合引入。
在第十方面,提供了生产如本文公开的结合成员的方法。所述方法包括使不含细胞 的表达系统与核酸产物模板接触。所述核酸产物模板编码根据第一方面的结合成员。在一些 实施方式中,所述方法包括提供不含细胞的系统。所述方法还可包括提供核酸产物模板。所 述方法还包括允许所述核酸产物模板发生转录和翻译。因此,所述方法包括允许形成反应混 合物。此外,所述方法包括从所述反应混合物中回收所述结合成员。
在一些实施方式中,根据第十方面的方法包括富集所述结合成员。在一些实施方式 中,根据第十方面的方法包括纯化所述结合成员。在一些实施方式中,根据第十方面的方法 包括分离所述结合成员。在一些实施方式中,所述方法包括至少一个化学合成步骤。因此, 生产所述结合成员可包括化学合成步骤。
在第十一方面,提供了检测生物样品中TNF α的存在的方法。所述方法可为体内方法或体外方法。所述方法包括使所述生物样品与根据第一方面的结合成员接触的步骤。在一 些实施方式中,所述方法包括提供根据第一方面的结合成员。在允许结合成员与TNF α特 异性结合的条件下进行所述生物样品与根据第一方面的结合成员的接触。所述方法另外包括 检测所述结合成员和TNF α之间是否已形成复合物的步骤。
在一些实施方式中,根据第十一方面的方法可包括评估所述结合成员和TNF α之间 形成的复合物的量。所述方法可包括定量所述结合成员和TNF α之间形成的复合物的量。
在根据第十一方面的方法中,所述生物样品通常是来自对象的样品。在一些实施方 式中,所述生物样品是来自对象的体液样品。在一些实施方式中,所述生物样品是活组织检 查样品。在一些实施方式中,体液样品是血样。在一些实施方式中,体液样品是尿样。在一 些实施方式中,体液样品是脑脊液样品。在一些实施方式中,体液样品是滑液样品。在一些 实施方式中,体液样品是淋巴样品。
在一些实施方式中,根据第十一方面的方法是将对象分层用于TNF α介导的疾病疗 法的方法。所述方法可看作是确定所述对象是否将响应使用本文公开的结合成员的TNFα 介导的疾病疗法的方法。所述方法可包括将所述结合成员和TNF α之间形成的复合物的量 与阈值相比较。在所述阈值或以上的所述结合成员和TNF α之间形成的复合物的量表明所 述对象将响应使用所述结合成员的TNF α介导的疾病的疗法。在所述阈值以下的所述结合 成员和TNF α之间形成的复合物的量表明所述对象将不响应使用所述结合成员的TNF α介导的疾病的疗法。
根据第十二方面,提供了根据第一方面的结合成员和已知浓度的TNF α的溶液的组 合。此类TNF α的溶液可用于获得参考溶液,例如用于校准目的。所述结合成员和所述TNF α的溶液的组合可包括在试剂盒中。所述结合成员和所述TNF α的溶液的组合可限定试剂盒。所述试剂盒可包括两个容器,第一容器包括所述结合成员,第二容器包括所述TNFα的溶液。所述试剂盒还可基本上由包括所述结合成员的第一容器和包括所述TNF α的溶液的第二容器组成。在一个实施方式中,所述试剂盒由第一容器、第二容器和使用说明书组成。
根据第十三方面,提供了根据第一方面的结合成员和检测试剂的组合。所述试剂盒 包括两个容器,第一容器包括所述结合成员,第二容器包括所述检测试剂。在一些实施方式 中,所述结合成员包括可检测标记,例如酶。所述可检测标记可能需要试剂的存在。作为说 明性实例,可能需要酶底物,其转化通过酶来催化。所述酶底物可例如产生可检测的产物。 各自的试剂,例如酶底物,可包括在第二容器中。
根据第十四方面,提供了制品,其可例如为试剂盒。此类制品可包括根据第一方面的结合成员连同试剂与说明书的包装组合。所述制品可基本上由所述结合成员和试剂与说明 书的包装组合组成。在一个实施方式中,所述制品由所述结合成员和试剂与说明书的包装组 合组成。
附图简述
图1A是显示scFv与重组人(rh)TNF α在ELISA中特异性结合的结果的图。将用作阳性对 照的scFv1(空心圆形,)或scFv DLX105(空心正方形,)添加至不同浓度下的固定化 rhTNF α中。使用蛋白L-HRP检测结合的scFv。特异性不同的,并因此不相关的的scFv(DLX1084)用作阴性对照(实心三角形,)。图1B显示所有固定至ELISA板上的scFv均适当地重折叠并可通过蛋白L-HRP识别。
图2是显示通过低皮摩尔浓度下的scFv抑制rhTNF α-介导的PK-15细胞的细胞毒性的图。scFv1(空心圆形,),或阳性对照scFv DLX105(空心正方形,)的系列稀释用可溶性TNF α预培育,随后用PK-15细胞培育。
图3是显示与其它市售IgG类型的TNF α拮抗剂相比较,通过scFv1抗体片段良好抑制可溶性TNF α-介导的PK-15细胞的细胞毒性的图。scFv1(空心圆形,)、戈利木单 抗(实心三角形,)、阿达木单抗(实心正方形,)或英夫利昔单抗(实心圆形,)的系列稀释用可溶性TNF α预培育,随后用PK-15细胞培育。
图4是显示scFv1结合并中和TNF α的跨膜(tm)形式的图。图4A描绘了采用表达tmTNF α的CHO细胞的scFv1(素线)和阴性对照scFv DLX1084(实心直方形)的流式细胞术分析。图4B描绘了scFv1(空心三角形)、阳性对照scFv DLX105(空心正方形,),和阴 性对照scFv DLX1084(实心三角形,)的系列稀释下的细胞存活,其采用表达tmTNF α 的CHO细胞培育,随后添加HEK-Dual TNF α-敏感细胞。
详述
为了使本文公开的对于结合成员、核酸、载体、宿主细胞、组合物、方法和用途的解释可以 更容易理解,首先限定某些术语。
定义
除非另外限定,否则用于说明书、附图和权利要求书的所有其它科学和技术术语都具有如本 领域普通技术人员通常理解的它们的普通意义。尽管与本文描述的那些类似或等效的方法和 材料可用于实践或测试本文公开的结合成员、核酸、载体、宿主细胞、组合物、方法和用 途,下文描述合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考通过 引用以其全部并入。在冲突的情况下,将以本说明书,包括定义为准。所述材料、方法和实 施例仅是说明性的,并且不意欲限制。
如本文所使用的单词“约”是指一数值在如本领域普通技术人员确定的特定值的可 接受的误差范围内,其将部分取决于该数值是如何测量或确定的,即,测量系统的限制。例 如,根据本领域中的实践,“约”可表示在一个或多于一个标准偏差内。术语“约”还用于表明讨论中的量或值可能是指定的值或近似相同的一些其它值。所述短语意欲传达类似的值 促进根据本发明的等效结果或效果。在该上下文中,“约”可指高达10%以上和/或以下的范 围。在一些实施方式中,单词“约”是指某一值以上和以下高达5%,例如该值以上或以下 高达2%、高达1%或高达0.5%的范围。在一个实施方式中,“约”是指给定值以上和以下高达0.1%的范围。
如本文所使用的术语“施用”是指任何模式的转移、输送、引入或运送物质例如化合物,例如药物化合物,或其它药剂例如抗原至对象。施用模式包括口服、局部接触、静脉内、腹膜内、肌肉内、鼻内或皮下施用(参见下文)。“组合”其它物质例如一种或更多种治 疗剂的施用包括同时(一并)施用和以任何次序连续施用。
如本文件中所使用的单词“测定”是指本领域通常已知的用于分析特征,例如催化活性,生物样本中出现的物质的存在、形成或量的方法。此类物质可存在于活有机体中或代表活有机体,例如蛋白质、核酸、脂质、细胞、病毒、糖、多糖、维生素或离子,举几个例 子来说。单词“测定”强调遵循某一步骤或一系列步骤,所述步骤可看作是代表各自的测 定。测定可包括定量的试剂和确定的方案以评估生物实体的存在、缺失、量或活性。
术语“结合测定”通常是指确定物质的相互作用的方法。因此,结合测定的一些实施方式可用于定性或定量地确定物质(matter),例如物质(substance),以结合其它物质,例如 蛋白质、核酸或任何其它物质的能力。结合测定的一些实施方式可用于基于物质与试剂例如 用于本方法/测定的结合伴侣(binding partner)的结合来分析该物质的存在和/或量。作为说明 性实例,TNF α结合测定可包括使用结合伴侣,例如本文公开的与TNF α特异性结合的结 合成员。在结合测定是基于使用免疫球蛋白或具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子作为 结合伴侣的情况下,此类方法/步骤还可称为“免疫测定”。在此方面,应理解获自免疫测定 的信号是一种或更多种免疫球蛋白或具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子和相应的含有 所述结合伴侣所结合的必要表位的分析物(例如TNF α)之间形成的复合物的直接结果。尽 管此类测定可检测全长分析物且测定结果表述为感兴趣的生物标记物的浓度,来自所述测定 的信号实际上是存在于样品中的所有此类“免疫反应性”分子的结果。分析物的量和/或存 在还可借助与免疫测定不同的手段来确定,包括蛋白质测量例如斑点印迹、蛋白质印迹、色 谱法、质谱分析法和核酸测量例如mRNA定量。
如本文所使用的术语“保守性修饰”和“保守性置换”分别是指维持关于相应参考的物理、生物、化学或功能性质的修饰和置换。包括具有保守性置换的序列的分子例如具有类似的尺寸、形状、电荷、化学性质,包括可比较的形成共价键或氢键的能力,和/或可比 较的极性。此类保守性修饰包括,但不限于,一个或更多个核碱基和氨基酸置换、添加和缺失。
例如,保守性氨基酸置换包括其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基取代的 那些。例如,关于结合抗原为非必需的氨基酸残基可被来自相同侧链家族的另一种氨基酸残 基取代,例如丝氨酸可被苏氨酸置换。氨基酸残基基于通常的、类似的侧链性质通常分成各 族,例如:
1.非极性侧链(例如,甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸),
2.不带电荷的极性侧链(例如,天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、色氨酸),
3.碱性侧链(例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸),
4.酸性侧链(例如,天冬氨酸、谷氨酸),
5.β-支化侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和
6.芳族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
该分类可进一步分段。作为另一方向,以下八个组各自含有可通常被看作限定用以 互相保守性置换的氨基酸:
1)丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly);
2)天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu);
3)天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln);
4)精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys);
5)异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、蛋氨酸(Met)、缬氨酸(Val);
6)苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp);
7)丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr);和
8)半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)。
保守性置换可被看作是在以上六个组中之一内的第一氨基酸被在所述六个组的相同 的组内的另一氨基酸置换。
保守性置换通常是以下置换,其根据待突变的氨基酸列出,各自跟随一个或更多个 可被看作是保守性的取代:Ala→Gly,Ser,Val;Arg→Lys;Asn→Gln,His;Asp→Glu;Cys→Ser;Gln→Asn;Glu→Asp;Gly→Ala;His→Arg,Asn,Gln;Ile→Leu,Val; Leu→Ile,Val;Lys→Arg,Gln,Glu;Met→Leu,Tyr,Ile;Phe→Met,Leu,Tyr;Ser→Thr; Thr→Ser;Trp→Tyr;Tyr→Trp,Phe;Val→Ile,Leu。其它置换也是允许的,并可根据 经验或根据其它已知的保守性或非保守性置换来确定。保守性置换还可包括非天然氨基酸的 使用。
非保守性置换,即将一族的成员相对另一族的成员进行交换,可导致显著的变化,例如,关于所述结合成员的电荷、偶极矩、尺寸、亲水性、疏水性或构象,其可导致结合活 性的显著下降,特别是若影响的氨基酸对于结合至靶分子是必需的话。非保守性置换还可包括非天然氨基酸的使用。
保守性和非保守性修饰可通过本领域已知的各种标准技术来引入亲本结合成员中, 所述技术例如组合化学、定点DNA诱变、PCR介导的和/或盒式诱变、肽/蛋白质化学合成、特异性修饰亲本结合成员中的反应性基团的化学反应。变体可通过常规方法来测试它们 的化学、生物、生物物理和/或生物化学性质。优选地,保守性氨基酸置换不显著改变亲本 序列的功能特性,以及通常也不改变其结构特征。因此,包括保守性置换的结合成员的结合 特征至少基本上未改变。另外,保守性氨基酸置换通常不显著修饰或破坏亲本序列的二级结 构。
术语“可检测标记”在本文中用于指任何物质,其通过物理或化学手段的直接或间接检测或测量指示样品中所选靶标生物实体的存在。有用的可检测标记的代表性实例包括, 但不限于可基于吸光度、荧光、反射率、光散射、磷光或发光性质直接或间接检测的分子或 离子、可通过它们的放射性质检测的分子或离子、或可通过它们的核磁共振或顺磁性质检测 的分子或离子。在一些实施方式中,可检测标记可为可基于吸光度或荧光间接检测的分子, 例如,引起适当的底物例如从非吸光分子转化成吸光分子、或从非荧光分子转化成荧光分子 的各种酶。
一个项目(例如化合物,包括本文公开的结合成员)的“有效量”或“治疗有效量”是在应用的给药方案下产生所需治疗效果(即达到某一治疗目标)的量-或者作为单一剂量或者作 为一系列剂量的部分。治疗有效量通常是足以在相关病理状态的治疗或管理中提供治疗益 处,或延迟或最小化与病症的存在相关的一种或更多种症状的量。所述剂量将取决于各种因 素,包括患者因素和临床因素(例如,患者的年龄、重量、性别、临床史、疾病的严重性和/ 或对于治疗的响应)、治疗的疾病的性质、待施用的特定组合物、给药途径和其它因素。
“表位”是抗原性的,并且因此表位也可被看作是限定“抗原结构”或“抗原决定簇”。因此,免疫球蛋白或具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子的结合结构域是“抗原相互作用位点”。根据本说明书的术语“抗原相互作用位点”限定多肽的基序,其能够与特定抗原或特定抗原组(例如不同种类中的TNF α)进行特异性相互作用。该结合/相互作用还应理解为限定“特异性识别”。表位通常由一种或更多种化学实体(例如多肽链或单糖或多糖) 的部分的空间可及表面分组(spatially accessible surface groupings)组成。限定表位的表面分组 可例如为氨基酸或糖侧链的分组。表位通常具有特定的三维结构特征,以及特定的电荷特 征。构象和非构象表位通过以下区分开:在变性溶剂的存在下,与前者的结合而不是与后者 的结合失去。
术语“表位”还指在抗原例如TNF α上的位点,免疫球蛋白、T细胞受体或具有免 疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子与其形成复合物。在一些实施方式中,表位是分子上的位点,针对所述分子将产生免疫球蛋白或具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子和/或抗体 将与其结合。例如,表位可通过免疫球蛋白或具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子来识 别。所述表位可为“线性表位”,其为其中氨基酸一级序列含有所识别的表位的表位。线性 表位通常在独特序列中包括至少3个,并更通常至少5个氨基酸。线性表位可例如在独特序 列中包括约8个至约10个氨基酸。所述表位还可为“构象表位”,其与线性表位不同,是其 中包括表位的氨基酸的一级序列不是所识别的表位的单独的限定组分的表位(例如其中氨基 酸的一级序列不必通过限定表位的抗体来识别的表位)。通常构象表位包括比线性表位数量 更多的氨基酸。关于构象表位的识别,免疫球蛋白或具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分 子识别抗原(例如肽或蛋白质,或肽或蛋白质的片段)的三维结构。作为说明性实例,当蛋白 质分子折叠以形成三维结构时,形成构象表位的某些氨基酸和/或全部或部分的多肽骨架变 为并列,从而允许抗体识别表位。确定表位构象的方法包括,但不限于,X射线晶体学、二 维核磁共振谱学、定点自旋标记和电子顺磁共振谱学。
提及多肽、核酸或细胞,通过使用术语“富集”表示特定的氨基酸/核苷酸序列或细胞,包括细胞群,构成存在于感兴趣的样品中比在获得所述样品的天然来源中的显著更高部 分(2-5倍)的总氨基酸序列或核酸序列。所述多肽、核酸或细胞还可构成比在正常或患病有 机体中或比在正常或患病细胞中或在获取所述序列的细胞中显著更高的部分。这可由存在的 其它氨基酸/核苷酸序列或细胞的量的优先减少引起,或通过感兴趣的特定氨基酸/核苷酸序 列或细胞的优先增加引起,或由两者的组合引起。但是,应当注意到富集不表示不存在其它 氨基酸序列、核苷酸序列或细胞。该术语仅限定已显著增加的感兴趣的序列的相对量。该术 语显著在此用于表示增加的水平可用于人实现此类增加,并通常表示相对于其它氨基酸或核 酸序列约至少2倍,例如至少约5至10倍或甚至更多的增加。该术语表示仅覆盖其中人类 进行干预以增加所需氨基酸序列、核苷酸序列或细胞的比例的那些情形。
术语“基本上由……组成”应理解为在样品或组合物中允许存在不影响该样品或组 合物性质的额外组分。作为说明性实例,若药物组合物基本上由活性成分组成,则其可包括 赋形剂。
提及生物标记物,术语“表达”(“expressing”和“expression”)意欲理解为如本领域所使用的通常意义。肽/蛋白质通过细胞经由核酸转录成mRNA,随后翻译成肽(其经折叠并可能进一步加工)来表达。因此,细胞表达肽/蛋白质的陈述表示该肽/蛋白质已通过各自细 胞的表达机构来合成。
术语“表达盒”是指编码序列和启动子,其任选地与一个或更多个控制序列组合。用于酶的表达盒包括,例如并且没有限制,翻译起始控制序列。
术语“控制序列”是指基因或表达盒中的核酸序列,其调节编码序列的转录并因此包括启动子、增强子、转录终止序列和翻译起始序列。
关于各自的生物过程本身,术语“表达”、“基因表达”(“gene expression”或“expressing”)是指将在基因的核酸序列中编码的信息首先转化成信使RNA(mRNA)并随后转化成蛋白质的调节途径的全部。因此,基因的表达包括其转录成初级hnRNA、该hnRNA 加工成成熟的RNA和mRNA序列翻译成蛋白质的相应的氨基酸序列。在这种情况下,还注 意到术语“基因产物”不仅指蛋白质,包括例如由该基因编码的最终蛋白质(包括其剪接变 体)和各自的前体蛋白质(适用时),而且指各自的mRNA,其可被认为是基因表达过程中的 “第一基因产物”。
在本公开的范围内,术语“抗体”是指全长免疫球蛋白以及其片段。此类全长免疫球蛋白可为单克隆、多克隆、嵌合、人源化、修饰或人抗体。在一些实施方式中,如本文所 公开的抗体可为糖基化的。在一些实施方式中,如本文所公开的抗体可能不是糖基化的。
提及多肽例如免疫球蛋白或蛋白质结合分子,“片段”表示存在于相应的多肽中的任 何氨基酸序列,只要其比全长序列短并且只要其能够表现蛋白质的感兴趣的功能-在免疫球 蛋白特异性结合所需靶标,例如抗原(例如TNF α)的情况下。术语“抗体片段”是指免疫 球蛋白的一部分,通常是高变区,和围绕重链和轻链的部分,其展示出对于特定靶标,通常 是分子的特异性结合亲和力。高变区是与多肽靶标物理结合的免疫球蛋白的一部分。因此抗 体片段包括全长免疫球蛋白的一个或更多个部分,或由全长免疫球蛋白的一个或更多个部分 组成,其保留该免疫球蛋白的靶向特异性。此类抗体片段可例如至少部分缺少全长免疫球蛋 白的恒定区(Fc区)。在一些实施方式中,抗体片段通过全长免疫球蛋白的消化产生。抗体片 段还可为合成构建物或重组构建物,其含有免疫球蛋白或免疫球蛋白链的一个或更多个部分 (参见,例如HOLLIGER,P.和Hudson,J.Engineered antibody fragmentsand the rise of single domains.Nature Biotechnology 2005,第23卷,第9期,第1126-1136页)。抗体片段的实例包 括,但不限于,scFv、Fab、Fv、Fab’、F(ab’)2片段、dAb、VHH、纳米抗体、V(NAR)或 所谓的最小识别单元。
“单链可变片段”或“单链抗体”或“scFv”是一种抗体片段的实例。scFv是包括 通过接头连接的免疫球蛋白的VH和VL结构域的融合蛋白。因此其缺少全长免疫球蛋白中 存在的恒定Fc区。
如本文所使用的“结合成员”是指全长免疫球蛋白、抗体片段、蛋白质非免疫球蛋白支架、和/或其它结合化合物,其具有免疫球蛋白样功能。通常所述结合成员是蛋白质结合分子。此类结合成员可为单价或多价的,即,具有一个或更多个抗原结合位点。单价结合成员的非限制性实例包括scFv、Fab片段、dAb、VHH、DARPin、affilin和纳米抗体。多价 结合成员可具有两个、三个、四个或更多个抗原结合位点,由此可识别一个或更多个不同的 抗原。全长免疫球蛋白、F(ab’)2片段、双-scFv(或串联scFv)和双抗体是多价结合成员的非限制性实例;在示例性多价结合成员中,存在两个结合位点,即所述结合成员是二价的。
在一些实施方式中,所述多价结合成员是双特异性的,即所述结合成员针对两个不 同的靶标或在同一靶分子上的两个不同的靶位点。双特异性抗体为例如在D.和 Kontermann,R.E.Bispecific antibodies.S.Weinheim编:Wiley-VCH,2007.ISBN 3527314539.第345-378页中综述。在一些实施方式中,所述多价结合成员包括多于两个, 例如三个或四个不同的结合位点分别用于三个或四个不同的抗原。此类结合成员分别是多价 的和多特异性的,特别是三或四特异性的。
“非抗体支架”是抗原结合多肽,其例如描述于FIELDER,M.和Skerra,A.Non-antibody scaffolds.S.Weinheim编:Wiley-VCH,2007.ISBN 3527314539.第467-500 页;或GILBRETH,R.N.和Koide,S.Structural insights for engineering bindingproteins based on non-antibody scaffolds.Curr Opin Struct Biol 2012,第22卷,第413-420页。非限制性实例包 括亲和体(affibodies)、affilin分子、AdNectin、基于脂质运载蛋白(lipocalin)家族的多肽 的突变蛋白DARPin、Knottin、Kunitz类型结构域、Avimer、四连接素 (Tetranectin)和反式体(trans-body)。Avimer含有所谓的A-结构域,其作为多个结构域的 串存在于数个细胞表面受体中(Silverman,J.,等人,NatureBiotechnology(2005)23,1556- 1561)。四连接素衍生自各自的人同源三聚体蛋白,同样含有C类型凝集素结构域中的环 区,其可经人工改造用于所需的结合(出处同上)。
“结合化合物”是化学分子或生物分子,其与靶标结合并且不属于如上所限定的全长免疫球蛋白、抗体片段和非抗体支架的类别。结合化合物的实例包括,而不限于大环内酯(GUNDLURU,M.K.等人Design,synthesis and initial biological evaluation of anovel pladienolide analog scaffold.Medchemcomm.2011,第2卷,第904-908页;Paterson,I.等人 Total synthesis and biological evaluation of a series ofmacrocyclic hybrids and analogies of the antimitotic natural productsdictyostatin,discodermolide and taxol.Chem Asian J.2011,第6卷, 第459–473页;Morita,H.等人Synthesis of unnatural alkaloid scaffolds by exploiting plantpolyketide synthase.PNAS 2011,第108卷,第13504-13509页)、分子印迹聚合物(HOSHINO, Y.等人Recognition,neutralization and clearance of target peptidesin the blood stream of living mice by molecular imprinted polymernanoparticles:a plastic antibody.J Am Chem Soc,2010,第 19卷,第664-6645页)、适配体(STREHLITZ,B.,等人Aptamers for pharmaceuticals and their application inenvironmental analytics.Bioanal Rev 2012,第4卷,第1-30页;YE,M.等人 GeneratingAptamers by Cell-SELEX for Applications in Molecular Medicine.Int J Mol Sci2012, 第13卷,第3341-3353页)、Spiegelmer(参见,例如MAASCH,C.等人Polyethylenimine- Polyplexes of Spiegelmer NOX-A50directed againstintracellular high mobility group protein A1 (HMGA1)reduce tumor growth invivo.JBC 2010,第285卷,第40012-40018页)、或肽(环状 或线性;参见,例如GOULD,A.等人Cyclotides,a novel ultrastable polypeptide scaffold for drug discovery.CurrPharm Des.2011,第17卷,第4294-4307页)。可充当蛋白质配体的类肽 是低聚(N-烷基)甘氨酸,其与肽的不同在于,其侧链与酰胺氮而不是α碳原子连接。类肽通 常耐蛋白酶和其它修饰酶并可具有比肽高得多的细胞穿透性(参见,例如Kwon,Y.-U.和 Kodadek,T.,J.Am.Chem.Soc.(2007)129,1508-1509)。
若需要,如本文公开的结合成员可为PEG化的或高糖基化的,同样参见下文。在一些实施方式中,结合成员是上文的示例蛋白质结合分子之一和白蛋白结合结构域(例如链球 菌蛋白G的白蛋白结合结构域)的融合蛋白。在一些实施方式中,结合成员是免疫球蛋白片 段(例如单链双抗体)和免疫球蛋白结合结构域(例如细菌免疫球蛋白结合结构域)的融合蛋 白。作为说明性实例,可将单链双抗体与葡萄球菌蛋白A的结构域B融合,如由Unverdorben等人(Protein Engineering,Design&Selection[2012]25,81-88)所述。
“IC50”或“半峰抑制浓度”是拮抗剂效力的量度,并且定量描述了化合物抑制生物或生物化学功能的有效性。因此该值表示需要多少某一项目,例如结合成员来抑制50%的某 生物或生物化学过程或功能。尽管没有直接的亲和力指示剂,IC50和Ki值是相关的并可经 由Cheng-Prusoff方程来确定(CHENG Y.和Prusoff W.H.Relationship between theinhibition constant(Ki)and the concentration of inhibitor which causes 50percent inhibition(IC50)of an enzymatic reaction.Biochem Pharmacol 1973,第22卷,第3099-3108页;RAMMES,G.,等人 Identification of a domain which affectskinetics and antagonistic potency of clozapine at 5-HT3 receptors.PLOS one2009,第4卷,第1-14页;ZHEN,J.,等人Concentration of receptor and ligandrevisited in a modified receptor binding protocol for high-affinityradioligands:[3H] spiperone binding to D2and D3dopamine receptors.J NeurosciMethods 2010,第188卷,第32- 38页)。
术语“构架”(FR)是指包埋各自的CDR的可变免疫球蛋白结构域的支架,所述可变免疫球蛋白结构域可变轻链(VL)或可变重链(VH)。VL和/或VH构架通常包括在CDR区侧 翼的四个构架部分,FR1、FR2、FR3和FR4。因此,如本领域已知的,VL具有一般结构: (FR-L1)–(CDR-L1)–(FR-L2)–(CDR-L2)–(FR-L3)–(CDR-L3)–(FR-L4),而 VH具有一般结构:(FR-H1)–(CDR-H1)–(FR-H2)–(CDR-H2)–(FR-H3)– (CDR-H3)–(FR-H4)。
术语“CDR”是指主要有助于抗原结合的抗体的高变区。通常抗原结合位点包括包埋在构架支架中的6个CDR。本文中,VL的CDR称作CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3,而 VH的CDR称作CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。这些可被如KABAT,E.A.,等人Sequences of Proteins ofImmunological Interest.第5版.U.S.DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES编.NIH Publications,1991.第91-3242页中所描述的鉴定。但是,如本文所使用 的CDR-H1与Kabat定义的不同在于,其从27位开始并在36位之前结束(为了说明,参见 图5)。
如本文所使用的,用于鉴定抗体的VH和VL中的氨基酸残基位置的编号系统对应于由HONEGGER,A.和Plückthun,A.描述的“AHo”-系统。而另一用于免疫球蛋白可变结 构域的编号方案是:自动建模和分析工具(An automatic modelling and analysis tool).JMB2001,第309卷,第657-670页。该出版物进一步提供了AHo和the Kabat系统之间的转换表(KABAT,E.A.,等人Sequences of Proteins of Immunological Interest.第5版.U.S.DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES编.NIH Publications,1991.第91-3242页)。
“人源化”抗体是指以下抗体:其包括非人亲本抗体(parent antibody)或其变体或合成 CDR的一个或更多个,通常全部6个CDR区,且其构架为,例如(i)人构架,可能包括非人 亲本抗体的一个或更多个构架残基,或(ii)来自非人抗体的经修饰以增加与天然产生的人构 架的相似度的构架。使抗体人源化的方法是本领域中已知的,参见,例如LEGER,O.和 Saldanha,J.Antibody Drug Discovery.WOOD,C.London编:Imperial College Press,2011.ISBN 1848166281.第1-23页。
术语“免疫”(“immunize”,“immunization”,或“immunizing”)是指使动物的免 疫系统暴露于抗原或其表位,如下文更详细地说明。可使用所需施用途径将抗原引入动物中,所述途径例如注射、吸入或摄取。在再次暴露于相同的抗原之后,适应性免疫应答,特别是T细胞和B细胞应答得到增强。
术语“分离”表示物质例如肽或核酸分子已从其正常的生理环境,例如天然来源中被移除,或者合成肽或核酸。使用术语“分离”表示天然存在的序列已从其正常细胞(例如染色体)环境中被移除。因此,所述序列可在不含细胞的溶液中或被置于不同的细胞环境中。提及多肽或核酸分子,“分离”表示彼此偶联的氨基酸(2个或更多个氨基酸)或核苷酸的聚合物,包括从天然来源分离或合成的多肽或核酸分子。术语“分离”不表示所述序列是唯一存在的氨基酸链或核苷酸链,而是其基本上分别不含(例如,约90-95%纯度或更高)例如天然与其相关的非氨基酸材料和/或非核酸材料。
如本文所使用的术语“同一性”是指两个蛋白质或核酸之间的序列匹配。例如使用生物信息学工具例如EMBOSS Needle(两序列比对;可在www.ebi.ac.uk上获得)将待比较的蛋白质或核酸序列进行比对以得到最大同一性。当待比较的序列中的相同位置被相同的核碱 基或氨基酸残基占据时,那么恰好在该位置上的各自的分子是相同的。因此,“%同一性” 是匹配位置的数量除以比较位置的数量并乘以100%的函数。例如,若10个序列位置中的6 个是相同的,那么同一性是60%。两个蛋白质序列之间的%同一性可例如使用Needleman和 Wunsch的算法(NEEDLEMAN,S.B.和Wunsch,C.D.A general methodapplicable to the search for similarities in the amino acid sequence of twoproteins.JMB 1970,第48卷,第443-453页)来 确定,所述算法已并入EMBOSS Needle,其使用BLOSUM62矩阵、“空位开放罚分”为 10、“空位扩展罚分”为0.5、错误“末端空位罚分”、“末端空位开放罚分”为10和“末端 空位扩展罚分”为0.5。具有相同的一级氨基酸或核酸序列的两个分子是相同的,不考虑任 何化学和/或生物修饰。例如,具有相同的一级氨基酸序列但不同的糖基化模式的两个抗体 就该定义而言是相同的。在核酸的情况下,例如,具有相同的序列但不同的连接组分(例如 硫代磷酸酯代替磷酸酯)的两个分子就该定义而言是相同的。
如本文所使用的术语“核酸分子”是指采取任何可能的构型的任何核酸,例如单链的、双链的或其组合。核酸的实例包括例如DNA分子、RNA分子、使用核苷酸类似物或使 用核酸化学产生的DNA或RNA的类似物、锁核酸分子(LNA)、蛋白质核酸分子(PNA)、烷 基膦酸酯和烷基磷酸三酯核酸分子以及tecto-RNA分子(例如Liu,B.,等人,J.Am.Chem.Soc. (2004)126,4076-4077)。LNA具有修饰的RNA骨架,在C4'和O2'之间具有亚甲基桥,为各 自的分子提供了较高的双重稳定性和核酸酶抗性。烷基膦酸酯和烷基磷酸三酯核酸分子可被 看作是DNA或RNA分子,其中核酸骨架的磷酸酯基通过核酸骨架中的磷酸酯基的P-OH基 分别与烷基和烷氧基交换来中和。DNA或RNA可为基因组来源或合成来源,并可为单链或 双链的。此类核酸可为例如mRNA、cRNA、合成RNA、基因组DNA、cDNA合成DNA、 DNA和RNA的共聚物、寡核苷酸等。各自的核酸可另外含有非天然核苷酸类似物和/或与 亲和标签或标记连接。
许多核苷酸类似物是已知的并可用于在本说明书中公开的方法中使用的核酸。核苷 酸类似物是在例如碱基、糖或磷酸酯部分上含有修饰的核苷酸。作为说明性实例,已知用 2'F、2'O-Me或2'H残基置换siRNA的2'-OH残基改善各自的RNA的体内稳定性。在碱基 部分上的修饰可为天然修饰或合成修饰A、C、G和T/U、不同的嘌呤或嘧啶碱基,例如尿 嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基和2-氨基腺嘌呤-9-基,以及非嘌呤或非嘧啶核苷酸碱基。其它核 苷酸类似物用作通用碱基。通用碱基的实例包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用碱基能够 与任何其它碱基形成碱基对。碱基修饰通常可与例如糖修饰,诸如例如2'-O-甲氧基乙基组合,例如以实现独特的性质例如增加的双重稳定性。
如本文件中所使用的,表述“药学上可接受的”是指那些活性化合物、材料、组合物、载体和/或剂型,其在恰当的医学判断的范围内,适用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应、或其它问题或并发症,与合理的效益/风险比相称。
术语“多肽”和“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物并且不限于产物的某一最小长度。在同时使用两个术语的情况下,该双重命名说明在本领域中两个术语并列使用。
在医学/生理学情况下,即在生理状态情况下,术语“预防”是指减小有机体感染或发展异常病症的可能性。
应理解术语“纯化”是与结合成员的原始环境相比较的相对指示,由此代表所述结合成员比在天然环境中相对更纯的指示。其因此包括,但不仅指,在来自其它具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子、免疫球蛋白或抗体片段的绝对纯度意义中的绝对值。与原始水 平相比较,纯化所述结合成员之后的水平将通常高至少2-5倍(例如就mg/ml而言)。明确考 虑至少一个数量级,例如约两个或三个数量级,包括例如约四个或五个数量级的纯化。可能 需要获得以功能上显著的水平至少基本上不含污染物,特别是不含其它蛋白质物质,例如约 90%、约95%或99%纯的结合成员。关于其它物质例如核酸分子、肽或蛋白质、或细胞,以 上经必要修改后亦适用。
“相似的”蛋白质序列是以下那些,其在经比对时,共享相似的氨基酸残基并且最通常地,但不必须地,在待比较的序列的相同位置处共享相同的氨基酸残基。相似的氨基酸残基根据侧链的化学特性被分组到各家族中。这些家族在下文针对“保守性氨基酸置换”进行描述。序列之间的“%相似性”是在待比较的序列的相同序列位置处含有相同或相似残基的位置数除以比较的位置的总数并乘以100%。例如,若10个序列位置中的6个具有相同的氨基酸残基并且10个位置中的2个含有相似的残基,那么该序列具有80%相似性。两个序列之间的相似性可例如使用EMBOSS Needle来确定。
应理解如本文件中所使用的术语“特异性的”表示结合成员针对、结合限定的靶标,例如TNF α,或与其反应。因此,针对、结合或与其反应包括所述结合成员特异性结 合TNF α。在该情况下术语“特异性地”表示所述结合成员与TNF α、或/和其部分反 应,但至少基本上不与另一蛋白质反应。术语“另一蛋白质”包括任何蛋白质,包括与所述 结合成员针对的例如TNF α紧密相关或同源的蛋白质。术语“基本上不结合”表示所述结 合成员对于另一蛋白质不具有特殊的亲和力,即,当与对TNF α的亲和力相比较时显示小 于约30%的交叉反应性。在一些实施方式中,所述结合成员显示小于约20%,例如小于约 10%的交叉反应性。在一些实施方式中,当与对TNF α的亲和力相比较时,所述结合成员 显示小于约9%、8%或7%的交叉反应性。在一些实施方式中,当与对TNF α的亲和力相比 较时,所述结合成员显示小于约6%,例如小于约5%的交叉反应性。可尤其通过将各自的 结合成员与TNF α的反应和所述结合成员与其它蛋白质的反应进行比较来容易地测试所述 结合成员是否如本文所限定特异性地反应。术语“特异性识别”(其可与术语“针对”或 “与……反应”互换使用)在本公开的上下文中表示特定的分子,通常是免疫球蛋白、免疫 球蛋白片段或具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子能够特异性地与如本文所限定的表位 的至少两个,包括至少三个,例如至少四个或甚至更多个氨基酸相互作用和/或结合。通常 免疫球蛋白或蛋白质结合分子可因此与例如TNF α的各自的表位形成复合物。此类结合可 通过“锁钥原理”的特异性来例示。“特异性结合”还可例如根据蛋白质印迹、ELISA-、 RIA-、ECL-、IRMA-测试、FACS、IHC和肽扫描来确定。
如本文所使用的术语“分层”(“stratifying”和“stratification”)表示根据匹配相应 的组的特征(例如响应本文公开的结合成员的对应的可能性)将个体分配到某一组中。所述组 可,例如,用于测试、规定、中止或放弃结合成员。因此,在根据本发明的方法或用途的一 些实施方式中,对象可分层到疗法的临床试验的亚组中。
如本文所使用的术语“对象”也称为个体,其是指人或非人动物,通常是哺乳动物。对象可为哺乳动物种类例如兔子、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、狗、猫、猪、牛、山羊、 绵羊、马、猴子、猿或人。因此,本文件中描述的方法、用途和组合物适用于人疾病和兽医 疾病两者。如下文更详细解释的,从所述对象中获得样品。因此应理解从样品中的表达水平 得出的结论和基于其的决定关系到由其获取样品的对象。此外,尽管对象通常是活有机体, 本文件中描述的方法或用途也可用于死后分析。在对象是接受对疾病或病症的医疗护理的活人的情况下,其还被称为“患者”。
如本文所使用的术语“治疗”(“treatment”和“treating”)是指具有治疗效果并预防、减缓(减轻)、或至少部分缓解或消除对象的有机体中的异常的,包括病态的病症的预防或防范措施。根据本公开的治疗包括向有需要的对象施用药学上有效量的如本文所述的分子,即,尤其是本文公开的结合成员(例如抗体)、核酸、载体或宿主细胞,以预防、治愈 TNFα-相关疾病的一种或更多种症状、延迟TNF α-相关疾病的一种或更多种症状的发作 和/或进展、降低TNF α-相关疾病的一种或更多种症状的严重度、稳定、调节、治愈或减 轻TNF α-相关疾病的一种或更多种症状。通常将所述结合成员、核酸、载体或宿主细胞在 药物组合物中提供,包括本文公开的那些。需要治疗的那些包括已经患有所述疾病的那些以 及容易患有所述疾病的那些,或其中要防治所述疾病(预防)的那些。通常,治疗减轻、稳定 或抑制与疾病或病理状态的存在和/或进展相关的症状的进展。术语“施用”涉及将化合物 并入对象的细胞、体液或组织中的方法。术语“治疗效果”是指抑制或激活引起或导致异常 病症的因素。治疗效果在一定程度上减轻异常病症或疾病的一种或更多种症状。术语“异常 病症”是指有机体的细胞或组织中的功能偏离了它们在该有机体中的正常功能。
如本文所使用的术语“TNF α特异性结合”描述了结合成员以比结合结构不同的抗原更高的亲和力结合TNF α,所述结构不同的抗原不含抗-TNF α结合成员所结合的TNF α表位。特异性结合通过低于1微摩尔的解离平衡常数(KD)来反映。该常数可例如使用 Attana仪器中的石英晶体微天平(Quartz Crystal Microbalance,QCM)或BIACORE仪器中的表 面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)技术来测定。
如本文所使用的“hTNF α”是指人TNF α并包括天然hTNF α和rhTNF α。 “rTNF α”是指重组TNF α。重组TNF α可具有或可不具有氨基末端蛋氨酸残基,取决 于其制备方法。“rhTNF α”β是指重组人TNF α。rhTNF α可例如获自Peprotech,USA, 目录号300-01A。TNF α还可通过从人或非人来源的生物样品的分离获得。
“变体”是指氨基酸或核酸序列,其借助添加(包括插入)、缺失和/或置换一个或更多 个氨基酸残基或核碱基而与亲本序列不同,同时保持本文公开的亲本序列的至少一种所需活 性。在抗体的情况下,此类所需活性可包括特异性抗原结合。类似地,当与亲本序列相比较 时,变体核酸序列可借助添加、缺失和/或置换一个或更多个核碱基来修饰,但是编码的抗 体保持如上所述的所需活性。变体可天然存在,例如等位基因变体或剪接变体,或可经人工 构建。
核酸杂交反应可在不同的严格度的条件下进行。“严格条件”在本领域中是广泛已知 的并且是公开的。通常在杂交反应期间,可使用基于SSC的缓冲液,其中SSC为具有7.0的pH的0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液。增加缓冲液浓度和变性剂的存在增加了杂 交步骤的严格度。例如,高度严格杂交条件可包括使用(i)在42℃下,50%(vol/vol)甲酰 胺、5x SSC(0.75M NaCl,0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1%焦磷酸钠、5 xDenhardt溶液、超声鲑鱼精DNA(50μg/mL)、0.1%SDS和10%硫酸葡聚糖,在0.2x SSC 和0.1%SDS中在42℃下洗涤;(ii)在42℃下,含有0.1%牛血清白蛋白的50%(vol/vol)甲酰胺/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/含有750mM氯化钠的pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液,75mM柠檬酸钠,或(iii)在55℃下,10%硫酸葡聚糖、2x SSC和50%甲酰胺,随后是 在55℃下由含有EDTA的0.1x SSC组成的高度严格洗涤。另外或替代地,可使用,例如50 ℃下的0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠在杂交方案中包括一个、两 个或更多个使用低离子强度和高温度的洗涤溶液的洗涤步骤。
任何术语使用的范围和意义将从使用该术语的具体上下文中显而易见。在详述的适 当情况下给出贯穿本文件使用的所选择的术语的某些另外的限定(如果适用)。
术语“包含”、“包括”、“含有”、“具有”等应当扩展理解或为开放式的,并且没有 限制。单数形式例如“一”、“一个”或“所述”包括复数参考,除非上下文清楚地另外指 出。因此,例如,提及“载体”包括单个载体以及多个载体,或者是相同的-例如相同的操 纵子-或者是不同的。同样提及“细胞”包括单个细胞以及多个细胞。除非另外指出,否则 在一系列元素之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每一个元素。术语“至少一”和 “至少之一”包括例如,一个、两个、三个、四个、或五个或更多个元素。进一步应理解可 使用所述范围以上和以下的微小变化来获得与该范围内的值基本相同的结果。同样,除非另 外指出,否则范围的公开意欲作为包括最小值和最大值之间的每个值的连续范围。
任何术语使用的范围和意义将从使用该术语的具体上下文中显而易见。在详述的适 当情况下给出贯穿本文件使用的所选择的术语的某些另外的限定(如果适用)。
在以下分部中进一步详细描述本公开的各种方面。应理解可随意组合各种实施方式、 优先和范围。另外,取决于具体实施方式,所选的限定、实施方式或范围可能不适用。
结合成员/抗体表征
在一些实施方式中,本文提供的结合成员是对TNF α有特异性的蛋白质结合分子。所述蛋 白质结合分子通常具有免疫球蛋白样功能。在一些实施方式中,所述结合成员基本上由对 TNF α有特异性的蛋白质结合分子组成。在一些实施方式中,所述结合成员包括对TNF α 有特异性的蛋白质结合分子。在一些实施方式中,所述结合成员是对TNF α有特异性的抗 体片段。在一些实施方式中,所述结合成员基本上由对TNF α有特异性的抗体片段组成。 在一些实施方式中,所述结合成员包括对TNF α有特异性的抗体片段。在一些实施方式中,所述结合成员是对TNF α有特异性的全长免疫球蛋白分子。在一些实施方式中,所述 结合成员基本上由对TNF α有特异性的全长免疫球蛋白分子组成。在一些实施方式中,所 述结合成员包括对TNF α有特异性的全长免疫球蛋白分子。在一些实施方式中,所述结合 成员是对TNF α有特异性的非免疫球蛋白支架。所述非免疫球蛋白支架通常具有免疫球蛋 白样功能。在一些实施方式中,所述结合成员基本上由对TNF α有特异性的非免疫球蛋白 支架组成。在一些实施方式中,所述结合成员包括对TNF α有特异性的非免疫球蛋白支 架。
所述结合成员具有对TNF α的结合特异性,即其与TNF α特异性结合。在一些实 施方式中,所述结合成员仅与TNF α特异性结合,并且不与任何另外的靶标特异性结合。 在一些实施方式中,所述结合成员是双特异性的,在于其与TNF α特异性结合,其中其结 合两个不同表位。在一些实施方式中,所述结合成员是双特异性的,在于其与TNF α特异 性结合,并且另外还结合另一靶标。在一些实施方式中,所述结合成员是多特异性的,即, 其与TNFα特异性结合,并且另外还结合多于一个另外的靶标。在一些实施方式中,所述 结合成员是针对TNF α的单价结合成员。所述结合成员以免疫球蛋白样方式结合TNF α。在一些实施方式中,所述结合成员是免疫球蛋白或其片段。特异性针对TNF α的结合 成员通常通过单一分子限定。此类分子通常是蛋白质的。所述结合成员可具有一个、两个或 更多个链。在所述结合成员中包括多个链的情况下,两个或更多个此类链可彼此共价或非共 价结合。
所述结合成员,例如所述单价结合成员,以低于50pM的IC50抑制可溶性人TNF α 的生物效应。在一些实施方式中,所述IC50低于约40pM。在一些实施方式中,所述IC50具 有约30pM或更低的值。
在一些实施方式中,所述单价结合成员是抗体片段。各自的抗体片段通常具有约60 kDa或更低的分子量。在一些实施方式中,所述抗体片段具有约55kDa或更低的分子量。在一些实施方式中,所述抗体片段的分子量为约50kDa或更低。在一些实施方式中,所述 抗体片段具有约45kDa或更低的分子量。在一些实施方式中,所述分子量为约40kDa或约35kDa或更低。在一些实施方式中,所述抗体片段的分子量为约30kDa或25kDa。在一些 实施方式中,所述抗体片段具有小于30kDa、或小于25kDa的分子量。在一些实施方式 中,所述抗体片段的分子量为约23kDa或更低、或约24kDa或更低。在一些实施方式中, 所述抗体片段具有约25kDa或更低、或约26kDa或更低的分子量。在一些实施方式中,所 述抗体片段的分子量为27kDa或更低。
在一个方面,提供了针对TNF α的结合成员。所述结合成员的结合特异性可使用本领域众所周知的技术来验证。可利用多种常规展示技术来测量结合成员的结合特征,所述结 合成员例如免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或蛋白质结合分子。Li等人(Organic&Biomolecular Chemistry(2006),4,3420-3426)已例如证明了如何使用噬菌体展示可获得能够与 所选的DNA适配体形成复合物的单链Fv片段。展示技术例如允许产生人工改造的免疫球 蛋白和对于所选的靶分子具有高亲和力的配体。因此,通常经由基因工程,还可能展示仅略 微不同的一批肽或蛋白质。因此可能根据相互作用的性质和生物物理参数筛选并随后进化 (evolve)蛋白质或肽。可在体外的基础上应用突变和选择的迭代轮次(iterative rounds)。
用于选择肽和蛋白质的体外展示技术依赖于该肽或蛋白质与编码其的核酸之间的物理 连接。已确立众多技术用于该目的,其中最常用的是噬菌体/病毒展示、核糖体展示、细胞 表面展示、‘在质粒上的肽’、mRNA展示、DNA展示和包括微珠展示的体外区室化(invitro compartmentalisation)(综述参见例如Rothe,A.,等人,FASEB J.(2006)20,1599-1610; Sergeeva,A.,等人,Advanced Drug Delivery Reviews(2006)58,1622-1654)。
还可获得将肽,包括蛋白质与核酸物理连接的不同手段。在具有细胞表面分子的细胞 中表达、作为具有病毒/噬菌体外壳蛋白的融合多肽表达、RNA分子、核糖体和各自的多肽 的稳定化体外复合物、经由嘌呤霉素分子或经由微珠的体外共价结合是本领域中目前使用的 连接蛋白质/肽和核酸的方法实例。另一展示技术依赖于油包水乳液。水滴用作隔间,在所 述每一个隔间中转录和翻译单一基因(Tawfik,D.S.,&Griffiths,A.D.,NatureBiotech.(1998)16, 652-656,美国专利申请2007/0105117)。肽包括蛋白质和核酸(编码所述肽)之间的物理连接提 供了回收编码所选的肽/蛋白质的核酸的可能性。与诸如免疫沉淀的技术相比较,在展示技 术中因此不仅可鉴定或选择所选靶分子的结合伴侣,而且可回收该结合伴侣的核酸并用于进 一步加工。因此,目前的展示技术提供了用于例如靶标开发(target discovery)、先导物开发 (lead discovery)和先导物优化(lead optimisation)的手段。可能可以大规模筛选肽或蛋白质(例 如抗体)的大量文库(Vast libraries)。
所述结合成员特异性结合的TNF α是一种细胞因子,其尤其涉及免疫细胞的调节。TNF α涉及与有机体的免疫系统相关的疾病,包括自身免疫疾病和免疫介导的疾病。在一些实施方式中,TNF α是人TNF α,其作为可溶性形式和作为膜形式存在。所述膜形式具 有胞内结构域、跨膜结构域和胞外结构域。所述可溶性形式对应于所述膜形式的233个氨基酸中的氨基酸位置77至233。人TNF α的膜形式具有Uniprot/Swissprot登录号P01375(2015年3月4号的202版)。
来自其它种类的TNF α同样以可溶性分子和跨膜蛋白质的形式存在。例如犬TNF α具有233个氨基酸的长度,其胞外结构域从氨基酸57跨至233。所述可溶性形式从氨基 酸位置77跨至233(参见Uniprot/Swissprot登录号P51742,2015年3月4号的112版)。在 一些实施方式中,所述结合成员特异性结合的TNF α是鼠TNF α,其具有 Uniprot/Swissprot登录号P06804(2015年3月4号的167版)。在一些实施方式中,所述结合 成员特异性结合的TNF α是猫TNF α,其具有Uniprot/Swissprot登录号P19101(2015年1 月7号的110版)。在一些实施方式中,所述结合成员特异性结合的TNF α是牛TNF α, 其具有Uniprot/Swissprot登录号Q06599(2015年3月4号的129版)。在一些实施方式中, TNF α是豚鼠TNF α,其具有Uniprot/Swissprot登录号P51435(2015年3月4号106 版)。在一些实施方式中,TNF α是狗TNF α,其具有Uniprot/Swissprot登录号P51742 (2015年3月4号的112版)。在一些实施方式中,所述结合成员特异性结合的TNF α是猕 猴TNF α,其具有Uniprot/Swissprot登录号P48094(2015年3月4号的108版)。
本文公开的结合成员可包括分别如SEQ ID No:6、7和8中所示的VH CDR序列 CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中的至少一种,或其变体。在一些实施方式中,所述结合成 员包括分别如SEQ ID No:6、7和8中所示的VH CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3 中的多于一种,或其变体。在一些实施方式中,所述结合成员包括分别如SEQ ID No:6、7 和8中所示的VH CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中的全部,或其变体。所述结合 成员还可包括分别如SEQ ID No:3、4和5中所示的VL CDR序列CDR-L1、CDR-L2和 CDR-L3中的至少一种,或其变体。在一些实施方式中,所述结合成员包括分别如SEQ ID No:3、4和5中所示的VL CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中的多于一种,或其变 体。在一些实施方式中,所述结合成员包括分别如SEQID No:3、4和5中所示的VL CDR 序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中的全部,或其变体。
在一些实施方式中,所述结合成员包括分别如SEQ ID No:6、7和8中所示的VH CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中的至少一种,或其变体,但不包括分别如SEQ ID No:3、4和5中所示的VL CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3,或其变体。在一些 实施方式中,所述结合成员包括分别如SEQ ID No:6、7和8中所示的VH CDR序列CDR- H1、CDR-H2和CDR-H3中的至少一种,或其变体,和分别如SEQ ID No:3、4和5中所示 的VL CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中的至少一种,或其变体。在一些实施方式 中,所述结合成员包括分别如SEQ ID No:6、7和8中所示的VH CDR序列CDR-H1、 CDR-H2和CDR-H3中的全部,或其变体,和分别如SEQ IDNo:3、4和5中所示的VL CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中的至少一种,或其变体。在一些实施方式中,所 述结合成员包括分别如SEQ ID No:6、7和8中所示的VH CDR序列CDR-H1、CDR-H2和 CDR-H3中的至少一种,或其变体,和分别如SEQ ID No:3、4和5中所示的VL CDR序列 CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中的全部,或其变体。在一些实施方式中,所述结合成员包 括分别如SEQ ID No:6、7和8中所示的VH CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中的 全部,或其变体,和分别如SEQ ID No:3、4和5中所示的VL CDR序列CDR-L1、CDR-L2 和CDR-L3中的全部,或其变体。
此类结合成员能够以低于50pM的IC50中和可溶性人TNF α。在一些实施方式中, 所述结合成员能够以低于约40pM的IC50中和可溶性人TNF α。在一些实施方式中,所述 结合成员能够以低于约30pM或更低的IC50中和可溶性人TNF α。
所述IC50可例如使用基于细胞的效力分析来测定。在一些实施方式中,以上的IC50值通过在1.4pM rhTNF α的存在下抑制PK-15细胞中的TNF α诱导的细胞毒性来测定。 在典型的实施方式中,使用约10000个细胞并在37℃下滴定所述结合成员。所述细胞通常 用结合成员和可溶性TNF α的混合物培育12至16小时,在一些实施方式中,培育16个小 时。优选地,所述IC50值是此类测定的至少三次独立重复试验所获得的平均值。在一个实施 方式中,此类测定是实施例3中描述的PK-15测定。
所述结合成员还可能能够以低于约100nM的IC50中和跨膜(tm)人TNF α。在一些 实施方式中,该IC50可低于约80nM或低于约75nM。在一些实施方式中,所述结合成员可 能能够以低于约70nM的IC50中和tm人TNF α。所述结合成员还可能能够以低于约65 nM或低于约60nM的IC50中和tm人TNF α。在一些实施方式中,所述IC50可低于约50 nM。在一些实施方式中,所述结合成员可能能够以低于约10nM的IC50中和tm人TNF α。
对tmTNF α的IC50可例如在使用HEK-Dual TNF α敏感细胞的测定中测量,所述HEK-Dual TNF α敏感细胞采用表达tmTNF α的CHO细胞刺激。例如,此类测定在实施 例3中详细描述。在典型的实例中,使用已采用所述结合成员预培育的10000个CHO细胞/ 孔和20000个HEK-Dual TNF α敏感细胞/孔,并在37℃下培养24小时。
因此,在一些实施方式中,提供能够比中和人跨膜TNF α更大程度地中和可溶性人TNF α的结合成员,其中对可溶性人TNF α的IC50值比对人跨膜TNF α的IC50值好至少 100倍。换句话说,对可溶性人TNF α的各自的结合成员的IC50值在与对人跨膜TNF α的 相同结合成员的IC50值相比较时低100倍或更多。因此,所述结合成员在中和可溶性人 TNF α方面比在中和人跨膜TNF α方面有效得多。
本文描述的结合成员可例如为抗体(例如全长免疫球蛋白)或抗体片段,例如Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fv片段、纳米抗体、VHH或最小识别单元)或非抗体支架。
在典型的实施方式中,如上所述的结合成员并且特别是单价结合成员是scFv。所述 VH和VL结构域可通过柔性接头以任何方向(VL-接头-VH或VH-接头-VL)连接。在优选的实施方式中,所述方向是VL-接头-VH,即轻链可变区在多肽的N-末端且重链可变区在多肽的C-末端。
在一些实施方式中,所述结合成员是人源化结合成员。在一些实施方式中,所述结合成员是人源化抗体或人源化抗体片段。
在一些实施方式中,如本文所公开的抗体且特别是抗体片段包括亚型VH3的可变重 链区。在一些实施方式中,如本文所公开的抗体且特别是抗体片段包括亚型Vkappa1的可变 轻链区。在一些实施方式中,如本文所公开的抗体和抗体片段包括亚型VH3的可变重链区 和亚型Vkappa1的可变轻链区两者。在一些实施方式中,如本文所公开的抗体和抗体片段仅 包括亚型VH3的可变重链区而不包括亚型Vkappa1的可变轻链区。在一些实施方式中,如 本文所公开的抗体和抗体片段仅包括亚型Vkappa1的可变轻链区而不包括亚型VH3的可变 重链区。
还提供了本文公开的序列的变体。在一些实施方式中,VH序列是SEQ ID No.:2的变体并与SEQ ID No.:2具有至少85%序列同一性。在一些实施方式中,VH序列是SEQ IDNo.:2的变体并与SEQ ID No.:2具有至少85%序列同一性。在一些实施方式中,VH序列是SEQ ID No.:2的变体并与SEQ ID No.:2具有至少90%序列同一性。在一些实施方式中, VH序列是SEQ ID No.:2的变体并与SEQ ID No.:2具有至少91%序列同一性。在一些实施 方式中,VH序列是SEQ ID No.:2的变体并与SEQ ID No.:2具有至少92%或93%序列同一 性。在一些实施方式中,SEQ ID No.:2的各自的变体与SEQ ID No.:2具有至少93%或94% 序列同一性。在一些实施方式中,VH序列是SEQ ID No.:2的变体并与SEQ ID No.:2具有 至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性。在一些实 施方式中,VH序列是SEQ ID No.:2的变体并与SEQ ID No.:2具有100%序列同一性。
另外或替代地,本文公开的结合成员是一种抗体,其包括SEQ ID No.:1的VL序列的变体,所述变体与SEQ ID No.:1的序列具有至少85%序列同一性。在一些实施方式中,所述抗体或变体包括可变轻链,其包括与SEQ ID No.:1具有至少90%序列同一性的序列。在一些实施方式中,所述抗体或变体包括可变轻链,其基本上由与SEQ ID No.:1具有至少90%序列同一性的序列组成。在一些实施方式中,所述抗体或变体包括可变轻链,其由与SEQ ID No.:1具有至少90%序列同一性的序列组成。在一些实施方式中,所述结合成员是一种抗体,其包括SEQ ID No.:1的VL序列的变体,所述变体与SEQ ID No.:1具有91%或 更多,包括92%或更多序列同一性。在一些实施方式中,所述结合成员是一种抗体,其含有SEQ ID No.:1的VL序列的变体,其中序列与SEQ ID No.:1的序列具有93%或更多,包括94%或更多序列同一性。在一些实施方式中,所述结合成员是一种抗体,其含有SEQ IDNo.: 1的VL序列的变体,所述变体与SEQ ID No.:1具有95%或更多,包括96%或更多序列同 一性。在一些实施方式中,VL序列是SEQ ID No.:1的变体并与SEQ ID No.:1具有至少97%序列同一性。在一些实施方式中,VL序列是SEQ ID No.:1的变体并与SEQ ID No.:1 具有97%或更多,包括98%或更多序列同一性。在一些实施方式中,所述结合成员是一种 抗体,其包括SEQ ID No.:1的VL序列的变体,所述变体与SEQ ID No.:1的序列具有至少 99%序列同一性。在一些实施方式中,所述VL序列是SEQ ID No.:1的变体并与SEQ ID No.:1具有100%序列同一性。
在一个实施方式中,此类抗体包括与SEQ ID No.:2具有85%或更多,例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多,并优选100%序列 相似性的VH序列。另外或替代地,所述抗体包括与SEQ ID No.:1具有85%或更多,例如 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多,并优选 100%序列相似性的VL序列。
在优选的实施方式中,所述抗体包括如SEQ ID No.:1中所示的VH和如SEQ IDNo.: 2中所示的VL或它们的变体。SEQ ID No:1和2的构架序列衍生自WO 03/097697A(ESBATech AG)中描述的人免疫球蛋白。其VH和VL构架序列经修饰用于兔抗体的人源化 和稳定化,参见例如,WO 2009/155726A(ESBATech,AN ALCON BIOMEDICAL RESEARCH UNITLLC);BORRAS,L.,等人Generic approach for the generation of stable humanizedsingle-chain Fv fragments from rabbit monoclonal antibodies.JBC 2010,第285卷,第12期,第9054-9066页。SEQ ID No:1、2、11或12的变体应当以scFv形式保持稳定, 即,它们在延长培育之后高度保持为单体的。例如,如本文所使用的“在延长培育之后高度 保持为单体的”是指例如在4℃、22℃或37℃下培育2周之后,在PBS pH 7.2(磷酸盐缓冲 盐水)中单体含量在10mg/mL下至少为80%。
所述结合成员,特别在scFv的情况下,可包括接头序列。此类接头序列通常具有10至25个氨基酸。通常此类接头肽富含赋予柔性的甘氨酸,以及用于改善溶解度的丝氨酸和/或苏氨酸。在优选的实施方式中,使用(GGGGS)4接头(SEQ ID No.:10)或其变体。也可使用具有三至五个重复片段的该基序的变型。其它合适的接头描述于,例如ALFTHAN,K.Properties of a single-chain antibody containing different linkerpeptides.Prot Eng 1995,第8卷, 第7期,第725-731页中。
因此,在一些实施方式中,所述结合成员具有包括SEQ ID No 9的氨基酸序列。在一 些实施方式中,所述结合成员具有基本上由SEQ ID No 9组成的氨基酸序列。在一个实施方 式中,所述结合成员具有由SEQ ID No 9组成的氨基酸序列。
在一些实施方式中,考虑本文提供的结合成员的变体。例如,可能合意的是改善抗原结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC),以减小对 蛋白水解的敏感性和/或对氧化的敏感性、增加稳定性或溶解性、降低免疫原性和/或改变所述结合成员的其它生物、生物化学或生物物理性质。在一些实施方式中,所述变体不显示优于亲本结合成员的任何改善。在一些实施方式中,变体可为蛋白质分子,其与给定结合成员在其氨基酸序列的一个、两个或更多个位置上不同。通常与给定结合成员的差异是置换。在一些实施方式中,与给定结合成员的差异是缺失。变体可为突变蛋白,即,由通过位点特异性诱变改变的基因序列的表达获得的肽/蛋白质。
本文提供的结合成员的变体可通过蛋白质和/或化学工程、向编码所述结合成员的核 酸序列中引入适当的修饰、或通过蛋白质/肽合成来制备。变体可通过任意组合缺失、置 换、添加和插入至构架或至CDR中的一种或更多种来获得,条件是所产生的结合成员具有 所需特征,针对所述特征其可使用适当的方法来筛选。在一些实施方式中,结合成员的变体 通过一个或两个置换而不同于本文限定的结合成员的特定序列。在一些实施方式中,结合成 员的变体通过高达5个置换而不同于本文限定的结合成员的特定序列。结合成员的氨基酸序 列中的置换可为如上所述的保守性置换。保守性置换的实例包括:
1.以缬氨酸(V)置换丙氨酸(A);
2.以赖氨酸(K)置换精氨酸(R);
3.以谷氨酰胺(Q)置换天冬酰胺(N);
4.以谷氨酸(E)置换天冬氨酸(D);
5.以丝氨酸(S)置换半胱氨酸(C);
6.以天冬氨酸(D)置换谷氨酸(E);
7.以丙氨酸(A)置换甘氨酸(G);
8.以精氨酸(R)或赖氨酸(K)置换组氨酸(H);
9.以亮氨酸(L)置换异亮氨酸(I);
10.以亮氨酸(L)置换蛋氨酸(M);
11.以酪氨酸(Y)置换苯丙氨酸(F);
12.以丙氨酸(A)置换脯氨酸(P);
13.以苏氨酸(T)置换丝氨酸(S);
14.以酪氨酸(Y)置换色氨酸(W);
15.以色氨酸(W)置换苯丙氨酸(F);
和/或
16.以亮氨酸(L)置换缬氨酸(V)
并且反之亦然。
本文描述的序列可包括一个或更多个,例如两个或三个此类保守性置换。在一些实 施方式中,本文公开的结合成员包括与本文公开的序列相比较具有四个或更多个保守性置换 的序列。在一些实施方式中,结合成员包括具有五个或更多个保守性置换的序列。在一些实 施方式中,相对于本文公开的序列,结合成员含有六个或更多个,例如七个或更多个保守性 置换。在一些实施方式中,结合成员可包括八个、九个、十个、十一个、十二个或更多个此 类保守性置换。
非保守性置换可例如,关于多肽的电荷、偶极矩、尺寸、亲水性、疏水性或构象导致更多显著改变。在一个实施方式中,所述结合成员包括一个或更多个,例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个或更多个此类非保守性置 换。
修饰可存在于CDR中或存在于构架序列中。例如,本文提供的CDR可包括一种、 两种、三种、四种、五种或甚至更多种修饰。例如,作为整体的CDR-L1、CDR-L2和CDR- L3序列与本文提供的CDR、特别与(i)SEQ ID No:3,4和5为75%或更多,例如76%或更 多、77%或更多、78%或更多、79%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、91%或 更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98% 或更多,并优选99%或更多相同。另外或替代地,作为整体的CDR-H1、CDR-H2和CDR- H3序列与本文提供的CDR、特别与(i)SEQ ID No:6,7和8至少80%,例如至少81%、82%、83%、84%、95%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或优选 99%相同。
在一个实施方式中,作为整体的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2 和CDR-H3与本文提供的CDR至少85%,例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%或优选99%相似。另外或替代地,作为整体的CDR-L1、CDR-L2、CDR- L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3与本文提供的CDR至少85%,例如90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或优选99%相似。
另外或替代地,变体可包括在序列SEQ ID No.:1至10中任一个中的一个或两个置换。在一些实施方式中,变体包括在序列SEQ ID No.:1至10中任一个中的三个置换。在一些实施方式中,变体包括在序列SEQ ID No.:1至10中任一个中的四个置换。
变体的优选类型是其中一个或更多个完整CDR被取代的一种。通常CDR-H3和 CDR-L3最显著地有助于抗原结合。例如,完整的CDR-L1、CDR-L2、CDR-H1和/或CDR- H2可被天然来源或人工来源的不同CDR取代。在一些实施方式中,一个或更多个CDR被 丙氨酸盒取代。
另外或替代地,抗体的VH可包括一个或更多个增强溶解性的点突变。 WO2009/155725(ESBATech,Novartis Company)描述了一种基序,其已证明增加抗体的总体 溶解性。残基被放置在位于抗体的可变结构域和恒定结构域的界面中的位置并特别稳定抗体片段例如缺乏恒定结构域的scFv。特别地,存在一个或两个以下残基:
(i)在重链氨基酸12位上的丝氨酸(S)(根据AHo编号);
(ii)在重链氨基酸103位上的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)(根据AHo编号);和/或
(iii)在重链氨基酸144位上的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)(根据AHo编号)。
在一些实施方式中,这三种残基全部存在。
在一些实施方式中,所述抗体在VH 12位上具有丝氨酸;在VH 103位上具有丝氨酸;和在VH 144位上具有苏氨酸(所有都是AHo编号)。
在一些实施方式中,如本文所公开的结合成员的变体,当与所述结合成员相比较时,保持与TNF α特异性结合。所述变体可例如保持与人TNF α特异性结合。在一些实 施方式中,如本文所公开的变体结合成员关于抑制可溶性人TNF α的生物效应具有低于约500pM的效力(IC50)。在一些实施方式中,关于抑制可溶性人TNF α的生物效应,所述变 体的效力低于约400pM。当与所述结合成员相比较时,所述变体的IC50在一些实施方式中 可低于约300pM,包括约200pM、约100pM、或约50pM。在一个实施方式中,关于抑制 可溶性人TNF α的生物效应,相对于所述结合成员,结合成员的变体具有低于约40pM的 效力(IC50)。
在一些实施方式中,结合成员的变体能够以小于约100nM、优选约80nM或更低的效力(IC50)抑制跨膜TNF α。在一些实施方式中,变体能够以约75nM或更低的效力(IC50) 抑制跨膜TNF α。在一些实施方式中,变体能够以约70nM或更低,例如约65nM或更低 的效力(IC50)抑制跨膜TNF α。在一些实施方式中,变体能够以约60nM或更低的效力(IC50) 抑制跨膜TNF α。
在一些实施方式中,结合成员的变体与人和非人TNF α交叉反应。在一些实施方式中,如同(亲本)结合成员结合例如食蟹猴、犬、猫和/或猕猴TNF α,结合成员的变体能够 结合相同的TNF α种类。在一些实施方式中,结合成员的变体与本文公开的结合成员竞争 结合TNF α。变体可例如与本文公开的结合成员竞争结合人TNF α。在一些实施方式 中,所述变体能够与本文公开的结合成员竞争结合所述结合成员能够结合的相同的非人TNF α。
在一些实施方式中,如本文所公开的变体结合成员保持与TNF α特异性结合;关于抑制可溶性人TNF α的生物效应具有低于约500pM、例如低于400pM、300pM、200 pM、100pM、50pM、优选低于40pM的效力(IC50);以低于100nM,优选低于约80nM、 75nM、70nM、65nM或60nM的效力IC50抑制跨膜TNF α;与人和非人TNF α交叉反 应,并且如同亲本结合成员结合例如食蟹猴、犬、猫和/或猕猴TNF α,所述变体结合成员 结合相同的TNF α种类;和与本文公开的结合成员竞争结合TNF α,例如人TNF α并优 选结合所述结合成员结合的相同的非人TNFα。
变体还可通过轻链和重链的链改组来制备。可将单一轻链与重链库组合以产生变体 库。在一个实施方式中,所述单一轻链选自上述VL序列组和/或所述重链库包括一个或更多 个上述VH序列。同样,可将单一重链与轻链库组合。在一些实施方式中,所述单一重链选 自上述VH序列组和/或所述轻链库包括一个或更多个上述VL序列。
结合成员可包括上述任何VL和/或VH序列。具有单一结构域形式的结合成员,例如纳米抗体或VHH,仅包括上述VL或VH序列中的任一者,优选VH序列,并且是单价 的。多价结合成员,例如F(ab’)2片段、双-scFv(也称为串联scFv)或双抗体,特别是双特 异性结合成员,可包括一个或更多个上述VL序列和/或一个或更多个上述VH序列。多价结 合成员可包括靶向不同于TNF α的抗原的VH和/或VL序列。
本文公开的结合成员特别稳定。具体而言,本文公开的单价抗体片段和本文公开的scFv特别稳定。如本文所使用的术语“稳定性”是指多肽用于在长期培育和/或在高温下培 育之后在溶液中保持为单体的生物物理性质。不稳定的多肽易于二聚或低聚并甚至沉淀,由 此减少保存期并变得较不适于药物应用。
本文提供的结合成员并特别是以上单价抗体片段在37℃下,以在pH 7.2的PBS中的 10mg/mL浓度培育1周以后保持至少75%、优选至少80%、85%、90%、95%并最优选97%为单体的。另外或替代地,本文提供的结合成员并特别是以上单价抗体片段在4℃或在22℃下,以在pH 7.2的PBS中的10mg/mL浓度1周以后保持90%或更多为单体的。在一 些实施方式中,本文公开的结合成员在4℃或在22℃下,以在pH 7.2的PBS中的10 mg/mL浓度1周以后保持92%或更多,例如94%或更多为单体的。在一些实施方式中,所 述结合成员在4℃或在22℃下,以在pH 7.2的PBS中的10mg/mL浓度1周以后保持95% 或更多,例如96%或更多,或97%或更多为单体的。在一个实施方式中,所述结合成员在4 ℃或在22℃下,以在pH7.2的PBS中的10mg/mL浓度1周以后保持99%或更多为单体 的。
单体的分数可例如通过SE-HPLC(尺寸排阻高效液相色谱,Size Exclusion-High-Performance Liquid Chromatography)来确定。用于此类测试的合适的流动相为例如PBSpH 7.2。单体含量可通过在蛋白质层析期间测量的UV280信号的峰值积分来定量。合适的系统 为例如通过6.5软件控制的Dionex UltiMate 3000RS HPLC,所述软件还允许随 后的色谱分析和峰值定量。
所述结合成员,例如单价抗体片段,包括scFv,可具有在5至10、优选7至9范围 内的理论等电点(pI)。所述理论pI可,例如,通过使用ExPASy服务器上的ProtParam工具 来计算(可获自http://web.expasy.org/protparam/;还参见GASTEIGER E.等人ProteinIdentification and Analysis Tools on the ExPASy Server.(In)The ProteomicsProtocols Handbook. WALKER J.M.Totowa编:Humana Press Inc.,2005.ISBN9781588295934.第571-607页)。
所述结合成员,例如scFv,可在PBS pH 7.2中浓缩至高于35mg/ml,优选高于40mg/ml、45mg/ml、47mg/ml、48mg/ml、49mg/ml,最优选高于50mg/ml的浓度。结合成 员可被浓缩得越高,结合成员的溶解度越高。
所述结合成员可与来自非人种类的TNF α交叉反应,所述来自非人种类的TNF α例如,而不限于,猫TNF α、猕猴TNF α、犬TNF α。这特别可用于临床前试验目的, 例如动物研究。优选地,所述结合成员不与人淋巴毒素α2/β1、人淋巴毒素α1/β2、人 CD40配体/TNFSF5和/或人TNFβ/TNFSF1交叉反应。
还提供了与如本文所公开的抗体竞争的结合成员,所述结合成员用于结合人TNFα。例如,此类竞争(或交叉阻断)结合成员可为中和。在典型的实施方式中,此类结合成员在抑制在PK-15细胞中的可溶性1.4pM rhTNF α诱导的细胞毒性时具有低于50pM的效力IC50。
如本文所使用的术语“竞争”是指用于结合相同靶标的结合成员之间的竞争。竞争可通过竞争性结合测定来确定,在所述测定中感兴趣的结合成员阻止或抑制或减少本文公开 的结合成员与普通抗原(此处是hTNF α或其片段)的特异性结合。此类竞争性结合测定在本 领域中是已知的,并且包括,而不限于,固相直接或间接放射免疫测定(RIA)和固相直接或 间接酶免疫测定(EIA)。通常此类测定包括使用与固体表面结合的纯化抗原、待测试的结合 成员和如本文所述的参考结合成员。竞争性抑制通过测定(i)在待测试的结合成员的存在下与 固体表面结合的参考结合成员的量,或(ii)在参考结合成员的存在下与固体表面结合的待测 试的结合成员的量来测量。竞争结合成员可结合(i)与所述参考结合成员相同的表位、(ii)重 叠表位(overlapping epitope)、或(iii)在相同的靶分子上但是空间阻碍所述参考结合成员与其靶 结合的不同表位。
通常,当竞争结合成员过量存在时,其将减少如本文所述的结合成员与TNF α的特异性结合,即,其交叉阻断结合达40-45%或更多。当过量存在时,在一些实施方式中,竞 争结合成员将使所述结合成员与TNF α的特异性结合减少45-50%或更多,例如50-55%或 更多、或55-60%或更多。在一些实施方式中,在竞争结合成员的存在下,结合成员的结合 减少60-65%或更多、65-70%或更多、70-75%或更多、或75%或更多。优选地,在竞争结合 成员的存在下,本文描述的结合成员的结合减少80-85%或更多。在一些实施方式中,在竞 争结合成员的存在下,结合成员的结合减少85-90%或更多,包括90-95%或更多。在一些实施方式中,在竞争结合成员的存在下,结合成员的结合减少95-97%或更多。在一些实施方式中,在竞争结合成员的存在下,结合成员的结合减少97%或更多。
在一些实施方式中,所述竞争结合成员以约1pM或更多的亲和力KD结合hTNF α。在一些实施方式中,所述竞争结合成员以约10pM或更多的KD结合hTNF α。在一些 实施方式中,所述竞争结合成员以约100pM或更多,例如500pM或更多的亲和力KD结合 hTNF α。在一些实施方式中,所述竞争结合成员以约1nM或更多的KD结合hTNF α。 在一些实施方式中,所述竞争结合成员以约10nM或更多的KD结合hTNF α。
因此,一方面,提供了结合成员,其
(i)能够结合可溶性TNF α和跨膜TNF α;
(ii)如通过抑制PK-15细胞中的1.4pM rhTNF α诱导的细胞毒性所测量,以约30±6pM 的IC50中和可溶性TNF α;
(iii)在用表达tm的CHO细胞刺激的HEK-Dual TNF α敏感细胞中测量时以约50nM的 IC50中和tmTNF α;和/或
(iv)与可溶性人、猕猴、食蟹猴、犬和猫TNF α交叉反应。在一个实施方式中,所述结合 成员包括如SEQ ID No.3-8中所示的至少一个,例如至少CDR-L3和CDR-H3,优选所有的 CDR。在一个实施方式中,所述结合成员是包括SEQ ID No.:9的scFv,并还具有一种或更多种以下特征
(v)在4℃和PBS pH 7.2中10mg/mL浓度下6个月至少90%是稳定的;
(vi)在4℃和PBS pH 7.2中10mg/mL浓度下2周至少95%是稳定的;
(vii)具有76℃的Tm;和/或
(viii)具有8.27的pI。
在一个实施方式中,本文公开的结合成员是单价的,例如scFv或Fab片段。在另一实施方式中,所述结合成员是多价的。此类多价分子可为二价的(例如全长免疫球蛋白或 F(ab’)2片段)或包括至少三个靶结合位点。
所述多价结合成员可为双特异性抗体,例如双抗体、单链双抗体或串联scFv(参见, 例如KONTERMANN,R.E.Methods in Molecular Biology.LO,B.Totowa,N.J.编:HumanaPress,2004.ISBN 1588290921.第227-242页)。各自的双特异性抗体可很好地使用比上文针 对scFv描述的那些更短的接头,即,仅具有SEQ ID NO:14的基本基序的一至三个重复(参 见,例如HOLLIGER,P.,等人Diabodies:small bivalent and bispecific antibodyfragments.PNAS 1993,第90卷,第14期,第6444-6448页)。在另一实施方式中,所述多价结合成员是三抗 体、微抗体或四抗体。
还提供了包括如本文所公开的抗体的T-抗体(T-bodies)。T-抗体是免疫球蛋白T-细胞 受体(cIgTCR),其将抗体的抗原识别与T-细胞受体复合物的信号和效应器性质组合。在此类 构建物中,在一些实施方式中,所述抗体是抗体片段,例如Fv、Fab、scFv或scFv-Fc。在 一个实施方式中,所述抗体是scFv。对于T-抗体的一般设计及其应用的进一步讨论参见例 如SCHIRRMANN,T.和Pecher,G.Handbook of Therapeutic Antibodies.S.Weinheim 编:Wiley-VCH,2009.ISBN 3527314539.第533-561页。
在一些实施方式中,根据本公开的结合成员可包括捕获部分,例如链霉亲和素结合 标签,例如描述于美国专利申请US 2003/0083474、美国专利5506121或6103493中的捕获部分的其它实例包括,但不限于,麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、钙调蛋白结合肽(CBP)、FLAG-肽(例如序列Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Gly 的)、T7表位(Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、单纯疱疹 病毒糖蛋白D的序列Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp的HSV表位、序列Tyr- Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys的水泡性口炎病毒糖蛋白(Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein,VSV-G)表位、序列Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala的血凝素(HA)表位和 序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu的转录因子c-myc的“myc”表位。
捕获部分的另一实例是金属螯合剂,其能够结合金属离子。各自的捕获部分可为乙 二胺、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、N,N-双(羧甲 基)甘氨酸(也称作氮川三乙酸,NTA)、1,2-双(o-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、2,3-二巯基-1-丙醇(二巯基丙醇)、卟啉或血红素。按照用于本领域的固定化金属亲和色谱的标准方法,例如低聚组氨酸标签能够与铜(Cu2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)或锌(Zn2+)离 子形成复合物,其可例如借助螯合剂氮川三乙酸(NTA)呈现用于色谱目的。
核酸、载体、宿主细胞和生产方法
如本文所述的结合成员可由单一核酸序列或由多个核酸序列编码。在多个核酸序列的情况 下,各序列可编码一个可变区。在一些实施方式中,核算序列可编码两个或更多个可变区。 一般而言多个核酸序列编码结合成员的可变区。通常各可变区由一个不同的核酸序列编码。 编码可变区的各自的核酸序列可包括在单一的核酸分子中。在一些实施方式中,编码可变区 的两个或更多个核酸序列包括在单一的核酸分子中。在一些实施方式中,编码可变区的各核 酸序列包括在单一的不同核酸分子中。因此,多个核酸分子可用于产生结合成员,例如各自 编码至少一个可变区。在一些实施方式中,各自的核酸分子可限定表达盒。如上所指出的, 表达盒是能够引导特定的核苷酸序列在适当的宿主细胞中表达的核酸分子。
表达盒包括启动子,其可操作地连接感兴趣的核苷酸序列,所述序列可操作地连接 一个或更多个终止信号。其还可包括核苷酸序列的适当翻译所需的序列。编码区可编码感兴 趣的多肽并且还可在正义方向或反义方向上编码感兴趣的功能RNA,包括但不限于,反义 RNA或非翻译RNA。包含感兴趣的核苷酸序列的表达盒可为嵌合的,表示其组分中的至少 一种关于其其它组分中的至少一种是异源的。所述表达盒还可为天然存在的一种,但是以可 用于异源表达的重组形式获得。但是,在一些实施方式中,所述表达盒关于宿主是异源的; 即,表达盒的特定核酸序列未天然存在于宿主细胞中,并且通过转化事件被引入宿主细胞或 宿主细胞的祖先中。核苷酸序列在表达盒中的表达可处于组成型启动子或诱导型启动子的控 制下,所述启动子仅在宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激时引发转录。在多细胞有机体例 如植物或动物的情况下,所述启动子还可能对于特定的组织、器官、或发育阶段是特异性 的。
已知所述结合成员或其部分的序列,编码多肽序列的cDNA可通过本领域众所周知的方法(例如通过基因合成)来产生。这些cDNA可通过标准克隆和诱变技术来克隆到合适的载体例如表达载体或克隆载体中。任选地,所述可变轻链由与所述抗体的可变重链不同的核 酸编码。另外,在基因构建物中可包括额外的序列例如标签(例如His-标签)、用于产生Fab 或全长免疫球蛋白的恒定结构域、接头、第二结合特异性或另一功能多肽例如用于产生融合 构建物或双特异性分子的酶的编码序列。
基于所选的克隆策略,基因构建物可产生具有一个或更多个在N-末端或C-末端的额 外的残基。例如,衍生自起始密码子的N-端蛋氨酸或额外的丙氨酸可存在于经表达的多肽 中,除非其在翻译后被剪去。因此应理解本文公开的抗体包括所公开的序列,而不是由其组 成。因此,在一个实施方式中,所述结合成员具有SEQ ID No.9或19的序列。
标准克隆、诱变和分子生物学技术的基本方案描述于,例如Molecular Cloning,ALaboratory Manual(GREEN,M.和Sambrook,J.Molecular Cloning:a Laboratory Manual.第4 版.Cold Spring Harbor Laboratory,2012.ISBN 1936113422.)中。
用于表达所述基因构建物的适当的宿主细胞可为原核的或真核的。合适的原核宿主 细胞是革兰氏阴性或革兰氏阳性的,并且包括埃希氏菌(Escherichia)、欧氏杆菌(Erwinina)、 肠杆菌(Enterobacter)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、假单胞菌(Pseudomonas)或芽孢杆菌(Bacillus) 家族的种类。在一些实施方式中,所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli),例如一个或更 多个大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Life TechnologiesTM,目录号C6000-03)和OrigamiTM 2(DE3) (Novagen,目录号71345)。
若需要翻译后修饰例如糖基化或磷酸化,可能有利的是使用真核宿主细胞。例如,真核微生物例如常用的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichiapastoris)菌株可 充当宿主细胞。宿主细胞的合适的实例还包括植物细胞或动物细胞,特别是昆虫细胞或哺乳 动物细胞。合适的哺乳动物细胞包括,而不限于,中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cells,CHO)、人胚肾细胞(Human Embryonic Kidney Cells,HEK)、人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)或NS0骨髓瘤细胞。
可通过在合适的宿主细胞中表达的方式产生所述结合成员。例如,通过标准技术例 如电穿孔或化学转化将上文描述的表达载体引入宿主细胞中。随后将转化的细胞在适合于重 组蛋白表达的条件下培养,通常在适当的营养培养基中,任选地经修饰用于诱导启动子、选 择转化体或扩增感兴趣的编码序列。使用本领域的标准技术从培养物中回收所述结合成员并 任选进行纯化。可通过优化培养基和培养条件例如温度或氧气供应来改善重组蛋白的产率。 在原核生物中,所述结合成员可在周质中产生,在细胞内作为包涵体或分泌到培养基中。在 收获之后,可使用本领域众所周知的方法将蛋白纯化,所述方法包括凝胶过滤、离子交换色 谱、反相色谱、疏水相互作用、混合模式色谱和/或亲和色谱。
在一个实施方式中,所述结合成员在不含细胞的系统中产生。这通常涉及编码如本 文所述的蛋白的核酸产物模板,例如质粒DNA或PCR产物模板的体外转录随后是体外翻译。例如,使用来自生长细胞的粗溶解产物,这提供了必需的酶以及细胞蛋白合成机构。必需的结构单元例如氨基酸或核碱基以及能量输送分子和其它可外部供应。不含细胞的表达系 统可,例如,基于溶解的兔网织红细胞(例如Rabbit Reticulocyte Lysate System,Promega,目 录号L4540)、HeLa细胞(例如1-Step Human In Vitro Translation Kit,Thermo Scientific,目录 号88881)、昆虫细胞(例如EasyXpress Insect Kit II,Qiagen,目录号32561)、小麦胚芽(例如 Wheat Germ Extract,Promega,目录号L4380)、或大肠杆菌细胞(例如In Vitro Protein Synthesis Kit,NEB,目录号E6800S)。同样,用于改善的二硫键生成的优化的不含细 胞的抗体表达系统可用于生产。市售试剂盒包括昆虫细胞溶解产物(例如EasyXpress Disulfide Insect Kit,Qiagen,目录号32582)或大肠杆菌溶解产物(例如EasyXpress Disulfide E. coli Kit,Qiagen,目录号32572)。不含细胞的蛋白合成具有例如快速、获得高产物产率、允 许容易的反应条件改变、形成低程度的副产物或甚至不形成副产物的优势。不含细胞的蛋白 合成可包括生物和/或化学步骤,其不能仅在生物或化学生产系统中进行。例如,可在所需 位置处将非天然的或化学修饰的氨基酸引入蛋白中。已在不含细胞的系统中成功地生产 ScFv-毒素融合蛋白(NICHOLLS,P.J.,等人Characterization of single-chain antibody(sFv)-toxin fusion proteinsproduced in vitro in rabbit reticulocyte lysate.JBC 1993,第268卷,第5302– 5308页)。因此,在一个实施方式中,提供了生产本文描述的结合成员或以上T-抗体的方 法,其包括步骤(a)提供不含细胞的系统,(b)提供编码以上结合成员或以上T-抗体的核酸 产物模板,(c)允许所述核酸产物模板的转录和翻译;(d)回收;和任选地(e)分别纯化所述 结合成员或所述T-抗体。
另外或替代地,产生本文描述的结合成员的方法包括至少一个化学合成步骤。例如,所述方法可完全是化学方法。在另一实施方式中,以上描述的基于细胞或不含细胞的生产系统包括此类至少一个化学合成步骤。
在一些实施方式中,使用用于在大肠杆菌中的胞内表达的表达载体在基于细胞的系 统中产生如本文所述的结合成员。在表达之后,多肽作为包涵体在宿主细胞内生成,该宿主 细胞与另外的细胞颗粒分开,随后在变性剂例如盐酸胍(GndHCl)中溶解并通过技术人员众所 周知的复性步骤进行重折叠。
所需结合成员还可在转基因动物中产生。可根据标准方法获得合适的转基因动物, 所述方法例如包括步骤(i)制备转基因胚胎,例如通过将包括所述结合成员的编码序列以及合 适的控制序列的DNA构建物微注射到鸡蛋中;(ii)将所述鸡蛋转移到假孕接收雌性体内; (iii)监控妊娠或孕期;和(iv)选择表达所需抗体的后代。
应理解以上描述的核酸、载体、宿主细胞和生产方法也适用于本文描述的结合成员 (在它们是蛋白的情况下)和/或T-抗体。
化学和/或生物修饰
一方面,本文公开的结合成员是经化学修饰和/或生物修饰的。此类修饰可包括,但不限 于,糖基化、PEG化、HES化、白蛋白融合技术、PAS化、用染料和/或放射性同位素标记、与酶和/或毒素缀合、磷酸化、羟基化和/或硫酸化。同样,以上描述的任何结合成员、 核酸序列、载体和/或宿主细胞可相应进行修饰。
可进行化学和/或生物修饰以优化蛋白的药效学或水溶性或减小其副作用。例如,可 应用PEG化、PAS化和/或HES化以减慢肾清除率并因此增加所述结合成员的血浆半衰期。另外或替代地,修饰可向蛋白增加不同的功能,例如增加毒素以更有效地对抗癌细胞,或增加用于诊断目的的检测分子。
糖基化是指在蛋白上附着碳水化合物的过程。在生物系统中,该过程在细胞内作为 共翻译修饰和/或翻译后修饰的形式酶促(enzymatically)进行。蛋白,此处是结合成员例如抗 体,也可经化学糖基化。通常地但不限于,糖基化是(i)N-连接至天冬酰胺或精氨酸侧链的 氮上;(ii)O-连接至丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟基赖氨酸或羟基脯氨酸侧链的羟基氧上; (iii)包括木糖、岩藻糖、甘露糖和N-乙酰葡糖胺与磷酸-丝氨酸连接;或(iv)以C-甘露糖基 化的形式,其中将甘露糖添加至在特异性识别序列中发现的色氨酸残基。糖基化模式可例如 通过选择适当的细胞系、培养基、蛋白工程制造模式和方法策略来控制(HOSSLER,P. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cellculture.Glycobiology 2009,第19 卷,第9期,第936-949页)。
用以控制或改变糖基化模式的蛋白工程可包括删除和/或添加一个或更多个糖基化位 点。可通过将相应的酶识别序列引入所述结合成员的氨基酸序列中或通过添加或置换一个或 更多个以上枚举的氨基酸残基来方便地实现糖基化位点的产生。
可能合意的是使所述结合成员PEG化。PEG化可改变蛋白的药效学性质和药代动力学性质。将分子量适当的聚乙二醇(PEG)共价连接到蛋白骨架上(参见,例如PASUT,G.和Veronese,F.State of the art in PEGylation:the great versatility achievedafter forty years of research.J Control Release 2012,第161卷,第2期,第461-472页)。PEG化可通过保护PEG 化蛋白免遭免疫系统的破坏来额外降低免疫原性和/或通过例如增加所述结合成员的体内稳 定性、保护其免于蛋白质水解降解、延长其半衰期并通过改变其生物分布来改变其药代动力 学。
可通过PEG模拟物来实现类似效果,例如HES化或PAS化所述抗体。HES化利用 羟乙基淀粉(“HES”)衍生物,而在PAS化期间,所述所述抗体变为与由氨基酸脯氨酸、丙 氨酸和丝氨酸组成的构象无序的多肽序列连接。这些PEG模拟物和相关化合物例如描述于BINDER,U.和Skerra,A.Half-Life Extension of Therapeutic Proteins via GeneticFusion to Recombinant PEG Mimetics,in Therapeutic Proteins:Strategies toModulate Their Plasma Half- Lives.KONTERMANN,R.,Weinheim编,Germany:Wiley-VCH,2012.ISBN:9783527328499. 第63-81页中。
所述结合成员可包括表位,例如补救受体(salvage receptor)结合表位。此类补救受体 结合表位通常是指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位并具有增加所 述分子的体内半衰期的作用。
另外或替代地,所述结合成员用第二部分标记或与第二部分缀合,所述第二部分在 靶向结合之后认为具有辅助功能。所述第二部分可例如具有额外的免疫效应器功能,有效用 于药物靶向或可用于检测,而不限于此。所述第二部分可例如使用本领域已知方法与所述结 合成员化学连接或基因融合。
可用作第二部分的分子包括,而不限于,放射性核素(也称作放射性同位素)、脱辅基 酶、酶、辅因子、肽部分例如HIS-标签、蛋白质、碳水化合物例如甘露糖-6-磷酸标签、荧光团例如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白、绿色/蓝色/红色或其它荧光蛋白、别藻蓝蛋白(APC)、发色团、维生素例如生物素、螯合剂、抗代谢物例如甲氨蝶呤、脂质体、毒素例如 细胞毒性药物或放射性毒素。放射性核素的说明性实例是35S、32P、14C、18F和125I。合适的 酶的实例包括,但不限于,碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和血管生成素。 合适的蛋白质的说明性实例是凝集素。合适的细胞毒性药物的实例包括,但不限于,紫杉 酚、短杆菌肽D和秋水仙素。
标记的结合成员特别可用于体外和体内检测或诊断目的。例如,用合适的放射性同 位素、酶、荧光团或发色团标记的结合成员可分别通过放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附 测定(ELISA)、或基于流式细胞术的单细胞分析(例如FACS分析)来检测。类似地,本文公开 的核酸和/或载体可用于检测或诊断目的,例如使用其标记片段作为杂交测定中的探针。标 记方案可例如在JOHNSON,I.和Spence,M.T.Z.Molecular Probes Handbook,AGuide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies.Life Technologies,2010.ISBN:0982927916中找 到。
应理解以上概述的内容也适用于T-抗体。
组合物
可在组合物中提供如本文所公开的结合成员、核酸序列和/或载体,该组合物还包括合适的 载体、赋形剂或稀释剂。在典型的实施方式中,各自的组合物包括本文描述的抗体。
此类组合物可例如为诊断组合物、化妆品组合物或药物组合物。为了治疗目的或美 容目的,所述组合物为包括药物载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物,即,在所采用的剂量 和浓度下无毒性。
合适的“载体”、“赋形剂”或“稀释剂”包括,而不限于:(i)缓冲剂例如磷酸盐、 柠檬酸盐或其它有机酸;(ii)抗氧化剂例如抗坏血酸和生育酚;(iii)防腐剂例如3-戊醇、六甲氯胺、苯扎氯铵、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯、邻苯二酚或环己醇;(iv)氨基酸,诸如例 如组氨酸、精氨酸;(v)肽类,优选长达10个残基例如聚赖氨酸;(vi)蛋白质,例如牛或人 血清白蛋白;(vii)亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮;(viii)单糖、二糖、多糖和/或其它碳 水化合物包括葡萄糖、甘露糖、蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、山梨糖醇、氨基葡聚糖或聚酰胺 型胺;(ix)螯合剂,例如EDTA;(x)成盐离子例如钠;(xi)金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物);和/或(xii)离子和非离子表面活性剂例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
许多示例化合物具有不同的功能并可例如充当载体和作为稀释剂。还应当理解所述 组合物可包括多于一种的各载体、稀释剂或赋形剂。
可将所述结合成员、所述核酸序列或所述载体在固体支撑材料(例如珠和微粒)上提 供。通常结合成员分子经由共价键(任选地涉及接头)、非共价键或两者与此类载体连接。所 述珠和微粒可包括,例如,淀粉、纤维素、聚丙烯酸酯、聚乳酸聚乙醇酸(polylacetate polyglycolate)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、胶乳或葡聚糖。
在一个实施方式中,提供一种药物组合物,其包括如上所述的结合成员、核酸序列或载体。所述组合物可另外包括治疗有效量的一种或更多种额外的治疗活性化合物。在一些 实施方式中,所述额外的治疗活性化合物是对抗TNF-介导的疾病有活性的化合物。
_ 治疗应用
如本文所述的分子,特别是所述结合成员(例如抗体)、所述核酸分子或所述载体可用作药 剂。通常此类药剂包括治疗有效量的如本文所提供的分子。因此,各自的分子可用于生产可 用于治疗一种或更多种TNF α相关疾病的药剂。
一方面,提供了治疗TNF α相关疾病的方法。所述方法包括向有需要的对象施用药学上有效量的如本文所述的分子,特别是抗体的步骤。在一个实施方式中,向对象施用以上描述的药物组合物,其包括此类药学上有效量的结合成员,例如抗体。可向对象施用以上提及的药剂。
需要治疗的对象可为人或非人动物。通常所述对象是哺乳动物,例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、狗、猫、猴、猿、山羊、绵羊、马、鸡、豚鼠或猪。在典型的实施方式中,所述 对象被诊断为患有TNF α相关疾病或可能获得此类疾病。在动物模型的情况下,所述动物 可进行基因工程以发展TNF α相关疾病。在动物模型中,动物还可以其显示TNF α介导 的疾病的特征的这种方式进行基因工程。
已知各种TNF α相关疾病,其中TNF α的拮抗剂已显示治疗效果。在一些实施方 式中,所述TNF α-相关疾病是增殖型糖尿病性视网膜病变(LIMB GA等人Distribution ofTNF αand its reactive vascular adhesion molecules in fibrovascular membranesof proliferative diabetic retinopathy.Br J Ophthalmol.1996年2月;80(2):168-73)。在一些实施方式中,所述 TNF α相关疾病是痛风性关节炎、急性痛风性关节炎和慢性痛风性关节炎中的至少一种 (TAUSCHE AK等人,Severe gouty arthritis refractory toanti-inflammatory drugs:treatment with anti-tumour necrosis factor alpha as anew therapeutic option.Ann Rheum Dis.2004年10 月;63(10):1351-2)。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是施尼茨勒综合征(Schnitzler syndrome)。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是全身型幼年特发性关节炎 (KOTANIEMI K等人,Long-term efficacyof adalimumab in the treatment of uveitis associated with juvenile idiopathicarthritis.Clin Ophthalmol.2011;5:1425-9,电子出版2011年10月3 号)。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是类风湿性关节炎(PARAMESWARAN,N.和 PAIAL S.TumorNecrosis Factor-a Signaling in Macrophages.Crit Rev Eukaryot Gene Expr.2010;第20(2)卷,第87-103页)。所述TNF α相关疾病还可为荨麻疹(SAND FL和THOMSEN SF. TNF-Alpha Inhibitors for Chronic Urticaria:Experience in 20Patients.J Allergy(Cairo). 2013;2013:130905.电子出版2013年9月18号)。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾 病是血管炎(CHUNG SA和SEO P.Advances in the use of biologic agents forthe treatment of systemic vasculitis.Curr Opin Rheumatol.2009年1月;21(1):3-9)。在一些实施方式中,所述 TNF α相关疾病是1型糖尿病或2型糖尿病。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是 复发性多病灶性骨髓炎。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是复发性多软骨炎 (CARTER JD.Treatment of relapsing polychondritis with aTNF antagonist.J Rheumatol.2005年 7月;32(7):1413)。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是cyropyrin-相关周期性综合征 (CAPS)。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是贝赛特氏症(disease)(PERRA D等人.Adalimumab for the treatment ofdisease:experience in 19patients. Rheumatology(Oxford).2012年10月;51(10):1825-31.电子出版2012年6月20号)。在一些 实施方式中,所述TNF α相关疾病是家族性地中海热。所述TNF α相关疾病还可能是慢 性阻塞性肺病(COPD)。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是风湿性多肌痛。在一些 实施方式中,所述TNF α相关疾病是基于含有NACHT、LRR和PYD结构域的蛋白质3 (NALP3)的一个或更多个突变。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是坏疽性脓皮病 (PATEL F等人Effective Strategies for theManagement of Pyoderma Gangrenosum:A Comprehensive Review.Acta DermVenereol.2014年11月12号)。在一些实施方式中,所述 TNF α相关疾病是慢性特发性荨麻疹。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是银屑病 (参见,例如CORDORO,KM和FLEDMANSR.TNF-alpha inhibitors in dermatology.Skin Therapy Letter 2007,第12卷,第4-6页)。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是骨关 节炎。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是湿性年龄相关性黄斑变性。在一些实施 方式中,所述TNF α相关疾病是干眼综合征。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病 是滑膜炎-痤疮-脓疱病-骨肥厚-骨炎综合征。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是巨 噬细胞活化综合征。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是周期热(Di Gangi M等人 Long-term efficacy of adalimumab inhyperimmunoglobulin D and periodic fever syndrome.Isr Med Assoc J.2014年10月;16(10):605-7)。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是腺 炎。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是咽炎,或口腔溃疡综合征。在一些实施方 式中,所述TNF α相关疾病是成人斯蒂尔病(adult-onset Still’s disease)。所述TNF α相关 疾病还可为甲羟戊酸激酶缺乏症。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是葡萄膜炎 (KOTANIEMI K等人,Long-term efficacy of adalimumab in the treatment of uveitis associated withjuvenile idiopathic arthritis.Clin Ophthalmol.2011;5:1425-9.电子出版2011年10月3 号)。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是炎性肠病(PARAMESWARAN,N.和PAIALS.Tumor Necrosis Factor-a Signaling in Macrophages.Crit Rev Eukaryot GeneExpr.2010;第 20(2)卷,第87-103页)。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是动脉粥样硬化 (PARAMESWARAN,N.和PAIAL S.Tumor Necrosis Factor-a Signaling inMacrophages.Crit Rev Eukaryot Gene Expr.2010;第20(2)卷,第87-103页)。在一些实施方式中,所述TNF α相关 疾病是TNF-受体相关周期性综合征(TRAPS)。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是 强直性脊柱炎(PARAMESWARAN,N.和PAIAL S.Tumor NecrosisFactor-a Signaling in Macrophages.Crit Rev Eukaryot Gene Expr.2010;第20(2)卷,第87-103页)。所述TNF α相 关疾病还可为化脓性汗腺炎(Brunasso AM,MassoneC.Treatment of hidradenitis suppurativa with tumour necrosis factor-alphainhibitors:An update on infliximab.Acta Derm Venereol.2011, 第91(1)卷,第70页;Sotiriou E.等人,Etanercept for the treatment of hidradenitis suppurativa,Acta Derm Venereol.2009,第89(1)卷,第82-83页)。在一些实施方式中,所述TNF α相关疾病是银屑病(PARAMESWARAN,N.和PAIAL S.Tumor Necrosis Factor-a Signaling inMacrophages.Crit Rev Eukaryot Gene Expr.2010;第20(2)卷,第87-103页)。在一些实施方式 中,所述TNF α相关疾病是寻常痤疮。
应理解术语“CAPS”或cryopyrin-相关周期性综合征包括家族性寒冷型自身炎症综合 征(FCAS)、穆-韦综合征(Muckle-Wells syndrome,MWS)和新生儿发病多系统炎性疾病,也称 为慢性婴儿神经、皮肤和关节(CINCA)综合征中的每一个。
可通过各种合适的施用途径中的一种或更多种应用所述药物组合物。可例如进行肠 胃外施用。在一些实施方式中,进行肌肉内施用。在一些实施方式中,作为大丸药或通过连 续灌注进行静脉内施用。在一些实施方式中,进行关节内施用。在一些实施方式中,进行滑 膜内施用。在一些实施方式中,可皮下施用。在一些实施方式中,进行局部施用,例如施用 至皮肤或眼睛。在一些实施方式中,经直肠进行施用。在一些实施方式中,进行经皮肤例如 皮肤内、皮下或透皮施用。在一些实施方式中,进行局部施用。另外的合适的施用模式包括,但不限于例如大脑内、脑脊髓内、鞘内、硬脑膜外或腹膜内;经口、经泌尿生殖器;玻 璃体内;全身;静脉内;眼内;经耳;鼻内;通过吸入;舌下;口腔。优选的是局部 (topical)、直肠、局部(local)、鼻内、静脉内和/或皮内施用途径。
可将本文公开的结合成员、核酸序列、载体或本文公开的宿主细胞与一种或更多种 另外的治疗有效化合物组合。在一些实施方式中,此类化合物可能能够经由TNF-α受体破 坏信号传导。在一些实施方式中,各自的化合物可能能够抑制一个或更多个另外的靶标,诸 如,例如炎性应答的其它介导物。可同时或依序施用此类化合物。
为了治疗应用,还可将所述结合成员进行放射性标记或与毒素连接或与如上所述的 另一效应器功能连接。
应理解以上概述的内容也适用于T-抗体。
诊断应用和/或检测目的
如本文所公开的结合成员可用于体内和/或体外检测或诊断目的。例如,技术人员已知涉及 用于检测特定细胞或组织中表达的抗体的宽范围的免疫测定。同样,在前文中描述的任何结 合成员、核酸序列、载体和/或宿主细胞可如该部分中所详述来相应地使用。
为了所述结合成员(例如抗体)的此类应用,本文公开的核酸序列、载体或宿主细胞可 包括可检测标记。在一些实施方式中,本文公开的所述结合成员、核酸序列、载体或宿主细 胞不包括可检测标记。作为说明性实例,可使用未标记抗体并通过与本文公开的结合成员 (例如抗体)上的表位特异性结合的第二抗体来检测。
在一些实施方式中,所述结合成员、核酸序列、载体和/或宿主细胞与可通过检测器 物质识别的一种或更多种物质结合。作为实例,所述结合成员可与生物素共价连接,所述生 物素可借助其与链霉亲和素结合的能力被检测。同样,本文公开的核酸和/或载体可用于检 测或诊断目的,例如,通过使用其标记片段作为杂交测定中的探针。
在某些实施方式中,本文提供的任何分子,特别是抗体,可用于检测样品(优选生物 来源的样品)中TNF α的存在。在本上下文中所使用的术语“TNF α”包括全长TNF α、 其片段和/或其前体,即跨膜TNF α和可溶性TNF α。术语“检测”包括定量和/或定性检 测。在某些实施方式中,生物样品包括来自人类患者的细胞或组织。生物样品的非限制性实 例包括血液、尿液、脑脊液、活组织切片、淋巴和/或非血液组织。
在某些实施方式中,所述方法包括使生物样品与如本文所述的对于TNF α的结合成 员(例如抗-TNF α抗体)在允许抑制剂与其靶标TNF α(若存在)结合,并检测抑制剂-靶标复 合物的条件下接触。此类方法可为体外或体内方法。在一个实施方式中,此类结合成员用于 选择适宜于用本文描述的结合成员治疗的对象,例如,其中TNF α是用于选择患者的生物 标记物。类似地,替代所述结合成员,此类方法可包括使用本文描述的T-抗体。
在另一方面,所述结合成员,例如抗体,用于化妆品应用,例如,用于改善皮肤的审美外观。
同样,以上描述的T-抗体、核酸序列、载体和/或宿主细胞可如上详述进行相应使用。
制品
在又一方面,提供了一种制品(即,试剂盒)。所述制品包括物质,例如材料,其可用于(i)治 疗、预防TNF α相关疾病或延迟TNF α相关疾病的进展;(ii)诊断目的或(iii)美容目 的。所述制品可包括使用说明书和一个或更多个容器。合适的容器包括,例如,瓶、小瓶、注射器、筒、板和试管并可由各种材料例如玻璃或塑料组成。至少一个容器含有包括如本文所公开的结合成员的组合物。所述容器可具有无菌入口(access port)。各容器通常贴有标签。
通常以预定量的干燥粉末(通常是冻干的)形式提供所述试剂,其包括赋形剂,在溶解 之后将提供具有适当浓度的试剂溶液。还可包括其它添加剂例如稳定剂和/或缓冲剂。若所 述结合成员用酶标记,则所述试剂盒将通常包括相应的底物和辅因子。
所述使用说明书可提供所述组合物用于治疗、预防特别的(of choice)疾病和/或延迟特 别的疾病的进展的指示;或用于进行检测或诊断测定的说明。所述说明可在标签上和/或包 装说明书上提供。
序列参考
本文公开的序列为:
SEQ ID No:1-scFv1的VL
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLASGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQSYYYTSNNSDGFWAFGQGTKLTVLG
SEQ ID No:2-scFv1的VH
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKASGIDFSNSGITWVRQAPGKGLEWVGYIYPGFGIRNYA NSVRGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPIYASSSGYADIWGQGTLVTVSS
SEQ ID No:3-scFv1的CDR-L1
QASQSISSYLA
SEQ ID No:4-scFv1的CDR-L2
WASTLAS
SEQ ID No:5-scFv1的CDR-L3
QSYYYTSNNSDGFWA
SEQ ID No:6-scFv1的CDR-H1
IDFSNSGIT
SEQ ID No:7-scFv1的CDR-H2
YIYPGFGIRNYANSVRG
SEQ ID No:8-scFv1的CDR-H3
DPIYASSSGYADI
SEQ ID No:9-scFv1
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLASGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQSYYYTSNNSDGFWAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKASGIDFSNSGITWVRQAPGKGLEWVGYI YPGFGIRNYANSVRGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPIYASSSGYADIW GQGTLVTVSS
SEQ ID No:10-接头
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID No:11-DLX105
MADIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVP SRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGG GGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGW INTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQG TLVTVSS
以下是说明本文公开的方法和组合物的实施例。考虑到以上提供的一般描述,应理解可实践 各种其它实施方式。
实施例
实施例1-中和TNFα的scFv的鉴定
兔子的免疫:将兔子用重组人(rh)TNF α(Peprotech,USA,目录号300-01A)进行免疫。在 最终加强免疫之后提取淋巴结并将细胞冷冻保存。
兔B细胞的流式细胞术分类和培养:使用FACSAria III(BD Biosciences)将TNFα- 特异性记忆B细胞作为单一细胞分类到96-孔微板中。在饲养细胞和含有10%胎牛血清(FCS) 的条件培养基的存在下培养单一B细胞克隆。
总共分类、培养3150个单一B细胞克隆并通过ELISA针对抗-TNF α-特异性IgG 的存在分析细胞培养物上清液。简言之,将在PBS中的rhTNF α(Peprotech,目录号300- 01A)以2mcg/mL的浓度涂覆在Maxisorp 96-孔微板4℃下过夜。在用5%脱脂干奶粉进行封 闭之后,添加细胞培养物上清液。通过抗-兔IgG-HRP(Southern Biotech,目录号4050-05)检 测TNF α-特异性IgG。用BM Blue POD底物(Roche Applied Science)使ELISA显色。总共 鉴定566个经选择的产生TNF α-特异性IgG的B细胞克隆并且在PK-15细胞测定中针对 IgG抗体的中和能力进一步分析它们。发现200个产生IgG的B细胞克隆中和rhTNF α的 细胞毒活性。
中和TNF α的IgG的测序:使用RNeasy Mini Kit(Qiagen Germany,目录号74106)使所有产生中和抗-TNF αIgG抗体的兔B细胞克隆经受mRNA分离。根据制造商方案将 mRNA用作逆转录的模板(OneStep RT-PCR试剂盒,Qiagen Germany,目录号210212)。随后 进行使用寡核苷酸来特异性扩增兔IgG重链和轻链编码序列的PCR反应(BiometraThermocycler T3)。独立地将重链和轻链PCR片段进行测序(ABI,Sanger 3730xl;Microsynth AG,Balgach,Switzerland),并且使用EMBOSS Transeq(http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/)将所获 得的核苷酸序列翻译成氨基酸序列并使用CLUSTALW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)进行比对。
抗-TNF αscFv基因的构建和scFv蛋白表达:鉴定如上所限定的可变轻链和可变重链的兔IgG CDR区并将其移植到人轻链和重链受体构架上。在一些中,引入点突变。产生 细菌表达载体,其编码scFv蛋白,其中N-端可变轻链通过序列SEQ ID No:10与C-端可变 重链连接。ScFv蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)Novagen,USA,目录号69450-3)中表达为包涵 体,其经纯化、溶解并且所述蛋白经重折叠。通过尺寸排阻色谱纯化重折叠的scFv并收集 对应于大约26kDa的单峰部分。通过ELISA针对TNF α结合分析经纯化的scFv。进一步 评价ScFv以在PK-15细胞测定中测定TNF α中和能力。通过该步骤,将72个测试的scFv 中的5个TNF α-特异性scFv鉴定为人TNF α的有效抑制剂。
实施例2–人可溶性TNF α和跨膜TNF α的结合
首先,通过ELISA确认TNF α的特异性识别(图1)。简言之,将在PBS中的rhTNF α以2mcg/mL的浓度涂覆在Maxisorp 96-孔微板上4℃下过夜。在用5%脱脂干奶粉进行封闭之后,添加浓度增加的所有五种预选的scFv(10至3000ng/mL),并通过蛋白L-HRP(Sigma-Aldrich,目录号P3226)检测scFv。用BM Blue POD底物(Roche Applied Science)使ELISA显 色。TNF α-特异性scFv DLX105用作阳性对照。但是CDR是相同的。DLX1084,一种特 异性不相关的scFv用作阴性对照。图1A显示scFv1特异性结合rhTNF α。当所有的scFv 被直接固定在微板上时,通过蛋白L-HRP识别(图1B)。这显示了(i)所述scFv被适当重折 叠,(ii)对照scFv DLX1084不结合rhTNF α,和(iii)确认鉴定的scFv1对于rhTNF α是 特异性的。
通过夹心ELISA评估天然产生的人TNF α的识别。人TNF α的天然形式衍生自人THP-1单核细胞细胞系(DSMZ Germany,目录号ACC 16)。将THP-1细胞在6-孔组织培养 板中培养,并用10ng/ml的佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA;Sigma-Aldrich,目录号P1585)刺激6小时,并随后用1mcg/mL的LPS(Sigma-Aldrich,目录号L4391)在37℃下刺 激16小时。收获细胞上清液并使用人TNF α/TNFSF1A ELISA DuoSet(R&D Systems,目录 号DY210)将分泌的TNF α定量。将scFv样品以在PBS pH 7.2中5mcg/mL固定在96-孔 微板(Maxisorp,Nunc)上。在封闭和洗涤之后,以5ng/mL的最终浓度应用人TNF α的天然 形式或重组表达的人TNF α(Peprotech,目录号300-01A)。用生物素化的多克隆抗-TNF α抗体和链霉亲和素-HRP(BD Pharmingen,目录号554060)来检测结合的TNF α。所有五 种经选择的scFv都同样良好地结合rhTNF α和人TNF α的天然形式两者。
跨膜TNF α的识别:用五种经选择的scFv或对照scFv将表达人TNF α的Δ1-12变体(其保持膜相关)的CHO细胞染色并通过流式细胞术进行分析。用增加量的scFv培育细胞,并使用生物素化的蛋白L和随后的用PE-标记的链霉亲和素染色来检测结合的scFv。 包括scFv1的所有五种scFv样品都有效结合tmTNF α,而阴性对照scFv DLX1084不结合 tmTNFα。scFv1和阴性对照scFv DLX1084的流式细胞术直方图显示于图4A。
实施例3–可溶性人TNF α和跨膜TNF α的中和
在PK-15细胞测定(猪肾上皮细胞,DSMZ,Germany,目录号ACC640)中测试全长抗体和 scFv的TNF α中和能力。将阳性对照scFv DLX105以及市售抗体(英夫利昔单抗、戈利木单抗和阿达木单抗)用于比较。将发光细胞生存力测定(Luminescent CellViability Assay)适应于测定TNF α-特异性scFv的IC50值。在该测定中,发光信号的产生与存在的ATP的量成正比,该ATP的量直接与存在于培养物中的活细胞数量成正比。简言 之,用浓度增加的scFv(200pg/mL至3mcg/mL)预培育rhTNF α的可溶性形式(1.4pM), 并将其添加到PK-15细胞中(10000/孔)。根据制造商的说明书使用试剂 (Promega,目录号G7572)。在96微板光度计(96Microplate Luminometer)上测量发 光。使用GraphPad软件,6.04版绘制抑制曲线并计算IC50值。scFv1以30±6pM 的IC50有效阻断了rhTNF α的细胞毒性,而单价阳性对照scFv DLX105的IC50值(260± 34pM)显著更高(图2、表1)。ScFv 2-5以在25pM至40pM范围内的IC50值有效抑制 rhTNF α的细胞毒活性。所有五种单价scFv的IC50值与市售的二价抗体英夫利昔单抗、阿 达木单抗和戈利木单抗的那些相当(图3)。
在实施例2中,显示所有经选择的scFv结合TNF α的跨膜形式。为了研究scFv是 否中和tmTNF α的生物活性,利用tmTNF α对于HEK-Dual TNF α-敏感细胞(InvivoGen, 目录号hkd-tnfa)的细胞毒效应。设计HEK-Dual TNF α-敏感细胞以通过评估NF-kB活化来 监测TNF α的生物活性。所述细胞通过两种NF-kB-诱导型报道构建物的稳定共转染而衍生 自人胚肾293细胞。因此,HEK-Dual TNF α-敏感细胞响应TNF α诱导的NF-kB活化时 分泌荧光素酶和胚胎碱性磷酸酶。使用Quanti-Luc(InvivoGen,目录号rep-qlc1)和Quanti- Blue(InvivoGen,目录号rep-qb1)测量细胞培养物上清液中的两种报道基因产物。将100μl 含有5%FCS的RPMI 1640中的表达tmTNF α的CHO细胞以10000个细胞/孔铺在96孔平 底微板中。在37℃下将scFv1、阳性对照scFv DLX105或阴性对照scFv DLX1084的系列稀 释(10至300nM)与表达tmTNF α的CHO细胞培育20min。随后以20000个细胞/孔添加 HEK-dual细胞,并在37℃下共培养24h。所得的细胞培养物上清液用于测量荧光素酶和分 泌的胚胎碱性磷酸酶的活性。使用GraphPad软件,6.04版绘制抑制曲线并计算IC50值。5种经选择的scFv以10nM至50nM范围内的IC50值抑制跨膜TNF α活性,其中 scFv5具有最高的IC50值。scFv1和阳性对照scFv DLX105分别以50nM和32nM的IC50抑 制tmTNF α的活性(图4B、表1)。当Quanti-Blue用于测量碱性磷酸酶活性时,获得类似 结果。因此,在这些实验条件下,400nM的scFv1抑制50%的tmTNF α活性。
表1:针对可溶性TNF α和跨膜TNF α的中和效力
*,在两个独立实验中获得类似结果。
实施例4–scFv的物种和TNF α家族交叉反应性
使用ELISA评估五种经选择的scFv对于除了人类以外的其它物种的TNF α同系物的交叉 反应性状况。研究以下重组表达的TNF α蛋白:猕猴(R&D Systems,USA,目录号1070- RM-025/CF)、食蟹猴(Sinobiological,目录号90018CNAE)、犬(KingfisherBiotech,USA,目 录号RP0261D-025)和猫(R&D systems,目录号2586FTCF)、兔(Kingfisher,目录号 RP0429U)、大鼠(Peprotech,目录号400-14)、鼠科动物(Peprotech,目录号315-01A)、豚鼠 (R&D Systems,目录号5035-TG-025/CF)、猪(R&D Systems,目录号690-PT-025/CF)。简言 之,将在PBS pH 7.2中的蛋白以2mcg/mL的浓度涂覆在Maxisorp96-孔微板上在4℃下过 夜。在用5%脱脂干奶粉进行封闭之后,向孔中添加浓度增加的scFv(0.1、0.3和1.0 mcg/mL)。用TNF α-特异性对照抗体单独确认每种蛋白的成功的涂覆。而通过蛋白L-HRP (Sigma-Aldrich,USA,目录号P3226)检测scFv1,通过链霉亲和素-HRP(BD Pharmingen, USA,目录号554060)或其它适宜的用HRP标记的第二抗体来检测全长IgG对照抗体。用 BM Blue POD底物(Roche Applied Science)使ELISA显色并测量450nm处的吸光度。将 scFvs1-5的交叉反应性与scFv DLX2481的相比较。DLX2481是EP-34scFv的一种变体,如 WO2009/155723(ESBATech,an Alcon Biomedical Research Unit LLC)中所述,其包括在构架 区中的数个点突变。scFv1、scFv3和scFv4特异性识别TNF α的五种直向同源物,即人、 猕猴、食蟹猴、猫和犬TNF α蛋白。scFv2特异性识别rhTNF α,但是不与任何其它测试 物种交叉反应。scFv DLX2481仅识别重组人TNF α。另外,通过用涂覆的重组人淋巴毒素 α2/β1(R&D systems,USA,目录号679-TX-010/CF)、重组人淋巴毒素α1/β2(R&Dsystems,目录号678-LY-010/CF)、重组人CD40配体/TNFSF5(R&D systems,目录号6420-CL-025/CF)和重组人TNFβ/TNFSF1(R&D systems,目录号211-TB-010/CF)进行的直接ELISA测量scFv1对于TNF家族成员的交叉反应性。scFv1不与高达40nM浓度的这些 TNF家族蛋白交叉反应。
实施例5–scFv的稳定性
可观察到可能影响scFv稳定性的两种不同的过程。首先,scFv可能容易二聚,通常随后是 低聚并进一步聚集和沉淀。其次,产生较小片段的scFv降解可随着时间发生。
研究了配制在PBS pH 7.2中的五种经选择的scFv在不同温度条件下储存时的稳定 性。在4℃、22℃、37℃和-20℃下,将scFv以10mg/mL浓度储存在1.5mL聚丙烯管中。 在指示的时间点处,视觉观察各样品并测量280nm处的蛋白浓度。然而scFv 3和4在4℃ 下和在37℃下、在1周的培育之后显示较低稳定性,对于scFv1没有观察到可见的蛋白沉淀 和显著的蛋白损失。通过SE-HPLC分析样品以确定单体、二聚体和高分子量低聚物相对于 总峰面积的水平(%):使用TOSOH TSKgel G2000 SWXL柱,二醇相,L×I.D.30cm× 7.8mm,5μm粒径(Sigma,目录号08540)。用5μL的1mg/mL的scFv1装柱。PBS pH 7.2选作流动相。
SE-HPLC分析显示在上述实验条件下没有可检测的低分子量降解产物。在4℃、22℃ 和-20℃下储存4周后未观察到scFv1的显著二聚。scFv1在37℃下储存1、2、3或4周之后分别形成高达2.61%、6.09%、8.75%和11.02%的二聚体(表2),并且在37℃下储存3和4周后仅观察到少量高分子量分子。
表2:在指示条件下储存后使用SE-HPLC测量的scFv1单体含量(%)
第7天 | 第14天 | 第21天 | 第28天 | ||
scFv1,10mg/mL,4℃ | 99.73 | 99.64 | 99.57 | 99.15 | |
scFv1,10mg/mL,22℃ | 99.52 | 99.17 | 98.89 | 98.57 | |
scFv1,10mg/mL,37℃ | 96.54 | 92.01 | 88.22 | 84.68 | |
scFv1,10mg/mL,-20℃ | nd* | nd | nd | 99.09 |
*nd,未确定。
将scFv1的稳定性测量延长至长达6个月。在4℃下6个月之后,scFv1制备物含有91.17% 的单体。
还通过差示扫描荧光分析(DSF)评估了scFv1的热稳定性。在PBS pH7.2中的20xOrange(Sigma-Aldrich,目录号S5692,5000x)的存在下,将配制在PBS pH 7.2中的 0.54mg/mL的scFv1以1℃/5秒的扫描速率在实时PCR设备(Corbett,Rotor-Gene)中从30℃ 加热至95℃。在梯度运行期间测量荧光值(激发波长470nm;发射波长555nm)。对于scFv1而言,使用Rotor-Gene 6000 Series Software 1.7计算的scFv1的中点解链温度(Tm)为76.0 ℃。
蛋白质生物制剂在制造、储存和运输期间可变得暴露于冻融应力,其可引起聚集和 降解。为了评估冻融循环期间的scFv1的稳定性,将其在1.5mL聚丙烯管中以10mg/mL配制在PBS pH 7.2中。将小瓶浸没在液氮中5min。对于融化,将它们在室温下在水浴中温育10min。进行1、3、5、7或10个冻融循环并通过如上提及的SE-HPLC分析样品。基本上 100%的scFv1在10个冻融循环之后保持为单体的,并且未观察到蛋白损失或沉淀。
对于进一步表征,从5种预选的scFv池中选择scFv1,这是由于其优异的稳定性参数,其高效力及其宽的交叉反应性谱。
实施例6-90%人血清中的稳定性
将5种scFv scFv1-5在PBS,pH 7.2中稀释至0.1mg/mL。将scFv的等分部分添加至人血清 (Sigma,目录号H4522)中以获得在90%v/v人血清中的10mcg/mL的最终浓度。平行地, 在含有1%的BSA的PBS,pH 7.2中稀释scFv。将样品在4℃和37℃下培育1、4和20个小时。如实施例2中所述,用固定化TNF α通过直接ELISA来测量样品的TNF α结合能 力。在增加的浓度(20至500ng/mL)下测试暴露于血清的scFv1并通过蛋白L-HRP进行检 测。结果显示,在37℃下暴露于人血清20小时不显著改变scFv1和scFv2-5的TNF α结合 能力。
实施例7–scFv的溶解度
将5种经选择的scFv scFv1-5纯化并储存在PBS缓冲液pH 7.2(磷酸盐缓冲盐水1X,Gibco, Life TechnologiesTM,目录号20012)中。使用Vivaspin 20离心浓缩器(Sartorius Stedim Biotech,目录号VS2001)在室温下将scFv1浓缩至高达50mg/mL并在视觉上和通过分析 HPLC(柱TOSOH TSKgel G2000 SWXL,目录号08540)进行分析。所得的scFv1溶液是清澈 的且没有任何沉淀物,并且100%的蛋白是单体的。因此,scFv1在PBS pH7.2中的溶解度 ≥50mg/mL。
实施例8–猕猴、食蟹猴和犬TNF α的中和
如上所述针对抑制猕猴、食蟹猴和犬TNF α蛋白对PK-15细胞的细胞毒活性测定ScFv1。 将scFv1的系列稀释用50pg/mL的重组猕猴、食蟹猴或犬TNF α蛋白预培育。将混合物添 加至PK-15细胞,进一步培育并如实施例3中所述进行分析。ScFv1在中和猕猴、食蟹猴和 犬TNF α蛋白方面是高度有效的。
实施例9–体内功效
使用Tg1278TNF-ko小鼠(一种含有编码具有侧翼区的完整人TNF α基因的转基因的小鼠品 系)展示scFv1体内阻断人TNF α的生物活性的能力。这些小鼠在缺乏小鼠TNF α的情况 下通常表达调节的人TNF α并展现没有明显病理的正常发育。
小鼠对于革兰氏阴性细菌衍生的脂多糖(LPS)的敏感性通过用D-半乳糖胺(D-gal)处理 来增加,D-半乳糖胺是一种肝毒剂,其将对于LPS的致死效应的敏感性增加了100000倍。 D-gal的效应仅限于肝细胞,其中其引起尿嘧啶核苷酸的耗竭,导致RNA和蛋白的生物合成 受到损害。在小鼠体内施用LPS/D-gal导致在48小时内观察到的由暴发性肝损伤引起的一 致性死亡,所述暴发性肝损伤以广泛的肝细胞凋亡性死亡为特征,其主要是由通过TNF受 体1进行的TNF α信号传导引起。用中和性抗-TNF α抗体治疗小鼠保护其免于LPS/D-gal 肝毒性的致死效应。
在用LPS/D-Gal (10 ng/剂的LPS、20 mg/剂的D-gal)进行腹膜内攻击之前1 h和1h之后,向8-9周龄hTNF α转基因小鼠以10.0 mg/kg体重的剂量腹膜内施用ScFv1和阳性对照scFv DLX105两次。在LPS/D-gal攻击两小时之后,获取血液样品并使用Mouse IL-6DuoSet ELISA试剂盒根据制造商的说明书(R&D Systems, 目录号 DY406)测量小鼠IL-6的血清水平。用特异性不相关的scFv (阴性对照scFv)以10 mg/kg剂量腹膜内处理阴性对照组两次。scFv1和阳性对照scFv DLX105有效保护LPS/D-gal攻击的小鼠,而阴性对照scFv并未如此(表3)。因此,小鼠血清IL-6水平被scFv1和阳性对照scFv DLX105显著抑制,而阴性对照scFv未抑制小鼠血清IL-6 (表3)。
表3显示scFv1、阳性对照scFv DLX105和阴性对照scFv的保护作用。显示了小鼠的
存活率(%)和以pg/mL计的作为包括标准偏差的平均值的小鼠IL-6的血清水平。
Tg1278/TNFko, n=6 | 治疗 | %存活,48 h | %存活,120 h | 存活 | 血清IL-6水平,2 h |
3♂/3♀ | DLX105 | 83.3 | 66.7 | 4/6 | 603 ± 223 pg/mL |
3♂/3♀ | 阴性对照scFv | 0 | 0 | 0/6 | 5240 ± 1212 pg/mL |
3♂/3♀ | scFv1 | 100 | 83.3 | 5/6 | 787 ± 385 pg/mL |
尽管显示并描述了本发明目前优选的实施方式,应理解本发明不限于此并可在以下权利要求 书的范围内另外多方面地进行具体体现和实践。因为本发明的众多修改和替代实施方式将对 于本领域技术人员容易显而易见,所以本说明书解释为仅仅是说明性的并且用于教导本领域 技术人员用于实施本发明的最佳模式的目的。因此,所有合适的修改和等效方式均可被认为 落入以下权利要求书的范围之内。
Claims (34)
1.一种抗体或其抗原结合片段,其具有对TNF α的结合特异性,所述抗体或其抗原结合片段包含
(i) 如SEQ ID No: 6、7和8中所示的可变重链CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列;和
(ii) 如SEQ ID No: 3、4和5中所示的可变轻链CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其是scFv。
3.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其为人源化的。
4.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其包含
(i) 如SEQ ID No. 1中所示的可变轻链;和/或
(ii) 如SEQ ID No. 2中所示的可变重链。
5.权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其进一步包含接头序列,其中所述接头序列是SEQ ID No: 10中所示的序列。
6.权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段,其为SEQ ID No. 9。
7.权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述可变重链进一步包含以下残基中的至少一种:
(i) 根据AHo编号在重链氨基酸12位上的丝氨酸(S);
(ii) 根据AHo编号在重链氨基酸103位上的丝氨酸(S)或苏氨酸(T);和/或
(iii) 根据AHo编号在重链氨基酸144位上的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。
8.权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其为
(i) 抗体片段,其是Fab、Fab’、F(ab)’2、scFv或Fv片段;或
(ii)全长免疫球蛋白分子。
9.权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其为单价或多价的。
10.权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段,其为双特异性的。
11.权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其为化学或生物修饰的。
12.权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段,其为糖基化、PEG化或HES化的。
13.一种分离的核酸分子,其编码权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
14.一种载体,其包含根据权利要求13所述的核酸分子的序列。
15.一种宿主细胞,其包含权利要求13所述的核酸分子或权利要求14所述的载体。
16.一种组合物,其包含权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求13所述的核酸分子、权利要求14所述的载体或权利要求15所述的宿主细胞;和另外合适的载体、稀释剂或赋形剂。
17.权利要求16所述的组合物,其为化妆品组合物、诊断组合物或药物组合物。
18.权利要求17所述的组合物,其为药物组合物并且所述载体为药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
19.权利要求18所述的组合物,其为适用于经口、直肠、经泌尿生殖器、玻璃体内、眼内、经耳、鼻内、经皮、舌下或口腔施用的形式。
20.权利要求18所述的组合物,其为适用于肠胃外、全身或局部施用的形式。
21.权利要求17至20中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗TNF α介导的疾病的药剂中的用途,其中所述TNF α介导的疾病为以下疾病中的至少一种:增殖型糖尿病性视网膜病变、痛风性关节炎、施尼茨勒综合征、全身型幼年特发性关节炎、类风湿性关节炎、荨麻疹、血管炎、1型糖尿病、2型糖尿病、复发性多病灶性骨髓炎、复发性多软骨炎、cyropyrin-相关周期性综合征(CAPS)、贝赛特氏症、家族性地中海热、慢性阻塞性肺病、风湿性多肌痛、NALP3-突变、坏疽性脓皮病、骨关节炎、湿性年龄相关性黄斑变性、干眼综合征、银屑病、滑膜炎-痤疮-脓疱病-骨肥厚-骨炎综合征、巨噬细胞活化综合征、周期热、腺炎、咽炎、口腔溃疡综合征、成人斯蒂尔病、甲羟戊酸激酶缺乏症、葡萄膜炎、炎性肠病、动脉粥样硬化、TNF-受体相关周期性综合征(TRAPS)、强直性脊柱炎、化脓性汗腺炎、银屑病和寻常痤疮。
22.权利要求21所述的用途,其中所述TNF α介导的疾病为以下疾病中的至少一种:急性痛风性关节炎、慢性痛风性关节炎和慢性特发性荨麻疹。
23.权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求13所述的核酸分子、权利要求14所述的载体或权利要求15所述的宿主细胞在制备用于治疗、预防TNF α介导的疾病或延迟TNF α介导的疾病的进展的药剂中的用途,其中所述TNF α介导的疾病是增殖型糖尿病性视网膜病变、痛风性关节炎、施尼茨勒综合征、全身型幼年特发性关节炎、类风湿性关节炎、荨麻疹、血管炎、1型糖尿病、2型糖尿病、复发性多病灶性骨髓炎、复发性多软骨炎、cyropyrin-相关周期性综合征(CAPS)、贝赛特氏症、家族性地中海热、慢性阻塞性肺病、风湿性多肌痛、NALP3突变、坏疽性脓皮病、骨关节炎、湿性年龄相关性黄斑变性、干眼综合征、银屑病、滑膜炎-痤疮-脓疱病-骨肥厚-骨炎综合征、巨噬细胞活化综合征、周期热、腺炎、咽炎、口腔溃疡综合征、成人斯蒂尔病、甲羟戊酸激酶缺乏症、葡萄膜炎、炎性肠病、动脉粥样硬化、TNF-受体相关周期性综合征(TRAPS)、强直性脊柱炎、化脓性汗腺炎、银屑病和/或寻常痤疮。
24.权利要求23所述的用途,其中所述TNF α介导的疾病是急性痛风性关节炎、慢性痛风性关节炎和/或慢性特发性荨麻疹。
25.一种产生权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法,所述方法包括:
(i) 培养权利要求15所述的宿主细胞,从而允许表达所述抗体或其抗原结合片段;和
(ii) 回收所述抗体或其抗原结合片段。
26.权利要求25所述的方法,所述方法还包括:
(iii) 纯化所述抗体或其抗原结合片段。
27.一种产生权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法,所述方法包括:
(a) 使不含细胞的表达系统与核酸产物模板接触,所述核酸产物模板编码根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段;
(b) 允许所述核酸产物模板发生转录和翻译,从而允许形成反应混合物;和
(c) 从所述反应混合物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
28.权利要求27所述的方法,所述方法还包括:
(d) 纯化所述抗体或其抗原结合片段。
29.一种产生权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法,其中产生所述抗体或其抗原结合片段包括化学合成步骤。
30.权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测生物样品中TNF α的存在的试剂中的用途,包括:
(i) 使所述生物样品与权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与TNF α特异性结合的条件下接触,和
(ii) 检测在所述抗体或其抗原结合片段和TNF α之间是否形成复合物。
31.权利要求30所述的用途,其中所述检测在体外或体内进行。
32.权利要求30或31所述的用途,其中所述生物样品是人源的。
33.权利要求30或31所述的用途,其中所述生物样品是血样、尿样、脑脊液样品、活组织检查样品和淋巴样品中的至少一种。
34.一种试剂盒,其包含权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段连同试剂与说明书的包装组合。
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