MX2011000075A - Anticuerpos estables y solubles que inhiben el tnfa. - Google Patents

Anticuerpos estables y solubles que inhiben el tnfa.

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MX2011000075A
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David Urech
Leonardo Borras
Tea Gunde
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Esbatech Alcon Biomed Res Unit
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Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos scFv y fragmentos Fab estables y solubles específicos para el TNF, que comprenden secuencias específicas de cadena ligera y cadena pesada que se optimizan para estabilidad, solubilidad, aglutinación in vitro e in vivo del TNF, y baja inmunogenicidad. Dichos anticuerpos se diseñan para el diagnóstico y/o tratamiento de desórdenes mediados por el TNF. También se dan a conocer los ácidos nucleicos, vectores y células hospederas para la expresión de los anticuerpos recombinantes de la invención, método5 para aislar los mismos y el uso de dichos anticuerpos en la medicina.

Description

ANTICUERPOS ESTABLES Y SOLUBLES QUE INHIBEN EL TNFa CAMPO Y ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El factor de necrosis tumoral alfa (TNFa, también conocido como caquectina o caquexina) , es una citocina mamifera de origen natural, producida por numerosos tipos de células, incluyendo los monocitos y macrófagos en respuesta a una endotoxina u otro estimulo. El TNFa es un mediador principal de reacciones inflamatorias, inmunológicas , y patofisiológicas (Grell, M . , et al. (1995) Cell, 83: 793-802).
El TNFa soluble se forma por la escisión de una proteina transmembrana precursora (Kriegler, et al. (1988) Cell 53: 45-53) , y el ensamble de polipéptidos de 17 kDa secretados a complejos de homotrimeros solubles (Smith, et al. (1987), J. Biol. Chem. 262: 6951-6954; para revisiones del TNFa, ver Butler, et al. (1986), Nature 320:584; Oíd (1986), Science 230: 630) . Estos complejos se aglutinan o unen entonces a receptores encontrados en una variedad de células. La aglutinación o unión produce un arreglo de efectos pro-inflamatorios, que incluyen (i) liberación de otras citocinas pro-inflamatorias tales como la interleucina IL-6, IL-8, y IL-1, (ii) liberación de metaloproteinasas de matriz y (iii) regulación por incremento de la expresión de moléculas de adhesión endotelial, que amplifican además la cascada inflamatoria e inmunológica atrayendo los leucocitos a los tejidos extravasculares.
Un gran número de desórdenes están asociados con niveles elevados de TNFa, muchos de estos de importancia médica significativa. Se ha mostrado que el TNFa se regula por incremento en una serie de padecimientos humanos, que incluyen padecimientos crónicos tales como artritis reumatoide (RA) , desórdenes inflamatorios del intestino que incluyen enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, septicemia, insuficiencia cardiaca congestiva, asma bronquial y esclerosis múltiple. Los ratones transgénicos con TNFa humano producen altos niveles de TNFa constitutivamente y desarrollan una poliartritis destructiva, espontánea, que se asemeja a la RA (Keffer et al. 1991, EMBO J., 10, 4025-4031). El TNFa por lo tanto se refiere como una citocina pro-inflamatoria.
El TNFa ahora está bien establecido como una clave o punto de referencia en la patogénesis de la RA, la cual es un padecimiento crónico, progresivo y debilitante, caracterizado por la inflamación y destrucción de coyunturas poliarticulares , con síntomas sistémicos de fiebre y malestares y fatiga. La AR también conduce a inflamación sinovial crónica, con un frecuente avance a la destrucción de cartílago articular y huesos. Los niveles incrementados de TNFa se encuentran tanto en el fluido sinovial como en la sangre periférica de pacientes que padecen RA. Cuando se administran agentes bloqueadores del TNFa a pacientes que padecen RA, los mismos reducen la inflamación, mejoran los síntomas y retardan el daño en articulaciones (McKown et al. (1999), Arthritis Rheum. 42:1204-1208) .
Fisiológicamente, el TNFOÍ también está asociado con la protección contra infecciones particulares (Cerami, et al. (1988), Immunol. Today 9:28) . El TNFOÍ es liberado por macrófagos que han sido activados por lipopolisacáridos de bacterias Gram-negativas . Tal así, que el TNFa parece ser un mediador endógeno de importancia central involucrado en el desarrollo y patogénesis del choque endotóxico asociado con la septicemia bacteriana (Michie, et al. (1989), Br. J. Surg. 76:670-671; Debets. et al. (1989), Second Vienna Shock Forum, p. 463-466; Simpson, et al. (1989) Crit. Care Clin. 5: 27-47; Waage et al. (1987) . Lancet 1: 355-357; Hammerle. et al. (1989) Second Vienna Shock Forum p. 715-718; Debets. et al. (1989), Crit. Care Med. 17:489-497; Calandra, et al. (1990), J. Infect. Dis. 161:982-987; Revhaug et al. (1988), Arch. Surg. 123: 162-170) .
Al igual que otros sistemas de órganos, el TNFa también ha mostrado jugar un papel crucial en el sistema nervioso central, en particular en desórdenes inflamatorios y autoinmunes del sistema nervioso, incluyendo esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barre y miastenia aguda, y en desórdenes degenerativos del sistema nervioso, que incluyen enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Huntington. El TNFa también está involucrado en desórdenes de sistemas relacionados de la retina y el músculo, incluyendo neuritis óptica, degeneración macular, retinopatia diabética, dermatomiositis , esclerosis lateral amiotrófica, y distrofia muscular, asi como en lesiones al sistema nervioso, incluyendo lesión craneal traumática, lesión aguda de la médula espinal, y ataque de apoplejía o ataque súbito.
La hepatitis es otro desorden inflamatorio relacionado con el TNFa el cual entre otros activadores puede ser causado por infecciones virales, incluyendo Epstein-Barr, citomegalovirus , y virus de hepatitis A-E. La hepatitis causa inflamación aguda del hígado en la región portal y lobular, seguida por fibrosis y evolución tumoral. El TNFa también puede mediar la caquexia en cáncer, que causa más morbilidad y mortalidad por cáncer (Tisdale M.J. (2004), Langenbecks Arch Surg. 389:299-305) .
El papel crucial jugado por el TNFa en la inflamación, respuestas inmunes celulares y la patología de muchos padecimientos, ha llevado a la investigación de antagonistas del TNFa. Una clase de antagonistas del TNFa diseñados para el tratamiento de padecimientos mediados por el TNFa son anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que específicamente aglutinan el TNFa y por lo tanto bloquean su función. El uso de anticuerpos anti-TNFa ha mostrado que e un bloqueo del TNFa puede revertir los efectos atribuidos al TNFa incluyendo disminuciones en IL-1, GM-CSF, IL-6, IL-8, moléculas de adhesión y destrucción de tejidos (Feldmann et al. (1997), Adv. Immunol. 1997:283-350). Entre los inhibidores específicos del TNFa que recientemente se han vuelto comercialmente disponibles, incluyen un anticuerpo de ratón-humano quimérico, monoclonal, dirigido contra el TNFa (infliximab, Remicade™; Centocor Corporation/Johnson & Johnson) , ha demostrado eficacia clínica en el tratamiento de la AR y la enfermedad de Crohn. Todos los inhibidores comercializados del TNFa se administran de manera intravenosa o subcutánea en intervalos semanales o mayores como inyecciones de bolos, que dan como resultado altas concentraciones de partida que se disminuyen constantemente hasta la siguiente inyección. Su volumen de distribución es limitado.
A pesar de estos avances, permanece la necesidad de formas novedosas y efectivas de anticuerpos u otros inmunoaglutinantes para el tratamiento de desórdenes asociados con el TNFa tales como la RA. En particular, existe una necesidad urgente de inmunoaglutinantes con propiedades funcionales óptimas para el tratamiento eficaz y continúo de la artritis y otros desórdenes mediados por el TNFa los cuales permitan una administración y formulación más flexibles y que tengan una penetración mejorada en el tejido y por lo tanto un volumen mayor de distribución.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De ahí que, sea un objetivo general de la invención proporcionar un anticuerpo estable y soluble u otro inmunoaglutinante, que aglutine específicamente el TNFa in vitro e in vivo. En una modalidad preferida dicho inmunoaglutinante es un anticuerpo scFv o fragmento Fab.
La presente invención proporciona anticuerpos scFv estables y solubles y fragmentos Fab específicos para el TNFa, los cuales comprenden secuencias específicas de cadena ligera y cadena pesada que se optimizan para estabilidad, solubilidad, aglutinación in vitro e in vivo del TNFa, y baja inmunogenicidad. Dichos anticuerpos son diseñados para el diagnóstico y/o tratamiento de desórdenes mediados por el TNFa. También se dan a conocer los ácidos nucleicos, vectores y células hospederas para la expresión de los anticuerpos recombinantes de la invención, métodos para aislar los mismos y el uso de dichos anticuerpos en la medicina.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras la y Ib representan la capacidad relativa de los sobrenadantes de 44 hibridomas RabMab anti-TNF para aglutinar el TNFa (ensayo Biacore) y para neutralizar su actividad (ensayo L929) .
La Figura 2 representa la capacidad de 20 anticuerpos de una sola cadena RabMab anti-TNF y 7 anticuerpos de una sola cadena anti-TNF humanizados, para aglutinar selectivamente el TNFa (ensayo de secreción ELISA, favor de notar que para este ensayo se utilizó sobrenadante de cultivo bacteriano, cuyo contenido de anticuerpos de una sola cadena no se normalizó) .
Las Figuras 3a y 3b representan la cinética de aglutinación (Figura 3A) del EP43max y la cinética de aglutinación (Figura 3B) del EP34max al TNF alfa humano.
La Figura 4 representa la potencia del EP43max (cuadrados abiertos), la potencia (círculos cerrados) del ESBA105. La EC50 del EP43max es de 1 ng/ml y la EC50 del ESBA105 es de 6,5 ng/ml .
La Figura 5 representa el desempeño del EP43max, EP6max y EP19max en un ensayo de desdoblamiento térmico (FTIR) .
La Figura 6 representa las curvas de desnaturalización térmica del EP43max y los derivados del mismo que se compararon mediante análisis FTIR.
Las Figuras 7a y 7b representan la comparación del EP43max (Figura 7A) y su variante EP43minmax (Figura 7B) en una prueba de tensión o esfuerzo térmico.
La Figura 8 representa la definición de CDR Hl utilizada en la presenta para injertar sitios de aglutinación de antígenos a partir de anticuerpos monoclonales de conejo en las estructuras de anticuerpos humanos altamente solubles y estables .
La Figura 9a ilustra la potencia del Epi34max y Adalimumab para bloquear la actividad citotóxica del TNFalfa humano recombinante de 1000 pg/ml (células L929 de murino (subfamilia de roedores miomorfos) . Se determinó que la IC50 para Ep34max y Adalimumab es de 1,03 ng/ml y 8,46 ng/ml, respectivamente. La Figura 9b ilustra la potencia del Adalimumab y Ep34max para bloquear la actividad citotoxica del TNFalfa humano recombinante de 10 pg/ml (células Kym-1 humanas) . Se determinó que la IC50 para Infliximab y Ep34max (791) es de 66,2 ng/ml y 0,69 ng/ml respectivamente.
La Figura 10a ilustra la potencia del Epi34max y el Infliximab para bloquear la actividad citotoxica del TNFalfa humano recombinante de 1000 pg/ml (células L929 de murino) . Se determinó que la IC50 para el Ep34max y el Infliximab es de 1.04 ng/ml y 13.9 ng/m, respectivamente. La Figura 10b ilustra la potencia del Infliximab y Ep34max (791) para bloquear la actividad citotoxica del TNFalfa humano recombinante de 10 pg/ml (células Kym-1 humanas) . Se determinó que la IC50 para el Infliximab y Ep34max es de 14,8 ng/ml y 0,63 ng/ml respectivamente .
La Figura 11 ilustra el perfil de desnaturalización térmica FT-IR BioATR, ajustado a partir de espectros infrarrojos con transformada de Fourier en la región de banda de la amida I del Ep34max en comparación con el ESBA903. El V50 para el ESBA903 fue de 71,12 y para el EP34max fue de 71,50; la pendiente o ESBA903 fue de 2,481 y 2,540 para EP34max.
La Figura 12 ilustra las curvas de desdoblamiento térmico DSC de los anticuerpos scFv de Ep34max y ESBA903. El Tm de EP34max es de 78,11°C y el Tm para ESBA903 es de 76,19°C.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Es un objetivo general de la invención proporcionar un inmunoaglutinante estable y soluble que aglutine específicamente el TNFa in vitro e in vivo. En una modalidad preferida dicho derivado de anticuerpo es un anticuerpo scFv es o fragmento Fab. Los inmunoaglutinantes de la invención preferiblemente comprenden una cadena ligera y/o pesada.
Definíciones Con el fin de que la presente invención pueda ser entendida más fácilmente, ciertos términos se definirán como sigue. Las definiciones adicionales se establecen en toda la descripción detallada.
El término "anticuerpo" que se utiliza en la presente es un sinónimo para "inmunoglobulina". Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden ser inmunoglobulinas enteras o fragmentos de las mismas, que comprenden al menos un dominio variable de una inmunoglobulina, tal como dominios variables únicos, Fv (Skerra A. y Pluckthun, A. (1988) Science 240: 1038-41), scFv (Bird, R.E. et al. (1988) Science 242 : 23-26; Huston, J.S. et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-83), Fab, (Fab') 2 u otros fragmentos bien conocidos para una persona experta en la técnica.
El término "CDR" se refiere a una de las seis regiones hipervariables dentro de los dominios variables de un anticuerpo que principalmente contribuyen a la aglutinación de antigenos. Una de las definiciones más comúnmente utilizadas para las seis CDR se proporcionó por Kabat ?.?. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242) .
Cuando se utiliza en la presente, la definición de Kabat de las CDRs solamente aplica para la CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena ligera (CDR Ll, CDR L2, CDR L3, ó Ll, L2, L3) , asi como para la CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena pesada (CDR H2, CDR H3, ó H2, H3) . La CDR1 del dominio variable de cadena pesada (CDR Hl ó Hl), sin embargo, cuando se utiliza en la presente es definida por los siguientes residuos (numeración Kabat) : Comienza con la posición 26 y termina antes de la posición 36. Esto es básicamente una fusión de CDR Hl que se define de diferente modo por Kabat y Chotia (ver también la Figura 8 para ilustración) .
El término "estructura de anticuerpo" que se utiliza en la presente se refiere a la parte del dominio variable, ya sea VL o VH, que sirve como un armazón proteico o soporte para los bucles de aglutinación de antigenos (CDRs) de este dominio variable. En esencia el mismo es el dominio variable sin las CDRs .
Se pretende que el término "anticuerpo de una sola cadena", "Fv de una sola cadena" o "scFv" se refiera a una molécula que comprenda un dominio variable de cadena pesada del anticuerpo (o región; VH) y un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo (o región; VL) , conectada por un enlace o conector. Tales moléculas scFv pueden tener las estructuras generales: NH2-VL-enlace-VH-COOH ó NH2-VH-enlace-VL-COOH .
El término "inmunoaglutinante" se refiere a una molécula que contiene la totalidad o una parte del sitio de aglutinación de antígenos de un anticuerpo, por ejemplo, la totalidad o parte del dominio variable de cadena pesada y/o cadena ligera, de tal manera que el inmunoaglutinante reconozca específicamente un antígeno objetivo. Los ejemplos no limitativos de inmunoaglutinantes incluyen moléculas de inmunoglobulina de longitud total y scFvs, así como fragmentos de anticuerpos, que incluyen pero no están limitados a (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región bisagra (secuencia de aminoácidos que yace en la base de las regiones de cadena pesada de una inmunoglobulina y facilita el movimiento flexible de la molécula) ; (iii) un fragmento Fab' ; (iv) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (v) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (vi) un anticuerpo de un solo dominio tal como un fragmento Dab el cual consiste de un dominio VH o VL, un anticuerpo de Camélido o un anticuerpo de Tiburón (por ejemplo, Nanobodies® Ig-NARs de tiburón) ; y (vii) un nanocuerpo, una región de cadena pesada gue contiene el dominio variable y dos dominios constantes.
Los sistemas de numeración que se utilizan en la presente para identificar posiciones de residuos de aminoácidos en regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos, corresponde a una que se define por A. Honegger, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670 (el sistema AHo) . Las tablas de conversión entre el sistema AHo y el sistema más comúnmente utilizado que se define por Kabat et al. (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) se proporcionan en A. Honegger, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670.
El término "epitope" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio o un antígeno al cual se une o aglutina una inmunoglobulina o anticuerpo (por ejemplo, TNF) . Un epitope típicamente incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol . 66, G. E. Morris, Ed. (1996).
Los términos "aglutinación específica", "aglutinación selectiva", "aglutina o une selectivamente", y "aglutina o une específicamente", se refieren a la aglutinación de anticuerpos a un epítope en un antígeno predeterminado. Típicamente, el anticuerpo se aglutina con una afinidad (KD) aproximadamente menor de 10-7 M, tal como aproximadamente menor de 10"8 M, 10"9 M ó 10"10 M o incluso mucho menor.
El término "KD", se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Típicamente, los anticuerpos de la invención se unen o aglutinan al TNF con una constante de equilibrio de disociación (KD) menor de aproximadamente 10~7 M, tal como menor de aproximadamente 10~8 M, 10~9 ó 10"10 ó incluso mucho menor, por ejemplo, cuando se determina utilizando tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) en un instrumento BIACORE.
Cuando se utiliza en la presente, "identidad" se refiere a la concordancia de secuencias entre dos polipéptidos , moléculas o entre dos ácidos nucleicos. Cuando una posición en ambas de las dos secuencias comparadas es ocupada por la misma subunidad de monómero base o de aminoácido (por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN es ocupada por adenina, o una posición en cada uno de los dos polipéptidos es ocupada por una lisina) , entonces las respectivas moléculas son idénticas .en esa posición. El "porcentaje de identidad" entre dos secuencias es una función del número de posiciones concordantes compartidas por las dos secuencias divididas entre el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias coinciden, entonces las dos secuencias tienen 60% de identidad. A manera de ejemplo, las secuencias de ADN CTGACT y CAGGTT comparten 50% de identidad (3 de las 6 posiciones totales coinciden) . Generalmente, se hace una comparación cuando dos secuencias se alinean para dar un máximo de identidad. Tal alineación se puede facilitar utilizando, por ejemplo, el método de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48_: 443-453, implementado convenientemente por programas informáticos tales como el programa Align (DNAstar, Inc.). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también se puede determinar utilizando el algoritmo de E. eyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4_: 11-17 (1988)) el cual se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de peso residual PAM120, una penalización por longitud de espacios vacíos de 12 y una penalización por espacio vacio de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. £¡8:444-453 (1970)) el cual se incorporado en el programa GAP en el paquete informático GCG (disponible en www.gcg.com), utilizando ya sea una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de vacío de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ó 4 y una peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.
Las secuencias "similares" son aquéllas que, cuando se alinean, comparten residuos de aminoácidos idénticos y similares, donde los residuos similares son sustituciones conservativas para los correspondientes residuos de aminoácidos en una secuencia de referencia alineada. En este sentido, una "sustitución conservativa" de un residuo en una secuencia de referencia es una sustitución por un residuo que es física o funcionalmente similar al correspondiente residuo de referencia, por ejemplo, que tiene un tamaño, forma, carga eléctrica, propiedades químicas, similares, incluyendo la capacidad de formar uniones covalentes o de hidrógeno, o similares. Por consiguiente, una secuencia "modificada por sustitución conservativa" es una que difiere de una secuencia de referencia o una secuencia de cepa natural en que una o más sustituciones conservativas están presentes. El "porcentaje de similaridad" entre dos secuencias es una función del número de posiciones que contiene residuos concordantes o sustituciones conservativas compartidas por las dos secuencias divididas entre el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias coinciden y 2 de 10 posiciones contienen sustituciones conservativas, entonces las dos secuencias tienen 80% de similaridad positiva .
Cuando se utiliza en la presente, el término "modificaciones de secuencia conservativa" se pretende que se refiera a modificaciones de aminoácidos que no afectan negativamente o alteran las características de aglutinación del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones de secuencias conservativas incluyen sustituciones, adiciones y eliminaciones de nucleótidos y aminoácidos. Por ejemplo, se pueden introducir modificaciones mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen algunas en las cuales el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Por consiguiente, un residuo de aminoácido no esencial previsto o predicho en un anticuerpo anti-VEGF humano preferiblemente es reemplazado con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Los métodos para identificar sustituciones conservativas de nucleótidos y aminoácidos que no eliminan la aglutinación de antígenos, son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12 (10) : 879-884 (1999); y Burks et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 9 : 412-417 (1997)).
Cuando se utiliza en la presente "secuencia de consenso de aminoácidos" se refiere a una secuencia de aminoácidos que se puede generar utilizando una matriz de al menos dos, y preferiblemente más, secuencias de aminoácidos alineadas, y que permite espacios vacíos en la alineación, de tal manera que sea posible determinar el residuo de aminoácido más frecuente en cada posición. La secuencia de consenso es aquella secuencia que comprende los aminoácidos que están representados más frecuentemente en cada posición. En el caso de que dos o más aminoácidos estén igualmente representados en una sola posición, la secuencia de consenso incluye ambos o todos aquéllos aminoácidos.
La secuencia de aminoácidos de una proteína se puede analizar a varios niveles. Por ejemplo, una conservación o variabilidad se puede exhibir al nivel de un solo residuo, nivel de múltiples residuos, residuos múltiples con espacios vacíos etc. Los residuos pueden exhibir la conservación del residuo idéntico o se puede conservar al nivel de clases. Los ejemplos de clases de aminoácidos incluyen grupos R polares pero no cargados (Serina, Treonina, Asparagina y Glutamina) ; grupos R positivamente cargados (Lisina, Arginina, e Histidina) ; grupos R negativamente cargados (Ácido glutámico y Ácido aspártico) ; grupos R hidrófobos (Alanina, Isoleucina, Leucina, Metionina, Fenilalanina, Triptófano, Valina y Tirosina) ; y aminoácidos especiales (Cisteina, Glicina y Prolina) . Otras clases son conocidas para un experto en la técnica y pueden definirse utilizando determinaciones estructurales u otros datos para evaluar la capacidad de sustitución. En ese sentido, un aminoácido sustituible puede se referir a cualquier aminoácido que se pueda sustituir y mantener su conservación funciona en esa posición.
Sin embargo, se reconocerá, que los aminoácidos de la misma clase pueden variar de grado por sus propiedades biofísicas. Por ejemplo, se reconocerá que ciertos grupos R hidrófobos (por ejemplo, Alanina, Serina, o Treonina) son más hidrófilos (es decir, de hidrofilicidad superior o hidrofobicidad inferior) que otros grupos R hidrófobos (por ejemplo, Valina o Leucina) . La hidrofilicidad o hidrofobicidad relativa se puede determinar utilizando métodos reconocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Rose et al., Science, 229: 834-838 (1985) y Cornette et al., J. Mol. Biol., 195: 659-685 (1987) ) .
Como se utiliza en la presente, cuando una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, una primera secuencia VH o VL) se alinea con una o más secuencias de aminoácidos adicionales (por ejemplo, una o más secuencias VH o VL en una base de datos) , una posición de aminoácido en una secuencia (por ejemplo, la primera secuencia VH o VL) se puede comparar con una "posición correspondiente" en una o más secuencias de aminoácidos adicionales. Cuando se utiliza en la presente, la "posición correspondiente" representa la posición equivalente en la(s) secuencia (s) que se compara (n) cuando las secuencias están óptimamente alineadas, es decir, cuando las secuencias se alinean para lograr el porcentaje de identidad o porcentaje de similaridad más alto.
Cuando se utiliza en la presente inmunoaglutinantes "quiméricos" que tienen una porción de la cadena pesada y/o ligera idéntica a u homologa a las correspondientes secuencias en los anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a un clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntica (s) a u homologas a las correspondientes secuencias en los anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, asi como fragmentos de tales anticuerpos. El anticuerpo humanizado que se utiliza en la presente es un subconjunto de anticuerpos quiméricos.
Cuando se utilizan en la presente "anticuerpos humanizados" son inmunoaglutinantes que han sido sintetizados utilizando tecnología de ADN recombinante para esquivar la respuesta inmune a antígenos extraños. La humanización es una técnica bien establecida para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos monoclonales de fuentes xenogénicas. Un anticuerpo humanizado consiste de una región variable de cadena pesada humanizada, una región variable de cadena ligera humanizada y dominios constantes completamente humanos. La humanización de una región variable involucra la elección de una estructura aceptora, típicamente un estructura aceptora humana, el grado al que las CDRs del inmunoaglutinante donador se insertan en la estructura aceptora de dominio variable y la sustitución de residuos de la estructura donadora en la estructura aceptora. Un método general para injertar CDRs en estructuras aceptoras humanas se ha dado a conocer por Winter en la Patente Norteamericana No. 5,225,539, la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Las enseñanzas de US 6,407,213, las cuales se incorporan como referencia en su totalidad, da a conocer una serie de posiciones de aminoácidos de la estructura donde se prefiere una sustitución del inmunoaglutinante donador.
Cuando se utiliza en la presente, el término "propiedad funcional" es una propiedad de un polipéptido (por ejemplo, un inmunoaglutinante) para el cual una mejora (por ejemplo, en relación a un polipéptido convencional) es deseable y/o provechosa para un experto en la técnica, por ejemplo, con el fin de mejorar las propiedades de fabricación o eficacia terapéutica del polipéptido. En una modalidad, la propiedad funcional es una estabilidad mejorada (por ejemplo, estabilidad térmica) . En otra modalidad, la propiedad funcional es una solubilidad mejorada (por ejemplo, bajo condiciones celulares) . En aún otra modalidad, la propiedad funcional es la no agregación. En todavía otra modalidad, la propiedad funcional es una mejora en la expresión (por ejemplo, en una célula procariota) . En aún otra modalidad la propiedad funcional es una mejora en el rendimiento de redoblamiento después de un proceso de purificación del cuerpo de inclusión. En ciertas modalidades, la propiedad funcional es sin una mejora en la afinidad de aglutinación de antígenos.
El término "molécula de ácido nucleico", se refiere a moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser de ADN de una sola hebra o de doble hebra, aunque preferiblemente es de ADN de doble hebra. Un ácido nucleico "se enlaza operablemente" cuando el mismo se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador se enlaza operablemente a una secuencia de codificación si el mismo afecta la transcripción de la secuencia.
El término "vector", se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual el mismo se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN de doble hebra en el cual pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde pueden ligarse segmentos de ADN adicionales al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedera a la cual los mismos se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamífero) . Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales) se pueden integrar al genoma de una célula hospedera en el momento de su introducción a la célula hospedera, y por lo tanto replicarse junto con el genoma hospedero.
El término "célula hospedera" se refiere a una célula a la cual y el vector de expresión se han introducido. Las células hospederas pueden incluir células de bacterias, microbios, plantas o animales. Las bacterias, que son susceptibles a transformación, incluyen miembros de enterobacteriáceas , tales como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae o bacilaceas, tales como Bacillus subtilis; Neumococo; Estreptococo, y Haemophilus influenzae. Los microbios adecuados incluyen Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris . Las líneas de células hospederas animales, adecuadas, incluyen CHO (líneas de Ovario de Hámster Chino) y células NSO.
Los términos "tratar", "que trata", y "tratamiento", se refieren a medidas terapéuticas o preventivas descritas en la presente. Los métodos de "tratamiento" emplean administración a un sujeto, en necesidad de tal tratamiento, un anticuerpo de la presente invención, por ejemplo, un sujeto que tiene un desorden mediado por TNFa o un sujeto que a la larga puede adquirir tal desorden, con el fin de prevenir, curar, retardar, reducir la severidad de, o mejorar uno o más síntomas del desorden o desorden recurrente, o con el fin de prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo previsto en la ausencia de tal tratamiento.
El término "desorden mediado por TNF" o "padecimiento mediado por TNF" se refiere a cualquier desorden, la aparición, avance o la persistencia de los síntomas o estados de padecimiento que requiere la participación del TNF. Los ejemplos de desórdenes mediados por TNF incluyen, pero no están limitados a, estados crónicos y/o autoinmunes de inflamación en general, desórdenes inflamatorios mediados por el sistema inmune en general, padecimiento inflamatorio del SNC, padecimientos inflamatorios que afectan los ojos, articulaciones, membranas mucosas, sistema nervioso central, tracto gastrointestinal, tracto urinario o pulmones, estados de uveítis en general, retinitis, uveítis HLA-B27+, enfermedad de Behcet, síndrome del ojo seco, glaucoma, síndrome de Sjógren, diabetes mellitus (incl. neuropatía diabética), resistencia a la insulina, estados de artritis en general, artritis reumatoide, osteoartritis , artritis reactiva y síndrome de Reiter, artritis juvenil, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barre, miastenia aguda, esclerosis lateral amiotrófica, sarcoidosis, glomerulonefritis , padecimiento crónico del riñon, cistitis, soriasis (ind.. artritis psoriásica), hidrosadenitis supurativa, paniculitis, piodermia gangrenosa, síndrome SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis) , acné, síndrome de Sweet, pénfigo, enfermedad de Crohn (incl. manifestaciones extra-intestinales) , colitis ulcerativa, asma bronquial, alveolitis alérgica, alergias generales, rinitis alérgica, sinusitis alérgica, padecimiento pulmonar obstructivo crónico (COPD) , fibrosis pulmonar, granulomatosis de Wegener, síndrome de Kawasaki, arteritis de células gigantes, vasculitis de Churg-Strauss, poliartritis nodosa, quemaduras, padecimiento del injerto contra el huésped, reacciones huésped contra injerto, episodios de rechazo subsiguientes al trasplante de órganos o médula ósea, estados sistémicos y locales de vasculitis en general, lupus eritematoso sistémico y discoide, polimiositis y dermatomiositis , esclerodermia, pre-eclampsia, pancreatitis aguda y crónica, hepatitis viral, hepatitis alcohólica, inflamación post-quirúrgica tal como después de cirugía de los ojos (por ejemplo cataratas (remplazo del cristalino del ojo) o cirugía de glaucoma) , cirugía de articulaciones (incl. cirugía artroscopica) , cirugía en estructuras relacionadas con las articulaciones (por ejemplo ligamentos), cirugía bucal y/o dental, procedimientos cardiovasculares mínimamente invasivos (por ejemplo PTCA (angioplastia coronaria transluminal, coronaria) , aterectomía, colocación de endoprótesis ) , procedimientos laparoscópicos y/o endoscópicos intra-abdominales y ginecológicos, procedimientos urológicos endoscópicos (por ejemplo cirugía de próstata, ureteroscopia, cistoscopia, cistitis intersticial) , o inflamación perioperatoria (prevención) en general, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, parálisis de Bell (parálisis facial idiopática) , enfermedad de Creutzfeld-Jakob . La osteólisis relacionada con el cáncer, inflamación relacionada con el cáncer, dolor relacionado con el cáncer, caquexia relacionada con el cáncer, metástasis de huesos, formas agudas y crónicas de dolor, independientemente de si estas son causadas por efectos centrales o periféricos del TNF y de si las mismas se clasifican como formas inflamatorias, nociceptivas o neuropáticas de dolor, ciática, dolor lumbar bajo, síndrome del canal carpiano, síndrome de dolor regional complejo (CRPS) , gota, neuralgia post-herpética, fibromialgia, estados de dolor local, síndromes de dolor crónico debidos a tumores metastásicos , dismenorrea. Septicemia bacteriana, viral o fúngica, tuberculosis, SIDA, aterosclerosis, padecimiento coronario, hipertensión, dislipidemia, insuficiencia cardiaca e insuficiencia cardiaca crónica. El término "dosis efectiva" o "dosificación efectiva" se refiere a una cantidad suficiente para lograr o al menos parcialmente lograr el efecto deseado. El término "dosis terapéuticamente efectiva" se define como una cantidad suficiente para curar o al menos parcialmente detener el padecimiento y sus complicaciones en un paciente que ya sufre el padecimiento. Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad del desorden que se trata y el estado general del propio sistema inmune del paciente.
El término "sujeto" se refiere a cualquier animal humano o no humano. Por ejemplo, los métodos y composiciones de la presente invención se pueden utilizar para tratar a un sujeto con un desorden mediado por TNF.
El término "lagomorfos" se refiere a miembros del orden taxonómico Lagomorpha, que comprende las familias Leporidae (por ejemplo liebres y conejos) , y Ochotonidae (pikas o picas) . En una modalidad más preferida, los lagomorfos son un conejo. El término "conejo" que se utiliza en la presente se refiere a un animal que pertenece a la familia de los lepóridos.
Se utilizaron diferentes nomenclaturas para los inmunoaglutinantes generados. Estos típicamente se identifican por un número (por ejemplo #34). En aquellos casos, donde se utilizó un prefijo tal como EP o Epi (por ejemplo EP 34 que es idéntico a Epi 34 o a #34), por lo tanto se indica el mismo inmunoaglutinante .
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto ordinario en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente en la práctica o análisis de la presente invención, los métodos y materiales adecuados se describen más adelante. En caso de conflicto, dominará la presente especificación, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son ilustrativos solamente y no se pretende que sean limitativos.
Varios aspectos de la invención se describen con mayor detalle en las siguientes subsecciones . Se entiende que las diversas modalidades, preferencias y rangos pueden combinarse a discreción o voluntad. Además, dependiendo de la modalidad específica, las definiciones, modalidades o rangos seleccionados pueden no aplicar.
Anticuerpos anti-TNFa En un aspecto, la presente invención proporciona inmunoaglutinantes que aglutinan el TNFa y que por consiguiente son adecuados para bloquear la función del TNFa in vivo. Las CDRs de estos inmunoaglutinantes se derivan de anticuerpos monoclonales anti-TNFa de conejo como se da a conocer en US7,431,927. Los anticuerpos de conejo son conocidos por tener afinidades particularmente altas. Además, las secuencias CDR dadas a conocer en la presente son secuencias naturales, lo que significa que no necesita realizarse una maduración de afinidad de los inmunoaglutinantes resultantes. En una modalidad preferida, el inmunoaglutinante neutraliza el TNFa in vivo.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un inmunoaglutinante, que aglutina específicamente el TNFa, que comprende al menos una de una secuencia de aminoácidos CDRH1, una CDRH2, una CDRH3, una CDRLl, una CDRL2, o una CDRL3. Las secuencias de aminoácidos CDR ejemplificantes para su uso en los inmunoaglutinantes de la invención se establecen en las SEC. ID. Nos.: 3-50 (Tabla 1). Las CDRs establecidas en las SEC. ID. Nos.: 3-50 se pueden injertar en cualquier soporte de aglutinación adecuado utilizando cualquier método reconocido de la técnica (ver, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332 : 323-32 ; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Nati. Acad. See. U.S. A. 86:10029-10033; Patente Norteamericana No. 5,225,539 de Winter, y Patentes Norteamericanas Nos. 5,530,101; 5,585, 089; 5,693,762 y 6,180,370 de Queen et al.). Las CDRs de diferentes anticuerpos parentales pueden combinarse en un anticuerpo para generar especies de anticuerpos adicionales. Sin embargo, se prefiere que los inmunoaglutinantes dados a conocer en la presente se humanicen, volviéndolos asi adecuados para aplicaciones terapéuticas.
Por consiguiente, en una modalidad, la invención proporciona un inmunoaglutinante que aglutina específicamente el TNFa humano, el inmunoaglutinante comprende: (i) una región variable de cadena pesada, humanizada (VH) , la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de estructura variable de cadena pesada humana y secuencias CDR Hl, CDR H2 y CDR H3 que provienen de un inmunoaglutinante de conejo; y/o (ii) una región variable de cadena ligera humanizada (VL) , la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de estructura variable de cadena ligera humana y secuencias CDR Ll, CDR L2 y CDR L3 que provienen de un inmunoaglutinante de conejo.
Como se conoce en la técnica, muchas cadenas VH de conejo tienen cisteína en extra pares en relación con las contrapartes de murino y humano. Además del puente de disulfuro de conservación formado entre cys22 y cys92, también hay un puente cys21-cys79 así como un puente inter-CDR S-S formado entre el último residuo de CDR Hl y el primer residuo de CDR H2 en algunas cadenas de conejo. Por otro lado, frecuentemente se encuentran pares de residuos de cisteína en la CDR-L3. Por otro, lado, muchas CDRs de anticuerpo de conejo no pertenecen a ninguna estructura canónica previamente conocida. En particular la CDR-L3 frecuentemente es mucho más larga que la CDR-L3 de una contraparte de humano o murino.
Además de los conejos, la invención puede utilizarse para injertar CDRs de cualquier lagomorfo.
En el caso de anticuerpos, las CDRs de conejo establecidas en las SEC. ID. Nos.: 3-50 pueden injertarse en las regiones de estructura de cualquier anticuerpo de cualquier especie. Sin embargo, previamente se ha descubierto que los anticuerpos o derivados de anticuerpos que comprenden las estructuras identificadas en la asi llamado selección de "control de calidad" (WO0148017), se caracterizan por una estabilidad y/o solubilidad generalmente alta y por consiguiente también pueden ser útiles en el contexto de aplicaciones extracelulares tales como la neutralización de TNFa humano. Por otra parte, se ha descubierto además que una combinación particular de estas estructuras solubles y estables de VL (cadena ligera variable) y VH (cadena pesada variable) , es particularmente adecuada para incorporar CDRs de conejo. Sorprendentemente se encontró que al injertarse en dicha estructura o sus derivados, la conformación de bucles de una gran variedad de CDRs de conejo podría mantenerse completamente, en gran parte independientemente de la secuencia de la estructura donadora. Por otra parte, dicha estructura o sus derivados que contienen diferentes CDRs de conejo son adecuadamente expresadas y bien producidas, al contrario de las cadenas únicas de cepa natural de conejo y a pesar de todo casi retienen completamente la afinidad de los anticuerpos de conejo donadores, originales. De acuerdo con esto, en una modalidad, las CDRs establecidas en las SEC. ID. Nos.: 3-50 se injertan en las estructuras de anticuerpos humanos derivadas mediante la selección de "control de calidad" dada a conocer en EP1479694. Las secuencias de aminoácidos de estructuras ejemplificantes para su uso en la invención, se establecen en las SEC. ID. Nos.: 1 y 2 más adelante.
SEC. ID. No. 1 Cadena ligera variable de FW1.4 EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC (X) n=3-50WYQQKPGKAPKLLIY (X) n=3-5o VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC (X) n=3-5oFGQGTKLTVLG SEC. ID. No. 2 Cadena pesada variable de FW1.4 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (X) n=3-5oWVRQAPGKGLEWVS (X) n=3-50 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK (X) n=3_50 GQGTLVTVSS X puede ser cualquier aminoácido de origen natural. Al menos tres y hasta 50 aminoácidos pueden estar presentes. Las CDRs típicamente se insertan en los sitios donde X está presente .
En otras modalidades, la invención proporciona un inmunoaglutinante, el cual se específicamente aglutina el TNFa, que comprende al menos uno de una secuencia de aminoácidos VH o VL. Las secuencias de aminoácidos VH o VL ejemplificantes para su uso en los inmunoaglutinantes de la invención, se establecen en las SEC. ID. Nos.: 51-111.
En ciertas modalidades, la invención proporciona además un inmunoaglutinante, el cual específicamente aglutina el TNFa, que comprende una secuencia de aminoácidos con similaridad sustancial a una secuencia de aminoácidos establecida en las SEC. ID. Nos.: 51-111, y en donde el inmunoaglutinante conserva o mejora las propiedades funcionales deseadas del inmunoaglutinante anti-TNFa de la invención. El porcentaje de similaridades ejemplificantes incluyen, pero no están limitadas a, aproximadamente 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% de identidad.
En ciertas modalidades, la invención proporciona además un inmunoaglutinante, el cual específicamente aglutina el TNFa, que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad sustancial a una secuencia de aminoácidos establecida en las SEC. ID. Nos.: 51-111, y en donde el inmunoaglutinante conserva o mejora las propiedades funcionales deseadas del inmunoaglutinante anti-TNFa de la invención. El porcentaje de similaridades e emplificantes incluyen, pero no están limitadas a, aproximadamente 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% de identidad.
En ciertas modalidades, la invención proporciona además un inmunoaglutinante, el cual específicamente aglutina el TNFa, que comprende una secuencia de aminoácidos con sustituciones conservativas en relación a una secuencia de aminoácidos establecida en las SEC. ID. Nos.: 51-111, y en donde el inmunoaglutinante conserva o mejora las propiedades funcionales deseadas del inmunoaglutinante anti-TNFa de la invención .
En una modalidad más preferida, el inmunoaglutinante de la invención comprende al menos una secuencia CDR que es al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, 90%, 95% ó 100% idéntica a cualquiera de las SEC. ID. Nos.: 3-50.
En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un inmunoaglutinante que comprende al menos una, preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco o más preferiblemente seis CDRs del grupo que consiste de las SEC. ID. Nos. 3-8.
En otra modalidad preferida de la invención, se proporciona un inmunoaglutinante que comprende al menos una, preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco o más preferiblemente seis CDRs del grupo que consiste de las SEC. ID. Nos. 9-14.
En otra modalidad preferida de la invención, se proporciona un inmunoaglutinante que comprende al menos una, preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco o más preferiblemente seis CDRs del grupo que consiste de las SEC. ID. Nos. 15-20.
En otra modalidad preferida de la invención, se proporciona un inmunoaglutinante que comprende al menos una, preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco o más preferiblemente seis CDRs del grupo que consiste de las SEC . ID. Nos. 21-26.
En otra modalidad preferida de la invención, se proporciona un inmunoaglutinante que comprende al menos una, preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco o más preferiblemente seis CDRs del grupo que consiste de las SEC. ID. Nos. 27-32.
En otra modalidad preferida de la invención, se proporciona un inmunoaglutinante que comprende al menos una, preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco o más preferiblemente seis CDRs del grupo que consiste de las SEC. ID. Nos. 33-38.
En otra modalidad preferida de la invención, se proporciona un inmunoaglutinante que comprende al menos una, preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco o más preferiblemente seis CDRs del grupo que consiste de las SEC. ID. Nos. 39-44.
En otra modalidad preferida de la invención, se proporciona un inmunoaglutinante que comprende al menos una, preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco o más preferiblemente seis CDRs del grupo que consiste de las SEC. ID. Nos. 45-50.
Las secuencias CDR provistas en la presente en las SEC. ID. Nos.: 3-50 además pueden comprender sustituciones. Preferiblemente, las secuencias tienen 3, más preferiblemente 2, y más preferiblemente sólo una sustitución (es) . Dichas sustituciones preferiblemente son de tal manera que la capacidad de aglutinación selectiva del inmunoaglutinante no se perjudicada aunque la afinidad del inmunoaglutinante sea alterada, preferiblemente mejorada.
Tabla 1. CDRs Donadoras Rabmab Clon Rabmab CDR Secuencia de Aminoácidos SEC. ?).. NO.: EP-43 CDR-H1 GFSLSSGA S 3 CDR-H2 VIISSGATYYASWAKG 4 CDR-H3 GGPDDSNSMGTFDP 5 CDR-L1 QASQSISDWLA 6 CDR-L2 GASRLAS 7 CDR-L3 QQGWSDSYVDNL 8 EP-1 CDR-H1 GIDLSNDAIS 9 CDR-H2 YISDWSIRYYANWAQG 10 CDR-H3 GAPGAGDNGI 1 1 CDR-L1 QSTESVYKNNYLA 12 CDR-L2 DASTLAS 13 CDR-L3 AGYYRSGGSTANGS 14 EP-6 CDR-H1 GFSLSRYGVS 15 CDR-H2 IGEAGRAYYANWARS 16 CDR-H3 GEVFNNGWGAFNI 17 CDR-L1 QASESIYSGLA 18 CDR-L2 QASTLAS 19 CDR-L3 QQGFGTSNVENP 20 EP-15 CDR-H1 GFSLSRYGVS 21 CDR-H2 AIGETGRAYYANWAKS 22 CDR-H3 GEEFNNGWGAFNI 23 CDR-L1 QASENIYSTLA 24 CDR-L2 SASTLAS 25 CDR-L3 QQGFATSNVENP 26 EP-19 CDR-H1 GFSLNSNEIS 27 CDR-H2 YIGNGGMTHYASWAKG 28 CDR-H3 SVEYTDLYYLNI 29 CDR-L1 QASDNIYRGLA 30 CDR-L2 DASTLQS 31 CDR-L3 LGVYGYSSDDGAA 32 EP-34 CDR-H1 GFTISRSYWIC 33 CDR-H2 CIYGDNDITPLYANWAKG 34 CDR-H3 LGYADYAYDL 35 CDR-L1 QSSQSVYGNIWMA 36 CDR-L2 QASKLAS 37 CDR-L3 QGNFNTGDRYA 38 EP-35 CDR-H1 GFSFSVGYWIC 39 CDR-H2 CIDAGTSGGTYYATWAKG 40 CDR-H3 GVSSNGYYFKL 41 CDR-L1 QASQSISNLLA 42 CDR-L2 AASKLAS 43 CDR-L3 QQGWSHTNVDNT 44 EP-42 CDR-H1 GIDLRNDAIS 45 CDR-H2 YISDWGIKYYASWVKG 46 CDR-H3 GAPGAGDNGI 47 CDR-L1 QSTESVYKNNYLA 48 CDR-L2 DASTLAS 49 CDR-L3 AGYYRSGFGTANG 50 En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos que se aglutinan o unen a un epitope en el TNF humano que se reconoce por un anticuerpo monoclonal que contiene un conjunto de CDRs (H1-H3, L1-L3; que pertenecen a un clon Rabmab) como se establece en la Tabla 1. Tales anticuerpos se pueden identificar en base a su capacidad de inter-competir con un anticuerpo de la Tabla 1 en un ensayo de aglutinación estándar del TNF. La capacidad de un anticuerpo de análisis para inhibir la aglutinación de un anticuerpo de la Tabla al TNFa humano demuestra que el anticuerpo de análisis puede competir con el anticuerpo de la Tabla 1 para aglutinarse al TNFa humano y por consiguiente involucra el mismo epitope en el TNFa humano que el anticuerpo de la Tabla 1. En una modalidad preferida, el anticuerpo que se aglutina o une al mismo epitope en el TNFa humano que los anticuerpos establecidos en la Tabla 1, es un anticuerpo monoclonal humano. Tales anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar y aislar como se describe en la presente.
En una modalidad, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la presente invención son anticuerpos de una sola cadena (scFv) o fragmentos Fab. En el caso de anticuerpos scFv, un dominio VL seleccionado se puede enlazar a un dominio VH seleccionado en cualquier orientación mediante un enlace flexible. Un enlace adecuado del estado de la técnica consiste de secuencias de aminoácidos GGGGS repetidas o variantes de las mismas. En una modalidad preferida de la presente invención un enlace (GGGGS) (SEC. ID. No.: 72) o sus derivados se utiliza, aunque también son posibles variantes de 1-3 repeticiones (Holliger et al. (1993), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448) . Otros enlaces que se pueden utilizar para la presente invención se describen por Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cáncer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 y Roovers et al. (2001), Cáncer Immunol. Immunother. 50:51-59. El arreglo puede ser ya sea NH2-VL-enlace-VH-COOH ó NH2-VH-enlace-VL-COOH, siendo preferida la primera orientación. En el caso de fragmentos Fab, los dominios variables de cadena ligera VL seleccionados se fusionan a la región constante de una cadena de Ig kappa humana, mientras que los dominios variables de cadena pesada VH adecuados se fusionan al primer dominio constante CHl (N-terminal) de una IgG humana. En el C-terminal, se forma un puente de disulfuro de inter-cadena entre los dos dominios constantes.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpos de la presente invención pueden tener afinidades con el TNF humano, con constantes de disociación Kd en el rango de 1 fM - 10 µ?. En una modalidad preferida de la presente invención la Kd es = 1 nM. La afinidad de un anticuerpo para un antigeno se puede determinar experimentalmente utilizando un método adecuado (Berzofsky et al. "Antibody-Antigen Interactions" , en Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed, Raven Press: New York, NY (1992); Kuby, J. Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, NY) y métodos descritos en los mismos.
Los anticuerpos preferidos incluyen anticuerpos que tienen una región de cadena pesada variable (VH) y/o cadena ligera variable (VL) de entre las siguientes secuencias VH y VL (las secuencias CDR se subrayan) : SEC. ID. NO.: 51 EP43min VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSGAMSWVRQAPGKGLEWVSVIISSGAT YYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGPDDSNSMGTFDPWGQ GTLVTVSS SEC. ID. NO.: 52 EP43min VL EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASRLASG VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVD LFGQGTKLTVLG SEC. ID. NO.: 53 EP43max VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSGAMSWVRQAPGKGLEWVGVIISSGAT YYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQ GTLVTVSS SEC. ID. NO.: 54 EP43max VL EIVMTQSPSTLSASVGDRVIIKCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASRLASG FPSRFSGSGSGAEFTLTISGLEPADFATYYCQQGWSDSYVD LFGQGTKLTVLG SEC. ID. NO. : 55 EP43maxDHP VH EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSGAMSWVRQAPGKGLEWGWIISSGAT YYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQ GTSVTVSS SEC. ID. NO. : 56 EP43minmaxVL: T22K VL EIVMTQSPSTLSASVGDRVIIKCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASRLASG VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTKLTVLG SEC. ID. NO. : 57 EP43minmaxVL: V58F VL EIV TQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASRLASG FPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTKLTVLG SEC. ID. NO. : 58 EP43minmaxVL: Q79E VL EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASRLASG VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLEPDDFATYYCQQG SDSYVD LFGQGTKLTVLG SEC. ID. NO. : 59 EP43minmaxVL: D81A VL EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISD LAWYQQKPGKAPKLLIYGASRLASG VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPADFATYYCQQG SDSYVDNLFGQGTKLTVLG SEC. ID. NO. : 60 EPlmin VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS DAISWVRQAPGKGLEWVSYISDWSIR YYANWAQGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGAPGAGDNGIWGQGTLV TVSS NOTA: la CDR-H1 de EPlmin no coincide con la de EPlmax SEC. ID. NO. : 61 EPlmin VL EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYIAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLA SGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGSGTANGSFGQGTKLTVL G SEC. ID. NO. : 62 EPlmax VH EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTVSGIDLSNDAISWVRQAPGKGLEWVAYISDWSIR YYANWAQGRFTISKDTSKNTVYLQ NSLRAEDTATYYCARGAPGAGDNGIWGQGTTV TVSS SEC. ID. NO. : 63 EPlmax VL ElVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYIiA YQQKPGKAPKLLIYDASTLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGSGTANGSFGQGTKLTVL G SEC. ID. NO. : 64 EP6min VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSRYGVSWVRQAPGKGLE VSTIGEAGRA YYA WARSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEVFNNGWGAF IWGQG TLVTVSS SEC. ID. NO. : 65 EP6min VL EIVMTQSPSTLSASVGDRVI ITCQASESIYSGLAWYQQKPGKAPKLLIYQASTLASG VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGFGTSNVENPFGQGTKLTVLG SEC. ID. NO. : 66 EP6max VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSRYGVSWVRQAPGKGLEWVGTIGEAGRA YYANWARSRSTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGEVFNNGWGAFNIWGQG TLVTVSS SEC. ID. NO. : 67 EP6max VL EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASESIYSGLAWYQQKPGKAPKLLIYQASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLAISSLQPDDFATYYCQQGFGTSNVENPFGQGTKLTVLG SEC. ID. NO. : 68 EP15min VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGVSWVRQAPGKGLEWVSAIGETGRA YYANWAKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEEFN GWGAFNIWGQG TLVTVSS SEC. ID. NO. : 69 EPl5min VL EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASENIYTSLAWYQQKPGKAP LLIYSASTLASG VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGFATSNVENPFGQGTKLTVLG SEC. ID. NO. : 70 EP15max VH EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTVSGFSLSRYGVSWVRQAPGKGLEWVGAIGETGRA YYANWAKSRSTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARGEEFN G GAF IWGQG TTVTVSS SEC. ID. NO. : 71 EP15max VL EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASENIYTSLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTLASG VP5RFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGFATSNVENPFGQGTKLTVLG SEC. ID. NO. : 72 enlace de glicina-serina GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEC. ID. NO. : 73 EP19maxmod VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLNSNEISWVRQAPGKGLEWVGYIGNGGMT HYAS AKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCASSVEYTDLYYLNIWGQGT LVTVSS SEC. ID. NO. : 74 EP19maxmod VL EIV TQSPSTLSASVGDRVIITCQASDNIYRGLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLQSG VPSRFSGSGSGTQFTLTISSLQPDDFATYYCLGVYGYSSDDGAAFGQGTKLTVLG SEC. ID. NO. : 75 EP19minmod VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLNS EISWVRQAPGKGLEWVSYIGNGGMT HYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSVEYTDLYYLNI GQGT LVTVSS SEC. ID. NO. : 76 EP19minmod VL EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASDNIYRGLA YQQKPGKAPKLLIYDASTLQSG VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCLGVYGYSSDDGAAFGQGTKLTVLG SEC. ID. NO.: 77 EP34min VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISRSYWICWVRQAPGKGLEWVSCIYGDND ITPLYANWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGYADYAYDL GQG TLVTVSS SEC. ID. NO. : 78 EP34min VL EIVMTQ5PSTLSASVGDRVIITCQSSQSVYGNIWMA YQQKPGKAPKLLIYQASKLA SGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGTKLTVLG SEC. ID. NO.: 79 EP34max VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTISRSYWICWVRQAPGKGLEWVACIYGDND ITPLYA WAKGRFPVSTDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGYADYAYDLWGQG TLVTVSS SEC. ID. NO.: 80 EP34max VL EIVMTQSPSTLSASLGDRVIITCQSSQSVYGNIWMAWYQQKSGKAPKLLIYQASKLA SGVPSRFSGSGSGAEFSLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGTKLTVLG SEC. ID. NO. : 81 EP35min VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVGYWIC VRQAPGKGLEWVSCIDAGTS GGTYYATWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGVSSNGYYFKL GQ GTLVTVSS SEC. ID. NO. : 82 EP35min VL EIV TQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIS LLAWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASG VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSHT VDNTFGQGTKLTVLG SEC. ID. NO. : 83 EP35max VH EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFSFSVGYWICWVRQAPGKGLEWVACIDAGTS GGTYYATWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARGVSSNGYYFKLWGQ GTTVTVSS SEC. ID. NO. : 84 EP35max VL EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIS LLAWYQQKPGKAPKLLIVAASKLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQG SHTNVDNTFGQGTKLTVLG SEC. ID. NO. : 85 EP42min VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFR DAIS VRQAPGKGLE VSYISDWGIK YYASWVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGAPGAGDNGIWGQGTLV TVSS NOTA: La CDR-Hl de EP42min no coincide con la de EP42max SEC. ID. NO. : 86 EP42min VL EIV TQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKN YLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLA SGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGFGTANGSFGQGTKLTVL G SEC. ID. NO. : 87 EP42max VH EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTVSGIDLRNDAIS VRQAPGKGLE VSYISD GIK YYASWVKGRFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARGAPGAGDNGIWGQGTTV TVSS SEC. ID. NO. : 88 EP42max VL EIVMTQSP STLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLASGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGFGTANGSFGQGTKLTVLG Producción de Anticuerpos anti- NF La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que las estructuras de anticuerpos humanos altamente solubles y estables identificados mediante un ensayo de Control de Calidad (QC) son estructuras particularmente adecuadas para incorporar CDRs de otras especies animales no humanas, por ejemplo, CDRs de conejo. En particular, la invención se basa en el descubrimiento de que las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo humano particular (el asi llamado, anticuerpo "FW 1.4"), son particularmente adecuadas como aceptores para CDRs de una variedad de anticuerpos de conejo de diferentes especificidades de aglutinación. Aunque la estructura FW1. de cadena ligera humana de ESBATech claramente tiene un desempeño menor al esperado en el ensayo de Control de Calidad y cuando se expresa en células HeLa cuando se utiliza junto con sus CDRs originales (como se da a conocer en WO03097697), sorprendentemente se encontró que, cuando se combina con otras CDRs, tales como CDRs de conejo, la misma da lugar a anticuerpos de una sola cadena muy estables, solubles y adecuadamente producibles. Además, los inmunoaglutinantes humanizados generados por el injerto de CDRs de conejo en estas estructuras ligeras y pesadas altamente compatibles de manera consiste y confiable conservan las propiedades de aglutinación de los anticuerpos de conejo a partir de los cuales se derivan las CDRs donadoras. Además, los inmunoaglutinantes generados mediante los métodos de la invención de un modo fiable exhiben propiedades funcionales superiores tales como solubilidad y estabilidad. De acuerdo con esto, es un objetivo general de la invención proporcionar métodos para injertar CDRs de conejo y otras CDRs no humanas, en las estructuras de anticuerpos humanos de cadena ligera y/o cadena pesada solubles y estables de la SEC. ID. NO. : 1 (K127) y SEC. ID. NO.: 2 (a43) , respectivamente, generando así anticuerpos humanizados con propiedades biofísicas superiores.
En una modalidad preferida, la estructura comprende una o más sustituciones en la estructura de cadena pesada (VH) en una posición del grupo que consiste de las posiciones H24, H25, H56, H82, H84, H89 y H108 (sistema de numeración AHo) . Adicional o alternativamente, la estructura puede comprender una sustitución en la estructura de cadena ligera (VH) en la posición L87 de acuerdo al sistema de numeración AHo. La presencia de dichas sustituciones ha mostrado proporcionar una estructura aceptora la cual conserva casi totalmente la afinidad de los anticuerpos donadores originales. En una modalidad más preferida, una o más de las sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de: treonina (T) en la posición H24, valina (V) en la posición H25, glicina (G) ó alanina (A) en la posición H56, lisina (K) en la posición H82, treonina (T) en la posición H84, valina (V) en la posición H89 y arginina (R) en la posición H108 y treonina (T) en la posición L87 de acuerdo al sistema de numeración AHo, están presentes en la secuencia de estructura.
Por consiguiente, en una modalidad aún más preferida, la estructura aceptora es SEC. ID. NO. 89: estructura de cadena pesada variable de rFW1.4 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS (X) n=3-50 WVRQAPGKGLE VG (X) n=3-50 RFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (X) n=3-50 WGQGTLV TVSS SEC. ID. NO. 90: estructura de cadena pesada variable de rFW1.4 (V2) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS (X) n=3-50 WVRQAPGKGLEWVG (X) n=3-50 RFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (X) n=3_5o WGQGTLVTVSS SEC. ID. NO. 91: estructura de cadena ligera variable sustituida de FW1.4 EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC (X) n=3-so WYQQKPGKAPKLLIY (X) n=3-50 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC (X)n=3-5o FGQGTKLTVLG SEC. ID. NO. 92: estructura de rF l .
EIV TQSPSTLSASVGDRVIITC (X) n=3-50 WYQQKPGKAPKLLIY (X) n=3-so GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC (X) n=s-50 FGQGTKLTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS (X) n=3-5o WVRQAPGKGLE VG(X)n=3-50 RFTISRDTSKNTVYLQMNS LRAEDTAVYYCAR (X) n=3-50 WGQGTLVTVSS SEC. ID. NO. 93: estructura de rFW1.4(V2) EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC (X) n=3-5o WYQQKPGKAPKLLIY (X) n=3-so GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC (X) n=3-50 FGQGTKLTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS (X) n=3-so WVRQAPGKGLEWVG (X) n=3-50 RFTISKDTSKNTVYLQMNSLR AEDTAVYYCAR(X)n=3-50 WGQGTLVTVSS X puede ser cualquier aminoácido de origen natural; al menos tres y hasta 50 aminoácidos pueden estar presentes. Las CDRs típicamente se insertan en los sitios donde X está presente .
Los anticuerpos o derivados de anticuerpos de la presente invención pueden generarse utilizando técnicas de rutina en el campo de la genética recombinante . Se sabe que las secuencias de los polipéptidos, los ADNcs que codifican los mismos se pueden generar mediante síntesis genética por medio de métodos bien conocidos en la técnica. Estos ADNcs se pueden clonar en plásmidos de vectores adecuados. Una vez que se obtiene el ADN que codifica un dominio VL y/o VH, se pueden realizar mutagénesis dirigida, por ejemplo mediante PCR utilizando cebadores mutagénicos, para obtener varios derivados. La mejor secuencia "de partida" se puede elegir dependiendo del número de alteraciones deseadas en las secuencias VL y/o VH. Una secuencia preferida son las secuencias TB-A y sus derivados, por ejemplo pueden elegirse las secuencias scFv o secuencias de péptidos de fusión Fab como plantillas o modelos para mutagénesis manejada con PCR y/o clonación.
Los métodos para incorporar o injertar CDRs en regiones de estructura incluyen las establecidas en, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332 : 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321 : 522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Nati. Acad. See. U.S. A. 86:10029-10033; Patente Norteamericana No. 5,225,539 de Winter, y Patentes Norteamericanas Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 de Queen et al, asi como aquéllas dadas a conocer en las Solicitudes Provisionales Norteamericanas Nos. de Serie 61/075,697 y 61/155,041, tituladas "Humanization of Rabbit Antibodies Using Universal Antibody Frameworks", presentadas el 25 de Junio de 2008 y el 4 de Febrero de 2009, respectivamente.
Se pueden utilizar técnicas estándar de clonación y mutagénesis bien conocidas para la persona experta en la técnica para anexar enlaces, dominios de reordenamiento o fusiones de constructos para la producción de fragmentos Fab. Los protocolos básicos que dan a conocer los métodos generales de esta invención, se describen en Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook & Russell, 3R ed. 2001) y en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1999) .
La secuencia de ADN que alberga un gen que codifica un polipéptido scFv, o en el caso de fragmentos Fab, que codifican ya sea dos genes separados o un operón bi-cistrónico que comprende los dos genes para las fusiones VL-CK y VH-CH1 se clonan en un vector de expresión adecuado, preferiblemente uno con un promotor inducible. Se debe tener cuidado de que delante de cada gen esté presente un sitio de aglutinación de ribosoma apropiado que asegure su traducción. Se entiende que los anticuerpos de la presente invención comprenden las secuencias dadas a conocer en vez de que éstos consistan de las mismas. Por ejemplo, las estrategias de clonación pueden requerir que se haga un constructo a partir del cual esté presente un anticuerpo con uno o unos cuantos residuos adicionales en el extremo N-terminal. Específicamente, la metionina derivada del codón inicial puede esta presente en la proteina final en casos donde la misma no se ha escindido posterior a la traducción. La mayoría de los constructos para anticuerpos scFv dan lugar a una alanina adicional en el extremo N-terminal. En una modalidad preferida de la presente invención, se elige un vector de expresión para la expresión periplásmica en E. coli (Krebber, 1997) . Dicho vector comprende un promotor delante de una secuencia de señal escindible. La secuencia de codificación para el péptido del anticuerpo se fusiona entonces al margen de la secuencia de señal escindible. Esto permite la focalizacion del polipéptido expresado al periplasma bacteriano donde se escinde la secuencia de señal. El anticuerpo se pliega o dobla entonces. En el caso de los fragmentos Fab, los péptidos de fusión tanto VL-C como VH-CH1 deben enlazarse a una señal de exportación. La unión S-S covalente se forma en las cisteinas C-terminales después de que los péptidos han llegado al periplasma. Si se prefiere la expresión citoplásmica de anticuerpos, dichos anticuerpos usualmente se pueden obtener a rendimientos elevados de los cuerpos de inclusión, los cuales se pueden separar fácilmente de otros fragmentos celulares y proteina. En este caso los cuerpos de inclusión se solubilizan en un agente de desnaturalización tal como por ejemplo clorhidrato de guaridina (GndHCl) y luego replegarse mediante procedimientos de re-naturalización bien conocidos para aquellos expertos en la técnica.
Los plásmidos que expresan los polipéptidos scFv o Fab se introducen en un huésped adecuado, preferiblemente una célula de bacterias, levaduras o mamífero, más preferiblemente una cepa de E. coli adecuada como por ejemplo JM83 para expresión periplásmica o BL21 para la expresión en cuerpos de inclusión. El polipéptido se puede cosechar ya sea desde el periplasma o formar cuerpos de inclusión y purificarse utilizando técnicas estándar tales como cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de fase reversa, cromatografía por afinidad y/o filtración de gel conocidas para la persona experta en la técnica .
Los anticuerpos o derivados de anticuerpos de la presente invención se pueden caracterizar con respecto al rendimiento, solubilidad y estabilidad in vitro. Las capacidades de aglutinación hacia el TNF, preferiblemente hacia el TNFa humano, se pueden analizar in vitro mediante ELISA o resonancia de plasmón superficial (BIACore) , utilizando TNF humano recombinante como se describe en W09729131, el último método también permite determinar la constante de relación koff, la cual preferiblemente deberá ser menor de 10~3s_:L. Se prefieren valores de Kd de = 10 nM.
A parte de anticuerpos con fuerte afinidad de aglutinación para TNF humano, también es deseable generar anticuerpos anti-TNF los cuales tengan propiedades benéficas desde una perspectiva terapéutica. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser uno que muestre neutralizar la actividad en un ensayo de citotoxicidad mediada por TNFalfa L929. En este ensayo, la toxicidad de las células de fibroblastos L929 de ratón, tratadas con Actinomicina, se indujo con TNF humano recombinante (hTNF) . Se determinó que el 90% de la citotoxidad máxima inducida por hTNF estaba a una concentración de TNF de 1000 pg/ml.
Todas las células L929 se cultivaron en RPMI 1640 con rojo de fenol, con medio de L-Glutamina suplementado con suero de ternera fetal (10% v/v) . La actividad neutralizante de los aglutinantes anti-TNFa se evaluó en RPMI 1640 sin rojo de fenol y 5% de suero de ternera fetal. Se agregan diferentes concentraciones (0 - 374 ng/mL) de aglutinantes anti-TNF a las células L929 en presencia de hTNF de 1000 pg/ml con el fin de determinar la concentración a la cual el efecto antagónico alcanza una inhibición media-máxima (EC50%). La curva de respuesta a la dosis se ajustó con regresión sigmoidea no lineal con pendiente variable y se calculó la EC50.
Variantes Optimizadas Los anticuerpos de la invención pueden optimizarse además para propiedades funcionales mejoradas, por ejemplo, para solubilidad y/o estabilidad mejorada.
En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención se optimizan de acuerdo con la metodología de "consenso funcional" dada a conocer en la Solicitud PCT No. de Serie PCT/EP2008/001958 , titulada "Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies", presentada el 12 de Marzo de 2008, la cual se incorpora en la presente como referencia .
Por ejemplo, los inmunoaglutinantes de TNFot de la invención se pueden comparar con una base de datos de scFvs seleccionados de manera funcional para identificar posiciones de residuos de aminoácidos que sean ya sea más o menos tolerantes de variabilidad que la(s) correspondiente (s) posición (es) en el inmunoaglutinante VEGF, indicando asi que tal (es) posición (es) de residuo (s) identificada ( s ) puede (n) ser adecuada (s) para diseñarse para mejorar su funcionalidad tal como la estabilidad y/o solubilidad.
Las posiciones de estructuras e emplificantes para sustitución se describen en la Solicitud PCT No. PCT/CH2008/000285, titulada "Methods of Modifying Antibodies, and Modified Antibodies with Improved Functional Properties", presentada el 25 de Junio de 2008, y Solicitud PCT No. PCT/CH2008/000284, titulada "Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies", presentada el 25 de Junio de 2008. Por ejemplo, una o más de las siguientes sustituciones pueden introducirse en una posición de aminoácido (la numeración AHo hace referencia a cada una de las posiciones de aminoácidos listadas más adelante) en la región variable de cadena pesada de un inmunoaglutinante de la invención : (a) Q ó E en la posición de aminoácido 1; (b) Q ó E en la posición de aminoácido 6; (c) T, S o A en la posición de aminoácido 7, más preferiblemente T ó A, incluso más preferiblemente T; (d) A, T, P, V o D, más preferiblemente T, P, V ó D, en la posición de aminoácido 10, (e) L o V, más preferiblemente L, en la posición de aminoácido 12, (f) V, R, Q, M ó K, más preferiblemente V, R, Q o en la posición de aminoácido 13; (g) R, M, E, Q ó K, más preferiblemente R, M, E o Q, incluso más preferiblemente R ó E, en la posición de aminoácido 14; (h) L o V, más preferiblemente L, en la posición de aminoácido 19; (i) R, T, K o N, más preferiblemente R, T o N, incluso más preferiblemente N, en la posición de aminoácido 20; (j) I, F, L o V, más preferiblemente I, F o L, incluso más preferiblemente I ó L, en la posición de aminoácido 21; (k) R o K, más preferiblemente K, en la posición de aminoácido 45; (1) T, P, V A ó R, más preferiblemente T, P, V o R, incluso más preferiblemente R, en la posición de aminoácido 47; (m) K, Q, H o E, más preferiblemente K, H o E, incluso más preferiblemente K, en la posición de aminoácido 50; (n) M o l, más preferiblemente I, en la posición de aminoácido 55; (o) K ó R, más preferiblemente K, en la posición de aminoácido 77; (p) A, V, L o I, más preferiblemente A, L o I, incluso más preferiblemente A, en la posición de aminoácido 78; (q) E, R, T o A, más preferiblemente E, T o A, incluso más preferiblemente E, en la posición de aminoácido 82; (r) T, S, I o L, más preferiblemente T, S o L, incluso más preferiblemente T, en la posición de aminoácido 86; (s) D, S, N o G, más preferiblemente D, N o G, incluso más preferiblemente N, en la posición de aminoácido 87; (t) A, V, L ó F, más preferiblemente A, V o F, incluso más preferiblemente V, en la posición de aminoácido 89; (u) F, S, H, D ó Y, más preferiblemente F, S, H o D, en la posición de aminoácido 90; (v) D, Q ó E, más preferiblemente D ó Q, incluso más preferiblemente D, en la posición de aminoácido 92; (w) G, N, T ó S, más preferiblemente G, N o T, incluso más preferiblemente G, en la posición de aminoácido 95; (x) T, A, P, F o S, más preferiblemente T, A, P ó F, incluso más preferiblemente F, en la posición de aminoácido 98; (y) R, Q, V, I, M, F, ó L, más preferiblemente R, Q, I, M, F ó L, incluso más preferiblemente Y, incluso más preferiblemente L, en la posición de aminoácido 103; y (z) N, S ó A, más preferiblemente N ó S, incluso más preferiblemente N, en la posición de aminoácido 107.
Adicional o alternativamente, una o más de las siguientes sustituciones se pueden introducir en la región variable de cadena ligera de un inmunoaglutinante de la invención: (aa) Q, D, L, E, S ó I, más preferiblemente L, E, S ó I, incluso más preferiblemente L ó E, en la posición de aminoácido 1; (bb) S, A, Y, I, P ó T, más preferiblemente A, Y, I, P ó T, incluso más preferiblemente P ó T, en la posición de aminoácido 2; (ce) Q, V, T ó I, más preferiblemente V, T ó I, incluso más preferiblemente V ó T, en la posición de aminoácido 3; (dd) V, L, I ó M, más preferiblemente V ó L, en la posición de aminoácido 4; (ee) S, E ó P, más preferiblemente S ó E, incluso más preferiblemente S, en la posición de aminoácido 7; (ff) T ó I, más preferiblemente I, en la posición de aminoácido 10; (gg) A ó V, más preferiblemente A, en la posición de aminoácido 11; (hh) S ó Y, más preferiblemente Y, en la posición de aminoácido 12; (ii) T, S ó A, más preferiblemente T ó S, incluso más preferiblemente T, en la posición de aminoácido 14; (jj) S ó R, más preferiblemente S, en la posición de aminoácido 18; (kk) T ó R, más preferiblemente R, en la posición de aminoácido 20; (11) R ó Q, más preferiblemente Q, en la posición de aminoácido 24; (mm) H ó Q, más preferiblemente H, en la posición de aminoácido 46; (nn) K, R ó I, más preferiblemente R ó I, incluso más preferiblemente R, en la posición de aminoácido 47; (oo) R, Q, K, E, T, ó M, más preferiblemente Q, , E, T ó M, en la posición de aminoácido 50; (pp) K, T, S, N, Q ó P, más preferiblemente T, S, N, Q ó P, en la posición de aminoácido 53; (qq) I ó M, más preferiblemente M, en la posición de aminoácido 56; (rr) H,. S, F ó Y, más preferiblemente H, S ó F, en la posición de aminoácido 57; (ss) I, V ó T, más preferiblemente V ó T, R, incluso más preferiblemente T, en la posición de aminoácido 74; (tt) R, Q ó K, más preferiblemente R ó Q, incluso más preferiblemente R, en la posición de aminoácido 82; (uu) L ó F, más preferiblemente F, en la posición de aminoácido 91; (vv) G, D, T ó A, más preferiblemente G, D o T, incluso más preferiblemente T, en la posición de aminoácido 92; (xx) S ó N, más preferiblemente N, en la posición de aminoácido 94; (yy) F, Y ó S, más preferiblemente Y ó S, incluso más preferiblemente S, en la posición de aminoácido 101; y (zz) D, F, H, E, L, A, T, V, S, G ó I, más preferiblemente H, E, L, A, T, V, S, G ó I, incluso más preferiblemente A ó V, en la posición de aminoácido 103.
En otras modalidades, los inmunoaglutinantes de la invención comprenden una o más de las mutaciones que mejoran la solubilidad y/o estabilidad descritas en la Solicitud Provisional Norteamericana No. 61/075,692, titulada "Solubility Optimization of Immunobinders" , presentada el 25 de Junio de 2008. En ciertas modalidades preferidas, el inmunoaglutinante comprende una mutación que mejora la solubilidad en una posición de aminoácido seleccionada del grupo de posiciones de aminoácidos de cadena pesada que consiste de 12, 103 y 144 (convención de Numeración AHo) . En una modalidad preferida, el inmunoaglutinante comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de: (a) Serina (S) en la posición de aminoácido 12 de cadena pesada; (b) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácido 103 de cadena pesada; y (c) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácido 144 de cadena pesada. En otra modalidad, el inmunoaglutinante comprende las siguientes sustituciones: (a) Serina (S) en la posición de aminoácido 12 de cadena pesada; (b) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácido 103 de cadena pesada; y (c) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácido 144 de cadena pesada .
Como se menciona anteriormente, las combinaciones de las secuencias VL y VH, en particular de aquéllas que tienen el mismo conjunto o esencialmente el mismo conjunto de secuencias CDR aunque diferentes secuencias de estructura por ejemplo debido a la presencia de las sustituciones mencionadas anteriormente, se pueden reordenar y combinar por medio de una secuencia de enlace. Las combinaciones ejemplificantes, sin limitarse a, incluyen: SEC. ID. NO. : 94 EP43 min EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISDWLAWYQQKPGKAP LLIYGASR LASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG FSLSSGAMSWVRQAPGKGLE VSVIISSGATYYASWAKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGPDDSNS GTFDPWGQGTLVTVSS SEC. ID. NO. : 95 EP43max EIVMTQSPSTLSASVGDRVIIKCQASQSISD LA YQQKPGKAPKLLIYGASR LASGFPSRFSGSGSGAEFTLTISGLEPADFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSG FSLSSGAMSWVRQAPGKGLEWVGVIISSGATYYASWAKGRFTISKDTSKNTV YLQMNSLRAEDTAVYYCARGGPDDSNS GTFDPWGQGTLVTVSS SEC. ID. NO. : 96 EP43minmax EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISD LA YQQKPGKAPKLLIYGASR LASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSG FSLSSGA SWVRQAPGKGLE VGVIISSGATYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNS LRAEDTAVYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQGTLVTVSS SEC. ID. NO. : 97 EP43raax DHP EIVMTQSPSTLSASVGDRVIIKCQASQSISD LAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGFPSRFSGSGSGAEFTLTISGLEPADFATYYCQQG SDSYVDNLFGQGTK LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTVSGF SLSSG AMSWVRQAPGKGLEWVGVIISSGATYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMN SLRAEDTATYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQGTSVTVSS SEC. ID. NO. : 98 EP43minmaxDHP EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISD LAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSG A SWVRQAPGKGLEWVGVIISSGATYYAS AKGRFTISKDTSKNTVYLQMN SLRAEDTATYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQGTSVTVSS SEC. ID. NO.: 99 EP43minmax VL: T22K EIV TQSPSTLSASVGDRVIIKCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSG FSLSSGA SWVRQAPGKGLEWVGVI ISSGATYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNS LRAEDTAVYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQGTLVTVSS SEC. ID. NO. : 100 EP43minmax: VL: V58F EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISD LAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGFPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSG A MSWVRQAPGKGLEWVGVIISSGATYYAS AKGRFTISKDTSKNTVYLQMNS LRAEDTAVYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQGTLVTVSS SEC. ID. NO. : 101 EP43rainmax VL: D81A EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISD LAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPADFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSG A MSWVRQAPGKGLEWVGVI ISSGATYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNS LRAEDTAVYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQGTLVTVSS SEC. ID. NO.: 102 EP43minmax VL: Q79E EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLEPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSG A MS VRQAPGKGLE VGVIISSGATYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNS LRAEDTAVYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQGTLVTVSS SEC. ID. NO. : 103 EPlmin EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDA STLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGSGTANGSFGQ GTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA AS GFTFSNDAISWVRQAPGKGLEWVSYISDWSIRYYAN AQGRFTISRDNSKNT LYLQ NSLRAEDTAVYYCAKGAPGAGDNGIWGQGTLVTVSS SEC. ID. NO.: 104 EPlmax EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYLA YQQKPGKAPKLLIYDA STLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGSGTANGSFGQ GTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCT VSGIDLSNDAISWVRQAPGKGLEWVAYISDWSIRYYANWAQGRFTISKDTSK NTVYLQMNSLRAEDTATYYCARGAPGAGDNGIWGQGTTVTVSS SEC. ID. NO.: 105 EPlminmax EIVMTQSPSTLSASVGDRVI ITCQSTESVYKNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDA STLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGSGTANGSFGQ GTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCT VSGIDLSNDAISWVRQAPGKGLEWVAYISDWSIRYYAN AQGRFTISKDTSK NTVYLQMNSLRAEDTATYYCARGAPGAGDNGIWGQGTTVTVSS SEC. ID. NO. : 106 EP6min EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASESIYSGLAWYQQKPGKAPKLLIYQASTL ASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGFGTSNVENPFGQGTKLT VLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSRY GVSWVRQAPGKGLEWVSTIGEAGRAYYANWARSRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYYCAKGEVFNNGWGAFNIWGQGTLVTVSS SEC. ID. NO. : 107 EP6max EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASESIYSGLAWYQQKPGKAPKLLIYQASTL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLAISSLQPDDFATYYCQQGFGTSNVENPFGQGTKL TVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSRYGVSWVRQAPGKGLEWVGTIG EAGRAYYANWARSRSTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGEVFNN GWGAFNI GQGTLVTVSS SEC. ID. NO. : 108 EP6minmax EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASESIYSGLAWYQQKPGKAPKLLIYQASTL ASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGFGTSNVENPFGQGTKLT VLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSRY GVSWVRQAPGKGLEWVGTIGEAGRAYYANWARSRSTISRDTSKNTVYLQM NSLRAEDTAVYYCARGEVFNNGWGAFNIWGQGTLVTVSS SEC. ID. NO. : 109 EP15min EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASENIYTSLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTL ASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGFATSNVENPFGQGT LT VLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRY GVSWVRQAPGKGLEWVSAIGETGRAYYANWAKSRFTISRDNSKNTLYLQ N SLRAEDTAVYYCAKGEEFNNGWGAFNIWGQGTLVTVSS SEC. ID. NO. : 110 EP15max EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASENIYTSLA YQQKPGKAPKLLIYSASTL ASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGFATSNVENPFGQGT LT VLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTVSGFSLSRY GVSWVRQAPGKGLEWVGAIGETGRAYYANWAKSRSTISRDTSKNTVYLQM NSLRAEDTATYYCARGEEFNNGWGAFNIWGQGTTVTVSS SEC. ID. NO.: 111 EP15minmax EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASENIYTSLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTL ASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGFATSNVENPFGQGTKLT VLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTVSGFSLSRY GVSWVRQAPGKGLEWVGAIGETGRAYYANWAKSRSTISRDTSKNTVYLQM NSLRAEDTATYYCARGEEFNNGWGAFNIWGQGTTVTVSS SEC. ID. NO. : 112 EP19minmod EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASDNIYRGLA YQQKPGKAPKLLIYDAST LQSGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCLGVYGYSSDDGAAFGQGT KLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFSLNSNEISWVRQAPGKGLE VSYIGNGGMTHYASWAKGRFTISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSVEYTDLYYLNIWGQGTLVTVSS SEC. ID. NO. : 113 EP19maxmod EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASDNIYRGLA YQQKPGKAPKLLIYDAST LQSGVPSRFSGSGSGTQFTLTISSLQPDDFATYYCLGVYGYSSDDGAAFGQGT KLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS GFSLNSNEISWVRQAPGKGLEWVGYIGNGGMTHYASWAKGRFTISRDTSKN TVYLQMNSLRAEDTAVYYCASSVEYTDLYYLNIWGQGTLVTVSS SEC. ID. NO.: 114 EP34min EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSSQSVYGNIWMA YQQKPGKAPKLLIYQA SKLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGT KLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTISRSY IC VRQAPGKGLEWVSCIYGDNDI PLYANWAKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGYADYAYDLWGQGTLVTVSS SEC. ID. NO.: 115 EP34max EIVMTQSPSTLSASLGDRVIITCQSSQSVYGNIWMA YQQKSGKAPKLLIYQA SKLASGVPSRFSGSGSGAEFSLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGT KLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS GFTISRSYWICWVRQAPGKGLEWVACIYGDNDITPLYAN AKGRFPVSTDTS KNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGYADYAYDLWGQGTLVTVSS SEC. ID. NO. : 116 EP35min EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISNLLA YQQKPGKAPKLLIYAASKL ASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSHTNVDNTFGQGTKL TVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSV GYWICWVRQAPGKGLE VSCIDAGTSGGTYYATWAKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKGVSSNGYYFKL GQGTLVTVSS SEC. ID. NO.: 117 EP35max EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISNLLA YQQKPGKAPKLLIVAASKL ASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQG SHTNVDNTFGQGTKL TVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFSFSVG YWICWVRQAPGKGLEWVACIDAGTSGGTYYATWAKGRFTISKDTSKNTVYL QMNSLRAEDTATYYCARGVSSNGYYFKLWGQGTTVTVSS SEC. ID. NO.: 118 EP35minmax EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISNLLAWYQQKPGKAPKLLIYAASKL ASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQG SHTNVDNTFGQGTKL TVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFSFSVG YWICWVRQAPGKGLEWVACIDAGTSGGTYYATWAKGRFTISKDTSKNTVYL QMNSLRAEDTATYYCARGVSSNGYYFKLWGQGTTVTVSS SEC. ID. NO. : 119 EP42min EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDA STLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGFGTANGSFGQ GTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFRNDAISWVRQAPGKGLEWVSYISD GIKYYASWVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGAPGAGDNGIWGQGTLVTVSS SEC. ID. NO.: 120 EP42max EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDA STLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGFGTANGSFGQ GTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCT VSGIDLRNDAISWVRQAPGKGLEWVSYISDWGIKYYASWVKGRFTISKDTSK NTVYLQ NSLRAEDTATYYCARGAPGAGDNGI GQGTTVTVSS SEC. ID. NO. : 121 EP42minmax EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDA STLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGFGTANGSFGQ GTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCT VSGIDLRNDAISWVRQAPGKGLEWVSYISDWGIKYYASWVKGRFTISKDTSK NTVYLQMNSLRAEDTATYYCARGAPGAGDNGIWGQGTTVTVSS En una modalidad preferida, una secuencia tiene al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad y más preferiblemente 100% de identidad con cualquiera de las secuencias SEC. ID. No. 94-121.
Usos de Anticuerpos anti-TNF Para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos anti-TNF de la invención se administran a un mamífero, preferiblemente un humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable tal como las discutidas anteriormente, incluyendo aquéllas que pueden administrarse a un humano intravenosamente como un bolo o mediante infusión continua durante un período de tiempo, mediante vía intramuscular, intraperitoneal, intra-cerebroespinal, subcutánea, intra-articular , intrasinovial , intratecal, oral, tópica, o por inhalación. Los anticuerpos también se administran de manera adecuada mediante vía intra-tumoral, peri-tumoral, intra-lesiones , o peri-lesiones , para ejercer efectos terapéuticos locales así como sistémicos.
Para la prevención o tratamiento de padecimientos, la dosificación apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de padecimiento a tratar, como se define anteriormente, la severidad y tratamiento en curso del padecimiento, si el anticuerpo se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, historial clínico del paciente y respuesta al anticuerpo, y el buen criterio del médico asistente. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente una sola vez o durante una serie de tratamientos.
Los anticuerpos anti-TNF son útiles en el tratamiento de padecimientos mediados por el TNF. Dependiendo del tipo y severidad del padecimiento, aproximadamente 1 ug/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg (por ejemplo, 0.1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más dosis separadas, o mediante infusión continúa. Una dosificación diaria o semanal típica podría variar desde aproximadamente 1 g/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se repite hasta que ocurra una supresión deseada de los síntomas del padecimiento. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se monitorea fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales, incluyendo, por ejemplo, imágenes radiográficas tumorales.
De acuerdo con otra modalidad de la invención, la efectividad del anticuerpo para prevenir o tratar un padecimiento puede mejorarse administrando el anticuerpo en serie o por partes o en combinación con otro agente que sea efectiva para esos propósitos, tal como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) ácidos o básicos, o factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar las actividades coagulantes del factor de tejido, proteina C, o proteina S (ver Esmon et al., Publicación de Patente PCT No. WO 91/01753, publicada el 21 de Febrero de 1991), un anticuerpo capaz de aglutinarse o unirse al receptor HER2 (ver Hudziak et al., Publicación de Patente PCT No. WO 89/06692, publicada el 27 de Julio de 1989), o uno o más agentes terapéuticos convencionales tales como, por ejemplo, agentes alquilantes, antagonistas de ácido fólico, anti-metabolitos del metabolismo de ácido nucleico, antibióticos, análogos de pirimidina, 5-fluorouracilo, cisplatino, nucleósidos de purina, aminas, aminoácidos, nucleósidos de triazol, o corticosteroides . Tales otros agentes pueden estar presentes en la composición que se administra o pueden administrarse por separado. También, el anticuerpo se administra de manera adecuada por partes o en combinación con tratamientos radiológicos, que impliquen ya sea irradiación o administración de sustancias radiactivas.
Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida tal como resina Sephadex o papel filtro, utilizando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene la proteina TNF (o fragmento de la misma) a purificarse, y después de esto el soporte se lava con un solvente adecuado que removerá sustancialmente todo el material en la muestra excepto la proteina TNF, la cual se une al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente adecuado, tal como amortiguador de glicina, pH 5.0, que liberará la proteina TNF del anticuerpo.
Los anticuerpos anti-TNF pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico de proteina TNF, por ejemplo, detectando su expresión en células especificas, tejidos, o suero. Tales métodos de diagnóstico pueden ser útiles en el diagnóstico de cáncer .
Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo típicamente se etiquetará con una porción o fracción detectable. Hay disponibles numerosas etiquetas las cuales generalmente se pueden agrupar en las siguientes categorías: (a) Radioisótopos, tales como, mIn., 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P ó 35S. El anticuerpo se puede etiquetar con el radioisótopo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, Volúmenes 1 y 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs . (1991), por ejemplo y la radioactividad se puede medir utilizando conteo por centelleo . (b) Etiquetas fluorescentes tales como quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, Lisamina, ficoeritrina y Rojo Texas que están disponibles. Las etiquetas fluorescentes se pueden conjugar con el anticuerpo utilizando las técnicas dadas a conocer en Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo. La fluorescencia se puede cuantificar utilizando un fluorimetro. (c) Varias etiquetas de substrato de enzima están disponibles y la Patente Norteamericana No. 4,275,149 proporciona una revisión de algunas de estas. La enzima generalmente cataliza una alteración química del substrato cromógeno el cual se puede medir utilizando varias técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un substrato, el cual se puede medir espectrofotométricamente . De manera alternativa, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del substrato. Las técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia se describen anteriormente. El substrato quimioluminiscente se excita electrónicamente mediante una reacción química y entonces puede emitir luz la cual se puede medir (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dar energía a un aceptor fluorescente. Los ejemplos de etiquetas enzimáticas incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; Patente Norteamericana No. 4,737,456), luciferina, 2 , 3-dihidroftalazindionas , deshidrogenasa de malato, ureasa, peroxidasa tales como peroxidasa de rábano (HRPO) , fosfatasa alcalina, .beta . -galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacárido (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa) , oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa) , lactoperoxidasa, microperoxidasa, y similares. Se describen técnicas para conjugar enzimas con anticuerpos en O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis) , Academic press, New York, 73:147-166 (1981) . Los ejemplos de combinaciones enzima-substrato incluyen, por ejemplo: (i) Peroxidasa de rábano (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como un substrato, en donde la peroxidasa de hidrógeno oxida un precursor de tinte (por ejemplo, ortofenilen-diamina (OPD) o clorhidrato de 3, 3', 5,5'-tetrametil-bencidina (TMB) ) ; (ii) fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de para-Nitrofenilo como substrato cromógeno; y (iii) . beta . -D-galactosidasa ( . beta . -D-Gal ) con un substrato cromógeno (por ejemplo, P-nitrofenil- .beta . -D-galactosidasa) o substrato fluorógeno 4-metilumbeliferil-. beta . -D-galactosidasa .
Otras numerosas combinaciones enzima-substrato están disponibles para aquellos expertos en la técnica. Para una revisión general de estas, ver las Patentes Norteamericanas Nos. 4,275,149 y 4,318,980. Algunas veces, la etiqueta se conjuga indirectamente con el anticuerpo. El experto en la técnica sabrá de varias técnicas para lograr esto. Por ejemplo, el anticuerpo se puede conjugar con biotina y cualquiera de las tres amplias categorías de etiquetas mencionadas anteriormente se pueden conjugar con avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a la avidina y por consiguiente, la etiqueta se puede conjugar con el anticuerpo de esta manera indirecta. Alternativamente, para lograr una conjugación indirecta de la etiqueta con el anticuerpo, el anticuerpo se conjuga con un pequeño hapteno (por ejemplo digoxina) y uno de los diferentes tipos de etiquetas mencionadas anteriormente se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno (por ejemplo, anticuerpo anti-digoxina) . Por consiguiente, se puede lograr la conjugación indirecta de la etiqueta con el anticuerpo.
En otra modalidad de la invención, el anticuerpo anti-TNF no necesita etiquetarse, y la presencia del mismo se puede detectar utilizando un anticuerpo etiquetado el cual se une al anticuerpo TNF.
Los anticuerpos de la presente invención pueden emplearse en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de aglutinación competitivos, ensayos de captura de doble anticuerpo directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitacion, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques,' pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987) .
Los ensayos > de aglutinación competitiva se valen de la capacidad de un estándar etiquetado para competir con el analito de muestra de análisis para aglutinarse con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de proteína TNF en la muestra de análisis es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se une, los anticuerpos generalmente se insolubilizan antes o después de la competencia o concurrencia, de modo que el estándar y el analito que se unen a los anticuerpos pueden separarse convenientemente del estándar y analito que permanecen sin unir.
Los ensayos de captura de doble anticuerpo involucran el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de aglutinarse a una diferente porción inmunógena, o epítope, de la proteína a detectar. En un ensayo de captura de doble anticuerpo, el analito de la muestra de análisis se une mediante un primer anticuerpo el cual se inmoviliza sobre un soporte sólido, y después de esto un segundo anticuerpo se une al analito, formando así un complejo insoluble de tres partes. Ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana NO. 4,376,110. El segundo anticuerpo por sí mismo puede etiquetarse con una porción o fracción detectable (ensayos de captura de doble anticuerpo directos) o puede medirse utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que se etiqueta con una porción o fracción detectable (ensayo de captura de doble anticuerpo indirecto) . Por ejemplo, un tipo de ensayo de captura de doble anticuerpo es un ensayo ELISA, en cuyo caso la porción detectable es una enzima .
Para inmunohistoquimica, la muestra de tumor puede ser totalmente nueva o congelada o puede incrustarse en parafina y fijarse con un agente conservador tal como formalina, por e emplo .
Los anticuerpos también pueden utilizarse para ensayos de diagnóstico in vivo. Generalmente, el anticuerpo se etiqueta con un radio-núclido (tal como .sup.ulIn., 99Tc, 14C, 1311, 125I, 3H, 32P ó 5S) de modo que el tumor se pueda localizar utilizando inmunocentellografia .
El anticuerpo de la presente invención se puede proporcionar en un kit o equipo, una combinación de reactivos en paquete en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. Cuando el anticuerpo se etiqueta con una enzima, el kit incluirá substratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de substrato el cual proporcione el cromóforo o fluoróforo detectable) . Además, pueden incluirse otros aditivos tales como estabilizadores, amortiguadores (por ejemplo, un tampón de bloque o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos puede variarse ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que sustancialmente optimicen la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proveerse como polvos secos, usualmente liofilizados, incluyendo excipientes que en disolución proporcionen una solución reactiva que tenga la concentración apropiada.
Preparaciones Farmacéuticas En un aspecto la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-TNF para el tratamiento de padecimientos mediados por el TNF. El término "formulación farmacéutica" se refiere a preparaciones que son de tal forma que permiten que la actividad biológica del anticuerpo o derivado de anticuerpo sea inequívocamente efectiva, y que no contengan componentes adicionales que sean tóxicos para los sujetos a los cuales se administraría la formulación. Los excipientes "farmacéuticamente aceptables" (vehículos, aditivos) son aquéllos que se administran de manera razonable a un sujeto mamífero para proporcionar una dosis efectiva del ingrediente activo empleado.
Una formulación "estable" es una en la cual el anticuerpo o derivado de anticuerpo esencialmente conserve su estabilidad física y/o estabilidad química y/o actividad biológica durante su almacenamiento. Varias técnicas analíticas para medir la estabilidad de la proteína están disponibles en la técnica y se revisan en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., arcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993), por ejemplo. La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada para un periodo de tiempo seleccionado. Preferiblemente, la formulación es estable a temperatura ambiente (aproximadamente 30°C) ó a 40°C durante al menos 1 mes y/o estable aproximadamente a 2-8 °C durante al menos 1 año para al menos 2 años. Además, la formulación preferiblemente es estable después del congelamiento (a, por ejemplo, -70°C) y descongelamiento de la formulación.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo "conserva su estabilidad física" en una formulación farmacéutica si el mismo no muestra señales de agregación, precipitación y/o desnaturalización durante un examen visual de color y/o claridad, o cuando se mide mediante dispersión de luz UV o mediante cromatografía de exclusión.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo "conserva su estabilidad química" en una formulación farmacéutica, si la estabilidad química en un momento dado, es tal que se considere que la proteína todavía conserva su actividad biológica como se define más adelante. La estabilidad química se puede evaluar detectando y cuantificando formas químicamente alteradas de la proteína. La alteración química puede involucrar modificación de tamaño (por ejemplo, recorte) la cual se puede evaluar utilizando cromatografía de exclusión, SDS-PAGE y/o ionización de desorción con láser asistido con matriz/espectrometria de masa de tiempo de vuelo (MALDI/TOF MS), por ejemplo. Otros tipos de alteración química incluyen alteración de carga (por ejemplo que ocurre como resultado de la desamidación) la cual se puede evaluar mediante cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo "conserva su actividad biológica" en una formulación farmacéutica, si la actividad biológica del anticuerpo en un momento dado está dentro de aproximadamente 10% (dentro de los errores del ensayo) de la actividad biológica exhibida en el momento que se preparó la formulación farmacéutica como se determina en un ensayo de aglutinación de antígenos, por ejemplo. Otros ensayos de "actividad biológica" para anticuerpos se elaboran en la presente más adelante.
Por "isotónica" se entiende que la formulación de interés esencialmente tiene la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas generalmente tendrán una presión osmótica desde aproximadamente 250 hasta 350 mOsm. La isotonicidad se puede medir utilizando una presión de vapor u osmómetro de tipo congelación en hielo, por ejemplo.
Un "poliol" es una sustancia con múltiples grupos hidroxilo, e incluye azucares (azucares reductoras y no reductoras), alcoholes de azúcar y azúcares ácidas. Los polioles preferidos en la presente tienen un peso molecular que es menor de aproximadamente 600 kD (por ejemplo en el rango desde aproximadamente 120 hasta aproximadamente 400 kD) . Una "azúcar reductora" es una que contiene un grupo semiacetal que puede reducir iones metálicos o hacer reacción covalentemente con lisina y otros grupos amino en proteínas y una "azúcar no reductora" es una que no tiene estas propiedades de una azúcar reductora. Los ejemplos de azucares reductoras son fructosa, mañosa, maltosa, lactosa, arabinosa, xilosa, ribosa, ramnosa, galactosa y glucosa. Las azúcares no reductoras incluyen sacarosa, trehalosa, sorbosa, melecitosa y rafinosa. El manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol y glicerol son ejemplos de alcoholes de azúcar. En lo que se refiere a azúcares ácidas, estas incluyen L-gluconato y sales metálicas del mismo. Cuando se desea que la formulación sea estable en congelación-descongelación, el poliol preferiblemente es uno que no se cristalice a temperaturas de congelación (por ejemplo -20°C) de tal manera que el mismo desestabilice el anticuerpo en la formulación. Las azúcares no reductoras tales como sacarosa y trehalosa son los polioles preferidos en la presente, prefiriéndose la trehalosa por encima de la sacarosa, debido a la estabilidad superior en solución de la trehalosa.
Cuando se utiliza en la presente, "amortiguador" se refiere a una solución amortiguada que resiste cambios en el pH por la acción de sus componentes de conjugado de ácido-base. El amortiguador de esta invención tiene un pH en el rango desde aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 6.0; de manera preferible desde aproximadamente 4.8 hasta aproximadamente 5.5; y de manera preferible tiene un pH de aproximadamente 5.0. Los ejemplos de amortiguadores que controlarán el pH en este rango incluyen acetato (por ejemplo acetato de sodio) , succinato (tal como succinato de sodio) , gluconato, histidina, citrato y otros amortiguadores de ácido orgánico. Cuando se desea una formulación estable en congelación-descongelación, el amortiguador preferiblemente no es fosfato.
En un sentido farmacológico, en el contexto de la presente invención, una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo o derivado de anticuerpo se refiere a una cantidad efectiva en la prevención o tratamiento de un desorden para cuyo tratamiento el anticuerpo o derivado dominio es efectivo. Un "padecimiento/desorden es cualquier condición que pudiera beneficiarse del tratamiento con el anticuerpo o derivado de anticuerpo. Esto incluye desórdenes o padecimientos crónicos y agudos que incluyen aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero al desorden en cuestión.
Un "agente conservador" es un compuesto que se puede incluir en la formulación para reducir esencialmente la acción bacteriana en la misma, facilitando así la producción de una formulación de usos múltiples, por ejemplo. Los ejemplos de agentes conservadores potenciales incluyen cloruro de octadecildimetilbencil-amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en la cual los grupos alquilo son compuestos de cadena larga), y cloruro bencetonio. Otros tipos de agentes conservadores incluyen alcoholes aromáticos tales como fenol, alcohol de butilo y bencilo, parabenos de alquilo tales como parabeno de metilo o propilo, catecol, resorcinol, ciclohexanol , 3-pentanol, y m-cresol. El agente conservador más preferido en la presente es el alcohol de bencilo.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más compuestos . de anticuerpos o derivados de anticuerpos, junto con al menos un portador fisiológicamente aceptable o excipiente. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, uno o más de agua, amortiguadores (por ejemplo, solución salina amortiguada neutral o solución salina amortiguada con fosfato) , etanol, aceite mineral, aceite vegetal, dimetilsulfóxido, carbohidratos (por ejemplo, glucosa, mañosa, sacarosa o dextranos) , manitol, proteínas, adyuvantes, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, agentes quelantes, tales como EDTA o glutationa y/o agentes conservadores. Como se indica anteriormente, otros ingredientes activos (aunque no necesariamente) pueden incluirse en las composiciones farmacéuticas provistas en la presente .
Un portador es una sustancia que puede asociarse con un anticuerpo o derivado de anticuerpo antes de su administración a un paciente, frecuentemente con el propósito de controlar la estabilidad y biodisponibilidad del compuesto. Los portadores para usarse dentro de tales formulaciones generalmente son biocompatibles, y también pueden ser biodegradables . Los portadores incluyen, por ejemplo, moléculas monovalentes o multivalentes tales como albúmina de suero (por ejemplo, humano o bovino) , albúmina de huevo, péptidos, polilisina y polisacáridos tales como aminodextrano y poliamidoaminas . Los portadores también incluyen materiales de soporte sólidos tales como perlas y microparticulas que comprenden, por ejemplo, poliglicolato de polilactato, poli ( láctida-co-glicólido) , poliacrilato, látex, almidón, celulosa o dextrano. Un portador puede llevar los compuestos en una variedad de formas, que incluyen unión covalente (ya sea directamente o a través de un grupo de enlace) , interacción o mezcla no covalente .
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para cualquier manera apropiada de administración, que incluye, por ejemplo, administración tópica, oral, nasal, rectal o parenteral. En ciertas modalidades, se prefieren composiciones en una forma adecuada para uso oral. Tales formas incluyen, por ejemplo, pildoras, tabletas, comprimidos, grageas, suspensiones acuosas u oleaginosas, polvos o gránulos dispersables, emulsión, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. Dentro de aún otras modalidades, las composiciones provistas en la presente pueden formularse como un liofilizado. El término parenteral que se utiliza en la presente incluye inyección subcutánea, intradérmica, intravascular (por ejemplo, intravenosa) , intramuscular, espinal, intracraneal, intratecal e intraperitoneal, asi como cualquier inyección similar o técnica de infusión.
Las composiciones previstas para uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y pueden contener uno o más agentes, tales como agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes, y agentes conservadores con el fin de proporcionar preparaciones agradables y apetecibles. Las tabletas contienen el ingrediente activo en combinación con excipientes fisiológicamente aceptables que son adecuados para la fabricación de tabletas. Tales excipientes incluyen, por ejemplo, diluyentes inertes (por ejemplo, carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio) , agentes de granulación y desintegración (por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico) , agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón, gelatina o acacia) y agentes lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco) .
Las tabletas pueden ser no recubiertas o las mismas pueden recubrirse mediante técnicas conocidas para retardar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y por lo tanto proporcionar una acción sostenida durante un periodo más prolongado. Por ejemplo, puede emplearse un material de tiempo de retardo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.
Las formulaciones para uso oral también pueden presentarse como cápsulas de gelatina dura en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte (por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín) , o como cápsulas de gelatina blanda en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleaginoso (por ejemplo, aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de olivo) . Las suspensiones acuosas contienen el anticuerpo o derivado de anticuerpo en combinación con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Tales excipientes incluyen agentes de suspensión (por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidropropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma acacia) ; y agentes de dispersión y humectación (por ejemplo, fosfátidos de origen natural tales como lecitina, productos de condensación de óxido de alquileno con ácidos grasos tales como estearato de polioxietileno, productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga tales como heptadecaetilenoxicetanol, productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos con un hexitol tal como monooleato de polioxietilen-sorbitol , o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol tales como monooleato de polietilen-sorbitán) . Las suspensiones acuosas también pueden comprender uno o más agentes conservadores, por ejemplo p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes , y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina. Los jarabes y elixires pueden formularse con agentes edulcorantes, tales como glicerol, propilenglicol, sorbitol, o sacarosa. Tales formulaciones también pueden comprender uno o más demulcentes, agentes conservadores, agentes saborizantes, y/o agentes colorantes.
Las suspensiones oleaginosas pueden formularse suspendiendo los ingredientes activos en un aceite vegetal (por ejemplo, aceite de maní, aceite de olivo, aceite de sésamo, aceite de coco) o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleaginosas pueden contener un agente espesante tal como cera de abejas, parafina dura, o alcohol cetílico. Pueden agregarse agentes edulcorantes, tales como los establecidos anteriormente, y/o agentes saborizantes para proporcionar preparaciones orales apetecibles. Tales suspensiones pueden preservarse mediante la adición de un anti-oxidante tal como ácido ascórbico.
Los polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el ingrediente activo en combinación con un agente de dispersión o humectación, agente de suspensión y uno o más agentes conservadores. Los agentes adecuados de dispersión o humectación y los agentes de suspensión se ejemplifican por aquéllos ya mencionados anteriormente. Los excipientes adicionales, por ejemplo agentes edulcorantes, saborizantes y colorantes, también pueden estar presentes.
Las composiciones farmacéuticas también pueden estar en la forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleaginosa puede ser un aceite vegetal (por ejemplo, aceite de olivo o aceite de maní), un aceite mineral (por ejemplo, parafina líquida), o una mezcla de los mismos. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen gomas de origen natural (por ejemplo, goma acacia o goma tragacanto) , fosfátidos de origen natural (por ejemplo, soya, lecitina, y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol) , anhídridos (por ejemplo, monooleato de sorbitán) , y productos de condensación de ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol con óxido de etileno (por ejemplo, monooleato de polioxietilen-sorbitán) . Una emulsión también puede comprender uno o más agentes edulcorantes y/o saborizantes.
La composición farmacéutica puede prepararse como una suspensión acuosa u oleaginosa, inyectable, estéril, en la cual el modulador, dependiendo del vehículo y concentración utilizados, se. suspende o disuelve en el vehículo. Tal composición puede formularse de acuerdo con la técnica conocida utilizando agentes de dispersión, humectación y/o agentes de suspensión adecuados tales como aquéllos mencionados anteriormente. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden emplearse están el agua, 1, 3-butandiol, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, pueden emplearse aceites fijos, estériles, como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito puede emplearse cualquier aceité fijo blando, incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Además, pueden utilizarse ácidos grasos tales como ácido oleico en la preparación de composiciones inyectables, y los adyuvantes tales como anestésicos locales, agentes conservadores y/o agentes amortiguadores se pueden disolver en el vehículo.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse como formulaciones de liberación sostenida (es decir, una formulación tal como una cápsula que realice una liberación lenta del modulador después de la administración) . Tales formulaciones generalmente pueden prepararse utilizando tecnología bien conocida y administrarse mediante, por ejemplo, implantación oral, rectal, o subcutánea, o mediante implantación en el sitio objetivo deseado. Los portadores para usarse dentro de tales formulaciones son biocompatibles , y también pueden ser biodegradables; preferiblemente la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación de modulador. La cantidad de un anticuerpo o derivado de anticuerpo contenido dentro de una formulación de liberación sostenida depende de, por ejemplo, el sitio de implantación, la velocidad y duración esperada de liberación y la naturaleza del padecimiento/desorden a tratarse o prevenirse .
El anticuerpo o derivados de anticuerpos provistos en la presente generalmente se administran en una cantidad que logra una concentración en un fluido corporal (por ejemplo, sangre, plasma, suero, CSF (liquido cefalorraquídeo), fluido sinovial, linfa, fluido intersticial celular, lagrimas u orina) que sea suficiente para unirse detectablemente al TNF y prevenir o inhibir los padecimientos/desórdenes mediados por el TNF. Se considera que una dosis es efectiva si da como resultado un beneficio discernible al paciente como se describe en la presente. Las dosis sistémicas preferidas varían desde aproximadamente 0.1 mg hasta aproximadamente 140 mg por kilogramo de peso corporal por día (aproximadamente 0.5 mg hasta aproximadamente 7 g por paciente por día) , con dosis orales que por lo general son aproximadamente 5-20 veces más altas que las dosis intravenosas. La cantidad de anticuerpo o derivado de anticuerpo que puede combinarse con los materiales portadores para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del huésped tratado y el modo particular de administración. Las formas unitarias de dosificación generalmente contendrán entre aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 500 mg de un ingrediente activo.
Las composiciones farmacéuticas pueden empacarse para tratar condiciones sensibles a un anticuerpo o derivado de anticuerpo dirigidas al TNF. Las composiciones farmacéuticas en paquete pueden incluir un contenedor que contenga una cantidad efectiva de al menos un anticuerpo o derivado de anticuerpo como se describe en la presente e instrucciones (por ejemplo, etiquetado) que indique que la composición contenida es para utilizarse en el tratamiento de un padecimiento/desorden sensible a un anticuerpo o derivado de anticuerpo después de su administración en el paciente.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpos de la presente invención también pueden se modificar químicamente. Los grupos modificadores preferidos son polímeros, por ejemplo un polialqueno de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituido, polialquenileno, o polímero de polioxialquileno o un polisacárido ramificado o no ramificado. Tal grupo efector puede incrementar la vida media del anticuerpo in vivo. Los ejemplos particulares de polímeros sintéticos incluyen poli (etilenglicol ) (PEG) de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituido, poli (propilenglicol ) , poli (vinilalcohol) o derivados de los mismos. Los polímeros de origen natural particulares incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glicógeno o derivados de los mismos. El tamaño del polímero puede variarse según se desee, aunque generalmente estará en un rango de peso molecular promedio de 500 Da a 50000 Da. Para aplicación local cuando el anticuerpo se diseña para penetrar el tejido, un peso molecular preferido del polímero es de alrededor de 5000 Da. La molécula del polímero se puede anexar al anticuerpo, en particular al extremo C-terminal de la cadena pesada del fragmento Fab a través de un péptido articular enlazado covalentemente como se describe en WO1094585. Con respecto al anexo de porciones de PEG, se hace referencia a "Poly (ethyleneglycol ) Chemistry, Biotechnological and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed) , Plenum Press, New York y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, New York.
Después de la preparación del anticuerpo o derivado de anticuerpo de interés como se describe anteriormente, se prepara la formulación farmacéutica que comprende el mismo. El anticuerpo que se formula no se ha sometido a liofilización previa y la formulación de interés de la presente es una formulación acuosa. Preferiblemente el anticuerpo o derivado de anticuerpo en la formulación es un fragmento de anticuerpo, tal como un scFv. La cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpo presente en la formulación se determina tomando en cuenta los volúmenes de dosis y modo(s) de administración deseados, por ejemplo. Desde aproximadamente 0.1 mg/ml hasta aproximadamente 50 mg/ml, de manera preferible desde aproximadamente 0.5 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml y de manera preferible desde aproximadamente 2 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml es una concentración de anticuerpo ejemplificante en la formulación.
Se prepara una formulación acuosa que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo en una solución con pH amortiguado. El amortiguador de esta invención tiene un pH en el rango desde aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 6.0, de manera preferible desde aproximadamente 4.8 hasta aproximadamente 5.5, y de manera más preferible tiene un pH de aproximadamente 5.0. Los ejemplos de amortiguadores que controlarán el pH dentro de este rango incluyen acetato (por ejemplo acetato de sodio) , succinato (tal como succinato de sodio) , histidina de gluconato, citrato y otros amortiguadores de ácido orgánico. La concentración de amortiguador puede ser desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM, de manera preferible desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 30 mM, dependiendo, por ejemplo, del amortiguador y la isotonicidad deseada de la formulación. El amortiguador preferido es acetato de sodio (aproximadamente 10 mM) , pH 5.0.
Un poliol, que actúa como un agente de tonificacion y que puede estabilizar el anticuerpo, se incluye en la formulación. En modalidades preferidas, la formulación no contiene una cantidad tonificante de una sal tal como cloruro de sodio, ya que esto puede causar que el anticuerpo o derivado de anticuerpo se precipite y/o puede dar como resultado la oxidación a un pH bajo. En modalidades preferidas, el poliol es una azúcar no reductora, tal como sacarosa o trehalosa. El poliol se agrega a la formulación en una cantidad que puede variar con respecto a la isotonicidad deseada de la formulación. Preferiblemente la formulación acuosa es isotónica, en cuyo caso las concentraciones adecuadas del poliol en la formulación están en el rango desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 15% p/v, de manera preferible en el rango de aproximadamente 2% hasta aproximadamente 10% p/v, por ejemplo. Sin embargo, también pueden ser adecuadas formulaciones hipertónicas o hipotónicas. La cantidad de poliol agregada también se puede alterar con respecto al peso molecular del poliol. Por ejemplo, puede agregarse una cantidad más baja de un monosacárido (por ejemplo manitol) , en comparación con un disacárido (tal como trehalosa) .
También se agrega un surfactante a la formulación de anticuerpo o derivado de anticuerpo. Los surfactantes ejemplificantes incluyen surfactantes no iónicos tales como polisorbatos (por ejemplo polisorbatos 20, 80 etc.) o poloxámeros (por ejemplo poloxámero 188). La cantidad de surfactante agregado es tal que la misma reduzca la agregación del anticuerpo/derivado de anticuerpo formulado y/o minimiza la formación de partículas en la formulación y/o reduzca la adsorción. Por ejemplo, el surfactante puede estar presente en la formulación en una cantidad desde aproximadamente 0.001% hasta aproximadamente 0.5%, de manera preferible desde aproximadamente 0.005% hasta aproximadamente 0.2% y de manera más preferible desde aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 0.1%.
En una modalidad, la formulación contiene los agentes anteriormente identificados (es decir anticuerpo o derivado de anticuerpo, amortiguador, poliol y surfactante) y esencialmente está libre de uno o más agentes conservadores, tales como alcohol de bencilo, fenol, m-cresol, clorobutanol y Cl de bencetonio. En otra modalidad, puede incluirse un agente conservador en la formulación, particularmente donde la formulación es una formulación de dosis múltiples. La concentración de agente conservador puede estar en el rango desde aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 2%, de manera más preferible desde aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 1%. Uno o más de otros portadores farmacéuticamente aceptables, excipientes o estabilizadores tales como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 21st edition, Osol, A. Ed. (2006), pueden incluirse en la formulación siempre y cuando los mismos no afecten adversamente las características deseadas de la formulación. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores o destinatarios a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen; agentes amortiguadores adicionales; co-solventes ; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; agentes de quelación tales como EDTA; complejos de metal (por ejemplo complejos de proteína de Zn) ; polímeros biodegradables tales como poliésteres; y/o contraiones formadores de sales tales como sodio .
Las formulaciones a utilizarse para administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de, o después de, la preparación de la formulación.
La formulación se administra a un mamífero en necesidad de tratamiento con el anticuerpo, preferiblemente un humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa como un bolo o mediante infusión continua durante un período de tiempo, mediante vía intramuscular, intraperitoneal, intra-cerebroespinal , subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o inhalación. En modalidades preferidas, la formulación se administra al mamífero mediante administración intravenosa. Para tales propósitos, la formulación puede inyectarse utilizando una jeringa o mediante una línea IV (intravenosa) , por ejemplo.
La dosificación apropiada ("cantidad terapéuticamente efectiva") del anticuerpo dependerá, por ejemplo, de la condición a tratar, la severidad y tratamiento en curso de la condición, si el anticuerpo se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del paciente y respuesta al anticuerpo, el tipo de anticuerpo utilizado, y el buen criterio del médico asistente. El anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra de manera adecuada al paciente una sola vez o durante una serie de tratamientos y puede administrarse al paciente en cualquier momento desde el diagnóstico hacia adelante. El anticuerpo o derivado de anticuerpo puede administrarse como un tratamiento único o en conjunción con otros fármacos o terapias útiles en el tratamiento de la condición en cuestión.
Como una propuesta general, la cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o derivado de anticuerpo administrado estará en el rango desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal del paciente ya sea mediante una o más administraciones, con el rango típico de anticuerpo utilizado que es desde aproximadamente 0.3 hasta aproximadamente 20 mg/kg, de manera más preferible desde aproximadamente 0.3 hasta aproximadamente 15 mg/kg, administrados diariamente, por ejemplo. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se monitorea fácilmente mediante técnicas convencionales .
Artículos de Fabricación En otra modalidad de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que comprende un contenedor que contiene la formulación farmacéutica de la presente invención, preferiblemente una formulación farmacéutica acuosa, y opcionalmente proporciona instrucciones para su uso. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales y jeringas. El contenedor puede formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. Un contenedor ejemplificante es un vial de vidrio de un sólo uso de 3-20 ce. Alternativamente, para una formulación de dosis múltiples, el contenedor puede ser un vial de vidrio de 3-100 ce. El contenedor contiene la formulación y la etiqueta sobre, o unida con, el contenedor puede indicar instrucciones de uso. El artículo de fabricación puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y para el usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, y prospectos o folletos informativos con instrucciones de uso.
Ejemplificaci?? La presente descripción se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, los cuales no deberán interpretarse como limitantes adicionales. El contenido de todas las figuras y todas las referencias, patentes y publicaciones de patente publicadas citadas en toda esta solicitud se incorporan expresamente en la presente como referencia en su totalidad.
En todos los ejemplos, se utilizaron los siguientes materiales y métodos a menos que se establezca de otra manera. Materiales y Métodos Generales En general, la práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de anticuerpos) , y técnicas estándar de preparación de polipéptidos . Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology) , 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); y Current Protocols in Molecular Biology, eds . Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992) .
Mediciones de termoestabilidad Se obtuvieron espectros IR con transformada de Fourier de reflectancia total atenuada (FTIR-ATR) de varias cadena únicas y siguiendo la trayectoria de las moléculas utilizando la célula FT-IR Bio-ATR en un Tensor Bruker. Las moléculas se concentraron hasta 3 mg/ml y se dializaron toda la noche a 4°C contra PBS, pH 6.5 y el flujo directo del amortiguador se recolectó como un ensayo en blanco. Los perfiles de desnaturalización se obtuvieron provocando térmicamente las moléculas con un amplio rango de temperatura en etapas de 5°C (25 a 95°C) . Todas las manipulaciones en los espectros se realizaron utilizando el programa informático OPUS. El principal amortiguador y el trasfondo atmosférico transitorio (C02 y H20) se substrajeron del espectro proteico. El espectro proteico resultante fue entonces la linea base corregida y los espectros proteicos de amida I se determinaron a partir de la amplitud del pico resoluble más amplio en la región esperada. Se obtuvieron espectros de derivada segunda para los espectros de banda de amida I utilizando una función de polinomios de tercer grado con una función de estandarización. Los cambios en la estructura proteica se estimaron mediante un análisis de derivada segunda de amida I utilizando una curva de calibración lineal para los cálculos iniciales de ajustamiento de curvas suponiendo un 0% de desnaturalización para las 3 mediciones más bajas y 100% de desnaturalización para las 3 mediciones más altas. Los perfiles de desnaturalización se utilizaron para aproximar los puntos medios de las transiciones de desdoblamiento térmico (TM) para cada variante que aplica el modelo sigmoideo Boltzmann.
Mediciones de solubilidad La solubilidad relativa de varias moléculas scFv se midió después de mejorar la agregación y precipitación proteica en presencia de sulfato de amonio. Se agregó sulfato de amonio a la proteina en soluciones acuosas para dar incrementos del 5% de saturación en la proteina de sal de la mezcla final. La precipitación en el rango dinámico se determinó empíricamente y los intervalos de saturación se redujeron en este rango a 2.5% de intervalos de saturación en la mezcla final. Después de la adición del sulfato de amonio, las muestras se mezclaron cuidadosamente y se centrifugaron 30 minutos a 6000 rpm. La proteína remanente en los sobrenadantes se recuperó para cada porcentaje de saturación de sulfato de amonio. Las curvas de solubilidad se determinaron midiendo la concentración proteica en el sobrenadante utilizando el Espectrofómetro NanoDropTM 1000. Las mediciones de proteína soluble remanente se normalizaron y utilizaron para estimar los puntos medios de estabilidad relativa para cada variante que aplica el modelo sigmoideo Boltzmann.
Análisis de Estabilidad a Corto Plazo Se examinaron los agregados solubles y productos de degradación de la proteina después de dos semanas de incubación a 40°C. Las proteínas con una concentración de 10 mg/ml se dializaron toda la noche a 4°C contra PBS con un amplio rango de pHs (3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.0, 7.5 y 8.5) . La proteína de control con la misma concentración en PBS amortiguador estándar (pH 6.5) se almacenó a -80°C durante el período de 2 semanas. La determinación de bandas de degradación mediante SDS-PAGE se hizo en puntos de tiempo de t=0 y t=14d y los agregados solubles se evaluaron en la SEC-HPLC. La determinación de la actividad remanente después de 2 semanas a 40°C se hizo utilizando Biacore.
Ensayo de potencia La actividad neutralizante de los aglutinantes anti-TNFa se evaluó en un ensayo L929 de citotoxidad mediada por TNFa . La toxicidad de células de fibroblastos Ratón L929, tratadas con Actinomicina , se indujo con TNF humano recombinante (hTNF) . Se determinó que el 90% de citotoxidad máxima inducida por hTNF está a una concentración de TNF de 1000 pg/ml. Todas las células L929 se cultivaron en RPMI 1640 con rojo de fenol, con medio de L-Glutamina suplementado con suero de ternera fetal (10% v/v) . La actividad neutralizante de los aglutinantes anti-TNFa se evaluó en RPMI 1640 sin rojo de fenol y 5% de suero de ternera fetal. Se agregaron diferentes concentraciones (0 - 374 ng/mL) de aglutinantes anti-TNF a células L929 en presencia de hTNF de 1000 pg/ml con el fin de determinar la concentración a la cual el efecto antagónico alcanza una inhibición media-máxima (EC50%) . La curva de dosis-respuesta o respuesta a una dosis dada se ajustó con regresión sigmoidea no lineal con pendiente variable y se calculó la EC50.
Análisis de aglutinación Biacore de scFvs anti-TNF Para mediciones de afinidad de aglutinación a pH 5 y pH 7,4 (datos no mostrados), se emplearon mediciones de resonancia con Plasmón superficial con BIAcore™-T100 , utilizando un chip sensor NTA y TNF marcado con His (producido en ESBATech) . La superficie del chip sensor NTA consiste de una matriz de dextrano carboximetilado pre-inmovilizada con ácido nitrilotriacético (NTA) para la captura de moléculas marcadas con histidina a través de quelación NÍ2+NTA. Los trímeros N-his de TNFa humano (5 nM) son capturados mediante el níquel a través de sus marcas de his N-terminales y se inyecta ESBA105 (analito) a diversas concentraciones que varían de 30 nM a 0.014 nM en etapas de dilución en series de 3. En la etapa de regeneración, el complejo se formó mediante níquel, el ligando y analito se lavaron. Esto permite el uso de las mismas condiciones de regeneración para diferentes muestras. La señal de respuesta se genera mediante tecnología de resonancia con Plasmón superficial (SPR) y se midió en unidades de resonancia (RU) . Todas las mediciones se realizan a 25°C. Se generaron sensogramas para cada muestra de scFv anti-TNF después de una corrección de células de referencia en linea seguida por una substracción de muestra de amortiguador. La constante de relación de disociación aparente (kd), la constante de relación de asociación aparente (ka) y la constante de equilibrio de disociación aparente (KD) , se calcularon utilizando el modelo de aglutinación uno a uno de Langmuir con el programa información de evaluación BIAcore T100 versión 1.1.
Ejemplo 1: Injerto de CDR y Humanización Funcional de anticuerpos anti-TNF de conejo monoclonal Injerto de CDRs de Conejo A diferencia de los métodos de humanización tradicionales que emplean la estructura aceptora de anticuerpos humanos que comparte la homología de secuencia más grande con el anticuerpo donador no humano, las CDRs de conejo se injertaron ya sea en la estructura FW1. (SEC. ID. Nos. 1 y 2, enlazadas mediante un enlace (GGGGS)^) para generar un injerto Min o en la estructura "transformada en estructura conejo" rFW1.4 (SEC. ID. No. 92) o su variante rF 1.4(v2) (SEC. ID. No. 93) para generar un injerto Max. Ambas estructuras se seleccionaron principalmente por sus propiedades funcionales deseables (solubilidad y estabilidad) , estabilidad estructural para incorporar una gran variedad de CDRs de conejo y homología razonable con la secuencia de consenso de dominio variable de conejo. La estructura rFWl .4 es un derivado de FW1. que se diseño además con el propósito de servir como una estructura aceptora universal para virtualmente cualquier conjunto de CDRs de conejo. Aunque la secuencia FW1. de la estructura estable y soluble exhibe homología elevada con los anticuerpos de conejo, la misma no es la secuencia más homologa disponible .
Identificación de residuos potencialmente involucrados en la aglutinación Para cada secuencia de dominio variable de conejo, se identificó la contraparte germinal de conejo más cercana. Si la línea germinal más cercana no pudiera establecerse, la secuencia se comparó contra el consenso del subgrupo o el consenso de secuencias de conejo con un alto porcentaje de similaridad. Los residuos raros de la estructura se consideraron como un posible resultado de una hipermutación somática y por lo tanto juegan un papel en la aglutinación de antígenos. Consecuentemente, tales residuos se consideraron para su injerto en la estructura aceptora rFWl.4 ó rFW1.4(v2) para generar injertos Max. Particularmente, se injertaron residuos potencialmente implicados en el contacto directo de antígenos o que influencian la disposición de VL y VH. Los residuos adicionales descritos por influenciar la estructura de la CDR se sustituyeron si fue necesario. No se hicieron sustituciones de la estructura cuando se injertaron CDRs en FW1. (injertos Min) . Los ejemplos de posiciones de la estructura que se injertaron para obtener los injertos Max como se da a conocer en la presente se pueden identificar haciendo una alineación de secuencia de las regiones de estructura de rFW1.4, rFW1.4(v2) y las secuencias scFv de interés provistas en la presente. Por ejemplo se pueden utilizar herramientas de internet que son conocidas en la técnica para dicho propósito (por ejemplo Clustal que está disponible el 23 de Junio de 2009 en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html ó MultíAlin que está disponible el 23 de Junio de 2009 http://bioinfo.genotoul.fr/multalin). Todas las posiciones de estructura en las cuales rFWl.4 y rF 1.4(v2) contienen el mismo residuo y en las cuales el scFv de interés revela un residuo diferente, son posiciones de estructura que se injertaron para obtener los injertos Max.
Reordenación de dominios Las cadenas ligeras variables de injertos Min se combinaron con injertos Max de cadena pesada variable para identificar combinaciones óptimas en términos de propiedades biofísicas (solubilidad y estabilidad) y actividad.
Clonación y expresión de scFvs Los siguientes scFvs descritos y caracterizados en la presente se produjeron como sigue. Las secuencias VL humanizadas y las secuencias VH humanizadas (SEC. ID. NOs . : 51-88, sin la SEC. ID. NO.: 72) se conectaron a través del enlace de la SEC. ID. NO.: 72 para dar un scFv de la siguiente orientación: NH2-VL-enlace-VH-COOH (ver por ejemplo SEC. ID. NOs . : 94-121). En muchos casos las secuencias de ADN que codifican los diversos scFvs se sintetizaron de novo en el proveedor de servicios Entelechon GmbH (www.entelechon.com). Los insertos de ADN resultantes se clonaron en el vector de expresión bacteriano pGMP002 a través de sitios de restricción Ncol y HindIII introducido en el extremo 5' y 3' de la secuencia de ADN del scFv, respectivamente. Entre la secuencia de ADN del dominio VL y el dominio VH, está localizado un sitio de restricción BamHI. En algunos casos el ADN que codifica el scFv se sintetizó de novo, aunque los constructos de expresión de scFv se clonaron mediante reordenación de dominios. De acuerdo con esto, los dominios VL se cortaron e introdujeron en los nuevos constructos a través de sitios de restricción Ncol y BamHI, los dominios VH a través de los sitios de restricción BamHI y HindIII. En otros casos, se introdujeron mutaciones puntuales en el dominio VH y/o VL utilizando métodos PCR de ensamblado del estado de la técnica. La clonación de GMP002 se describe en el Ejemplo 1 de WO2008006235. La producción de los scFvs se hizo de manera análoga al ESBA105 como se describe en el Ejemplo 1 de O2008006235.
Ejemplo 2 : Descripción del Perfil y Selección de Anticuerpos Donadores de CDR de Conejo El procedimiento experimental general que se siguió para la selección de anticuerpos de Conejo ("RabMabs") con actividad inhibidora del TNF es como sigue: Los anticuerpos de conejo se emplearon como anticuerpos donadores para CDRs en la generación de inmunoaglutinantes de TN F altamente solubles. Los conejos se inmunizaron con TNFOÍ antes de la esplenectomia . Se aislaron los esplenocitos de los conejos para la generación de hibridomas. Un total de 44 hibridomas se aislaron y se describieron los perfiles de afinidad de unión, potencia biológica, y especificidad de los sobrenadantes de estos hibridomas .
La Figura 1 representa la capacidad relativa de los sobrenadantes de los 44 hibridomas RabMab anti-TNF para la neutralización del TNFOÍ in vivo. La neutralización se analizó midiendo la inhibición de la citotoxicidad del TNF en fibroblastos L929 de ratón, cultivados. Los sobrenadantes exhiben diferentes eficacias en el ensayo L929. Los valores EC50 (concentración efectiva para lograr 50% de inhibición) se determinaron en una selección primaria (barras azules) y secundarias (barras rojas) y se normalizaron con respecto al mayor rendimiento en cada ensayo. La afinidad de aglutinación del TN F también se midió mediante análisis BIACore para cada RabMab (barras verdes) .
Los RabMabs codificados por cada hibridoma también se secuenciaron y las secuencias se sometieron a análisis filogenético en base a la predicción de los agrupamientos de epitopes. Cuatro Rabmabs representativos (EPI-6, EPI-19, EPI-34, y EPI-43) con alta actividad aglutinante y potente actividad neutralizante, se seleccionaron de entre diferentes familias filogenéticas como anticuerpos donadores para el injerto de CDR. Cuatro (4) Rabmabs adicionales (EPI-1, EPI-15, EP-35 y EP-42) se seleccionaron para injerto de CDR en base a su actividad favorable en un ELISA por secreción (ver la Figura 2 ) .
Ejemplo 3: Injerto de CDR y Humanización Funcional de Anticuerpos Donadores de Conejo A diferencia de los métodos de humanización tradicionales que emplean la estructura aceptora de anticuerpos humanos que comparte la homología de secuencia más, grande con el anticuerpo donador no humano, las CDRs de conejo se injertaron en una estructura (FW 1.4) humana que se pre-seleccionó por sus propiedades funcionales deseables (solubilidad y estabilidad) utilizando en ensayo de Control de Calidad. Aunque la secuencia de estructura estable y soluble exhibió una elevada homología con el Rab ab, el anticuerpo aceptor seleccionado no es la secuencia más homologa disponible.
Se generó una serie de injertos de CDR para cada uno de los rabmabs. El término "injerto Min" o "min" que se utiliza en la presente se refiere a un dominio variable humanizado que se generó mediante el injerto de CDRs de conejo de un dominio variable de conejo en una estructura aceptora humana de origen natural (FW 1.4, SEC. ID. No. 172). No se hicieron cambios en las regiones de la estructura. La estructura misma se pre-seleccionó por sus propiedades funcionales deseables (solubilidad y estabilidad) . El término "injerto Max" o "max" que se utiliza en la presente se refiere a un dominio variable humanizado que se generó mediante el injerto de CDRs de conejo de un dominio variable de conejo en la estructura aceptora humana, "transformada en estructura de conejo" "RabTor" (rFWl.4, SEC. ID. No. 173), o en un derivado del mismo referido como rF 1.4(v2) (SEC. ID. No. 174). La estructura "RabTor" se preparó incorporando residuos de conejo conservados (que de lo contrario son más bien variables en otras especies) en posiciones de la estructura generalmente involucradas en la estructura y estabilidad del dominio variable de conejo, con el propósito de generar una estructura universalmente aplicable que acepte virtualmente cualquier conjunto de CDRs de conejo sin la necesidad de injertar residuos de la estructura donadora diferentes en las posiciones que sean diferentes en su secuencia progenitora probable, por ejemplo que se alteren durante una hipermutación somática y que por consiguiente, posiblemente contribuyan a la aglutinación de antigenos. Se define que la secuencia progenitora probable es la contraparte germinal de conejo más cercana y en el caso de que no se pueda establecer la contraparte germinal más cercana, el consenso del subgrupo de conejo o el consenso de secuencias de conejo con un alto porcentaje de similaridad. "Min-Max" o "minmax" se refiere a un dominio variable humanizado que consiste de una cadena ligera variable del "injerto Min" combinado con una cadena pesada variable del "injerto Max", mientras que "Max-Min" o "maxmin" se refiere a un dominio variable humanizado que consiste de una cadena ligera variable del "injerto Max" combinada con una cadena pesada variable del "injerto Min".
La Tabla 2 muestra un resumen de los datos de caracterización detallados para anticuerpos humanizados de una sola cadena que se originan de ocho diferentes anticuerpos de conejo monoclonal o rabmabs (EP1, EP6, EP15, EP19, EP34, EP35, EP42 y EP43) . Los asi llamados injertos "min" (por ejemplo EPlmin) se refieren a constructos para los cuales solamente se injertaron CDRs donadoras de conejo, mientras que para los asi llamados injertos "max", se injertaron no solamente las CDRS, sino también algunas posiciones de aminoácidos en la estructura donadora. Adicionalmente, la tabla 2 muestra los datos de dos anticuerpos de una sola cadena marcados con His (EP34min_C-His y EP19max_C-His) , asi como el anticuerpo ESBA105 de una sola cadena de referencia, descrito en WO 2006/131013. La tercera columna, referida como "L929" indica las potencias relativas de los diferentes anticuerpos de una sola cadena que se determinaron en un ensayo L929 en comparación con la potencia del ESBA105. Los valores para kon, koff y KD se dan en unidades de M"1s"1, s_1 y M, respectivamente. La séptima columna da el punto medio del desdoblamiento térmicamente inducido que se determinó con FT-IR. La última columna indica el rendimiento relativo de proteina correctamente doblada obtenida de cuerpos de inclusión solubilizados después de una metodología de re-doblamiento.
Algunos ejemplos para los datos BIACore que entraron en la tabla 2 se dan en la figura 3. Se muestra las cinéticas de aglutinación para la unión del ESBA105 (Fig. 3a), EP43max (Fig. 3b) y EP34max (Fig. 3c) al TNFOÍ humano. Los ejemplos de ensayos de potencia celular se dan en la figura 4, la cual compara el ESBA105 (círculos cerrados) contra el EP43max (cuadrados abiertos) en un ensayo L929. Se dan ejemplos adicionales de ensayos de potencia celular que comparan el EP34max contra los anticuerpos comercializados infliximab y adalimumab, se dan en las figuras 9 y 10.
Tabla 2: Resumen de los datos de caracterización detallados para los cuatro monoclonales de conejo (EP6, EP19, EP34 y EP43) y sus variantes injertadas con CDR.
*L929 [EC50-E105/EC50-X] , comparadas en unidades de masa [ng/ml] en relación al desempeño del ESBA105 (WO06/131013) ** (solución de re-doblamiento en mg/L) ; ***No Determinado H» O 1/1 o Descripción ID L929* kon koff FT-IR TM°C Rendimiento RF** EPl_min 1071 ND*** - - - - 2 EP6_tnin 673 ND*** 4.67E+04 4.94E-03 1.06E-07 50.2 35 EP15_min 1073 ND*** 1.57E+05 4.10E-02 2.62E-07 - 41.5 EP19_min 616 ND*** - - - - - EP34_min 643 ND*** - - - - - EP35_min 1075 ND*** - - - - 1 EP42_min 1076 ND*** 1.42E+05 8.35E-03 5.87E-08 - 3 EP43_min 705 ND*** 5.38E+03 2.98E-02 5.54E-06 70.2 30.0 EPl_max 1072 ND*** 1.1 1 E+04 6.30E-04 5.69E-08 - 44 EP6_max 674 1.1 2.84E+05 1.45E-04 5.12E-10 48.1 12 EP15_max 1074 0.39 1.53E+06 2.26E-03 1.48E-09 68.6 57.8 EP 19_max 1007 0.6 2.25E+04 6.54E-05 2.91E-09 53.5 52 EP34_max 791 10.5 5.86E+05 1.68E-05 2.86E-1 1 72.4 4.05 EP35_max 1089 5.20 7.72E+05 1.50E-04 1.94E-10 - 0.66 EP42_max 1077 ND*** 1.21E+05 4.19E-04 3.46E-09 - 47.6 EP43_max 676 6.4 1.78E+05 4.48E-05 2.5 1E-10 74.3 21.73 EP34min_C-His 790 0.2 EP19max C-His 789 1.9 Ejemplo 4: Optimización de Solubilidad y Estabilidad de EP43max, un Potente Aglutinante de TNFa El EP43max se seleccionó por su optimización adicional basada en su potente actividad de aglutinación al TNF. La caracterización biofísica de este inmunoaglutinante reveló que el mismo exhibe un elevado punto medio de desnaturalización (Tm>70°C) en un ensayo de desdoblamiento térmico (FTIR) (ver la Figura 5) . No obstante, el EP43max se sometió a optimización de solubilidad para estrechar su amplia fase de transición en el desdoblamiento térmico. Con el fin de mejorar la solubilidad del EP43max nativo o natural, las tres posiciones de residuos 12, 103, ó 144 en la cadena VH se sustituyeron con aminoácidos con hidrofilicidad más alta. Se mostró que esta combinación incrementa la solubilidad de la proteína nativa sin afectar la estabilidad o actividad de aglutinamiento . (V->S en la posición AHo 12, V->T en la posición AHo 103, y L->T en la posición AHo 144) se introdujeron para reemplazar residuos hidrófobos en la interfaz del domino V-C de la región de cadena pesada variable (VH) del EP43max. Además de las mutaciones que mejoran la solubilidad, se identificaron nueve mutaciones de estabilización (TIOS, K47R, Y57S, L91F y T103V en el VL y E1Q, E6Q, S7T y V103L I en el VH) en EP43max (ver la Tabla 3) . Estos residuos de estabilización se identificaron a partir de un análisis de consenso funcional de las estructuras de control de calidad (QC) de ESBATech. Los residuos de estabilización en las posiciones 1 y 3 en el VL y la posición 89 en el VH ya estaban presentes en la molécula EP43max. Se identificó una mutación de estabilización adicional (M->L) en la posición 4 de VL, aunque se eliminó de consideración en base a su papel previsto en la aglutinación de antigenos.
Tabla 3: Mutaciones de Estabilización en EP43max Residuo Sustitución Mutación de Dominio Posición Parental Preferida Estabilización VL 1 E E Ya Presente VL 3 V V Ya Presente VI ? A I Involucrada en la V L *t 1V1 Aglutinación VL 10 T s TI OS VL 47 K R K47R VL 57 Y S Y57S VL 91 L F L91F VL 103 T V T103V VH 1 E Q E1Q VH 6 E Q E6Q VH 7 S T S7T VH 89 V V Ya Presente VH 103 V L V103L Columna 1 , Dominio Variable. Columna 2, Posición de aminoácido AHo. Columna 3, Residuo parental en EP43max. Columna 4, Sustitución preferida para la posición indicada en la columna 2. Columna 5, Mutación de estabilización.
Ejemplo 5: Variantes Optimizadas de EP43max, un Potente Aglutinante de TNFo La Tabla 4 y 5 muestra los datos de caracterización para tres variantes optimizadas de EP43max. El EP43maxDHP es la variante mejorada de solubilidad de EP43max y comprende las tres mutaciones que mejoran la solubilidad anteriormente (V->S en la posición AHo 12, V->T en la posición AHo 103, y L- T en la posición AHo 144) . Las variantes EP43_maxmin y EP43_minmax se generaron por medio de reordenación de dominios entre los injertos "min" y "max". Por ejemplo, la variante "minraax" comprende la versión de injerto mínimo (injerto CDR solamente) de la versión de injerto máximo y de cadena ligera de la cadena pesada (es decir CDRs de conejo injertadas más residuos de estructura de conejo involucrados en la aglutinación de antígenos) mientras que, la variante "maxmin" comprende la versión de injerto máximo de la cadena ligera y la versión de injerto mínimo de la cadena pesada.
Tabla 4: Datos de caracterización para EP43max y variante del mismo.
Tabla 5: Datos de caracterización para EP43max y variante del mismo.
Rendimiento RF Expresión Inspección de Purificación redoblamiento EP43_max 27,73 +++ si si EP43_maxDHP 17 +++ si si EP43_maxmin 1 1 +++ si si EP43_m¡nmax 46 +++ si si Las curvas de desnaturalización térmica de EP43max y sus variantes optimizadas se compararon por medio de análisis FTIR (ver la Figura 6 y Tabla 6) . Se encontró que EP43minmax tiene un punto medio más bajo de desdoblamiento que el EP43max.
Tabla 6: Comparación de curvas de desnaturalización térmica del EP43max y sus variantes optimizadas mediante análisis FTIR Además, la variante minmax exhibió una transición de desdoblamiento de una sola etapa, que indica que ambos dominios se desdoblaron a temperaturas muy similares. EP43max (Figura 7A) y su variante EP43minmax (Figura 7B) se compararon adicionalmente en un análisis de tensión térmica. El contenido de hoja plegada Beta y la concentración de la proteína soluble se evaluaron siguiendo la concentración térmica a temperaturas cada vez mayores (50, 60 y 70°C) . El EP43minmax fue considerablemente más estable que EP43max a la temperatura intermedia de 60 °C.
Ejemplo 6: Comparación de EP34max con aglutinantes de TNFct comercialmente disponibles La capacidad de EP34max, Adalimumab e Infliximab para bloquear la actividad citotóxica del TNF humano recombinante de 1000 pg/ml, se comparó como se detalla anteriormente en un ensayo L929. La capacidad de EP43max, Adalimumab e Infliximab para bloquear la actividad citotoxica de TNFalfa humano recombinante de 10 pg/ml, se evaluó en un ensayo Kym-1. Los resultados se muestran en las Figuras 9a, b y figuras 10a, b, respectivamente .
La Figura 9a ilustra la potencia de EP34max y Adalimumab para bloquear la actividad citotoxica de TNFalfa humano recombinante de 1000 pg/ml (células L929 de murino) . La IC50 para EP34max y Adalimumab se determinó que es de 1,03 ng/ml y 8.45 ng/ml, respectivamente. La Figura 9b ilustra la potencia de Adalimumab y EP34max para bloquear la actividad citotoxica de TNFalfa humano recombinante de 10 pg/ml (células Kym-1 humanas) . La IC50 para Adalimumab y EP34max (791) se determinó que es de 66,2 ng/ml y 0,69 ng/ml respectivamente.
La Figura 10a ilustra la potencia del EP34max y el Infliximab para bloquear la actividad citotoxica del TNFalfa humano recombinante de 1000 pg/ml (células 929 de murino) . La IC50 para EP34max y el Infliximab se determinó que es de 1,04 ng/ml y 13,9 ng/m, respectivamente. La Figura 10b ilustra la potencia del Infliximab y EP34max (791) para bloquear la actividad citotoxica del TNFalfa humano recombinante de 10 pg/ml (células Kym-1 humanas) . La IC5o para Infliximab y EP34max se determinó que es de 14,98 ng/ml y 0,63 ng/ml, respectivamente. Por consiguiente, en ambos casos, el EP34max mostró mejor desempeño como Infliximab.
OTRAS MODALIDADES Se entiende que la invención también incluye cualquiera de las metodologías, referencias, y/o composiciones establecidas en los Apéndices anexados A hasta E.
EQUIVALENTES Numerosas modificaciones y modalidades alternativas de la presente invención serán evidentes para aquellos expertos en la técnica en vista de la descripción anterior. De acuerdo con esto, esta descripción se interpretará como ilustrativa solamente y es para el propósito de enseñar a aquellos expertos en la técnica el mejor modo para llevar a cabo la presente invención. Los detalles de la estructura pueden variar sustancialmente sin apartarse del espíritu de la invención, y se reserva el uso exclusivo de todas las modificaciones que entren dentro del alcance de las reivindicaciones anexadas. Se pretende que la presente invención se limite solamente en la medida requerida por las reivindicaciones anexadas y las normas legales aplicables.
Toda la literatura y material similar citado en esta solicitud, incluyendo, patentes, solicitudes de patente, artículos, libros, tratados, disertaciones, páginas de internet, figuras y/o apéndices, independientemente del formato de tal literatura y materiales similares, se incorporan expresamente como referencia en su totalidad. En el caso de que uno o más de los materiales de literatura y similares incorporados difiera de o contradiga esta solicitud, incluyendo términos definidos, utilización de términos, técnicas descritas, o similares, esta solicitud domina.
Los encabezados de sección utilizados en la presente son para propósitos de organización solamente y no se interpretarán como limitantes de la materia descrita de ninguna manera.
Aunque la presente invención ha sido descrita en conjunción con varias modalidades y ejemplos, no se pretende que las presentes enseñanzas limiten tales modalidades o ejemplos. Por el contrario, la presente invención abarca varias alternativas, modificaciones, y equivalentes, como se apreciará por aquellos expertos en la técnica.
Las reivindicaciones no deberán interpretarse como limitadas al orden o elementos descritos a menos que se establezca con ese fin. Se deberá entender que pueden hacerse varios cambios en forma y detalle sin apartarse del alcance de las reivindicaciones anexadas. Por lo tanto, se reivindican todas las modalidades que entren dentro del alcance y espíritu de las siguientes reivindicaciones y equivalentes de las mismas .

Claims (28)

REIVINDICACIONES
1. - Un inmunoaglutinante que aglutina específicamente el TNFa humano, el inmunoaglutinante caracterizado porque comprende: (i) una secuencia de estructura variable de cadena pesada, humana, y secuencias CDR Hl, CDR H2 y CDR H3 que provienen de un inmunoaglutinante de conejo, en donde la estructura de región variable de cadena pesada, humana, tiene al menos 90% de identidad con la SEC. ID. NO. : 1; y (ii) una secuencia de estructura variable de cadena ligera, humana, y secuencias CDR Ll, CDR L2 y CDR L3 que provienen de un inmunoaglutinante de conejo, en donde la estructura de región variable de cadena ligera, humana, tiene al menos 85% de identidad con la SEC. ID. NO.: 2.
2. - El inmunoaglutinante de la reivindicación 1, caracterizado porque la estructura de región variable de cadena pesada, humana, es o comprende la SEC. ID. NO.: 1, SEC. ID. NO.: 89, ó SEC. ID. NO. : 90, y la secuencia de estructura de región variable de cadena ligera, humana, es o comprende la SEC. ID. NO.: 2 ó SEC. ID. NO.: 91.
3.- El inmunoaglutinante de la reivindicación 2, caracterizado porque comprende una o más sustituciones en la estructura de cadena pesada (VH) en una posición del grupo que consiste de las posiciones H24, H25, H56, H82, H84, H89 y H108; y/o una sustitución en la estructura de cadena ligera (VL) en la posición L87 de acuerdo al sistema de numeración AHo .
4. - El inmunoaglutinante de la reivindicación 3, caracterizado porque la sustitución se selecciona del grupo que consiste de treonina (T) en la posición H24, valina (V) en la posición H25, glicina (G) ó alanina (A) en la posición H56, lisina (K) en la posición H82, treonina (T) en la posición H84, valina (V) en la posición H89 y arginina (R) en la posición H108 y treonina (T) en la posición L87 de acuerdo al sistema de numeración AHo.
5. - El inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones previas, caracterizado porque el inmunoaglutinante comprende una sustitución que mejora la solubilidad en al menos una de las posiciones de amino de cadena pesada 12, 103 y 144 (numeración AHo) .
6. El inmunoaglutinante de la reivindicación 7, caracterizado porque la sustitución que mejora la solubilidad se selecciona del grupo que consiste de: (a) Serina (S) en la posición 12; (b) Treonina (T) en la posición 103; y (c) Treonina (T) en la posición 144.
7. - El inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende además : a) una o más secuencias CDR que son al menos 80% idénticas a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO. : 3, SEC. ID. NO. : 4, SEC. ID. NO.: 5, SEC. ID. NO.: 6, SEC. ID. NO.: 7 y SEC. ID. NO.: 8; b) una o más secuencias CDR que son al menos 80% idénticas a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO.: 9, SEC. ID. NO.: 10, SEC. ID. NO.: 11, SEC. ID. NO.: 12, SEC. ID. NO.: 13 y SEC. ID. NO. : 14; c) una o más secuencias CDR que son al menos 80% idénticas a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO. : 15, SEC. ID. NO.: 16, SEC. ID. NO.: 17, SEC. ID. NO.: 18, SEC. ID. NO.: 19 y SEC. ID. NO.: 20; d) una o más secuencias CDR que son al menos 80% idénticas a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO. : 21, SEC. ID. NO.: 22, SEC. ID. NO.: 23, SEC. ID. NO.: 24, SEC. ID. NO.: 25 y SEC. ID. NO. : 26; e) una o más secuencias CDR que son al menos 80% idénticas a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO.: 27, SEC. ID. NO.: 28, SEC. ID. NO.: 29, SEC. ID. NO.: 30, SEC. ID. NO.: 31 y SEC. ID. NO.: 32; f) una o más secuencias CDR que son al menos 80% idénticas a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO.: 33, SEC. ID. NO.: 34, SEC. ID. NO.: 35, SEC. ID. NO.: 36, SEC. ID. NO.: 37 y SEC. ID. NO.: 38; g) una o más secuencias CDR que son al menos 80% idénticas a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO.: 39, SEC. ID. NO.: 40, SEC. ID. NO. : 41, SEC. ID. NO.: 42, SEC. ID. NO.: 43 y SEC. ID. NO.: 44; ó h) una o más secuencias CDR que son al menos 80% idénticas a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO.: 45, SEC. ID. NO.: 46, SEC. ID. NO.: 47, SEC. ID. NO.: 48, SEC. ID. NO.: 49 y SEC. ID. NO.: 50.
8. - El inmunoaglutinante de la reivindicación 7, caracterizado porque la estructura de cadena pesada del inmunoaglutinante que comprende una o más secuencias CDR que son al menos 80% idénticas a una secuencia seleccionada del grupo de d) , e), f) , g) o H) , tiene eliminaciones en las posiciones 85 y 88 de la estructura.
9. - El inmunoaglutinante de la reivindicación 7, caracterizado porque una o más secuencias CDR son al menos 80% idénticas a una secuencia seleccionada del grupo de a) una sustitución en al menos una de las posiciones 22, 74, 95, 97 y 99 de la región variable de cadena ligera (VL) de acuerdo al sistema de numeración AHo, preferiblemente treonina (T) en la posición L22, fenilalanina (F) o tirosina en la posición L74, glutamato € L95 o alanina (A) en la posición L99, o una combinación de las mismas.
10. - El inmunoaglutinante de la reivindicación 7, caracterizado porque una o más secuencias CDR son al menos 80% idénticas a una secuencia seleccionada del grupo de c) , que tiene una sustitución en al menos una de las posiciones 87, 89 y 92 de la región variable de cadena ligera (VL) de acuerdo al sistema de numeración AHo.
11. - El inmunoaglutinante de la reivindicación 7, caracterizado porque una o más secuencias CDR son al menos 80% idénticas a una secuencia seleccionada del grupo de e) , que tiene una sustitución en al menos una de las posiciones 86 y 87 de la región variable de cadena ligera (VL) de acuerdo al sistema de numeración AHo, preferiblemente treonina (T) en la posición L87 (Q) y glutamina en la posición L88.
12. - El inmunoaglutinante de la reivindicación 7, caracterizado porque una o más secuencias CDR son al menos 80% idénticas a una secuencia seleccionada del grupo de f) , que tiene una sustitución en al menos una de las posiciones 15, 48, 90 de la región variable de cadena ligera (VL) de acuerdo al sistema de numeración AHo.
13. - El inmunoaglutinante de la reivindicación 7, caracterizado porque una o más secuencias CDR son al menos 80% idénticas a una secuencia seleccionada del grupo de g) , que tiene una sustitución en al menos una de las posiciones 57 y 87 de la región variable de cadena ligera (VL) de acuerdo al sistema de numeración AHo, preferiblemente para valina (V) en la posición L57 y treonina (T) en la posición L87.
14. - El inmunoaglutinante de la reivindicación 7, caracterizado porque una o más secuencias CDR son al menos 80% idénticas a una secuencia seleccionada del grupo de g) o h), que tiene una sustitución en al menos una de las posiciones 1, 3, 4, 10, 47, 57, 91 y 103 de la región variable de cadena ligera (VL) de acuerdo al sistema de numeración AHo, preferiblemente una sustitución que mejora la estabilidad seleccionada del grupo que consiste de (a) Ácido glutámico (E) en la posición 1, (b) Valina (V) en la posición 3, (c) Leucina (L) en la posición 4; (d) Serina (S) en la posición 10; (e) Arginina en la posición 47; (f) Serina (S) en la posición 57; (g) Fenilalanina (F) en la posición 91; y (h) Valina (V) en la posición 103.
15.- El inmunoaglutinante de la reivindicación 7, caracterizado porque comprende: a) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO.: 51, SEC. ID. NO.: 53 y SEC. ID. NO.: 55, y una región variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC . ID. NO.: 52, SEC. ID. NO.: 54, SEC. ID. NO.: 56, SEC. ID. NO.: 57, SEC. ID. NO.: 58 y SEC. ID. NO.: 59; b) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO. : 60 y SEC. ID. NO.: 62, y/o una región variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO. : 61 y SEC. ID. NO. : 63; c) que comprende una región variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO.: 64 y SEC. ID. NO.: 66, y/o una región variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO. : 65 y SEC. ID. NO.: 67; d) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO.: 68 y SEC. ID. NO.: 70, y/o una región variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO. : 69 y SEC. ID. NO. : 71; e) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO. : 73 y SEC. ID. NO.: 75, y/o una región variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO. : 74 y SEC. ID. NO. : 76; f) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO.: 77 y SEC. ID. NO. : 79, y/o una región variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO. : 78 y SEC. ID. NO . : 80; g) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO.: 81 y SEC. ID. NO.: 83, y/o una región variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO.: 82 y SEC. ID. NO.: 84; ó h) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO.: 85 y SEC. ID. NO.: 87, y/o una región variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID. NO. : 86 y SEC. ID. NO. : 88.
16. - El inmunoaglutinante de la reivindicación 15, caracterizado porque tiene al menos 90% de identidad de secuencia con, preferiblemente 100% con cualquiera de la SEC. ID. NO.: 94 a SEC. ID. NO.: 121.
17. - El inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es un anticuerpo, scFv, Fab o Dab.
18. - Un inmunoaglutinante que tiene CDRs que son diferentes de cualquier CDR de las SEC. ID. NOs . : 3-50, que compite por aglutinarse o unirse al TNFa humano con el inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes .
19. - Un inmunoaglutinante que tiene CDRs que son diferentes de cualquier CDR de las SEC. ID. NOs.: 3-50, que aglutina el mismo epitope en el TNFa humano que el inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes .
20. - Una composición caracterizada porque comprende el inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y un portador farmacéuticamente aceptable.
21. - Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica una región de cadena pesada variable (VH) y/o región de cadena ligera variable (VL) de cualquiera de las reivindicaciones precedentes .
22. - Un vector de expresión caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 21.
23. - Una célula hospedera que comprende el vector de expresión de la reivindicación 22.
24. - El uso del inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-19 en la producción de un medicamento para el tratamiento o prevención de un padecimiento mediado por el TNFa humano.
25. - El inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-19 para el tratamiento o prevención de un padecimiento mediado por el TNFa humano.
26. - El uso de la reivindicación 24 ó el inmunoaglutinante de la reivindicación 25, caracterizado porque el padecimiento mediado por el TNFa se selecciona del grupo que consiste de estados crónicos y/o autoinmunes de inflamación en general, desórdenes inflamatorios mediados por el sistema inmune en general, padecimiento inflamatorio del SNC, padecimientos inflamatorios que afectan los ojos, articulaciones, membranas mucosas, sistema nervioso central, tracto gastrointestinal, tracto urinario o pulmones, estados de uveitis en general, retinitis, uveitis HLA-B27+, enfermedad de Behcet, síndrome del ojo seco, glaucoma, síndrome de Sjogren, diabetes mellitus (incl. neuropatía diabética) , resistencia a la insulina, estados de artritis en general, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis reactiva y síndrome de Reiter, artritis juvenil, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barre, miastenia aguda, esclerosis lateral amiotrófica, sarcoidosis, glomerulonefritis, padecimiento crónico del riñon, cistitis, soriasis (ind.. artritis psoriásica) , hidrosadenitis supurativa, paniculitis, piodermia gangrenosa, síndrome SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis) , acné, síndrome de Sweet, pénfigo, enfermedad de Crohn (incl. manifestaciones extra-intestinales) , colitis ulcerativa, asma bronquial, alveolitis alérgica, alergias generales, rinitis alérgica, sinusitis alérgica, padecimiento pulmonar obstructivo crónico (COPD) , fibrosis pulmonar, granulomatosis de Wegener, síndrome de Kawasaki, arteritis de células gigantes, vasculitis de Churg-Strauss, poliarteritis nodosa, quemaduras, padecimiento del injerto contra el huésped, reacciones huésped contra injerto, episodios de rechazo subsiguientes al trasplante de órganos o médula ósea, estados sistémicos y locales de vasculitis en general, lupus eritematoso sistémico y discoide, polimiositis y dermatomiositis, esclerodermia, pre-eclampsia, pancreatitis aguda y crónica, hepatitis viral, hepatitis alcohólica, inflamación post-quirúrgica tal como después de cirugía de los ojos (por ejemplo cataratas (remplazo del cristalino del ojo) o cirugía de glaucoma) , cirugía de articulaciones (incl. cirugía artroscópica) , cirugía en estructuras relacionadas con las articulaciones (por ejemplo ligamentos) , cirugía bucal y/o dental, procedimientos cardiovasculares mínimamente invasivos (por ejemplo PTCA (angioplastia coronaria transluminal , coronaria) , aterectomía, colocación de endoprótesis) , procedimientos laparoscópicos y/o endoscópicos intra-abdominales y ginecológicos, procedimientos urológicos endoscópicos (por ejemplo cirugía de próstata, ureteroscopia, cistoscopia, cistitis intersticial) , o inflamación perioperatoria (prevención) en general, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, parálisis de Bell (parálisis facial idiopática) , enfermedad de Creutzfeld-Jakob, la osteólisis relacionada con el cáncer, inflamación relacionada con el cáncer, dolor relacionado con el cáncer, caquexia relacionada con el cáncer, metástasis de huesos, formas agudas y crónicas de dolor, independientemente de si estas son causadas por efectos centrales o periféricos del TNFOÍ y de si las mismas se clasifican como formas inflamatorias, nociceptivas o neuropáticas de dolor, ciática, dolor lumbar bajo, síndrome del canal carpiano, síndrome de dolor regional complejo (CRPS) , gota, neuralgia post-herpética, fibromialgia, estados de dolor local, síndromes de dolor crónico debidos a tumores metastásicos, dismenorrea, septicemia bacteriana, viral o fúngica, tuberculosis, SIDA, aterosclerosis, padecimiento coronario, hipertensión, dislipidemia, insuficiencia cardiaca e insuficiencia cardiaca crónica .
27. - La composición de la reivindicación 20, formulada para administración tópica, oral, nasal, rectal o parental.
28. - Un método para tratar un padecimiento mediado por el TNFa en un mamífero, en particular en un humano, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes mediante vía intramuscular, intraperitoneal , intra-cerebroespinal , subcutánea, intra-articular , intrasinovial , intratecal, oral, tópica, o inhalación. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos scFv y fragmentos Fab estables y solubles específicos para el TNF, que comprenden secuencias específicas de cadena ligera y cadena pesada que se optimizan para estabilidad, solubilidad, aglutinación in vitro e in vivo del TNF, y baja inmunogenicidad . Dichos anticuerpos se diseñan para el diagnóstico ylo tratamiento de desórdenes mediados por el TNF. También se dan a conocer los ácidos nucleicos, vectores y células hospederas para la expresión de los anticuerpos recombinantes de la invención, métodos para aislar los mismos y el uso de dichos anticuerpos en la medicina.
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