JP2015083607A - ＴＮＦαを阻害する安定かつ可溶性の抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】ＴＮＦαを阻害する安定かつ可溶性の抗体の提供。【解決手段】本発明は、安定性、溶解性、インビトロおよびインビボでのＴＮＦ結合、ならびに低免疫原性に対して最適化されている特定の軽鎖配列および重鎖配列を含む、ＴＮＦに特異的な、とりわけ安定かつ可溶性のｓｃＦｖ抗体およびＦａｂフラグメントに関する。前記抗体は、ＴＮＦ媒介性障害の診断および／または処置のためにデザインされている。本発明の組換え抗体を発現するための核酸、ベクター、および宿主細胞、これらを単離するための方法、ならびに医薬における前記抗体の使用も開示する。【選択図】なし

Description

（関連出願）
この出願は、２００８年６月２５日のＵＳ６１／０７５，６４０および２００８年６月２６日のＵＳ６１／０７５，９５６の優先権を主張する。

（発明の背景）
腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα、カケクチンとしても公知である）は、内毒素または他の刺激に反応して、単球およびマクロファージを含めた多数の細胞型によって産生される、天然に存在する哺乳動物のサイトカインである。ＴＮＦαは、炎症反応、免疫反応、および病態生理学的反応の主要なメディエーターである（非特許文献１）。

可溶性ＴＮＦαは、前駆の膜貫通型タンパク質の切断によって形成され（非特許文献２）、分泌された１７ｋＤａのポリペプチドは可溶性のホモトリマー複合体へと集合する（非特許文献３；ＴＮＦＡの総説には非特許文献４を参照されたい；非特許文献５）。次いで、これらの複合体は、様々な細胞上に見られる受容体に結合する。結合により、（ｉ）インターロイキンＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＩＬ−１などの他のプロ炎症性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインの放出、（ｉｉ）マトリックスメタロプロテイナーゼの放出、ならびに（ｉｉｉ）内皮接着分子の発現の上方制御を含めた一連のプロ炎症効果がもたらされ、白血球を血管外組織中に引きつけることによって炎症および免疫のカスケードがさらに増幅される。

ＴＮＦαレベルの上昇には多数の障害が関連しており、その多くは医学的に極めて重要である。ＴＮＦαは、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、クローン病および潰瘍性大腸炎を含めた炎症性腸障害、敗血症、うっ血性心不全、気管支喘息、ならびに多発性硬化症などの慢性疾患を含めた数々のヒト疾患において上方制御されることが示されている。ヒトＴＮＦαについてトランスジェニックであるマウスは、高レベルのＴＮＦαを恒常的に生成し、ＲＡに類似する自発性、破壊性の多発性関節炎を発症する（非特許文献６）。それゆえＴＮＦαはプロ炎症性サイトカインと呼ばれている。

ＴＮＦαは、今やＲＡの病因における鍵として十分に確立されており、ＲＡは、多関節性の関節の炎症および破壊を特徴とする、慢性、進行性、消耗性の疾患であり、発熱および倦怠感および疲労の全身症状がある。ＲＡはまた、慢性の滑膜炎をもたらし、関節軟骨および骨の破壊に頻繁に進行する。ＲＡに罹患している患者の滑液および末梢血の両方において、ＴＮＦαレベルの上昇が見られる。ＲＡに罹患している患者にＴＮＦα遮断薬を投与すると、これらは炎症を低減し、症状を改善し、関節の損傷を遅らせる（非特許文献７）。

生理学的に、ＴＮＦαは特定の感染からの保護にも関連する（非特許文献８）。ＴＮＦαは、グラム陰性細菌のリポ多糖によって活性化されたマクロファージによって放出される。そのため、ＴＮＦαは、細菌性敗血症に付随する内毒素ショックの発症および病原に関与する中心的に重要な内因性メディエーターであると思われる（非特許文献９；非特許文献１０；Ｓｉｍｐｓｏｎら、（１９８９年）Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｃｌｉｎ．、５巻、２７〜４７頁；Ｗａａｇｅら、（１９８７年）、Ｌａｎｃｅｔ、１巻、３５５〜３５７頁；Ｈａｍｍｅｒｌｅ．ら、（１９８９年）Ｓｅｃｏｎｄ Ｖｉｅｎｎａ Ｓｈｏｃｋ Ｆｏｒｕｍ、７１５〜７１８頁；Ｄｅｂｅｔｓ．ら、（１９８９年）、Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．、１７巻、４８９〜４９７頁；Ｃａｌａｎｄｒａ．ら、（１９９０年）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１６１巻、９８２〜９８７頁；Ｒｅｖｈａｕｇら、（１９８８）、Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．、１２３巻、１６２〜１７０頁）。

ＴＮＦαは、他の器官系同様、中枢神経系において、とりわけ、多発性硬化症、ギランバレー症候群、および重症筋無力症を含めた神経系の炎症性障害および自己免疫障害において、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病を含めた神経系の変性障害において重要な役割を果たすことも示された。ＴＮＦαはまた、視神経炎、黄斑変性症、糖尿病性網膜症、皮膚筋炎、筋萎縮性側索硬化症、および筋ジストロフィーを含めた網膜および筋肉の関連系の障害、ならびに外傷性脳損傷、急性脊髄損傷、および脳卒中を含めた神経系に対する損傷に関与する。

肝炎は、他の誘因の中でもエプスタインバー、サイトメガロウイルス、およびＡ〜Ｅ型肝炎ウイルスを含めたウイルス感染によって引き起こされ得る別のＴＮＦα関連炎症性障害である。肝炎は、門脈および小葉の領域において肝臓の急性炎症を引き起こし、線維症および腫瘍の進行が続く。ＴＮＦαはがんにおける悪液質も媒介することがあり、悪液質はほとんどのがんの病的状態および死亡をもたらす（Ｔｉｓｄａｌｅ Ｍ． Ｊ．（２００４年）、Ｌａｎｇｅｎｂｅｃｋｓ Ａｒｃｈ Ｓｕｒｇ．、３８９巻、２９９〜３０５頁）。

炎症、細胞免疫反応、および多くの疾患の病理においてＴＮＦαが果たす重要な役割は、ＴＮＦαのアンタゴニストの探索を導いている。ＴＮＦα媒介性疾患の処置用にデザインされた１クラスのＴＮＦαアンタゴニストは、ＴＮＦαに特異的に結合し、それによってその機能を阻止する抗体または抗体フラグメントである。抗ＴＮＦα抗体の使用によって、ＴＮＦαの遮断はＴＮＦαに起因する作用を取り消し得る（ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、接着分子、および組織破壊における低減を含む）ことが示された（Ｆｅｌｄｍａｎｎら（１９９７年）、Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７巻、２８３〜３５０頁）。最近市販されるようになったＴＮＦαの特異的なインヒビターの中で、ＴＮＦαに対する、モノクローナルの、キメラのマウス−ヒト抗体（インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ^ＴＭ；Ｃｅｎｔｏｃｏｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ／Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）は、ＲＡおよびクローン病の処置における臨床的効能を実証している。市販されているＴＮＦαインヒビターは全て、ボーラス注射として、週１回、またはそれより長い間隔において静脈内投与または皮下投与され、高い開始濃度（これは次回の注射までに着実に低減する）をもたらす。これらの分布容積は限られている。

Ｇｒｅｌｌ， Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ、１９９５年、８３巻、７９３〜８０２頁 Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ、１９８８年、５３巻、４５〜５３頁 Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、１９８７年、２６２巻、６９５１〜６９５４頁 Ｂｕｔｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８６年、３２０巻、５８４頁 Ｏｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８６年、２３０巻、６３０頁 Ｋｅｆｆｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ、１９９１年、１０巻、４０２５〜４０３１頁 ＭｃＫｏｗｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ、１９９９年、４２巻、１２０４〜１２０８頁 Ｃｅｒａｍｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ、１９８８年、９巻、２８頁 Ｍｉｃｈｉｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、１９８９年、７６巻、６７０〜６７１頁 Ｄｅｂｅｔｓ．ら、Ｓｅｃｏｎｄ Ｖｉｅｎｎａ Ｓｈｏｃｋ Ｆｏｒｕｍ、１９８９年、４６３〜４６６頁

このような進歩にもかかわらず、ＲＡなどのＴＮＦα関連障害を処置するための、新しく、有効な形態の抗体または他のイムノバインダーが依然として必要とされている。とりわけ、より柔軟な投与および処方を可能にし、組織浸透を改善し、それによって分布容積を増大させる、関節炎および他のＴＮＦα媒介性障害の有効かつ継続的な処置に最適な機能特性を有するイムノバインダーが緊急に必要とされている。

（発明の概要）
したがって、本発明の全般的目的は、インビトロおよびインビボでＴＮＦαに特異的に結合する、安定かつ可溶性の抗体または他のイムノバインダーを提供することである。好ましい実施形態において、前記イムノバインダーはｓｃＦｖ抗体またはＦａｂフラグメントである。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
（ｉ）ヒト重鎖可変フレームワーク配列、ならびにウサギイムノバインダーに由来するＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、およびＣＤＲ Ｈ３配列、ならびに／または
（ｉｉ）ヒト軽鎖可変フレームワーク配列、ならびにウサギイムノバインダーに由来するＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、およびＣＤＲ Ｌ３配列
を含む、ヒトＴＮＦαに特異的に結合するイムノバインダー。
（項目２）
前記ヒト重鎖可変領域フレームワークが配列番号１に少なくとも９０％の同一性を有し、かつ／または前記ヒト軽鎖可変領域フレームワーク配列が配列番号２に少なくとも８５％の同一性を有する、項目１に記載のイムノバインダー。
（項目３）
前記ヒト重鎖可変領域フレームワークが配列番号１であるか、もしくは配列番号１を含み、かつ／または前記ヒト軽鎖可変領域フレームワーク配列が配列番号２であるか、もしくは配列番号２を含む、項目２に記載のイムノバインダー。
（項目４）
前記ヒト重鎖可変領域フレームワークが配列番号８９もしくは配列番号９０であるか、または配列番号８９もしくは配列番号９０を含み、かつ／または前記ヒト軽鎖可変領域フレームワーク配列が配列番号９１であるか、もしくは配列番号９１を含む、項目２に記載のイムノバインダー。
（項目５）
ＡＨｏナンバリングシステムによる、前記重鎖フレームワーク（ＶＨ）における位置Ｈ２４、Ｈ２５、Ｈ５６、Ｈ８２、Ｈ８４、Ｈ８９、およびＨ１０８からなる群からの位置に１つもしくは複数の置換を含み、かつ／または前記軽鎖フレームワーク（ＶＬ）における位置Ｌ８７に置換を含む、項目１または２のいずれか一項に記載のイムノバインダー。（項目６）
前記置換が、ＡＨｏナンバリングシステムによる、位置Ｈ２４のスレオニン（Ｔ）、位置Ｈ２５のバリン（Ｖ）、位置Ｈ５６のグリシン（Ｇ）またはアラニン（Ａ）、位置Ｈ８２のリジン（Ｋ）、位置Ｈ８４のスレオニン（Ｔ）、位置Ｈ８９のバリン（Ｖ）および位置Ｈ１０８のアルギニン（Ｒ）、ならびに位置Ｌ８７のスレオニン（Ｔ）からなる群より選択される、項目５に記載のイムノバインダー。
（項目７）
イムノバインダーが、重鎖のアミノ酸の位置１２、１０３、および１４４（ＡＨｏナンバリング）の少なくとも１つにおいて溶解性強化置換を含む、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目８）
前記溶解性強化置換が、（ａ）位置１２のセリン（Ｓ）、（ｂ）位置１０３のスレオニン（Ｔ）、および（ｃ）位置１４４のスレオニン（Ｔ）からなる群より選択される、項目７に記載のイムノバインダー。
（項目９）
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群より選択される配列に少なくとも８０％同一であるＣＤＲ配列を１つまたは複数さらに含む、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目１０）
ＡＨｏナンバリングシステムによる、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の位置２２、７４、９５、９７、および９９の少なくとも１つに、好ましくは位置Ｌ２２のスレオニン（Ｔ）、位置Ｌ７４のフェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）、Ｌ９５のグルタミン酸（Ｅ）、および位置Ｌ９９のアラニン（Ａ）の少なくとも１つの置換を有する、項目９に記載のイムノバインダー。
（項目１１）
配列番号５１、配列番号５３、および配列番号５５からなる群より選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／または配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、および配列番号５９からなる群より選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、項目９から１０のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目１２）
配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、および配列番号１０２に少なくとも９０％、好ましくは１００％の配列同一性を有する、項目９から１１のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目１３）
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群より選択される配列に少なくとも８０％同一であるＣＤＲ配列を１つまたは複数さらに含む、項目１から８のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目１４）
配列番号６０および配列番号６２からなる群より選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／または配列番号６１および配列番号６３からなる群より選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、項目１３に記載のイムノバインダー。
（項目１５）
配列番号１０３、配列番号１０４、または配列番号１０５に少なくとも９０％、好ましくは１００％の配列同一性を有する、項目１４に記載のイムノバインダー。
（項目１６）
配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０からなる群より選択される配列に少なくとも８０％同一であるＣＤＲ配列を１つまたは複数さらに含む、項目１から８のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目１７）
ＡＨｏナンバリングシステムによる、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の位置８７、８９、および９２の少なくとも１つにおける置換を有する、項目１５に記載のイムノバインダー。
（項目１８）
配列番号６４および配列番号６６からなる群より選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／または配列番号６５および配列番号６７からなる群より選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、項目１６から１７のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目１９）
配列番号１０６、配列番号１０７、または配列番号１０８に少なくとも９０％、好ましくは１００％の配列同一性を有する、項目１５から１８のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目２０）
配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６からなる群より選択される配列に少なくとも８０％同一であるＣＤＲ配列を１つまたは複数さらに含む、項目１から８のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目２１）
前記重鎖フレームワークが、ＡＨｏナンバリングシステムによる、フレームワーク位置８５および８８に欠失を有する、項目２０に記載のイムノバインダー。
（項目２２）
配列番号６８および配列番号７０からなる群より選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／または配列番号６９および配列番号７１からなる群より選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、項目２０から２１のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目２３）
配列番号１０９、配列番号１１０、または配列番号１１１に少なくとも９０％、好ましくは１００％の配列同一性を有する、項目１９から２２のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目２４）
配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２からなる群より選択される配列に少なくとも８０％同一であるＣＤＲ配列を１つまたは複数さらに含む、項目１から８のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目２５）
前記重鎖フレームワークが、ＡＨｏナンバリングシステムによる、フレームワーク位置８５および８８に欠失を有する、項目２４に記載のイムノバインダー。
（項目２６）
ＡＨｏナンバリングシステムによる、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の位置８６および８７の少なくとも１つに、好ましくは位置Ｌ８７のスレオニン（Ｔ）および位置Ｌ８８のグルタミン（Ｑ）の少なくとも１つの置換を有する、項目２４から２５のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目２７）
配列番号７３および配列番号７５からなる群より選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／または配列番号７４および配列番号７６からなる群より選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、項目２４から２６のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目２８）
配列番号１１２または配列番号１１３に少なくとも９０％、好ましくは１００％の配列同一性を有する、項目２４から２７のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目２９）
配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８からなる群より選択される配列に少なくとも８０％同一であるＣＤＲ配列を１つまたは複数さらに含む、項目１から８のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目３０）
前記重鎖フレームワークが、ＡＨｏナンバリングシステムによる、フレームワーク位置８５および８８に欠失を有する、項目２９に記載のイムノバインダー。
（項目３１）
ＡＨｏナンバリングシステムによる、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の位置１５、４８、９０の少なくとも１つに置換を有する、項目２９から３０のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目３２）
配列番号７７および配列番号７９からなる群より選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／または配列番号７８および配列番号８０からなる群より選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、項目２９から３１のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目３３）
配列番号１１４または配列番号１１５に少なくとも９０％、好ましくは１００％の配列同一性を有する、項目２９から３２のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目３４）
配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４からなる群より選択される配列に少なくとも８０％同一であるＣＤＲ配列を１つまたは複数さらに含む、項目１から８のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目３５）
ＡＨｏナンバリングシステムによる、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）の位置５７および８７の少なくとも１つに、好ましくは位置Ｌ５７のバリン（Ｖ）および位置Ｌ８７のスレオニン（Ｔ）の少なくとも１つの置換を有する、項目３４に記載のイムノバインダー。
（項目３６）
前記重鎖フレームワークが、ＡＨｏナンバリングシステムによる、フレームワーク位置８５および８８に欠失を有する、項目３４から３５のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目３７）
ＡＨｏナンバリングシステムによる、前記軽鎖可変領域の位置１、３、４、１０、４７、５７、９１、および１０３の少なくとも１つにおける安定性強化置換、好ましくは、（ａ）位置１のグルタミン酸（Ｅ）、（ｂ）位置３のバリン（Ｖ）、（ｃ）位置４のロイシン（Ｌ）、（ｄ）位置１０のセリン（Ｓ）、（ｅ）位置４７のアルギニン（Ｒ）、（ｅ）位置５７のセリン（Ｓ）、（ｆ）位置９１のフェニルアラニン（Ｆ）、および（ｇ）位置１０３のバリン（Ｖ）からなる群より選択される少なくとも１つの安定性強化置換を有する、項目３４から３６のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目３８）
配列番号８１および配列番号８３からなる群より選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／または配列番号８２および配列番号８４からなる群より選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、項目３４から３７のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目３９）
配列番号１１６、配列番号１１７、または配列番号１１８に少なくとも９０％、好ましくは１００％の配列同一性を有する、項目３４から３８のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目４０）
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、および配列番号５０からなる群より選択される配列に少なくとも８０％同一であるＣＤＲ配列を１つまたは複数さらに含む、項目１から８のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目４１）
前記重鎖フレームワークが、ＡＨｏナンバリングシステムによる、フレームワーク位置８５および８８に欠失を有する、項目４０に記載のイムノバインダー。
（項目４２）
ＡＨｏナンバリングシステムによる、前記軽鎖可変領域の位置１、３、４、１０、４７、５７、９１、および１０３の少なくとも１つに安定性強化置換、好ましくは、（ａ）位置１のグルタミン酸（Ｅ）、（ｂ）位置３のバリン（Ｖ）、（ｃ）位置４のロイシン（Ｌ）、（ｄ）位置１０のセリン（Ｓ）、（ｅ）位置４７のアルギニン（Ｒ）、（ｅ）位置５７のセリン（Ｓ）、（ｆ）位置９１のフェニルアラニン（Ｆ）、および（ｇ）位置１０３のバリン（Ｖ）からなる群より選択される少なくとも１つの安定性強化置換を有する、項目４０から４１のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目４３）
配列番号８５および配列番号８７からなる群より選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／または配列番号８６および配列番号８８からなる群より選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、項目４０から４２のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目４４）
配列番号１１９、配列番号１２０、または配列番号１２１に少なくとも９０％、好ましくは１００％の配列同一性を有する、項目４０から４３のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目４５）
抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、またはＤａｂである、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目４６）
ヒトＴＮＦαに対する結合を、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーと競合する、配列番号３から５０のいずれかのＣＤＲと異なるＣＤＲを有するイムノバインダー。
（項目４７）
前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーと同じヒトＴＮＦα上のエピトープに結合する、配列番号３から５０のいずれかのＣＤＲと異なるＣＤＲを有するイムノバインダー。
（項目４８）
前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダー、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
（項目４９）
前述の項目のいずれか一項に記載の可変重鎖（ＶＨ）領域および／または可変軽鎖（ＶＬ）領域をコードする、単離された核酸分子。
（項目５０）
項目４９に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
（項目５１）
項目５０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目５２）
被験体がＴＮＦα媒介性疾患について処置されるように、前述の項目のいずれか一項に記載の抗体を該被験体に投与することを含む、被験体におけるヒトＴＮＦα媒介性疾患を処置または予防する方法。
（項目５３）
前記ＴＮＦα媒介性疾患が、炎症の慢性状態および／または自己免疫状態全般、免疫媒介性炎症性障害全般、炎症性ＣＮＳ疾患、眼、関節、皮膚、粘膜、中枢神経系、消化管、尿路、または肺を冒す炎症性疾患、ブドウ膜炎の状態全般、網膜炎、ＨＬＡ−Ｂ２７＋ブドウ膜炎、ベーチェット病、眼乾燥症候群、緑内障、シェーグレン症候群、真性糖尿病（糖尿病性神経障害を含む）、インスリン抵抗性、関節炎の状態全般、慢性関節リウマチ、変形性関節症、反応性関節炎およびライター症候群、若年性関節炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、ギランバレー症候群、重症筋無力症、筋萎縮性側索硬化症、サルコイドーシス、糸球体腎炎、慢性腎疾患、膀胱炎、乾癬（乾癬性関節炎を含む）、汗腺膿瘍、皮下脂肪組織炎、壊疽性膿皮症、ＳＡＰＨＯ症候群（滑膜炎、ざ瘡、膿疱症、骨化過剰症、および骨炎）、ざ瘡、スウィート症候群、天疱瘡、クローン病（腸外の症状発現を含む）、潰瘍性大腸炎、気管支喘息、過敏性肺臓炎、一般的なアレルギー、アレルギー性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、ウェジナー肉芽腫症、川崎病、巨細胞性動脈炎、チャーグストラウス脈管炎、結節性多発性動脈炎、火傷、対宿主性移植片病、宿主対移植片反応、臓器または骨髄移植後の拒絶反応の発現、脈管炎の全身的および局所的状態全般、全身性および円板状エリテマトーデス、多発性筋炎および皮膚筋炎、強皮症、子癇前症、急性および慢性膵炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、眼の手術（例えば、白内障（眼水晶体置換）もしくは緑内障手術）、関節手術（関節鏡視下手術を含む）、関節関連構造（例えば、靭帯）の手術、口および／または口腔外科手術、侵襲性が最小である心血管手技（例えば、ＰＴＣＡ、アテレクトミー、ステント置換）、腹腔鏡下および／または内視鏡下の腹腔内および婦人科手技、内視鏡下の泌尿器科手技（例えば、前立腺手術、尿管鏡検査、膀胱鏡検査、間質性膀胱炎）後などの手術後炎症全般、または手術時の炎症（予防）全般、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ベル麻痺、クロイツフェルトヤコブ病、がんに関連する骨溶解、がんに関連する炎症、がんに関連する疼痛、がんに関連する悪液質、骨転移、ＴＮＦαの中枢効果によって引き起こされていているか、または末梢効果によって引き起こされているかにかかわりなく、炎症型疼痛、または侵害受容性疼痛、または神経障害性疼痛のタイプと分類されているかにかかわりなく、急性型および慢性型の疼痛、坐骨神経痛、腰痛、手根管症候群、複合性局所疼痛症候群（ＣＲＰＳ）、痛風、疱疹後神経痛、線維筋痛症、局所的疼痛状態、腫瘍の転移による慢性疼痛症候群、月経困難症、細菌性、ウイルス性、または真菌性敗血症、結核、ＡＩＤＳ、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈疾患、高血圧、脂質異常症、心不全、および慢性心不全からなる群より選択される、項目５２に記載の方法。

本発明は、安定性、可溶性、インビトロおよびインビボでのＴＮＦαの結合、ならびに低免疫原性に対して最適化されており、特定の軽鎖配列および重鎖配列を含む、ＴＮＦαに特異的な、安定かつ可溶性のｓｃＦｖ抗体およびＦａｂフラグメントを提供する。前記抗体は、ＴＮＦα媒介性障害の診断および／または処置のためにデザインされている。本発明の組換え抗体を発現するための核酸、ベクター、および宿主細胞、これらを単離するための方法、ならびに医薬における前記抗体の使用も開示する。

図１は、ＴＮＦαへの結合（Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ）、およびその活性の中和（Ｌ９２９アッセイ）における、４４個の抗ＴＮＦ ＲａｂＭａｂハイブリドーマからの上清の相対的能力を示す図である。 図１は、ＴＮＦαへの結合（Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ）、およびその活性の中和（Ｌ９２９アッセイ）における、４４個の抗ＴＮＦ ＲａｂＭａｂハイブリドーマからの上清の相対的能力を示す図である。 図２は、ＴＮＦαへの選択的結合における、２０個の抗ＴＮＦ ＲａｂＭａｂ単鎖抗体および７個のヒト化抗ＴＮＦ単鎖抗体の能力を示す図である（ＥＬＩＳＡ分泌アッセイ、このアッセイでは細菌培養からの上清を用い、これは、単鎖抗体の含有量について正規化しなかったことに留意されたい）。 図３は、ヒトＴＮＦαに対するＥＰ４３ｍａｘの結合動態（図３Ａ）およびＥＰ３４ｍａｘの結合動態（図３Ｂ）を示す図である。 図３は、ヒトＴＮＦαに対するＥＰ４３ｍａｘの結合動態（図３Ａ）およびＥＰ３４ｍａｘの結合動態（図３Ｂ）を示す図である。 図４は、ＥＰ４３ｍａｘの効力（白四角）、ＥＳＢＡ１０５の効力（黒丸）を示す図である。ＥＰ４３ｍａｘのＥＣ５０は１ｎｇ／ｍｌであり、ＥＳＢＡ１０５のＥＣ５０は６．５ｎｇ／ｍｌである。 図５は、熱アンフォールディングアッセイ（ＦＴＩＲ）における、ＥＰ４３ｍａｘ、ＥＰ６ｍａｘ、およびＥＰ１９ｍａｘの成績を示す図である。 図６は、ＦＴＩＲ分析によって比較した、ＥＰ４３ｍａｘおよびその誘導体の熱変性曲線を示す図である。 図７は、熱ストレス試験におけるＥＰ４３ｍａｘ（図７Ａ）およびそのＥＰ４３ｍｉｎｍａｘ改変体（図７Ｂ）の比較を示す図である。 図８は、ウサギモノクローナル抗体からの抗原結合性部位を、高度に可溶性かつ安定なヒト抗体フレームワーク中に融合させるのに本明細書で用いられるＣＤＲ Ｈ１の定義を示す図である。 図９ａは、組換えヒトＴＮＦα１０００ｐｇ／ｍｌの細胞毒性活性を阻止する、Ｅｐｉ３４ｍａｘおよびアダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）の効力を示す図である（マウスＬ９２９細胞）。Ｅｐ３４ｍａｘおよびアダリムマブに対するＩＣ_５０はそれぞれ１．０３ｎｇ／ｍｌおよび８．４６ｎｇ／ｍｌであると決定された。図９ｂは、組換えヒトＴＮＦα１０ｐｇ／ｍｌの細胞毒性活性を阻止する、アダリムマブおよびＥｐ３４ｍａｘの効力を示す図である（ヒトＫｙｍ−１細胞）。インフリキシマブおよびＥｐ３４ｍａｘ（７９１）に対するＩＣ_５０はそれぞれ６６．２ｎｇ／ｍｌおよび０．６９ｎｇ／ｍｌであると決定された。 図１０ａは、組換えヒトＴＮＦα１０００ｐｇ／ｍｌの細胞毒性活性を阻止する、Ｅｐｉ３４ｍａｘおよびインフリキシマブの効力を示す図である（マウスＬ９２９細胞）。Ｅｐ３４ｍａｘおよびインフリキシマブに対するＩＣ_５０はそれぞれ１．０４ｎｇ／ｍｌおよび１３．９ｎｇ／ｍであると決定された。図１０ｂは、組換えヒトＴＮＦα１０ｐｇ／ｍｌの細胞毒性活性を阻止する、インフリキシマブおよびＥｐ３４ｍａｘ（７９１）の効力を示す図である（ヒトＫｙｍ−１細胞）。インフリキシマブおよびＥｐ３４ｍａｘに対するＩＣ_５０はそれぞれ１４．８ｎｇ／ｍｌおよび０．６３ｎｇ／ｍｌであると決定された。 図１１は、ＥＳＢＡ９０３と比較したＥｐ３４ｍａｘのアミドＩバンド領域における、フーリエ変換赤外線スペクトルからフィットさせたＢｉｏＡＴＲ ＦＴ−ＩＲ熱変性プロファイルを示す図である。ＥＳＢＡ９０３のＶ５０は７１．１２であり、ＥＰ３４ｍａｘでは７１．５０であり、ＥＳＢＡ９０３の勾配は２．４８１、ＥＰ３４ｍａｘでは２．５４０であった。 図１２は、Ｅｐ３４ｍａｘおよびＥＳＢＡ９０３ ｓｃＦｖ抗体のＤＳＣ熱アンフォールディング曲線を示す図である。ＥＰ３４ｍａｘのＴｍは７８．１１℃であり、ＥＳＢＡ９０３に対するＴｍは７６．１９℃である。

（発明の詳細な説明）
本発明の全般的目的は、インビトロおよびインビボでＴＮＦαに特異的に結合する、安定かつ可溶性のイムノバインダーを提供することである。好ましい一実施形態において、前記抗体誘導体は、ｓｃＦｖ抗体またはＦａｂフラグメントである。本発明のイムノバインダーは軽鎖および／または重鎖を含んでいるのが好ましい。

（定義）
本発明がより容易に理解され得るために、ある種の用語を以下の通りに定義する。さらなる定義を、詳細な説明を通して記載する。

本明細書で用いられる「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」の同義語である。本発明による抗体は、免疫グロブリン全体、または、単一可変ドメインであるＦｖ（Ｓｋｅｒｒａ Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ．（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、１０３８〜４１頁）、ｓｃＦｖ（Ｂｉｒｄ， Ｒ． Ｅ．ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻４２３〜２６頁；Ｈｕｓｔｏｎ， Ｊ． Ｓ．ら（１９８８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻、５８７９〜８３頁）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、もしくは当業者には周知の他のフラグメントなどの、免疫グロブリンの可変ドメインを少なくとも１つ含む、免疫グロブリンのフラグメントであってよい。

「ＣＤＲ」という用語は、抗原の結合に主に寄与する抗体の可変ドメイン内の６つの超可変領域の１つを意味する。６つのＣＤＲに対して最も一般的に用いられる定義の１つは、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら、（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、９１〜３２４２頁によって提供されたものである。本明細書で用いられるように、ＣＤＲのＫａｂａｔの定義は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｌ３、またはＬ１、Ｌ２、Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインのＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、またはＨ２、Ｈ３）に対してのみあてはまる。しかし、本明細書で用いられる場合、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１（ＣＤＲ Ｈ１またはＨ１）は以下の残基によって定義される（Ｋａｂａｔナンバリング）：位置２６で始まり位置３６の前で終了する残基。これは、基本的には、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｉａにより異なって定義されるＣＤＲ Ｈ１の融合物である（説明のために図８も参照されたい）。

本明細書で用いられる「抗体フレームワーク」という用語は、この可変ドメインの抗原結合性ループ（ＣＤＲ）に対する骨格として働く、ＶＬまたはＶＨいずれかの可変ドメインの部分を意味する。本質的に、これはＣＤＲのない可変ドメインである。

「単鎖抗体」、「単鎖Ｆｖ」、または「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーによって連結されている抗体重鎖可変ドメイン（または領域；Ｖ_Ｈ）および抗体軽鎖可変ドメイン（または領域；Ｖ_Ｌ）を含む分子を意味するものとされる。このようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ_２−Ｖ_Ｌ−リンカー−Ｖ_Ｈ−ＣＯＯＨまたはＮＨ_２−Ｖ_Ｈ−リンカー−Ｖ_Ｌ−ＣＯＯＨを有することができる。

「イムノバインダー」という用語は、抗体の抗原結合部位の全てまたは一部分（例えば、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインの全てまたは一部分）を含む分子を意味し、そのためイムノバインダーは、標的の抗原を特異的に認識する。イムノバインダーの非限定的な例としては、全長の免疫グロブリン分子およびｓｃＦｖ、および、これらに限定されないが、（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ、およびＣ_Ｈ１ドメインからなる１価のフラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）_２フラグメント、（ｉｉｉ）Ｆａｂ’フラグメント、（ｉｖ）Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｖ）抗体の単腕のＶ_ＬおよびＶ_ＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖｉ）Ｖ_ＨもしくはＶ_ＬドメインからなるＤａｂフラグメント、ラクダ抗体、またはサメ抗体（例えば、ｓｈａｒｋ Ｉｇ−ＮＡＲｓ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））などの単一のドメインの抗体、ならびに（ｖｉｉ）可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む重鎖領域であるナノボディ、を含む抗体フラグメントが挙げられる。

抗体の重鎖および軽鎖の可変領域におけるアミノ酸残基の位置を同定するのに本明細書で用いられるナンバリングシステムは、Ａ． Ｈｏｎｅｇｇｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３０９巻（２００１年）６５７〜６７０頁によって定義されるものに相当する（ＡＨｏシステム）。ＡＨｏシステムとＫａｂａｔら（Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ．ら（１９９１年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、第９１〜３２４２）によって定義される最も一般的に用いられているシステムとの間の変換表は、Ａ．Ｈｏｎｅｇｇｅｒ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３０９巻（２００１年）、６５７〜６７０頁にもたらされる。

「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原（例えば、ＴＮＦ）上の部位を意味する。エピトープは、典型的には、独特の空間的な立体配置における、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸を含む。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６６巻、Ｇ． Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ編集（１９９６年）を参照されたい。

「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」、および「特異的に結合する」という用語は、抗体が所定の抗原上のエピトープに結合することを意味する。典型的には、抗体は、約１０^−８Ｍ、約１０^−９Ｍ、もしくは約１０^−１０Ｍ未満、またはそれよりさらに低いなどの、約１０^−７未満の親和性（Ｋ_Ｄ）で結合する。

「Ｋ_Ｄ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を意味する。典型的には、本発明の抗体は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ機器において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いて決定するとき、約１０^−８Ｍ、約１０^−９Ｍ、もしくは約１０^−１０Ｍ未満、またはそれよりさらに低いなどの、約１０^−７未満の解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）でＴＮＦに結合する。

本明細書で用いられる「同一性」は、２つのポリペプチド間、分子間、または２つの核酸間でマッチする配列を意味する。比較された２つの配列の両方における位置が同じ塩基、または同じアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合（例えば、各々の２つのＤＮＡ分子におけるある位置がアデニンによって占められている場合、または各々の２つのポリペプチドにおけるある位置がリジンによって占められている場合）、それぞれの分子はその位置で同一である。２つの配列間の「パーセント同一性」は、２つの配列が共有するマッチする位置（ｍａｔｃｈｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）数を、比較する位置数によって除して１００をかけた関数である。例えば、２つの配列における１０個の位置のうち６個がマッチした場合、この２つの配列は６０％の同一性を有する。一例として、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴとは５０％の同一性を共有する（全部で６個の位置のうち３個がマッチしている）。一般的に、２つの配列を、最大の同一性をもたらすように整列させた場合に比較が行われる。このようなアラインメントは、例えば、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）などのコンピュータプログラムによって便利に実行される、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、（１９７０年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４３〜４５３頁の方法を用いて提供され得る。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、ギャップレングスペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み入れられたＥ． ＭｅｙｅｒｓおよびＷ． Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．、４巻１１〜１７頁（１９８８年））を用いてやはり決定することができる。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、およびギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４、およびレングスウェイト１、２、３、４、５、または６を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて入手可能）においてＧＡＰプログラム中に組み入れられた、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４４〜４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムを用いて決定され得る。

「類似の」配列は、整列した場合に、同一および類似のアミノ酸残基を共有する配列であり、この場合、類似の残基は、整列した参照配列における対応するアミノ酸残基に対する保存的置換である。この点において、参照配列における残基の「保存的置換」は、対応する参照の残基に物理的または機能的に類似する残基、例えば、類似のサイズ、形状、電荷、化学的特性（共有結合または水素結合を形成する能力などを含む）を有する残基による置換である。したがって、「保存的置換改変」配列は、１つまたは複数の保存的置換が存在する点で、参照配列または野生型の配列とは異なるものである。２つの配列間の「パーセント類似性」は、２つの配列が共有するマッチする残基または保存的置換を含む位置の数を、比較する位置の数によって除して１００をかけた関数である。例えば、２つの配列における１０個の位置のうち６個がマッチし、１０個の位置のうち２個が保存的置換を含んでいる場合、この２つの配列は８０％ポジティブな類似性を有する。

本明細書で用いられる「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合性の特徴にネガティブな影響を及ぼさず、またはそれを変更しないアミノ酸の改変を意味するものとされる。このような保存的配列改変には、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、付加、および欠失が含まれる。例えば、改変は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性の変異誘発など、当該分野で公知の標準技術によって導入されてよい。アミノ酸の保存的置換には、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものが含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、無極性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝した側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、ヒト抗ＶＥＧＦ抗体における予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同一の側鎖のファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。抗原結合性を除去しない、ヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を同定する方法は当該分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３２巻、１１８０〜１１８７頁（１９９３年）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１２巻（１０）：８７９〜８８４頁（１９９９年）；およびＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９４巻、４１２〜４１７頁（１９９７年）を参照されたい）。

本明細書で用いられる「アミノ酸コンセンサス配列」は、少なくとも２つ、好ましくはそれを超える整列しているアミノ酸配列のマトリックスを用い、各位置の最も高頻度のアミノ酸残基を決定することが可能であるように、アラインメントにおけるギャップを可能にすることで産生することができるアミノ酸配列を意味する。コンセンサス配列は、各位置で最も高頻度に現れるアミノ酸を含む配列である。２つまたはそれを超えるアミノ酸が単一の位置で等しく現れる場合は、コンセンサス配列にはこれらのアミノ酸の両方または全てが含まれる。

タンパク質のアミノ酸配列は、様々なレベルで分析することができる。例えば、保存または変動性は、単一残基レベルで、複数残基レベルで、ギャップを有する複数の残基などで表されてよい。残基は、同一の残基の保存を示すことがあり、またはクラスレベルで保存されることがある。アミノ酸のクラスの例としては、極性無電荷Ｒ群（セリン、スレオニン、アスパラギン、およびグルタミン）、正電荷Ｒ群（リジン、アルギニン、およびヒスチジン）、負電荷Ｒ群（グルタミン酸、およびアスパラギン酸）、疎水性Ｒ群（アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、およびチロシン）、ならびに特別なアミノ酸（システイン、グリシン、およびプロリン）が挙げられる。他のクラスは当業者には公知であり、構造決定または置換可能性を評価するための他のデータを用いて定義し得る。この意味において、置換可能なアミノ酸は、その位置で、置換され得、機能的保存を維持し得る、任意のアミノ酸を意味し得る。

しかし、同じクラスのアミノ酸は、その生物物理学的特性によってある程度変動することがあることが理解される。例えば、ある種の疎水性Ｒ群（例えば、アラニン、セリン、またはスレオニン）は、他の疎水性Ｒ群（例えば、バリンまたはロイシン）よりも親水性である（すなわち、親水性が高いか、または疎水性が低い）ことが理解される。相対的な親水性または疎水性は、当該分野で認められている方法を用いて決定することができる（例えば、Ｒｏｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻、８３４〜８３８頁（１９８５年）、およびＣｏｒｎｅｔｔｅら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１９５巻、６５９〜６８５頁（１９８７年）を参照されたい）。

本明細書で用いられる通り、１つのアミノ酸配列（例えば、最初のＶ_ＨまたはＶ_Ｌの配列）が１つまたは複数のさらなるアミノ酸配列（例えば、データベースにおける１つまたは複数のＶＨまたはＶＬの配列）と整列する場合、１つの配列（例えば、最初のＶ_ＨまたはＶ_Ｌの配列）におけるアミノ酸の位置は、上記の１つまたは複数のさらなるアミノ酸配列における「対応する位置」と比較されてよい。本明細書で用いられる「対応する位置」は、配列を最適に整列した場合の、すなわち、最高のパーセント同一性またはパーセント類似性を達成するように配列を整列した場合の、比較される（１つまたは複数の）配列における等しい位置を意味する。

本明細書で用いられる「キメラの」イムノバインダーは、特定の種に由来するか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列に同一かまたは相同である、重鎖および／または軽鎖の部分を有し、一方（１つまたは複数の）鎖の残りは、別の種に由来するか、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体およびそのような抗体のフラグメントにおける対応する配列に同一かまたは相同である。本明細書で用いられるヒト化抗体は、キメラ抗体のサブセットである。

本明細書で用いられる「ヒト化抗体」は、外来の抗原に対する免疫反応を回避するために組換えＤＮＡ技術を用いて合成されたイムノバインダーである。ヒト化は、外因性供給源のモノクローナル抗体の免疫原性を低減するために十分に確立されている技術である。ヒト化抗体は、ヒト化重鎖可変領域、ヒト化軽鎖可変領域、および完全ヒト定常ドメインからなる。可変領域のヒト化は、アクセプターフレームワークの選択、典型的にはヒトアクセプターフレームワークの選択、可変ドメインアクセプターフレームワーク中に挿入すべきドナーのイムノバインダーからのＣＤＲの程度、およびドナーのフレームワークからアクセプターフレームワーク中への残基の置換に関連する。ＣＤＲをヒトアクセプターフレームワーク中に融合させるための一般的方法は、その全文が参照によって本明細書に援用されるＷｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号によって開示されている。その教示が参照によってその全文において援用される米国特許第６，４０７，２１３号は、ドナーのイムノバインダーからの置換が好ましいフレームワークの数々のアミノ酸位置を開示している。

本明細書で用いられる「機能特性」という用語は、例えば、ポリペプチドの製造上の特性または治療効能を改善するために、改善（例えば、従来のポリペプチドに比べて）が望ましく、かつ／または当業者にとって有利であるポリペプチド（例えば、イムノバインダー）の特性である。一実施形態において、機能特性は改善された安定性（例えば、熱安定性）である。別の一実施形態において、機能特性は改善された溶解性（例えば、細胞性条件下の）である。さらに別の一実施形態において、機能特性は非凝集性である。なお別の一実施形態において、機能特性は、（例えば、原核細胞における）発現における改善である。さらに別の一実施形態において、機能特性は、封入体精製プロセス後のリフォールディング収率の改善である。ある実施形態において、機能特性は抗原結合親和性における改善ではない。

「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を意味する。核酸分子は一本鎖でも、または二本鎖でもよいが、二本鎖ＤＮＡが好ましい。核酸は、別の核酸配列と機能的関係において配置された場合、「作動可能に連結して」いる。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、その配列に作動可能に連結している。

「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を運搬することができる核酸分子を意味する。ベクターの１タイプが「プラスミド」であり、これはその中にさらなるＤＮＡセグメントをライゲーション（ｌｉｇａｔｅ）することができる環状の二本鎖ＤＮＡのループを意味する。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中にライゲーションすることができる。ある種のベクターは、導入される宿主細胞において、自律的に複製することできる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）を、宿主細胞中への導入に際し宿主細胞のゲノム中に組み込むことができ、それによって、それらのベクターは宿主のゲノムと一緒に複製される。

「宿主細胞」という用語は、その中に発現ベクターが導入されている細胞を意味する。宿主細胞としては、細菌細胞、微生物細胞、植物細胞、または動物細胞が挙げられ得る。形質転換を受けやすい細菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたはサルモネラ属の菌株などの腸内細菌科のメンバー、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのバチルス属、肺炎球菌、連鎖球菌およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅが挙げられる。適切な微生物としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。適切な動物宿主細胞系としては、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）およびＮＳ０細胞が挙げられる。

「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、本明細書に記載する治療的手段または予防的手段を意味する。「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」の方法は、障害または再発性の障害の１つまたは複数の症状を予防、治癒、遅延、症状の重症度の低減、または回復させるために、あるいは処置の非存在下で予想されるものを上回って被験体の生存を延長するために、処置を必要とする被験体、例えば、ＴＮＦα媒介性障害を有する被験体またはそのような障害を最終的に得る可能性がある被験体に対する本発明の抗体の投与を使用する。

「ＴＮＦ媒介性障害」または「ＴＮＦ媒介性疾患」という用語は、症状または疾患状態の発症、進行、または持続がＴＮＦの関与を必要とする任意の障害を意味する。例示的ＴＮＦ媒介性障害としては、それだけには限定されないが、炎症の慢性状態および／または自己免疫状態全般、免疫媒介性炎症性障害全般、炎症性ＣＮＳ疾患、眼、関節、皮膚、粘膜、中枢神経系、消化管、尿路、または肺を冒す炎症性疾患、ブドウ膜炎の状態全般、網膜炎、ＨＬＡ−Ｂ２７＋ブドウ膜炎、ベーチェット病、眼乾燥症候群、緑内障、シェーグレン症候群、真性糖尿病（糖尿病性神経障害を含む）、インスリン抵抗性、関節炎の状態全般、慢性関節リウマチ、変形性関節症、反応性関節炎およびライター症候群、若年性関節炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、ギランバレー症候群、重症筋無力症、筋萎縮性側索硬化症、サルコイドーシス、糸球体腎炎、慢性腎疾患、膀胱炎、乾癬（乾癬性関節炎を含む）、汗腺膿瘍、皮下脂肪組織炎、壊疽性膿皮症、ＳＡＰＨＯ症候群（滑膜炎、ざ瘡、膿疱症、骨化過剰症、および骨炎）、ざ瘡、スウィート症候群、天疱瘡、クローン病（腸外の症状発現（ｍａｎｉｆｅｓｔａｓｔａｔｉｏｎ）を含む）、潰瘍性大腸炎、気管支喘息、過敏性肺臓炎、一般的なアレルギー、アレルギー性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、ウェジナー肉芽腫症、川崎病、巨細胞性動脈炎、チャーグストラウス脈管炎、結節性多発性動脈炎、火傷、対宿主性移植片病、宿主対移植片反応、臓器または骨髄移植後の拒絶反応の発現、脈管炎の全身的および局所的状態全般、全身性および円板状エリテマトーデス、多発性筋炎および皮膚筋炎、強皮症、子癇前症、急性および慢性膵炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、眼の手術（例えば、白内障（眼水晶体置換）もしくは緑内障手術）、関節手術（関節鏡視下手術を含む）、関節関連構造（例えば、靭帯）の手術、口および／または口腔外科手術、侵襲性が最小である心血管手技（例えば、ＰＴＣＡ、アテレクトミー、ステント置換）、腹腔鏡下および／または内視鏡下の腹腔内および婦人科手技、内視鏡下の泌尿器科手技（例えば、前立腺手術、尿管鏡検査、膀胱鏡検査、間質性膀胱炎）後などの手術後炎症全般、または手術時の炎症（予防）全般、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ベル麻痺、クロイツフェルトヤコブ病、がんに関連する骨溶解、がんに関連する炎症、がんに関連する疼痛、がんに関連する悪液質、骨転移、ＴＮＦαの中枢効果によって引き起こされているか、または末梢効果によって引き起こされているかにかかわりなく、炎症型疼痛、または侵害受容性疼痛、または神経障害性疼痛のタイプと分類されているかにかかわりなく、急性型および慢性型の疼痛、坐骨神経痛、腰痛、手根管症候群、複合性局所疼痛症候群（ＣＲＰＳ）、痛風、疱疹後神経痛、線維筋痛症、局所的疼痛状態、腫瘍の転移による慢性疼痛症候群、月経困難症（ｄｉｓｍｅｎｏｒｒｈｅａ）、細菌性、ウイルス性、または真菌性敗血症、結核、ＡＩＤＳ、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈疾患、高血圧、脂質異常症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、心不全、および慢性心不全が挙げられる。「有効用量（ｄｏｓｅ）」、または「有効投与量（ｄｏｓａｇｅ）」という用語は、所望の効果を達成するのに、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量を意味する。「治療有効量」という用語は、すでに疾患に罹患している患者における疾患およびその合併症を治すか、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量と定義される。この使用に効果的な量は、処置する障害の重症度、および患者自身の免疫系の全体的状態による。

「被験体」という用語は、任意のヒトまたは非ヒトの動物を意味する。例えば、本発明の方法および組成物を、ＴＮＦ媒介性障害を有する被験体を処置するのに用いることができる。

「ウサギ類（ｌａｇｏｍｏｒｐｈ）」という用語は、Ｌｅｐｏｒｉｄａｅ科（例えば、ノウサギおよびウサギ（ｒａｂｂｉｔ））ならびにＯｃｈｏｔｏｎｉｄａｅ科（ナキウサギ）を含めた、分類学上のＬａｇｏｍｏｒｐｈａ目のメンバーを意味する。最も好ましい一実施形態において、ウサギ類はウサギである。本明細書で用いられる「ウサギ」という用語は、ｌｅｐｏｒｉｄａｅ科に属する動物を意味する。

産生したイムノバインダーに対して様々な用語体系を用いた。これらは、数字（例えば、♯３４）によって通常同定される。ＥＰまたはＥＰｉなどの接頭辞を用いた場合は（例えば、Ｅｐｉ３４もしくは♯３４と同一であるＥＰ３４）、それらによって同じイムノバインダーが示される。

別段の定義がなければ、本明細書で用いる技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野における通常の技術者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明を実施または試験する上で、本明細書に記載したものと類似または等価の方法および材料を用いることができるが、適切な方法および材料を下に記載する。矛盾する場合には、定義を含めた本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図しない。

本発明の様々な態様を、以下のサブセクションにおいてさらに詳しく記載する。様々な実施形態、選択、および範囲を任意に組み合わせることができることが理解される。さらに、特定の実施形態によっては、選択された定義、実施形態、または範囲を適用しなくてもよい。

（抗ＴＮＦα抗体）
一態様において、本発明は、ＴＮＦαに結合し、したがってインビボでＴＮＦαの機能を阻止するのに適するイムノバインダーを提供する。これらイムノバインダーのＣＤＲは、米国特許第７，４３１，９２７号に開示されるウサギ抗ＴＮＦαモノクローナル抗体に由来する。ウサギ抗体は特に高い親和性を有することが公知である。さらに、本明細書に開示するＣＤＲ配列は天然の配列であり、これは、得られたイムノバインダーの親和性成熟は行われる必要がないことを意味している。好ましい一実施形態において、イムノバインダーはインビボでＴＮＦαを中和する。

ある実施形態において、本発明はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、またはＣＤＲＬ３のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む、ＴＮＦαに特異的に結合するイムノバインダーを提供する。本発明のイムノバインダーにおいて用いるための例示的ＣＤＲアミノ酸配列を、配列番号３〜５０（表１）に記載する。配列番号３〜５０に記載するＣＤＲは、当該分野で認められている任意の方法を用いて、任意の適切な結合性骨格上に融合させることができる（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ．ら、（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３〜３２７頁；Ｊｏｎｅｓ， Ｐ．ら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻、５２２〜５２５；Ｑｕｅｅｎ， Ｃ．ら（１９８９年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｅｅ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６巻、１００２９〜１００３３頁；Ｗｉｎｔｅｒへの米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにＱｕｅｅｎらへの米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号を参照されたい）。異なる親の抗体からのＣＤＲを１つの抗体中に合わせて、さらなる抗体種を産生してもよい。しかし、本明細書に開示するイムノバインダーは、ヒト化され、したがって治療的適用に適することが好ましい。

したがって、一実施形態において、本発明は、
（ｉ）重鎖可変領域が、ヒト重鎖可変フレームワーク配列、ならびにウサギイムノバインダーに由来するＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、およびＣＤＲ Ｈ３配列を含む、ヒト化重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／または
（ｉｉ）軽鎖可変領域が、ヒト軽鎖可変フレームワーク配列、ならびにウサギイムノバインダーに由来するＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、およびＣＤＲ Ｌ３配列を含む、ヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、ヒトＴＮＦαに特異的に結合するイムノバインダーを提供する。

当該分野では公知のように、ウサギＶＨ鎖の多くは、マウスおよびヒトの対応物と比較して、余分なシステイン対を有する。ｃｙｓ２２とｃｙｓ９２との間に形成される保存されているジスルフィド架橋のほかに、ｃｙｓ２１−ｃｙｓ７９架橋、ならびにいくつかのウサギ鎖におけるＣＤＲ Ｈ１の最後の残基とＣＤＲ Ｈ２の最初の残基との間に形成されるＣＤＲ間Ｓ−Ｓ架橋も存在する。さらに、システイン残基の対は、しばしばＣＤＲ−Ｌ３に見られる。さらに、ウサギ抗体ＣＤＲの多くは、あらゆる以前に公知の標準的構造に属さない。とりわけ、ＣＤＲ−Ｌ３は、ヒトまたはマウスの対応物のＣＤＲ−Ｌ３よりもずっと長いことが多い。

ウサギに加えて、本発明は、任意のウサギ類のＣＤＲを融合させるのに用いることができる。

抗体の場合は、配列番号３〜５０に記載したウサギＣＤＲを、任意の種からの任意の抗体のフレームワーク領域中に融合させてもよい。しかし、いわゆる「品質管理」スクリーニング（ＷＯ１４８０１７）において同定されたフレームワークを含む抗体または抗体誘導体は、一般的に高い安定性および／または溶解性を特徴としており、したがって、ヒトＴＮＦαの中和などの細胞外の適用の状況においても有用であり得ることが以前に発見されている。さらに、これらＶＬ（可変軽鎖）およびＶＨ（可変重鎖）の可溶性かつ安定性のフレームワークの１つの特定の組合せが、ウサギＣＤＲを収容するのにとりわけ適していることがさらに発見されている。驚くべきことに、前記フレームワークまたはその誘導対中に融合させる際に、多種多様なウサギＣＤＲのループコンフォメーションが、ドナーのフレームワークの配列とは殆ど無関係に、完全に維持され得ることが見出された。さらに、様々なウサギＣＤＲを含む前記フレームワークまたはその誘導体は、ウサギ野生型単鎖とは反対に良好に発現されて良好に生成され、オリジナルのドナーのウサギ抗体の親和性を依然として殆ど完全に保持している。したがって、一実施形態において、配列番号３〜５０に記載したＣＤＲを、ＥＰ１４７９６９４に開示される「品質管理」スクリーニングに由来するヒト抗体フレームワーク中に融合させる。本発明で用いるための例示的フレームワークのアミノ酸配列を、以下の配列番号１および２

に記載する。

Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸であってよい。少なくとも３個から最高５０個のアミノ酸が存在してよい。ＣＤＲは、典型的にＸが存在する部位中に挿入される。

他の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＶＨまたはＶＬアミノ酸配列を含む、ＴＮＦαに特異的に結合するイムノバインダーを提供する。本発明のイムノバインダーにおいて用いるための例示的ＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列を、配列番号５１〜１１１に記載する。

ある実施形態において、本発明は、配列番号５１〜１１１に記載するアミノ酸配列に実質的な類似性を有するアミノ酸配列を含む、ＴＮＦαに特異的に結合するイムノバインダーをさらに提供し、イムノバインダーは本発明の抗ＴＮＦαイムノバインダーの所望の機能特性を保持または改善する。例示的類似性パーセント値としては、それだけには限定されないが、約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性が挙げられる。

ある実施形態において、本発明は、配列番号５１〜１１１に記載するアミノ酸配列に実質的な同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＴＮＦαに特異的に結合するイムノバインダーをさらに提供し、イムノバインダーは本発明の抗ＴＮＦαイムノバインダーの所望の機能特性を保持または改善する。例示的同一性パーセント値としては、それだけには限定されないが、約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性が挙げられる。

ある実施形態において、本発明は、配列番号５１〜１１１に記載するアミノ酸配列に対する保存的置換を有するアミノ酸配列を含む、ＴＮＦαに特異的に結合するイムノバインダーをさらに提供し、イムノバインダーは本発明の抗ＴＮＦαイムノバインダーの所望の機能特性を保持または改善する。

最も好ましい一実施形態において、本発明のイムノバインダーは、配列番号３〜５０のいずれか１つに少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるＣＤＲ配列を少なくとも１つ含む。

本発明の好ましい一実施形態において、配列番号３〜８からなる群のＣＤＲを少なくとも１つ、好ましくは２つ、３つ、４つ、５つ、または最も好ましくは６つ含むイムノバインダーを提供する。

本発明の別の好ましい一実施形態において、配列番号９〜１４からなる群のＣＤＲを少なくとも１つ、好ましくは２つ、３つ、４つ、５つ、または最も好ましくは６つ含むイムノバインダーを提供する。

本発明の別の好ましい一実施形態において、配列番号１５〜２０からなる群のＣＤＲを少なくとも１つ、好ましくは２つ、３つ、４つ、５つ、または最も好ましくは６つ含むイムノバインダーを提供する。

本発明の別の好ましい一実施形態において、配列番号２１〜２６からなる群のＣＤＲを少なくとも１つ、好ましくは２つ、３つ、４つ、５つ、または最も好ましくは６つ含むイムノバインダーを提供する。

本発明の別の好ましい一実施形態において、配列番号２７〜３２からなる群のＣＤＲを少なくとも１つ、好ましくは２つ、３つ、４つ、５つ、または最も好ましくは６つ含むイムノバインダーを提供する。

本発明の別の好ましい一実施形態において、配列番号３３〜３８からなる群のＣＤＲを少なくとも１つ、好ましくは２つ、３つ、４つ、５つ、または最も好ましくは６つ含むイムノバインダーを提供する。

本発明の別の好ましい一実施形態において、配列番号３９〜４４からなる群のＣＤＲを少なくとも１つ、好ましくは２つ、３つ、４つ、５つ、または最も好ましくは６つ含むイムノバインダーを提供する。

本発明の別の好ましい一実施形態において、配列番号４５〜５０からなる群のＣＤＲを少なくとも１つ、好ましくは２つ、３つ、４つ、５つ、または最も好ましくは６つ含むイムノバインダーを提供する。

本明細書の配列番号３〜５０において提供するＣＤＲ配列は、置換をさらに含むことができる。

好ましくは、配列は、３つ、より好ましくは２つ、最も好ましくはたった１つの置換を有する。前記置換は、イムノバインダーの選択的結合能力は損なわれないが、イムノバインダーの親和性は変化され、好ましくは増強されるような置換であるのが好ましい。

別の一実施形態において、本発明は、表１に記載する１セットのＣＤＲ（Ｒａｂｍａｂクローンの１つに属するＨ１〜Ｈ３、Ｌ１〜Ｌ３）を含むモノクローナル抗体によって認識されるヒトＴＮＦα上のエピトープに結合する抗体を提供する。このような抗体は、標準のＴＮＦ結合アッセイにおいて表１の抗体と交差競合（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｅ）するその能力に基づいて同定することができる。表１の抗体のヒトＴＮＦαに対する結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がヒトＴＮＦαに対する結合に対して表１の抗体と競合することができ、したがって表１の抗体と同じヒトＴＮＦα上のエピトープに関与することを実証している。好ましい一実施形態において、表１に記載する抗体と同じヒトＴＮＦα上のエピトープに対して結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体を、本明細書に記載する通りに調製、単離することができる。

一実施形態において、本発明の抗体および抗体フラグメントは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）またはＦａｂフラグメントである。ｓｃＦｖ抗体の場合は、選択されたＶＬドメインが、柔軟なリンカーによっていずれかの配向において選択されたＶＨドメインに連結することができる。適切な最先端のリンカーは、ＧＧＧＧＳアミノ酸配列の繰返し、またはその改変体からなる。本発明の好ましい一実施形態において、（ＧＧＧＧＳ）_４リンカー（配列番号７２）またはその誘導体が用いられるが、１〜３回の繰返しの改変体も可能である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、（１９９３年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ、９０巻、６４４４〜６４４８頁）。本発明のために用いることができる他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎら、（１９９５年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、８巻、７２５〜７３１頁、Ｃｈｏｉら、（２００１年）、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１巻、９４〜１０６頁、Ｈｕら、（１９９６年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５６巻、３０５５〜３０６１頁、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、（１９９９年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９３巻、４１〜５６頁、およびＲｏｏｖｅｒｓら、（２００１年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５０巻、５１〜５９頁に記載されている。配置は、ＮＨ_２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ_２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨのいずれかであってよく、前者の配向が好ましいものである。Ｆａｂフラグメントの場合は、選択された軽鎖可変ドメインＶＬがヒトＩｇκ鎖の定常領域に融合しており、適切な重鎖可変ドメインＶＨがヒトＩｇＧの最初の（Ｎ末端の）定常ドメインＣＨ１に融合している。Ｃ末端では、２つの定常ドメイン間に鎖間ジスルフィド架橋が形成する。

本発明の抗体または抗体誘導体は、１ｆＭ〜１０μＭの範囲の解離定数Ｋ_ｄでヒトＴＮＦに対する親和性を有することができる。本発明の好ましい一実施形態において、Ｋ_ｄは≦１ｎＭである。抗原に対する抗体の親和性は、適切な方法（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ， Ｗ．Ｅ．編集、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）におけるＢｅｒｚｏｆｓｋｙら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」；Ｋｕｂｙ， Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）およびそこに記載される方法を用いて実験的に決定することができる。

好ましい抗体としては、以下のＶＨ配列およびＶＬ配列からの可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）の領域を有する抗体が挙げられる：

（ＣＤＲ配列には下線）。

（抗ＴＮＦ抗体の生成）
本発明は、品質管理（ＱＣ）アッセイによって同定された非常に可溶性かつ安定なヒト抗体フレームワークが、他の非ヒトの動物種からのＣＤＲ、例えば、ウサギＣＤＲを収容するのにとりわけ適するフレームワークであるという発見に、少なくとも部分的に基づくものである。とりわけ、本発明は、特定のヒト抗体（いわゆる「ＦＷ１．４」抗体）の軽鎖および重鎖の可変領域は、異なる結合特異性の様々なウサギ抗体からのＣＤＲに対するアクセプターとしてとりわけ適するという発見に基づくものである。ＥＳＢＡＴｅｃｈのヒト単鎖フレームワークＦＷ１．４は、ＨｅＬａ細胞において発現され、そのオリジナルのＣＤＲ（ＷＯ０３０９７６９７において開示される）と一緒に用いた場合、品質管理アッセイにおいて明らかに期待以下の作用であったが、ウサギＣＤＲなどの他のＣＤＲと組み合わせた場合、非常に安定的かつ可溶性で、良好に生成できる単鎖抗体を生じることが驚くべきことに見出された。さらに、ウサギＣＤＲをこれらの高度に適合性の軽鎖および重鎖フレームワーク中に融合させることによって産生したヒト化イムノバインダーは、ドナーのＣＤＲが由来するウサギ抗体の結合性の性質を一貫して、かつ確実に保持する。さらに、本発明の方法によって産生したイムノバインダーは、溶解性および安定性などの優れた機能特性を確実に示す。したがって、本発明の全般的な一目的は、ウサギＣＤＲおよび他の非ヒトのＣＤＲを、配列番号１（Ｋ１２７）および配列番号２（ａ４３）の可溶性かつ安定なそれぞれ軽鎖および／または重鎖ヒト抗体フレームワーク中に融合させ、それによって優れた生物物理学的性質を有するヒト化抗体を産生するための方法を提供することである。

好ましい一実施形態において、フレームワークは、重鎖フレームワーク（ＶＨ）の位置Ｈ２４、Ｈ２５、Ｈ５６、Ｈ８２、Ｈ８４、Ｈ８９、およびＨ１０８（ＡＨｏナンバリングシステム）からなる群からの位置における１つまたは複数の置換を含む。さらに、またはあるいは、フレームワークは、ＡＨｏナンバリングシステムによる軽鎖フレームワーク（ＶＨ）の位置Ｌ８７における置換を含んでいてよい。前記置換の存在は、オリジナルのドナーの抗体の親和性を殆ど完全に保持するアクセプターフレームワークを提供することを示している。より好ましい実施形態において、ＡＨｏナンバリングシステムによる位置Ｈ２４のスレオニン（Ｔ）、位置Ｈ２５のバリン（Ｖ）、位置Ｈ５６のグリシン（Ｇ）またはアラニン（Ａ）、位置Ｈ８２のリジン（Ｋ）、位置Ｈ８４のスレオニン（Ｔ）、位置Ｈ８９のバリン（Ｖ）、および位置Ｈ１０８のアルギニン（Ｒ）、ならびに位置Ｌ８７のスレオニン（Ｔ）からなる群より選択される１つまたは複数の置換がフレームワーク配列中に存在する。

したがって、さらにより好ましい一実施形態において、アクセプターフレームワークは以下、

である。

Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸であってよく、少なくとも３個から最大５０個のアミノ酸が存在してよい。ＣＤＲは典型的に、Ｘが存在する部位中に挿入される。

本発明の抗体または抗体誘導体は、組換え遺伝学の分野における日常的な技術を用いて産生することができる。ポリペプチドの配列を知り、これらをコードするｃＤＮＡを、当該分野では周知の方法によって遺伝子合成により産生することができる。これらのｃＤＮＡを適切なベクタープラスミド中にクローニングすることができる。ＶＬおよび／またはＶＨドメインをコードするＤＮＡを得た後は、例えば、変異促進性のプライマーを用いたＰＣＲによって、部位特異的変異誘発を行って様々な誘導体を得ることができる。最良の「開始」配列は、ＶＬおよび／またはＶＨ配列における望ましい変化の数に応じて選択することができる。好ましい配列はＴＢ−Ａ配列であり、その誘導体、例えば、ｓｃＦｖ配列またはＦａｂ融合ペプチド配列を、ＰＣＲが駆動する変異誘発および／またはクローニングに対するテンプレートとして選択してよい。

ＣＤＲをフレームワーク領域中に組み入れるかまたは融合させるための方法には、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ．ら、（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３〜３２７頁；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ら、（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻、５２２〜５２５頁；Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ら、（１９８９年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｅｅ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６巻、１００２９〜１００３３頁；Ｗｉｎｔｅｒへの米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにＱｕｅｅｎらへの米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号に記載されているもの、ならびに「Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ」という名称の、それぞれ２００８年６月２５日出願および２００９年２月４日出願の米国仮特許出願第６１／０７５，６９７号および同第６１／１５５，０４１号に開示されているものが含まれる。

当業者には周知の標準のクローニング技術および変異誘発技術を用いて、Ｆａｂフラグメントを生成するために、リンカーを付着し、ドメインをシャッフルし、または融合物を構築してよい。本発明の全般的方法を開示する基本的プロトコールは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ、第３版、２００１年）に、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９年）に記載されている。

ｓｃＦｖポリペプチドをコードする遺伝子を内部に持つＤＮＡ配列、またはＦａｂフラグメントの場合はＶＬ−ＣκおよびＶＨ−ＣＨ１融合物に対する２つの遺伝子を含む２つの別々の遺伝子またはバイシストロン性オペロンのいずれかをコードする遺伝子を内部に持つＤＮＡ配列が、適切な発現ベクターに、好ましくは誘導プロモーターを伴なう発現ベクターにクローニングされる。各遺伝子の前には翻訳を確実にする好適なリボゾーム結合部位が存在するよう、注意を払わなければならない。本発明の抗体は、開示した配列からなるのではなく、開示した配列を含むことが理解される。例えば、クローニングの戦略は、Ｎ末端の１つまたは少数のさらなる残基を伴なう抗体から構築物が作製されることを必要とし得る。具体的には、開始コドンに由来するメチオニンが翻訳後に切断されなかった場合、最終のタンパク質中に存在することがある。ｓｃＦｖ抗体についてのほとんどの構築物は、Ｎ末端にさらなるアラニンを生じる。本発明の好ましい一実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるペリプラズム発現のための発現ベクターが選択される（Ｋｒｅｂｂｅｒ、１９９７年）。前記ベクターは、切断可能なシグナル配列の前にプロモーターを含む。次いで、抗体ペプチドについてのコード配列を、インフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）で切断可能なシグナル配列に融合する。これにより、細菌のペリプラズム（ここでシグナル配列が切断される）への、発現されたポリペプチドのターゲティングが可能になる。次いで、抗体はフォールディングされる。Ｆａｂフラグメントの場合は、ＶＬ−Ｃκ融合物のペプチドおよびＶＨ−ＣＨ１融合物のペプチドの両方が移行シグナルに連結していなければならない。ペプチドがペリプラズムに到達した後、Ｃ末端のシステインでＳ−Ｓ共有結合が形成される。抗体の細胞質内発現が好ましい場合、前記抗体は通常、封入体から高収率で得ることができ、封入体は他の細胞フラグメントおよびタンパク質から容易に分離され得る。この場合、封入体は、例えば塩酸グアニジン（ＧｎｄＨＣｌ）などの変性剤中に可溶化され、次いで当業者には周知の復元手順によってリフォールディングされる。

ｓｃＦｖまたはＦａｂポリペプチドを発現するプラスミドを、適切な宿主、好ましくは細菌、酵母、または哺乳動物の細胞、最も好ましくは適切なＥ．ｃｏｌｉ菌株（例えば、ペリプラズムの発現についてＪＭ８３、または封入体中の発現についてＢＬ２１）の中に導入する。ポリペプチドを、ペリプラズムまたは封入体のいずれかから収集し、当業者には公知の、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、および／またはゲルろ過などの標準技術を用いて精製してよい。

本発明の抗体または抗体誘導体を、収率、溶解性、およびインビトロの安定性に関して特徴付けることができる。ＴＮＦに対する、好ましくはヒトＴＮＦαに対する結合可能性を、ＷＯ９７２９１３１に記載されている通り、組換えヒトＴＮＦを用いて、インビトロでＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡＣｏｒｅ）によって試験することができ、表面プラズモン共鳴法はまた、ｋ_ｏｆｆ速度定数の決定を可能にし、これは好ましくは１０^−３ｓ^−１未満であるべきである。≦１０ｎＭのＫ_ｄ値が好ましい。

ヒトＴＮＦに対する強力な結合親和性を有する抗体の他に、治療上の観点からの有益な性質を有する抗ＴＮＦ抗体を産生するのも望ましい。例えば、抗体は、Ｌ９２９ ＴＮＦα媒介性細胞毒性アッセイにおいて中和活性を示すものであってもよい。このアッセイにおいて、アクチノマイシンで処理したマウスＬ９２９線維芽細胞の毒性を組換えヒトＴＮＦ（ｈＴＮＦ）で誘発した。最大ｈＴＮＦ誘発性細胞毒性の９０％は、１０００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ濃度のときであることが決定された。

Ｌ９２９細胞を全て、ウシ胎仔血清（１０％ｖ／ｖ）を補ったＬ−グルタミン培地を含むフェノールレッドを含むＲＰＭＩ１６４０中で培養した。抗ＴＮＦαバインダーの中和活性を、フェノールレッドおよび５％ウシ胎仔血清を含まないＲＰＭＩ１６４０において評価した。アンタゴニスト効果が最大半量阻害（ＥＣ５０％）に到達する濃度を決定するために、様々な濃度（０〜３７４ｎｇ／ｍＬ）の抗ＴＮＦバインダーを、ｈＴＮＦ１０００ｐｇ／ｍｌの存在下でＬ９２９細胞に加える。用量反応曲線を可変勾配を伴なう非線形シグモイド回帰とフィットさせ、ＥＣ５０を計算した。

（最適化された改変体）
本発明の抗体を、機能特性の増強に対して、例えば、溶解性および／または安定性の増強に対してさらに最適化してよい。

ある実施形態において、本発明の抗体を、本明細書に参照によって援用される、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」という名称の、２００８年３月１２日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００１９５８に開示されている「機能的コンセンサス」方法論に従って最適化する。

例えば、本発明のＴＮＦαイムノバインダーを、機能的に選択されたｓｃＦｖのデータベースと比較してＶＥＧＦイムノバインダーにおける対応する（１つまたは複数の）位置よりも変動性への耐性が大きいかまたは小さいアミノ酸残基の位置を同定することができ、それによって、このように同定された残基の（１つまたは複数の）位置が、安定性および／または溶解性などの機能性を改善するように操作するのに適することがあることを指摘している。

置換のための例示的フレームワーク位置は、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」という名称の、２００８年６月２５日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＨ２００８／０００２８５、および「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」という名称の、２００８年６月２５日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＨ２００８／０００２８４に記載されている。例えば、以下の置換の１つまたは複数を、本発明のイムノバインダーの重鎖可変領域におけるアミノ酸の位置に導入することができる（以下に列挙する各アミノ酸位置に対してＡＨｏナンバリングが参照される）：
（ａ）アミノ酸位置１のＱまたはＥ；
（ｂ）アミノ酸位置６のＱまたはＥ；
（ｃ）アミノ酸位置７の、Ｔ、Ｓ、またはＡ、より好ましくはＴまたはＡ、さらにより好ましくはＴ；
（ｄ）アミノ酸位置１０の、Ａ、Ｔ、Ｐ、Ｖ、またはＤ、より好ましくはＴ、Ｐ、Ｖ、またはＤ、
（ｅ）アミノ酸位置１２の、ＬまたはＶ、より好ましくはＬ、
（ｆ）アミノ酸位置１３の、Ｖ、Ｒ、Ｑ、Ｍ、またはＫ、より好ましくはＶ、Ｒ、Ｑ、またはＭ；
（ｇ）アミノ酸位置１４の、Ｒ、Ｍ、Ｅ、Ｑ、またはＫ、より好ましくはＲ、Ｍ、ＥまたはＱ、さらにより好ましくはＲまたはＥ；
（ｈ）アミノ酸位置１９の、ＬまたはＶ、より好ましくはＬ；
（ｉ）アミノ酸位置２０の、Ｒ、Ｔ、Ｋ、またはＮ、より好ましくはＲ、Ｔ、またはＮ、さらにより好ましくはＮ；
（ｊ）アミノ酸位置２１の、Ｉ、Ｆ、Ｌ、またはＶ、より好ましくはＩ、Ｆ、またはＬ、さらにより好ましくはＩまたはＬ；
（ｋ）アミノ酸位置４５の、ＲまたはＫ、より好ましくはＫ；
（ｌ）アミノ酸位置４７の、Ｔ、Ｐ、Ｖ、ＡまたはＲ、より好ましくはＴ、Ｐ、Ｖ、またはＲ、さらにより好ましくはＲ；
（ｍ）アミノ酸位置５０の、Ｋ、Ｑ、Ｈ、またはＥ、より好ましくはＫ、Ｈ、またはＥ、さらにより好ましくはＫ；
（ｎ）アミノ酸位置５５の、ＭまたはＩ、より好ましくはＩ；
（ｏ）アミノ酸位置７７の、ＫまたはＲ、より好ましくはＫ；
（ｐ）アミノ酸位置７８の、Ａ、Ｖ、Ｌ、またはＩ、より好ましくはＡ、Ｌ、またはＩ、さらにより好ましくはＡ；
（ｑ）アミノ酸位置８２の、Ｅ、Ｒ、Ｔ、またはＡ、より好ましくはＥ、Ｔ、またはＡ、さらにより好ましくはＥ；
（ｒ）アミノ酸位置８６の、Ｔ、Ｓ、Ｉ、またはＬ、より好ましくはＴ、Ｓ、またはＬ、さらにより好ましくはＴ；
（ｓ）アミノ酸位置８７の、Ｄ、Ｓ、Ｎ、またはＧ、より好ましくはＤ、Ｎ、またはＧ、さらにより好ましくはＮ；
（ｔ）アミノ酸位置８９の、Ａ、Ｖ、Ｌ、またはＦ、より好ましくはＡ、Ｖ、またはＦ、さらにより好ましくはＶ；
（ｕ）アミノ酸位置９０の、Ｆ、Ｓ、Ｈ、Ｄ、またはＹ、より好ましくはＦ、Ｓ、Ｈ、またはＤ；
（ｖ）アミノ酸位置９２の、Ｄ、Ｑ、またはＥ、より好ましくはＤまたはＱ、さらにより好ましくはＤ；
（ｗ）アミノ酸位置９５の、Ｇ、Ｎ、Ｔ、またはＳ、より好ましくはＧ、Ｎ、またはＴ、さらにより好ましくはＧ；
（ｘ）アミノ酸位置９８の、Ｔ、Ａ、Ｐ、Ｆ、またはＳ、より好ましくはＴ、Ａ、Ｐ、またはＦ、さらにより好ましくはＦ；
（ｙ）アミノ酸位置１０３の、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、またはＬ、より好ましくはＲ、Ｑ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、またはＬ、さらにより好ましくはＹ、さらにより好ましくはＬ；および（ｚ）アミノ酸位置１０７の、Ｎ、Ｓ、またはＡ、より好ましくはＮまたはＳ、さらにより好ましくはＮ。

さらに、またはあるいは、以下の置換の１つまたは複数を、本発明のイムノバインダーの軽鎖可変領域中に導入することができる：
（ａａ）アミノ酸位置１の、Ｑ、Ｄ、Ｌ、Ｅ、Ｓ、またはＩ、より好ましくはＬ、Ｅ、Ｓ、またはＩ、さらにより好ましくはＬまたはＥ；
（ｂｂ）アミノ酸位置２の、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｉ、Ｐ、またはＴ、より好ましくはＡ、Ｙ、Ｉ、Ｐ、またはＴ、さらにより好ましくはＰまたはＴ；
（ｃｃ）アミノ酸位置３の、Ｑ、Ｖ、Ｔ、またはＩ、より好ましくはＶ、Ｔ、またはＩ、さらにより好ましくはＶまたはＴ；
（ｄｄ）アミノ酸位置４の、Ｖ、Ｌ、Ｉ、またはＭ、より好ましくはＶまたはＬ；
（ｅｅ）アミノ酸位置７の、Ｓ、Ｅ、またはＰ、より好ましくはＳまたはＥ、さらにより好ましくはＳ；
（ｆｆ）アミノ酸位置１０の、ＴまたはＩ、より好ましくはＩ；
（ｇｇ）アミノ酸位置１１の、ＡまたはＶ、より好ましくはＡ；
（ｈｈ）アミノ酸位置１２の、ＳまたはＹ、より好ましくはＹ；
（ｉｉ）アミノ酸位置１４の、Ｔ、Ｓ、またはＡ、より好ましくはＴまたはＳ、さらにより好ましくはＴ；
（ｊｊ）アミノ酸位置１８の、ＳまたはＲ、より好ましくはＳ；
（ｋｋ）アミノ酸位置２０の、ＴまたはＲ、より好ましくはＲ；
（ｌｌ）アミノ酸位置２４の、ＲまたはＱ、より好ましくはＱ；
（ｍｍ）アミノ酸位置４６の、ＨまたはＱ、より好ましくはＨ；
（ｎｎ）アミノ酸位置４７の、Ｋ、Ｒ、またはＩ、より好ましくはＲまたはＩ、さらにより好ましくはＲ；
（ｏｏ）アミノ酸位置５０の、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｅ、Ｔ、またはＭ、より好ましくはＱ、Ｋ、Ｅ、ＴまたはＭ；
（ｐｐ）アミノ酸位置５３の、Ｋ、Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、またはＰ、より好ましくはＴ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、またはＰ；
（ｑｑ）アミノ酸位置５６の、ＩまたはＭ、より好ましくはＭ；
（ｒｒ）アミノ酸位置５７の、Ｈ、Ｓ、Ｆ、またはＹ、より好ましくはＨ、Ｓ、またはＦ；
（ｓｓ）アミノ酸位置７４の、Ｉ、Ｖ、またはＴ、より好ましくはＶまたはＴ、Ｒ、さらにより好ましくはＴ；
（ｔｔ）アミノ酸位置８２の、Ｒ、Ｑ、またはＫ、より好ましくはＲまたはＱ、さらにより好ましくはＲ；
（ｕｕ）アミノ酸位置９１の、ＬまたはＦ、より好ましくはＦ；
（ｖｖ）アミノ酸位置９２の、Ｇ、Ｄ、Ｔ、またはＡ、より好ましくはＧ、Ｄ、またはＴ、さらにより好ましくはＴ；
（ｘｘ）アミノ酸位置９４の、ＳまたはＮ、より好ましくはＮ；
（ｙｙ）アミノ酸位置１０１の、Ｆ、Ｙ、またはＳ、より好ましくはＹまたはＳ、さらにより好ましくはＳ；および
（ｚｚ）アミノ酸位置１０３の、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｅ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｇ、またはＩ、より好ましくはＨ、Ｅ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｇ、またはＩ、さらにより好ましくはＡまたはＶ。

他の実施形態において、本発明のイムノバインダーは、「Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｅｒｓ」という名称の、２００８年６月２５日出願の、米国仮出願第６１／０７５，６９２号に記載されている、溶解性および／または安定性を増強する変異を１つまたは複数含んでいる。ある好ましい実施形態において、イムノバインダーは、１２、１０３、および１４４（ＡＨｏナンバリング慣例）からなる重鎖アミノ酸位置の群より選択されるアミノ酸位置に溶解性を増強する変異を含んでいる。好ましい一実施形態において、イムノバインダーは、（ａ）重鎖アミノ酸位置１２のセリン（Ｓ）；（ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）；および（ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）からなる群より選択される置換を１つまたは複数含んでいる。別の一実施形態において、イムノバインダーは、以下の置換：（ａ）重鎖アミノ酸位置１２のセリン（Ｓ）；（ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）；および（ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４のセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）を含んでいる。

上記で言及した通り、ＶＬ配列およびＶＨ配列の組合せを、とりわけ同じかまたは本質的に同じＣＤＲ配列のセットを有するが、例えば上記で言及した置換が存在するために、フレームワーク配列の異なるものを、シャッフルし、リンカー配列によって組み合わせることができる。例示的組合せは、それだけには限定されないが、以下、

を含む。

好ましい一実施形態において、配列は、配列番号９４〜１２１のいずれか１つの配列に、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは１００％の同一性を有する。

（抗ＴＮＦ抗体の使用）
治療的適用のために、本発明の抗ＴＮＦ抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、鞘内、経口、局所的または吸入経路によって、ボーラスとしてかまたはある期間にわたる持続的注入によって、ヒトに静脈内投与できる形態を含む、上で議論された形態などの、薬学的に許容される投薬形態で投与する。抗体はまた、腫瘍内、腫瘍周囲（ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌ）、病巣内または病変周囲（ｐｅｒｉｌｅｓｉｏｎａｌ）の経路によって適切に投与され、局所性および全身性治療効果をもたらす。

疾患を予防または処置するための、抗体の適切な投与量は、上で定義したように、処置する疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、抗体を予防または治療のどちらの目的で投与するか、以前の治療、患者の病歴および抗体への応答、ならびに主治医の自由裁量に依存する。抗体は、１回でまたは一連の処置にわたって適切に患者に投与する。

抗ＴＮＦ抗体は、ＴＮＦ媒介性疾患の処置において有用である。疾患のタイプおよび重症度に応じて、抗体約１μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）が、例えば、１回もしくは複数回の別々の投与によるとしても、または持続的な注入によるとしても、患者に投与するための最初の候補の投与量である。典型的な毎日のまたは毎週の投与量は、上に記載した因子に応じて、約１μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの範囲であってよく、またはそれを超えてよい。数日にわたる、またはそれを超える繰返し投与に関して、状態に応じて、疾患症状の望ましい抑制が生じるまで処置を繰り返す。しかし、他の投薬レジメンも有用であり得る。この治療の進行は、例えばＸ線撮影腫瘍イメージングを含めた、従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。

本発明の別の実施形態により、疾患の予防または処置における抗体の有効性は、抗体を連続的に投与することによって、またはそれらの目的に有効である別の薬剤、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、酸性もしくは塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）または肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の新脈管形成活性を阻害または中和できる抗体、組織因子、プロテインＣまたはプロテインＳの血液凝固活性を阻害または中和できる抗体（１９９１年２月２１日に公開された、ＥｓｍｏｎらのＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／０１７５３を参照されたい）、ＨＥＲ２受容体に結合できる抗体（１９８９年７月２７日に公開された、ＨｕｄｚｉａｋらのＰＣＴ特許出願ＷＯ８９／０６６９２を参照されたい）、または例えばアルキル化剤、葉酸拮抗剤、核酸代謝の代謝拮抗薬、抗生物質、ピリミジン類似体、５−フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、アミン、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシドもしくはコルチコステロイドなどの１つまたは複数の従来の治療剤などと抗体とを組み合わせて投与することによって改善することができる。かかる他の薬剤は、投与する組成物中に存在し得、または別々に投与することができる。また、放射性物質の照射または投与を含んだとしても、抗体は、連続的にまたは放射線学的処置と組み合わせて適切に投与される。

本発明の抗体は、親和性精製剤として使用することができる。このプロセスにおいて、抗体は、当該分野で周知の方法を用いて、セファデックス樹脂または濾紙のような固相上に固定化する。固定化した抗体を、ＴＮＦタンパク質（またはそのフラグメント）を含む試料と接触させて精製し、その後、担体を適切な溶媒で洗浄し、これにより固定化した抗体に結合するＴＮＦタンパク質以外の、試料中の実質的に全ての物質が除去される。最後に、担体をｐＨ５．０のグリシン緩衝液などの別の適切な溶媒で洗浄し、これにより抗体からＴＮＦタンパク質が放出される。

抗ＴＮＦ抗体はまた、ＴＮＦタンパク質の診断アッセイ、例えば特定の細胞、組織または血清中でのその発現を検出するのにも有用な場合がある。かかる診断方法は、がんの診断に有用な場合がある。

診断的適用のために、抗体は、一般的に検出可能な部分により標識される。非常に多くの標識が利用でき、それらは概して次のカテゴリーに分類することができる：
（ａ）^１１１Ｉｎ、^９９Ｔｃ、^１４Ｃ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、^３２Ｐまたは^３５Ｓなどの放射性同位元素。抗体は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１および２巻、Ｃｏｌｉｇｅｎら編、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｐｕｂｓ．（１９９１年）に記載の技法を用いて、放射性同位元素により標識でき、放射活性は、シンチレーション計数器を用いて測定することができる。

（ｂ）希土類キレート（ユーロピウムキレート）またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリンおよびテキサスレッドなどの蛍光標識を利用することができる。蛍光標識は、例えば上記のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙに開示されている技法を用いて、抗体と結合体化することができる。蛍光は、蛍光計を用いて定量化することができる。

（ｃ）様々な酵素−基質標識を利用でき、米国特許第４，２７５，１４９号ではこれらのいくつかの概説が提供されている。酵素は、一般的に、様々な技法を用いて測定できる、色素形成基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は、分光光度的に測定できる、基質における色の変化を触媒することができる。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を変えることができる。蛍光における変化を定量化するための技法は、上に記載されている。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起状態になり、次いで（例えば、ケミルミノメーター（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を用いて）測定できる光を放射し得、または蛍光アクセプターにエネルギーを供与する。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸脱水素酵素、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類酸化酵素（例えば、グルコース酸化酵素、ガラクトース酸化酵素およびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、複素環酸化酵素（ウリカーゼおよびキサンチン酸化酵素など）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。酵素を抗体に結合体化するための技法は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．（Ｊ． Ｌａｎｇｏｎｅ ＆ Ｈ． Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、７３巻：１４７〜１６６頁（１９８１年）に記載されている。酵素−基質の組合せの例としては、例えば：
（ｉ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と、基質としての水素ペルオキシダーゼであり、水素ペルオキシダーゼが、色素前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する、
（ｉｉ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と、色素形成基質としてのパラ−ニトロフェニルホスフェート、および
（ｉｉｉ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）と色素形成基質（例えば、Ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、が挙げられる。

当業者には、多数の他の酵素−基質の組合せが可能である。これらの全般的総説には、米国特許第４，２７５，１４９号および同第４，３１８，９８０号を参照されたい。標識が抗体に間接的に結合体化していることがある。当業者であれば、これを実現するための様々な技術を認識する。例えば、抗体はビオチンと結合体化していてよく、上記で言及した標識の３つの広範なカテゴリーのうちの任意のものがアビジンと結合体化していてよく、またはその反対も同様である。ビオチンはアビジンに対して選択的に結合し、したがって標識は、この間接的な様式において抗体と結合体化していてよい。あるいは、標識の、抗体との間接的な結合体化を実現するために、抗体が小型のハプテン（例えば、ジゴキシン）と結合体化し、上記で言及した様々なタイプの標識の１つが抗ハプテン抗体（例えば、抗ジゴキシン抗体）と結合体化する。このように、標識の、抗体との間接的な結合体化を実現することができる。

本発明の別の実施形態では、抗ＴＮＦ抗体を標識する必要はなく、その存在は、ＴＮＦ抗体に結合する標識抗体を使用して検出することができる。

本発明の抗体には、競合的結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイなどの任意の公知のアッセイ方法も採用することができる。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７〜１５８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ． １９８７年）。

競合的結合アッセイは、制限された量の抗体と結合するために試験試料分析物と競合する、標識した標準物質の能力に依存する。試験試料中のＴＮＦタンパク質の量は、抗体と結合状態になる標準物質の量に反比例する。結合状態になる標準物質の量の決定を容易にするために、抗体を、一般的に競合の前または後に不溶化し、抗体に結合する標準物質および分析物を、結合しないままの標準物質および分析物から都合良く分離できるようにする。

サンドイッチアッセイは、検出されるタンパク質の異なる免疫原性部分またはエピトープにそれぞれが結合できる２つの抗体の使用を含む。サンドイッチアッセイでは、試験試料分析物は、固体担体上に固定化する第１抗体によって結合され、その後、第２抗体が分析物に結合し、したがって不溶性の３部分の複合体が形成される。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照されたい。第２抗体は、それ自体、検出可能な部分で標識でき（直接的サンドイッチアッセイ）、検出可能な部分で標識される抗免疫グロブリン抗体を使用して測定することもできる（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１種にＥＬＩＳＡアッセイがあり、これは検出可能な部分が酵素の場合である。

免疫組織化学に関しては、腫瘍試料は新鮮または凍結であってよく、例えば、パラフィン中に包埋し、例えばホルマリンなどの保存剤で固定してもよい。

抗体は、インビボの診断アッセイに使用することもできる。一般的に、抗体は、放射性核種（^１１１Ｉｎ、^９９Ｔｃ、^１４Ｃ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、^３２Ｐまたは^３５Ｓなど）で標識し、免疫シンチグラフィ（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｏｇｒａｐｈｙ）を使用して腫瘍の場所を突き止められるようにする。

本発明の抗体は、キット、すなわち診断アッセイを行うための説明書と所定量の試薬をパッケージした組合せで提供され得る。抗体が酵素で標識される場合、キットには酵素に必要な基質および補因子が含まれる（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアをもたらす基質前駆体）。さらに、安定剤、緩衝液（例えば、ブロック緩衝液または溶解緩衝液）などの他の添加剤を含むことができる。様々な試薬の相対量は、幅広く変えることができ、アッセイの感度を実質的に最適にする、溶液中の試薬の濃度を可能にする。特に試薬は、通常、凍結乾燥した乾燥粉末として提供でき、溶解状態で適切な濃度を有する試薬溶液をもたらす賦形剤を含む。

（薬学的調製物）
１つの態様では、本発明は、ＴＮＦ媒介性疾患の処置のための抗ＴＮＦ抗体を含む薬学的処方物を提供する。用語「薬学的処方物」とは、明白に有効である抗体または抗体誘導体の生物活性を可能にするような形態であり、処方物を投与した被験体に毒性のある追加の成分を含まない調製物をいう。「薬学的に許容される」賦形剤（ビヒクル、添加剤）とは、被験体である哺乳動物に合理的に投与し、採用する活性成分の有効用量を実現できるものである。

「安定的な」処方物とは、処方物中の抗体または抗体誘導体が、保存に際しその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物活性を本質的に保持するものである。タンパク質の安定性を測定するための様々な分析技法は、当該分野で利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７〜３０１頁、Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｐｕｂｓ．（１９９１年）、およびＪｏｎｅｓ， Ａ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０巻：２９〜９０頁（１９９３年）に概説されている。安定性は、選択した期間の間、選択した温度で測定することができる。好ましくは、処方物は、少なくとも１カ月間、室温（約３０℃）または４０℃で安定であり、および／または少なくとも１年間または少なくとも２年間、約２〜８℃で安定である。その上、処方物は、好ましくは、処方物の凍結（例えば−７０℃まで）および解凍の後も安定である。

色および／または透明さの視覚的検査で、あるいはＵＶ光散乱またはサイズ排除クロマトグラフィーによって測定したときに、凝集、沈殿および／または変性の徴候を示さない場合、抗体または抗体誘導体は、薬学的処方物において「その物理的安定性を保持する」。

抗体または抗体誘導体は、所与の時間での化学的安定性が、タンパク質が以下に定義されるようなその生物活性をなおも保持すると考えられるほどであれば、薬学的処方物において「その化学的安定性を保持する」。化学的安定性は、化学変化したタンパク質の形態を検出および定量化することによって評価することができる。化学変化は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳ）を用いて評価できる、サイズ修正（例えばクリッピング（ｃｌｉｐｐｉｎｇ））に関わり得る。他のタイプの化学変化には、例えばイオン交換クロマトグラフィーによって評価できる電荷変化（例えば、脱アミドに起因して起こる）が挙げられる。

抗体または抗体誘導体は、所与の時間での抗体の生物活性が、例えば、薬学的処方物を抗原結合アッセイで決定されるように調製したときに示される生物活性の、約１０％以内（アッセイのエラー内）であれば、薬学的処方物において「その生物活性を保持する」。抗体に関する他の「生物活性」アッセイは、本明細書で以下に詳しく述べる。

「等張」とは、目的の処方物が、本質的にヒト血液と同じ浸透圧を有することを意味する。等張処方物は、一般的に約２５０から３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。等張性は、例えば、蒸気圧またはアイスフリージング型浸透圧計を用いて測定することができる。

「ポリオール」は、複数のヒドロキシル基を有する物質であり、糖（還元および非還元糖）、糖アルコールおよび糖酸が挙げられる。本明細書における好ましいポリオールは、約６００ｋＤ未満（例えば、約１２０から約４００ｋＤの範囲）の分子量を有する。「還元糖」とは、金属イオンを還元できるか、またはタンパク質中のリジンおよび他のアミノ基と共有結合的に反応できるヘミアセタール基を含むものであり、「非還元糖」とは、還元糖のこれらの特性をもたないものである。還元糖の例は、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトースおよびグルコースである。非還元糖には、スクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトースおよびラフィノースが挙げられる。マンニトール、キシリトール、エリスリトール、トレイトール、ソルビトールおよびグリセロールは、糖アルコールの例である。糖酸について、これには、Ｌ−グルコネートおよびその金属塩が挙げられる。処方物が凍結−解凍に対して安定であることが望まれる場合、ポリオールは、好ましくは処方物中の抗体が不安定になるような凍結温度（例えば−２０℃）での結晶化をしないものである。スクロースおよびトレハロースなどの非還元糖は、本明細書において好ましいポリオールであり、トレハロースの優れた溶液安定性の理由から、スクロースよりトレハロースが好ましい。

本明細書で使用するとき、「緩衝液」とは、酸−塩基の結合体化成分の作用によるｐＨの変化に耐える緩衝溶液をいう。本発明の緩衝液は、約４．５から約６．０、好ましくは約４．８から約５．５の範囲のｐＨを有し、最も好ましくは約５．０のｐＨを有する。この範囲でｐＨを制御する緩衝液の例には、酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸の緩衝液が挙げられる。凍結−解凍に対して安定的な処方物が望まれる場合、緩衝液は、好ましくはホスフェートではない。

薬理学的な意味において、本発明に関連して、抗体または抗体誘導体の「治療有効量」とは、抗体または抗体誘導体が有効である処置に関して、障害の予防または処置に有効な量をいう。「疾患／障害」とは、抗体または抗体誘導体を用いた処置により利益を得る任意の状態である。これには、哺乳動物を問題の障害にかからせる病理学的状態を含む、慢性および急性の障害または疾患が含まれる。

「保存剤」とは、処方物中に含まれ得、本質的にそこで細菌の作用を減少できる化合物であり、したがって、例えばマルチユーズ（ｍｕｌｔｉ−ｕｓｅ）の処方物の製造を容易にすることができる。可能性のある保存剤の例には、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド（アルキル基が長鎖の化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドの混合物）、およびベンゼトニウムクロリドが挙げられる。保存剤の他のタイプには、フェノール、ブチルおよびベンジルアルコールなどの芳香族アルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノールならびにｍ−クレゾールが挙げられる。本明細書における最も好ましい保存剤は、ベンジルアルコールである。

本発明はまた、生理学的に許容される少なくとも１つの担体または賦形剤と一緒に、１つまたは複数の抗体または抗体誘導体化合物を含む薬学的組成物も提供する。薬学的組成物は、例えば、１つまたは複数の水、緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水またはホスフェート緩衝生理食塩水）、エタノール、鉱油、植物油、ジメチルスルホキシド、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、アジュバント、ポリペプチド、またはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡもしくはグルタチオンなどのキレート剤、および／または保存剤を含むことができる。上述のように、他の活性成分を、（必ずしも必要ではないが）本明細書で提供される薬学的組成物中に含めることができる。

担体は、しばしば化合物の安定性または生物学的利用能を制御する目的のため、患者に投与する前に、抗体または抗体誘導体に関連し得る物質である。かかる処方物内部で使用するための担体は、一般的に生体適合性を有し、生分解性も有し得る。担体には、例えば、血清アルブミン（例えばヒトまたはウシ）、卵アルブミン、ペプチド、ポリリジンなどの一価または多価分子、およびアミノデキストランなどの多糖類およびポリアミドアミンが挙げられる。担体はまた、例えば、ポリラクテート、ポリグリコレート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロースまたはデキストランを含む、ビーズおよびミクロ粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）などの固体担体物質も含む。担体は、共有結合（直接的またはリンカー基を介してのいずれか）、非共有結合の相互作用または混合を含む、様々な方法において化合物を有し得る。

薬学的組成物は、例えば、局所、経口、経鼻、直腸または非経口投与を含む、任意の適切な投与方式に関して処方することができる。ある種の実施形態では、経口使用に適切な形態の組成物が好ましい。このような形態には、例えば、丸剤、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性懸濁物、分散性粉末もしくは顆粒、エマルジョン、硬もしくは軟カプセル、またはシロップもしくはエリキシル剤が挙げられる。さらなる他の実施形態内では、本明細書で提供される組成物は、凍結乾燥物として処方することができる。本明細書で使用されるような非経口という用語は、皮下、皮内、血管内（例えば静脈内）、筋肉内、脊髄、頭骸内、くも膜下腔内および腹腔内注射、ならびに任意の類似の注射または注入技法を含む。

経口使用を意図する組成物は、薬学的組成物の製造のための当該分野では公知の任意の方法にしたがって調製することができ、魅力的かつ風味のよい調製物を提供するために、甘味剤、矯味矯臭薬、着色剤、および保存剤などの１つまたは複数の薬剤を含むことができる。錠剤は、錠剤の製造に適する生理学的に許容される賦形剤と混合した有効成分を含む。このような賦形剤としては、例えば、不活性な希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム）、造粒剤および崩壊剤（例えば、コーンスターチ、またはアルギン酸）、結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン、またはアカシア）、ならびに潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク）が挙げられる。錠剤はコーティングされていなくてもよく、または消化管における崩壊および吸収を遅らせ、それによって長期間にわたって作用の持続を提供するために公知の技術によってコーティングされていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を使用してもよい。

経口の使用のための処方物は、有効成分が不活性な固体希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、もしくはカオリン）と混合されている硬ゼラチンカプセル剤として、あるいは有効成分が水または油の媒体（例えば、ピーナツ油、流動パラフィン、もしくはオリーブ油）と混合されている軟ゼラチンカプセル剤として与えられてもよい。水性懸濁物は、水性懸濁物の製造に適する賦形剤と混合された抗体または抗体誘導体を含んでいる。このような賦形剤には、懸濁化剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース（ｈｙｄｒｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、およびアカシアゴム）、ならびに分散剤または加湿薬（例えば、レシチンなどの天然に存在するホスファチド、ポリオキシエチレンステアレートなどのアルキレンオキシドの脂肪酸との縮合生成物、ヘプタデカエチレンオキシセタノールなどのエチレンオキシドの長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどの脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、もしくはポリエチレンソルビタンモノオレエートなどの脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物）が挙げられる。水性懸濁物は、１つまたは複数の保存剤（例えば、エチルもしくはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸）、１つまたは複数の着色剤、１つまたは複数の矯味矯臭薬、および１つまたは複数の甘味剤（例えば、ショ糖もしくはサッカリン）を含むこともできる。シロップ剤およびエリキシル剤は、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、またはショ糖などの甘味剤と一緒に調合されてもよい。このような処方物は、１つもしくは複数の粘滑剤、保存剤、矯味矯臭薬、および／または着色剤も含むことができる。

油性懸濁物は、有効成分を植物油（例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはココナツ油）中に、または流動パラフィンなどの鉱油中に懸濁することによって処方することができる。油性懸濁物は、ミツロウ、硬パラフィン、またはセチルアルコールなどの増粘剤を含むことができる。上に記載したものなどの甘味剤、および／または矯味矯臭薬を添加して風味のよい経口調製物を提供してもよい。このような懸濁物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加によって保存することができる。

水の添加による水性懸濁物の調製に適する分散性の粉末および顆粒は、分散剤または加湿薬、懸濁化剤、および１つまたは複数の保存剤と混合した有効成分を提供する。適切な分散剤または加湿薬、および懸濁化剤は、すでに上記で言及したものによって例示される。さらなる賦形剤、例えば、甘味剤、矯味矯臭薬、および着色剤も存在してよい。

薬学的組成物は水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は植物油（例えば、オリーブ油もしくはラッカセイ油）、鉱油（例えば、流動パラフィン）、またはこれらの組合せであってよい。適切な乳化剤としては、天然に存在するゴム（例えば、アカシアゴムまたはトラガカントゴム）、天然に存在するホスファチド（例えば、大豆、レシチン、ならびに脂肪酸およびヘキシトールに由来するエステルまたは部分エステル）、無水物（例えば、ソルビタンモノオレエート）、ならびに脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルのエチレンオキシドとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が挙げられる。乳剤はまた、１つまたは複数の甘味剤および／または矯味矯臭薬を含むことができる。

薬学的組成物は、使用するビヒクルおよび濃度に依存して、モジュレータがビヒクル中に懸濁または溶解されている、無菌注射が可能な水性または油性懸濁物として調製することができる。かかる組成物は、上述のものなどの、適切な分散剤、加湿薬および／または懸濁化剤を使用する公知の技術に従って処方することができる。採用できる許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、１，３−ブタンジオール、リンゲル液および等張食塩水がある。さらに、無菌の固定油は、溶媒または懸濁媒体として採用することができる。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む、刺激の少ない任意の固定油を採用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を、注射可能な組成物の調製に使用でき、局所麻酔剤などのアジュバント、保存剤および／または緩衝剤を、ビヒクル中に溶解することができる。

薬学的組成物は、持続放出処方物（すなわち、投与後にモジュレータの徐放をもたらすカプセルなどの処方物）として処方することができる。かかる処方物は、一般的に周知の技術を用いて調製でき、例えば、経口、直腸もしくは皮下移植によって、または所望の標的部位に移植することによって投与することができる。かかる処方物内で使用するための担体は、生体適合性を有し、生分解性も有し得て、好ましくは、処方物は比較的一定レベルのモジュレータ放出を可能にする。持続放出処方物内に含まれる抗体または抗体誘導体の量は、例えば、移植の部位、放出の速度および期待される持続期間、ならびに処置または予防する疾患／障害の特性によって決まる。

本明細書で提供される抗体または抗体誘導体は、一般的に、検出可能な程度にＴＮＦに結合し、ＴＮＦ媒介性疾患／障害を予防または阻害するのに十分な、体液（例えば、血液、血漿、血清、ＣＳＦ、滑液、リンパ、細胞間質液、涙または尿）中の濃度に達する量で投与する。用量は、本明細書に記載のような認識できる患者の利益をもたらすとき、有効であると考えられる。好ましい全身の用量は、１日につき、体重１キログラムにつき約０．１ｍｇから約１４０ｍｇ（１日につき患者１人につき約０．５ｍｇから約７ｇ）の範囲であり、経口での用量は、一般的に静脈内での用量より約５〜２０倍多い。担体物質と組み合わせて単一投薬形態を産出できる抗体または抗体誘導体の量は、処置される受給者（ｈｏｓｔ）および特定の投与様式によって変化する。投薬単位形態には、一般的に約１ｍｇから約５００ｍｇの間の活性成分が含まれる。

薬学的組成物は、ＴＮＦに向けられる抗体または抗体誘導体に応答する状態を処置するためにパッケージすることができる。パッケージされた薬学的組成物は、本明細書に記載のような少なくとも１つの抗体または抗体誘導体の有効量を保持する容器、および患者への投与後に、１つの抗体または抗体誘導体に応答する疾患／障害を処置するために含有組成物を使用することを示す説明書（例えばラベル）を含むことができる。

本発明の抗体または抗体誘導体は、化学的に修飾することもできる。好ましい修飾基は、例えば、場合によって置換した直鎖もしくは分岐鎖ポリアルケン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレンポリマー、または分岐したかもしくは分岐していない多糖類などのポリマーである。かかるエフェクター基は、インビボでの抗体の半減期を長くすることができる。合成ポリマーの特定の例には、場合によって置換した直鎖または分岐鎖ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）またはその誘導体が挙げられる。天然に存在する特定のポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコゲンまたはその誘導体が挙げられる。ポリマーのサイズは、所望のように変化できるが、一般的に平均分子量は５００Ｄａから５００００Ｄａの範囲である。局所適用のために、抗体を組織に浸透するようにデザインする場合、ポリマーの好ましい分子量は、約５０００Ｄａである。ポリマー分子は、抗体、特に、ＷＯ０１９４５８５に記載のように、共有結合的に連結するヒンジペプチドを介して、Ｆａｂフラグメントの重鎖のＣ末端部に付着することができる。ＰＥＧ部分の付着に関しては、「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９９２年、Ｊ． Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、および「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１９９８年、Ｍ． Ａｓｌａｍ ａｎｄ Ａ． Ｄｅｎｔ、Ｇｒｏｖｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。

上記のように目的の抗体または抗体誘導体を調製した後、それを含む薬学的処方物を調製する。処方される抗体は、事前の凍結乾燥に供さず、本明細書で目的の処方物は、水性処方物である。好ましくは、処方物中の抗体または抗体誘導体は、ｓｃＦｖなどの抗体フラグメントである。処方物中に存在する抗体の治療有効量は、例えば、所望の用量体積および投与様式（複数可）を考慮に入れて決定する。約０．１ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌから約２５ｍｇ／ｍｌ、および最も好ましくは約２ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌが、処方物中の典型的な抗体濃度である。

水性処方物は、ｐＨ緩衝溶液中の抗体または抗体誘導体を含めて調製する。本発明の緩衝液は、約４．５から約６．０、好ましくは約４．８から約５．５の範囲のｐＨを有し、最も好ましくは約５．０のｐＨを有する。この範囲内でｐＨを制御する緩衝液の例には、酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸の緩衝液が挙げられる。緩衝液の濃度は、約１ｍＭから約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭから約３０ｍＭであってよく、例えば緩衝液および処方物の所望の等張性によって決めることができる。好ましい緩衝液は、酢酸ナトリウム（約１０ｍＭ）、ｐＨ５．０である。

トニシファイアー（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）として働き、抗体を安定化できるポリオールは、処方物中に含まれる。好ましい実施形態では、抗体または抗体誘導体の沈殿を引き起こし得、および／または低ｐＨで酸化を引き起こし得るため、処方物は塩化ナトリウムなどの塩をトニシファイ量（ｔｏｎｉｃｉｆｙｉｎｇ ａｍｏｕｎｔ）で含まない。好ましい実施形態では、ポリオールは、スクロースまたはトレハロースなどの非還元糖である。ポリオールは、処方物の所望の等張性に対して変化できる量で処方物中に添加する。好ましくは、水性処方物は等張であり、この場合、処方物中の適切なポリオール濃度は、例えば、約１％から約１５％ｗ／ｖの範囲、好ましくは約２％から約１０％ｗｈｖの範囲である。しかし、高張性または低張性処方物も適切であり得る。添加するポリオールの量も、ポリオールの分子量に対して変えることができる。例えば、二糖（トレハロースなど）と比較して、より少量の単糖（例えばマンニトール）を添加することができる。

界面活性剤も、抗体または抗体誘導体処方物に添加する。典型的な界面活性剤には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）またはポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。添加する界面活性剤の量は、処方した抗体／抗体誘導体の凝集を減少させ、および／または処方物中の粒子の形成を最小化し、および／または吸着を低下させるほどの量である。例えば、界面活性剤は、約０．００１％から約０．５％、好ましくは約０．００５％から約０．２％、および最も好ましくは約０．０１％から約０．１％の量で処方物中に存在し得る。

一実施形態では、処方物は、上記で同定した薬剤（すなわち、抗体または抗体誘導体、緩衝液、ポリオールおよび界面活性剤）を含み、本質的に、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノールおよび塩化ベンゼトニウムなどの１つまたは複数の保存剤を含まない。別の実施形態では、特に処方物が複数用量の処方物である場合、保存剤を処方物中に含むことができる。保存剤の濃度は、約０．１％から約２％、最も好ましくは約０．５％から約１％の範囲であってよい。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ， Ａ．編（２００６年）に記載のものなどの、１つまたは複数の他の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を、それらが処方物の所望の特徴に悪影響を及ぼさないという条件で、処方物中に含めることができる。許容される担体、賦形剤または安定剤は、採用する投与量および濃度でレシピエントに毒性がなく、追加の緩衝剤、共溶媒、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）、ポリエステルなどの生分解性ポリマー、ならびに／またはナトリウムなどの塩形成対イオンを含む。

インビボの投与に使用する処方物は、無菌でなければならない。これは、処方物を調製する前または後に、無菌ろ過膜を通すろ過によって容易に成し遂げられる。

処方物は、抗体を用いる処置が必要な哺乳動物、好ましくはヒトに、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、皮下、関節内、滑膜内、鞘内、経口、局所または吸入経路による、ボーラスとしてかまたはある期間にわたる持続的注入による静脈内投与などの公知の方法に従って投与する。好ましい実施形態では、処方物は、静脈内投与によって、哺乳動物に投与する。かかる目的のために、処方物は、例えば注射器を用いて、またはＩＶラインを介して注射することができる。

抗体の適切な投与量（「治療有効量」）は、例えば、処置する病状、病状の重症度および経過、抗体を予防または治療のどちらの目的で投与するか、以前の治療、患者の病歴および抗体への応答、使用する抗体のタイプ、ならびに主治医の自由裁量によって決まる。抗体または抗体誘導体は、１回または１連の処置にわたって患者に適切に投与し、診断以降の任意の時間に患者に投与することができる。抗体または抗体誘導体は、単独の処置としてか、または問題とする病状の処置に有用な他の薬物もしくは治療と併せて投与することができる。

一般的な提案として、投与する抗体または抗体誘導体の治療有効量は、１回投与かまたは複数回投与かは別にして、患者の体重に対して約０．１から約５０ｍｇ／ｋｇの範囲となり、使用する抗体の典型的な範囲は、例えば、毎日の投与で約０．３から約２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．３から約１５ｍｇ／ｋｇとなる。しかし、他の投薬レジメンも有用であり得る。この治療の進行は、従来の技法によって容易にモニターされる。

（製造品）
本発明の別の実施形態では、本発明の薬学的処方物を、好ましくは水性薬学的処方物を保持する容器を含む、製造品が提供され、その使用に関する説明書が場合によって提供される。適切な容器には、例えば、ボトル、小瓶および注射器が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。典型的な容器は、３〜２０ｃｃの単回使用のガラスの小瓶である。あるいは、複数用量処方物用に、容器は３〜１００ｃｃのガラス小瓶であってよい。容器は処方物を保持し、容器上のラベルにより、または容器に付随したラベルにより、使用に関する指示を示すことができる。製造品は、商業および使用者の視点から望まれる他の物質をさらに含むことができ、これには、他の緩衝液、希釈液、フィルタ、針、注射器、および使用に関する説明の付いた添付文書が挙げられる。

（例示）
本開示を、さらに限定するものと解釈すべきではない以下の実施例によってさらに説明する。全ての図ならびにこの出願全体にわたって引用される全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、それらの全体が参照により本明細書に明示的に援用される。

実施例全体にわたり、特に明記しない限り、以下の材料および方法を使用した。

（一般的な材料および方法）
一般的に、本発明の実施では、特に示さない限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば抗体技術）の従来技法、およびポリペプチド調製の標準技法を採用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５１０巻、Ｐａｕｌ， Ｓ．、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ（１９９６年）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ、１６９巻）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ編、Ｉｒｌ Ｐｒ（１９９６年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら、Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ． Ｐｒｅｓｓ， Ｐｕｂ．（１９９９年）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９２年）を参照されたい。

（熱安定性の測定）
減衰全反射フーリエ変換ＩＲ（ＦＴＩＲ−ＡＴＲ）スペクトルを、Ｔｅｎｓｏｒ ＢｒｕｋｅｒにおけるＦＴ−ＩＲ Ｂｉｏ−ＡＴＲセルを使用して、様々な単鎖および追加の分子に関して入手した。分子を、３ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ６．５）に対して４℃で一晩中透析し、緩衝液のフロースルー（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）をブランクとして採取した。変性プロファイルを、５℃ステップ（２５から９５℃）の広範な温度で分子を熱チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）することによって入手した。全てのスペクトルの操作は、ＯＰＵＳソフトウェアを用いて行った。主な緩衝液および一過性の雰囲気（ＣＯ_２およびＨ_２Ｏ）のバックグラウンドは、タンパク質スペクトルから差し引いた。結果のタンパク質スペクトルを、次いでベースライン補正し、タンパク質アミドＩスペクトルを、期待される領域における最大幅の分解可能なピークの幅から決定した。第２の誘導体スペクトルを、平滑関数による３次多項式関数を用いて、アミドＩバンドスペクトルに関して入手した。タンパク質構造における変化を、３つの低度測定に関して０％の変性、および３つの高度測定に関して１００％変性と仮定する、初期カーブフィット（ｃｕｒｖｅ−ｆｉｔ）計算についての直線検定曲線を用いて、アミドＩの第２誘導体分析によって、推定した。変性プロファイルを、ボルツマンシグモイドモデル（Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ ｓｉｇｍｏｉｄａｌ ｍｏｄｅｌ）に適用する改変体毎の熱アンフォールディング転移（ＴＭ）の中間点を概算するのに使用した。

（溶解性の測定）
様々なｓｃＦｖ分子の相対的な溶解性を、硫酸アンモニウムの存在下でタンパク質の凝集および沈殿を増強させた後、測定した。硫酸アンモニウムを水溶液中のタンパク質に添加し、塩−タンパク質の最終混合物における飽和を５％増加させた。動的な範囲における沈殿を実験的に決定し、飽和間隔は、最終混合物において２．５％の飽和間隔までこの範囲で減少した。硫酸アンモニウムの添加後、試料を静かに混合し、６０００ｒｐｍで３０分遠心分離した。上清中に残ったタンパク質を、硫酸アンモニウムの飽和のパーセント毎に回収した。溶解曲線を、ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ１０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用して、上清中のタンパク質濃度を測定することによって決定した。上清中に残った可溶性タンパク質の測定を正規化し、ボルツマンシグモイドモデルに適用する改変体毎の相対的な溶解性の中間点を推定するのに使用した。

（短期間の安定性試験）
タンパク質を、可溶性凝集物および分解産物に関して、４０℃で２週間インキュベーションした後、調べた。１０ｍｇ／ｍｌの濃度のタンパク質を、広範なｐＨ（３．５、４．５、５．５、６．５、７．０、７．５および８．５）のＰＢＳに対して４℃で一晩中透析した。標準緩衝液ＰＢＳ（ｐＨ６．５）中の同じ濃度の対照タンパク質を、２週間の間−８０℃で保管した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分解のバンドの決定は、ｔ＝０およびｔ＝１４ｄ時点で行い、可溶性凝集物をＳＥＣ−ＨＰＬＣにおいて評価した。４０℃で２週間後、残った活性の決定を、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して行った。

（効力アッセイ）
抗ＴＮＦａバインダーの中和活性を、Ｌ９２９ ＴＮＦａ媒介性細胞毒性アッセイにおいて評価した。アクチノマイシンで処理したマウスＬ９２９線維芽細胞の毒性を、組換えヒトＴＮＦ（ｈＴＮＦ）で誘発した。最大ｈＴＮＦ誘発性細胞毒性の９０％は、ＴＮＦ濃度１０００ｐｇ／ｍｌのときであると決定した。Ｌ９２９細胞を全て、ウシ胎仔血清（１０％ｖ／ｖ）を補ったＬ−グルタミン培地を含む、フェノールレッドを含むＲＰＭＩ１６４０中で培養した。抗ＴＮＦａバインダーの中和活性を、フェノールレッドおよび５％ウシ胎仔血清を含まないＲＰＭＩ１６４０中で評価した。アンタゴニスト効果が最大半量阻害（ＥＣ５０％）に到達する濃度を決定するために、様々な濃度の（０〜３７４ｎｇ／ｍＬ）抗ＴＮＦバインダーを、ｈＴＮＦ１０００ｐｇ／ｍｌの存在下でＬ９２９細胞に加える。用量反応曲線を可変勾配を伴う非線形シグモイド回帰とフィットさせ、ＥＣ５０を計算した。

（抗ＴＮＦ ｓｃＦｖのＢｉａｃｏｒｅ結合分析）
ｐＨ５およびｐＨ７．４（データは示さず）での結合親和性を測定するために、ＮＴＡセンサーチップおよびＨｉｓでタグ付けしたＴＮＦ（ＥＳＢＡＴｅｃｈで生成）を用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭ−Ｔ１００での表面プラズモン共鳴測定を使用した。ＮＴＡセンサーチップの表面は、Ｎｉ２＋ＮＴＡキレート化によってヒスチジンタグ付けした分子を捕獲するためニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）で予め固定化したカルボキシメチル化デキストランマトリックスからなっている。ヒトＴＮＦａ Ｎ−ｈｉｓトリマー（５ｎＭ）を、これのＮ末端ｈｉｓタグを介しニッケルによって捕獲し、ＥＳＢＡ１０５（分析物）を、３倍の連続希釈ステップにおいて３０ｎＭから０．０１４ｎＭまでの範囲のいくつかの濃度で注入した。再生のステップでは、ニッケル、リガンド、および分析物によって形成された複合体を洗い流した。これにより、様々な試料に対して同じ再生条件が使用できるようになる。反応シグナルは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によって産生され、共鳴単位（ＲＵ）において測定される。測定は全て２５℃で行われる。インライン参照のセル補正に続いて緩衝液試料を差し引いた後、センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）を抗ＴＮＦ ｓｃＦｖ試料の各々に対して作成した。見かけの解離速度定数（ｋ_ｄ）、見かけの会合速度定数（ｋ_ａ）、および見かけの解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアバージョン１．１を用いて、１対１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）を使用して計算した。

（実施例１：ＣＤＲ融合およびモノクローナルウサギ抗ＴＮＦ抗体の機能的ヒト化）
（ウサギＣＤＲの融合）
非ヒトのドナー抗体と最大の配列相同性を共有するヒト抗体アクセプターフレームワークを用いる伝統的なヒト化方法と異なり、ウサギＣＤＲを、Ｍｉｎ−ｇｒａｆｔを産生するためのフレームワークＦＷ１．４（（ＧＧＧＧＳ）_４リンカーによって連結されている配列番号１および２）の中、またはＭａｘ−ｇｒａｆｔを産生するための「ウサギ化」フレームワークｒＦＷ１．４（配列番号９２）もしくはその改変体であるｒＦＷ１．４（ｖ２）（配列番号９３）の中のいずれかに融合させた。両方のフレームワークとも、主に、所望の機能特性（溶解性および安定性）、広範囲のウサギＣＤＲを収容するための構造適合性、ならびにウサギ可変ドメインコンセンサス配列に対する妥当な相同性に対して選択した。フレームワークｒＦＷ１．４は、実質的にあらゆるセットのウサギＣＤＲに対する普遍的なアクセプターフレームワークとして役割を果たす目的でさらに操作されたＦＷ１．４の誘導体である。安定かつ可溶性のフレームワーク配列ＦＷ１．４はウサギ抗体に対して高い相同性を示すが、これが入手可能な最も相同な配列というわけではない。

（潜在的に結合に関与する残基の同定）
ウサギ可変ドメイン配列の各々に対して、最も近いウサギ生殖系列の対応物を同定した。最も近い生殖系列を確立することができなかった場合は、配列を、サブグループのコンセンサスまたは高いパーセント値の類似性を有するウサギ配列のコンセンサスに対して比較した。稀なフレームワーク残基は、起こり得る体細胞性の過剰変異の結果であって、したがって抗原の結合において役割を果たすとみなした。したがって、このような残基は、Ｍａｘ−ｇｒａｆｔを産生するためアクセプターフレームワークｒＦＷ１．４またはｒＦＷ１．４（ｖ２）上へ融合させるためのものとみなされた。とりわけ、直接的な抗原接触に潜在的に関係付けられるか、またはＶＬおよびＶＨの配置に影響を及ぼす残基を融合させた。ＣＤＲ構造に影響を及ぼすと記載されているさらなる残基を、必要に応じて置換した。ＣＤＲをＦＷ１．４上に融合させた場合（Ｍｉｎ−ｇｒａｆｔ）、フレームワークの置換をしなかった。本明細書に開示するＭａｘ−ｇｒａｆｔを得るために融合させられたフレームワーク位置の例は、ｒＦＷ１．４、ｒＦＷ１．４（ｖ２）、および本明細書で提供する目的のｓｃＦｖ配列のフレームワーク領域の配列アラインメントを作成することによって同定することができる。例えば、当該分野では公知のウェブツールを前記の目的に用いてもよい（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで２００９年６月２３日に入手可能なＣｌｕｓｔａｌ Ｗ、またはｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｇｅｎｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｍｕｌｔａｌｉｎで２００９年６月２３日に入手可能なＭｕｌｔｉＡｌｉｎ）。ｒＦＷ１．４およびｒＦＷ１．４（ｖ２）が同じ残基を含み、目的のｓｃＦｖが異なる残基を明らかにするフレームワーク位置は全て、Ｍａｘ−ｇｒａｆｔを得るために融合させられたフレームワーク位置である。

（ドメインシャッフリング）
Ｍｉｎ−ｇｒａｆｔの可変軽鎖を、可変重鎖Ｍａｘ−ｇｒａｆｔと組み合わせて、生物物理学的性質（溶解性および安定性）ならびに活性の点で最適の組合せを同定した。

（ｓｃＦｖのクローニングおよび発現）
本明細書に記載し、特徴付けたｓｃＦｖを以下の通りに生成した。ヒト化ＶＬ配列およびヒト化ＶＨ配列（配列番号７２以外の、配列番号５１〜８８）を配列番号７２のリンカーによって連結して以下の配向：ＮＨ_２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨのｓｃＦｖを得た（例えば、配列番号９４〜１２１を参照されたい）。多くの場合において、様々なｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列を、サービスプロバイダーであるＥｎｔｅｌｅｃｈｏｎ ＧｍｂＨ（ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍ）で新規に合成した。得られたＤＮＡ挿入物を、ｓｃＦｖのＤＮＡ配列の５’末端および３’末端に導入したそれぞれＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位によって、細菌の発現ベクターであるｐＧＭＰ００２中にクローニングした。ＶＬドメインのＤＮＡ配列とＶＨドメインのＤＮＡ配列との間に、ＢａｍＨＩ制限酵素認識部位が位置する。いくつかの場合において、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを新規に合成しなかったが、ｓｃＦｖを発現する構築物をドメインシャッフリングによってクローニングした。したがって、ＶＬドメインを切り取り、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位によって新しい構築物中に導入し、ＶＨドメインを切り取り、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位によって新しい構築物中に導入した。他の場合において、点変異を、最先端のアセンブリングＰＣＲ（ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ＰＣＲ）法を用いてＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン中に導入した。ＧＭＰ００２のクローニングは、ＷＯ２００８００６２３５の実施例１に記載されている。ｓｃＦｖの生成は、ＷＯ２００８００６２３５の実施例１に記載されているＥＳＢＡ１０５と同様に行った。

（実施例２：ウサギＣＤＲドナー抗体のプロファイリングおよび選択）
ＴＮＦ阻害活性を有するウサギ抗体（「ＲａｂＭａｂ」）の選択のためにしたがった全般的な実験手順は以下の通りである：非常に可溶性のＴＮＦイムノバインダーの産生におけるＣＤＲについてのドナー抗体として、ウサギ抗体を用いた。ウサギをＴＮＦαで免疫化した後、脾摘出術を行った。ハイブリドーマを産生するために、脾細胞をウサギから単離した。合計４４のハイブリドーマを単離し、これらのハイブリドーマからの上清を結合親和性、生物学的効力、および結合特異性に対してプロファイリングした。

図１は、４４個の抗ＴＮＦ ＲａｂＭａｂハイブリドーマからの上清の、インビボでＴＮＦαを中和する相対的能力を示す。培養したマウスＬ９２９線維芽細胞中ＴＮＦαの細胞毒性の阻害を測定することによって、中和を試験した。Ｌ９２９アッセイにおいて、上清は様々な効力を示した。ＥＣ５０値（５０％阻害を達成するのに有効な濃度）を、第１スクリーニング（青色バー）および第２スクリーニング（赤色バー）において決定し、各アッセイにおいて最高の成績を示したものに対して正規化した。ＴＮＦ結合親和性をまた、各ＲａｂＭａｂに関してＢＩＡＣｏｒｅ分析によって測定した（緑色バー）。

各ハイブリドーマによってコードされるＲａｂＭａｂについて配列決定も行い、配列を、エピトープクラスターの予測に基づいた系統学的分析に供した。結合活性が高く、中和活性が強力な４つの代表的なＲａｂｍａｂ（ＥＰＩ−６、ＥＰＩ−１９、ＥＰＩ−３４、およびＥＰＩ−４３）を、ＣＤＲ融合についてのドナー抗体として種々の系統学的ファミリーから選択した。さらなる４つのＲａｂｍａｂ（ＥＰＩ−１、ＥＰＩ−１５、ＥＰ−３５、およびＥＰ−４２）を、分泌ＥＬＩＳＡにおけるこれらの好ましい活性に基づいて、ＣＤＲ融合のために選択した（図２を参照されたい）。

（実施例３：ＣＤＲ融合およびウサギドナー抗体の機能的ヒト化）
非ヒトのドナー抗体と最大の配列相同性を共有するヒト抗体アクセプターフレームワークを用いる伝統的なヒト化方法と異なり、品質管理アッセイを用いて所望の機能特性（溶解性および安定性）に対して予め選択されたヒトフレームワーク（ＦＷ１．４）中に、ウサギＣＤＲを融合させた。可溶性かつ安定性のフレームワーク配列はＲａｂＭａｂとの高い相同性を示したが、選択されたアクセプター抗体が、入手可能な最も相同な配列ではない。

ｒａｂｍａｂの各々に対して数々のＣＤＲ融合片を産生した。本明細書で用いられる「Ｍｉｎ−ｇｒａｆｔ」または「ｍｉｎ」の用語は、ウサギの可変ドメインからのウサギＣＤＲを、天然に存在するヒトアクセプターフレームワーク（ＦＷ１．４、配列番号１７２）中に融合させることによって産生されたヒト化可変ドメインを意味する。フレームワーク領域における変更は行っていない。フレームワーク自体を所望の機能特性（溶解性および安定性）に対して予め選択した。本明細書で用いられる「Ｍａｘ−ｇｒａｆｔ」または「ｍａｘ」という用語は、ウサギの可変ドメインからのウサギＣＤＲを、「ウサギ化した」ヒトアクセプターフレームワークである「ＲａｂＴｏｒ」（ｒＦＷ１．４、配列番号１７３）中に、またはｒＦＷ１．４（ｖ２）（配列番号１７４）と呼ばれるその誘導体中に融合させることによって産生されたヒト化可変ドメインを意味する。「ＲａｂＴｏｒ」フレームワークは、推定可能なその前駆配列において異なる位置（例えば、体細胞の過剰変異の間に変化し、したがって抗原の結合におそらく寄与する位置）以外のドナーのフレームワーク残基を融合させる必要なしに、実質的に任意のセットのウサギＣＤＲを受け入れる普遍的に適用可能なフレームワークを産生する目的で、ウサギ可変ドメインの構造および安定性に一般に関与するフレームワーク位置に、保存されているウサギの残基を組み入れることによって（そうでなければ、他の種においてかなり可変である）、調製したものである。推定可能な前駆配列を、最も近いウサギの生殖系列の対応物であると定義し、最も近い生殖系列の対応物を確立できなかった場合は、ウサギのサブグループのコンセンサスまたは高パーセント値の類似性を有するウサギ配列のコンセンサスであると定義する。「Ｍｉｎ−Ｍａｘ」または「ｍｉｎｍａｘ」は、「Ｍａｘ−ｇｒａｆｔ」の可変重鎖と組み合わされた「Ｍｉｎ−ｇｒａｆｔ」の可変軽鎖からなるヒト化可変ドメインを意味し、「Ｍａｘ−Ｍｉｎ」または「ｍａｘｍｉｎ」は、「Ｍｉｎ−ｇｒａｆｔ」の可変重鎖と組み合わされた「Ｍａｘ−ｇｒａｆｔ」の可変軽鎖からなるヒト化可変ドメインを意味する。

表２は、８つの異なるウサギモノクローナル抗体またはｒａｂｍａｂ（ＥＰ１、ＥＰ６、ＥＰ１５、ＥＰ１９、ＥＰ３４、ＥＰ３５、ＥＰ４２、およびＥＰ４３）から生じるヒト化単鎖抗体についての詳しい特徴付けのデータの要約を示すものである。いわゆる「ｍｉｎ」融合片（例えば、ＥＰ１ｍｉｎ）は、ウサギのドナーＣＤＲだけが融合された構築物を意味し、いわゆる「ｍａｘ」融合片は、ＣＤＲだけではなくドナーフレームワークにおけるいくつかのアミノ酸位置も融合されたものを意味する。さらに、表２は、２つのＨｉｓでタグ付けされた単鎖抗体に対するデータ（ＥＰ３４ｍｉｎ＿Ｃ−ＨｉｓおよびＥＰ１９ｍａｘ＿Ｃ−Ｈｉｓ）、ならびにＷＯ２００６／１３１０１３に記載される参照単鎖抗体ＥＳＢＡ１０５を示す。「Ｌ９２９」と表される第３の列は、ＥＳＢＡ１０５の効力と比べて、Ｌ９２９アッセイにおいて決定された様々な単鎖抗体の相対的な効力を示すものである。ｋｏｎ、ｋｏｆｆ、およびＫ_Ｄについての値は、それぞれＭ^−１ｓ^−１、ｓ^−１、およびＭの単位において示す。７番目の列は、ＦＴ−ＩＲで決定した熱誘発アンフォールディングの中間点を示す。最後の列は、リフォールディングの取組み後、可溶化した封入体から得られる正確にフォールディングされたタンパク質の相対的収率を示す。

表２

で詳述したＢＩＡＣｏｒｅデータについてのいくつかの例を図３に示す：ヒトＴＮＦαに結合するＥＳＢＡ１０５（図３ａ）、ＥＰ４３ｍａｘ（図３ｂ）、およびＥＰ３４ｍａｘ（図３ｃ）に対する結合動態を示す。細胞の効力アッセイについての例を図４に示すが、これはＬ９２９アッセイにおいてＥＳＢＡ１０５（黒丸）対ＥＰ４３ｍａｘ（白四角）を比較するものである。ＥＰ３４ｍａｘ対市販の抗体であるインフリキシマブおよびアダリムマブを比較する細胞効力アッセイのさらなる例を図９および１０に示す。

（実施例４：強力なＴＮＦαバインダーであるＥＰ４３ｍａｘの溶解性および安定性の最適化）
ＥＰ４３ｍａｘを、その強力なＴＮＦ結合活性に基づき、さらなる最適化のために選択した。このイムノバインダーを生物物理学的に特徴付けることで、このイムノバインダーが熱アンフォールディングアッセイ（ＦＴＩＲ）において高温の変性中間点（Ｔｍ＞７０℃）を示すことを明らかにした（図５を参照されたい）。それでも、ＥＰ４３ｍａｘを、熱アンフォールディングにおけるその広範囲の転移相を狭めるために、溶解性の最適化に供した。天然のＥＰ４３ｍａｘの溶解性を改善するために、ＶＨ鎖における１２、１０３、または１４４の３つの残基位置をより親水性の高いアミノ酸で置換した。この組合せは、安定性または結合活性に影響を及ぼさずに天然のタンパク質の溶解性を増大させることが示された。（ＡＨｏ位置１２のＶ→Ｓ、ＡＨｏ位置１０３のＶ→Ｔ、およびＡＨｏ位置１４４のＬ→Ｔ）を導入して、ＥＰ４３ｍａｘの可変重鎖（ＶＨ）領域のＶ−Ｃドメインの境界面における疎水性残基を置換した。溶解性強化変異のほかに、９つの安定化変異（ＶＬにおけるＴ１０Ｓ、Ｋ４７Ｒ、Ｙ５７Ｓ、Ｌ９１Ｆ、およびＴ１０３Ｖ、ならびにＶＨにおけるＥ１Ｑ、Ｅ６Ｑ、Ｓ７Ｔ、およびＶ１０３ＬＩ）をＥＰ４３ｍａｘにおいて同定した（表３を参照されたい）。

これらの安定化の残基を、ＥＳＢＡＴｅｃｈの品質管理（ＱＣ）フレームワークの機能的コンセンサス分析から同定した。ＶＬにおける位置１および３、ならびにＶＨにおける位置８９の安定化の残基はＥＰ４３ｍａｘ分子に前から存在していた。さらなる安定化変異（Ｍ→Ｌ）をＶＬ位置４で同定したが、抗原結合において予測されるその役割に基づいて考慮すべきことからはずした。

（実施例５：強力なＴＮＦαバインダーであるＥＰ４３ｍａｘの最適化された改変体）
表４および表５は、ＥＰ４３ｍａｘの最適化された改変体３つに対する特徴付けデータを示す。

ＥＰ４３＿ｍａｘＤＨＰはＥＰ４３ｍａｘの溶解性を増強した改変体であり、上記の３つの溶解性強化変異を含んでいる（ＡＨｏ位置１２のＶ→Ｓ、ＡＨｏ位置１０３のＶ→Ｔ、およびＡＨｏ位置１４４のＬ→Ｔ）。ＥＰ４３＿ｍａｘｍｉｎおよびＥＰ４３＿ｍｉｎｍａｘの改変体を、「ｍｉｎ」融合片と「ｍａｘ」融合片との間のドメインシャッフリングによって産生した。例えば、「ｍｉｎｍａｘ」改変体は、軽鎖の最小の融合片（ＣＤＲ融合片のみ）のバージョンおよび重鎖の最大の融合片バージョン（すなわち、融合されたウサギＣＤＲおよび抗原結合に関与するウサギフレームワーク残基）を含んでおり、「ｍａｘｍｉｎ」改変体は軽鎖の最大の融合片バージョンおよび重鎖の最小の融合片バージョンを含んでいた。

ＥＰ４３ｍａｘおよびその最適化された改変体の熱変性曲線を、ＦＴＩＲ分析によって比較した（図６および表６を参照されたい）。

ＥＰ４３ｍｉｎｍａｘは、ＥＰ４３ｍａｘよりも低いアンフォールディングの中間点を有することを見出した。

さらに、ｍｉｍａｘ改変体は１段階のアンフォールディング転移を示し、このことは、両方のドメインが非常に類似した温度でアンフォールディングすることを指摘した。ＥＰ４３ｍａｘ（図７Ａ）およびそのＥＰ４３ｍｉｎｍａｘ改変体（図７Ｂ）を、熱ストレス試験においてさらに比較した。高温（５０℃、６０℃、および７０℃）の熱濃度（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）の後、βシート含量量および可溶性タンパク質の濃度を評価した。ＥＰ４３ｍｉｎｍａｘは、６０℃の中間温度においてＥＰ４３ｍａｘよりもかなり安定であった。

（実施例６：ＥＰ３４ｍａｘと市販のＴＮＦαバインダーとの比較）
ＥＰ３４ｍａｘ、アダリムマブ、およびインフリキシマブが組換えヒトＴＮＦα１０００ｐｇ／ｍｌの細胞毒性活性を阻止する能力を、Ｌ９２９アッセイにおいて上記に詳述した通りに比較した。ＥＰ４３ｍａｘ、アダリムマブ、およびインフリキシマブが組換えヒトＴＮＦα１０ｐｇ／ｍｌの細胞毒性活性を阻止する能力を、Ｋｙｍ−１アッセイにおいて評価した。結果を、図９ａ、ｂ、および図１０ａ、ｂにそれぞれ示す。

図９ａは、ＥＰ３４ｍａｘおよびアダリムマブが、組換えヒトＴＮＦα１０００ｐｇ／ｍｌの細胞毒性活性を阻止する効力を示す（マウスＬ９２９細胞）。ＥＰ３４ｍａｘおよびアダリムマブについてのＩＣ_５０を、それぞれ１．０３ｎｇ／ｍｌおよび８．４５ｎｇ／ｍｌと決定した。図９ｂは、アダリムマブおよびＥＰ３４ｍａｘが、組換えヒトＴＮＦα１０ｐｇ／ｍｌの細胞毒性活性を阻止する効力を示す（ヒトＫｙｍ−１細胞）。アダリムマブおよびＥＰ３４ｍａｘ（７９１）についてのＩＣ_５０を、それぞれ６６．２ｎｇ／ｍｌおよび０．６９ｎｇ／ｍｌと決定した。

図１０ａは、ＥＰ３４ｍａｘおよびインフリキシマブが、組換えヒトＴＮＦα１０００ｐｇ／ｍｌの細胞毒性活性を阻止する効力を示す（マウスＬ９２９細胞）。ＥＰ３４ｍａｘおよびインフリキシマブについてのＩＣ_５０を、それぞれ１．０４ｎｇ／ｍｌおよび１３．９ｎｇ／ｍと決定した。図１０ｂは、インフリキシマブおよびＥＰ３４ｍａｘ（７９１）が、組換えヒトＴＮＦα１０ｐｇ／ｍｌの細胞毒性活性を阻止する効力を示す（ヒトＫｙｍ−１細胞）。インフリキシマブおよびＥＰ３４ｍａｘについてのＩＣ_５０を、それぞれ１４．９８ｎｇ／ｍｌおよび０．６３ｎｇ／ｍｌと決定した。このように、両方の場合において、ＥＰ３４ｍａｘはインフリキシマブより優れた成績を示した。

（他の実施形態）
本発明は、添付の付加物ＡからＥに記載するあらゆる方法、参考文献、および／または組成物も含むことが理解される。

（等価物）
前述の記載を考慮すると、本発明の多くの修正および代替の実施形態が、当業者に明らかである。したがって、この記載は、単なる例示として解釈すべきであり、本発明を実施するのに最良の様式を当業者に教示するためのものである。構造の詳細は、本発明の精神から逸脱することなく実質的に変えることができ、添付の特許請求の範囲内となる全ての修正の独占的使用権を保有する。本発明は、添付の特許請求の範囲および適用可能な法律の規則によって要求される程度にのみ制限されるものであると意図する。

特許、特許出願、論説、書籍、論文、論述、ウェブページ、図および／または添付書類を含む、本出願に引用された全文献および類似物は、かかる文献および類似物の書式に関わらず、参照によりそれらの全体が明示的に援用される。援用された文献および類似物の１つまたは複数が、定義された用語、用語の使用法、記載された技法または同様のものを含む本明細書と異なるか相反する場合には、本明細書が優先される。

本明細書で使用される節の見出しは、単に構成のためのものであり、記載された主題を限定するものと決して解釈すべきではない。

本発明は、様々な実施形態および実施例と併せて記載されているが、本教示がかかる実施形態または実施例に限定されるという意図はない。それどころか、当業者に理解されるように、本発明は、様々な代替、修正および等価物を包含する。

特許請求の範囲は、その趣旨を述べない限り、記載された順番または要素に限定されると読むべきではない。形態および詳細の様々な変更は、添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、行うことができると理解すべきである。したがって、以下の特許請求の範囲およびその等価物の範囲および精神内となる全実施形態が特許請求される。

Claims (1)

1. 明細書に記載された発明。