KR20110031373A - 마크로분자 전달을 증강하는 방법 및 조성물 - Google Patents

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에스바테크, 언 알콘 바이오메디칼 리서치 유닛 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 항원 결합 폴리펩티드 등과 같은 거대 마크로분자(즉, 10 kDa 이상)의 밀착 연접을 통과하는 전달을 증강하는 조성물과 방법을 제공한다. 상기한 방법과 조성물은 신경장애를 치료하기 위해 치료용 항원 결합 폴리펩티드를 CNS에 비강내 투여에 의해 전달하는데 특히 유용하다.

Description

마크로분자 전달을 증강하는 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR ENHANCED DELIVERY OF MACROMOLECULES}
관련 출원
본 출원은 2008년 7월 10일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/079586호에 대해 우선권을 주장하고 있으며, 상기 출원의 내용은 참조를 위해 여기에 포함되어 있다.
발명의 분야
본 발명은 생체막을 통과하는 분자 전달을 촉진하는 조성물 및 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항원과 결합한 폴리펩티드를 혈뇌 장벽(blood-brain barrier)을 통과하여 중추신경계(CNS)에 전달하는 것에 관한 것이다.
발명의 배경
2006년 세계보건기구의 보고에 따르면, 세계적으로 10억 이상의 인구가 신경장애를 겪고 있으며, 이러한 장애로 매년 약 680만명이 사망한다고 한다. 치료용 항원 결합 펩티드, 예를 들면 항체는 대부분은 아니지만 많은 신경장애들의 치료에 사용될 수 있다. 하지만 이러한 치료용 항원 결합 펩티드를 사용한 신경장애의 치료는 혈뇌 장벽(BBB)을 통과하는 약물 전달과 관련한 어려움으로 자주 방해받는다.
상피세포층을 통과하는 분자 전달을 증강시키는 화합물들이 발견되었지만, 이들은 일반적으로 작은 분자의 전달을 증강하는데 효과적일 뿐인 것으로 나타났다. 예를 들면, 펩티드 4-페닐아조벤질 옥시카르보닐-Pro-Leu-Gly-Pro는 작은 분자들의 상피세포층을 통과하는 수송을 증강하는 것으로 입증된 반면, 10 kDa 이상의 거대 분자에 대해서는 침투 증강 효과를 입증하지 못하였다(미국 특허 제5,534,496호; Yen et al. 1995, J Control Release, 36:25-37 참조). 집중적인 연구에도 불구하고, 치료용 항원 결합 폴리펩티드를 CNS에 편리하고 효과적으로 전달하는 방법은 현재 없다.
따라서 치료용 항원 결합 폴리펩티드의 상피층을 통과하는 특이적 전달, 특히 CNS 장애를 치료하기 위한 CNS로의 특이적 전달을 증강하는 조성물과 방법에 대한 요구가 당분야에서 지속되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 침투 인핸서(예를 들면, Pz-펩티드 또는 FMOC-펩티드)가 특히 비점막내로 투여되었을 때 항원 결합 폴리펩티드(scFv 등)와 같은 거대 마크로분자(즉, 10 kDa 이상)의 CNS로의 특이적 전달을 강화할 수 있다는 놀라운 발견에 적어도 일부가 기초하고 있다. 따라서, 본 발명은 항원 결합 폴리펩티드(scFv 등)와 같은 거대 마크로분자(예를 들면, 10kDa 이상)의 상피층을 통과하는 전달을 강화하는 조성물 및 방법을 제공한다. 상기한 방법과 조성물은 이들이 신경 장애를 치료하기 위해 항원 결합 폴리펩티드(scFv 등)를 비강 내로의 투여에 의해 CNS에 편리하고 효과적이며 선택적으로 전달할 수 있다는 점에서 특히 유리하다.
일 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 항원 결합 폴리펩티드, 예를 들면 면역결합제(예를 들면, scFv), 및 하나 이상의 침투 인핸서(예를 들면, Pz-펩티드 또는 FMOC-펩티드)를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정한 구현예에서, 항원 결합 폴리펩티드는 침투성 인핸서에 공유적으로 연결된다.
임의의 구현예에서, 항원 결합 폴리펩티드는 다음으로 구성되는 군에서 선택되는 표적 항원과 특이적으로 결합한다: TNF-알파, 아밀로이드 베타, 아밀로이드 베타에서 유도된 확산성 리간드 리셉터, 모노아민 옥시다제-B, L-3,4-디히드록시페닐알라닌 데카복실라제, 아세틸-coA 카복실라제, N-메틸-D-아스파테이트 수용체(일명 GRINl), GRINA, GRIN2A, GRIN2B, GRIN2C, GRIN2D, GRIN3A, GRJN3B, 히스타민 Hl 리셉터, 무스카린 리셉터 (일명 CHRMl), CHRM2, CHRM3, CHRM4, 히포크레틴 리셉터 1, 히포크레틴 리셉터 2, 5-히드록시트립타민(일명 HTRlA), 도파민 리셉터(일명 DRDl), DRD2, DRD3, DRD4, DRD5, 아드레날린 베타 1 리셉터, 노르에피네프린 트랜스포터(NET), 및 도파민 D2 리셉터, 특히 TNF-알파.
다른 구현예에서, 항원 결합 폴리펩티드는 여기의 표 5, 6 및 7에 개시된 하나 이상의 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상의 동일성 또는 유사성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 scFv이다.
다른 구현예에서, 침투 인핸서는 항원 결합 폴리펩티드의 중추신경계로의 선택적 비강내 전달을 촉진한다.
본 발명의 조성물은 약제(또는 약제의 제조)로서 특히 유용하며, 특히 제한적인 것은 아니나 편두통, 우울증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 정신분열증, 간질, 뇌졸중, 뇌수막염, 근위축성 측색 경화증, 불면증, 기억장애, 다발성 경화증, 기면증, 외상성 뇌손상 및 스트레스 등의 신경 장애의 진행의 지연, 예방 또는 치료에 특히 유용하다.
다른 양태에서 본 발명은 하나 이상의 항원 결합 폴리펩티드(예를 들면, scFv), 하나 이상의 침투 인핸서(예를 들면, Pz-펩티드 또는 FMOC-펩티드), 및 사용 지시서를 포함하는 키트를 제공한다.
상세한 설명
정 의
"침투 인핸서"란 조직 장벽(예를 들면, 상피)과 같은 생리적 장벽(physical barrier)을 통하여 약물의 통과를 증강하는 조성물을 포함한다. 적합한 침투 인핸서는, 제한은 없으나, 4-페닐아조벤질옥시카르보닐(Pz), N-메틸, t-부틸옥시카르보닐(t-Boc), 플루오로엔일메틸옥시카르보닐(FMOC), 및 카르보벤즈옥시(CBZ)(여기에 참조를 위해 포함되어 있는 미국 특허 제5,534,496호 참조) 등의 보호 그룹과 N-터미널로 연결된, 펩티드 Pro-Leu-Gly-Pro-Arg [서열번호 28], Pro-Leu-Gly-Pro-Lys [서열번호 29],Pro-Leu-Gly-Pro-Glu [서열번호 30], Pro-Leu-Gly-Pro-Asp [서열번호 31], Pro-Leu-Gly-Pro [서열번호 32], Pro-Leu-Gly 및 Pro-Leu 등이 있다.
"Pz-펩티드"란 Pz 그룹(여기에 참조를 위해 포함되어 있는 미국 특허 제5,534,496호 참조)에 N-터미널로 연결된, Pro-Leu-Gly-Pro-Arg [서열번호 28]를 지칭한다.
"FMOC-펩티드"란 FMOC 그룹(여기에 참조를 위해 포함되어 있는 미국 특허 제5,534,496호 참조)에 N-터미널로 연결된, Pro-Leu-Gly-Pro-Arg [서열번호 28]를 지칭한다.
"선택적 비강내 전달"이란 환자의 혈청보다 CNS에서 분자(예를 들면, 항원 결합 폴리펩티드)의 농도가 더 높아지게 되는 조건 하에서 환자에게 상기 분자를 비강내 적용하는 것을 지칭한다.
"항원 결합 폴리펩티드"란 용어는 10 kDa 이상의 크기를 가지는 폴리펩티드를 지칭하며, 예를 들면 면역결합제, 모노클로날 항체(전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이성 항체(예를 들면, 이중특이성 항체), 키메릭 항체, CDR 그래프트된 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 단일 사슬 항체(scFv) 및 항원 절편뿐만 아니라, 예를 들면, 제한적인 것은 아니나 CTLA-4, 텐다미스태트(tendamistat), 피브로넥틴(FN3), 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin), CBM4-2, 리포칼린, T-세포 리셉터, 단백질 A 도메인(단백질 Z), Im9, 설계된 안키린(ankyrin)-반복 단백질(DARPins), 설계된 TPR 단백질, 아연 핑거, pVIII, 조류 췌장 폴리펩티드, GCN4, WW 도메인, Src 상동성 도메인 3 (SH3), Src 상동성 도메인 2 (SH2), PDZ 도메인, TEM-I β-락타마제, GFP, 티오레독신, 스타필로코칼(staphylococcal) 뉴클레아제, PHD-핑거, CI-2, BPTl APPI, HPSTI, 에코틴, LACI-Dl, LDTI, MTI-II, 전갈 독, 곤충 디펜신(defensin) A 펩티드, EETI-II, Min-23, CBD, PBP, 시토크롬 b562, LdI 리셉터 도메인 A, γ-크리스탈린, 유비퀴틴, 트랜스페린, 및 C-타입 레시틴-유사 도메인 (예를 들면, Binz 2005, Curr Opin Biotechnol. Vol. 16 p. 459-69 참조) 등의 당분야에서 공지된 선택적 스캐폴드에 기초한 항원 결합 폴리펩티드 등이 있다.
"면역결합제(immunobinder)"는 항체의 항원 결합부위의 일부 또는 전체, 예를 들면, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 전체 또는 일부를 포함하는 분자를 지칭하며, 이러한 면역결합제는 특이적으로 목적 항원을 인식한다. 면역결합제의 비제한적 실시예는 항체 절편뿐만 아니라 전체 길이의 면역글로불린 분자 및 scFv를 포함하며, 예를 들면 제한적인 것은 아니나 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 일가 절편인 Fab 절편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 결합에 의해 연결되는 2개의 Fab 절편을 포함하는 2가 절편인 F(ab')2 절편; (iii) 힌지 영역의 일부를 가지는 본질적으로 Fab인 Fab' 절편(Fundamental Immunology (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993) 참조); (iv) VH 및 CHI 도메인으로 구성되는 Fd 절편; (v) 항체의 싱글 암(single arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 절편; (vi) VH 또는 VL 도메인으로 구성되는 Dab 절편(Ward et al, (1989) Nature 341 :544-546), Camelid(Hamers-Casterman, et al., Nature 363:446-448 (1993), 및 Dumoulin, et al., Protein Science 11:500-515 (2002)), 또는 Shark 항체(예를 들면, shark Ig-NARs Nanobodies®) 등의 단일 도메인 항체; 및 (vii) 단일 가변 도메인과 2개의 정상 도메인을 함유하는 중쇄 가변영역인 나노바디(nanobody) 등이 있다.
여기에서 사용된 "항체"라는 용어는 "면역글로불린"의 동의어이다. 본 발명에 따른 항체는, 예를 들면 단일 가변 도메인, Fv(Skerra A. and Pluckthun, A. (1988) Science 240:1038-41), scFv (Bird, R.E. et al. (1988) Science 242:423-26; Huston, J.S. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83), Fab, (Fab')2 또는 당업자에게 공지된 다른 절편 등의 면역글로불린의 하나 이상의 가변 도메인을 포함하는 전체 면역글로불린 또는 그의 절편일 수 있다.
"단일 사슬 항체" 또는 "scFv"는 링커에 의해 연결된 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 분자를 지칭한다. 이러한 scFv 분자는 다음과 같은 일반 구조를 가질 수 있다: NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH.
여기에서 사용된 "항체 프레임워크"는 가변 도메인의 일부, VL 또는 VH를 지칭하며, 상기 가변 도메인의 항원 결합 루프에 대해 스캐폴드(scaffold)로서 작용한다(Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242). 적합한 프레임워크의 예는 PCT 출원 제PCT/CH2009/000219호 및 제PCT/CH2009/000222호에 기술되어 있으며, 상기 출원들은 참고를 위해 여기에 포함되어 있다.
"링커"란 2개의 도메인을 연결하는 선형 아미노산 서열을 지칭한다. 본 발명의 링커는 유전적으로 및/또는 화학적으로 도메인에 융합될 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 링커 내에 존재하는 2개의 시스테인 사이에 형성된 디설파이드 가교에 의해 형성된 루프를 포함한다. 이러한 링커의 일반적 구조를 서열번호 18과 19에 나타내었으며; 서열번호 16과 17은 상기 링커의 예시이다. 인공 링커(art linker)의 또다른 적합한 상태는 반복되는 GGGGS 아미노산 서열 또는 이들의 변이체로 구성된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, (GGGGS)4 링커(서열번호 36) 또는 그의 유도체(예를 들면, 서열번호 37)가 사용되지만, 1 내지 3회 반복의 변이체 또한 가능하다(Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). 본 발명에서 사용가능한 다른 링커들은 Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al.(2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. MoI. Biol. 293:41-56 및 Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. Immunother. 50:51-59에 의해 기술되었다.
폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 "변성된" 또는 "변성하는"이란 용어는, 폴리펩티드 서열 내에 아미노산의 첨가 또는 폴리펩티드 서열 내에 존재하는 아미노산의 치환을 모두 지칭한다. 폴리펩티드를 변성하는데 적합한 아미노산은 알려진 모든 천연 아미노산, 비자연적인 아미노산 및 이들의 작용화된 유도체(그 내용이 참조를 위해 여기에 포함되어 있는, 미국 특허 제7,045,337호 및 제7,083,970호 참조) 등이 있다. 임의의 구현예에서, 이 용어는 폴리펩티드 서열에서 아미노산의 결실을 지칭한다.
"표적 항원"은 항체가 특이적으로 결합하는 항원성 결정인자를 함유하는 분자(예를 들면, 가용성 단백질 또는, 하나 이상의 막 스패닝 도메인, 폴리펩티드, 펩티드 또는 탄수화물을 가지는 막 결합 단백질)이다.
"신경 장애"는 중추신경계(즉, 뇌와 척수)에 영향을 미칠 수 있는 질환과 장애를 포함한다.
"CNS 장애"란 용어는 CNS에서 나타나는 장애를 지칭한다. 예를 들면, 뇌종양 또는 신경 장애일 수 있다.
"유효량"이란 환자의 질환 또는 장애(예를 들면, 신경 장애)를 부분적으로 또는 완전하게 예방하거나 중지하는데 충분한 치료제(예를 들면, 항원 결합 폴리펩티드)의 양으로 정의된다. 유효량은 질환 또는 장애의 심각성 및, 사용된 본 발명의 특정한 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되고 있는 특정한 화합물의 배출율, 치료의 지속시간, 적용된 특정 조성물과 병용하여 사용된 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적 건강과 이전의 메디컬 기록 및 메디컬 분야에서 알려진 기타 인자 등의 다양한 약동학적 인자에 따라 다를 수 있다.
"환자"는 예방 처치 또는 치료 처치를 받는 사람 및 다른 포유동물 대상을 포함한다.
"특이적 결합", "선택적 결합", "선택적으로 결합한다", 및 "특이적으로 결합한다"라는 용어는 미리 결정된 항원 상의 에피토프에 대한 항체 결합을 지칭한다. 전형적으로 항체는 대략적으로 약 10-7 M 미만, 예를 들면 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만의 친화성(Kj)으로 결합한다.
여기에서 사용된 "동일성"이란 2개 폴리펩티드, 분자간 또는 2개 핵산 간의 서열 매칭(matching)을 지칭한다. 2개의 비교 서열 모두에서 한 위치에 동일한 염기 또는 아미노산 모노머 서브유니트가 있으면(예를 들면, 2개의 DNA 분자 각각에서 한 위치에 아데닌이 있거나 또는 2개의 폴리펩티드 각각에서 한 위치에 라이신이 있다면), 각각의 분자는 그 위치에서 동일하다. 2개 서열 간의 "동일성 백분율"은 2개 서열에 의해 공유된 매칭되는 위치의 수/비교 위치의 수 X 100의 함수이다. 예를 들면, 2개 서열에서 10개 위치 중 6이 일치되면, 2개 서열의 동일성은 60 %이다. 예를 들면, DNA 서열 CTGACT와 CAGGTT는 50 %의 동일성을 공유한다(총 6개 위치 중 3개가 일치). 일반적으로 2개 서열이 나란히 정렬된 경우의 비교에서 동일성이 최대가 된다. 이러한 정렬은, 예를 들면 Needleman 등, (1970) J MoI. Biol. 48: 443-453의 방법을 사용하여 제공되며, Align program (DNAstar, Inc.)과 같은 컴퓨터 프로그램으로 편리하게 시행될 수 있다. 2개 아미노산 서열 간의 동일성 비율은 또한 E. Meyers와 W. Miller의 알고리즘(Comput . Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))을 사용하여 결정할 수 있으며, 상기 알고리즘은 PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티와 4의 갭 페널티를 사용하는 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)과 결합되어 있다. 또한, 2개 아미노산 서열 간의 동일성 비율은 Needleman과 Wunsch의 알고리즘 (J. Mol . Biol . 48:444-453 (1970))을 사용하여 결정할 수 있으며, 상기 알고리즘은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 중량을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 판매)의 GAP 프로그램에 결합되어 있다.
"유사한" 서열이란 나란히 정렬되었을 때, 동일하고 유사한 아미노산 잔기를 공유하는 서열이며, 여기에서 유사한 잔기는 정렬된 참조 서열 내에 상응하는 아미노산 잔기에 대한 보존적(conservative) 치환이다. 이와 관련하여, 참조 서열 내 잔기의 "보존적 치환"이란 상응하는 참조 잔기와 물리적 또는 작용적으로 유사한, 예를 들면, 공유결합 또는 수소결합을 형성하는 작용을 포함하여, 유사한 크기, 형태, 전하, 화학적 특성을 가지는 잔기에 의한 치환이다. 따라서 "보존적 치환 변성된" 서열은 하나 이상의 보존적 치환이 있는 참조 서열 또는 야생형 서열과는 다른 것이다. 2개 서열 간의 "유사성 백분율"은 2개 서열에 의해 공유된 일치하는 잔기 또는 보존적 치환을 포함하는 위치의 수를 비교되는 위치의 수로 나누고 100을 곱한 함수이다. 예를 들면 2개 서열에서 10개 중 6개가 일치하고 10개 중 2개가 보존적 치환을 포함하면 2개 서열은 80 %의 포지티브 유사성을 가진다.
여기에서 사용된, "보존적 서열 변성"이란 그 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성을 변경하거나 부정적으로 영향을 미치지 않는 아미노산 변성을 지칭한다. 이러한 보존적 서열 변성은 뉴클레오티드와 아미노산의 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 예를 들면, 부위특이적 돌연변이와 PCR-매개 돌연변이 등과 같은 당분야에서 공지된 표준 기술에 의해 변성을 삽일할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기로 대체되는 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기들의 종류는 당 분야에서 정의되어 있다. 상기한 종류들로는 염기성 측쇄를 가지는 아미노산(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가지는 아미노산(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 극성의 비전하 측쇄를 가지는 아미노산(예를 들면, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 가지는 아미노산(예를 들면, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄를 가지는 아미노산(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 측쇄를 가지는 아미노산(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 있다. 그러므로, 사람 안티-VEGF 항체 내의 추정되는 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게 동일한 측쇄 종류의 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드와 아미노산 보존 치환을 확인하는 방법은 당분야에 공지되어 있다(예를 들면, Brummell et al, Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng . 12(10):879-884 (1999); 및 Burks et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:412-417 (1997) 참조).
달리 정의되지 않는 한, 여기에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 일반적인 기술의 하나로 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 여기에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법과 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있으나 적합한 방법과 물질을 이하에 기술하였다. 충돌이 있을 경우, 정의들을 포함하는 본 명세서가 조절하게 된다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 예시일 뿐으로 제한을 의미하지는 않는다.
본 발명의 다양한 양태를 이하에서 보다 상세하게 기술하였다. 다양한 구현예, 참조 및 범위가 임의로 결합될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 특정한 구현예에 따라서 선택된 정의, 구현예 또는 범위를 적용하지 않는다. 다양한 구현예들이 의지에 따라 결합될 수 있다.
개선된 항원-결합 폴리펩티드 조성물
일 양태에서, 본 발명은 항원 결합 폴리펩티드(예를 들면, scFv)와 같은 치료용 폴리펩티드의 조직 장벽, 보다 구체적으로는 코점막을 통한 CNS로의 전달을 증강하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 일반적으로 항원 결합 폴리펩티드와 침투 인핸서를 포함한다. 이러한 조성물은 중추신경계에 항원 결합 폴리펩티드를 선택적으로 비강내 전달할 수 있다는 점에서 특히 유리하다. 오늘날 생물학제제는 전형적으로 전신적으로 투여되어 약물의 고농도 투약을 필요로 하거나 및/또는 이를 필요로 하는 개체에게 투약하며; 선택적으로, 생물학제제는 두개골 카눌라에 의해 투여될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 항원 결합 폴리펩티드가 필요한 대상의 삶의 질을 상당히 개선한다.
항원 결합 폴리펩티드는 본 발명의 방법에서 사용하는데 적합하다. 임의의 구현예에서, 항원 결합 폴리펩티드는 면역결합제, 예를 들면 scFv이다. 이러한 scFv는, 바람직하게는 그 내용이 참조를 위해 여기에 포함되어 있는 PCT 공개 번호 제WO09/000098호에 개시된 바와 같은 고도로 안정하고 가용성인 프레임워크 영역을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, scFv는 표 5, 6 및 7에 개시된 하나 이상의 아미노산 서열과 80% 이상의 유사성(예를 들면, 85%, 90%, 95%, 또는 99%)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, scFv는 표 5, 6 및 7에 개시된 하나 이상의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 scFv는 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27과 80% 이상의 유사성(예를 들면, 85%, 90%, 95% 또는 99%), 더욱 바람직하게는 80% 이상의 동일성, 보다 더 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 프레임워크 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 scFv는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 35와 80% 이상의 유사성(예를 들면, 85%, 90%, 95% 또는 99%), 더욱 바람직하게는 80% 이상의 동일성, 보다 더 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 추가로 또는 선택적으로, 상기 scFv는 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 또는 서열번호 34와 80% 이상의 유사성(예를 들면, 85%, 90%, 95% 또는 99%), 더욱 바람직하게는 80% 이상의 동일성, 보다 더 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 VH 및/또는 VL은 링커에 의해 결합되어 일반식 구조 NH2-VH-링커-VL-COOH 또는 NH2-VL-링커-VH-COOH를 가지는 분자를 생성한다. 상기한 링커 분자는, 예를 들면 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 36 및 서열번호 37로 구성되는 군에서 선택되며; 또는 이들에 대한 80% 이상의 유사성을 가지는 서열이다.
바람직한 구현예에서, scFv는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 또는 서열번호 33과 80% 이상의 유사성(예를 들면, 85%, 90%, 95%, 또는 99%), 더욱 바람직하게는 80% 이상의 동일성, 보다 더 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
침투 인핸서를 본 발명의 조성물에 사용할 수 있다. 임의의 구현예에서, 침투 인핸서는 보호그룹에 연결된 펩티드 또는 펩티드 모방체이다. 본 발명에서 사용하는데 적합한 펩티드는 공지의 아미노산, 예를 들면 천연 아미노산, 천연이 아닌 아미노산, D-아미노산 및 아미노산 유도체를 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, 침투 인핸서는 4-페닐아조벤질옥시카르보닐(Pz), N-메틸, t-부틸옥시카르보닐(t-Boc), 플루오로엔일메틸옥시카르보닐(FMOC) 및 카르보벤즈옥시 (CBZ) (예를 들면, 여기에 참조로 포함되어 있는 미국 특허 제5,534,496호 참조) 등의 보호 그룹에 N-터미널 연결된, Pro-Leu-Gly-Pro-Arg [서열번호 28], Pro-Leu-Gly-Pro-Lys [서열번호 29], Pro-Leu-Gly-Pro-Glu [서열번호 30], Pro-Leu-Gly-Pro-Asp [서열번호 31], Pro-Leu-Gly-Pro [서열번호 32], Pro-Leu-Gly 및 Pro-Leu로 구성되는 군에서 선택된 펩티드이다. 바람직한 구현예에서, 침투 인핸서는 Pz 또는 FMOC 그룹(예를 들면, 여기에 참조로 포함되어 있는 미국 특허 제5,534,496호 참조)과 N-터미널 연결된 Pro-Leu-Gly-Pro-Arg [서열번호 28]이다.
침투 인핸서와 항원 결합 단백질을 단일 약학 조성물로 표적 조직에 동시 전달하거나 또는 이들의 전달을 별개의 조성물로 투여하여 일시적으로 분리하는 것을 본 발명의 범위 내에서 고려할 수 있다.
또한, 침투 인핸서를 항원 결합 단백질에 컨쥬게이트시키는 것을 본 발명의 범위내에서 고려할 수 있다. 당분야에서 알려진 모든 물리적 또는 화학적 컨쥬게이션 방법이 고려될 수 있다. 화학적 그룹과 아미노산, 아미노산 유도체, 또는 아미노산 모방체의 컨쥬게이션에 있어서, 당분야에서 공지된 적합한 화학반응을 적용할 수 있다. 라이신, 시스테인 및 히스티딘 잔기 등의 항원 결합 단백질의 어떠한 아미노산 잔기와도 컨쥬게이션할 수 있다.
임의의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 상기한 항원 결합 단백질과의 동시 전달에 적합한 추가 화합물을 포함할 수 있다. 상기한 약물로는, 제한적인 것은 아니나 저분자, 누트로픽스(nootropics), 폴리펩티드 및 올리고뉴클레오티드 등이 있다.
본 발명의 조성물은 제한적인 것은 아니나 점막 상피(예를 들면, 비강(nasal) 상피), 및 각막 조직과 같은 생체막의 밀착 연접을 통과하여 항원 결합 단백질을 전달하는데 사용될 수 있다. 특히 바람직한 표적 막은 비강 상피이며, 본 발명의 조성물은 비강 상피로 투여되어, 바람직하게 혈류로 먼저 유입되지 않고 CNS에 항원 결합 단백질을 직접적이고 특이적으로 전달하기 때문이다.
CNS 장애의 치료
본 발명의 조성물은 항원 결합 폴리펩티드를 CNS에 코점막을 통해 직접적이고 선택적으로 전달할 수 있으므로 CNS 장애의 진행을 치료, 예방 및/또는 지연하는데 특히 적합하다. 본 발명의 조성물을 사용하여 치료하는 적합한 장애로는, 제한적인 것은 아니나, 행동/인지 증후군, 두통장애(예를 들면, 편두통, 군집성 두통 및 긴장성 두통), 간질, 외상성 뇌 손상, 신경퇴행성 질환(예를 들면, 부신백색질형성장애증, 알코올중독, 알렉산더병, 알퍼병, 알츠하이머병, 근위축성 측색 경화증(일명, 루게릭병), 혈관확장성 운동실조증, 바텐병(일명 스필마이어-보그트-쇼그렌-바텐병), 광우병, 카나반병, 뇌성마비, 코카인 증후군, 피질기저 퇴화, 크로이츠펠트병, 가족성 치명성 불면증, 전측두엽 퇴행증, 헌팅턴병, HIV-연관성 치매, 케네디병, 크랩병, 루이바디성 치매, 신경보렐리아증, 마차도-죠셉병(척수소뇌 실조증 제3타입), 다발계 위축증, 다발성 경화증, 기면증, 니이먼-픽병, 파킨슨병, 펠리체우스-메르츠바허병, 픽병, 원발성 측삭 경화증, 프리온병, 진행성 핵상 마비, 레프섬병, 샌드호프병, 쉴러병, 악성 빈혈로 부수되는 척수의 아급성 연합성 변성, 척수소뇌 실조증, 척수성 근위축증, 스틸-리처드슨-올스제브스키병, 척수 매독, 및 중독성 뇌병증, 뇌혈관질환(예를 들면, 일과성 허혈 발작 및 뇌졸중), 수면장애, 뇌성마비, 감염(예를 들면, 뇌염, 뇌수막염, 및 척수염), 종양(예를 들면, 뇌 및 척수 종양), 운동 장애(예를 들면, 반무도병, 틱장애 및 뚜렛 증후군), CNS의 탈수초성 질환(예를 들면, 다발성 경화증 길램-바레 증후군, 및 만성 염증성 탈수초성 말초신경병증), 말초신경장애(예를 들면, 근육병 및 신경근 접합), 변성된 정신상태(예를 들면, 뇌병증, 혼미 및 혼수), 말과 언어 장애, 부종양성 신경학적 증후군, 및 명백한 생리적 원인이 없는 기능신경학적 증상이 있는 증후군 등이 있다.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 중추신경계 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 중추신경계 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상의 코점막에 항원 결합 폴리펩티드(예를 들면, scFv) 및 침투 인핸서(예를 들면, Pz-펩티드)를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하여 상기한 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 것을 포함한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 항원 결합 폴리펩티드를 대상의 중추신경계에 선택적으로 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 항원 결합 폴리펩티드(예를 들면, scFv) 및 침투 인핸서(예를 들면, Pz-펩티드)를 포함하는 조성물을 대상의 코점막에 접촉시키는 것을 포함하며, 이러한 방법에 의해 항원 결합 폴리펩티드는 직접적이고 선택적으로 중추신경계에 전달된다.
표적 항원
본 발명의 방법에서 사용되는 항원 결합 폴리펩티드는 하나 이상의 특이적 표적 항원에 결합할 수 있다. 적합한 표적 항원으로는, 제한적인 것은 아니나, TNF알파(예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_000585.2), 아밀로이드-베타(예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_000475.1), 아밀로이드-베타로 유도된 확산성 리간드 리셉터(예를 들면, PCT 국제공개 제WO/2004/031400호), 모노아민 옥시다제-B(예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_000889.3), L-3,4-디히드록시페닐알라닌 데카복실라제(예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_000781.1), 아세틸-coA 카복실라제(예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_942131.1), N-메틸-D-아스파테이트 수용체 (일명 GRINl)(예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_000823.4)), GRINA (예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_000828.1), GRIN2D (예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_ 000827.2), GRJN2C (예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_000826.2), GRIN3B (예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_619635.1), GRIN2A (예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_000824.1), GRIN2B (예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_000825.2), GRIN3A (예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_597702.2), 히스타민 Hl 리셉터(예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_000852.1), 무스카린 리셉터(일명 CHRMl)(예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_0000729.2), CHRM2 (NP_000730.1), CHRM3 (NP_000731.1), CHRM4 (NP_000732.2), 히포크레틴 리셉터 1 (예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_OOl516.2), 히포크레틴 리셉터 2 (예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_OOl517.2), 5-히드록시트립타민(일명 HTRl A)(예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_ 000515.2), 도파민 리셉터(일명 DRDl)(예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_000785.1), DRD2 (예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_000786.1), DRD3 (예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_000787.2), DRD4 (예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_000788.2), DRD5 (예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_000789.1), 노르에피네프린 트랜스포터(NET) (예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_OO 1034.1), 아드레날린 베타 1 리셉터(예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_000675.1), 및 도파민 D2 리셉터(예를 들면, Genbank 기탁번호: NP_000786.1) 등이 있다.
제형화
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 항원 결합 폴리펩티드/침투 인핸서 조성물의 약학 제제에 관한 것이다. 이러한 제제는 일반적으로 하나 이상의 항원 결합 폴리펩티드, 하나 이상의 침투 앤핸서, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 여기서 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체"란 생리학적으로 적합한 모든 종류의 용매, 분산 매질, 코팅제, 항세균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등이 있다. 바람직하기로는, 상기 담체는, 예를 들면 정맥내, 근육내, 피하, 국소(예를 들면, 눈, 피부 또는 상피층), 흡입, 비경구, 척수 또는 표피 투여(예를 들면, 주사 또는 흡입)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 항원 결합 폴리펩티드/침투 인핸서 조성물은 산의 작용과 상기 화합물을 불활성화할 수 있는 자연 조건으로부터 상기 화합물을 보호하는 물질로 코팅할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. "약학적으로 허용가능한 염"이란 모(母) 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 유지하고 바람직하지 않은 어떠한 독성 효과도 부과하지 않는 염을 지칭한다(예를 들면, Berge, S. M., et al. (1977) J Pharm. Sci. 66:1-19 참조). 이러한 염의 예로는 산 부가염과 염기 부가염이 있다. 산 부가염은, 예를 들면 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐 치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족산, 지방족 및 방향족 설폰산 등의 비독성 유기산뿐만 아니라 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬산, 요오드산, 아인산 등의 비독성 무기산으로부터 유도될 수 있다. 염기 부가염은, 예를 들면 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등의 비독성 유기 아민뿐만 아니라, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등의 알칼리 토금속으로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 약학적으로 허용가능한 산화방지제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 산화방지제의 예는 다음과 같다: (1) 수용성 산화방지제, 예를 들면 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 비설페이트, 소듐 메타비설파이트, 소듐 설파이트 등; (2) 유용성 산화방지제, 예를 들면 아스코르빌 팔미테이트, 부틸레이트된 히드록시아니솔(BHA), 부틸레이트된 히드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트제, 예를 들면 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등.
본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로는, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등)과 이들의 적합한 혼합물, 올리브 오일 등의 식물성 오일, 에틸 올리에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르 등이 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다.
상기한 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 에멀젼화제 및 분산제 등의 보조제를 포함할 수 있다. 미생물은 앞서 언급한 바와 같이 멸균 공정에 의해서, 또한 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 다양한 항세균제와 항진균제를 포함하여 방지할 수 있다. 또한, 바람직하게는 당, 염화나트륨 등의 등장화제를 조성물에 포함시킬 수 있다. 또한, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연하는 물질을 첨가하여 주사가능한 약학적 제형의 흡수를 지연할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체로는 주사가능한 멸균 용액 또는 분산액의 임시 조제물을 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말 등이 있다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질과 제제의 사용은 당 분야에서는 공지되어 있다. 종래의 매질 또는 제제가 활성 화합물과 상용화할 수 없는 것이 아닌 한, 본 발명의 약학 조성물에서 이들의 사용을 고려할 수 있다. 보충적인 활성 화합물도 상기 조성물에 포함시킬 수 있다.
약학 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균성이고 안정해야만 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀 또는 고농도의 약물에 적합한 다른 주문된 구조로서 제형화될 수 있다. 상기 담체는, 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 적합한 이들의 혼합물 등을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다. 대부분의 경우에, 등장화제를 상기 조성물 중에 포함하는 것이 바람직하며, 등장화제의 예로는 당, 만니톨과 같은 폴리알코올, 소르비톨 또는 염화나트륨 등이 있다. 모노스테아레이트염 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연하는 물질을 조성물 중에 포함시켜서 주사가능한 조성물의 흡수를 지연할 수 있다.
멸균 주사용액은 적절한 용매 중에 있는 필요량의 활성 화합물을 상기한 성분들 중 하나 또는 그 조합물과 혼합하고, 필요하다면 이어서 멸균 미세여과하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본적인 분산 매질과 상기한 성분들 중에서 필요한 다른 성분들을 포함하는 멸균 비히클에 혼합하여 제조할 수 있다. 멸균 주사 용액 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조방법은 진공 건조법과 동결건조법(lyophilization)이며, 미리 멸균 여과된 이들의 용액으로부터 활성 성분과 추가의 목적 성분의 분말을 얻는다.
단일 투약형태를 제조하기 위하여 담체 물질과 결합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료 대상과 특정한 투여 방법에 따라 달라질 수 있다. 담체 물질과 결합되어 단일 투약형태를 제조할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 얻는 조성물의 양이 된다. 일반적으로, 100 % 중에서, 상기 양은 약학적으로 허용가능한 담체와의 조합물 중에 활성 성분 약 0.01 % 내지 약 99 %, 바람직하게는 약 0.1 % 내지 약 70 %, 가장 바람직하게는 약 1 % 내지 약 30 % 범위이다.
투약 요법은 최적의 목적하는 반응(예를 들면, 치료 반응)을 제공하도록 조절된다. 예를 들면, 단일 볼루스(bolus)로 투여되거나, 수회로 분할된 투약량을 시간에 따라 투여하거나 또는 투약량을 치료 상황의 위급에 의해 표시되는 바에 따라 비율적으로 증감할 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성과 투약량의 균일성을 위해 투약량 단위형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 여기에서 사용된 투약량 단위 형태는 치료 대상에게 단위 투약량으로 적당한 물리적으로 별개인 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약학적 담체와 관련하여 목적하는 치료 효과를 나타내기 위해 계산된 활성 화합물의 미리 정해진 양을 포함한다. 본 발명의 투약량 단위 형태에 대한 상세는 (a) 활성 화합물의 독특한 특성과 얻고자 하는 특정한 치료 효과, 및 (b) 개인의 감수성 처리를 위한 상기한 활성 화합물을 혼합하는 기술에 내재하는 한계에 의해 결정되고 직접적으로 영향받는다.
본 발명의 다른 태양은 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 방법이다. 대표적인 전달 요법으로 경구 비경구(피하, 근육내 및 정맥내 등), 직장, 구강, 혀밑, 폐, 경피, 비강내 및 경구 등을 본 발명의 범위 내에서 고려할 수 있다. 바람직한 전달 요법은 코이다.
비강 투여에 있어서, 고체 또는 액체 담체를 사용할 수 있다. 고체 담체는, 예를 들면 약 20 내지 약 500 마이크론 범위의 입자 크기를 가지는 조분말일 수 있으며, 이러한 제제는 비강을 통해 급속 흡입하여 투여된다. 액체 담체를 사용하는 경우, 이러한 제제는 코 스프레이 또는 점비액으로 투여될 수 있으며, 활성 성분의 오일 또는 수용액 등이 있다.
비강 투여에 적합한 제제는 활성 화합물을 함유하고 바람직하게는 0.5 내지 7 마이크론 범위의 직경을 가지는 입자를 수용자의 기관세지에 전달하도록 제공된다. 하나의 가능성으로서 이러한 제제는 흡입 장치에서 사용하기 위한, 적절하게 젤라틴 등으로 된 관통가능한 캡슐내, 또는 선택적으로 활성 화합물, 적합한 액체 또는 기체 분사제 및, 계면활성제 및/또는 고체 희석제 등의 임의의 다른 성분을 포함하는 자항식(self-propelling) 제제로서 편리하게 제공될 수 있는 미세분된 분말 형태일 수 있다. 적합한 액체 분사제로는, 예를 들면 프로판과 클로로플루오로카본 등이 있으며, 적합한 기체 분사제로는 이산화탄소 등이 있다. 또한 자항식 제제를 적용할 수 있으며, 여기에서 활성 화합물은 용액 또는 현탁액의 액적 형태로 분산된다. 이러한 자항식 제제는 당분야에서 공지된 것과 유사하며 종래의 방법에 의해 제조될 수 있다. 적합하게는 이들은 목적하는 스프레이 특성을 가지는 수동으로 작동가능한 또는 자동적으로 작용하는 밸브가 구비된 컨테이너에 제공되며; 유리하기로는 상기 밸브는 이들의 각각의 작동에 따라 고정된 용량, 예를 들면 25 내지 100 μl를 전달하는 계량형이다. 또다른 가능성으로서, 활성 화합물은 아토마이저(atomizer) 또는 네뷸라이저(nebuliser)에서 사용하기 위한 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있으며, 여기에서 가속된 기류 또는 초음파 교반을 적용하여 흡입을 위한 미세 액적 미스트를 생성한다. 분산 시에, 상기한 제제는 바람직하게는 비강 내에서 잔류할 수 있는 10 내지 200 마이크론의 입자 크기를 가져야 하며; 이것은, 적절하게는 적합한 입자 크기의 분말을 사용하거나 또는 적절한 밸브를 선택하여 얻어질 수 있다. 다른 적합한 제제로는 20 내지 500 마이크론 범위의 입자 직경을 가지는 조분말로, 코에 근접하여 유지되는 컨테이너에서 비강을 통한 급속 흡입 투여용이며, 수용액 또는 오일 용액 또는 현탁액 중에 활성 성분 0.2 내지 5 w/v%를 포함하는 점비액이 있다.
본 발명의 조성물의 용도
본 발명의 조성물은 약제로서 사용될 수 있으며, 예를 들면 신경 장애의 진행을 치료, 예방 및/또는 지연하기 위한 약제로서 사용될 수 있다. 따라서, 여기에 기술된 조성물은 신경 장애의 치료 또는 예방에 유용한 약제의 제조에 사용될 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 상기한 장애는 편두통, 우울증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 정신분열증, 간질, 뇌졸중, 뇌수막염, 근위축성 측색 경화증, 불면증, 기억장애, 다발성 경화증, 기면증, 외상성 뇌손상 및 스트레스로 구성되는 군에서 선택된다.
바람직하게는, 상기 조성물은 비강내 전달용으로 제형화된다.
본 발명의 특징과 이점은 첨부된 도면과 함께, 이하의 상세한 설명으로부터 보다 잘 이해될 수 있다:
도 1은 400 μg scFv를 비강내 투여한 후, (A) 후각 신경구, (B) 대뇌, (C) 소뇌 및 (D) 뇌간에서 ESBA105의 농도를 추적한 경시적 실험을 나타낸 것이다.
도 2는 (A) 후각 신경구, (B) 대뇌, (C) 소뇌, (D) 뇌간 및 (E) 혈청에서 ESBA105를 비강내(400 μg/mL) 또는 정맥내(40 μg/mL) 투여한 후, 그리고 비강내 또는 정맥내에 ESBA105를 400 μg/mL의 동일한 농도로 투여한 후 (F) 혈청에서 ESBA105의 농도를 비교한 것이다.
도 3은 Pz-펩티드를 포함하거나 또는 포함하지 않는 비강내 투여 후에 상이한 뇌 영역에서 ESBA105의 (A) Cmax (평균값 ± SEM, n = 4) 및 (B) 노출 (AUC) 뇌조직 대 혈액 농도 비율을 나타낸 것이다.
도 4는 비강내 전달 후 비강내에서 CNS로의 ESBA105의 이동 경로를 나타낸 것이다. 비강내에서 출발하여 투여된 화합물은 혈액으로 이동하여 혈뇌 장벽을 통과하여 최종적으로 뇌조직(하부 경로)으로 침투한다. 선택적으로, 상기 화합물은 축색돌기(즉, 세포내)로 또는 신경주위(즉, 세포외)로 N. olfactorius를 경유하여 후각 신경구로 이동한 다음, 대뇌로 이동한다. 상기 화합물은 또한 N. trigeminus(신경주위로, 즉 세포외로)를 거쳐서 뇌간으로, 이후 소뇌로 이동할 수 있다.
실시예
본 발명은 다음 실시예에 의해 보다 상세히 예시되었으며, 이들 실시예는 제한적인 것으로 이해되지 않아야 한다.
일반적으로, 본 발명의 실시는, 다른 지시가 없는 한, 화학, 분자 생물학, 재조합 DNA 기술, 및 면역학(특히, 예를 들면, 면역글로불린 기술)의 공지된 방법을 적용하고 있다. 예를 들면, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al, C.S.H.L. Press, Pub. (1999); 및 Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al, John Wiley & Sons (1992) 등의 문헌을 참조할 수 있다. 또한 Polymeries 미국 특허 제6,803,438호 ; 유럽 특허공개 제EP1701741A2호; 유럽 특허공개 제EP1648518A2호; PCT 국제공개 제WO05065712A2호; PCT 국제공개 제WO05007197A2호; 유럽 특허공개 제EP1496941A1호; 유럽 특허공개 제EP1222217B1호; 유럽 특허공개 제EP1210093A4호; 유럽 특허공개 제EP1461369A2호; PCT 국제공개 제WO03089010A1호; PCT 국제공개 제WO03059973A2호; 및 유럽 특허공개 제EP1210093A1호; Genentech의 미국 특허공개 제20070092940A1호 및 유럽 특허공개 제EP1240337B1호; 및 ESBATech의 미국 특허출원 제60/899,907호, PCT 출원 제PCT/CH2009/000225호, 제PCT/CH2009/000222호, PCT 국제공개 제WO06/131013호 및 PCT 국제공개 제WO03097697A2호를 참조할 수 있다.
ESBA105의 정제
분자량이 26.3 kDa인 안티-TNFα 단일 사슬 항체 절편, ESBA105를 이전에 기술된 바(Furrer et al. (2009) Invest Opthalmol Vis Sci 50, 771-778; Ottiger et al. (2009) Invest Opthalmol Vis Sci 50, 779-786)와 같이 Escherichia coli 숙주 세포로부터 정제하였다. 요약하면, ESBA105를 E. coli BL21(DE3)에서 재조합 발현하고 봉입체로부터 리폴딩한 다음, 크기 배제 크로마토그래피하여 제조하였다. 동물 시험을 위하여 ESBA105를 50 mM 소듐 포스페이트, 150 mM NaCl, pH 6.5 중의 10 mg/ml (비강내 투여용) 또는 0.5 mg/ml (정맥내 투여용) 용량으로 제형화하였다. LAL 응고 에세이에서 측정된 내독소 함량은 생체내 실험에서 사용된 모든 제제에서 0.1 EU 이하였다.
에반스 블루의 비강내 투여
단백질을 CNS에 표적화하는 최적의 조건을 0.9 % NaCl 중의 0.3% 에반스 블루를 비강내 경로에 의해 Balb/c 마우스에 투여하여 먼저 측정하였다. 이후, 시험동물을 미리 정해진 시점에 CO2 흡입에 의해 치사시키고, 이들의 폐와 위를 수집하여 에반스 블루의 존재를 시각적으로 검사하였다. 최적 조건은 시험동물을 이소플루란(Provet, Lyssach, Switzerland) 마취 하에서 앙와위를 유지하고 각각의 비공을 2 μl 에반스 블루로 5분 간격으로 총 40 μl가 될 때(45분)까지 처리하여 얻어졌다(표 1). 따라서, 이 방법을 여기에 기술된 모든 구현예에서 ESBA105의 비강내 투여에 사용하였다.
ESBA105의 비강내 투여 및 정맥내 투여
모든 동물의 예혈(prebleed)을 ESBA105를 비강내 또는 정맥내 투여하기 10일 전에 수집하였다. ESBA105를 이소플루란(Provet, Lyssach, Switzerland) 마취 하에서 비강내 투여하였다. 마우스를 앙와위로 배치하고 총 40 μl (400 μg)의 ESBA105를 2 μl씩 피펫으로 투여하여 각 비공을 매 5분 마다 총 45분 동안 처리하였다. 비강내 PK 시험에서, 4마리의 동물을 처음 비강내 적하 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 및 24시간 후에 치사하였다. 일부 실험에서, 밀착연접의 개방을 일시적인 가역 방법으로 트리거링하여 세포간 마커의 수송을 촉진하는 침투 인핸서인 3 mM Pz-펩티드 (4-페닐아조벤즈옥시카보닐-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg; Bachem, Bubendorf, Switzerland)를 ESBA105 제제에 첨가하였다. 4마리의 동물을 최초 투여 1, 2 및 4시간 후에 치사하였다. 정맥내 주사하는 동안, 마우스를 억제장치에 배치하고 40 μg (80 μl)의 ESBAl05를 꼬리 정맥 내로 주사하였다. 정맥내 투여량은 ESBAl05 400 μg을 비강내 투여하면서 4시간 동안 관찰된 혈액 농도-시간 곡선(AUC) 하의 면적에 따른 전신 노출과 가장 근접하도록 선택되었다. 2마리를 각각의 시점(1, 2 및 4시간)에 치사하였다. 치사 시점에 마우스들을 케타민(ketamine)(Ketasol 100, 65 mg/kg; Pharmacy, Schlieren, Switzerland), 자일라진(xylazine)(Rompun, 13 mg/kg; Provet, Lyssach, Switzerland) 및 아세프로마진(acepromazine) (Prequillan, 2 mg/kg; Arovet, Zollikon, Switzerland)의 혼합물로 깊게 마취시켰다. 마우스를 20 ml PBS로 관류하기 전에 심장 천자에 의해 혈액 샘플을 모았다. 뇌를 주의깊게 획득하여 후각 신경구, 시상과 시상하부를 포함하는 대뇌, 소뇌 및 뇌간으로 절개하였다. 조직의 중량을 측정하고 드라이아이스 상에서 동결하여 분석때까지 -80 ℃에서 저장하였다.
조직 조제물
조직은 분석을 위해 다음과 같이 제조하였다. 100 μl의 용균 완충액(10 mM Tris, pH 7,4, 0,1 % SDS와 프로테이나제 억제제 혼합물(Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland))을 15 mg의 뇌 조직에 첨가하였다. 조직을 5초 동안 초음파처리(8회 반복, 100% 강도)(Sonoplus, Bandelin, Berlin, Germany)하고, 원심분리하여 상징액을 ESBA105의 농도에 대하여 ELISA에 기초한 측정을 실시하였다.
혈청과 뇌 조직 중의 ESBA105의 정량
ESBA105의 농도를 직접 ELISA에서 각 샘플에 대해 3회 측정하여 결정하였다. 96-웰 플레이트(NUNC MaxiSorp; Omnilab, Mettmenstetten, Switzerland)를 PBS 중의 0,5 μg/ml 인간 TNF-알파(Peprotech, London, UK)로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 각각의 다음 단계들 사이에 플레이트를 마이크로 플레이트 세척기(ASYS Atlantis, Salzburg, Austria)를 사용하여 TBS-T (0,005 % 트윈 20; Axon Lab, Baden-Dattwyl, Switzerland)로 3회 세척하였다. 비특이성 결합 부위를 PBS/1 % BSA/0,2 % 트윈 20 중에서 1.5시간 인큐베이션하여 포화하였다. 각 샘플의 예비희석물을 각각의 매트릭스(후각 신경구, 대뇌, 소뇌, 뇌간 및 혈청) 10%를 포함하는 희석 완충액(PBS, 0,1 % BSA, 0,2 % 트윈 20)으로 조제하였다. ESBA105의 표준 대조 희석 시리즈(50 내지 0,5 ng/ml)를 희석 완충액/10% 각 매트릭스로 조제하였다. 이 후, 미리 희석된 샘플과 표준 대조 희석물을 웰에 첨가하고 플레이트를 1.5시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 모아진 ESBA105를 1:20,000 비율로 희석 완충액 중에 희석된, 비오틴화 친화성 정제 폴리클로날 래빗 안티-ESBA105 항체(AK3A, ESBATech, Schlieren, Switzerland)로 검출하였다(1.5시간, 실온). 다음으로, AK3A를 희석 완충액 0,2 ng/ml의 농도에서 폴리-홀스래디쉬 퍼옥시다제 스트렙타비딘(Stereospecific Detection Technologies, Baesweiler, Germany)으로 검출하였다. POD (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland)를 퍼옥시다제 기질로 사용하였으며, 2 내지 20분(색상 강도에 따라) 후에 1 M HCl을 첨가하여 발색 반응을 중지하였다. 플레이트 판독기(Sunrise; Tecan, Maennedorf, Switzerland)로 450 nm에서 흡광도를 측정하고 샘플 중의 ESBA105 농도를 표준곡선(GraphPad Prism 4,03; GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)에서 다항식 회귀로 계산하였다. ESBA105의 정량가능한 최소 농도(LOQ)는 각각 혈청 중에서는 5 ng/ml이고 뇌 조직 중에서는 33 ng/ml이었다. 정량에 대한 하한치 이하의 시그널을 생성하는 희석되지 않은 샘플은 수학적 평가 및 그래픽 디스플레에에 대해 LOQ로 세팅되었다.
실시예 1 비강내 투여 방법
본 실험은 저용량의 비강 투여가 CNS로의 특이적 전달을 유발하는 것을 입증하고 있다. 약물의 CNS로의 효율적이고 특이적인 전달에 있어서, 적용된 기질은 비강 내에 남아 있어야 한다; 그러나 몇몇 연구에서는 비강 내에 적용된 기질이 호흡과 섭취로 인하여 호흡계와 위장관으로 이동할 수 있는 것으로 나타났다(Eyles et al. (1999) Int J Pharm 189, 75-79; Klavinskis et al. (1999) J Immunol 162, 254-262; Lundholm et al (1999) Vaccine 17, 2036-2042; Trolle et al. (2000) Vaccine 18, 2991-2998). 당업자라면 여러가지 측면(예를 들면, 마취, 동물 배치, 및 투여 빈도와 용량 등)에서 비강내 투여된 화합물의 잔류 시간이 영향받을 수 있다는 것을 인지할 것이다. 상기한 비강내 투여 전략을 사용하여 에반스 블루를 트레이서로 하여 비강내 적용한 다음, 염료의 투여후 분포를 평가하였다. 40 내지 50 μl의 에반스 블루를 몇가지 상이한 방법으로 비강내로 투여하였다. 1차로, 앙와위 상태의 마취된 마우스 또는 의식이 있는 마우스에 1회 투약한 결과, 두 경우 모두에서 폐와 위로 염료가 이동하였다. 2차로, 마취된 시험 동물에게 앙와위 상태에서 3분 대신 30 내지 50분 동안 1회 투약하였다. 3차로, 염료의 용량을 5분 간격으로 10 μl씩 2회로 나누어 투여하였다. 상기한 어떤 방법도 에반스 블루가 폐와 위로 이동하는 것을 줄이지 못하였다. 마지막으로 2 μl 이하의 용량을 앙와위 상태의 마취된 시험 동물에게 적용하였고, 그 결과 최소량의 에반스 블루가 폐에 나타났으며, 푸른 얼룩이 위에서는 전혀 나타나지 않았다(표 1).
실시예 2 ESBA105의 CNS로의 전달
본 실시예에서는 scFv를 비강내 투여하여 scFv가 CNS로 전달되는 것을 입증하였다. ESBA105(서열번호 1)는 TNFα와 특이적으로 결합하여 억제하는 단일 사슬 항체이다(예를 들면, 참조를 위해 여기에 포함되어 있는 PCT 국제공개 제WO06/131013호 참조). 상기한 방법에 따라 비강내 투여한 후에, ESBA105는 분석된 뇌의 모든 영역에서 상당한 농도에 이르렀고 시간에 따라 양봉 분포를 나타내었다. 소뇌와 뇌간에서 최대 ESBA105 농도(Cmaχ)가 1차 점적주사한 지 1시간 후에 얻어졌고, 후각 신경구와 대뇌의 농도는 1시간 후에 피크를 나타내었다. 이후, ESBA105 농도는 모든 뇌 영역에서 감소하였으나, 6 내지 12 시간 후에 다시 상승하여 후각 신경구, 소뇌 및 뇌간에서 명백한 낮은 수준의 2차 농도 피크를 나타내었으며(도 1), 이것은 2개의 상이한 이동 경로가 존재할 수 있는 것을 입증하는 것이다. 가장 높은 농도는 후각 신경구와 뇌간에서 측정되었다. 후각 시스템(N olfactorius)을 통해서 비강으로 연결되는 후각 신경구에서, 농도는 9455 ng/ml였다. 농도는 뇌간에서 훨씬 더 높았고(11067 ng/ml) 말초 삼차신경계(N. trigeminus)를 통해서 비강으로 연결된다(표 2). 대뇌에서의 Cmax(975 ng/ml)는 약간 지연(2 시간)되었고, 소뇌 또는 후각 신경구 각각에서 보다 약 7 내지 10 배 더 낮았다. 이러한 결과는 ESBA105가 먼저 후각 신경구와 뇌간에 도달하고 거기에서부터 대뇌와 소뇌로 분포하는 것을 증명한다. 뇌간 및 소뇌와 마찬가지로, 혈청 내의 Cmax는 ESBA105의 최초 투여 1시간 후에 얻어졌으며 5시간과 10시간 사이에 두 번째 피크가 나타난다. 흥미롭게도, ESBA105 농도는 최종 12시간 동안 거의 일정하게 남아있다(도 1).
실시예 3 ESBA105의 CNS로의 직접 전달
본 실시예는 ESBA105의 비강내 투여가 혈류를 통해서 보다 CNS로 직접 전달되는 것을 입증하고 있다. ESBA105가 BBB를 통해서 비강에서 CNS로 직접 이동하는지 아니면 전신 흡수와 이후의 뇌로의 트랜스-BBB 전달에 의해 간접적으로 이동하는지를 측정하기 위해 비강내 투여를 상기한 정맥내 주사와 비교하였다. 정맥내 주사 후에, ESBA105는 농도가 정량 하한값 이하인 대뇌를 제외하고 모든 분석 영역에서 상당한 농도에 이르렀다. 그러나, 비강내 투여 후에는 모든 뇌 영역에서 상당히 높은 약물 농도가 측정되었다(도 2). 비강내 투약에 따른 소뇌와 간뇌에서의 최대 ESBA105 농도는 정맥내 주사 후보다 약 10 내지 18배 더 높았다. 또한 후각 신경구에서의 Cmaχ는 정맥내 투여 대비 비강내 투여가 60배 이상 더 높았다(표 3). 놀라웁게도, 2개 경로에 대해 유사한 전신 노출을 생산하기 위해 투약량이 정해졌지만, 혈청 농도는 비강 투여 후에 명백히 더 낮아져서 6006 ng/ml에 달하였지만, 정맥 주사 후 Cmaχ는 10 배 이상 더 높았다(63709 ng/ml) (표 3). 정맥내 주사 후에, 후각 신경구, 소뇌 및 뇌간에서 최대 농도(Cmax)와 노출(AUC)은 각각 Cmax에 대하여는 202, 257, 및 174 ng/ml이고 AUC에 대하여는 448, 567, 및 416 ng-h/ml로 유사한 값을 얻었다. 정맥내 주사 후 뇌 조직 내의 Cmax는 2시간일 때였고 4시간에서는 ESBA105를 검출할 수 없었다. 대조적으로 비강내 투여 후에는 명백히 더높은 농도가 모든 뇌 영역에서 측정되었다. 가장 높은 값은 후각 신경구(Cmax: 12586 ng/ml; AUC: 23130 ng-h/ml)에 대해 얻어졌으며, 그 다음은 뇌간(Cmax: 3169 ng/ml; AUC: 7942 ng-h/ml), 소뇌(Cmax: 2819 ng/ml; AUC: 5908 ng-h/ml) 및 대뇌(Cmax: 1831 ng/ml; AUC: 2951 ng-h/ml)로 이어졌다. 또한 정맥내 주사와 대조적으로, 비강내 투여 4시간 후에 모든 뇌 영역에서 ESBA105의 농도를 여전히 검출할 수 있다. 이러한 결과는 ESBA105가 혈관에서 BBB를 통과하여 CNS로 침투할 수 있고 가장 효율적인 전달은 비강내 투여에 의한 경로임을 입증한다(표 3).
실시예 4 BBB를 통과하는 ESBA105의 전달을 개선하는 Pz-펩티드
본 실시예는 Pz-펩티드가 CNS로의 scFv의 비강내 전달을 상당히 증강하는 것을 입증하고 있다. 특이적으로, BBB를 통해서 약물을 수송하는 침투 인핸서로서 작용하는 Pz-펩티드의 능력을 3 mM Pz-펩티드를 ESBA105에 첨가하여 시험하고 뇌로의 수송을 평가하였다. Pz-펩티드 존재 하에서 후각 신경구, 대뇌 및 소뇌의 Cmax는 ESBA105 단독일 경우 보다 더 빨리 얻어졌다(최초 투약 후 2시간 대신에 1시간)(표 4). 또한 Pz-펩티드의 첨가로 후각 신경구 및 대뇌에서의 Cmax가 2 내지 3배 증가하였고(7309 내지 15786 ng/ml 및 1133 내지 3417 ng/ml, 각각), 뇌간에서의 Cmax는 변하지 않았다. Cmax에 대한 조직 대 혈액 비율은 ESBA105 만을 투여한 것 보다 ESBA105와 Pz-펩티드를 동시투여하여 후각 신경구와 대뇌에서 명백히 더 높았다(도 3A). 그러나, 소뇌, 간뇌 및 혈청으로의 전달 효과는 덜 두드러졌다. 요약하면, Pz-펩티드는 전신적 노출의 증가 없이 후각 신경구와 대뇌에 거대 분자량 단백질의 전달을 증강시킬 수 있다(도 3). 따라서, 치료 용도에서 Pz-펩티드는 전신적 부작용의 위험을 증가시키지 않고 약물 전달을 증강할 수 있다(표 4).
Figure pct00001

Figure pct00002

Figure pct00004

Figure pct00005

Figure pct00006

Figure pct00007

Figure pct00008

Figure pct00009

Figure pct00010
Figure pct00011

동등한 구현예
당업자라면 일반적인 실험에 의해서 여기에 기술된 본 발명의 특이한 구현예와 동등한 결과를 실현하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 동등한 결과물은 다음 특허청구범위에 의해 포함되는 것으로 간주된다.
SEQUENCE LISTING <110> ESBATech AG <120> Methods and compositions for enhanced delivery of macromolecules <130> P105008PC00 <150> US61/079,586 <151> 2008-07-10 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESBA105 scFv <400> 1 Met Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Gly Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser Val Ser 20 25 30 Asn Asp Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser 85 90 95 Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly 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Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 195 200 205 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220 Ala Arg Tyr Gly Gly Leu Arg Pro Tyr Tyr Phe Pro Met Asp Phe Trp 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 5 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESBA521 scFv <400> 5 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asp Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Gln Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 145 150 155 160 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 165 170 175 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 180 185 190 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 195 200 205 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Gly Ile Ala Val Ala Gly Thr Gly Phe 225 230 235 240 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 6 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESBA105 VH <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val 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<210> 13 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EP43max VL <400> 13 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser Gly Phe Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Pro 65 70 75 80 Ala Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Trp Ser Asp Ser Tyr 85 90 95 Val Asp Asn Leu Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 14 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESBA212 VL <400> 14 Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr 20 25 30 Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Pro Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Thr Asn Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg 100 105 <210> 15 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESBA521 VL <400> 15 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asp Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Gln Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 16 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 16 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 17 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 17 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Gly Ala His Trp Gln 1 5 10 15 Phe Asn Ala Leu Thr Val Arg Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Ser <210> 18 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <220> <221> loop <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least three and up to 50 amino acids can be present. <400> 18 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Xaa Cys Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <220> <221> C-terminal <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least three and up to 15 amino acids can be present. <220> <221> loop <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least three and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> N-terminal <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least three and up to 15 amino acids can be present. <400> 19 Xaa Cys Xaa Cys Gly Xaa 1 5 <210> 20 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FW 1.4 VH (a43) <220> <221> CDR <222> (26)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (42)..(42) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (76)..(76) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Asn Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Xaa Asn Arg Phe Thr Ile Ser 35 40 45 Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 50 55 60 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Xaa Asn Trp Gly Gln 65 70 75 80 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 85 <210> 21 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FW1.4 VL (KI27) <220> <221> CDR <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (41)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (75)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <400> 21 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 20 25 30 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe 35 40 45 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 50 55 60 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Asn Phe Gly Gln Gly 65 70 75 80 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 85 <210> 22 <211> 195 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FW1.4 scFv <220> <221> CDR <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (41)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (75)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (133)..(133) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (149)..(149) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (183)..(183) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <400> 22 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 20 25 30 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe 35 40 45 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 50 55 60 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Asn Phe Gly Gln Gly 65 70 75 80 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 85 90 95 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 100 105 110 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 115 120 125 Cys Ala Ala Ser Xaa Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 130 135 140 Glu Trp Val Ser Xaa Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 145 150 155 160 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 165 170 175 Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Xaa Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 180 185 190 Val Ser Ser 195 <210> 23 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rFW1.4 VH <220> <221> CDR <222> (26)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (42)..(42) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (76)..(76) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Xaa Asn Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Xaa Asn Arg Phe Thr Ile Ser 35 40 45 Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 50 55 60 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Asn Trp Gly Gln 65 70 75 80 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 85 <210> 24 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rFW1.4 VL and rFW1.4v2 VL <220> <221> CDR <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (41)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (75)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <400> 24 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 20 25 30 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe 35 40 45 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 50 55 60 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Asn Phe Gly Gln Gly 65 70 75 80 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 85 <210> 25 <211> 195 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rFW1.4 scFv <220> <221> CDR <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (41)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (75)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (133)..(133) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (149)..(149) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (183)..(183) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <400> 25 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 20 25 30 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe 35 40 45 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 50 55 60 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Asn Phe Gly Gln Gly 65 70 75 80 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 85 90 95 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 100 105 110 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 115 120 125 Cys Thr Ala Ser Xaa Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 130 135 140 Glu Trp Val Gly Xaa Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys 145 150 155 160 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 165 170 175 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 180 185 190 Val Ser Ser 195 <210> 26 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rFW1.4v2 VH <220> <221> CDR <222> (26)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (42)..(42) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (76)..(76) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Xaa Asn Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Xaa Asn Arg Phe Thr Ile Ser 35 40 45 Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 50 55 60 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Asn Trp Gly Gln 65 70 75 80 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 85 <210> 27 <211> 195 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rFW1.4 v2 scFv <220> <221> CDR <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (41)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (75)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (133)..(133) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (149)..(149) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <220> <221> CDR <222> (183)..(183) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid. At least one and up to 50 amino acids can be present. <400> 27 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 20 25 30 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe 35 40 45 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 50 55 60 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Asn Phe Gly Gln Gly 65 70 75 80 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 85 90 95 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 100 105 110 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 115 120 125 Cys Thr Val Ser Xaa Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 130 135 140 Glu Trp Val Gly Xaa Asn Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys 145 150 155 160 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 165 170 175 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 180 185 190 Val Ser Ser 195 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> penetration enhancer <400> 28 Pro Leu Gly Pro Arg 1 5 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> penetration enhancer <400> 29 Pro Leu Gly Pro Lys 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> penetration enhancer <400> 30 Pro Leu Gly Pro Glu 1 5 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> penetration enhancer <400> 31 Pro Leu Gly Pro Asp 1 5 <210> 32 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> penetratin enhancer <400> 32 Pro Leu Gly Pro 1 <210> 33 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESBA903 scFv <400> 33 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ile Ile His Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Tyr Leu Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Gly Ala Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 130 135 140 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser 145 150 155 160 Leu Thr Asp Tyr Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 165 170 175 Gly Leu Glu Trp Val Gly Phe Ile Asp Pro Asp Asp Asp Pro Tyr Tyr 180 185 190 Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys 195 200 205 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 210 215 220 Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Asp His Asn Ser Gly Trp Gly Leu Asp 225 230 235 240 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 34 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESBA903 VL <400> 34 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ile Ile His Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Tyr Leu Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Gly Ala Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 35 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ESBA903 VH <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Gly Phe Ile Asp Pro Asp Asp Asp Pro Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Gly Asp His Asn Ser Gly Trp Gly Leu Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 36 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 37 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SLS2 <400> 37 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20

Claims (17)

  1. 항원 결합 폴리펩티드와 침투 인핸서를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 침투 인핸서가 Pz-펩티드 또는 FMOC-펩티드인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원 결합 폴리펩티드가 면역결합제인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 면역결합제가 scFv인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 결합 폴리펩티드가, TNF-알파, 아밀로이드 베타, 아밀로이드 베타로 유도된 확산성 리간드 리셉터, 모노아민 옥시다제-B, L-3,4-디히드록시페닐알라닌 데카복실라제, 아세틸-coA 카복실라제, N-메틸-D-아스파테이트 수용체(GRINl), GRTNA, GRIN2D, GRIN2C, GRIN3B, GRIN2A, GRIN2B, GRIN3A, 히스타민 Hl 리셉터, 무스카린 리셉터(CHRMl), CHRM2, CHRM3, CHRM4, 히포크레틴 리셉터 1, 히포크레틴 리셉터 2, 5-히드록시트립타민(HTRlA), 도파민 리셉터(DRDl), DRD2, DRD3, DRD4, DRD5, 아드레날린 베타 1 리셉터, 노르에피네프린 트랜스포터(NET) 및 도파민 D2 리셉터로 구성되는 군에서 선택된 표적 항원, 특히 TNF-알파와 특이적으로 결합하는 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, scFv가 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 또는 서열번호 27과 80% 이상의 유사성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
  7. 제5항에 있어서, scFv가 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 또는 서열번호 35와 80% 이상의 유사성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 조성물.
  8. 제5항 또는 제7항에 있어서, scFv가 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 또는 서열번호 34와 80% 이상의 유사성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 조성물.
  9. 제5항, 제7항 또는 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, scFv가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 33과 80% 이상의 유사성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
  10. 제5항, 제7항 또는 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, scFv가 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 36 또는 서열번호 37과 80% 이상의 유사성을 가지는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 결합 폴리펩티드가 침투 인핸서와 공유결합하는 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 침투 인핸서가 항원 결합 폴리펩티드의 중추신경계로의 선택적 비강내 전달을 촉진하는 조성물.
  13. 항원 결합 폴리펩티드, 침투 인핸서 및 사용지시서를 포함하는 키트.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약제로서 사용되는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 약제가 신경 장애를 치료하거나, 예방하거나 또는 진행을 지연하는 조성물.
  16. 신경 장애의 치료, 예방 또는 진행의 지연에 유용한 약제를 제조하기 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 장애가 편두통, 우울증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 정신분열증, 간질, 뇌졸중, 뇌수막염, 근위축성 측색 경화증, 불면증, 기억장애, 다발성 경화증, 기면증, 외상성 뇌손상 및 스트레스로 구성되는 군에서 선택되는 조성물 또는 용도.
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