ES2424042T3 - Anticuerpos estables y solubles que inhiben TNF± - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo o derivado de anticuerpo estable y soluble que se une específicamente a TNFa,comprendiendo dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo un dominio variable de cadena ligera (VL) deSEO ID NO: 1 que se combina con el dominio variable de cadena pesada (VH) de SEO ID NO: 2.

Description

Anticuerpos estables y solubles que inhiben TNFa
Campo técnico
La presente invención se refiere a anticuerpos y derivados de anticuerpos optimizados que se unen a y bloquean la
función del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) y son útiles para el diagnóstico y/o el tratamiento, la prevención o la mejora de enfemnedades asociadas a TNFa; a sus secuencias codificantes, producción y uso en composiciones farmacológicamente adecuadas.
Antecedentes de la técnica
El factor de necrosis tumoral alfa (TNFa, también conocido como caquectina), es una citocina de mamiferos que se
produce de manera natural por numerosos tipos de células, incluyendo monocitos y macrófagos en respuesta a endotoxina u otros estímulos. TNFa es un mediador principal de reacciones inflamatorias, inmunológicas y
fisiopatológicas (Grell, M., et al. (1995) Cell, 83: 793-802).
Se forma TNFa soluble mediante la escisión de una proteína transmembrana precursora (Kriegler, et al. (1988) Cell
53: 45-53), y los polipéptidos de 17 kDa secretados se ensamblan para formar complejos de homotrímero solubles (Smith, et al. (1987), J. Biol. Chem. 262: 6951-6954; para revisiones de TNF, véase Butler, et al. (1986), Nature 320:584; Old (1986), Science 230: 630). Estos complejos se unen entonces a receptores que se encuentran en una variedad de células. La unión produce una serie de efectos proinflamatorios, incluyendo (i) liberación de otras citocinas proinflamatorias tales como interleucina (IL)-6, IL-8 e IL-1, (ii) liberación de metaloproteinasas de la matriz y
(iii) regulación por incremento de la expresión de moléculas de adhesión endotelial, que amplifican adicionalmente la cascada inflamatoria e inmunitaria atrayendo leucocitos a tejidos extravasculares.
Un gran número de trastornos están asociados con niveles elevados de TNFa, muchos de ellos de importancia médica significativa. Se ha mostrado que el TNFa está regulado por incremento en varias enfemnedades humanas, incluyendo enfermedades crónicas tales como artritis reumatoide (AR), trastornos inflamatorios del intestino incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, septicemia, insuficiencia cardiaca congestiva, asma bronquial y
esclerosis múltiple. Ratones transgénicos para TNFa humano producen altos niveles de TNFa. de manera
constitutiva y desarrollan una poli artritis espontánea, destructiva que se asemeja a la AR (Keffer et al. 1991, EMBO J., 10,4025-4031). Por tanto, se considera que el TNFa es una citocina proinflamatoria.
Está bien establecido ahora que el TNFa es clave en la patogénesis de AR, que es una enfermedad crónica, progresiva y debilitante caracterizada por inflamación y destrucción de articulaciones poliarticulares, con síntomas sistémicos de fiebre y malestar y fatiga. La AR también conduce a inflamación sinovial crónica, con frecuente progresión hasta destrucción de hueso y cartílago articular. Se encuentran niveles aumentados de TNFa tanto en el
líquido sinovial como en la sangre periférica de pacientes que padecen AA. Cuando se administran agentes
bloqueantes de TNFa a pacientes que padecen AR, reducen la inflamación, mejoran los síntomas y retardan el daño articular (McKown et al. (1999), Arthritis Rheum. 42:1204-1208).
Fisiológicamente, el TNFa está asociado también con protección frente a infecciones particulares (Cerami. et al. (1988), Immunol. Today 9:28). Se libera TNFa por macrófagos que se han activado mediante lipopolisacáridos de bacterias Gram-negativas. Como tal, parece que el TNFa es un mediador endógeno de importanCia central implicado en el desarrollo y la patogénesis del choque endotóxico asociado con septicemia bacteriana (Michie, et al. (1989), Br. J. Surg.76:670-671; Debets. et al. (1989), Second Vienna Shock Forum, p. 463-466; Simpson, et al. (1989) Crit. Care Clin. 5: 27-47; Waage et al. (1987). Lancet 1: 355-357; Hammerle. et al. (1989) Second Vienna Shock Forum p. 715-718; Debets. etal. (1989), Crit. Care Med. 17:489-497; Calandra. etal. (1990), J. Infect. Dis. 161 :982-987; Revhaug et al. (1988), Arch. Surg. 123:162-170).
Como con otros sistemas orgánicos, se ha mostrado también que el TNFa desempeña un papel clave en el sistema
nervioso central, en particular en trastornos inflamatorios y autoinmunitarios del sistema nervioso, incluyendo esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barre y miastenia grave, y en trastornos degenerativos del sistema
nervioso, incluyendo enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfemnedad de Huntington. El TNFa está implicado también en trastornos de sistemas relacionados de la retina y del músculo, incluyendo neuritis óptica,
degeneración macular, retinopatía diabética, dermatomiositis, esclerosis lateral amiotrófica y distrofia muscular, así como en lesiones del sistema nervioso, incluyendo lesión cerebral traumática, lesión aguda de la médula espinal y accidente cerebrovascular.
La hepatitis es otro trastorno inflamatorio relacionado con TNFa. que entre otros desencadenantes puede estar
provocada por infecciones virales, incluyendo virus de Epstein-Barr, citomegalovirus y de la hepatitis A-E. La hepatitis provoca inflamación aguda del hígado en la región portal y lobular, seguido por fibrosis y progresión
tumoral.
El TNFa puede mediar en la caquexia en cáncer, que provoca la mayoría de la morbilidad y mortalidad del cáncer (Tisdale M.J. (2004), Langenbecks Arch Surg. 389:299-305).
El papel clave desempeñado por el TNFa en inflamación, respuestas inmunitarias celulares y la patología de muchas enfermedades ha conducido a la búsqueda de antagonistas de TNFa.
El TNFa es una citocina importante cuyo bloqueo sistémico conlleva el riesgo de un aumento de la frecuencia y gravedad de infecciones manifestadas clínicamente, en particular reactivación de tuberculosis latente y posiblemente otros riesgos incluyendo inducción de linfomas, enfermedades desmielinizantes e insuficiencia cardiaca.
Una clase de antagonistas de TNFa diseñados para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNFa son anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se unen especificamente a TNFa y bloquean de ese modo su función. El uso de anticuerpos anti-TNFa ha mostrado que un bloqueo de TNFa puede revertir efectos atribuidos a TNFa incluyendo disminuciones en IL-1, GM-CSF, IL-6, IL-8, moléculas de adhesión y destrucción de tejido (Feldmann el al. (1997), Adv.lmmunol. 1997:283-350).
Se han propuesto anticuerpos dirigidos contra TNFa para la profilaxis y el tratamiento de choque endotóxico (Beutler el al. (1985) Science: 234, 470-474). El uso de anticuerpos anti-TNFa en el tratamiento del choque septicémico se discute por Bodmer el al., 1993, (Critical Care Medicine, 21:441-946,1993), Wherry el al., 1993, (Critical Care Medicine, 21 :436-440) y Kirschenbaum el al., 1998, (Critical Care Medicine, 26:1625-1626).
Se ha dado a conocer un método para tratar una enfermedad neurodegenerativa en un ser humano administrando un anticuerpo monoclonal anti-TNFa o un fragmento de unión a TNFa del mismo en el documento US2003147891.
El documento W0014932 enseña el uso de bloqueantes de TNFa incluyendo anticuerpos anti-TNFa para tratar trastomos neurológicos y relacionados provocados por TNFa. Proporciona un método para tratar dichos trastornos administrando un antagonista de TNFa.
El documento W00304751 O da a conocer diversas clases de anticuerpos monoclonales y modificados por ingeniería genética dirigidos contra TNFa, su producción, compuestos que los comprenden y su uso en medicina.
Anticuerpos útiles para terapias de enfermedades mediadas por TNFa son habitualmente o bien anticuerpos monoclonales (Acm) producidos mediante tecnología de hibridoma a partir de una fuente natural, habitualmente un
ratón, o bien anticuerpos modificados por ingeniería genética. Estos últimos corresponden o bien a anticuerpos que se producen de manera natural porque comprenden cadenas pesadas y ligeras de longitud completa, o bien a los fragmentos Fab que pueden generarse también a partir de anticuerpos naturales mediante escisión proteolítica, o bien a anticuerpos scFv de cadena sencilla en los que se unen fragmentos de las regiones de cadena pesada y ligera variables mediante un ligador peptídico.
Las cadenas tanto pesadas como ligeras de un anticuerpo comprenden dominios constantes y variables. Puesto que
los anticuerpos no humanos son inmunogénicos, la cantidad de secuencias de tipo humano en un anticuerpo se
aumenta a menudo en un denominado anticuerpo "híbrido·, que comprende regiones constantes de una IgG
humana, y regiones variables que coinciden con las secuencias de un anticuerpo animal, en la mayoría de los casos
anticuerpos murinos con la especificidad deseada. Estas regiones variables pueden adaptarse entonces
adicionalmente para que sean más similares a un anticuerpo humano típico mediante mutagénesis, conduciendo a un anticuerpo "humanizado". Aún en un enfoque alternativo, sólo las partes de unión a antígeno, es decir, las
regiones determinantes de complementariedad (COR) de las regiones variables de un anticuerpo de ratón se combinan con un esqueleto de un anticuerpo humano, dando como resultado un anticuerpo "con injertos de COR".
Se han descrito anticuerpos monoclonales contra TNFa en la técnica anterior. Meager el al., 1087 (Hybridoma 6:305-311) describen anticuerpos monoclonales murinos contra TNFa recombinante. Shimamoto el al., 1988, (Immunology Lellers 17:311-318) describen el uso de anticuerpos monoclonales murinos contra TNFa en la
prevención del choque endotóxico en ratones.
El documento US5919452 da a conocer anticuerpos quiméricos anti-TNFa y su uso en el tratamiento de patologías asociadas con la presencia de TNFa.
El uso de anticuerpos anti-TNFa en el tratamiento de AR y enfermedad de Crohn se discute en Feldman el al. (1998), (Transplantation Proceedings 30:4126-4127), Adorini el al., 1997, (Trends in Immunology Today 18:209-211) y en Feldmann el al., 1997, (Advanced Immunology 64:283-350). Los anticuerpos frente a TNFa usados en tales tratamientos son generalmente anticuerpos quiméricos, tales como los descritos en el documento US5919452.
El documento US20003187231 da a conocer anticuerpos anti-TNFa humanizados con al menos una región COR no humana que tienen características de unión mejorada. Además, en la solicitud de patente internacional WO 92/11383, se dan a conocer anticuerpos recombinantes, inCluyendo anticuerpos con injertos de COR, específicos para TNFa. Rankin el al. (1995), (British J. Rheumatology 34:334-342) describen el uso de tales anticuerpos con injertos de COR en el tratamiento de AR,
El documento W09211383 da a conocer un anticuerpo con injertos de CDR humanizado específico para TNFa que se deriva del anticuerpo monoclonal murino 61 E7, hTNFI, hTNF3 0101,4, Yenseña la producción y el uso de dichos anticuerpos en diagnóstico y/o terapia de trastornos asociados a TNFa.
Entre los inhibidores específicos de TNFa que se han puesto a disposición comercial sólo recientemente, un anticuerpo monoclonal, de ratón-ser humano quimérico dirigido contra TNFa (infliximab, Remicade™; Centocor Corporation/Johnson & Johnson) ha demostrado eficacia clínica en el tratamiento de AR (Elliott et al.1994, Lancet 344:1105-1110; Mani et al. (1998), Arlhritis & Rheumatism 41: 1552-1563). Infliximab también ha demostrado eficacia clínica en el tratamiento del trastorno inflamatorio del intestino enfemnedad de Crohn (Baert et al. 1999, Gastroenterology 116: 22-28)
El documento US22002037934 da a conocer el tratamiento de hepatitis mediante la administración de un anticuerpo anti-TNFa tal como infliximab.
El documento US6428787 enseña el tratamiento de enfermedades neurológicas y asociadas a TNFa con anticuerpos anti-TNFa incluyendo infliximab, CDP571 y D2E7.
D2E7 (Adalimumab), un anticuerpo monoclonal anti-TNFa humano (Abbott) se ha desarrollado para tratar AR y enfemnedad de Crohn (documento W09729131). Celltech está desarrollando CDP571 (documento EP0626389), un anticuerpo de IgG4 anti-TNFa monoclonal humanizado para tratar enfermedad de Crohn y CDP870, un fragmento de anticuerpo anti-TNFa monoclonal humanizado para tratar AR. La administración local de dichos anticuerpos para el tratamiento de trastornos localizados se da a conocer en el documento US2003185826.
Se generaron muchos anticuerpos de cadena sencilla (scFv) contra una multitud de diferentes antígenos, en particular porque pueden seleccionarse fácilmente por su alta capacidad de unión usando técnicas tales como por
ejemplo presentación en fago o presentación en ribosoma. Además, pueden producirse anticuerpos scFv en sistemas microbianos que están asociados con menores costes en comparación con la producción de anticuerpos
terapéuticos de longitud completa.
Además de aplicaciones in vitro y extracelulares convencionales, también se han usado satisfactoriamente scFv
para aplicaciones intracelulares (Worn et al. 2000, JBC, 28; 275(4):2795-2803; Auf der Maur et al. 2002, JBC, 22; 277(47):45075-45085; Stocks MR, 2004, Drug Discov Today. 15; 9(22):960-966); por tanto, se han desarrollado scFv dirigidos contra antígenos intracelulares. En general, la expresión intracelular de scFv funcionales está limitada por su inestabilidad, insolubilidad y tendencia a formar agregados. Por este motivo, se han desarrollado
satisfactoriamente sistemas de selección in vivo para anticuerpos scFv, que son particularmente solubles y estables
en condiciones reductoras típicas para el entorno intracelular (por ejemplo núcleo, citoplasma) usando una denominada selección de "control de calidad" (documento W00148017; Auf der Maur et al. (2001), FEBS Lett. 508:407-412; Auf der Maur et al. (2004), Methods 34:215-224) y han conducido a la identificación de secuencias esqueleto de scFv particulamnente estables y solubles para tales fines (documento W003097697). Además, estos esqueletos muestran niveles de expresión excepcionales y propiedades de solubilidad y estabilidad potenciadas
también en condiciones naturales, oxidantes en el entorno extracelular. Por tanto, estas propiedades bioquímicas y
biofísicas favorables se traducen en altos rendimientos de producción favorables y permiten que estos fragmentos
de anticuerpo, una vez dirigidos contra antígenos específicos, se apliquen localmente ylo sistémicamente como
productos terapéuticos de proteína en áreas terapéuticas particulares. Ya que tanto los anticuerpos scFv como los fragmentos Fab, en contraposición a anticuerpos de longitud completa, carecen de la parte Fc que se reconoce por el receptar de Fc de monocitos, tales como por ejemplo células citotóxicas naturales, no provocan citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y por tanto no provocan toxicidad inespecífica debido a la
unión a receptores de Fe en células no diana.
Por tanto, hay una necesidad de nuevas formas eficaces de anticuerpos para el tratamiento de trastornos asociados a TNFa tales como AR, particularmente tratamientos que puedan proporcionar terapia sostenida, controlada mediante administración local con un bajo grado de efectos secundarios. La presente invención proporciona anticuerpos, composiciones y métodos para el tratamiento eficaz y continuo de procesos inflamatorios de artritis y otros mecanismos fisiopatológicos o trastornos mediados por TNF·a, en particular diversas formas de dolor.
Descripción de la invención
Por tanto, es un objeto general de la invención proporcionar un anticuerpo o derivado de anticuerpo estable y soluble, que se une específicamente a TNFa in vitro e in vivo. En una realización preferida, dicho derivado de anticuerpo es un anticuerpo scFv o fragmento Fab.
Ahora, con el fin de implementar éstos y todavía objetos adicionales de la invención, que resultarán más fácilmente evidentes a medida que la descripción avanza, dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo se manifiesta mediante las características que comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1 que se combina con un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 2.
En otra realización preferida, el anticuerpo o derivado de anticuerpo de la presente invención tiene especificidad por
TNFa humano. Preferiblemente, la unión al antígeno se caracteriza por una K, de ~ 100 nM o menos. Se prefiere más un anticuerpo con una Ko de 10 nM o menos, y lo más preferido de 1 nM y menos.
Derivados de anticuerpos según la presente invención son por ejemplo fusiones con Fc, fusiones con toxinas,
fusiones con actividades enzimátk:as. diferentes formalos tales como minicuerpos, diacuerpos. anticuerpos lineales,
anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos de anticuerpos biespecíficos, en particular fragmentos Fab y scFv.
Otro objeto preferido de la presente invención es un anticuerpo scFv cuyos dominios VL y VH están conectados por un ligador, preferiblemente en una disposición de secuencia VL-ligador-VH. Más preferiblemente, dicho ligador tiene la secuencia SEO ID NO: 10.
Otro Objeto preferido de la presente invención es el fragmento Fab que comprende un dominio VL que se fusiona con la región constante de una cadena kappa de Ig humana, y un dominio VH que se fusiona con el dominio CH 1 de una IgG humana, mediante lo cual los dos poIipéptidos de fusión se conectan mediante un puente disulfuro
intercatenario.
Todavia en otro aspecto, el anticuerpo o derivado de anticuerpo, por ejemplo el fragmento de anticuerpo, de la presente invención está marcado o qulmicamente modificado.
La presente invención proporciona también una secuencia de ADN que codifica cualquiera de los anticuerpos o derivados de anticuerpo de la presente invención, así como un vector de expresión o clonación que contiene dicha
secuencia de AON. Además, se proporciona una célula huésped adecuada transformada con dicha secuencia de AON, que es preferentemente una célula de E. coli, de levadura o de mamifero.
Además, se proporciona un método para la producción de los anticuerpos o derivados de anticuerpo de la presente invención, que comprende cultivar la célula huésped transformada con el AON que codifica cualquiera de dichos
anticuerpos o derivados de anticuerpo en condiciones que permiten la síntesis de dicho anticuerpo o derivado de
anticuerpo, y recuperar dicha molécula de dicho cultivo. Preferiblemente, dicho método proporciona un anticuerpo scFv o fragmento Fab purificado a partir de E. eoli.
Otro aspecto de la presente invención es el uso de los anticuerpos o derivados de anticuerpo proporcionados por la presente invención como herramienta de diagnóstico para diagnósticos in vitro, y/o como producto farmacéutico. Este uso se prefiere particularmente en el contexto de cualquier estado relacionado con TNFa.
La presente invención abarca también una composición que comprende un anticuerpo o derivado de anticuerpo de
la presente invención en combinación con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, dicha
composición va a usarse como medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas a TNFu.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una preparación de combinación que comprende un
anticuerpo o derivado de anticuerpo de la presente invención , preferiblemente con un segundo compuesto que no es
un anticuerpo o derivado de anticuerpo específico para TNFa.
Aún en otro aspecto de la presente invención, el vector que comprende la secuencia de AON que codifica un
anticuerpo scFv de la presente invención se usa para terapia génica.
El tratamiento de enfermedades asociadas a TNFa se logra mediante el bloqueo de TNFa debido a una fuerte interacción de TNFa con el anticuerpo o el derivado de anticuerpo. Preferiblemente, se prevé un tratamiento de estados autoinmunitarios, de inflamación aguda o crónica, enfermedades relacionadas con cáncer, dolor, trastornos
neurológicos y neurodegenerativos, enfermedades infecciosas y enfermedades cardiovasculares.
Breve descripción de los dibujos
La invención se entenderá mejor y los objetos distintos de los expuestos anteriormente resultarán evidentes cuando se considere la siguiente descripción detallada de la misma. Tal descripción hace referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La figura 1 muestra un esquema de los anticuerpos scFv con las secuencias de TB-A y TB-B que delimitan el
intervalo de las variaciones más frecuentes. Los asteriscos designan posiciones en las que se toleran cambios de
aminoácidos en el esqueleto de los anticuerpos. Los aminoácidos indicados por debajo de las COR (enfatlzándose las COR con un fondo gris) pueden usarse en las respectivas COR.
La figura 2 muestra un esquema a modo de ejemplo para la expresión de un fragmento Fab.
La figura 3 muestra el rendimiento de producción de scFv cuando se expresan en E. eoli. A. Electroforesis en gel de SOS-poliacrilamida de proteínas expresadas. B. Filtración en gel analítica de TB-A y TB-wt que muestra solubilidad superior de TB-A.
La figura 4 muestra una comparación de la afinidad de diferentes anticuerpos scFv hacia TNFa determinada mediante ELlSA.
La figura 5 muestra la inhibición de la citotoxlcldad inducida por TNFa humano en fibroblastos L929 de ratón. A. Inhibición dependiente de la concentración de TB·A en comparación con TB·wt e infliximab con valores de Clso. B. Comparación de derivados de TB·A para bloquear la citotoxicidad inducida por TNFa. C. Comparación de formatos de scFv y Fab de TB·A.
La figura 6 muestra el efecto del tratamiento con anticuerpos de la hinchazón de articulaciones inducida por TNFa humano en rata (Experimento: 5.3., Experimento 1).
La figura 7 muestra el esquema de puntuación para la puntuación de inflamación histopatológica.
La figura 8 muestra el efecto del tratamiento con anticuerpos de la inflamación de articulaciones inducida por TNFa humano en rata (Experimento: 5.3., Experimento 1).
La figura 9 muestra el efecto del tratamiento con anticuerpos de la hinchazón de articulaciones inducida por TNFa humano en rata (Experimento: 5.3., Experimento 2).
La figura 10 muestra el efecto del tratamiento con anticuerpos sobre la inflamación de articulaciones inducida por TNFa humano en rata. (Experimento: 5.3., Experimento 2).
La figura 11 muestra la estabilidad de TB·A en diferentes fluidos corporales.
Modos para llevar a cabo la invención
Se ha encontrado que los anticuerpos o derivados de anticuerpo que comprenden los esqueletos identificados en la denominada selección de "control de calidad" (documento W00148017) se caracterizan por una estabilidad y/o solubilidad generalmente alta y por tanto pueden ser útiles también en el contexto de aplicaciones extracelulares
tales como neutralización de TNFa.. La presente invención proporciona anticuerpos o derivados de anticuerpo
caracterizados por solubilidad y estabilidad potenciadas que reconocen y se unen especlficamente a TNFa y por tanto son adecuados para bloquear la función de TNFa in vivo. Dichos anticuerpos o derivados de anticuerpo se
caracterizan por un esqueleto especial derivado de la selección de "control de calidad" para anticuerpos con
esqueletos particularmente estables y solubles independientes de su sitio de unión a antrgeno que se ha dado a conocer en el documento EP1479694. Si los esqueletos usados en la selección son esqueletos de anticuerpos
humanos, pueden considerarse como esqueletos no inmunogénicos para aplicaciones en seres humanos. Las CDR
de los anticuerpos de la presente invención son idénticas a o se derivan de las CDR del anticuerpo monoclonal murino Di62 (DOring el al., 1994) que se une específicamente a TNFa humano con una alta afinidad (K. ~ 0,4 nM) y puede bloquear la unión de TNFa a su receptor. Además, Di62 inhibe la citotoxicidad inducida por TNFa humano en células L929 de ratón. La etapa obvia de injertar las CDR del anticuerpo de ratón sobre el esqueleto aceptar humano aparentemente más adecuado con propiedades de unión a antígeno no definidas, teniendo dicho esqueleto la secuencia de VL SEO ID NO: 5 y la secuencia de VH SEO ID NO: 6, estando unidas dichas secuencias por un ligador (GGGGS). (SEO ID NO: 10), dio como resultado un anticuerpo scFv de la secuencia
DIVLTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYOORPGKAPKRLIYSAFNRYTG.·
VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDVAVYYCQODYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSG
GGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYS rTHYGMNWVRQAPGQ GLEWHGWINTYTGEPTYAOKFKORVTLTRDTSIGTVYMELTSLTSDDTAVYYCARER GOAMOYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:3+SEQ ID NO:IO+ SEQ ID NO:4)
denominándose dicho anticuerpo scFv TB·8. TB-B dio buenos rendimientos en expresión de proteína (figura 3a), pero no pudo unirse específicamente a TNFa (figura 4a).
Por tanto, para obtener un anticuerpo o derivado de anticuerpo que es (i) suficientemente especifico como para unirse a TNFa, (ji) suficientemente soluble como para permitir una producción y purificación eficaces y para bloquear TNFII in vivo, (iii) suficientemente estable como para ser útil como producto farmacéutico sin padecer una rápida degradación y (jv) suficientemente no inmunogénico, se buscó un compromiso entre la mejor solubilidad y las mejores características de unión a antígeno variando el esqueleto y las CDA. La presente Invención proporciona una secuencia para VL y VH que está optimizada para la combinación de los criterios (j·iv). Un anticuerpo scFv que comprende dicha VL (SEO ID NO: 1 unida por un ligador (GGGGS), a dicha VH (SEO ID NO: 2) se denomina TB·A. La secuencia de TB·A se facilita por SEO ID NO: 40. Este anticuerpo es todavía razonablemente estable y soluble como para proporcionar rendimientos satisfactorios cuando se expresa y se purifica a partir de E. coli (figura 3A), y no se agrega (figura 3B). Sus características de unión hacia TNFII son excelentes, con una K. de 0,8 nM.
Se dan a conocer secuencias de VL y VH derivadas de las presentes secuencias en TB-A de diversos modos. En
primer lugar, se ha encontrado que son aceptables mutaciones puntuales en hasta cinco posiciones en el esqueleto
de VL y/o en hasta nueve posiciones en el esqueleto de VH, especialmente mutaciones puntuales que hacen que los esqueletos sean más similares a TB-B, es decir, más similares a SEO ID NO: 3 para VL o SEO ID NO: 4 para VH. Un anticuerpo scFv que comprende un dominio VL de la secuencia SEO ID NO: 11 y un dominio VH de la secuencia SEO ID NO: 4, unidos por elligador (GGGGS}4, se denomina TB-B R46L porque difiere sólo en la posición 46 de VL con respecto a TB-B. En contraposición a TB-B, este anticuerpo tiene todavia buenas propiedades de unión hacia TNFa (Ko = 100 nM). Esto sugiere que el número de cambios en TB-B R46L en relación con TB-A representa aproximadamente el limite superior para los cambios en el esqueleto de dominio variable.
Sólo se introducen mutaciones puntuales individuales o dobles en entramados de VL y/o VH de TB-A. Los residuos de esqueleto preferidos para las mutaciones están en las posiciones 4, 46, 65, 67, 70 Y 83 para VL, y en las posiciones 11, 16, 28, 43, 48, 68, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 79, 93 Y112 para VH. Las posiciones se numeran según la
numeración en las listas de secuencias. Las sustituciones de aminoácidos son preferiblemente o bien "conservativas", o tales que los aminoácidos de reemplazo son más similares o preferiblemente incluso idénticos a
los correspondientes aminoácidos presentes en la secuencia de TB-B. Por ejemplo, A 76 de VH en TB-A puede cambiarse por 176 tal como está presente en TB-B, pero también puede cambiarse por otro aminoácido con cadena lateral similar, es decir, una cadena lateral no polar tal como VoL. Éste es un ejemplo de una sustitución de
aminoácido "conservativa". Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares adecuados para sustituciones "conservativas" tal como se usan en el presente documento,
incluyendo cadenas laterales básicas (K, R, H), cadenas laterales ácidas (D, E), cadenas laterales polares no cargadas (O, N, S, T, Y, C), cadenas laterales no polares (G, A, V, L, 1, P, F, M, W), cadenas laterales ramificadas en beta (T, V, I) Y cadenas laterales aromáticas (Y, F, W, H). Un cambio conservativo preferido es el de VL en la posición 83, en el que se cambia V o bien a F (SEO ID NO: 26) o bien a A (SEO ID NO: 27). Sin embargo, en SEO ID NO: 32, un cambio no conservativo en VL es V83E, que se combina con un cambio en CDR1, es decir, N31 D, Y en VH con V79A. Otra variante de TB-A extraordinaria es la de SEO ID NO: 33, con un intercambio de F68L conservativo en VH conectado a VL mediante un ligador que porta una R en la posición 2, reemplazando a G.
Intercambios de aminoácidos individuales mucho más preferidos son R65S o Y67S en VL y K430 o F68 a V, L o A en VH. Cambios dobles mucho más preferidos son F70UL72R o A761/S77G en VH. Anticuerpos ScFv que comprenden secuencias de TB-A con dichas alteraciones muestran inhibición de la citotoxicidad inducida por TNFa en células L929. Los resultados de algunos de ellos se muestran en la figura 5B. Sus secuencias son las siguientes:
SEO ID NO: 18 = TB-A H_K430 (TB-A H43)
SEO ID NO: 19 = TB-A HJ68V (TB-A H68)
SEO ID NO: 20 = TB-A H_F70UL72R (TB-A H70/72)
SEO ID NO: 21 = TB-A H_A761/S77G (TB-A H76/77)
SEO ID NO: 22 = TB-A L_L46R (TB-A L46)
SEO ID NO: 23 = TB-A L_R65S (TB-A L65)
SEO ID NO: 24 = TB-A L_ Y67S(TB-A L67}
Cualquiera de los dominios VH mencionados anteriormente puede combinarse con cualquiera de los dominios VL mencionados anteriormente.
Los dominios VL y VH de TB-A y TB-B se intercambian de manera que el dominio VL de TB-A (SEO ID NO: 1) se combina con el dominio VH de TB-B (SEO ID NO: 4), o el dominio VL de TB-B (SEO ID NO: 4) se combina con el dominio VH de TB-A (SEO ID NO: 2). Las versiones intercambiadas obtenidas en un scFv se conectan con elligador (GGGGS}4 de la secuencia SEO ID NO: 10, dando como resultado los anticuerpos scFv TB-AB (SEO ID NO: 12) o TB-BA (SEO ID NO: 13), respectivamente. Dicho ligador (GGGGS}4 puede tener un intercambio de aminoácidos de
una glicina por un aminoácido más hidrófilo, es decir, polar, o incluso cargado, que puede hacer que el anticuerpo
sea más soluble. Entre estas variaciones, se prefiere la que tiene la secuencia GRGGS-(GGGGS}3 (SEO ID NO: 39).
También se da a conocer la combinación de dominios VL o VH de secuencias similares a T8-8 con dominios VH o
VL de secuencias similares a TB-A, mediante lo cual similar a TB-B/TB-A significa que las secuencias están más
próximas a una que a la otra,
Se cambian uno o más aminoácidos en las regiones CDR de las secuencias de VL y/o VH de TB-A para que
coincidan con los correspondientes aminoácidos presentes en las secuencias seleccionadas SEO ID NO: 5 de VL
y/o SEO ID NO: 6 o SEO ID NO: 25 de VH. Se prefieren mucho más cambios en una de las CDR de VL (CDR2 de VL o CDR3 de VL) y/o CDR de VH (CDR2 o CDR3), conduciendo los cambios más preferidos a las secuencias de VL SEO ID NO: 7 o SEO ID NO: 8 y/o las secuencias de VH SEO ID NO: 25 o SEO ID NO: 9, respectivamente.
Las secuencias de VL SEO ID NO: 26 o SEO ID NO: 27 se combinan con la secuencia de VH SEO ID NO: 30. La secuencia de VL SEO ID NO: 1 se combina con las secuencias de VH SEO ID NO: 28 o SEO ID NO: 29.
Generalmente, cualquiera de las secuencias de VL dadas a conocer puede combinarse con cualquiera de las secuencias de VH dadas a conocer.
Los objetos de la presente descripción son anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, en particular polipéptidos de VL
o VH, anticuerpos de cadena sencilla (scFv) o fragmentos Fab. En el caso de anticuerpos scFv, un dominio VL seleccionado puede unirse a un dominio VH seleccionado en cualquier orientación mediante un ligador flexible. Un ligador adecuado del estado de la técnica consiste en secuencias de aminoácidos GGGGS repetidas o variantes de las mismas. En una realización preferida de la presente invención, se usa un ligador de (GGGGS). de la secuencia ID NO: 10 o su derivado SEO ID NO: 39, pero también son posibles variantes de 1-3 repeticiones (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. ScL USA 90:6444-6448). Otros ligadores que pueden usarse para la presente invención se describen por Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31 :94-1 06, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 y Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. Immunother. 50:51-59. La disposición puede ser o bien VL-ligador-VH o bien VH-ligador-VL, prefiriéndose
la primera orientación.
En el caso de fragmentos Fab, se fusionan dominios variables de cadena ligera VL seleccionados con la región constante de una cadena kappa de Ig humana, mientras que se fusionan los dominios variables de cadena pesada VH adecuados con el primer dominio constante (N-terminal) CHl de una IgG humana. En una realización a modo de ejemplo de la presente invención, el dominio CJe humano tiene la secuencia SEO ID NO: 14 y el dominio CHl usado para construir los fragmentos Fab tiene la secuencia SEO ID NO: 15. La figura 2 muestra un ejemplo de un fragmento Fab en el que se usan los dominios VL y VH de TB-A de manera que el dominio VL se une directamente al dominio constante kappa humano, dando como resultado la secuencia
DIVMTOSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYOQRPGKAPKLLIYSAFNRYTG
VPSRFSGRGYGTDFTLTISSLOPEDVAVYYCOODYNSPRTFGQGTKLEIKRTVAAPS'
VFIFPPSOEOLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWVDNALQSGNSOESVTEODSKDST
YSLSSTLTLSKAOYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC
(SEO ID NO:l+SEO ID NO:14) y el dominio VH se fusiona con el primer dominio constante (CH1), dando como resultado la secuencia
OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGHNNVROAPGKGLEWHGWINTYTGE
PTYADKFKDRFT FSLETSASTVYMELTSLTS DDTAVYYCARERGDAMOYWGOGTLVT
VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFSEPVTVSWNSGALTSGVHTFP
AVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTYICNVNHKPSNTKVOKKVEPKSCTS
(SEO ID NO:2+SEO ID NO:15) .
En el extremo C~terminal, se forma un puente disulfuro intercatenario entre los dos dominios constantes.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpo de la presente invención pueden tener afinidades por TNFa humano con constantes de disociación K" en un intervalo de 0,8-10.000 nM. En una realización preferida de la presente invención, la K" es ,,10 nM. La afinidad de un anticuerpo por un antígeno puede determinarse experimentalmente usando un método adecuado (Berzolsky et al. "Antibody-Antigen Interactions·, en Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed, Raven Press: Nueva York, NY (1992); Kuby, J. Immunology, W.H. Freeman y Company: Nueva York, NY) y métodos descritos en los mismos.
En un aspecto de la presente invención, los anticuerpos o derivados de anticuerpo, especialmente los fragmentos FAB o scFv, están marcados. Puede lograrse el marcaje detectable de un anticuerpo o derivado de anticuerpo específico de TNFa uniéndolo a una enzima para su uso en un inmunoensayo enzimático (EIA) o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELlSA), que son métodos bien conocidos por el experto en la técnica (por ejemplo Current Protocols in Immunology, Coligan et al. Eds, John Wiley & Sons, 2005).
Marcando radiactivamente los anticuerpos o derivados de anticuerpo específicos de TNFa, es posible detectar TNF-a a través del uso de radioinmunoanálisis (RIA) (véase por ejemplo, Work et al., Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, N.Y. (1978). El radioisótopo puede detectarse mediante el uso de un contador gamma o un contador de centelleo o mediante autorradiografía. Isótopos
particularmente útiles son 3H, 131 1, 358. 14C y preferiblemente 1251.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpo de la presente invención pueden marcarse también con compuestos de marcaje fluorescentes tales como fluoresceína, isotiocianato, rOdamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, 0
ftaldehído y fluorescamina, O con compuestos quimioluminiscentes tales como luminol, isoluminol, éster de acridino teromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.
El experto en la técnica conoce bien protocoles de marcaje y detección. Por ejemplo, están disponibles de Using Antibodies: A Laboratory Manual: Porlable Protocol NO. I (Harlow, E. y Lane, D., t998).
Anticuerpos o derivados de anticuerpo marcados de la presente invención son útiles para fines de diagnóstico, en
particular la detección de TNFa en una muestra biológica extraída de un paciente. Puede usarse cualquíer muestra que contenga TNFa, por ejemplo fluídos bíológicos como sangre, suero, línfa, orína, exudado ínflamatorio, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, un homogeneizado o extracto tisular, y similares, o muestras histológicas para
detección in situ.
PREPARACIONES FARMACÉUTICAS
Definiciones: El término "formulación farmacéutica" se refiere a preparaciones que están en una forma tal que permite que la actividad biológica del anticuerpo o derivado de anticuerpo sea inequívocamente eficaz, y que no contienen componentes adicionales que sean tóxicos para los sujetos a los que se administraría la formulación.
Excipientes "farmacéuticamente aceptables" (vehículos, aditivos) son los que pueden administrarse razonablemente
a un sujeto mamífero para proporcionar una dosis eficaz del principio activo empleado.
Una formulación "estable" es una en la que el anticuerpo o derivado de anticuerpo en la misma conserva esencialmente su estabilidad física y/o estabilidad química y/o actividad biológica tras el almacenamiento. Están disponibles en la técnica diversas técnicas analíticas para medir la estabilidad de proteínas y se revisan en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Pubs. (1991) YJones,
A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993), por ejemplo. La estabilidad puede medirse a una temperatura seleccionada durante un periodO de tiempo seleccionado. Preferiblemente, la formulación es estable a temperatura ambiente (aproximadamente 30°C) o a 40°C durante al menos 1 mes y/o es estable a aproximadamente 2-8°C durante al menos 1 año, durante al menos 2 años. Además, la formulación es preferiblemente estable tras la congelación (hasta, por ejemplo, -70°C) y la descongelación de la formulación.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo "conserva su estabilidad física" en una formulación farmacéutica si no muestra signos de agregación, precipitación y/o desnaturalización tras el examen visual del color y/o la claridad, o tal como se mide mediante dispersión de luz UV o mediante cromatografía de exclusión molecular.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo "conserva su estabilidad química" en una formulación farmacéutica si la estabilidad química en un momento dado es tal que se considera que la proteína conserva todavía su actividad biológica tal como se define a continuación. La estabilidad química puede evaluarse detectando y cuantificando formas químicamente alteradas de la proteína. La alteración química puede implicar modificación del tamaño (por ejemplo recorte) que puede evaluarse usando cromatografía de exclusión molecular, SDS-PAGE y/o espectrometría de masas por desorción(¡onización mediante láser asistida por matriz/tiempo de vuelo (MALDlfTOF MS), por ejemplo. Otros tipos de alteración química incluyen alteración de carga (por ejemplo produciéndose como resultado de desamidación) que puede evaluarse mediante cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo "conserva su actividad biológica" en una formulación farmacéutica si la actividad biológica del anticuerpo en un momento dado está dentro de aproximadamente el 10% (dentro de los errores del ensayo) de la actividad biológica que presentaba en el momento en el que se preparó la formulación farmacéutica en un ensayo de unión a antígeno, por ejemplo. Se elaboran otros ensayos de "actividad biológica"
para anticuerpos a continuación en el presente documento.
Por "isotónica" quiere decirse que la formulación de interés tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas tendrán generalmente una presión osmótica de desde
aproximadamente 250 hasta 350 mOsm. La isotonicidad puede medirse usando un osmómetro de tipo presión de vapor o congelación con hielo, por ejemplo.
Un "poliol" es una sustancia con múltiples grupos hidroxilo, e incluye azúcares (azúcares reductores y no
reductores), alcoholes de azúcar y ácidos de azúcar. Los polioles preferidos en el presente documento tienen un peso molecular que es inferior a aproximadamente 600 kD (por ejemplo en el intervalo de desde aproximadamente 120 hasta aproximadamente 400 kD). Un "azúcar reductor" es uno que contiene un grupo hemiacetal que puede
reducir iones metálicos o reaccionar covalentemente con lisina y otros grupos amino en proteínas y un "azúcar no
reductor" es uno que no tiene estas propiedades de un azúcar reductor. Ejemplos de azúcares reductores son
fructosa, manosa, maltosa, lactosa, arabinosa, xilosa, libosa, ramnosa, galactosa y glucosa. Los azúcares no reductores incluyen sacarosa, trehalosa, sorbosa, melezitosa y rafinosa. Manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol y
glicerol son ejemplos de alcoholes de azúcar. En cuanto a ácidos de azúcar, estos incluyen L-gluconato y sales
metálicas de los mismos. Cuando se desea que la formulación sea estable a la congelación-descongelación, el poliol
es preferiblemente uno que no cristaliza a temperaturas de congelación (por ejemplo -20'C) de manera que desestabilice el anticuerpo en la formulación. Azúcares no reductores tales como sacarosa y trehalosa son los polioles preferidos en el presente documento, prefiriéndose trehalosa con respecto a sacarosa, debido a la superior estabilidad en disolución de la trehalosa.
Tal como se usa en el presente documento, '1ampón" se refiere a una disolución tamponada que resiste los cambios en el pH mediante la acción de sus componentes de conjugado de ácido-base. El tampón de esta invención tiene un pH en el intervalo de desde aproximadamente 4,5 hasta aproximadamente 6,0; preferiblemente desde aproximadamente 4,8 hasta aproximadamente 5,5; y lo más preferiblemente tiene un pH de aproximadamente 5,0. Los ejemplos de tampones que controlarán el pH en este intervalo incluyen acetato (por ejemplo acetato de sodio), succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros tampones de ácidos orgánicos: cuando se desea una formulación estable a la congelación-descongelación, el tampón no es preferiblemente fosfato.
En un sentido farmacológico, en el contexto de la presente invención, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un anticuerpo o derivado de anticuerpo se refiere a una cantidad eficaz en la prevención o el tratamiento de un trastorno
para el tratamiento del cual el anticuerpo o derivado de anticuerpo es eficaz. Una "enfermedad/trastorno" es
cualquier estado que se beneficiaría del tratamiento con el anticuerpo o derivado de anticuerpo. Esto incluye
enfermedades o trastornos crónicos y agudos incluyendo los estados patológicos que predisponen al mamífero al
trastorno en cuestión. Un "conservante" es un compuesto que puede incluirse en la formulación para reducir esencialmente la acción
bacteriana en la misma, facilitando así la producción una formulación de múltiples usos, por ejemplo. Los ejemplos de posibles conservantes incluyen cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en la que los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromáticos tales como fenal, alcohol butílico y bencílico, alquilparabenos tales como metilo propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3pentanol y m-cresol. El conservante más preferido en el presente documento es alcohol bencílico.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más anticuerpos o
compuestos de derivado de anticuerpo, junto con al menos un portador o excipiente fisiológicamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, uno o más de agua, tampones (por ejemplo,
solución salina tamponada neutra o solución salina tamponada con fosfato), etanol, aceite mineral, aceite vegetal,
dimetilsulfóxido, hidratos de carbono (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, adyuvantes, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, agentes quelantes tales como EDTA o
glutatión y/o conservantes. Tal como se indicó anteriormente, pueden incluirse otros principios activos (pero no es necesario) en las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento.
Un portador es una sustancia que puede asociarse con un anticuerpo o derivado de anticuerpo antes de su
administración a un paciente, a menudo para el fin de controlar la estabilidad o biodisponibilidad del compuesto. Los portadores para su uso dentro de tales formulaciones son generalmente biocompatibles, y también pueden ser biodegradables. Los portadores incluyen, por ejemplo, moléculas monovalentes o multivalentes tales como albúmina sérica (por ejemplo, humana o bovina), albúmina de huevo, péptidos, polilisina y polisacáridos tales como aminodextrano y poliamidoaminas. Los portadores también incluyen materiales de soporte sólido tales como perlas y micropartículas que comprenden, por ejemplo, polilactato-poliglicolato, poli(lactida-co-glicolida), poliacrilato, látex, almidón, celulosa o dextrano. Un portador puede llevar los compuestos en una variedad de modos, incluyendo unión covalente (o bien directamente o bien mediante un grupo ligador), interacción no covalente o mezcla.
Pueden formularse composiciones farmacéuticas para cualquier manera apropiada de administración, incluyendo, por ejemplo, administración tópica, oral, nasal, rectal o parenteral. En determinadas realizaciones, se prefieren composiciones en una forma adecuada para uso oral. Tales formas incluyen, por ejemplo, píldoras, comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, gránulos o polvos dispersables, emulsión, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. Dentro de aún otras realizaciones, pueden formularse composiciones proporcionadas en el presente documento como un liofilizado. El término parenteral tal como se usa en el presente documento incluye inyección subcutánea, intradérmica, intravascular (por ejemplo, intravenosa), intramuscular, espinal, intracraneal, intratecal e intraperitoneal, así como cualquier técnica de infusión o inyección similar.
Pueden prepararse composiciones destinadas para uso oral según cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y pueden contener uno o más agentes tales como agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agente colorante y agentes conservantes con el fin de proporcionar preparaciones atractivas y agradables. Los comprimidos contienen el principio activo en mezcla con excipientes fisiológicamente aceptables que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Tales excipientes incluyen, por ejemplo, diluyentes inertes (por ejemplo, carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de SOdio), agentes disgregantes y de granulación (por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico), agentes de unión (por ejemplo, almidón, gelatina o goma arábiga) y agentes lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco). Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden recubrirse mediante técnicas conocidas para retardar la disgregación y absorción en el tubo digestivo y de ese modo proporcionar una acción sostenida a lo largo de un periodo más largo. Por ejemplo, puede emplearse un material de retardo temporal tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.
También pueden presentarse formulaciones para uso oral como cápsulas de gelatina duras en las que el principio activo se mezcla con un diluyente sólido inerte (por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolin), o como cápsulas de gelatina blandas en las que el principio activo se mezcla con agua o un medio de aceite (por ejemplo, aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva). Las suspensiones acuosas contienen anticuerpo o derivado de anticuerpo en mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Tales excipientes incluyen agentes de suspensión (por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidropropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma arábiga); y agentes humectantes o de dispersión (por ejemplo, fosfátidos que se producen de manera natural tales como lecitina, productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos tales como estearato de polioxietileno, productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga tales como heptadecaetilenoxicetanol, productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilensorbitol o productos de condensación de un óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol tales como monooleato de polietilensorbitano). Las suspensiones acuosas también pueden comprender uno o más conservantes, por ejemplo hidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o más agentes
colorantes, uno o más agentes aromatizantes y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.
Pueden formularse jarabes y elixires con agentes edulcorantes, tales como glicerol, propilenglicol, sorbitol o
sacarosa. Tales formulaciones pueden comprender también uno o más demulcentes, conservantes, agentes
aromatizantes y/o agentes colorantes.
Pueden formularse suspensiones oleosas suspendiendo los principios activos en un aceite vegetal (por ejemplo, aceite de maní, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco) o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante tal como cera de abejas, parafina dura o alcohol
eetilica. Pueden añadirse agentes edulcorantes, tales como los expuestos anteriormente, ylo agentes aromatizantes para proporcionar preparaciones orales agradables. Tales suspensiones pueden conservarse mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.
Gránulos y polvos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de
agua proporcionan el principio activo en mezcla con un agente humectante o de dispersión, agente de suspensión y
uno o más conservantes. Se muestran a modo de ejemplo agentes humectantes o de dispersión y agentes de suspensión adecuados mediante los ya mencionados anteriormente. Pueden estar también presentes excipientes adicionales, por ejemplo agentes edulcorantes, aromatizantes y colorantes.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar también presentes en forma de emulsiones de aceite en agua. La
fase oleosa puede ser un aceite vegetal (por ejemplo, aceite de oliva o aceite de maní), un aceite mineral (por ejemplo, parafina líquida) o una mezcla de los mismos. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen gomas que se producen de manera natural (por ejemplo, goma arábiga o goma tragacanto), fosfátidos que se producen de manera natural (por ejemplo, soja, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol), anhídridos (por ejemplo, monooleato de sorbitano) y productos de condensación de ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol con óxido de etileno (por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitano). Una emulsión puede comprender también uno o más agentes edulcorantes y/o aromatizantes.
La composición farmacéutica puede prepararse como una suspensión oleaginosa o acuosa inyectable estéril en la que el modulador, dependiendo del vehículo y la concentración usada, o bien se suspende o bien se disuelve en el vehículo. Una composición de este tipo puede formularse según la técnica conocida usando agentes humectantes, de dispersión y/o agentes de suspensión adecuados tales como los mencionados anteriormente. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, 1,3-butanodiol, disolución de Ringer y disolución de cloruro de sodio isotónica. Además, pueden emplearse aceites fijos, estériles como disolvente o medio de suspensión. Por este motivo, puede emplearse cualquier aceite fijo insípido, incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, pueden usarse ácidos grasos tales como ácido oleico en la preparación de composiciones inyectables, y adyuvantes tales como anestésicos locales, conservantes y/o agentes de tamponamiento pueden disolverse en el vehículo.
Pueden formularse composiciones farmacéuticas como formulaciones de liberación sostenida (es decir, una formulación tal como una cápsula que efectúa una liberación lenta del modulador tras su administración). Tales formulaciones pueden prepararse generalmente usando tecnologia bien conocida y administrarse mediante, por ejemplo, implantación oral, rectal o subcutánea, o mediante implantación en el sitio diana deseado. Los portadores para su uso dentro de tales formulaciones son biocompatibles, y también pueden ser biodegradables; preferiblemente la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación de modulador. La cantidad de un anticuerpo o derivado de anticuerpo contenida dentro de una formulación de liberación sostenida depende de, por ejemplo, el sitio de implantación, la tasa y duración esperada de la liberación y la naturaleza de la enfermedad/trastorno que va a tratarse o prevenirse.
El anticuerpo o los derivados de anticuerpo proporcionados en el presente documento se administran generalmente
en una cantidad que logra una concentración en un fluido corporal (por ejemplo, sangre, plasma, suero, LeR, líquido sinovial, linfa, líquido intersticial celular, lágrimas u orina) que es suficiente para unirse de manera detectable a TNFa
y prevenir o inhibir enfermedades/trastornos asociados a TNFa. Se considera que una dosis es eficaz si da como resultado un beneficio discernible para el paciente tal como se describe en el presente documento. Dosis sistémicas preferidas oscilan entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 140 mg por kilogramo de peso corporal al día (de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 7 g por paciente al día), siendo generalmente las dosis orales aproximadamente 5-20 veces superiores que las dosis intravenosas. La cantidad de anticuerpo o derivado de anticuerpo que puede combinarse con los materiales portadores para producir una fonma farmacéutica individual variará dependiendo del huésped tratado y el modo de administración particular. Las fonmas unitarias de dosificación contendrán generalmente entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 500 mg de un principio activo.
Las composiciones fanmacéuticas pueden envasarse para tratar estados sensibles a un anticuerpo o derivado de
anticuerpo dirigido a TNF-a. Las composiciones farmacéuticas envasadas pueden incluir un recipiente que contiene
una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo o derivado de anticuerpo tal como se describe en el presente documento e instrucciones (por ejemplo, etiquetas) que indican que la composición contenida va a usarse para tratar
una enfermedad/trastorno sensible a un anticuerpo o derivado de anticuerpo tras su administración en el paciente.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpo de la presente invención pueden modificarse también químicamente.
Grupos de modificación preferidos son polímeros, por ejemplo un polímero de polialqueno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido o un polisacárido ramificado o no ramificado. Tal grupo efector puede aumentar la semivida del anticuerpo in vivo. Los ejemplos particulares de polímeros sintéticos incluyen polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, poli(alcohol vinílico) de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituidos o derivados de los mismos. Los polímeros que se producen de manera natural incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glucógeno o derivados de los mismos. El tamaño del polímero puede variarse según se desee, pero generalmente estará en un intervalo de peso molecular promedio de desde 500 Da hasta 50000 Da. Para aplicación local cuando el anticuerpo está diseñado para penetrar en el tejido, un peso molecular preferido del polímero es de aproximadamente 5000 Da. La molécula de polímero puede unirse al anticuerpo, en particular al extremo C-terminal de la cadena pesada del fragmento Fab mediante un péptido de bisagra unido covalentemente tal como se describe en el documento W00194585. Con respecto a la unión de restos de PEG, se hace referencia a "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnological and Biomedical Applications", 1992, J. Millon Harris (ed), Plenum Press, Nueva York y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, Nueva York.
Preparación de la formulación
Tras la preparación del anticuerpo o derivado de anticuerpo de interés tal como se describió anteriormente, se prepara la formulación farmacéutica que lo comprende. El anticuerpo que va a formularse no se ha sometido a
liofilización previa y la formulación de interés en el presente documento es una formulación acuosa. Preferiblemente,
el anticuerpo o derivado de anticuerpo en la formulación es un fragmento de anticuerpo, tal como un scFv. La
cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo presente en la formulación se determina teniendo en cuenta el/los
modos de administración y los volúmenes de dosis deseados, por ejemplo. De desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 50 mg/ml, preferiblemente desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml y lo más preferiblemente desde aproximadamente 2 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml es una
concentración de anticuerpo a modo de ejemplo en la formulación.
Se prepara una formulación acuosa que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo en una disolución de pH tamponado. El tampón de esta invención tiene un pH en el intervalo de desde aproximadamente 4,5 hasta aproximadamente 6,0, preferiblemente desde aproximadamente 4,8 hasta aproximadamente 5,5 y lo más preferiblemente tiene un pH de aproximadamente 5,0. Los ejemplos de tampones que controlarán el pH dentro de este intervalo incluyen acetato (por ejemplo acetato de sodio), succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros tampones de ácidos orgánicos. La concentración de tampón puede ser de desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM, preferiblemente desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 30 mM, dependiendo, por ejemplo, del tampón y la isotonicidad deseada de la formulación. El tampón preferido es acetato de sodio (aproximadamente 10 mM), pH 5,0.
Se incluye en la formulación un poliol, que actúa como tonificante y puede estabilizar el anticuerpo. En realizaciones preferidas, la formulación no contiene una cantidad de tonificación de una sal tal como cloruro de sodio, ya que puede provocar que el anticuerpo o derivado de anticuerpo precipite y/o puede dar como resultado oxidación a pH bajo. En realizaciones preferidas, el poliol es un azúcar no reductor, tal como sacarosa o trehalosa. El pOliol se
añade a la formulación en una cantidad que puede variar con respecto a la isotonicidad deseada de la formulación. Preferiblemente, la formulación acuosa es isotónica, en cuyo caso concentraciones adecuadas del poliol en la
formulación están en el intervalo de desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 15% p/v, preferiblemente en el intervalo de desde aproximadamente el 2% hasta aproximadamente el 10% p/v, por ejemplo. Sin embargo, también pueden ser adecuadas formulaciones hipertónicas o hipotónicas. La cantidad de poliol añadida también puede alterarse con respecto al peso molecular del poliol. Por ejemplo, puede añadirse una cantidad inferior de un monosacárido (por ejemplo manitol), en comparación con un disacárido (tal como trehalosa).
Se añade también un tensioactivo a la formulación de anticuerpo o derivado de anticuerpo. Los tensioactivos a modo de ejemplo incluyen tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos (por ejemplo polisorbatos 20, 80, etc.) o poloxámeros (por ejemplo poloxámero 188). La cantidad de tensioactivo añadida es tal que reduce la agregación del anticuerpo/derivado de anticuerpo formulado y/o minimiza la formación de particulados en la formulación y/o reduce la adsorción. Por ejemplo, el tensioactivo puede estar presente en la formulación en una cantidad de desde aproximadamente el 0,001% hasta aproximadamente el 0,5%, preferiblemente desde aproximadamente el 0,005% hasta aproximadamente el 0,2% y lo más preferiblemente desde aproximadamente el 0,01 % hasta aproximadamente el 0,1 %.
En una realización, la formulación contiene los agentes identificados anteriormente (es decir, anticuerpo o derivado de anticuerpo, tampón, poliol y tensioactivo) y está esencialmente libre de uno o más conservantes, tales como alcohol bencilico, fenol, m-cresol, clorobutanol y CI de bencetonio. En otra realización, puede incluirse un conservante en la formulación, particularmente cuando la formulación es una formulación de múltiples dosis. La concentración de conservante puede estar en el intervalo de desde aproximadamente el 0,1% hasta aproximadamente el 2%, lo más preferiblemente desde aproximadamente el 0,5% hasta aproximadamente el 1 %. Pueden incluirse uno o más de otros portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables tales como los descritos en Remington's Pharmaceutlcal Sciences 21' edición, Osol, A. Ed. (2006) siempre que no afecten de manera adversa a las caracterlsticas deseadas de la formulación. Portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen; agentes de tamponamiento adicionales; codisolventes; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y melíonina; agentes quelantes tales como EDTA; complejos de metal (por ejemplo complejos de Zn-proteína); pollmeros biodegradables tales como paliésteres; y/o contraiones formadores de sales tales como sodio.
Las formulaciones que van a usarse para administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la preparación de la
formulación.
Administración de la formulación
La formulación se administra a un mamffero que necesita tratamiento con el anticuerpo, preferiblemente un ser
humano, según métodos conocidos, tales como administración intravenosa como un bolo o mediante infusión
continua a lo largo de un periodo de tiempo, mediante vías intramuscular, intraperitoneal, Intracerebroespinal,
subcutánea, intraarticular, inlrasinovial, ¡ntratacal, oral, tópica o de inhalación. En realizaciones preferidas, la formulación se administra al mamífero mediante administración intravenosa. Para tales fines, la formulación puede
inyectarse usando una jeringuilla o mediante una linea Lv., por ejemplo.
La dosificación apropiada ("cantidad·terapéuticamente eficaz") del anticuerpo dependerá, por ejemplo, del estado que va a tratarse, la gravedad y el transcurso del estado, si el anticuerpo se administra para fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la historia cllnica del paciente y la respuesta al anticuerpo, el tipo de anticuerpo usado y el criterio del médico encargado. El anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra adecuadamente al paciente
en un tiempo o a lo largo de una selÍe de tratamientos y puede administrarse al paciente en cualquier momento
desde el diagnóstico en adelante. El anticuerpo o derivado de anticuerpo puede administrarse como único tratamiento o conjuntamente con otros fármacos o terapias útiles en el tratamiento del estado en cuestión .
Como proposición general, la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o derivado de anticuerpo administrada estará en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mglkg de peso corporal del paciente ya sea
mediante una o más administraciones, siendo el intervalo típico del anticuerpo usado de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 20 mglkg, más preferiblemente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 15 mglkg, administrado diariamente, por ejemplo. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas convencionales.
Artlculos de fabricación
En otra realización de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que comprende un recipiente que
contiene la formulación farmacéutica acuosa de la presente invención y opcionalmente proporciona instrucciones
para su uso. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales y jeringuillas. El recipiente puede formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. Un recipiente a modo de ejemplo es un vial de vidrio de un solo uso de 3-20 cc. Alternativamente, para una formulación de múltiples dosis, el recipiente puede ser un vial de vidrio de 3-' 00 cc. El recipiente contiene la formulación y la etiqueta en, o asociada con, el recipiente puede indicar directrices de uso. El artículo de fabricación puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas y
prospectos con instrucciones para su uso.
Generación de los anticuerpos de la presente invención
Los anticuerpos o derivados de anticuerpo de la presente invención pueden generarse usando técnicas de rutina en
el campo de la genética recombinante. Sabiendo las secuencias de los pOlipéptidos, pueden generarse los ADNc que codifican los mismos mediante síntesis génica (www.genscript.com). Estos ADNc pueden clonarse en plásmidos de vector adecuados. Una vez obtenido el ADN que codifica un dominio VL y/o VH, puede realizarse mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo mediante PCR usando cebadores mutagénicos, para obtener diversos derivados. Puede elegirse la mejor secuencia "de partida" dependiendo del número de alteraciones deseadas en las secuencias de VL y/o VH. Una secuencia preferida es la secuencia TB-A y sus derivados, por ejemplo pueden elegirse secuencias de scFvo secuencias de péptidos de fusión con Fab como moldes para la clonación y/o mutagénesis dirigida por PCR.
Pueden usarse técnicas de mutagénesis y clonación convencionales bien conocidas por el experto en la técnica
para unir ligadores, dominios de intercambio o fusiones de constructos para la producción de fragmentos Fab. Se describen protocolos básicos que dan a conocer los métodos generales de esta invención en Molecular Cloning, A laboratory Manual (Sambrook & Russell, 3' ed. 2001) Y en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel el al., 1999).
La secuencia de ADN que alberga un gen que codifica un polipéptido de scFv, o en el caso de fragmentos Fab, que codifica o bien dos genes separados o bien un operón bicistrónico que comprende los dos genes para las fusiones VL-CK y VH-CHl (figura 2), se clona en un vector de expresión adecuado, preferiblemente uno con un promotor inducible. Debe tenerse cuidado de que enfrente de cada gen esté presente un sitio de unión al ribosoma (RBS en la figura 2) apropiado que garantice la traducción. Debe entenderse que los anticuerpos de la presente invención
comprenden las secuencias dadas a conocer en vez de que consistan en las mismas. Por ejemplo, las estrategias
de clonación pueden requerir que se prepare un constructo a partir del cual está presente un anticuerpo con uno o unos cuantos residuos adicionales en el extremo N-terminal. Específicamente, la metionina derivada del codón de
iniciación puede estar presente en la proteína final en casos en los que no se ha escindido postraduccionalmente. La mayoría de los constructos para anticuerpos scFv dan lugar a una alanina adicional en el extremo N-terminal. En una realización preferida de la presente invención, se elige un vector de expresión para expresión periplásmica en E.
coli (Krebber, 1997). Dicho vector comprende un promotor enfrente de una secuencia señal escindible. La secuencia codificante para el péptido de anticuerpo se fusiona entonces en marco con la secuencia señal escindible. Esto permite el direccionamiento del polipéptido expresado al periplasma bacteriano donde se escinde la secuencia señal. Entonces se pliega el anticuerpo. En el caso de los fragmentos Fab, los péptidos de fusión tanto VL-Cl< como VH-CHl deben unirse a una señal de exportación. El enlace S-S covalente se forma en las cisteínas C-terminales después de que los péptidos hayan alcanzado el periplasma. Si se prefiere la expresión citoplasmática de los anticuerpos, dichos anticuerpos pueden obtenerse habitualmente en altos rendimientos a partir de cuerpos de inclusión, que pueden separarse fácilmente de otros fragmentos celulares y proteínas. En este caso, los cuerpos de inclusión se solubilizan en un agente desnaturalizante tal como por ejemplo clorhidrato de guanidina (GndHCI) y
entonces se repliegan mediante procedimientos de renaturalización bien conocidos por el experto en la técnica.
Se introducen plásmidos que expresan los polipéptidos de scFv o Fab en un huésped adecuado, preferiblemente una célula bacteriana, de levadura o de mamífero, lo más preferiblemente una cepa de E. coli adecuada como por ejemplo JM83 para expresión periplásmica o BL21 para expresión en cuerpos de inclusión. El polipéptido puede recogerse o bien a partir del periplasma o bien a partir de cuerpos de inclusión y purificarse usando técnicas
convencionales tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, cromatografía de
afinidad y/o filtración en gel conocidas por el experto en la técnica.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpo de la presente invención pueden caracterizarse con respecto al
rendimiento, la solubilidad y la estabilidad in vilro. las capacidades de unión hacia TNFa, preferiblemente hacia TNFa humano, pueden someterse a prueba in vilro mediante ElISA o resonancia de plasmón superficial (BIACore), usando TNFa recombinante humano tal como se describe en el documento W09729131, permitiendo también este último método determinar la constante de velocidad kon, que debe ser preferiblemente inferior a 10.3 .'. Se prefieren valores de K" de ,;10 nM.
La actividad neutralizante in vivo de un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la presente invención puede estimarse usando el ensayo de citotoxicidad de L929. El TNFa recombinante humano ejerce un efecto citotóxico hacia células de fibroblastos L929 de una manera dependiente de la concentración. Esta citotoxicidad inducida por TNFa puede inhibirse mediante anticuerpos neutralizantes de TNFa (Diiring, 1994). Un valor de CI" preferido
correspondiente a la mitad de la concentración de inhibidor máxima es :::;100 ng mr1.
Puesto que el TNFa ha demostrado un papel fisiopatológico en diversas enfermedades humanas, en particular
trastornos inflamatorios, trastornos inmunitarios y regulados por la inmunidad, infecciones que provocan choque septicémico, endotóxico y cardiovascular, enfermedades neurodegenerativas y enfermedades malignas. Puesto que
se sospecha que el TNFa desempeña un papel relevante en la enfermedad en un número cada vez mayor de enfermedades humanas adicionales, es difícil facilitar una lista exhaustiva de indicaciones que también garantice una representación completa del espectro de aplicaciones clínicas para inhibidores de TNFa en el futuro. Por tanto, los anticuerpos o derivados de anticuerpo de la presente invención pueden aplicarse para tratar las enfermedades
enumeradas en el siguiente catálogo, que no debe considerarse una lista completa o exclusiva. También se incluyen otras enfermedades no mencionadas específicamente, que directa Oindirectamente se ven influidas por TNFa.
Inflamación autoinmunitaria o crónica:
Estados crónicos y/o autoinmunitarios de inflamación en general, trastornos inflamatorios mediados por la inmunidad
en general, enfermedad inflamatoria del SNC, enfermedades inflamatorias que afectan alojo, la articulación, la piel,
las membranas mucosas, el sistema nervioso central, el tubo digestivo, las vías urinarias o el pulmón, estados de
uveítis en general, retinitis, uveítis HLA-B27+, enfermedad de Behcet, síndrome de ojo seco, glaucoma, síndrome de Sjogren, diabetes mellitus (incluyendo neuropatía diabética), resistencia a la insulina, estados de artritis en general, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis reactiva y síndrome de Roller, artritis juvenil, espondilitis anquilosante,
esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barre, miastenia grave, esclerosis lateral amiotrófica, sarcoidosis,
glomerulonefritis, enfermedad renal crónica, cistitis, psoriasis (incluyendo artritis psoriásica), hidradenitis supurativa, paniculitis, pioderma gangrenoso, síndrome de SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), acné, síndrome de Sweet, pénfigo, enfermedad de Crohn (incluyendo manifestaciones extraintestinales), colitis ulcerosa, asma bronquial, neumonitis por hipersensibilidad, alergias generales, rinitis alérgica, sinusitis alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis pulmonar, granulomatosis de Wegener, síndrome de Kawasaki, arteritis de células gigantes, vasculitis de Churg-Strauss, poliarteritis nodosa, quemaduras, enfermedad de injerto contra huésped, reacciones huésped contra injerto, episodios de rechazo tras trasplante de médula ósea u órganos,
estados sistémicos y locales de vasculitis en general, lupus eritematoso sistémico y discoide, polimiositis y dermatomiositis, esclerodermia. preeclampsia, pancreatitis aguda y crónica, hepatitis viral, hepatitis alcohólica.
Inflamación aguda ylo prevención de dolor e inflamación postraumático o posguirúraico:
Prevención de la inflamación posquirúrgica en general, cirugía ocular (por ejemplo cirugía de cataratas (reemplazo del cristalino) o glaucoma), cirugía articular (incluyendo cirugía artroscópica), cirugía en estructuras relacionadas con articulaciones (por ejemplo ligamentos), cirugía oral y/o dental, procedimientos cardiovasculares mínimamente invasivos (por ejemplo PTCA, aterectomla, colocación de endoprótesis), procedimientos ginecológicos e intraabdominales endoscópicos y/o laparoscópicos, procedimientos endoscópicos urológicos (por ejemplo cirugía de la próstata, ureteroscopia, cistoscopia, cistitis intersticial), inflamación perioperatoria (prevención) en general.
Enfermedades neurológicas y neurodegenerativas:
Enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, parálisis de Bell, enfermedad de Creutzfeld-Jakob.
Cancer:
Osteolisis relacionada con cáncer. inflamación relacionada con cáncer, dolor relacionado con cáncer, caquexia relacionada con cáncer, metástasis óseas.
Dolor:
Formas agudas y crónicas de dolor, independientemente de si están provocadas por efectos centrales o periféricos de TNFa y si se clasifican como formas inflamatorias, nociceptivas o neuropáticas de dolor, ciática, dolor lumbar, síndrome del túnel carpiano, síndrome de dolor regional complejo (SDRC), gota, neuralgia posherpética, fibromialgia, estados de dolor local, síndromes de dolor crónico debidos a tumor metastásico, dismenorrea.
Infección:
Septicemia bacteriana, viral o fúngica, tuberculosis, SIDA.
Enfermedad cardiovascular:
Aterosclerosis, arteriopatía coronaria, hipertensión, dislipidemia, insuficiencia cardiaca y fallo cardiaco crónico.
En una realización preferida de la presente invención, puede lograrse el tratamiento de osteoartritis o uveítis o enfermedad inflamatoria del intestino con los anticuerpos o derivados de anticuerpo de la presente invención.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo o derivado de anticuerpo de la presente invención en combinación con un excipiente, diluyente o portador
farmacéuticamente aceptable.
La composición farmacéutica debe comprender preferiblemente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la presente invención, es decir, una cantidad de dicho anticuerpo que es necesaria para tratar, mejorar o prevenir la enfermedad o estado relacionado con TNFa, o para presentar un efecto preventivo o terapéutico detectable. La
dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse o bien en ensayos de cultivo celular o bien en modelos animales,
habitualmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal también puede usarse para determinar el intervalo de concentración y la vía de administración apropiados. Un modelo animal adecuado para
observar un efecto del anticuerpo o derivado de anticuerpo de la presente invención es un modelo de rata para
monoartritis aguda (Bolon el al. (2004), Ve!. Pathol.41 :235-243). Se inyecta TNFa humano por vía intraarticular en la articulación de la rodilla de una rata, conduci.endo a una monoartritis aguda, autolimitante en la articulación en la que se realizó la inyección. Puede cuantificarse la bioactividad de un anticuerpo anti-TNFa (derivado) mediante la reducción de la hinchazón de la articulación de la rodilla inducida por TNFa y/o la reducción de los parámetros histológicos de la inflamación.
Puesto que los anticuerpos o derivados de anticuerpo de la presente invención son altamente solubles, altas concentraciones de anticuerpo (60 mg mI"' o más) permiten el uso de volúmenes de aplicación pequeños.
El anticuerpo o derivado de anticuerpo de la presente invención puede utilizarse en cualquier terapia en la que se desee reducir el nivel de TNFa biológicamente activo presente en el cuerpo humano o animal. El TNFa puede estar
en circulación en el cuerpo o puede estar presente a un alto nivel de manera no deseada localizado en un sitio particular del cuerpo. La presente invención proporciona modos para aplicaciones sistémicas así como locales en general, que incluyen, pero no se limitan a las siguientes: aplicación peroral, inyección intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraarticular, intravítrea, intradérmica o intraparenquimatosa, inhalación por aerosol, aplicación tópica
a la piel, a membranas mucosas o alojo, liberación sistémica o local mediante minibomba implantable o liberación local mediante dispositivo/formulación implantable que permite liberación retardada, aplicación tópica a superficies
serosas, aplicación intratecal o intraventricular, aplicación oral en formulaciones que permiten liberación intraluminal
controlada en partes seleccionadas del tubo digestivo, liberación intravasal localizada a partir de dispositivos/formulaciones adecuados (por ejemplo, endoprótesis), administración local a quiste urinario, liberación intraluminal localizada (por ejemplo al conducto biliar, uréter) o administración local a través de dispositivos endoscópicos, o liberación a partir de lentes de contacto (lentillas). Una aplicación preferida es una local tal como inyección intraarticular o aplicación tópica por ejemplo alojo. Para ambas aplicaciones preferidas, es necesario que
el anticuerpo de la presente invención esté en disolución.
La presente invención también revela el uso del anticuerpo o derivado de anticuerpo de la presente invención para la
producción de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas a TNFa. En este caso, el anticuerpo
o derivado de anticuerpo está comprendido en una composición terapéutica. Dicha composición se usa como medicamento, lo más preferiblemente para la prevención o terapia de enfermedades relacionadas con TNFa.
En otro aspecto, los anticuerpos scFv de la presente invención se usan en terapia génica, en particular en terapia
génica celular adoptiva. Los trastornos autoinmunitarios representan respuestas inmunitarias inapropiadas dirigidas
al tejido propio. Las células T CD4+ especificas de antígeno y las células dendriticas (OC) presentadoras de antígeno son mediadores importantes en la patogénesis de enfermedad autoinmunitaria y por tanto son candidatos ideales para terapia génica celular adoptiva, un enfoque ex vivo para la transferencia génica terapéutica. El uso de células transducidas de manera retroviral y bioluminiscencia de luciferasa, Tarner el al. (2003, Ann. N. Y. Acad. Scl. 998:512-519) han demostrado que células T primarias, hibridomas de células T y OC migran de manera rápida y preferente a los sitios de inflamación en modelos animales de esclerosis múltiple, artritis y diabetes. Estas células,
transducidas con vectores retrovirales que dirigen la expresión de diversas "proteínas reguladoras" tales como
interleucinas y scFv anti-TNF, administran estas proteinas inmunorreguladoras a las lesiones inflamadas,
proporcionando terapia para encefalitis autoinmunitaria experimental, artritis inducida por colágeno y ratones
diabéticos no obesos. Los esqueletos estables y solubles de los anticuerpos o derivados de anticuerpo de las
presentes invenciones son particularmente adecuados para la administración intracelular del antígeno, por ejemplo cuando el anticuerpo o derivado de anticuerpo se expresa a partir de un transgén portado por un vector retroviral
adecuado. La terapia génica celular adoptiva conduce a expresión localizada y secreción del scFv anti-TNFa. Smith el al. (2003) han demostrado que scFv derivados de un anticuerpo monoclonal neutralizante de TNFa (i) pueden neutralizar TNFa in vilro y (ii) cambian el patrón de expresión de citocinas en ratones que padecen artritis inducida por colágeno localmente en las articulaciones, pero no de manera sistémica. Alternativamente, la inyección local o
sistémica directa de vectores adecuados (por ejemplo virus) que permiten la expresión continua de un anticuerpo
scFv anti-TNFa se considera como otro posible enfoque de terapia génica.
Las secuencias dadas a conocer son las siguientes:
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10 . AHDYWGQGTLVTVSS
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DDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS La invención se entenderá más completamente mediante referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, no
debe interpretarse que limitan el alcance de la invención.
Experimento 1: Construcción de anticuerpos scFv
El material de partida para la generación de anticuerpos o derivados de anticuerpo anti-TNFa humano humanizados, tales como fragmentos de cadena sencilla (scFv) o fragmentos Fab, fue el anticuerpo monoclonal murino Di62. Las secuencias de la región variable de la cadena ligera y la cadena pesada se dan a conocer en Dóring el al. (1994, Mol. Immunol. 31:1059-1067). Las propiedades de este anticuerpo monoclonal se discuten también en la misma publicación. En resumen, Di62 se une específícamente a TNFa humano de una manera dependiente de la concentración. Es un anticuerpo con alta afinidad (Ko = 0,4 nM) y puede bloquear la unión de TNFa a su receptor. Además, Di62 inhibe la citotoxicidad inducida por TNFa humano en células L929 de ratón.
Basándose en su secuencia publicada, se construyó Di62 en forma de un derivado de anticuerpo de cadena sencilla
(scFv) en la orientación VL-ligador-VH, en la que la secuencia de Iigador está compuesta por cuatro repeticiones de cuatro residuos de glicina y uno de serina (Gly4Ser)4. En el presente documento, este scFv se denomina TB-wt, con un VL de SEO ID NO: 16 y un VH de SEO ID NO: 17.
Para humanizar este derivado de anticuerpo para el fin de a) hacerlo más similar a secuencias humanas con el fin
de minimizar la posible inmunogenicidad, y b) hacerlo más estable y soluble, se injertaron secuencias de CDR de TB-wt en esqueletos humanos estables y solubles (Auf der Maur el al. (2001), FEBS Let!. 508:407-412; Auf der Maur el al. (2004), Methods 39:215-229). Se identificaron el subgrupo I de VH y el subgrupo I de VL-kappa humano como la subfamilia humana más próxima. Se eligió el esqueleto aceptor apropiado a partir de un conjunto de secuencias de VL y VH humanas, seleccionadas por sus propiedades bioquímicas y biofísicas ventajosas, tales como por ejemplo propiedades de estabilidad, solubilidad y expresión (Auf der Maur, el al. (2001), FEBS Let!. 508:407-412; Auf der Maur, el al. (2004), Methods 34:215-224). El aislamiento y las propiedades de estos esqueletos de anticuerpo se describen en los documentos W003097697/EP1506236. A partir de este conjunto, se identificó un esqueleto de anticuerpo de cadena sencilla con propiedades de unión a antigeno no definidas como aceptor adecuado. Este aceptor consiste en un dominio VL-kappa I humano (SEO ID NO: 5) en combinación con un dominio VHI humano (SEO ID NO: 6). En el presente documento, este esqueleto aceptor se denomina FW2.3. Entre los 81 residuos del esqueleto de VL, TB-wt y FW2.3 comparten 55 residuos de aminoácido idénticos, lo que asciende a un 67% de identidad. Entre los 87 residuos del esqueleto de VH, TB-wt y FW2.3 tienen 55 residuos idénticos, lo que corresponde a un 63% de identidad. Ambos derivados de anticuerpo de cadena sencilla tienen longitudes de CDR idénticas, aparte del VH-CDR3, que es más largo en FW2.3. La composición de aminoácidos dentro de los residuos de CDR es diferente para ambos scFv. Se describen diversos métodos para la humanización de dominios variables de anticuerpos (Riechmann el al. (1998), Nature 332:323-327; Padlan, E. A. (1991). Mol. Immunol. 28:489-498; Roguska el al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :969-973; Gonzales el al. (2005), Tumor Biol. 26:31-43; Ewert, S., el al. (2004), Methods 34:184-199). Se llevó a cabo por primera vez el enfoque mínimo, concretamente la transferencia conservativa de todos los bucles de CDR de ratón a partir de TB-wt sobre FW2.3. El scFv resultante se
denomina TB-B Y tiene la secuencia de VL de SEO ID NO: 3 y la secuencia de VH de SEO ID NO: 4_ Los bucles de COR en TB-wt se definieron según el esquema de numeración de Kabat (Kabat el al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, S' Ed, Natl. Inst. Health, Bethesda, MO) y se limitan a los siguientes residuos (véase la figura 1):
VL
COR1: L24-L34 (misma numeración de Kabat)
COR2: LSO-L56 (misma numeración de Kabat)
COR3: L89-L97 (misma numeración de Kabat)
VH
COR1 : H31-H35 (misma numeración de Kabat)
COR2: HSO-H66 (numeración de Kabat HSO-H6S)
COR3: H99-H106 (numeración de Kabat H9S-H102).
Este anticuerpo no podía unirse a TNFa eficazmente (figura 4A). La siguiente etapa era determinar qué residuo o residuos de estos componentes debe(n) sustituirse para optimizar las propiedades del anticuerpo humanizado resultante.
Puesto que la sustitución de residuos de aminoácIdo humanos por otros aminoácidos debe minimizarse debido a que la introducción de secuencias de aminoácidos foráneas aumenta el riesgo de inmunogenlcidad del anticuerpo o derivado de anticuerpo en Seres humanos (Gonzales el al. (2005), Tumor Biol. 26:31-43), se construyeron varias variantes. Una de dichas variantes, denominada en el presente documento TB-B L46 (VL SEO ID NO: 11; VH SEO ID NO: 4) se construyó con el objetivo de minimizar el riesgo de que fuese inmunogénica pero para que mostrase todavla suficiente actividad de unión. Esta variante se basa en TB-B y contiene un único cambio de aminoácido en la posición 46 en VL, concretamente R->l. Este aminoácido está ubicado dentro del núcleo superior de la cadena ligera y participa en la superficie de contacto del dímero. Está implicado en la definición de la conformación de LCOR1 y tiene influencia en el empaquetamiento de VHNl. Se ha notificado que se favorece un residuo de leucina en esta posición particular (documento PCT/US03l19333). En contraposición a TB-B, el scFv TB-B L46 conserva algo de unión específica a TNFa (figura 4A; K. =1 00 nM»_
Con el fin de mejorar adicionalmente la actividad de unión a TNFa, se realizaron uno o más intercambios adicionales en uno o más de los residuos de VL 4, 46, 65, 67, 70, y/o residuos de VH 28, 43, 68, 70, 71 , 72, 73, 76, 77. En el presente documento, la variante con intercambios en todas las posiciones se denomina TB-A (VL SEO ID NO: 1; VH SEO ID NO: 2).
Además, por lo que se refiere a anticuerpos anti-TNFa particulares de la presente invención, ensayos de competición con péptidos derivados de L-COR1 y L-COR2 mostraron que ambos bucles de COR son importantes para la unión del scFv al antígeno (Oóring el al. (1994), Mo\. Immuno\. 31:1059-1067).
En experimentos adicionales dirigidos a minimizar el número de residuos no humanos requeridos para conservar la
unión y a optimizar las propiedades bloflslcas (estabilidad y solubilidad), se aplicaron mutagénesls sistemática e intercambio de dominios pemnitiendo dilucidar las diferencias funcionales entre dominios VL y VH de ratón y
humanizados.
Se obtuvieron dos variantes mediante intercambio de dominios. La primera variante está compuesta por el dominio
Vl de TB-A conectado mediante un ligador de glicina-serina (SEO ID NO: 10) con el dominio VH de TB-B, dando como resultado TB-AB (SEO ID NO: 12). la segunda variante, TB-BA, es la inversa de la primera variante, concretamente, el dominio VL de TB-B en combinación con el dominio VH de TB-A (SEO ID NO: 13).
Se generaron variantes adicionales mediante mutagénesis sistemática de TB-A. La figura 1 muestra una comparación de secuencias de las secuencias de Vl y VH de TB-A y TB-B. Un total de 14 residuos de esqueleto difieren entre TB-A y TB-B (asteriscos). Sólo cinco de ellos, los residuos de Vl 4 y 70. Y los residuos de VH 28, 71 Y 73 muestran sólo diferencias minoritarias en tamaño y propiedad y por tanto no se consideraron para la mutagénesis en este punto. Se reemplazaron las siguientes posiciones de esqueleto por el correspondiente aminoácido de TB-8. Estos mutantes dobles o individuales de TB-A son los siguientes:
TB-A H43
superficie de contacto (SEO ID NO: 18)
TB-A H68
VH de bucle externo (SEO ID NO: 19)
TB-A H70/72
VH de bucle externo (SEO ID NO: 20)
TB-A H76f77 VH de bucle externo (SEO ID NO: 21)
TB-A L46 superficie de contacto (SEO ID NO: 22)
TB-A L65 R--.S VL de bucle extemo (SEO ID NO: 23)
TB-A L67 Y--.S VL de bucle externo (SEO ID NO: 24)
Muchos factores pueden influir en la inmunogenicidad de un anticuerpo o derivado de anticuerpo (Gonzales el al. (2005), Tumor Biol. 26:31-43). Para reducir adicionalmente el contenido no humano de las regiones variables del scFv de TB-A humanizado, se intercambiaron los bucles de CDR2 y CDR3 murinos de VL y el bucle de CDR2 murino de VH por los correspondientes bucles de CDR humanos de FW2.3. Los constructos resultantes en el presente documento se denominan TB_l2 (SEO ID NO: 7), TB_L3 (SEO ID NO: 8) y TB_H2 (SEO ID NO: 9),
respectivamente.
Se generaron los ADNc que codifican la versión de cadena sencilla murina del anticuerpo monoclonal Di62, y las dos versiones humanizadas TB-B y TB-A mediante slntesis génica (www.genscript.com).Seintrodujeron todas las mutaciones puntuales en las otras variantes (TB-B L46, TB-A H43, TB-A H67, TB-A H69n1 , TB·A H75n6, TB-A L46, TB-A L65, TB-A L67, TB-A V83F, TB·A V83A. TB-A D66G) mediante mutagénesis dirigida al sitio dirigida por PeR siguiendo procedimientos de clonación convencionales. Se logró el intercambio de los bucles de CDR murinos de TB-A por los bucles de CDR humanos de FW2.3 usando PCR y procedimientos de clonación del estado de la técnica. Se produjo el ADNc que codifica todas las variaciones de TB-A de VH tal como se da a conocer en SEO ID NO: 28, SEO ID NO: 29 y SEO ID NO: 30 mediante síntesis génica completa.
Se dan a conocer algunas TB-A preferidas adicionales en de SEO ID NO: 31 a SEO ID NO: 38. Se encontró que estos anticuerpos eran particularmente estables y solubles, tal como se muestra a continuación en la tabla 1.
Se clonaron todos los fragmentos de scFv en un vector de expresión para la producción perlplásmlca en E. coli (Krebber el al. (1997), J. Immunol. Methods 201 :35-55).
Además de los derivados de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) descritos anteriormente, se generaron los fragmentos Fab correspondientes tal como sigue. Se fusionaron dominíos variables de cadena ligera (VL)
seleccionados con la región constante de una cadena kappa de 19 humana, mientras que se fusionaron los dominios
variables de cadena pesada (VH) adecuados con el primer dominio constante (N-terminal) (CH1) de una IgG humana. Se amplificaron ambos dominios constantes humanos mediante PCR a partir de una biblioteca de ADNcde bazo humano y dio como resultado la secuencia SEO ID NO: 14 para CKy SEO ID NO: 15 para CH1 .
Experimento 2: Expresión, producción y estabilidad de anticuerpos Fab o scFv humanizados
Se introdujeron plásmidos que codifican TB-wt, sus derivados humanizados o fragmentos Fab en una cepa de E. coli adecuada (por ejemplo JM83) para expresión periplásmica. También se expresaron las variantes de scFv como cuerpos de inclusión, por ejemplo en la cepa de E. co/i Bl21. Se obtuvieron anticuerpos de cadena sencilla funcionales mediante replegamiento de cuerpos de inclusión y posterior purificación mediante, por ejemplo filtración en gel.
Los rendimientos de expresión tras la expresión periplásmica de los scFv oscilaba entre 0,5 mg y 12 mg por litro de cultivo en condiciones de cultivo de laboratorio convencionales (medio dYT, con aproximadamente 3 horas de tiempo de inducción a 30°C, agitando a 200 rpm) con frascos de agitación convencionales. En general, se observó que, tal como se esperaba a partir de los análisis previos de esqueletos seleccionados por su estabilidad y solubilidad (Auf der Maur, el al. (2004), Methods 34:215-224), cuanto más próxima esté la secuencia de un derivado humanizado a la secuencia del esqueleto aceptar (FW2.3), mayor será el rendimiento obtenido tras su expresión en bacterias. Por ejemplo, el rendimiento obtenido a partir de la expresión de TB-B es de lejos mejor que el obtenido a partir de la expresión de TB-A. Según estos hallazgos, la reducción del número de residuos de aminoácido presentes en TB-A tuvo un efecto positivo hacia los rendimientos de expresión (figura 3A).
Otra característica importante de los anticuerpos o derivados de anticuerpo de la presente invención es su
solubilidad. La figura 3B muestra la superioridad del esqueleto TB-A con respecto al esqueleto donador (TB-wt) en cuando a solubilidad en solución salina tamponada con fosfato. En la filtración en gel analítica, TB-A migra predominantemente en un estado de monómero (pico a 70 mi) mientras que TB-wt muestra una fuerte tendencia a formar agregados (pico a 50 mi). Además de eso, se evaluó la solubilidad máxima de TB-A y determinados derivados del mismo mediante precipitación con PEG (Athat DH. el al. JBC. 1981,256; 23.12108-12117). En resumen, se midió la solubilidad aparente de protelnas de prueba en presencia de polietilenglicol 3000 (PEG3000).
Se determinaron curvas de solubilidad midiendo la concentración de proteína en el sobrenadante de mezclas de
proteína-PEG300 centrifugadas. Todas las curvas mostraron una dependencia lineal de lag S (mg/ml) sobre la concentración de PEG3000 (%, p/v). Se estimó la solubilidad máxima (Sm".) de una proterna de prueba mediante extrapolación de la regresión lineal hacia el 0% de PEG (tabla 1). Para TB-A, se calculó que Smá,. era de aproximadamente 70 mg/ml. Todas las protelnas de prueba mostraron solubilidad excepcionalmente buena. En un segundo enfoque, se aplicó un método denominado cromatografía de autointeracci6n (SIC) para evaluar la
atracción/repulsión intermolecular de TB-A (SEO ID NO: 40), TB-A Ligador_G2R H_F68L (SEO ID NO: 33), TB-A H_K43R1F681 (SEO ID NO: 34) y TB-A H_F68L (SEO ID NO: 35) a una concentración de 1 mgiml en PBS (fosfato 50 mM pH 6,5, NaCI 150 mM). En este método, se inmoviliza la proteína de interés sobre una fase estacionaria porosa y se empaqueta en una columna. Se detecta la interacción entre la proteína libre (fase móvil) y la inmovilizada como desplazamientos en el volumen de retención. Se calculó el segundo coeficiente del virial osmótico de proteínas B22, que es una medición de la atracción/repulsión intermolecular, según Tessier, PM el al., Biophys. J. 2002,82: 1620-1632 (tabla I). Cuanto más positivo sea B22, menor será la atracción intermolecular de la proteína de prueba y, por tanto, mayor será su solubilidad. Debido a la alta similitud de las secuencias de proteínas de prueba, se supuso que los valores de B22 de las diferentes proteínas pueden compararse directamente entre sí.
Tabla 1: Características de solubilidad de derivados de TB-A
Aún otra característica relevante de los anticuerpos o derivados de anticuerpo de la presente invención es su alta
estabilidad. Se evaluó la estabilidad de proteínas de TB-A, TB-A H_M48UF681 (SEO ID NO: 31), TB-A ligado,-G2R H_F68L (SEO ID NO: 33), TB-A H_K43R/F681 (SEO ID NO: 34) y TB-A H_F68L (SEO ID NO: 35) determinando la temperatura de comienzo del despliegue mediante dicroismo circular y dispersión de luz a tanto 218 como 292 nm (tabla II). En este experimento, TB-A comenzó a desplegarse a una temperatura de 53'C mientras que sus derivados TB-A H_M48UF681 (SEO ID NO: 31), TB-A Iigado,-G2R H_F68L (SEO ID NO: 33), TB-A H_K43R1F681 (SEO ID NO: 34) y TB-A H_F68L (SEO ID NO: 35) mostraban estabilidad térmica aumentada (56 y 58'C). Todas las proteínas de
prueba mostraban desnaturalización irreversible y precipitaron tras desplegarse, haciendo imposible determinar la temperatura de fusión. Con el fin de determinar el punto medio de la transición en un proceso reversible, se indujo el
despliegue con clorhidrato de guanidina (GdnHCI), para mantener las proteínas desplegadas en disolución. En este enfoque, se determinaron los máximos de emisión de fluorescencia mediante fluorimetría para seguir el despliegue. En este sistema, TB-A mostraba de nuevo buena estabilidad con un punto medio de transición a GdnHCI 2,07 M. En línea con los resultados del despliegue térmico, los derivados TB-A ligador_G2R H_F68L (SEO ID NO: 33) y TB-A H_K43R/F681 (SEO ID NO: 34) mostraban estabilidad aumentada ya que presentaban puntos medios de transición superiores, GdnHCI 2,33 y 2,3 M, respectivamente.
Tabla 11: Características de estabilidad de derivados de TB-A
SEO
Comienzo de desnaturalización r'CI [GdnHCI] en el punto medio de la transición
TB-A
53 2,07 M
TB-A H M48UF681
58 nd
TB-A L V83E H V79A
nd nd
TB-A ligador G2R H F68L
58 2,33 M
TB-A-QCI5.2
56 2,30 M
TB-A-OC23.2
58 nd
TB-A-H F68A
nd nd
TB-A H F68V/F70L
nd nd
TB-A H F70L
nd nd
Se sometió a ensayo la estabilidad de TB-A en suero humano, orina humana, fluido del cuerpo vítreo de cerdo y fluido de la cámara anterior de cerdo midiendo la actividad de unión a TNFa de TB-A tras la incubación durante 3 días a 37'C en el respectivo fluido corporal o tampón de ensayo (TBSTM) como control positivo. Se diluyó TB-A en fluidos corporales hasta una concentración final de 1 O ~M. Tras el periodo de incubación, se sometieron a ensayo series de dilución de las muestras mediante ELlSA con el fin de detenninar la constante de unión K, de TB-A (figura 11). Cuando se comparan muestras de fluido corporal con las muestras de TBSTM control positivo, un
desplazamiento de Kc! hacia concentraciones superiores indicaría una disminución de la proteína activa durante el
periodo de incubación. Sin embargo, en nuestros experimentos, no pudo detectarse tal desplazamiento, lo que indica que la cantidad de TB-A completamente activa permanecía constante en cada ensayo de fluido corporal debido a una alta estabilidad del anticuerpo.
Experimento 3: Características de unión de derivados de anticuerpo humanizados
3S
Se sometieron a prueba las propiedades de unión de todas las variantes de scFv humanizadas en ELlSA sobre TNFa humano recombinante. Las constantes de disociación (Ko) para todas las variantes se encuentran dentro de un intervalo de 0,8 a más de 10,000 nM. Parece haber una correlación inversa entre el grado de homologia con el esqueleto aceptar humano y la afinidad del ligando de unión respectivo (la figura 4A). No obstante, algunas variantes de TB-A que contenian mutaciones hacia la secuencia de TB-B muestran niveles de afinidad hacia TNFa humano que son comparables a los de TB-A. La figura 4B muestra dos derivados con rendimiento de expresión mejorado de TB-A (en comparación con la figura 3A) que presentan afinidades similares a TB-A cuando se comparan en ELlSA.
TB-A representa un buen compromiso entre el equilibrio aparente de rendimiento de expresión y afinidad. En cuanto a afinidad, no pudieron detectarse diferencias significativas entre el fonnato de cadena sencilla y el de fragmento Fab de TB-A (datos no mostrados).
Se detenninaron también la afinidad por TNFa y la cinética de unión para TB-A mediante resonancia de plasmón superficial (BIACorel' dando como resultado una constante de disociación Ko = 0,8 nM, una velocidad de disociación de koH =4,4 x 10" 5 Y una velocidad de asociación de kan =5 x 1 O' 5' M"'.
Experimento 4: Ensayo de citotoxicidad de L929
La función de los anticuerpos o derivados de anticuerpo en la neutraJización de TNFa in vivo puede someterse a
prueba midiendo la inhibición de la citotoxicldad de TNFa hacia fibroblastos L929 de ratón cultivados o alternativamente hacia células de mielosarcoma KYM-l humanas (tabla 111). Los derivados de scFv humanizados de Di62 presentan diferentes eficacias en el ensayo de L929 tal como se muestra en la figura 5B. Algunos derivados de scFv muestran valores de CI50 (concentración inhibidora para lograr el 50% de inhibición) en el intervalo de 5 ng/ml, mientras que otros no tenian efecto en los ensayos de L929. Los datos del ELlSA y los resultados del ensayo de L929 no siempre Se correlacionan. Sin embargo, los datos de KYM-l y los resultados de L929 se correlacionaban bien con la única diferencia de que se requerían concentraciones mucho más altas de TNF humano recombinante y en consecuencia también del antagonista para observar un efecto. Por tanto, se usó principalmente KYM-l para confirmar los resultados de L929. Para comparación directa de proteínas de prueba, se expresa la potencia como un valor relativo normalizado con respecto a TB-A (CEsoX I CE'GTB-A). Sin embargo, en general, los valores de CI50 eran de nuevo superiores cuanto más próxima está la secuencia de un ligando de unión al esqueleto aceptar humano (FW2.3). La figura 5 compara la potencia de diferentes derivados de TB-A para bloquear la citotoxicidad inducida por TNFa hacia células de fibroblastos L929 de ratón. La absorción a 450 nm se correlaciona con la
supervivencia celular.
TB-A Y la IgG anti-hTNFa Infliximab" muestran un valor de Clso similar en el ensayo de L929, mientras que la potencia de TB·wt para bloquear la cnotoxicidad inducida por TNFa humano es significativamente inferior (figura 5A). Cuando se comparan derivados de TB-A con TB-A para detenninar su potencial para bloquear la citotoxicidad índucida por TNFa, la mayoría de estos derivados excepto TB-H43 tienen una eficacia reducida en L929 (figura 5B).
Tabla 111: Propiedades funcionales de derivados de TB-A
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i I CE::X'í' ::EsoTB-A r:i""I~. L929
r:"I"I~" KYM·l TB-A
1,0
1,0 rB·A H M4RI /~ ~1
1,6 rB-A L _V83E H_ nc
nd rB-A liaador G2R HJ68L 0,8
1,3 >.2 1,37
1,5 TB-A.or:n
1,32
1,5 ,14
nd
• H_ '70L ,28
nd .HJ70L
,7 nd
En línea con los datos de ELlSA, no hay ninguna diferencia significativa en la capacidad para bloquear la citotoxicidad inducida por TNFa entre el formato de scFv y el de Fab de TB-A (figura 5C). El valor de Clso del fonnato de Fab de TB-A se encuentra aproximadamente en un factor de dos por encima del valor de Clso del fonnato de scFv de TB-A (figura 5C), lo más probablemente como resultado de la masa molecular superior del fragmento Fab.
Experimento 5. Experimentos con animales con derivados de anticuerpo anti-TNFa
5.1. Descripción del experimento
Con el fin de someter a prueba la eficacia de los derivados de anticuerpo anti-TNFa de ESBATech (scFv y Fab) en
la neutralización funcional de la bioactividad de TNFa. humano en una situación in vivo, se usó un modelo de rata
recientemente publicada para monoartritis aguda. Este modelo se ha descrito extensamente por Balan y colaboradores (véase Balan el al. (2004), Ve!. Pathol. 41 :235-243). En resumen, en este modelo de artritis animal, se inyecta TNFa humano por vía intraarticular en la articulación de la rodilla de ratas Lewis macho. La inyección de
TNFa humano conduce a una monoartritis aguda, autolimitante en la articulación en la que se realiza la inyección.
La artritis puede cuantificarse mediante la medición de la hinchazón de la articulación y la puntuación histológica. En consecuencia, puede cuantificarse la bioactividad de antagonistas de TNFa respectivos mediante la reducción de la hinchazón de la articulación inducida por TNFa y/o la reducción de los parámetros histológicos de la inflamación.
5.2. Materiales y métodos
Diseño experimental
Se diseñaron los actuales estudios para examinar el potencial respectivo de un anticuerpo scFv representativo y un
anticuerpo Fab representativo de la serie descrita anteriormente con el anticuerpo comercializado Infliximab (Remicade®) para inhibir la bioactividad de TNFa humano en un modelo de artritis animal apropiado. Balan y colaboradores habían mostrado anteriormente que la aplicación intraarticular de 10 microgramos de TNFa humano recombinante en la articulación de la rodilla de la rata provoca una monoartritis aguda, autolimitante que puede
cuantificarse mediante análisis microscópico y macroscópico convencional. Por tanto, este modelo animal sirvió
como sistema ideal para evaluar el efecto terapéutico de derivados de anticuerpo aplicados localmente. Se completaron dos experimentos en serie (tablas IV y V). 1) Un estudio de eficacia básico que evalúa el potencial global de los anticuerpos para bloquear la monoartritis inducida por TNFa humano; y 2) un estudio de respuesta a la dosis que evalúa la eficacia relativa de los derivados de anticuerpo entre sí. Se administraron ambos, cltocinas y
derivados de anticuerpo una vez mediante inyecciones separadas. tal como se describe a continuación. La dosis de citocinas usada se basó en la publicación de Balan y colaboradores, mientras que el intervalo de dosis de los derivados de anticuerpo se basó en datos de cultivo celular disponibles y estimación razonada. Se realizaron los
experimentos según directrices de cuidado de animales generales.
Animales y cría
Se asignaron aleatoriamente ratas Lewis macho jóvenes, adultas (6-7 semanas y 175-200 g) a grupos de tratamiento (n=31cohorte) y se alojaron según Balan el al. (2004), Ve!. Pathol. 41 :235-243.
Instilación de anticuerpos y citocinas
Se realizaron inyecciones de anestesia y citocinas tal como se describe por Balan y colaboradores. Con el fin de no
exceder un volumen inyectado por vía intraarticular total de 50 microlitros, se instilaron citocinas y derivados de anticuerpo en dos inyecciones intraarticulares separadas mediante lo cual se inyectaron los 10 microgramos de
TNFa humano recombinante en 10 microlitros de solución salina tamponada con fosfato (PBS) esterilizada por
filtración y se inyectó la dosis respectiva del anticuerpo respectivo en 40 microlitros de solución salina tamponada con fosfato esterilizada por filtración. Se les inyectó por vía Lp. a los animales tratados con Infliximab/Remicade® aplicado por vía intraperitoneal los derivados de anticuerpo 3 horas antes de la inyección intraarticular del TNFa humano. En todos los animales tratados con tratamientos con anticuerpos aplicados por vía intraarticular, se inyectó la dosis de anticuerpo respectivo 5 minutos antes de la inyección del TNFa humano. Se les inyecto a los animales control 10 microlitros de PBS sin TNFa humano.
Se adquirió Infliximab/Remicade® usado en los experimentos en una farmacia suiza oficial. Se expresaron en E. co/i
anticuerpos scFv y Fab (TB-A) específicos anti-TNFa humano así como un esqueleto de anticuerpo scFv sin tratamiento previo usado como anticuerpo control no específico en el experimento de respuesta a la dosis y se
purificaron mediante métodos convencionales. Se mantuvo la contaminación con endotoxinas por debajo de 10 UE
por miligramo de proteína en todas las preparaciones debido a que el componente de lipopolisacárido es un potente inductor de TNFa.
Se adquirió TNFa humano recombinante de PeproTech EC Ud.
Medición del diámetro de la articulación
Inmediatamente antes de la inyección del derivado de anticuerpo respectivo, aplicado por vía intraperitoneal o por vía intraarticular, o, en el caso de los animales control, antes de la inyección de PBS o TNFa, se determinó el diámetro de la articulación de la rodilla en la que iba a realizarse la inyección por medio de un calibre convencional. 48 horas después de la inyección de TNFa (o PBS en animales control) e inmediatamente antes del sacrificio de los animales, se determinó de nuevo del diámetro de la articulación de la rodilla en la que se realizó la inyección y se calculó la hinchazón de la articulación restando el valor de la segunda medición del diámetro del valor de la primera medición del diámetro (figuras 6 y 9).
Procesamiento del tejido
48 horas tras la inyección de TNFa (o PBS en el caso de animales control), se sacrificaron los animales. En la necropsia, se separaron las rodillas en las que se realizó la inyección de la pata y el muslo, se fijaron intactas
mediante inmersión en etanol al 70% y se procedió a la tinción con hematoxilina y eosina (HE) convencional, tal como se describe por Balan y colaboradores.
Análisis morfológico
Se realizó el análisis de puntuación histológica para la medición de la inflamación de la articulación tal como se 5 describe por Balan y colaboradores. Se aplicaron los criterios de puntuación histopatológica para la evaluación de la inflamación de la articulación según Bolon y colaboradores (figura 7, 8 Y 10).
5.3. Resultados
En un primer conjunto de experimentos, se compararon un anticuerpo scFv de ESBATech aplicado por vía intraarticular, TB-A, yel correspondiente anticuerpo Fab de ESBATech aplicado por vía intraarticular para determinar 10 su capacidad para bloquear la inducción de la mono artritis aguda con Infliximab/Remicade® aplicado por vía intraarticular y por vía intraperitoneal según la tabla IV:
Tabla IV: Esquema de inyección, experimento 1
Los resultados obtenidos referentes a los efectos del tratamiento sobre el cambio en el diámetro de la rodilla (como indicador de efectos sobre la hinchazón de la articulación inducida por TNFa) se representan en la figura 6. Todos 15 los anticuerpos bloquearon completamente la hinchazón de la articulación inducida por TNFa.
Para la evaluación de los efectos del tratamiento sobre la inflamación de la articulación, se realizó la puntuación histológica de cortes de tejido teñidos con HE. Se puntuó la inflamación de la articulación mediante los siguientes criterios (véase la figura 7 para ejemplos de puntuación representativos):
Puntuación O: Normal
20 Puntuación 1: Engrosamiento leve del revestimiento sinovial Puntuación 2: Engrosamiento del revestimiento sinovial e inflamación leve del subrevestimiento Puntuación 3: Engrosamiento del revestimiento sinovial e inflamación moderada del subrevestimiento Los resultados obtenidos referentes a los efectos del tratamiento sobre las puntuaciones de inflamación histopatológica se muestran en la figura 8.
25 Se observaron efectos comparables de todos los tratamientos sobre las puntuaciones de inflamación
histopatológica.
En un segundo conjunta de experimentos, se comparó la respuesta a la dosis relativa a las derivados de anticuerpo
evaluados. Se compararon el anticuerpo scFv de ESBATech aplicado por vía intraarticular representativo TB-A y el
correspondiente anticuerpo Fab aplicado por vía intraarticular del experimento 1 con Infliximab/Remicade® aplicado
30 por vía intraarticular y par vía intraperitoneal y un anticuerpo scFv no relacionado que carecía de cualquier actividad de unión frente a TNFa humano a lo largo de un intervalo de dosis diferente y más amplio en comparación con el experimento 1, según la tabla V.
Tabla V: Esquema de inyección, experimento 2 Los resultados obtenidos referentes a los efectos del tratamiento sobre el cambio de diámetro de la rodilla (como indicador de los efectos sobre la hinchazón de la articulación inducida por TNFa) se muestran en la figura 9.
GRUPO
TNFa (ua) en PBS INHIBIDOR DOSIS (ua)
1
n-3 O ni;muno
2 n-3
10 ninauno
3 n-3
10 anticueroo scFv no relacionado 180
4 n-3
10 anticueroo scFv de TB-A 156
5 (n-3)
10 anticuerpo scFv de TB-A 45
6 (n-3)
10 anticuerpo scFv de TB-A 11
7 (n-3
10 anticuerpo Fab de TB-A 156
8 (n-3
10 anticuerpo Fab de TB-A 45
9 (
n-3 10 anticuerpo Fab de TB-A 11
10
n-3 10 Infliximab i.a. 156
11
n-3 10 Infliximab La. 45
12
n-3 10 Infliximab La. 11
13
n-3 10 Infliximab La. 156
14 (n-3
10 Infliximab (j.a. 45
15 (n-3
10 Infliximab (La. 11
Los resultados obtenidos referentes a los efectos del tratamiento sobre las puntuaciones de inflamación histopatológica se presentan en la figura 10.
s En resumen, tanto el anticuerpo scFv anti-TNFa de ESBATech representativo como el anticuerpo Fab anti-TNFa de ESBATech representativo eran altamente eficaces en el bloqueo de la monoartritis inducida por TNFa humano tras administración local (intraarticular).
Aunque se muestran y describen realizaciones actualmente preferidas de la invención, debe entenderse con claridad que la invención no se limita a las mismas sino que de lo contrario puede realizarse y ponerse en práctica de forma
10 diversa dentro del aJcance de las siguientes reivindicaciones. Lista de secuencias
<110> ESBATechAG
<120> Anticuerpos estables y solubles que inhiben TNFalfa
lS
<130> 12013PC
<160> 40
20 <170> PatenUn versión 3.3
<210> 1
<211> 108
<212> PRT 2S <213> artificial
<220>
<223> derivado de TB-B
30 <220>
<221> VUTB-A
<222> (1)..(108)
<400> 1
ASp I1e val Me~ Thr G1n Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser val G1y
1 5 10 15 ASp Arg val Thr Leu Thr cys Thr Ala Ser G1n Ser val Ser Asn ASP
20 25 30 Val val Trp Tyr Gl" Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu l1e
35 40 45 Tyr ~~r Ala phe Asn Afg nr Thr ~ly val pro ~Ór Afg Phe Ser G1y
Arg G1y Tyr Gly Thr ASp phe Thr Leu Thr l1e Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80 Glu ASp val Ala val TYr Tyr Cys Gln Gln ASP Tyr Asn Ser Pro Arg
85 Thr phe Gly Gln Gly Thr Lys
5 <210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> artificial
10 <220>
<223> derivado de TB-B
<220>
<221> VHfTB-A 15 <222> (1 )..(117)
<400> 2
90 95 Leu Glu val Lys Arg
Gln val Gln Leu val Gln Ser Gly Ala Glu val LyS Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser val Lys Val Ser cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr phe Thr His Tyr
20 25 30 Gly Met AS" Trp val Arg Gln Ala pro Gly Lys Gly le... Glu Trp Met
35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu pro Thr ¡~r Ala ASp Lys phe
50 SS ~~s ASp Arg Phe Thr ~~e Ser Leu Glu Thr ~~r Ala Ser Thr val ¡~r
Met Glu Leu Thr ~~r Leu Thr Ser ASP'~6P Thr Ala val ~yr ~~r Cys
Ala Arg Glu Arg Gly ASp Ala' Met ASp Tyr Trp Gly Glo Gly Thr Leu ~ ~5 lW
val Thr val Ser Ser
<210> 3
<211 > 108 5 <212> PRT
<213> humano-murino
<220>
<221> VLJTB-B 10 <222> (1 )..(1 08)
<400> 3
ASP 11e val leu Thr G1n ser Pro Ser Ser Leu Ser A1a Ser Val Gly
1 S 10 15 ASp Arg val Thr leu Thr cys Thr Ala Ser Gln Ser val Ser Asn ASp
20 25 30
val val ~~p Tyr Gln Gln Arg :Óo Gly lys Ala Pro ~~s Arg leu rle
Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly val pro ser Arg phe Ser Gly
SO 55 60 Ser Gly ser Gly Thr Glu phe Thr Leu Thr 11e Ser Ser leu Gln Pro
65 70 7S 80
Glu ASp val Ala val Tyr Tyr cys Gln Gln ASp Tyr Asn Ser Pro Arg85 90 95
Thr phe Gly Gln Gly Thr LyS LeU Glu val Lys Arg100 105
<210> 4 5 <211> 117
<212> PRT
<213> humano-murino
<220> 10 <221> VHfTB-B
<222> (1)..(117)
<400> 4
Gln val Gln Leu val Gln Ser Gly Ala Glu val Lys Lys pro Gly Ala
1 5 10 lS . Ser Val Lys val Ser Cy5 Thr Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Me~ Asn Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Me~
35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu pro Thr Tyr Ala ASp Lys phe
50 55 60 Lys Asp Arg val Thr Leu Thr Arg ASP Thr Ser xle Gly Thr val Tyr
65 70 75 80 Me~ Glu Leu Thr ~~r Leu Thr ser ASP ~ijP Thr Ala val Tyr ~~r cys
Ala Arg Glu ~tig Gly ASP Ala Me~ ~~~ Tyr Trp Gly Gln flb Thr Leu
val Thr val Ser Ser
<210> 5
<211> 108 5 <212> PRT
<213> humano
<220>
<221> VUFW2.3 10 <222>(1)..(108)
<400> 5
ASp Xle val Leu Thr Gln ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser val Gly
1 5 10 15
ASp Arg val Thr Leu Thr cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Glu 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro L YS Arg Leu 11e
35 40 45 Tyr Ala Gly ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
SO 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr l1e Ser Ser Leu Gln pro
65 70 75 80 Glu ASp val Ala val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr TYr Ser Leu Pro Tyr 85 90 9S Met phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu val Lys Arg
100 105
<210> 6
<211> 124 5 <212> PRT
<2 13> humano
<220>
<221> VUFW2.3 10 <222> (1 )..(124)
<400> 6
Gln val Gln Leu val Gln Ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser val Lys Val Ser cys Thr Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30 phe Leu His Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg xle Asn Pro ASp Ser Gly ASp Thr xle Tyr Ala Gln Lys Phe . 50 55 00
Gln Asp Arg val Thr Leu Thr Arg ASp Thr Ser Xle Gly Thr Val Tyr65 70 75 80
Met Glu leu Thr ~~r Leu Thr ser ASp ;~p Thr Ala val Tyr ~~r cys
Ala Arg val pro Arg Gly Thr Tyr Leu ASP pro Trp ASP Tyr phe ASP
100 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu val
115 120
<210> 7
<211> 108
5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> derivado de TB-A
<220>
<221> VlJTB_l2
<222> (1) ..(108)
15 <400> 7
105 110 Thr val Ser Ser
ASp rle val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu ser Ala ser val Gly1 5 10 15
ASp Arg Val Thr Leu Thr cys Thr Ala Ser Gln ser val Ser Asn ASp20 25 30
val val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala pro Lys Leu Leu rle
35 40 45 Tyr Ala Gly Ser Ile Leu Gln Ser Gly val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 Arg Gly Tyr Gly Thr ASp phe Thr Leu Thr rle ser ser Leu Gln Pro
65 70 75 80 Glu ASp Val Ala val Tyr Tyr cys Gln Gln ASp Tyr Asn Ser Pro Arg85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu val Lys Arg
100 lOS
<210> 8
<211>108 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> derivado de TB-A
<220>
<221> VLJTB_L3
<222> (1) ..(108)
15 <400> 8 ASp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala ser val Gly
1 5 10 15 ASp Arg val Thr Leu Thr cys Thr Ala ser Gln Ser val Ser Asn ASp
20 25 30
val val Trp Tyr Gln Gln Arg pro Gly Lys Ala Pro LYS Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ser Ala phe Asn Arg Tyr Thr Gly val Pro Ser Arg Phe ser Gly50 55 6D
.Arg Gly Tyr Gly Thr ASp Phe Thr Leu Thr Ile Ser ser leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu ASp val Ala val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser leu pro Tyr 85 90 95
Met phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu val Lys Arg
100 105
<210> 9
<211 > 117
<212> PRT 5 <213> artificial
<220>
<223> derivado de TB-A
10 <220>
<221 > VHfTB_H2
<222> (1 )..(117)
<400> 9
Gln val Gln Leu val Gln Ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser val Lys val ser cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr phe Thr Mis Tyr 20 25 30
Gly Met Asn Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg 11e Asn Pro ASP ser Gly ASp Thr 11e T yr Ala Gln Lys phe
50 55 6O Gln ASp Arg phe Thr phe Ser Leu Glu Thr ser Ala Ser Thr val Tayr
65 70 75 O Met Glu Leu Thr ser Leu Thr Ser ASp ASp Thr Ala val Tyr Tgyr cys
85 90 5 Ala Arg Glu Arg Gly ASp Ala Met ASp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu ~ W5 ~ val Thr val Ser Ser
<210>10 <211>20 5 <212> PRT
<213> ligador artificial
<220>
<223> secuencia de ligador artificial
<220>
<221> ligador de glicina-serina
<222> (1 )..(20)
15 <400> 10
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly 1 S 10 15
Gly Gly Gly Ser 20
<210> 11
<211> 108
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> derivado de TB-B
<220> 10 <221> VUTB-B R46L
<222> (1 ) .. (1 08)
<400> 11
ASp xle val Leu Thr eln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val ely
1 5 10. 15 ASp Arg val Thr Leu Thr cys Thr Ala ser eln ser val ser Asn ASp
20 25 30 val val Trp Tyr eln eln Arg pro Gly Lys Ala pro ~~s Leu Leu Ile
35 40 Tyr ser Ala phe Asn Arg Tyr Thr ely val .pro ser Arg phe ser ely
50 55 60 ser ely ser ely Thr Glu phe Thr Leu Thr rle ser ser Leu eln Pro
65 70 75 80 Glu ASP val Ala val Tyr Tyr cys eln eln ASp Tyr Asn ser pro Arg
85 90 95 Thr phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu val Lys Arg 100 lOS 15 <210> 12
<211> 245
<212> PRT
<213> artificial
20 <220>
<223> scFv, humano-murino con ligador artificial
<220>
<221> TB-AB
<222> (1)..(245)
<223> VL(TB-A)-ligador-VH(TB-B)
<400>12
ASp 11e val Me~ Thr Gln ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 S 10 15
ASp Arg val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser val Ser Asn ASP 20 25 30
val val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala pro 4LYS Leu Leu 11e 35 40 5
Tyr ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly val pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
Arg Gly Tyr Gly Thr ASp phe Thr Leu Thr 11. Ser Ser Lau Gln pro 65 70 75 80
Glu ASp val Ala val Tyr Tyr cys Gln Gln ASp Tyr Asn Ser Pro Arg
85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu val Lys Arg Gly Gly Gly Gly
100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125 Gln val Gln Leu val Gln ser Gly Ala G1u val Lys Lys Pro Gly Ala
130 135 140 Ser val Lys val Ser cys Thr Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr His TYr
145 150 155 160 Gly Met Asn Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leú Glu Trp Met
165 170 175 Gly Trp 11e Asn Thr Tyr Thr Gly Glu pro Thr Tyr Ala ASp Lys Phe 180 185 190 Lys ASp Arg val Thr Leu Thr Arg ASp Thr Ser 11e Gly Thr val Tyr
195 200 205 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser ASp Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys210 215 220 Ala Arg Glu Arg Gly ASP Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
22S
230 235 240
val Thr val
Ser ser
245
<210> 13
<211> 245 <212> PRT <213> artificial
5
<220> <223> scFv, humano-murino con ligador artificial
10
<220> <221> TB-BA <222> (1 )..(245) <223> VL(TB-B)-ligador-VH(TB-A)
<400> 13
ASp t1e val Leu Thr G1n Ser Pro Ser Ser Leu ser Ala Ser val G1y1 5 10 15
ASp Arg val Thr Leu 7hr Cys Thr Ala Ser G1n ser val Ser Asn ASp
20 25 . 30' val val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly lys Ala Pro Lys Arg Leu 11. 35 40 45 Tyr ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr G1y val pro Ser Arg Phe Ser G1y50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 11e Ser ser Leu Gln Pro
65 70 75 80 Glu ASP val Ala val Tyr Tyr cys Gln Gln ASp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95 Thr phe Gly Gln Gly Thr Lys leu G1u val Lys Arg Gly Gly Gly Gly
100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125 Gln val Gln Leu val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1.30 135 140 Ser val Lys val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
145 150 155 160
Gly Met Asn Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175
Gly Trp 11e Asn Thr Tyr Thr Gly G1u pro Thr Tyr Ala ASp Lys Phe 180 185 190 Lys ASp Arg phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr ser Ala Ser Thr val Tyr195 200 205
Met Glu Leu Thr ser Leu Thr ser ASp ASp Thr Ala Val Tyr Tyr cys 210 215 220
Ala Arg Glu Arg Gly ASg Ala Met ASp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 23 235 240 val Thr Val Ser ser
<210>14
<211> 106
<212> PRT
<213> humano
5 <220>
<221> C-kappa de Ig humana
<222> (1)..(105)
<400> 14
Thr Val Ala Ala pro Ser val phe Ile phe pro pro Ser ASp Glu Gln 1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala ~er val val Cys Leu Leu Asn Asn phe Tyr
20 25 30 pro Arg Glu Ala Lys val Gln Trp LYS val ASp Asn Ala Leu Gln ser
35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser val Thr Glu Gln ASp ser Lys Asp ser Thr
50 55 60 Ir Ser Leu ser Ser Thl" Leu Thl" Leu ser
70 ~!s Ala ASP Tyr Glu ~~S His Lys val Tyr Ala cys Glu val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser pro
85 90 95 val T!1r.Lys ser phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210>15
<211> 105
<212> PRT 15 <213> humano
<220>
<221> CHl de Ig humana
<222> (1 )..(1 05)
<400> 15
Ala Ser Thr Lys Gly pro Ser val phe pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1 5 10 15
Ser Thr ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu val 3LYS ASp Tyr
20 25 O
Phe Ser Glu pro val Thr val Ser Trp Asn ~er Gly Ala Leu Thr ser 35 40 45
Gly val His Thr Phe pro Ala val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60 Leü Ser Ser val val Thr val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80 Tyr Ile CYS Asn val Asn His Lys pro ser Asn Thr LYS val ASp Lys
85 90 95 Lys val Glu pro Lys Ser Cys Thr Ser
100 105
<210> 16
<211>108 5 <212> PRT
<213> murino
<220>
<221> VUTBwt 10 <222> (1 )..(1 08)
<400> 16
ASp Ile val Met Thr Gl n Thr Pro Lys Phe Leu Leu val Ser Ala.Gly
1 5 10 lS
ASp Arg val Thr xl e Thr cys Thr Ala ser Gln Ser Val Ser Asn ASp
20 25 30 val val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln ser pro ~~s Me~ Leu Me~
35 40 Tyr ~gr Ala phe ASn Arg ~~r Thr Gly val pro ~p Arg phe Thr Gly
Arg Gly Tyr Gly Thr ASp Phe Thr phe Thr 11e Ser Ser val Gln Ala
65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala val Tyr phe cys Gln Gln ASp Tyr Asn Ser Pro Arg
85 90 9S
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 11e Lys Arg 100 105
<210> 17
<211> 117 5 <212> PRT
<213> murino
<220>
<221> VHrrSwt 10 <222> (1) ..(117)
<400> 17
Gln xle Gln Leu val G1n Ser Gly pro Glu Leu Lys lys Pro G1y Glu 1 5 10 15
Thr val Lys l1e Ser cys Lys Ala ser G1y Tyr Thr PhI! Thr His Tyr
20 25 30 Gly Met Asn Trp val LyS Gln Ala pro G1y Lys Gly Uu Lys Trp Met
35 40 4S
Gly Trp-I1e Asn Thr Tyr Thr Gly G1u pro Thr Tyr Ala ASP ASp phe50 55 60 G1u His phe Ala phe Ser Leu G1u Thr ser Ala ser Thr val phI!
~~s
70 75 80 Leu G1n XlI! Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu ArS Gly ASP Ala Met As~ Tyr Trp G1y Gln G1~ Thr ser
10 10 11 val Thr val Ser Ser
<210> 18
<211> 245 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> scFv, humano-murino con ligador artificial
<220>
<221> TB-A H43
<222> (1 )..(245)
<223> scFv VL(TB-A)-ligador-VH(TB-A K43Q)
<400> 18
ASP l1e val Met Thr Gln ser pro Ser ser Leu ser Ala Ser val Gly1 5 10 15
Asp Arg val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gl" Ser val ser AS" ASP
20 25 30
val val ~5P Tyr eln eln Arg :óo Gly Lys Ala.pro ¡~s Leu Leu Ile
Tyr ~8r Ala phe Asn Arg ~~r Thr Gly val Pro ~r Arg Phe Ser Gly
Arg Gly Tyr Gly Thr ASp phe Thr Leu Thr Ile Ser ser Leu Gln pro65 70 75 80
Glu ASp val Ala val Tyr Tyr cys Gln Gln ASP Tyr Asn ser pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly eln Gly Thr Lys Leu Glu Val _LY5 Arg Gly Gly Gly Gly
100 105 -110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser
-
11S 120 US Gln val Gln Leu val Gln Ser Gly Ala elu val-Lys Lys Pro-Gly Ala 130 135 140 Ser val Lys val Ser cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr H;S Tyr
14S 150 155 160 Gly Me~ Asn Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Me~ 165 170 175 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala ASp Lys pne180 185 190 Lys Asp Arg phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr val Tyr195 200 205 Met Glu l@U Thr Ser Leu Thr Ser ASp ASP Thr Ala val Tyr Tyr cys
210 215 220 Ala Arg Glu Arg Gly ASP Ala Met ASp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240
val Thr val ser ser 245
<210> 19
<211> 245
<212> PRT 5 <213> artificial
<220>
<223> scFv, humano-murino con ligador artificial
<220>
<221> TB-A H70/72
<222> (1)..(245)
<223> scFv VL(TB-A)-ligador-VH(TB-A F70UL72R)
<400> 19
ASp 11e val Met Thr Gl" Ser Pro Ser Ser leu Ser Ala ser val Gly
1 S 10 15
ASP Arg val Thr leu Thr Cys Thr Ala Ser Gl" Ser val Ser AS" ASp
20 25 30
val val Trp Tyr Gln Gln Arg pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Xle 35 40" 45
Tyr Ser Ala phe Asn Arg Tyr Thr Gly val Pro Ser Arg phe Ser Gly50 55 60
Arg Gly Tyr Gly Thr ASp Phe Thr leu Thr 11e Ser Ser Leu Gln pro
65 70 75 80
Glu ASP val Ala val Tyr Tyr Cys Gln Gl" ASp Tyr Asn Ser Pr.o Arg
8S 90 9S Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu val Lys Arg Gly Gly Gly Gly
100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 ~ U5 Gln val Gln Leu val Gln ser Gly Ala Glu val LyS LYS Pro Gly Ala
130 135 140 ser val Lys Val Ser cys Thr Ala ser Gly Tyr Thr phe Thr His Tyr
145 150 155 160 Gly Met AS" Trp val Arg Gln Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
165 170 175 Gly Trp rle Asn Thr Tyr Thr Gly Glu pro Thr Tyr Ala ASP lys phe "
180 185 190 Lys ASp Arg val Thr phe Ser leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr val Tyr
195 200 20S Met Glu leu Thr ser leu Thr Ser ASp ASp Thr Ala val Tyr Tyr cys
210 215 220 Ala Arg Glu Arg Gly ASP Ala Met ASp Tyr Trp Gly Gln Gly Thrleu
225 230 235 240 val Thr val ser ser
<210> 20
<211> 245
<212> PRT <213> artificial
5
<220> <223> scFv, humano-murino con ligador artificial
10
<220> <221> TB-A H70n2 <222> (1) ..(245) <223> scFv VL(TB-A)-ligador-VH(TB-A F70UL72R)
<400> 20
ASP' X1e val Met 111r G1n ser Pro Ser ser Leu Ser Ala Ser val Gly 1 5 10 lS
ASp Arg val Thr Leu Thr cys Thr A la Ser Gln ser val Ser Asn ASp
20 25 30
val Val Trp Tyr G1n G1n Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 11e 3S 40 4S
Tyr ~~r Ala Phe Asn Arg I~r Thr Gly Val Pro ~8r Ar9 Phe Ser Gly
Arg Gly Tyr Gly Thr ASp phe Thr Leu Thr x1e Ser ser Leu Gln pro65 70 75 80
G1u ASp val Ala Val Tyr Tyr Cy5 Gln G1n ASp Tyr Asn ser Pro Arg
85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu val Lys Arg Gly Gly Gly Gly
100 105 110 Ser G1y Gly Gly Gly Ser G1y Gly Gly G1y Ser G1y G1y Gly G1y ser
llS UO US Gln val Gln Leu val G1n Ser G1y Ala G1u val Lys LYS Pro Gly Ala
130 135 140 Ser val Lys val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr phe Thr His Tyr
145 150 155 160 G1y Met Asn Trp val Arg Gln Ala Pro G1y Lys Gly Leu Glu Trp Met
165 170 175
Gly Trp 11e Asn Thr Tyr Thr Gly Glu pro Thr Tyr Ala ASp LyS phe' 180 185 190
Lys ASp Arg phe Thr Leu ser Arg Glu Thr ser Ala Ser Thr val Tyr ~5 200 205
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser ASp ASP Thr Ala val Tyr Tyr Cys210 Zl5 220
Ala Arg G1u Arg Gly ASP Ala Met ASp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240 val Thr val Ser Ser
<210> 21 <211>245
<212> PAT
<213> artificial
<220> 5 <223> scFv, humano-murino con ligador artificial
<220>
<221> TB-A H76/77
<222> (1 )..(245) 10 <223> scFv VL(TB-A)-ligador-VH(TB-A A761/S77G)
<400> 21
Asp xle Val Met Thr Gln ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser val Gly
1 5 10 15 ASp Arg val Thr Leu Thr cys Thr Ala Ser Gln Ser val Ser Asn ASp
20 25 30 val val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro HS Leu Leu xle
35 40 Tyr ser Ala Phe Asn Arg I!r Thr Gly val pro Ser Arg phe ser Gly
50 60 Arg Gly Tyr Gly Thr ASP phe Thr Leu Thr xle Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80 Glu ASp val Ala val Tyr Tyr Cys Gln Gln ASp Tyr Asn Ser Pro Arg
85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu val Lys Arg Gly !~ Gly Gly
100 105 Ser Gly Gl~ Gly Gly Ser Gly Gl~ Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 11 12 125 Gln Val Gln Leu val Gln ser Gly Ala Glu val Lys Lys pro Gly Ala 130 135 140 Ser val Lys val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tl~r
145 150 155 60
Gly Met AS" Trp val Arg G1" Ala Pro Gly Lys G1y Leu G1u Trp Met 165 170 175
Gly Trp ¡le AS" Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala ASP Lys phe180 185 190
Lys ASp Arg phe Thr phe Ser Leu G1u Thr Ser I1e G1y Thr val Tyr195 200 205
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr ser ASP ASp Thr Ala val Tyr Tyr cys210 215 220
Ala Arg Glu Arg Gly ASP Ala Met ASp Tyr Trp G1y G1" Gly Thr Leu
225 230 235 240
val Thr val Ser ser 245
<210> 22
<211> 245 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> scFv, humano-murino con ligador artificial
<220>
<221> TB-A L46
<222> (1 ).. (245)
<223> scFv VL(TB-A L46R)-ligador-VH(TB-A)
<400> 22
ASp Ile val Met Thr Gln Ser pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser val Gly
1 5 10 15 ASp Arg val Thr Leu Thr cys Thr Ala Ser Gln Ser val ser AS" ASp20 25 30 val val Trp Tyr G1n eln Arg pro cly Lys Ala pro ~~5 Arg Leu 11e 35 40 Tyr ~~r Ala phe Asn Arg ~r Thr Gly val pro ~Ór Arg phe Ser ely
Arg ely Tyr Gly Thr ASp phe Thr Leu Thr ¡le Ser ser Leu el" Pro
65 70 75 80 Glu ASp val Ala val Tyr Tyr cys G1n G1n ASp Tyr Asn Ser pro Arg85 90 95 Thr phe Gly eln ely Thr LYS Leu G1u val Lys Arg ely ely ely ely
100 105 110 Ser Cly ely ely Gly Ser ely Gly Gly ely·ser Gly ely Gly ely Ser 115 120 125
Gl" val eln Leu val Gln Ser Gly Ala elu val Lys Lys Pro ely Ala
no 135 140 ser val Lys val ser cys Thr Ala Ser ely Tyr Thr phe Thr HiS ' Tyr
145· 150 155 160 Gly ~et Asn Trp val Arg el" Ala Pro ely LYS Gly Leu Glu Trp Met
165 170 175 ely Trp rle Asn Thr Tyr Thr ely elu Pro Thr. Tyr Ala ASp LyS phe '
180 185 1.90 Lys ASP Arg phe Thr Phe Ser Leu elu Thr ser Ala Ser Thr val Tyr
195 200 205 Met elu Leu Thr Ser Leu Thr Ser .ASp ASP Thr Ala val Tyr Tyr cys
210 215 220 Ala Arg Glu Arg Gly ASp Ala Met ASP Tyr Trp ely eln ely Thr Leu
225 230 235 240 val Thr val ser Ser
<210> 23 <211> 245
<212> PRT
<213> artificial
5 <220>
<223> scFv, humano-murino con ligador artificial
<220>
<221> TB-A L65 10 <222> (1 )..(245)
<223> scFv VH(TB-A R65S)-ligador-VH(TB-A)
<400> 23
ASp ¡le Val Me1: Tnr Gln ser Pro ser 'Ser Leu Ser Ala Ser val G1y
1 5 lO l'5
ASp Arg val Thr Leu Thr cys Tnr Ala Ser Gln Ser val ser Asn ASp 20 25 30
val val Trp Tyr Gln <iln Arg Pro <ily lys Ala Pro ~~S leu Leu ¡le
3S 40
Tyr ~~r Ala Phe Asn Arg ~~r Tnr Gly val pro ~~r Arg phe Ser G1y
56
Ser G1y Tyr Gly Thr ASp phe Thr'Leu Thr I1e Ser Ser Leu G1n pro 65 70 75 80
G1u ASp val Ala val Tyr Tyr cys Gln G1n.Asp Tyr Asn Ser Pro Arg
85 90 95
Thr phe G1y G1n G1y Thr Lys Leu G1u Val LYS Arg G1y Gly G1y G1y
100 lOS 110 Ser G1y G1y G1y G1y Ser G1y G1y G1y G1y Ser G1y G1y G1y .G1y Ser
lU lZ0 liS G1n val G1n Leu val G1n ser G1y Ala G1u val LyS Lys Pro G1y Ala
130 135 140 Ser val LyS val ser cys Thr Ala Ser G1y Tyr Thr Phe Thr His Tyr
145 150 lSS 160 G1y Met Asn Trp val Arg G1n Ala pro G1y Lys G1y Leu G1u TrP Met
165 170 175 G1y Trp Ile Asn Thr Tyr Thr G1y Glu pro Thr Tyr Ala ASP Lys phe
180 185 190 Lys ASP Arg Phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr ser Ala Ser Thr val Tyr
195 200 ZOS Met Glu Leu Thr ser Leu Thr Ser ASP ASp Thr Ala val Tyr Tyr cys
210 215 no Ala Arg Glu Arg G1y ASg Ala Met ASp Tyr Trp G1y Gln Gly Thr Leu
225 23 235 240 val Thr val Ser ser
<210> 24
<211> 245 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> scFv, humano-murino con ligador artificial
<220>
<221> TB-A L67
<222> (1 )..(245)
<223> scFv VL(TB-A Y67S)-ligador-VH(TB-A)
<400> 24
ASp Ile val Met Thr Gl" Ser pro Ser ser leu Ser Ala Ser val Gly
1 S 10 15
ASP Arg val Thr leu Thr cys Thr Ala Ser Gln ser val Ser Asn ASp20 25 30
val val Trp Tyr eln Gln Arg Pro Gly lys Ala Pro lys Leu leu 11e, 35 40 45
Tyr ser Ala phe AS" Arg Tyr Thr <oly val pro Ser Arg phe Ser Gly50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr ASp Phe Thr leu Thr 11e Ser Ser Leu Gln pro 65 70 75 80
G1u ASp val Ala val Tyr Tyr Cys Gl" el" ASP Tyr Asn ser Pro Arg
85 90 95 Thr Phe G1y (¡ln Gly Thr Lys Leu Glu val Lys Arg Gly Gl~ Gly ' Gly
100 105 11 ser Gly tl~ GlY Gly Ser Gly Gl~ Gly G1y Ser Gly Gl$ Gly Gly ser
12 12 Gln val el" Leu val eln Ser Gly Ala elu val Lys LYS Pro G1y Ala
130 135 140 Ser Val Lys val Ser cys Thr Ala Ser G1y Tr Thr Phe Thr His Tyr
145 150 1 5 160 G1y Met Asn Trp val Arg Gln Ala Pro Gl bLyS Gly Leu Glu Tr~ Met
165 17 17 Gly Trp 11e AS" Thr Tyr Thr Gly elu Pro Thr Tyr Ala ASp Lys Phe 180 185 190 lys ASp Arg phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr ser Ala ser Thr Val Tyr195 200 205 Met Glu leu Thr Ser leu Thr ser ASp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys 210 215 220
Ala Arg Glu Arg Gly ASp Ala Met ASp Tyr Trp Gly,el" 'Gly Thr LeU
225 230 235 240
val Thr val ser Ser
<210> 25
<211 > 117 <212> PRT
<213> artificial
<220> 5 <223> derivado de TB-A
<220>
<221> VHfTB-A D66G
<222> (1).. (117)
<400> 25
Gln Val Gln Leu val Gln Ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
S.r val Lys val Ser cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30
Gly..Met Asn Trp val Arg Gln Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr T yr Ala ASP Lys phe
50 SS 6O ~~S Gly Arg phe Thr ~Se ser Leu Glu Thr ~~r Ala Ser Thr val ¡~r
MetGlu Leu Thr Ser Leu Thr Ser ASP ASP Thr Ala Val Tyr Tgyr cys
85 90 5 Ala Afg Glu Arg Gly ASp Ala Met ASp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu ~ W5 ~ val Thr val ser Ser
<210> 26 15 <21 1> 108
<212> PRT
<21 3> artificial
<220> 20 <223> derivado de TB-A
<220>
<221> VUTB-A V83F
<222> (1)..(108)
<400> 26
ASp xle Val Me~ Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala ser val Gly 1 5 10 15
ASp Arg Val Thr Leu Thr cys Thr Ala Ser Gln Ser val Ser Asn ASp20 2S 30
Val val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly LyS Ala pro 4LyS Leu Leu xle 35 40 5
Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr G~l_~al pro Ser Arg phe Ser Gly 50 55 60
Arg Gly Tyr Gly Thr ASP Phe Thr Leu Thr 11e ser Ser Leu Gln pro 65 70 75 80
Glu ASp phe Ala val Tyr Tyr cys Gln Gln ASP Tyr Asn Ser pro Arg
8S 90 95
Thr phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu val Lys Arg 100 105
10 <210> 27 <211>108
<212> PRT
<213> artificial
15 <220>
<223> derivado de TB-A
<220>
<221> VlfTB-A V83A 20 <222> (1 )..(1 08)
<400> 27
ASp ¡le val Me't Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu ser Ala ser val Gly
1 S 10 15 ASp Arg val Thr Leu Thr cys Thr Ala Ser Gln ser val Ser Asn Asp 20 2S 30 Val val Trp Tyr Gln Gln Arg pro Gly Lys Ala pro ¡~s Leu Leu xle 35 40 Tyr ~8r Ala phe Asn Arg 1~r Thr Gly val pro ~~r Arg phe Ser Gly
Arg Gly Tyr Gly Thr ASp phe Thr Leu Thr xle Ser Ser Leu Gln pro6S 70 75 80
Glu Asp Ala Ala val Tyr Tyr cys Gln Gln ASp Tyr Asn Ser Pro Arg
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100
<210> 28
<211> 117 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> derivado de TB-A 10
<220>
<221 > VHfTB-AH43/70171 /73/77
<222> (1)..(117)
90 95
leu Glu val Lys Arg105
15
<223> VH de TB-A con K4301F70US71T/E73D/S77G
<220>
<221> VHfTB-AH43/70/71/73m
<222> (1) ..(117)
20
<223> VH de TB-A con K4301F70US71T/E73D/S77G
<400> 28
"Gln val Gln ~eu val Gln Ser Gly Ala Glu val ~ys Lys Pro Gly Ala
l. 5 10 15 Ser val ~ys val Ser cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr phe Thr His Tyr
20 25 30 Gly "Met Asn Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly ~eu Glu Trp Met
. 3S 40 45
Gly ~ÓP Ile Asn Thr Tyr !~r Gly Glu pro Thr ¡~r Ala ASp ~ys phe
~6YSASP Arg phe Thr ~eu Thr ~eu ASP Thr Ser Ala Gly Thr val Tsyr
5 10 . 75 O Met Glu ~eu Thr Ser ~eu Thr Ser Asp ASP Thr Ala val Tyr Tgyr cys
85 90 5 Ala Arg Glu Arg Gly ASp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr ~eu
100 lOS 110 val Thr Val ser ser
<210> 29
<211> 117 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> derivado de TB-A
<220>
<221> VHfTB-A H43nOn1
<222> (1 )«(117)
<223> VH de TB-A con K4301F70US71T
<400> 29
Gln Val eln Leu val e1n Ser Gly Ala elu val Lys Lys pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys val Ser cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr H;S Tyr20 25 30
Gly Met Asn Trp val Arg Gln Ala pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 3S 40 4S
Gly róp ¡le AS" Thr Tyr ~~r Gly Glu Pro Thr ¿br A"a ASP Lys Phe
~l5 ASp Arg phe Thr ~~u Thr Leu Glu Thr ~~r Ala Ser Thr val ¡br.
Met Glu Leu Thr ~~r Leu Thr ser ASp ;~p Thr Ala val Tyr ¡~r cys
Ala Arg Glu Arg Gly ASp Ala Met ASp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 . llO
val Thr val ser Ser
<210> 30 5 <211> 117
<212> PRT
<213> artificial
<220> 10 <223> derivado de TB-A
<220>
<221> VHfTB-A H11/16143166f70f73f77/931112
<222> (1 )..(117) 15 <223> VH de TB-A con V11D/A16GK4301D66G/F70US71T/E73D/S77GN93T/L112S
<220>
<221> VHfTB-A H11/16/43166f70f73177/931112
<222> (1) ..(117) 20 <223> VH de TB-A con V11 DIA16G/K4301D66G/F70US71T/E73D/S77GN93T/L112S
<400> 30
Gln Val Gln Leu val Gln Ser Gly Ala Glu ASp lys LyS pro Gly Gly
1 S 10 15
ser val Lys val Ser cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30
Gly Met Asn Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu pro Thr Tyr Ala ASp Lys phe50 55 60
~!S Gly Arg Phe Thr ~~u Thr Leu ASP Thr ~~r Ala Gly Thr val ~~r
Met Glu Leu Thr Ser leu Thr Ser ASP ASp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Glu Arg Gly ASp Ala Met ASP Tyr Trp Gly Gln Gly Thr ser . 10 lOS l~O
val Thr val Ser Ser 115
<210> 31
<211> 245
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> derivado de TB-A
<220>
15 <221> TB-A H_M48UF681
<222> (1 ) .. (245)
<223> TB-A con VL de TB-A y VH M48L y F681 unidos mediante SEO ID NO: 10
<400> 31
ASP xle val Met Thr Gln Ser pro Ser ser leu Ser Ala Ser val Gly
1 5 1() 15 ASp Arg val Thr leu Thr Cys Thr Ala·ser Gln Ser val Ser AS" ASp
20 25 30
val val 1sP Tyr Gln Gln Arg :óo Gly Lys Ala Pro ~~S Leu Leu xle
Tyr ~gr Ala phe Asn Arg ~~r Thr Gly val Pro :~r Arg Phe Ser Gly
Arg Gly Tyr Gly Thr ASp phe Thr Leu Thr Ile ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80 G1u ASp val Ala val Tyr Tyr Cys Gln Gln ASp Tyr Asn Ser pro Arg
85 90 95 Thr phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu·val Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110 ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly G1y Gly Gly ser 11S 120 125 Gln val Gln leu val Gl" ser Gly Ala Glu val Lys Ly5 Pro Gly Ala
130 135 140 Ser val Lys val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr H;s Tyr
145 150 155 160
Gly Met Asn Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 165 170 175
Gly Trp I1e Asn Thr Tyr Thr Glv Glu pro Thr Tyr Ala ASp LyS phe180 185 190
Lys ASp Arg 11e Thr phe ser Leu Glu Thr Ser Ala ser Thr val Tyr 195 200 205
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser ASP ASP Thr Ala val Tyr Tyr cys
2W 2B 220
Ala Arg Glu Arg Gly ASp Ala Met ASp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240
val Thr val ser Ser
<210> 32 <211>245
<212> PAT
<213> artificial
5 <220>
<223> derivado de TB-A
<220>
<221 > TB-A L_ V83E H_V79A 10 <222> (1) ..(245)
<223> TB-A con VL V83A y VH_V79A unidos mediante SEQ ID NO: 10
<400> 32
ASp l1e Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu ser Ala Ser val Gly
1 5 10 15 ASP Arg val Thr Leu Thr cys Thr Ala-Ser Gln ser val Ser Asn ASp
20 25 30
val Val Trp TYr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu ¡le35 40 4S
Tyr ~~r Ala phe Asn Arg ~~r Thr Gly val pro ·~~r Arg Phe Ser Gly
Arg Gly Tyr Gly Thr ASp Phe Thr Leu Thr 11e Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80 Glu ASp Glu Ala val Tyr Tyr Cys Gln Gln ASp Tyr Asn Ser Pro Arg85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu val Lys Arg Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125
Gln val Gln Leu val 'ln Ser 'ly Ala Glu val Lys Lys pro "Y Ala 130 135 140
Ser val Lys val Ser Cys Thr Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160
G1y Met As" Trp val Arg G1n Ala pro Gly LYS Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175
Gly Trp 11e Asn Thr Tyr Thr 'ly Glu Pro Thr Tyr Ala ASp Lys Phe 180 185 190
Lys"ASP Arg phe Thr phe ser Leu Glu Thr ser Ala Ser Thr Ala Tyr 195 200 205
Met G1u Leu Thr Ser Leu Thr Ser ASp ASP Thr Ala val Tyr Tyr cys
210 215 220
Ala Arg Glu Arg Gly ASp Ala Met ASp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240
val Thr val Ser Ser
<210> 33
<211> 245 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> derivado de TB-A
<220>
<221> TB-A Ligador_G2R H_F68L
<222> (1 )..(245)
<223> TB-A con VL de TB-A y VH_F68L unidos mediante SEQ ID NO: 39
<400> 33
ASp 11e val Met Thr Gln Ser pro ser Ser Leu ser Ala Ser val G1y
1 5 10 15 ASp Arg val Thr Leu Thr cys Thr Ala Ser Gln Ser Val ser Asn ASp
20 2S 30 val val Trp Tyr Gln Gln Arg pro G1y Lys Ala Pro L YS Leu Leu 11.
35 40 45 Tyr ~ór Ala phe AS" Arg l~r Thr G1y val Pro ~~r Arg phe Ser G1y
Arg Gly Tyr G1y Thr ASP Phe Thr Leu Thr 11e Ser Ser Leu Gln pro
65 70 75 80 G1u ASp val Ala val Tyr Tyr cys Gln Gln ASP Tyr Asn ser Pro Arg85 90 95
Thr phe Gly Gln G1y Thr Lys Leu Glu val Lys Arg Gly Arg Gly G1y
100 105 110
Ser G1y Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 no U5 Gln val Gln Leu val Gln ser Gly Ala Glu Val Lys Lys pro Gly Ala
130 135 140 Ser val Lys val Ser cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr phe Thr His Tyr
145 150 155 160 G1y Met Asn Trp val Arg G1n Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
165 170 175 G1y Trp l1e Asn Thr Tyr Thr Gly Glu pro Thr TYr Ala ASP Lys Phe
180 185 190 Lys ASp Aro Leu Thr phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr val Tyr
195 200 205 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr ser ASp ASp Thr Ala val Tyr Tyr Cys
210 215 220 Ala Arg Glu Arg Gly ASp Ala Met ASp Tyr Trp Gly Gl" G1y Thr Leu
225 230 235 240 val Thr val Ser Ser
<210> 34
<211> 245
<212> PRT
<213> artificial
5 <220>
<223> derivado de TB-A
<220>
<221> TB-A H_K43R1F681 10 <222> (1 )..(245)
<223> TB-A con VL de TB-A y VH_K43R_F681 unidos mediante SEO ID NO: 10
<400> 34
ASp Ile val Met Thr Gln ser Pro ser Ser leu Ser Ala Ser val Gly
1 5 10 15 ASp Arg val Thr leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser Val ser Asn ASp
20 25 30
70
val val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Prn LyS Leu Leu xle 35 40 45
Tyr Ser Ala phe Asn Arg Tyr Thr Gly val Pro Ser Arg phe Ser Gly
50 SS 60 Arg Gly TYr Gly Thr ASp phe Thr Leu Thr Xle Ser Ser Leu Gln pro
65 70 75 80
Glu ASP val Ala val Tyr TYr cys Gln Gln ASp Tyr Asn Ser pro Arg
85 90 9S Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu val Lys Arg Gly Gl~ Gly Gly
100 105 11 ser Gly G1SGly Gly ser Gly Gl~ Gly Gly Ser Gly G1SGly Gly Ser
11 12 12 Gln Val Gln Leu val Gln Ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala
130 135 140 ser val Lys val Ser cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
145 150 155 160 Gly Met Asn Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
165 170 175 Gly Trp xle Asn Thr TYr Thr Gly Glu pro Thr Tyr Ala ASp Lys Phe
180 185 190 Lys Asp Arg Ile Thr Phe Ser Leu Glu Thr ser Ala Ser Thr val Tyr
195 200 205 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser ASp ASp Thr Ala val Tyr Tyr Cys210 215 220 Ala Arg Glu Arg Gly ASP Ala Met ASP Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240 val Thr val ser ser
<210> 35
<211> 245 5 <212> PRT
<213> artificial <220>
<223> derivado de TB-A
<220>
<221> TB-A HJ68L
<222> (1 )..(245)
<223> TB-A con VL de TB-A y VHJ68L unidos mediante SEO ID NO: 10
<400> 35
ASP ¡le val Met Thr Gln ser pro Ser Ser Leu ser Ala Ser val Gly1 5 10 15
ASp Arg Val Thr Leu Thr cys Thr Ala Ser Gln Ser val ser Asn ASp20 25 lO
val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro 4LYS Leu Leu Ile
35 40 5
Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
SO 55 60' Arg Gly Tyr Gly Thr ASp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln pro
65 70 75 80 Glu ASp val Ala val Tyr Tyr cys Gln Gl" ASp Tyr As" Ser Pro Arg85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu val LyS Arg Gly Gly Gly Giy
100 105 110 Ser G1V Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gln val Gl" Leu val Gln ser Gly Ala Glu val Lys Lys pro Gly Ala
130 135 140 ser val Lys val ser cys Thr Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
145 150 155 160 Gly Met Asn Trp val Arg Gln Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
U5 UO U5 Gly Trp xle AS" Thr TYr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asg Lys Phe
180 . 185 19 Ly$ ASP Arg Leu Thr Phe ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr val Tyr
US WO W5 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser ASp ASp Thr Ala val Tyr Tyr Cys
210 2lS' 220 Ala Arg Glu Arg Gly ASp Ala Met ASp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr leu
225 230 235 240 val Thr val Ser Ser
<210> 36
<211> 245
<212> PRT
<213> artificial
5 <220>
<223> derivado de TB-A
<220>
<221 > TB-A H_F68A 10 <222> (1) ..(245)
<223> TB-A con VL de TB-A y VH_F68A unidos mediante SEQ ID NO: 10
<400> 36
74
ASp' lle val Met Thr Gln Ser Pro Ser ser Leu Ser Ala Ser val Gly
1 5 10 15 ASp Arg val Thr Leu Thr Cys Thr Ala ser Gln ser val ser Asn ASp20 25 30 val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro ~!S Leu Leu Xle
35 40 Tyr Ser Ala phe Asn Arg ~Ir Thr Gly val Pro Ser Arg phe Ser Gly
50 60 Arg Gly Tyr Gly Thr ASp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln pro
65 70 75 80
Glu ASP Val Ala val Tyr Tyr cys Gln Gln ASp Tyr Asn Ser Pro Arg
85 90 95 Thr phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu val Lys Arg Gly Gly Gly Gly
100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser
115 120 125 Gln Val Gln Leu val Gln Ser Gly Ala Glu val Lys Lys pro Gly Ala
130 135 140 Ser val Lys val Ser cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
145 150 155 160 Gly Met Asn Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
165 170 175 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala ASP Lys phe180 lBS 190 Lys ASp Arg Ala Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr val Tyr
195 200 205
Met Glu leu Thr Ser Leu Thr Ser ASp ASp Thr Ala val Tyr Tyr cys2W 215 220
Ala Arg Glu Arg Gly ASP Ala Met ASp .Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240
val Thr val ser Ser 245
<210> 37 <211> 245
<212> PRT
<213> artificial
5 <220>
<223> derivado de TB-A
<220>
<221> TB-A HJ68V/F70L 10 <222> (1 )..(245)
<223> TB-A con VL de TB-A y VH_F68V1F70L unidos mediante SEO ID NO: 10
<400> 37
ASp xle Val Met Thr Gln ser Pro Ser Ser Leu ser Ala ser Val Gly1 5 10 15
ASp Arg val Thr Leu Thr Cy5 Thr Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn ASp
20 25 30 val val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala pro ~Js Leu Leu Ile
35 40 Tyr ser Ala Phe Asn Arg l~r Thr Gly val pro ser Arg phe ser Gly
50 60 Arg Gly Tyr Gly Thr ASp phe Thr Leu Thr Ile ser Ser Leu Gln pro65 70 75 80 Glu Asp val Ala val Tyr Tyr cys Gln Gln ASp Tyr Asn ser Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr LyS Leu Glu val Lys Arg Gly Gly Gly Gly
100 105 110
ser Gly ~i~ Gly Gly ser Gly !~~ Gly Gly ser Gly ~~ Gly Gly Ser
Gln val Gln Leu val Gln ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140
Ser val lys val Ser cys Thr Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
145 150 155 160
Gly Met Asn Trp val Arg Gln Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175
Gly Trp lle Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala ASP Lys phe180 185 190
Lys ASp Arg val Thr Leu Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr val Tyr195 200 205
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser ASP ASp Thr Ala val Tyr Tyr cys
210 215 220 Ala"Arg Glu Arg Gly Asg Ala Met ASp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 23 235 240 val Thr val ser ser
<210> 38
<211> 245 5 <212> PRT
<213> artificial
<223> derivado de TB-A
<220>
<221> TB-A H]70L
<222> (1)..(245)
<223> TB-A con VL de TB-A y VH_F70L unidos mediante SEO ID NO: 10
<400> 38
ASp Ile val Met Thr Gln Ser Pro ser Ser Leu Ser Ala ser val Gly
1 5 10 15 " ASp Arg val Thr Leu Thr cys Thr Ala Ser Gln·ser val ser Asn ASp20 2S 30 val val Trp Tyr Gln Gln Arg pro Gly Lys Ala pro 4LYS Leu Leu Ile
3S 40 5
Tyr ~~r Ala phe Asn Arg ~~r Thr Gly val Pro ~r Arg phe ser Gly
Arg Gly Tyr Gly Thr ASp phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr cys Gln Gln ASp Tyr Asn Ser pro Arg8S 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu val Lys Arg Gly Gly Gly Gly
100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser
115 120 125 Gln val Gln Leu val Gln Ser Gly Ala Gru val Lys Lys Pro Gly Ala
130 135 140 ser val LYS val Ser cys Thr Ala Ser Gly T~r Thr phe Thr H;S Tyr
145 150 1 5 160
Gly Met Asn Trp val Arg Gln Ala Pro Gl~ LyS Gly Leu Glu Trp Met
165 17 175 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala ASp Lys phe
180 185 190 LYS ASp Arg Phe Thr Leu Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr val Tyr
195 200 20S
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr ser ASP ASP Thr Ala val Tyr Tyr cys 2~ 2n 2~
Ala Arg Glu Arg Gly ASp Ala Met ASp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240
val Thr val Ser Ser 245
<210> 39
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> ligador
<220>
<221> G2RLigador
<222> (1 )..(20)
<400> 39
Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 S . 10 . 15
Gly Gly Gly Ser 20
<210> 40
<211> 245
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> anticuerpo scFv de TB-A
<220>
<221> TB-A
<222> (1 )..(245)
<223> ESBA 105
<400> 40
ASp 11e val Met Thr Gl" ser pro Ser ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
ASp Arg val Thr leu Thr cys Thr Ala ser Gln Ser val ser Asn ASp
20 25 30
val val Trp Tyr eln eln Arg pro ely Lys Ala Pro .lYS Leu Leu 11e
35 40 5
Tyr ~gr Ala phe Asn Arg I~r Thr Gly val Pro ~~r Arg phe Ser e1y
.Arg Gly Tyr ely Thr ASp phe Thr Leu Thr l1e Ser ser Leu eln Pro
65 10 15 80' e1uAsp val Ala Val Tyr Tyr Cys eln eln ASp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95 Thr phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu val Lys Arg Gly Gly ely Gly
100 105 110 Ser Gly Gly G1y Gly Ser Gly Gly ely G1y ser Gly Gly Gly ely ser
115 120 125 eln val Gln Leu val Gl" ser ely Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala
130 B5 140
.~:~ val Lys val Ser ~~~ Thr Ala Ser Gly rI~ Thr Phe Thr His ~
ely Met Asn Trp val Arg Gln Ala Pro ely Lys G1y Leu Glu Trp Met 165 110 175
Gly Trp 11e Asn Thr Tyr Thr Gly Glu pro Thr Tyr Ala ASp Lys Phe 180 185 190
Lys ASp Arg phe Thr phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr val Tyr
. 195 200 205 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser ASp ASP Thr Ala val Tyr Tyr cysZlO 215 220 Ala Arg Glu Arg G1y ASP Ala Met ASp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240 val Thr val Ser ser

Claims (26)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un anticuerpo o derivado de anticuerpo estable y soluble que se une específicamente a TNFa, comprendiendo dicho anticuerpo o derivado de anticuerpo un dominio variable de cadena ligera (VL) de SEO ID NO: 1 que se combina con el dominio variable de cadena pesada (VH) de SEO ID NO: 2.
  2. 2.
    El derivado de anticuerpo según la reivindicación 1, que es un anticuerpo scFv, en el que los dominios VL y VH están conectados por un ligador.
  3. 3.
    El anticuerpo scFv según la reivindicación 2, que comprende una disposición de secuencia VL-ligador-VH.
  4. 4.
    El anticuerpo scFv según la reivindicación 2 ó 3, en el que elligador tiene la secuencia SEO ID NO: 10 o se
    deriva de dicha secuencia.
  5. 5. El anticuerpo scFv según la reivindicación 4, en el que al menos una G de dicho ligador se cambia por un
    aminoácido más polar o cargado .
  6. 6. El derivado de anticuerpo según la reivindicación 1, que es un fragmento Fab en el que el dominio VL se fusiona con la región constante de una cadena kappa de Ig humana, el dominio VH se fusiona con el dominio eHl de una IgG humana y los dos polipéptidos de fusión se conectan mediante un puente disulfuro intercatenario.
  7. 7. El anticuerpo o derivado de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6. que está marcado
    o químicamente modificado.
  8. 8. Una secuencia de ADN que codifica el anticuerpo o derivado de anticuerpo según una cualquiera de las
    reivindicaciones 1-6.
  9. 9. Un vector de expresión o clonación que contiene la secuencia de ADN según la reivindicación 8.
  10. 10. Una célula huésped adecuada transformada con Un vector de expresión según la reivindicación 9.
  11. 11 . La célula huésped según la reivindicación 10, que es una célula de E. eoli, de levadura, vegetal, de insecto
    o de mamífero.
  12. 12.
    Un método para la producción de una molécula de anticuerpo o derivado de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que comp rende cultivar la célula huésped según las reivindicaciones 10 u 11 en condiciones que permiten la srntesis de dicha molécula de anticuerpo y recuperarla de dicho cultivo.
  13. 13.
    El anticuerpo o derivado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, como producto farmacéutico.
  14. 14.
    El anticuerpo o derivado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad relacionada con TNFa.
  15. 15.
    El anticuerpo o derivado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1~7, para su uso en un
    método de tratamiento de una enfermedad relacionada con TNFa según la reivindicación 14, caracterizado porque la enfermedad relacionada con TNFa es osteoartritis, síndrome de ojo seco, uvertis, enfermedades inflamatorias que afectan a la piel, psoriasis o enfermedad inflamatoria del intestino.
  16. 16. El anticuerpo o derivado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1·7, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad relacionada con TNFa en el que el anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra localmente o por vía tópica.
  17. 17. El uso de un anticuerpo o derivado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para la
    producción de un medicamento para el tratamiento de o como diagnóstico in vitro para la detección de
    enfermedades asociadas a TNFa.
  18. 18. El uso según la reivindicación 17, en el que el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad
    asociada a TNFa y en el que el anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra localmente o por vía
    tópica.
  19. 19. El uso según la reivindicación 17 Ó 18, en el que la enfermedad asociada a TNFa es osteoartritis, uveltis, enfermedad inflamatoria del intestino, srndrome de ojo seco, enfermedades inflamatorias que afectan a la piel o psoriasis.
  20. 20. Una composición de diagnóstico o terapéutica que comprende un anticuerpo según cualquiera de las
    reivindicaciones 1 -7 en combinación con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
  21. 21. Una preparaclon de combinación que comprende el anticuerpo según una cualquiera de las
    reivindicaciones 1-7 junto con al menos un segundo compuesto.
  22. 22. La preparación de combinación según la reivindicación 21, en la que el segundo compuesto no es un anticuerpo específico para TNFa.
    s 23. La preparación de combinación según la reivindicación 21 Ó 22, para su uso como medicamento.
  23. 24. El vector según la reivindicación 9, como producto farmacéutico para aplicaciones de terapia génica en
    seres humanos y/o en animales.
    Figura 1
    Anticuerpo ScFv
    VL
    VH
    (G GGGS) -ligilld ....
    . .
    I I .
    TB-A DIVMl'QS.88 LSASVGOaV'1' L~ImVVWfQQlU' OJtAn:LLlYS D-a DlVL'1'Q8I'S. LSA.IVQDIlVT L'f'CDSQaVa ImVVWfQQlU' aaa.l'IQ\tLIYS • • ~DlSLa • A
    'ta-..
    AnIIlr1'GY:IPS USGIIGYG'I'D rrL~:U:SLQP J:DWI.vrtcQQ ¡:,rnH.'r1"GQ T8-a ~lItI'SGSGSGD ftLl'lSSLQP IWWI.vrtCQQ D11I8H.'rJ'QQ CSZLQ. •• • • y A DI
    QYQLVQSGAZ ~SCT.ASI:l'Glr lP'11i""l n~.ara".... QYQLV'Q.SGAIl ~SC'lUGYSI'T n~HQGL'lftlP• * G i"L8 * * Il
    ft-A l'14'!1~ aD~SI.l:TUS'J'V! HItl.7SL\I'SDD TAvrtCANT8-1!1 lMItG&ri1 aDKna)1lV'l'L 'J'RD'I'SIQ'lVl NaL'1A.'I'SDD TAVYYCAN1'D8 D'1'I Q
    QG..... ... ..,.
    n-A M------DA MDnIIGIQG 'l'LV'J"YS8 T8-. M------DA MDDIIaQG 'l'LWY$S Tn.I)!'W Y • *
    Figura 2
    dominio VL e..
    Enlace
    50S
    dominio VH eH'
    Figura 3
    Rendimiento de producción de scFv mediante expresión en Ecol;
    A.
    IPrG .. . .. • .. . + .,.,,0 + . + .. ..
    l. l. i I!.
    ID
    .... i •.... I!
    = -....,---
    -
  24. 8.
    Monómero
    Agregados
    eo
    Volumen de elución (mi)
    Figura 4
    Comparación de afinidad mediante ELlSA
    A.
    ~TII..t. --O Tll-AB
  25. -
    ... T8~lAI 0,8 -.() T1I-IIA
    ...... ,...
    0,_
    1 10 100 1000 10000
    l~nM
    B.
    abe. 4!Onm
    • TB-A
    •
    TS-A H70J12
    •
    T8-AL65
    o
    •
    0,01 O,, 1 10 lOO 1000 [lIeFV] ntoe
    Figura 5 Inhibición de citotoxicidad inducida por TNF en células L929
    A.
    .. TB-A
    •
    TBwt
    •
    InfIildm.b
    o 0,01 0,' '0 .eo ,(100 'coco
    (AH] en na/mi
    I ITBwI IntflllimobTB-AI .a.,.
    CI" [ng/mi) 10,31 '2,51
    B.
    c.
    GPO' 0,0' 0,1 1:0 1ao 1000
    fJ\IIl--.
    ITlI-AFab
  26. 29.1 65,9
    Cambio medio del diámetro Tl de la rodilla (cm) !O
    c:
    C3
    .p
    ... O)
    PBS
    TNF PBS+18Otag de Ac. scFv anli-TNF TNf+ 180,,; de Ac. scFv anti-TNF P8S+450JlII de Ac. Fab anli-TNF
    'D TNF+450pOde Ac. Fab anti-TNF THF+18Op.ode Ac. Fab anli-TNF PBS+450"g de Infliximab La. TNf+~O de Infliximab La. THF.11O"g de Infliximab La. TNF+dOp.g de Infliximab Lp. TNF+11Op.g de Infliximab Lp.
    Figura 7
    "
    . ,•
    ~ .. I/l ..
    } ~ ....
    'T1
    (Q
    c:
    Puntuación histológica ~
    ~
    o:>
    PBS+ 180¡.Lgde k .scFv artiTKf+ 180I'Dde k .scFv arti-PBS+450JlGde kFab arti-TN' '!) TNF+450llgde kFab arti-TIIF
    -
    TNF+1110¡&gde kFab ......TIIF. P8S+ 450,,~de hfliximab i TNF+ 4S0I'~de hfliximab· TNF+ 1SO¡aGde hfliximab TNF+ 4SOtLg de hfliximab i P TNF+180llllde hfliximabip ..
    .,.,
    c::::
    Cambio medio del diámetro ..., de la rodilla (cm) Oi) <O
    P8S
    TNF
    TNF +18~gdeAc sch .... reDc:iooBlo
    TNF. 1511" de Ac..scfvlllti-DF
    TNF. 451&11 de AcscFv lllti-DF
    ...,
    \O TNF+ 11fl1 deAc..scfvlllti-DF TNF. 1St",de AcFab !Di-DF TNf+ CSI&II de AcFab lllti-lN'" TMF. 11,,9 deAcFab lllti-lN'" TNF+ 1511'1de hllxinatJ i.a. TNF.45pl de .,fIlcinab i.a.
    TNF+ 111'11 de ~i.a. TNF+ 156J&S1 de ~i.p. TNF+ 451" de hllxinatJi.p. TNF+111'1 de hlixiflabi.p.
    'T1
    Puntuación histológica (C
    c:
    ..,
    Q)
    ..... TNF
    TNF + 1IOflQdesd'v 110 ....aciona... TNF+ 156,.g de Ac.scFv Iri-DF . TNF+ 45jlQ de Ac.scFv arti-TNF . TNF+ 11119 de Ac.scFv Iri-DF •
    'D
    TNF+ 156"ude Ac.Fab arü-DF TNF+ 45,&9 de Ac.Fab arü-DF TNF+ 1',.8 de Ac.Fab arü-DF TNF+ 156119 de hfixmBb iJil. TNF+ 4"Jl9 de hfixmBb iJil. TNF+ 11J19 de hfixmBb iJil.
    TNF+ 156p9 de lnfIxinab i.p. TNF+ 45,,9 de lnfIxinab i.p. TNF+ 11,,9 de lnfIxinab i.p.
    w
    Figura 11
    Estabilidad de T8-A, 3 días a 3rC
    1,2
    .. suero
    y fluido vítreo
    1,0
    • TBSTM
    ....
    <4$0m\
    • orina
    .".
    • fluido de la cámara
    .,.
    ',2
    ',0
    0,001
    fluido del
    fluido de la
    su ero
    cuerpo vítreo T B S T M ori n a cámara anterior
    Ko
    3,622 3,184 3,394 4,141 2,970
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