KR20140071450A - ＴＮＦα를 억제하는 안정적이고 가용성인 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TNFα에 특이적이며, 안정성, 가용성, TNFα와의 시험관내 및 생체내 결합에 대해 최적화되고 면역원성이 낮은 특이적 경쇄 및 중쇄 서열을 포함하는, 특별히 안정적이고 가용성인 scFv 항체 및 Fab 단편에 관한 것이다. 상기 항체는 TNFα-관련 장애의 진단 및/또는 치료용으로 디자인된다. 본 발명의 재조합 항체 발현을 위한 핵산, 벡터 및 숙주 세포, 이의 단리 방법, 및 의약에 있어서의 상기 항체의 용도 역시 개시되어 있다.

Description

ＴＮＦα를 억제하는 안정적이고 가용성인 항체 {STABLE AND SOLUBLE ANTIBODIES INHIBITING TNFα}
본 발명은 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)에 결합하고 그의 기능을 차단하며, TNFα-관련 질환의 진단 및/또는 치료, 예방 또는 완화에 유용한 최적화 항체 및 항체 유도체, 이들의 코딩 서열, 제조 방법, 및 약리상 적합한 조성물 중에서의 용도에 관한 것이다.
종양 괴사 인자 알파 (TNFα, 카켁틴이라고도 공지되어 있음)는 내독소 또는 다른 자극에 대한 반응으로 단핵구 및 대식세포 등을 비롯한 수많은 세포 유형에 의해 생성되는 천연 포유동물 사이토카인이다. TNFα는 염증성 반응, 면역학적 반응 및 병태생리적 반응의 주요 매개자이다 (문헌 [Grell, M., et al. (1995) Cell, 83:793-802]).
가용성 TNFα는 전구체 막횡단 단백질의 절단으로 형성되고 [Kriegler, et al. (1988) Cell 53:45-53], 분비된 17 kDa 폴리펩티드는 가용성 단독삼량체 복합체로 조립된다 (문헌 [Smith, et al.(1987), J. Biol. Chem. 262:6951-6954], TNF에 대한 검토는 문헌 [Butler, et al. (1986), Nature 320:584], [Old (1986), Science 230:630] 참조). 이들 복합체는 이후에 다양한 세포에 존재하는 수용체에 결합한다. 결합으로 인해 (i) 인터루킨 (IL)-6, IL-8 및 IL-1 등과 같은 다른 프로-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인의 방출, (ii) 매트릭스 메탈로프로테이나제의 방출, 및 (iii) 백혈구를 혈관외 조직으로 끌어들여서 염증 및 면역 캐스케이드를 더욱 증폭시키는, 내피 부착 분자 발현의 상향 조절 등을 비롯한 일련의 프로-염증성 효과가 발생된다.
많은 장애가 TNFα의 수준 상승과 관련이 있고, 이들 중 다수가 유의한 의학적 중요성을 갖는다. TNFα는 만성 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염 (RA), 염증성 장 장애, 예컨대 크론병 및 궤양성 대장염, 패혈증, 울혈성 심부전, 기관지 천식 및 다발성 경화증 등을 비롯한 수많은 인간 질환에서 상향 조절되는 것으로 나타났다. 인간 TNFα에 트랜스제닉인 마우스는 TNFα를 높은 수준으로 구성적 생성하고, RA와 유사한 자발적이고 파괴적인 다발성관절염을 발병시킨다 [Keffer et al. 1991, EMBO J., 10, 4025-4031]. 따라서, TNFα는 프로-염증성 사이토카인이라 불린다.
현재, TNFα는 열 및 권태 및 피로의 전신적 증상을 수반하는 다관절성 관절 염증 및 파괴를 특징으로 하는 만성, 진행성 및 허약화 질환인 RA의 발병에 있어서의 핵심 요인으로 수립되어 있다. RA는 또한 흔히 관절 연골 및 골 파괴로 진행되는 만성 활액 염증을 야기한다. RA를 앓고 있는 환자의 활액과 말초혈 둘다에서 TNFα의 수준이 증가한 것으로 밝혀졌다. TNFα 차단제가 RA를 앓고 있는 환자에게 투여되면, 이것들은 염증을 감소시키고 증상을 호전시키며 관절 손상을 지연시킨다 [McKown et al. (1999), Arthritis Rheum. 42:1204-1208].
생리적으로, TNFα는 또한 특정 감염으로부터의 보호와도 관련이 있다 [Cerami. et al. (1988), Immunol. Today 9:28]. TNFα는 그램(Gram)-음성 박테리아의 지다당류에 의해 활성화된 대식세포에 의해 방출된다. 이와 같이, TNFα는 박테리아 패혈증과 관련이 있는 내독소 쇼크의 발병 및 병리에 수반되는 매우 중요한 내인성 매개자라고 여겨진다 ([Michie, et al. (1989), Br. J. Surg. 76:670-671], [Debets. et al. (1989), Second Vienna Shock Forum, p. 463-466], [Simpson, et al. (1989) Crit. Care Clin. 5:27-47], [Waage et al. (1987). Lancet 1:355-357], [Hammerle. et al. (1989) Second Vienna Shock Forum p. 715-718], [Debets. et al. (1989), Crit. Care Med. 17:489-497], [Calandra. et al. (1990), J. Infect. Dis. 161:982-987], [Revhaug et al. (1988), Arch. Surg. 123:162-170]).
다른 유기 시스템에 있어서도, TNFα는 중추 신경계, 특히 다발성 경화증, 길랑-바레 증후군 및 중증 근무력증 등을 비롯한 상기 신경계의 염증성 장애 및 자가면역 장애, 및 알쯔하이머병, 파킨슨병 및 헌팅톤병을 비롯한 신경계의 퇴행성 장애에서도 핵심적인 역할을 하는 것을 밝혀진 바 있다. TNFα는 또한 시신경염, 황반 변성, 당뇨병성 망막증, 피부근염, 근위축성 측삭 경화증 및 근육이영양증 등을 비롯한 망막 및 근육의 관련 시스템의 장애 뿐 아니라 또한 외상성 뇌 상해, 급성 척수 상해 및 졸중 등을 비롯한 신경계 상해에도 관련이 있다.
간염은, 다른 촉발인자 중에서도 엡스테인-바르 바이러스, 사이토메갈로 바이러스 및 A형 내지 E형 간염 바이러스 등을 비롯한 바이러스 감염에 의해 야기될 수 있는 또다른 TNFα-관련 염증성 장애이다. 간염은 문맥 및 소엽 영역에서 급성 간 염증을 일으키고, 이후에는 섬유증 및 종양 진행이 수반된다.
TNFα는 암에서 대부분의 암 이환 및 사망을 야기하는 악액질을 매개할 수 있다 [Tisdale M.J. (2004), Langenbecks Arch Surg. 389:299-305].
염증, 세포의 면역 반응 및 많은 질환들의 병리상태에서 TNFα가 수행하는 핵심적인 역할로 인해, TNFα의 길항제가 조사되었다.
TNFα는 그의 전신 차단이 임상적으로 발생된 감염, 특히 잠복 결핵의 재활성화의 빈도 및 중증도 증가 위험 및 가능하게는 림프종, 탈수초 질환 및 심부전의 유도 등을 비롯한 다른 위험을 수반하는 중요한 사이토카인이다.
TNFα-매개 질환의 치료용으로 디자인된 TNFα 길항제의 한 부류는 TNFα에 특이적으로 결합하여 그의 기능을 차단하는 항체 또는 항체 단편이다. 항-TNFα 항체의 사용은 TNFα의 차단이 IL-1, GM-CSF, IL-6, IL-8, 부착 분자 및 조직 파괴에서의 감소 등과 같이 TNFα로 인한 효과를 반전시킬 수 있음을 보여주었다 [Feldmann et al. (1997), Adv. Immunol. 1997:283-350].
TNFα에 대한 항체는 내독소 쇼크의 예방 및 치료용으로 제안된 바 있다 [Beutler et al. (1985) Science:234, 470-474]. 패혈성 쇼크의 치료에 있어서 항-TNFα 항체의 용도는 문헌 ([Bodmer et al., 1993, Critical Care Medicine, 21:441-446, 1993], [Wherry et al., 1993, Critical Care Medicine, 21:436-440] 및 [Kirschenbaum et al., 1998, Critical Care Medicine, 26:1625-1626])에서 논의된다.
인간에서 항-TNFα 모노클로날 항체 또는 그의 TNFα 결합 단편의 투여에 의한 신경변성 질환의 치료 방법은 미국 제2003147891호에 개시된 바 있다.
제WO 0149321호는 신경 장애 및 TNFα에 의해 야기되는 관련 장애의 치료에 있어서 항-TNFα 항체를 비롯한 TNFα 차단제의 용도를 교시한다. 상기 문헌은 TNFα 길항제를 투여하여 상기 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
제WO 03047510호는 TNFα에 대한 여러 종류의 모노클로날 항체 및 조작된 항체, 이들의 제조 방법, 이들을 포함하는 화합물, 및 의약에서의 용도를 개시한다.
TNFα 매개 질환 요법에 유용한 항체는 일반적으로 천연 공급원, 일반적으로는 마우스로부터 하이브리도마 기술로 생성된 모노클로날 항체 (mAB) 또는 조작된 항체이다. 조작된 항체는 전장 중쇄 및 경쇄를 포함한다는 점에서 천연 항체에 상응하거나, 또는 단백질분해성 절단에 의해 천연 항체로부터 생성될 수도 있는 Fab 단편에 상응하거나, 또는 가변 중쇄 및 경쇄 영역의 단편이 펩티드 링커(linker)에 의해 연결되어 있는 단일 쇄 scFv 항체에 상응한다.
항체의 중쇄와 경쇄는 둘다 불변 도메인 및 가변 도메인을 포함한다. 비-인간 항체는 면역원성이기 때문에, 소위 "하이브리드" 항체에서는 항체 중 인간-유사 서열의 양이 종종 증가되고, 이것은 인간 IgG의 불변 영역 및 동물 항체의 서열과 매치(match)되는 가변 영역을 포함하며, 대부분의 경우에는 원하는 특이성을 갖는 뮤린(murine) 항체이다. 이어서, 이들 가변 영역은 돌연변이유발에 의해 전형적인 인간 항체에 더욱 유사해지도록 추가로 조작되어 "인간화" 항체가 생성되도록 할 수 있다. 별법의 접근법에서, 마우스 항체 가변 영역의 항원 결합 부분, 즉 상보성 결정 영역 (CDR)만이 인간 항체의 프레임워크(framework)와 조합되어, "CDR-이식된" 항체가 생성된다.
TNFα에 대한 모노클로날 항체는 선행 기술에 기재된 바 있다. 문헌 [Meager et al., 1087, Hybridoma 6:305-311]은 재조합 TNFα에 대한 뮤린 모노클로날 항체를 기재한다. 문헌 [Shimamoto et al., 1988, Immunology Letters 17:311-318]은 마우스에서의 내독소 쇼크 예방에 있어서 TNFα에 대한 뮤린 모노클로날 항체의 용도를 기재한다.
미국 제5,919,452호는 항-TNFα 키메라 항체 및 TNFα의 존재와 관련된 병리상태의 치료에 있어서의 그의 용도를 개시한다.
RA 및 크론병 치료에 있어서 항-TNFα 항체의 용도는 문헌 ([Feldman et al. (1998), Transplantation Proceedings 30:4126-4127], [Adorini et al., 1997, Trends in Immunology Today 18:209-211] 및 [Feldmann et al., 1997, Advanced Immunology 64:283-350])에서 논의되고 있다. 이러한 치료법에 사용되는 TNFα에 대한 항체는 일반적으로 미국 제5,919,452호에 기재된 것과 같은 키메라 항체이다.
미국 제20003187231호는 결합 특성이 개선된 1개 이상의 비-인간 CDR 영역을 갖는 인간화 항-TNFα 항체를 개시한다. 추가로, 국제 특허 출원 제WO 92/11383호에는, TNFα에 특이적인 재조합 항체, 예컨대 CDR-이식된 항체가 개시되어 있다. 문헌 [Rankin et al. (1995), British J. Rheumatology 34:334-342]은 RA의 치료에 있어서 이러한 CDR-이식된 항체의 용도를 기재한다.
제WO 9211383호는 뮤린 모노클로날 항체 61E7, hTNFI, hTNF3 또는 101.4에서 유래된 TNFα-특이적 재조합 인간화 CDR-이식된 항체를 개시하고, 상기 항체의 제조 방법 및 TNFα-관련 장애의 진단 및/또는 요법에서의 용도를 교시한다.
오직 최근에만 시판되고 있는 TNFα의 특이적 억제제 중에서, TNFα에 대한 모노클로날 키메라 마우스-인간 항체 (인플릭시맙(infliximab), 레미케이드(Remicade)TM; 센토코르 코포레이션(Centocor Corporation)/존슨 앤드 존슨(Johnson ＆ Johnson))는 RA 치료에 있어서의 임상적 효능이 입증된 바 있다 ([Elliott et. al. 1994, Lancet 344:1105-1110], [Mani et al. (1998), Arthritis ＆ Rheumatism 41:1552-1563]). 인플릭시맙은 또한 염증성 장 장애 크론병 치료에 있어서의 임상적 효능 또한 입증된 바 있다 [Baert et al. 1999, Gastroenterology 116:22-28].
미국 제22002037934호는 인플릭시맙과 같은 항-TNFα 항체의 투여에 의한 간염 치료를 개시한다.
미국 제6428787호는 인플릭시맙, CDP571 및 D2E7 등을 비롯한 항-TNFα 항체를 사용하여 신경 질환 및 TNFα-관련 질환을 치료하는 것에 대하여 교시한다.
D2E7 (아달리무맙(Adalimumab))은 인간 항-TNFα 모노클로날 항체 (애보트(Abbott))로서, RA 및 크론병 치료를 위해 개발된 것이다 (제WO 9729131호). 셀테크(Celltech)는 크론병 치료용 인간화 모노클로날 항-TNFα IgG4 항체인 CDP571 (유럽 제0626389호) 및 RA 치료용 인간화 모노클로날 항-TNFα 항체 단편인 CDP870을 개발 중이다. 국소화 장애의 치료를 위해 상기 항체를 국소 투여하는 것은 미국 제2003185826호에 개시되어 있다.
많은 단일 쇄 항체 (scFv)는, 이들이 특히 예를 들어 파지 디스플레이 또는 리보솜 디스플레이 등과 같은 기술을 이용하여 높은 결합능에 대하여 쉽게 선별될 수 있기 때문에 다수의 여러 항원에 대하여 생성되었다. 추가로, scFv 항체는 치료용 전장 항체의 제조와 비교할 때 비용이 덜 드는 미생물 시스템에서 제조될 수 있다.
통상적인 세포외 및 시험관내 용도 이외에도, scFv는 세포내 용도에도 성공적으로 이용되어 왔기 때문에 ([Woern et al. 2000, JBC, 28; 275 (4):2795-2803], [Auf der Maur et al. 2002, JBC, 22; 277 (47):45075-45085], [Stocks MR, 2004, Drug Discov Today. 15; 9 (22):960-966]), 세포내 항원에 대한 scFv가 개발되었다. 일반적으로, 기능적 scFv의 세포내 발현은 이들의 불안정성, 불용성 및 응집체 형성 경향으로 인한 한계가 있다. 이러한 이유로, 세포내 환경 (예를 들어 핵, 세포질)에 전형적인 환원 조건하에서 특히 가용성이고 안정적인 scFv 항체에 대한 생체내 스크리닝 시스템이 소위 "품질 제어(Quality Control)" 스크리닝을 이용하여 성공적으로 개발되었고 (제WO 0148017호, [Auf der Maur et al. (2001), FEBS Lett. 508:407-412], [Auf der Maur et al. (2004), Methods 34:215-224]), 이러한 목적을 위한 특히 안정적이고 가용성인 scFv 프레임워크 서열이 동정되었다 (제WO 03097697호). 추가로, 이들 프레임워크는 세포외 환경의 천연 산화 조건하에서도 우수한 발현 수준 및 증대된 안정성 및 가용성을 나타낸다. 따라서, 이러한 유리한 생체물리학적, 생화학적 성질로 인해 유리한 높은 생산 수율이 가능하고, 일단 특이적 항원에 대해 지시된 이들 항체 단편이 단백질 치료제로서, 특히 치료 영역에 국소 및/또는 전신 적용될 수 있게 한다. scFv 항체와 Fab 단편 모두에는 전장 항체와는 달리 단핵구, 예를 들어 천연 킬러 세포의 Fc-수용체에 의해 인식되는 Fc 부분이 결여되어 있기 때문에, 이것들은 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 일으키지 않으며, 따라서 비-표적 세포상의 Fc-수용체와의 결합으로 인한 비특이적 독성을 야기하지 않는다.
따라서, RA 등과 같은 TNFα-관련 장애의 치료, 특히 국소 투여에 의해 부작용 정도가 낮은 지속적이고 제어된 요법을 제공할 수 있는 치료에 효과적인 새로운 형태의 항체가 요구된다. 본 발명은 관절염 및 다른 TNFα-매개 장애 또는 병태생리적 메카니즘, 특히 다양한 형태의 통증의 염증 과정의 효과적이고 지속적인 치료를 위한 항체, 조성물 및 방법을 제공한다.
본원에서 인용된 모든 간행물 및 참고자료는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
발명의 개시
따라서, 본 발명의 일반적인 목적은 TNFα에 시험관내 및 생체내 특이적으로 결합하는 안정적이고 가용성인 항체 또는 항체 유도체를 제공하는 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 항체 유도체는 scFv 항체 또는 Fab 단편이다.
이제, 본 발명의 이러한 목적 및 추가의 목적은 하기하는 기재로부터 보다 더 명백해질 것이며, 상기 항체 또는 항체 유도체는 서열 2의 서열로 이루어지거나 서열 2의 서열에서 유래된 중쇄 가변 도메인과 조합된, 서열 1의 서열로 이루어지거나 서열 1의 서열에서 유래된 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 유래된 서열일 경우에는 상기 서열이 상기 VL 도메인의 프레임워크 내에는 최대 5개 이하의 변화 및/또는 상기 VH 도메인의 프레임워크 내에는 최대 9개 이하의 변화를 갖는다는 특징이 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 프레임워크 내의 임의의 위치, 바람직하게는 VL 도메인의 위치 4, 46, 65, 67 70 및 83의 군에서 선택된 하나 이상의 위치 및/또는 VH 도메인의 위치 11, 16, 28, 43, 48, 68, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 79, 93 및 112의 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 1개 이상의 아미노산 변화가 도입된 상기 항체 또는 항체 유도체이다. 더욱 바람직하게는, 1개 이상의 상기 전환이 VL의 경우에는 서열 3 및/또는 VH의 경우에는 서열 4에 존재하는 아미노산이 되도록 하고, 훨씬 더욱 바람직하게는 총 13개 이하의 전환이 존재한다.
가장 바람직하게는, 상기 항체 또는 항체 유도체는 서열 1의 서열의 VL 도메인 및/또는 서열 2의 서열로 이루어지거나 서열 2의 서열에서 유래된 VH 도메인, 또는 서열 11의 서열의 VL 도메인 및 서열 4의 서열의 VH 도메인을 포함한다. 본 발명의 항체의 VH 도메인이 서열 1의 VL 도메인을 포함하는 경우, 바람직한 실시양태에서는 VH 서열이 서열 2에서 유래되고, 위치 68의 페닐알라닌이 알라닌, 루이신, 이소루이신 또는 발린으로 변화된다. VH 내의 추가 변화는 임의적이다. 이러한 종류의 scFv 항체는 서열 31, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36 및 서열 37에 기재되어 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 항체 또는 항체 유도체는 서열 1의 VL 서열 및 서열 2의 VH 서열을 갖고 1개 이상의 CDR에 서열 5의 VL 서열 및/또는 서열 6 또는 서열 25의 VH 서열의 상응하는 CDR에 존재하는 잔기로 전환된 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 항체에서 유래된다.
본 발명의 훨씬 바람직한 실시양태에서는, 상기 항체 또는 항체 유도체에서 VL CDR2, VL CDR3, VH CDR2 또는 VH CDR3의 군 중 1개 이상의 CDR이 서열 5의 VL 서열 및/또는 서열 25 또는 서열 6의 VH 서열의 상응하는 CDR로 전환된다.
가장 바람직하게는, 상기 항체 또는 항체 유도체는 하기하는 VL/VH 서열 조합을 포함한다:
VL 서열 7/VH 서열 2,
VL 서열 8/VH 서열 2,
VL 서열 1/VH 서열 9,
VL 서열 1/VH 서열 25,
VL 서열 1/VH 서열 28,
VL 서열 1/VH 서열 29,
VL 서열 26/VH 서열 30,
VL 서열 27/VH 서열 30.
또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 유도체는 인간 TNFα에 대한 특이성을 갖는다. 바람직하게는, 항원 결합은 Kd가 약 100 nM 이하임을 특징으로 한다. 더욱 바람직한 것은 Kd가 10 nM 이하인 항체이고, 가장 바람직한 것은 Kd가 1 nM 이하인 항체이다.
본 발명에 따른 항체 유도체는 예를 들어 Fc 융합체, 독소 융합체, 효소 활성 융합체, 여러가지 포맷, 예를 들어 미니바디(minibody), 디아바디(diabody), 선형 항체, 단일 쇄 항체, 이중특이적 항체 단편, 특히 scFv 및 Fab 단편 등이다.
본 발명의 또다른 바람직한 목적은 VL 도메인 및 VH 도메인이 링커에 의해, 바람직하게는 VL-링커-VH 서열 배열로 연결된 scFv 항체이다. 더욱 바람직하게는 상기 링커가 서열 10의 서열을 갖는다.
본 발명의 또다른 바람직한 목적은 서열 40에서 유래된 scFv 항체 (TB-A)이다. 이러한 항체는 돌연변이유발로 수득될 수 있고, 프레임워크, CDR 및/또는 링커 서열에서 3개 이하의 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, scFv 항체는 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37 또는 서열 38의 서열을 갖는다.
본 발명의 또다른 바람직한 목적은 인간 Ig 카파 쇄의 불변 영역에 융합된 VL 도메인, 및 인간 IgG의 CH1 도메인에 융합된 VH 도메인을 포함하고, 상기 2개의 융합 폴리펩티드가 쇄간 디술피드 연결기(bridge)에 의해 연결된 Fab 단편이다.
또다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 항체 유도체, 예를 들어 항체 단편은 표지되거나 화학적으로 변형된다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 항체 또는 항체 유도체를 코딩하는 DNA 서열 및 상기 DNA 서열을 함유하는 클로닝 또는 발현 벡터를 제공한다. 추가로, 상기 DNA 서열로 형질전환된 적합한 숙주 세포가 제공되며, 이것은 바람직하게는 이. 콜라이(E. coli), 효모 또는 포유동물 세포일 것이 선호된다.
추가로, 본 발명의 임의의 항체 또는 항체 유도체를 코딩하는 DNA로 형질전환된 숙주 세포를 상기 항체 또는 항체 유도체의 합성을 허용하는 조건하에 배양하는 단계, 및 상기 분자를 상기 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체 또는 항체 유도체의 생산 방법이 제공된다. 바람직하게는, 상기 방법은 이. 콜라이에서 정제된 scFv 항체 또는 Fab 단편을 제공한다.
본 발명의 또다른 측면은 시험관내 진단용 진단 도구 및/또는 의약품으로서 본 발명에서 제공하는 항체 또는 항체 유도체의 용도이다. 이러한 용도는 임의의 TNFα 관련 상태와 관련하여 특히 바람직하다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항체 유도체, 및 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, TNFα-관련 질환의 치료용 의약으로서 사용되는 조성물을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항체 유도체를, 바람직하게는 TNFα에 특이적인 항체 또는 항체 유도체가 아닌 제2 화합물과 함께 포함하는 조합 제제를 제공한다.
본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명의 scFv 항체를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터가 유전자 요법에 사용된다.
TNFα-관련 질환의 치료는 TNFα와 상기 항체 또는 항체 유도체와의 강력한 상호작용으로 인한 TNFα의 차단에 의해 달성된다. 바람직하게는, 자가면역, 급성 또는 만성 염증 상태, 암-관련 질환, 통증, 신경 및 신경변성 장애, 감염성 질환 및 심혈관 질환의 치료가 예측된다.
하기하는 발명의 상세한 설명을 고려하면, 본 발명이 더욱 잘 이해될 것이고, 상기한 것 이외의 목적이 명백해질 것이다. 이러한 기재는 첨부된 도면을 언급하며 설명된다.
도 1은 가장 빈번한 변이의 범위를 표시한 TB-A 및 TB-B 서열을 갖는 scFv 항체의 개요도를 보여준다. 별표(*)는 본 발명에 따른 항체의 프레임워크에서의 아미노산 변화가 허용되는 위치를 표시한 것이다. CDR (CDR에는 회색 음영을 넣어 강조하였음) 아래쪽에 나타낸 아미노산은 각각의 CDR에서 사용될 수 있다.
도 2는 Fab 단편의 발현에 관한 예시적 개요도를 보여준다.
도 3은 이. 콜라이에서 발현된 scFv의 생산 수율을 보여준다. A: 발현된 단백질의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동. B: TB-A 및 TB-wt의 분석용 겔 여과로서, TB-A의 가용성이 더 우수함을 보여줌.
도 4는 TNFα에 대한 여러가지 scFv 항체의 친화도를 ELISA로 결정하여 비교한 것을 보여준다.
도 5는 마우스 L929 섬유아세포에서 인간 TNFα-유도된 세포독성의 억제를 보여준다. A: TB-wt 및 인플릭시맙과 비교한 TB-A의 농도 의존적 억제 및 IC50 값. B: TB-A 유도체에 의한, TNFα 유도된 세포독성 차단 비교. C: TB-A의 scFv 포맷 및 Fab 포맷 비교.
도 6은 래트에서 인간 TNFα-유도된 관절 종창(swelling)에 대한 항체 처치의 효과를 보여준다 (실험 5.3., 실험 1).
도 7은 조직병리학적 염증 스코어링에서의 스코어링 방식을 보여준다.
도 8은 래트에서 인간 TNFα-유도된 관절 염증에 대한 항체 처치의 효과를 보여준다 (실험 5.3., 실험 1).
도 9는 래트에서 인간 TNFα-유도된 관절 종창에 대한 항체 처치의 효과를 보여준다 (실험 5.3., 실험 2).
도 10은 래트에서 인간 TNFα-유도된 관절 염증에 대한 항체 처치의 효과를 보여준다 (실험 5.3., 실험 2).
도 11은 여러가지 신체 유체 중 TB-A의 안정성을 보여준다.
본 발명의 수행 방식
이른바 "품질 제어" 스크리닝 (제WO 0148017호)에서 확인된 프레임워크를 포함하는 항체 또는 항체 유도체는 일반적으로 높은 안정성 및/또는 가용성을 특징으로 하며, 따라서 TNFα를 중화시키는 것과 같이 세포외에서 적용하는 상황에서도 유용할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본 발명은 TNFα를 특이적으로 인식하고 그에 결합하여 생체내에서 TNFα의 기능을 차단하는데 적합한 증대된 안정성 및 가용성을 특징으로 하는 항체 또는 항체 유도체를 제공한다. 상기 항체 또는 항체 유도체는 EP1479694에 개시된 항원 결합 부위와 독립적으로 특히 안정적이고 가용성인 프레임워크를 갖는 항체에 대한 "품질 제어" 스크리닝에서 유래된 특정 프레임워크를 특징으로 한다. 스크리닝에 사용된 프레임워크가 인간 항체 프레임워크인 경우, 이는 인간 적용을 위한 비-면역원성 프레임워크로서 고려될 수 있다. 본 발명의 항체의 CDR은 인간 TNFα에 고 친화도 (Kd = 0.4 nM)로 특이적으로 결합하여 TNFα와 그의 수용체의 결합을 차단할 수 있는 뮤린 모노클로날 항체 Di62 [Doering et al., 1994]의 CDR과 동일하거나 그로부터 유래된다. 또한, Di62는 마우스 L929 세포에서 인간 TNFα-유도된 세포독성을 억제한다. 마우스 항체로부터의 CDR을, 정의되지 않은 항원 결합 성질을 가지며 외견상 가장 적합한 인간 어셉터(acceptor) 프레임워크 상에 이식하는데, 상기 프레임워크는 서열 5의 VL 서열 및 서열 6의 VH 서열을 갖고, 상기 서열은 (GGGGS)4 링커 (서열 10)에 의해 연결되는 것인, 명백한 단계에 의해 하기 서열의 scFv 항체가 얻어졌다.
Figure pat00001

상기 scFv 항체는 TB-B라고 부른다. TB-B는 단백질 발현의 우수한 수율을 제공하지만 (도 3a), TNFα에 특이적으로 결합할 수 없다 (도 4a).
따라서, (i) TNFα와 결합하는 데 있어서 충분히 특이적이고, (ii) 효과적인 제조 및 정제를 허용하고 생체내에서 TNFα를 차단하기에 충분히 가용성이고, (iii) 빠른 분해를 경험하지 않고 의약품으로서 유용하도록 충분히 안정적이며, (iv) 충분히 비-면역원성인 항체 또는 항체 유도체를 얻기 위해, 프레임워크 및 CDR을 변화시켜 최적의 가용성과 최적의 항원 결합 특성 사이의 절충점을 찾아냈다. 본 발명은 상기 기준 (i-iv)의 조합에 대하여 최적화되어 있는 VL 및 VH에 대한 서열을 제공한다. (GGGGS)4 링커에 의해 상기 VH (서열 2)에 연결된 상기 VL (서열 1)을 포함하는 scFv 항체는 TB-A라고 부른다. TB-A의 서열은 서열 40에 의해 제공된다. 이 항체는 여전히 상당히 안정적이고 가용성이어서 이. 콜라이로부터 발현 및 정제되는 경우에 만족스러운 수율을 제공하고 (도 3A), 응집하지 않는다 (도 3B). TNFα에 대한 그의 결합 특성은 Kd가 0.8 nM로서 우수하다.
본 발명은 또한 TB-A에 존재하는 서열에서 유래된 VL 및 VH 서열을 다양한 방식으로 개시한다. 먼저, VL의 프레임워크에서 최대 5개의 위치 및/또는 VH의 프레임워크에서 최대 9개의 위치에서의 점 돌연변이, 특히 프레임워크를 TB-B와 더 유사하게, 즉 VL에 대한 서열 3 및 VH에 대한 서열 4와 더 유사하게 만드는 점 돌연변이가 허용가능한 것으로 나타났다. (GGGGS)4 링커에 의해 연결된, 서열 11의 서열의 VL 도메인 및 서열 4의 서열의 VH 도메인을 포함하는 scFv 항체는 TB-B와 VL의 위치 46에서만 차이가 나기 때문에 TB-B R46L이라고 부른다. TB-B와는 달리, 상기 항체는 TNFα에 대해 여전히 양호한 결합 성질을 가졌다 (Kd = 약 100 nM). 이는 TB-A에 상대적인 TB-B R46L에서의 변화의 수가 가변 도메인 프레임워크에서의 변화에 대해 대략 상한을 나타냄을 시사한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, TB-A의 VL 및/또는 VH 프레임워크에 1개 또는 2개의 점 돌연변이만을 도입한다. 돌연변이에 대한 바람직한 프레임워크 잔기는 VL의 경우에 위치 4, 46, 65, 67, 70 및 83에 존재하고, VH의 경우에 위치 11, 16, 28, 43, 48, 68, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 79, 93 및 112에 존재한다. 이들 위치는 서열 목록에서의 번호에 따라 번호를 매긴다. 아미노산 치환은 바람직하게는 "보존적"이거나, 또는 치환 아미노산이 TB-B 서열에 존재하는 상응하는 아미노산과 더 유사하거나 또는 바람직하게는 심지어 상기 아미노산과 동일하도록 한다. 예를 들어, TB-A에서 VH의 A76은 TB-B에 존재하는 바와 같이 I76으로 변화시킬 수 있지만, 유사한, 즉 비-극성 측쇄를 갖는 또다른 아미노산, 예를 들면 V 또는 L로 변화시킬 수도 있다. 이는 "보존적" 아미노산 치환의 예이다. 염기성 측쇄 (K, R, H), 산성 측쇄 (D, E), 비대전된 극성 측쇄 (Q, N, S, T, Y, C), 비-극성 측쇄 (G, A, V, L, I, P, F, M, W), 베타-분지형 측쇄 (T, V, I) 및 방향족 측쇄 (Y, F, W, H)를 비롯하여 본원에 사용된 바와 같은 "보존적" 치환에 적합한 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 바람직한 보존적 변화는 V가 F (서열 26) 또는 A (서열 27)로 변화된다는 점에서 위치 83에서의 VL의 변화이다. 그러나, 서열 32에서는 VL에서의 비-보존적 변화는 CDR1에서의 변화, 즉 N31D와 조합되는 V83E이고, VH에서는 V79A이다. 또다른 특별한 TB-A 변이체는 G를 치환하는, 위치 2에서 R을 보유하는 링커에 의해 VL에 연결된 VH에서 보존적 F68L 교환을 갖는 서열 33의 변이체이다.
훨씬 바람직한 단일 아미노산 교환은 VL에서 R65S 또는 Y67S이고, VH에서 K43Q이거나 또는 F68로부터 V, L 또는 A로의 교환이다. 훨씬 바람직한 이중 변화는 VH에서 F70L/L72R 또는 A76I/S77G이다. 상기 변경을 갖는 TB-A 서열을 포함하는 ScFv 항체는 L929 세포에서 TNFα 유도된 세포독성의 억제를 나타낸다. 이들 몇몇의 결과는 도 5B에 나타나 있다. 이들의 서열은 다음과 같다:
서열 18 = TB-A H_K43Q (TB-A H43)
서열 19 = TB-A H_F68V (TB-A H68)
서열 20 = TB-A H_F70L/L72R (TB-A H70/72)
서열 21 = TB-A H_A76I/S77G (TB-A H76/77)
서열 22 = TB-A L_L46R (TB-A L46)
서열 23 = TB-A L_R65S (TB-A L65)
서열 24 = TB-A L_Y67S (TB-A L67)
바람직한 실시양태에서, 상기 언급한 임의의 VH 도메인을 상기 언급한 임의의 VL 도메인과 조합할 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, TB-A 및 TB-B의 VL 및 VH 도메인은 TB-A (서열 1)의 VL 도메인이 TB-B (서열 4)의 VH 도메인과 조합되거나 또는 TB-B (서열 4)의 VL 도메인이 TB-A (서열 2)의 VH 도메인과 조합되도록 셔플링(shuffling)된다. 훨씬 바람직한 실시양태에서, scFv에서 얻어진 셔플링된 형태를 서열 10의 (GGGGS)4 링커와 연결하여 scFv 항체 TB-AB (서열 12} 또는 TB-BA (서열 13)을 각각 얻는다. 상기 (GGGGS)4 링커는 글리신이 보다 친수성, 즉 극성으로 아미노산 교환되거나 또는 심지어는 항체가 보다 가용성이 되게 할 수 있는 대전된 아미노산으로 아미노산 교환될 수 있다. 이들 변이 중에서, 서열 GRGGS-(GGGGS)3 (서열 39)을 갖는 변이가 바람직하다.
또한, TB-B-유사 서열의 VL 또는 VH 도메인을 TB-A-유사 서열의 VH 또는 VL 도메인과 조합하는 것도 본 발명의 범위내이며, TB-B/TB-A-유사는 서열이 다른 것보다 어느 하나에 더 가까움을 의미한다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, TB-A VL 및/또는 VH 서열의 CDR 영역 내의 1개 이상의 아미노산이 VL의 서열 5 및/또는 VH의 서열 6 또는 서열 25의 선택된 서열에 존재하는 상응하는 아미노산과 매치하도록 변화시킨다. VL CDR (VL CDR2 또는 VL CDR3) 및/또는 VH CDR (CDR2 또는 CDR3) 중 하나에서의 변화가 훨씬 바람직하며, 서열 7 또는 서열 8의 VL 서열 및/또는 서열 25 또는 서열 9의 VH 서열을 각각 형성하는 변화가 가장 바람직하다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, 서열 26 또는 서열 27의 VL 서열을 서열 30의 VH 서열과 조합한다. 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, 서열 1의 VL 서열을 서열 28 또는 서열 29의 VH 서열과 조합한다.
일반적으로, 개시된 임의의 VL 서열을 개시된 임의의 VH 서열과 조합할 수 있다.
본 발명의 목적은 항체 및 항체 단편, 특히 VL 또는 VH 폴리펩티드, 단일-쇄 항체 (scFv) 또는 Fab 단편이다. scFv 항체의 경우, 선택된 VL 도메인을 선택된 VH 도메인에 각 배향으로 가요성 링커에 의해 연결할 수 있다. 적합한 상태의 당업계의 링커는 반복된 GGGGS 아미노산 서열 또는 그의 변이체로 이루어진다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 서열 10 또는 그의 유도체 서열 39의 (GGGGS)4 링커가 사용되지만, 1-3 반복부의 변이체가 또한 가능하다 [Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448]. 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 링커는 문헌 ([Alfthan et al. (1995.), Protein Eng. 8:725-731], [Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106], [Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061], [Klpriyanov et al. (1999), J. MoI. Biol. 293:41-56] 및 [Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. Immunother. 50:51-59])에 기재되어 있다. 배열은 VL-링커-VH 또는 VH-링커-VL일 수 있으며, 전자의 배향이 바람직한 것이다.
Fab 단편의 경우, 선택된 경쇄 가변 도메인 VL을 인간 Ig 카파 쇄의 불변 영역에 융합시키며, 적합한 중쇄 가변 도메인 VH는 인간 IgG의 제1 (N-말단) 불변 도메인 CH1에 융합시킨다. 본 발명의 예시적인 실시양태에서, 인간 CK 도메인은 서열 14의 서열을 가지며, Fab 단편을 구축하는 데 사용된 CH1 도메인은 서열 15의 서열을 갖는다. 도 2는 VL 도메인을 인간 카파 불변 도메인과 직접 연결시켜 서열
Figure pat00002
의 서열이 생성되고 VH 도메인을 제1 불변 도메인 (CH1)에 융합시켜 서열
Figure pat00003
의 서열이 생성되도록 TB-A의 VL 및 VH 도메인을 사용하는 Fab 단편의 예를 나타낸다.
C-말단에서, 쇄간 디술피드 연결기는 2개의 불변 도메인 사이에 형성된다.
본 발명의 항체 또는 항체 유도체는 0.8-10,0OO nM 범위의 해리 상수 Kd를 갖는 인간 TNFα에 대해 친화도를 가질 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, Kd는 1O nM 이하이다. 항원에 대한 항체의 친화도는 적합한 방법 ([Berzofsky et al. "Antibody-Antigen Interactions", in Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed, Raven Press: New York, NY (1992)]; [Kuby, J. Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY]) 및 이 문헌에 기재된 방법을 이용해서 실험적으로 측정할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 항체 또는 항체 유도체, 특히 scFv 또는 Fab 단편은 표지된다. TNFα-특이적 항체 또는 항체 유도체의 검출가능한 표지화는 당업자에게 잘 알려진 방법인 효소 면역검정 (EIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)(예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, Coligan et al. Eds, John Wiley ＆ Sons, 2005] 참조)에 사용되는 효소에 상기 항체 또는 항체 유도체를 연결함으로써 달성할 수 있다.
TNFα-특이적 항체 또는 항체 유도체를 방사활성으로 표지화함으로써, 방사성면역검정 (RIA)의 사용에 의해 TNF-α를 검출할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Work et al., Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, N.Y. (1978)] 참조). 방사성동위원소는 감마 카운터 또는 섬광 계수기를 사용해서 또는 오토라디오그래피에 의해 검출할 수 있다. 특히 유용한 동위원소는 3H, 131I, 35S, 14C이며, 바람직하게는 125I이다.
본 발명의 항체 또는 항체 유도체는 또한 형광성 표지화 화합물, 예를 들면 플루오레스세인, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리쓰린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프트알데히드 및 플루오레스카민, 또는 화학발광성 화합물, 예를 들면 루미놀, 이소루미놀, 테로마틱(theromatic) 아크리디늄 에스테르, 이미다졸 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르로 표지할 수 있다.
표지화 및 검출 프로토콜은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 이들은 문헌 [Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I (Harlow, E. and Lane, D., 1998)]으로부터 이용할 수 있다.
본 발명의 표지된 항체 또는 항체 유도체는 진단 목적, 특히 환자로부터 제거된 생물학적 샘플 중의 TNFα를 검출하는 데 유용하다. TNFα를 함유하는 임의의 샘플, 예를 들어 혈액, 혈청, 림프, 뇨, 염증성 삼출물, 뇌척수액, 양수, 조직 추출물 또는 균질물과 유사한 생물학적 유체, 또는 계내(in situ) 검출을 위한 조직학적 샘플을 사용할 수 있다.
제약 약제
정의: 용어 "제약 제제"는 항체 또는 항체 유도체의 생물학적 활성이 명백하게 효과적일 수 있도록 하는 형태로 존재하며 제제가 투여되는 대상체에게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 약제를 지칭한다. "제약상 허용가능한" 부형제 (비히클, 첨가제)는 대상 포유동물에게 적합하게 투여되어, 사용되는 활성 성분의 유효 투여량을 제공할 수 있는 부형제이다.
"안정적" 제제는 보관시 내부의 항체 또는 항체 유도체가 본질적으로 그의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 보유하는 제제이다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술이 당업계에서 이용가능하며, 예를 들어 문헌 ([Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., Pubs. (1991)] 및 [Jones,.A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)])에 검토되어 있다. 안정성은 선택된 시간 동안 선택된 온도에서 측정할 수 있다. 바람직하게는, 제제는 실온 (약 30℃) 또는 40℃에서 1 개월 이상 동안 안정적이고/이거나 약 2℃ 내지 8℃에서 1년 이상 또는 2년 이상 동안 안정적이다. 추가로, 제제는 바람직하게는 제제의 동결 (예를 들어 -70℃) 및 해동 이후에 안정적이다.
항체 또는 항체 유도체는 색상 및/또는 투명도의 시각적 조사시 또는 UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 것으로 응집, 침전 및/또는 변성의 징후를 나타내지 않는다면 제약 제제 중에서 "그의 물리적 안정성을 유지한다."
항체 또는 항체 유도체는, 단백질이 하기 정의된 바와 같은 그의 생물학적 활성을 여전히 보유하는 것으로 고려되도록 주어진 시간에서 화학적으로 안정적이라면 제약 제제 중에서 "그의 화학적 안정성을 유지한다." 화학적 안정성은 화학적으로 변경된 단백질 형태를 검출 및 정량함으로써 평가할 수 있다. 화학적 변경은 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피, SDS-PAGE 및/또는 매트릭스-보조 레이저 탈거(desorption) 이온화/비행-시간(time-of-flight) 질량 분광법 (MALDI/TOP MS)을 이용해서 평가할 수 있는 크기 변형 (예를 들어 클리핑(clipping))을 포함할 수 있다. 다른 유형의 화학적 변경은 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피에 의해 평가될 수 있는 전하 변경 (예를 들어 탈아미드화(deamidation)의 결과로서 일어남)을 포함한다.
항체 또는 항체 유도체는 주어진 시점에서의 항체의 생물학적 활성이 예를 들어 항원 결합 검정에서 측정된 바로는 제약 제제가 제조된 시점에서 나타난 생물학적 활성의 약 10％ 이내 (검정 오차 이내)인 경우에 제약 제제 중에서 "그의 생물학적 활성을 보유한다." 항체에 대한 다른 "생물학적 활성" 검정은 본원의 이하에 상세히 설명되어 있다.
"등장성"이라는 것은 관심 제제가 인간 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 가짐을 의미한다. 등장성 제제는 일반적으로 약 250 내지 350 mOsm의 삼투압을 가질 것이다. 등장성은 예를 들어 증기압 또는 얼음-동결 유형의 삼투압계를 사용해서 측정할 수 있다.
"폴리올"은 다수의 히드록실기를 갖는 물질이며, 당 (환원 및 비-환원 당), 당 알콜 및 당 산을 포함한다. 본원에서 바람직한 폴리올은 약 600 kD (예를 들어 약 120 내지 약 400 kD의 범위) 미만의 분자량을 갖는다. "환원 당"은 금속 이온을 환원시키거나 단백질에서 리신 및 다른 아미노기와 공유적으로 반응할 수 있는 헤미아세탈기를 함유하는 헤미아세탈기를 함유하는 당이며, "비-환원 당"은 환원 당의 이러한 성질을 갖지 않는 당이다. 환원 당의 예로는 프룩토스, 만노스, 말토스, 락토스, 아라비노스, 자일로스, 리보스, 람노스, 갈락토스 및 글루코스가 있다. 비-환원 당으로는 수크로스, 트레할로스, 소르보스, 멜레지토스 및 라피노스를 들 수 있다. 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 쓰레이톨, 소르비톨 및 글리세롤은 당 알콜의 예이다. 당 산의 경우, 이들은 L-글루코네이트 및 그의 금속 염을 포함한다. 제제가 동결-해동에 대해 안정적인 것이 바람직한 경우, 폴리올은 그가 제제 중의 항체를 불안정화하도록 동결 온도 (예를 들어 -20℃)에서 결정화하지 않는 것이 바람직하다. 본원에서 비-환원 당, 예를 들면 수크로스 및 트레할로스가 바람직한 폴리올이며, 트레할로스는 수크로스에 비해 트레할로스의 용액 안정성이 더 우수하기 때문에 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같이, "완충제"는 그의 산-염기 컨쥬게이트(conjugate) 성분의 작용에 의해 pH에서의 변화에 저항하는 완충된 용액을 지칭한다. 본 발명의 완충제는 약 4.5 내지 약 6.0, 바람직하게는 약 4.8 내지 약 5.5 범위의 pH를 가지며, 가장 바람직하게는 약 5.0의 pH를 갖는다. pH를 상기 범위에서 조절하는 완충제의 예로는 아세테이트 (예를 들어 아세트산나트륨), 숙시네이트 (예를 들어 나트륨 숙시네이트), 글루코네이트, 히스티딘, 시트레이트 및 다른 유기산 완충제를 들 수 있다. 동결-해동 안정적 제제가 바람직한 경우, 완충제는 바람직하게는 포스페이트가 아니다.
약리학적 의미로, 본 발명의 상황에서, 항체 또는 항체 유도체의 "치료 유효량"은 항체 또는 항체 유도체가 치료상 효과적인 장애의 예방 또는 치료에 있어서 효과적인 양을 지칭한다. "질환/장애"는 항체 또는 항체 유도체를 사용한 치료가 유익한 임의의 상태이다. 이는 포유동물을 해당 장애에 걸리기 쉽게 만드는 병리 상태를 비롯한 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다.
"보존제"는 제재 내의 박테리아 작용을 본질적으로 감소시킴으로써 예를 들어 다수회-사용 제제의 제조를 용이하게 하는 제제에 포함될 수 있는 화합물이다. 잠재적인 보존제의 예로는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 및 벤즈에토늄 클로라이드를 들 수 있다. 다른 유형의 보존제로는 방향족 알콜, 예를 들면 페놀, 부틸 및 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예를 들면 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올, 및 m-크레졸을 들 수 있다. 본원에서 가장 바람직한 보존제는 벤질 알콜이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 항체 또는 항체 유도체 화합물을 하나 이상의 생리적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 제약 조성물은 예를 들어 물, 완충제 (예를 들어 중성 완충 염수 또는 포스페이트 완충 염수), 에탄올, 미네랄 오일, 식물성 오일, 디메틸술폭시드, 탄수화물 (예를 들어 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 보조제, 폴리펩티드 또는 아미노산, 예를 들면 글리신, 항산화제, 킬레이트화제, 예를 들면 EDTA 또는 글루타티온 및/또는 보존제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 다른 활성 성분이 본원에 제공된 제약 조성물 중에 포함될 수 있다 (꼭 필요하지는 않음).
담체는 환자에게 투여하기에 앞서 흔히 화합물의 안정성 또는 생체이용성을 조절할 목적으로 항체 또는 항체 유도체와 회합될 수 있는 물질이다. 이러한 제제 내에 사용하기 위한 담체는 일반적으로 생체적합성이며, 또한 생분해성일 수 있다. 담체로는 예를 들어 1가 또는 다가 분자, 예를 들면 혈청 알부민 (예를 들어 인간 또는 소), 난 알부민, 펩티드, 폴리리신 및 폴리사카라이드, 예를 들면 아미노덱스트란 및 폴리아미도아민을 들 수 있다. 또한 담체로는 예를 들어 폴리락테이트 폴리글리콜레이트, 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀롤로스 또는 덱스트란을 포함하는 비드 및 미세입자와 같은 고체 지지 물질을 들 수 있다. 담체는 공유 결합 (직접 공유 결합 또는 링커기를 통한 공유 결합), 비공유 상호작용 또는 혼합물을 비롯한 다양한 방식으로 화합물을 보유할 수 있다.
제약 조성물은 예를 들어 국부, 경구, 비측, 직장 또는 비경구 투여를 비롯한 임의의 적절한 투여 방식으로 제제화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 경구 사용에 적합한 형태의 조성물이 바람직하다. 이러한 형태로는 예를 들어 환제, 정제, 트로키제, 로젠지제, 수성 또는 유성 현탁액제, 분산성 분말 또는 과립제, 에멀젼제, 경질 또는 연질 캡슐제, 또는 시럽제 또는 엘릭서제를 들 수 있다. 또 다른 실시양태 내에서, 본원에 제공된 조성물은 동결건조물로서 제제화될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 비경구라는 용어는 피하, 피내, 혈관내 (예를 들어 정맥내), 근육내, 척추, 두개내, 경막내 및 복강내 주사, 및 임의의 유사한 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
경구용으로 의도된 조성물은 제약 조성물의 제조를 위한 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 구미가 당기고 맞 좋은 약제를 제공하기 위한 하나 이상의 물질, 예를 들면 감미제, 향미제, 착색제, 및 보존제를 함유할 수 있다. 정제는 정제의 제조에 적합한 생리적으로 허용가능한 부형제와의 혼합물로 활성 성분을 함유한다. 이러한 부형제로는 예를 들어 불활성 희석제 (예를 들어 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨), 과립화제 및 붕해제 (예를 들어 옥수수 전분 또는 알긴산), 결합제 (예를 들어 전분, 젤라틴 또는 아카시아) 및 윤활제 (예를 들어 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 탈크)를 들 수 있다. 정제는 코팅하지 않을 수 있거나 또는 공지된 기술에 의해 코팅해서 위장관에서 붕해 및 흡수를 지연시키고 이에 따라 더 오랜 기간 동안 지연된 작용을 제공할 수 있다. 예를 들어 시간 지연 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 사용할 수 있다.
경구용 제제는 또한 활성 성분이 불활성 고체 희석제 (예를 들어 탄산칼슘, 인간칼슘 또는 카올린)와 혼합된 경질 젤라틴 캡슐제 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질 (예를 들어 땅콩 오일, 액체 파라핀 또는 올리브 오일)과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐제로 제공될 수 있다. 수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와의 혼합물로 항체 또는 항체 유도체를 함유한다. 이러한 부형제로는 현탁화제 (예를 들어 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드로프로필메틸셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 고무 및 아카시아 검); 및 분산제 또는 습윤제 (예를 들어 천연 포스파티드, 예컨대 레시틴, 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합 생성물, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물, 예를 들면 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 에틸렌 옥시드와, 지방산과 헥시톨에서 유래된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 또는 에틸렌 옥시드와, 지방산 및 헥시톨 무수물에서 유래된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예를 들면 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)를 들 수 있다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예를 들어 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제, 및 하나 이상의 감미제, 예를 들면 수크로스 또는 사카린을 포함할 수 있다. 시럽 및 엘릭서제는 감미제, 예를 들면 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 또는 수크로스와 함께 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 또한 하나 이상의 점활제, 보존제, 향미제 및/또는 착색제를 포함할 수 있다.
유성 현탁액은 활성 성분을 식물성 오일 (예를 들어 아라키스 오일, 올리브 오일, 참기름, 또는 코코넛 오일) 또는 미네랄 오일, 예를 들면 액체 파라핀 중에 현탁시킴으로써 제제화할 수 있다. 유성 현탁액은 증점제, 예를 들면 밀랍, 경화 파라핀, 또는 세틸 알콜을 함유할 수 있다. 감미제, 예를 들면 상기 기재된 것들, 및/또는 향미제를 첨가해서 맛 좋은 경구용 약제를 제공할 수 있다. 이러한 현탁액은 아스코르브산과 같은 항산화제를 첨가해서 보존할 수 있다.
물을 첨가하는 수성 현탁액의 약제에 적합한 분산성 분말 및 과립은 활성 성분을 분산제 또는 습윤제, 현탁화제 및 하나 이상의 보존제와의 혼합물로 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제의 예로는 상기에서 이미 언급된 것들이 있다. 추가의 부형제, 예를 들어 감미제, 향미제 및 착색제가 또한 존재할 수 있다.
제약 조성물은 수중유 에멀젼 형태일 수도 있다. 유성 상은 식물성 오일 (예를 들어 올리브 오일 또는 아라키스 오일), 미네랄 오일 (예를 들어 액체 파라핀) 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제로는 천연 검 (예를 들어 아라비카 고무 또는 트라가칸트 고무), 천연 포스파티드 (예를 들어 대두, 레시틴, 및 에스테르 또는 지방산과 헥시톨에서 유래된 부분 에스테르), 무수물 (예를 들어 소르비탄 모노올레에이트), 및 지방산과 헥시톨에서 유래된 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물 (예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)를 들 수 있다. 에멀젼은 하나 이상의 감미제 및/또는 향미제를 포함할 수도 있다.
제약 조성물은 사용된 비히클 및 농도에 따라 조절제가 비히클 중에 현탁 또는 용해된 멸균의 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액으로 제조할 수 있다. 이러한 조성물은 적합한 분산제, 습윤제 및/또는 현탁화제, 예를 들면 상기 언급된 것들을 사용해서 공지된 기술에 따라 제제화할 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 1,3-부탄디올, 링거(Ringer)액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균의 고정 오일을 용매 또는 현탁화 매질로서 사용할 수 있다. 이러한 목적을 위해 합성 모노- 또는 디-글리세라이드를 비롯한 임의의 온화한 고정 오일을 사용할 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산을 주사가능한 조성물의 약제 중에 사용할 수 있으며, 보조제, 예를 들면 국소 마취제, 보존제 및/또는 완충제를 비히클 중에 용해시킬 수 있다.
제약 조성물은 지연 방출 제제 (즉, 투여 후 조절제의 느린 방출을 수행하는 캡슐제와 같은 제제)로서 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 일반적으로 잘 알려진 기술을 이용해서 제제화할 수 있으며, 예를 들어 경구, 직장 또는 피하 이식에 의해 또는 원하는 표적 부위에서의 이식에 의해 투여할 수 있다. 이러한 제제 중에 사용하기 위한 담체는 생체적합성이며 또한 생분해성일 수 있으며, 바람직하게는 제제는 상대적으로 일정한 수준의 조절제를 방출한다. 지연 방출 제제 중에 함유된 항체 또는 항체 유도체의 양은 예를 들어 이식 부위, 방출 속도 및 예상 방출 기간, 및 치료 또는 예방될 질환/장애의 특성에 따라 달라진다.
본원에 제공된 항체 또는 항체 유도체는 일반적으로, TWFα와 검출가능하게 결합하여 TNFα-관련 질환/장애를 예방 또는 억제하기에 충분한 체액 (예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, CSF, 활액, 림프, 세포내 간질 유체, 눈물 또는 뇨) 중의 농도를 달성하는 양으로 투여된다. 투여량은 본원에 기재된 인식가능한 환자 이점을 나타내는 경우 효과적인 것으로 고려된다. 바람직한 전신적 투여량은 하루에 체중 1 kg 당 약 0.1 mg 내지 약 140 mg 범위 (하루에 환자 당 약 0.5 mg 내지 약 7 g)이며, 경구 투여량은 일반적으로 정맥내 투여량보다 약 5 내지 20 배 더 높다. 단일 투여 형태를 제조하기 위한 담체 물질과 조합될 수 있는 항체 또는 항체 유도체의 양은 치료될 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 투여 단위 형태는 일반적으로 약 1 mg 내지 약 500 mg의 활성 성분을 함유할 것이다.
제약 조성물은 TNF-α로 지시된 항체 또는 항체 유도체에 반응성인 상태를 치료하기 위해 패키지화될 수 있다. 패키지화된 제약 조성물은 본원에 기재된 유효량의 하나 이상의 항체 또는 항체 유도체를 보유하는 용기 및 함유된 조성물이 환자에서의 투여 후에 하나의 항체 또는 항체 유도체에 반응성인 질환/장애를 치료하기 위해 사용되는 것임을 나타내는 지침 (예를 들어 표지화)을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 유도체는 또한 화학적으로 변형시킬 수 있다. 바람직한 변형 기는 중합체, 예를 들어 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알켄, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지형 또는 미분지형 폴리사카라이드이다. 이러한 이펙터 기는 생체내에서 항체의 반감기를 증가시킬 수 있다. 합성 중합체의 특정 예로는 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜)(PEG), 폴리(프로필렌글리콜), 폴리(비닐알콜) 또는 이들의 유도체를 들 수 있다. 특정 천연 중합체로는 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이들의 유도체를 들 수 있다. 중합체의 크기는 원하는 바와 같이 달라질 수 있지만, 일반적으로 500 Da 내지 50000 Da 범위의 평균 분자량을 가질 것이다. 항체가 조직을 투과하도록 디자인된 것인 국소 적용의 경우, 중합체의 바람직한 분자량은 약 5000 Da이다. 중합체 분자는 항체, 특히 제WO 0194585호에 기재된 바와 같은 공유 결합된 힌지 펩티드를 통해 Fab 단편 중쇄의 C-말단부에 부착될 수 있다. PEG 잔기의 부착에 대해서는, 문헌 (["Poly (ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnological and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York] 및 ["Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York])을 참조한다.
제제의 제조
상기 기재된 바와 같은 관심 항체 또는 항체 유도체의 제조 후, 이를 포함하는 제약 제제를 제조한다. 제제화될 항체는 사전 동결건조 처리를 하지 않았으며, 본원의 관심 제제는 수성 제제이다. 바람직하게는 제제 중의 항체 또는 항체 유도체는 항체 단편, 예를 들면 scFv이다. 제제 중에 존재하는 항체의 치료 유효량은 예를 들어 원하는 투여 부피 및 투여 방식(들)을 고려해서 결정한다. 제제 중의 전형적인 항체 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 바람직하게는 약 0.5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 가장 바람직하게는 약 2 mg/mL 내지 약 10 mg/mL이다.
pH 완충 용액 중에 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 수성 제제를 제조한다. 본 발명의 완충제는 약 4.5 내지 약 6.0, 바람직하게는 약 4.8 내지 약 5.5 범위의 pH를 가지며, 가장 바람직하게는 약 5.0의 pH를 갖는다. 상기 범위내에서 pH를 조절하는 완충제의 예로는 아세테이트 (예를 들어 아세트산나트륨), 숙시네이트 (예를 들면, 나트륨 숙시네이트), 글루코네이트, 히스티딘, 시트레이트 및 다른 유기산 완충제를 들 수 있다. 완충제 농도는, 예를 들어 제제의 원하는 등장성 및 완충제에 따라 달라지며 약 1 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게는 약 5 mM 내지 약 30 mM일 수 있다. 바람직한 완충제는 아세트산나트륨 (약 10 mM; pH 5.0)이다.
등장화제(tonicifier)로 작용하며 항체를 안정화시킬 수 있는 폴리올이 제제 중에 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 제제는 등장화 양의 염, 예를 들면 염화나트륨을 함유하지 않는데, 이는 상기 염이 항체 또는 항체 유도체의 침전을 유발할 수 있고/있거나 낮은 pH에서 산화를 일으킬 수 있기 때문이다. 바람직한 실시양태에서, 폴리올은 비-환원 당, 예를 들면 수크로스 또는 트레할로스이다. 폴리올은 제제의 원하는 등장성에 따라 달라질 수 있는 양으로 제제에 첨가된다. 바람직하게는 수성 제제는 등장성이며, 이 경우 제제 중 폴리올의 적합한 농도는 예를 들어 약 1％ 내지 약 15％ (w/v)의 범위, 바람직하게는 약 2％ 내지 약 10％ (w/v)의 범위이다. 그러나, 고등장성 또는 저등장성 제제가 적합할 수도 있다. 폴리올의 양은 폴리올의 분자량에 따라 변경될 수도 있다. 예를 들어 디사카라이드 (예를 들면 트레할로스)에 비해 적은 양의 모노사카라이드 (예를 들어 만니톨)를 첨가할 수 있다.
계면활성제가 또한 항체 또는 항체 유도체 제제에 첨가된다. 예시적인 계면활성제로는 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 (예를 들어 폴리소르베이트 20, 80 등) 또는 폴록사머 (예를 들어 폴록사머 188)를 들 수 있다. 첨가되는 계면활성제의 양은 계면활성제가 제제화된 항체/항체 유도체의 응집을 감소시키고/시키거나 제제 중의 미립자의 형성을 최소화하고/하거나 흡수를 감소시키는 양이다. 예를 들어 계면활성제는 제제 중에 약 0.001％ 내지 약 0.5％, 바람직하게는 약 0.005％ 내지 약 0.2％, 가장 바람직하게는 약 0.01％ 내지 약 0.1％의 양으로 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, 제제는 상기 언급된 물질 (즉, 항체 또는 항체 유도체, 완충제, 폴리올 및 계면활성제)을 함유하며, 하나 이상의 보존제, 예를 들면 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, 클로로부탄올 및 벤즈에토늄 Cl을 본질적으로 함유하지 않는다. 또다른 실시양태에서, 특히 제제가 다중투여 제제인 경우에 보존제가 제제 중에 포함될 수 있다. 보존제의 농도는 약 0.1％ 내지 약 2％, 가장 바람직하게는 약 0.5％ 내지 약 1％의 범위일 수 있다. 하나 이상의 다른 제약상 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제, 예를 들면 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 21st edition, Osol, A. Ed. (2006)]에 기재된 것들이 제제 중에 포함될 수 있으며, 단 이들은 제제의 원하는 특성에 불리한 영향을 주지 않는다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 추가의 완충제, 공용매, 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제, EDTA와 같은 킬레이트화제, 금속 복합체 (예를 들어 Zn-단백질 복합체), 생분해성 중합체, 예를 들면 폴리에스테르, 및/또는 염-형성 카운터이온, 예를 들면 나트륨이 포함된다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균된 것이어야 한다. 이는 제제의 제조 이전 또는 이후에 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
제제의 투여
제제는 항체를 사용한 치료를 요하는 포유동물, 바람직하게는 인간에게, 공지된 방법, 예를 들면 환괴(bolus)로서의 정맥내 투여에 따라 또는 소정의 시간 동안 지속적인 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 윤활막내, 경막내, 경구, 국부 또는 흡입 경로에 의해 투여된다. 바람직한 실시양태에서, 제제는 포유동물에게 정맥내 투여에 의해 투여된다. 이러한 목적을 위해, 제제는 예를 들어 주사기를 사용해서 또는 IV 라인을 통해 주사될 수 있다.
항체의 적절한 투여량 ("치료 유효량")은 예를 들어 치료될 증상, 증상의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상적 이력 및 항체에 대한 반응, 사용되는 항체의 유형 및 주치의의 고려에 따라 달라질 것이다. 항체 또는 항체 유도체는 한 시점 또는 일련의 치료 동안 환자에게 적합하게 투여되며, 진단 이후로부터 임의의 시점에서 환자에게 투여될 수 있다. 항체 또는 항체 유도체는 단일 치료로서 또는 당해 증상을 치료하는 데 있어서 유용한 다른 약물 또는 요법과 함께 투여될 수 있다.
일반적인 제안으로서, 투여되는 항체 또는 항체 유도체의 치료 유효량은 1회 이상의 투여에 의해 환자의 체중 kg 당 약 0.1 내지 약 50 mg의 범위이고, 사용되는 항체의 전형적인 범위는 예를 들어 매일 투여로서 약 0.3 내지 약 20 mg/kg이며, 더욱 바람직하게는 약 0.3 내지 약 15 mg/kg이다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술에 의해 쉽게 모니터링된다.
제조 용품
본 발명의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 제제를 보유하며 임의로 그의 사용 지침을 제공하는 용기를 포함하는 제조 용품이 제공된다. 적합한 용기로는 예를 들어 병, 바이알 및 주사기를 들 수 있다. 용기는 다양한 물질, 예를 들면 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 예시적인 용기는 3 내지 20 cc 1회용 유리 바이알이다. 별법으로, 다중투여 제제의 경우, 용기는 3 내지 100 cc 유리 바이알일 수 있다. 용기는 제제, 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 표지를 보유하며, 용기는 사용 지시사항을 나타낼 수 있다. 제조 용품은 상업적 및 소비자 견지에서 바람직한, 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 지침을 갖는 패키지 삽입물을 비롯한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 항체의 생성
본 발명의 항체 또는 항체 유도체는 재조합 유전학 분야의 통상의 기술을 이용해서 생성시킬 수 있다. 폴리펩티드의 서열을 알고있다면, 이를 코딩하는 cDNA는 유전자 합성 (www.genscript.com)에 의해 생성시킬 수 있다. 이들 cDNA를 적합한 벡터 플라스미드에 클로닝할 수 있다. VL 및/또는 VH 도메인을 코딩하는 DNA가 얻어진다면, 예를 들어 돌연변이유발 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 부위-지정 돌연변이유발을 수행하여 다양한 유도체를 얻을 수 있다. VL 및/또는 VH 서열에서 원하는 변경의 횟수에 따라 최적의 "출발" 서열을 선택할 수 있다. 바람직한 서열은 TB-A 서열 및 그의 유도체, 예를 들어 scFv 서열이거나, 또는 Fab 융합 펩티드 서열은 PCR 유도에 의한 돌연변이유발 및/또는 클로닝을 위한 주형으로서 선택할 수 있다.
당업자에게 잘 알려진 표준 클로닝 및 돌연변이유발 기술을 이용해서, Fab 단편의 제조를 위한 링커, 셔플링 도메인 또는 구축물 융합물을 부착할 수 있다. 본 발명의 일반적인 방법을 개시하는 기본 프로토콜은 문헌 ([Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook ＆ Russell, 3rd ed. 2001)] 및 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1999)])에 기재되어 있다.
scFv 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 Fab 단편의 경우 2개의 별도의 유전자 또는 VL-CK 및 VH-CH1 융합 (도 2)을 위한 2개의 유전자를 포함하는 비-시스트론성 오페론을 코딩하는 유전자를 보유하는 DNA 서열을 적합한 발현 벡터, 바람직하게는 유도가능한 프로모터를 갖는 벡터 내에 클로닝한다. 번역을 보장하는 적절한 리보솜 결합 부위 (도 2에서 RBS)가 각 유전자의 정면에 존재하도록 주의를 기울여야 한다. 본 발명의 항체는 개시된 서열로 이루어진 것이라기 보다는 개시된 서열을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어 클로닝 전략은 N-말단부에 하나 또는 몇몇의 추가의 잔기가 존재하는 항체로부터 구축물을 제조하는 것이 필요할 수 있다. 구체적으로, 출발 코돈에서 유래된 메티오닌이 최종 단백질에 존재할 수 있으며, 이 경우 최종 단백질은 번역 후에 절단되지 않는다. scFv 항체에 대한 구축물의 대부분은 N-말단부에서 추가의 알라닌을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 이. 콜라이에서 원형질막주변공간 발현을 위한 발현 벡터가 선택된다 [Krebber, 1997]. 상기 벡터는 절단가능한 신호 서열 정면에 프로모터를 포함한다. 이어서, 항체 펩티드에 대한 코딩 서열을 절단가능한 신호 서열에 인-프레임(in frame)으로 융합시킨다. 이로써, 발현된 폴리펩티드를 신호 서열이 절단되는 박테리아 원형질막주변공간으로 표적화할 수 있다. 이어서, 항체가 폴딩된다. Fab 단편의 경우, VL-CK 및 VH-CH1 융합 펩티드는 둘 다 수출(export) 신호에 연결되어야 한다. 펩티드가 원형질막주변공간에 도달한 다음, C-말단 시스테인에서 공유 S-S 결합이 형성된다. 항체의 세포질 발현이 바람직한 경우, 상기 항체는 일반적으로 세포내 단편 및 단백질로부터 쉽게 분리될 수 있는 봉입체(inclusion body)로부터 고수율로 얻어질 수 있다. 이 경우, 봉입체는 변성제, 예를 들면 구아리딘 하이드로클로라이드 (GndHCl) 중에서 가용화되며, 이어서 당업자에게 잘 알려진 재변성 절차에 의해 리폴딩시킨다.
scFv 또는 Fab 폴리펩티드를 발현시키는 플라스미드를, 적합한 숙주, 바람직하게는 박테리아, 효모 또는 포유동물 세포, 가장 바람직하게는 적합한 이. 콜라이 균주, 예를 들면 원형질막주변공간 발현을 위한 JM83 또는 봉입체에서의 발현을 위한 BL21에 도입한다. 폴리펩티드는 원형질막주변공간 또는 봉입체로부터 회수할 수 있으며, 표준 기술, 예를 들면 당업자에게 공지된 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 및/또는 겔 여과를 이용해서 정제할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 유도체는 시험관내의 수율, 가용성 및 안정성을 특징으로 할 수 있다. TNFα, 바람직하게는 인간 TNFα7에 대한 결합 능력은 시험관내에서 ELISA 또는 표면 플라즈몬 공명 (BIACore)에 의해 제WO 9729131호에 기재된 바와 같은 재조합 인간 TNFα를 사용해서 시험할 수 있으며, 또한 후자의 방법으로 koff 속도 상수를 결정할 수 있으며, 이는 바람직하게는 10-3s-1 미만이어야 한다. Kd 값은 10 nM 이하인 것이 바람직하다.
본 발명의 항체 또는 항체 유도체의 생체내 중화 활성은 L929 세포독성 검정으로 예측될 수 있다. 인간 재조합 TNFα는 배양된 마우스 L929 섬유아세포에 농도-의존적 방식으로 세포독성 영향을 미친다. 이 TNFα-유도된 세포독성은 TNFα 중화 항체에 의해 억제될 수 있다 [Doering, 1994]. 절반-최대 억제제 농도에 상응하는 바람직한 IC50 값은 ≤ 100 ng ml-1이다.
TNFα가 각종 인간 질환, 특히 염증성 장애, 면역 및 면역-조절 장애, 패혈성 유발 감염, 내독소 및 심혈관 쇽, 신경변성 질환, 및 악성 질환에서 입증된 병태생리적 역할을 가진다. TNFα가 꾸준히 상승하는 수의 추가 인간 질환에서 질환-관련 역할을 수행하는 것으로 추측되기 때문에, 또한 미래에 TNFα 억제제에 대한 임상적 사용 스펙트럼을 확실하게 완전히 나타내는 표시의 포괄적 목록을 나타내기는 어렵다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 항체 유도체는 완전하거나 또는 배타적인 목록으로서 고려되지 않는 하기 카탈로그에 열거되는 질환의 치료에 사용될 수 있다. 구체적으로 언급되지는 않지만, TNFα에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 영향 받는 다른 질환도 포함된다.
자가면역 또는 만성 염증:
일반적으로 염증의 만성 및/또는 자가면역 상태, 일반적으로 면역 매개 염증성 장애, 염증성 CNS 질환, 눈, 관절, 피부, 점막, 중추 신경계, 위장관, 요로 또는 폐에 영향을 주는 염증성 질환, 일반적으로 포도막염 상태, 망막염, HLA-B27+ 포도막염, 베체트병, 건성안 증후군, 녹내장, 쇼그렌 증후군, 진성 당뇨병 (당뇨병성 신경병증 포함), 인슐린 내성, 일반적으로 관절염 상태, 류마티스성 관절염, 골관절염, 반응성 관절염 및 라이터 증후군, 소아 관절염, 강직성 척추염, 다발성 경화증, 길랑-바레 증후군, 중증 근무력증, 근위축성 측삭 경화증, 사코이드증, 사구체신염, 만성 신장 질환, 방광염, 건선 (건선성 관절염 포함), 화농성 한선염, 지방층염, 괴저 농피증, SAPHO 증후군 (윤활막염, 여드름, 농포증, 골과다형성증 및 골염), 여드름, 스위트 증후군, 천포창, 크론병 (장외 증상 포함), 궤양성 대장염, 기관지 천식, 과민성 폐렴, 일반 알레르기, 알레르기 비염, 알레르기 동염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 섬유증, 베게너 육아종증, 가와사끼 증후군, 거세포성 동맥염, 처커-스트라우스 혈관염, 결절성 다발동맥염, 화상, 이식편 대 숙주 질환, 숙주 대 이식편 반응, 기관 또는 골수-이식 후 거부 반응, 일반적으로 혈관염의 전신 및 국소 상태, 전신적 및 원판상 루푸스 에리테마도데스, 다발성근염 및 피부근염, 경피증, 전자간증, 급성 및 만성 췌장염, 바이러스 간염, 알콜성 간염.
급성 염증 및/또는 수술후 또는 외상후 염증 및 통증의 예방:
일반적으로 수술후 염증 예방, 안과 수술 (예를 들어, 백내장 (안과 렌즈 교체) 또는 녹내장 수술), 관절 수술 (관절경 수술 포함), 관절-관련 구조 (예를 들어, 인대)에서의 수술, 구강 및/또는 치아 수술, 최소 침습 심혈관 과정 (예를 들어, PTCA, 죽종절제, 스텐트 설치), 복강경 및/또는 내시경 동맥내 및 부인과 과정, 내시경 비뇨기과 과정 (예를 들어, 전립선 수술, 요관경시술, 방광경검사, 간질 방광염), 일반적으로 수술기 주위 염증 (예방).
신경 및 신경변성 질환:
알쯔하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 벨 마비, 크로이츠펠트-야콥병.
암:
암-관련 골용해, 암-관련 염증, 암-관련 통증, 암-관련 악액질, 골 전이.
통증:
통증의 급성 및 만성 형태, (이들이 TNFα의 중심 또는 말부 영향에 의해 발생되고 이들이 통증의 염증성, 침해수용 또는 신경병증 형태로 분류되든지 상관없음), 좌골신경통, 요통, 손목굴 증후군, 복합 국소 통증 증후군 (CRPS), 통풍, 포진후 신경통, 섬유근육통, 국소 통증 상태, 전이 종양에 의한 만성 통증 증후군, 월경통.
감염:
박테리아, 바이러스 또는 진균 패혈증, 결핵, AIDS.
심혈관 질환:
아테롬성경화증, 관상 동맥 질환, 고혈압, 고지혈증, 심장 기능부족 및 만성 심부전.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 골관절염 또는 포도막염 또는 염증성 장 질환의 치료는 본 발명의 항체, 또는 항체 유도체로 달성될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항체 유도체 분자를 제약상 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
제약 조성물은 바람직하게는 치료 유효량의 본 발명의 항체, 즉 TNFα-관련 질환 또는 상태의 치료, 완화 또는 예방하거나, 또는 검출가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내는 데 필요한 양의 상기 항체를 포함하여야 한다. 치료 효과적 투여량은 세포 배양 검정 또는 동물 모델, 일반적으로 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 예측될 수 있다. 동물 모델은 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하기 위해 사용될 수도 있다. 본 발명의 항체 또는 항체 유도체의 효과를 관측하기에 적합한 동물 모델은 급성 단관절염의 경우 래트 모델이다 [Bolon et al. (2004), Vet. Pathol.41: 235-243]. 인간 TNFα는 래트의 무릎 관절 내로 관절내 주사하여, 급성 자기-제한 단관절염을 주사된 관절에서 유도한다. 항-TNFα 항체 (유도체)의 생활성은 TNFα-유도된 무릎 관절 종창의 감소 및/또는 염증의 조직학적 매개변수의 감소에 의해 정량될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 유도체가 고도로 가용성이기 때문에, 높은 항체 농도 (60 mg ml-1 이상)는 작은 사용 부피의 사용을 가능하게 한다.
본 발명의 항체 또는 항체 유도체는 인간 또는 동물 신체에 존재하는 생물학적 활성 TNFα의 수준을 감소시키는 것이 바람직한 임의의 요법에서 사용될 수 있다. TNFα는 체내에서 순환되거나 또는 신체내 특정 부위에 국소화되어 바람직하지 않게 높은 수준으로 존재할 수 있다. 본 발명은 일반적으로 하기 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 전신 뿐만 아니라 국소 사용 방식을 제공한다: 경구 사용, 정맥내, 피하, 근내, 관절내, 초자체내, 피내, 또는 실질내 주사, 에어로졸 흡입, 피부, 점막 또는 눈에 대한 국부 사용, 이식가능 미니펌프를 통한 전신적 또는 국소 방출 또는 지연 방출을 허용하는 이식가능 제제/장치를 통한 국소 방출, 장막 표면에 대한 국부 사용, 경막내 또는 심실내 사용, 위장관의 선택된 부위에서 조절되는 루멘내 방출을 허용하는 제제로의 경구 사용, 적절한 제제/장치 (예를 들어, 스텐트)로부터의 국소화 관내(intravasal) 방출, 방광으로의 국소 전달, (예를 들어, 담도, 요관으로의) 국소화된 루멘내 방출, 또는 내시경 장치를 통한 국소 전달, 또는 콘택트 렌즈(콘택트)로부터의 방출. 바람직한 사용은 국소 사용, 예컨대 관절내 주사 또는 국부 사용, 예를 들어 안구 내로의 사용이다. 바람직한 사용 모두의 경우에, 본 발명의 항체는 용액 중에 존재하는 것이 요구된다.
본 발명은 또한 TNFα-관련 질환 치료용 의약을 제조하기 위한 본 발명의 항체 또는 항체 유도체의 용도를 밝힌다. 이 경우에, 항체 또는 항체 유도체는 치료 조성물에 포함된다. 상기 조성물은 의약, 가장 바람직하게는 TNFα-관련 질환의 예방 또는 요법용 의약으로서 사용된다.
또다른 측면에서 ,본 발명의 scFv 항체는 유전자 요법, 특히 입양 세포 유전자 요법에 사용된다. 자가면역 장애는 자가-조직에 대한 부적절한 면역 반응에서 나타난다. 항원-특이적 CD4+ T 세포 및 항원-존재 수상 세포 (DC)는 자가-면역 질환의 병리에서 중요한 매개자이고, 따라서 입양 세포 유전자 요법인 치료 유전자 전달에 대한 체외 접근법에 대한 이상적 후보이다. 레트로바이러스 도입 세포 및 루시퍼라제 생물발광을 사용하여, 문헌 [Tarner et al., 2003, Ann. N. Y. Acad. Sci. 998:512-519]은 1차 T 세포, T 세포 하이브리도마 및 DC가 신속하고 우선적으로 다발성 경화증, 관절염, 및 당뇨병의 동물 모델에서 염증 부위로 돌아간다는 것을 입증하고 있다. 각종 "조절 단백질", 예컨대 인터루킨 및 항-TNF scFv의 발현을 유도하는 레트로바이러스 벡터로 도입된 이들 세포는 이들 면역조절 단백질을 염증 병소에 전달하며, 실험적 자가면역 뇌염, 콜라겐-유도된 관절염, 및 비-비만 당뇨성 마우스에서 요법을 제공한다. 본 발명의 항체 또는 항체 유도체의 안정적이고 가용성인 프레임워크는 예를 들어 항체 또는 항체 유도체가 적합한 레트로바이러스 벡터에 의해 갖는 트랜스진으로부터 발현되는 경우에 항원의 세포내-전달에 특히 적합하다. 입양 세포 유전자 요법은 국소화된 발현 및 항-TNFα scFv의 분비를 유도한다. 문헌 [Smith et al. (2003)]은 TNFα 중화 모노클로날 항체에서 유래된 scFv가 (i) TNFα를 시험관내에서 중화시킬 수 있고, (ii) 전신이 아닌, 관절에 국소적으로 콜라겐-유도된 관절염을 앓고 있는 마우스에서 사이토카인 발현 패턴을 변화시킨다는 것을 입증하고 있다. 달리, 항-TNFα scFv 항체의 지속적인 발현을 허용하는 적합한 벡터 (예를 들어, 바이러스)의 직접 전신 또는 국소 주사는 또다른 가능한 유전자 요법 접근법으로서 고려된다.
본 발명의 서열은 하기 것이다:
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009
Figure pat00010
본 발명은 하기 실시예를 참조로 더욱 충분히 이해될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다. 모든 인용 문헌 및 특허는 본원에 참고로 인용된다.
<실시예>
실험 1: scFv 항체의 구축
인간화 항-인간 TNFα 항체 또는 항체 유도체, 예컨대 단일-쇄 단편 (scFv) 또는 Fab 단편의 생산의 출발 물질은 뮤린 모노클로날 항체 Di62이었다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 서열은 문헌 [Doering et al., 1994, Mol . Immunol . 31:1059-1067]에 개시되어 있다. 이 모노클로날 항체의 성질은 또한 동일한 공개 문헌에서 논의되고 있다. 간략하게는, Di62는 인간 TNFα에 농도-의존적 방식으로 특이적으로 결합한다. Di62는 높은 친화도 항체 (Kd = 0.4 nM)이고, 그의 수용체에 대한 TNFα 결합의 결합을 차단할 수 있다. 또한, Di62는 인간 TNFα-유도된 세포독성을 마우스 L929 세포에서 억제한다.
그의 공개 서열 Di62에 기초하여 배향 VL-링커-VH으로의 단일-쇄 항체 유도체 (scFv)의 형태로 구축하였으며, 여기서 링커 서열은 4개 글리신 및 1개 세린 잔기의 4 반복 (Gly4Ser)4으로 이루어진다. 여기서, 이 scFv는 서열 16의 VL 및 서열 17의 VH를 갖는 TB-wt로서 지칭된다.
a) 잠재적 면역원성을 최소화하기 위해 인간 서열에 더욱 유사하게 하고, b) 안정적이고 가용성이 되도록 할 목적으로 이 항체 유도체를 인간화하기 위해, TB-wt CDR 서열을 안정적이고 가용성인 인간 프레임워크 상에 이식시켰다 [Auf der Maur et al. (2001), FEBS Lett. 508:407-412]; [Auf der Maur et al. (2004), Methods 34:215-224]. 인간 VL-카파 아군 I 및 VH 아군 I가 가장 가까운 인간 서브패밀리로서 동정되었다. 적절한 어셉터 프레임워크는 유리한 생화학적 및 생체물리학적 성질, 예컨대 안정성, 가용성, 및 발현 성질을 위해 선택된 인간 VL 및 VH 서열의 풀로부터 선별하였다 [Auf der Maur, et al. (2001), FEBS Lett. 508:407-412]; [Auf der Maur, et al. (2004), Methods 34:215-224]. 이들 항체 프레임워크의 단리 및 성질은 제WO 03097697호/유럽 제1506236호에 기재되어 있다. 이 풀로부터, 비정의된 항원 결합 성질을 갖는 단일-쇄 항체 프레임워크는 적합한 어셉터로서 동정되었다. 이 어셉터는 인간 VL-카파 I 도메인 (서열 14)과 인간 VHI 도메인 (서열 15)로 구성되어 있다. 여기서, 이 어셉터 프레임워크는 FW2.3로서 지칭된다. 81 VL 프레임워크 잔기 중에, TB-wt 및 FW2.3은 55개 동일한 아미노산 잔기를 공유하며, 이는 67％ 동일성이다. 87개 VH 프레임워크 잔기 중에, TB-wt 및 FW2.3은 55개 동일한 동일한 잔기를 가지며, 이는 63％ 동일성에 상응한다. 이들 단일-쇄 항체 유도체 모두는 VH-CDR3 (FW2.3에서 더 길다)과는 달리 동일한 CDR 길이를 가진다. CDR 잔기 내의 아미노산 조성물은 모든 scFv에 대해 상이하다. 항체 가변 도메인의 각종 인간화 방법은 문헌 [Riechmann et al. (1998), Nature 332:323-327]; [Padlan, E. A. (1991). Mol. Immunol. 28:489-498]; [Roguska et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973]; [Gonzales et al. (2005), Tumor Biol. 26:31-43]; [Ewert, S., et al. (2004), Methods 34:184-199]에 기재되어 있다. 최소 접근법, 즉 TB-wt로부터 FW2.3 상으로의 모든 마우스 CDR 루프의 보존적 전달을 먼저 수행하였다. 생성된 scFv는 TB-B로서 지칭하고, 서열 3의 VL 서열 및 서열 4의 VH 서열을 가진다. TB-wt 중의 CDR-루프는 카바트(Kabat) 넘버링 방식 [Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed , Natl. Inst. Health, Bethesda, MD]에 따라 정의되고, 하기 잔기 (도 1 참조)를 한정한다:
VL
CDR1: L24-L34 (동일한 카바트 넘버링)
CDR2: L50-L56 (동일한 카바트 넘버링)
CDR3: L89-L97 (동일한 카바트 넘버링)
VH
CDR1: H31-H35 (동일한 카바트 넘버링)
CDR2: H50-H66 (카바트 넘버링 H50-H65)
CDR3: H99-H106 (카바트 넘버링 H95-H102).
이 항체는 TNFα에 유효하게 결합할 수 없었다 (도 4A). 다음 단계는 이들 성분으로부터의 잔기 또는 잔기들이 생성된 인간화 항체의 성질을 최적화하기 위해 치환되어야 하는지를 측정한다.
외인성 아미노산 서열의 도입이 인간에서 항체 또는 항체 유도체의 면역원성의 위험을 증가시키므로 [Gonzales et al. (2005), Tumor Biol. 26:31-43] 다른 아미노산에 의한 인간 아미노산 잔기의 치환이 최소화되어야 하기 때문에, 몇몇 변이체가 구축되었다. TB-B L46 (VL 서열 11; VH 서열 4)으로서 본원에서 지칭하는 상기 변이체 중 하나는 면역원성의 위험을 최소화하지만 여전히 충분한 결합 활성을 나타내기 위한 목적으로 구축하였다. 이 변이체는 TB-B를 기초로 하고, VL 중의 위치 46에 1개 단일 아미노산 변화를 함유한다 (즉, R→L). 이 아미노산은 경쇄의 상부 코어 내에 위치하고, 이량체 경계면에 가담한다. 이는 L-CDR1의 형태를 정의하는 데 관여되고, VH/VL 패킹에 영향을 미친다. 루이신 잔기가 이 특정 위치에서 선호되는 것으로 보고되었다 (PCT/US03/19333). TB-B와는 달리, scFv TB-B L46은 일부 TNFα-특이적 결합을 보유한다 (도 4A; Kd
Figure pat00011
100 nM).
추가로 TNFα-결합 활성을 개선하기 위해, 하나 이상의 추가 교환이 하나 이상의 VL 잔기 4, 46, 65, 67, 70, 및/또는 VH 잔기 28, 43, 68, 70, 71, 72, 73, 76, 77에서 만들어졌다. 여기서, 모든 위치에 교환을 갖는 변이체는 TB-A (VL 서열 1; VH 서열 2)로서 지칭한다.
추가로, 본 발명의 특정 항-TNFα 항체와 관련하여, L-CDR1 및 L-CDR2에서 유래된 펩티드를 갖는 경쟁 검정은 모든 CDR 루프가 항원에 대한 scFv의 결합에 중요함을 나타냈다 [Doering et al. (1994), Mol. Immunol. 31:1059-1067].
결합을 유지하기 위해 요구되는 비-인간 잔기의 수를 최소화하고 생체물리학적 성질 (안정성 및 가용성)을 최적화하기 위한 목적인 추가 실험에서, 전체 돌연변이유발 및 도메인 셔플링을 사용하여 마우스 및 인간화 VL 및 VH 도메인 간의 기능적 차이를 밝힐 수 있었다.
2개 변이체를 도메인 셔플링으로 수득하였다. 제1 변이체는 TB-B로부터의 VH 도메인을 갖는 글리신 세린 링커 (서열 10)를 통해 연결된 TB-A로부터의 VL 도메인으로 이루어져 TB-AB (서열 12)를 생성하였다. 제2 변이체인 TB-BA는 제1 변이체의 역, 즉 TB-B로부터의 VL 도메인과 TB-A의 VH 도메인의 조합이다 (서열 13).
추가 변이체를 TB-A의 전체 돌연변이유발에 의해 생산하였다. 도 1은 TB-A 및 TB-B의 VL 및 VH 서열의 서열 비교를 나타낸다. 총 14개 프레임워크 잔기가 TB-A와 TB-B 간에 상이하다 (별표(*)). 이들 중 단지 4개인 VL 잔기 4 및 70, 및 VH 잔기 28, 71, 및 73는 크기 및 특성에서 유의하지 않은 차이만을 나타내기 때문에 이 지점에서 돌연변이유발이 고려되지는 않았다. 하기 프레임워크 위치는 TB-B로부터 상응하는 아미노산으로 교체되었다. TB-A의 이들 단일 또는 이중 돌연변이체는 하기와 같다:
TB-A H43 K->Q 인터페이스 (서열 18)
TB-A H68 F->V 외부 루프 VH (서열 19)
TB-A H70/72 F->L,L->R 외부 루프 VH (서열 20)
TB-A H76/77 A->I,S->G 외부 루프 VH (서열 21)
TB-A L46 L->R 인터페이스 (서열 22)
TB-A L65 R->S 외부 루프 VL (서열 23)
TB-A L67 Y->S 외부 루프 VL (서열 24)
다수의 인자는 항체 또는 항체 유도체의 면역원성에 영향을 줄 수 있다 [Gonzales et al. (2005), Tumor Biol. 26:31-43]. 인간화 TB-A scFv의 가변 영역의 비-인간 함유를 추가로 감소시키기 위해, VL의 뮤린 CDR2 및 CDR3 루프 및 VH의 뮤린 CDR2 루프는 FW2.3으로부터의 상응하는 인간 CDR 루프와 교환하였다. 생성된 구축물은 본원에서 TB_L2 (서열 7), TB_L3 (서열 8), 및 TB_H2 (서열 9)로서 각각 지칭된다.
모노클로날 항체 Di62의 뮤린 단일-쇄 형태 및 2개의 인간화 형태 TB-B 및 TB-A를 코딩하는 cDNA를 유전자 합성에 의해 생산하였다 (www.genscript.com). 다른 변이체 (TB-B L46, TB-A H43, TB-A H67, TB-A H69/71, TB-A H75/76, TB-A L46, TB-A L65, TB-A L67, TB-A V83F, TB-A V83A, TB-A D66G) 중의 모든 점 돌연변이는 표준 클로닝 과정 후에 PCR-운행 부위-지정 돌연변이유발에 의해 도입되었다. FW2.3으로부터의 인간 CDR 루프과의 TB-A의 뮤린 CDR 루프의 교환은 PCR 및 당업계클로닝 과정으로 달성하였다. 서열 28, 서열 29, 및 서열 30로서 개시된, 모든 VH TB-A 변이를 코딩하는 cDNA는 완전 유전자 합성에서 의해 실현하였다.
일부 추가로 바람직한 TB-A는 서열 31 내지 서열 38로 개시되어 있다. 이들 항체는 하기 표 1에 나타내는 바와 같이 특히 안정적이고 가용성인 것으로 밝혀졌다.
모든 scFv 단편는 이. 콜라이에서의 세포질 생산을 위한 발현 벡터 내로 클로닝하였다 [Krebber et al. (1997), J. Immunol. Methods 201:35-55].
상기 기재된 단일-쇄 항체 유도체 (scFv) 외에, 상응하는 Fab 단편은 하기와 같이 생산하였다. 선택된 경쇄 가변 도메인 (VL)은 인간 Ig 카파 쇄의 불변 영역에 융합되지만, 적합한 중쇄 가변 도메인 (VH)은 인간 IgG의 제1 (N-말단) 불변 도메인 (CH1)에 융합되었다. 인간 불변 도메인 모두는 인간 비장 cDNA 라이브러리로부터 PCR하여 증폭하고, 그 결과 cκ-에 대해 서열 14 및 CH1에 대해 서열 15를 생산하였다.
실험 2: 인간화 scFv 또는 Fab 항체의 발현, 생산 및 안정성
TB-wt, 그의 인간화 유도체, 또는 Fab 단편을 코딩하는 플라스미드를 세포질 발현에 적합한 이. 콜라이 계통 (예를 들어, JM83) 내로 도입하였다. scFv 변이체는 또한 봉입체로서 예를 들어 BL21 이. 콜라이 계통에서 발현되었다. 기능적 단일-쇄 항체는 봉입체의 리폴딩 및 예를 들어 겔 여과에 의한 후속적 정제에 의해 수득하였다.
scFv의 세포질 발현시 발현 수율의 범위는 통상적 진탕 플라스크를 사용하는 표준 실험실 배양 상태 (dYT 배지, 30 ℃에서 대략 3시간 유도 시간, 200 rpm에서 진탕) 하에 배양물 1 리터당 0.5 mg 내지 12 mg 이하이었다. 일반적으로, 본 발명자들은 안정성 및 가용성에 대해 선택된 프레임워크의 본 발명자들의 이전 분석으로부터 예상된 바와 같이 [Auf der Maur, et al. (2004), Methods 34:215-224] 인간화 유도체의 서열이 어셉터 프레임워크의 서열 (FW2.3)에 가까울수록 박테리아에서 발현시에 얻어지는 수율이 높음을 관찰하였다. 예를 들어, TB-B의 발현으로부터 얻은 수율은 TB-A의 발현으로부터 얻은 것보다 더욱 양호하다. 이들 발견에 따르면, TB-A에 존재하는 상이한 아미노산 잔기의 수를 감소시키는 것은 발현 수율에 대해 양성적 영향을 가졌다 (도 3A).
본 발명의 항체 또는 항체 유도체의 또다른 중요한 특성은 그의 가용성이다. 도 3B는 인산염 완충 염수 중의 가용성 면에서 공여체 프레임워크 (TB-wt)보다 프레임워크 TB-A가 더 우수함을 나타낸다. 분석 겔 여과에서, TB-A는 단량체 상태로 (70 ml에서 피크) 우세하게 이동하지만, TB-wt는 응집체를 형성하는 강한 경향을 나타낸다 (50 ml에서 피크). 그 외에, TB-A 및 그의 특정 유도체의 최대 가용성은 PEG 침전에 의해 평가하였다 [Athat DH. et al. JBC. 1981, 256;23. 12108-12117]. 간략하게는, 시험 단백질의 겉보기 가용도를 폴리에틸렌 글리콜 3000 (PEG3000)의 존재하에 측정하였다. 가용도 곡선은 원심분리된 단백질-PEG300 혼합물의 상등액 중의 단백질 농도를 측정함으로써 작성하였다. 모든 곡선은 PEG3000 농도 (％, w/v)에 대해 log S (mg/mL)의 선형 의존성을 나타냈다. 시험 단백질의 최대 가용성 (Smax)은 0％ PEG에 대한 선형 회귀의 외삽에 의해 측정하였다 (표 1). TB-A의 경우에 Smax가 약 70 mg/mL로 계산되었다. 모든 시험 단백질은 특별히 양호한 가용성을 나타냈다. 제2 접근접에서는, 자가-상호작용-크로마토그래피 (SIC)로 칭해지는 방법을 적용하여 PBS (50 mM 인산염 pH 6.5, 150 mM NaCl) 중에 농도 1 mg/mL에서 TB-A (서열 40), TB-A 링커_G2R H_F68L (서열 33), TB-A H_K43R/F68I (서열 34) 및 TB-A H_F68L (서열 35)의 분자간 인력/반발력을 평가하였다. 이 방법에서, 목적 단백질은 다공성 정지상 상으로 고정되고, 칼럼 내로 패킹된다. 유리 (이동상) 및 고정 단백질 간의 상호작용은 보유 부피에서 이동으로서 탐지된다. 분자간 인력/반발력의 척도인 단백질 삼투 제2 바이러스 입자 계수 B22는 문헌 [Tessier, PM et al.. Biophys. J. 2002, 82: 1620-1632]에 따라 계산하였다 (표 1). B22가 더욱 양수인 경우에 시험 단백질의 분자간 인력은 더 낮고, 따라서 그의 가용성은 더 높다. 시험 단백질 서열의 높은 유사성 때문에 상이한 단백질의 B22 값을 서로 직접적으로 비교할 수 있을 것으로 추정되었다.
Figure pat00012
본 발명의 항체 또는 항체 유도체의 또다른 관련 특징은 그의 높은 안정성이다. TB-A, TB-A H_M48L/F68I (서열 31), TB-A 링커_G2R H_F68L (서열 33), TB-A H_K43R/F68I (서열 34) 및 TB-A H_F68L (서열 35)의 단백질 안정성은 218 및 292 nm에서 모두 원형 광이색성 및 광 산란에 의한 언폴딩(unfolding)의 개시에 대한 온도를 측정함으로써 평가하였다 (표 2). 이 실험에서, TB-A는 53 ℃의 온도에서 비-폴딩을 시작하지만, 그의 유도체 TB-A H_M48L/F68I (서열 31), TB-A 링커_G2R H_F68L (서열 33), TB-A H_K43R/F68I (서열 34) 및 TB-A H_F68L (서열 35)은 상승된 열 안정성 (56 및 58 ℃)을 나타냈다. 모든 시험 단백질은 비가역 변성을 나타내고, 언폴딩시에 침전되며, 이는 융점의 측정을 불가능하게 한다. 비가역 프로세스에서 전이의 중간점을 측정하기 위해, 언폴딩은 구아니딘 히드로클로라이드 (GdnHCl)로 유도되어 용액에서 언폴딩된 단백질을 유지하였다. 이 접근법에서, 형광 방출 최고를 형광측정법에 의해 측정하여 언폴딩을 수행하였다. 이 설비에서, TB-A는 또한 2.07 M GdnHCl에서 전이의 중간점으로 양호한 안정성을 나타냈다. 열 언폴딩으로부터의 결과와 일치하게, 유도체 TB-A 링커_G2R H_F68L (서열 33) 및 TB-A H_K43R/F68I (서열 34)는 각각 전이의 더 높은 중간점인 2.33 및 2.3 M GdnHCl로 나타나는 바와 같이 증가된 안정성을 나타냈다.
Figure pat00013
인간 혈청, 인간 뇨, 돼지 초자체 유체 및 돼지 전방액(anterior chamber fluid)에서의 TB-A의 안정성은 3일 동안 37 ℃에서 인큐베이션 후에 양성 대조군으로서의 각 체액 또는 검정 완충제 (TBSTM) 중에서 TB-A의 TNFα 결합 활성을 측정함으로써 검정하였다. TB-A를 체액에서 최종 농도 10 μM로 희석하였다. 인큐베이션 기간 후에, 샘플의 희석 시리즈는 TB-A의 결합 상수 Kd를 측정하기 위해 ELISA에 의해 검정하였다 (도 11). 체액 샘플을 양성 대조군 TBSTM 샘플과 비교하는 경우에, 더 높은 농도로의 Kd의 이동은 인큐베이션 기간 동안의 활성 단백질의 감소를 나타낼 것이다. 그러나, 본 발명자들의 실험에서, 이러한 이동은 검출가능하지 않았으며, 이는 항체의 높은 안정성 때문에 완전 활성 TB-A의 양이 모든 체액 검정에서 일정하게 잔존함을 나타낸다.
실험 3: 인간화 항체 유도체의 결합 특성
모든 인간화 scFv 변이체의 결합 성질은 재조합 인간 TNFα에 대한 ELISA로 시험하였다. 모든 변이체에 대한 해리 상수 (Kd)는 0.8 내지 10,00O nM 이상의 범위 내에 있다. 인간 어셉터 프레임워크에 대한 상동성의 등급과 각 결합제의 친화도 간의 역 상관관계가 있음을 나타내는 것으로 여겨진다 (도 4A). 그럼에도, TB-B 서열에 대한 돌연변이를 함유한 일부 TB-A 변이체는 TB-A에 필적하는 인간 TNFα에 대한 친화도 수준을 나타낸다. 도 4B는 ELISA로 비교시에 TB-A와 유사한 친화성을 나타내는 TB-A의 2개의 발현 수율-개선 유도체 (도 3A와 비교)를 나타낸다.
TB-A는 발현 수율과 친화도의 겉보기 거래 간의 양호한 절충안을 나타낸다. 친화도 면에서, TB-A의 단일-쇄 및 Fab 단편 포맷 간의 유의한 차이는 검출가능하지 않았다 (데이타를 나타내지 않음).
TNFα에 대한 친화도 및 결합 역학은 또한 표면 플라즈몬 공명 (BIACore)에 의해 TB-A에 대해 측정하였으며, 그 결과는 해리 상수가 Kd = 0.8 nM이고, 해리율(off rate)은 koff = 4.4 x 10-4s-1이고, 결합률(on rate)은 kon = 5 x 105s-1M-1이다.
실험 4: L929 세포독성 검정
TNFα를 생체내에서 중화시키는 데 있어서의 항체 또는 항체 유도체의 기능은 배양된 마우스 L929 섬유아세포 또는 별법으로 인간 KYM-1 골수 육종증 세포에 대한 TNFα의 세포독성의 억제를 측정함으로써 시험할 수 있다 (표 3). Di62의 인간화 scFv 유도체는 도 5B에 나타나는 바와 같이 L929 검정에서 상이한 효능을 나타낸다. 일부 scFv 유도체는 IC50 (50％ 억제를 달성하는 억제 농도) 값의 범위가 5 ng/ml이지만, 다른 것은 L929 검정에 영향을 주지 않았다. L929 검정으로부터의 ELISA 데이타 및 결과는 항상 상관관계가 있지는 않다. 그러나, KYM-1 데이타 및 L929 결과는 재조합 인간 TNF의 더욱더 높은 농도이고, 그 결과 효과를 나타내기 위해 요구되는 길항제도 더욱더 높은 농도인 차이 외에는 정밀한 상관관계가 있다. 따라서, KYM-1은 주로 L929 결과를 확인하기 위해 사용된다. 시험 단백질의 직접 비교의 경우에, 역가는 TB-A로 규격화된 상대값 (EC50X/EC50TB-A)으로서 나타낸다. 그러나, 일반적으로, IC50 값도 더 높아질수록 결합제의 서열은 인간 어셉터 프레임워크 (FW2.3)에 더 가깝다. 도 5는 마우스 L929 섬유아세포 세포에 대해 TNFα 유도된 세포독성을 차단하는 TB-A의 상이한 유도체의 역가를 비교한다. 450 nm의 흡광도는 세포 생존과 상관관계가 있다.
TB-A 및 항-hTNFα IgG 인플릭시맙®은 유사한 IC50 값을 L929 검정에서 나타내지만, 인간 TNFα 유도된 세포독성을 차단하는 TB-wt의 역가는 유의하게 더 낮음을 나타낸다 (도 5A). TB-A 유도체를 TNFα 유도된 세포독성을 차단하는 그의 역가에 대해 TB-A와 비교하는 경우에, TB-H43을 제외한 대부분의 이들 유도체는 감소된 효능을 L929에서 나타낸다 (도 5B).
Figure pat00014
ELISA 데이타 줄에서, TB-A의 scFv와 Fab 포맷 간에 TNFα-유도된 세포독성의 차단능에서 유의한 차이가 없었다 (도 5C). TB-A Fab 포맷의 IC50 값은 가장 가능성 있게는 Fab 단편의 더 높은 분자 질량의 결과로서 TB-A scFv 포맷의 IC50 값보다 약 2배이었다 (도 5C).
실험 5. 항- TNF α 항체 유도체를 갖는 동물 실험
5.1. 실험의 설명
생체내 상황에서 인간 TNFα 생활성을 기능적으로 중화시키는 데 있어서의 ESBATech 항-TNFα 항체 유도체 (scFv 및 Fab)의 효능에 대해 시험하기 위해, 급성 단관절염의 최근 공개된 래트 모델을 사용하였다. 이 모델은 볼론 등에 의해 널리 설명되어 있다 (참조, 문헌 [Bolon et al. (2004), Vet. Pathol. 41:235-243]). 간략하게는, 이 동물 관절염 모델에서, 인간 TNFα는 수컷 루이스(Lewis) 래트의 무릎 관절 내로 관절내 주사하였다. 인간 TNFα의 주사는 급성 자기-제한 단관절염을 주사된 관절에서 유도한다. 관절염은 관절 종창 및 조직학적 스코어링의 측정에 의해 정량할 수 있다. 그 결과, 각 TNFα 길항제의 생활성은 TNFα-유도된 관절 종창의 감소 및/또는 염증의 조직학적 매개변수의 감소에 의해 정량할 수 있다.
5.2. 재료 및 방법
실험 디자인
본 연구는 적절한 동물 관절염 모델에서 인간 TNFα의 생활성을 억제하는 시판 항체 인플릭시맙 (레미케이드®)과 상기 기재된 일련의 대표적 scFv 항체 및 대표적 Fab 항체의 각 역가를 조사하기 위해 디자인하였다. 볼론 등은 래트 무릎 관절 내로의 재조합 인간 TNFα 10 마이크로그람의 관절내 투여가 표준 육안 및 현미경 분석에 의해 정량할 수 있는 급성 자기-제한 단관절염을 유발함을 이전에 보였다. 따라서, 이 동물 모델은 국소 투여 항체 유도체의 치료 효과를 평가하기 위한 이상적 시스템으로서 제공되었다. 2개 실험을 시리즈로 완료하였다 (표 4 및 5). 1) 인간 TNFα-유도된 단관절염을 차단하는 항체의 전체 역가를 평가하는 기초적 효능 연구; 및 2) 서로 간에 항체 유도체의 상대적 효능을 평가하는 투여량 반응 연구. 사이토카인 및 항체 유도체 모두는 하기 기재되는 바와 같이 개별 주사에 의해 1회 투여하였다. 사용되는 사이토카인 투여량은 볼론 등의 공개 문헌에 기초하지만, 항체 유도체의 투여량 범위는 사용가능한 세포 배양 데이타 및 교육된 추측에 기초하였다. 실험을 일반 동물 관리 지침에 따라 수행하였다.
동물 및 관리
젊은 성숙 수컷 루이스 래트 (6 내지 7주령 및 175 내지 20O g)를 랜덤하게 치료 군으로 배정하고 (n=3/일 군), 문헌 [Bolon et al. (2004), Vet. Pathol. 41:235-243]에 따라 수용하였다.
사이토카인 및 항체 점적주입
마취 및 사이토카인 주사를 볼론 등에 의해 기재된 바와 같이 수행하였다. 총 관절내 주사 부피 50 마이크로리터를 초과하지 않기 위해, 사이토카인 및 항체 유도체를 2개의 개별 관절내 주사로 점적주입하였으며, 이에 의해 10 마이크로그람의 재조합 인간 TNFα를 10 마이크로리터의 필터-멸균 인산염-완충 염수 (PBS)로 주사하고, 각 항체의 각 투여량은 40 마이크로리터의 필터-멸균 인산염-완충 염수로 주사하였다. 인플릭시맙/레미케이드®를 복강내로 투여 처리한 동물에 인간 TNFα의 관절내 주사 3시간 전에 항체 유도체를 i.p. 주사하였다. 관절내 투여 항체 처리로 처리한 모든 동물에서, 각 항체 투여량은 인간 TNFα 주사 5분 전에 주사하였다. 대조군 동물에 인간 TNFα가 없는 10 마이크로리터의 PBS를 주사하였다.
실험에 사용되는 인플릭시맙/레미케이드®를 공인된 스위스 제약사(Swiss pharmacy)로부터 구입하였다. 항-인간 TNFα 특이적 scFv 및 Fab (TB-A) 항체 뿐만 아니라 투여량 반응 실험에서 비-특이적 대조군 항체로서 사용되는 천연 scFv 항체 프레임워크는 이. 콜라이에서 발현되었고, 표준 방법에 의해 정제하였다. 내독소 오염은 지다당류 성분이 TNFα의 유효한 유도제이기 때문에 모든 약제에서 단백질 1 밀리그람당 10 EU 미만으로 보유하였다.
재조합 인간 TNFα는 페프로테크 이씨 엘티디(PeproTech EC Ltd)로부터 구입하였다.
관절 직경의 측정
각 복강내 또는 관절내 투여 항체 유도체의 주사 직전 또는 PBS (대조군 동물의 경우에) 또는 TNFα의 주사 전에, 주사될 무릎 관절의 직경을 표준 캘리퍼스로 측정하였다. TNFα (또는 대조군 동물의 경우에 PBS) 주사 48시간 후 및 동물의 안락사 직전에, 주사된 무릎 관절의 직경을 다시 측정하고, 관절 종창을 제1 직경 측정 값으로부터 제2 직경 측정 값을 뺄셈하여 계산하였다 (도 6 및 9).
조직 프로세싱
TNFα (또는 대조군 동물의 경우에 PBS) 주사 48시간 후에 동물을 안락사시켰다. 부검에서, 주사된 무릎을 발 및 넓적다리로부터 분리하고, 70％ 에탄올에 함침함으로써 무손상 고정하고, 볼린 등에 의해 기재된 바와 같이 표준 헤마톡실린 및 에오신 (HE) 염색을 수행하였다.
형태학적 분석
관절 염증 측정을 위한 조직학적 스코어링 분석을 볼론 등에 의해 기재된 바와 같이 수행하였다. 관절 염증 평가를 위한 조직병리학적 스코어링 판단기준은 볼론 등에 따라 적용하였다 (도 7, 8 및 10).
5.3. 결과
실험의 제1 세트에서, 대표적 관절내 투여 ESBATech scFv 항체, TB-A, 및 상응하는 관절내 투여 ESBATech Fab 항체를 표 4에 따른 관절내 및 복강내 투여 인플릭시맙/레미케이드®와 급성 단관절염 유도의 그의 차단능에 대해 비교하였다.
Figure pat00015
(TNFα-유도된 관절 종창에 대한 효과의 지시자로서) 무릎 직경의 변화에 대한 치료 효과와 관련하여 얻은 결과를 도 6에 나타낸다. 모든 항체는 TNFα-유도된 관절 종창을 완전히 차단하였다.
관절 염증에 대한 치료 효과의 평가를 위해, HE-염색 조직 슬라이드의 조직학적 스코어링을 수행하였다. 관절 염증을 하기 판단기준에 의해 스코어링하였다 (대표적 스코어링 예를 위해 도 7 참조):
스코어 0: 정상
스코어 1: 활막의 가벼운 비대
스코어 2: 활막의 비대 및 서브막(sublining)의 가벼운 염증
스코어 3: 활막의 비대 및 서브막의 중간정도 염증
조직병리학적 염증 스코어에 대한 치료 효과와 관련하여 얻은 결과를 도 8에 나타낸다.
조직병리학적 염증 스코어에 대한 모든 치료에서 유사한 효과를 관찰하였다.
실험의 제2 세트에서, 평가 항체 유도체에 대한 상대적 투여량 반응을 비교하였다. 실험 1의 대표적 관절내 투여 ESBATech scFv 항체 TB-A 및 상응하는 관절내 투여 Fab 항체를 표 5에 따라 실험 1에 비교된 바와 같이 더 넓고 상이한 투여량 범위에 걸쳐 관절내 및 복강내 투여 인플릭시맙/레미케이드® 및 인간 TNFα에 대한 임의의 결합 활성을 결실한 비관련 scFv 항체와 비교하였다.
Figure pat00016
(TNFα-유도된 관절 종창에 대한 효과의 지시자로서) 무릎 직경의 변화에 대한 치료 효과와 관련하여 얻은 결과를 도 9에 나타낸다.
조직병리학적 염증 스코어에 대한 치료 효과와 관련하여 얻은 결과를 도 10에 나타낸다.
요약하여, 대표적 ESBATech 항-TNFα scFv 및 대표적 ESBATech 항-TNFα Fab 항체 모두는 국소 (관절내) 투여 시에 인간 TNFα-유도된 단관절염의 차단에 매우 유효하였다.
본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내고 기재하였지만, 본 발명이 이에 제한되지 않고 하기 청구의 범위 내에서 다양하게 달리 실시되고 수행할 수 있는 것으로 명백하게 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> ESBATech AG <120> Stable and soluble antibodies inhibiting TNFalpha <130> 12013PC <160> 40 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> artificial <220> <223> derivative of TB-B <220> <221> VL/TB-A <222> (1)..(108) <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg 100 105 <210> 2 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> derivative of TB-B <220> <221> VH/TB-A <222> (1)..(117) <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr 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<400> 36 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190 Lys Asp Arg Ala Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr 195 200 205 Met Glu Leu 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Claims (1)

  1. 서열 2의 서열인 중쇄 가변 도메인 (VH)과 조합된, 서열 1의 서열인 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는, TNFα에 특이적으로 결합하는 안정적이고 가용성인 항체를 이용한 치료 방법.
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