KR101711472B1 - 기능화 폴리펩티드 - Google Patents

기능화 폴리펩티드 Download PDF

Info

Publication number
KR101711472B1
KR101711472B1 KR1020167010129A KR20167010129A KR101711472B1 KR 101711472 B1 KR101711472 B1 KR 101711472B1 KR 1020167010129 A KR1020167010129 A KR 1020167010129A KR 20167010129 A KR20167010129 A KR 20167010129A KR 101711472 B1 KR101711472 B1 KR 101711472B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
linker
ser
gly
esba105
polypeptide
Prior art date
Application number
KR1020167010129A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160046927A (ko
Inventor
데이비드 우레히
Original Assignee
에스바테크 - 어 노바티스 컴파니 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에스바테크 - 어 노바티스 컴파니 엘엘씨 filed Critical 에스바테크 - 어 노바티스 컴파니 엘엘씨
Publication of KR20160046927A publication Critical patent/KR20160046927A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101711472B1 publication Critical patent/KR101711472B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • A61K47/48215—
    • A61K47/48338—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1062—Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 기능화 폴리펩티드, 특히 치료 폴리펩티드(예를 들면, scFv)를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 기능성 부분(예를 들면, PEG) 및/또는 결합 특이성(예를 들면, 특정 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열)의 첨가로 신속하면서 특이적으로 기능화될 수 있는 링커(linker) 서열을 포함한다. 이같은 기능화 폴리펩티드는 비기능화 폴리펩티드보다 개선된 약동학적 특성(예를 들면, 생체내 반감기, 조직 침투 및 조직 체류 시간 개선)을 갖는다는 점에서 유리하다. 신속하면서 재생가능한 기능화 폴리펩티드의 생성방법이 또한 제공된다.

Description

기능화 폴리펩티드{FUNCTIONALIZED POLYPEPTIDES}
관련 출원
본 출원은 "Methods and Compositions For Modifying Immunobinders"라는 명칭으로 2008년 6월 30일 출원된 미국 임시출원 제61/076,775호를 우선권으로 주장하며, 그의 내용은 본 원에 참고로 원용된다.
치료 폴리펩티드의 효능은 보통 그의 내재된 약동학적 특성에 크게 제한을 받는다. 예를 들어, 치료 항체에 있어서, 조직 침투, 조직 체류 및 혈청 반감기와 관련한 문제가 빈번히 보고되고 있다. 치료 폴리펩티드의 약동학적 특성 개선은 효능 개선 및 투여 계획 감소로 이어진다. 치료 폴리펩티드의 약동학적 특성을 조절하는 현재의 방법은 일반적으로 혈청 반감기 문제를 다루는 것에 제한되어 있다. 더욱이, 이들 방법은 전형적으로 시간 소모적이거나 기존 폴리펩티드의 비특이적인 화학적 변경을 포함한다.
따라서, 당업계에서는 신속하면서 특이적인 아미노산 변경 수단을 제공하고, 반감기 외에 약동학적 변수를 다루는, 치료 폴리펩티드의 약동학적 특성을 조절하기 위한 개선된 방법이 요망된다.
발명의 개요
본 발명은 기능화 폴리펩티드, 특히 치료 폴리펩티드(예를 들면, scFv)를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 기능성 부분(예를 들면, PEG) 및/또는 결합 특이성(예를 들면, 특정 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열)의 첨가로 신속하면서 특이적으로 기능화될 수 있는 링커(linker) 서열을 포함한다. 이같은 기능화 폴리펩티드는 비기능화 폴리펩티드보다 개선된 약동학적 특성(예를 들면, 생체내 반감기, 조직 침투 및 조직 체류 시간 개선)을 갖는다는 점에서 유리하다. 신속하면서 재생가능한 기능화 폴리펩티드의 생성방법이 또한 제공된다.
따라서, 일 측면으로, 본 발명은 아미노산 링커로 연결된 두 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 예컨대 면역바인더(예를 들면, scFv)를 제공한다. 링커는 일반적으로 사슬내 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 두 시스테인을 포함하며, 이들 두 시스테인 사이에 있는 링커 서열의 아미노산은 두 시스테인이 서로 디설파이드 결합되는 경우 루프(loop)를 형성한다. 특정 구체예에 있어서, 링커는 서열번호 1 또는 2에 기재된 서열을 포함한다.
특정 구체예에 있어서, 링커는, 예컨대 PK 조절제(예를 들면, 히알우론산, 및 혈청 알부민)와 같이 표적 분자에 결합하는 루프를 함유한다. 표적 분자에 결합함으로써, 혈청 반감기 및/또는 조직으로의 침투 효능 및/또는 링커를 포함하는 폴리펩티드의 특정 결합 특이성이 향상된다. 특정 구체예에 있어서, 링커는 서열번호 3 또는 4에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 6 또는 8에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에 있어서, 링커내 적어도 하나의 시스테인 잔기가 기능성 부분에 공유결합된다. 특정 구체예에 있어서, 링커내 두 시스테인 잔기는 동일한 기능성 부분에 공유결합된다. 적합한 기능성 부분은, 예를 들면, PEG, 탄수화물 분자 및 하이드록시에틸 전분(HES)을 포함한다. PEG 또는 HES와 같은 기능성 부분이 폴리펩티드에 공유 결합되는 경우, 대상내 상기 폴리펩티드의 반감기는 길어진다.
다른 측면으로, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자(예를 들면, 벡터), 및 상기 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 기능화 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다. 이 방법은 일반적으로 펩티드 서열의 라이브러리를 제공하고, 라이브러리로부터 표적 분자에 결합하는 적어도 하나의 펩티드 서열을 확인하며, 상기 확인된 적어도 하나의 펩티드 서열을 포함하도록 링커-함유 폴리펩티드의 루프 영역을 변경시키는 단계를 포함한다. 목적하는 펩티드 서열은 예를 들면, 파지 디스플레이, 이스트(yeast) 디스플레이 또는 mRNA 디스플레이를 비롯한 당업계에 주지된 임의의 방법으로 확인할 수 있다.
도 1은 다양하게 처리된 ESBA105 분자(레인 3-10)의 SDS page를 도시한다. 레인 1: 마커; 레인 2: 비특이적; 레인 3: DTT로 환원; 레인 4: 환원 및 투석; 레인 5: 환원, 시스테인-페길화; 레인 6: 시스테인-페길화, 투석; 레인 7: 대조군; 레인 8: 리신-페길화; 레인 9: 라이신-페길화, 투석; 레인: 10 대조군. PEG의 분자 크기는 약 0,7 kDa/PEG이다.
도 2는 (A) 시스테인-페길화 ESBA105 및 (B) 리신-페길화 ESBA105의 TNFα 결합-활성을 ELISA 분석한 결과 나타낸 것이다. A: EC50 - ESBA105의 경우는 0.9833이고; 환원된 ESBA105의 경우는 1.291이며; Cys 페길화 ESBA105의 경우는 1.164이다. R2 - ESBA105의 경우는 0.9814이고; 환원된 ESBA105의 경우는 0.9891이며; Cys 페길화 ESBA105의 경우는 0.9857이다. B: EC50 - ESBA105의 경우는 0.8073이고, Lys 페길화 ESBA105의 경우는 1.326이다. R2 - ESBA105의 경우는 0.9870이고, 페길화 ESBA105의 경우는 0.9640이다.
도 3은 (a) 비변형, 산화 ESBA105-SS-링커, (b) 단일기능성 페길화 시약 1을 사용하여 페길화된 ESBA105-SS-링커(ESBA105-S2-PEG2) 및 (c) 이기능성 페길화 시약 2를 이용하여 페길화된 ESBA105-SS-링커(ESBA105-S2-PEG)를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 (A) ESBA105 및 ESBA105-SS-링커의 TNFα 결합-활성에 대한 ELISA 분석; (B) 다양하게 처리된 ESBA105의 SDS-PAGE 겔; 및 (C) 토끼 항-PEG 항체를 사용하여 ESBA105 및 ESBA105-SS-링커의 페길화 정도를 평가한 웨스턴 블롯(Western blot)을 나타낸다. 도 4 (B): 레인 1: ESBA105 SS 링커 환원 + 투석 + 상향 농축(up-concentrated); 레인 2: ESBA105 SS 링커 환원 + 투석; 레인 3: ESBA105 SS 링커 환원 + 페길화; 레인 4: ESBA105 SS 링커 환원 + 페길화 + 투석; 레인 5: ESBA105 SS 링커.
도 5는 파지 디스플레이를 위해 박테리오파지 2 표면상의 scFv 분자 1의 펩티드 루프를 개략적으로 도식화한 것이다(scFv 분자 및 파지는 스케일화하지 않음). 도면에서, 루프는 혈청 알부민(반감기 연장), FcRx(태반 운반), 뮤신(상피 체류 시간 연장), 인테그린(RGD 펩티드), 상보체, 밀착 결합 단백질, 다량체화(multimerization) 등과 같은, 표적 분자 3과 상호작용할 수 있는 7개의 아미노산을 포함한다.
도 6은 ESBA105 및 시스테인-페길화 ESBA105-SS-링커의 TNFα 결합-활성을 ELISA 분석한 것이다. EC50 - ESBA105의 경우는 0.9980이고; 페길화된 SS 링커를 갖는 ESBA105의 경우는 1.181이다. R2 - ESBA105의 경우는 0.9397이고; 페길화된 SS 링커를 갖는 ESBA105의 경우는 0.9851이다.
도 7a는 ESBA903의 VEGF 결합 반응속도를 나타낸다. Fit: 1:1 결합; ka(I/Ms): 7.68E+5; kd(1/s): 4.310E-5; KD(M): 5.608E-I 1. 도 7b는 ESBA903-Pepl의 결합 반응속도를 나타낸다. Fit: 1:1 결합; ka(I/Ms): 1.133E+6; kd(1/s): 5.026E-5. 7a 및 7b 모두, X-축 값은 초로 주어졌고, Y-축 값은 공명 단위(RU)로 주어졌다.
상세한 설명
정의
폴리펩티드와 관련하여 용어 "도메인"은 당업계에 주지된 의미를 가지며, 삼차 구조의 불연속 단위를 가리킨다. 도메인 예로는 항체 VH 또는 VL 도메인, 피브로넥틴 도메인 및 안키린-반복 도메인을 들 수 있으나, 이들로만 한정되지는 않는다.
용어 "링커"는 두 도메인을 연결하는 선형 아미노산 서열을 가리킨다. 본 발명의 링커는 도메인에 유전적 및/또는 화학적으로 융합될 수 있디. 특정 구체예에 있어서, 링커는 루프를 함유한다.
용어 "루프"는 링커내에서 사슬내 디설파이드 결합으로 형성된 환형 아미노산 서열을 가리킨다.
용어 "폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 화학식 HO-(CH2CH2O)n-H의 선형 또는 분지형 중성 폴리에테르 및 그의 반응성 유도체를 의미한다. 반응성 PEG 유도체는 당업계에 익히 알려졌으며, 메틸-PEO12-말레이미드, N-하이드록시 숙신이미딜 카보네이트, N-하이드록시 숙신이미딜 프로피오네이트, p-니트로페닐카보네이트, 벤조트리아졸카보네이트 및 알데하이드에 결합된 PEG를 포함하나, 이들로만 한정되지는 않는다. 특정 구체예에 있어서, 아미노-반응성 PEG 유도체는 디설파이드 결합과 특이적으로 결합할 수 있는 비스-설폰-결합 PEG이다(참조예: Brocchini et al., Nature Protocols, 2006: 1(5), 241). 적합한 PEG 분자는 분자 크기가 0.5 kDa 내지 50 kDa인 것이다.
용어 "표적 분자"는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 루프 영역에 의해 특이적으로 결합된 임의의 분자를 가리킨다. 표적 분자는, 예를 들면, 당, 단백질 및 리피드를 포함한다.
용어 "기능성 부분"은 부착된 분자(예를 들면, PEG 분자, 하나 이상의 탄수화물 분자 또는 하이드록시에틸 전분(HES))에 추가적인 기능성을 부여하는 생물학적 또는 화학적 물질을 가리킨다.
용어 "PK 조절제"는 단백질에 결합시 해당 단백질의 약동학적 프로파일을 변경시키는 임의의 분자를 가리킨다. PK 조절제는 전형적으로 대상(예를 들면, 환자)에 존재하는 자연 발생적인 내인성 분자이나 필수적이지는 않다. 대상내 상기 PK 조절제의 편재화 및 다량화는 생리학적 또는 병리학적일 수 있다(예를 들면, 암세포 표면상 또는 염증 부위에서 과발현). 적합한 PK 조절제는, 예를 들면, 히알우론산, II형 콜라겐, 혈청 알부민, 항체 Fc 수용체(예를 들면, FcRx), 항체 Fc 영역, 뮤신, 인테그린, 밀착 결합 단백질, 트랜스페린 및 보체 인자를 포함한다.
폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 용어 "변형된" 또는 "변형되는 것"은 폴리펩티드 서열에 아미노산 첨가 또는 폴리펩티드 서열에서 기존 아미노산의 치환을 모두 가리킨다. 폴리펩티드를 변형시키는데 적합한 아미노산은 공지된 모든 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 및 이들의 기능화 유도체이다(참조예: 그의 전체내용이 본 원에 참고로 원용되는 미국 특허 제7,045,337호 및 7,083,970호).
용어 "면역바인더(immunobinder)"는 항체의 전 또는 일부 항원 결합 부위, 예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 전부 또는 일부를 함유하는 분자를 가리키며, 따라서 면역바인더는 표적 항원을 특이적으로 인식한다. 면역바인더의 예로는 전장 면역글로불린 분자 및 scFv와, (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CHI 도메인으로 구성된 일가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디설파이드 브리지(disulfide bridge)로 연결된 두 Fab 단편을 포함하는 이가 단편; (iii) 실질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab인 Fab' 단편(참조: Fundamental Immunology(Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) VH 및 CHI 도메인으로 구성된 Fd 단편; (v) 단일 항체 팔(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; 및 (vii) 단일 가변 도메인 및 두 불변 도메인을 함유한 중쇄 가변 영역인 나노바디(nanobody)가 예시되나 이들로 한정되지 않는 항체 단편이 포함되지만 이들로만 한정되는 것은 아니다.
본 원에 사용된 용어 "항체"는 "면역글로불린"과 동의어이다. 본 발명에 따른 항체는 면역글로불린 전체, 또는 그의 단편, 예를 들면 면역글로불린의 적어도 하나의 가변 도메인, 예컨대 단일 가변 도메인, Fv(Skerra A. and Pluckthun, A.(1988) Science 240:1038-41), scFv(Bird, R.E. et al.(1988) Science 242:423-26; Huston, J.S. et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83), Fab, (Fab')2 또는 당업자들에게 공지된 그밖의 다른 단편일 수 있다.
용어 "단일 쇄 항체" 또는 "scFv"는 링커로 연결된 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 분자를 가리킨다. 이러한 scFv 분자는 일반 구조 NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH를 가질 수 있다.
본 원에 사용된, 용어 "기능성"은 안정성(예를 들면, 열 안정성), 가용성(예를 들면, 생체내 및 세포 배양시), 및 항원 결합 친화성을 들 수 있으나, 이들로만 한정되지는 않는 폴리펩티드(예를 들면, 면역바인더)의 성질이다.
용어 "특이적 결합," "선택적 결합," "선택적으로 결합" 및 "특이적으로 결합"이라는 것은 예정 항원상의 에피토프에 대한 항체 결합을 가리킨다. 전형적으로, 항체는 약 10-7 M 미만 정도, 예컨대 약 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만 정도의 친화도(K73)로 결합한다.
용어 "PK 조절제"는 단백질에 결합시 해당 단백질의 약동학적 프로파일을 변경시키는 임의의 분자를 가리킨다. PK 조절제는 전형적으로 대상(예를 들면, 환자)에 존재하는 자연 발생적인 내인성 분자이나 필수적이지는 않다. 대상내 상기 PK 조절제의 편재화 및 다량화는 생리학적 또는 병리학적일 수 있다(예를 들면, 암세포 표면상 또는 염증 부위에서 과발현). 적합한 PK 조절제는, 예를 들면, 히알우론산, II형 콜라겐, 혈청 알부민, 항체 Fc 수용체(예를 들면, FcRx), 항체 Fc 영역, 뮤신, 인테그린, 밀착 결합 단백질, 트랜스페린 및 보체 인자를 포함한다.
폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 용어 "변형된" 또는 "변형되는 것"은 폴리펩티드 서열에 아미노산 첨가 또는 폴리펩티드 서열에서 기존 아미노산의 치환을 모두 가리킨다. 폴리펩티드를 변형시키는데 적합한 아미노산은 공지된 모든 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 및 이들의 기능화 유도체이다(참조예: 그의 전체내용이 본 원에 참고로 원용되는 미국 특허 제7,045,337호 및 7,083,970호).
용어 "면역바인더(immunobinder)"는 항체의 전 또는 일부 항원 결합 부위, 예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 전부 또는 일부를 함유하는 분자를 가리키며, 따라서 면역바인더는 표적 항원을 특이적으로 인식한다. 면역바인더의 예로는 전장 면역글로불린 분자 및 scFv와, (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CHI 도메인으로 구성된 일가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디설파이드 브리지(disulfide bridge)로 연결된 두 Fab 단편을 포함하는 이가 단편; (iii) 실질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab인 Fab' 단편(참조: Fundamental Immunology(Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) VH 및 CHI 도메인으로 구성된 Fd 단편; (v) 단일 항체 팔(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; 및 (vii) 단일 가변 도메인 및 두 불변 도메인을 함유한 중쇄 가변 영역인 나노바디(nanobody)가 예시되나 이들로 한정되지 않는 항체 단편이 포함되지만 이들로만 한정되는 것은 아니다.
본 원에 사용된 용어 "항체"는 "면역글로불린"과 동의어이다. 본 발명에 따른 항체는 면역글로불린 전체, 또는 그의 단편, 예를 들면 면역글로불린의 적어도 하나의 가변 도메인, 예컨대 단일 가변 도메인, Fv(Skerra A. and Pluckthun, A.(1988) Science 240:1038-41), scFv(Bird, R.E. et al.(1988) Science 242:423-26; Huston, J.S. et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83), Fab, (Fab')2 또는 당업자들에게 공지된 그밖의 다른 단편일 수 있다.
용어 "단일 쇄 항체" 또는 "scFv"는 링커로 연결된 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 분자를 가리킨다. 이러한 scFv 분자는 일반 구조 NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH를 가질 수 있다.
본 원에 사용된, 용어 "기능성"은 안정성(예를 들면, 열 안정성), 가용성(예를 들면, 생체내 및 세포 배양시), 및 항원 결합 친화성을 들 수 있으나, 이들로만 한정되지는 않는 폴리펩티드(예를 들면, 면역바인더)의 성질이다.
용어 "특이적 결합," "선택적 결합," "선택적으로 결합" 및 "특이적으로 결합"이라는 것은 예정 항원상의 에피토프에 대한 항체 결합을 가리킨다. 전형적으로, 항체는 약 10-7 M 미만 정도, 예컨대 약 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만 정도의 친화도(K73)로 결합한다.
용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 의미한다. 핵산 분자는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중가닥 DNA이다. 핵산은 다른 핵산 서열에 대해 기능적 관계로 위치하는 경우, "작동가능하게 결합된다". 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서(enhancer)는 서열 전사에 영향을 미치는 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 결합된다.
용어 "벡터"란 연결되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 한 종류는 "플라스미드"이며, 추가적인 DNA 세그먼트가 리게이션된 환형 이중가닥 DNA 루프를 가리킨다. 다른 종류의 벡터는 바이러스 벡터로서, 여기에서 추가적인 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 리게이션될 수 있다. 특정 벡터는 도입된 숙주 세포에서 자동 복제할 수 있다(예를 들면, 박테리아 기원 복제의 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 기타 벡터(예를 들면, 비에피솜 포유동물 벡터)들은 숙주 세포로 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다.
용어 "숙주 세포"란 발현 벡터가 도입된 세포를 말한다. 숙주 세포는 박테리아, 미생물, 식물 또는 동물 세포일 수 있다. 형질전환 감수성 박테리아는 장내세균과(enterobacteriaceae) 멤버, 예컨대 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) 균주 또는 살모넬라(Salmonella); 간균과(Bacillaceae), 예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 폐렴균(Pneumococcus); 연쇄상구균(Streptococcus) 및 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)를 포함한다. 적합한 미생물에는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아파스토리스(Pichiapastoris)가 포함된다. 적합한 동물 숙주 세포주는 CHO(중국 햄스터 난소세포주) 및 NSO 세포를 포함한다.
달리 정의되지 않으면, 본 원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 업자들이 일반적으로 이해하고 있는 의미와 동일한 의미를 가진다. 본 발명을 실시하는데에 본 원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질들이 사용될 수 있기는 하지만, 적합한 방법 및 물질에 대해 이하 설명하기로 한다. 정의를 비롯하여 상충되는 경우, 본 명세서를 따를 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 설명만을 목적으로 하는 것이며, 한정할 의도는 없다.
이하, 세부항목에서 본 발명의 다양한 측면들이 보다 상세히 설명될 것이다. 다양한 구체예들은 임의적으로 조합될 수 있는 것으로 이해하여야 한다.
폴리펩티드 링커
일 측면으로, 본 발명은 사슬내 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 두 시스테인 잔기를 가지는 아미노산 링커에 의해 연결되어 있는 두 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 링커는 기능성 부분(예를 들면, PEG)의 부위 특이적 첨가 및/또는 폴리펩티드에 하나 이상의 결합 친화성 부가가 가능하다는 점에서 특히 유리하다. 본 발명의 링커는 바람직하게는 유전공학에 의해 하나의 도메인, 보다 바람직하게는 두 도메인 사이에 유전적으로 결합되어 이들을 연결함으로써 단일 폴리펩티드를 형성한다. 다른 한편으로, 본 발명의 링커는 아미노산 결합을 수행하는데 업계에 주지된 임의의 화학을 이용하여 도메인에 화학적으로 결합할 수 있다. 기능성 부분은 주지된 임의의 화학을 이용하여 링커에 연결될 수 있다. 바람직하게, 이들은 링커에 존재하는 하나 이상의 시스테인에 연결된다.
특정 구체예에 있어서, 아미노산 링커는 일반식 (X)a-C-(X)b-C-(X)c를 가지며, 여기에서 C는 시스테인이고; X는 천연, 비천연 아미노산, 및 이들의 화학 유도체를 비롯한 임의의 아미노산이며; a, b 및 c는 아미노산 개수로서, 임의의 자연수일 수 있다. 바람직하게, a 및 c는 1 내지 25의 수이고, b는 3 내지 250의 수이다. 보다 바람직하게, a 및 c는 1 내지 20의 수이고, b는 3 내지 100의 수이다.
일 구체예에 있어서, 링커는 루프 형성 영역 Xb에 펩티드 서열을 포함한다. 이 경우, b는 바람직하게는 3-30 아미노산의 임의의 수, 즉 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30이다. 가장 바람직하게, b는 7 또는 12이다. 바람직하게, 영역 Xb를 형성하는 루프는 시스테인 잔기를 포함하지 않는다.
특정 구체예에 있어서, 링커는 폴딩된 폴리펩티드 도메인을 포함한다. 일반식 (X)a-C-(X)b-C-(X)c에서, b는 바람직하게는 30 내지 250의 수, 예를 들면 50-200, 100-200, 125-225, 75-225, 125-225, 예컨대 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 또는 250이다. 여기에서 지정 범위내 모든 자연수가 명시되는 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 아미노산 링커는 일반식 (X)a-C-도메인-C-(X)b[여기에서, C는 시스테인이고; X는 천연, 비천연 아미노산, 및 이들의 화학 유도체를 비롯한 임의의 아미노산이며; 도메인은 상기 정의된 바와 같은 도메인이고; a, b 및 c는 아미노산 개수로서, 임의의 자연수일 수 있다]의 것이다.
특정 구체예에 있어서, 아미노산 링커는 일반식 (X)n=S-15-C-(X)n=3-50-C-(X)n=3-15(표 1에서 서열번호 1)의 것이며, 여기에서, C는 시스테인이고; X는 천연, 비천연 아미노산, 및 이들의 화학 유도체를 비롯한 임의의 아미노산이며; n은 아미노산 개수이다. 링커의 각 영역에서 아미노산 잔기의 수는 부착된 폴리펩티드의 구조에 따라 달라질 수 있으나, 단 링커내 시스테인 잔기는 비환원 조건하에서 사슬내 디설파이드 결합을 형성할 수 있어야 한다. 또힌, 링커 길이 및 서열은 링커가 일부분인 폴리펩티드의 하나 이상의 기능성을 실질적으로 손상시키지 않아야 하는 것이다. 특정 구체예에 있어서, 아미노산 링커는 서열번호 2, 3, 및 4중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함한다(표 1 참조).
본 발명의 링커는 scFv, 특히 예컨대 본 원에 참고로 원용되는 WO09/000098호에 기술된 바와 같은 고안정성 및 가용성인 scFv에서 VH 및 VL 도메인을 결합시키는데 특히 적합하다. 본 발명의 링커를 포함하는 예시적인 scFv 폴리펩티드의 아미노 서열이 서열번호 6 및 8에 기재되었(표 1 참조).
폴리펩티드
본 발명은 기능화 폴리펩티드, 특히 치료 폴리펩티드(예를 들면, scFv)를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 기능성 부분(예를 들면, PEG) 및/또는 결합 특이성 첨가로(예를 들면, 특정 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열) 신속하고 특이적으로 기능화할 수 있는 링커 서열을 포함한다.
본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 면역글로불린 도메인(예를 들면, VH 또는 VL 도메인)을 포함하는 폴리펩티드가 예시되나 이에 한정되지 않는 임의의 폴리펩티드가 기능화될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 폴리펩티드는 면역바인더 (예를 들면, scFv)이다.
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드는 일반식 도메인 1-(X)a-C-(X)b-C-(X)c-도메인 2의 것이며, 여기에서, C는 시스테인이고; 도메인 1 및 2는 상기 정의된 바와 같으며; X는 천연, 비천연 아미노산, 및 이들의 화학 유도체를 비롯한 임의의 아미노산이고; a, b, 및 c는 아미노산 개수이다. 바람직하게, 도메인 1 및 2는 각각 VH 및 VL 도메인, 또는 VL 및 VH 도메인이다.
링커에 기능성 부분 첨가
본 발명의 링커는 비환원 조건하에서 사슬내 디설파이드 결합을 형성하는 적어도 두개의 두 시스테인 잔기를 함유한다(도 3 참조). 상기 디설파이드 결합은 본 원에 기재된 방법을 이용하여 링커에 기능성 부분(예를 들면, PEG)을 부위 특이적으로 첨가할 수 있게 한다. 구체적으로, 디설파이드 결합내 시스테인 잔기는 기능성 부분(예를 들면, PEG)에 공유적으로 결합할 수 있다. 노출된 시스테인이 훨씬 더 페길화 지향적이기 때문에, 종래 PEG-부착 부위와 비교할 때 PEG-부착 부위에 대해 불균일 집단을 종종 양산하는 제조 이점이 있다. 단일기능성 반응 그룹을 함유하는 기능성 부분이 사용되는 경우, 기능성 부분은 단일 시스테인 잔기에 결합하게 될 것이다. 그러나, 디설파이드 결합-특이적 이기능성 반응 그룹을 함유하는 기능성 부분이 사용되는 경우에, 기능성 부분은 사슬내 디설파이드 결합의 양 시스테인 잔기 둘 다에 결합하게 될 것이다. 이러한 이기능성 시약은 당업계에 익히 알려졌으며, 비스-설폰이 포함된다(참조예: Brocchini et al., Nature Protocols, 2006: 1(5), 241).
특정 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 2, 3, 4, 6 및 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공하며(표 1 참조), 여기에서 링커내 적어도 하나의 시스테인 잔기는 기능성 부분(예를 들면, PEG)에 공유적으로 결합한다. 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 제공한다 서열번호 2, 3, 4, 6 및 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공하며(표 1 참조), 여기에서 링커내 양 시스테인 잔기는 이기능성 반응 그룹(예를 들면, 비스-설폰)을 사용하여 동일한 기능성 부분(예를 들면, PEG)에 공유적으로 결합한다.
루프의 기능화
본 발명의 링커에서 시스테인 잔기에 의한 사슬내 디설파이드 결합 형성으로 시스테인 잔기 사이의 링커 아미노산 서열이 폐환되어 루프를 형성한다(도 3 및 5 참조). 이러한 루프 구조는 하나 이상의 특정 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열을 포함하도록 변형되어 루프가 일부분인 폴리펩티드에 추가의 기능성을 부여할 수 있다는 점에서 특히 유리하다.
루프 서열은, 예를 들면 임의의 표적 분자에 대해 결합 특이성을 가진다. 적합한 표적 분자로는 PK 조절제, 예를 들어 히알우론산, 혈청 알부민, 인테그린, 항체 Fc 영역, 트랜스페린 등을 들 수 있으나, 이들로만 한정되지는 않는다. 예를 들면, 혈청 알부민으로의 결합은 폴리펩티드의 반감기를 연장한다. FcRx의 결합은 태반으로의 폴리펩티드 운반을 향상시키는데 반해, 뮤신으로의 결합은 상피에서의 체류 시간을 연정한다. 특정 구체예에 있어서, 항원 특이성을 갖는 면역바인더의 경우, VH와 VL 도메인 사이의 루프 영역을 항원에 결합하도록 조작하여 면역바인더의 친화성을 향상시킬 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 표적 분자는 폴리펩티드 자체이다. 다시 말해, 루프는 폴리펩티드가 이량체, 삼량체 또는 고차 다량체를 형성하도록 야기하는 다량화 기능을 제공할 수 있다. 다량체는 단량체에 비해 결합력이 강하다. 또한, 다량체는 가교결합이 가능하고, 종국에는 세포 표면상의 수용체를 활성화할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 표적 분자는 그의 링커에서 상보성 루프를 디스플레이하는 또 다른 면역바인더이며, 즉 두 분자의 루프는 서로 결합하며, 루프는 동일하거나 상이할 수 있다. 이에 따라 이중특이적 또는 다중특이적 면역바인더 복합체 형성이 가능하다. 이중특이적 또는 다중특이적 복합체로분자 또는 세포를 다른 세포 또는 분자에 동원할 수 있으며, 예를 들어 암 세포로 T 세포를 동원함으로써 암 세포를 죽일 수 있다(Cancer Res. volume 69 page 4941).
목적하는 표적 분자에 결합 특이성을 갖는 임의의 짧은 아미노산 서열이 본 발명의 루프에 도입될 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 루프 서열은 5 내지 15개의 아미노산(즉, 일반식 (X)a-C-(X)b-C-(X)c에서 b는 5 내지 15이다)으로 구성되며, 시스테인을 함유하지 않는다. 루프에 도입될 수 있는 적합한 아미노산 서열은 히알우론산 결합 펩티드(예를 들면, 표 1에서 서열번호 4의 잔기 12 내지 23을 포함하는 펩티드) 및 인테그린 결합 펩티드(예를 들면, RGD 펩티드)를 포함하나, 이들에만 한정되지는 않는다.
루프 도입에 적합한 목적하는 표적 분자에 결합 특이성을 갖는 새로운 펩티드는 당업계에 주지된 수단, 예를 들면, 파지 디스플레이, 이스트 디스플레이 및 mRNA 디스플레이 등의 수단으로 동정할 수 있다. 이러한 디스플레이 시스템은 당업계에 익히 알려졌다(참조예: 본 원에 참고로 원용되는 미국 특허 제66258558호, 6699658호; 및 7118879호). 예로, 파지 디스플레이 스크린을 수행하는 경우, 링커의 두 시스테인에 의해 형성된 루프를 파지 표면상의 디스플레이를 위해 파지 캡시드 단백질에 융합할 수 있다(도 5의 개략도 참조). 이상적으로 5 내지 15개의 아미노산을 포함하고 루프를 형성하기 위해 필요한 것 이외의 시스테인을 함유하지 않는 루프 서열을 랜덤화하여 스크린하기 위한 루프 서열의 라이브러리를 제공할 수 있다. 적합한 파지 라이브러리는 상업적으로 입수가능하며, 예를 들면 뉴잉글랜드 바이오랩(New England Biolab) 사 제품인 디설파이드-구속 헵타펩티드(Ph.D.-C7C) 라이브러리이다. 이러한 파지 스크린을 위한 표적 분자로는, 예를 들면, PK 조절제, 예컨대, II형 콜라겐, 알부민, 항체 Fc 영역, 항체 Fc 수용체(예를 들면, FcRx), 뮤신, 인테그린, 밀착 결합 단백질 및 보체 인자가 포함된다.
변형된 폴리펩티드
부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 링커 영역 밖의 하나 이상의 아미노산 잔기에서 기능성 부분(예를 들면, PEG)에 공유적으로 결합할 수 있다. 실질적으로 폴리펩티드의 하나 이상의 기능성을 손상시키지 않는 임의의 아미노산 잔기, 예를 들면, 표면 노출된 리신 및 시스테인 잔기가 사용될 수 있다. 경우에 따라, 폴리펩티드를 변형시켜 (첨가 또는 치환으로) 기능성 부분 결합에 적합한 추가의 반응성 아미노산을 도입할 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 폴리펩티드는 적어도 하나의 시스테인 잔기쌍을 함유하도록 변형되며, 시스테인 잔기의 적어도 한쌍은 성숙 폴리펩티드에서 사슬내 디설파이드 결합을 형성한다. 기능성 부분은 단일기능성 반응 그룹을 사용하여 단일 반응 잔기(예를 들면, 시스테인)에 결합시킬 수 있거나, 이기능성 디설파이드 결합-특이적 반응 그룹(예를 들면, 비스-설폰)을 사용하여 두 디설파이드 결합 시스테인에 결합시킬 수 있다.
따라서, 일 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 여기에서 Lys40, Lys43, Lys46, Lys1O7, Lys176, Lys197 및 Lys208로 구성된 그룹중에서 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기는 기능성 부분(예를 들면, PEG)에 공유적으로 결합된 폴리펩티드를 제공한다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 여기에서 C24-C89 및 C154-C228로 구성된 그룹중에서 선택된 시스테인 잔기의 적어도 한쌍은 동일한 기능성 부분(예를 들면, PEG)에 공유적으로 결합된 폴리펩티드를 제공한다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 여기에서 Cys123 및 Cys136으로 구성된 그룹중에서 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기는 기능성 부분(예를 들면, PEG)에 공유적으로 결합된 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 여기에서 시스테인 잔기 Cys123-Cys136 쌍은 동일한 기능성 부분(예를 들면, PEG)에 공유적으로 결합된 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 여기에서 Lys44, Lys47, Lys105, Lys1O9, Lys142, Lys143, Lys149, Lys173, Lys193 및 Lys195로 구성된 그룹중에서 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기는 기능성 부분(예를 들면, PEG)에 공유적으로 결합된 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 여기에서 Cys25-Cys90 및 Cys152-Cys226으로 구성된 그룹중에서 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기는 동일한 기능성 부분(예를 들면, PEG)에 공유적으로 결합된 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 여기에서 Cys121 및 Cys129로 구성된 그룹중에서 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기는 기능성 부분(예를 들면, PEG)에 공유적으로 결합된 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 여기에서 시스테인 잔기 Cys121-Cys129 쌍은 동일한 기능성 부분(예를 들면, PEG)에 공유적으로 결합된 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 5, 6, 7, 또는 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 적어도 하나의 반응성 아미노산(예를 들면, 시스테인 또는 리신)을 함유하도록 변형된 폴리펩티드를 제공한다. 상기 반응성 아미노산은 기능성 부분(예를 들면, PEG)에 공유적으로 결합될 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 5, 6, 7, 또는 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 시스테인 잔기의 적어도 한쌍을 함유하도록 변형되며, 시스테인 잔기의 적어도 한쌍은 성숙 폴리펩티드에서 사슬내 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 제공한다. 특정 구체예에 있어서, 시스테인 잔기의 적어도 한쌍은 동일한 기능성 부분(예를 들면, PEG) 이기능성 반응 그룹(예를 들면, 비스-설폰)에 공유적으로 결합된다.
당업계에 공지된 바와 같이, PEG 부착은 생물약제의 기능 변경없이 그의 특정 특성을 개선함으로써 그의 치료 효과를 향상시킬 수 있다. 예시적인 효과로는 (i) 가용성 향상, 안정성 개선, 흡수 지속 및/또는 연속적인 생물약제 작용에 의한 약동학 개선; (ii) 치료적 유효량 및/또는 투약 빈도를 감소시키는 순환 시간 증가; 및/또는 (iii) 예를 들면 안정성 프로파일 개선, 면역원성 감소, 항원성 감소 및/또는 단백질분해 감소에 따른 독성 감소를 들 수 있다.
폴리펩티드 조성물 및 제제
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 폴리펩티드(예를 들면, ScFv) 조성물의 약제학적 제제에 관한 것이다. 이러한 제제는 전형적으로 폴리펩티드(예를 들면, ScFv) 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 원에 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리적으로 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 바람직하게, 담체는, 예를 들면, 정맥내, 근육내, 피하, 국소(예를 들면, 눈, 피부 또는 표피층), 흡입, 비경구, 척수 또는 표피 투여(예를 들면, 주사 또는 주입에 의해)용으로 적합하다. 투여 경로에 따라, 폴리펩티드(예를 들면, ScFv)는 산 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 자연적인 조건으로부터 화합물을 보호하도록 하는 물질로 코팅될 수 있다.
본 발명의 약제학적 화합물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용되는 염"이란 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하면서 바람직하지 않은 어떠한 독성적인 효과도 부여하지 않는 염을 의미한다(참조예: Berge, S. M., et al.(1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). 이러한 염의 예로는 산 부가염 및 염기 부가염을 들 수 있다. 산 부가염에는 비독성 무기산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터 유도된 것 및 비독성 유기산, 예컨대 지방족 모노- 및 디카복실산, 페닐-치환 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족산, 지방족산 및 방향족 설폰산 등으로부터 유도된 것들이 포함된다. 염기 부가염에는 알칼리토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유도된 것 및 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유도된 것들이 포함된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 항산화제의 예로는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 바이설파이트, 소듐 메타바이설파이트, 소듐 설파이트 등; (2) 오일-용해성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 들 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 들 수 있다. 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅재의 사용, 분산물의 경우는 필요한 입자 크기 유지 및 계면활성제의 사용으로 적당한 유동성이 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 어쥬번트를 포함할 수 있다. 상술된 멸균 처리 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함으로 미생물 발생 예방을 확보할 수 있다. 등장제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 포함시킴으로써 주사용 약제 형태의 장기 흡수를 이룰 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체는 멸균 수용액 또는 분산물, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 상기 매질 및 제제는 당업계에 공지되었다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물에 비적합한 경우를 제외하고, 본 발명의 약제학적 조성물에 이들을 사용하는 것이 구상된다. 보충적인 활성 화합물이 또한 조성물에 도입될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건하에서 멸균 및 안정하여야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀 또는 고약물 농도에 적합한 기타 질서 구조로 제제화될 수 있다. 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅재의 사용, 분산물의 경우는 필요한 입자 크기 유지 및 계면활성제의 사용으로 적당한 유동성이 유지될 수 있다. 많은 경우, 조성물에 등장제, 예를 들면, 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알콜, 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 조성물에 포함시킴으로써 주사용 조성물의 장기 흡수를 이룰 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요한 양의 활성 화합물을, 필요에 따라 상술된 성분중 하나 또는 들 배합물과 함께, 적절한 용매에 도입한 후, 미세여과 멸균시켜 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산물은 활성 화합물을, 염기성 분산물 매질 및 상술된 것 중에서 선택되는 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 부형제에 도입하여 제조된다. 멸균 주사용 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 미리 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 제공하는 진공 건조 및 냉동건조(동결건조)이다.
단일 제형을 제공하기 위해 담체 물질과 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 처리 대상 및 특정 투여 형태에 따라 달라질 것이다. 단일 제형을 제공하기 위해 담체 물질과 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 제공하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 이같은 양은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 100% 중에서 활성 성분 약 0.01 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1 내지 약 30%일 것이다.
투약 계획은 목적하는 최적의 반응(예를 들면, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들면, 단일 볼러스가 투여될 수 있거나, 다수 분할량이 일정 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 또는 용량은 치료 상황의 긴급에 따라 비례해서 증감될 수 있다. 투여의 용이성 및 용량 균일성을 위해, 비경구 조성물을 복용 단위형으로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 원에 사용된 복용 단위형은 치료할 대상에 단일 복용형으로 적합한 물리적 불연속 단위를 말하며, 이때 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께, 목적하는 치료 효과를 산출하도록 계산된 활성 화합물의 소정량을 함유한다. 본 발명의 복용 단위형 규격은 개체의 민감성을 치료하는 경우 (a) 활성 화합물의 고유 특성 및 이룰 특정 치료 효과, 및 (b) 활성 화합물을 배합하는데 업계에 내재해 있는 제한에 좌우되고, 이에 직접 의존한다.
Figure 112016037106659-pat00001
구체적 예시
본 발명의 개시내용이 하기 실시예로 더욱 상세히 설명될 것이나, 한정적인 의미로 해석하여서는 안된다. 본 출원에 인용된 모든 도면, 참조문헌, 특히 및 공개된 특허 출원은 명백히 그의 전체내용이 참고로 본 원에 포함된다.
일반적으로, 본 발명의 실시는 달리 제시되지 않는 한, 통상의 화학 기술, 분자 생물학, 재조합 DNA 기술 및 면역학(특히, 예를 들면 면역글로불린 기술)을 이용한다[참조예: Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr(1996); Antibody Engineering: A Practical Approach(Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., IrI Pr(1996); Antibody: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub.(1999); Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)]. 예를 들면, 폴리테릭스(Polytherics) 사에 의한 US6803438호; EP1701741A2호; EP1648518A2호; WO05065712A2호; WO05007197A2호; EP1496941A1호; EP1222217B1; EP1210093A4호; EP1461369A2호; WO03089010A1호; WO03059973A2호; 및 EP1210093A1호; 제네테크(Genentech) 사에 의한 US20070092940A1호 및 EP1240337B1호; 및 에스바테크(ESBATech) 사에 의한 U.S.S.N. 60/899,907호 및 WO03097697A2호도 또한 참조바람.
ESBA105의 페길화
ESBA105(서열번호 7) 및 ESBA105-SS-링커(서열번호 8)에서 설프히드릴 그룹을 변형하는데 메틸-PEO12-말레미드(Pierce), 설프히드릴-반응 페길화 시약을 사용하였다. ESBA105는 측쇄 황 원자가 디설파이드 결합으로서 쌍으로 발생하는 시스테인 잔기를 함유하기 때문에, 이들 디설파이드 결합의 환원은 메틸-PEO12-말레미드로 페길화하기 위한 표적으로 제공되는 설프히드릴 그룹의 노출을 필요로 한다. ESBA105 및 ESBA105-SS-링커의 페길화는 PEG 공급업체(Thermo Scientific: Pierce Protein Research Products)에서 추천하는대로 수행하였다. 요약하면, 약 2 mg의 ESBA105를 4 ℃에서 20 mM DTT 존재하에 30 분간 인큐베이션하여 디설파이드 결합을 환원시켰다. DTT를 제거하기 위해, 환원된 ESBA105를 Slide-A-Lyzer 투석 카세트(Pierce; 컷오프(cut-off): 7000 Da)를 사용해 PBS(pH 6.5)로 투석하였다. 투석 및 농도 상향 후, 20-배 몰 과량의 메틸-PEO12-말레미드를 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하여 단백질 2 mg/ml를 페길화하였다. Slide-A-Lyzer 투석 카세트(Pierce; 컷오프: 7000 Da)를 사용해 표지 단백질을 비반응 메틸-PEO12-말레미드로부터 정제하였다.
SDS-PAGE
상업적으로 입수가능한 인비트론(Invitrogen) 사의 Bis-Tris 전기이동 시스템을 이용해 비환원 조건하에서 공급업체 지시에 따라 SDS-PAGE를 수행하였다. 5 μg의 단백질 샘플을 프리캐스트(precast) 12% Bis-Tris 겔상에 로딩하였다. 겔을 쿠마시 시약(Coomassie reagent)(0.1%(w/v) 쿠마시 G250, 10% 빙초산, 50% 에탄올)으로 15 분간 염색하였다. 10%(v/v) 아세트산을 사용하여 탈염하였다.
웨스턴 블롯 분석으로 페길화 확인
1, 10 및 100 ng의 페길화 ESBA105-SS-링커를 프리캐스트 12% Bis-Tris 겔상에 로딩하였다. 샘플을 니트로셀룰로스 막상에 블롯팅하고, 토끼 모노클로날 항-PEG 항체(Epitomics)로 PEG 부분을 검출하였다. 일차 항체와 인큐베이션한 후, 막을 겨자무과산화효소(HRP)-접합 염소 항-토끼 폴리클로날 항체(Santa Cruz)와 인큐베이션하였다. 화학발광 검출 시스템(Pierce)으로 막에 대한 항체의 특이적 결합을 검출하였다.
직접 ELISA로 인간 TNF 알파에 대한 페길화 ESBA105 결합 확인
ESBA105 및 그의 유도체 결합을 직접 ELISA로 평가하였다. 인간 TNF 알파(PeproTech EC Ltd)를 96-웰 미량역가판상에 코팅한 후, BSA(소 혈청 알부민)로 블록킹하였다. ESBA105 및 ESBA105 유도체를 50 nM, 12.5 nM, 3.13 nM, 1.56 nM, 0.78 nM, 0.39 nM, 0.20 nM, 0.10 nM 및 0.05 nM 농도에서 검사하였다. 이어, 비오티닐화 토끼 폴리클로날 항-ESBA105 항체(AK3A, ESBATech에서 제조), 스트렙타빈 폴리 HRP 및 발색 기질(POD)을 첨가하여 인간 TNF 알파에 대한 ESBA105 및 그의 유도체 결합을 가시화하였다. 분광광도계를 사용하여 450 nM에서 광밀도(OD)를 측정해 상기 반응 산물을 검출하였다. 4-변수 로지스틱 곡선 피트(4-parameter logistic curve fit)로 데이터를 분석하고, scFv의 용량-반응 곡선으로부터 EC50 값을 산출하였다.
링커에 Pepl을 갖는 ESBA903 및 ESBA903의 표면 플라즈몬 공명 분석
결합 친화성을 측정하는데, BIAcore™-T100을 이용한 표면 플라즈몬 공명 측정을 이용하였다. 이들 실험에서는, 정제된 에스케리키아 콜리((Escherichia coli)-발현 재조합 인간 VEGF165(PeproTech EC Ltd)가 사용되었다. 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩(CM4, GE Healthcare)을 공급업체 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드 및 N-하이드록시숙신이미드로 활성화시켰다. 인간 VEGFi65를 표준 아민-커플링 절차를 이용하여 CM4 센서 칩상에 있는 4개의 상이한 유세포중 하나에 커플링시켰다. 커플링 및 블록킹 후 고정된 hVEGF165 분자로 얻은 반응 범위는 약 120 내지 140 반응 단위(RU)였다. 각 칩에서 네번째 유세포를 블록킹 전 단백질을 고정화시키지 않는 것만을 제외하고 상기와 유사하게 처리하고, 유세포를 인라인 기준(in-line reference)으로 사용하였다. HBS-EP 버퍼(0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20) 중 다양한 농도의 항-VEGF scFv(20 nM, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1.25 nM, 0.63 nM, 0.31 nM 및 0.16 nM)를 30 μl/분의 속도로 5 분동안 유세포에 주입하였다. CM4 칩상에서 VEGF로부터 항-VEGF scFv 해리를 25 ℃에서 10 분간 진행시켰다. 인라인 기준 세포 보정에 이어 버퍼 샘플을 감하여 각 항-VEGF scFv 샘플에 대한 센서그램(sensorgram)을 생성하였다. BIAcore T1OO 평가 소프트웨어 버전 1.1과 일대일 랑뮈르(one-to-one Langmuir) 결합 모델을 이용하여 겉보기 해리 속도 상수(k<ι), 겉보기 회합 속도 상수(ka) 및 겉보기 해리 평형 상수(KD)를 계산하였다.
scFv의 클로닝 및 발현
본 원에 기술되고 특정된 scFv를 다음과 같이 제조하였다. 일부의 경우, 다양한 scFv를 코딩하는 DNA 서열은 서비스 공급체 Entelechon GmbH (www.entelechon.com)에서 데노보(de novo) 합성되었다. 생성된 DNA 삽입물을 각각 scFv DNA 서열의 5' 및 3' 말단에 도입된 Ncol 및 HindIII 제한 부위를 통해 박테리아 발현 벡터 pGMP002에 클로닝하였다. 일부의 경우에는, VH와 VL 도메인 간 적합한 제한 부위에 클로닝함으로써 변형된 링커가 각각의 아미노산 분자를 코딩하는 어닐링된 상보성 올리고로서 최신 방법으로 도입되었다. 다른 경우에는, 점 돌연변이가 최신 어셈블링 PCR 방법을 이용하여 VH 및/또는 VL 도메인으로 도입되었다. GMP002 클로닝에 대해서는 WO2008006235호의 실시예 1에 기술되어 있다. scFv 생성은 본 원에 참고로 원용되는 WO08/006235호의 실시예 1에서 ESBA105에 대해 기술된 바와 같이 수행하였다.
실시예 1
ESBA105 및 ESBA105 -SS-링커의 페길화
ESBA105(서열번호 7)는 인간 TNFα에 특이적으로 결합하여 이를 저해하는 단일 쇄 항체이다(참조예: 본 원에 참고로 원용되는 WO 06/131013호). ESBA105-SS-링커(서열번호 8)는 링커가 SS-링커(서열번호 3)로 대체된 ESBA105 변이체이다.
ESBA105, DTT로 환원된 ESBA105, 환원 및 시스테인 페길화된 ESBA105, 및 환원 및 시스테인 페길화 후 투석된 ESBA105를 SDS-PAGE로 분석하였다. 단백질 페길화시, 분자량이 약 4 kDa 증가될 것으로 예상된다. "환원된 ESBA105" 및 "환원 및 시스테인-페길화된 ESBA105"는 ESBA105에 비해 약간 더 높은 위치로 이동한다. cys 페길화 ESBA105 투석시, 단백질은 ESBA105와 동일한 위치로 이동하며, 이는 단백질 이동이 페길화에 의한 것이 아니며 투석동안 설프히드릴 그룹이 산화되어 다시 형성되는 디설파이드 결합의 환원에 의한 것임을 제시한다. 이들 데이터는 ESBA105의 환원된 분자내 시스테인(SH)이 PEG-NHS에 접근성이 낮음을 보여준다. 도 1의 레인 6 및 7에 나타낸 바와 같이, 일차 아민(N-말단의 리신 잔기)은 ESBA105에 있는 분자내 시스테인의 설프히드릴 그룹과 달리, PEG-NHS에 접근성이 용이하다.
상술한 바와 같이 상이하게 처리된 ESBA105 제제의 활성을 ELISA 실험으로 평가하였다. 도 2에 도시된 ELISA 분석은 환원된 ESBA105가 산화된 ESBA105 만큼 활성적임을 나타낸다. Cys 페길화 ESBA105는 ESBA105에 비해 결합 활성이 아주 미미한 정도로 손실된 것으로 나타났다. 그러나, 도 1에 도시된 바와 같이, ESBA105에서 사슬내 디설파이드의 페길화 정도는 낮았다. 인간 TNF 알파에 대한 결합 활성이 아주 조금 손실되었고 Lys-페길화는 성공적이었다.
본 발명의 목적은 cys-페길화에 민감한 scFv 항체를 제공하는 것이다. 제 1 단계에서, 비페길화 ESBA105-SS-링커 분자가 ESBA105에 비해 여전히 활성적인지를 조사하였다. 도 4A에 도시된 바와 같이, 이것이 ELISA 분석으로 확인되면, ESBA105-SS-링커를 cys-페길화시켰다. 성공적인 cys-페길화인지를 검사하기 위해서, ESBA105-SS-링커, 환원된 ESBA105-SS-링커, 환원된 cys 페길화 ESBA105-SS-링커 및 투석된 cys 페길화 ESBA105-SS-링커를 SDS-PAGE로 분석하였다(도 4B 참조). 페길화 ESBA105-SS-링커는 ESBA105-SS-링커 보다 더 높은 위치로 이동하여 ESBA105-SS-링커가 성공적으로 페길화되었음을 입증한다. 토끼 항-PEG 모노크로날 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석으로 ESBA105-SS-링커의 페길화를 확인하였다(도 4C 참조). 100 ng/ml 페길화 ESBA105-SS-링커로 예정 크기의 시그널이 검출되었다. 또한, 도 6에 도시된 ELISA 분석은 cys-페길화 ESBA105-SS-링커가 네이키드(naked) ESBA105에 비해 거의 완전히 활성적임을 예증한다.
모노특이적 반응 그룹을 갖는 PEG를 사용한 ESBA105 SS-링커의 종래 cys-페길화를 도 3(가운데)에 개략적으로 도시하였다. 또 다른 cys-페길화 방법이 또한 도 3에 도시되었다(우측). 이 후자의 방법은 이기능성 반응 그룹에 부착된 PEG(그의 좌측 말단에 PEG 분자를 갖는 수평 "T"로 개략적으로 표시)를 사용하며, 이는 단백질내 디설파이드 결합의 양 시스테인 잔기에 PEG 분자가 연결가능하도록 한다. 이러한 링커 기술은 문헌[Shaunak et al. Nature Chemical Biology 2006, volume 2 page 312; Brocchini et al, Nature Protocols, 2006: 1(5), 241] 및 WO05/007197호에 기술되어 있다.
실시예 2
SS-링커에 결합 활성 도입
본 발명의 제 2 면은 폴리펩티드(예를 들면, scFv)에 추가적인 결합 특이성을 도입하는 것이다. 본 실시예에서는, 파지 디스플레이 선별동안 히알우론산에 결합하는 것으로 확인된 Pep-1 펩티드(Mummert et al. J. Exp. Med. 2000, volume 192, page 769)를 SS 링커의 루프 영역에 도입하여 SS Pepl 링커(서열번호 4)를 생성하였다. SS Pepl 링커를 scFv ESBA903에 도입하여 ESBA903 SS Pepl 링커(종종 ESBA903-Pepl로도 칭해짐; 서열번호 6)를 생성하였다. 도 7에 예시된 표면 플라즈몬 공명 결과로 입증되는 바와 같이, 그의 루프에서 Pepl 12mer 펩티드를 디스플레이하는 ESBA903-Pepl은 비변형 ESBA903(서열번호 5)과 동등하게 그의 표적(VEGF)에 결합하며, 따라서 여전히 완전 기능성을 갖는다(Kd 값이 각각 4.436E-11 M 및 5.608E-11 M로 측정됨). ESBA903-Pepl은, 예를 들면 유리체 또는 관절과 같이, 히알우론산이 존재하는 부위에 적용되는 경우, 네이키드 ESBA903 보다 국소 반감기가 연장되도록 설계되었다.
동등성
당업자들이라면 단지 통상적인 실험만으로도 본 원에 개시된 본 발명의 특정 구체예에 대한 많은 동등물을 알 수 있거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 동등물은 하기 청구범위에 의해 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ESBATech AG <120> Functionalized polypeptides <130> P104981PC00 <150> US61/076775 <151> 2008-06-30 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ss linker sequence, general structure <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X is any amino acid; 3-15 amino acids are present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is any amino acid; 3-50 amino acids are present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X is any amino acid; 3-15 amino acids are present <400> 1 Xaa Cys Xaa Cys Xaa 1 5 <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> X is any amino acid; 3-50 amino acids are present. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X is any amino acid; 3-50 amino acids are present. <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Xaa Cys Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 <210> 3 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 4 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 4 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Gly Ala His Trp Gln 1 5 10 15 Phe Asn Ala Leu Thr Val Arg Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Ser <210> 5 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv ESBA903 <400> 5 Met Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ile Ile His Ser 20 25 30 Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Tyr Leu Ala Ser 85 90 95 Thr Asn Gly Ala Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 130 135 140 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser 145 150 155 160 Leu Thr Asp Tyr Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 165 170 175 Gly Leu Glu Trp Val Gly Phe Ile Asp Pro Asp Asp Asp Pro Tyr Tyr 180 185 190 Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys 195 200 205 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 210 215 220 Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Asp His Asn Ser Gly Trp Gly Leu Asp 225 230 235 240 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 6 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv ESBA903 with SS linker <400> 6 Met Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ile Ile His Ser 20 25 30 Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Tyr Leu Ala Ser 85 90 95 Thr Asn Gly Ala Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Gly Ala His Trp Gln 115 120 125 Phe Asn Ala Leu Thr Val Arg Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 145 150 155 160 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr 165 170 175 Asp Tyr Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 180 185 190 Glu Trp Val Gly Phe Ile Asp Pro Asp Asp Asp Pro Tyr Tyr Ala Thr 195 200 205 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 210 215 220 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 225 230 235 240 Tyr Cys Ala Gly Gly Asp His Asn Ser Gly Trp Gly Leu Asp Ile Trp 245 250 255 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 260 265 <210> 7 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv ESBA105 <400> 7 Met Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Gly Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser Val Ser 20 25 30 Asn Asp Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser 85 90 95 Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 145 150 155 160 His Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 165 170 175 Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp 180 185 190 Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr 195 200 205 Val Tyr Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 225 230 235 240 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 8 <211> 256 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv ESBA105 with SS linker <400> 8 Met Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Gly Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser Val Ser 20 25 30 Asn Asp Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser 85 90 95 Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val 130 135 140 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser 145 150 155 160 Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr Gly Met Asn Trp Val 165 170 175 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr 180 185 190 Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr 195 200 205 Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Thr Ser 210 215 220 Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Gly 225 230 235 240 Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 255

Claims (2)

  1. (a) 펩티드 서열의 라이브러리를 제공하는 단계;
    (b) 라이브러리로부터 표적 분자에 결합하는 적어도 하나의 펩티드 서열을 확인하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 확인된 적어도 하나의 펩티드 서열을 포함하도록 링커-함유 폴리펩티드의 루프 영역을 변경시켜 폴리펩티드를 기능화시키는 단계를 포함하며,
    상기 링커-함유 폴리펩티드는, 사슬내 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 두 시스테인을 갖는 아미노산 링커로 연결된 항체 VH 도메인 및 항체 VL 도메인을 포함하며, 링커 서열내 시스테인 간 아미노산은 두 시스테인이 서로 디설파이드 결합되는 경우 루프(loop)를 형성하는 폴리펩티드인,
    폴리펩티드의 기능화 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 확인하는 단계가 파지 디스플레이, 이스트 디스플레이 또는 mRNA 디스플레이를 이용하여 수행되는, 폴리펩티드의 기능화 방법.
KR1020167010129A 2008-06-30 2009-06-30 기능화 폴리펩티드 KR101711472B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7677508P 2008-06-30 2008-06-30
US61/076,775 2008-06-30
PCT/CH2009/000225 WO2010006454A2 (en) 2008-06-30 2009-06-30 Functionalized polypeptides

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117001520A Division KR101678925B1 (ko) 2008-06-30 2009-06-30 기능화 폴리펩티드

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160046927A KR20160046927A (ko) 2016-04-29
KR101711472B1 true KR101711472B1 (ko) 2017-03-02

Family

ID=41139486

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117001520A KR101678925B1 (ko) 2008-06-30 2009-06-30 기능화 폴리펩티드
KR1020167010129A KR101711472B1 (ko) 2008-06-30 2009-06-30 기능화 폴리펩티드

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117001520A KR101678925B1 (ko) 2008-06-30 2009-06-30 기능화 폴리펩티드

Country Status (12)

Country Link
US (3) US8637022B2 (ko)
EP (2) EP2304033B1 (ko)
JP (3) JP5988580B2 (ko)
KR (2) KR101678925B1 (ko)
CN (2) CN102089431A (ko)
AU (1) AU2009270405B2 (ko)
BR (1) BRPI0915343A2 (ko)
CA (1) CA2729185A1 (ko)
MX (2) MX344076B (ko)
RU (2) RU2582244C2 (ko)
WO (1) WO2010006454A2 (ko)
ZA (1) ZA201008596B (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110031373A (ko) 2008-07-10 2011-03-25 에스바테크, 언 알콘 바이오메디칼 리서치 유닛 엘엘씨 마크로분자 전달을 증강하는 방법 및 조성물
US20100056766A1 (en) * 2008-08-27 2010-03-04 Abbott Laboratories Purification of biological conjugates by size exclusion chromatography
AR083495A1 (es) 2010-10-22 2013-02-27 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Anticuerpos estables y solubles
CN109608543A (zh) 2011-10-20 2019-04-12 艾斯巴技术-诺华有限责任公司 稳定的多抗原结合抗体
EP3122777B1 (en) 2014-03-26 2020-12-23 Cell Medica Switzerland AG Binding members to tnf alpha
TWI806150B (zh) 2014-11-07 2023-06-21 瑞士商諾華公司 穩定的含有高濃度抗vegf抗體之蛋白質溶液調配物
KR20220062494A (ko) * 2019-08-15 2022-05-17 얀센 바이오테크 인코포레이티드 개선된 단일 사슬 가변 단편을 위한 재료 및 방법

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB9225453D0 (en) * 1992-12-04 1993-01-27 Medical Res Council Binding proteins
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
WO1998031700A1 (en) 1997-01-21 1998-07-23 The General Hospital Corporation Selection of proteins using rna-protein fusions
US20050159343A1 (en) * 1999-03-26 2005-07-21 Board Of Regents, University Of Texas System Inhibitors of glycosaminoglycans
DK1165112T3 (da) 1999-03-26 2006-10-09 Univ Texas Modulatorer af polysaccharider og anvendelser deraf
AU7346400A (en) 1999-09-03 2001-04-10 School Of Pharmacy, University Of London, The Degradable polymers
EP1222217B1 (en) 1999-09-08 2005-06-15 Polytherics Limited Uniform molecular weight polymers
US20050287153A1 (en) * 2002-06-28 2005-12-29 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
CA2390691C (en) 1999-12-24 2016-05-10 Genentech, Inc. Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds
CA2406593A1 (en) * 2000-04-20 2001-11-01 Cangene Corporation Rhamm peptide conjugates
US7211395B2 (en) * 2001-03-09 2007-05-01 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
CA2444098C (en) * 2001-04-19 2016-06-21 The Scripps Research Institute Methods and composition for the production of orthogonal trna-aminoacyltrna synthetase pairs
GB0131112D0 (en) 2001-12-31 2002-02-13 Univ London Pharmacy Block copolymers
GB0209022D0 (en) 2002-04-19 2002-05-29 Imp College Innovations Ltd Compounds
DK1506236T3 (da) * 2002-05-22 2013-03-04 Esbatech A Novartis Co Llc Immunglobulin-frameworks, der udviser forbedret stabilitet i det intracellulære miljø og fremgangsmåder til identifikation deraf
AU2003301122B2 (en) 2002-12-19 2009-11-26 Nektar Therapeutics Cyanovirin variant-polymer conjugates
US7834258B2 (en) * 2003-06-30 2010-11-16 Mu-Hyeon Choe Dimer of chimeric recombinant binding domain-functional group fusion formed via disulfide-bond-bridge and the processes for producing the same
GB0316294D0 (en) 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
GB0400264D0 (en) 2004-01-07 2004-02-11 Polytherics Ltd Complexes
EP1769000B1 (en) * 2004-07-16 2014-12-24 Amgen Research (Munich) GmbH Expression-enhanced polypeptides
NZ553500A (en) * 2004-09-23 2009-11-27 Genentech Inc Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates withCysteine engineered antibodies and conjugates with a free cysteine amino acid in the heavy chain a free cysteine amino acid in the heavy chain
CA2580796C (en) * 2004-09-24 2013-03-26 Amgen Inc. Modified fc molecules having peptides inserted in internal loop regions
US20060147862A1 (en) * 2005-01-06 2006-07-06 Jeffrey Bell Reduced smoking wick and candle
US7723472B2 (en) * 2005-02-28 2010-05-25 The Regents Of The University Of California Extracellular matrix binding chimeric proteins and methods of use thereof
KR101457223B1 (ko) 2005-06-07 2014-11-04 에스바테크 - 어 노바티스 컴파니 엘엘씨 ＴＮＦα를 억제하는 안정적이고 가용성인 항체
JP2009509535A (ja) * 2005-09-27 2009-03-12 アムニクス， インコーポレイテッド タンパク様薬剤およびその使用
KR101571027B1 (ko) * 2006-06-12 2015-11-23 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 효과기 기능을 갖는 단일쇄 다가 결합 단백질
RU2438708C2 (ru) 2006-07-10 2012-01-10 Эсбатек, Эн Элкон Биомедикал Рисёрч Юнит Ллк ScFv-АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ ПРОХОДЯТ ЧЕРЕЗ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЙ И/ИЛИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЙ СЛОИ
RU2010102064A (ru) 2007-06-25 2011-07-27 Эсбатек, Эн Элкон Биомедикал Рисёрч Юнит Ллк (Ch) Способ конструирования, основанный на определении последовательностей, способ оптимизации одноцепочечных антител
MX2009013328A (es) * 2007-06-25 2010-06-02 Esbatech An Alcon Biomedical R Metodos para modificar anticuerpos, y anticuerpos modificados con propiedades funcionales mejoradas.
EP3216803B1 (en) * 2008-06-25 2020-03-11 Novartis Ag Stable and soluble antibodies inhibiting vegf

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Curr. Opin. Biotechnol. Vol. 8, No. 4, pp. 429-434 (1997.08.)
J. Exp. Med., Vol. 192, No. 6, pp. 769-779 (2000.09.18.)

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010006454A2 (en) 2010-01-21
WO2010006454A3 (en) 2010-03-25
ZA201008596B (en) 2012-02-29
AU2009270405A1 (en) 2010-01-21
CN102089431A (zh) 2011-06-08
US8637022B2 (en) 2014-01-28
US9371525B2 (en) 2016-06-21
JP2016147909A (ja) 2016-08-18
BRPI0915343A2 (pt) 2015-10-27
RU2016108598A (ru) 2018-11-23
JP5988580B2 (ja) 2016-09-07
MX2011000006A (es) 2011-08-03
EP3130603A1 (en) 2017-02-15
RU2011103168A (ru) 2012-08-10
JP2011526145A (ja) 2011-10-06
KR20160046927A (ko) 2016-04-29
EP2304033B1 (en) 2016-09-07
CA2729185A1 (en) 2010-01-21
MX344076B (es) 2016-12-05
KR101678925B1 (ko) 2016-11-24
US20160354479A1 (en) 2016-12-08
CN105153300A (zh) 2015-12-16
EP2304033A2 (en) 2011-04-06
RU2582244C2 (ru) 2016-04-20
AU2009270405B2 (en) 2014-06-05
JP2014111670A (ja) 2014-06-19
US20110200594A1 (en) 2011-08-18
KR20110039274A (ko) 2011-04-15
US20140178386A1 (en) 2014-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11858979B2 (en) Fibronectin based scaffold domain proteins that bind PCSK9
KR101711472B1 (ko) 기능화 폴리펩티드
Niesner et al. Quantitation of the tumor-targeting properties of antibody fragments conjugated to cell-permeating HIV-1 TAT peptides
CN103180339B (zh) 具有改善的稳定性的基于纤连蛋白的支架蛋白质
KR101151805B1 (ko) 바이포달 펩타이드 바인더
Lühmann et al. Site-specific POxylation of interleukin-4
US20220281985A1 (en) Single chain fusionconstructs comprising multimeric antibody fragments fused to collagen trimerization domains
KR20120125455A (ko) 세포내 타겟 결합용 바이포달 펩타이드 바인더
EP4204439A1 (en) Glycosylated il-2 proteins and uses thereof
KR20200089282A (ko) 등장화제로서 라이신 염을 함유하는 아플리베르셉트 제제 및 그것의 용도
WO2023092324A1 (zh) 多特异性配体结合分子及其应用
AU2014215955B2 (en) Functionalized polypeptides
US6413934B1 (en) Streptavidin mutants having secondary functional domains
CN116162148A (zh) 多特异性配体结合分子及其应用
AU2016253633A1 (en) Functionalized polypeptides
US20240209098A1 (en) Fusion proteins with specifity for type ii collagen and vegf-a for the treatment of eye diseases

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant