JP2011526145A - 機能性ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2008年6月30日に出願された米国仮特許出願番号第61/076,775号(名称「Methods And Compositions For Modifying Immunobinders」)への優先権を主張し、上記米国仮特許出願の内容は、その全容が参照によって本明細書に援用される。
治療用ポリペプチドの効能はしばしば、それらに固有の薬物動態特性によって大きく制限される。例えば、治療用抗体の場合、組織浸透、組織滞留(residency)および血清半減期に関する問題が頻繁に報告されている。治療用ポリペプチドの薬物動態特性を改善して、効能の改善および投与レジメンの低量化をもたらすことができる。治療用ポリペプチドの薬物動態特性を調節する現在の方法は典型的には、血清半減期の問題に対処することに制限されている。さらに、これらの方法には典型的に、既存のポリペプチドの、時間を要するかまたは非特異的な化学的変化が関与する。
本発明は、機能性ポリペプチド、特に、治療用ポリペプチド(例えば、scFv)を提供する。本発明のポリペプチドは、1つまたは複数の機能性部分(例えば、PEG)および/または結合特異性(例えば、特定の結合特異性を示すアミノ酸配列)を付加することによって、迅速かつ特異的に機能性を付与され得るリンカー配列を含む。そのような機能性ポリペプチドは、非機能性ポリペプチドと比べて、薬物動態特性の改善(例えば、インビボにおける半減期、組織浸透および組織滞留時間の改善)を示すという点で好都合である。また、機能性ポリペプチドの迅速でかつ再現性のある生成のための方法も提供する。
(定義)
ポリペプチドに関する「ドメイン」という用語は、当該分野で認識されている意味をとり、個別の単位の三次構造を指す。ドメインの例としては、これらに限定されないが、抗体のVHドメインまたはVLドメイン、フィブロネクチンのドメインおよびアンキリン反復ドメインが挙げられる。
1つの態様では、本発明は、2つのドメインを含むポリペプチドを提供し、これらのドメインは、アミノ酸リンカーによってつながれており、このリンカーは、鎖内ジスルフィド結合を形成することができる2つのシステイン残基を含有する。そのようなリンカーは、機能性部分(例えば、PEG)の部位特異的付加、および/またはこのポリペプチドへの、1つもしくは複数の結合親和性の付加を可能にする点で特に好都合である。本発明のリンカーを、好ましくは、遺伝子工学によって遺伝子的に、あるドメインにつなぎ、より好ましくは2つのドメイン間につなぎ、それによって、それらを連結して、単一のポリペプチドを形成する。あるいは、アミノ酸をつなぐための任意の当該分野で認識されている化学反応を使用して、本発明のリンカーをあるドメインに化学的につなぐこともできる。任意の当該分野で認識されている化学反応によって、機能性部分をこのリンカーに接続することができる。好ましくは、機能性部分は、このリンカー中に存在する1つまたは複数のシステインに接続されている。
本発明は、機能性ポリペプチド、特に、治療用ポリペプチド(例えば、scFv)を提供する。本発明のポリペプチドは、1つまたは複数の機能性部分(例えば、PEG)および/または結合特異性(例えば、特定の結合特異性を示すアミノ酸配列)を付加することによって、迅速かつ特異的に機能性を付与され得るリンカー配列を含む。
本発明のリンカーは、非還元条件下で鎖内ジスルフィド結合を形成する少なくとも2つのシステイン残基を含有する(図3を参照されたい)。このジスルフィド結合によって、機能性部分(例えば、PEG)を、本明細書に記載する方法を使用してリンカーに部位特異的に付加することが可能となる。具体的には、このジスルフィド結合中のシステイン残基を機能性部分(例えば、PEG)に共有結合させることができる。露出しているシステインによって、はるかに良好な定方向のペグ化が可能になるので、PEG付加部位に関して不均質な集団をしばしばもたらす、従来のPEG付加部位を上回る製造上の利点が達成される。単官能性反応基を含有する機能性部分を利用する場合、この機能性部分が、単一のシステイン残基に連結される。しかし、ジスルフィド結合に特異的である二官能性反応基を含有する機能性部分を利用する場合には、この機能性部分は、鎖内ジスルフィド結合の両方のシステイン残基に連結される。そのような二官能性試薬は、当該分野では周知であり、それらとしては、ビス−スルホンが挙げられる(例えば、Brocchiniら、Nature Protocols、2006年:1巻(5号)241頁を参照されたい)。
本発明のリンカー中のシステイン残基によって鎖内ジスルフィド結合を形成させて、これらシステイン残基間のリンカーのアミノ酸配列を環化して、ループを形成する(図3および5を参照されたい)。このループ構造は、この構造を改変して、1つまたは複数の特定の結合特異性を示すアミノ酸配列を含ませ、したがって、追加の機能性を、このループが一部をなすポリペプチドに付加することができる点で特に好都合である。
それに加えてまたは代わって、本発明のポリペプチドを、このリンカー領域の外側の1つまたは複数のアミノ酸残基において機能性部分(例えば、PEG)に共有結合させることもできる。1つまたは複数のこのポリペプチドの機能特性を実質的に損なうことのない任意のアミノ酸残基、例えば、表面に露出しているリジン残基およびシステイン残基を利用することができる。所望により、ポリペプチドを(付加または置換により)改変して、機能性部分への連結に適した追加の反応性のアミノ酸を導入することができる。特定の実施形態では、ポリペプチドを改変して、少なくとも一対のシステイン残基を含有させ、少なくとも一対のこれらのシステイン残基は成熟したポリペプチド中で鎖内ジスルフィド結合を形成する。機能性部分を、単官能性反応基を使用して、単一の反応性の残基(例えば、システイン)に連結してもよく、または二官能性のジスルフィド結合に特異的な反応基(例えば、ビス−スルホン)を使用して、2つの、ジスルフィド結合システインに連結してもよい。
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチド(例えば、ScFv)の組成物の薬学的処方物に関する。そのような処方物は典型的には、このポリペプチド(例えば、ScFv)の組成物および薬学的に許容できる担体を含む。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる担体」は、生理学的に適合性である、任意かつ全ての溶媒、分散媒、被覆剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、(例えば、眼、皮膚もしくは上皮層への)局所投与、吸入による投与、非経口投与、脊髄投与または上皮投与(例えば、注射または注入による)に適している。投与経路に応じて、これらのポリペプチド(例えば、ScFv)を、材料中に被覆して、化合物を不活性化する恐れがある酸の作用およびその他の天然の条件から、化合物を保護することができる。
本開示を、以下の実施例によってさらに例証するが、これらの実施例を、本発明をさらに限定するものであると解釈すべきではない。本出願の全体を通して引用するすべての図、参考文献、特許および公開されている特許出願の内容は、その全容が参照により本明細書に明示的に援用される。
メチル−PEO12−マレイミド(Malemide)(Pierce)、すなわち、スルフヒドリル反応性ペグ化試薬を使用して、ESBA105(配列番号7)およびESBA105−SS−リンカー(配列番号8)中のスルフヒドリル基を改変した。ESBA105は、その側鎖の硫黄原子がジスルフィド結合として対をなして存在するシステイン残基を含有するので、メチル−PEO12−マレイミドを用いるペグ化のための標的として働く、これらのスルフヒドリル基を露出させるために、これらのジスルフィド結合を還元することが必要である。ESBA105およびESBA105−SS−リンカーのペグ化を、PEGの供給元(Thermo Scientific:Pierce Protein Research Products)の推奨に従って実施した。手短に述べると、およそ2mgのESBA105を、20mM DTTの存在下、4℃で30分間インキュベーションすることによって、ジスルフィド結合を還元した。DTTを除去するために、還元したESBA105を、PBS(pH6.5)に対して、Slide−A−Lyzer Dialysisカセット(Pierce;カットオフ:7000Da)を使用して透析した。透析および濃縮した後、2mg/mlのタンパク質を、20倍モル過剰なメチル−PEO12−マレイミドと4℃で一晩インキュベーションすることによってペグ化した。標識化タンパク質を、反応していないメチル−PEO12−マレイミドから、Slide−A−Lyzer Dialysisカセット(Pierce;カットオフ:7000Da)を使用する透析によって精製した。
SDS−PAGEを、非還元条件下で、Invitrogenから市販されているBis−Tris電気泳動システムを使用して、供給元の推奨に従って実施した。5μgのタンパク質試料を、プレキャスト12%Bis−Trisゲル上に添加した。このゲルを、クマシー試薬(0.1%(w/v)クマシーG250、10%氷酢酸、50%エタノール)を使用して15分間染色した。脱染は、10%(v/v)酢酸を使用して行った。
1、10および100ngのペグ化ESBA105−SS−リンカーを、プレキャスト12%Bis−Trisゲル上に添加した。試料を、ニトロセルロース膜上にブロットし、PEG部分を、ウサギモノクローナル抗PEG抗体(Epitomics)を用いて検出した。一次抗体とのインキュベーション後、膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合体化ヤギ抗ウサギポリクローナル抗体(Santa Cruz)とインキュベートした。抗体の、膜への特異的結合を、化学発光検出システム(Pierce)によって検出した。
ESBA105およびその誘導体の結合を、直接ELISAによって評価した。ヒトTNFアルファ(PeproTech EC Ltd)を、96ウエルのマイクロタイタープレート上にコートし、次いで、BSA(ウシ血清アルブミン)を使用してブロックした。ESBA105およびESBA105誘導体を、50nM、12.5nM、3.13nM、1.56nM、0.78nM、0.39nM、0.20nM、0.10nMおよび0.05nMの濃度で試験した。それに続いて、ビオチン化ウサギポリクローナル抗ESBA105抗体(AK3A、ESBATechにおいて生成した)、ストレプトアビジンポリHRP、および発色基質(POD)を添加することによって、ESBA105およびその誘導体の、ヒトTNFアルファに対する結合を可視化した。この反応の産物を、分光計を使用して450nMにおける光学密度(OD)を測定することによって検出した。データを、4パラメータロジスティック曲線へのフィットを使用して分析し、EC50値を、scFvの用量−応答曲線から計算した。
結合親和性を測定するために、BIAcoreTM−T100を用いる表面プラズモン共鳴の測定を利用した。これらの実験では、精製Escherichia coil発現組換えヒトVEGF165(PeproTech EC Ltd)を使用した。カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM4、GE Healthcare)を、N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩およびN−ヒドロキシスクシンイミドを用いて、供給元の指示に従って活性化した。ヒトVEGF165を、CM4センサーチップ上の4つの異なるフローセルのうちの1つに、標準的なアミンカップリングの手順を使用してカップリングさせた。カップリングおよびブロッキングの後に固定化hVEGF165分子を用いて得られた応答範囲は、およそ120〜140応答単位(RU)であった。各チップの第4のフローセルを、ブロッキング前にタンパク質を固定化しない以外は同様に処理し、このフローセルを、インラインの参照として使用した。HBS−EP緩衝液(0.01M HEPES、pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性剤P20)中の種々の濃度の抗VEGF scFv(20nM、10nM、5nM、2.5nM、1.25nM、0.63nM、0.31nMおよび0.16nM)を、フローセル中に、30μl/分の流速で5分間注入した。CM4チップ上のVEGFからの抗VEGF scFvの解離を、25℃で10分間進行させた。インライン参照セルについて補正し、これに続いて、緩衝液試料を減じて、センサーグラムを、各抗VEGF scFv試料について得た。見かけの解離速度定数(kd)、見かけの結合速度定数(ka)、および見かけの解離平衡定数(KD)を、BIAcore T100 evaluation Software version 1.1を用いて、一対一ラングミュア結合モデル(one−to−one Langmuir binding model)を使用して計算した。
本明細書において記載し、特徴付けたscFvは、以下に従って産生した。場合によっては、種々のscFvをコードするDNA配列を、サービスの提供元Entelechon GmbH(www.entelechon.com)において新規に合成した。得られたDNA挿入物を、細菌発現ベクターpGMP002中に、scFv DNA配列の5’末端および3’末端においてそれぞれ導入したNcoI制限酵素認識部位およびHindIII制限酵素認識部位を介してクローニングした。場合によっては、改変リンカーを、最先端の方法により、それぞれのアミノ酸分子をコードするアニールさせた相補性を示すオリゴとして、それらをVHドメインとVLドメインとの間の適切な制限酵素認識部位内にクローニングすることによって導入した。その他の場合には、点変異を、VHドメインおよび/またはVLドメイン内に、最先端のアセンブリPCRの方法を使用して導入した。GMP002のクローニングが、WO2008006235の実施例1に記載されている。scFvの産生は、参照により本明細書に援用されるWO08/006235の実施例1のESBA105についての記載に従って実施した。
(ESBA105およびESBA105−SS−リンカーのペグ化)
ESBA105(配列番号7)は、ヒトTNFアルファに特異的に結合し、それを阻害する単鎖の抗体である(例えば、参照により本明細書に援用されるWO06/131013を参照されたい)。ESBA105−SS−リンカー(配列番号8)は、ESBA105の改変体であり、リンカーが、SS−リンカー(配列番号3)で置換されている。
(SS−リンカー内への結合活性の導入)
本発明の第2の適用は、追加の結合特異性をポリペプチド(例えば、scFv)内に導入することである。この実施例では、ファージディスプレイによる選択中に、ヒアルロン酸に結合することが同定されたPep−1ペプチド(Mummertら、J. Exp. Med. 2000年、192巻、769頁)を、SSリンカーのループ領域内に導入して、SS Pep1リンカー(配列番号4)を得た。このSS Pep1リンカーを、scFv ESBA903に導入して、ESBA903 SS Pep1リンカーを産生した(時に、ESBA903−Pep1とも呼ばれる;配列番号6)。図7に示す表面プラズモン共鳴の結果が実証するように、そのループ中にPep1の12アミノ酸長のペプチドを提示するESBA903−Pep1は、その標的(VEGF)に対して、未改変のESBA903(配列番号5)と同じく良好に結合し、したがって、依然として十分な機能を示す(測定したKd値はそれぞれ、4.436E−11Mおよび5.608E−11Mであった)。ESBA903−Pep1を、裸のESBA903と比較して、ヒアルロン酸が存在する部位、例えば、硝子体または関節等に適用した場合に、局所半減期が延長するように設計した。
当業者であれば、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または日常的な実験のみを使用して、それらを究明することが可能である。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。
Claims (21)
- アミノ酸リンカーによって接続されている2つのドメインを含むポリペプチドであって、前記リンカーが、鎖内ジスルフィド結合を形成することができる2つのシステインを含み、前記2つのシステインが相互にジスルフィド結合すると、前記リンカー配列中の前記システイン間のアミノ酸がループを形成する、ポリペプチド。
- 前記リンカーが配列番号1に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記リンカーが配列番号2に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記ループが標的分子に結合する、前述の請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記標的分子がPK変更因子である、請求項5に記載のポリペプチド。
- 前記PK変更因子が血清アルブミンである、請求項5に記載のポリペプチド。
- 前記PK変更因子がヒアルロン酸である、請求項5に記載のポリペプチド。
- 前記リンカーが配列番号3に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記リンカーが配列番号4に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- イムノバインダーである、前述の請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- scFvである、請求項10に記載のポリペプチド。
- 配列番号6または8に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記リンカー中の少なくとも1つのシステイン残基が、機能性部分に共有結合している、前述の請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記リンカー中の前記2つのシステイン残基が、同じ機能性部分に共有結合している、前述の請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記機能性部分がPEGである、請求項13または14に記載のポリペプチド。
- 前述の請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容できる担体を含む組成物。
- 前述の請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
- 請求項17に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項18に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 機能性ポリペプチドを製造する方法であって、
(a)ペプチド配列のライブラリーを提供するステップと、
(b)前記ライブラリーから、標的分子に結合する少なくとも1つのペプチド配列を同定するステップと、
(c)ステップ(b)で同定した少なくとも1つのペプチド配列を含むように、リンカー含有ポリペプチドのループ領域を改変して、それによって、機能性ポリペプチドを製造するステップと
を含む、方法。 - 前記同定ステップが、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイまたはmRNAディスプレイを使用して実施される、請求項20に記載の方法。
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