CN102089431A - 官能化的多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供官能化的多肽，尤其是治疗性多肽(例如，scFv)，其包括可通过添加一个或官能部分(例如，PEG)或结合特异性(例如，有特定结合特异性的氨基酸序列)来快速及特异性地官能化的接头序列。所述官能化的多肽的优点在于，它们相比非官能化的多肽具有改善的药代动力学性质(例如，改善的体内半衰期，组织渗透及组织停留时间)。还提供了快速及可再现产生官能化的多肽的方法。

Description

官能化的多肽
【相关申请】
本申请要求提交于2008年6月30日的题为″Methods And Compositions For Modifying Immunobinders″的美国临时申请No.61/076,775的优先权，将其内容通过引用整体并入本文。
【背景技术】
治疗性多肽的功效常大大受限于它们固有的药代动力学性质。例如，治疗性抗体的情况中，组织渗透，组织停留及血清半衰期的问题常被报道。治疗性多肽的药代动力学性质的改善可导致改善的功效及减少的剂量方案。调节治疗性多肽的药代动力学性质的现有方法一般限于解决血清半衰期的问题。而且这些方法一般涉及耗时或既有多肽的非特异性化学改变。
因此，本领域中有对提供氨基酸修饰的快速及特异手段，及除了半衰期之外，也获得药代动力学参数的调节治疗性多肽的药代动力学性质的改良的方法的需求。
【发明概述】
本发明提供官能化的多肽，尤其是治疗性多肽(例如，scFv)。本发明的多肽包括可通过添加一个或官能部分(例如，PEG)和/或结合特异性(例如，有特定结合特异性的氨基酸序列)来快速及特异性地官能化的接头序列。所述官能化的多肽的优点在于，相比非官能化的多肽具有改善的药代动力学性质(例如，改善的体内半衰期，组织渗透及组织停留时间)。还提供了快速及可再现产生官能化的多肽的方法。
因此，一方面，本发明提供多肽，例如免疫结合子(例如scFv)，包括通过氨基酸接头连接的2个结构域。接头通常包括能形成链内二硫键的2个半胱氨酸，及当2个半胱氨酸通过二硫键彼此键合时，这2个半胱氨酸之间的接头序列中的氨基酸形成环。特定实施方式中，接头包括SEQ ID NO：1或2所示的序列。
某些实施方式中，接头含结合靶分子，例如PK修饰剂(例如，透明质酸，及血清白蛋白)的环。通过结合到靶分子，包括多肽的接头的血清半衰期和/或渗透进组织的功效和/或特定结合特异性增强。特定实施方式中，接头包括SEQ ID NO：3或4所示的氨基酸序列。优选实施方式中，多肽包括SEQ ID NO：6或8所示的氨基酸序列。
某些实施方式中，接头中的至少一个半胱氨酸残基共价连接到官能部分。特定实施方式中，接头中的2个半胱氨酸残基共价连接到相同的官能部分。适宜官能部分包括，例如，PEG，碳水化合物分子及羟乙基淀粉(HES)。将官能部分例如PEG或HES共价连接到多肽之后，所述多肽在受试者中的半衰期延长。
另一实施方式中，本发明提供包括本发明的一或多种多肽及药学可接受的载质的组合物。
其他实施方式中，本发明提供编码本发明的多肽的核酸分子(例如载体)，及含所述核酸分子的宿主细胞。
另一实施方式中，本发明提供生产官能化的多肽的方法。所述方法通常包括：提供肽序列库，从库中鉴定结合靶分子的至少一种肽序列，及修饰含接头的多肽的环区，以包括鉴定的至少一种肽序列。期望的肽序列可通过任何本领域已知的方法鉴定，包括，例如，噬菌体展示，酵母展示，或mRNA展示。
【附图说明】
图1示各种处理的ESBA105分子的SDS-PAGE(泳道3～10)。
泳道1：标记物；泳道2：未标出；泳道3：用DTT还原的；泳道4：还原的及透析的；泳道5：还原的，半胱氨酸-聚乙二醇化的；泳道6：半胱氨酸-聚乙二醇化的，透析的；泳道7：对照；泳道8：赖氨酸-聚乙二醇化的；泳道9：赖氨酸-聚乙二醇化的，透析的；泳道：10，对照。PEG的分子大小约为0.7kDa/PEG。
图2显示(A)半胱氨酸-聚乙二醇化的ESBA105及(B)赖氨酸-聚乙二醇化的ESBA105的TNFα结合活性的ELISA分析。A：对于ESBA105的EC50为0,9833；对于还原的ESBA105：1,291；及对于Cys聚乙二醇化的ESBA105：1,164。对于ESBA105的R2为0,9814；对于还原的ESBA105：0,9891；Cys聚乙二醇化的ESBA105：0,9857。B：对于ESBA105的EC50为0,8073，及对于Lys聚乙二醇化的ESBA105：1,326。对于ESBA105的R2为0,9870，及对于聚乙二醇化的ESBA1050,9640。
图3显示(a)未修饰的，氧化的ESBA105-SS-接头的示意图，(b)使用单官能PEG化剂1聚乙二醇化的ESBA105-SS-接头(ESBA105-S2-PEG2)，及(c)使用双官能PEG化剂2聚乙二醇化的ESBA105-SS-接头(ESBA105-S2-PEG)。
图4显示：(A)ESBA105及ESBA105-SS-接头的TNFα结合活性的ELISA分析；(B)ESBA105的SDS-PAGE凝胶经历各种处理；及(C)使用兔抗-PEG抗体蛋白印迹评定ESBA105及ESBA105-SS-接头的聚乙二醇化程度。图4(B)：泳道1：还原的+透析的+上限浓缩的ESBA105 SS接头；泳道2：还原的+透析的ESBA105 SS接头；泳道3：还原的+聚乙二醇化的ESBA105 SS接头；泳道4：还原的+聚乙二醇化的+透析的ESBA105 SS接头；泳道5：ESBA105 SS接头。
图5显示图示以噬菌体展示的目的在噬菌体2表面上的scFv分子1的肽环的展现(scFv分子及噬菌体不成比例)的示意图。图示的情况中，环包括可与靶分子3，例如血清白蛋白(半衰期延长)，FcRx(胎盘转运)，粘蛋白(上皮停留时间延长)，整联蛋白(RGD肽)，补体，紧密连接蛋白，多聚化，等相互作用的7个氨基酸。
图6显示ESBA105及半胱氨酸-聚乙二醇化的ESBA105-SS-接头的TNFα结合活性的ELISA分析。对于ESBA105的EC50为0,9980；及对于有聚乙二醇化的SS接头的ESBA105：1,181。对于ESBA105的R2为0,9397；及对于有聚乙二醇化的SS接头的ESBA105：0,9851。
图7a显示ESBA903的VEGF结合动力学。Fit：1∶1结合；ka(I/Ms)：7,68E+5；kd(1/s)：4,310E-5；KD(M)：5,608E-11。图7b显示ESBA903-Pepl的结合动力学。Fit：1∶1结合；ka(I/Ms)：1.133E+6；kd(1/s)：5,026E-5。对于7a及7b两者，X轴的值以秒给出，Y轴的值以共振单位(RU)给出。
【发明详述】
【定义】
术语″结构域″，对于多肽，取本领域认可的意义，及指独立的三级结构单元。结构域之例包括但不限于抗体VH或VL结构域，纤连蛋白结构域及锚蛋白-重复结构域。
术语″接头″是指连接2个结构域的线性氨基酸序列。本发明的接头可遗传和/或化学融合到结构域。某些实施方式中，接头含环。
术语″环″是指由接头内链内二硫键形成的环状氨基酸序列。
术语″聚乙二醇″或″PEG″是指有化学式HO-(CH2CH2O)n-H的线性或分支的中性聚醚，及其反应性衍生物。反应性PEG衍生物为本领域熟知，及包括但不限于偶联于甲基-PEO12-马来酰亚胺，N-羟基湖泊酰亚胺碳酸酯，N-羟基湖泊酰亚胺丙酸酯，p-硝基苯-碳酸酯，苯并三唑-碳酸酯，及醛的PEG。特定实施方式中，氨基-反应性PEG衍生物是能与二硫键特异反应的双-砜-偶联的PEG(见例如，Brocchini eta\，Nature Protocols，2006：1(5)，241)。适宜PEG分子的分子大小在0,5kDa及50kDa之间。
术语″靶分子″是指被本发明的多肽环区特异结合的任何分子。靶分子，包括，例如，糖类，蛋白及脂类。
术语″官能部分″是指给其所连接的分子(例如PEG分子，一或多个碳水化合物分子或羟乙基淀粉(HES))附加额外的官能性的生物或化学实体。
术语″PK修饰物″是指当结合到蛋白时改变蛋白的药代动力学性质的任何分子。PK修饰物一般(但不必需)是存在于受试者(例如患者)的天然存在的，内源性分子。所述PK修饰物在受试者内的定位及丰度可为生理或病理的(例如在癌细胞表面，或在发炎位点过表达)。适宜PK修饰物包括，例如，透明质酸，II型胶原，血清白蛋白，抗体Fc受体(例如，FcRx)，抗体Fc区，粘蛋白，整联蛋白，紧密连接蛋白，转铁蛋白，及补体因子。
术语″修饰的″或″修饰″，对于多肽的氨基酸序列，是指添加氨基酸到多肽序列或置换多肽序列中既有的氨基酸。适宜于修饰多肽的氨基酸包括全部已知的天然氨基酸，非天然氨基酸，及其官能化的衍生物(见例如，美国专利7,045,337及7,083,970，将其通过引用整体并入本文)。
术语″免疫结合子″是指含抗体抗原结合位点的全部或部分(例如，重链和/或轻链可变区的全部或部分)的分子，从而免疫结合子特异性地识别靶抗原。免疫结合子的非限定例包括全长免疫球蛋白分子及scFv，以及抗体片段，包括但不限于(i)Fab片段，由VL，VH，CL及CHI结构域构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包括于铰链区通过二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)Fab′片段，其基本上为有部分铰链区的Fab(见，Fundamental Immunology(Paul ed.，3.sup.rd ed.1993))；(iv)由VH及CHI结构域构成的Fd片段；(v)由抗体单臂的VL及VH结构域构成的Fv片段；及(vii)纳米抗体，含单个可变区及2个恒定区的重链可变区。
本文所用的术语″抗体″是″免疫球蛋白″的同义词。本发明的抗体可为全免疫球蛋白或其包括至少一个免疫球蛋白可变区的片段，例如本领域技术人员熟知的单可变区，Fv(Skerra A.and Pluckthun，A.(1988)Science 240：1038-41)，scFv(Bird，R.E.et al.(1988)Science 242：423-26；Huston，J.S.et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-83)，Fab，(Fab′)2或其他片段。
术语″单链抗体″或″scFv″是指包括通过接头连接的抗体重链可变区(VH)及抗体轻链可变区(VL)的分子。所述scFv分子可具有如下共同结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。
本文中的术语″官能性质″是多肽(例如，免疫结合子)性质，包括但不限于，稳定性(例如，热稳定性)，溶解度(例如，体内及细胞内培养)，及抗原结合亲和力。
术语″特异性结合″，″选择性结合″，″选择性结合″及″特异性结合″是指抗体结合到预定抗原上的表位。一般而言，抗体以大致小于约10-7M的亲和力(K73)，例如大致小于约10-8M，10-9M或10-10M的亲和力结合。
术语″核酸分子″是指DNA分子及RNA分子。核酸分子可为单链或双链，但优选为双链DNA。当与另一核酸序列置于功能关系时，核酸为″可操作连接的″。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，其可操作连接到编码序列。
术语″载体″是指能转运其所连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是″质粒″，其是指向其中可连接额外的DNA段的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中，额外的DNA段可连接到病毒基因组。某些载体能在导入有其的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制原点及附加体哺乳动物载体的细菌载体)。其他载体(例如，非附加体哺乳动物载体)可在导入宿主细胞之后整合到宿主细胞基因组，由此随着宿主基因组复制。
术语″宿主细胞″是指向其中已导入表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌，微生物，植物或动物细胞。细菌，其易受转化，包括肠杆菌科成员，例如大肠埃希氏菌或沙门氏菌属；芽孢杆菌科，例如芽孢杆菌；肠炎球菌；链球菌属，及流感嗜血菌的株。适宜微生物包括：酿酒酵母及毕赤酵母。适宜动物宿主细胞系包括：CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)及NSO细胞。
除非另有定义，本文所用的全部技术及科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文所述类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试，以下描述了适宜方法和材料。如有冲突，以本说明书，包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅旨在说明及不旨在限制。
本发明的各方面更详细描述于下文。应知，可根据需要组合各实施方式。
【多肽接头】
一方面，本发明提供包括2个结构域的多肽，其中所述结构域通过氨基酸接头连接，及其中所述接头含能形成链内二硫键的2个半胱氨酸残基。所述接头的优点特别在于，它们使定点添加官能部分(例如，PEG)，和/或向多肽添加一或多种结合亲和力。本发明的接头优选通过遗传加工，更优选2个结构域之间，由此将它们连接形成单个多肽，从而遗传连接到结构域。或者，本发明的接头可使用任何本领域明晰的用于实现氨基酸连接的化学方法化学连接到结构域。官能部分可通过任何本领域明晰的化学方法连接到接头。优选地，它们连接到存在于接头中的一或多个半胱氨酸。
某些实施方式中，氨基酸接头的通式为：(X)a-C-(X)b-C-(X)c，其中C是半胱氨酸；X是任何氨基酸，包括天然、非天然氨基酸，及其化学衍生物；及，a，b，及c对应氨基酸数，及可为任意自然数。优选地，a及c是1～25之间的数，b是3～250之间的数。更优选地，a及c是1～20之间的数，b是3～100之间的数。
在一实施方式中，接头在环形成区Xb中包括肽序列。这种情况下，b优选为3～30的任意数个氨基酸，即3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30。最优选，b是7或12。优选地，环形成区Xb不包括半胱氨酸残基。
某些实施方式中，接头包括折叠的多肽结构域。通式：(X)a-C-(X)b-C-(X)c中，b优选为30与250之间的数，例如50～200，100～200，125～225，75～225，125～225，例如30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230，240或250。需知，本文公开了指定范围内的任意自然数。因此，氨基酸接头有通式(X)a-C-结构域-C-(X)b，其中C是半胱氨酸；X是任何氨基酸，包括天然、非天然氨基酸，及其化学衍生物；结构域是如上定义的结构域；及，a，b对应氨基酸数，及可为任意自然数。
某些实施方式中，氨基酸接头有通式：(X)n＝S-15-C-(X)n＝3～ 5o-C-(X)n＝3-是(表1中的SEQ ID NO：1)，其中C是半胱氨酸；X是任何氨基酸，包括天然、非天然氨基酸，及其化学衍生物；及，n是氨基酸数。接头各区中的氨基酸残基数可随着其所连接的多肽结构变化，前提是接头中的半胱氨酸残基能在非还原性条件下形成链内二硫键。而且，接头长度及序列必需为接头不实质上损害以其作为一部分的多肽的一或多种官能性质。特定实施方式中，氨基酸接头包括SEQ ID NO：2，3，及4任之一所示的氨基酸序列(见表1)。
本发明的接头特别良好适宜于在scFv(尤其是高度稳定及可溶的scFv)中连接VH及VL结构域，例如WO09/000098中所述的那些，将其内容通过引用并入本文。包括本发明的接头的例示scFv多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO：6及8(见表1)。
【多肽】
本发明提供官能化的多肽，尤其是治疗性多肽(例如，scFv)。本发明的多肽包括可通过添加一或多个官能部分(例如，PEG)和/或结合特异性(例如，有特定结合特异性的氨基酸序列)来快速及特异性地官能化的接头序列。
任何多肽可使用本发明的方法和组合物官能化，包括但不限于，包括免疫球蛋白结构域(例如，VH或VL结构域)的多肽。特定实施方式中，多肽是免疫结合子，(例如，scFv)。
优选实施方式中，本发明的多肽有以下通式：结构域1-(X)a-C-(X)b-C-(X)c-结构域2，其中C是半胱氨酸；结构域1及2是如上定义的结构域；X是任何氨基酸，包括天然、非天然氨基酸，及其化学衍生物；及，a，b，及c是氨基酸数。优选地，结构域1及2分别是VH及VL结构域，或VL及VH结构域。
【向接头添加官能部分】
本发明的接头含在非还原性条件下形成链内二硫键的至少2个半胱氨酸残基(见图3)。此二硫键使使用本文所述的方法将官能部分(例如，PEG)定点添加到接头。特别是，二硫键中的半胱氨酸残基可共价连接到官能部分(例如，PEG)。随着暴露的半胱氨酸使甚更好定向的聚乙二醇化，实现相比常规PEG附着位点的制备优势，其常成倍产生有关PEG附着位点的不均一的群。如果采用含单官能反应性基团的官能部分，官能部分会连接到单个半胱氨酸残基。但是，如果采用含二硫键特异性双官能反应性基团的官能部分，官能部分会连接到链内二硫键的两个半胱氨酸残基。所述双官能试剂为本领域熟知，及包括，双-砜(见例如，Brocchini et a\，Nature Protocols，2006：1(5)，241)。
某些实施方式中，本发明提供包括SEQ ID NO：2，3，4，6及8所示的氨基酸序列的多肽(见表1)，其中接头中的至少一个半胱氨酸残基共价连接到官能部分(例如，PEG)。其他实施方式中，本发明提供包括SEQ ID NO：2，3，4，6及8所示的氨基酸序列的多肽(见表1)，其中接头中的两个半胱氨酸残基使用双官能反应性基团，(例如，双-砜)共价连接到相同的官能部分(例如，PEG)。
【环的官能化】
由本发明的接头中的半胱氨酸残基的链内二硫键形成导致接头半胱氨酸残基之间的氨基酸序列环化形成环(见图3及5)。此环结构的优点尤其在于，其可修饰为包括有一或多种特定结合特异性的氨基酸序列，由此将额外的官能性添加到部分是环的多肽。
环序列可例如具有对于任何靶分子的结合特异性。适宜靶分子包括但不限于PK修饰物，例如，透明质酸，血清白蛋白，整联蛋白，抗体Fc区，转铁蛋白，等。例如，结合到血清白蛋白延长多肽的半衰期。结合到FcRx改良多肽向胎盘的转运，然而结合到粘蛋白延长在上皮中的停留时间。有对抗原的特异性的免疫结合子的情况中，某些实施方式中，VH及VL结构域之间的环区可加工为结合抗原，从而提高免疫结合子的亲和力。另一实施方式中，靶分子是多肽本身。换言之，环可提供导致多肽建立二聚体，三聚体或更多聚的多聚体的多聚化功能。多聚体相比单体具有更强亲合力。此外，多聚体使交联，及最后活化例如细胞表面上的受体。另一实施方式中，靶分子是在其接头内呈现互补环的另一免疫结合子，即2个分子的环彼此结合，然而环可相同或不同。这使形成双特异性或多特异性免疫结合子复合物。双特异性或多特异性复合物使募集分子或细胞到另一细胞或分子，例如募集T细胞到癌细胞导致杀癌细胞(Cancer Res.volume 69 page 4941)。
可将任何有针对期望的靶分子的结合特异性的短氨基酸序列导入本发明的环。优选实施方式中，环序列由5～15个氨基酸构成(即在通式(X)a-C-(X)b-C-(X)c中，b是5～15)，及不含半胱氨酸。可合入环的适宜氨基酸序列包括但不限于透明质酸结合肽(例如，包括表1中SEQ ID NO：4的残基12～23的肽)，及整联蛋白结合肽(例如，RGD肽)。
可通过本领域熟知的方法鉴定有对期望的靶分子的结合特异性的适宜于合入环的新肽，例如，噬菌体展示，酵母展示及mRNA展示。所述展示系统为本领域熟知(见，例如，美国专利66258558，6699658；及7118879，将其通过引用并入本文)。例如，为执行噬菌体展示帅选，可将由接头的2个半胱氨酸形成的环融合到用于噬菌体表面展示的噬菌体壳蛋白(见图5的示意图)。将在理想情况下包括5～15之间的氨基酸及不含不同于需要于形成环的半胱氨酸的半胱氨酸的环序列随机化，以提供环序列库，以进行筛选。适宜噬菌体库可商购，例如，自New England Biolab的二硫键连接的七肽(Ph.D.-C7C)库。用于所述噬菌体筛选的靶分子包括，例如，PK修饰物，例如，II型胶原，白蛋白，抗体Fc区，抗体Fc受体(例如，FcRx)，粘蛋白，整联蛋白，紧密连接蛋白及补体因子。
【修饰的多肽】
此外，本发明的多肽可于接头区外侧的一或多个氨基酸残基共价连接到官能部分(例如，PEG)。可采用不实质上损害多肽的一或多种官能性质的任何氨基酸残基，例如，表面暴露的赖氨酸及半胱氨酸残基。如果需要，多肽可修饰(通过添加或置换)为导入适宜于连接到官能部分的额外的反应性氨基酸。特定实施方式中，多肽修饰为含至少一对半胱氨酸残基，及其中至少一对半胱氨酸残基在成熟的多肽内形成链内二硫键。官能部分可使用单官能反应性基团(例如，半胱氨酸)连接到单个反应性残基，或使用双官能二硫键特异性反应性基团(例如，双-砜)连接到2个二硫键键合的半胱氨酸。
因此，在一实施方式中，本发明提供包括SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的多肽，其中选自Lys40，Lys43，Lys46，Lys107，Lys176，Lys197及Lys208的至少一个氨基酸残基共价连接到官能部分(例如，PEG)。
另一实施方式中，本发明提供包括SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的多肽，其中选自C24～C89及C154～C228的至少一对半胱氨酸残基共价连接到相同的官能部分(例如，PEG)。
另一实施方式中，本发明提供包括SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽，其中选自Cys123及Cys136的至少一个氨基酸残基共价连接到官能部分(例如，PEG)。
另一实施方式中，本发明提供包括SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽，其中所述对半胱氨酸残基Cys123～Cys136共价连接到相同的官能部分(例如，PEG)。
另一实施方式中，本发明提供包括SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽，其中选自Lys44，Lys47，Lys105，Lys109，Lys142，Lys143，Lys149，Lys173，Lys193及Lys195的至少一个氨基酸残基共价连接到官能部分(例如，PEG)。
另一实施方式中，本发明提供包括SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽，其中选自Cys25～Cys90及Cys152～Cys226的至少一对半胱氨酸残基共价连接到相同的官能部分(例如，PEG)。
另一实施方式中，本发明提供包括SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽，其中选自Cys121及Cys129的至少一个氨基酸残基共价连接到官能部分(例如，PEG)。
另一实施方式中，本发明提供包括SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽，其中所述对半胱氨酸残基Cys121～Cys129共价连接到相同的官能部分(例如，PEG)。
另一实施方式中，本发明提供包括SEQ ID NO：5，6，7，或8所示的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽修饰为含至少一个反应性氨基酸(例如，半胱氨酸或赖氨酸)。所述反应性氨基酸可共价连接到官能部分(例如，PEG)。
另一实施方式中，本发明提供包括SEQ ID NO：5，6，7，或8所示的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽修饰为含至少一对半胱氨酸残基，及其中至少一对半胱氨酸残基能在成熟的多肽内形成链内二硫键。特定实施方式中，至少一对半胱氨酸残基共价连接到相同的官能部分(例如，PEG)双官能反应性基团(例如，双-砜)。
如本领域所知，PEG的连接不改变它们的功能地改良生物医药的某些特性，由此增强它们的治疗效果。例示效果是：(i)通过增强的溶解度，改善的稳定性，持续的吸收和/或连续的生物医药作用的改善的药代动力学；(ii)降低治疗有效量和/或施剂频度的增加的循环时间；和/或(iii)降低的毒性，例如由于改善的安全性特征，降低的免疫原性，降低的抗原性和/或降低的蛋白水解。
【多肽组合物和制剂】
本发明的另一方面涉及本发明的多肽(例如ScFv)组合物药物制剂。所述制剂一般包括多肽(例如ScFv)组合物及药学可接受的载质。本文所用的″药学可接受的载质″包括生理相容的任何及全部溶剂，分散介质，涂层，抗细菌及抗真菌剂，等渗剂及吸收延迟剂，等。优选地，载质适宜于，例如，静脉内，肌内，皮下，局部(例如，到眼，皮肤，或表皮层)，吸入，经肠外，脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。取决于施用途径，多肽(例如ScFv)可包于材料，以保护化合物免于酸及可灭活化合物的其他天然条件的作用。
本发明的药物化合物可包括一或多种药学可接受的盐。″药学可接受的盐″是指保持母化合物的期望的生物活性及不附加任何不期望的毒理学效果的盐(见例如，Berge，S.M.，et al.(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。所述盐之例包括酸加成盐及碱加成盐。酸加成盐包括源于非毒性无机酸的盐，所述无机酸例如：盐酸，硝酸，磷酸，硫酸，氢溴酸，氢碘酸，亚磷酸等，以及源于非毒性有机酸的盐，所述有机酸例如：脂肪族单羧酸和二羧酸，苯基-取代的链烷酸，羟基链烷酸，芳族酸，脂肪族及芳族磺酸等。碱加成盐包括源于碱土金属的盐，所述金属例如：钠，钾，镁，钙等，以及源于非毒性有机胺类的盐，所述胺例如：N，N′-二苄乙烯二胺，N-甲基葡萄糖胺，氯普鲁卡因，胆碱，二乙醇胺，乙二胺，普鲁卡因等。
本发明的药物组合物也可包括药学可接受的抗氧化剂。药学可接受的抗氧化剂之例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸，半胱氨酸盐酸盐，硫酸氢钠，焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯，丁羟茴醚(BHA)，丁羟甲苯(BHT)，卵磷脂，棓酸丙酯，α-生育酚，等；及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，山梨糖醇，酒石酸，磷酸，等。
可用于本发明的药物组合物的适宜水和非水载质之例包括水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，聚乙二醇，等)，及其适宜混合物；植物油，例如橄榄油；及可注射的有机酯类，例如油酸乙酯。可例如，通过使用包被材料(例如卵磷脂)，通过维持所需的颗粒尺寸(分散液的情况中)，及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
这些组合物还可含佐剂，例如防腐剂，润湿剂，乳化剂及分散剂。可通过之前的灭菌过程，及通过包含各种抗细菌及抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚山梨酸，等)来确保防止微生物的存在。组合物中还可期望包括等渗剂，例如糖类，氯化钠，等。此外，可通过包含延缓吸收的试剂(例如单硬脂酸铝及明胶)来实现可注射的药物形式的延长的吸收。
药学可接受的载质包括用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌水溶液或分散液及无菌粉末。所述介质及试剂用于药学活性物质为本领域所知。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，考虑其用于本发明的药物组合物。补充性活性化合物也可合入组合物。
治疗性组合物一般必需在制备及保存的条件下无菌及稳定。组合物可制成溶液，微乳剂，脂质体，或适宜于高药物浓度的其他有序结构。载质可为含，例如，水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇，及液体聚乙二醇，等)，及其适宜混合物的溶剂或分散介质。可例如，通过使用涂层(例如卵磷脂)，通过维持所需的颗粒尺寸(分散液的情况中)，及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。许多情况下，组合物中会优选包括等渗剂，例如，糖类，多元醇(例如甘露糖醇，山梨糖醇)，或氯化钠。可通过组合物中包括延缓吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐及明胶)来实现可注射的组合物的延长的吸收。
根据需要，可通过将活性化合物以所需量合入含上列成分之一或它们的组合的适当的溶剂来制备无菌可注射溶液，然后灭菌微过滤。一般而言，通过将活性化合物合入含基础分散介质及所需的其他以上所列的成分的无菌媒质来制备分散液。用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是由之前无菌过滤的其溶液产生活性成分加任何其他所需成分的粉末的真空干燥及冷冻干燥(冷冻干燥)。
可与载质物质组合来产生单剂型的活性成分的量会依赖于被治疗的受试者，及特定施用模式而变化。可与载质物质组合来产生单剂型的活性成分的量会通常是产生治疗效果的组合物的量。一般而言，以百分率计，此量会为从约0.01％到约99％的活性成分，优选从约0.1％到约70％，最优选从约1％到约30％的活性成分与药学可接受的载质组合。
调整剂量方案以提供最佳所需反应(例如，治疗性反应)。例如，可施用单个药丸，可经时施用几个份剂，或剂量可根据治疗状况的急迫程度按比例减少或增加。就施用容易度及剂量均一性，以剂量单元形式配制经肠外组合物尤其有优势。本文所用的剂量单元形式是指适于作为针对待治疗的受试者的单元剂型的物理离散的单元；各单元含计算为结合所需药物载质产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的剂量单元形式的规格取决于及直接依赖于(a)待达到的活性化合物的独特性质及特定治疗效果，及(b)就个体中所述活性化合物的治疗灵敏度的配药领域固有的限制。
表1：接头和scFv序列
Figure BDA0000041294590000151
【例示】
通过以下实施例进一步详述本公开内容，其不应被认为是进一步限制。将本申请通篇引用的全部图，参考文献，专利及公开的专利申请的内容明确地通过引用整体并入本文。
一般而言，除非另有说明，本发明的实施采用常规化学技术，分子生物学，重组DNA技术，及免疫学(尤其是，例如，免疫球蛋白技术)。见，例如，Sambrook，Fritsch and Maniatis，Molecular Cloning：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology)，510，Paul，S.，Humana Pr(1996)；Antibody Engineering：A Practical Approach (Practical Approach Series，169)，McCafferty，Ed.，IrI Pr(1996)；Antibodies：ALaboratory Mannual，Harlow et al.，C.S.H.L.Press，Pub.(1999)；Current Protocols in Molecular Biology，eds.Ausubel et al.，John Wiley & Sons(1992)。也见，例如，Polytherics US6803438；EP1701741A2；EP1648518A2；WO05065712A2；WO05007197A2；EP1496941A1；EP1222217B1；EP1210093A4；EP1461369A2；WO03089010A1；WO03059973A2；及EP1210093A1)；GenentechUS20070092940A1及EP1240337B1；及ESBATech U.S.S.N.60/899,907及WO03097697A2。
【ESBA105的PEG化】
将甲基-PEO12-马来酰亚胺(Pierce)，巯基-反应性聚乙二醇化剂用于修饰ESBA105(SEQ ID NO：7)及ESBA105-SS-接头(SEQ IDNO：8)中的巯基。由于ESBA105含侧链硫原子作为二硫键对成出现的半胱氨酸残基，需要还原这些二硫键，以暴露作为用甲基-PEO12-马来酰亚胺聚乙二醇化的靶的巯基。根据PEG生产商(Thermo Scientific：Pierce Protein Research Products)的建议进行ESBA105及ESBA105-SS-接头的聚乙二醇化。简言之，通过在20mM DTT的存在下将约2mg的ESBA105于4℃温育30分钟来还原二硫键。为除去DTT，将还原的ESBA105使用Slide-A-Lyzer透析盒(Pierce；截止：7000Da)相对PBS(pH6.5)透析。透析及上限浓缩后，通过20倍摩尔过量的甲基-PEO12-马来酰亚胺于4℃温育过夜来聚乙二醇化2mg/ml的蛋白。从非反应的甲基-PEO12-马来酰亚胺通过使用Slide-A-Lyzer透析盒(Pierce；截止：7000Da)透析来纯化标记的蛋白。
【SDS-PAGE】
使用可从Invitrogen商购的Bis-Tris电泳系统，根据生产商的建议，在非还原性条件下进行SDS-PAGE。将5μg的蛋白样品装于预凝固的12％Bis-Tris凝胶。使用考马斯试剂(0.1％(w/v)考马斯G250，10％冰醋酸，50％乙醇)将凝胶染色15分钟。使用10％(v/v)乙酸进行脱色。
【证实PEG化的蛋白印迹分析】
将1，10及100ng的聚乙二醇化的ESBA105-SS-接头装于预凝固的12％Bis-Tris凝胶。将样品点斑于硝酸纤维素膜，及PEG部分用兔单克隆抗-PEG抗体(Epitomics)检测。与第一抗体温育后，将膜用缀合辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗-兔多克隆抗体(Santa Cruz)温育。用化学发光检测系统(Pierce)检测抗体与膜的特异性结合。
【确认聚乙二醇化的ESBA105与人TNFα的结合的直接ELISA】
用直接ELISA评定ESBA105及其衍生物的结合。将人TNFα(PeproTech EC Ltd)包被于96孔微孔板，然后用BSA(牛血清白蛋白)封闭。以50nM，12.5nM，3.13nM，1.56nM，0.78nM，0.39nM，0.20nM，0.10nM及0.05nM的浓度测试ESBA105及ESBA105衍生物。通过随后添加生物素化的兔多克隆抗-ESBA105抗体(AK3A，在ESBATech生产)，链霉亲和素Poly HRP及发色底物(POD)来可视化ESBA105及其衍生物与人TNFα的结合。通过使用分光光度计测量450nM处的光密度(OD)来检测此反应产物。使用4-参数逻辑曲线拟合分析数据，及由scFv的剂量-反应曲线计算EC50值。
【接头中有Pepl的ESBA903及ESBA903的表面等离子体共振分析】
对于结合亲和力测量，采用了用BIAcoreTM-T100的表面等离子体共振测量。这些实验中，使用了大肠埃希氏菌-表达的纯化的重组人VEGF165(PeproTech EC Ltd)。用N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐及N-羟基湖泊酰亚胺，根据产品说明书活化羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM4，GE Healthcare)。使用标准胺-偶联方法将人VEGF165偶联于CM4传感器芯片上的4个不同流动池之一。偶联和封闭后用固定的hVEGF165分子得到的反应范围约为120～140反应单位(RU)。各芯片的第四流动池进行类似处理，除了封闭之前不固定蛋白之外，将此流动池用作内部参照。将HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES，pH7.4，0.15M NaCl，3inM EDTA，0.005％表面活性剂P20)中的各种浓度的抗-VEGF scFv(20nM，10nM，5nM，2.5nM，1.25nM，0.63nM，0.31nM及0.16nM)以30μl/分钟的流速注入流动池5分钟。使从CM4芯片上的VEGF的抗-VEGF scFv解离于25℃进行10分钟。内部参照池校正，然后减去缓冲液样品后产生各抗-VEGF scFv样品的传感图。使用一一对应的Langmuir结合模型，用BIAcore T100评估软件1.1版计算表观解离速度常数(k＜ι)，表观结合速度常数(ka)及表观解离平衡常数(KD)。
【scFv的克隆及表达】
如下产生本文描述及表征的scFv。有时，在服务提供商Entelechon GmbH(www.entelechon.com)从头合成编码各种scFv的DNA序列。将得到的DNA插入子经分别导入到scFv DNA序列的5′及3′端的Ncol及HindIII限制性位点克隆进细菌表达载体pGMP002。有时，修饰的接头通过现有技术中的方法，作为编码相应氨基酸分子的退火的，互补的寡核苷酸，通过将它们克隆进VH及VL结构域之间的适宜限制性位点来导入。其他情况中，使用现有技术中的装配PCR方法将点突变导入VH和/或VL结构域。GMP002克隆描述于WO2008006235的实施例1。scFv的产生如WO08/006235的实施例1中就ESBA105所述进行，将它们通过引用并入本文。
【实施例】
【实施例1】ESBA105及ESBA105-SS-接头的聚乙二醇化
ESBA105(SEQ ID NO：7)是特异性结合及抑制人TNFα的单链抗体(见例如WO 06/131013，将其通过引用并入本文)。ESBA105-SS-接头(SEQ ID NO：8)是ESBA105变体，其中接头被SS-接头(SEQ ID NO：3)取代。
用SDS-PAGE分析ESBA105，用DTT还原的ESBA105，还原的及经历半胱氨酸聚乙二醇化的ESBA105，及还原的及经历半胱氨酸聚乙二醇化、然后透析的ESBA105。蛋白聚乙二醇化之后，预期了约4kDa的分子量增加。″还原的ESBA105″及″还原的半胱氨酸-聚乙二醇化的ESBA105″相比ESBA105，在稍微更高位置迁移。cys聚乙二醇化的ESBA105透析之后，蛋白在与ESBA105相同的位置迁移，提示位移不是由于聚乙二醇化，而是由于透析期间巯基氧化之后再次形成的二硫键还原。这些数据表明，ESBA105的还原的分子内半胱氨酸(SH)具有对于PEG-NHS的低接近性。不同于ESBA105中分子内半胱氨酸的巯基，伯胺(在N-端的赖氨酸残基)对于PEG-NHS可接近，如图1的泳道6及7中所示。
在ELISA实验中评定如上所述的不同处理的ESBA105制剂的活性。示于图2的ELISA分析显示还原的ESBA105如氧化的ESBA105活跃。Cys聚乙二醇化的ESBA105显示，相比ESBA105仅轻微丧失结合活性。但是，如图1中所示，ESBA105中链内二硫键的聚乙二醇化程度低。Lys-聚乙二醇化是成功的，仅有向人TNFα的最少结合活性损失。
本发明的一个目的是提供易受cys-聚乙二醇化的scFv抗体。第一步，检验了是否未聚乙二醇化的ESBA105-SS-接头分子相比ESBA105仍活跃。一旦这如图4A中所示被利用ELISA测定证实，ESBA105-SS-接头经历cys-聚乙二醇化。为测试成功的cys-聚乙二醇化，用SDS-PAGE分析ESBA105-SS-接头，还原的ESBA105-SS-接头，还原的cys聚乙二醇化的ESBA105-SS-接头、及cys聚乙二醇化的经历透析的ESBA105-SS-接头(见图4B)。聚乙二醇化的ESBA105-SS-接头相比ESBA105-SS-接头在更高位置迁移，表明成功的ESBA105-SS-接头的聚乙二醇化。通过蛋白印迹分析，使用兔抗-PEG单克隆抗体确认ESBA105-SS-接头的聚乙二醇化(见图4C)。用100ng/ml聚乙二醇化的ESBA105-SS-接头检测期望大小的信号。此外，如图6中所示的ELISA测定证实，cys-聚乙二醇化的ESBA105-SS-接头相比裸ESBA105几乎完全活跃。
使用有单特异性反应性基团的PEG的ESBA105 SS-接头的常规cys-聚乙二醇化示意于图3(中)。cys-聚乙二醇化的替代方法也示于图3(右)。此后来的方法采用连接到双官能反应性基团的PEG(示意为在其左端具有PEG分子的横向的″T″)，其使PEG分子与蛋白中二硫键的两个半胱氨酸残基连接。所述接头技术被Shaunak et al.Nature Chemical Biology 2006，volume 2 page 312；Brocchini et al，Nature Protocols，2006：1(5)，241，及WO05/007197描述。
【实施例2】向SS-接头导入结合活性
本发明的第二应用是将额外的结合特异性导入多肽(例如，scFv)。本实施例中，将Pep-1肽(其鉴定为在噬菌体展示筛选期间结合透明质酸)(Mummert et al.J.Exp.Med.2000，volume 192，page 769)导入SS接头的环区来产生SS Pepl接头(SEQ ID NO：4)。将SS Pepl接头导入scFv ESBA903来产生ESBA903 SS Pepl接头(有时也称为ESBA903-Pepl；SEQ ID NO：6)。如显示于图7的表面等离子体共振结果所示，在其环中展示Pepl 12聚体肽的ESBA903-Pepl与未修饰的ESBA903(SEQ ID NO：5)等同良好结合其靶(VEGF)，因此仍完全官能化(所测的Kd值分别是4.436E-11M及5.608E-11M)。将ESBA903-Pepl设计为，当施加到存在透明质酸的位点(例如玻璃体或关节)时，相比裸ESBA903延长局部半衰期。
【等同发明】
本领域技术人员会使用无外乎常规实验认可或能确定本文所述的本发明的特定实施方式的许多等同发明。所述等同发明旨在包括在以下权利要求中。
Figure IDA0000046960730000011
Figure IDA0000046960730000021
Figure IDA0000046960730000031
Figure IDA0000046960730000041
Figure IDA0000046960730000071

Claims (21)

1.多肽，其包括通过氨基酸接头连接的2个结构域；
其中所述接头包括能形成链内二硫键的2个半胱氨酸，且
其中当2个半胱氨酸通过二硫键彼此键合时，所述接头序列中的半胱氨酸之间的氨基酸形成环。
2.权利要求1的多肽，其中所述接头包括SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
3.权利要求1的多肽，其中所述接头包括SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
4.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述环结合靶分子。
5.权利要求5的多肽，其中所述靶分子是PK修饰物。
6.权利要求5的多肽，其中所述PK修饰物是血清白蛋白。
7.权利要求5的多肽，其中所述PK修饰物是透明质酸。
8.权利要求1的多肽，其中所述接头包括SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
9.权利要求1的多肽，其中所述接头包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
10.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽是免疫结合子。
11.权利要求10的多肽，其为scFv。
12.权利要求1的多肽，其包括SEQ ID NO：6或8所示的氨基酸序列。
13.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述接头中的至少一个半胱氨酸残基共价连接到官能部分。
14.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述接头中的2个半胱氨酸残基共价连接到相同的官能部分。
15.权利要求13或14的多肽，其中所述官能部分是PEG。
16.组合物，其包括：前述权利要求中任一项的多肽，及药学可接受的载质。
17.分离的核酸分子，其编码前述权利要求中任一项的多肽。
18.表达载体，其包括权利要求17的核酸分子。
19.宿主细胞，其包括权利要求18的表达载体。
20.产生官能化的多肽的方法，包括：
(a)提供肽序列的库；
(b)从所述库中鉴定结合靶分子的至少一种肽序列；
(c)修饰含接头的多肽的环区，以包括步骤(b)中鉴定的至少一种肽序列，由此生产官能化的多肽。
21.权利要求20的方法，其中所述鉴定步骤使用噬菌体展示，酵母展示，或mRNA展示进行。
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