CN104271148A - 红细胞结合性治疗剂 - Google Patents

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J.A.休贝尔
S.康托斯
K.Y.戴恩
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Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
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Abstract

本申请描述了特异性结合红细胞的肽。这些肽作为具有特异性结合红细胞的序列的肽配体，或者是特异性结合红细胞的抗体或其片段提供。所述肽可以作为与治疗剂、耐受化抗原、或靶向肽的分子融合物制备。可以通过使用所述的融合物和在需要被耐受的物质上选择抗原来创建免疫耐受性。

Description

红细胞结合性治疗剂
对相关申请的交叉引用
本申请要求2012年2月15提交的美国系列申请No.13/397,202的优先权，在此通过提及并入本文。
技术领域
技术领域涉及结合红细胞的配体或抗体的医用组合物和用途。具体的用途包括免疫耐受化(immunotolerization)、药物递送、和癌症疗法。
发明背景
移植组织排斥和自身免疫疾病是病理状态(pathological conditions)，其涉及外源生物分子由于其抗原性造成的免疫排斥。许多药物和临床操作都涉及对免疫排斥的抑制或治疗。疫苗借助这一过程，通过激发针对病源性生物分子上的抗原的免疫应答，增强免疫系统对于载有所述抗原的蛋白质或其他生物分子的应答。
发明概述
耐受性发生是创建(creat)对某种物质的免疫耐受的过程。经治疗以耐受某种物质的人或非人患者，会对所述物质产生减弱的适应免疫应答(adaptive immune response)。适应免疫应答中的减弱，可通过分析与所述物质反应的循环抗体的量，或者通过分析T-细胞与所述物质和耐受试剂(tolerizing agent)的反应来测定。本申请提供耐受化(tolerization)组合物和方法。许多实施方案中涉及施用融合物分子，所述的融合物分子具有与红细胞结合部分(binding moiety)相结合的耐受抗原(tolerizing antigen)。所述融合物分子结合红细胞，并以建立耐受性的方式起始耐受抗原向免疫系统呈递的过程。
已发现了特异性地结合于红细胞(erythrocytes)(也称作红血球(red bloodcells))的肽。这些肽配体是红细胞-结合部分，其即使在血液中的其他因子存在的情况下也与红细胞特异性地结合。这些配体可以多种方式被使用。
本发明的一种实施方案是包含分子融合物的药学上可接受的组合物，所述分子融合物包含致耐受性抗原和特异性地结合患者中的红细胞的红细胞-结合部分，其中所述的红细胞-结合部分特异性地结合选自下述的生物分子：Band 3(CD233),水通道蛋白-1,Glut-1,Kidd抗原,RhAg/Rh50(CD241),Rh(CD240),Rh30CE(CD240CE),Rh30D(CD240D),Kx,血型糖蛋白B(CD235b),血型糖蛋白C(CD235c),血型糖蛋白D(CD235d),Kell(CD238),Duffy/DARCi(CD234),CR1(CD35),DAF(CD55),红细胞糖苷脂,CD44,ICAM-4(CD242),Lu/B-CAM(CD239),XG1/XG2(CD99),EMMPRIN/neurothelin(CD147),JMH,糖基转移酶,Cartwright,Dombrock,C4A/CAB,Scianna,MER2,stomatin,BA-1(CD24),GPIV(CD36),CD108,CD139,和H抗原(CD173)。
本发明的一种实施方案是药学上可接受的组合物，其包含与某种靶物，例如包含致耐受性抗原的蛋白质，特异性结合的结构域相连的、红细胞-结合部分。这些结构域的一方或两者可能是肽配体、或抗体、或抗体片段。
另一种实施方案是药学上可接受的组合物，其用于抗体清除(depletion)或从患者的循环中去除(removing)抗体。这种组合物具有与抗原，例如天然自身抗原或治疗性蛋白抗原，相连的红细胞-结合部分。
附图简述
图1显示了ERY 1和卵清蛋白(OVA)的分子融合物的实验方案和结果，其中ERY1-OVA融合物以高亲和力结合小鼠红细胞的赤道外周；小图(a)：ERY1肽与卵清蛋白(OVA)缀合的示意图，导致结合红细胞表面血型糖蛋白-A；小图(b)：每种OVA缀合物与中间体的结合，通过流式细胞术表征；黑色实心直方图，ERY1-OVA；空心直方图，SMCC-OVA；虚线直方图，MIS-OVA；ERY1＝红细胞结合性肽WMVLPWLPGTLD(SEQ IDNO:1)，MIS＝错配肽PLLTVGMDLWPW(SEQ ID NO:2)，SMCC＝琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐，其用于缀合ERY1与OVA；小图(c)：ERY1-OVA对红细胞的平衡结合，其展示通过流式细胞术测定的ERY1-OVA的低解离常数(R2＝0.97，单一位点结合)。
图2是结果的拼合，其显示了红细胞结合诱导对抗原攻击的耐受：小图(a)OTI CD8+T细胞过继转移耐受模型，其展示用于实验及攻击和幼稚的对照组(n＝5)的实验方案；小图(b)OTI CD8+T细胞群体(CD3ε+CD8α+CD45.2+)的流式细胞术检测；小图(c)CD45.1+小鼠中抗原攻击后第4天时引流淋巴结(腹股沟和腿弯部)中OTI CD8+T细胞群体的定量(**P<0.01)；小图(d)表达IFNγ的OTI CD8+T细胞的流式细胞术检测；小图(e)用SIINFEKL肽(SEQ ID NO:3)抗原攻击和再刺激后第4天时引流淋巴结中表达IFNγ的OTI CD8+T细胞(**P<0.01)；小图(f)根据ELISA测定，在用SIINFEKL肽(SEQ ID NO:3)再刺激后第4天时在淋巴结细胞培养基中的IFNγ浓度(**P<0.01)；小图(g)根据ELISA测定，在用OVA再刺激后第4天时在淋巴结细胞培养基中的IL-10浓度(*P<0.05)。数据代表均值±最小值至最大值；小图(h)在第19天时的OVA特异性血清IgG效价，(*P<0.05)，数据代表均值±SE；小图(i)表达组合OTI与OVA的EL4胸腺瘤(E.G7-OVA)肿瘤耐受模型，其展示用于实验组及对照组(n分别＝4,3)的实验方案；小图(j)过继转移后第5天时在血液中循环的非增殖(第0代)OTI CD8+T细胞的定量；数据代表中值±最小值至最大值(**P<0.01)；小图(k)OTI过继转移后9天皮下注射的E.G7-OVA肿瘤的生长概况，数据代表均值±SE(*P<0.05)。
图3是显示红细胞结合如何减弱C57BL/6小鼠中的抗原特异性体液应答的柱形图。C57BL/6小鼠中相隔6天两次施用1μg OVA或1μg ERY1-OVA后19天时在血清中的OVA特异性IgG检测(*P≤0.05)。
图4呈现了实验结果，其中8臂PEG-ERY1在体外及在体内结合红细胞；小图(a)8臂PEG-ERY1(黑色实心直方图)在体外温育后结合小鼠红细胞，而8臂PEG-MIS(灰色实心直方图)或8臂PEG-吡啶基二硫化物则不然；小图(b)8臂PEG-ERY1(黑色实心直方图)在静脉内注射后结合循环的红细胞，而8臂PEG-MIS(灰色实心直方图)则不然。
图5呈现了实验结果，其描绘了通过流式细胞术测定的8臂PEG-ERY1(实心环)和8臂PEG-MIS(空心框)的红细胞细胞表面半衰期。
图6是以柱状图的形式呈现的、肽配体结合人红细胞的实验结果。
图7是以流式细胞术直方图的形式呈现的实验结果。小鼠红细胞与TER119-SIINFEKL(以灰色实心直方图)或白蛋白(空心直方图)一起温育。荧光信号来自用于检测scFv的抗-6xHis-PE抗体。
图8所呈现的是在静脉内施用盐水,OVA,ERY1-OVA,或TER119-SIINFEKL之后，脾中OT-I CD8T细胞增殖的实验结果图。**P<0.01,***P<0.001
图9是呈现过继转移并静脉内施用盐水,OVA,ERY1-OVA,或TER119-SIINFEKL之后，OTI CD8T细胞表型特征的实验结果图。左图：在流式细胞术中以膜联蛋白-V结合标记的凋亡OTI细胞诱导；右图：在流式细胞术中以PD-1表达标记的耗尽的(exhausted)OTI细胞。
图10是流式细胞术分析的实验结果图，其显示由经过多种注射配方耐受化的小鼠攻击位点引流的淋巴结中，炎症性(IFNγ+)OTI T细胞的特征。
图11是显示通过ELISA确定的、接受了2或6个剂量的ERY1-天冬酰胺酶(ASNase)或野生型天冬酰胺酶的小鼠，在施用21天后，其中天冬酰胺酶-特异性血清IgG滴定度实验结果图。
图12是显示与脾DC以及多种介质添加物共培养的、来自转基因NODBDC2.5小鼠的CD4T细胞增殖实验结果图。
图13是通过流式细胞术确定的实验结果图、其显示过继转移和静脉内施用TER119-ChrA,游离1040-p31肽,或盐水后，非增殖的NODBDC2.5CD4T细胞的定量。
发明详述
本申请针提供用于耐受性发生的分子设计。使有待被耐受的蛋白质或其他分子抗原与红细胞结合部分形成缀合物(conjugate)。所述的部分(moiety)可包含肽配体，抗体，适体，抗体片段。所述的缀合物，也称作分子融合物，可以是融合物蛋白，或者可能包含接头，例如聚合物或聚合物微团或聚合物纳米颗粒，的缀合物。
本文中描述了特异性结合红细胞的肽。这些肽以具有特异性结合红细胞的序列的肽配体的形式，或者以特异性结合红细胞的抗体或其片段的形式提供。所述肽可以制备为与治疗剂、致耐受化抗原、或靶向肽的分子融合物。有利地，所述治疗剂当作为所述融合物的一部分时，可以具有延长的体内循环半衰期。通过使用所述融合物并选择有待被耐受的物质上的抗原，可以产生免疫耐受。在本申请中，术语抗原指实际大小的抗原，其抗原性片段，或致耐受性抗原的模拟物。与靶向性肽形成的融合物将融合物引导至靶物，例如肿瘤，在那里红细胞结合性配体通过将红细胞募集至靶物来减少或完全消除对肿瘤的血流。
特异性结合红细胞的肽序列
PCT/US2011/047078的申请人发现并报道了特异性结合红细胞的肽，包括称作ERY1的肽，其特异性地结合红细胞。已报道了六种特异性结合人红细胞的肽(ERY19,ERY59,ERY64,ERY123,ERY141和ERY162)。实施例9详细描述了肽配体(ERY64,ERY123,和ERY141)如何与荧光蛋白报道分子形成融合蛋白，并保持它们的特异性结合特性。本发明的一个实施方案是包含ERY1、或人红细胞结合性肽之一的氨基酸序列、或其保守取代的基本上纯的多肽，或其编码核酸。此类多肽特异性结合红细胞，并且是红细胞的配体。配体是指对靶分子具有特异性结合的化学模块的术语。靶(物)是指使用者意图与配体结合的预定的分子、组织、或位置。如此，对组织的靶向递送，是指将分子或其它材料(诸如细胞)递送到意图的靶组织。因而，实施方案包括这样的分子或组合物，其包含本文中所公开的用于结合红细胞的至少一种配体。多肽对红细胞的结合活性只需遵循如本文中描述的实验规程即可测定。使用此类方法，可以测定给定生理学条件下多肽变体相对于ERY1或人红细胞结合性肽的结合强度，例如利用保守取代、添加或去除侧翼基团，或者用于调节在水溶液中序列溶解度的变化或添加而生成的序列。肽配体可特异性地针对下述靶物或靶物的组中一种或以上生成：红细胞表面分子(蛋白质，糖蛋白),Band 3(CD233)，血型糖蛋白,更具体而言，血型糖蛋白A(CD235a),血型糖蛋白B(CD235b),血型糖蛋白C(CD235c)&血型糖蛋白D(CD235d),水通道蛋白-1,Glut-1,Kidd抗原,RhAg/Rh50(CD241),Rh(CD240),Rh30CE(CD240CE),Rh30D(CD240D),Kx,Kell(CD238),Duffy/DARC(CD234),CR1(CD35),DAF(CD55),红细胞糖苷脂,CD44,ICAM-4(CD242),Lu/B-CAM(CD239),XG1/XG2(CD99),EMMPRIN/neurothelin(CD147),JMH,糖基转移酶,Cartwright,Dombrock,C4A/CAB,Scianna,MER2,stomatin,BA-1(CD24),GPIV(CD36),CD108,CD139,和H抗原(CD173)。红细胞细胞-表面蛋白,无论是纯化的制备物或是其混合物，均可用于筛选肽配体。红细胞细胞-表面蛋白可以以全长的形式、或者作为与增强蛋白质表达或稳定性的标签相融合的部分结构域的形式重组表达。所述的重组蛋白靶物可被固定到平板或珠上，用作文库筛选过程中的亲和靶。红细胞细胞-表面蛋白也可以从全血的细胞制备物中分离，其中，膜蛋白的纯化的或是复合混合物可被固定于固体基质(珠，平板，或其他)，并用作筛选过程中的亲和靶。整个筛选过程可在高浓度的血清白蛋白(例如50mg/mL)存在下，于37 C下进行，以减少非特异性结合事件，并以选择血清中具有良好的结合特性的肽。最优选地，肽配体选自Band 3(CD233),血型糖蛋白B(CD235b),血型糖蛋白C(CD235c)和血型糖蛋白D(CD235d)。
观察到肽配体结合于红细胞的细胞表面并不改变细胞形态，也无胞质易位。所述配体分布于细胞表面并不成簇。血型糖蛋白-A(GYPA)被证明是作为ERY-1的靶的特异性蛋白。ERY-1仅与小鼠和大鼠种具有反应性。特异性结合人红细胞的肽配体被确定为特异于人红细胞，而非其他种。已报道了指向小鼠红细胞表面的、展示高亲和力的肽,WMVLPWLPGTLD(SEQ ID NO:1本申请中称作ERY1)的噬菌体克隆。在表1-2中显示了通过其他实验鉴定的人红细胞结合配体。六种序列与人红细胞特异性结合。第七个序列，名为ERY50,结合人红细胞也结合上皮/内皮细胞。
表1:结合人红细胞的肽配体
肽的名称 结合人红细胞的肽序列 序列号
ERY19 GQSGQPNSRWIYMTPLSPGIYRGSSGGS SEQ ID NO:4
ERY50 GQSGQSWSRAILPLFKIQPVGSSGGS SEQ ID NO:5
ERY59 GQSGQYICTSAGFGEYCFIDGSSGGS SEQ ID NO:6
ERY64 GQSGQTYFCTPTLLGQYCSVGSSGGS SEQ ID NO:7
ERY123 GQSGHWHCQGPFANWVGSSGGS SEQ ID NO:8
ERY141 GQSGQFCTVIYNTYTCVPSSGSSGGS SEQ ID NO:9
ERY162 GQSGQSVWYSSRGNPLRCTGGSSGGS SEQ ID NO:10
带加下划线的序列部分指接头序列。
表2:结合小鼠或人红细胞的肽配体
肽 序列号
ERY19’ PNSRWIYMTPLSPGIYR SEQ ID NO:11
ERY50’* SWSRAILPLFKIQPV SEQ ID NO:12
ERY59’ YICTSAGFGEYCFID SEQ ID NO:13
ERY64’ TYFCTPTLLGQYCSV SEQ ID NO:14
ERY123’ HWHCQGPFANWV SEQ ID NO:15
ERY141’ FCTVIYNTYTCVPSS SEQ ID NO:16
ERY162’ SVWYSSRGNPLRCTG SEQ ID NO:17
ERY1** WMVLPWLPGTLD SEQ ID NO:1
*对红细胞不是特异性的
**针对小鼠
本发明的实施方案包括特异性结合红细胞表面的肽。没有为了最小长度而优化这些序列。此类优化是本领域技术内的，并且可以使用本文中所描述的技术实施。例如，Kenrick等(Protein Eng.Des.Sel.(2010)23(1):9-17)从15个残基的文库筛选，然后鉴定长度7个残基的最小结合序列。Getz(ACS Chem.Biol.,2011年5月26日)鉴定出了长度小到5个残基的最小结合域。红细胞结合性肽可以存在于相同序列的重复中，例如2-20个重复；技术人员容易领会，明确记载的范围之内的所有范围和数值都是被考虑到的。此外，肽可以存在于组合中，其中两个或更多个不同的序列处于同一个肽中或者构成单个分子融合物的一部分。
提供特异性结合的连续残基的数目预期为约4-12个残基。因而，存在于表2中所有长度为4个连续残基的肽，以及例如所有5、6、7、或8个连续残基的肽均已被公开。此数目基于其它肽性蛋白质-结合配体的残基数目。本发明的实施方案包括本文中(包括表1)的红细胞结合SEQ ID组之一的最小长度序列。因而，某些实施方案涉及一种包含肽，或分离的(或纯化的)肽的组合物，所述肽或分离的(或纯化的)肽包含选自下组的序列的4-12个连续氨基酸残基的若干个连续氨基酸序列：SEQ ID NO:11,SEQ IDNO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQID NO:1及它们的保守取代，其中所述序列特异性结合红细胞。或者，连续残基的数目可以选择为约5-约18；技术人员会容易想到明确记载的范围内的所有范围和数值均已被考虑到，例如7、8、9、10，或者8至18。红细胞结合序列可以具有例如序列的至少一个且不超过两个氨基酸的保守取代，或1、2、或3处取代、或1-5处取代。此外，通常可以实现用D-氨基酸替换发现的序列中的L-氨基酸，如Giordano中的。在一些实施方案中，肽或组合物可以基本上由选自下组的序列组成：SEQ ID NO:11,SEQ IDNO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQID NO:1。肽可以是长度有限的，例如，具有约10-约100的残基数目；技术人员容易想到，明确记载的范围内的所有范围和数值均已被考虑到，例如，约10至约50或约15至约80。可以提供这样的肽红细胞结合性模块，其包含具有约10μM-0.1nM的解离常数的肽配体，如通过所述肽和红细胞之间的平衡结合测量测定的；技术人员容易想到，明确记载的范围内的所有范围和数值均已被考虑到，例如，约1μM至约1nM。肽可以进一步包含治疗剂。例如，治疗剂可以是蛋白质、生物制剂、抗体片段、ScFv、或肽。肽可以进一步包含致耐受性抗原，例如，用于缺乏某种蛋白质的人中的该人蛋白质(例如，血液因子诸如因子VIII或因子IX)、具有非人糖基化的蛋白质、不天然存在于人中的合成蛋白质、人食物变应原、或人自身免疫抗原。
对于具体的应用而言，可以适宜使用不同长度的多肽。一般而言，对于含有多肽配体序列的多肽而言，若该多肽有机会(is available for)与红细胞体内相互作用，则它将展现特异性结合。可以使用本文中所描述的方法来测试具有折叠潜力的肽。因而，某些实施方案涉及具有多肽配体但是不存在于自然界中的多肽，并且某些其它实施方案涉及具有特定长度，例如6至3000个残基，或12-1000个，或12-100个，或10-50个残基的多肽；技术人员容易想到，明确记载的限度内的每个数值和范围均已被考虑到。
某些实施方案提供了多种多肽序列和/或纯化的或分离的多肽。多肽是指氨基酸残基链的术语，与翻译后修饰(例如磷酸化或糖基化)和/或与其它多肽的复合，合成为多亚基复合物、与核酸和/或碳水化合物、或其它分子无关。因此，蛋白聚糖在本文中也称为多肽。如本文中所使用的，“功能性多肽”是能够促进说明的功能的多肽。可以通过许多方法生成多肽，其中许多是本领域中公知的。例如，可以通过提取(例如，自分离的细胞)，通过表达编码多肽的重组核酸，或者通过化学合成获得多肽。例如可以通过重组技术，并将编码多肽的表达载体导入宿主细胞中(例如，通过转化或转染)以表达编码的多肽，来生成多肽。
存在着多种保守性的变化，可以对氨基酸序列进行这样的变化而不改变活性。这些变化称作保守取代或突变；也就是说，可以用属于具有特定大小或特征的氨基酸群组的氨基酸替换另一氨基酸。氨基酸序列的取代者可以选自氨基酸所属的类别的其它成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。此类变化预期不会实质性影响通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的表观分子量或等电点。保守取代还包括用序列的光学异构体替换其它光学异构体，具体地，对于序列的一个或多个残基用D氨基酸替换L氨基酸。此外，序列中的所有氨基酸可以经历D-L(D to L)异构体取代。例示性的保守取代包括但不限于用Lys取代Arg及相反，以维持正电荷；用Glu取代Asp及相反，以维持负电荷；用Ser取代Thr，以维持游离的OH；以及用Gln取代Asn以维持游离的NH2。此外，在一些情况中，可以进行多肽序列或相应的核酸序列的点突变、缺失、和插入而不丧失多肽或核酸片段的功能。取代可以包括例如1、2、3、或更多个残基。本文中所描述的氨基酸残基采用单字母氨基酸标志符或三字母缩写。本文中所使用的缩写与标准多肽命名，J.Biol.Chem.,(1969),243,3552-3559一致。所有氨基酸残基序列在本文中以左右朝向的表达式按照常规的氨基端至羧基端方向呈现。
在一些情况中，可能需要测定肽与本文中所列的序列的百分比同一性。在此类情况中，百分比同一性以肽或肽的一部分的残基数目来量度。具有例如90％同一性的多肽也可以是某个较大肽的一部分。
术语“纯化的”在本文中用来指多肽时，是指已经过化学合成并且因此基本上不被其它多肽污染，或者已经自与其天然伴随的其它大多数细胞组分(例如，其它细胞蛋白质、多核苷酸、或细胞组分)分离开来或纯化出来的多肽。纯化的多肽的一个例子是不含至少70％(按干重计)的与其天然关联的蛋白质和天然存在的有机分子的多肽。因此，纯化的多肽的制备物可以是例如至少80％、至少90％、或至少99％(按干重计)的该多肽。多肽也可以工程化改造从而含有标签序列(例如，多组氨酸标签、myc标签、或标签)，其使得多肽易于纯化或标记(例如，捕获到亲和基质上，在显微镜下显现)。因此，包含多肽的纯化的组合物，除非另有指示，是指纯化的多肽。术语“分离的”表明本发明的多肽或核酸不处于其天然环境中。因此，本发明的分离的产物可以包含在培养上清液中，经过部分富集，自异源来源产生，克隆在载体中，或者与媒介物配制在一起，等等。
多肽可以包含化学修饰：该术语在此语境中指氨基酸的天然化学结构中的变化。此类修饰可以对单链或末端进行，例如改变氨基端或羧基端。在一些实施方案中，修饰可用于创建这样的化学基团：其可以方便地用于连接多肽与其它材料，或者附接治疗剂。
所谓特异性结合，如同在该术语通常在生物学技术领域中使用时一样，是指与非靶物组织相比以相对较高的亲和力结合靶物的分子，并且一般牵涉多种非共价相互作用，诸如静电相互作用、范德华相互作用、氢键键合，等等。特异性结合相互作用是抗体-抗原结合、酶-底物结合、以及特异结合性蛋白质-受体相互作用等的特征；虽然此类分子有时可能结合其靶物以外的组织，但是将此类结合称为缺乏特异性，不是特异性结合。在一些情况中，肽ERY1及其衍生物和人红细胞结合性肽及其衍生物可能结合非红细胞，但是已经观察到此类结合是非特异性的，证据是这些肽对红细胞的结合比对其他细胞或蛋白质的结合强得多。
如此，实施方案包括这样的配体，其特异性结合红细胞，并且不特异性结合其它血液组分，例如下列的一种或多种：血液蛋白质、白蛋白、纤连蛋白、血小板、白细胞、基本上所有从典型的人采集的血液样品中找到的组分。在血液样品的上下文中，术语“基本上所有”指通常存在，但是排除非常低浓度的偶然组分，使得它们从效果上说不减少原本为生物可用的配体的效价。
抗体肽
除了结合红细胞的肽之外，本文中还提供蛋白质，具体是抗体，且特别是单链抗体片段。用于生成针对抗原的抗体的技术是公知的。在此上下文中，术语“抗原”指由响应抗原的宿主免疫系统识别的位点。抗原选择在抗体生成技术领域等领域中是已知的。实施方案包括这些肽在本文中提供的分子融合物和其它方法中的应用。抗原可以以全长的形式、或者作为与增强蛋白质表达或稳定性的标签相融合的部分结构域的形式重组表达。所述的重组蛋白抗原可被固定于平板或珠上，用作文库筛选过程中的亲和靶。抗原也可以从全血的细胞制备物中分离，其中，膜蛋白的纯化的或是复合混合物可被固定于固体基质(珠，平板，或其他)，并用作筛选过程中的亲和靶。
阅读此公开内容的技术人员将能够创建特异性结合红细胞的抗体。实施例4-6涉及生成抗体或其片段。多种平行技术用于发现新抗体或抗体片段，或是用于制备包含这种对红细胞具有活性的片段的组合物，包括但不限于噬菌体展示，酵母展示，细菌展示。另外的红细胞结合抗体，抗体片段或scFvs可特异性地针对选自下述靶物或靶物的组(在本申请中总称为红细胞靶物组)中一种或以上生成：Band 3(CD233),水通道蛋白-1,Glut-1,Kidd抗原,RhAg/Rh50(CD241),Rh(CD240),Rh30CE(CD240CE),Rh30D(CD240D),Kx,血型糖蛋白A(CD235a),血型糖蛋白B(CD235b),血型糖蛋白C(CD235c),血型糖蛋白D(CD235d),Kell(CD238),Duffy/DARC(CD234),CR1(CD35),DAF(CD55),红细胞糖苷脂,CD44,ICAM-4(CD242),Lu/B-CAM(CD239),XG1/XG2(CD99),EMMPRIN/neurothelin(CD147),JMH,糖基转移酶,Cartwright,Dombrock,C4A/CAB,Scianna,MER2,stomatin,BA-1(CD24),GPIV(CD36),CD108,CD139,和H抗原(CD173)。
此外，新的红细胞-特异性抗体可以通过用完整的人红细胞、或其蛋白制备物免疫小鼠来制备。在用与佐剂配制在一起的靶物免疫后，在预定的时间点处死小鼠，将它们的抗体所有组成成分(repertoires)测序，和/或分离它们的B细胞用作基于杂交瘤的筛选。这些抗体或抗体片段可以通过数种以上所述的体外技术优化，以获得改善的结合和/或稳定性参数。另外的红细胞结合抗体或抗体片段可通过之前发现的结合红细胞的抗体杂交瘤生产。可利用，例如用于生产TER119scFv的方法制备。可利用下述杂交瘤克隆作为模板，或作为抗体源：BRIC 4,5,6,10,14,18,39,66,68,69,87,108,110,111,125,126,128,145,155,157,163,170,198,203,216,220,221,222,229,230,231,235,or 256；BRAC 17,18；BGRL 1,2,11,100；BRAD 3；BIRMA D6,D10,K3,84B；6A7；COE；或KZ1等。
术语“肽”在本文中与术语“多肽”互换使用。抗体和抗体片段是肽。术语“抗体片段”指抗体中保留抗体的抗原结合功能的部分。片段可以顾名思义从较大抗体的一部分生成，或者可以从头合成。抗体片段包括例如单链可变片段(scFv)。scFv是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区用接头肽(例如约10至约50个氨基酸)连接而成的融合蛋白。接头可以连接VH的N端与VL的C端，或者相反。术语“scFv”包括二价scFv、双抗体、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)和抗体片段的其它组合。抗体具有称作互补位的抗原结合部分。术语”肽配体”指这样的肽，其不是互补位的一部分。
通过抗体及其片段，通过肽结合配体，以及通过适体，结合红细胞，可在没有共价结合红细胞的情况下进行。所述的结合可在体内进行，而无先体外后体内红细胞结合事件。这种包括抗原与红细胞产生缔合的结合事件，可以在不引起红细胞凋亡的情况下进行。进行所述的处理，以使得红细胞的表面分子不因交联试剂和/或结合事件彼此交联，并且不经由共价键交联。
双特异性蛋白质构建体结合红细胞抗原
在创建结合红细胞的蛋白质构建体时，主要的设计选择在于创建包含所关注的抗原和所述红细胞-结合部分的、单个的蛋白质或分子融合物。
供选择的、在生产和应用中更有效的设计，是与直接或间接结合所关注抗原的其他结构域融合的、包含一个结合红细胞的结构域的、双特异性蛋白质或分子构建体。所述分子融合物中不包含所关注的实际抗原，仅是其某个部分(moiety)直接或间接结合所关注的抗原。如此，不需要对所关注的抗原进行修饰或工程化。此种涉及的一个示例是双特异性抗体或抗体片段，其具有一种特异于红细胞的抗体结构域，该结构域与另一种抗体结构域重组融合，上述的另一种结构域特异性结合具有所关注抗原的生物分子。实施了多种不同的双特异性抗体构建体，包括但不限于串连scFv的，双抗体，和串连scFv-IgG分子(62)。也使用了其他的非-蛋白质的支架，包括聚合的纳米颗粒或其他的多价的高分子缀合物，其通过驻留(harboring)结合所关注抗原的结构域，以及结合红细胞的、另外的结构域，被工程化为双特异性的。
所述双特异性构建体的亲合性部分可以是肽结构域和/或抗体片段结构域的任意组合。结合红细胞或靶蛋白质抗原的肽由常规的肽文库筛选技术获得，包括，珠子或多成肽文库筛选，噬菌体展示，细菌展示，和酵母展示。所述工程化的肽对其结合靶的特异性和亲合性利用标准的生物化学实验，例如ELISA,表面等离振子共振，和基于流式细胞术的方法，表征。利用常规的技术，例如基于杂交瘤的选择方法，噬菌体展示,酵母展示,细菌展示,核蛋白体展示，或是直接抗体基因或基于蛋白质组学的测序方法，由所免疫的动物来获得结合红细胞或靶蛋白质抗原的抗体或抗体片段。工程化的抗体或抗体片段对其结合靶的特异性和亲合性利用标准的生物化学实验，例如ELISA,表面等离振子共振，和基于流式细胞术的方法，表征。
在发现并表征了每一亲合性部分(肽，抗体和/或抗体结构域)之后，利用标准的重组DNA技术，例如装配PCR(assembly PCR)或者直接基因合成，将它们融合形成双特异性分子构建体，而后，所述的融合蛋白在合适的宿主中表达。也通过化学的方式将两种单独的部分，以被认为是适合双特异性结合的任意组合(肽-肽，肽-抗体片段，等等)缀合在一起，来创建双特异性构建体。利用多种现有技术(state-of-the-art architectures)(1)，用两种抗体结构域创建双特异性抗体。此外，利用合成的聚合物支架(PEG,PPG,或其他)构建各结合部分之间的连接，提高所述构建体的灵活度(flexibility)。也利用支化聚合物，通过抗体亲抗原效应(avidity effects)来提高对红细胞、对蛋白质抗原，或对以上两者的亲和力。
利用标准的体外生物化学结合亲和力实验，例如ELISA，和表面等离子体共振，进行所述双特异性构建体的结合效力表征。通过向动物模型，如小鼠或大鼠，注射所述的双特异性构建体、或者是所述双特异性构建体和抗原，然后采样血液，利用类似的体外实验检验红细胞和抗原结合，由此来表现所述双特异性构建体的体内性能。
实施方案包括药学上可接受的组合物，其包含：与特异性结合靶物的结构域相连的红细胞-结合部分。所述的靶物可包括蛋白质，所述蛋白质还包含致耐受性抗原。所述的红细胞-结合部分可包括肽配体,抗体，抗体片段,单链抗原结合结构域(ScFv)或适体。所述的结构域可能选自：抗体，抗体片段，和单链抗原结合结构域(ScFv)，肽配体，和适体。一种实施方案是组合物，其包含具有红细胞结合部分的、选自分子融合物,串连scFv,双抗体，和串连scFv-IgG分子，的成员，所述的结构域是上述成员的一部分。单个的融合蛋白或其编码核酸可包含红细胞-结合结构域以及其他的结合所述靶物的结构域。
利用红细胞-结合抗原对抗原-特异性抗体进行治疗性清除
抗原-特异性抗体的诱导对治疗不利，并通常可在蛋白质替换治疗过程中、自体免疫发病中、以及生物试剂治疗中，引起危险的副作用(63-68)。能清除血液中循环的抗原-特异性抗体的治疗性干预可能具有正面的临床影响，因为这种药物-特异性抗体的清除使得未来利用所述药物进行治疗、同时减少由于药物-抗体复合物所导致的不利免疫副作用风险成为可能。在血友病-A的示例中，大约30％的患者诱导针对标准的治疗蛋白质药物抗-药物因子VIII的抗体，使得进一步应用因子VIII的治疗危险且无效。在所述的患者中治疗性干预，以清除因子VIII-特异性循环抗体，使得治疗性因子VIII的方案重新起效，而不必使患者变换到其他更加昂贵且效力较低的治疗选择。在在全身性红斑狼疮(SLE,lupus)，即：一种由针对体内天然自身抗原的抗体所诱导的自身免疫疾病的示例中，治疗性处理，以清除自身抗原-特异性抗体在血液中的循环可极大地降低致病性和疾病发作的进程。
为了清除抗原-特异性抗体，将抗原工程化以结合施用后的循环红细胞。创建与所关注的抗原融合的红细胞-结合部分的分子构建体，以形成所述的红细胞-结合抗原。或者如上所述地，实施双特异性构建体以创建所述抗原的红细胞-结合制剂(formulation)。通过此种方式，一旦注射了红细胞-结合抗原，任何特异于所述抗原的循环抗体都将结合于工程化的抗原，与循环红细胞原位紧密缔合。在抗原特异性抗体与红细胞之类的天然循环细胞的紧密物理缔合过程中，危险的炎症免疫效应通过呈现在红细胞上的调节信号所抑制。红细胞在其表面上表达数种调节分子，包括CD55和CD59，等(67)。由此，抗原-特异性抗体保持与红细胞的结合，并通行于天然清除红细胞的区域，其间它们也被清除了。所述的抗原-装饰的红细胞作为细胞保管库(cellular safe-deposit)和抗原特异性抗体的清除载体。
在施用所述工程化的抗原构建体后，通过从实验动物定期采血并实施抗原特异性抗体滴定技术，如ELISA，对抗原-特异性抗体的清除进行体内表征。分泌抗体的免疫细胞(B细胞，桨细胞，等等)的特异性清除或灭活，也通过从受体小鼠的血液，骨髓，脾，淋巴系统分离免疫细胞，并进行抗原-特异性体外再刺激B-细胞ELISpots实验，和多参数流式细胞术，进行表征。在自体免疫相关研究中，相关的自身免疫紊乱小鼠模型用于在自身清除中红细胞-结合抗原作用的表征。
所述组合物的用途包括，从循环中去除抗体和/或将其结合于红细胞。一种实施方案是，药学上可接受的组合物，其包含：与抗原相连的红细胞-结合部分。所述的抗原可能是天然自身抗原，如红斑狼疮抗原。所述的抗原也可以是施用于患者的治疗性蛋白，例如因子VIII抗原。
用于特异性结合红细胞的适体
除了结合红细胞的肽配体之外，还教导了红细胞表面组分的核苷酸适体配体。因而，要生成并使用适体，如本文中对其它红细胞结合性模块描述的。可以使用DNA和RNA适体来提供非共价红细胞结合。由于它们仅由核苷酸构成，适体是有希望的生物分子靶向模块，因为：筛选方法学建立完善，它们容易化学合成，并且由于在体内快速清除所以导致的副作用毒性和/或免疫原性有限(Keefe,Pai等,2010)。此外，由于核苷酸-靶蛋白相互作用的非规范性质，在体内靶物结合后几乎不可能发生任何有效的激动性信号传导，从而促成低免疫原性和毒性。因而，许多基于适体的分子目前在许多临床适应症(包括白血病、黄斑变性、血栓形成、和2型糖尿病)的人临床试验中(Keefe,Pai等,2010)。也已经在诸如癌症化学疗法和荧光或放射线学肿瘤检测技术等应用中使用适体作为靶向剂来将药物载荷递送到体内的特定组织(Rockey,Huang等,2011；Savla,Taratula等,2011)。
适体是结合特定靶分子的寡核酸或肽。通常通过从大的随机序列集合遴选适体，来创建适体以结合感兴趣的靶物。适体可以分类为DNA适体、RNA适体、或肽适体。核酸适体是已经经由重复轮次的体外遴选或指数富集的配体系统进化(Systematic Evolution of配体by Exponential Enrichment,SELEX)方法(Archemix,Cambridge,MA,USA)(Sampson,2003)工程化改造以特异性结合靶物诸如小分子、蛋白质、核酸、细胞、组织和生物体的核酸种类。肽适体通常具有在两个末端附接于蛋白质支架的短的肽可变域。肽适体是设计为干扰细胞内部的其它蛋白质相互作用的蛋白质。它们由在两个末端附接于蛋白质支架的可变肽环构成。此双重结构约束大大提高肽适体的结合亲和力，乃至与抗体相当。可变环长度通常由约10至约20个氨基酸构成，而支架是具有良好溶解性且致密的蛋白质。例如，细菌蛋白质硫氧还蛋白-A是一种支架蛋白质，其中可变环插入还原性活性位点(其在野生蛋白质中是-Cys-Gly-Pro-Cys-环)内，两个半胱氨酸侧链能够形成二硫化物桥。
一些用于生成适体的技术详述于Lu等,Chem Rev 2009:109(5):1948-1998，以及还有US 7,892,734,US 7,811,809,US 2010/0129820,US2009/0149656,US 2006/0127929,和US 2007/0111222。实施例8进一步详述了制作和使用供用于本文中所公开的实施方案的适体的材料和方法。
分子融合物
可以在第一肽红细胞结合性配体和第二肽之间形成分子融合物。融合物包含彼此直接或间接缀合的肽。肽可以彼此直接缀合或者经由接头间接缀合。接头可以是肽、聚合物、适体、核酸、或颗粒。例如，颗粒可以是微粒、纳米颗粒、聚合物囊泡(polymersome)、脂质体、或胶束。例如，聚合物可以是天然的、合成的、线性的、或分支的。包含第一肽和第二肽的融合蛋白是肽的分子融合物的例子，其中融合蛋白包含彼此直接连接的肽或者具有居间接头序列和/或在一个或两个末端的其它序列。与接头的缀合可以经由共价键进行。其它键包括离子键。方法包括制备分子融合物或包含分子融合物的组合物，其中分子融合物包含特异性结合红细胞的肽和治疗剂、耐受化抗原、或其它物质。
术语“分子融合物”，或术语“缀合的”，指通过化学键(包括共价的、静电离子、电荷-电荷)的直接或间接结合。缀合形成通过化学键合维持的单元。直接缀合指与作用剂的化学键合，其中用或不用中间接头或化学基团。间接缀合指与担载体的化学连接。担载体可以大部分包囊作用剂，例如聚合物囊泡、脂质体或胶束或某些类型的纳米颗粒，或者在其表面上具有作用剂，例如，金属纳米颗粒或珠，或者两者兼有，例如包含一部分作用剂在其内部且包含一部分作用剂在其外部上。载体还可以包囊用于免疫耐受的抗原。例如，可以制作包囊抗原的聚合物囊泡、脂质体、或颗粒。术语“包囊”意指完全覆盖，实质上没有任何部分暴露，例如，可以制作包囊抗原或药剂的聚合物囊泡。治疗剂的例子是单链可变片段(scFv)、抗体片段、小分子药物、生物活性肽、生物活性蛋白、和生物活性生物分子。
可以通过用或不用接头共价键合肽与另一种分子来实现缀合。此类缀合物的形成在技术人员的技术范围内，并且用于实现缀合的多种技术是已知的，具体技术的选择依照要缀合的材料而定。对多肽(C或N端)添加的、含有可离子化侧链(即天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、组氨酸、或酪氨酸)，并且不包含在多肽序列的活性部分中的氨基酸以其未质子化状态作为强亲核体与附接于聚合物(即同或异双功能性PEG)的反应性基团进行各种生物缀合反应(例如，Lutolf和Hubbell,Biomacromolecules 2003；4:713-22,Hermanson,Bioconjugate Techniques,London.Academic Press Ltd；1996)。在一些实施方案中，使用可溶性聚合物接头，并且可以以药学可接受形式对患者施用。或者，药物可以在聚合物囊泡或媒介物中包囊或者共价附接于肽配体。
一个实施方案是非蛋白质治疗剂和特异性红细胞的肽配体、抗体、抗体片段、或适体的缀合物。红细胞结合性肽方法学的应用不限于多肽治疗剂；可以将它转化成其它药物配制剂，诸如小分子和聚合颗粒。在小分子及其在药物中应用的长期历史中，循环半衰期短和生物利用度差一直影响其体内效力。聚合胶束和纳米颗粒代表相对更新一代的药物类型，但是其药动学行为仍然差强人意，原因包括经由网状内皮系统作用的高清除速率(Moghimi和Szebeni,2003)。红细胞结合设计可以延伸到这些以及其它药物类型以提高其循环半衰期和临床效力。
缀合物可以包含颗粒。可以将红细胞结合性肽附接于颗粒。抗原、作用剂、或其它物质可以在颗粒之中或之上。纳米颗粒、胶束、和其它颗粒的例子可参见例如US 2008/0031899,US 2010/0055189,US 2010/0003338，在此通过提及将所述申请并入本文用于所有目的，所述目的包括组合将其与如本文中所列的配体组合；然而，在冲突的情况中，以本说明书为准。
根据通过制备方法产生的多分散性，纳米颗粒可以制备为直径约10nm-约200nm(包括明确限定的边界之间的所有范围和数值，例如约20至约200，以及约20至约40，至约70，或至约100nm)的颗粒的集合的形式。可以利用各种纳米颗粒系统，诸如那些自聚(乙二醇)和聚(乳酸)的共聚物形成的、那些自聚(环氧乙烷)和聚(β-氨基酯)的共聚物形成的、和那些自蛋白质诸如血清白蛋白形成的。其它纳米颗粒系统是这些领域中的技术人员已知的。还可见Devalapally等,Cancer Chemother Pharmacol.,07-25-06；Langer等,International Journal of Pharmaceutics,257:169-180(2003)；及Tobío等,Pharmaceutical Research,15(2):270-275(1998)。
也可以制备纳入有软骨组织结合配体的超过约200nm平均直径的较大颗粒，这些颗粒在本文中称作微粒，因为它们开始接近微米尺度，并且接近落入光学分辨率的界限内。例如，用于生成微粒的某些技术在美国专利Nos.5,227,165,6,022,564,6,090,925,及6,224,794中列出。
为了利用靶向能力而功能化纳米颗粒，需要将靶向性多肽与颗粒缔合，例如使用生物缀合技术通过共价结合来进行缔合，其中具体技术的选择依照多肽要连接的颗粒或纳米颗粒或其它构建体而定。一般地，用于将肽附接于其它材料的许多生物缀合技术是公知的，并且可以针对具体材料选择最合适的技术。例如，可以将其它氨基酸附接于多肽序列，诸如在将多肽附接于硫醇反应性分子的情况中为半胱氨酸。
为了创建能够展示多个不同生物反应性分子的多聚分子，将商品化8-臂PEG树枝状聚合物(dendrimer)化学修饰以包含反应基团以便于缀合反应。8-臂PEG-吡啶基二硫化物含有吡啶基二硫化物基团，其容易与来自小分子和/或含有半胱氨酸的肽或蛋白质的硫醇盐或酯起反应，在附接的生物活性模块和8臂PEG支架之间产生二硫键。8臂PEG的多聚构造容许不同肽或分子与支架的缀合，如此创建依靠其附接的模块而具有多种活性的异官能化生物分子。创建了能够在体外(图4A)及在体内(图4B)结合红细胞的异官能化荧光8臂PEG构建体。此结合是对ERY1肽序列特异性的，因为含有非特异性MIS肽的缀合物对红细胞显示极少的结合或无结合。体内结合是长时间存在的，因为荧光8臂PEG-ERY1-ALEXAFLUOR647在静脉内施用后5小时在循环的红细胞上检出，并且展示2.2小时的细胞表面半衰期(图5)。为了在自身免疫性糖尿病小鼠模型中证明耐受性诱导，创建了与ERY1和糖尿病抗原嗜铬粒蛋白-A(CrA)两者缀合的8臂PEG。8臂PEG-吡啶基二硫化物支架的模块性质使得有可能通过顺序添加化学计量上限定量的分子来共缀合不同的含有硫醇的分子。
分子融合物可以包含聚合物。聚合物可以是分支的或线性的。分子融合物可以包含树枝状聚合物。一般地，可以使用可溶性亲水性生物相容性聚合物，使得缀合物可溶，并且在导入患者中后可为生物利用。可溶性聚合物的例子是具有至少100、400、或100-400,000的分子量的聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、和聚乙二醇(该术语包括聚氧化乙烯)(涵盖这些明确数值间的所有范围和数值)。在此上下文中的溶解度指在水或生理盐水中每升至少1克的溶解度。也可以使用生物可降解聚合物的域，例如，聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚己酸内酯、多羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、和聚腈基丙烯酸酯。
在一些实施方案中，制备多肽-聚合物缔合物(例如聚合物)，并将其以药学可接受状态的纯化的组合物的形式，或者与药用赋形剂一起导入身体中。例如，导入的部位可以是全身性的，或者在组织或移植部位处。
技术人员可以使用这些领域中已知的技术来制备融合蛋白。实施方案包括制备融合蛋白，分离它们，并以药学可接受形式与或不与其它作用剂一起，例如，与TGF-β的白介素组合施用它们。实施方案包括用于转染细胞，由此工程化改造细胞以使之在体内生成融合蛋白的载体及方法，其中细胞在体外、离体、或在体内转染，且细胞是组织移植物的成员或区别于组织移植物。在此出于所有目的通过提及将下列美国专利申请并入本文，所述目的包括生成融合蛋白的目的，在冲突的情况中以本说明书为准：5227293,5358857,5885808,5948639,5994104,6512103,6562347,6905688,7175988,7704943,US 2002/0004037,US 2005/0053579,US 2005/0203022,US 2005/0250936,US 2009/0324538。
例如，分子融合物的实施方案包括包含致耐受性抗原和红细胞结合性模块的分子融合物，所述红细胞结合性模块特异性结合患者中的红细胞，由此连接抗原与红细胞，其中以对包含致耐受性抗原的物质有效产生免疫耐受性的量施用分子融合物。例如，实施方案包括这样的组合物，其包含与选自下组的担载体连接的、特异性结合红细胞的红细胞结合性模块：聚合物、分支的聚合物、和颗粒，其中所述担载体与治疗剂连接。例如，颗粒可以是微粒、纳米颗粒、聚合物囊泡、脂质体、或胶束。红细胞结合性模块可以包含含有选自下组的序列的至少5个连续的氨基酸残基的肽：SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ IDNO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:1及它们的保守取代，其中所述序列特异性结合红细胞。红细胞结合性模块可以包含抗体、抗体片段、适体、scFv或肽配体。分子融合物的实施方案包括红细胞结合性模块和致耐受性抗原、抗体、抗体片段、ScFv、小分子药物、颗粒、蛋白质、肽、或适体。
本发明的一个优选的方面提供分子融合物，其包含致耐受性抗原和选自Band 3(CD233),血型糖蛋白B(CD235b),血型糖蛋白C(CD235c)和血型糖蛋白D(CD235d)的红细胞-结合部分。所述的分子融合物特别适于产生免疫耐受性。优选的分子融合物包含选自下述的致耐受性抗原：蛋白质，蛋白质的部分，人蛋白质或其部分，非人蛋白质或其部分，聚糖，含非人糖基化的蛋白质的聚糖，人自身免疫抗原，用于人的治疗性蛋白或其部分和人食物的一部分，由于遗传疾病缺损的蛋白质，具有非人糖基化的蛋白质，非人蛋白质，非天然存在于人中的合成蛋白质，人食物抗原，人移植抗原，和人自身免疫抗原；以及选自Band 3(CD233),血型糖蛋白B(CD235b),血型糖蛋白C(CD235c),血型糖蛋白D(CD235d)的红细胞-结合部分。
用于改善药动学的红细胞结合性配体
由于许多药物是全身性地递送到血液循环系统的，对有效药物递送问题的解答经常聚焦于在血液中将药物维持更长时期。因此，在血液中长期保持生物可用性的长期循环(长半衰期)治疗剂的开发，将会代表为了效力、安全性、和经济可行性等目的而工程化改造的新一代药物。
本发明的实施方案包括红细胞结合性肽与治疗剂的分子融合物。特异性结合红细胞的肽和治疗剂或其它物质之间的分子融合物为作用剂/物质提供延长的循环时间(体内血液循环半衰期)。例如，延长可以是血清半衰期延长约1.5倍至20倍，技术人员容易想到，明确规定的范围内的所有范围和数值均已被考虑到，例如约3倍或约6倍或约3倍-约6倍。
例如，可以通过将肽重组添加、或通过化学缀合将肽添加到治疗剂或相关分子或颗粒上的反应性位点，来实现分子融合物。由于可以使用固相肽合成来合成高产量的具有不同末端反应基团的纯肽，有多种用于将肽附接于治疗剂上的缀合策略。虽然此功能化方法因蛋白质使用的重组方法而异，但据信效果(红细胞结合，其导致循环半衰期延长)是相同的。
本发明的一个实施方案涉及利用特异性结合红细胞的短肽配体作为用于改善治疗剂的药动学参数的工具来功能化治疗剂。此半衰期延长方法学考虑治疗性药物设计中的关键参数，即制造简单性、模块性(modularity)、以及延长效果的调节能力。使用标准重组DNA技术，容易在氨基酸水平上改变蛋白质以使其含有新的或改变的功能性。一般地，依靠使用较短的肽域来发挥功能相对于使用较大的多肽域是优选的，原因包括容易制造、正确折叠成功能性治疗性蛋白质、以及对原始治疗剂自身的生物物理改变最小。多肽，例如ERY1(一种人红细胞结合性配体)，或抗体或其片段可以工程化改造为特异性结合红细胞，并且可以与治疗剂缀合以延展生物利用度(例如以作用剂的循环半衰期来量度的)。
本文中报告的结果提供了生成分子融合物以改善治疗剂的药动学参数的机会，所述治疗剂诸如胰岛素、醋酸普兰林肽(pramlintide acetate)、生长激素、胰岛素样生长因子-1、红细胞生成素、1型α干扰素、干扰素α2a、干扰素α2b、干扰素β1a、干扰素β1b、干扰素γ1b、β-葡糖脑苷脂酶、腺苷脱氨酶、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白介素1、白介素2、白介素11、因子VIIa、因子VIII、因子IX、艾塞那肽(exenatide)、L-天冬酰胺酶、拉布立酶(rasb尿酸氧化酶)、肿瘤坏死因子受体、和恩夫韦地(enfuvirtide)。
其他人实现被动(passive)半衰期改善方法的尝试聚焦于增加药物的表观流体动力学半径。肾的肾小球过滤装置是身体中过滤血液组分的主要部位。过滤的主要决定因素是血液中分子的流体动力学半径；较小的分子(<80kDa)以比较大的分子高的程度被滤出血液。研究者已经利用此一般化的规则来修饰药物以展现出较大的流体动力学半径以及因此较长的半衰期，修饰主要是藉由与大分子量水溶性聚合物，诸如聚乙二醇(PEG)的化学缀合来进行。此方法在目前在临床中供应的许多PEG化蛋白质和小分子治疗剂中取得了明显的成功(Pasut和Veronese,2009；Fishburn,2008)。虽然在许多情况中在延长循环半衰期方面是有效的，尤其在嫁接物或融合物的流体动力学半径增加时(Gao,Liu等,2009)，但是这些方法在制造和维持生物学效应物功能方面却提出了难题。缀合反应中的不均一性可能导致具有不同生物学活性的复杂产品混合物，这主要是由于利用位点非特异性化学所致。往往在精确的纯化方法后进行大量的生物化学表征以保留均一的治疗产品(Huang,Gough等,2009；Bailon,Palleroni等,2001；Dhalluin,Ross等,2005)。此外，对蛋白质的反应性区附接大的模块(诸如分支的PEG)可导致受体亲和力的降低(Fishburn,2008)。
其他人的其它工作已经提供了治疗性蛋白质结合白蛋白以实现药物循环延长(Dennis,2002；Walker,Dunlevy等,2010)。考虑到上述关于肾过滤的相同一般原则，Dennis及同事提出了通过工程化改造治疗剂以结合血液中的另一种蛋白质(诸如血清白蛋白)来增加其表观大小会降低药物清除速率的假说。以此方式，药物只有在施用到血流后才会获得较大的分子尺寸。对抗体片段添加亲和力成熟的血清白蛋白结合肽在小鼠中将其循环时间延长24倍(Dennis,2002)。此方法虽然有效，但由于新生儿Fc受体(FcRn)的白蛋白再循环的动力学及使用半胱氨酸约束性环肽实现功能性而变得复杂。Walker及同事确证了Dennis在2002年贡献的结果，即对蛋白质赋予血清白蛋白亲和力可延长其半衰期。由Walker及同事描述的方法涉及对蛋白质药物重组添加大的抗体片段，这可以引起结构及制造上的复杂情况。Dennis和Walker的方法虽然巧妙且有效，但由于使用复杂的环域或大型域来实现功能性而变得复杂。Dennis及同事发现的肽虽然对白蛋白展示高亲和力，但是它们在使用之前需要正确形成环形结构的物理约束。Walker的融合较大抗体片段的方法是一种更繁琐的办法，可能不适用于本来已具有复杂的折叠结构的或表达产量低的蛋白质。
单链抗体
本发明的一个实施方案是scFv与特异性结合红细胞的肽的分子融合物。scFv可以用作治疗剂，并且其与红细胞结合性肽的组合可以用于延长其循环半衰期，并且使其能进入身体区室。重组抗体和重组抗体片段在生物制品业中具有作为治疗剂的潜力(Sheridan,2010)。
单链可变片段(scFv)抗体片段包含全长IgG的整个抗原结合域，但是缺乏铰链和恒定片段区(Maynard和Georgiou,2000)。scFv的重组构建牵涉用短的多肽结构融合可变重链(VH)域与可变轻链(VL)域，所述短的多肽接头由甘氨酸和丝氨酸的串联重复组成(例如(GGGGS)4)(SEQ ID NO:18)。虽然scFv的简单性对于治疗性应用是有吸引力的，但是其主要的缺点是由于其相对较小的26-28kDa的分子量致使它们展现的短循环半衰期(Weisser和Hall,2009)。
由于scFv设计中通常使用的甘氨酸-丝氨酸接头本质上是非功能性的，而是作为物理桥存在以确保正确的VH-VL折叠，因此在本文中测试了展现出结合血液中红细胞的功能的接头域。如此，工程化scFv可以是多功能性且双特异性的，通过VH-VL域展示对其天然抗原的亲和力，并且在其接头域中展示对红细胞的亲和力。在对红细胞的结合中，工程化scFv会展现出较长的循环半衰期，如已经对具有此相同功能性的另一种模型蛋白质证明的。scFv抗体片段可以具有如本文中所描述的接头，或者可以提供如这些领域中的技术人员已知的其它接头。一个备选的实施方案准备在scFv的接头区中工程构建游离的半胱氨酸基团，并且使用此半胱氨酸硫醇通过化学缀合连接红细胞结合性配体。
工程化scFv抗体的设计聚焦于接头域长度，及红细胞结合性肽的安排(spacing)的重要性。由于野生型变体设计为具有(GGGGS)4接头(SEQ IDNO:18)并验证了抗原结合，随后的突变体设计为具有20个氨基酸的最小接头长度的接头。由于接头域可以调节scFv正确折叠成其正确的三级结构，设计了两个含有ERY1的突变体。REP突变体含有在接头域中居中的ERY1肽，其侧翼有正确数目的Gly和Ser残基以维持亲本20个氨基酸的接头长度。在可能的情况下，ERY1肽的疏水性质不是线性排列的，而是群集成较短的装配域，此时REP的接头长度会更短，并且由此可能阻碍正确折叠。出于该原因，INS突变体设计为含有添加到亲本接头域中心的ERY1肽，并将接头延长到32个氨基酸。由于被发现的ERY1肽具有游离的N端，其在受约束的多肽构象中的存在是否会实现红细胞结合是不得而知的。为了应对此潜在的行为，通过与合成的ERY1肽化学缀合创建了这样的scFv变体，使得此肽的N端是游离的，而C端与scFv缀合。
以此方式，红细胞结合性肽的数目，以及相应地scFv的红细胞结合能力可以在整个缀合反应期间以化学计量的方式加以调整。因而，ScFv可以工程化改造成包含如本文中教导的红细胞结合性肽。实施方案包括包含范围为1至20的配体数目的scFv；技术人员容易想到明确规定的范围内的所有范围和数值都已被考虑到，例如2-6之间。
实施方案包括scFv与致耐受性抗原缀合以生成诱导耐受性的分子融合物，例如实施例6中描述了用于产生耐受性的详情，以产生针对附接于scFv的OVA的耐受性为例。实施例6还详述了用于生成与抗原的免疫识别表位重组融合的scFv蛋白构建体的材料和方法。该scFv以红细胞识别为目的。所述抗原是如本文中所描述的抗原，例如致耐受性抗原。本文中报告的工作例描述了使用鼠模型的结果，在构建体中使用鼠TER119scFv作为抗体域。TER119是一种结合小鼠红细胞的抗体。TER119抗体域可以替换为其它抗体域，例如针对人或其它动物中的红细胞的域。例如，可以使用10F7抗体域来创建能够结合人红细胞的抗体-抗原构建体。用三种不同抗原(如实施例6中报告的)，包括OVA的MHC-I免疫优势表位、嗜铬粒蛋白-A模拟表位(mimetope)1040-p31、和胰岛素原制备了来自Ter-119的scFv的其它融合物。
实施例13给出了已制备出的scFv的另外的实施方案，包括在动物模型中检测的实施方案，以及与人具有反应性的实施方案。这些具体方案包括涉及蛋白质水平的：TER119-SIINFEKL,TER119-ChrA,和TER119-胰岛素原。还包括基因水平的：TER119-SIINFEKL,TER119-ChrA,TER119-胰岛素原,TER119-尿酸氧化酶,TER119-InsB9-23,TER119-ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO:80),TER119-H-2kb,TER119-H-2kd,10F7-SIINFEKL,10F7-ChrA,10F7-胰岛素原，和10F7-尿酸氧化酶。
红细胞对特定部位，诸如肿瘤血管系统的结合
除了延长药物的半衰期之外，工程化治疗剂结合红细胞的能力对于将红细胞选择性结合并定位至身体中的特定部位的目的也是有用的。在实体瘤治疗中，可以使用经动脉化学栓塞(TACE)来限制对肿瘤的血供，由此阻碍其获得生长需要的营养物。TACE治疗牵涉在肿瘤血供上游手术插入聚合固体微粒。当微粒到达肿瘤血管床时，它们被物理捕捉于血管网络中，由此产生对肿瘤血供的阻塞(Vogl,Naguib等,2009)。
按照TACE主题，本文中的一个实施方案是使用血液中循环的自体红细胞作为肿瘤栓塞的天然微粒，其通过将肿瘤归巢性(tumor-homing)治疗剂工程化改造为含有红细胞结合性肽来实现。以此方式，治疗剂定位于肿瘤血管床，并且募集通过的红细胞以结合血管，由此限制并阻断对肿瘤块的血流。此类治疗与经典的TACE相比侵入性较小：药物仅会被注射静脉内，并利用已经存在于血液中的天然红细胞作为栓塞颗粒。术语“肿瘤结合性”或“肿瘤归巢性”指这样的肽，其可结合肿瘤血管系统中的肿瘤细胞上的能够从血液区室接触到的组分。
具体的肿瘤归巢性治疗剂的发现是癌症研究领域中已知的。肿瘤的生物活性靶向的范例依赖于结合肿瘤环境中特异性表达的蛋白质标志物。这些包括但不限于：RGD-定向整联蛋白(directed integrin)、氨肽酶-A和-N、内皮唾液酸蛋白、细胞表面核仁蛋白、细胞表面膜联蛋白-1、细胞表面p32/gC1q受体、细胞表面网蛋白-1、纤连蛋白EDA和EDB、白介素11受体α、生腱蛋白-C、内皮糖蛋白/CD105、BST-2、半乳凝素-1、VCAM-1、纤维蛋白、和组织因子受体。(Fonsatti,Nicolay等,2010；Dienst,Grunow等,2005；Ruoslahti,Bhatia等,2010；Thijssen,Postel等,2006；Schliemann,Roesli等,2010；Brack,Silacci等,2006；Rybak,Roesli等,2007)。靶向任何这些分子的治疗剂可以是将红细胞结合性肽携带到肿瘤血管系统以引起特异性闭塞的载体。
一个实施方案是特异性结合红细胞的第一配体，其与第二配体缀合，所述第二配体特异性结合癌性细胞或肿瘤血管系统或肿瘤血管系统的组分，诸如内皮下膜(其部分暴露于肿瘤中的血液)中的蛋白质或肿瘤内皮细胞表面上的蛋白质。所述配体可以是导入患者中，例如导入血流中的药学可接受组合物的一部分。所述配体结合红细胞，而肿瘤归巢性配体结合肿瘤或肿瘤血管系统处或附近的部位，或者结合癌性细胞。红细胞在靶定部位处聚集，并且阻断靶部位接触营养物，例如通过栓塞血管。鉴于栓塞是机械性的，由红细胞的物理尺寸决定，栓塞将是迅速的。
实体瘤很大程度上依赖于其血管供应，已经开发出生物分子治疗剂及材料治疗剂(material therapetics)来阻断其血管供应的生长或阻断对其血管供应的流动。一个实施方案是生物分子配制剂或生物分子-纳米颗粒配制剂，其用于全身性注射以快速堵塞已知或未知位置处的原发性肿瘤或转移肿瘤中的实体瘤血管系统。
已经以多种方式尝试解决肿瘤栓塞，包括使用基于颗粒和生物分子的方法。生物材料颗粒(包括那些由聚乙烯醇生成的)具有大于肿瘤微血管系统的直径，例如50-500微米的直径，并且已经开发了用于在经导管动脉栓塞，或TACE中临床使用的生物材料颗粒(Maluccio,Covey等,2008)。一种平行方法包括在颗粒内部加载化学治疗剂以便在经动脉化学栓塞(TACE)中缓慢释放，主要用于治疗肝细胞癌(Gadaleta和Ranieri,2010)。在这两种情况中，当颗粒被注射到动脉循环中时(通常由参与干预的放疗人员在射线照相的引导下进行)，这些颗粒可以流入肿瘤血管系统中，并且堵塞它们，阻断血流(Maluccio,Covey等,2008)。利用这些局部方法仅治疗了通过放置导管直接靶向的肿瘤，而其它肿瘤，诸如已知或未知位置处的转移，未得到治疗，因为颗粒不容易在血管中靶向。新近，已经探索了生物分子办法，例如使用识别血栓形成因子和不存在于正常血管系统中的肿瘤血管内皮标志物两者的双特异性抗体进行。在特异性结合肿瘤血管系统后，抗体积累，并在肿瘤血管内启动血液凝块形成以阻断它们；此效应仅在抗体靶向肿瘤时被诱导(Huang,Molema等,1997)。则这些生物分子办法具有这样的益处：若可以鉴定特异性肿瘤血管标签，则通过静脉内输注靶向原发性和继发性肿瘤两者；但是它们的缺点是不提供对肿瘤的迅速机械阻塞。
本发明的实施方案包括一种在患者中栓塞肿瘤的方法，包括对患者施用包含与靶向模块偶联的红细胞结合性模块的组合物，其中所述靶向模块是针对选自肿瘤和肿瘤微血管系统的靶物的抗体、抗体片段、或肽，且其中所述红细胞结合性模块包括特异性结合红细胞的肽、抗体、抗体片段、或适体。例如，肽可以是如本文中所列的序列。
抗原特异性免疫学耐受性
在改善治疗剂的药动学行为外，已经发现了红细胞亲和力可以在创建抗原特异性耐受性的方法中使用。实施例中列出了某些实施方案。在实施例部分给出了工作实施方案和预见实施方案。如本申请中所描述的，耐受性发生可以消除针对抗原的循环抗体，或使针对抗原的循环抗体减少至少10倍，即，至少100倍，至少1000倍，或10,000倍以上。耐受性发生可以预防，治愈或延缓疾病的进程，减少或消除移植组织排斥，以及减少或消除对某种物质的过敏反应。
实施例3和10-12详述了如何在预示人行为的小鼠动物模型中创建耐受性。实施例3显示用与结合于红细胞表面的肽配体相连的试验抗原(卵清白蛋白)创建耐受性。实施例10-12印证实施例3的结果，并提供进一步的工作例(working example)显示利用附着于scFv的卵清白蛋白和附着于肽配体的天冬酰胺酶创建耐受性。实施例12提供耐受性创建工作实施例，所述的耐受性逆转之前存在的免疫排斥。由此，实施方案包括用于耐受性发生的融合物分子，其包含天冬酰胺酶，抗原性天冬酰胺酶片段，天冬酰胺酶抗原性模拟表位，和红细胞-结合部分，所述的红细胞-结合部分特异性地结合于，例如血型糖蛋白A，或选自下述的靶物：Band 3,血型糖蛋白B,血型糖蛋白C或红细胞靶组的其它成员。所述的红细胞-结合部分可以是，例如选自抗体，抗体片段,scFvs,肽配体和适体和/或选自ERY19,ERY59,ERY64,ERY123,ERY141,ERY162,ERY19’,ERY59’,ERY64’,ERY123’,ERY141’,和ERY162’及其保守取代。可以在第一次施用天冬酰胺酶之前预防性地施用这些融合物分子，在一系列的天冬酰胺酶治疗过程中和/或在天冬酰胺酶治疗过程之后施用这些融合物分子。这些融合物分子可以在观察到对天冬酰胺酶药物的免疫应答之前，或是观察到了这种应答之后施用。
实施例3中，已经发现了结合小鼠红细胞的肽ERY1。用测试抗原卵清蛋白(OVA)生成ERY1的分子融合物。融合物在体内特异性结合红细胞，并且不结合其它分子，包括那些在血液或血管系统中的。观察到长的循环半衰期。观察到ERY1-OVA的红细胞结合导致抗原呈递细胞(APC)高效地交叉呈递OVA MHC I免疫优势表位(SIINFEKL)及反应性T细胞的相应交叉致敏。ERY1-OVA比OVA诱导数目高得多的膜联蛋白-V+增殖性OT-I CD8+T细胞，这提示了最终会导致克隆删除的凋亡命运。使用建立的OT-I攻击-耐受性模型(Liu,Iyoda等,2002)(图2)，证明了ERY1-OVA即使在使用非常强的细菌衍生的佐剂的情况下也可防止随后对疫苗介导的抗原攻击的免疫应答。与在用LPS进行抗原攻击前施用未修饰的OVA的小鼠(图2c)相比，ERY1-OVA的静脉内施用导致引流淋巴结(图2；图12b中门控)和脾中OT-ICD8+T细胞群的深度降低，这证明删除性耐受(deletional tolerance)。在施用ERY1-OVA的小鼠中展现的这种有效的克隆删除支持了早先OT-I CD8+T细胞交叉致敏增强的观察结果，而且还显示了交叉致敏在没有共刺激分子的APC呈递的情况下发生，导致删除性耐受。与经OVA处理的小鼠相比，ERY1-OVA的静脉内施用在第一次抗原施用后19天使OVA特异性血清IgG水平降低39.8倍(图3)。为了进一步证实抗原特异性免疫耐受性的诱导，将OT-I攻击-耐受模型与表达OVA的肿瘤移植模型(图2)组合，得到了有利的结果。此实施例中详述的结果表明ERY1-OVA对红细胞结合的可诱导抗原特异性免疫耐受。这一点响应于强佐剂攻击及表达异种抗原(xeno-抗原)的植入的细胞移植物都得以表现。此外，耐受是经由与循环红细胞上存在的抗原的相互作用而导致反应性CD8+T细胞功能性失活和删除来实现的，不依赖于直接的CD4+T细胞调节。用ERY1，一种小鼠红细胞结合性肽进行的这些详细实验可以预示在人体中使用人红细胞结合性肽(其中几种在本文中教导)得到的相似结果。此外，在已经显示了肽配体有效的条件下，可以使用与其它红细胞结合性配体，例如抗体、抗体片段、或适体，与结合红细胞表面分子的这些部分，例如本申请所述的表面蛋白或抗原中一种，的缀合物产生相似的结果。
实施例10还显示，通过将致耐受性抗原与结合红细胞的scFv融合创建针对致耐受性抗原的耐受性，以及制备所述融合物分子作为药物施用于患者。实施例10显示诱导针对OVA的MHC-I优势免疫结构域，即肽SIINFEKL(SEQ ID NO:3)，的耐受。该抗原与已知结合小鼠红细胞的scFvTER-119融合。与施用ERY1-OVA或OVA相比(图8)，在施用了TER119-SIINFEKL的小鼠中，通过流式细胞术测定由氟CFSE的稀释物确定的OT-ICD8+T细胞增殖明显增强，显示与可溶性抗原SIINFEKL相比，红细胞-结合提高了抗原-特异性CD8+T细胞交叉致敏(cross-priming)。此外，这些数据显示了，设计为结合红细胞抗体片段，展示免疫表位被免疫细胞有效地加工，以交叉致敏抗原特异性T细胞。这些有关交叉呈递和交叉致敏的结果，与其他通过来自凋亡细胞的APC吞咽抗原(engulfing antigen)在MHC I上呈递的致耐受性抗原的有关研究一致(Albert 1998,Green 2009)。TER119-SIINFEKL和ERY1-OVA比OVA诱导了更大量的膜联蛋白-V+和PD-1+增殖OT-I CD8+T细胞(图13)，表明导致克隆缺失的耗尽和凋亡命运。这些增殖CD8+T细胞的表型与其他已报道的OT-I过继转移模型一致，在所述的OT-I过继转移模型中，通过APC进行的、受调节的抗原-特异性T细胞受体衔接(engagement)没能诱导炎症性免疫应答(Bursch,Rich,etal.,2009)。
关于实施例10，显示了TER119-SIINFEKL和ERY1-OVA阻止针对疫苗-介导的抗原攻击(即使是与很强的、细菌衍生的佐剂一起的攻击)的随后免疫应答的能力。因此，具有结合红细胞的scFv或肽配体的融合物分子有效地产生耐受性。
实施例11显示，可以诱导针对治疗性蛋白以及具有治疗潜力的蛋白质的、抗原-特异性免疫耐受。许多的治疗性蛋白诱导免疫反应，使其临床应用具有危险或无效。天冬酰胺酶是源于微生物的治疗性酶，用于治疗急性淋巴母细胞性白血病，但其也诱导危险的免疫应答，因此排除了其重复施用的可能。使用的是小鼠模型。将天冬酰胺酶和红细胞-结合部分(肽ERY1)的融合物分子施用于小鼠，与用临床药物天冬酰胺酶治疗的小鼠相比较。所述的药物天冬酰胺酶产生了抗体，但所述融合物分子没有；这一试验确认了抗体水平可以用作耐受性的测量手段。通过向小鼠施用所述的融合物分子，然后重复施用临床药物天冬酰胺酶来检验耐受性，观察到即使是在重复施用所述药物的强烈攻击之后，也没有出现有力的抗体应答(potent antibody response)。相反，接受了药物而没有接受所述融合物分子的小鼠呈现免疫反应性和严重的过敏症。
实施例12显示，免疫逆转(immunoreversal)是可能的。对某种蛋白质呈现免疫反应性的小鼠经治疗，转变为对该蛋白耐受。应用的是实施例11的天冬酰胺酶小鼠模型。经所述融合物分子(天冬酰胺酶-和-红细胞结合剂(binder))治疗的、对所述药物天冬酰胺酶具有免疫反应性的小鼠，变为耐受所述药物天冬酰胺酶。
比较而言，先前的报告已经教导了通过将抗原附接于红细胞表面，由此生成疫苗来创建免疫排斥，并且其它报告已经使用包囊在红细胞内的抗原来创建疫苗。例如，当抗原包囊在红细胞内时，由此生成疫苗(Murray等,Vaccine 24:6129-6139(2006))。或者，与红细胞表面缀合的抗原是免疫原性的，并且被提议作为疫苗(Chiarantini等,Vaccine 15(3):276-280(1997))。这些参考文献显示了红细胞递送方法得到与用带佐剂的正常疫苗获得的一样好的免疫应答。其他人已经报告了诱导耐受需要红细胞内的放置，如专利申请WO2011/051346中，该专利申请还教导了几种改变红细胞表面以增强肝中被肝中的库普弗细胞清除的手段。该申请也教导了使抗体结合红细胞表面蛋白诸如血型糖蛋白A，但其目的是为了在红细胞上生成免疫复合物以增强其被肝中的库普弗细胞的清除。
本文中所列的实施方案提供了一种产生免疫耐受的方法，该方法包括施用包含分子融合物的组合物，所述分子融合物包含致耐受性抗原和红细胞结合性模块，该红细胞结合性模块特异性结合患者中的红细胞，由此连接抗原与该红细胞，其中以对包含所述致耐受性抗原的物质有效产生免疫耐受的量施用所述分子融合物。红细胞和患者可以没有对红细胞引起其它变化的处理，并且没有红细胞交联、化学共价缀合、包被、和与肽的特异性结合之外的其它改变。分子融合物可以包含，或组成为，与抗原直接共价键合的红细胞结合性模块。分子融合物可以包含附接于颗粒的红细胞结合性模块，所述颗粒附接于抗原。颗粒可以包括微粒、纳米颗粒、脂质体、聚合物囊泡、或胶束。致耐受性抗原可以包含治疗性蛋白质，例如，对遭受血液因子生成缺乏的患者施用的该血液因子的一部分。实施方案包括如下的例子，其中：患者是人，而致耐受性抗原是该患者遗传缺陷的人蛋白质；其中患者是人，而致耐受性抗原包含非人蛋白质的一部分；其中患者是人，而致耐受性抗原包含工程化治疗性蛋白质的不天然存在于人中的一部分；其中患者是人，而致耐受性抗原包含含有非人糖基化的蛋白质的一部分；其中致耐受性抗原包含人自身免疫性疾病蛋白质的一部分；其中致耐受性抗原是同种异体移植物移植中的抗原；其中致耐受性抗原包含选自下组的物质的一部分：人食物；和/或其中红细胞结合性模块选自下组：肽、抗体、和抗体片段。实施方案包括耐受化材料和方法，其中红细胞结合性模块包含含有选自下组的序列的至少5个连续的氨基酸残基的肽：SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ IDNO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:1及它们的保守取代，其中所述序列特异性结合红细胞。
可以选择分子融合物以在红细胞内部或外部上放置抗原。不限于具体的作用机制，提出了以下的理论。在人中，每天有约1％红细胞凋亡(红细胞凋亡(eryptotic))并且被清除，大量细胞及其蛋白质以如下的方式加工，使得维持对红细胞自身抗原的耐受性。经由使用ERY1肽或人红细胞结合性肽、红细胞结合单链抗体或抗体、红细胞结合适体、或另一种红细胞结合剂工程化改造为结合红细胞的抗原也可以引发相同的致耐受性应答。鉴于由Miller及同事(见上文)开发的现有技术方法是麻烦的，因为它需要将供体脾细胞收获并起反应以便重新施用，我们的非共价红细胞结合方法提供一种更简单的备选。由于在体内导入抗原缀合物或融合物后自发发生ERY1-红细胞或人红细胞结合性肽-红细胞或其它亲和性生物分子(例如单链抗体、抗体、或适体)相互作用，仅通过注射施用工程化抗原，就会原位发生结合。
在一些情况下，致耐受性抗原源自期望耐受的治疗剂蛋白质。例子是患者由于该蛋白质缺陷而对其不建立中心耐受的野生型蛋白质药物，例如，人因子VIII或因子IX；或者在人体中使用的非人蛋白质药物。其它例子是由于制备而以非人形式糖基化的蛋白质药物，或工程化蛋白质药物，其例如具有可以引起不想要的免疫应答的非天然序列。属于非天然存在于人体中的工程化治疗性蛋白质的致耐受性抗原的例子包括具有工程化突变，例如，改善药理学特征的突变的人蛋白质。包含非人糖基化的致耐受性抗原的例子包括在酵母或昆虫细胞中生成的蛋白质。
实施方案包括以某种频率X或剂量Y施用蛋白质以及还以更小的频率和/或剂量(例如，不超过0.2X的频率或不超过0.2Y的剂量)施用来自所述蛋白质的抗原；技术人员容易想到，明确规定的范围内的所有范围和数值都被考虑到了，例如，0.01或005X或其间的某个范围。
实施方案包括从蛋白质缺陷的人施用的蛋白质选择致耐受性抗原。缺陷意指接受该蛋白质的患者不天然生成足够的该蛋白质。此外，蛋白质可以是该患者遗传缺陷的蛋白质。此类蛋白质包括例如抗凝血酶-III、蛋白C、因子VIII、因子IX、生长激素、生长素、胰岛素、醋酸普兰林肽、美卡舍明(mecasermin)(IGF-1)、β-葡糖脑苷脂酶、阿葡糖苷酶(alglucosidase)-α、Laronidase(α-L-艾杜糖苷酸酶)、Idursuphase(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)、Galsulphase、阿加糖酶(agalsidase)-β(α-半乳糖苷酶)、α-1蛋白酶抑制剂、和白蛋白。因此，实施方案包括用于耐受性发生的融合物分子，其包含红细胞结合部分和至少一种抗原，抗原性片段，或一种或多种这些蛋白质的模拟表位，所述的红细胞-结合部分特异性地结合于，例如血型糖蛋白A，或选自下述的靶物：Band 3,血型糖蛋白B,血型糖蛋白C或红细胞靶组的其它成员。所述的红细胞-结合部分可以是，例如选自抗体，抗体片段,scFvs,肽配体和适体。
实施方案包括从治疗性抗体，抗体样分子，包括抗体片段和与所述抗体和抗体片段的融合蛋白中选择致耐受性抗原。它们包括非人(如小鼠)抗体，嵌合抗体和人源化抗体。在人中，甚至观察到对人源化抗体的免疫应答(Getts,2010)。因此，实施方案包括用于耐受性发生的融合物分子，其包含红细胞结合部分和至少一种抗原，抗原性片段，或一种或多种这些蛋白质的模拟表位，所述的红细胞-结合部分特异性地结合于，例如血型糖蛋白A，或选自下述的靶物：Band 3,血型糖蛋白B,血型糖蛋白C或红细胞靶组的其它成员。所述的红细胞-结合部分可以是，例如选自抗体，抗体片段,scFvs,肽配体和适体。
实施方案包括自非人的蛋白质选择致耐受性抗原。此类蛋白质的例子包括腺苷脱氨酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶、乳糖酶、肉毒杆菌毒素A型、肉毒杆菌毒素B型、胶原酶、透明质酸酶、木瓜蛋白酶、L-天冬酰胺酶、拉布立酶、来匹卢定(lepirudin)、链激酶、阿尼普酶(anistreplase)(茴酰化血纤维蛋白溶酶原链激酶激活剂复合物)、抗胸腺细胞球蛋白、响尾蛇多价免疫Fab、地高辛免疫血清Fab、L-精氨酸酶、和L-甲硫氨酸酶。
实施方案包括从人同种异体移植物移植抗原选择致耐受性抗原。这些抗原的例子是各种MHC I类和MHC II类单体型蛋白的亚基，以及次要血型抗原(minor blood group antigen)，包括RhCE,Kell,Kidd,Duffy和Ss上的单氨基酸多态性。
在一些情况中，致耐受性抗原是患者针对其已经形成自身免疫应答或者可能形成自身免疫应答的自身抗原。例子是胰岛素原(糖尿病)、胶原(类风湿性关节炎)、髓鞘碱性蛋白(多发性硬化)。
例如，I型糖尿病(T1D)是自身免疫疾病型，识别胰岛蛋白的T细胞已脱离免疫调节，并发信号给免疫系统以破坏胰腺组织。已经发现了多种蛋白质抗原是此类致糖尿T细胞的靶，包括胰岛素,GAD65,嗜铬粒蛋白-A，等等。在治疗或预防T1D中，诱导针对所定义的致糖尿抗原的抗原-特异性免疫耐受，功能性地灭活或排除所述的致糖尿T细胞克隆是有用的。实施例14在其他实施例中预测性建立的T-细胞数据的基础上，详细描述了呈递作为致耐受性抗原的嗜铬粒蛋白-A(ChrA)模拟表位的融合物分子成功地创建了针对ChrA的耐受性发生。据此，实施方案包括用于耐受性发生的融合物分子，其包含嗜铬粒蛋白-A，具有红细胞结合部分的、抗原或其抗原性部分，或其模拟表位，所述的红细胞-结合部分特异性地结合于，例如血型糖蛋白A，或选自下述的靶物：Band 3,血型糖蛋白B,血型糖蛋白C或红细胞靶组的其它成员。所述的红细胞-结合部分可以是，例如选自抗体，抗体片段,scFvs,肽配体和适体，和/或选自ERY19,ERY59,ERY64,ERY123,ERY141,ERY162,ERY19’,ERY59’,ERY64’,ERY123’,ERY141’,ERY162’及其保守取代。
因此，可能实现针对多种蛋白质的自身免疫疾病的耐受和/或发动过程的延迟，所述的蛋白质是人自身免疫性蛋白质(该术语指各种自身免疫性疾病，其中一种或多种引起疾病的蛋白质是已知的或者可以通过常规的测试建立)。
实施方案包括测试患者以鉴定自身免疫性蛋白质，并创建在分子融合物中使用的抗原及创建对蛋白质的免疫耐受。实施方案包括下列一种或多种蛋白质的抗原，或者从下列一种或多种蛋白质选择抗原。在1型糖尿病中，已经鉴定出几种主要的抗原：胰岛素、胰岛素原、前胰岛素原、谷氨酸脱羧酶-65(GAD-65)、GAD-67、胰岛素瘤关联蛋白2(IA-2)、和胰岛素瘤关联蛋白2β(IA-2β)；其它抗原包括ICA69、ICA12(SOX-13)、羧肽酶H、Imogen 38、GLIMA 38、嗜铬粒蛋白-A、HSP-60、羧肽酶E、外周蛋白、葡萄糖转运蛋白2、肝癌-肠-胰/胰腺关联蛋白、S100β、胶质细胞原纤维酸性蛋白、再生基因II、胰十二指肠同源框1、萎缩性肌强直病(dystrophia myotonica)激酶、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白、和SST G蛋白偶联受体1-5。在自身免疫性甲状腺疾病(包括桥本甲状腺炎和格雷夫斯氏病)中，主要的抗原包括甲状腺球蛋白(TG)、甲状腺过氧化物酶(TPO)和促甲状腺激素受体(TSHR)；其它抗原包括钠碘同向转运蛋白(symporter)(NIS)和巨蛋白。在甲状腺相关眼病和皮肤病中，除了甲状腺自身抗原(包括TSHR)外，抗原是胰岛素样生长因子1受体。在甲状旁腺功能减退中，主要的抗原是钙敏感性受体。在阿狄森(Addison)氏病中，主要的抗原包括21-羟化酶、17α-羟化酶、和P450侧链切割酶(P450scc)；其它抗原包括ACTH受体、P450c21和P450c17。在卵巢功能早衰中，主要的抗原包括FSH受体和α-烯醇化酶。在自身免疫性下垂体炎，或垂体自身免疫性疾病中，主要的抗原包括垂体配体特异性蛋白质因子(PGSF)1a和2；另一种抗原是2型碘化甲腺氨酸脱碘酶。在多发性硬化中，主要的抗原包括髓鞘碱性蛋白、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白和蛋白脂质蛋白。在类风湿性关节炎中，主要的抗原是胶原II。在免疫胃炎(immunogastritis)中，主要的抗原是H+,K+-ATP酶。在恶性贫血(pernicious angemis)中，主要的抗原是内因子。在乳糜泻中，主要的抗原是组织转谷氨酰胺酶和麦醇溶蛋白。在白癜风中，主要的抗原是酪氨酸酶，和酪氨酸酶相关蛋白1和2。在重症肌无力中，主要的抗原是乙酰胆碱受体。在寻常型天疱疮和变型中，主要的抗原是桥粒芯蛋白(desmoglein)3、1和4；其它抗原包括天疱膜联蛋白、桥粒胶蛋白(desmocollin)、斑珠蛋白(plakoglobin)、斑周蛋白(perplakin)、桥粒斑蛋白(desmoplakin)、和乙酰胆碱受体。在大疱性类天疱疮中，主要的抗原包括BP180和BP230；其它抗原包括网蛋白和层粘连蛋白5。在杜林疱疹样皮炎中，主要的抗原包括肌内膜和组织转谷氨酰胺酶。在获得性大疱性表皮松解(epidermolysis bullosa acquisita)中，主要的抗原是胶原VII。在系统性硬化病(systemic sclerosis)中，主要的抗原包括基质金属蛋白质酶1和3、胶原特异性分子伴侣热休克蛋白47、微纤维蛋白-1、和PDGF受体；其它抗原包括Scl-70、U1RNP、Th/To、Ku、Jo1、NAG-2、着丝粒蛋白、拓扑异构酶I、核仁蛋白、RNA聚合酶I、II和III、PM-Slc、纤维蛋白、和B23。在混合性结缔组织病中，主要的抗原是U1snRNP。在斯耶格伦(Sjogren)氏综合征中，主要的抗原是核抗原SS-A和SS-B；其它抗原包括胞衬蛋白、多聚(ADP-核糖)聚合酶和拓扑异构酶。在系统性红斑狼疮中，主要的抗原包括核蛋白，包括SS-A、高迁移率组框1(HMGB1)、核小体、组蛋白蛋白质和双链DNA。在古德帕斯丘综合征(Goodpasture’s syndrome)中，主要的抗原包括肾小球基膜蛋白，包括胶原IV。在风湿性心脏病中，主要的抗原是心脏肌球蛋白。自身免疫性多腺性综合征1型中揭示的其它自身抗原包括芳香族L-氨基酸脱羧酶、组氨酸脱羧酶、半胱氨酸亚磺酸脱羧酶、色氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、苯丙氨酸羟化酶、肝P450细胞色素P4501A2和2A6、SOX-9、SOX-10、钙感测受体蛋白、和1型干扰素干扰素α、β和ω。实施例15对于针对此类蛋白质的耐受性发生给出了详细的指导，并以胰岛素为例描述了具体过程。
在一些情况中，致耐受性抗原是患者已经针对其形成不想要的免疫应答的外来抗原。例子是食物抗原。实施方案包括测试患者以鉴定外来抗原，并创建包含抗原的分子融合物，并治疗患者以形成对抗原或食物的免疫耐受。提供了此类食物和/或抗原的例子。例子来自花生的：伴花生球蛋白(Ara h 1)、变应原II(Ara h 2)、花生凝集素、羽扇豆球蛋白(Ara h 6)；来自苹果的：31kda主要变应原/疾病抗性蛋白同源物(Mal d 2)、脂质转运蛋白前体(Mal d 3)、主要变应原Mal d 1.03D(Mal d 1)；来自乳的：α-乳清蛋白(ALA)、乳转铁蛋白；来自奇异果(kiwi)的：猕猴桃素(actinidin)(Act c1,Act d 1)、植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂(phytocystatin)、奇异果甜蛋白(thaumatin)样蛋白(Act d 2)、kiwellin(Act d 5)；来自芥菜的：2S白蛋白(Sina 1)、11S球蛋白(Sin a 2)、脂质转运蛋白(Sin a 3)、抑制蛋白(Sin a 4)；来自芹菜的：抑制蛋白(Api g 4)、高分子量糖蛋白(Api g 5)；来自虾的：Pena 1变应原(Pen a 1)、变应原Pen m 2(Pen m 2)、原肌球蛋白快速同种型(fast isoform)；来自小麦和/或其它谷物的：高分子量麦谷蛋白、低分子量麦谷蛋白、α和γ-麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白、裸麦醇溶蛋白、燕麦蛋白；来自草莓的：主要草莓变态反应Fra a 1-E(Fra a 1)，来自香蕉：抑制蛋白(Mus xp 1)。
在人和兽医医学中使用的许多蛋白质药物诱导免疫应答，对患者产生风险，而且限制药物的效力。这对于已经工程化改造的人蛋白质、先天性蛋白质生成缺陷的患者中使用的所述人蛋白质、以及非人蛋白质均可能发生。在初始施用前使接受者耐受这些蛋白质药物可能是有利的，并且在初始施用及形成免疫应答后使接受者耐受这些蛋白质药物可能是有利的。在自身免疫患者中，自身免疫形成所针对的自身抗原是已知的。在这些情况中，在形成自身免疫之前使有风险的受试者耐受可能是有利的，并且在初始自身免疫的生物分子指征形成之时或之后使受试者耐受可能是有利的。例如，在1型糖尿病中，在胰腺中β细胞的广泛破坏及葡萄糖稳态的临床病情发作前自身免疫的免疫学指征。在临床病情发作前在检测出这些免疫学指征后使受试者耐受可能是有利的。
由Miller及同事负责的新近工作已经显示了离体共价缀合的抗原与同种异体脾细胞在施用到小鼠静脉内时产生抗原特异性免疫耐受(Godsel,Wang等,2001；Luo,Pothoven等,2008)。该方法涉及收获供体脾抗原呈递细胞，并在胺-羧酸交联反应程序中使它们起化学反应。已经证明该技术可有效对多发性硬化(Godsel,Wang等,2001)、新发作的糖尿病1型(Fife,Guleria等,2006)、和同种异型胰岛移植物(Luo,Pothoven等,2008)的小鼠模型诱导抗原特异性耐受。虽然负责致耐受应答的确切机制是未知的，但有人提出，一个主要的条件涉及在凋亡抗原偶联细胞上不表达共刺激分子的情况下的抗原呈递(Miller,Turley等,2007)。还已经考虑在红细胞影内包囊抗原，离体加工红细胞，并再注射它们，如在WO2011/051346中的。
施用
本文中所列的本发明的许多实施方案描述了可以对人或其它动物患者施用的组合物。本发明的实施方案包括例如识别红细胞或肿瘤或肿瘤血管系统上的抗原的分子融合物、融合蛋白、肽配体、抗体、scFv及其组合。这些组合物可以以药学可接受组合物且与合适的药学可接受担载体或赋形剂一起制备。
结合红细胞的组合物结合红细胞可以是特异性的。此特异性为组合物与红细胞的体内结合，以及作为备选的离体过程提供可能。因而，可以将组合物直接注射入患者的血管系统中。一种备选是注射到组织(例如肌肉)中、皮肤、或皮下，以供随后由红细胞接触和摄取。本发明的一种实施方案是在患者中诱导耐受性发生的方法，其包括：向患者施用与红细胞-结合部分相关联的耐受抗原(tolerizing antigen)，以便在体内使所述抗原附着于红细胞；在体内的附着(attachment)可以在不进行先体外后体内的红细胞加工的情况下进行。这一过程的进行可以不以红细胞将凋亡作为该过程的结果。进行这一过程可以使得红细胞不会(不涉及)暴露于下述的一种或以上：交联试剂；交联红细胞表面分子的交联试剂；包含至少两种交联基团的交联试剂；与红细胞形成共价键的交联试剂；与红细胞形成共价键的功能基团；和与红细胞共价结合的抗原和/或抗原性物质。进行这一过程使得红细胞和/或所述的抗原免于接触1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)(EDC；亦为EDAC或EDCI)，也可能免疫任何与碳二亚胺的反应。这一过程可以通过自身红细胞而无异基因的红细胞参与进行。
可以使用药学可接受担载体或赋形剂来递送如本文中所描述的实施方案。赋形剂指一种作为治疗剂的稀释剂或媒介物使用的惰性物质。药学可接受担载体一般与化合物一起使用，从而使化合物可用于治疗或作为产品。一般地，对于任何物质，药学可接受担载体是与要递送给动物的物质组合的材料。常规的药用载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可以是必需的或期望的。在某些情况中，担载体对于递送而言是必需的，例如用来溶解不溶性化合物以进行液体递送；缓冲液以控制物质的pH从而保持其活性；或稀释剂以防止贮存容器中的物质损失。然而，在其它情况中，担载体是为了方便，例如，用于更方便施用的液体。本文中所描述的化合物的药学可接受盐可以依照本领域技术人员已知的方法合成。因此，药学可接受组合物是高度纯化的，从而不含污染物，是生物相容的且无毒的，而且更适合施用于患者。在水作为担载体的情况中，将水进行高度纯化，并处理成不含污染物，例如内毒素。
通常，本文中所描述的化合物要与根据意图施用形式适当选择且与符合常规药学实践的合适药用稀释剂、赋形剂、增量剂或载体(在本文中称为药学可接受担载体，或担载体)掺混起来施用。如此，可递送的化合物可以制备为以适合于口服、直肠、表面、静脉内注射、动脉内注射、或胃肠外施用的形式。担载体包括固体或液体，并且基于使用的施用类型而选择担载体的类型。可以包括合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、芳香剂、流动诱导剂(flow-inducing agent)、和熔化剂(melting agent)作为担载体，例如用于丸剂。例如，活性组分可以与口服、无毒性、药学可接受的、惰性载体诸如乳糖、明胶、琼脂、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇、山梨糖醇，等等组合。化合物可以以固体剂型，诸如胶囊、片剂、和粉末，或者以液体剂型，诸如酏剂、糖浆剂、和悬浮液口服施用。活性化合物也可以以无菌液体剂型胃肠外施用。也可以使用缓冲剂来实现生物学pH或渗量。
实施例
实施例1：表征结合小鼠红细胞的分子靶物
结果：为了搜索ERY1肽的分子靶物，采用使用生物素化的可溶性肽的亲和力下拉(pull-down)技术；此方法揭示了血型糖蛋白-A(GYPA)为红细胞膜上的ERY1配体。在将完整红细胞与用生物素功能化的ERY1肽和可光活化的交联剂一起温育时，通过链霉亲合素Western印迹检出一个28kDa蛋白质与该肽-生物素复合物缀合。将反应裂解物充分清洗，并使用链霉亲合素磁珠纯化以确保没有残留来自红细胞裂解物的未标记的蛋白质。如预期的，错配肽不能与任何红细胞蛋白质缀合。错配肽PLLTVGMDLWPW(SEQ ID NO:2)设计为含有与ERY1相同的氨基酸残基，并且与其疏水性分布状况一致。相互作用的蛋白质的表观大小的证据提示了几个较小的、单次跨膜蛋白质为可能的配体，即血型糖蛋白。来自交联反应的相同的纯化样品的抗GYPA Western印迹确认候选生物素化的蛋白质是GYPA。
通过高分辨率共焦显微术分析ERY1噬菌体与GYPA的共定位。GYPA是天然表达的，并且作为由几种膜和细胞骨架蛋白构成的复合物的一部分呈现(Mohandas和Gallagher,2008)。这一点在GYPA染色中是直观明显的，在细胞赤道外周看到不一致的标记。用ERY1噬菌体标记产生极其相似的染色分布情况。共定位分析中高达0.97的重叠系数佐证了如下的结论，即ERY1噬菌体和抗GYPA结合相同的蛋白质。在用文库噬菌体标记的红细胞中还见到GYPA群集，但是没有噬菌体结合，因而也没有明显的共定位。
方法：在TGR树脂上使用标准的固相f-moc化学合成ERY1(H2N-WMVLPWLPGTLDGGSGCRG-CONH2)(SEQ ID NO:19)和错配(H2N-PLLTVGMDLWPWGGSGCRG-CONH2)(SEQ ID NO:20)肽。将肽在95％三氟乙酸、2.5％乙二硫醇、2.5％水中自树脂切割下来，并在冰冷的乙醚中沉淀。使用C18反相柱在Waters制备用HPLC-MS上进行纯化。
将ERY1和错配肽与Mts-Atf-生物素(Thermo Scientific)缀合，如由制造商建议的。简言之，将肽在PBS/DMF中溶解，并于4 C与1.05当量的Mts-atf-生物素起反应过夜。在通过离心使反应澄清后，将生物素化的肽于37 C在PBSA-50中与红细胞一起温育1小时，将细胞在新鲜的PBS中清洗两次，并于室温于365nm进行UV照射8分钟。通过超声处理裂解细胞，并使用经链霉亲合素包被的磁珠(Invitrogen)纯化裂解物。将洗脱物在SDS-PAGE上运行，并转移到PVDF膜，并用链霉亲合素-HRP(R&D Systems)或抗小鼠GYPA免疫印迹。
实施例2：表征对人红细胞的结合
结果：为了表征所选择的结合人红细胞的肽，对展示每个肽的细菌用多种细胞类型进行结合测定。七种肽中的六种(ERY19,ERY59,ERY64,ERY123,ERY141和ERY162)与针对人上皮293T细胞和人内皮HUVEC的结合相比特异性结合人红细胞。另外，肽结合人A和B型血，但是不结合小鼠血液，指示这些肽对人血液是特异性的，但是不依赖于普通的血型抗原。使用标准的固相f-moc化学来合成肽，与纳米颗粒缀合，并分析其对各细胞类型的结合，如上文。使用显微术和流式细胞术两者研究对红细胞表面的结合。
实施例3：经由红细胞与缀合有ERY1肽的抗原或缀合有人红细胞结合性肽的抗原的非共价结合诱导抗原特异性免疫学耐受性
为了获得抗原对红细胞的强烈且特异性的生物物理结合，我们使用了一种合成的12个氨基酸的肽(ERY1)，我们通过噬菌体展示发现该肽特异性结合小鼠血型糖蛋白-A(Kontos和Hubbell,2010)。在此调查中，将模型抗原OVA与转基因小鼠品系(OT-I)一起使用，所述转基因小鼠品系(OT-I)的CD8+T细胞群表达对MHC I OVA免疫优势肽SIINFEKL(SEQ ID NO:3)特异性的T细胞受体。将ERY1肽与OVA化学缀合以创建OVA变体(ERY1-OVA)，其以高亲和力和特异性结合小鼠红细胞(图1a)。高分辨率共焦显微术确认了早先关于ERY1结合的观察结果(Kontos和Hubbell,2010)，即定位于细胞膜赤道外周，没有缀合有ERY1的蛋白质的胞内移位。ERY1介导的对血型糖蛋白-A的结合是序列特异性的，因为与错配肽(其含有与ERY1相同的氨基酸，但是在一级序列上是乱序的)缀合的OVA变体(MIS-OVA)展示的结合可以忽略(图1b)。仅与用于缀合肽的交联分子缀合的OVA针对红细胞没有展示任何可测量的亲和力，这确认了ERY1-OVA结合是ERY1肽与红细胞表面上的血型糖蛋白-A之间的非共价相互作用的结果。此外，ERY1-OVA以高亲和力特异性红细胞，展现出6.2±1.3nM的抗体样解离常数(Kd)，如通过平衡结合测量测定的(图1c)。
在小鼠中静脉内施用后确认ERY1-OVA体内对循环红细胞的结合。在注射150μg OVA或ERY1-OVA后30分钟采集的全血样品确认了ERY1-OVA的特异性红细胞结合能力，即使在血液和血管系统的复杂异质环境中。与血型糖蛋白-A结合一致，ERY1-OVA结合红细胞(CD45-)，但不结合白细胞(CD45+)。ERY1-OVA结合就红细胞的凋亡状态而言没有偏好，对膜联蛋白-V+群体和膜联蛋白-V-CD45-群体两者均强烈结合。OVA缀合物的药动学研究证明ERY1-OVA红细胞结合在体内是长久的，展现出17.2小时的细胞表面半衰期。ERY1-OVA在施用后长达72小时仍然结合红细胞；在此时限期间，约13％的红细胞在小鼠中被清除(Khandelwal和Saxena,2006)。在体内定量红细胞结合的ERY1-OVA显示每106个红细胞0.174±0.005ngOVA的相对高负荷。
为了排除OVA加载对红细胞功能的任何潜在生理学影响，在静脉内施用ERY1-OVA或OVA后的不同时间点时表征血液学参数。与施用OVA相比，ERY1-OVA的红细胞结合没有引发血细胞比容、血球体积(corpuscularvolume)、或血细胞血红蛋白含量的可检测差异。这些结果表明血型糖蛋白-A介导的红细胞与抗原的结合没有改变其血液学参数。
为了揭示施用后红细胞结合的抗原的细胞靶物，给小鼠静脉内注射与ERY1(ERY1-别藻蓝蛋白)或MIS肽(MIS-别藻蓝蛋白)缀合的高度荧光别藻蓝蛋白蛋白质。施用后12和36小时对脾DC群体的流式细胞术分析显示与MIS-别藻蓝蛋白相比MHCII+CD11b-CD11c+DC对ERY1-别藻蓝蛋白的摄取增强9.4倍，但MHCII+CD11b+CD11c+DC对ERY1-别藻蓝蛋白和MIS-别藻蓝蛋白的摄取类似。另外，发现MHCII+CD8α+CD11c+CD205+脾DC以比MIS-别藻蓝蛋白大3.0倍的程度摄取ERY1-别藻蓝蛋白，尽管绝对量显著低于脾中的其它DC群。抗原对未活化的和CD8α+CD205+脾DC的此类靶向可能加强红细胞结合的致耐受性潜力，因为这些群体已经广泛牵涉凋亡细胞驱动的致耐受性(Ferguson,Choi等,2011；Yamazaki,Dudziak等,2008)。在肝中，与MIS-别藻蓝蛋白相比，ERY1-别藻蓝蛋白也极大地增强肝细胞(CD45-MHCII-CD1d-；78.4倍)和肝星形细胞(CD45-MHCII+CD1d+；60.6倍)的摄取；已经报告了这两种群体为触发CD8+T细胞删除耐受性的抗原呈递细胞(Holz,Warren等,2010；Ichikawa,Mucida等,2011；Thomson和Knolle,2010)。令人感兴趣的是，在肝DC(CD45+CD11c+)或肝巨噬细胞(CD45+MHCII+F4/80+)(其充当帮助清除红细胞和补体包被的颗粒的网状内皮系统的成员)中没有看到此类摄取。致耐受性脾DC和肝细胞群对红细胞结合的抗原的摄取增加提示了通过非淋巴样肝细胞和经典脾细胞对话驱动的抗原特异性T细胞删除的复杂互连机制的潜在可能。
观察到ERY1-OVA的红细胞结合导致APC对OVA MHC I免疫优势表位(SIINFEKL)(SEQ ID NO:3)的高效交叉呈递和相应的反应性T细胞交叉致敏。将经CFSE标记的OT-I CD8+T细胞(CD45.2+)过继性转移入CD45.1+小鼠中。在静脉内施用10μg OVA、10μg ERY1-OVA、或10μg无关红细胞结合抗原ERY1-谷胱甘肽-S-转移酶(ERY1-GST)后5天期间内对OT-I CD8+T细胞的增殖进行测量。与OVA相比，OT-I CD8+T细胞增殖(如通过流式细胞术测量的，通过稀释fluor CFSE测定)在施用ERY1-OVA的小鼠中明显增强，表明与可溶性抗原相比，红细胞结合提高抗原特异性CD8+T细胞交叉致敏。通过施用低10倍的抗原剂量1μg也获得相似的结果，表明由红细胞结合的抗原诱导的OT-I CD8+T细胞增殖效力的动力学范围宽。关于交叉呈递和交叉致敏的结果与其它关于吞噬来自凋亡细胞的抗原的APC在MHC I上的致耐受性抗原呈递的研究相符(Albert,Pearce等,1998；Green,Ferguson等,2009)。
为了区别扩增成为功能性效应物表型的T细胞与那些被扩增并删除的T细胞，分析了增殖性OT-I CD8+T细胞的膜联蛋白-V作为凋亡且因此作为删除的标志。ERY1-OVA比OVA诱导数目高得多的膜联蛋白-V+增殖OT-ICD8+T细胞(图12d)，提示了最终会导致克隆删除的凋亡命运。通过ERY1-OVA施用诱导的相同的增殖性OT-I CD8+T细胞在1和10μg剂量下都展现出有抗原经历的表型，展示上调的CD44和下调的CD62L。增殖性CD8+T细胞的此表型与其它报告的OT-I过继转移模型相符，其中由APC实现的调节的抗原特异性T细胞受体衔接不能诱导炎性应答(Bursch,Rich等,2009)。
使用一种确立的OT-I攻击-耐受性模型(Liu,Iyoda等,2002)(图2a)，证明了ERY1-OVA即使在使用非常强的细菌衍生的佐剂的情况下亦可阻止随后对疫苗介导的抗原攻击的免疫应答。为了致耐受，我们在将OT-I CD8+(CD45.2+)T细胞过继转移至CD45.1+小鼠后1和6天静脉内施用10μg OVA或ERY1-OVA。再经过9天以容许转移的T细胞的可能的删除后，然后我们用以脂多糖(LPS)为佐剂的OVA通过皮内注射攻击受体小鼠。我们在攻击后第4天时表征引流淋巴结和脾细胞及其炎症应答以确定删除是否实际上发生。
与在用LPS进行抗原攻击前被施用了未修饰的OVA的小鼠(图2c)相比，ERY1-OVA的静脉内施用导致引流淋巴结(图2；图2b中门控)和脾中OT-I CD8+T细胞群的深度降低，这证明删除性耐受。来自经ERY1-OVA处理的小鼠的引流淋巴结含有比经OVA处理的小鼠少超过11倍的OT-ICD8+T细胞，及比没有接受抗原的静脉内注射的攻击对照小鼠少39倍；脾细胞中的应答是相似的。在施用ERY1-OVA的小鼠中展现的这种有效的克隆删除支持了先前关于OT-I CD8+T细胞交叉致敏增强的观察结果，而且显示了交叉致敏在没有共刺激分子的APC呈现的情况下发生，导致删除性耐受。
为了进一步评估抗原攻击后的免疫应答，借助OT-I CD8+T细胞的干扰素-γ(IFNγ)表达来表征驻留的淋巴结和脾细胞的炎性性质(图2d)。在用OVA和LPS攻击后，先前用ERY1-OVA处理的小鼠的淋巴结含有与攻击对照小鼠(先前没有接受抗原)相比少53倍的IFNγ表达细胞，及与先前用等同剂量的OVA处理的小鼠相比少超过19倍的IFNγ表达细胞(图2e)，证明红细胞结合在对攻击的致耐受性保护中的重要性；在脾细胞中的应答是类似的。此外，在先前用ERY1-OVA处理的小鼠的淋巴结和脾中存在的小OT-I CD8+T细胞群中，表达IFNγ的百分比更低，提示了克隆失活(clonalinactivation)。此外，在先前用ERY1-OVA处理的小鼠中，SIINFEKL再刺激后自引流淋巴结分离的细胞生成的总IFNγ水平的大小实质性降低(图2f)，红细胞结合将IFNγ水平降低16倍(与OVA施用相比)和超过115倍(与攻击对照相比)。值得注意的是，抑制性现象也与下调的白介素-10(IL-10)表达相关联，因为来自先前用ERY1-OVA处理的小鼠的淋巴结细胞与先前经OVA处理的小鼠和攻击对照小鼠相比分别表达少38％和50％的IL-10(图2g)。IL-10通常被认为是一种在APC-T细胞通信的背景下由调节性CD4+T细胞表达以抑制Th1应答的细胞因子(Darrah,Hegde等,2010；Lee和Kim,2007)，IL-10表达对于对攻击的脱敏是不必要的。类似地，已经有人提出IL-10下调与CD8+T细胞介导的致耐受性有关(Fife,Guleria等,2006；Arnaboldi,Roth-Walter等,2009；Saint-Lu,Tourdot等,2009)。红细胞结合也实质性减弱针对抗原的体液免疫应答，因为用ERY1-OVA处理的小鼠与用可溶性OVA处理的小鼠相比展现出低100倍的抗原特异性血清IgG效价(图2h)。在非过继转移的C57BL/6(CD45.2+)小鼠中看到由于红细胞结合所致的OVA特异性IgG效价降低的类似降低。相隔7天两次静脉内施用1μg OVA或ERY1-OVA后，经ERY1-OVA处理的小鼠在第一次抗原施用后19天展现出低39.8倍的OVA特异性血清IgG水平(图3)。这种在抗原的红细胞连接后B细胞活化的表观降低佐证了当前关于耐受性诱导期间非炎性抗原呈递的假设(Miller,Turley等,2007；Green,Ferguson等,2009；Mueller,2010)。
为了进一步确证抗原特异性免疫耐受性的诱导，将OT-I攻击-耐受模型与表达OVA的肿瘤移植物模型组合(图2i)。与先前的实验设计相似，通过在过继转移OT-I CD8+T细胞后两次静脉内施用10μg ERY1-OVA或10μgOVA使小鼠耐受。在第一次抗原施用后5天检出明显的T细胞删除，因为经ERY1-OVA注射的小鼠在血液中含有少2.9倍的非增殖(第0代)OT-I CD8+T细胞(图2j)。为了在没有外源施用的强佐剂的情况下测定增殖性OT-I CD8+T细胞的功能响应性，在过继转移后9天将表达OVA的EL-4胸腺瘤细胞(E.G7-OVA)皮内注射入小鼠的背部皮肤中。为了评估结合了红细胞的抗原的致耐受效力，在肿瘤移植后6天用加有LPS佐剂的OVA攻击携带肿瘤的小鼠，所用的剂量和日程表与攻击-耐受模型类似。与经OVA处理的或幼稚的对照小鼠相比，在经ERY1-OVA处理的小鼠中连续观察到稳健的肿瘤生长，直到肿瘤移植后8天(图2k)，确认ERY1-OVA驱动的OT-I CD8+T细胞增殖诱导对OVA的功能性免疫非响应性。肿瘤大小在移植后8天停滞于稳态可能提示尚未经历ERY1-OVA驱动的删除性耐受的OT-I CD8+T细胞的残留。
动物
瑞士兽医当局先前批准了所有动物规程。使用8-12周龄雌性C57BL/6小鼠(Charles River)进行体内结合研究并作为E.G7-OVA肿瘤宿主。将C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb(OT-I)小鼠(Jackson Labs)在EPFL动物房繁殖，并在6-12周龄时使用雌性进行脾细胞分离。使用8-12周龄雌性B6.SJL-PtprcaPepcb/Boy(CD45.1)小鼠(Charles River)作为接受宿主来进行OT-ICD8+T细胞过继转移和耐受性诱导研究。
肽设计和合成
在自动化液相处理器(CHEMSPEED)上使用TGR树脂(Nova Biochem)使用标准的固相f-moc化学合成ERY1(H2N-WMVLPWLPGTLDGGSGCRG-CONH2)(SEQ ID NO:19)和错配(H2N-PLLTVGMDLWPWGGSGCRG-CONH2)(SEQ ID NO:20)肽。加下划线的序列是ERY112聚体序列，我们先前通过噬菌体展示发现其为小鼠血型糖蛋白-A结合物(Kontos和Hubbell,2010)。GGSG区充当与用于缀合的半胱氨酸残基的接头；侧翼精氨酸残基用来降低pKa，从而提高半胱氨酸残基的反应性(Lutolf,Tirelli等,2001)。将肽在95％三氟乙酸、2.5％乙二硫醇、2.5％水中历时3小时自树脂切割下来，并在冰冷的乙醚中沉淀。使用C18反相柱(PerSpective Biosystems)在制备用HPLC-MS(Waters)上进行纯化。
ERY1-抗原缀合
将二甲基酰胺中溶解的10摩尔当量琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC,CAS#64987-85-5,Thermo Scientific)于室温与PBS中的5mg/mL无内毒素(<1EU/mg)OVA(Hyglos GmbH)起反应1小时。在2mLZEBA脱盐旋转柱(Thermo Scientific)上脱盐后，添加3M盐酸胍中溶解的10当量ERY1或MIS肽，并容许于室温反应2小时。使用2mLZEBA脱盐旋转柱使缀合物脱盐，进行0.2μm无菌过滤，分配成工作等份，并于-20C贮存。通过BCA测定法(Thermo Scientific)测定蛋白质浓度。该方案导致肽上的半胱氨酸侧链与抗原上的赖氨酸侧链的缀合。在BL21大肠杆菌中表达谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，并使用标准的谷胱甘肽亲和层析纯化。通过充分的Triton-X114(Sigma Aldrich)清洗来实施柱上内毒素去除，并使用THP-1X Blue细胞(InvivoGen)确认内毒素去除。使用相同反应规程来缀合ERY1与GST。将马来酰亚胺活化的别藻蓝蛋白(Innova Biosciences)在PBS中溶解，并与ERY1或MIS缀合，如上文所描述的。
对红细胞结合的显微术
将5x105个新鲜分离的小鼠红细胞于37 C暴露于含有10mg/mL BSA的PBS中的100nM ERY1-OVA或OVA达1小时。在离心和清洗后，在冰上用1:200稀释的山羊抗小鼠血型糖蛋白-A(Santa Cruz)和兔抗OVA(AbDSEROTEC)标记细胞20分钟。在离心和清洗后，在冰上用1:200ALEXAFLUOR488抗山羊IgG(Invitrogen)和AlexaFluor546抗兔IgG(Invitrogen)标记细胞20分钟。在最终的旋转/清洗循环后，将细胞进行硬固(Hard set)封固，并在具有63x油浸物镜的Zeiss LSM700倒置共焦显微镜上成像。在IMAGEJ(NIH)中进行图像分析，对这两幅图像进行相同加工。
体内结合和生物分布
将100μL体积0.9％盐水(B.Braun)中的150μg ERY1-OVA或OVA在异氟烷麻醉下静脉内注射入8-12周龄雌性C57BL/6小鼠的尾中。注意确保小鼠在实验期间用加热垫保持于37 C。在预定的时间点，在尾部上从小的切口采集5μL血液，以100倍稀释到含10mM EDTA的PBS中，用含10mg/mLBSA的PBS清洗三次，并通过流式细胞术和ELISA分析OVA含量。通过夹心式ELISA定量OVA，其中使用小鼠单克隆抗OVA抗体(Sigma)进行捕捉，多克隆兔抗OVA抗体(AbD SEROTEC)进行检测，山羊抗兔IgG-HRP抗体(BioRad)进行最终的检测，接着是TMB底物(GE Life Sciences)。在ADVIVA 2120血液学系统(Siemens)上实施血液学表征。通过将经标记的细胞与山羊抗GST(GE Healthcare Life Sciences)一起温育，接着与AlexaFluor488驴抗山羊(Invitrogen)一起温育来检测红细胞结合的ERY1-GST，并通过流式细胞术分析。对于生物分布研究，将20μg ERY1-APC或MIS-APC静脉内注射入8-12周龄雌性C57BL/6小鼠的尾静脉中，如上文所描述的。将小鼠于预定的时间点处死，并取出脾、血液和肝。用胶原酶D(Roche)消化每种器官，并均质化以获得单细胞悬浮液以进行流式细胞术染色。
T细胞过继转移
使用CD8磁珠负选择试剂盒(Miltenyi Biotec)按照制造商的用法说明书分离来自OT-I(CD45.2+)小鼠脾的CD8+T细胞。将新鲜分离的CD8+OT-I细胞在PBS中重悬，并于室温用1μM羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE,Invitrogen)标记6分钟，并用等体积的具有10％FBS的IMDM(Gibco)将反应淬灭1分钟。将细胞清洗，计数，并在纯的IMDM中重悬，之后注射。将3x106个经CFSE标记的CD8+OT-I细胞静脉内注射入受体CD45.1+小鼠的尾静脉中。对于短期增殖研究，在过继转移后24小时注射100μL体积中的10μg ERY1-OVA或OVA。在抗原施用后5天收获脾细胞，并染色以通过流式细胞术分析。
OT-I耐受性和攻击模型
将3x105个经CFSE标记的OT-I CD8+T细胞注射入CD45.1+接受小鼠中，如上文所描述的。在过继转移后1和6天，给小鼠对尾静脉静脉内施用100μL盐水中的10μg ERY1-OVA或OVA。过继转移后15天，用25μL中的5μg OVA和25ng超纯大肠杆菌LPS(InvivoGen)对每个后腿足垫皮内攻击小鼠(Hock方法，总剂量10μg OVA和50ng LPS)。在攻击后第4天时处死小鼠，并分离脾和引流淋巴结细胞供再刺激。对于对胞内细胞因子的流式细胞术分析，在存在1mg/mL OVA或1μg/mL SIINFEKL(SEQ ID NO:3)肽(Genscript)的条件下再刺激细胞3小时。添加布雷菲德菌素(Brefeldin)-A(Sigma,5μg/mL)，并继续再刺激3小时，之后染色和流式细胞术分析。对于所分泌因子的ELISA测量，在存在100μg/mL OVA或1μg/mL SIINFEKL(SEQ ID NO:3)肽的条件下将细胞再刺激4天。将细胞旋转，并收集培养基以使用IFNγ和IL-10Ready-Set-Go试剂盒(eBiosciences)按照制造商的用法说明书进行ELISA分析。通过在经OVA包被的板上温育不同稀释的小鼠血液，接着最终与山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)一起温育来检测OVA特异性血清IgG。
OT-I E.G7-OVA耐受模型
如上文所描述的那样将1x106个经CFSE标记的OT-I CD8+T细胞注射入8-12周龄雌性C57BL/6小鼠中。过继转移后1和6天，给小鼠尾静脉静脉内施用100μL盐水中的10μg ERY1-OVA或10μg OVA。在过继转移后5天采集血液以通过流式细胞术表征OT-I CD8+T细胞增殖。按照ATCC指南培养表达OVA的EL-4胸腺瘤细胞(E.G7-OVA,ATCC CRL-2113)。简言之，在补充有10％胎牛血清、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠、0.05mMβ-巯基乙醇、1％嘌呤霉素/链霉素(Invitrogen Gibco)、和0.4mg/mL G418(PAALaboratories)的RPMI 1640培养基中培养细胞。在即将注射前，将细胞在没有G418的培养基中扩增，并在收获后在HBSS(Gibco)中重悬。过继转移后9天，用异氟烷麻醉小鼠，剔去背区的毛，并在肩胛骨间皮内注射1x106个E.G7-OVA细胞。E.G7-OVA移植后4天，用数字测径器每24小时测量肿瘤尺寸，并且肿瘤体积以椭圆体(V＝(π/6)l w h)计算，其中V是肿瘤的体积，l是长度，w是宽度，而h是高度)。过继转移后15天，用25μL中的5μg OVA和25ng超纯大肠杆菌LPS(InvivoGen)在每个前腿足垫处皮内攻击小鼠(总剂量10μg OVA和50ng LPS)。
抗体和流式细胞术
流式细胞术使用下列抗小鼠抗体：CD1d Pacific Blue,CD3εPerCP-Cy5.5,CD8αPE-Cy7,CD11b PE-Cy7,CD11c Pacific Blue,生物素化的CD45,CD45.2Pacific Blue,CD45Pacific Blue,IFNγ-APC,CD8αAPC-eF780,CD44PE-Cy5.5,CD62L PE,CD205PE-Cy7,F4/80PE,I-A/I-E MHCIIFITC(均来自eBioscience)，以及可固定的活/死染料(Invitrogen)、膜联蛋白-V-Cy5标记试剂盒(BioVision)、链霉亲合素Pacific Orange(Invitrogen)、和抗OVA-FITC(Abcam)外。在CyAn ADP流式细胞仪(Beckman Coulter)上分析样品。首先用PBS清洗细胞，在冰上用活/死染料染色20分钟，在冰上用24G2杂交瘤培养基封闭20分钟，在冰上表面染色20分钟，在冰上在2％低聚甲醛中固定20分钟，在0.5％皂苷存在下在冰上胞内染色45分钟，接着进行最终的清洗，之后分析。对于凋亡染色，添加膜联蛋白-V-Cy5，5分钟，然后分析。对于CD45染色，用链霉亲合素Pacific Orange在冰上染色细胞20分钟，清洗，并分析。
应用颗粒
ERY1肽也已经以纳米颗粒形式实现形成耐受，所述纳米颗粒同时与ERY1肽和致耐受性抗原缀合。
为了形成ERY1与聚合物纳米颗粒(其还与肽或蛋白质抗原缀合)的缀合物，可以连续添加化学计量学量的每种组分以控制缀合转化。为了形成与OVA和ERY1或错配肽两者缀合的纳米颗粒，首先将肽在3M盐酸胍水溶液中溶解，并将0.5当量添加至含有硫醇反应性吡啶基二硫化物基团的纳米颗粒。在343nm处进行吸光度测量以监测反应转化，因为反应产生在此波长处具有高吸光度的非反应性嘧啶-2-硫酮种类。室温下2小时后，343nm的吸光度已经稳定，将OVA在3M盐酸胍水溶液中溶解，并以2倍摩尔过量添加至纳米颗粒溶液。室温2小时后，343nm的吸光度已经再一次稳定至较高的数值，并且计算溶液中的肽和OVA两者的浓度。通过在SepharoseCL6B填充柱上的凝胶过滤从未反应的组分纯化双功能性纳米颗粒。借助荧光胺对每个0.5mL级分分析蛋白质和/或肽的存在，并通过动态光散射(DLS)评估纳米颗粒大小。
如果抗原不含有任何游离的硫醇基团来进行该反应，可以通过重组DNA技术引入它们来创建突变体，然后可以重组表达并纯化该突变体。或者，可以使用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)在纳米颗粒和抗原之间进行胺-羧酸交联。
为了形成ERY1与聚合物胶束(其也与肽或蛋白质抗原缀合)的缀合物，可使用与就聚合纳米颗粒所描述的反应类似的反应。可以形成含有对合适的缀合方案而言理想的官能团的胶束。鉴于我们的纳米颗粒和胶束可以合成为含有许多不同化学基团官能化，有许多缀合方案可能性可供创建纳米颗粒/胶束-抗原-ERY1复合物时采用。
实施例4：开发结合小鼠和/或人红细胞的抗体和抗体片段
作为另一种非共价结合红细胞的方法，也可以使用红细胞结合性抗体来诱导抗原特异性免疫学耐受。可以使用现有技术的展示平台，包括但不限于噬菌体展示、酵母和大肠杆菌表面展示，通过筛选抗体文库来分离对红细胞表面蛋白质展示高亲和力的抗体。在发现新的红细胞结合性抗体后，可以如对ERY1肽所实施的那样评估类似的对结合的生物化学表征。为了创建具有改善的结合特征的更高亲和力的突变体，对从初始文库筛选中发现为结合红细胞的抗体片段进行亲和力成熟。使用标准的重组DNA技术，诸如易错PCR和定点诱变，从亲本结合序列创建新的文库。然后，使用如上文所描述的现有技术展示平台展示亲和力成熟文库，以得到与亲本结合序列相比对红细胞具有增强的亲和力的其它抗体片段。
也对结合小鼠红细胞或人红细胞的现有抗体实施亲和力成熟。大鼠单克隆TER-119克隆抗体(Kina等,Br J Haematol,2000)结合小鼠红细胞的位点尚有待完全测定，但是由于其特异性它已通常用于从异质细胞群体中移除红细胞。对TER-119抗体(作为全长抗体或作为抗体片段诸如scFv)实施亲和力成熟，以发现对小鼠红细胞具有更高亲和力的新抗体。小鼠单克隆10F7克隆抗体(Langlois等,J Immunol 1984)在人红细胞细胞表面上结合人血型糖蛋白-A。对10F7抗体(作为全长抗体或作为抗体片段诸如scFv)实施亲和力成熟，以发现对人红细胞具有更高亲和力的新抗体。
为了测定TER-119抗体的一级序列，我们将来自TER-119杂交瘤的抗体特异性分离的cDNA克隆入质粒中，所述质粒容许基因片段的简便测序。使用一组特异性引物以进行容许扩增基因区段的多个可变域的抗体片段PCR扩增过程(Krebber等,1997；Reddy等,2010)。抗体域的DNA序列容许我们确定TER-119IgG抗体的重链和轻链的可变区。为了构建TER-119IgG的scFv型式，我们使用装配PCR(assembly PCR)来创建如下的基因，其构成为：TER-119的可变重链，接着是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)4(SEQ IDNO:18)接头，接着是TER-119的可变轻链。
使用Superscript III第一链合成系统(Invitrogen)对来自TER-119杂交瘤克隆的mRNA实施标准逆转录酶PCR(RT-PCR)以制备该克隆的互补DNA(cDNA)。然后，使用下组引物进行PCR以特异性扩增抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)区的DNA序列：
然后，用限制性内切核酸酶(对于VL为NcoI和NotI，对于VH为NdeI和HindIII)消化扩增出的VH和VL基因，在琼脂糖电泳后使用标准试剂盒(Zymo Research,Orange,CA,USA)纯化基因片段，并连接到克隆质粒pMAZ360中。对含有VH或VL基因的质粒测序，并使用装配PCR构建新基因以创建TER-119scFv序列：
5’-GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAAACTCTCCTGTGTAGCCTCAGGATTCACTTTCAGGGACCACTGGATGAATTGGGTCCGGCAGGCTCCCGGAAAGACCATGGAGTGGATTGGAGATATTAGACCTGATGGCAGTGACACAAACTATGCACCATCTGTGAGGAATAGATTCACAATCTCCAGAGACAATGCCAGGAGCATCCTGTACCTGCAGATGAGCAATATGAGATCTGATTACACAGCCACTTATTACTGTGTTAGAGACTCACCTACCCGGGCTGGGCTTATGGATGCCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACTGTCTCCTCAGCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGACATTCAGATGACGCAGTCTCCTTCAGTCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACTCTCAACTGCAAAGCAAGTCAGAATATTAACAAGTACTTAAACTGGTATCAGCAAAAGCTTGGAGAAGCTCCCAAAGTCCTGATATATAATACAAACAATTTGCAAACGGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACACTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACATATTTCTGCTTTCAGCATTATACTTGGCCCACGTTTGGAGGTGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGTACT-3’(SEQID NO:69),其编码位于翻译蛋白N端的TER-119克隆VH区，接着是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)4(SEQ ID NO:18)接头域，接着是位于翻译蛋白C端的TER-119克隆VL区。用引物SK07和SK08(对VH区特异性)及SK09和SK10(对VL区特异性)扩增TER-119cDNA以构建TER-119scFv基因：
将每个最终完成的scFv基因产物用SfiI和XhoI(NEB,Ipswich,MA,USA)消化，并连接入pSecTagA哺乳动物表达质粒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)上的相同位点中。
为了亲和力成熟结合人血型糖蛋白-A的10F7scFv，自DNA2.0(MenloPark,CA,USA)商业合成并获得该基因，序列如下：
5’-GTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCGGCGCAGGTGAAACTGCAGCAGAGCGGCGCGGAACTGGTGAAACCGGGCGCGAGCGTGAAACTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATACCTTTAACAGCTATTTTATGCATTGGATGAAACAGCGCCCGGTGCAGGGCCTGGAATGGATTGGCATGATTCGCCCGAACGGCGGCACCACCGATTATAACGAAAAATTTAAAAACAAAGCGACCCTGACCGTGGATAAAAGCAGCAACACCGCGTATATGCAGCTGAACAGCCTGACCAGCGGCGATAGCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCTGGGAAGGCAGCTATTATGCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGATATTGAACTGACCCAGAGCCCGGCGATTATGAGCGCGACCCTGGGCGAAAAAGTGACCATGACCTGCCGCGCGAGCAGCAACGTGAAATATATGTATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCGCGAGCCCGAAACTGTGGATTTATTATACCAGCAACCTGGCGAGCGGCGTGCCGGGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTATAGCCTGACCATTAGCAGCGTGGAAGCGGAAGATGCGGCGACCTATTATTGCCAGCAGTTTACCAGCAGCCCGTATACCTTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAAATTAAACGCGCGGCGGCGGCCTCGGGGGCCGAGGGCGGCGGTTCT-3’(SEQ ID NO:74).
对10F7基因实施使用上文对TER-119描述的重组DNA技术的相似亲和力成熟以获得突变体文库，为筛选对人红细胞的增强结合提供条件。
实施例5：经由红细胞与偶联有抗体的抗原的非共价结合诱导抗原特异性免疫学耐受性
可以使用标准的交联反应来缀合抗体与抗原，如本文中实施例3和别处提及的。纯化的抗体-抗原缀合物会对1型糖尿病、多发性硬化、胰岛移植的标准小鼠模型中的抗原，及OVA模型抗原展现出耐受的诱导。
为了证明对OVA的耐受的诱导，可以给小鼠静脉内或血管外施用OVA-抗体缀合物或OVA-纳米颗粒-抗体缀合物。在施用后预定的天数，处死小鼠，并收获淋巴结、脾、和血液以进行分析。将脾细胞和淋巴结衍生的细胞铺板，并用OVA和/或SIINFEKL肽离体再刺激3天，并通过ELISA测量其IFNγ、IL-17a、IL-2、和IL-4表达的下调，以及TGF-β1上调，这些都是确立的耐受证据。在用OVA和/或SIINFEKL肽离体再刺激6小时后对脾细胞和淋巴结衍生的细胞使用流式细胞术实施IFNγ,IL-17a,IL-2和IL-4的胞内染色。此外，使用流式细胞术来表征CD4、CD8、和来自淋巴结的调节T细胞、脾、和血液衍生的细胞的表达谱。另外，在不同时间点从小鼠采集血液样品以测量针对OVA抗原的体液抗体应答。实施离体再刺激的变型实验以确定系统耐受是否已经建立。给小鼠施用OVA-抗体缀合物或OVA-抗体-纳米颗粒缀合物，如上文所描述的，9天后在有佐剂(脂多糖、完全弗氏佐剂、明矾，等等)的条件下再施用OVA，并通过ELISA和/或流式细胞术评估脾细胞对OVA抗原的响应性，如上文所描述的。OVA-抗体缀合物和/或OVA-抗体-纳米颗粒配制剂会使脾细胞对用OVA和佐剂的第二次攻击不响应，这是一种证明系统耐受性的有效建立的方法。在初次施用OVA-抗体缀合物和/或OVA-抗体-纳米颗粒配制剂后，可以用转基因细胞系进行类似的体内攻击实验作为耐受性的进一步证明，诸如用OT-I T细胞的过继转移，这与实施例3中详细描述的研究相似。为了展现治疗性分子在自身免疫或脱免疫的小鼠模型中的免疫耐受，可以对相关抗原生成类似的抗体缀合物，如本文中就OVA所描述的。
实施例6：经由红细胞与单链抗体融合的抗原的非共价结合诱导抗原特异性免疫学耐受
可以使用单链抗体片段(scFv)作为红细胞的非共价结合剂。可以使用现有技术展示平台通过筛选scFv文库分离对红细胞表面蛋白展示高亲和力的scFv。在发现新的红细胞结合抗体片段后，评估类似的对结合的生物化学表征，如用ERY1肽实施的。由于scFv具有一条多肽链，使用标准的重组DNA技术以位点特异性重组方式将其与抗原融合。根据抗原融合配偶的性质，将scFv与抗原的N或C端融合以创建双功能性蛋白质种类。在主要组织相容性复合体(MHC)肽识别序列对于抗原已知的情况下，也将肽插入scFv的接头域中，如此创建新的双功能性抗体/抗原构建体，其含有scFv的天然末端。
为了证明对OVA的耐受诱导，可以给小鼠静脉内或血管外施用OVA-scFv或OVA-纳米颗粒-scFv缀合物。在施用后的预定天数时，处死小鼠，并收获淋巴结、脾、和血液以进行分析。将脾细胞和淋巴结衍生的细胞铺板，用OVA和/或SIINFEKL肽(SEQ ID NO:3)离体再刺激3天，并例如用通过ELISA测量其IFNγ、IL-17a、IL-2、和IL-4表达的下调，以及TGF-β1的上调，这些都是确立的耐受证据。用OVA和/或SIINFEKL肽(SEQ IDNO:3)离体再刺激6小时后，使用流式细胞术对脾细胞和淋巴结衍生的细胞实施IFNγ,IL-17a,IL-2和IL-4的胞内染色。此外，可以使用流式细胞术来表征CD4、CD8、和来自淋巴结的调节T细胞、脾、和血液衍生的细胞的表达谱。另外，在不同时间点从小鼠采集血液样品以测量针对OVA抗原的体液抗体应答。实施离体再刺激的变型实验以确定系统耐受是否已经建立。给小鼠施用OVA-scFv或OVA-纳米颗粒-scFv，如上文所描述的，9天后在有佐剂(脂多糖、完全弗氏佐剂、明矾，等等)的条件下再施用OVA，并通过ELISA和/或流式细胞术评估脾细胞对OVA抗原的响应性，如上文所描述的。OVA-scFv和/或OVA-scFv-纳米颗粒配制剂会使脾细胞对用OVA和佐剂的第二次攻击不响应，由此显示系统耐受的有效建立。在初次施用OVA-scFv和/或OVA-scFv-纳米颗粒配制剂后，可以用转基因细胞系进行类似的体内攻击实验以证明耐受性，诸如用OT-I T细胞的过继转移，这与实施例3中详细描述的研究相似。为了证明治疗性分子在自身免疫或脱免疫的小鼠模型中的免疫耐受性，可以对相关抗原生成类似的scFv融合物，如本文中就OVA所描述的。
使用标准的重组DNA技术创建了抗体构建体，其既结合小鼠红细胞又展示OVA(SGLEQLESIINFEKL)(SEQ ID NO:75)的MHC-I免疫优势表位。使用重叠延伸PCR，我们首先创建了DNA片段，其编码末端3’域(包含SGLEQLESIINFEKL(SEQ ID NO:75)肽)及与TER119序列的3’端互补的重叠5’域。在标准的PCR中使用此DNA片段作为反向引物，以及互补的正向5’引物以创建编码TER119-SGLEQLESIINFEKL(SEQ ID NO:75)的整个DNA片段：
5’-
GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAAACTCTCCTGTGTAGCCTCAGGATTCACTTTCAGGGACCACTGGATGAATTGGGTCCGGCAGGCTCCCGGAAAGACCATGGAGTGGATTGGAGATATTAGACCTGATGGCAGTGACACAAACTATGCACCATCTGTGAGGAATAGATTCACAATCTCCAGAGACAATGCCAGGAGCATCCTGTACCTGCAGATGAGCAATATGAGATCTGATTACACAGCCACTTATTACTGTGTTAGAGACTCACCTACCCGGGCTGGGCTTATGGATGCCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACTGTCTCCTCAGCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGACATTCAGATGACGCAGTCTCCTTCAGTCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACTCTCAACTGCAAAGCAAGTCAGAATATTAACAAGTACTTAAACTGGTATCAGCAAAAGCTTGGAGAAGCTCCCAAAGTCCTGATATATAATACAAACAATTTGCAAACGGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACACTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACATATTTCTGCTTTCAGCATTATACTTGGCCCACGTTTGGAGGTGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGTACTCATCATCACCATCATCACGGTGGCGGTTCTGGCCTGGAGCAGCTGGAG TCTATTATTAATTTCGAAAAACTG-3’(SEQ ID NO:76).加下划线的序列表示编码SGLEQLESIINFEKL的基因区段。将该DNA片段插入哺乳动物和原核表达载体中以重组表达。
使用标准的重组DNA技术来创建既结合小鼠红细胞又展示嗜铬粒蛋白-A模拟表位1040-p31(YVRPLWVRME)(SEQ ID NO:77)的抗体构建体。使用重叠延伸PCR创建了这样的DNA片段，其编码末端3’域，包含YVRPLWVRME(SEQ ID NO:77)肽，及与TER119序列的3’端互补的重叠5’域。在标准PCR中使用此DNA片段作为引物，以及互补的正向5’引物，以创建编码TER119-YVRPLWVRME的整个DNA片段：
5’-
GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAAACTCTCCTGTGTAGCCTCAGGATTCACTTTCAGGGACCACTGGATGAATTGGGTCCGGCAGGCTCCCGGAAAGACCATGGAGTGGATTGGGGATATTAGACCTGATGGCAGTGACACAAACTATGCACCATCTGTGAGGAATAGATTCACAATCTCCAGAGACAATACCAGGAGCATCCTGTACCTGCAGATGGGCAATATGAGATCTGATTACACAGCCACTTATTACTGTGTTAGAGACTCACCTACCCGGGCTGGGCTTATGGATGCCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACTGTCTCCTCAGCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGACATTCAGATGACGCAGTCTCCTTCAGTCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACTCTCAACTGCAAAGCAAGTCAGAATATTAACAAGTACTTAAACCGGTATCAGCAAAAGCTTGGAGAAGCTCCCAAAGTCCTGGTATATAATACAAACAATTTGCAAACGGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGCACAGATTTCACACTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACATATTTCTGCTTTCAGCATTATACTTGGCCCACGTTTGGAGGTGTGACCAAGCTGGAAATCAAACGTACTCATCATCACCATCATCACGGTGGCGGTTATGTCAGACCTCTGTGGGTC AGAATGGAA-3’(SEQ ID NO:78).
加下划线的序列表示编码嗜铬粒蛋白-A(1040-p31)模拟表位(YVRPLWVRME)(SEQ ID NO:77)的基因区段。将该DNA片段插入哺乳动物和原核表达载体中以重组表达。
使用标准的重组DNA技术来创建抗体构建体，其既结合小鼠红细胞又展示小鼠胰岛素原——一种在NOD小鼠中的主要糖尿病自身抗原。使用重叠延伸PCR，我们首先创建了一个DNA片段，其编码末端3’域(包含整个胰岛素原蛋白质)，及与TER119序列的3’端互补的重叠5’域。在标准的PCR中使用此DNA片段作为引物，以及互补的正向5’引物以创建编码TER119-胰岛素原的整个DNA片段：
5’-
GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAAACTCTCCTGTGTAGCCTCAGGATTCACTTTCAGGGACCACTGGATGAATTGGGTCCGGCAGGCTCCCGGAAAGACCATGGAGTGGATTGGAGATATTAGACCTGATGGCAGTGACACAAACTATGCACCATCTGTGAGGAATAGATTCACAATCTCCAGAGACAATGCCAGGAGCATCCTGTACCTGCAGATGAGCAATATGAGATCTGATTACACAGCCACTTATTACTGTGTTAGAGACTCACCTACCCGGGCTGGGCTTATGGATGCCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACTGTCTCCTCAGCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGACATTCAGATGACGCAGTCTCCTTCAGTCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACTCTCAACTGCAAAGCAAGTCAGAATATTAACAAGTACTTAAACTGGTATCAGCAAAAGCTTGGAGAAGCTCCCAAAGTCCTGATATATAATACAAACAATTTGCAAACGGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACACTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACATATTTCTGCTCTCAGCATTATACTTGGCCCACGTTTGATGGTGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGTACTCATCATCACCATCATCACGGTGGCGGTTTTGTGAAACAGCATCTGTGC GGTCCGCATCTGGTGGAAGCGCTGTATCTGGTGTGCGGCGAACGTGG CTTTTTTTATACCCCGAAAAGCCGTCGTGAAGTGGAAGATCCGCAGG TGGAACAGCTGGAACTGGGCGGCAGCCCGGGTGATCTGCAGACCCT GGCCCTGGAAGTGGCGCGTCAGAAACGTGGCATTGTGGATCAGTGC TGCACCAGCATTTGCAGCCTGTATCAGCTGGAAAACTATTACAAC-3’(SEQ ID NO:79).
加下划线的序列表示该构建体的胰岛素原基因区段。将该DNA片段插入哺乳动物和原核表达载体中以重组表达。
实施例7：包含红细胞结合性配体和其它功能的分支聚合物的合成
为了合成8臂PEG-硫代乙酸盐，将8臂PEG-OH(Nektar)在甲苯中溶解，并在氩气下于室温与10当量的三乙胺(Sigma Aldrich,CAS#121-44-8)和10当量的甲磺酰氯(Sigma Aldrich,CAS#124-63-0)反应18小时。滤去残留物，在减压下浓缩滤液，在二甲基甲酰胺(DMF)中溶解，并添加10当量的硫代乙酸钾(Sigma Aldrich,CAS#10387-40-3)。室温18小时后，滤去残留物，在减压下浓缩滤液，并在乙醚中沉淀。将沉淀物过滤，并在减压下干燥以获得最终的产物。
为了合成8臂PEG-吡啶基二硫化物，将8臂PEG-硫代乙酸盐在二甲基甲酰胺(DMF)中溶解，并于室温在氩气下在Schlenk管中用1.05当量的甲醇钠盐(Sigma Aldrich,CAS#124-41-4)脱保护1小时。为了将脱保护的硫醇还原成硫醇盐，将2当量的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP,Thermo Scientific,CAS#51805-45-9)和2当量的蒸馏水添加至溶液。室温2小时后，添加12当量的2,2’-二硫二吡啶(Aldrithiol-2,Sigma Aldrich,CAS#2127-03-9)，并于室温搅拌溶液24小时。然后，将反应混合物在MWCO 3,500Da透析管中对5L蒸馏水透析48小时，期间更换蒸馏水4次。通过在100mM HEPES,pH8.0中的25mM TCEP中还原来定量加载到8臂PEG上的吡啶基二硫化物，并于343nm测量紫外-可见光谱以监测嘧啶-2-硫酮离去基团的存在。
为了合成8臂PEG-吡啶基二硫化物-ALEXAFLUOR647，将8臂PEG-硫代乙酸盐在DMF中溶解，并于室温在氩气下在Schlenk管中用1.05当量的甲醇钠(Sigma Aldrich,CAS#124-41-4)脱保护1小时。为了将脱保护的硫醇还原成硫醇盐，将2当量的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP,Thermo Scientific,CAS#51805-45-9)和等体积的100mM HEPES pH 8.0添加至溶液。于室温在2小时后，将0.125当量(相当于8条中的1条臂)的AlexaFluor647-C2-马来酰亚胺(Invitrogen)添加到溶液。室温2小时后，添加12当量的2,2’-二硫二吡啶(Aldrithiol-2,Sigma Aldrich,CAS#2127-03-9)，并于室温搅拌溶液24小时。然后，将反应混合物在MWCO 3,500Da透析管中对5L蒸馏水透析48小时，期间更换蒸馏水4次。通过在100mM HEPES,pH 8.0中的25mM TCEP中还原来定量加载到8臂PEG上的吡啶基二硫化物，并于343nm测量紫外-可见光谱以监测嘧啶-2-硫酮离去基团的存在。
在室温下，通过将溶于3M盐酸胍(Sigma Aldrich,CAS#50-01-10)水溶液中的化学计量学量的肽添加到8臂PEG-吡啶基二硫化物的水溶液中，来将含有硫醇的肽与8臂PEG-吡啶基二硫化物缀合。通过测量343nm的紫外-可见光谱定量嘧啶-2-硫酮离去基团的存在，来监测反应转化。若要将超过一个分子与8臂PEG-吡啶基二硫化物缀合，则在同一个罐中用该新分子重复反应过程。一旦完成缀合，将反应混合物在ZEBASPIN脱盐柱(ThermoScientific)上脱盐，并将纯化的产物在合适的无菌条件下贮存。
对于8臂PEG-ERY1/MIS-SIINFEKL缀合物(SIINFEKL:SEQ IDNO:3)，可以通过将其静脉内或血管外施用于小鼠来演示针对OVA的耐受的诱导。使用人特异性配体时，此测试还会指示人体中耐受的诱导。在此类演示中，施用后的预定天数，将小鼠处死，并收获淋巴结、脾、和血液以进行分析。将脾细胞和淋巴结衍生的细胞铺板，并用OVA和/或SIINFEKL(SEQ ID NO:3)肽离体再刺激3天，并通过ELISA测量其IFNγ、IL-17a、IL-2、和IL-4表达的下调，以及TGF-β1的上调，这是确立的耐受性证据。在用OVA和/或SIINFEKL(SEQ ID NO:3)肽离体再刺激6小时后对脾细胞和淋巴结衍生的细胞使用流式细胞术实施IFNγ,IL-17a,IL-2和IL-4的胞内染色。此外，使用流式细胞术来表征CD4、CD8、和来自淋巴结的调节T细胞、脾、和血液衍生的细胞的表达谱。另外，在不同时间点时从小鼠采集血液样品以测量针对OVA抗原的体液抗体应答。实施离体再刺激的变型实验以确定系统耐受是否已经建立。给小鼠施用8臂PEG-ERY1/MIS-SIINFEKL缀合物(SIINFEKL:SEQ ID NO:3)，如上文所描述的，9天后在有佐剂(脂多糖、完全弗氏佐剂、明矾，等等)的情况中再施用OVA，并通过ELISA和/或流式细胞术评估脾细胞对OVA抗原的响应性，如上文所描述的。8臂PEG-ERY1/MIS-SIINFEKL缀合物(SIINFEKL:SEQ IDNO:3)配制剂会使脾细胞对用OVA和佐剂的第二次攻击不响应，这是一种证明系统耐受的有效建立的方法。在初次施用8臂PEG-ERY1/MIS-SIINFEKL缀合物配制剂(SIINFEKL:SEQ ID NO:3)后，可以用转基因细胞系进行类似的体内攻击实验以进一步证明耐受性，诸如用OT-I T细胞的过继转移，这与实施例3中详细描述的研究相似。为了证明治疗性分子在自身免疫或脱免疫的小鼠模型中的免疫耐受性，可以对相关抗原生成类似的8臂PEG构建体，如本文就SIINFEKL(SEQ ID NO:3)所描述的。
实施例8：经由红细胞与缀合有适体的抗原的非共价结合诱导抗原特异性免疫学耐受
可以使用其它非抗体生物亲和试剂实施方法，来以测量它们通过非共价红细胞结合诱导免疫学耐受的能力。针对其它基于蛋白质的亲和性模块，诸如设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)(Steiner,Forrer等,2008)、设计的犰狳(armadillo)重复蛋白(Parmeggiani,Pellarin等,2008)、纤连蛋白域(Hackel,Kapila等,2008)、和半胱氨酸-结(knottin)亲和支架(Silverman,Levin等,2009)筛选对红细胞展示结合亲和力者。
使用完善建立的指数富集的配体系统进化(SELEX)方法(Archemix,Cambridge,MA,USA)(Sampson,2003)进行文库筛选以发现对红细胞高亲和力的DNA/RNA适体。在发现以高亲和力结合红细胞的新DNA/RNA序列后，化学合成它们以在其3’或5’端包含额外的化学反应性基团，用于与抗原和/或聚合物胶束/纳米颗粒缀合。例如，化学合成的适体确实含有反应性NH2基团，其经由EDC/NHS缀合化学与纳米颗粒或抗原或纳米颗粒-抗原复合物上存在的COOH基团缀合，以创建由红细胞结合适体和抗原或抗原-纳米颗粒构成的单一生物缀合物。通过对适体、抗原和/或抗原-纳米颗粒两者改变正交反应基团和缀合方案尝试各种化学缀合技术。
为了证明针对OVA的耐受性诱导，给小鼠静脉内或血管外施用OVA-适体或OVA-纳米颗粒-适体缀合物。在施用后的预定天数时，将小鼠处死，并收获淋巴结、脾、和血液以进行分析。将脾细胞和淋巴结衍生的细胞铺板，并用OVA和/或SIINFEKL肽(SEQ ID NO:3)离体再刺激3天，并通过ELISA测量其IFNγ、IL-17a、IL-2、和IL-4表达的下调，以及TGF-β1的上调，这些是确立的耐受证据。在用OVA和/或SIINFEKL(SEQ ID NO:3)肽离体再刺激6小时后对脾细胞和淋巴结衍生的细胞使用流式细胞术实施IFNγ,IL-17a,IL-2和IL-4的胞内染色。此外，使用流式细胞术来表征CD4、CD8、和来自淋巴结的调节T细胞、脾、和血液衍生的细胞的表达谱。另外，在不同时间点从小鼠采集血液样品以测量针对OVA抗原的体液抗体应答。实施离体再刺激的变型实验以确定系统耐受是否已经建立。给小鼠施用OVA-抗体或OVA-抗体-纳米颗粒缀合物，如上文所描述的，9天后在有佐剂(脂多糖、完全弗氏佐剂、明矾，等等)的条件下再施用OVA，并通过ELISA和/或流式细胞术评估脾细胞对OVA抗原的响应性，如上文所描述的。预期OVA-抗体和/或OVA-抗体-纳米颗粒配制剂会使脾细胞对用OVA和佐剂的第二次攻击不响应，由此证明系统耐受性的有效建立。在初次施用OVA-适体和/或OVA-适体-纳米颗粒配制剂后，用转基因细胞系进行类似的体内攻击实验以展示耐受，诸如用OT-I T细胞的过继转移，这与实施例3中详细描述的研究相似。为了证明治疗性分子在自身免疫或脱免疫的小鼠模型中的免疫耐受性，可以对相关抗原生成类似的适体构建体，如本文就OVA所描述的。
实施例9:对人红细胞结合的表征
为了表征在非细胞展示背景下(non-cell displayed context)所选择的、结合人红细胞的细菌展示的肽，通过化学合成所述的肽与荧光别藻蓝蛋白(APC)偶联。以此种方式，在可溶性背景下，即作为蛋白质缀合物，对每种肽的红细胞-结合能力进行表征。如图6中所示的，肽ERY64,ERY123,和ERY141以APC缀合物的形式与人红细胞结合。
APC-肽偶联方法
向PolyPeptide Group(Strasbourg,France)经由标准的fmoc固相肽合成，订制合成肽。溶于3M胍-盐酸的10当量的肽添加到PBS中的2mg/mL顺丁烯二酰亚胺-活化的APC(InnovaBiosciences,Cambridge,UK)。在4 C下温育4小时后，该反应于2mL ZEBA脱盐柱(Thermo Scientific)上脱盐，并于4 C下储存。
通过流式细胞术法对红细胞结合进行定量
新鲜分离的人血100-倍溶解于添加了20mg/mL BSA的PBS中。5x105红细胞添加于150μL的1μM APC-肽缀合物中，于37 C下温育45min。将细胞在PBS+20mg/mL BSA中充分洗涤，并在CyAn ADP流式细胞计数器(Beckman Coulter)上分析APC荧光。
实施例10:通过红细胞-结合单链抗体-融合的抗原诱导抗原-特异性免疫耐受
构建了scFv与OVA的MHC-I优势免疫结构域(SIINFEKL)的重组融合物。图7中通过流式细胞术示出所得的、结合小鼠红细胞的scFv(本申请中称作TER119-SIINFEKL)。
鉴于本申请中已经显示出ERY1-OVA诱导这一耐受性，所以其是表征免疫事件的有用系统。经确定红细胞结合ERY1-OVA导致，通过抗原呈递细胞(APCs)有效交叉呈递OVA免疫显性MHC I表位(SIINFEKL)，以及反应性T细胞的相应的交叉致敏。CFSE-标记的OT-I CD8+T细胞(CD45.2+)被过继转移到CD45.1+小鼠中，静脉内施用10μg of OVA,10μgERY1-OVA，等摩尔剂量的TER119-SIINFEKL，或等摩尔剂量的SIINFEKL之后，测定5天以上OT-I CD8+T细胞的增殖。与施用ERY1-OVA或OVA相比，经由流式细胞术测定的、通过氟CFSE稀释确定的OT-I CD8+T细胞增殖，在施用了TER119-SIINFEKL的小鼠中显著地增强(图8)，这表明与所述的可溶性抗原SIINFEKL相比，红细胞-结合提高了抗原-特异性CD8+T细胞交叉致敏。
为了将已扩展成为功能性效应物表型的T细胞与那些经扩展并清除的T细胞区分开，分析增殖OT-I CD8+T细胞的、作为凋亡标志(hallmark)并因此被清除的膜联蛋白-V，以及衰竭标记程序性死亡-1(PD-1)。与OVA相比，TER119-SIINFEKL和ERY1-OVA诱导了更高数量的膜联蛋白-V+和PD-1+增殖OT-I CD8+T细胞(图9)。
利用已建立的OT-I攻击-至-耐受(challenge-to-tolerance)模型(Liu,Iyoda,et al.,2002)，显示出TER119-SIINFEKL和ERY1-OVA预防后续疫苗-介导的抗原(甚至包含很强的细菌衍生佐剂)攻击的能力。为了耐受的目的，在将OT-I CD8+(CD45.2+)T细胞过继转移到CD45.1+小鼠之后的第1和第6天，静脉内施用10μg的OVA或ERY1-OVA，或是等摩尔剂量的TER119-SIINFEKL。再经过9天允许所述经转移的T细胞潜在缺失(allow potentialdeletion)之后，用以脂多糖为佐剂的OVA皮内注射攻击受体小鼠。攻击后4天对引流淋巴结和脾细胞以及它们的炎症应答进行表征，以确定是否实际地发生了缺失。
与施用了未经修饰的OVA、之后用连同LPS一起的抗原进行攻击的小鼠相比，静脉内施用TER119-SIINFEKL或ERY1-OVA造成，引流淋巴结和脾中的OT-I CD8+T细胞群中的严重下降，这显示缺失耐受(deletionaltolerance)。与OVA-治疗的小鼠相比，来自ERY1-OVA-治疗的小鼠的引流淋巴结包含减少超过11-倍的CD8+T细胞，与没有接受抗原静脉注射的攻击对照小鼠相比减少39-倍；脾细胞中的应答类似。与OVA-治疗的小鼠相比，来自TER119-SIINFEKL-治疗的小鼠的引流淋巴结包含减少超过13-倍的OT-I CD8+T细胞，与没有接受抗原静脉注射的攻击对照小鼠相比减少超过42-倍；脾细胞中的应答类似。这种在施用了TER119-SIINFEKL或ERY1-OVA的小鼠中显示出的有效克隆缺失，支持更早的有关OT-ICD8+T细胞交叉致敏的观察(图8)，而且显示在不存在共-刺激分子APC呈递下出现交叉致敏导致缺失耐受。
为进一步评估抗原攻击后的免疫应答，驻留的(resident)淋巴结和脾细胞的炎症性本质通过OT-I CD8+T细胞表达的干扰素-γ(IFNγ)进行表征(图10)。与攻击对照小鼠(之前没有接受抗原)相比，用OVA和LPS进行攻击后，之前用ERY1-OVA治疗的小鼠的淋巴结包含了减少超过10-倍的IFNγ-表达细胞，与之前用等当量剂量OVA治疗的小鼠相比，具有减少超过4-倍的IFNγ-表达细胞。与攻击对照小鼠(之前没有接受抗原)相比，用OVA和LPS进行攻击后，之前用TER119-SIINFEKL治疗的小鼠的淋巴结包含了减少超过33-倍的IFNγ-表达细胞，与之前用等当量剂量OVA治疗的小鼠相比，具有减少超过14-倍的IFNγ-表达细胞，表明在对攻击的致耐受性保护中，红细胞结合的重要性；在脾细胞中的应答类似。
动物方法
瑞士兽医当局先前批准了所有动物规程。C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb(OT-I)小鼠(Jackson Labs)在EPFL动物机构繁殖，雌性小鼠用于在第6-12周龄进行脾细胞分离。8-12周龄雌性B6.SJL-PtprcaPepcb/Boy(CD45.1)小鼠(Charles River)用作OT-I CD8+T细胞过继转移和耐受诱导研究的受体宿主。
肽设计和合成方法
ERY1(H2N-WMVLPWLPGTLDGGSGCRG-CONH2)肽(SEQ IDNO:128)，以标准的固相f-moc化学利用TGR树脂(Nova Biochem)在自动化的液体处理器(Chemspeed)上合成。加下划线的序列是ERY112-mer序列，其是我们之前通过小鼠血型糖蛋白-A结合物(binder)噬菌体展示发现的(Kontos and Hubbell,2010)。所述的GGSG区域用作半胱氨酸残基的接头，用于缀合；所述侧翼的精氨酸残基有助于较低的pKa并由此提高半胱氨酸残基的反应性(Lutolf,Tirelli,et al.,2001)。在95％三氟乙酸，2.5％乙二硫醇,2.5％水中，3小时的时间，使所述的肽从所述的树脂上裂解下来，在冰冷的乙醚(diethyl ether)中沉淀。利用C18反向柱(PerSpective Biosystems)通过制备型HPLC-MS(Waters)进行纯化。
ERY1-抗原缀合方法
溶于二甲基甲酰胺的10摩尔当量(摩尔当量)的琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC,CAS#64987-85-5,ThermoScientific)与PBS中的5mg/mL无内毒素(<1EU/mg)的OVA(HyglosGmbH)，于室温下反应1小时。在2mL ZEBA脱盐旋转柱(Desalt spincolumn)(Thermo Scientific)上脱盐后，添加溶于3M胍-HCl中的10当量的ERY1肽，于室温下反应2小时。用2mL ZEBA脱盐旋转柱使所述的缀合物脱盐，0.2μm无菌过滤，分散成工作小份(working aliquots),并于-20C下储存。蛋白质浓度经由BCA试验(Thermo Scientific)确定。该方案(scheme)使得所述肽上的半胱氨酸侧链与所述抗原上的赖氨酸侧链缀合。
T细胞过继转移方法
利用CD8磁珠负选择试剂盒(Miltenyi Biotec)，根据制造商的说明从OT-I(CD45.2+)小鼠脾分离CD8+T细胞。将新鲜分离的CD8+OT-I细胞重悬于PBS中，并用1μM羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE,Invitrogen)于室温下标记6分钟，使所述的反应用等体积的IMDM和10％FBS(Gibco)淬火1min。细胞经清洗，计数，并于注射前重悬于纯IMDM中。3x106CFSE-标记的CD8+OT-I细胞静脉内注射于受体CD45.1+小鼠的尾静脉内。出于短期增殖研究的目的，在过继转移后24小时，注射10μg的ERY1-OVA或OVA,或100μL体积中等摩尔剂量的TER119-SIINFEKL。抗原施用后5天收集脾细胞并染色，用于流式细胞术分析。
OT-I耐受和攻击模型方法
如上所述3x105CFSE-标记的OT-I CD8+T细胞注射到CD45.1+受体小鼠中。过继转移后的第1和第6天，向小鼠尾静脉内，静脉内施用100μL盐水的10μg的ERY1-OVA或OVA,或等摩尔剂量的TER119-SIINFEKL。过继转移后的第15天用25μL中的5μg OVA和25ng超纯大肠杆菌LPS(InvivoGen)向每一后腿垫(rear leg pad)皮内攻击小鼠(Hock方法，总剂量10μg OVA和50ng LPS)。攻击后4天处死小鼠，分离出脾和引流淋巴结细胞用于再刺激。对于对胞内细胞因子的流式细胞术分析，在存在1mg/mL OVA或1μg/mL SIINFEKL肽(Genscript)的条件下再刺激细胞3小时。添加布雷菲德菌素(Brefeldin)-A(Sigma,5μg/mL)，并继续再刺激3小时，之后染色和流式细胞术分析。
抗体和流式细胞术方法
流式细胞术使用下列抗小鼠抗体：CD1d Pacific Blue,CD3εPerCP-Cy5.5,CD8αPE-Cy7,CD45.2Pacific Blue,IFNγ-APC,CD8αAPC-eF780(均来自eBioscience)，以及可固定的活/死染料(Invitrogen)、膜联蛋白-V-Cy5标记试剂盒(BioVision)。在CyAn ADP流式细胞仪(Beckman Coulter)上分析样品。首先用PBS清洗细胞，在冰上用活/死染料染色20分钟，在冰上用24G2杂交瘤培养基封闭20分钟，在冰上表面染色20分钟，在冰上在2％低聚甲醛中固定20分钟，在0.5％皂苷存在下在冰上胞内染色45分钟，接着进行最终的清洗，之后分析。对于凋亡染色，添加膜联蛋白-V-Cy5，5分钟，然后分析。
实施例11:通过红细胞结合肽-和-缀合的抗原的融合物分子创建针对治疗性蛋白的抗原-特异性免疫耐受
通过小鼠红细胞-特异性肽ERY1(Kontos and Hubbell,2010)的缀合创建天冬酰胺酶小鼠红细胞-结合变体(ERY1-ASNase)。为了确定红细胞-结合的天冬酰胺酶相对于野生型的天冬酰胺酶的免疫原性，进行了两种方案的评估研究，即暴露于2-剂量和6-剂量ERY缀合物(ERY1-ASNase)或天然形式(天冬酰胺酶MEDAC,Medac GmbH；其也用作ERY1-ASNase缀合物的原始材料)的方案。在每一方案中，每两天静脉内施用15μg的ERY1-ASNase或ASNase，每7天抽取血液。
暴露于治疗剂量后，在多种时间点测定抗体滴度，直至最后一次注射后的21天。结果清楚地表明，红细胞缀合大幅降低了免疫原性，在2-剂量方案和6-剂量方案中没有可观察到的抗体(图11)。相比之下，野生型，天然天冬酰胺酶(目前临床应用的,天冬酰胺酶MEDAC中)即使是在2剂量方案也诱导出了旺盛的免疫性。
为确定是否红细胞-结合天冬酰胺酶诱导了真正的(bona-fide)针对天冬酰胺酶的免疫耐受进行了预防研究。在体液免疫激发(onset)后，用额外的剂量攻击之前施用了野生型临床天冬酰胺酶的小鼠。在再次施用所述蛋白质后抗体水平升高或维持在高水平；这代表针对所述治疗的超敏性和伤害反应的危险临床情况。即使是在用野生型天冬酰胺酶进行6次攻击之后，在先用ERY1-缀合的天冬酰胺酶治疗的小鼠中没有诱导强有力的抗体应答。平均地，用红细胞-结合天冬酰胺酶耐受化的小鼠产生了针对临床野生型天冬酰胺酶大约减少了6000-倍的抗体。
ERY1-ASNase缀合方法
将二甲基酰胺中溶解的10摩尔当量琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC,CAS#64987-85-5,Thermo Scientific)于室温下，与PBS中的5mg/mL天冬酰胺酶Medac起反应2小时。在2mLZEBA脱盐旋转柱(Thermo Scientific)上脱盐后，添加3M盐酸胍中溶解的2.5当量ERY1肽，并容许于室温反应2小时。使用2mLZEBA脱盐旋转柱使缀合物脱盐，进行0.2μm无菌过滤，分配成工作等份，并于-20 C贮存。通过BCA测定法(Thermo Scientific)测定蛋白质浓度。该方案导致肽上的半胱氨酸侧链与抗原上的赖氨酸侧链的缀合。
流式细胞术检测方法
新鲜分离的人血在添加了20mg/mL BSA的PBS中稀释了100-倍。大约500,000红细胞添加到100nM的天冬酰胺酶中，并于37 C温育1小时。洗涤后，细胞与山羊抗-天冬酰胺酶(Abnova)于冰上温育30min。第二轮洗涤后，细胞与ALEXAFLUOR488-缀合的抗-山羊IgG抗体(Invitrogen)于冰上温育20min。最终洗涤后，在流式细胞器上分析以检测红细胞-结合天冬酰胺酶。
天冬酰胺酶施用方法
在无菌的0.9％盐水中制备所需剂量的ERY1-ASNase或ASNase，100μL的所述溶液注射到经麻醉的C57BL/6小鼠的尾静脉。通过颊穿刺或尾切割在预定的时间点抽血。
由血清方法检测抗-天冬酰胺酶抗体
用PBS系列稀释试验组的血清，于室温下在ASNase-包被的ELISA板上温育2小时。HRP-缀合的抗-小鼠IgG(Southern Biotech)用作检测抗体。
实施例12:免疫逆转用于创建免疫反应后的耐受
在临床案例中，当在患者中已经诱导出了针对治疗性蛋白或所关注的蛋白质的免疫性(以存在抗-药物-抗体显示)时，希望能逆转针对所述药物的免疫应答，由此可以进一步施用所述的治疗。再次地，在这一实施例中使用临床可获得的微生物酶，即天冬酰胺酶，以显示小鼠中针对治疗性蛋白的耐受性的诱导，所述的小鼠具有之前存在的、针对天冬酰胺酶的免疫性。通过缀合小鼠红细胞-特异性肽ERY1创建小鼠天冬酰胺酶(ERY1-ASNase)红细胞-结合变体。
为确定红细胞-结合天冬酰胺酶是否能逆转针对临床天冬酰胺酶的免疫性，实施了交叉研究。2天分别对小鼠静脉内施用多个剂量的野生型天冬酰胺酶，施用后21天，在血清中检测到了高水平的抗-天冬酰胺酶抗体。以不同剂量的红细胞-结合天冬酰胺酶方案对经免疫的小鼠进行治疗性处理。在两个剂量方案中，ERY-缀合的天冬酰胺酶使抗体水平降低了大约10-倍，由此逆转了预先存在的体液免疫。
ERY1-ASNase缀合方法
将二甲基酰胺中溶解的10摩尔当量琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC,CAS#64987-85-5,Thermo Scientific)于室温与PBS中的5mg/mL天冬酰胺酶Medac起反应2小时。在2mLZEBA脱盐旋转柱(Thermo Scientific)上脱盐后，添加3M盐酸胍中溶解的2.5当量ERY1肽，并容许于室温反应2小时。使用2mLZEBA脱盐旋转柱使缀合物脱盐，进行0.2μm无菌过滤，分配成工作等份，并于-20 C贮存。通过BCA测定法(Thermo Scientific)测定蛋白质浓度。该方案导致肽上的半胱氨酸侧链与抗原上的赖氨酸侧链的缀合。
结合的流式细胞术检测方法
新鲜分离的人血在添加了20mg/mL BSA的PBS中稀释了100-倍。大约500,000红细胞添加到100nM的天冬酰胺酶中，并于37 C温育1小时。洗涤后，细胞与山羊抗-天冬酰胺酶(Abnova)于冰上温育30min。第二轮洗涤后，细胞与ALEXAFLUOR488-缀合的抗-山羊IgG抗体(Invitrogen)于冰上温育20min。最终洗涤后，在流式细胞器上分析以检测红细胞-结合天冬酰胺酶。
天冬酰胺酶施用方法
在无菌的0.9％盐水中制备所需剂量的ERY1-ASNase或ASNase，100μL的所述溶液注射到经麻醉的C57BL/6小鼠的尾静脉。通过颊穿刺或尾切割在预定的时间点抽血。
由血清方法检测抗-天冬酰胺酶抗体
用PBS系列稀释试验组的血清，于室温下在ASNase-包被的ELISA板上温育2小时。HRP-缀合的抗-小鼠IgG(Southern Biotech)用作检测抗体。
实施例13:结合小鼠和/或人红细胞的抗体或抗体片段的研发
创建了几种红细胞结合抗原构建体。这些构建体包括涉及蛋白质水平的：TER119-SIINFEKL,TER119-ChrA,和TER119-胰岛素原。也包括涉及基因水平的:TER119-SIINFEKL,TER119-ChrA TER119-胰岛素原,TER119-尿酸氧化酶,TER119-InsB9-23,TER119-ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO:80),TER119-H-2kb,TER119-H-2kd,10F7-SIINFEKL,10F7-ChrA,10F7-胰岛素原,和10F7-尿酸氧化酶。
方法
来自TER-119杂交瘤克隆的mRNA由瑞士日内瓦大学的Shozo Izui教授惠赠。标准的逆转录酶PCR(RT-PCR)利用SUPERSCRIPT III FIRSTSTRAND SYNTHESIS SYSTEM(Invitrogen)进行以创建所述克隆的互补DNA(cDNA)。利用下述的引物组实施PCR，以特异性地扩增所述抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)区域的DNA序列：
所扩增的VH和VL基因用限制性内切核酸酶(NcoI和NotI用于VL,NdeI和HindIII用于VH)消化，纯化所述的基因片段，接下来用标准的试剂盒(Zymo Research,Orange,CA,USA)进行琼脂糖凝胶电泳，并将其连接到克隆质粒pMAZ360中。对所述克隆质粒进行测序，以确定TER119的VH和VL基因的DNA序列。
TER119和10F7-抗原DNA构建体由DNA2.0(Menlo Park,CA,USA)设计、商业合成，并获得。
每个最终完成的scFv基因均用SfiI和XhoI(NEB,Ipswich,MA,USA)消化，并连接到pSecTagA哺乳动物表达质粒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)上的相同位点。
实施例14:利用红细胞-结合糖尿病抗原对致糖尿病抗原耐受的诱导
嗜铬粒蛋白-A模拟表位肽(称作1040-p31或ChrA)被工程化以结合小鼠红细胞，其通过将所述的肽与小鼠红细胞-特异性scFv TER119融合获得。所得的scFv,本申请中称作TER119-ChrA，紧密地结合小鼠红细胞(数据未示出)。为了研究针对嗜铬粒蛋白-A抗原变体的T细胞行为，使用包含特异性识别嗜铬粒蛋白-A抗原的T-细胞的NODBDC2.5转基因小鼠。为了确定是否TER119-ChrA以、足以使BDC2.5T细胞致敏的方式被加工，并展示在主要组织相容性-II(MHC-II)复合物上，将所述的抗原添加到BDC2.5脾树突细胞和CD4T细胞共-培养系统中。如图12中所示，TER119-ChrA被有效地加工，并且正确的抗原性结构域被展示在MHC-II上，以在体外致敏转基因BDC2.5CD4T细胞的抗原-特异性增殖，其是体内T细胞耐受所必需的。
为确定体内红细胞结合CD4上自身抗原的增殖结果，利用荧光分子CFSE标记的BDC2.5CD4T细胞进行了类似的增殖研究。在所述经标记的BDC2.5CD4T细胞过继转移到裸NOD小鼠中后，静脉内地施用10μg的TER119-ChrA或等摩尔剂量游离的可溶性1040-p31肽。如图13中所显示的，与用可溶性1040-p31肽治疗的小鼠相比，用TER119-ChrA治疗的小鼠在脾和胰腺淋巴结(pLN)中都驻留大大减少的非-增殖BDC2.5CD4T细胞。这些数据表明红细胞-结合抗原，以功能性区别于可溶性抗原的方式驱动有力的抗原-特异性CD4T细胞信号传导和致敏，与本发明人有关CD8T细胞缺失耐受的详尽研究类似。这种在系统(脾)和局部(胰腺淋巴结)致糖尿的T细胞显著的降低是控制疾病发作的有利结果的正面指示。
实施例15:对胰岛素耐受的诱导
如本申请中已经显示的(例如，参见实施例14),可以创建对各种抗原的耐受。该实施例描述如何创建针对胰岛素的耐受。为了诱导对胰岛素，其是致糖尿的T细胞识别的另一种胰岛抗原，的耐受。通过重组融合至小鼠红细胞-特异性scFv TER119，工程化胰岛素以结合小鼠红细胞。所得的scFv,本申请中称作TER119-胰岛素原,在自然发作T1D的常规小鼠模型，称作NOD/ShiLt小鼠，之中施用。所述NOD/ShiLt小鼠自发地进行免疫细胞介导的、胰岛素-产生胰岛组织的摧毁，由此诱导高血糖和疾病发作。类似地，人胰岛素和人红细胞结合因子可用于在人中创建对胰岛素的耐受。
为了在这个健壮的自发自身免疫小鼠模型中显示耐受,TER119-胰岛素原以不同的时间间隔和剂量被施用于稚(～3周龄)小鼠，以功能性地灭活和/或缺失胰岛素-反应性T细胞。监控被治疗的小鼠的葡萄糖水平以评估高血糖以及疾病的临床发作。TER119-胰岛素原也用于治疗学的模式以诱导疾病的减轻。在此类研究中，TER119-胰岛素原以不同的剂量和时间间隔施用于新-发作的高血糖小鼠，监控葡萄糖水平以评估高血糖的降低并回归体内平衡,由此表明T1D临床发作的免除。
实施例16:利用红细胞-结合MHC分子创建对细胞移植(celluar grafts)和移植物(transplants)的耐受
以实施例的方式提供创建抑移植耐受的过程。通过化学缀合红细胞-结合肽于可溶性MHC结构域，以工程化红细胞-结合MHC分子。供选择地，所述MHC分子可作为与红细胞-特异性scFv的融合物表达。
为了证明通过红细胞结合针对MHC分子的耐受，实施了细胞移植，如肿瘤移植，皮肤移植，胰岛移植和造血细胞移植的小鼠模型。在每一研究中，通过在移植程序之前或之中施用红细胞-结合MHC，宿主小鼠针对供体MHC类别耐受。对于每一项研究利用适合的方法监控移植接纳(Graftacceptance)；即测定肿瘤移植中的肿瘤生长，在皮肤移植中监控组织凋亡或生长，在胰岛移植中监控胰岛质量和血糖，以及表征在造血细胞移植中的嵌合性(chimerism)。
进一步的公开内容
一个实施方案是一种产生免疫耐受的方法，该方法包括施用包含分子融合物的组合物，所述分子融合物包含致耐受性抗原和红细胞结合性模块，该红细胞结合性模块特异性结合所述患者中的红细胞，并且由此连接所述抗原与所述红细胞，其中以对包含所述致耐受性抗原的物质有效产生免疫耐受的量施用所述分子融合物。一个实施方案是所述方法，其中所述分子融合物由与抗原直接共价键合的至少一个红细胞结合性模块构成：例如包含模块和抗原的融合蛋白。一个实施方案是所述方法，其中分子融合物包含至少一个附接于颗粒的红细胞结合性模块，所述颗粒附接于抗原或含有抗原，例如，其中所述颗粒选自下组：微粒、纳米颗粒、脂质体、聚合物囊泡、和胶束。一个实施方案是如下的情况，其中致耐受性抗原包含治疗性蛋白质的一部分，例如，蛋白质包含因子VIII或因子IX。一个实施方案是如下的情况，其中致耐受性抗原包含非人蛋白质的一部分。一个实施方案是如下的情况，其中蛋白质包含腺苷脱氨酶、L-天冬酰胺酶、拉布立酶、抗胸腺细胞球蛋白、L-精氨酸酶、和L-甲硫氨酸酶。一个实施方案是所述方法，其中所述患者是人，而致耐受性抗原包含不存在于自然界中的蛋白质的一部分。一个实施方案是如下的情况，其中患者是人，而致耐受性抗原包含含有非人糖基化的蛋白质的聚糖。一个实施方案是如下的情况，其中致耐受性抗原至少包含人移植抗原的一部分。一个实施方案是如下的情况，其中致耐受性抗原包含人自身免疫性疾病蛋白质的一部分，所述人自身免疫性疾病蛋白质例如选自下组：前胰岛素原、胰岛素原、胰岛素、GAD65、GAD67、IA-2、IA-2β、甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶、促甲状腺激素受体、髓鞘碱性蛋白、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、蛋白脂质蛋白、胶原II、胶原IV、乙酰胆碱受体、基质金属蛋白质1和3、分子伴侣热休克蛋白47、微纤维蛋白-1、PDGF受体α、PDGF受体β、和核蛋白SS-A。一个实施方案是如下的情况，其中致耐受性抗原包含人食物的一部分，所述人食物例如选自下组：伴花生球蛋白(Ara h 1)、变应原II(Ara h2)、花生凝集素(Ara h 6)、α-乳清蛋白(ALA)、乳转铁蛋白、谷蛋白、低分子量谷蛋白、α和γ-麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白、裸麦醇溶蛋白、和燕麦蛋白。一个实施方案是如下的情况，其中红细胞结合性模块选自下组：肽配体、抗体、抗体片段、和单链抗原结合域(ScFv)。一种实施方案是，其中所述的红细胞-结合部分包含来自产生抗红细胞的抗体的杂交瘤的、抗体，抗体片段或ScFv，所述的杂交瘤选自：BRIC 4,BRIC 5,BRIC6,BRIC 10,BRIC 14,BRIC 18,BRIC 39,BRIC 66,BRIC 68,BRIC 69,BRIC87,BRIC 108,BRIC 110,BRIC 111,BRIC 125,BRIC 126,BRIC 128,BRIC145,BRIC 155,BRIC 157,BRIC 163,BRIC 170,BRIC 198,BRIC 203,BRIC216,BRIC 220,BRIC 221,BRIC 222,BRIC 229,BRIC 230,BRIC 231,BRIC235,BRIC 256,BRAC 17,BRAC 18,BGRL 1,BGRL 2,BGRL 11,BGRL 100,BRAD 3,BIRMA D6,BIRMA D10,BIRMA K3,BIRMA K3,84B；6A7；COE；或KZ1。一种实施方案是，其中所述的红细胞-结合部分特异性地结合选自下述的生物分子：Band 3(CD233),水通道蛋白-1,Glut-1,Kidd抗原,RhAg/Rh50(CD241),Rh(CD240),Rh30CE(CD240CE),Rh30D(CD240D),Kx,血型糖蛋白A,血型糖蛋白B(CD235b),血型糖蛋白C(CD235c),血型糖蛋白D(CD235d),Kell(CD238),Duffy/DARCi(CD234),CR1(CD35),DAF(CD55),红细胞糖苷脂,CD44,ICAM-4(CD242),Lu/B-CAM(CD239),XG1/XG2(CD99),EMMPRIN/neurothelin(CD147),JMH,糖基转移酶,Cartwright,Dombrock,C4A/CAB,Scianna,MER2,stomatin,BA-1(CD24),GPIV(CD36),CD108,CD139,和H抗原(CD173)。所述的致耐受性抗原可能包含模拟表位。一个实施方案是如下的情况，其中scFv包含某些或整个10F7，例如，10F7的轻链和/或10F7的重链和/或10F7轻链和/或10F7重链的较高亲和力变体中的一种或多种。一个实施方案是所述方法，其中红细胞结合性模块包含如下的肽配体，所述肽配体包含选自下组的序列的至少5个连续的氨基酸残基：SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:1及它们的保守取代，其中所述序列特异性结合红细胞。
一个实施方案是包含分子融合物的组合物，所述分子融合物包含致耐受性抗原和红细胞结合性模块，该红细胞结合性模块特异性结合所述患者中的红细胞，并且由此连接所述抗原与所述红细胞。一个例子是如下的情况，其中红细胞结合性模块与抗原共价键合。另一个例子是如下的情况，其中分子融合物包含附接于颗粒的红细胞结合性模块，所述颗粒附接于抗原，例如微粒、纳米颗粒、脂质体、聚合物囊泡、或胶束。致耐受性抗原的例子是：治疗性蛋白质的一部分、非人蛋白质的一部分、不天然存在于人的蛋白质的一部分(包括完整部分，即整个)、包含非人糖基化的蛋白质的聚糖、人自身免疫抗原的一部分、人食物的一部分。一个实施方案是组合物，其中红细胞结合性模块选自下组：肽配体、抗体、抗体片段、和单链抗原结合域(ScFv)，例如，整个或部分的10F7。红细胞结合性模块可以包含如下的肽配体，所述肽配体包含选自下组的序列的至少5个连续的氨基酸残基：SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:1及它们的保守取代，其中所述序列特异性结合红细胞。红细胞结合性模块可以是包含肽配体的，所述肽配体具有约10μM-0.1nM的解离常数，如通过所述肽和红细胞之间的平衡结合测量所测定的。一种实施方案是，其中所述的红细胞-结合部分包含来自产生抗红细胞的抗体的杂交瘤的、抗体，抗体片段或ScFv，所述的杂交瘤选自：BRIC 4,BRIC 5,BRIC 6,BRIC 10,BRIC 14,BRIC 18,BRIC 39,BRIC 66,BRIC 68,BRIC 69,BRIC 87,BRIC 108,BRIC 110,BRIC 111,BRIC 125,BRIC 126,BRIC 128,BRIC 145,BRIC 155,BRIC 157,BRIC 163,BRIC 170,BRIC 198,BRIC 203,BRIC 216,BRIC 220,BRIC 221,BRIC 222,BRIC 229,BRIC 230,BRIC 231,BRIC 235,BRIC 256,BRAC 17,BRAC 18,BGRL 1,BGRL 2,BGRL 11,BGRL 100,BRAD 3,BIRMA D6,BIRMA D10,BIRMA K3,BIRMA K3,84B；6A7；COE；或KZ1。一种实施方案是，其中所述的红细胞-结合部分特异性地结合选自下述的生物分子：Band 3(CD233),水通道蛋白-1,Glut-1,Kidd抗原,RhAg/Rh50(CD241),Rh(CD240),Rh30CE(CD240CE),Rh30D(CD240D),Kx,血型糖蛋白A,血型糖蛋白B(CD235b),血型糖蛋白C(CD235c),血型糖蛋白D(CD235d),Kell(CD238),Duffy/DARCi(CD234),CR1(CD35),DAF(CD55),红细胞糖苷脂,CD44,ICAM-4(CD242),Lu/B-CAM(CD239),XG1/XG2(CD99),EMMPRIN/neurothelin(CD147),JMH,糖基转移酶,Cartwright,Dombrock,C4A/CAB,Scianna,MER2,stomatin,BA-1(CD24),GPIV(CD36),CD108,CD139,和H抗原(CD173).所述的致耐受性抗原可能包含模拟表位。
所述的致耐受性组合物可用于治疗病理性状况，例如选自下述的病理性状况：移植排斥,自身免疫疾病，食物过敏，和抗治疗剂免疫反应。
一种实施方案是药学上可接受的组合物，用于针对某种物质的免疫应答的免疫逆转，所述的组合物包含融合物分子，所述融合物分子包含红细胞-结合部分和所述物质的抗原。所述的组合物可能具有，例如选自下述的致耐受性抗原：蛋白质，蛋白质的部分，人蛋白质或其部分，非人蛋白质或其部分，聚糖，含非人糖基化的蛋白质的聚糖，人自身免疫抗原,用于人的治疗性蛋白或其部分，以及人食物的一部分。所述的组合物可能具有，例如选自下述的致耐受性抗原：由于遗传疾病缺损的蛋白质，具有非人糖基化的蛋白质，非人蛋白质，非天然存在于人中的合成蛋白质，人食物抗原，人移植抗原，和人自身免疫抗原。所述的红细胞-结合部分可能特异性地结合选自下述的生物分子：Band 3(CD233),水通道蛋白-1,Glut-1,Kidd抗原,RhAg/Rh50(CD241),Rh(CD240),Rh30CE(CD240CE),Rh30D(CD240D),Kx,血型糖蛋白A,血型糖蛋白B(CD235b),血型糖蛋白C(CD235c),血型糖蛋白D(CD235d),Kell(CD238),Duffy/DARCi(CD234),CR1(CD35),DAF(CD55),红细胞糖苷脂,CD44,ICAM-4(CD242),Lu/B-CAM(CD239),XG1/XG2(CD99),EMMPRIN/neurothelin(CD147),JMH,糖基转移酶,Cartwright,Dombrock,C4A/CAB,Scianna,MER2,stomatin,BA-1(CD24),GPIV(CD36),CD108,CD139,和H抗原(CD173)。所述的红细胞-结合部分可能选自：肽配体,抗体，抗体片段，和单链抗原结合结构域(ScFv)。可以制备所述的红细胞-结合部分使其包含来自产生抗红细胞的抗体的杂交瘤的、抗体，抗体片段或ScFv，所述的杂交瘤选自：BRIC 4,BRIC 5,BRIC 6,BRIC 10,BRIC 14,BRIC 18,BRIC 39,BRIC 66,BRIC 68,BRIC 69,BRIC 87,BRIC 108,BRIC 110,BRIC 111,BRIC 125,BRIC 126,BRIC 128,BRIC 145,BRIC 155,BRIC 157,BRIC 163,BRIC 170,BRIC 198,BRIC 203,BRIC 216,BRIC 220,BRIC 221,BRIC 222,BRIC 229,BRIC 230,BRIC 231,BRIC 235,BRIC 256,BRAC 17,BRAC 18,BGRL 1,BGRL 2,BGRL 11,BGRL 100,BRAD 3,BIRMA D6,BIRMA D10,BIRMA K3,BIRMA K3,84B；6A7；COE；或KZ1。
具体的实施方案包括融合物分子，所述融合物分子包含红细胞-结合部分和天冬酰胺酶的抗原。由多种红细胞-结合部分的公开内容显然可见，对于同一目的所述的红细胞-结合部分有许多选择，包括：结合人红细胞的scFv或选自下述的肽结合配体：SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,及其组成型取代，其中，所述的序列特异性结合红细胞。包含所述融合物分子的此类组合物可用于诱导对天冬酰胺酶的耐受。
具体的实施方案包括融合物分子，所述融合物分子包含红细胞-结合部分和嗜铬粒蛋白-A的抗原。所述的抗原可以是模拟表位或一些或全部嗜铬粒蛋白-A。由多种红细胞-结合部分的公开内容显然可见，对于同一目的所述的红细胞-结合部分有许多选择，包括：结合人红细胞的scFv或选自下述的肽结合配体：SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,及其组成型取代，其中，所述的序列特异性结合红细胞。包含所述融合物分子的此类组合物可用于诱导对嗜铬粒蛋白-A的耐受和/或预防糖尿病或减弱糖尿病发展进程。
另一个例子是包含与实体连接的红细胞结合性模块的组合物，所述红细胞结合性模块特异性结合红细胞，所述实体选自下组：合成聚合物、分支的合成聚合物、和颗粒。例如，颗粒可以是微粒、纳米颗粒、脂质体、聚合物囊泡、和胶束。组合物可以进一步包含致耐受性抗原、治疗剂、或肿瘤归巢性配体。
一个实施方案是单链抗原结合域(scFv)，其包含特异性结合红细胞的肽配体。肽可以附接于scFv或布置在接头部分中。可以包含一个或多个肽配体。
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出于所有目的，本文中提及的所有专利申请、专利、和出版物在此通过提及并入本文；在冲突的情况中，以本说明书为准。
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Claims (39)

1.药学上可接受的组合物，其包含：
分子融合物，所述的分子融合物包含致耐受性抗原和与患者中的红细胞特异性结合的红细胞-结合部分(moiety)
其中，所述的红细胞-结合部分与选自下述的生物分子特异性结合：Band 3(CD233),水通道蛋白-1,Glut-1,Kidd抗原,RhAg/Rh50(CD241),Rh(CD240),Rh30CE(CD240CE),Rh30D(CD240D),Kx,血型糖蛋白B(CD235b),血型糖蛋白C(CD235c),血型糖蛋白D(CD235d),Kell(CD238),Duffy/DARCi(CD234),CR1(CD35),DAF(CD55),红细胞糖苷脂,CD44,ICAM-4(CD242),Lu/B-CAM(CD239),XG1/XG2(CD99),EMMPRIN/neurothelin(CD147),JMH,糖基转移酶,Cartwright,Dombrock,C4A/CAB,Scianna,MER2,stomatin,BA-1(CD24),GPIV(CD36),CD108,CD139,和H抗原(CD173)。
2.权利要求1的组合物，其中，所述的红细胞-结合部分共价结合于所述抗原。
3.权利要求1或2的组合物，其中，所述的红细胞-结合部分选自：肽配体,抗体，抗体片段，和单链抗原结合结构域(ScFv)。
4.权利要求1-3中任一项的组合物，其中，所述的红细胞-结合部分包含来自产生抗红细胞抗体的杂交瘤的、抗体，抗体片段或ScFv，所述的杂交瘤选自：BRIC 4,BRIC 5,BRIC 6,BRIC 10,BRIC 14,BRIC 18,BRIC 39,BRIC 66,BRIC 68,BRIC 69,BRIC 87,BRIC 108,BRIC 110,BRIC 111,BRIC 125,BRIC 126,BRIC 128,BRIC 145,BRIC 155,BRIC 157,BRIC 163,BRIC 170,BRIC 198,BRIC 203,BRIC 216,BRIC 220,BRIC 221,BRIC 222,BRIC 229,BRIC 230,BRIC 231,BRIC 235,BRIC 256,BRAC 17,BRAC 18,BGRL 1,BGRL 2,BGRL 11,BGRL 100,BRAD 3,BIRMA D6,BIRMA D10,BIRMA K3,BIRMA K3,BIRMA 84B；6A7；COE；和KZ1。
5.权利要求1-4中任一项的组合物，其中，所述的致耐受性抗原包含蛋白质的模拟表位。
6.权利要求1-5中任一项的组合物，其中，所述的致耐受性抗原选自：蛋白质，蛋白质的部分，人蛋白质或其部分，非人蛋白质或其部分，聚糖，含非人糖基化的蛋白质的聚糖，人自身免疫抗原，用于人的治疗性蛋白或其部分，以及人食物的一部分。
7.权利要求1-5中任一项的组合物，其中，所述的致耐受性抗原选自：由于遗传疾病缺损的蛋白质，具有非人糖基化的蛋白质，非人蛋白质，非天然存在于人中的合成蛋白质，人食物抗原，人移植抗原，和人自身免疫抗原。
8.权利要求1-5中任一项的组合物，其中，所述的致耐受性抗原包含选自下述的抗原：因子VIII,因子IX，腺苷脱氨酶,L-天冬酰胺酶,拉布立酶(rasburicase),抗胸腺细胞球蛋白,L-精氨酸酶,L-甲硫氨酸酶,前胰岛素原,胰岛素原,胰岛素,GAD65,GAD67,IA-2,IA-2β,甲状腺球蛋白,甲状腺过氧化物酶,促甲状腺素受体,髓壳碱性蛋白,髓壳少突胶质糖蛋白,蛋白脂质蛋白,胶原II,胶原IV,乙酰胆碱受体,基质金属蛋白1和3,分子伴侣热激蛋白47,肌原纤蛋白-1,PDGF受体α,PDGF受体β,核内蛋白SS-A,伴花生球蛋白(Ara h 1),变应原II(Ara h 2),花生凝集素(Ara h 6),α-乳清蛋白(ALA),乳运铁蛋白,谷蛋白(glutein),低分子量谷蛋白,α-麦醇溶蛋白,γ-麦醇溶蛋白,大麦醇溶蛋白,裸麦醇溶蛋白，和燕麦蛋白。
9.权利要求8的组合物，其中，所述的抗原是模拟表位。
10.权利要求1-9中任一项的组合物用于治疗选自下述的病理状态(pathologic condition)：移植排斥,自身免疫疾病，食物过敏，和抗治疗剂免疫反应。
11.分子融合物，其包含致耐受性抗原和红细胞-结合部分，所述红细胞-结合部分选自：Band 3(CD233),血型糖蛋白B(CD235b),血型糖蛋白C(CD235c)和血型糖蛋白D(CD235d)。
12.权利要求11的分子融合物用于产生免疫耐受性。
13.分子融合物，其包含选自下述的致耐受性抗原：蛋白质，蛋白质的部分，人蛋白质或其部分，非人蛋白质或其部分，聚糖，含非人糖基化的蛋白质的聚糖，人自身免疫抗原,用于人的治疗性蛋白或其部分，以及人食物的一部分，由于遗传疾病缺损的蛋白质，具有非人糖基化的蛋白质，非人蛋白质，非天然存在于人中的合成蛋白质，人食物抗原，人移植抗原，和人自身免疫抗原；以及选自下述的红细胞-结合部分：Band 3(CD233),血型糖蛋白B(CD235b),血型糖蛋白C(CD235c),血型糖蛋白D(CD235d)。
14.产生免疫耐受性的方法，所述方法包括施用包含下述分子融合物的组合物，所述的分子融合物包含致耐受性抗原和与患者中的红细胞特异性结合的红细胞-结合部分(moiety)，其中，所述的分子融合物以用于产生针对某种物质的免疫耐受性的有效量施用，所述物质包含上述的致耐受性抗原。
15.药学上可接受的组合物用于针对包含下述融合物分子的物质的免疫应答的免疫逆转(immunoreversal)，所述的融合物分子包含红细胞-结合部分和所述物质的抗原。
16.权利要求15的组合物，其中，所述的致耐受性抗原选自：蛋白质，蛋白质的部分，人蛋白质或其部分，非人蛋白质或其部分，聚糖，含非人糖基化的蛋白质的聚糖，人自身免疫抗原,用于人的治疗性蛋白或其部分，以及人食物的一部分。
17.权利要求15的组合物，其中，所述的致耐受性抗原选自：由于遗传疾病缺损的蛋白质，具有非人糖基化的蛋白质，非人蛋白质，非天然存在于人中的合成蛋白质，人食物抗原，人移植抗原，和人自身免疫抗原。
18.权利要求15-17任一项的组合物，其中，所述的红细胞-结合部分特异性结合选自下述的生物分子：Band 3(CD233),水通道蛋白-1,Glut-1,Kidd抗原,RhAg/Rh50(CD241),Rh(CD240),Rh30CE(CD240CE),Rh30D(CD240D),Kx,血型糖蛋白A,血型糖蛋白B(CD235b),血型糖蛋白C(CD235c),血型糖蛋白D(CD235d),Kell(CD238),Duffy/DARCi(CD234),CR1(CD35),DAF(CD55),红细胞糖苷脂,CD44,ICAM-4(CD242),Lu/B-CAM(CD239),XG1/XG2(CD99),EMMPRIN/neurothelin(CD147),JMH,糖基转移酶,Cartwright,Dombrock,C4A/CAB,Scianna,MER2,stomatin,BA-1(CD24),GPIV(CD36),CD108,CD139,和H抗原(CD173)。
19.权利要求15-17任一项的组合物，其中，所述的红细胞-结合部分选自：肽配体，抗体，抗体片段，和单链抗原结合结构域(ScFv)。
20.权利要求15-17任一项的组合物，其中，所述的红细胞-结合部分包含来自产生抗红细胞的抗体的杂交瘤的、抗体，抗体片段或ScFv，所述的杂交瘤选自：BRIC 4,BRIC 5,BRIC 6,BRIC 10,BRIC 14,BRIC 18,BRIC39,BRIC 66,BRIC 68,BRIC 69,BRIC 87,BRIC 108,BRIC 110,BRIC 111,BRIC 125,BRIC 126,BRIC 128,BRIC 145,BRIC 155,BRIC 157,BRIC 163,BRIC 170,BRIC 198,BRIC 203,BRIC 216,BRIC 220,BRIC 221,BRIC 222,BRIC 229,BRIC 230,BRIC 231,BRIC 235,BRIC 256,BRAC 17,BRAC 18,BGRL 1,BGRL 2,BGRL 11,BGRL 100,BRAD 3,BIRMA D6,BIRMA D10,BIRMA K3,BIRMA K3,BIRMA 84B；6A7；COE；和KZ1。
21.权利要求15-20任一项的组合物，其中，所述的致耐受性抗原包含蛋白质的模拟表位。
22.融合物分子，其包含红细胞-结合部分和天冬酰胺酶的抗原。
23.权利要求22的融合物分子，其中，所述的红细胞-结合部分包含与人红细胞结合的scFv或选自下述的肽结合配体：SEQ ID NO:11,SEQ IDNO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQID NO:17,及其组成型取代，其中，所述的序列特异性结合红细胞。
24.包含权利要求22或23的融合物分子的组合物用于诱导对天冬酰胺酶的耐受性。
25.融合物分子，其包含红细胞-结合部分和嗜铬粒蛋白-A的抗原。
26.权利要求25的融合物分子，其中，所述的红细胞-结合部分包含与人红细胞结合的scFv或选自下述的肽结合配体：SEQ ID NO:11,SEQ IDNO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQID NO:17,及其组成型取代，其中，所述的序列特异性结合红细胞。
27.包含权利要求25或26的融合物分子的组合物A用于诱导对嗜铬粒蛋白-A的耐受性。
28.药学上可接受的组合物，其包含：
红细胞-结合部分，所述红细胞-结合部分与特异性地结合某靶物的结构域相连。
29.权利要求28的组合物，其中，所述的靶物包含蛋白质，所述蛋白质还包含致耐受性抗原。
30.权利要求28或29的组合物，其中，所述的红细胞-结合部分包含肽配体。
31.权利要求28或29的组合物，其中，所述的红细胞-结合部分选自：抗体，抗体片段，和单链抗原结合结构域(ScFv)。
32.权利要求28-31任一项的组合物，其中，所述的结构域选自：抗体，抗体片段，和单链抗原结合结构域(ScFv)。
33.权利要求28-32任一项的组合物，其中，所述的组合物包含选自分子融合物，串连scFv，双抗体和串连scFv-IgG分子的成员，红细胞-结合部分和所述结构域是上述成员的一部分。
34.药学上可接受的组合物，其包含：与抗原相连的红细胞-结合部分。
35.权利要求34的组合物，其中，所述的抗原是天然自身抗原。
36.权利要求34或35的组合物，其中，所述的自身抗原选自：红斑狼疮抗原。
37.权利要求34-36任一项的组合物，其中，所述的抗原属于治疗性蛋白质。
38.权利要求37的组合物，其中，所述的抗原是因子VIII抗原。
39.权利要求34-37任一项的组合物在从循环中去除非所需要的抗体中的用途。
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