KR20150010699A - 적혈구 결합요법 - Google Patents

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제프레 아 우벨
스테판느 콘또스
카렝 이그렉 다느
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에꼴 뽈리떼끄닉 뻬데랄 드 로잔느 (으뻬에프엘)
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Abstract

적혈구에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 대해 기재한다. 이들은 적혈구에 특이적으로 결합하는 서열을 갖는 펩타이드계 리간드로서, 또는 적혈구에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편으로서 제공된다. 펩타이드는 치료약, 관용 항원 또는 표적화 펩타이드와의 분자 융합체로서 제조될 수 있다. 면역 관용은 관용화가 바람직한 물질 상에 항원의 선택 및 융합체의 사용에 의해 형성될 수 있다.

Description

적혈구 결합요법 {ERYTHROCYTE-BINDING THERAPEUTICS}
본 출원은, 본 출원에 인용에 의해 통합되는, 2012년 2월 15일 출원 미국 특허 출원 제13/397,202호의 우선권을 주장한다.
본 기술 분야는 적혈구에 결합하는 리간드 또는 항체의 의료용 조성물 및 용도에 관한 것이다. 구체적인 용도에는 면역 관용화, 약물 전달 및 암치료가 포함된다.
이식 조직의 거부반응과 자가면역질환은 외래 생체분자의 항원 성질에 의해 야기되는 면역거부반응을 포함하는 병리학적 상태이다. 많은 약물과 임상 프로세스는 면역거부반응을 억제 또는 치료하는 것과 관련된다. 백신은 항원을 운반하는 다른 생체분자 또는 단백질에 대해 면역계 반응을 형성하기 위해 병원성 생체분자의 항원에 대한 면역 반응을 자극함으로써 이 프로세스를 이용한다.
면역 관용 유도(Tolerogenesis)는 물질에 대해 면역학적 관용을 형성하는 방법이다. 물질에 대해 관용을 형성하도록 처치된 사람이나 사람이 아닌 환자는 그 물질에 대해 저하된 적응 면역 반응을 가지게 된다. 적응 면역 반응의 저하는 그 물질에 반응하는 혈중 항체의 양에 대한 분석 또는 그 물질 및 관용화제(tolerizing agent)에 대한 T세포 반응을 분석함으로써 측정될 수 있다. 관용화를 위한 조성물과 방법이 본 명세서에 기재되어 있다. 많은 구현예는 적혈구 결합 부분과 조합된 관용화 항원(tolerizing antigen)을 가진 융합 분자를 투여하는 것을 포함한다. 융합 분자는 적혈구와 결합하여, 관용(tolerance)을 형성하는 방식으로 면역계에 관용화 항원을 제공하는 프로세스를 시작한다.
적혈구(erythrocyte)(red blood cell 이라고도 불린다)에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 발견되어 왔다. 그러한 펩타이드 리간드는 혈액 중에 존재하는 다른 인자의 존재 하에서도 적혈구에 특이적으로 결합 하는 적혈구-결합 부분 (erythrocyte-binding moieties) 이다. 이러한 리간드는 다양한 용도에 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예는 관용 유도 항원과 환자의 적혈구에 특이적으로 결합하는 적혈구-결합 부분(erythrocyte-binding moiety)을 포함하고 있는 분자 융합체를 포함하는 약학적으로 허용되는 조성물이다. 상기 적혈구-결합 부분은, Band 3 (CD233), 아쿠아포린-1, Glut-1, 키드(Kidd) 항원, RhAg/Rh50 (CD241), Rh (CD240), Rh30CE (CD240CE), Rh30D (CD240D), Kx, 글리코포린 B (CD235b), 글리코포린 C (CD235c), 글리코포린 D (CD235d), Kell (CD238), Duffy/DARCi (CD234), CR1 (CD35), DAF (CD55), 글로보시드, CD44, ICAM-4 (CD242), Lu/B-CAM (CD239), XG1/XG2 (CD99), EMMPRIN/뉴로텔린(neurothelin) (CD147), JMH, 글리코실전달효소, 카트라이트(Cartwright), 돔브록(Dombrock), C4A/CAB, 시안나(Scianna), MER2, 스토마틴, BA-1 (CD24), GPIV (CD36), CD108, CD139, 및 H 항원(CD173)으로 이루어진 군에서 선택되는 생체 분자에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 일구현예는 관용 유도 항원을 포함하는 단백질과 같은 표적에 특이적으로 결합하는 도메인과 결합한 적혈구-결합 부분을 포함하는 약학적으로 허용되는 조성물이다. 상기 도메인의 하나 또는 둘은 펩타이드성 리간드이거나 항체 또는 항체 단편일 수 있다.
다른 구현예는 항체 결핍 또는 환자의 혈중에서 항체를 제거하는 것에 사용되는 약학적으로 허용가능한 조성물이다. 조성물은, 예를 들어 고유 자기항원 (native auto-antigen) 또는 치료 단백질에 대한 항원과 같은 항원과 결합된 적혈구-결합 부분을 가진다.
도 1은 ERY1과 난백알부민(OVA)의 분자 융합체 실험 계획 및 결과로서. ERY1-OVA 융합체가 고친화성으로 마우스 적혈구의 적도 주변에 결합하는 것을 보여준다. 패널 (a)는 난백알부민(OVA)에의 ERY1 펩타이드의 콘쥬게이션이 적혈구 표면 글리코포린 A에 결합하는 것을 보여주는 모식도이다. 패널 (b)는 유세포 분석기(flow cytometry)에 의해 특징지어지는, 각 OVA 콘주게이트 및 중간체의 결합; 검은색 히스토그램은 ERY1-OVA; 흰색 히스토그램은 SMCC-OVA; 점선 히스토그램은 MIS-OVA; ERY1=적혈구 결합 펩타이드 WMVLPWLPGTLD(서열번호 1), MIS=미스매치 펩타이드 PLLTVGMDLWPW(서열번호 2), SMCC=설포숙신이미딜-4-(N-말레이미드메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트(sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate)로서 ERY1을 OVA에 콘쥬게이트하는데 사용한 것이다. 패널 (c)는 유세포 분석기(flow cytometry)에 의해 측정된, RY1-OVA의 낮은 해리 상수(R2=0.97, 단일 부위 결합)를 보여주는 ERY1-OVA의 적혈구에 대한 평형결합이다.
도 2는 항원 시험에 대해 적혈구 결합이 관용를 유도하는 것을 보여주는 결과의 몽타주이다. 패널 (a)는 챌린지군 및 미처치 대조군 뿐만 아니라 실험군에 관한 실험 프로토콜을 보여주는 OTI CD8+ T세포의 입양전달 관용(adoptive transfer tolerance) 모델 (n=5)을 나타낸다. 패널 (b)는 OTI CD8+ T세포 집단(CD3ε+ CD8α+ CD45.2+)의 유세포 분석에 의한 검출 결과를 나타낸다. 패널 (c)는 CD45.1+ 마우스의 항원 실험 4일 후의, 배액 림프절(draining lymph nodes)(서경부 및 오금)에서의 OTI CD8+ T세포 집단의 정량화 결과(** P<0.01)이다. 패널 (d)는 IFNγ 발현 OTI CD8+ T세포의 유세포 분석에 의한 검출 결과를 나타낸다. 패널 (e)는 항원 실험 및 SIINFEKL 펩타이드(서열 번호 3)에 의한 재자극으로부터 4일 후의 배액 림프절에서의 IFNγ 발현 OTI CD8+ T세포를 나타낸다(** P<0.01). 패널 (f)는 ELISA에 의해 측정한, SIINFEKL 펩타이드(서열번호 3)에 의한 재자극으로부터 4일 후의, 림프절 세포 배양 배지에 있어서의 IFNγ 농도를 나타낸다(** P<0.01). 패널 (g)는 ELISA에 의해 측정한, OVA에 의한 재자극 4일 후의 림프절 세포 배양배지의 IL-10 농도를 나타낸다(* P<0.05). 데이터는 중앙치 ± 최소치 내지 최대치를 나타낸다. 패널 (h)는 19일째의 OVA 특이적 혈청 IgG의 역가(* P<0.05)를 나타낸다. 데이터는 평균±표준 편차(SE)이다. 패널 (i)는, OTI 및 OVA 발현 EL4 흉선종(E.G7-OVA) 종양 관용 모델의 조합으로서, 실험군 및 대조군(각각 n=4, 3)의 실험 프로토콜을 나타낸다. 패널 (j)는 입양 전이로부터 5일 후의, 혈액중을 순환하는 비증식(0세대) OTI CD8+ T세포의 정량화 결과를 나타낸다. 데이터는 중앙치 ± 최소치 내지 최대치이다 (** P<0.01). 패널 (k)는 OTI 입양 전이 9일 후에 피하 주사된, E.G7-OVA 종양 증식 프로파일을 나타낸다. 데이터는 평균±표준 편차이다(* P<0.05).
도 3은 C57BL/6 마우스에 있어서, 적혈구 결합이 항원 특이적 체액성 면역반응(humoral responses)을 어느 정도 감소시키는지를 나타내는 막대 그래프이다. C57BL/6 마우스에 OVA 1μg 또는 ERY1-OVA 1μg을 6 일 간격으로 2 회 투여하고, 19일 후에 혈청에서 OVA 특이적 IgG 를 검출하였다 (* P≤0.05).
도 4는 8-arm PEG-ERY1가 인비트로(in vitro) 및 인비보(in vivo)에서 적혈구에 결합하는 실험 결과를 나타낸다. 패널 (a)는 8-arm PEG -ERY1(검은색 히스토그램)는 인비트로 인큐베이션 후에 마우스 적혈구에 결합하지만, 8-arm PEG-MIS(회색 히스토그램) 또는 8-arm PEG-피리딜 디설파이드(8-arm PEG-pyridyldisulfide)는 결합하지 않는다. 패널 (b)는 정맥내 주사 시 8-arm PEG-ERY1(검은색 히스토그램)는 순환 적혈구에 결합 하지만, 8-arm PEG-MIS(회색 히스토그램)는 결합하지 않는 것을 보여준다.
도 5는 유세포 분석기에 의해 측정된, 8-arm PEG-ERY1(검은색 원) 및 8-arm PEG-MIS(백색 사각)의 적혈구 세포 표면 반감기를 나타내는 실험 결과를 나타낸다.
도 6은 사람 적혈구에 대한 펩타이드성 리간드의 결합에 대한 실험결과를 보여주는 막대 그래프이다.
도 7은 실험결과를 보여주는 유세포 분석 히스토그램이다. 마우스 적혈구는 TER119-SIINFEKL(회색 히스토그램) 또는 알부민 (흰색 히스토그램)과 함께 인큐베이트 되었다. 형광 시그널은 scFv 검출을 위해 사용된 anti-6xHis-PE로부터 나온다.
도 8은 식염수(saline), OVA, ERY1-OVA, 또는 TER119-SIINFEKL의 정맥내 투여 후 비장에서 증식하는 OT-I CD8 T세포를 보여주는 실험 결과의 플롯이다. **P<0.01, ***P<0.001
도 9는 입양 전달과, 식염수, OVA, ERY1-OVA, 또는 TER119-SIINFEKL의 정맥내 투여 후에 OTI CD8 T세포의 표현형의 특징를 보여주는 실험 결과를 나타낸다. 좌측 패널: 유세포 분석에서 아넥신-V 바인딩으로 표시된 세포사멸 OTI 세포 유도; 우측 패널: 유세포 분석에서 PD-1 발현으로 표시된 소모성 OTI 세포 유도.
도 10은 다양한 주사제에 대한 마우스 관용화 실험에서 림프절 배액 부분에서의 염증성(IFNγ+) OTI T세포의 특징을 유세포 분석기로 분석한 실험 결과를 나타낸다.
도 11은 ERY1-ASNase 또는 야생형 ASNase 를 2 또는 6 도스(dose) 마우스에 투여하고 투여 21일 후에 ELISA로 측정한, 아스파라기나제(ASNase)-특이 세럼 IgG의 정량(titer) 실험 결과를 나타낸다.
도 12는 다양한 배지 첨가물과, 비장 수지상세포(DCs)와 공생배양 (co-culture)에서의 형질전환 NODBDC2.5 마우스 유래 CD4 T세포의 증식 실험결과를 나타낸다.
도 13은 입양전달과, TER119-ChrA, 유리 1040-p31 펩타이드, 또는 식염수의 정맥내 투여 후에 유세포 분석기로 측정한, 비증식 NODBDC2.5 CD4 T세포의 정량(titer) 실험 결과를 나타낸다.
면역 관용 유도를 위한 분자 구조체를 제공한다. 관용이 요구되는 분자 항원 또는 단백질은 적혈구 결합 부분과 콘쥬게이트로서 형성된다. 상기 부분은 펩타이드 리간드, 항체, 압타머, 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 분자 융합체라고도 불리는 콘쥬게이트는, 예를 들어 폴리머 또는 폴리머 마이셀 또는 폴리머 나노입자 콘쥬게이트와 같은 링커를 포함하거나 융합 단백질일 수 있다.
본 명세서는 적혈구에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 대해 기술한다. 이들은 적혈구에 특이적으로 결합하는 서열을 갖는 펩타이드성 리간드로서, 또는 적혈구에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편으로서 제공된다. 펩타이드는 치료약, 관용 항원 또는 표적화 펩타이드와의 분자 융합체로서 조제될 수 있다. 치료약이 상기 융합체의 일부분인 경우, 인비보의 긴 순환 반감기를 유리하게 가질수 있다. 면역 관용은 관용이 요구되는 물질 상의 항원 선택 및 융합체의 사용에 의해 형성될 수 있다. 이 문맥에서 항원이라고 하는 용어는 완전한 크기(full size) 항원, 항원 단편, 또는 관용 유도 항원의 유사 항원을 의미한다. 표적화 펩타이드를 갖는 융합체는, 융합체를 표적, 예를 들어 종양으로 유도해, 그곳에서 적혈구 결합 리간드가 적혈구를 표적으로 리크루트함으로써 종양으로의 혈류를 감소시키거나 완전하게 저지한다.
적혈구에 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열(sequence)
적혈구에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 PCT/US2011/047078 출원에 개시되어 있으며, 적혈구에 특이적으로 결합하는 ERY1 이라고 하는 펩타이드를 포함한다. 사람 적혈구에 특이적으로 결합하는 6종 (ERY19, ERY59, ERY64, ERY123, ERY141 및 ERY162) 펩타이드 또한 보고되어 있다. 실시예 9는 펩타이드성 리간드 (ERY64, ERY123, 및 ERY141)가 어떻게 형광 단백질 리포터와 함께 융합 단백질 일부를 구성하는지, 그리고 특이적 결합 특징을 가지는지에 대해 설명한다. 본 발명의 일구현예는 ERY1의 아미노산 서열, 또는 사람 적혈구 결합 펩타이드의 아미노산 서열, 또는 이들의 보존적 치환체, 혹은 이들을 코드하는 핵산을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩타이드이다. 이러한 폴리펩타이드는 적혈구에 특이적으로 결합하는 것으로, 적혈구에 대한 리간드이다. 리간드란, 표적 분자에 특이적으로 결합하는 화학적 부분(chemical moiety)을 말하는 용어이다. 표적이란, 사용자가 리간드와 결합시키려고 하는 소정의 분자, 조직 또는 부위를 말한다. 따라서 조직으로의 표적 송달이란, 분자 또는 세포 등의 다른 물질을 목적하는 표적 조직에 송달하는 것을 말한다. 따라서, 구현예는 적혈구와의 결합에 사용되는 본 명세서에 개시된 리간드를 적어도 하나 포함하는 분자 또는 조성물을 포함한다. 폴리펩타이드의 적혈구와의 결합 활성은, 본 명세서에 기재된 이하의 실험 프로토콜에 의해 간단하게 측정할 수 있다. 이러한 방법을 이용하면, 일정한 생리적 조건하에서, ERY1 또는 사람 적혈구 결합 펩타이드와 비교하여, 폴리펩타이드 변종, 예를 들어, 보존적 치환, 인접하는 기의 부가 또는 제거, 또는 수용액에 대한 서열의 용해도를 조절하기 위한 변화 또는 부가에 의해 제조된 서열과 같은 변종의 결합력을 측정할 수 있다. 펩타이드성 리간드는, 적혈구 표면 분자(단백질, 당단백질), Band 3 (CD233), 글리코포린(glycophorin), 보다 구체적으로는 글리코포린 A(CD235a), 글리코포린 B (CD235b), 글리코포린 C (CD235c) 및 글리코포린 D (CD235d), 아쿠아포린-1, Glut-1, 키드 항원(Kidd antigen), RhAg/Rh50 (CD241), Rh (CD240), Rh30CE (CD240CE), Rh30D (CD240D), Kx, Kell (CD238), Duffy/DARC (CD234), CR1 (CD35), DAF (CD55), 글로보시드, CD44, ICAM-4 (CD242), Lu/B-CAM (CD239), XG1/XG2 (CD99), EMMPRIN/뉴로텔린 (CD147), JMH, 글리코실전달효소, 카트라이트, 돔브록, C4A/CAB, 시안나, MER2, 스토마틴, BA-1 (CD24), GPIV (CD36), CD108, CD139, 및 H 항원(CD173)을 포함하는 군에서 선택되는 하나 이상의 표적 또는 표적 그룹에 대해 특이적으로 생성될 수 있다. 정제된 조제물 또는 혼합물 상태의 적혈구 세포 표면 단백질은 펩타이드성 리간드에 대해 스크리닝될 수 있다. 적혈구 세포 표면 단백질은 단백질 발현 또는 안정성을 향상시키는 태그와 융합되어 완전한 형태나 부분적 도메인으로 재조합 발현될 수 있다. 이후에 재조합 단백질 표적은 플레이트 또는 비드에 고정되어, 라이브러리 스크리닝 프로세스의 친화성 표적으로 사용될 수 있다. 또한 적혈구 세포 표면 단백질은, 막 단백질의 정제되거나 복잡한 혼합물이 고체 매트릭스(비드, 플레이트 또는 그 외)에 고정될 수 있는, 전혈의 세포 조제물로부터 분리되어 스크리닝 프로세스에 대한 친화성 표적으로 사용될 수 있다. 비특이적 결합 현상을 줄이기 위해, 또한 혈청 중에서 바람직한 결합 특성을 갖는 펩타이드를 선택하기 위해, 고농도의 혈청 알부민(예를 들어, 50 mg/mL)의 존재하 37℃에서 전체 스크리닝 프로세스가 실시될 수 있다. 펩타이드 리간드는 Band 3 (CD233), 글리코포린 B (CD235b), 글리코포린 C (CD235c) 및 글리코포린 D (CD235d)에서 선택되는 것이 가장 바람직하다.
펩타이드성 리간드가 세포 형태를 변화시키지 않고, 세포질 전위 없이 적혈구 표면에 결합하는 것이 관찰되었다. 상기 리간드는 세포 표면 전체에 분포하며 클러스터 형성을 하지 않았다. 글리코포린-A (GYPA)는 ERY-1의 표적으로 식별된 특이적 단백질이다. ERY-1는 오직 마우스 및 래트 종과 반응하였다. 사람 적혈구에 특이적으로 결합하는 펩타이드성 리간드는 사람 적혈구에는 특이적이지만, 다른 종에는 특이적이지 않은 것으로 밝혀졌다. 마우스 적혈구 세포 표면에 대해 고친화성 펩타이드, WMVLPWLPGTLD (서열번호 1 이하에서는 ERY1)을 제시하는 파지 클론이 밝혀졌다. 다른 실험들에서 사람 적혈구에 대한 결합 리간드가 표 1 및 2에 나타낸 바와 같이 확인되었다. 6개의 서열은 특이적으로 사람 적혈구에 결합하였다. ERY50 이라고 이름 붙인 7번째의 서열은 사람 적혈구에 결합할 뿐만 아니라, 표피/내피 세포에도 결합하였다.
사람 적혈구에 결합하는 펩타이드 리간드
펩타이드 명칭 사람 적혈구에 결합하는 펩타이드 서열 서열번호
ERY19 GQSGQ PNSRWIYMTPLSPGIYR GSSGGS 서열번호 4
ERY50 GQSGQ SWSRAILPLFKIQPV GSSGGS 서열번호 5
ERY59 GQSGQ YICTSAGFGEYCFID GSSGGS 서열번호 6
ERY64 GQSGQ TYFCTPTLLGQYCSV GSSGGS 서열번호 7
ERY123 GQSG HWHCQGPFANWV GSSGGS 서열번호 8
ERY141 GQSGQ FCTVIYNTYTCVPSS GSSGGS 서열번호 9
ERY162 GQSGQ SVWYSSRGNPLRCTG GSSGGS 서열번호 10
밑줄 친 부분의 서열은 연결 서열을 나타냄.
마우스 및 사람 적혈구에 결합하는 펩타이드 리간드
펩타이드 서열번호
ERY19' PNSRWIYMTPLSPGIYR 서열번호 11
ERY50'* SWSRAILPLFKIQPV 서열번호 12
ERY59' YICTSAGFGEYCFID 서열번호 13
ERY64' TYFCTPTLLGQYCSV 서열번호 14
ERY123' HWHCQGPFANWV 서열번호 15
ERY141' FCTVIYNTYTCVPSS 서열번호 16
ERY162' SVWYSSRGNPLRCTG 서열번호 17
ERY1** WMVLPWLPGTLD 서열번호 1
*는 적혈구에 특이적이지 않음.
**는 마우스에 특이적임.
본 발명의 구현예는 적혈구 표면에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함한다. 배열은 최소 길이에 대해 최적화되지 않았다. 이러한 최적화는 당해 기술 분야의 기술 범위 내이며, 본 명세서에 기재된 기술을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, Kenrick 등(Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23(1):9-17) 은 15개 잔기의 라이브러리로부터 스크리닝한 다음, 7개 잔기 길이의 최소 결합 서열을 특정하였다. Getz (ACS Chem. Biol., May 26, 2011)는 5개 잔기 길이라고 하는 작은 최소 결합 도메인을 특정하였다. 적혈구 결합 펩타이드는 같은 서열의 반복 예를 들어 2 내지 20의 반복을 나타낼 수 있다. 당업자라면 명시한 범위 내의 모든 범위 및 값을 의도하고 있는 것을 곧바로 이해할 것이다 게다가, 펩타이드는 같은 펩타이드 내에 있거나 단일의 분자 융합체의 일부분인 2개 이상의 다른 서열과 조합되어 존재할 수 있다.
특이적 결합을 제공하는 연속하는 잔기의 수는 약 4 내지 12 개 잔기일 것으로 예상된다. 따라서, 예를 들어, 5개, 6개, 7개 또는 8개가 연속한 잔기의 펩타이드 외에도 4개의 연속한 잔기인 길이를 갖는 모든 펩타이드가 표 2에 개시되어 있다. 이 개수는, 다른 펩타이드성 단백질 결합 리간드에 대한 잔기 수에 근거한다. 본 발명의 구현예는, 표 1을 포함하여, 본 명세서에 기술된 적혈구에 결합하는 서열번호(SEQ ID)의 하나에 대한 최소 길이의 서열을 포함한다. 따라서, 어떤 종류의 구현예는, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 1 및 이들의 보존적 치환체로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열의 4~12개가 연속한 아미노산 잔기의 몇 개의 연속한 아미노산 서열을 포함하며, 상기 서열은 적혈구에 특이적으로 결합하는 것인 펩타이드 또는 분리된(또는 정제된) 펩타이드를 포함하는 조성물을 대상으로 한다. 다른 방법으로, 연속한 잔기의 수는 약 5 내지 약 18이 되도록 선택할 수 있다. 당업자라면, 예를 들어, 7, 8, 9, 10 또는 8 내지 18 등의 명기한 범위 내의 모든 범위 및 값을 의도하고 있는 것을 곧바로 이해할 것이다. 적혈구 결합 서열은, 예를 들어, 서열의 적어도 하나이면서 2개 이하인 아미노산의 보존적 치환체 또는 1, 2 또는 3개의 치환체 또는 1 내지 5개의 치환체를 가질 수 있다. 또한 Giordano 와 마찬가지로, 발견된 서열의 L- 아미노산과 D- 아미노산과의 치환을 빈번하게 수행할 수 있다. 일부 구현예에서는, 펩타이드 또는 조성물은, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 본질적으로 포함할 수 있다. 펩타이드는 길이가 한정될 수 있으며, 예를 들어, 약 10 내지 약 100개의 많은 잔기를 가진다. 당업자라면, 예를 들어, 약 10 내지 약 50 또는 약 15 내지 약 80 등, 명기한 범위 내의 모든 범위 및 값을 의도하고 있는 것을 곧바로 이해할 것이다. 펩타이드와 적혈구와의 평형 결합 측정에 의해 결정된 약 10 μM 내지 0.1 nM의 해리상수를 갖는 펩타이드 리간드를 포함하는 펩타이드의 적혈구 결합 부분을 제공할 수 있다. 당업자라면, 예를 들어, 약 1 μM 내지 약 0.1 nM 등, 명기한 범위 내의 모든 범위 및 값을 의도하고 있는 것을 곧바로 이해할 것이다. 상기 펩타이드는 치료약을 더 포함할 수 있다. 치료약은, 예를 들어, 단백질, 생물제제, 항체단편, ScFv , 또는 펩타이드일 수 있다. 펩타이드는 관용 유도 항원, 예를 들어, 해당 단백질을 결손한 사람에게 사용되는 인간 단백질(예를 들어, 제 VIII 인자 또는 제 IX 인자 등의 혈액 인자), 비인간형 글리코실화를 포함한 단백질, 인간에게서는 자연적으로 발견되지 않은 합성 단백질, 인간 음식 알레르겐 또는 인간 자가 면역 항원을 더 포함할 수 있다.
특정 용도에 따라 다양한 길이의 폴리펩타이드를 사용할 수 있다. 일반적으로, 폴리펩타이드 리간드 배열을 포함하는 폴리펩타이드는 인비보(in vivo) 적혈구와 상호작용할 수 있으면 특이적 결합을 나타낼 것이다. 접힐(fold) 가능성이 있는 펩타이드에 대해서는, 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 테스트할 수 있다. 따라서, 어떤 종류의 구현예에서는 폴리펩타이드 리간드를 가지지만, 자연계에 존재하지 않는 폴리펩타이드를 대상으로 하며, 어떤 종류의 다른 구현예에서는 특정의 길이, 예를 들어, 6 내지 3000 잔기, 또는 12 내지 1000 잔기 또는 12 내지 100 잔기 또는 10 내지 50 잔기를 갖는 폴리펩타이드를 대상으로 한다. 당업자라면, 명기한 범위 내의 모든 값 및 범위를 의도하고 있는 것을 곧바로 이해할 것이다.
어떤 종류의 구현예는, 다양한 폴리펩타이드 배열 및/또는 정제되거나 또는 분리된 폴리펩타이드를 제공한다. 폴리펩타이드란, 번역후 변형(예를 들어, 인산화 또는 글리코실화) 및/또는 추가의 폴리펩타이드와 복합체 형성, 핵산 및/또는 당질 또는 다른 분자와의 멀티 서브유닛 복합체의 합성에 관계 없이, 아미노산 잔기 사슬을 지칭하는 용어이다. 따라서 본 명세서에서는, 프로테오글리칸도 폴리펩타이드라고 지칭한다. 본 명세서에서 사용하는 경우, "기능성 폴리펩타이드"란, 적시된 기능을 촉진할 수 있는 폴리펩타이드이다. 폴리펩타이드는, 몇 가지 방법에 의해 제조할 수 있고 그 대부분이 당해 기술 분야에 있어서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 추출(예를 들어, 분리된 세포로부터)에 의해, 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산의 발현에 의해, 또는 화학 합성에 의해 얻을 수 있다. 폴리펩타이드는, 예를 들어, 재조합 기술 및 인코딩된 폴리펩타이드의 발현을 위해서 숙주 세포에 도입되는(예를 들어, 형질 전환 또는 트랜스펙션에 의해) 폴리펩타이드를 코드하는 발현 벡터를 사용하여 제조할 수 있다.
활성을 변화시키지 않고 아미노산 서열에 일반적으로 실시할 수 있는 보존적 변화에는 여러가지가 있다. 이러한 변화는, 보존적 치환 또는 돌연변이로 불린다; 즉, 특정의 크기 또는 특성을 갖는 아미노산의 그룹에 속하는 아미노산을 다른 아미노산과 치환할 수 있다. 아미노산 서열의 치환은, 그 아미노산이 속하는 클래스 이외의 멤버로부터 선택할 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산으로는, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌 및 티로신을 들 수 있다. 중성 아미노산으로서는, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 예로 들 수 있다. 양전하를 갖는(염기성) 아미노산으로는, 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 들 수 있다. 음전하를 갖는(산성) 아미노산으로는, 아스파르트산 및 글루타민산을 들 수 있다. 이러한 변화는, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 등전점에 의해 측정하는 경우 겉보기 분자량에 실질적으로 영향을 주지 않을 것으로 예상된다. 보존적 치환은 또한, 서열의 광학 이성체와 다른 광학 이성체와의 치환, 구체적으로는 서열의 하나 이상의 잔기에 대한 D 아미노산과 L 아미노산과의 치환을 포함한다. 게다가, 서열 중의 모든 아미노산을 D 이성체로부터 L 이성체로 치환할 수 있다. 예시적 보존적 치환에는, 양전하가 유지되는 Arg로부터 Lys으로의 치환 및 그 반대; 음전하가 유지되는 Asp로부터 Glu으로의 치환 및 그 반대; 유리 -OH 기가 유지되는 Thr로부터 Ser으로의 치환; 및 유리 NH2가 유지되는 Asn로부터 Gln으로의 치환이 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 더욱이, 폴리펩타이드 또는 핵산 단편의 기능을 잃게 하면서, 폴리펩타이드 서열 또는 그에 대응하는 핵산 서열의 점(point) 돌연변이, 결실 및 삽입을 실시할 수 있다. 치환은, 예를 들어, 1, 2, 3 개 또는 그 이상의 잔기를 더 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 아미노산 잔기는, 아미노산의 단일 문자 표기 또는 세 문자 약어를 사용한다. 본 명세서에 사용한 약어는, 표준 폴리펩타이드 명명법, J. Biol. Chem., (1969), 243, 3552-3559에 따른다. 본 명세서의 아미노산 잔기의 서열은 모두, 왼쪽 및 우측의 방향성, 기존의 방향인 아미노 말단으로부터 카르복시 말단 방향인 방식으로 나타내어진다.
경우에 따라서는, 본 명세서에 나타낸 서열 세트에 대한 펩타이드의 동일성 백분율 판정이 필요하다. 이러한 경우에는, 펩타이드 또는 펩타이드의 일부분의 잔기 수의 관점에서 동일성 백분율을 측정한다. 예를 들어, 90% 동일한 폴리펩타이드는 보다 큰 펩타이드의 일부분일 수도 있다.
본 명세서에서 폴리펩타이드에 관련하여 '정제'되었다고 하는 용어란, 폴리펩타이드가 화학적으로 합성되어 있으며, 따라서 실질적으로 다른 폴리펩타이드로 인해 오염되어 있지 않거나, 혹은 자연적으로 수반하는 다른 대부분의 세포 성분(예를 들어, 다른 세포 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 세포 성분)으로부터 분리 또는 정제 되어 있는 것을 의미한다. 정제된 폴리펩타이드의 한 예로서 건조 중량으로 적어도 70%이며, 자연적으로 결합하거나 자연적으로 발생하는 유기 분자 및 단백질을 포함하지 않는 폴리펩타이드를 들 수 있다. 따라서 정제된 폴리펩타이드 조제물은, 예를 들어, 해당 폴리펩타이드의 건조 중량으로 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 99%일 수 있다. 폴리펩타이드는 또한, 폴리펩타이드를 정제하거나 마크하기(예를 들어, 친화성 매트릭스 위에 포착하고, 현미경 하에서 가시화한다) 용이하게 태그 배열(예를 들어, 폴리히스티딘 태그, myc 태그 또는 FLAG
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태그)을 포함하도록 조작될 수 있다. 달리 언급하지 않는 한, 폴리펩타이드를 포함하는 정제된 조성물이란 정제된 폴리펩타이드를 말한다. '분리된' 이라는 용어는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 핵산이 자연적 환경이 아니라는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 분리된 산물이란, 배양 상등액에 포함되거나, 부분적으로 농축되거나, 이종 공급원으로부터 생산되거나, 벡터에 클로닝 되거나, 또는 매개체(vehicle)와 함께 제제화 되는 등을 포함할 수 있다.
폴리펩타이드는 화학적 개질물(chemical modification)을 포함할 수 있다. 여기에서 상기 용어는, 아미노산의 자연적으로 발생하는 화학 구조에 있어서의 변화를 말한다. 이러한 개질은 예를 들어 아미노산 말단 또는 카르복실 말단의 변화와 같이 곁사슬 또는 말단에 만들어질 수 있다. 일부 구현예에서 개질은 폴리펩타이드를 다른 물질과 결합시키거나 치료약과 결합시키는데 편리하게 사용될 수 있는 화학기를 형성하는데 유용하다.
바이오 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 특이적 결합이라고 하는 용어는, 비표적 조직과 비교하여 비교적 높은 친화성으로 분자가 표적과 결합하는 것을 말하며, 일반적으로 정전기적 상호작용, 반데르발스 상호작용, 수소결합 등의 복수의 비공유 결합성 상호작용이 관계한다. 특이적 결합 상호작용은, 항체-항원 결합, 효소-기질 결합 및 특이적으로 결합하는 단백질-수용체 상호작용의 특징이지만, 이러한 분자들이 때로는 그 표적 이외의 조직에 결합할 수 있는데 이러한 결합은 특이성이 없다고 하며 특이적 결합은 아니다. 펩타이드 ERY1 및 그 유도체와 사람 적혈구 결합 펩타이드 및 그 유도체는, 일부 환경에서 적혈구 이외의 것에 결합할 수 있지만, 다른 세포 또는 단백질과 달리 상기 펩타이드가 적혈구와 훨씬 많이 결합하는 것에 의해 증명되는 것 처럼, 이러한 결합은 비특이적인 것으로 관찰되었다.
따라서, 구현예는 적혈구에 특이적으로 결합하고 다른 혈액성분, 예를 들어, 혈액 단백질, 알부민, 피브로넥틴, 혈소판, 백혈구, 사람으로부터 채취한 혈액 샘플 내의 실질적으로 모든 성분 중 하나 이상과 특이적으로 결합 하지 않는 리간드를 포함한다. 혈액 샘플에 있어서 "실질적으로 모든"이라는 용어는 전형적으로 존재하는 성분을 말하며, 달리 생물학적으로 이용가능한 리간드의 역가를 사실상 저하시키지 않는 매우 낮은 농도의 부수적인 성분을 제외하는 것을 말한다.
항체 펩타이드
본 명세서는, 적혈구에 결합하는 펩타이드 뿐만 아니라, 단백질, 특히 항체와, 특히 단일 사슬 항체 단편도 제시한다. 항원에 대한 항체의 생산 기술은 잘 알려져있다. 여기에서 항원이라고 하는 용어는 항원에 반응하는 숙주 면역계에 의해 인식되는 부위를 말한다. 항원의 선택은 수많은 기술 분야 중에서 항체를 생산하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 구현예는, 분자 융합체 및 본 명세서에 기재된 다른 방법에서 펩타이드를 사용하는 것을 포함한다. 항원은 단백질 발현 또는 단백질의 안정성을 향상시키는 태그와 융합되어 완전한 형태 또는 부분적 도메인으로 재조합 발현될 수 있다. 그 이후에 재조합 단백질 항체는 플레이트 또는 비드에 고정되어, 라이브러리 스크리닝(library screening) 과정의 친화성 표적으로 사용될 수 있다. 항체는 또한 전혈의 세포 조제물로부터 분리될 수 있으며, 그로부터 정제되거나 막 단백질의 복잡한 혼합물이 고체 매트릭스(비드, 플레이트 또는 그 외)에 고정되어 스크리닝 프로세스를 위한 친화성 표적으로 사용될 수 있다.
본 개시 내용을 읽은 당업자라면 적혈구에 특이적으로 결합하는 항체를 제조할 수 있을 것이다. 실시예 4 내지 6은 항체 또는 그 단편의 제조에 관한 것이다. 수많은 유사한 기술들이, 새로운 항체 또는 항체 단편의 발견, 또는 바이러스(phage) 디스플레이, 효모 디스플레이 그리고 세균 디스플레이를 비롯한(그러나 제한적이지는 않은) 적혈구에 대해 활성인 단편을 포함하는 조성물을 제조하는데 사용된다. 추가적인 적혈구 결합 항체이나 항체 단편 또는 scFv는, Band 3 (CD233), 아쿠아포린-1, Glut-1, 키드 항원, RhAg/Rh50 (CD241), Rh (CD240), Rh30CE (CD240CE), Rh30D (CD240D), Kx, 글리코포린 A (CD235a), 글리코포린 B (CD235b), 글리코포린 C (CD235c), 글리코포린 D (CD235d), Kell (CD238), Duffy/DARC (CD234), CR1 (CD35), DAF (CD55), 글로보시드, CD44, ICAM-4 (CD242), Lu/B-CAM (CD239), XG1/XG2 (CD99), EMMPRIN/뉴로텔린 (CD147), JMH, 글리코실전달효소, 카트라이트, 돔브록, C4A/CAB, 시안나, MER2, 스토마틴, BA-1 (CD24), GPIV (CD36), CD108, CD139, 및 H 항원 (CD173)을 포함하는 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 표적 또는 표적 그룹(여기서, '적혈구 표적 그룹'이라 통칭)에 특이적으로 생성될 수 있다.
추가적으로, 새로운 적혈구 특이적 항체는 온전한 마우스의 면역화(immunization), 또는 사람 적혈구의 단백질 조제물에 의해 생성될 수 있다. 보조제로 조제된 표적으로 면역화된 마우스는 미리 정해진 시간에 희생되어, 그 항체 레퍼토리를 서열분석하고/하거나 그 B 세포는 혼성세포 기반 스크리닝(hybridoma-based screening)을 위해 분리된다. 이 항체 또는 항체 단편은 개선된 결합 및/또는 안정성 파라미터를 위해 전술한 바와 같은 몇몇 인비트로 (in vitro) 기술로 최적화될 수 있다. 추가적인 적혈구 결합 항체 또는 항체 단편은 적혈구 결합이 이미 밝혀진 항체 혼성세포 클론을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, TER119 scFv를 생성하는데 사용되는 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 주형(template)으로서, 또는 항체 소스(source)로서, BRIC 4, 5, 6, 10, 14, 18, 39, 66, 68, 69, 87, 108, 110, 111, 125, 126, 128, 145, 155, 157, 163, 170, 198, 203, 216, 220, 221, 222, 229, 230, 231, 235, or 256; BRAC 17, 18; BGRL 1, 2, 11, 100; BRAD 3; BIRMA D6, D10, K3, 84B; 6A7; COE; 또는 KZ1을 포함하는 혼성세포(하이브리도마) 클론을 사용할 수 있다.
본 명세서에서, '펩타이드'라는 용어와 '폴리펩타이드'라는 용어를 동의어로 사용한다. 항체 및 항체 단편은 펩타이드이다. '항체 단편'이라고 하는 용어는 항체의 항원 결합 기능을 보유하는 항체의 일부분을 말한다. 단편은 문자 그대로 보다 큰 항체의 일부분으로부터 제조되거나 데노보 합성(de novo synthesis)될 수 있다. 항체 단편은, 예를 들어, 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함한다. scFv는 링커 펩타이드, 예를 들어, 약 10 내지 약 50 아미노산으로 연결된, 면역 글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 링커는 VH의 N말단을 VL의 C말단과 연결할 수 있고 또는 그 반대로도 할 수 있다. scFv 라고 하는 용어는, 2가의 scFv, 이중 특이성 항체(diabody), 삼중 특이성 항체(triabody), 사중 특이성 항체(tetrabody) 및 항체 단편의 다른 조합을 포함한다. 항체는 파라토프(paratope)라는 항원 결합 부분을 가진다. '펩타이드 리간드'라고 하는 용어는 파라토프의 일부분이 아닌 펩타이드를 말한다.
항체와 그 단편, 펩타이드성 결합 리간드, 및 압타머(aptamer)에 의한 적혈구 결합은 적혈구에 대한 공유결합 없이 실시될 수 있다. 상기 결합은 엑스 비보(ex vivo) 적혈구 결합 이벤트(event) 없이 인비보(in vivo)에서 실시될 수 있다. 적혈구와 항체의 결과적인 조합을 포함하는 상기 결합 이벤트는 적혈구가 아포토시스(apoptosis) 되는 것을 야기하지 않고 실시될 수 있다. 이 과정은 적혈구의 표면 분자가 가교제 및/또는 결합 이벤트에 의해 서로 가교되지 않도록, 그리고 공유 결합에 의해 가교되지 않도록 실시될 수 있다.
적혈구에 항원을 결합하는 이중특이적 단백질 구조체
적혈구에 결합하는 단백질 구조체를 형성할 때, 주요한 설계 옵션은 목적 항원과 적혈구 결합 부분을 모두를 포함하는 단일 단백질 또는 분자 융합체를 형성하는 것이다.
생산과 사용에 있어서 더 효율적일 수 있는 대안적인 설계는, 목적 항원에 대해 직접적 또는 간접적으로 결합된 추가적인 도메인과 융합되어 있는 적혈구와 결합하는 하나의 도메인을 포함하는 이중 특이적 단백질 또는 분자 구조물이다. 실제 목적 항원은 이 분자 융합체에 포함되어 있지 않으며, 오직 목적 항원에 직접적 또는 간접적으로 결합하는 부분만 포함되어 있다. 이 때문에, 목적 항원의 수정(modify)이나 조작(engineer)을 필요로 하지 않는다. 이러한 설계에 대한 하나의 예는, 목적 항원을 가지는 생체 분자에 특이적으로 결합하는 세컨드 항체 도메인에 재조합 융합된 적혈구에 특이적인 하나의 항체 도메인을 가진, 이중특이적 항체 또는 항체 단편이다. 다수의 다양한 이중특이성 항체 구조물은, 탠덤(tandem) scFv, 다이어바디(diabodies) 그리고 탠덤 scFv-IgG 분자를 포함하지만 이에 한정되지 않고 실현되었다(참고문헌 62). 목적 항원에 결합하는 도메인과 적혈구에 결합하는 다른 도메인에 결합하는 도메인의 하버링(harboring)에 의해 이중 특이성을 갖도록 조작된 폴리머성 나노입자 또는 다른 다가 폴리머 콘쥬게이트를 포함하는 기타 비단백질 스케폴드(non-proteinaceous scaffold) 또한 사용된다.
이중 특이성 구조물의 친화성 부분은 펩타이드 도메인 및/또는 항체 단편 도메인의 임의의 조합이 될 수 있다. 적혈구 또는 표적 단백질 항원에 결합하는 펩타이드는, 예를 들어, 비드 또는 복합 펩타이드 라이브러리 스크리닝, 바이러스 디스플레이, 세균 디스플레이 그리고 효모 디스플레이를 포함하는 통상적인 펩타이드 라이브러리 스크리닝 기술로 얻어진다. 조작된 펩타이드는, 예를 들어, ELISA, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance) 그리고 유세포 분석 기반 방법과 같은 표준 생화학적 분석법을 사용하여 결합 표적에 대한 특이성과 친화성이 특징지어진다. 적혈구 또는 표적 단백질 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편은, 예를 들어, 혼성세포 기반 선택 방법, 바이러스 디스플레이, 효모 디스플레이, 세균 디스플레이, 리보소말 디스플레이 또는 면역화된 동물의 직접적인 항체 유전자 또는 단백질체 기반 서열 분석 방법과 같은 통상적 기술을 사용하여 얻어진다. 조작된 항체 또는 항체 단편은, 예를 들어, ELISA, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance) 그리고 유세포 분석 기반 방법과 같은 표준 생화학적 분석법을 사용하여 결합 표적에 대한 특이성과 친화성이 특징지어진다.
각각의 친화성 부분(펩타이드, 항체 및/또는 항체 도메인)의 발견과 특성분석에 이어, 어셈블리(assembly) PCR 또는 직접 유전자 합성과 같은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 이중특이성 분자 구조체를 형성하도록 융합되고, 융합 단백질은 적합한 숙주에서 발현된다. 또한, 이중특이성 구조체는, 이중특이성 결합에 적합하다고 여겨지는 임의의 조합(펩타이드-펩타이드, 펩타이드-항체 단편, 등)으로 개개의 두 부분을 화학적으로 콘쥬게이션하여 형성할 수도 있다. 두 항체 도메인은 다양한 최신의 기술(1)을 사용하여 이중특이성 항체의 형성에 사용될 수 있다. 이에 더하여, 합성 폴리머 스케폴드(PEG, PPG, 또는 그 외)는 각각의 결합 부분간의 안정적인 연결을 형성하고 구조체의 가요성을 향상시키는데 사용된다. 분기형(branched) 폴리머는 또한, 적혈구, 단백질 항원 또는 양쪽 모두에 대해 활성 효과(avidity effect)에 의한 결합 친화성을 높이는데 사용된다.
이중 특이성 구조체의 결합 유효성에 대한 특성분석은 표준 인비트로(in vitro) 생화학적 결합 친화성 분석, 예를 들어 ELISA와 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 실시된다. 이중 특이성 구조체의 인비트로(in vivo) 검증은, 이중 특이성 구조체 또는 이중 특이성 구조체와 항원을 마우스 또는 래트와 같은 동물 모델에 투여하고, 혈액을 채취하여 유사 인비트로(in vitro) 분석을 이용하여 적혈구와 항원 결합 모두에 대하여 테스트하여 실시된다.
구현예들은 약학적으로 허용되는 조성물을 포함하며, 상기 조성물은 표적에 특이적으로 결합하는 도메인과 연결되는 적혈구 결합 부분을 포함한다. 상기 표적은 단백질을 포함할 수 있고, 상기 단백질은 관용 유도 항원을 더 포함할 수 있다. 상기 적혈구 결합 부분은 펩타이드 리간드, 항체, 항체 단편, 단일 사슬 항원 결합 도메인 (ScFv) 또는 압타머를 포함 할 수 있다. 상기 도메인은 항체, 항체 단편 및 단일 사슬 항원 결합 도메인(ScFv), 펩타이드 리간드 및 압타머로 이루어진 군에서 선택 될수 있다. 일 구현예는 분자 융합체, 탠덤 scFv, 이중 특이성 항체 및 탠덤 scFv-IgG 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 멤버와, 적혈구 결합 부분 및 상기 멤버들의 일부인 도메인을 함께 포함하는 조성물이다. 단일 융합 단백질 또는 이를 인코딩하는 핵산은 적혈구 결합 도메인과 표적에 결합하는 다른 도메인을 포함할 수 있다.
적혈구 결합 항원을 사용하는 항원 특이적 항체의 치료적 결핍 (Therapeutic depletion)
항원 특이적 항체의 유도는 치료에 대하여 유해하며, 자가 면역 질환의 단백질 치환 치료 동안에 그리고 일반적인 생물학적 처치 동안에 위험한 부작용을 일으킬 수 있다(참고문헌63-68). 상기 약물 특이적(drug-specific) 항체의 결핍은 약물-항체 복합물에 의한 부정적인 면역학적 부작용의 위험을 감소시키면서 향후의 치료를 가능하게 한다는 점에서, 혈액 내에서 순환하는 항원 특이적 항체를 감소시키는 치료적 개입은 긍정적인 임상효과를 야기할 수 있다. 헤모필리아 A(hemophilia-A)의 경우를 예로 들면, 약 30%의 환자에게 있어서 표준 치료 단백질 약물 제 VIII 인자를 통해 항-약물 항체(anti-drug antibodies)가 유도되어, 제 VIII 인자에 의한 추가 치료는 위험하고 효능이 없게 된다. 이러한 환자에 대한 제 VIII 인자 특이적 순환 항체를 감소시키는 치료적 개입은, 상기 치료적 제 VIII 인자 처지법을 다시 가능하게 하며, 환자에게 더 비싸고 덜 효과적인 대체 치료법으로 변경할 필요가 없게 한다. 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosis(SLE) lupus: 주로 체내의 고유자가면역을 통한 항체의 유도에 의해 매개되는 자가면역질환이다)의 경우를 예로 들면, 혈중에 순환하는 자가-항체-특이 항원(auto-antigen-specific antibodies)을 감소 시킬 수 있는 치료법으로 질병의 발병과 진행을 대폭으로 줄일 수 있다.
항원 특이적 항체를 결핍시키기 위해, 항원은 투여 후 순환 적혈구에 결합하도록 조작된다. 목적 항원에 융합된 적혈구 결합 부분의 분자 구조체는 상기 적혈구 결합 항원을 형성하기 위해 생성된다. 다른 방법으로는, 전술한 바와 같이 항원의 적혈구 결합 제제를 형성하기 위해 이중 특이성 구조체가 구현될 수 있다. 이 방법에서는, 상기 적혈구 결합 항원의 투여시, 상기 항원에 대해 특이적인 임의의 순환 항체는 조작된 항원에 결합하게 되고, 인시튜(in situ)에서 순환 적혈구와 밀접하게 결합된다. 적혈구와 같이 자연적으로 순환하는 세포에 대해 항원 특이적 항체가 밀접하게 물리적 결합을 하는 동안에, 위험한 염증성 면역 효과는 상기 적혈구 상에 존재하는 제어성 시그널에 의해 저해된다. 적혈구는 그 표면에 특히 CD55 및 CD59을 포함하는 몇몇 제어 분자를 발현한다(참고문헌 67). 따라서, 항원 특이적 항체는 적혈구와 결합된 채로 적혈구의 자연 제거 영역에 운반되고, 이 과정 동안 항원 특이적 항체도 제거된다. 상기 항원 장식 적혈구(antigen-decorated erythrocyte)는 항체 특이적 항원에 대한 세포의 보관소 및 결핍 캐리어(depletion carrier)의 역할을 한다.
항원 특이적 항체의 결핍은, 상기 조작된 항원 구조체를 테스트 동물에 투여한 후 테스트 동물로부터 주기적으로 혈액을 채취하고, ELISA와 같은 항원 특이적 항체를 적정하는 기술을 사용함으로써, 인비보(in vivo)에서 특징지어진다. 또한, 항체 분비 면역 세포 (B cell, plasma cell 또는 그 외)의 특이적 결핍 또는 비활성화는, 대상 마우스의 혈액, 골수, 비장, 또는 림프계의 면역 세포 분리와 인비트로(in vitro)에서의 항원 특이적 재자극 B 세포 엘리스팟 분석(estimulations B-cell ELISpots assays)의 수행 및 다중 매개변수 유세포분석(multi-parameter flow cytometry)으로 특징지어진다. 자가면역 관련 연구에서, 자가 면역 장애와 관련있는 마우스 모델은 자가면역 결핍에 있어서 적혈구 결합 항원의 영향을 특징짓는데 사용된다.
혈액 순환계로부터 항체 제거 및/또는 적혈구에 대한 항체 결합을 포함하는 조성물의 용도. 일 구현예는 항원에 결합된 적혈구 결합 부분을 포함하는 약학적으로 허용되는 조성물이다. 상기 항원은 홍반성 낭창 항원(lupus erythematosis antige)과 같은 고유자가항원(native auto-antigen)일 수 있다. 혹은 상기 항원은, 환자에게 투여되는 치료용 단백질용 항원, 예를 들어, 제 VIII 인자 항원일 수 있다.
적혈구에 특이적으로 결합하는 압타머
적혈구에 결합하는 펩타이드 리간드 이외에도, 적혈구 표면 성분에 대한 뉴클레오타이드 압타머 리간드를 교시한다. 따라서, 압타머는 본 명세서에 개시된 것과 같은 방법으로 다른 적혈구 결합 부분에 대하여 제조 및 사용될 수 있다. DNA 압타머 및 RNA 압타머를 사용하여 비공유 결합성의 적혈구 결합을 제공할 수 있다. 이들은 뉴클레오타이드 만으로 형성되기 때문에, 스크리닝 방법이 충분히 확립되어 있고, 화학적으로 합성하기 쉬우며, 인비보(in vivo)에서의 빠른 제거로 인해 독성 및/또는 면역원성의 부작용이 제한된다(Keefe, Pai, et al., 2010). 게다가, 뉴클레오타이드-표적 단백질 상호작용의 비표준적(non-canonical) 성질에 의해, 인비보(in vivo)에서의 표적 결합에 있어서 임의의 증식성(productive) 작용물질 시그널 전달이 일어날 가능성이 적고, 따라서 낮은 면역원성 및 독성에 기여한다. 이 때문에, 수많은 압타머 기반 분자에 대해 현재, 백혈병, 황반 변성증, 혈전증 및 2 형 당뇨병 등 몇 개의 임상 적응증에 관한 사람 임상실험이 진행 중이다(Keefe, Pai, et al., 2010). 압타머는 또한 암 화학요법 및 형광 또는 방사성 물질에 의한 종양 검출 기술 등의 분야에서, 인비보(in vivo)에서 약물 페이로드(drug payload)를 특정 조직에 운반하는 표적화제로 사용되어 왔다(Rockey, Huang, et al., 2011; Savla, Taratula, et al., 2011).
압타머는 특정의 표적 분자에 결합하는 올리고 핵산 또는 펩타이드이다. 압타머는 통상, 큰 랜덤 서열군으로부터 이들을 선택함으로써 목적 표적에 결합하도록 제조된다. 압타머는, DNA 압타머, RNA 압타머 또는 펩타이드 압타머로 분류할 수 있다. 핵산 압타머는 소분자, 단백질, 핵산, 세포, 조직 및 생물체 등의 표적에 특이적으로 결합하는 인비트로 셀렉션 또는 시험관내 진화법(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: SELEX) (Archemix, Cambridge, MA, USA) (Sampson, 2003)을 수회 반복하여 조작된 핵산종이다. 펩타이드 압타머는 전형적으로 양단이 단백질의 골격에 결합된 짧은 가변 펩타이드 도메인을 가진다. 펩타이드 압타머는 세포 내에서 다른 단백질의 상호작용을 저해하도록 설계된 단백질이다. 펩타이드 압타머는 양단이 단백질 골격에 결합된 가변 펩타이드 루프로 이루어진다. 이런 이중 구조적 제한은 펩타이드 압타머의 결합 친화성을 항체와 비슷하게 되도록 크게 향상시킨다. 가변 루프의 길이는 전형적으로는 약 10 내지 약 20 아미노산으로 이루어지고, 골격은 양호한 용해성을 가지며 컴팩트한 단백질이다. 예를 들어, 박테리아 단백질 티오레독신-A는 그 야생형 단백질의 ―Cys-Gly-Pro-Cys- 루프 (2개의 시스테인 곁사슬이 이황화물 가교를 형성할 수 있다)인 환원 활성 부위 내에 삽입되는 가변 루프를 가지는 골격 단백질이다.
압타머를 제조하기 위한 몇 가지 기술은 Lu 등의 Chem Rev 2009:109(5):1948-1998, 또한 US 7,892,734, US 7,811,809, US 2010/0129820, US 2009/0149656, US 2006/0127929, 및 US 2007/0111222 에 소개되어 있다. 실시예 8은 본 명세서에 개시된 구현예에 사용되는 압타머의 제조 및 사용을 위한 재료 및 방법을 더 구체적으로 설명한다.
분자 융합체
분자 융합체는, 제1 펩타이드성 적혈구 결합 리간드와 제2 펩타이드 사이에서 형성될 수 있다. 융합체는 서로 직접적 또는 간접적으로 콘쥬게이트된 펩타이드를 포함한다. 펩타이드는 서로 직접적으로 콘쥬게이트되거나, 링커를 통하여 간접적으로 콘쥬게이트될 수 있다. 상기 링커는 펩타이드, 폴리머, 압타머, 핵산, 또는 입자일 수 있다. 상기 입자는 예를 들어, 마이크로입자, 나노입자, 폴리머솜(polymersome), 리포솜 또는 마이셀일 수 있다. 상기 폴리머는 예를 들어, 천연, 합성, 선형, 또는 분기형일 수 있다. 제1 펩타이드 및 제2 펩타이드를 포함하는 융합 단백질은 펩타이드 분자 융합체의 일 예이며, 상기 융합 단백질은 서로 직접 결합한 펩타이드를 포함하거나, 중간 링커 서열 및/또는 추가의 서열을 일 단부 또는 양 단부에 포함한다. 링커와의 콘쥬게이션은 공유결합을 통해 이루어질 수 있다. 다른 결합으로 이온 결합을 포함한다. 방법은 분자 융합체, 또는 분자 융합체를 포함하는 조성물을 조제하는 것을 포함하며, 상기 분자 융합체는 적혈구에 특이적으로 결합하는 펩타이드와, 치료약, 관용 항원 또는 다른 물질들을 포함한다.
'분자 융합체'라고 하는 용어, 또는 '콘쥬게이트' 되었다고 하는 용어는 공유결합, 정전기적 이온 결합, 전하-전하 결합을 포함하는 화학적 결합에 의한 직접적 또는 간접적 결합을 말한다. 상기 콘쥬게이션은, 화학적 결합에 의해 유지되는 유닛을 형성한다. 직접 콘쥬게이션이란, 중간 링커 또는 화학기를 이용하거나 이용하지 않는, 작용 물질과의 화학적 결합을 말한다. 간접 콘쥬게이션은 캐리어와의 화학적 결합을 말한다. 상기 캐리어는 주로, 예를 들어, 폴리머솜, 리포좀 또는 마이셀 또는 어떤 종류의 나노 입자와 같이 작용물질을 봉입하거나, 또는, 예를 들어, 금속 나노입자 또는 비드와 같이 작용 물질을 그 표면에 가지거나, 또는 그 양쪽 모두에 가져도 좋은, 예를 들어, 작용 물질의 일부를 그 내부 및 외부에 포함하는 입자일 수 있다. 상기 캐리어는 또한, 면역 관용을 위한 항원을 봉입할 수 있다. 예를 들어, 항원을 봉입하는 폴리머솜, 리포좀 또는 입자를 제조할 수 있다. 상기 '봉입한다'라는 용어는, 노출되는 부분이 없이 효율적으로 전체를 피복하는 것을 의미하며, 예를 들어, 항원 또는 작용 물질을 봉입하는 폴리머솜을 제조할 수 있다. 치료약의 예에는, 단일 결합 가변 조각(scFv), 항체 단편, 소분자 약제, 생리 활성 펩타이드, 생리 활성 단백질 및 생리 활성 생체 분자가 있다.
콘쥬게이션은, 링커를 사용하거나 사용하지 않고 펩타이드를 다른 분자에 공유결합함으로써 달성할 수 있다. 이러한 콘쥬게이트의 형성은 당업계 기술의 범위 내에 있고 콘쥬게이션을 달성하기 위한 다양한 기술이 알려져 있어, 개개의 기술의 선택은 콘쥬게이션 하고자 하는 재료에 의해 좌우된다. 폴리펩타이드(C 또는 N말단)에, 이온성 곁사슬를 함유하고 폴리펩타이드 서열의 활성 부분에 포함되지 않는 아미노산, 즉 아스파르트산, 글루타민산, 라이신, 아르기닌, 시스테인, 히스티딘 또는 티로신을 부가하는 것은 이들의 비양성자화(unprotonated) 상태에서, 폴리머 즉 호모 또는 헤테로 이중 기능성 PEG에 부착된 반응기와의 다양한 생접합 반응에 관여하는 잠재적인 친핵체로서의 역할을 한다(예를 들어, Lutolf and Hubbell, Biomacromolecules 2003;4:713-22, Hermanson, Bioconjugate Techniques, London.Academic Press Ltd;1996). 몇몇 구현예에서는, 가용성 폴리머 링커를 사용하여 약학적으로 허용되는 형태로 환자에게 투여할 수 있다. 또는, 약제를 폴리머솜(polymerosome) 또는 소포(vesicle)에 봉입하거나, 또는 펩타이드 리간드에 공유결합시킬 수 있다.
일 구현예는 비단백질 치료제와, 적혈구에 특이적으로 결합하는 펩타이드 리간드, 항체, 항체 단편, 또는 압타머와의 콘쥬게이션이다. 적혈구 결합 펩타이드법의 응용은 폴리펩타이드 요법에 한정되는 것이 아니라, 오히려 소분자 및 폴리머 입자와 같은 다른 약물 제제 형태로 나타날 수 있다. 소분자 및 이들의 약제로서 응용하기 위한 긴 역사에서, 짧은 순환 반감기 및 낮은 생물학적 이용 가능성이 인비보(in vivo)에서의 이들의 유효성을 항상 방해하여 왔다. 폴리머 마이셀 및 나노 입자는 비교적 새로운 세대의 약제 클래스이며, 세망내피계(reticuloendothelial system)의 작용에 의한 높은 제거율 등의 이유로, 그 약물 동태학적 거동은 여전히 불충분하다(Moghimi and Szebeni, 2003). 적혈구 결합 설계를 이들 외의 약제 클래스로 넓히고, 이들의 순환 반감기를 길게 하여, 임상적 유효성을 높일 수 있다.
상기 콘쥬게이트는 입자를 포함할 수 있다. 상기 적혈구 결합 펩타이드는 입자에 결합될 수 있다. 항원, 작용 물질 또는 다른 물질은 입자 내에 있거나 입자 상에 있을 수 있다. 나노 입자, 마이셀 및 다른 입자의 예에 대해서는, 본 발명에서 설명하는 리간드와의 결합을 포함하여, 예를 들어, US 2008/0031899, US 2010/0055189, US 2010/0003338에 개시되어 있으며, 이들은 인용에 의해 본 명세서에 통합되나 모순되는 경우는 본 명세서가 우선한다.
나노 입자는, 평균 직경 약 10 nm 내지 약 200 nm를 갖는 입자의 집합체로서 제조될 수 있으며, 제조 방법에 의한 다분산도에 따라, 명기한 범위 내의 모든 범위 및 값, 예를 들어, 약 20 내지 약 200 nm 및 약 20 내지 약 40 nm 이하, 약 70 nm 이하 또는 약 100 nm 이하의 모든 범위 및 값을 포함한다. 폴리(에틸렌글리콜)와 폴리(락트산)과의 공중합체부터 형성된 것, 폴리(에틸렌 옥사이드)와 폴리(β-아미노에스테르)와의 공중합체로부터 형성된 것, 그리고 혈청 알부민과 같은 단백질로부터 형성된 것과 같은 다양한 나노 입자 시스템을 이용할 수 있다. 다른 나노 입자 시스템도 당업자에게 알려져 있다. 또한, Dev alapally 등, Cancer Chemother Pharmacol., 07-25-06;Langer 등, International Journal of Pharmaceutics, 257:169~180(2003); 및 Tobio등, Pharmaceutical Research, 15(2):270~275(1998)도 참조된다.
연골 조직 결합 리간드를 포함하는 평균 직경 약 200 nm 이상의 큰 입자도 제조할 수 있으며, 이들 입 자는 미크론 스케일에 근접하기 때문에 본 명세서에서는 마이크로 입자 라고 하여, 거의 광학 분해능의 한계 내에 해당한다. 예를 들어, 마이크로 입자를 제조하는 일부 기술에 대해서는, 미국 특허 5,227,165; 6,022,564; 6,090,925; 6,224,794에 개시되어 있다.
표적화 능력을 이용하기 위하여 나노 입자를 기능화하려면, 예를 들어, 생접합 기술을 이용하는 공유결합에 의해 표적화 폴리펩타이드를 입자와 결합시킬 필요가 있으며, 특정 기술의 선택은 폴리펩타이드가 결합하는 입자 또는 나노 입자 또는 다른 구조체에 의해 좌우된다. 일반적으로, 펩타이드를 다른 재료에 결합 시키는 많은 생접합 기술이 잘 알려져 있어 개개의 재료에 가장 적합한 기술을 선택할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드를 티올 반응성 분자(thiol-reactive molecules)에 결합 시키는 경우, 시스테인 등, 폴리펩타이드 서열에 추가의 아미노산을 결합시킬 수 있다.
복수의 다양한 생리 활성 분자를 제시할 수 있는 다량체 분자를 제조하기 위해, 시판되고 있는 8-arm PEG 덴드리머를 화학적으로 변성시켜, 콘쥬게이션 반응을 용이하게 하는 반응기를 포함시켰다. 8-arm PEG-피리딜디설파이드(8-arm PEG-pyridyldisulfide)는, 소분자 및/또는 시스테인 함유 펩타이드 또는 단백질의 티올 레이트(thiolates)와 용이하게 반응하는 피리딜디설파이드기를 함유하고, 결합한 생리 활성 부분과 8-arm PEG 골격 사이에 이황화결합이 생기도록 한다. 8-arm PEG의 다량체 구조에 의해, 그 골격과 다양한 펩타이드 또는 분자와의 콘쥬게이션이 가능하게 되어, 그 결합 된 부분에 의해 복수의 활성을 갖는 헤테로 관능성의 생체 분자가 제조된다. 인비트로(도 4A) 및 인비보(도 4B)에서 적혈구에 결합 할 수 있는, 헤테로 관능성 형광 8-arm PEG 구조체(Heterofunctionalized fluorescent 8-arm PEG constructs)를 제조하였다. 이 결합은, 비특이적 MIS 펩타이드를 갖는 콘쥬게이트가 적혈구에 거의 또는 전혀 결합하지 않는 것을 증명했으므로, ERY1 펩타이드에 특이적인 서열이다. 형광 8-arm PEG-ERY1-ALEXAFLUOR647가 정맥내 투여로부터 5시간 후에 순환 적혈구 상에서 검출되었고, 세포 표면에서의 반감기가 2.2시간을 나타냈으므로, 인비보에서의 결합은 오래간다(도 5). 자가면역 당뇨병 마우스 모델에 있어서의 관용의 유도를 증명하기 위해, ERY1 및 당뇨병 항원 크로모그라닌 A(CrA) 양쪽 모두와 콘쥬게이트된 8-arm PEG를 제조하였다. 8-arm PEG-피리딜디설파이드 구조체의 모듈성에 의해, 다양한 티올 함유 분자를 화학량론적으로 결정된 양으로 연속적으로 첨가하는 것에 의해 공동 콘쥬게이트(co-conjugate) 하는 것이 가능하다.
상기 분자 융합체는 폴리머를 포함할 수 있다. 상기 폴리머는 분기형 또는 선형일 수 있다. 분자 융합체는 덴드리머를 포함할 수 있다. 일반적으로, 가용성의 친수성 생체 적합성 폴리머가 사용하여, 콘쥬게이트가 가용성이며 환자에게 도입 후에 생체내로 이용되도록 할 수 있다. 가용성 폴리머의 예에는, 적어도 100, 400 또는 100 내지 400, 000(명시적인 값 사이의 모든 범위 및 값을 의도함)의 분자량을 갖는 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌이민 및 폴리에틸렌글리콜(폴리에틸렌 옥사이드를 포함하는 용어임)이 있다. 여기서 용해성 또는 가용성이란, 물 또는 생리 식염수(살린) 1리터 당 적어도 1그램의 용해도를 말한다. 또, 생분해성 폴리머는 예를 들어, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산과 폴리글리콜산과의 코폴리머, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시부티르산, 폴리오르쏘에스테르, 폴리아세탈, 폴리디하이드로피란 및 폴리시아노아실레이트의 도메인을 사용할 수 있다.
몇몇 구현예에서는, 폴리펩타이드-폴리머 결합물, 예를 들어, 콘쥬게이트를 제조한 후 약학적으로 허용되는 상태의 정제된 조성물로서, 또는 약학적부형제와 함께 체내에 도입한다. 도입의 부위는 예를 들어, 전신, 조직 또는 이식 부위일 수 있다.
당업자라면 당해 기술로 알려진 기술을 이용하여 융합 단백질을 제조할 수 있다. 일 구현예에서는 융합 단백질의 제조, 이들을 분리하는 것 및 다른 작용 물질을 이용하거나 이용하지 않고 약학적으로 허용 되는 형태로, 예를 들어, TGF-β의 인터류킨과의 조합으로, 이들을 투여하는 것을 포함한다. 일 구현예에서는, 세포에 형질주입(transfection)시킴으로 세포를 조작해 인비보에서 융합 단백질을 제조하기 위한 벡터 및 방법을 포함하고, 상기 세포는 인비트로, 엑스 비보 또는 인비보에서 형질 주입되며, 상기 세포는 조직 이식 멤버 또는 그것과 구분되는 멤버일 수 있다. 이하의 미국 특허 출원에는, 융합 단백질을 제조하는 목적을 포함하는 여러가지 목적을 위해 인용에 의해 본 명세서에 통합되나, 모순이 있는 경우에는 본 명세서가 우선된다. 미국특허 5,227,293, 5,358,857, 5,885,808, 5,948,639, 5,994,104, 6,512,103, 6,562,347, 6,905,688, 7,175,988, 7,704,943, US 2002/0004037, 2005/0053579, 2005/0203022, 2005/0250936, 2009/0324538.
분자 융합체의 구현예는, 예를 들어, 관용 유도 항원과, 환자의 적혈구에 특이적으로 결합하고 그것에 의해 항원을 적혈구에 결합하는 적혈구 결합 부분을 포함하는 분자 융합체를 포함하고, 상기 분자 융합체는 관용 유도 항원을 포함하는 물질에 면역 관용을 일으키는데 효과적인 양으로 투여된다. 일 구현예는, 예를 들어, 폴리머, 분기형 폴리머 및 입자로 이루어진 군에서 선택되는 캐리어에 결합된 적혈구에 특이적으로 결합하는 적혈구 결합 부분을 포함하는 조성물을 포함하며, 상기 캐리어는 치료 약물과 결합된다. 상기 입자는 예를 들어, 마이크로입자, 나노입자, 폴리머솜(polymersome), 리포솜 또는 마이셀일 수 있다. 적혈구 결합 부분은, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열 번호 17, 서열번호 1 및 이들의 보존적 치환체로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열의 적어도 5개가 연속한 아미노산 잔기를 포함한 펩타이드 리간드를 포함할 수 있으며, 상기 배열은 적혈구에 특이적으로 결합 한다. 상기 적혈구 결합 부분은, 항체, 항체 단편, 압타머, scFv 또는 펩타이드 리간드를 포함할 수 있다. 분자 융합체의 구현예는, 적혈구 결합 부분 및 관용 유도 항원, 항체, 항체 단편, ScFv , 소분자 약제, 입자, 단백질, 펩타이드 또는 압타머를 포함한다.
본 발명의 바람직한 양상에 따르면, 관용 유도 항원과 Band 3 (CD233), 글리코포린 B (CD235b), 글리코포린 C (CD235c) 및 글리코포린 D (CD235d)에서 선택된 적혈구 결합 부분을 포함하는 분자 융합체가 제공된다. 상기 분자 융합체는 특히 면역 관용을 일으키기 위한 용도이다. 바람직한 분자 융합체는 이하로부터 선택된 관용 유도 항원을 포함하는 것이다: 단백질, 단백질의 부분, 인간 단백질 또는 그 부분, 비인간 단백질 또는 그 부분, 글리칸, 비인간 글리코실화를 포함하는 단백질의 글리칸, 인간의 자가면역 항원, 인간 치료용 단백질 또는 그 부분, 그리고 인간 식품의 부분, 유전성 질환에 의한 결핍 단백질, 비인간 글리코실화를 가진 단백질, 비인간 단백질, 인간에게서 자연적으로 발견되지 않는 합성 단백질, 인간 음식 항원, 인체 이식 항원 및 인체 자가면역 항원, 그리고 Band 3 (CD233), glycophorin B (CD235b), glycophorin C (CD235c), glycophorin D (CD235d)에서 선택된 적혈구 결합 부분.
개선된 약물 동태를 위한 적혈구 결합 리간드
많은 약제는 혈액 순환계에 전신적으로 전달되기 때문에, 효과적인 약물 전달이라고 하는 문제에 대한 해결책은 대부분의 경우 혈액 중의 약제를 장시간에 걸쳐 유지하는 것에 초점이 맞추어져 있다. 이 때문에, 장시간에 걸쳐 혈액 중에서 생물학적으로 이용가능한 상태로 있는 장시간 순환형(긴 반감기의) 치료제의 개발은 유효성, 안전성 및 경제적 실현가능성의 관점으로 조작된 새로운 세대의 약제를 대표하게 될 것이다.
본 발명의 구현예는, 적혈구 결합 펩타이드와 치료약과의 분자 융합체를 포함한다. 적혈구에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 치료약 또는 다른 물질과의 분자 융합체는, 치료약/물질의 순환 시간(생체 내 혈액 중의 순환 반감기)을 증대시킨다. 증대되는 시간은, 예를 들어 혈청중 반감기가 약 1.5배 내지 20배 길어질 수 있고, 당업자라면, 예를 들어, 약 3배 또는 약 6배 또는 약 3배 내지 약 6배 등, 명기한 범위 내의 모든 범위 및 값을 의도하고 있다는 것을 곧바로 이해할 것이다.
분자 융합은 예를 들어, 펩타이드의 재조합체의 부가 또는 화학적 콘쥬게이션에 의해, 치료약 또는 결합되는 분자 또는 입자의 반응성 부위에 펩타이드를 부가하는 것으로 이루어 질 수 있다. 고상 펩타이드 합성법을 이용하여 다양한 말단 반응기를 갖는 순수한 펩타이드를 높은 수율로 합성할 수 있으며, 펩타이드를 치료약에 부착시키기 위한 복수개의 콘쥬게이션 전략이 존재한다. 이 관능화(기능화)법은 단백질에 대해 사용되는 재조합법과는 다르지만, 효과(순환 반감기의 연장으로 연결되는 적혈구 결합)는 같다고 가정된다.
본 발명의 일구현예는, 치료약의 약물동태 파라미터를 개선하는 도구로서 적혈구에 특이적으로 결합하는 짧은 펩타이드 리간드를 이용하고, 치료약을 관능화(기능화)하는 것을 포함한다. 이 반감기 연장법은, 치료 약제 설계의 중요한 파라미터, 즉, 제조과정의 간편성, 모듈성 및 연장 효과 제어성을 고려하고 있다. 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여, 단백질이 새로운 기능성 또는 변화한 기능성을 포함하도록 아미노산 레벨에서 용이하게 변화시킨다. 일반적으로, 제조의 용이성, 기능적인 치료용 단백질로의 정확한 폴딩 및 당초의 요법제 그 자체에 대해 생물물리학적 변화의 최소화 등의 이유로 인해, 관능화를 위해 보다 짧은 펩타이드 도메인의 사용에 의존하는 것이, 보다 큰 폴리펩타이드 도메인을 사용 하는 것보다 바람직하다. 폴리펩타이드, 예를 들어, ERY1, 인간 적혈구 결합 리간드, 또는 항체나 항체 단편은 적혈구에 특이적으로 결합하도록 조작되어, 예를 들어, 치료약의 순환 반감기로 판정되는 생물학적 이용 가능성을 연장시킬 수 있도록 치료약에 콘쥬게이트될 수 있다.
본 명세서에 보고된 결과는, 인슐린, 프람린타이드 아세트테이트, 성장 호르몬, 인슐린형 성장 인자-1, 에리트로포에틴, 1 형 인터페론 α, 인터페론 α2a, 인터페론 α2b, 인터페론 β1a, 인터페론 β1b, 인터페론 γ1b, β- 글루코세레브로시다아제, 아데노신 디아미나제, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자, 인터류킨 1, 인터류킨 2, 인터류킨 11, 제 VIIa 인자, 제 VIII 인자, 제 IX 인자, 엑세나타이드, L- 아스파라기나제, 라스부리카제, 종양 괴사 인자 수용체 및 엔푸버타이드 등의 치료약의 약물동태학적 파라미터를 개선하는 분자 융합체를 제조할 수 있는 기회를 제공한다.
수동적 반감기의 개선법을 만들어 내려고 하는 다른 연구자에 의한 시도는, 약제의 유체역학적 겉보기 반경을 증대시키는 것에 초점이 맞추어져 있다. 신장의 사구체 여과 장치는 혈액 성분이 여과되는 체내의 주요 부위이다. 여과의 주된 결정 인자는 혈액 중의 분자의 유체역학적 반경이다. 즉, 보다 큰 분자보다 보다 작은 분자(<80 kDa)가 혈액으로부터 여과되는 정도가 크다. 연구자들은 이러한 일반화된 규칙을 이용하여, 약제가 보다 큰 유체역학적 반경을 나타내어 그 결과 보다 긴 반감기를 나타내도록, 주로 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같이 큰 분자량의 수용성 폴리머와의 화학적 컨쥬게이션에 의해 약제를 개량하여 왔다. 이 방법의 성공은 현재 임상에서 제공되는 많은 PEG화 단백질 및 소분자 치료법에서 눈에 띈다(Pasut and Veronese, 2009; Fishburn, 2008). 특히 이식체 또는 융합체의 유체역학적 반경의 증대가, 많은 경우, 순환 반감기를 길게 하는데 효과적이라고 해도(Gao, Liu, et al., 2009), 이들 방법은 제조 과정 및 생물학적 주요 기능의 유지에 있어서 과제를 제시한다. 콘쥬게이션 반응에서의 이질성은, 주로 부위-비특정 화학작용을 이용하는 것이며, 다양한 생물 활성을 갖는 복잡한 산물의 혼합물을 야기할 수 있다. 상세한 생화학적 평가는, 주로 균일한 치료 제품을 유지하기 위해 정밀한 정제 방법이 수반된다(Huang, Gough, et al., 2009; Bailon, Palleroni, et al., 2001; Dhalluin, Ross, et al., 2005). 더욱이, 분지된 PEG 등의 큰 부분의 부착물을 단백질의 반응 영역에 결합시키면 수용체 친화성이 저하될 수 있다(Fishburn, 2008).
다른 연구자에 의한 또 다른 연구는 약제의 순환을 길게 하기 위해, 치료용 단백질을 알부민에 결합시켰다(Dennis, 2002; Walker, Dunlevy, et al., 2010). 신장 여과에 있어서 상술된 일반적인 규칙을 고려하여, Dennis 등은, 치료제가 혈액 중의 다른 단백질(혈청알부민 등)에 결합하도록 조작함으로써 치료제의 겉보기 크기를 증대시켜 약제 제거 속도가 저하할 것이라는 가설을 세웠다. 이 방법에서는, 약제가 혈류에 투여되었을 경우에만 큰 분자 사이즈가 된다. 친화성-성숙한 혈청알부민-결합 펩타이드를 항체 단편에 부가하자, 마우스에서 그 순환 시간이 24 배 길어졌다(Dennis, 2002). 이 방법은 효과적이지만, 태아성 Fc 수용체(neonatal Fc receptor)(FcRn)에 의한 알부민 재이용의 동태 및 기능성을 위한 시스테인 구속성(cystein-constrained) 환형 펩타이드의 사용에 의해 복잡하게 된다. Walker 등은, 2002 년에 Dennis 에 의해 얻어진 결과, 즉 혈청알부민 친화성을 단백질에 부여하면 그 반감기가 길어지는 것을 증명하였다. Walker 등이 기술한 방법은, 단백질 약제에 큰 항체 단편의 재조합체 첨가를 포함하는 것이며, 이것은 구조상 및 제조상 복잡함의 원인이 될 수 있다. Dennis 및 Walker 의 방법은 명확하고 효과적이지만 기능성 때문에 복합 환형 도메인 또는 큰 도메인을 사용하기 때문에 복잡하다. Dennis 등에 의해 발견된 펩타이드는 알부민에 대해 고친화성을 나타내지만, 사용 전에 환형 구조를 정확하게 형성해야 하는 물리적 제약을 수반한다. 보다 벌키한 접근법으로, 보다 큰 항체 단편을 융합하는 Walker 의 방법은, 원래 복잡한 폴딩 구조를 가지거나 또는 발현수율이 낮은 단백질에는 대응할 수 없는 경우가 있다.
단일 사슬 항체
본 발명의 실시 형태는, scFv와 적혈구에 특이적으로 결합하는 펩타이드와의 분자 융합체이다. scFv는 치료약으로서 사용될 수 있고, 적혈구 결합 펩타이드와의 조합을 통해 그 순환 반감기를 연장하는데 사용될 수 있고 체 구분(body compartments)에 액세스를 제공할 수 있다. 재조합 항체 및 재조합 항체 단편은 생물 제제 산업에 있어서 치료제로서 유망하다(Sheridan, 2010).
단일 사슬 가변 프래그먼트(scFv) 항체 단편은, 전체 길이 IgG 의 전항원 결합 도메인을 포함하지만 힌지(hinge) 및 정상 단편 영역이 없다(Maynard and Georgiou, 2000). scFv의 재조합체 구축은, 가변중쇄(VH) 도메인 과 가변경쇄(VL) 도메인을, 글리신 및 세린의 탠덤 리피트(예를 들어 (GGGGS)4)(서열번호 18)로 이루어진 짧은 폴리펩타이드 링커와 융합하는 것을 포함한다. scFv's 의 단순성은 치료 용도에 바람직한 것이지만, 그 주된 문제는 분자량이 26 내지 28 kDa 로 비교적 작기 때문에 짧은 순환 반감기를 나타내는 것이다(Weisser and Hall, 2009).
scFv의 설계에 일반적으로 사용되는 글리신-세린 링커는 원래 비기능성이며, 엄밀히 말하면 정확한 VH-VL폴딩을 확보하는 물리적 가교로 존재하므로, 본 발명에서는, 혈액 중의 적혈구에 결합하는 기능을 나타내는 링커 도메인을 시험하였다. 이 때문에, 조작 scFv는, VH-VL도메인에 의해 그 고유 항원에 대한 친화성 및 그 링커 도메인의 적혈구에 대한 친화성을 나타내는 다기능성 및 이중특이성일 수 있다. 적혈구에 대한 결합에 있어서, 조작 scFv는 동일한 기능성을 갖는 다른 모델 단백질에 대해 증명된 것과 같이, 보다 긴 순환 반감기를 나타낸다. scFv 항체 단편은 본 명세서에 기재된 링커를 가질 수 있고, 또는 당업자에게 잘 알려진 다른 링커일 수도 있다. 대체적인 구현예에서는 scFv의 링커 영역에 조작된 유리 시스테인기를 공급하고, 시스테인 티올을 화학적 콘쥬게이션에 의해 적혈구 결합 리간드를 결합하는데 사용한다.
조작된 scFv 항체의 설계는 적혈구 결합 펩타이드의 간격 뿐만 아니라 링커 도메인의 길이의 중요성에 초점이 맞추어진다. 야생형 변종은 (GGGGS)4 링커(서열번호 18)와 결합된 항원에 대해 설계되고 검증되었기 때문에, 후속 변이체는 최소 길이가 20 아미노산인 링커에 대하여 설계되었다. 상기 링커 도메인은 scFv의 정확한 폴딩을 정확한 삼차 구조로 조절할 수 있으므로, 2개의 ERY1를 포함한 변이체를 설계하였다. REP 변이체는, 링커 도메인의 중앙에 정확한 수의 Gly 잔기 및 Ser 잔기에 끼인 ERY1 펩타이드를 포함하여, 부모의 20 아미노산 링커 길이를 유지하고 있다. 소수성의 ERY1 펩타이드가 선형이 되지 않고, 보다 짧은 집합 도메인에 클러스터화 할 수 있는 경우에는 REP의 링커 길이가 짧을 수 있고, 결과적으로 정확한 폴딩을 방해할 우려가 있다. 이러한 이유로부터, ERY1 펩타이드가, 32 아미노산으로 연장된 부모 링커 도메인의 중앙에 들어가도록 INS 변이체를 설계하였다. ERY1 펩타이드가 자유 N 말단을 포함하는 것이 알려짐에 따라, 제약이 있는(constrained) 폴리펩타이드 입체 구조에 있어서의 그 존재가 적혈구 결합에 영향을 주는지 여부는 밝혀내지 못하였다. 이런 잠재적 행동의 가능성을 검토하기 위해, 합성 ERY1 펩타이드와의 화학적 콘쥬게이션에 의해 scFv 변형을 제작하였으며, 이로 인해 펩타이드의 N 말단은 자유 상태로, C 말단은 scFv에 콘쥬게이트되어 있다.
이런 방법으로, 적혈구 결합 펩타이드의 수, 그리고 scFv의 적혈구 결합 능력을 콘쥬게이션 반응 동안에 화학양론적으로 조정할 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시한 적혈구 결합 펩타이드를 포함하도록 ScFv를 조작할 수 있다. 구현예는 1 내지 20의 수많은 리간드를 함유하는 scFv를 포함한다; 당업자라면, 예를 들어 2 내지 6 등의 명기한 범위 내의 모든 범위 및 값을 의도하고 있는 것을 곧바로 이해할수 있을 것이다.
구현예는, 예를 들어, scFv에 결합된 OVA에 대해 관용을 일으키는 것을 예시하고 상세하게 설명하고 있는 실시예 6에서와 같이, 관용을 유도하는 분자 융합체를 제조하기 위해 관용 유도 항원에 콘쥬게이트된 scFv를 포함한다. 실시예 6은 또한, 항원의 면역 인식 에피톱에 재조합적으로 융합된 scFv 단백질 구조체를 제조하기 위한 물질 및 방법에 대해서도 설명한다. 상기 scFv는 적혈구의 인식에 관한 것이다. 상기 항원은, 본 명세서에 설명된 항원, 예를 들어, 관용 유도 항원이다. 본 발명에 보고된 실시예는, 마우스의 TER119 scFv를 구조체의 항체 도메인으로 사용한 마우스 모델을 이용한 결과에 대해 기재한다. TER119는 마우스 적혈구에 결합하는 항체이다. 상기 TER119 항체 도메인은 다른 항체 도메인, 예를 들어 사람 또는 다른 동물의 적혈구에 대한 도메인으로 치환할 수 있다. 예를 들어, 10F7 항체 도메인을 사용하고 사람 적혈구에 결합할 수 있는 항체-항원 구조체를 제조할 수 있다. TER-119 유래의 scFv와, OVA의 면역 우성(immunodominant) MHC-I 에피톱, 크로모그라닌 A 미모톱(chromogranin-A mimotope) 1040-p31 및 전구인슐린(proinsulin)을 포함하는 실시예 6에 보고된 3종의 항원과의 융합체를 추가로 제조하였다.
실시예 13은 동물 모델의 테스트에 대한 구현예, 그리고 사람에 대한 반응의 구현예를 포함하는 scFv의 다른 구현예에 대해 기재한다. 상기 구현예는 단백질 레벨 TER119-SIINFEKL, TER119-ChrA, 및 TER119-프로인슐린에 관한 것을 포함한다. 이것은 또한 유전자레벨 TER119-SIINFEKL, TER119-ChrA, TER119-프로인슐린, TER119-uricase, TER119-InsB9-23, TER119-ISQAVHAAHAEINEAGR (서열번호 80), TER119-H-2kb, TER119-H-2kd, 10F7-SIINFEKL, 10F7-ChrA, 10F7-프로인슐린, 및 10F7-uricase에 관한 것을 포함한다.
적혈구와 종양 맥관구조(tumor vasculature)과 같은 특정 부위와의 결합
적혈구에 결합하도록 조작된 치료제는, 약제의 반감기를 길게 할 뿐만 아니라, 적혈구에 선택적으로 결합해 체내의 특정의 부위에 국재화시킬 수 있다는 점에서도 유용하다. 고형암(solid tumor)의 처치로는, 간동맥 화학색전 요법(TACE)을 이용하여 종양으로의 혈액 공급을 제한해, 종양의 증식에 필요한 영양소와의 접촉을 방해한다. TACE의 처치는, 종양의 혈액 공급의 상류에 폴리머 고체 마이크로입자의 외과적 삽입을 포함한다. 상기 마이크로입자가 종양 혈관(tumor vascular) 바닥(bed)에 도달하면, 혈관망에 물리적으로 포착되어 종양으로의 혈액 공급 차단이 일어난다.
TACE 리포트에 따르면, 일 구현예는 적혈구 결합 펩타이드를 포함하도록 종양 호밍(tumor-homing) 치료제의 조작을 통해, 혈액 중에 순환하는 자가 적혈구를 종양 색전술을 위한 천연의 마이크로입자로서 사용한다. 이 방법에서는, 치료제는 종양 혈관 바닥에 국재되고, 혈관에 결합하여 지나가는 적혈구를 리크루트함으로써 종양 덩어리로의 혈액 흐름을 제한하고 차단한다. 이러한 처치는 고전적인 TACE 보다 침습성이 낮다. 상기 약제는 단순하게 정맥내 주사를 주사해 색전술 입자로서 혈액 중에 이미 존재하는 천연의 적혈구를 사용하기 때문이다. 종양 결합 또는 종양 호밍이라고하는 용어는 종양 혈관계 또는 종양 세포의 혈액 컴파트먼트로부터 접촉할 수 있는 성분에 결합하는 펩타이드를 말한다.
암연구 분야에서는 특이적인 종양 호밍 요법제가 발견되어 알려져 있다. 종양의 생리 활성 표적화의 패러다임(paradigm)은 종양 환경에서 특이적으로 발현하는 단백질 마커에 대한 결합을 필요로 한다. 이것에는 RGD 의존성 인테그린(RGD-directed integrins), 아미노펩티다제 A(aminopeptidase-A) 및 아미노펩티다제 N(aminopeptidase-N), 엔도시알린(endosialin), 세포 표면 뉴클레올린(nucleolin), 세포 표면 아넥신-1(annexin-1), 세포 표면 p32/gC1q 수용체, 세포 표면 프렉틴 1(plectin-1), 피브로넥틴 EDA 및 EDB, 인터류킨 11 수용체 α, 테나신-C(tenascin-C), 엔도글린/CD105, BST-2, 갈렉틴-1, VCAM-1, 피브린 및 조직 인자 수용체가 있지만 이것만으로 한정되는 것은 아니다. (Fonsatti, Nicolay, et al., 2010; Dienst, Grunow, et al., 2005; Ruoslahti, Bhatia, et al., 2010; Thijssen, Postel, et al., 2006; Schliemann, Roesli, et al., 2010; Brack, Silacci, et al., 2006; Rybak, Roesli, et al., 2007) 이들의 분자 중 어느 하나를 표적으로 하는 요법제는 적혈구 결합 펩타이드를 종양 혈관계로 운반하여 특이적 폐색을 일으키는 벡터일 수 있다.
일 구현예는, 암성 세포 또는 종양 혈관계 또는 종양 혈관계의 성분, 예를 들어, 내피하층(일부가 종양의 혈액에 노출되어 있다)의 단백질 또는 종양 내피 세포의 표면의 단백질에 특이적으로 결합하는 제2 리간드와 콘쥬게이트된, 적혈구에 특이적으로 결합하는 제1 리간드이다. 상기 리간드는 환자(예를 들어, 혈류)에 도입되는 약학적으로 허용 되는 조성물의 일부분일 수 있다. 상기 리간드는 적혈구에 결합하고, 상기 종양 호밍 리간드는 종양 또는 종양 혈관계 부위 또는 거기에 가까운 부위 혹은 암성세포에 결합한다. 상기 적혈구는 표적화 부위에 모여, 예를 들어, 혈관의 색전에 의해 표적 부위와 영양소의 접촉을 차단한다. 색전술이 적혈구의 물리적 크기에 의해 결정되며 역학적이라는 것을 고려하여 색전술은 급속하게 처치된다.
고형암은 그 혈관공급에 크게 의존하고 있으며, 혈관공급의 증가를 차단하기 위해, 또는 그 혈관 공급의 흐름을 차단하기 위해 생체 분자 치료제 및 물질 치료제가 개발되어 왔다. 일 구현예는, 이미 알려져 있거나 알려져 있지 않은 부위의 원발종양 또는 전이에 있어서, 고형암의 혈관계를 신속히 폐쇄하기 위하여 전신에 주사되는 생체 분자 제제 또는 생체 분자-나노입자 제제이다.
종양 색전술은, 입자 및 생체 분자 기반 방법의 사용 등 몇 가지 방법으로 행해져 왔다. 폴리비닐알코올로 만들어지진 것을 포함하는 생체 적합 물질 입자는, 직경이 종양 미소 혈관, 예를 들어 직경 50~500 마이크로미터보다 큰 것으로, 경도관 동맥색전술 또는 TACE의 임상에서 사용하기 위하여 개발되어 왔다(Maluccio, Covey, et al,, 2008). 유사한 접근법으로서 주로 간세포암의 처치에 사용되는 간동맥 화학색전요법(TACE)에 있어서 서방성을 위해 입자 내에 도입된 화학요법약이 있다(Gadaleta and Ranieri, 2010). 양쪽 경우 모두, 중재 방사능 연구자에 의한 방사선 사진술에 의하여 동맥 순환계에 입자가 주사되면, 이들 입자는 종양 혈관계에 흘러들어 그것을 폐색하고 흐름을 차단한다(Maluccio, Covey, et al, 2008). 이러한 국소적 접근법을 이용하는 경우, 카테터의 위치로 인하여 직접 표적이되는 종양만 치료되고, 입자는 혈관 중에서 용이하게 표적화할 수 없기 때문에, 이미 알려져 있거나 알려져 있지 않은 부위로의 전이 등에 의한 다른 종양은 치료되지 않는다. 최근 들어, 정상적인 혈관계에 존재하지 않는 혈전증 인자(thrombosis factor) 및 종양 혈관내피 표적 양쪽 모두를 인식하는 이중 특이성 항체를 이용하는 생체 분자 접근법이 검토되고 있다. 항체는 종양 혈관계에 특이적으로 결합한 후 축적되고, 종양 혈관 내에서 응혈의 형성을 야기해 혈관을 차단한다; 이 작용은, 항체가 종양을 표적으로 했을 경우에만 유도되었다(Huang, Molema 등, 1997). 이러한 생체 분자 접근법은, 특이적 종양 혈관의 특징(signature)을 동정할 수 있는 경우에, 점적 정주로부터 원발종양 및 2차 종양의 양쪽 모두를 표적으로 하는 이점이 있다. 단, 이 접근법은, 종양에 대해 신속한 물리적 폐색을 제공하지 못하는 약점이 있다.
본 발명의 구현예는, 환자의 종양을 색전하는 방법으로서, 표적화 부분에 결합하는 적혈구 결합 부분을 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 표적화 부분은 종양 및 종양 미소혈관으로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적을 향한 항체, 항체 단편 또는 펩타이드이며, 적혈구 결합 부분은 적혈구에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 항체, 항체 단편 또는 압타머를 포함하는 것인 방법을 포함한다. 펩타이드는, 예를 들어, 본 명세서에 기재되어 있는 서열일 수 있다.
항원 특이적 면역학적 관용
치료약의 약물 동태학적 거동을 개선할 뿐만 아니라, 적혈구 친화성이 항원 특이적 관용을 일으키는 방법으로 사용될 수 있다는 것이 발견되고 있다. 몇 가지 구현예를 실시예에 기재한다. 본 발명에서 증명된 것과 같이 면역 관용 유도는 적어도 10 배, 즉, 적어도 100배, 적어도 1000배, 또는 10,000배 이상으로 항원에 대한 순환 항체의 억제, 또는 항원에 대한 순환 항체의 감소를 나타낼수 있다. 면역 관용 유도는 질병의 예방, 치료, 또는 진행 지연, 이식된 조직 거부의 감소 또는 제거, 그리고 물질에 대한 알러지 반응의 감소 또는 제거를 할 수 있다.
실시예 3 및 10 내지 12는, 사람의 행동 예측 마우스 동물 모델에서 어떻게 관용화가 형성되는지 보여준다. 실시예 3은 적혈구 표면과 결합하는 펩타이드 리간드에 연결된 테스트 항원(난백알부민)을 이용한 관용 형성 과정을 나타낸다. 실시예 10 내지 12는 실시예 3의 결과를 증명하고, scFv와 결합된 난백알부민과 펩타이드성 리간드에 결합된 아스파라기나제를 사용한 관용 형성을 보여주는 추가적인 실시예를 나타낸다. 추가적 실시예는 실시예 12에서 기존의 면역거부에 대한 반대적 관용 형성을 나타낸다. 따라서, 구현예는 아스파라기나아제, 항원성 아스파라기나아제 단편, 아스파라기나아제의 항원성 미모톱 및 적혈구 결합 부분을 포함하는 면역관용 유도를 위한 융합 분자를 포함하며, 적혈구 결합 부분은 예를 들어, 밴드 3, 글리코포린 A, 글리코포린 B, 글리코포린 C 또는 적혈구 표적 그룹의 기타 멤버로 이루어진 군에서 선택되는 표적에 특이적으로 결합한다. 상기 적혈구 결합 부분은, 예를 들어, 항체, 항체 단편, scFv, 펩타이드계 리간드 및 압타머로 이루어진 군으로부터 그리고/또는 ERY19, ERY59, ERY64, ERY123, ERY141, ERY162, ERY19', ERY59', ERY64', ERY123', ERY141', 및 ERY162'로 구성된 군(group) 및 이들의 보존체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 융합 분자는, 아스파라기나제 최초 투여 이전에 예방을 위해서, 아스파라기나제에 의한 치료 과정 중, 및/또는 아스파라기나제 치료 과정 후에 적용될 수 있다. 아스파라기나아제 약품에 대한 면역 반응이 관찰되기 전, 또는 상기 반응이 관찰 된 후에 상기 융합 분자는 적용될 수 있다.
실시예 3에서, 마우스 적혈구에 결합하는 펩타이드, ERY1이 발견되었다. ERY1과 시험용 항원, 난백알부민(OVA)과의 분자 융합체가 제작되었다. 이 융합체는 인비보에서 적혈구에 특이적으로 결합하고, 혈액 또는 혈관계 분자 등의 다른 분자에는 결합하지 않았다. 긴 순환 반감기가 관찰되었다. ERY1-OVA 적혈구 결합은, 항원 제시 세포(APC)에 의한 OVA 면역 우성 MHC I 에피톱(SIINFEKL)의 효율적인 교차 제시(cross-presentation) 및 대응하는 반응성 T세포의 교차 감작(cross-priming)을 일으키는 것이 관찰되었다. ERY1-OVA는 OVA에 비해 훨씬 많은 수의 아넥신-V+ 증식 OT-I CD8+ T세포를 유도하였으며, 이는 최종적으로 클론 제거를 야기하는 아포토시스가 불가피하다는 것을 나타낸다. 확립된 OT-I 챌린지-투-톨러런스 모델(OT-I challenge-to-tolerance model)(Liu, Iyoda 등, 2002)(도 2)을 이용하여, ERY1-OVA 가 매우 강력한 세균 유래의 아쥬반트를 이용한 백신 개재성 항원 챌린지에 대해서도 후속 면역 반응을 방해하는 것이 증명되었다. ERY1-OVA의 정맥내 투여의 결과, 유입 영역 림프절(도 2; 도 12b에서 게이팅) 및 OT-I CD8+ T세포 집단이, LPS에 의한 항원 챌린지 전에 언모디파이드 OVA(unomdified OVA)를 투여한 마우스(도 2c)에 비해 현저하게 감소한 것으로부터, 제거성 관용화가 증명되었다. ERY1-OVA가 투여된 마우스에 나타난 이러한 효과적인 클론 제거는, OT-I CD8+ T세포의 교차 감작(cross-priming)의 증강이라고 하는 전술한 관찰 결과를 지지하는 것이고, 교차 감작이 공자극 분자의 APC 제시의 부재에서 일어나 제거성 관용을 야기하는 것을 나타낸다. ERY1-OVA의 정맥내 투여에 의해, OVA 처치 마우스와 비교하여, 제1 항원 투여로부터 19일 후, OVA 특이적 혈청 IgG의 레벨은 39.8배 낮아졌다(도 3). 항원 특이적 면역 관용의 유도를 한 층 더 검증하기 위해, OT-I 챌린지-투-톨러런스 모델을 유리한 결과를 나타낸 OVA 발현 종양 이식편 모델(도 2)과 결합시켰다. 이 실시예에서 설명된 결과는, ERY1-OVA에 의한 적혈구 결합은 항원 특이적 면역 관용을 유도하는 것을 보여준다. 이것은, 강력한 아주반트 챌린지 및 이종 항원을 발현하는 이식된 세포 이식편에 대한 반응을 나타낸다. 게다가 관용화는, 직접적인 CD4+ T세포의 제어와 독립적으로, 순환 적혈구 상에 존재하는 항원과의 상호작용을 통한 반응성 CD8+ T세포의 기능적 불활성화 및 제거에 의해서 이루어졌다. ERY1, 마우스 적혈구 결합 펩타이드를 이용한 상세한 실험 결과로부터, 인간 적혈구 결합 펩타이드를 이용하면 사람에서도 같은 결과가 예측되며, 몇개의 예가 본 명세서에 교시된다. 또한, 펩타이드 리간드가 효과적인 것으로 나타났기 때문에, 예를 들어, 항체, 항체 단편 또는 압타머와 같은 다른 적혈구 결합 리간드를 본 발명에 기재한 표면 단백질 또는 항원과 같은 적혈구의 표면 분자와 결합시키는 콘쥬게이트를 통해 유사한 결과를 얻을 수 있다.
실시예 10은 관용유도 항원을 적혈구와 결합하는 scFv와 융합시키고, 상기 융합분자를 환자에게 투여하기 위한 약제로서 조제하는 것에 의해 관용유도 항원에 대한 관용 형성에 대해 상세하게 설명한다. 실시예 10은 상기 펩타이드 SIINFEKL (서열번호 3)과 같은 OVA 의 MHC-I 면역우성 도메인에 대한 관용 유도를 나타낸다. 상기 항원은 마우스 적혈구에 결합하는 것으로 알려진 scFv TER-119과 융합되었다. 유세포 분석기로 측정한 형광 CFSE의 희석에 의해 판정하면, OT-I CD8+ T세포의 증식은, ERY1-OVA 또는 OVA와 비교해 TER119-SIINFEKL가 투여된 마우스에서 현저하게 증강된 것으로부터(도 8), 적혈구 결합에 의해 가용성 항원 SIINFEKL과 비교해 항원 특이적 CD8+ T세포의 교차 감작(cross-priming)이 증강되었음을 알 수 있다. 또한, 상기 데이터는 적혈구에 결합하도록 설계된 항체 단편 및 면역 에피톱의 표시는 면역세포에 교차 감작하는 항원 특이적 T세포에 의하여 효율적으로 처리되는 것을 보여준다. 교차 제시(ross-presentation) 및 교차 감작(cross-priming)의 결과는, 아포토시스 세포 유래 항원을 탐색하는 APC에 의한 MHC I의 관용 유도 항원 제시에 관한 다른 연구 결과와 일치한다(Albert 1998, Green 2009). OVA와 비교하여 TER119-SIINFEKL 및 ERY1-OVA는 훨씬 많은 수의 아넥신-V+ 및 PD-1+ 증식 OT-I CD8+ T세포를 유도하여(도 13), 최종적으로 클론 제거를 야기하는 아포토시스가 불가피하다는 것을 보여준다. 이런 증식 CD8+ T세포의 표현형은 APC에 의해 제어된 항원 특이적 T세포 수용체의 결합이 염증 반응을 유도할 수 없다고 보고된 다른 OT-I 입양전달 모델과 일치한다(Bursch, Rich 등, 2009년).
실시예 10에 따르면, 백신 매개 항원(vaccine-mediated antigen) 시험에 대한 후속 면역 반응을 막는 TER119-SIINFEKL 및 ERY1-OVA의 능력은 매우 강한 세균 유래 아쥬반트 조건 하에서도 나타났다. scFv 또는 적혈구 결합을 위한 펩타이드 리간드를 가진 융합 분자는 관용을 형성하기에 효과적이었다.
실시예 11은 치료 단백질 및 잠재적인 치료 단백질에 대한 항원 특이적 면역 관용의 유도가 가능하다는 것을 보여준다. 많은 치료 단백질은 상기 치료 단백질의 임상적 사용을 위험하게 하거나 비효율적으로 만드는 면역 반응을 야기한다. 아스파라기나제는 급석 림프구성 백혈병 치료를 위해 사용된 미생물 유래 치료 효소(microbially-derived therapeutic enzyme)이며, 여전히 위험한 면역 반응을 유도하여 반복된 사용이 금해지고 있다. 마우스 모델이 사용되었다. 아스파라기나제의 융합 분자 및 적혈구 결합 부분 (상기 펩타이드 ERY1)을 마우스에 투여하고, 상기 임상 약물 아스파라기나아제로 처치한 마우스와 비교하였다. 상기 약물 아스파라기나아제는 항체를 생산했지만 상기 융합분자는 생산하지 않았다; 이 실험은 항체 레벨이 관용화의 척도로 사용될 수 있다는 것을 증명하였다. 관용화는 임상 약물 마우스에 융합분자를 투여하고 이어서 아스파라기나아제의 반복적 투여를 통해 증명되었는데, 상기 약물의 반복적인 투여를 통한 공격적인 실험에서도, 강력한 항체 반응이 없다는 것이 관찰되었다. 대조적으로, 융합 분자가 아닌 상기 의약품을 투여받은 마우스는 면역 반응성 및 심각한 과민성 반응을 보였다.
실시예 12는 면역 반전(immunoreversal)이 가능하다는 것을 나타낸다. 단백질에 대해 면역반응을 보이는 마우스는 상기 단백질에 잘 견딜 수 있도록 처치되었다. 실시예 11의 아스파라기나아제 마우스 모델이 사용되었다. 상기 약물 아스파라기나아제에 대해 면역 반응성을 보이는 마우스는 상기 융합 분자 (아스파라기나아제-및-적혈구 바인더)로 처치되었으며 상기 약물 아스파라기나아제에 대해 관용화 되었다.
그에 반해서, 종래의 보고는 적혈구 표면에 항원 결합을 통해 면역거부반응을 일으켜 백신을 제조하고, 또 다른 보고는 백신을 제조하기 위해 적혈구 내에 봉입된 항원을 사용하고 있다. 예를 들어, 적혈구 내에 항원을 봉입하면 그것에 의해 백신이 제조된다(Murray et al,, Vaccine 24: 6129-6139 (2006)). 또는, 적혈구 표면에 콘쥬게이트된 항원은 면역원성을 가지며, 백신으로서 제안되었다(Chiarantini et al,, Vaccine 15(3): 276-280 (1997)). 이들 참고 문헌은, 적혈구 운반 접근법이, 아쥬반트를 갖는 통상의 백신으로 얻을 수 있는 것과 같은 면역 반응을 유도하는 것을 나타낸다. 다른 연구자들은, 간에서의 쿠파(Kupfer) 세포에 의한 제거를 높이도록 적혈구 표면을 변화시키기 위한 몇개의 수단을 WO 2011/051346에서 개시하고 있는데, 관용을 유도하려면 적혈구 내에 배치가 필요하다고 보고하고 있다. 상기 출원은 또한, 글리코포린 A등의 적혈구 표면 단백질에 결합하는 항체도 개시하고 있지만, 이는 쿠퍼세포에 의한 제거를 높이기 위해서 적혈구 상에 면역 복합체를 만드는 것을 목적으로 한 것이다.
본 발명에 기재된 구현예는, 면역 관용을 일으키는 방법이며, 관용 유도 항원과, 환자의 적혈구에 특이적으로 결합하고, 그것에 의해 항원을 적혈구에 결합시키는 적혈구 결합 부분을 포함하는 분자 융합체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 해당 분자 융합체는 관용 유도 항원을 포함한 물질에 대해 면역 관용을 일으키기에 효과적인 양으로 투여되는 것인 방법을 제공한다. 적혈구 및 환자는, 적혈구에 다른 변화를 일으키는 처치를 받지 않을 수 있으며, 또한 적혈구 가교, 화학적 공유결합 컨쥬게이션, 코팅 및 펩타이드의 특이적 결합 이외의 다른 변화를 야기하는 처치를 받지 않을 수 있다. 분자 융합체는, 항원에 직접 공유결합한 적혈구 결합 부분을 포함하거나, 또는 이들로 이루어질 수 있다. 분자 융합체는, 항원에 결합하는 입자에 부착된 적혈구 결합 부분을 포함할 수 있다. 입자는, 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 폴리머솜 또는 마이셀을 포함할 수 있다. 관용 유도 항원은, 치료용 단백질의 일부분, 예를 들어, 혈액 인자의 산생 결여 병을 앓는 환자에게 투여되는 혈액 인자를 포함할 수 있다. 구현예는 이하의 예를 포함한다: 환자는 사람이며 관용 유도 항원은 환자가 유전적으로 결손하고 있는 인간 단백질인 예; 환자는 사람이며 관용 유도 항원은 비인간 단백질의 일부분을 포함하는 예; 환자는 사람이며 관용 유도 항원은 사람에게서 천연적으로 발견되지 않는 조작된 치료용 단백질의 일부분을 포함하는 예; 환자는 사람이며 관용 유도 항원은 비인간 형태 글리코실화를 포함한 단백질의 일부분을 포함하는 예; 관용 유도 항원은 인간 자가면역질환 단백질의 일부분을 포함하는 예; 관용 유도 항원은 동종 이식에 있어서의 항원인 예; 관용 유도 항원은 사람이 먹는 음식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질의 일부분을 포함하는 예; 및/또는 적혈구 결합 부분이 펩타이드, 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 예. 구현예는, 적혈구 결합 부분이, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 1 및 이들의 보존적 치환체로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열의 적어도 5개가 연속한 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드를 포함하며, 상기 서열은 적혈구에 특이적으로 결합하는 관용화 물질 및 방법을 포함한다.
상기 분자 융합체는 상기 적혈구의 내부 또는 외부에 상기 항원이 위치하도록 선택될 수 있다. 특정 메커니즘에 한정되지 않지만, 하기 이론으로 실시될 수 있다. 사람의 경우, 매일 약 1% 정도의 적혈구가 아폽토시스(에립토시스(eryptotic)) 및 제거되고, 많은 수의 세포 및 이들 단백질은 상기 적혈구 자기 항원에 대한 관용을 유지하도록 처리된다. ERY1 펩타이드 또는 사람 적혈구 결합 펩타이드의 사용에 의해 적혈구에 결합하도록 조작된 항원, 적혈구 결합 단일 사슬 항체 또는 항체, 적혈구 결합 압타머, 또는 다른 적혈구 결합제 또한, 동일한 관용 유도 반응을 일으킬 수 있다. Miller 등에 의해 개발된 현재의 최신의 방법(상기 참조)이, 재투여를 위해 도너 비장 세포를 채취해 반응시킬 필요가 있다는 점에서 번거롭기 때문에, 본 발명의 비공유 적혈구 결합 방법(non-covalent erythrocyte-binding method)은 보다 간소한 대체법이다. ERY1-적혈구, 또는 사람 적혈구 결합 펩타이드-적혈구, 또는 다른 친화성 생체 분자(단일 사슬 항체, 항체 또는 압타머 등)의 상호작용은 인비보에서 항원 콘쥬게이트 또는 융합체의 도입 후에, 자연스럽게 발생되며, 조작된 항원은 주사에 의해 단순하게 투여되며, 결합은 인-시츄(in situ)에서 일어난다.
경우에 따라, 관용 유도 항원은 관용화가 요구된 단백질 치료제로부터 유래되었다. 예로서 야생형 단백질 약제, 예를 들어, 환자에게 이들의 단백질이 결손하고 있었기 때문에, 중추성 관용을 확립할 수 없었던 인간 제 VIII 인자 또는 제 IX 인자, 또는 사람에게 사용되는 비인간 단백질 약제를 들 수 있다. 다른 예로서, 제조로 인하여 비인간형 글리코실화(glycosylate) 되는 단백질 약제, 또는 바람직하지 않은 면역반응을 유발할 수 있는 넌네이티브(non-native) 서열을 갖는 조작된 단백질 약제를 들 수 있다. 자연적으로 인간에게 없는 조작된 치료용 단백질의 관용 유도 항원으로 예를 들어, 약리학적 특성을 향상시키기 위한 변이체를 갖는, 조작된 변이체를 갖는 인간 단백질이 있다. 비인간 형태 글리코실화를 포함한 관용 유도 항원에는 효모 또는 곤충 세포에서 산생된 단백질이 있다.
구현예는 소정 빈도 X 또는 용량 Y로 단백질을 투여하며, 그 단백질 유래의 항원을 보다 낮은 빈도 및/또는 용량, 예를 들어, 0.2X 이하의 빈도, 또는 0.2Y 이하의 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 당업자라면, 예를 들어, 0.01 또는 005 X 또는 그 사이에 있는 범위 등, 명기한 범위 내의 모든 범위 및 값을 의도하고 있는 것을 곧 바로 이해할 것이다.
구현예는, 단백질이 결손된 사람에게 투여되는 단백질 유래의 관용 유도 항원을 선택하는 것을 포함한다. 결손이란, 단백질을 투여받는 환자가 단백질을 자연적으로 충분히 생성하지 못하는 것을 의미한다. 게다가, 상기 단백질은 환자에게 유전적으로 결손된 단백질일 수 있다. 이러한 단백질에는, 예를 들어, 안티트롬빈-III, 단백질 C, 제 VIII 인자, 제 IX 인자, 성장 호르몬, 소마토트로핀, 인슐린, 프람린타이드 아세트에이트, 메카세르민(IGF-1), β- 글루코 세레브로시다제, 알글루코시다제-α, 라로니다제(α-L-이두로니다제), 이듀르스파제(이두로네이토-2-술파타제), 가르술파제, 아가르시다제-β (α- 갈락토시다제), α-1 프로테이나제 저해제 및 알부민이 있다. 따라서, 구현예는 적혈구 결합 부분 및 하나 이상의 항원, 항원성 단편, 또는 이러한 단백질의 하나 또는 그 이상의 항원성 미모톱(antigenic miomotpe)을 포함하는 면역관용 유도(tolerogenesis)를 위한 융합분자와 함께, 적혈구 결합 부분 이 특이적으로 결합하는 예를 들어, 글리코포린 A, 또는 적혈구 표적 그룹의 밴드 3, 글리코포빈 B, 글리코포빈 C 또는 그 외로부터 선택되는 표적을 포함한다. 상기 적혈구 결합 부분은, 예를 들어, 항체, 항체 단편, scFv, 펩타이드 리간드 및 압타머로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
구현예는 상기 치료용 항체 및 항체 조각 및 항체 및 항체 조각을 포함한 융합 단백질을 포함하는 항체성(antibody-like) 분자로부터 관용유도 항원을 선택하는 것을 포함한다. 이들은 비인간 (예를 들어 마우스) 항체, 키메라(chimeric) 항체 및 인간화(humanized) 항체를 포함한다. 인간화 항체에 대한 면역 반응은 사람에게서 관찰되고 있다 (Getts, 2010). 따라서, 구현예는 적혈구 결합 부분 및 하나 이상의 항원, 항원성 단편, 또는 이러한 단백질의 하나 또는 그 이상의 항원성 미모톱(antigenic miomotpe)을 포함하는 면역관용유도(tolerogenesis)를 위한 융합분자와 함께, 적혈구 결합 부분이 특이적으로 결합하는 예를 들어, 글리코포린 A, 또는 적혈구 표적 그룹의 밴드 3, 글리코포빈 B, 글리코포빈 C 또는 그 외로부터 선택되는 표적을 포함한다. 상기 적혈구 결합 부분은, 예를 들어, 항체, 항체 단편, scFv, 펩타이드 리간드 및 압타머로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
구현예는 비인간 단백질 유래의 관용 유도 항원을 선택하는 것을 포함한다. 이러한 단백질의 예로는, 아데노신 디아미나제, 췌장 리파제, 췌장 아밀라제, 락타제, A형 보툴리눔독소, B형 보툴리눔독소, 콜라게나제, 히알루로니다제, 파파인, L-아스파라기나제, 라스부리카아제, 레피루딘(lepirudin), 스트렙토키나제, 아니스트레프라제(anistreplase)(APSAC; anisoylated plasminogen streptokinase activator complex), 항흉선 세포 글로불린, 살모사과 다가 면역 Fab(crotalidae polyvalent immune Fab), 디곡신 면역 혈청 Fab(digoxin immune serum Fab), L-아르기나제 및 L-메티오나제가 있다.
구현예는 사람 동종 이식 항원 유래의 관용 유도 항원을 선택하는 것을 포함한다. 이들의 항원의 예에는, 다양한 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 단상형 단백질의 서브유닛 및 RhCE, Kell, Kidd, Duffy 및 Ss 를 포함하는 마이너 혈액형 항원의 단일 아미노산 다형체(polymorphisms)가 있다.
경우에 따라서, 관용유도 항원은 환자가 자가 면역반응을 보이고 있거나, 자가 면역반응을 보일 가능성이 있는 자기항원이다. 예를 들어, 프로인슐린(당뇨병), 콜라겐(관절 류머티즘), 수초염기성 단백질(다발성 경화증)이 있다.
예를 들어, 제1형 당뇨병(T1D)은 T세포가 면역 조절로부터 분리된 섬형 단백질(islet protein)을 인식하고, 상기 면역계에 췌장 조직을 파괴하도록 신호를 보내는 자가 면역장애이다. 인슐린, GAD65, 크로모그라닌-A 및 다른 항원을 포함하는, 상기 당뇨병 유발성 T세포(diabetogenic T cell)의 타겟이 되는 많은 단백질 항원이 발견되었다. T1D를 처방 또는 예방에 있어서, 정의된 당뇨병 유발성 항원에 대하여 항원 특이적 면역 관용화를 야기하는 것이 상기 당뇨병 유발성 T세포를 기능적으로 불활성화 또는 제거하기에 유용할 수 있다. 실시예 14는 크로모노그래닌-A (ChrA) 미모톱을 관용 유도 항원으로 가지는 융합 분자가 어떻게 다른 실시예에서 예측가능한 방향으로 확립된 T세포 데이터에 기초하여 성공적으로 chrA에 대하여 관용 유도를 형성하는지 상술한다. 따라서, 구현예는 크로모그래닌 A, 항원 또는 그것의 항원성 단백질, 또는 같은 것의 미니톱을 포함하는 면역 관용 유도를 위한 융합분자와 함께, 적혈구 결합 부분이 특이적으로 결합하는 예를 들어, 글리코포린 A, 또는 적혈구 표적 그룹의 밴드 3, 글리코포린 B, 글리코포린 C 또는 그 외로부터 선택되는 표적을 포함한다. 상기 적혈구 결합 부분은, 예를 들어, 항체, 항체 단편, scFv, 펩타이드계 리간드 및 압타머로 구성된 군으로부터 및/또는 ERY19, ERY59, ERY64, ERY123, ERY141, ERY162, ERY19', ERY59', ERY64', ERY123', ERY141', 및 ERY162'로 구성된 군 및 이들의 대체물로부터 선택될 수 있다.
따라서, 자가면역질환의 진행 또는 발병의 관용화 및/또는 지연은 인간 자가면역 단백질인 많은 다양한 단백질에 의해 달성될 수 있는데, 상기 인간 자가면역 단백질이란 질환을 일으키는 단백질을 포함하는 다양한 자가면역질환이 통상의 실험을 통해 알려질 수 있거나 확인될 수 있다는 것을 의미한다.
구현예는, 자가면역 단백질을 동정 하기 위해 환자를 검사하는 것, 및 분자 융합체에 사용되는 항원을 제작하는 것, 및 단백질에 대한 면역 관용을 일으키는 것을 포함한다. 구현예는, 하기 단백질 중 하나 이상으로부터 유래되는 항원, 또는 하기 단백질 중 하나 이상으로부터 항원을 선택하는 것을 포함한다. 1형 당뇨병에서는, 인슐린, 프로 인슐린, 프리프로인슐린, 글루타민산 데카르복실라제-65 (GAD-65), GAD-67, 인스리노마 관련 단백질 2(IA-2) 및 인스리노마 관련 단백질 2β (IA-2β)의 몇개의 주요한 항원이 동정되었다. 다른 항원으로서 ICA69, ICA12 (SOX-13), 카르복시펩티다제 H, Imogen 38, GLIMA 38, 크로모그라닌 A, HSP-60, 카르복시펩티다제 E, 페리페린, 글루코스 트랜스포터-2, 간세포암-장-췌장/췌장 관련 단백질(hepatocarcinoma-intestine-pancreas/pancreatic ass ociated protein), S100β, 글리어 섬유성 산성 단백질, 리제네레이팅 유전자 II(regenerating gene II), 췌장 십이지장 홈 박스 1(pancreatic duodenal homeobox 1), 근경직성 디스트로피키나제, 췌장 내에 점존하는 세포군 특이적 글루코스-6-포스파타제 촉매 서브유닛 관련 단백질 및 SST G 단백질 공역형 수용체 1 내지 5가 있다. 하시모토병 및 그레이브스병을 포함하는 갑상선 자가면역질환의 주요한 항원으로서 티로글로블린(TG), 갑상선 퍼옥시다아제(TPO) 및 티로트로핀 수용체(TSHR)가 있으며, 다른 항원으로서 나트륨 요오드 동시 수용체(NIS) 및 메가린(megalin)을 포함한다. 갑상선 관련 안질환 및 피부증에는 TSHR 등의 갑상선 자기항원 뿐만이 아니라, 항원으로서 인슐린형 성장 인자 1 수용체가 있다. 부갑상선 기능 저하증에서는, 주요한 항원으로서 칼슘 감응성 수용체가 있다. 에디슨 병에서는, 주요한 항원으로서 21-히드록실라제, 17α-히드록실라제 및 P450 곁사슬 분할 효소(P450scc)가 있으며, 다른 항원으로서 ACTH 수용체, P450c21 및 P450c17가 있다. 조기 난소 부전에서는, 주요한 항원으로서 FS H 수용체 및 α-에놀라제가 있다. 자가면역성 뇌하수체염, 또는 뇌하수체 자가면역질환에서는, 주요한 항원으로서 뇌하수체 특이적 단백질 인자(PGSF) 1 a 및 2가 있으며, 다른 항원으로는 2형 요오드티로닌 데이오디나제가 있다. 다발성 경화증에서는, 주요한 항원으로서 수초염기성 단백질, 마이엘린 올리고덴드로사이트 당 단백질 및 단백지질 단백질이 있다. 관절 류머티즘에서는, 주요한 항원으로서 콜라겐 II가 있다. 면역 위염에서는, 주요한 항원으로서 H+, K+-ATPase 가 있다. 악성 빈혈(pernicious angemia)에서는, 주요한 항원으로서 내재성 인자(intrinsic factor)가 있다. 셀리악병에서는, 주요한 항원으로서 조직 트랜스글루타미나제 및 글리아딘이 있다. 백반증에는, 주요한 항원으로서 티로시나제 및 티로시나제 관련 단백질 1 및 2가 있다. 중증 근무력증에서는, 주요한 항원으로서 아세틸콜린 수용체가 있다. 심상성천포창(pemphigus vulgaris) 및 그 변형에서, 주요한 항원으로 데스모글레인 3, 1 및 4를 포함하며, 다른 항원으로 펜파키신(pemphax in), 데스모코린, 프라코그로빈, 페르프라킨(perplakin), 데스모프라킨 및 아세틸콜린 수용체를 포함한다. 수포성 류천포창(bullous pemphigoid)에는 주요한 항원은 BP180 및 BP230를 포함하며, 다른 항원은 프렉틴 및 라미닌 5를 포함한다. 듀링 포진상 피부염(dermatitis herpetiformis Duhring)에서는, 주요한 항원으로서 근내막 및 조직 트랜스글루타미나제가 있다. 후천성 표피 수포증에서는, 주요한 항원으로서 콜라겐 VII이 있다. 전신성 경화증에서는, 주요한 항원으로서 기질 금속단백질 분해효소 1(MMP 1) 및 3(MMP 3), 콜라겐-특이적 분자 셰프론 열충격 단백질 47, 피브릴린 1 및 PDGF 수용체가 있으며, 다른 항원으로서 Scl-70, U1 RNP, Th/To, Ku, Jo1, NAG-2, 동원체 단백질, 토포이소머라아제 I, 핵단백질(nucleolar proteins), RNA 폴리머라제 I, II 및 III, PM-Slc, 피브리라린 및 B23를 포함한다. 혼합 결합 조직병에서는, 주요한 항원으로서 U1snRNP를 포함한다. 쇼그렌 증후군에서는, 주요한 항원으로서 핵항원 SS-A 및 SS-B가 있으며, 다른 항원으로서 포드린, 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 및 토포이소머라아제가 있다. 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus)에서는, 주요한 항원으로서 SS-A, high mobility group box 1(HMGB1), 뉴클레오솜, 히스톤 단백질 및 이중가닥 DNA를 포함하는 핵단백질이 있다. 구드파스튜어증후군 (Goodpasture's syndrome)에서는, 주요한 항원으로서 콜라겐 IV 등의 사구체 기저막 단백질이 있다. 류마티스성 심장질환에서는, 주요한 항원으로서 심근 마이오신(cardiac myosin)이 있다. 다선성 자가면역 증후군 1형(autoimmune polyglandular syndrome type 1)으로 밝혀진 다른 자기 항원에서는, 방향족 L-아미노산 디카르복실라제, 히스티딘 디카르복실라제, 시스테인 설핀산 디카르복실라제, 트립토판 하이드록실라제, 티로신 하이드록실라제, 페닐알라닌 하이드록실라제, 간장 P450 시토크롬(hepatic P450 cytochromes) P4501A2 및 2 A6, SOX-9, SOX-10, 칼슘 감지 수용체 단백질 및 1형 인터페론의 인터페론 α, β 및 ω를 포함한다. 실시예 15는 상기 단백질에 대한 면역 관용 유도의 상세한 지침을 제공하며 예시로서 인슐린을 이용한 과정에 대하여 구체적으로 기재한다.
경우에 따라, 관용유도 항원은 환자가 바람직하지 않은 면역반응을 나타낸 적이 있는 외래항원이다. 예를 들어 음식 항원이 있다. 구현예는 외래 항원을 동정 하기 위해 환자를 검사하는 것, 항원을 포함하는 분자 융합체를 제조하는 것 및 항원 또는 식품에 대한 면역 관용을 일으키도록 환자를 처치하는 것을 포함한다. 이러한 식품 및/또는 항원의 예를 제공한다. 예로서, 땅콩 유래의 콘아라킨(Ara h 1), 알레르겐 II(Ara h 2), 땅콩 응집소, 콘글루틴 (Ara h 6), 사과 유래의 31 kda 의 주요 알레르겐/ 질병 저항성 단백질 호모 로그(Mal d 2), 지질 전이 단백질 선구 물질(Mal d 3), 주요 알레르겐 Mal d 1.03 D(Mal d 1), 우유 유래의 α-락토알부민(ALA), 락토트랜스페린, 키위 유래의 아크치니딘(Act c 1, Act d 1), 피토시스타틴, 타우마틴 유사 단백질(Act d 2) , 키웨린(kiwellin)(Act d 5), 겨자 유래의 2S 알부민(Sin a 1), 11S 글로불린(Sin a 2), 지질 전이 단백질(Sin a 3), 프로필린(Sin a 4), 샐러리 유래의 프로필린(Api g 4), 고분자량 당단백질(Api g 5), 새우 유래의 Pen a 1 알레르겐(Pen a 1), 알레르겐 Pen m 2(Pen m 2), 트로포미오신 패스트 아이소폼(tropomyosin fast isoform), 밀 및/ 또는 다른 곡류 유래의 고분자량 글루테닌, 저분자량 글루테닌, α-글리어딘, γ-글리어딘, 호르데인, 세카린, 아베닌, 딸기 유래의 주요 딸기 알레르기 Fra a 1-E(Fra a 1), 바나나 유래의 프로필린(Mus xp 1)이 있다.
사람 및 동물 의약에 사용되는 많은 단백질 약제는, 환자에게 위험이 되는 면역반응을 유도해, 약제의 유효성이 제한된다. 이것은 조작된 인간 단백질, 인간 단백질의 생성에 선천적 결손이 있는 환자에게 사용한 인간 단백질 및 비인간 단백질에 의해서도 야기될 수 있다. 최초 투여 전에 이들 단백질 약제의 피투여자를 관용화하는 것이 유리할 수 있으며, 최초의 투여 후 및 면역반응을 나타낸 후에 단백질 약제의 피투여자를 관용화하는 것도 유리할 수 있다. 자가면역의 환자의 경우는, 자가 면역을 나타내는 자기 항원이 알려져 있다. 이러한 경우에는, 자가면역을 나타내기 전에 위험이 있는 피검체를 관용화하는 것이 유리하다라고 생각할 수 있고, 초기의 자가면역의 생체 분자 지표를 나타낸 시점 또는, 그 후에 피검체를 관용화하는 것도 유리할 수 있다. 예를 들어, 1형 당뇨병의 경우, 췌장 β세포의 광범위한 파괴 전 및 글루코스 항상성에 관계하는 임상 질환의 발증 전에 자가면역의 면역학적 지표가 존재한다. 임상 질환의 증세가 나타나기 전 이들의 면역학적 지표를 검출하여 피검체를 관용화하는것이 유리할 수 있다.
Miller 등을 리더로 한 최근의 연구에는, 엑스 비보(ex vivo)에서 항원을 동종이계 지라세포(allogenic splenocyte)에 공유 결합으로 콘쥬게이트해 마우스 정맥내에 투여하면, 항원 특이적 면역관용이 일어나는 것을 개시한다(Godsel, Wang, et al., 2001; Luo, Pothoven, et al., 2008). 이 프로세스는, 기증자의 지라의 항원 제시 세포를 채취하는 것 및 아민-카르복실산 가교 반응 스킴(amine-carboxylic acid crosslinking reaction scheme)으로 이들을 화학적으로 반응시키는 것을 포함한다. 상기 기술은 항원 다발성 경화증(multiple sclerosis)(Godsel, Wang, et al, 2001), 새로운 발병 제 1형 당뇨병(new onset diabetes type 1) (Fife, Guleria, et al, 2006) 및 동종 췌장내에 점존하는 세포군 이식(allogenic islet transplants)(Luo, Pothoven, et al,, 2008) 마우스 모델에 대한 특이적 관용 유발에서 효과적이라는 것이 입증되었다. 관용유도반응에 관한 정확한 메카니즘은 밝혀져 있지 않지만, 주요한 요건으로서 아포토시스 항원 결합 세포에서 공자극 분자의 발현 없이 항원제시를 포함하는 것이 제안되었다(Miller, Turley 등, 2007 년). 게다가 WO2011/051346와 같이 파열 적혈구 내에 항원을 봉입해, 적혈구를 엑스 비보에서 처리하고, 재주사하는 것도 검토되어 왔다.
투여
본 명세서에 기재된 본 발명의 많은 구현예는, 사람 또는 다른 동물 환자에게 투여할 수 있는 조성물에 대하여 설명한다. 본 발명의 구현예는 예를 들어, 적혈구 또는 종양 또는 종양 혈관계 상의 항원을 인식하는 분자 융합체, 융합 단백질, 펩타이드 리간드, 항체, scFv 또는 이들의 조합을 포함한다. 이들 조성물은, 적합한 약학적으로 허용되는 캐리어 또는 부형제제와 함께 약학적으로 허용되는 조성물로 조제될 수 있다.
적혈구에 결합하는 조성물은 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 특이성은, 인비보에서의 조성물과 적혈구의 결합 이외에, 대안으로 엑스 비보에서의 프로세스도 가능하게 한다. 따라서, 조성물은 환자의 혈관계에 직접 주사될 수 있다. 대안으로서, 후속적인 적혈구와의 접촉 및 흡수를 위해, 예를 들어 근육, 피부 또는 피하와 같은 조직 내로 주사될 수 있다. 본 발명의 구현예는 적혈구 결합 부분과 관련된 환자에게 관용화 항원을 투여하여 인비보로 적혈구에 항원을 부착시키는 것을 포함하는 환자에게 있어 관용유도(tolerogenesis)를 야기하는 방법이며, 상기 인비보 부착은 적혈구의 엑스 비보 처리 없이 수행될 수 있다. 상기 과정은 상기 적혈구가 상기 과정의 결과 아포토시스화 되지 않는 상황에서 수행될 수 있다. 상기 과정은 적혈구를 하기 물질들 중 하나 이상에 노출시키는 과정 없이(포함하지 않고) 실시될 수 있다. 가교제; 적혈구의 표면분자를 가교하는 가교제; 적어도 2개의 관능기를 포함하는 가교제; 적혈구와 공유결합을 형성하는 가교제; 적혈구와 공유결합을 형성하는 관능기; 그리고 적혈구와 공유결합을 형성하는 항원 및/또는 항원성 물질. 상기 과정은 상기 적혈구 및/또는 상기 항원이 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC; 또한 EDAC 또는 EDCI)을 포함하지 않고, 또한 카르보디이미드(carbodiimide)에 의한 임의의 반응을 포함하지 않고 실현될 수 있다. 상기 과정은 자가 적혈구(autologous erythrocytes)를 이용하여, 그리고 동종이계 적혈구(allogeneic erythrocytes) 없이 실행될 수 있다.
본 발명에 기재된 구현예를 전달하기 위해 약학적으로 허용 되는 캐리어 또는 부형제가 사용될 수 있다. 부형제란, 치료약에 희석제 또는 비히클로서 사용되는 불활성 물질을 말한다. 약학적으로 허용되는 캐리어는 일반적으로, 요법 또는 제품에 유용한 화합물과 함께 사용된다. 일반적으로, 임의의 물질에 대하여, 약학적으로 허용되는 캐리어는, 동물에게 상기 약물을 전달하기 위하여 그 약물과 배합되는 물질이다. 통상의 약학적 캐리어, 수성, 분말, 또는 유성 기제, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 경우에 따라 캐리어는, 예를 들어, 액체 전달을 위해 불용성 화합물을 가용화하기 위해 전달에 불가결하고, 활성을 유지하기 위해 물질의 pH를 제어하기 위한 완충제, 또는 저장 용기내 물질의 소실을 막기 위한 희석제이다. 그러나, 다른 경우, 캐리어는 편의상 예를 들어, 보다 투여하기 좋은 액체이다. 당업자는 공지의 방법에 의해, 본 발명에 개시된 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 합성할 수 있다. 따라서, 약학적으로 허용되는 조성물은, 오염물이 없도록 고도로 정제되고, 생체 적합성이며 독성이 없고, 환자에게 투여하는데 적합하다. 물이 캐리어인 경우는, 물을 고도로 정제하고, 오염물, 예를 들어, 엔도톡신을 포함하지 않도록 처리한다.
본 발명에 기재된 화합물은 전형적으로는, 의도하는 투여 형태에 따라 적절히 선택되며, 종래의 의료 관행에 따른 적합한 약학적 희석제, 부형제, 증량제 또는 캐리어(본 명세서에서는 약학적으로 허용되는 캐리어 또는 캐리어라고 한다)와의 혼합물로서 투여한다. 따라서 전달 가능한 화합물은, 경구투여, 직장 투여, 국소 투여, 정맥 내 주사, 관절내 주사 또는 비경구(parentally) 투여에 적합한 형태로 제조할 수 있다. 캐리어는 고체 또는 액체를 포함하며, 캐리어의 종류는, 사용되는 투여의 종류에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 환약의 경우에는, 캐리어로서 적합한 결합제, 활택제, 붕괴제, 착색제, 착향제, 유동화제 및 용해제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 활성 성분은, 약학적으로 허용되는 무독성 불활성의 경구 캐리어, 예를 들어 락토스, 젤라틴, 한천, 전분, 수크로스, 글루코스, 메틸 셀룰로오스, 스테아린산 마그네슘, 인산 2칼슘, 황산칼슘, 만니톨, 소르비톨 등과 조합될 수 있다. 화합물은, 캡슐제, 정제 및 가루약 등 고체 제형으로 경구투여, 또는 에리키실제, 시럽제 및 현탁제 등 액체 제형으로 경구투여될 수 있다. 또 활성 화합물은, 무균의 액체 제형으로 비경구 투여될 수 있다. 생리적 pH 또는 오스몰 농도를 달성하기 위해 완충액을 사용할 수 있다.
실시예
실시예 1: 마우스 적혈구에 결합하는 분자 표적의 특징 부여
결과: ERY1 펩타이드의 분자 표적의 탐색에는, 비오틴화한 가용성 펩타이드를 이용한 친화성 풀다운 법을 이용하였다. 이 방법에 의해, 적혈구막상의 ERY1 리간드로서 글리코포린 A(GYPA)가 밝혀졌다. 비오틴 관능기를 갖는 ERY1 펩타이드 및 광활성화형 크로스 링커와 전체 적혈구를 인큐베이트하고, 스트렙트아비딘 웨스턴 블로팅으로 검출했을 때, 단일의 28 kDa의 단백질이 펩타이드-비오틴 복합체와 콘쥬게이트되었다. 이 반응의 라이세이트를 충분히 세정하고, 적혈구 라이세이트에 비표지 단백질이 확실히 잔존하지 않도록 스트렙트아비딘 자성 비즈를 이용하여 정제하였다. 예상한 대로, 미스매치 펩타이드는 어느 적혈구 단백질과도 콘쥬게이트되지 않았다. 미스매치 펩타이드 PLLTVGMDLWPW(서열번호 2)는, ERY1과 같은 아미노산 잔기를 포함하며 그 소수성 분포(hydropathy topography)와 일치하도록 설계하였다. 상기 상호작용 단백질의 겉보기 크기의 증거으로부터, 몇 가지 보다 작은 1회 막관통 단백질, 즉 글리코포린과 같은 리간드가 제시되었다. 가교 반응으로부터 정제된 동일한 샘플의 항GYPA 웨스턴 블로팅에 의해, 상기 후보 비오틴화 단백질이 GYPA인 것이 확인되었다.
ERY1 파지와 GYPA와의 공-국재(co-location)를 고해상도의 공초점 현미경에 의해 분석하였다. GYPA는 자연적으로 발현하여 몇 개의 막과 세포 골격 단백질을 포함하는 복합체의 일부분으로서 존재한다(Mohandas and Gallagher, 2008). 이것은 GYPA 의 염색으로 시각적으로 명백하며, 그 때문에 세포의 적도 주변에서는 불균일성의 표지가 인식된다. ERY1 파지에 의한 표지도 매우 유사한 염색 분포를 얻을 수 있었다. 공-국재 분석에 있어서의 오버랩 계수가 0.97 로 높은 것으로부터, ERY1 파지 및 항-GYPA 가 동일한 단백질에 결합한다고 하는 결론이 증명된다. 또, 라이브러리-파지로 표지해도 파지의 결합이 없었던 적혈구에서 GYPA 클러스터 형성도 확인되었기 때문에, 공-국재가 없는 것이 분명하였다.
방법: TGR 수지상의 표준적인 고상 f-moc 화학을 이용하고, ERY1 (H2N-WMVLPWLPGTLDGGSGCRG-CONH2)(서열번호 19) 펩타이드 및 미스매치(H2N-PLLTVGMDLWPWGGSGCRG-CONH2)(서열번호 20) 펩타이드를 합성하였다. 펩타이드는, 95% 트리플루오로 초산, 2.5% 에탄디티올, 2.5% 물 중에서 수지로부터 분리하고, 얼음냉각 디에틸에테르에서 침전시켰다. 정제는 C18 역상 컬럼을 이용하여 예비 HPLC-MS (Waters) 상에서 이루어졌다.
ERY1 및 미스매치 펩타이드를 Mts-Atf-비오틴(Thermo Scientific)에, 제조사가 제시한 방법에 따라 콘쥬게이트하였다. 간단하게 말하면, 펩타이드를 PBS/DMF에 가용화하고, 1.05 당량의 Mts-atf-비오틴과 하룻밤 4℃에서 반응시켰다. 반응물을 원심분리에 의해 청징화한 후, PBSA-50 내, 37℃에서 1시간 동안 비오틴화 펩타이드를 적혈구와 인큐베이트하고, 세포를 새로운 PBS로 2회 세정하고, 실온에서 8분간 365 nm로 UV 조사하였다. 세포를 초음파 처리에 의해 용해시키고, 라이세이트를, 스트렙트아비딘 코트 자성 비즈(Invitrogen)를 사용하여 정제하였다. 용출액을 SDS-PAGE에 로딩하여 PVDF막에 전사하고, 스트렙트아비딘-HRP(R&D Systems) 또는 항마우스 GYPA로 이뮤노블로팅하였다.
실시예 2: 사람 적혈구에 대한 결합의 특징 부여
결과: 사람 적혈구에 결합한 선택된 펩타이드의 특징 부여를 실시하기 위해, 개개의 펩타이드를 제시하고 있는 세균에 대해, 복수의 세포 형태와 관련하여 결합 에세이를 실시하였다. 7종 중 6종(ERY19, ERY59, ERY64, ERY123, ERY 141 및 ERY162)의 펩타이드가, 사람 표피 293T세포 및 사람 내피 HUVEC에 대한 결합에 비해 사람 적혈구에 특이적으로 결합하였다. 추가적으로, 사람 혈액형 A 및 B에 결합했지만 쥐 혈액에 결합하지 않았던 펩타이드가 있는 것으로부터, 이들 펩타이드는 사람 혈액에는 특이적이지만, 공통의 혈액형 항원에 의존하지 않는 것이 시사되었다. 펩타이드는 표준적인 고상 f-moc 화학을 이용하여 합성되어, 나노 입자에 콘쥬게이트되고, 상술한 바와 같이 개개의 세포 형태와 관련된 결합에 대해 분석되었다. 적혈구 표면에 대한 결합은 현미경 및 플로우 사이트메트리 양쪽 모두를 이용하여 조사하였다.
실시예 3: 비공유 적혈구 결합과 ERY1 펩타이드 콘쥬게이트 항원 또는 사람 적혈구 결합 펩타이드 콘쥬게이트 항원을 통한 항원 특이적 면역학적 관용 유도
적혈구에 대한 항원의 강력하고 특이적인 생물물리학적 결합을 얻기 위해, 파지 디스플레이에 의해 마우스 글리코포린 A 에 특이적으로 결합하는 것으로 확인된 합성 12 아미노산 펩타이드(ERY1) 를 사용하였다(Kontos and Hubbell, 2010). 이 연구에서는, 모델 항원 OVA를, CD8+ T세포 집단이 MHC I 면역 우성 OVA 펩타이드 SIINFEKL(서열번호 3)에 특이적인 T세포 수용체를 발현하는 형질전환 마우스 주(OT-I)에 대해 사용하였다. ERY1 펩타이드를 OVA에 화학적으로 콘쥬게이트 하고, 높은 친화성 및 특이성으로 마우스 적혈구에 결합하는 OVA 변형(ERY1-OVA)을 제작하였다(도 1a). 고해상도 공초점 현미경 관찰로부터, ERY1 결합에 관해서 종래의 관찰 결과(Kontos and Hubbell, 2010), 즉 세포막 적도 주변에 국재하지만, ERY1-콘쥬게이트 단백질의 세포내 트랜스로케이션이 없는 것이 확인되었다. ERY1과 동일한 아미노산을 포함하지만 일차 서열의 시퀀스를 바꿔 넣은 미스매치 펩타이드(MIS-OVA)와 콘쥬게이트한 OVA 변형은, 무시할 수 있는 정도의 결합을 나타내었기 때문에(도 1b), 글리코포린 A에 대한 ERY1의 결합은 서열 특이적이었다. 펩타이드를 콘쥬게이트하는데 사용한 가교 분자와만 콘쥬게이트된 OVA는, 적혈구에 대해 측정 가능한 친화성을 전혀 나타내 보이지 않는 것으로부터, ERY1-OVA 결합은 적혈구 표면에서의 ERY1 펩타이드와 글리코포린 A와의 비공유 결합성 상호작용의 결과인 것이 확인되었다. 게다가, ERY1-OVA는 적혈구에 높은 친화성으로 결합하고, 평형 결합 측정에 의해 판정하면, 6.2±1.3 nM 이라고 하는 항체와 같은 해리상수(Kd)를 나타내었다(도 1c).
마우스 정맥내 투여 후, 순환 적혈구에 대한 ERY1-OVA의 결합을 인비보로 검증하였다. 150μg 의 OVA 또는 ERY1-OVA를 주사하고 30분 후에 채취한 전혈 샘플로부터, 혈액의 복잡하고 불균일한 환경 및 혈관계 중에서도 ERY1-OVA의 특이적인 적혈구 결합 능력이 확인되었다. ERY1-OVA는, 글리코포린 A와의 결합과 일치하게, 적혈구(CD45-)에는 결합하였지만, 백혈구(CD45+)에는 결합하지 않았다. ERY1-OVA의 결합은, 적혈구의 아포토시스 상태에 관해 치우치지 않고, 아넥신-V+ 및 아넥신-V- CD45- 집단의 양쪽 모두에 강하게 결합하였다. OVA 콘쥬게이트의 약물동태학적 연구로부터, ERY1-OVA 의 적혈구 결합이 인비보로 길게 유지되며, 세포 표면 반감기가 17.2 시간을 나타내는 것이 확인되었다. ERY1-OVA는 투여 후, 72시간이라는 장시간에 걸쳐 적혈구에 결합한 상태가 유지되었으며, 마우스에서는 이 기간에 약 13%의 적혈구가 제거된다(Khandelwal and Saxena, 2006). 인비보로 적혈구에 결합한 ERY1-OVA 의 정량에 의해, 106 적혈구 당 0.174±0.005 ng의 OVA라고 하는 비교적 높은 부하가 나타났다.
OVA의 부하가 적혈구 기능에 미칠 수 있는 잠재적인 생리적 작용을 배제하기 위해, ERY1-OVA 또는 OVA의 정맥내 투여 후의 다양한 시점에서 혈액학적 파라미터의 특징부여를 실시하였다. ERY1-OV A에 의한 적혈구 결합은 OVA의 투여와 비교하여, 적혈구 용적률, 혈구 용적 또는 적혈구 헤모글로빈 양에 있어서 검출가능한 차이점을 야기하지 않았다. 이들 결과에 의해, 항원과의 글리코포린 A-매개 적혈구 결합은, 그 혈액학적 파라미터를 변화시키지 않았음이 확인된다.
투여시의 적혈구 결합 항원의 세포 표적을 분명히 하기 위해, ERY1(ERY1-아로피코시아닌) 또는 MIS 펩타이드 (MIS-아로피코시아닌)와 콘쥬게이트한 강한 형광을 발하는 아로피코시아닌 단백질을 마우스에 정맥내 주사하였다. 투여로부터 12시간 후 및 36시간 후 비장의 DC 집단의 플로우사이트메트리 해석에 의해, MHCII+ CD11b- CD11c+ DC에 의한 ERY1-아로피코시아닌의 흡수(uptake)가 MIS-아로피코시아닌과 비교해 9.4 배 증강하는 한편, MHCII+ CD11b+ CD11c+ DC에 의한 ERY1-아로피코시아닌 및 MIS-아로피코시아닌의 흡수는 유사하게 나타났다. 추가적으로, MHCII+ CD8α+ CD11c+ CD205+ 비장 DC는, MIS-아로피코시아닌보다 3.0배 정도 많이 ERY1-아로피코시아닌을 흡수하지만, 절대량은 비장의 다른 DC 집단의 경우보다 현저하게 낮은 것이 밝혀졌다. 비활성 및 CD8α+ CD205+ 비장 DC에 대한 항원의 이러한 표적화는, 이들의 집단이 아포토시스 세포에 의한 면역 관용 유도에 관계하고 있는 것이 널리 알려지고 있기 때문에(Ferguson, Choi 등, 2011년; Yamaz aki, Dudziak 등, 2008년), 적혈구 결합의 관용 유도의 가능성을 높일 수 있을 것이다. 간장에서는, ERY1-아로피코시아닌은 MIS-아로피코시아닌과 비교하여 간실질 세포(CD45- MHCII- CD1d-; 78.4배) 및 간성 세포(CD45- MHCII+ CD1d+; 60.6배)에 의한 흡수(uptake)도 크게 증강시켰으며; 양쪽의 집단은 CD8+ T세포 제거성 톨러런스를 유발하는 항원 제시 세포로서 보고되었다(Holz, Warren, et al., 2010; Ichikawa, Mucida, et al., 2011; Thomson and Knolle, 2010). 흥미롭게도, 이러한 흡수는, 적혈구 및 보체 피복 입자(complement-coated particles)의 클리어런스를 돕는 세망 내피계의 멤버로서 일하는 간장 DC(CD45+ CD11c+) 또는 쿠퍼 세포(CD45+ MHCII+ F4/80+)에서는 볼 수 없다. 관용 유도성의 비장 DC 및 간장 세포 집단에 의한 적혈구 결합 항원의 흡수 증대로부터, 비림프액구 간세포와 표준적인 비장 세포와의 크로스-토크에 의해 생기는 항원 특이적 T세포 결손이 서로 관계하는 복잡한 메카니즘의 가능성이 시사된다.
ERY1-OVA의 적혈구 결합은, APC에 의한 OVA 면역 우성 MHC I 에피톱(SIINFEKL)(서열번호 3)의 효율적인 교차 제시 및 대응하는 반응성 T세포의 교차 감작을 일으키는 것이 관찰되었다. CFSE 표지 OT-I CD8+ T세포(CD45.2+)를 CD45.1+ 마우스에 입양전달 하였다. 10μg의 OVA, 10μg의 ERY1-OVA, 또는 10μg 의 무관한 적혈구 결합 항원, ERY1-글루타티온-S- 트랜스퍼라제(ERY1-GST)의 정맥내 투여 후 5 일에 걸쳐, OT-I CD8+ T세포의 증식에 대해 측정하였다. 플로우사이트메트리로 측정한 형광 CFSE의 희석에 의해 판정하면, OT-I CD8+ T세포의 증식이, OVA에 비해 ERY1-OVA가 투여된 마우스에서 현저하게 증강된 것으로부터, 적혈구 결합에 의해, 가용성 항원에 비해 항원 특이적 CD8+ T세포의 교차 감작이 증강되었음을 나타낸다. 10배 낮은 1μg라고 하는 항원 용량의 투여에 의해서도, 적혈구 결합 항원에 의해 유도되는 OT-I CD8+ T세포 증식의 유효성의 작용 범위가 넓게 나타나는 것으로부터 유사한 결과가 얻어졌다. 교차 제시(ross-presentation) 및 교차 감작(cross-priming)의 결과는, 아포토시스 세포 유래 항원을 탐색하는 APC에 의한 MHC I 관용 유도 항원 제시에 관한 다른 연구결과와 일치한다 (Albert, Pearce, et al., 1998; Green, Ferguson, et al., 2009).
기능적인 이펙터 표현형이 되는 T세포와 증폭 및 제거되는 T세포를 구별하기 위해, 증식하는 OT-I CD8+ T세포를 아포토시스 및 제거의 특징으로서 아넥신-V에 대해 분석하였다. ERY1-OVA가 OVA 보다 훨씬 많은 수의 아넥신-V+ 증식 OT-I CD8+ T세포를 유도한 것으로부터(도 12d), 아포토시스가 불가피하며 최종적으로 클론 제거가 생길 것이 시사되었다. ERY1-OVA 투여에 의해 유도된 동일한 증식 OT-I CD8+ T세포는, 1μg 및 10μg의 용량의 양쪽 모두에서 항원-접촉 표현형을 나타내었으며, CD44의 업레귤레이션(up regulation) 및 CD62L의 다운레귤레이션(down regulaton)을 나타내었다. 이러한 증식 CD8+ T세포의 표현형은, APC에 의해 제어된 항원 특이적 T세포 수용체의 결합이 염증 반응을 유도할 수 없다고 보고된, 다른 OT-I 입양전달(adoptive transfer) 모델과 일치한다(Bursch, Rich 등, 2009년).
확립된 OT-I 챌린지-투-톨러런스 모델(Liu, Iyoda 등, 2002년)(도 2a)를 이용하여, ERY1-OVA가, 매우 강력한 세균 유래의 아주반트를 이용하는 경우에도 백신 매개 항원 시험에 대한 후속 면역 반응을 방해하는 것이 증명되었다. 관용화하기 위하여, 우리는 OT-I CD8+ (CD45.2+) T세포의 입양전달로부터 1일 후 및 6일 후, 10μg의 OVA 혹은 ERY1-OVA를 CD45.1+ 마우스에 정맥내 투여하였다. 추가로 9일 후, 이입한 T세포가 제거될 수 있도록, 피투여 마우스에 리포다당(LPS)을 아주반트에 첨가한 OVA를 피내 주사하여 실험하였다. 상기 실험으로부터 4일 후, 유입 영역 림프절 및 비장 세포 외, 염증 반응에 대한 특성 분석으로 제거가 실제 일어났는지 판정할 수 있었다.
ERY1-OVA의 정맥내 투여 결과, 유입 영역 림프절(도 2; 도 2b에서 게이팅) 및 비장의 OT-I CD8+ T세포 집단이 LPS에 의한 항원 실험 전의 언모디파이드 OVA를 투여한 마우스(도 2c)와 비교해 현저하게 감소한 것으로부터, 제거성 관용화가 증명되었다. ERY1-OVA로 처치한 마우스 유래의 유입 영역 림프절에 포함된 OT-I CD8+ T세포는, OVA로 처치한 마우스와 비교해 11배 넘게 감소했으며, 항원의 정맥내 주사를 하지 않았던 실험 대조군 마우스보다 39배 감소하였다; 비장 세포의 반응도 비슷하였다. ERY1-OVA가 투여된 마우스에 나타난 이와 같은 효과적인 클론 제거는, OT-I CD8+ T세포의 교차 감작(cross-priming)의 증강이라고 하는 전술한 바와 같은 관찰 결과를 지지하는 것이고, 교차 감작이 공자극 분자의 APC 제시의 부재에서 일어나 제거성 관용화를 야기한 것을 나타낸다.
항원 실험 후의 면역 반응을 더 평가하기 위해, OT-I CD8+ T세포에 의한 인터페론γ (IFNγ)의 발현으로, 상주성의 림프절 및 비장 세포의 염증 특성의 특징부여를 실시하였다(도 2d). OVA 및 LPS에 의한 실험 후, ERY1-OVA로 미리 처치한 마우스 림프절의 IFNγ 발현 세포는, 실험 대조군 마우스(항원을 미리 투여하지 않았음)와 비교해 53배 적고, 같은 용량의 OVA로 미리 처치한 마우스와 비교해 19배 넘게 감소한(도 2e) 것으로부터, 실험에 대한 관용 유도에 의한 보호에 있어서 적혈구 결합의 중요성이 증명되었다; 비장 세포의 반응도 유사하였다. 게다가, ERY1-OVA로 미리 처치한 마우스의 림프절 및 비장에 존재하는 작은 OT-I CD8+ T세포 집단 중에서, IFNγ를 발현하는 비율이 낮은 것으로부터 클론의 비활성화가 예상되었다. 추가적으로, ERY1-OVA로 미리 처치한 마우스에서는, SIINFEKL로 재자극할 때 유입 영역 림프절로부터 분리된 세포에서 산생되는 총 IFNγ 레벨의 크기가 실질적으로 저하하였고(도 2f), 적혈구 결합은 IFNγ 레벨을 OVA의 투여와 비교해 16배 저하시키고, 실험 대조군과 비교해 115배 이상 저하시켰다. 특히, 상기 억제 현상은, 인터루킨-10(IL-10) 발현의 다운 레귤레이션과도 상관이 있었는데, ERY1-OVA로 미리 처치한 마우스 유래의 림프절 세포에서 발현한 IL-10은, OVA로 미리 처치한 마우스 및 실험 대조군 마우스와 비교해 각각 38% 및 50% 감소하였다(도 2g). Th1 반응을 억제하는 APC-T세포 커뮤니케이션의 맥락에서는 제어성 CD4+T세포 발현 사이토카인을 고려하는 것이 일반적이고 (Darrah, Hegde et al., 2010년; Lee and Kim, 2007), IL-10의 발현은 실험에 대해 둔감화하는데에는 불필요하였다. 유사한 IL-10 다운 레귤레이션(downregulation)은 CD8+ T세포에 의한 면역 관용 유도와 관계되어 있다 (Fife, Guleria, et al,, 2006; Ainaboldi, Roth- Walter, et al,, 2009; Saint-Lu, Tourdot, et al,, 2009). 게다가 ERY1-OVA로 처치한 마우스 혈청 중 항원 특이적 IgG 역가가, 가용성 OVA로 처치한 마우스와 비교해 100배 저하했기 때문에, 적혈구 결합은 항원에 대한 체액성 면역 반응도 실질적으로 약화시켰다(도 2h). 적혈구 결합에 기인하는 OVA 특이적인 IgG 역가의 유사한 저하는 비입양전달의 C57BL/6(CD45.2+) 마우스에서도 나타났다. 1μg의 OVA 또는 ERY1-OVA를 7일간의 간격을 두고 2회 정맥내 투여한 후, ERY1-OVA로 처치한 마우스는 혈청 중의 OVA 특이적인 IgG 레벨이, 제1항원 투여로부터 19일 후 39.8배의 저하를 나타냈다(도 3). 항원에 의한 적혈구 라이게이션(ligation) 후 B 세포 활성화에 있어서의 이러한 현저한 저하는, 관용 유도에 있어서 비염증성 항원 제시에 관한 현재의 가설을 증명하는 것이다(Miller, Turley 등, 2007년; Green, Ferguson 등, 2009년; Mueller, 2010년).
항원 특이적 면역 관용 유도를 더 검증하기 위해, OT-I 챌린지-투-관용 모델을 OVA 발현 종양 이식 모델과 결합시켰다(도 2i). 이전의 실험 설계와 같이, OT-I CD8+ T세포의 입양전달 이후, 10μg의 ERY1-OVA 또는 10μg의 OVA를 2 회 정맥내 투여하여 마우스를 관용화하였다. 제1 항원 투여로부터 5일 후, ERY1-OVA를 주사한 마우스의 혈액내 비-증식(0세대) OT-I CD8+ T세포는 2.9배 감소했기 때문에, 현저한 T세포 제거가 발견되었다(도 2j). 외부로부터 투여되는 강력한 아주반트 없이 증식하는 OT-I CD8+ T세포의 기능적 반응성을 판정하기 위해, 입양전달로부터 9일 후 OVA 발현 EL-4 흉선종 세포(E.G7-OVA)를 마우스 등 피부에 피내 주사하였다. 적혈구 결합 항원의 관용 유도의 유효성을 평가하기 위해, 용량 및 스케줄을 챌린지-투-관용 모델과 같게 하고, 종양 이식으로부터 6일 후 종양 마우스에 LPS를 아주반트로 첨가한 OVA를 실험하였다. ERY1-OVA로 처치한 마우스에서는, OVA로 처치한 마우스 또는 처치하지 않은 대조 마우스와 비교하여, 종양 이식으로부터 8일 뒤에까지 충분한 종양 증식이 지속적으로 관찰된 것(도 2k)으로부터, ERY1-OVA에 의한 OT-I CD8+ T세포의 증식이 OVA에 대한 기능적인 면역 비반응성을 유도하는 것이 확인되었다. 종양의 크기가 이식으로부터 8일 후에 정상 상태가 된 것은, ERY1-OVA에 의한 제거성 관용화가 진행 중인 OT-I CD8+ T세포가 잔존하고 있었음을 나타내는 것일 수 있다.
동물
스위스 수의 당국에서 이미 모든 동물의 처치를 승인하였다. 인비보 결합 연구에서는 8~12주령의 암컷 C57BL/6마우스(Charles River)를 E.G7-OVA 종양의 숙주로서 사용하였다. C57BL/6-Tg(TcraTcrb) 1100 Mjb(OT-I) 마우스(Jackson Labs)를 EPFL 동물 시설에서 사육하였고, 비장세포의 분리에는 6~12주령의 암컷을 사용하였다. OT-I CD8+ T세포의 입양전달 및 관용유도 연구에는 8~12주령의 암컷 B6.SJL-PtprcaPepcb/Boy (CD45.1)마우스(Charles River)를 대상 숙주로 사용하였다.
펩타이드의 디자인과 합성
TGR 수지(Nova Biochem)상의 표준적인 고상 f-moc 화학물을 이용하고, ERY1(H2N-WMVLPWLPGTLDGGSGCRG-CONH2)(서열번호 19) 및 미스매치(H2N-PLLTVGMDLWPWGGSGCRG-CONH2)(서열번호 20) 펩타이드를 합성하였다. 밑줄 친 서열은, 본 발명자들이 파지 디스플레이에 의해 마우스 글리코포린 A 바인더로서 이전에 발견한 ERY1의 12-mer 서열이다(Kontos and Hubbell, 2010). 상기 GGSG 영역은, 콘쥬게이션에 사용되는 시스테인 잔기와의 링커로서 기능하였다. 인접하는 아르기닌 잔기는 pKa를 저하시키고, 따라서 시스테인 잔기의 반응성을 높이는 역할을 하였다 (Lutolf, Tirelli 등, 2001년). 펩타이드는, 95% 트리플루오로아세트산(tri-fluoroacetic acid), 2.5% 에탄디티올(ethanedithiol), 2.5% 물을 이용하여 수지로부터 3시간 동안 절단시켰고, 얼음냉각 디에틸에테르(ice-cold diethyl ether)에서 침전시켰다. 정제는, C18 역상 컬럼(PerSpective Biosystems)을 이용하여 예비 HPLC-MS(preparative HPLC-MS)(Waters)로 실시하였다.
ERY1 항원 콘쥬게이션
디메틸포름아마이드에 용해시킨 10몰 당량의 숙신이미딜-4-(N-말레이미드메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC, CAS# 64987-85-5, Thermo Scientific)를 5 mg/mL의 엔도톡신 프리(<1 EU/mg) OVA(Hyglos G mbH)와, PBS 내에서 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 2 mL의 ZEBA 탈염 스핀 컬럼(Thermo Scientific)으로 탈염시킨 후, 3 M 구아니딘-HCl에 용해시킨 10 당량의 ERY1 또는 MIS 펩타이드를 첨가하여 2시간 동안 실온으로 반응시켰다. 콘쥬게이트를 2 mL의 ZEBA 탈염 스핀 컬럼을 이용하여 탈염하고, 0.2 μm의 필터로 여과하여 멸균하고, 사용 용량으로 분주하여 -20℃로 저장하였다. 단백질 농도는, BCA Assay(Thermo Scientific)로 측정하였다. 상기 스킴의 결과, 펩타이드의 시스테인 곁사슬과 항원의 리신 곁사슬의 콘쥬게이션을 얻을 수 있다. 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)를 BL21 대장균(Escherichia coli)에 발현시키고, 표준 글루타티온 친화성 크로마토그래피(standard glutathione affinity chromatography)를 사용하여 정제하였다. 충분한 트리톤- X114(Sigma Aldrich) 세정에 의해 컬럼의 엔도톡신(endotoxin)을 제거하였으며, 엔도톡신의 제거는 THP-1 X Blue 세포(InvivoGen)로 확인하였다. 동일한 반응 절차를 이용하여 ERY1을 GST에 콘쥬게이트하였다. 말레이미드 활성화 아로피코시아닌(Maleimide-activated allophycocyanin)(Innova Biosciences)을 PBS에 용해시키고, 상술한 바와 같이 ERY1 또는 MIS와 콘쥬게이트하였다.
적혈구 결합의 현미경 관찰
새로 분리한 5X105 개의 마우스 적혈구를, 10 mg/mL의 BSA를 포함하는 37℃의 PBS에서 100 nM의 ERY1-OVA 또는 OVA에 1시간 동안 노출시켰다. 원심분리 및 세정 후, 세포는 얼음 상에서 20분간 1:200 희석 염소 안티-마우스 글리코포린 A(Santa Cruz) 및 토끼 안티-OVA(AbD SEROTEC)로 표지되었다. 원심분리 및 세정 후, 세포는 얼음 상에서 20분간 1:200 ALEXAFLU OR488 안티-염소 IgG(Invitrogen) 및 Alex aFluor546 안티-토끼 IgG(Invitrogen)로 표지되었다. 마지막 회전/세정 사이클 후, 세포를 단단히 고정하고, 63x 유침용(oil immersion) 대물렌즈를 구비한 Zeiss LSM700 공초점 도립 현미경으로 이미지를 관찰하였다. 이미지의 해석은 양쪽 이미지 모두 동일하게 처리한 후 MAGEJ(NIH)로 실시하였다.
인비보 결합 및 체내 분포
0.9% 식염수(B. Braun) 내에 150 μg의 ERY1-OVA 또는 OVA를 포함하는 용액 100 μl를 아이소플루레인으로 마취한 8 내지 12 주령의 암컷 C57BL/6 마우스의 꼬리에 정맥내 주사하였다. 실험은 가온 패드를 이용하여 마우스를 37℃로 확실히 유지하도록 주의하였다. 예정된 시점에서, 꼬리의 작은 절개를 통해 5μL의 혈액을 채취하여 10 mM의 EDTA를 포함하는 PBS로 100배 희석하고, 10 mg/ml의 BSA를 포함한 PBS로 3회 세정한 후, 유세포분석 및 ELISA를 통해 OVA 함유량을 분석하였다. OVA는 샌드위치 ELISA 방법으로 정량하고, 포획용으로 마우스 단일클론 안티-OVA 항체(Sigma), 검출용으로 폴리크로널 토끼 안티-OVA 항체(AbD SEROTEC), 최종 검출용으로 염소 안티-토끼-IgG-HRP 항체(BioRad)를, 뒤이어 TMB 기질(GE Life Sciences)을 사용하였다. ADVI VA 2120 Hematology System(Siemens)으로 혈액학적 특징을 분석하였다. 적혈구 결합 ERY1-GST는, 표지된 세포를 염소 안티-GST(GE Healthcare Life Sciences)와 인큐베이트하고, 뒤이어 Alex aFluor488 당나귀 안티-염소(Invitrogen)와의 인큐베이션을 통해 검출한 후 유세포 분석기로 해석하였다. 생물 분류(biodistribution) 연구에서는 전술한 바와 같은 8 내지 12주령의 암컷 C57BL/6마우스의 꼬리 정맥에 20 μg의 ERY1-APC 또는 MIS-APC를 정맥내 주사하였다. 마우스를 소정의 시점에서 도살해, 비장, 혈액 및 간장을 제거하였다. 각 기관을 콜라게나제 D(Roche)로 소화하고(digested), 균질화해 유세포분석 염색을 위한 단일 세포 부유액을 얻었다.
T세포의 입양 전달
CD8 자성 비즈 네거티브 선택 키트(CD8 magnetic bead negative selection kit)(Miltenyi Biotec)를 제조사의 지침에 따라 이용하여 OT-I(CD45.2+) 쥐 비장 유래 CD8+ T세포를 분리하였다. 새롭게 분리한 CD8+ OT-I 세포를 PBS에 재현탁하고, 1 μM의 카르복시플루오레세인 숙신이미딜에스테르(arboxyfluorescein succinimidyl ester)(CFSE, Inv itrogen)로 6분간 실온에서 표지하고, 10% FBS(Gibco)를 포함하는 같은 부피의 IMDM로 반응을 1분간 휴지(quench) 시켰다. 세포를 세정, 카운트하고, 주사 전에 깨끗한 IMDM에 재현탁하였다. 3x106 개의 CFSE 표지 CD8+ OT-I 세포를 피주사 CD45.1+ 마우스 꼬리 정맥에 정맥내 주사하였다. 단기 증식 연구를 위해, 입양전달으로부터 24 시간 후에 10 μg 의 ERY1-OVA 또는 OVA를 100μl 함량으로 주사하였다. 항원 투여로부터 5일 후에 비장 세포를 채취해, 유세포분석을 이용한 분석을 위해 염색하였다.
OT-I의 관용화 및 실험 모델
3x105개의 CFSE 표지 OT-I CD8+ T세포를 전술한 바와 같이 CD45.1+ 피주사 마우스에 주사하였다. 입양전달으로부터 1일 후 및 6일 후에, 마우스의 꼬리정맥에 10μg 의 ERY1-OVA 또는 OVA 를 포함하는 100μl의 식염수를 정맥내 투여하였다. 입양전달으로부터 15일 후, 5 μg의 OVA 및 25 ng의 초고순도의 대장균 LPS (ultra-pure Escherichia coli LPS; InvivoGen) 25 μl를 각각의 마우스의 뒷 다리 패드에 피내 주사하였다(Hock 법, 총투여량 10μg 의 OVA 및 50 ng의 LPS). 마우스를 상기 실험으로부터 4일 후에 도살하고, 재자극을 위해 비장 및 유입 영역 림프절 세포를 분리하였다. 세포 안 사이토카인의 유세포 분석을 위해, 세포를 1 mg/ml의 OVA 또는 1 μg/ml의 SIINFEKL(서열번호 3) 펩타이드(Genscript)의 존재 하에서 3 시간 동안 재자극하였다. 브레펠딘 A(Sigma, 5μg/mL)를 첨가하고 염색 및 유세포분석 전에 추가적으로 3시간 동안 재자극을 계속하였다. 분비 인자의 ELISA 측정에서는 100 μg/ml의 OVA 또는 1 μg/ml의 SIINFEKL(서열번호 3) 펩타이드의 존재 하에서 4 일간 세포를 재자극하였다. 세포를 회전시키고, IFNγ 및 IL-10 의 Ready-Set-Go 키트(eBiosciences)를 제조사의 지침에 따라 이용하여 ELISA 해석을 위한 배지를 수집하였다. OVA 특이적 혈청 IgG를, OVA-코트 플레이트 상에서 여러 가지 농도로 희석한 마우스 혈청을 인큐베이트한 후, 마지막에 염소 안티-마우스 IgG-HRP(Southern Biotech)와 인큐베이트하여 검출하였다.
OT-I 의 E.G7-OVA 관용화 모델
1x106 개의 CFSE 표지 OT-I CD8+ T세포를 전술한 바와 같이 8 내지 12주령의 암컷 C57BL/6 마우스에 주사하였다. 입양전달으로부터 1일 후 및 6일 후에, 마우스 꼬리 정맥에 10 μg의 ERY1-OVA 또는 OVA 를 포함하는 100μl의 식염수를 정맥내 투여하였다. 입양전달로부터 5일 후, 유세포분석에 의한 OT-I CD8+ T세포 증식의 특징 분석을 위해 혈액을 채취하였다. OVA 발현 EL-4 흉선종 세포(E.G7-OVA, ATCC CRL-2113)를 ATCC 가이드라인에 따라 배양하였다. 간단하게 말하면, 10% FBS(fetal bovine serum), 10 mM HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨(sodium pyruvate), 0.05 mM β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 1% 퓨로마이신/스트렙토마이신(puromycin/streptomycin) (Invitrogen Gibco) 및 0.4 mg/ml G418(PAA Laboratories)를 포함하는 RPMI 1640에서 세포를 배양하였다. 주사하기 직전에, G418를 포함하지 않는 배지에서 세포를 증식시키고, 수거(harvest)하여 HBSS(Gibco)에 재현탁하였다. 입양전달로부터 9일 후, 마우스를 아이소플루레인으로 마취하고, 등 쪽을 면도한 후, 양 견갑골의 사이에 1x106 개의 E.G7-OVA 세포를 피내 주사하였다. E.G7-OVA 이식으로부터 4일 후, 종양 치수를 24시간 마다 디지털 캘리퍼스로 측정해, 종양 용적을 타원체(V=(π/6) l·w·h)로 계산하였다. 식에서 V는 종양의 용적, l는 길이, w는 폭, h는 높이이다. 입양전달로부터 15일 후, 5 μg의 OVA 및 25 ng의 초고순도 대장균 LPS(ultra-pure Escherichia coli LPS; InvivoGen) 25 μl를 각각의 마우스의 앞 다리 패드에 피내 주사하였다(총투여량 10μg의 OVA 및 50 ng의 LPS).
항체 및 유세포 분석
유세포 분석에는 이하의 안티-마우스 항체가 사용되었다: CD1d 퍼시픽 블루, CD3ε PerCP-Cy5.5, CD8α PE-Cy7, CD11b PE-Cy7, CD11c 퍼시픽 블루, 비오틴화 CD45, CD45.2 퍼시픽 블루, CD45 퍼시픽 블루, IFNγ-APC, CD8α APC-eF780, CD44 PE-Cy5.5, CD62L PE, CD205 PE-Cy7, F4/80 PE, I-A/I-E MHCII FITC (모두 eBioscience) 외, 고정가능한 라이브/데드 색소(fixable live/dead dye)(Inv itrogen), 아넥신-V-Cy5 표지 키트(annexin-V-Cy5 labeling kit)(BioVision), 스트렙트아비딘 퍼시픽 오랜지(streptavidin Pacific Orange)(Invitrogen) 및 안티-OVA-FITC(Abcam). 샘플은, CyAn ADP 유세포 분석기(Beckman Coulter)로 분석하였다. 먼저 PBS로 세포를 세정하고, 라이브/데드 색소로 얼음 상에서 20분간 염색하고, 24G2 하이브리도마 배지와 함께 얼음 상에서 20분간 블로킹하고, 얼음 상에서 20분간 표면 염색하고, 2% 파라포름알데하이드로 얼음 상에서 20분간 고정하고, 0.5% 사포닌의 존재 하에 얼음 상에서 45분간 세포내 염색을 한 후, 분석 전에 마지막 세정을 실시하였다. 아포토시스 염색의 경우, 분석 전에 아넥신-V-Cy5를 5분간 첨가하였다. CD45 염색에서는, 세포를 스트렙트아비딘 퍼시픽 오랜지로 염색하여 분석하였다.
입자를 이용한 실시
면역 관용 유도를 위해 ERY1 펩타이드를, ERY1 펩타이드 및 관용 유도 항원 양쪽 모두를 콘쥬게이트한 나노입자의 형태로 구현하였다.
ERY1과 폴리머 나노입자의 콘쥬게이트로서, 펩타이드 또는 단백질 항원에도 콘쥬게이트된 콘쥬게이트를 형성하기 위해, 콘쥬게이션의 전환율을 제어하기 위해 각 성분을 화학양론적 양으로 연속적으로 첨가할 수 있다. OVA와 ERY1 또는 미스매치 펩타이드 둘 다와 콘쥬게이트된 나노입자를 형성하려면, 펩타이드를 최초로 3 M의 수성 구아니딘 HCl에 용해시키고, 0.5 당량을 티올 반응성 피리딜디설파이드기를 함유하고 있는 나노입자에 첨가하였다. 343 nm에서의 흡광도 측정을 실시해, 반응의 전환율을 모니터링하였는데, 상기 반응에서는 이 파장에서 높은 흡광도를 갖는 비반응성 피리딘-2-티온 종(non-reactive pyridine-2-thione species)을 형성하기 때문이다. 실온에서 2시간 후, 343 nm에서의 흡광도가 안정화 되었고, OVA를 3 M의 수성 구아니딘 HCl에 용해시키고, 2배 몰 과잉으로 나노입자 용액에 가하였다. 실온에서 2시간 후, 343 nm에서의 흡광도는 보다 높은 값에서 다시 안정화 되었고, 용액 중의 펩타이드 및 OVA 양쪽 모두의 농도를 산출하였다. 상기 이중기능성 나노입자를, 세파로스 CL6B 충전 칼럼을 이용한 겔 여과로 미반응 성분으로부터 정제하였다. 0.5 mL 분획 각각에 대해, 플루오레사민(fluorescamine)에 의해 단백질 및/또는 펩타이드 존재에 대해 분석하고, 나노입자의 크기를 동적 광산란(DLS)에 의해 평가하였다.
항원이 이러한 반응을 수행하는 유리 티올기를 전혀 포함하지 않는 경우, 유리 티올기를 재조합 DNA 기술에 의해 도입해 변이체를 제조할 수 있으며, 그 후 변이체를 재조합 기술로 발현시키고 정제할 수 있다. 혹은, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)를 이용하여 나노입자와 항원 사이에 아민-카르복실산 가교(amine-carboxylic acid crosslinking)를 형성할 수 있다.
ERY1과 폴리머 마이셀의 콘쥬게이트로서, 펩타이드 또는 단백질 항원에도 콘쥬게이트된 콘쥬게이트를 형성하려면, 폴리머 나노입자와 함께 전술한 것과 유사한 반응을 수행할 수 있다. 상기 마이셀은, 적절한 콘쥬게이션 스킴에 적합한 관능기를 포함하도록 형성될 수 있다. 본 발명자들의 나노입자 및 마이셀이 다양한 화학적 관능기를 포함하도록 합성될 수 있다면, 나노입자/마이셀-항원-ERY1 복합체를 형성하는데 사용되는 콘쥬게이션 스킴에는 많은 가능성이 존재한다.
실시예 4: 마우스 적혈구 및/또는 사람 적혈구에 결합하는 항체 및 항체 단편의 개발
적혈구에 비공유 결합적으로 결합하는 다른 방법으로서, 적혈구 결합 항체를 사용하여 항원 특이적 면역학적 관용을 유도할 수 있다. 하기로 한정되는 것은 아니지만, 박데리오 파지 디스플레이, 효모 및 대장균(E.coli) 표면 디스플레이를 포함하는 최신의 디스플레이 플랫폼을 사용하는 항체 라이브러리의 스크리닝에 의해, 적혈구 표면 단백질에 대해 고친화성을 나타내는 항체를 분리할 수 있다. 신규 적혈구 결합 항체를 발견하면, ERY1 펩타이드에 대해 행한 것과 같은 결합에 대한 생화학적 특징부여로 평가할 수 있다. 결합 특성이 향상된 보다 높은 친화성의 변이체를 형성하기 위해, 최초의 라이브러리 스크리닝으로부터 적혈구에 결합하는 것으로 확인된 항체 단편에 대해 친화성 성숙을 실시한다. 실수 유발 PCR(error-prone PCR) 및 부위 특이적 변이 유발 등의 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하고, 부모 결합 서열로부터 새로운 라이브러리를 제작한다. 그 다음에 상기와 같은 최신의 디스플레이 플랫폼을 이용하여, 부모 결합 서열과 비교해 적혈구에 대한 친화성이 증강된 다른 항체 단편의 친화성 성숙 라이브러리를 제시한다.
친화성 성숙은 또한, 마우스 적혈구 또는 인간 적혈구에 결합하는 기존의 항체로 행해져도 된다. 래트 단일클론 TE R-119 클론 항체(Kina 등, Br J Haematol, 2000년)는, 아직 충분히 규명되지 않은 부위에서 마우스 적혈구에 결합하지만, 그 특이성은 불균일 세포 집단으로부터 적혈구를 제거하는데 일반적으로 사용되고 있다. 마우스 적혈구에 대한 친화성이 증강된 새로운 항체를 발견하려면, 전체 길이 항체로서 또는 scFv 등의 항체 단편으로서의 TER-119 항체의 친화성 성숙을 실시한다. 마우스 단일클론 10F7 클론 항체(Langlois 등, J Immunol 198 4년)는, 인간 적혈구 세포 표면의 인간 글리코포린-A에 결합한다. 인간 적혈구에 대한 친화성이 증강된 새로운 항체를 발견하려면, 전체 길이 항체로서 또는 scFv등의 항체 단편으로서의 10F7 항체의 친화성 성숙을 실시한다.
본 발명자들은, TER-119 항체의 일차 서열을 판정하기 위해, TER-119 하이브리도마로부터 분리된 항체 특이적 cDNA를 유전자 단편을 용이하게 시퀀싱할 수 있는 플라스미드에 클로닝하였다. 유전자 세그먼트의 복수 가변 도메인의 증폭을 가능하게 하는 항체 유전자의 PCR 증폭 프로세스에는 특정의 프라이머세트를 사용하였다(Krebber 등, 1997년; Reddy 등, 2010년). 항체 도메인의 DNA 서열로부터, TER-119 IgG 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역을 결정할 수 있었다. 본 발명자들은, TER-119 IgG의 scFv version을 구축하기 위해, 어셈블리 PCR(assembly PCR)을 사용하고, TER-119의 가변중쇄, 이어서 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)4(서열번호 18) 링커, 뒤이어 TER-119의 가변경쇄를 포함하는 유전자를 제작하였다.
Superscript III First Strand Synthesis System(Invitrogen)을 이용하고, TER-119 하이브리도마 클론 유래의 mRNA에 대해 표준적인 역전사 PCR(RT-PCR)를 실시해 클론의 cDNA(complimentary DNA)를 제작하였다. 이어서, 하기 표 3의 프라이머 세트를 이용해 PCR을 수행하여 항체의 가변 중사슬(VH)및 가변 경사슬(VL)영역의 DNA 서열을 특이적으로 증폭시켰다.
프라이머
명칭		 프라이머 서열 (5' 내지 3') 서열 번호
VL-FOR1 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TCC AGC TGA CTC AGC C 서열번호 21
VL-FOR2 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TTC TCW CCC AGT C 서열번호 22
VL-FOR3 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TGM TMA CTC AGT C 서열번호 23
VL-FOR4 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TGY TRA CAC AGT C 서열번호 24
VL-FOR5 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TRA TGA CMC AGT C 서열번호 25
VL-FOR6 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTM AGA TRA MCC AGT C 서열번호 26
VL-FOR7 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTC AGA TGA YDC AGT C 서열번호 27
VL-FOR8 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TYC AGA TGA CAC AGA C 서열번호 28
VL-FOR9 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TTC TCA WCC AGT C 서열번호 29
VL-FOR10 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG WGC TSA CCC AAT C 서열번호 30
VL-FOR11 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTS TRA TGA CCC ART C 서열번호 31
VL-FOR12 AGC CGG CCA TGG CGG AYR TTK TGA TGA CCC ARA C 서열번호 32
VL-FOR13 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TGA TGA CBC AGK C 서열번호 33
VL-FOR14 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TGA TAA CYC AGG A 서열번호 34
VL-FOR15 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TGA TGA CCC AGW T 서열번호 35
VL-FOR16 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TGA TGA CAC AAC C 서열번호 36
VL-FOR17 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTT TGC TGA CTC AGT C 서열번호 37
VL-FOR18 AGC CGG CCA TGG CGG ARG CTG TTG TGA CTC AGG AAT C 서열번호 38
VL-REV1 GAT GGT GCG GCC GCA GTA CGT TTG ATT TCC AGC TTG G 서열번호 39
VL-REV2 GAT GGT GCG GCC GCA GTA CGT TTT ATT TCC AGC TTG G 서열번호 40
VL-REV3 GAT GGT GCG GCC GCA GTA CGT TTT ATT TCC AAC TTT G 서열번호 41
VL-REV4 GAT GGT GCG GCC GCA GTA CGT TTC AGC TCC AGC TTG G 서열번호 42
VL-REV5 GAT GGT GCG GCC GCA GTA CCT AGG ACA GTC AGT TTG G 서열번호 43
VL-REV6 GAT GGT GCG GCC GCA GTA CCT AGG ACA GTG ACC TTG G 서열번호 44
VH-FOR1 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA KGT RMA GCT TCA GGA GTC 서열번호 45
VH-FOR2 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA GGT BCA GCT BCA GCA GTC 서열번호 46
VH-FOR3 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GCA GGT GCA GCT GAA GSA STC 서열번호 47
VH-FOR4 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA GGT CCA RCT GCA ACA RTC 서열번호 48
VH-FOR5 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GCA GGT YCA GCT BCA GCA RTC 서열번호 49
VH-FOR6 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GCA GGT YCA RCT GCA GCA GTC 서열번호 50
VH-FOR7 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GCA GGT CCA CGT GAA GCA GTC 서열번호 51
VH-FOR8 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA GGT GAA SST GGT GGA ATC 서열번호 52
VH-FOR9 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA VGT GAW GYT GGT GGA GTC 서열번호 53
VH-FOR10 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA GGT GCA GSK GGT GGA GTC 서열번호 54
VH-FOR11 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA KGT GCA MCT GGT GGA GTC 서열번호 55
VH-FOR12 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA GGT GAA GCT GAT GGA RTC 서열번호 56
VH-FOR13 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA GGT GCA RCT TGT TGA GTC 서열번호 57
VH-FOR14 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA RGT RAA GCT TCT CGA GTC 서열번호 58
VH-FOR15 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA AGT GAA RST TGA GGA GTC 서열번호 59
VH-FOR16 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GCA GGT TAC TCT RAA AGW GTS TG 서열번호 60
VH-FOR17 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GCA GGT CCA ACT VCA GCA RCC 서열번호 61
VH-FOR18 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA TGT GAA CTT GGA AGT GTC 서열번호 62
VH-FOR19 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA GGT GAA GGT CAT CGA GTC 서열번호 63
VH-REV1 CCC TTG AAG CTT GCT GAG GAA ACG GTG ACC GTG GT 서열번호 64
VH-REV2 CCC TTG AAG CTT GCT GAG GAG ACT GTG AGA GTG GT 서열번호 65
VH-REV3 CCC TTG AAG CTT GCT GCA GAG ACA GTG ACC AGA GT 서열번호 66
VH-REV4 CCC TTG AAG CTT GCT GAG GAG ACG GTG ACT GAG GT 서열번호 67
그 후, 증폭한 VH 유전자 및 VL 유전자를 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonucleases)(VL에는 NcoI 및 NotI, VH 에는 NdeI 및 HindIII)로 자르고, 유전자 단편을, 아가로스 전기영동 후에 표준 키트(standard kit; Zymo Research, Orange, CA, USA)를 이용하여 정제하고, 클로닝 플라스미드 pMAZ360 에 라이게이션하였다. VH 또는 VL의 유전자를 포함한 플라스미드의 서열 분석을 실시하고, 어셈블리 PCR를 이용하여 새로운 유전자를 구축함으로써 하기 TER-119 scFv 서열을 얻었다.
5'GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAAACTCTCCTGTGTAGCCTCAGGATTCACTTTCAGGGACCACTGGATGAATTGGGTCCGGCAGGCTCCCGGAAAGACCATGGAGTGGATTGGAGATATTAGACCTGATGGCAGTGACACAAACTATGCACCATCTGTGAGGAATAGATTCACAATCTCCAGAGACAATGCCAGGAGCATCCTGTACCTGCAGATGAGCAATATGAGATCTGATTACACAGCCACTTATTACTGTGTTAGAGACTCACCTACCCGGGCTGGGCTTATGGATGCCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACTGTCTCCTCAGCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGACATTCAGATGACGCAGTCTCCTTCAGTCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACTCTCAACTGCAAAGCAAGTCAGAATATTAACAAGTACTTAAACTGGTATCAGCAAAAGCTTGGAGAAGCTCCCAAAGTCCTGATATATAATACAAACAATTTGCAAACGGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACACTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACATATTTCTGCTTTCAGCATTATACTTGGCCCACGTTTGGAGGTGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGTACT-3' (서열번호 69), 이 서열은, 번역된 단백질의 N말단에 TER-119클론의 VH 영역, 이어서 (Gly-Gly -Gly-Gly-Ser)4(서열번호 18) 링커 도메인, 이어서 번역된 단백질의 C말단에 TER-119클론의 VL영역을 코드한다. TER-119 scFv 유전자는, VH 영역에 특이적인 프라이머 SK07 및 SK08 및 VL 영역에 특이적인 SK09 및 SK10를 이용하여 TER-119 cDNA 를 증폭함으로써 구축하였다.
프라이머
명칭		 프라이머 서열 (5' 내지 3') 서열번호
SK07 ACT CGC GGC CCA GCC GGC CAT GGC GGA GGT GAA GCT GCA GGA GTC 서열번호 70
SK08 GGA GCC GCC GCC GCC AGA ACC ACC ACC ACC AGA ACC ACC ACC ACC GGC TGA GGA GAC AGT GAC TG 서열번호 71
SK09 GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGA TCC GAC ATT CAG ATG ACG CAG TC 서열번호 72
SK10 GAC TAC TAG GCC CCC GAG GCC AGT ACG TTT GAT TTC CAG CT 서열번호 73
최종적으로 완성된 scFv 유전자 산물을 각각 SfiI 및 XhoI(NEB, Ipswich, MA, USA)로 자르고, pSecTagA 포유동물 발현 플라스미드(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)의 같은 부위에 라이게이션하였다.
인간 글리코포린 A에 결합하는 10F7 scFv를 친화성 성숙시키기 위해, 유전자를 상업적으로 합성하고, DNA2.0 (Menlo Park, CA, USA)으로부터 하기의 서열을 얻었다.
5'GTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCGGCGCAGGTGAAACTGCAGCAGAGCGGCGCGGAACTGGTGAAACCGGGCGCGAGCGTGAAACTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATACCTTTAACAGCTATTTTATGCATTGGATGAAACAGCGCCCGGTGCAGGGCCTGGAATGGATTGGCATGATTCGCCCGAACGGCGGCACCACCGATTATAACGAAAAATTTAAAAACAAAGCGACCCTGACCGTGGATAAAAGCAGCAACACCGCGTATATGCAGCTGAACAGCCTGACCAGCGGCGATAGCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCTGGGAAGGCAGCTATTATGCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGATATTGAACTGACCCAGAGCCCGGCGATTATGAGCGCGACCCTGGGCGAAAAAGTGACCATGACCTGCCGCGCGAGCAGCAACGTGAAATATATGTATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCGCGAGCCCGAAACTGTGGATTTATTATACCAGCAACCTGGCGAGCGGCGTGCCGGGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTATAGCCTGACCATTAGCAGCGTGGAAGCGGAAGATGCGGCGACCTATTATTGCCAGCAGTTTACCAGCAGCCCGTATACCTTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAAATTAAACGCGCGGCGGCGGCCTCGGGGGCCGAGGGCGGCGGTTCT-3' (서열번호 74).
상술한 재조합 DNA 기술을 이용하여 TER-119에 대하여 유사한 친화성 성숙을 10F7 유전자 상에 실시하여, 사람 적혈구에 대해 강화된 결합을 스크리닝할 수 있는 변이체의 라이브러리를 얻는다.
실시예 5: 항체-콘쥬게이트 항원과의 비공유 적혈구 결합에 의한 항원 특이적 면역학적 관용의 유도
항체는 실시예 3 및 본 발명의 다른 부분에서 언급된 표준적인 가교 반응을 이용하여 항원과 콘쥬게이트될 수 있다. 정제된 항체-항원 콘쥬게이트는 1형 당뇨병, 다발성 경화증, 췌장 내에 점존하는 세포군 이식의 표준적인 마우스 모델에 있어서의 항원 및 OVA 모델 항원에 대한 관용의 유도를 나타낸다.
OVA에 대한 관용 유도를 증명하기 위해 OVA-항체 콘쥬게이트 또는 OVA-나노입자-항체 콘쥬게이트를 마우스에 정맥내 투여 혹은 혈관외 투여할 수 있다. 투여 후 소정 날짜에 마우스를 도살하고, 분석을 위해 림프절, 비장 및 혈액을 채취한다. 비장 세포 및 림프절 유래의 세포를 플레이팅하고, OVA 및/또는 SIINFEKL 펩타이드로 엑스 비보에서 3일간 재자극하고, 이들에 의한 IFNγ, IL-17 a, IL-2 및 IL-4의 발현의 다운 레귤레이션 및 TGF-β1의 업 레귤레이션을 ELISA에 의해 측정하였는데, 이것은 확인된 관용화의 증거이다. IFNγ, IL-17 a, IL-2 및 IL-4의 세포내 염색은, OVA 및/또는 SIINFEKL 펩타이드로 엑스 비보에서의 재자극으로부터 6시간 후, 비장 세포 및 림프절 유래 세포의 유세포분석을 이용하여 실시되었다. 또한, 유세포분석을 이용하여, 림프절, 비장 및 혈액 유래 세포의 CD4, CD8 및 제어성 T세포와의 발현 프로파일의 특징부여를 실시한다. 추가적으로, 다양한 시점에서 마우스로부터 혈액 샘플을 채취해 OVA 항원에 대한 액성 항체 반응도 측정한다. 엑스 비보에서의 재자극 변형 실험을 실시해, 전신성 면역 관용이 확립되어 있는지 판정한다. 마우스에 상기와 같이 OVA-항체 콘쥬게이트 또는 OVA-항체-나노입자 콘쥬게이트를 투여해, 아주반트(지질다당체(lipopolysaccharide), 완전 플루드 아주반트(complete Freud's adjuvant), 명반 또는 그 외)와 함께 9일 후에 OVA를 재투여해, OVA 항원에 대한 비장 세포의 반응을 상기와 같이 ELISA 및/또는 유세포분석에 의해 분석한다. 상기 OVA-항체 콘쥬게이트 및/또는 OVA-항체-나노입자 제제에 의해, 비장 세포는 OVA 및 아주반트에 의한 제 2 실험에 반응하지 않도록 되었는데, 이것은 전신성 면역 관용의 효과적인 확립을 증명하는 하나의 방법이다. OVA-항체 콘쥬게이트 및/또는 OVA-항체-나노입자 제제에 의한 최초의 투여 후, 관용화를 더 증명하기 위해, 실시예 3에 상세하게 기재된 연구결과와 같이 OT-I T세포의 입양전달 등, 유전자 도입 세포주를 이용하여 인비보에서 유사한 실험을 실시할 수 있다. 자가면역 마우스 모델의 면역 관용 또는 치료제 분자의 탈면역화(deimmunization)를 증명하기 위해, 본 명세서에 기재된 것과 같이 OVA와 관련있는 항원에 대한 유사한 항체 콘쥬게이트를 제작할 수 있다.
실시예 6: 단일사슬 항체 융합 항원과의 비공유 적혈구 결합에 의한 항원 특이적 면역학적 관용의 유도
단일사슬 항체 단편(scFv)은 적혈구에 대한 비공유 결합 바인더로서 사용할 수 있다. 적혈구 표면 단백질에 대해 고친화성을 나타내는 scFv는, 최신의 디스플레이 플랫폼을 이용하여 scFv 라이브러리를 스크리닝함으로써 분리할 수 있다. 신규 적혈구 결합 항체 단편이 발견되면, ERY1 펩타이드에 대해 행한 것과 유사하게 결합에 대한 생화학적 특징부여를 평가할 수 있다. scFv는 1개의 폴리펩타이드 사슬을 가지기 때문에, 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용한 부위 특이적 재조합법으로 항원에 융합된다. 항원 융합 파트너의 성질에 따라 scFv를 항원의 N 말단 또는 C 말단에 융합해 이중기능 단백질 종을 제조한다. 항원의 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 펩타이드 인식 서열을 알고 있는 경우에는, 펩타이드 또한 scFv의 링커 도메인에 삽입하여, scFv의 네이티브 말단을 포함하는 새로운 이중기능성 항체/항원 구조체를 제조한다.
OVA에 대한 관용의 유도를 증명하기 위해, OVA-scFv 또는 OVA-나노입자-scFv 콘쥬게이트를 마우스에 정맥내 투여 또는 혈관외 투여할 수 있다. 투여 후 소정 날짜에, 마우스를 도살하고, 분석을 위해 림프절, 비장 및 혈액을 채취한다. 비장 세포 및 림프절 유래 세포를 플레이팅하고, OVA 및/또는 SIINFEKL 펩타이드(서열번호 3)로 엑스 비보에서 3일간 재자극하여, 이들에 의한 IFNγ, IL-17 a, IL-2 및 IL-4의 발현의 다운 레귤레이션 및 TGF-β1의 업 레귤레이션을, 예를 들어, ELISA에 의해 측정하는데, 이는 확립된 관용화의 증거이다. IFNγ, IL-17a, IL-2 및 IL-4의 세포내 염색은, OVA 및/또는 SIINFEKL 펩타이드(서열번호 3)에 의한 엑스 비보에서의 재자극으로부터 6시간 후, 비장 세포 및 림프절 유래 세포의 유세포분석을 이용하여 실시되었다. 또한, 유세포분석을 통하여 림프절, 비장 및 혈액 유래 세포의 CD4, CD8 및 제어성 T세포와의 발현 프로파일의 특징부여를 실시할 수 있다. 추가적으로, 다양한 시점에서 마우스로부터 혈액 샘플을 채취해 OVA 항원에 대한 액성 항체 반응도 측정한다. 엑스 비보로에서의 재자극 변형 실험을 실시해, 전신성 면역 관용이 확립되어 있는지 판정한다. 전술한 바와 같이, 마우스에 OVA-scFv 또는 OVA-나노입자-scFv 콘쥬게이트를 투여하고, 9일 후에 아주반트(지질다당체(lipopolysaccharide), 완전 플루드 아주반트(complete Freud's adjuvant), 명반 또는 그 외)와 함께 OVA를 재투여해, OVA 항원에 대한 비장 세포의 반응을 ELISA 및/또는 유세포분석에 의해 분석한다. OVA-scFv 및/또는 OVA-scFv-나노입자 제제에 의해, 비장 세포는 OVA 및 아주반트에 의한 제 2 실험에 반응하지 않도록 되는데, 이로부터 전신성 면역 관용의 효과적인 확립이 설명된다. OVA-항체 콘쥬게이트 및/또는 OVA-항체-나노입자 제제에 의한 최초 투여 후, 관용화를 증명하기 위해, 실시예 3에 상세하게 기재된 연구결과와 같이 OT-I T세포의 입양전달 등, 유전자 도입 세포주를 이용하여 인비보에서 유사한 실험을 실시할 수 있다. 자가면역 마우스 모델의 면역 관용 또는 치료제 분자의 탈면역화를 증명하기 위해, 본 명세서에 OVA에 대해 기재된 것처럼 관련 항원에 대한 유사한 scFv 융합체를 제조할 수 있다.
표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하고, 마우스 적혈구에 결합하는 OVA의 면역 우성 MHC-I 에피톱(SGLEQ LESIINFEKL)(서열번호 75)을 제시하는 항체 구조체를 제조하였다. 본 발명자들은 최초로, 오버랩 익스텐션 PCR(overlap extension PCR)을 이용하여 TER119 배열의 3' 말단에 상보적인 오버랩 5' 도메인과 함께, SGLEQLESIINFEKL(서열번호 75) 펩타이드를 포함하는 3' 도메인을 코드하는 DNA 단편을 제조하였다. 이 DNA 조각을 리버스 프라이머(reverse primer)로서 상보적인 포워드 5' 프라이머와 함께 사용해 표준적인 PCR로, TER11 9-SGLEQLESIINFEKL(서열번호 75)를 코드하기 위한 하기와 같은 전 DNA 단편을 제조하였다:
5'-GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAAACTCTCCTGTGTAGCCTCAGGATTCACTTTCAGGGACCACTGGATGAATTGGGTCCGGCAGGCTCCCGGAAAGACCATGGAGTGGATTGGAGATATTAGACCTGATGGCAGTGACACAAACTATGCACCATCTGTGAGGAATAGATTCACAATCTCCAGAGACAATGCCAGGAGCATCCTGTACCTGCAGATGAGCAATATGAGATCTGATTACACAGCCACTTATTACTGTGTTAGAGACTCACCTACCCGGGCTGGGCTTATGGATGCCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACTGTCTCCTCAGCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGACATTCAGATGACGCAGTCTCCTTCAGTCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACTCTCAACTGCAAAGCAAGTCAGAATATTAACAAGTACTTAAACTGGTATCAGCAAAAGCTTGGAGAAGCTCCCAAAGTCCTGATATATAATACAAACAATTTGCAAACGGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACACTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACATATTTCTGCTTTCAGCATTATACTTGGCCCACGTTTGGAGGTGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGTACTCATCATCACCATCATCACGGTGGCGGTTCTGGCCTGGAGCAGCTGGAGTCTATTATTAATTTCGAAAAACTG-3' (서열번호 76). 밑줄 친 서열은, SGLEQLESIINFEKL를 코드하는 유전자 세그먼트를 나타낸다. 상기 DNA 단편을 재조합 발현시키기 위해 포유동물 및 원핵생물 발현 벡터에 삽입하였다.
표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여, 마우스 적혈구에 결합시키고 크로모그라닌 A 미메톱 1040-p31(YVRPLWVRME)(서열번호 77)을 제시하는 항체 구조체를 제조하였다. 오버랩 익스텐션 PCR을 이용하여, TER119 서열의 3'말단에 상보적인 오버랩 5' 도메인과 함께, YVRPLWVRME(서열번호 77) 펩타이드를 포함하는 말단 3' 도메인을 코드하는 DNA 단편을 제조하였다. 이 DNA 단편을 프라이머로서 상보적 포워드 5' 프라이머와 함께 사용해 표준적인 PCR로, TER119-YVRPLWVRME 를 코드하는 하기 전 DNA 단편을 제조하였다:
5'-GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAAACTCTCCTGTGTAGCCTCAGGATTCACTTTCAGGGACCACTGGATGAATTGGGTCCGGCAGGCTCCCGGAAAGACCATGGAGTGGATTGGGGATATTAGACCTGATGGCAGTGACACAAACTATGCACCATCTGTGAGGAATAGATTCACAATCTCCAGAGACAATACCAGGAGCATCCTGTACCTGCAGATGGGCAATATGAGATCTGATTACACAGCCACTTATTACTGTGTTAGAGACTCACCTACCCGGGCTGGGCTTATGGATGCCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACTGTCTCCTCAGCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGACATTCAGATGACGCAGTCTCCTTCAGTCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACTCTCAACTGCAAAGCAAGTCAGAATATTAACAAGTACTTAAACCGGTATCAGCAAAAGCTTGGAGAAGCTCCCAAAGTCCTGGTATATAATACAAACAATTTGCAAACGGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGCACAGATTTCACACTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACATATTTCTGCTTTCAGCATTATACTTGGCCCACGTTTGGAGGTGTGACCAAGCTGGAAATCAAACGTACTCATCATCACCATCATCACGGTGGCGGTTATGTCAGACCTCTGTGGGTCAGAATGGAA-3'(서열번호 78). 밑줄 친 서열은 크로모그라닌 A(1040-p31) 미메톱(YVRPLWVRME)(서열번호 77)을 코드하는 유전자 세그먼트를 나타낸다. 상기 DNA 단편을 재조합 발현시키기 위해 포유동물 및 원핵 생물 발현 벡터에 삽입하였다.
표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여, 마우스 적혈구에 결합시키고 NOD 마우스의 당뇨병 주요 자가 항원 마우스 프로인슐린을 제시하는 항체 구조체를 제조하였다. 본 발명자들은 최초로, 오버랩 익스텐션 PCR(overlap extension PCR)을 이용하여 TER119 서열의 3' 말단에 상보적인 오버랩 5' 도메인과 함께, 전 프로인슐린 단백질를 포함하는 말단 3' 도메인을 코드하는 DNA 단편을 제조하였다. 이 DNA 단편을 프라이머로서 상보적 포워드 5'프라이머와 함께 사용해 표준적인 PCR로, TER119-프로인슐린을 코드하는 하기 전 DNA 단편을 제조하였다:
5'-GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAAACTCTCCTGTGTAGCCTCAGGATTCACTTTCAGGGACCACTGGATGAATTGGGTCCGGCAGGCTCCCGGAAAGACCATGGAGTGGATTGGAGATATTAGACCTGATGGCAGTGACACAAACTATGCACCATCTGTGAGGAATAGATTCACAATCTCCAGAGACAATGCCAGGAGCATCCTGTACCTGCAGATGAGCAATATGAGATCTGATTACACAGCCACTTATTACTGTGTTAGAGACTCACCTACCCGGGCTGGGCTTATGGATGCCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACTGTCTCCTCAGCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGACATTCAGATGACGCAGTCTCCTTCAGTCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACTCTCAACTGCAAAGCAAGTCAGAATATTAACAAGTACTTAAACTGGTATCAGCAAAAGCTTGGAGAAGCTCCCAAAGTCCTGATATATAATACAAACAATTTGCAAACGGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACACTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACATATTTCTGCTCTCAGCATTATACTTGGCCCACGTTTGATGGTGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGTACTCATCATCACCATCATCACGGTGGCGGTTTTGTGAAACAGCATCTGTGCGGTCCGCATCTGGTGGAAGCGCTGTATCTGGTGTGCGGCGAACGTGGCTTTTTTTATACCCCGAAAAGCCGTCGTGAAGTGGAAGATCCGCAGGTGGAACAGCTGGAACTGGGCGGCAGCCCGGGTGATCTGCAGACCCTGGCCCTGGAAGTGGCGCGTCAGAAACGTGGCATTGTGGATCAGTGCTGCACCAGCATTTGCAGCCTGTATCAGCTGGAAAACTATTACAAC-3' (서열번호 79). 밑줄 친 서열은, 구조체의 프로 인슐린 유전자 세그먼트를 나타낸다. 상기 DNA 조각을 재조합 발현시키기 위해 포유동물 및 원핵생물 발현 벡터에 삽입하였다.
실시예 7: 적혈구 결합 리간드 및 다른 기능을 포함하는 분기형 폴리머의 합성
8-arm PEG-티오아세테이트(8-arm PEG-thioacetate)를 합성하기 위해, 8-arm PEG-OH(Nektar)를 톨루엔에 용해시키고, 10 당량의 트리에틸아민(triethylamine) (Sigma Aldrich, CAS# 121-44-8) 및 10 당량의 메탄설포닐 클로라이드(Sigma Aldrich, CAS# 124-63-0)와 아르곤 분위기의 실온에서 18시간 반응시켰다. 잔여물을 여과하고, 여과된 액체를 감압하에서 농축해, 디메틸포름 아마이드(DMF)에 용해시키고, 10 당량의 포타슘티오아세테이트 (Sigma Aldrich, CAS# 10387-40-3)를 첨가하였다. 실온에서 18 시간 후, 잔여물을 여과하고, 여과된 액체를 감압하에서 농축시키고, 디에틸에테르(diethyl ether)로 침전시켰다. 상기 침전물을 감압하에서 여과 및 건조하여 최종 생성물을 얻었다.
8-arm PEG-피리딜디설파이드의 합성을 위해, 8-arm PEG-티오 아세테이트를 디메틸포름아마이드(DMF)에 용해시키고, 슈렌크 튜브(Schlenk tube)에서 1.05 당량의 소듐메톡사이드(Sigma Aldrich, CAS# 124-41-4)로 아르곤 분위기의 실온에서 1시간 동안 탈보호시켰다. 탈보호한 티올을 티올레이트로 환원시키기 위해, 용액에 2 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP, Thermo Scientific, CAS# 51805-45-9) 및 2 당량의 증류수를 첨가하였다. 실온에서 2시간 후, 12 당량의 2,2'-디티오 디피리딘(Aldrithiol-2, Sigma Aldrich, CAS# 2127-03-9)을 첨가하고, 용액을 실온에서 24 시간 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을, MWCO 3,500 Da의 투석 튜브로 5 L의 증류수에 대해 48 시간 투석하고, 투석하는 동안 증류수를 4회 교환하였다. 25 mM의 TCEP를 포함하는 100 mM HEPES, pH 8.0으로 환원시켜, 8-arm PEG에 로드한 피리딜 디설파이드를 정량하고, 343 nm에서 UV-vis 스펙트럼을 측정해 피리딘-2-티온 이탈기의 존재를 모니터링하였다.
8-arm PEG-피리딜 디설파이드-ALEXAFLUOR647의 합성을 위해, 8-arm PEG-티오 아세테이트를 DMF에 용해시키고, 슈렌크 튜브에서 1.05 당량의 소듐메톡사이드 (Sigma Aldrich, CAS# 124-41-4)로 아르곤 분위기의 실온에서 1시간 동안 탈보호하였다. 탈보호한 티올을 티올레이트로 환원시키기 위해, 용액에 2 당량의 트리스(2-카르 복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP, Thermo Scientific, CAS# 51805-45-9) 및 같은 부피의 100 mM의 HEPES pH 8.0 을 첨가하였다. 실온에서 2시간 후, 0.125 당량(8-arm 의 1 arm 상당)의 Alex aFluor647-C2-말레이미드(Invitrogen)를 첨가하였다. 실온에서 2 시간 후, 12 당량의 2,2'-디티오디피리딘(Aldrithiol-2, Sigma Aldrich, CAS# 2127-03-9)을 첨가하고 용액을 실온에서 24 시간 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을, MWCO 3,500 Da 의 투석 튜브로 5 L의 증류수에 대해 48 시간 투석하고, 투석하는 동안 증류수를 4회 교환하였다. 25 mM의 TCEP를 포함하는 100 mM HEPES, pH 8.0으로 환원시켜, 8-arm PEG에 로드한 피리딜디설파이드를 정량하고, 343 nm에서 UV-vis 스펙트럼을 측정하여 피리딘-2-티온 이탈기의 존재를 모니터링하였다.
티올 함유 펩타이드와 8-arm PEG-피리딜디설파이드와의 콘쥬게이트는, 3 M의 수성 구아니딘-HCl(Sigma Aldri ch, CAS# 50-01-10)에 용해시킨 화학량론적 함량의 펩타이드를, 8-arm PEG-피리딜 디설파이드의 수용액에 실온에서 첨가하였다. 343 nm에서 UV-vis 스펙트럼을 측정하여, 피리딘-2-티온 이탈기의 존재를 정량하고, 반응 전환율을 모니터링하였다. 8-arm PEG-피리딜디설파이드에 1개 이상의 분자가 콘쥬게이트 되었을 경우, 동일한 포트에서 새로운 분자에 대해 반응 순서를 반복하였다. 콘쥬게이션이 종료되면, 반응 혼합물을 ZEBASPIN 탈염 컬럼(Thermo Scientific)으로 탈염하고, 정제된 생성물을 적절한 멸균 조건 하에서 저장하였다.
OVA에 대한 관용 유도는, 8-arm PEG-ERY1/MIS-SIINFEKL 콘쥬게이트(SIINFEKL: 서열번호 3)를 마우스 정맥내 투여 혹은 혈관외 투여함으로써 증명할 수 있다. 이 시험을 이용하면, 인간 특이적 리간드를 사용해 사람에게 있어서의 관용 유도도 밝혀질 것이다. 이러한 증명에서는, 투여 후 소정 날짜에, 마우스를 도살하고, 분석을 위해 림프절, 비장 및 혈액을 채취한다. 비장 세포 및 림프절 유래 세포를 플레이팅하고, OVA 및/또는 S IINFEKL(서열번호 3) 펩타이드로 엑스 비보에서 3일간 재자극하고, 이들에 의한 IFNγ, IL-17 a, IL-2 및 IL-4의 발현의 다운 레귤레이션 및 TGF-β1의 업 레귤레이션을 ELISA에 의해 측정하는데, 이는 확립된 관용의 증거이다. IFNγ, IL-17 a, IL-2 및 IL-4의 세포내 염색은, OVA 및/또는 SIINFEKL(서열번호 3) 펩타이드에 의한 엑스 비보에서의 재자극으로부터 6시간 후, 비장 세포 및 림프절 유래 세포의 유세포분석을 이용하여 실시된다. 또한, 유세포분석을 이용하여, 림프절, 비장 및 혈액 유래 세포의 CD4, CD8 및 제어성 T세포와의 발현 프로파일의 특징부여를 실시한다. 추가적으로, 다양한 시점에서 마우스로부터 혈액 샘플을 채취해 OVA 항원에 대한 액성 항체 반응도 측정한다. 엑스 비보에서의 재자극 변형 실험을 실시해, 전신성 면역 관용이 확립되어 있는지 판정한다. 전술한 바와 같이, 마우스에 8-arm PEG-ERY1/MIS-SIINFEKL 콘쥬게이트(SIINFEKL:서열번호 3)를 투여하고, 9일 후에 아주반트(지질다당체(lipopolysaccharide), 완전 플루드 아주반트(complete Freud's adjuvant), 명반 또는 그 외)와 함께 OVA를 재투여해, OVA 항원에 대한 비장 세포의 반응을 ELISA 및/또는 유세포분석에 의해 분석한다. 8-arm PEG-ERY1-SIINFEKL 콘쥬게이트 제제(SIINFEKL: 서열번호 3)에 의해, 비장 세포는 OVA 및 아주반트에 의한 제 2 실험에 반응하지 않도록 되는데, 이것은 전신성 면역 관용의 효과적인 확립을 증명하는 방법이다. 8-arm PEG-ERY1/MIS-SIINFEKL 콘쥬게이트 제제(SIINFEKL:서열번호 3)에 의한 최초 투여 후의 관용화를 더 증명하기 위하여, 실시예 3에 상세하게 기재된 연구와 같이 OT-I T세포의 입양전달 등, 유전자 도입 세포주 방식을 이용하여 인비보에서 유사한 실험을 실시할 수 있다. 자가면역 마우스 모델의 면역 관용 또는 치료제 분자의 탈면역화를 증명하기 위해, 본 명세서에 SIINFEKL(서열번호 3)에 대해 기재된 것처럼 관련 항원에 대한 유사한 8-arm PEG 구조체를 제조할 수 있다.
실시예 8: 압타머-콘쥬게이트 항원과의 비공유 적혈구 결합에 의한 항원 특이적 면역학적 관용의 유도
비공유 적혈구 결합에 의한 면역학적 관용의 유도 능력을 측정하기 위해, 다른 비항체 생체 친화성 시약을 이용하는 방법을 실시할 수 있다. 다른 단백질 기반 친화성 부분, 예를 들어, 설계된 안키린 리피트 단백질(DARPin) (Steiner, Forrer, et al,, 2008), 설계된 아르마딜로 반복 단백질 (Parmeggiani, Pellarin, et al, 2008), 피브로넥틴 도메인 (Hackel, Kapila, et al, 2008) 및 시스테인-노트(knottin), 친화성 스캐폴드 (Silverman, Levin, et al,, 2009) 등, 적혈구에 대한 결합 친화성을 나타내는 부분에 대해 스크리닝한다.
적혈구에 대한 고친화성 DNA/RNA 압타머를 발견하는 라이브러리-스크리닝은, 충분히 확립된 시험관내 진화법(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichmen: SELEX)(Archemix , Cambridge, MA, USA)을 이용하여 실시한다(Sampson, 2003). 고친화성으로 적혈구에 결합하는 신규 DNA/RNA 배열을 발견하면, 그 3' 또는 5' 말단에 추가의 화학 반응기를 포함하도록 이들을 화학 합성하고, 항원 및/또는 폴리머 마이셀/나노입자와 콘쥬게이트된다. 화학적으로 합성한 압타머는 반응성 NH2 기를 가지고 있어, 예를 들어, 나노입자 또는 항원 또는 나노입자-항원 복합체 중 어느 하나에 존재하는 COOH 기와의 EDC/NHS 콘쥬게이션 화학에 의해 콘쥬게이트되어, 적혈구 결합 압타머 및 항원 또는 항원-나노입자를 포함하는 단일의 바이오 콘쥬게이트를 형성한다. 압타머, 항원 및/또는 항원-나노입자의 직교 반응기 및 콘쥬게이션 스킴의 양쪽 모두를 변경시킴으로써 다양한 화학적 콘쥬게이션 기술이 시도되고 있다.
OVA에 대한 관용 유도를 증명하기 위해, OVA-압타머 또는 OVA-나노입자-압타머 콘쥬게이트를 마우스에 정맥내 투여 혹은 혈관외 투여한다. 투여 후 소정 날짜에, 마우스를 도살하고 분석을 위해 림프절, 비장 및 혈액을 채취한다. 비장 세포 및 림프절 유래 세포를 플레이팅하고, OVA 및/또는 SIINFEKL 펩타이드(서열번호 3)로 엑스 비보에서 3일간 재자극하고, 이들에 의한 IFNγ, IL-17 a, IL-2 및 IL-4의 발현의 다운 레귤레이션 및 TGF-β1의 업 레귤레이션을 ELISA에 의해 측정하는데, 이는 확립된 관용의 증거이다. IFNγ, I L-17a, IL-2 및 IL-4의 세포내 염색은, OVA 및/또는 SIINFEKL(서열번호 3) 펩타이드에 의한 엑스 비보에서의 재자극으로부터 6시간 후, 비장 세포 및 림프절 유래 세포의 유세포분석을 이용하여 실시된다. 또한, 유세포분석을 이용하여, 림프절, 비장 및 혈액 유래 세포의 CD4, CD8 및 제어성 T세포와의 발현 프로파일에 대한 특징부여를 실시한다. 추가적으로, 다양한 시점에서 마우스로부터 혈액 샘플을 채취해 OVA 항원에 대한 액성 항체 반응도 측정한다. 엑스 비보에서의 재자극 변형 실험을 실시해, 전신성 면역 관용이 확립되어 있는지 판정한다. 전술한 바와 같이, 마우스에 OVA-항체 또는 OVA-항체-나노입자 콘쥬게이트를 투여하고, 9일 후에 아주반트(지질다당체(lipopolysaccharide), 완전 플루드 아주반트(complete Freud's adjuvant), 명반 또는 그 외)와 함께 OVA를 재투여해, OVA 항원에 대한 비장 세포의 반응을 ELISA 및/또는 유세포분석에 의해 분석한다. OVA-항체 및/또는 OVA-항체-나노입자 제제에 의해, 비장 세포는 OVA 및 아주반트에 의한 제 2 실험에 반응하지 않도록 되는데, 이것은 전신성 면역 관용의 효과적인 확립을 증명하는 방법이다. 우리의 OVA-압타머 및/또는 OVA-압타머-나노입자 제제에 의한 최초의 투여 후, 관용을 증명하기 위해, 실시예 3에 상세하게 기재된 연구와 같이 OT-I T세포의 입양전달 등, 유전자 도입 세포주 방식을 이용하여 인비보에서 유사한 실험을 실시할 수 있다. 자가면역 마우스 모델의 면역 관용 또는 치료제 분자의 탈면역화를 증명하기 위해, 본 명세서에 OVA에 대해 설명된 것처럼 관련 항원에 대한 유사한 압타머 구조체를 제조한다.
실시예 9: 사람 적혈구에 대한 결합의 특징부여
비 세포(non-cell) 디스플레이 문맥에 있어서, 사람 적혈구에 결합된 상기 선택된 세균 디스플레이 펩타이드에 특징부여를 위해, 상기 펩타이드는 화학적으로 합성되며 APC(fluorescent protein allophycocyanin)에 콘쥬게이트된다. 상기 방법을 통해, 적합한(용해성) 문맥에서 각 펩타이드의 적혈구 결합 능력, 즉 단백질 콘쥬게이트로서 특징이 부여된다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 펩타이드 ERY64, ERY123, 및 ERY141은 APC의 콘쥬케이트로서 사람 적혈구에 결합한다.
APC 펩타이드 콘쥬게이션 방법
펩타이드는 PolyPeptide Group (Strasbourg, France)의 표준 fmoc 고체 펩타이드 합성을 통하여 주문합성되었다. 3M 구아니딘-HCl에 용해된 10당량의 펩타이드를 PBS내 2mg/mL 말레이미드-활성화 APC(InnovaBiosciences, Cambridge, UK)에 첨가하였다. 4℃에서 4시간의 인큐베이션 후에, 상기 반응물은 2 mL ZEBA 탈염 컬럼(Thermo Scientific)에서 탈염 되었고 4℃로 저장되었다.
유세포분석법을 통한 적혈구 결합의 정량
새롭게 분리된 사람 혈액을 20mg/mL BSA가 첨가된 PBS로 100배 용해시켰다. 5x105 개의 적혈구를 1 μM APC-펩타이드 콘쥬게이트 150 μL에 첨가하고 37℃에서 45분간 인큐베이션하였다. 세포를 충분한 양의 PBS내 20 mg/mL BSA로 세척한 후 CyAn ADP Flow cytometer (Beckman Coulter) 상에서 APC 형광에 대해 분석하였다.
실시예 10: 단일사슬 항체 융합 항원과 적혈구 결합에 의한 항원 특이적 면역학적 관용의 유도
OVA, SIINFEKL의 상기 MHC-I 면역 우성 도메인에 대한 scFv의 재조합적 융합체가 형성되었다. 도 7의 유세포분석에서 입증되었듯이, 상기 결과물 scFv (이하에서 TER119-SIINFEKL라고 함)은 마우스 적혈구와 결합하였다.
ERY1-OVA가 상기 관용을 유도하는 것이 증명되었으므로 상기 시스템은 면역학적 경우에 대한 특징부여에 유용하다. ERY1-OVA 의 적혈구 결합은, 항원 제시 세포(APCs)에 의한 OVA 면역 우성 MHC I 에피톱(SIINFEKL)의 효율적인 교차 제시 및 대응하는 반응성 T세포의 교차 감작을 일으키는 것이 관찰되었다. CFSE-labeled OT-I CD8+ T세포 (CD45.2+)를 CD45.1+ 마우스에 입양 전달하고 나서, 10 μg OVA, 10 μg ERY1-OVA, 등몰 용량의 TER119-SIINFEKL, 또는 등몰 용량의 SIINFEKL을 정맥내 투여하고 5일간 OT-I CD8+ T세포의 증식을 측정하였다. 유세포 분석기로 측정한 형광 CFSE의 희석에 의해 판정하면, OT-I CD8+ T세포의 증식은, ERY1-OVA 또는 OVA와 비교하여, TER119-SIINFEKL가 투여된 마우스에서 현저하게 증강된 것(도 8)으로부터, 적혈구 결합에 의해 가용성 항원 SIINFEKL에 비해 항원 특이적 CD8+ T세포의 교차 감작(cross-priming)이 증강되었음을 보여준다.
기능적인 이펙터 표현형이 되는 T세포와 증폭 및 제거되는 T세포를 구별하기 위해, 증식하는 OT-I C D8+T세포를 아포토시스 및 유전자 결실, 게다가 소진 마커 PD-1(exhaustion marker programmed death-1)의 특징으로서 아넥신-V에 대해 분석하였다. TER119-SIINFEKL 및 ERY1-OVA 는 OVA 보다 훨씬 많은 수의 아넥신-V+ 와 PD-1+ 증식 OT-I CD8+ T세포를 야기하였다(도 9).
확립된 OT-I 챌린지-투-톨러런스 모델(Liu, Iyoda, et al., 2002)을 사용하여, 백신-매개 항원 실험에 대한 후속 면역반응을 막는 TER119-SIINFEKL 및 ERY1-OVA의 능력을 - 매우 강한 세균 유래 아주반트 조건 하에서도 확인하였다. (Liu, Iyoda, et al,, 2002). 관용화하기 위해, OT-I CD8+ (CD45.2+) T세포를 CD45.1+ 마우스에 입양 전달하고, 1일 및 6일 후에 10 μg의 OVA 또는 ERY1-OVA, 또는 등몰 용량의 TER119-SIINFEKL을 정맥내 투여하였다. 추가로 9 일 후, 이입된 T세포가 제거될 수 있도록 리포다당(LPS)을 아주반트로 첨가한 OVA를 피투여 마우스에 피내 주사하였다. 상기 실험으로부터 4 일 후, 유입 영역 림프절 및 비장 세포외, 그 염증 반응의 특징부여에 의해, 제거가 실제로 발생했는지 판정하였다.
TER119-SIINFEKL 또는 ERY1-OVA의 정맥내 투여의 결과, 유입 영역 림프절(도 14; 도 14b에서 게이팅) 및 비장의 OT-I CD8+ T세포 집단이, LPS에 의한 항원 실험 전에 언모디파이드 OVA를 투여한 마우스(도 14c)에 비해 현저하게 감소한 것으로부터 제거성 관용이 증명되었다. ERY1-OVA로 처치한 마우스 유래의 유입 영역 림프절에 포함된 OT-I CD8+ T세포는, OVA로 처치한 마우스와 비교해 11배 이상 감소하였고, 항원의 정맥내 주사를 하지 않았던 실험 대조 마우스보다 39배 감소하였다; 비장 세포의 반응도 유사하였다. TER119-SIINFEKL로 처치한 마우스 유래의 유입 영역 림프절에 포함된 OT-I CD8+ T세포는, OVA로 처치한 마우스와 비교해 13배 이상 감소하였고, 항원의 정맥내 주사를 하지 않았던 실험 대조 마우스보다 42배 이상 감소하였다; 비장 세포의 반응도 유사하였다. ERY1-OVA가 투여된 마우스에 나타난 이와 같은 효과적인 클론 제거는, OT-I CD8+ T세포의 교차 감작의 증강이라고 하는 기존의 관찰 결과(도 8)를 지지하는 것이고, 또한 교차 감작이 공자극 분자의 APC 제시의 비존재 하에서 일어나 제거성 관용을 야기한 것을 나타낸다.
항원 실험 후의 면역 반응을 더 평가하기 위해, OT-I CD8+ T세포에 의한 인터페론γ(IFNγ)의 발현으로부터, 상주성의 림프절 및 비장 세포의 염증 특성의 특징부여를 실시하였다(도 10). OVA 및 LPS 에 의한 실험 후, ERY1-OVA 로 미리 처치한 마우스의 림프절 IFNγ 발현 세포는, 실험 대조 마우스(항원을 미리 투여하지 않았음)와 비교해 10 배 적고, 동 용량의 OVA 로 미리 처치한 마우스와 비교해 4 배 이상 감소하였다. OVA 및 LPS에 의한 챌린지 후, TER119-SIINFEKL로 미리 처치한 마우스의 림프절 IFNγ발현 세포는, 실험 대조 마우스(항원을 미리 투여하지 않았음)와 비교해 33배 적고, 동 용량의 OVA로 미리 처치한 마우스와 비교해 14배 이상 감소한 것으로부터, 실험에 대한 관용 유도에 의한 보호에 있어서의 적혈구 결합의 중요성이 증명되었다; 비장 세포의 반응도 유사하였다.
동물실험
스위스 수의 당국은 이미 모든 동물 처치를 승인하였다. C57BL/6-Tg(TcraTcrb) 1100 Mjb(OT-I) 마우스(Jackson Labs)를 EPFL 동물 시설에서 사육하고, 비장 세포 분리에는 6~12주령의 암컷을 사용하였다. OT-I CD8+ T세포의 입양전달 및 관용유도 연구에는 8~12주령의 암컷 B6.SJL-PtprcaPepcb/Boy (CD45.1) 마우스(Charles River)를 대상 숙주로 사용하였다.
펩타이드의 설계와 합성 방법
ERY1(H2N-WMVLPWLPGTLDGGSGCRG-CONH2)(서열번호 128) 펩타이드를, TGR 수지(Nov a Biochem)를 이용하여 자동 리퀴드 핸들러(Chemspeed)로 표준적인 고상 f-moc 화학에 의해 합성하였다. 밑줄 친 서열은, 본 발명자들이 파지 디스플레이에 의해 마우스 글리코포린 A 바인더로서 이전에 발견한 ERY1의 12-mer 서열이다(Kontos and Hubbell, 2010). 상기 GGSG 영역은, 콘쥬게이션에 사용되는 시스테인 잔기와의 링커로서 기능하였다. 인접하는 아르기닌 잔기는 pKa 를 저하시키고, 따라서 시스테인 잔기의 반응성을 높이는 역할을 하였다(Lutolf, Tirelli 등, 2001년). 펩타이드는, 95% 트리플루오로아세트산, 2.5% 에탄디티올, 2.5% 물을 이용하여 수지로부터 3시간 동안 절단되었고, 얼음 냉각 디에틸에테르로 침전시켰다. 정제는, C18 역상 컬럼(PerSpective Biosystems)을 이용하여 예비 HPLC-MS(Waters)로 실시하였다.
APC 펩타이드 콘쥬게이션 방법
디메틸포름아마이드에 용해시킨 10 몰 당량의 숙신이미딜-4-(N-말레이미드메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC, CAS# 64987-85-5, Thermo Scientific)를 5 mg/mL의 엔도톡신 프리(<1 EU/mg) OVA(Hyglos G mbH)와 PBS 중에서 1시간 동안 실온으로 반응시켰다. 2 mL의 ZEBA 탈염 스핀 컬럼(Thermo Scientific)으로 탈염 후, 3 M 의 구아니딘-HCl에 용해시킨 10 당량의 ERY1를 첨가하고 2시간 동안 실온으로 반응시켰다. 상기 콘쥬게이트는 2 mL Zeba 탈염 스핀 컬럼을 사용하여 탈염되었고, 0.2 μm 필터로 여과 멸균된 후 사용 용량으로 분주되고 -20℃로 저장되었다. 단백질 농도는, BCA 어세이(Thermo Scientific)에 의해 결정하였다. 이 스킴에 의해, 펩타이드의 시스테인 곁사슬과 항원의 리신 곁사슬과의 콘쥬게이션을 얻을 수 있다.
T세포의 입양전달 방법
CD8 자성 비즈 네거티브 선택 키트(Miltenyi Biotec)를 제조사의 지침대로 이용하여, OT-I(CD45.2+) 쥐 비장으로부터 CD8+ T세포를 분리하였다. 새롭게 분리된 CD8+OT-I 세포를 PBS에 재현탁하고, 1 μM의 카르복시플루오레세인 숙신이미딜에스테르(CFSE, Inv itrogen)로 6분간 실온에서 표지하고, 10% FBS(Gibco)를 포함하는 등 체적의 IMDM로 1분간 반응을 휴지시켰다. 세포를 세정하고, 카운트하고, 주사 전에 순수한 IMDM에 재현탁 하였다. 3x106 개의 CFSE 표지 CD8+OT-I 세포를 피험체 CD45.1+ 마우스 꼬리 정맥에 정맥내 주사하였다. 단기 증식 연구를 위해, 입양전달 24시간 경과 후에 10 μg 의 ERY1-OVA 또는 OVA, 또는 등몰 용량의 TER119-SIINFEKL를 100 μL 주사하였다. 항원 투여로부터 5일 후에 비장 세포를 채취해, 유세포분석을 통한 분석을 위해 염색하였다.
OT-I 톨러런스 및 실험 모델 방법
3x105 개의 CFSE 표지 OT-I CD8+ T세포를 상기와 같이 CD45.1+ 피험체 마우스에 주사하였다. 입양전달로부터 1일 후 및 6일 후, 10 μg의 ERY1-OVA 또는 OVA, 또는 등몰 용량의 TER119-SIINFEKL를 포함하는 100μL의 식염수를 마우스의 꼬리 정맥에 정맥내 투여하였다. 입양전달로부터 15일 후, 5 μg의 OVA 및 25 ng의 초고순도의 대장균 LPS (ultra-pure Escherichia coli LPS; InvivoGen) 25 μl를 각각의 마우스의 뒷 다리 패드에 피내 주사하였다(Hock 법, 총투여량 10μg 의 OVA 및 50 ng 의 LPS). 마우스를 실험 후 4일 후에 도살하고, 재자극을 위해 비장 및 유입 영역 림프절 세포를 분리시켰다. 세포내 사이토카인의 유세포분석을 위해, 세포를 1 mg/mL의 OVA 또는 1 μg/mL의 SIINFEKL 펩타이드(Genscript) 의 존재 하에서 3 시간 동안 재자극하였다. Brefeldin-A(Sigma, 5μg/mL)를 첨가하며 염색 및 유세포분석 전에 재자극을 추가로 3 시간 동안 계속하였다.
항체 및 유세포분석법
유세포분석에는 이하의 항 마우스 항체가 사용되었다: 고정가능한 라이브/데드 색소(Invitrogen), 및 아넥신-V-Cy5 라벨링 키트 (BioVision) 외, CD1d Pacific Blue, CD3ε PerCP-Cy5.5, CD8α PE-Cy7, CD45.2 Pacific Blue, IFNγ-APC, CD8α APC-eF780, (모두 eBioscience). 샘플은, CyAn ADP 유세포 분석기(Beckman Coulter)로 분석되었다. 최초로 PBS로 세포를 세정하고, 라이브/데드(live/dead) 색소로 20분간 얼음 상에서 염색하고, 24G2 하이브리도마 배지로 20분간 얼음 상에서 블로킹하고, 20분간 얼음 상에서 표면 염색하고, 2% 파라포름알데하이드로 20분간 얼음 상에서 고정하고, 0.5% 사포닌 존재 하에서 45분간 얼음 상테서 세포내 염색한 후, 분석 전에 마지막 세정을 실시하였다. 아포토시스 염색의 경우, 분석 전에 아넥신-V-Cy5를 5분 첨가하였다.
실시예 11: 적혈구 결합 펩타이드-및-콘쥬게이트 항원의 융합 분자를 통한 치료 단백질에 대한 항원 특이적 면역학적 관용 형성
아스파라기나제의 마우스 적혈구 결합 변종(ERY1-ASNase)을 상기 마우스 적혈구 특이적 펩타이드 ERY1의 콘쥬게이트를 통해 형성하였다 (Kontos and Hubbell, 2010). 적혈구 결합형 및 와일드형 아스파라기나제의 면역원성을 측정하기 위하여, 두 가지 레짐(regimens), 즉 ERY 콘쥬게이트 또는 고유형(ASPARAGINASE MEDAC, Medac GmbH; ERY1-ASNase 콘쥬게이트에 대한 원료물질로도 사용되었음)을 2-도스(dose) 및 6-도스 레짐에 노출시키는 연구를 수행하였다. 각각의 레짐에서, 15 μg의 ERY1-ASNase 또는 ASNase를 2일마다 정맥내 투여하고, 7일마다 혈액을 채취하였다.
치료 용량에 노출시킨 후, 최종 주사후 21일까지 다양한 시점에서 항체 타이터(antibody titers)를 측정하였다. 결과는, 적혈구 콘쥬게이션을 통해 2-도스 레짐과 6-도스 레짐 시리즈 전부에 있어서 항체가 전혀 관찰되지 않았고, 면역원성이 상당히 감소되었음이 명확하게 나타났다(도 11). 대조적으로, 와일드형인 고유형 아스파라기나제 (현재 임상적으로 사용되는 제품명 ASPARAGINASE MEDAC)는 2-도스 레짐 후에도 강한 면역력(vigorous immunity)을 야기하였다.
적혈구 결합 아스파라기나제가 와일드형 아스파라기나제에 대해 진정한(bona-fide) 면역을 야기하였는지 여부에 대해 알아보기 위해 예방적 연구를 수행하였다. 와일드형 임상 아스파라기나제가 미리 투여된 마우스에 체액면역 개시 후 추가의 용량(dose)을 투여하였다. 단백질의 재투여 후 항체 레벨은 증가하거나 유지되었다; 이것은 치료에 대한 과민증 및 쇼크 반응의 위험한 임상 상황을 나타내는 것이다. ERY1-콘쥬게이트 아스파라기나제가 미리 투여된 마우스는 와일드형 아스파라기나제를 6회 투여한 후에도 잠재적인 항체 반응을 야기하는데 실패하였다. 평균적으로, 적혈구 결합 아스파라기나제로 관용화된(tolerized) 마우스는 임상 와일드형 아스파라기나제에 대하여 약 600배 적은 항체를 발현하였다.
ERY1-ASNase 콘쥬게이션 방법
10몰 당량의 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC, CAS# 64987-85-5, Thermo Scientific)를 디메틸포름아마이드에 용해한 후 5 mg/mL의 PBS내 Asparaginase Medac 과 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 2 mL의 Zeba 탈염 스핀 컬럼(Thermo Scientific)으로 탈염 후, 3 M 의 구아니딘-HCl에 용해시킨 2.5 당량의 ERY1 펩타이드를 첨가하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 콘쥬게이트는 2 mL Zeba 탈염 스핀 컬럼을 사용하여 탈염되었고, 0.2 μm 필터로 여과 멸균되어, 사용 용량으로 분주된 후 -20℃로 저장되었다. 단백질 농도는, BCA 어세이(Thermo Scientific)에 의해 분석하였다. 이 스킴에 의해, 펩타이드의 시스테인 곁사슬와 항원의 리신 곁사슬과의 콘쥬게이션을 얻을 수 있다.
결합 방법의 유세포 분석기 측정
새로 분리해낸 사람의 혈액을 20mg/mL BSA가 첨가된 PBS로 100배 희석하였다. 약 500,000 개의 적혈구를 100 nM 의 아스파라기나제에 첨가하고 37℃ 에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 세척 후, 세포를 염소 항-아스파라기나제(Abnova)와 얼음 위에서 30분간 인큐베이션 하였다. 2차 세척 후, 세포를 ALEXAFLUOR488-콘쥬게이트 항-염소 IgG 항체(Invitrogen)와 얼음 위에서 20분간 인큐베이션 하였다. 최종 세척 후, 세포를 유세포 분석기 상에서 분석하여 적혈구 결합 아스파라기나제를 검출하였다.
아스파라기나제 투여 방법
바람직한 투여량의 ERY1-ASNase 또는 ASNase 를 멸균된 0.9% 식염수(saline)로 조제하고, 100 μL의 용액을 마취시킨 C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥내 주사하였다. 예정된 시간에 혈액을 볼절개(cheek puncture) 또는 꼬리절개(tail incisions)에 의해 채취하였다.
세럼법에 의해 항 아스파라기나제 항체 검출
실험군으로부터 세럼을 연속적으로 PBS 로 희석한 후 ASNase 코팅 ELISA 플레이트 상에서 실온으로 2시간 동안 인큐베이션 하였다. HRP-콘쥬게이트 항-마우스 IgG (Southern Biotech)를 검출용 항체로 사용하였다.
실시예 12: 면역반응 후 관용 형성에 대한 면역 반전(Immune Reversal)
치료 단백질 또는 목적 단백질에 대한 면역성이 환자에게 이미 유발된 임상 케이스(항-약물-항체 존재로 예를 들 수 있는)에 있어서, 약물에 대한 면역 반응을 리버스시켜 추가적인 치료적 사용이 가능하게 하는 것이 바람직하다. 다시, 본 실시예에서는 임상적으로 입수 가능한 미생물 효소 아스파라기나제를 사용하여 아스파라기나제에 대해 이미 면역성을 갖는 마우스에서 치료 단백질에 대한 관용을 유발하는 것을 보여준다. 아스파라기나제의 마우스 적혈구 결합 변종(ERY1-ASNase)을 상기 마우스 적혈구 특이적 펩타이드 ERY1의 콘쥬게이트를 통해 형성하였다.
적혈구 결합 아스파라기나제가 임상 아스파라기나제에 대해 면역을 리버스할 수 있는지에 대해 알아보는 교차 연구를 수행하였다. 마우스에 와일드형 아스파라기나제를 2일 간격으로 정맥내 다중 투여하였다. 투여 21일 후, 세럼에서 높은 레벨의 항 아스파라기나제가 검출되었다. 그 후, 면역화된 마우스를 다양한 투여량의 적혈구 결합 아스파라기나제 레짐으로 치료적으로 처치하였다. 두 가지 투여 레짐에 있어서, ERY-콘쥬게이트 아스파라기나제는 항체 레벨을 약 10 배 감소시켜, 기존 체액 면역을 리버스하였다.
ERY1-ASNase 콘쥬게이션 방법
10몰 당량의 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC, CAS# 64987-85-5, Thermo Scientific)를 디메틸포름아마이드에 용해한 후 5 mg/mL 의 PBS 내 Asparaginase Medac 과 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 2 mL의 Zeba 탈염 스핀 컬럼(Thermo Scientific)으로 탈염 후, 3 M 의 구아니딘-HCl에 용해시킨 2.5 당량의 ERY1 펩타이드를 첨가하고 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 상기 콘쥬게이트는 2 mL ZEBA 탈염 스핀 컬럼을 사용하여 탈염되었고, 0.2 μm 필터로 여과 멸균되어, 사용 용량으로 분주되어 -20℃로 저장되었다. 단백질 농도는, BCA 어세이(Thermo Scientific)에 의해 측정하였다. 이 스킴에 의해, 펩타이드의 시스테인 곁사슬과 항원의 리신 곁사슬과의 콘쥬게이션을 얻을 수 있다.
결합 방법의 유세포 분석기 측정
새로 분리해낸 사람의 혈액을 20mg/mL BSA가 첨가된 PBS로 100배 희석하였다. 약 500,000 개의 적혈구를 100 nM 의 아스파라기나제에 첨가하고 37℃ 에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포를 염소 항-아스파라기나제(Abnova)와 얼음 위에서 30분간 인큐베이션 하였다. 2차 세척 후, 세포를 ALEXAFLUOR488-콘쥬게이트 항-염소 IgG 항체(Invitrogen)와 얼음 위에서 20분간 인큐베이션 하였다. 최종 세척 후, 세포를 유세포 분석기 상에서 분석하여 적혈구 결합 아스파라기나제를 검출하였다.
아스파라기나제 투여 방법
바람직한 투여량의 ERY1-ASNase 또는 ASNase 를 멸균된 0.9% 식염수(saline)로 조제하고, 100 μL의 용액을 마취시킨 C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥내 주사하였다. 예정된 시간에 혈액을 볼절개(cheek puncture) 또는 꼬리절개(tail incisions)에 의해 채취하였다.
세럼법에 의해 항 아스파라기나제 항체 검출
실험군으로부터 세럼을 연속적으로 PBS 로 희석한 후 ASNase 코팅 ELISA 플레이트 상에서 실온으로 2시간 동안 인큐베이션 하였다. HRP-콘쥬게이트 항-마우스 IgG (Southern Biotech)를 검출용 항체로 사용하였다.
실시예 13: 마우스 적혈구 및/또는 사람 적혈구에 결합하는 항체 및 항체 단편의 개발
몇 개의 적혈구 결합 항원 구조체가 형성되었다. 이들은 단백질 레벨: TER119-SIINFEKL, TER119-ChrA, 및 TER119-프로인슐린에 관한 것을 포함한다. 이들은 또한 유전자 레벨: TER119-SIINFEKL, TER119-ChrA, TER119-프로인슐린, TER119-uricase, TER119-InsB9-23, TER119-ISQAVHAAHAEINEAGR (서열번호 80), TER119-H-2kb, TER119-H-2kd, 10F7-SIINFEKL, 10F7-ChrA, 10F7-프로인슐린, 및 10F7-uricase에 관한 것을 포함한다.
방법:
TER-119 하이브리도마 클론으로부터의 mRNA는 스위스 제네바 대학의 소조 이즈이 교수로부터 기증받았다. Superscript III First Strand Synthesis System(Inv itrogen) 를 이용하고, 표준적인 역전사 PCR(RT-PCR) 를 실시해, 클론의 상보(complimentary) DNA(cDNA) 를 제조하였다. 이어서 하기 표 5의 프라이머 세트를 이용해 PCR을 하고 항체의 가변 중사슬(VH) 및 가변 경사슬(VL) 영역의 DNA서열을 특이적으로 증폭시켰다.
프라이머
명칭		 프라이머 서열 (5' 내지 3') 서열번호
VL-FOR1 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TCC AGC TGA CTC AGC C 서열번호 81
VL-FOR2 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TTC TCW CCC AGT C 서열번호 82
VL-FOR3 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TGM TMA CTC AGT C 서열번호 83
VL-FOR4 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TGY TRA CAC AGT C 서열번호 84
VL-FOR5 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TRA TGA CMC AGT C 서열번호 85
VL-FOR6 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTM AGA TRA MCC AGT C 서열번호 86
VL-FOR7 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTC AGA TGA YDC AGT C 서열번호 87
VL-FOR8 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TYC AGA TGA CAC AGA C 서열번호 88
VL-FOR9 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TTC TCA WCC AGT C 서열번호 89
VL-FOR10 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG WGC TSA CCC AAT C 서열번호 90
VL-FOR11 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTS TRA TGA CCC ART C 서열번호 91
VL-FOR12 AGC CGG CCA TGG CGG AYR TTK TGA TGA CCC ARA C 서열번호 92
VL-FOR13 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TGA TGA CBC AGK C 서열번호 93
VL-FOR14 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TGA TAA CYC AGG A 서열번호 94
VL-FOR15 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TGA TGA CCC AGW T 서열번호 95
VL-FOR16 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTG TGA TGA CAC AAC C 서열번호 96
VL-FOR17 AGC CGG CCA TGG CGG AYA TTT TGC TGA CTC AGT C 서열번호 97
VL-FOR18 AGC CGG CCA TGG CGG ARG CTG TTG TGA CTC AGG AAT C 서열번호 98
VL-REV1 GAT GGT GCG GCC GCA GTA CGT TTG ATT TCC AGC TTG G 서열번호 99
VL-REV2 GAT GGT GCG GCC GCA GTA CGT TTT ATT TCC AGC TTG G 서열번호 100
VL-REV3 GAT GGT GCG GCC GCA GTA CGT TTT ATT TCC AAC TTT G 서열번호 101
VL-REV4 GAT GGT GCG GCC GCA GTA CGT TTC AGC TCC AGC TTG G 서열번호 102
VL-REV5 GAT GGT GCG GCC GCA GTA CCT AGG ACA GTC AGT TTG G 서열번호 103
VL-REV6 GAT GGT GCG GCC GCA GTA CCT AGG ACA GTG ACC TTG G 서열번호 104
VH-FOR1 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA KGT RMA GCT TCA GGA GTC 서열번호 105
VH-FOR2 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA GGT BCA GCT BCA GCA GTC 서열번호 106
VH-FOR3 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GCA GGT GCA GCT GAA GSA STC 서열번호 107
VH-FOR4 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA GGT CCA RCT GCA ACA RTC 서열번호 108
VH-FOR5 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GCA GGT YCA GCT BCA GCA RTC 서열번호 109
VH-FOR6 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GCA GGT YCA RCT GCA GCA GTC 서열번호 110
VH-FOR7 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GCA GGT CCA CGT GAA GCA GTC 서열번호 111
VH-FOR8 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA GGT GAA SST GGT GGA ATC 서열번호 112
VH-FOR9 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA VGT GAW GYT GGT GGA GTC 서열번호 113
VH-FOR10 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA GGT GCA GSK GGT GGA GTC 서열번호 114
VH-FOR11 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA KGT GCA MCT GGT GGA GTC 서열번호 115
VH-FOR12 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA GGT GAA GCT GAT GGA RTC 서열번호 116
VH-FOR13 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA GGT GCA RCT TGT TGA GTC 서열번호 117
VH-FOR14 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA RGT RAA GCT TCT CGA GTC 서열번호 118
VH-FOR15 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA AGT GAA RST TGA GGA GTC 서열번호 119
VH-FOR16 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GCA GGT TAC TCT RAA AGW GTS TG 서열번호 120
VH-FOR17 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GCA GGT CCA ACT VCA GCA RCC 서열번호 121
VH-FOR18 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA TGT GAA CTT GGA AGT GTC 서열번호 122
VH-FOR19 GTT ATT GCT AGC GGC TCA GCC GGC AAT GGC GGA GGT GAA GGT CAT CGA GTC 서열번호 123
VH-REV1 CCC TTG AAG CTT GCT GAG GAA ACG GTG ACC GTG GT 서열번호 124
VH-REV2 CCC TTG AAG CTT GCT GAG GAG ACT GTG AGA GTG GT 서열번호 125
VH-REV3 CCC TTG AAG CTT GCT GCA GAG ACA GTG ACC AGA GT 서열번호 126
VH-REV4 CCC TTG AAG CTT GCT GAG GAG ACG GTG ACT GAG GT 서열번호 127
그 다음에, 증폭한 VH 유전자 및 VL 유전자를 제한 엔도뉴클레아제(VL에는 NcoI 및 NotI, VH에는 NdeI 및 HindIII) 로 소화시키고, 유전자 단편을 아가로스 전기영동 후에 표준 키트(Zymo Research, Orange, CA, US A)를 이용하여 정제하고, 클로닝 플라스미드 pMAZ360 에 라이게이트하였다. 그 후, 클로닝 플라스미드를 시퀀스하여 TER119의 VH 및 VL 유전자의 DNS 서열을 결정하였다.
TER119 및 10F7-항원 DNA 구조체를 설계 및 상업적으로 합성하고, DNA2.0 (Menlo Park, CA, USA)으로부터 입수하였다.
최종적으로 완성한 scFv 유전자를 각각 Sfil 및 XhoI(NEB, Ips wich, MA, USA)로 소화하고, pSecTagA 포유동물 발현 플라스미드(Inv itrogen, Carlsbad, CA, USA)의 같은 부위에 라이게이트 하였다.
실시예 14: 적혈구 결합 당뇨병 항원을 이용한 당뇨병 유발성 항원에 대한 관용 유발
크로모그라닌-A 미모톱 펩타이드 (1040-p31 or ChrA 라고 함) 펩타이드를 마우스 적혈구에 결합시키기 위하여 마우스 적혈구 특이적 ScFv TER119에 재조합적으로 융합시켜 조작하였다. 결과물인 scFv (여기에서 TER119-ChrA 라고 함)는 마우스 적혈구에 타이트하게 결합하였다(데이터는 개시하지 않음). 크로모그라닌-A 항원 변종에 대한 T세포 행동을 연구하기 위하여, 크로모그라닌-A 항원의 인식을 위한 T세포 특이적인 NODBDC2.5 형질전환 마우스를 사용하였다. TER119-ChrA가 주요 조직 적합성(MHC-II) 복합체 상에 BDC2.5 T세포 프라이밍(priming)에 충분하게 처리되고 나타나는지 알아보기 위하여, 항원을 공생배양 시스템에 BDC2.5 비장 수지상 세포 및 CD4 T세포와 함께 첨가하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, TER119-ChrA는 효과적으로 처리되었고, MHC-II 상에 정확한 항원 도메인이 나타나서 인비트로(in vitro) 형질전환 BDC2.5 CD4 T세포의 항원-특이적 증식을 프라임하였는데, 이것은 인비보(in vivo) T세포 관용의 필요조건이다.
인비보(in vivo) CD4 증식에서 자가항원의 적혈구 결합의 결과를 알아보기 위하여, 형광분자 CFSE로 라벨링된 BDC2.5 CD4 T세포를 사용하여 유사한 증식 연구를 수행하였다. 라벨링된 BDC2.5 CD4 T세포를 나이브 NOD 마우스에 입양전달(adoptive transfer) 한 후, 10 μg의 TER119-ChrA 또는 등몰 투여량의 유리된 가용성(free soluble) 1040-p31 펩타이드를 정맥내 투여하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 비장과 췌장 림프절(pLN)에서 훨씬 적은 양의 비증식 BDC2.5 CD4 T세포를 갖는 TER119-ChrA로 처리된 마우스를 가용성 1040-p31 펩타이드로 처리된 마우스와 비교하였다. 상기 데이터는 적혈구 결합 항원이, 가용성 항원과 기능적으로 구별되는 방식으로, CD8 T세포 제거성 관용에 대한 본 발명자들의 연구결과와 유사하게, 잠재적인 항원 특이적 CD4 T세포 시그널링 및 프라이밍을 유도하는 것을 보여준다. 이와 같은 시스템적(비장) 및 국소적(췌장 림프절) 당뇨병 유발성 T세포의 현저한 감소는 발병을 조절할 수 있는 바람직한 결과를 나타내는 명확하고 긍정적인 징후이다.
실시예 15: 인슐린에 대한 관용 유도
본 명세서에서 이미 기술한 바와 같이(예를 들어 실시예 14 참조), 관용은 다양한 항원에 대해 형성될 수 있다. 본 실시예는 인슐린에 대한 관용이 어떻게 유도될 수 있는지 설명한다. 당뇨병 유발성 T세포에 의해 인식되는 다른 세포군 항원인 인슐린에 대한 관용을 유도하기 위해, 인슐린을 조작하여 마우스 적혈구 특이적 scFv TER119에 재조합적 융합에 의해 마우스 적혈구에 결합시켰다. 결과물인 scFv (이하 TER119-프로인슐린 이라 함)를 자발적 개시(spontaneous onset) T1D의 통상적인 마우스 모델, 즉 NOD/ShiLt 마우스에서 구현하였다. NOD/ShiLt 마우스는 자발적으로 면역세포에 의해 매개되는 인슐린-생산 췌장 조직의 면역세포 파괴를 진행하였고, 그 결과 고혈당과 임상 질환의 개시를 유발하였다. 유사하게, 인간 인슐린과 인간 적혈구 결합 인자는 인체에서 인슐린에 대한 관용을 형성하는데 사용될 수 있다.
상기 자연발생적으로 튼튼한 자가면역 마우스에서 관용화를 입증하기 위해, TER119-프로인슐린을 어린 (~3 주령) 마우스에 인슐린 반응 T세포를 기능적으로 비활성화 및/또는 제거하려고 다양한 시간 간격과 용량으로 투여하였다. 상기 처리된 마우스의 글루코스 레벨을 고혈당 및 임상 질환의 발병의 측정을 위해 모니터하였다. TER119-프로인슐린은 또한 질병의 차도를 유도하기 위해 치료 모드로 사용되기도 하였다. 상기 연구에서, TER119-프로인슐린은 새로이 발병한 고혈당 마우스에게 다양한 용량과 시간 간격을 두고 투여되었으며, 고혈당의 완화와 항상성의 회복을 측정하기 위해 글루코스 레벨을 모니터하였고, 이를 통해 T1D의 임상적 발병에 대한 차도를 입증하였다.
실시예 16: 적혈구 결합 MHC 분자를 이용한 세포 이식편 및 이식에 대한 관용 형성
이식편의 관용 형성 과정을 예로 들어 설명한다. 적혈구 결합 펩타이드를 가용성 MHC 도메인에 화학적으로 콘쥬게이트하여 적혈구 결합 MHC 분자를 조작하였다. 다른 방법으로, MHC 분자는 적혈구 특이적 scFv와 융합되어 재조합적으로 발현될 수 있다.
적혈구 결합에 의한 MHC 분자에 대한 관용을 보여주기 위하여, 마우스 모델의 종양 이식편, 피부 이식편, 세포군 이식 및 조혈세포 이식과 같은 세포 이식을 수행하였다. 각각의 연구에서, 호스트 마우스는 이식 절차 전에 또는 도중에 적혈구 결합 MHC를 투여하여 도너에 대해 관용화되었다. 이식 수용성(Graft acceptance)은 각각의 연구에 적합한 방법으로 관찰되었다; 즉, 종양 이식편에서 종양의 성장 측정, 피부 이식에서 조직괴사 또는 성장 관찰, 세포군 이식에서 세포군 질량 및 혈당증 관찰, 및 조혈세포 이식에서 키메라 현상 특징부여.
추가 설명
일 구현예는, 면역 관용을 일으키는 방법이며, 관용 유도 항원 및 환자의 적혈구에 특이적으로 결합하고, 그것에 의해 항원을 적혈구에 결합하는 적혈구 결합 부분을 포함하는 분자 융합체를 포함한 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 분자 융합체는 관용 유도 항원을 포함한 물질에 면역 관용을 일으키는데 효과적인 양으로 투여하는 것이다. 일 구현예는, 분자 융합체가, 항원에 직접 공유결합한 적어도 하나의 적혈구 결합 부분으로 이루어지는 방법이며, 예를 들어, 융합 단백질은 그 결합 부분 및 항원을 포함한다. 일 구현예는, 분자 융합체가, 항원에 결합하는 또는 항원을 포함하는 입자에 결합된 적어도 하나의 적혈구 결합 부분을 포함하고, 예를 들어, 입자는 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 폴리머솜 및 마이셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 일 구현예는, 관용 유도 항원이 치료용 단백질의 일부분을 포함하는, 예를 들어, 상기 단백질이 제VIII 인자 또는 제IX인자를 포함하는 경우이다. 일 구현예는, 관용 유도 항원이 비인간 단백질의 일부분을 포함하는 경우이다. 일구현예는, 단백질이 아데노신 데아미나제, L-아스파라기나제, 라스브리카제, 항흉선세포 글로블린, L-아르기나제 및 L-메티오나제를 포함하는 경우이다. 일 구현예는, 환자가 사람이며, 관용 유도 항원이 자연계에서 발견되지 않은 단백질의 일부분을 포함하는 방법이다. 일 구현예는, 환자가 사람이며, 관용 유도 항원이, 비인간 형태 글리코실화를 함유하는 단백질의 글리칸을 포함하는 경우이다. 일 구현예는, 관용 유도 항원이, 인체 이식 항원의 적어도 일부분을 포함하는 경우이다. 일 구현예는, 관용화 유도 항원이, 예를 들면, 프리프로인슐린, 프로인슐린, 인슐린, GAD65, GAD67, IA-2, IA-2β, 타이로글로불린(thyroglobulin), 갑상선 퍼옥시다아제, 갑상선 자극 호르몬 수용체, 수초염기성 단백질, 마이엘린 올리고덴드로사이트 당단백질, 단백지질 단백질, 콜라겐 II, 콜라겐 IV, 아세틸콜린 수용체, 매트릭스 금속함유 단백질1 및 3, 분자 샤프롱 열충격 단백질 47, 피브릴린-1, PDGF 수용체 α, PDGF 수용체 β, 및 핵단백질 SS-A로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 자가면역 질환 단백질의 일부를 포함하는 경우이다. 일구현예는, 관용 유도 항원이, 예를 들어, 콘아라킨(Ara h 1), 알레르겐 II(Ara h 2), 피너츠 아글루티닌(Ara h 6), α- 락토알부민(ALA), 락토트랜스페린, 글루테인, 저분자량 글루테인, α-글리아딘, γ-글리아딘, 호르데인, 세카린 및 아베닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 식품의 일부분을 포함하는 경우이다. 일 구현예는, 적혈구 결합 부분이 펩타이드 리간드, 항체, 항체 단편 및 단일 사슬 항원 결합 도메인(ScFv)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경우이다. 일 구현예는, 적혈구 결합 부분이 항체, 항체 단편 또는 적혈구에 대항하여 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 유도된 ScFv을 포함하며, 상기 하이브리도마는 BRIC 4, BRIC 5, BRIC 6, BRIC 10, BRIC 14, BRIC 18, BRIC 39, BRIC 66, BRIC 68, BRIC 69, BRIC 87, BRIC 108, BRIC 110, BRIC 111, BRIC 125, BRIC 126, BRIC 128, BRIC 145, BRIC 155, BRIC 157, BRIC 163, BRIC 170, BRIC 198, BRIC 203, BRIC 216, BRIC 220, BRIC 221, BRIC 222, BRIC 229, BRIC 230, BRIC 231, BRIC 235, BRIC 256, BRAC 17, BRAC 18, BGRL 1, BGRL 2, BGRL 11, BGRL 100, BRAD 3, BIRMA D6, BIRMA D10, BIRMA K3, BIRMA K3, 84B; 6A7; COE; 또는 KZ1로 이루어진 군에서 선택되는 경우이다. 일 구현예는, 적혈구 결합 부분이 Band 3 (CD233), 아쿠아포린-1, Glut-1, 키드 항원, RhAg/Rh50 (CD241), Rh (CD240), Rh30CE (CD240CE), Rh30D (CD240D), Kx, 글리코포린 A, 글리코포린 B (CD235b), 글리코포린 C (CD235c), 글리코포린 D (CD235d), Kell (CD238), Duffy/DARCi (CD234), CR1 (CD35), DAF (CD55), 글로보시드, CD44, ICAM-4 (CD242), Lu/B-CAM (CD239), XG1/XG2 (CD99), EMMPRIN/뉴로텔린 (CD147), JMH, 글리코실전달효소, 카트라이트, 돔브록, C4A/CAB, 시안나, MER2, 스토마틴, BA-1 (CD24), GPIV (CD36), CD108, CD139, 및 H 항원(CD173)으로 이루어진 군에서 선택되는 생체분자에 특이적으로 결합되는 경우이다. 관용 유도 항원은 미모톱을 포함할 수 있다. 일 구현예는, scFv가 10F7의 일부분 또는 전부, 예를 들어, 10F7의 경쇄 및/또는 10F7의 중쇄의 하나 이상 및/또는, 10F7의 경쇄 및/또는 10F7의 중쇄의 것보다 높은 친화성의 변형을 포함하는 경우이다. 일 구현예는, 적혈구 결합 부분이, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번 호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 1 및 이들의 보존적 치환체로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열의 적어도 5개가 연속한 아미노산 잔기를 포함한 펩타이드 리간드를 포함하고, 상기 서열은 적혈구에 특이적으로 결합하는 것인 방법이다.
일 구현예는, 관용 유도 항원 및, 환자의 적혈구에 특이적으로 결합하고 그것에 의해 항원을 적혈구에 결합시키는 적혈구 결합 부분을 함유하는 분자 융합체를 포함하는 조성물이다. 일 예는, 적혈구 결합 부분이 항원에 공유결합하는 경우이다. 다른 예는, 분자 융합체가, 항원에 부착하는 입자, 예를 들어, 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 폴리머솜 또는 마이셀에 부착된 적혈구 결합 부분을 포함하는 경우이다. 관용 유도 항원의 예로서 치료용 단백질의 일부분, 비인간 단백질의 일부분, 인간에게서 자연적으로 발견되지 않는 단백질의 일부분(그 단백질의 전부, 즉, 모든 단백질을 포함), 비인간 형태 글리코실화를 포함한 단백질의 글리칸, 인간 자가면역 항원의 일부분, 사람의 식품의 일부분을 들 수 있다. 일 구현예는, 적혈구 결합 부분이 펩타이드 리간드, 항체, 항체 단편 및 단일 사슬 항원 결합 도메인(ScFv), 예를 들어, 10F7의 전부 또는 일부분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물이다. 적혈구 결합 부분은, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열 번호 17, 서열번호 1 및 이들의 보존적 치환체로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열의 적어도 5개가 연속한 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드 리간드를 포함할 수 있으며, 상기 서열은 적혈구에 특이적으로 결합한다. 적혈구 결합 부분은, 펩타이드와 적혈구와의 평형 결합의 측정에 의해 판정했을 경우, 약 10μM ~ 0.1 nM의 해리상수를 갖는 펩타이드 리간드를 포함하는 부분일 수 있다. 일 구현예는, 적혈구 결합 부분이 항체, 항체 단편 또는 적혈구에 대항하여 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 유도된 ScFv을 포함하며, 상기 하이브리도마는 BRIC 4, BRIC 5, BRIC 6, BRIC 10, BRIC 14, BRIC 18, BRIC 39, BRIC 66, BRIC 68, BRIC 69, BRIC 87, BRIC 108, BRIC 110, BRIC 111, BRIC 125, BRIC 126, BRIC 128, BRIC 145, BRIC 155, BRIC 157, BRIC 163, BRIC 170, BRIC 198, BRIC 203, BRIC 216, BRIC 220, BRIC 221, BRIC 222, BRIC 229, BRIC 230, BRIC 231, BRIC 235, BRIC 256, BRAC 17, BRAC 18, BGRL 1, BGRL 2, BGRL 11, BGRL 100, BRAD 3, BIRMA D6, BIRMA D10, BIRMA K3, BIRMA K3, 84B; 6A7; COE; 또는 KZ1로 이루어진 군에서 선택되는 경우이다. 일 구현예는, 적혈구 결합 부분이 Band 3 (CD233), 아쿠아포린-1, Glut-1, 키드 항원, RhAg/Rh50 (CD241), Rh (CD240), Rh30CE (CD240CE), Rh30D (CD240D), Kx, 글리코포린 A, 글리코포린 B (CD235b), 글리코포린 C (CD235c), 글리코포린 D (CD235d), Kell (CD238), Duffy/DARCi (CD234), CR1 (CD35), DAF (CD55), 글로보시드, CD44, ICAM-4 (CD242), Lu/B-CAM (CD239), XG1/XG2 (CD99), EMMPRIN/뉴로텔린 (CD147), JMH, 글리코실전달효소, 카트라이트, 돔브록, C4A/CAB, 시안나, MER2, 스토마틴, BA-1 (CD24), GPIV (CD36), CD108, CD139, 및 H 항원 (CD173)으로 이루어진 군에서 선택되는 생체분자에 특이적으로 결합된다. 관용 유도 항원은 미모톱을 포함할 수 있다.
상기 관용 유도 조성물은 병리학적 상태, 예를 들어 이식 거부반응, 자가면역 질환, 음식 알레르기 및 치료 인자에 대한 면역 반응에 대해 사용될 수 있다.
본 구현예는 약학적으로 허용 가능한 조성물이며 상기 조성물은 적혈구 결합 부분 및 물질의 항원을 함유하는 융합 분자를 포함하는 물질에 대한 면역 반응의 면역반전에 사용된다. 상기 조성물은 예를 들어, 단백질, 단백질의 부분, 인체 단백질 또는 그것의 부분, 비인체 단백질 또는 그것의 부분, 글리칸, 비인체 글리코실화를 포함하는 단백질의 글리칸, 인간의 자가면역항원, 인체 치료용 단백질 또는 그것의 부분 및 사람 음식의 일부로 이루어진 군에서 선택된 관용 유도 항원을 가질 수 있다. 상기 조성물은, 예를 들어, 유전성 질환에 의한 결손 단백질, 비인체형 글리코실화 단백질, 비인체형 단백질, 인체에서 자연적으로 발견되지 않는 합성 단백질, 사람 음식 항원, 인체 이식 항원 및 인체 자가 면역 항원으로 이루어진 군에서 선택되는 관용 유도 항원을 가질 수 있다. 상기 적혈구 결합 부분은, Band 3 (CD233), 아쿠아포린-1, Glut-1, 키드 항원, RhAg/Rh50 (CD241), Rh (CD240), Rh30CE (CD240CE), Rh30D (CD240D), Kx, 글리코포린 A, 글리코포린 B (CD235b), 글리코포린 C (CD235c), 글리코포린 D (CD235d), Kell (CD238), Duffy/DARCi (CD234), CR1 (CD35), DAF (CD55), 글로보시드, CD44, ICAM-4 (CD242), Lu/B-CAM (CD239), XG1/XG2 (CD99), EMMPRIN/뉴로텔린 (CD147), JMH, 글리코실전달효소, 카트라이트, 돔브록, C4A/CAB, 시안나, MER2, 스토마틴, BA-1 (CD24), GPIV (CD36), CD108, CD139, 및 H 항원(CD173)으로 이루어진 군에서 선택되는 생체분자에 특이적으로 결합되는 것일 수 있다. 상기 적혈구 결합 부분은 펩타이드 리간드, 항체, 항체 단편 및 단일 사슬 항원 결합 도메인(ScFv)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 적혈구 결합 부분은 항체, 항체 단편 또는 적혈구에 대항하여 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 유도된 ScFv을 포함하도록 제조될 수 있으며, 상기 하이브리도마는 BRIC 4, BRIC 5, BRIC 6, BRIC 10, BRIC 14, BRIC 18, BRIC 39, BRIC 66, BRIC 68, BRIC 69, BRIC 87, BRIC 108, BRIC 110, BRIC 111, BRIC 125, BRIC 126, BRIC 128, BRIC 145, BRIC 155, BRIC 157, BRIC 163, BRIC 170, BRIC 198, BRIC 203, BRIC 216, BRIC 220, BRIC 221, BRIC 222, BRIC 229, BRIC 230, BRIC 231, BRIC 235, BRIC 256, BRAC 17, BRAC 18, BGRL 1, BGRL 2, BGRL 11, BGRL 100, BRAD 3, BIRMA D6, BIRMA D10, BIRMA K3, BIRMA K3, 84B; 6A7; COE; 또는 KZ1로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
구현예는 적혈구 결합 부분 및 아스파라기나제의 항원을 포함하는 융합분자를 포함한다. 적혈구 결합 부분에 대한 다양한 개시로부터 명백하듯이, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 및 이들의 보존적 치환체로 이루어진 군에서 선택되는 펩타이드 결합 리간드 또는 인간 적혈구에 결합하는 scFv를 포함하는 다양한 선택이 있을 수 있으며, 상기 서열은 적혈구에 특이적으로 결합한다. 이러한 융합 분자를 포함하는 조성물은 아스파라기나제에 대한 관용을 유도하는데 사용될 수 있다.
구현예는 적혈구 결합 부분과 크로모그라닌-A의 항원을 포함하는 융합 분자를 포함한다. 상기 항원은 미모톱 또는 크로모그라닌-A의 부분 또는 전체가 될 수 있다. 적혈구 결합 부분에 대한 다양한 개시로부터 명백하듯이, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 및 이들의 보존적 치환체로 이루어진 군에서 선택되는 펩타이드 결합 리간드 또는 인간 적혈구에 결합하는 scFv를 포함하는 다양한 선택이 있을 수 있으며, 상기 서열은 적혈구에 특이적으로 결합한다. 상기 융합 분자를 포함하는 조성물은 크로모그라민-A에 대한 관용을 유도하고/하거나 당뇨병을 예방하거나 당뇨성 질환의 진행을 지연시키는 것에 사용될 수 있다.
다른 예는, 합성 폴리머, 분기형 합성 폴리머 및 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 실체에 결합된, 적혈구에 특이적으로 결합하는 적혈구 결합 부분을 포함하는 조성물이다. 입자는, 예를 들어, 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 폴리머솜 및 마이셀일 수 있다. 조성물은, 관용 유도 항원, 치료약 또는 종양 호밍 리간드를 더 포 함할 수 있다.
일 구현예는, 적혈구에 특이적으로 결합하는 펩타이드 리간드를 포함하는 단일 사슬 항원 결합 도메인(scFv) 이다. 펩타이드는, scFv에 결합하고 있거나, 혹은 링커 부분에 배치되어 있어도 된다. 1개 이상의 펩타이드 리간드를 포함할 수 있다.
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본 명세서에 언급된 모든 특허출원, 특허 및 공개물은 모든 목적을 위해 인용에 의해 통합되며, 상충되는 경우에는 본 명세서에 따른다.
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420 tccgacattc agatgacgca gtctccttca gtcctgtctg catctgtggg agacagagtc 480 actctcaact gcaaagcaag tcagaatatt aacaagtact taaactggta tcagcaaaag 540 cttggagaag ctcccaaagt cctgatatat aatacaaaca atttgcaaac gggcatccca 600 tcaaggttca gtggcagtgg atctggtaca gatttcacac tcaccatcag tagcctgcag 660 cctgaagatt ttgccacata tttctgcttt cagcattata cttggcccac gtttggaggt 720 gggaccaagc tggaaatcaa acgtact 747 <210> 70 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 70 actcgcggcc cagccggcca tggcggaggt gaagctgcag gagtc 45 <210> 71 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 71 ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc agaaccacca ccaccggctg aggagacagt 60 gactg 65 <210> 72 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 72 ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gacattcaga tgacgcagtc 50 <210> 73 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 73 gactactagg cccccgaggc cagtacgttt gatttccagc t 41 <210> 74 <211> 793 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10F7 scFv <400> 74 gttattactc gcggcccagc cggccatggc ggcgcaggtg aaactgcagc agagcggcgc 60 ggaactggtg aaaccgggcg cgagcgtgaa actgagctgc aaagcgagcg gctatacctt 120 taacagctat tttatgcatt ggatgaaaca gcgcccggtg cagggcctgg aatggattgg 180 catgattcgc ccgaacggcg gcaccaccga ttataacgaa aaatttaaaa acaaagcgac 240 cctgaccgtg gataaaagca gcaacaccgc gtatatgcag ctgaacagcc tgaccagcgg 300 cgatagcgcg gtgtattatt gcgcgcgctg ggaaggcagc tattatgcgc tggattattg 360 gggccagggc accaccgtga ccgtgagcag cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag 420 cggcggcggc ggcagcgata ttgaactgac ccagagcccg gcgattatga gcgcgaccct 480 gggcgaaaaa gtgaccatga cctgccgcgc gagcagcaac gtgaaatata tgtattggta 540 tcagcagaaa agcggcgcga gcccgaaact gtggatttat tataccagca acctggcgag 600 cggcgtgccg ggccgcttta gcggcagcgg cagcggcacc agctatagcc tgaccattag 660 cagcgtggaa gcggaagatg cggcgaccta ttattgccag cagtttacca gcagcccgta 720 tacctttggc ggcggcacca aactggaaat taaacgcgcg gcggcggcct cgggggccga 780 gggcggcggt tct 793 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 75 Ser Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 10 15 <210> 76 <211> 819 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 76 gaggtgaagc tgcaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggggggtc tctgaaactc 60 tcctgtgtag cctcaggatt cactttcagg gaccactgga tgaattgggt ccggcaggct 120 cccggaaaga ccatggagtg gattggagat attagacctg atggcagtga cacaaactat 180 gcaccatctg tgaggaatag attcacaatc tccagagaca atgccaggag catcctgtac 240 ctgcagatga gcaatatgag atctgattac acagccactt attactgtgt tagagactca 300 cctacccggg ctgggcttat ggatgcctgg ggtcaaggaa cctcagtcac tgtctcctca 360 gccggtggtg gtggttctgg tggtggtggt tctggcggcg gcggctccgg tggtggtgga 420 tccgacattc agatgacgca gtctccttca gtcctgtctg catctgtggg agacagagtc 480 actctcaact gcaaagcaag tcagaatatt aacaagtact taaactggta tcagcaaaag 540 cttggagaag ctcccaaagt cctgatatat aatacaaaca atttgcaaac gggcatccca 600 tcaaggttca gtggcagtgg atctggtaca gatttcacac tcaccatcag tagcctgcag 660 cctgaagatt ttgccacata tttctgcttt cagcattata cttggcccac gtttggaggt 720 gggaccaagc tggaaatcaa acgtactcat catcaccatc atcacggtgg cggttctggc 780 ctggagcagc tggagtctat tattaatttc gaaaaactg 819 <210> 77 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody portion <400> 77 Tyr Val Arg Pro Leu Trp Val Arg Met Glu 1 5 10 <210> 78 <211> 804 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 78 gaggtgaagc tgcaggagtc aggaggaggc ttggtgcaac ctggggggtc tctgaaactc 60 tcctgtgtag cctcaggatt cactttcagg gaccactgga tgaattgggt ccggcaggct 120 cccggaaaga ccatggagtg gattggggat attagacctg atggcagtga cacaaactat 180 gcaccatctg tgaggaatag attcacaatc tccagagaca ataccaggag catcctgtac 240 ctgcagatgg gcaatatgag atctgattac acagccactt attactgtgt tagagactca 300 cctacccggg ctgggcttat ggatgcctgg ggtcaaggaa cctcagtcac tgtctcctca 360 gccggtggtg gtggttctgg tggtggtggt tctggcggcg gcggctccgg tggtggtgga 420 tccgacattc agatgacgca gtctccttca gtcctgtctg catctgtggg agacagagtc 480 actctcaact gcaaagcaag tcagaatatt aacaagtact taaaccggta tcagcaaaag 540 cttggagaag ctcccaaagt cctggtatat aatacaaaca atttgcaaac gggcatccca 600 tcaaggttca gtggcagtgg atctggcaca gatttcacac tcaccatcag tagcctgcag 660 cctgaagatt ttgccacata tttctgcttt cagcattata cttggcccac gtttggaggt 720 gtgaccaagc tggaaatcaa acgtactcat catcaccatc atcacggtgg cggttatgtc 780 agacctctgt gggtcagaat ggaa 804 <210> 79 <211> 1026 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 79 gaggtgaagc tgcaggagtc aggaggaggc ttggtgcaac ctggggggtc tctgaaactc 60 tcctgtgtag cctcaggatt cactttcagg gaccactgga tgaattgggt ccggcaggct 120 cccggaaaga ccatggagtg gattggagat attagacctg atggcagtga cacaaactat 180 gcaccatctg tgaggaatag attcacaatc tccagagaca atgccaggag catcctgtac 240 ctgcagatga gcaatatgag atctgattac acagccactt attactgtgt tagagactca 300 cctacccggg ctgggcttat ggatgcctgg ggtcaaggaa cctcagtcac tgtctcctca 360 gccggtggtg gtggttctgg tggtggtggt tctggcggcg gcggctccgg tggtggtgga 420 tccgacattc agatgacgca gtctccttca gtcctgtctg catctgtggg agacagagtc 480 actctcaact gcaaagcaag tcagaatatt aacaagtact taaactggta tcagcaaaag 540 cttggagaag ctcccaaagt cctgatatat aatacaaaca atttgcaaac gggcatccca 600 tcaaggttca gtggcagtgg atctggtaca gatttcacac tcaccatcag tagcctgcag 660 cctgaagatt ttgccacata tttctgctct cagcattata cttggcccac gtttgatggt 720 gggaccaagc tggaaatcaa acgtactcat catcaccatc atcacggtgg cggttttgtg 780 aaacagcatc tgtgcggtcc gcatctggtg gaagcgctgt atctggtgtg cggcgaacgt 840 ggcttttttt ataccccgaa aagccgtcgt gaagtggaag atccgcaggt ggaacagctg 900 gaactgggcg gcagcccggg tgatctgcag accctggccc tggaagtggc gcgtcagaaa 960 cgtggcattg tggatcagtg ctgcaccagc atttgcagcc tgtatcagct ggaaaactat 1020 tacaac 1026 <210> 80 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv <400> 80 Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly 1 5 10 15 Arg <210> 81 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 81 agccggccat ggcggayatc cagctgactc agcc 34 <210> 82 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 82 agccggccat ggcggayatt gttctcwccc agtc 34 <210> 83 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 83 agccggccat ggcggayatt gtgmtmactc agtc 34 <210> 84 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 84 agccggccat ggcggayatt gtgytracac agtc 34 <210> 85 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 85 agccggccat ggcggayatt gtratgacmc agtc 34 <210> 86 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 86 agccggccat ggcggayatt magatramcc agtc 34 <210> 87 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 87 agccggccat ggcggayatt cagatgaydc agtc 34 <210> 88 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 88 agccggccat ggcggayaty cagatgacac agac 34 <210> 89 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 89 agccggccat ggcggayatt gttctcawcc agtc 34 <210> 90 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 90 agccggccat ggcggayatt gwgctsaccc aatc 34 <210> 91 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 91 agccggccat ggcggayatt stratgaccc artc 34 <210> 92 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 92 agccggccat ggcggayrtt ktgatgaccc arac 34 <210> 93 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 93 agccggccat ggcggayatt gtgatgacbc agkc 34 <210> 94 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 94 agccggccat ggcggayatt gtgataacyc agga 34 <210> 95 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 95 agccggccat ggcggayatt gtgatgaccc agwt 34 <210> 96 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 96 agccggccat ggcggayatt gtgatgacac aacc 34 <210> 97 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 97 agccggccat ggcggayatt ttgctgactc agtc 34 <210> 98 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 98 agccggccat ggcggargct gttgtgactc aggaatc 37 <210> 99 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 99 gatggtgcgg ccgcagtacg tttgatttcc agcttgg 37 <210> 100 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 100 gatggtgcgg ccgcagtacg ttttatttcc agcttgg 37 <210> 101 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 101 gatggtgcgg ccgcagtacg ttttatttcc aactttg 37 <210> 102 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 102 gatggtgcgg ccgcagtacg tttcagctcc agcttgg 37 <210> 103 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 103 gatggtgcgg ccgcagtacc taggacagtc agtttgg 37 <210> 104 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 104 gatggtgcgg ccgcagtacc taggacagtg accttgg 37 <210> 105 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 105 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggakgtrmag cttcaggagt c 51 <210> 106 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 106 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggaggtbcag ctbcagcagt c 51 <210> 107 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 107 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc gcaggtgcag ctgaagsast c 51 <210> 108 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 108 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggaggtccar ctgcaacart c 51 <210> 109 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 109 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc gcaggtycag ctbcagcart c 51 <210> 110 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 110 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc gcaggtycar ctgcagcagt c 51 <210> 111 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 111 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc gcaggtccac gtgaagcagt c 51 <210> 112 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 112 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggaggtgaas stggtggaat c 51 <210> 113 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 113 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggavgtgawg ytggtggagt c 51 <210> 114 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 114 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggaggtgcag skggtggagt c 51 <210> 115 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 115 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggakgtgcam ctggtggagt c 51 <210> 116 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 116 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggaggtgaag ctgatggart c 51 <210> 117 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 117 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggaggtgcar cttgttgagt c 51 <210> 118 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 118 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggargtraag cttctcgagt c 51 <210> 119 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 119 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggaagtgaar sttgaggagt c 51 <210> 120 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 120 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc gcaggttact ctraaagwgt stg 53 <210> 121 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 121 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggatgtgaac ttggaagtgt c 51 <210> 122 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 122 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggatgtgaac ttggaagtgt c 51 <210> 123 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rimer <400> 123 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggaggtgaag gtcatcgagt c 51 <210> 124 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 124 cccttgaagc ttgctgagga aacggtgacc gtggt 35 <210> 125 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 125 cccttgaccc ttgaagcttg ctgcagagac agtgaccaga gtagcttgct gaggagactg 60 tgagagtggt 70 <210> 126 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 126 cccttgaagc ttgctgcaga gacagtgacc agagt 35 <210> 127 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 127 cccttgaagc ttgctgagga gacggtgact gaggt 35 <210> 128 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ligand <400> 128 Trp Met Val Leu Pro Trp Leu Pro Gly Thr Leu Asp Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Cys Arg Gly

Claims (39)

  1. 관용 유도 항원과 환자의 적혈구에 특이적으로 결합하는 적혈구 결합 부분(erythrocyte-binding moiety)을 함유하는 분자 융합체를 포함하며,
    상기 적혈구 결합 부분은, Band 3 (CD233), 아쿠아포린-1, Glut-1, 키드 항원, RhAg/Rh50 (CD241), Rh (CD240), Rh30CE (CD240CE), Rh30D (CD240D), Kx, 글리코포린 B (CD235b), 글리코포린 C (CD235c), 글리코포린 D (CD235d), Kell (CD238), Duffy/DARCi (CD234), CR1 (CD35), DAF (CD55), 글로보시드, CD44, ICAM-4 (CD242), Lu/B-CAM (CD239), XG1/XG2 (CD99), EMMPRIN/뉴로텔린 (CD147), JMH, 글리코실전달효소, 카트라이트, 돔브록, C4A/CAB, 시안나, MER2, 스토마틴, BA-1 (CD24), GPIV (CD36), CD108, CD139, 및 H 항원(CD173)으로 이루어진 군에서 선택되는 생체 분자에 특이적으로 결합하는 것인, 약학적으로 허용가능한 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 적혈구 결합 부분이 항원에 공유결합되어 있는 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 적혈구 결합 부분이 펩타이드 리간드, 항체, 항체 단편 및 단일 사슬 항원 결합 도메인(ScFv)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적혈구 결합 부분이 항체, 항체 단편 또는 적혈구에 대항하여 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 유도된 ScFv을 포함하며,
    상기 하이브리도마는 BRIC 4, BRIC 5, BRIC 6, BRIC 10, BRIC 14, BRIC 18, BRIC 39, BRIC 66, BRIC 68, BRIC 69, BRIC 87, BRIC 108, BRIC 110, BRIC 111, BRIC 125, BRIC 126, BRIC 128, BRIC 145, BRIC 155, BRIC 157, BRIC 163, BRIC 170, BRIC 198, BRIC 203, BRIC 216, BRIC 220, BRIC 221, BRIC 222, BRIC 229, BRIC 230, BRIC 231, BRIC 235, BRIC 256, BRAC 17, BRAC 18, BGRL 1, BGRL 2, BGRL 11, BGRL 100, BRAD 3, BIRMA D6, BIRMA D10, BIRMA K3, BIRMA K3, 84B; 6A7; COE; 및 KZ1로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 관용 유도 항원이 단백질의 미모톱인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 관용 유도 항원은 단백질, 단백질의 부분, 인간 단백질 또는 그것의 부분, 비인간 단백질 또는 그것의 부분, 글리칸, 비인간 글리코실화를 포함하는 단백질의 글리칸, 인간의 자가면역항원, 인체 치료용 단백질 또는 그것의 부분 및 사람 음식의 일부로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 관용 유도 항원은, 유전성 질환에 의한 결손 단백질, 비인간형 글리코실화 단백질, 비인간형 단백질, 인체에서 자연적으로 발견되지 않는 합성 단백질, 사람 음식 항원, 인체 이식 항원 및 인체 자가 면역 항원으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 관용 유도 항원이 제 VIII 인자, 제 IX 인자. 아데노신 디아미나제(adenosine deaminase), L-아스파라기나제, 라스부리카제(rasburicase), 항흉선세포글로불린, L-아르기나제, L-메티오나제, 프리프로인슐린, 프로인슐린, 인슐린, GAD65, GAD67, IA-2, IA-2β, 타이로글로불린(thyroglobulin), 갑상선 퍼옥시다아제, 갑상선 자극 호르몬 수용체, 수초염기성 단백질, 마이엘린 올리고덴드로사이트 당단백질, 단백지질 단백질, 콜라겐 II, 콜라겐 IV, 아세틸콜린 수용체, 매트릭스 금속함유 단백질1 및 3, 분자 샤프롱 열충격 단백질 47, 피브릴린-1, PDGF 수용체 α, PDGF 수용체 β, 및 핵단백질 SS-A, 콘아라킨(Ara h 1), 알레르겐 II(Ara h 2), 피너츠 아글루티닌(Ara h 6), α-락토알부민(ALA), 락토트랜스페린, 글루테인, 저분자량 글루테인, α-글리아딘, γ-글리아딘, 호르데인, 세카린 및 아베닌으로 이루어진 군에서 선택되는 항원을 포함하는 것인 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 항원이 미모톱인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    이식 거부반응, 자가면역 질환, 음식 알레르기 및 치료 인자에 대한 면역 반응으로 이루어진 군에서 선택되는 병리학적 상태를 치료하는데 사용되는 것인 조성물.
  11. 관용 유도 항원과, Band 3 (CD233), 글리코포린 B (CD235b), 글리코포린 C (CD235c) 및 글리코포린n D (CD235d)에서 선택된 적혈구 결합 부분을 포함하는 분자 융합체.
  12. 제11항에 있어서,
    면역 관용을 일으키기 위해 사용되는 분자 융합체.
  13. 단백질, 단백질의 부분, 인간 단백질 또는 그것의 부분, 비인간 단백질 또는 그것의 부분, 글리칸, 비인간 글리코실화를 포함하는 단백질의 글리칸, 인간 자가면역 항원, 인간 치료용 단백질 또는 그것의 부분, 그리고 사람의 식품의 부분, 유전성 질환에 의해 결손하고 있는 단백질, 비인간 글리코실화를 가진 단백질, 비인간 단백질, 인간에게서 천연적으로 발견되지 않는 합성 단백질, 사람 음식 항원, 인간 이식 항원, 그리고 인간 자가면역 항원으로부터 선택되는 관용유도 항원; 및 Band 3 (CD233), 글리코포린 B (CD235b), 글리코포린 C (CD235c), 글리코포린 D (CD235d)에서 선택된 적혈구 결합 부분을 포함하는 분자 융합체.
  14. 면역 관용을 일으키는 방법으로서, 관용 유도 항원 및 환자의 적혈구에 특이적으로 결합하는 적혈구 결합 부분을 함유하는 분자 융합체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 상기 분자 융합체는, 관용 유도 항원을 포함하는 물질에 대해 면역 관용을 일으키는데 효과적인 양으로 투여되는 것인 방법.
  15. 적혈구 결합 부분 및 물질의 항원을 함유하는 융합 분자를 포함하는 물질에 대한 면역 반응의 면역 반전에 사용하기 위한 약학적으로 허용되는 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 관용 유도 항원은 단백질, 단백질의 부분, 인간 단백질 또는 그것의 부분, 비인간 단백질 또는 그것의 부분, 글리칸, 비인간 글리코실화를 포함하는 단백질의 글리칸, 인간의 자가면역항원, 인간 치료용 단백질 또는 그것의 부분 및 사람 음식의 일부로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 관용 유도 항원은, 유전성 질환에 의한 결손 단백질, 비인간형 글리코실화 단백질, 비인간형 단백질, 인체에서 자연적으로 발견되지 않는 합성 단백질, 사람 음식 항원, 인간 이식 항원 및 인간 자가 면역 항원으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적혈구 결합 부분이 Band 3 (CD233), 아쿠아포린-1, Glut-1, 키드 항원, RhAg/Rh50 (CD241), Rh (CD240), Rh30CE (CD240CE), Rh30D (CD240D), Kx, 글리코포린 A, 글리코포린 B (CD235b), 글리코포린 C (CD235c), 글리코포린 D (CD235d), Kell (CD238), Duffy/DARC (CD234), CR1 (CD35), DAF (CD55), 당지질, CD44, ICAM-4 (CD242), Lu/B-CAM (CD239), XG1/XG2 (CD99), EMMPRIN/뉴로텔린 (CD147), JMH, 글리코실전달효소, 카트라이트, 돔브록, C4A/CAB, 시안나, MER2, 스토마틴, BA-1 (CD24), GPIV (CD36), CD108, CD139, 및 H 항원 (CD173)으로 이루어진 군에서 선택되는 생체분자에 특이적으로 결합되는 것인 조성물.
  19. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적혈구 결합 부분이 펩타이드 리간드, 항체, 항체 단편 및 단일 사슬 항원 결합 도메인(ScFv)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  20. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적혈구 결합 부분이 항체, 항체 단편 또는 적혈구에 대항하여 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 유도된 ScFv을 포함하며, 상기 하이브리도마는 BRIC 4, BRIC 5, BRIC 6, BRIC 10, BRIC 14, BRIC 18, BRIC 39, BRIC 66, BRIC 68, BRIC 69, BRIC 87, BRIC 108, BRIC 110, BRIC 111, BRIC 125, BRIC 126, BRIC 128, BRIC 145, BRIC 155, BRIC 157, BRIC 163, BRIC 170, BRIC 198, BRIC 203, BRIC 216, BRIC 220, BRIC 221, BRIC 222, BRIC 229, BRIC 230, BRIC 231, BRIC 235, BRIC 256, BRAC 17, BRAC 18, BGRL 1, BGRL 2, BGRL 11, BGRL 100, BRAD 3, BIRMA D6, BIRMA D10, BIRMA K3, BIRMA K3, 84B; 6A7; COE; 또는 KZ1로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 관용 유도 항원이 단백질의 미모톱인 조성물.
  22. 적혈구 결합 부분 및 아스파라기나제의 항원을 포함하는 융합분자.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 적혈구 결합 부분이 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 및 이들의 보존적 치환체로 이루어진 군에서 선택되는 펩타이드 결합 리간드 또는 인간 적혈구에 결합하는 scFv를 포함하며, 상기 서열은 적혈구에 특이적으로 결합하는 것인, 융합 분자.
  24. 제22항 또는 제23항의 융합 분자를 포함하며, 아스파라기나제에 대한 관용을 유도하는데 사용되는 조성물.
  25. 적혈구 결합 부분 및 아스파라기나제의 항원을 포함하는 융합분자.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 적혈구 결합 부분이 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 및 이들의 보존적 치환체로 이루어진 군에서 선택되는 펩타이드 결합 리간드 또는 인간 적혈구에 결합하는 scFv를 포함하며, 상기 서열은 적혈구에 특이적으로 결합하는 것인, 융합 분자.
  27. 제25항 또는 제26항의 융합 분자를 포함하며, 크로모그라닌-A에 대한 관용을 유도하는데 사용되는 조성물.
  28. 표적에 특이적으로 결합하는 도메인과 결합된 적혈구 결합 부분을 포함하는 약학적으로 허용가능한 조성물.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 표적은 단백질을 포함하며, 상기 단백질은 관용 유도 항원을 더 포함하는 것인, 조성물.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서,
    상기 적혈구 결합 부분은 펩타이드 리간드를 포함하는 것인 조성물.
  31. 제28항 또는 제29항에 있어서,
    상기 적혈구 결합 부분이 펩타이드 리간드, 항체, 항체 단편 및 단일 사슬 항원 결합 도메인(ScFv)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 도메인은 항체, 항체 단편, 및 단일 사슬 항체 결합 도메인(ScFv)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    분자 융합체, 탠덤 scFv, 이중 특이성 항체 및 탠덤 scFv-IgG 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 멤버를 적혈구 결합 부분 및 상기 멤버들의 도메인과 함께 포함하는 조성물.
  34. 항원에 결합된 적혈구 결합 부분을 포함하는 약학적으로 허용가능한 조성물.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 항원이 고유 자가-항원인 조성물.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서,
    상기 자가-항원이 홍반성 낭창 항원(lupus erythematosis antigens)인 조성물.
  37. 제34항 내지 36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원이 치료적 단백질인 조성물.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 항원이 제 VIII 인자 항원인 것인 조성물.
  39. 제34항 내지 37항 중 어느 한 항의 조성물을 순환계(circulation)로부터 바람직하지 않은 항체를 제거하는데 사용하는 용도.
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